CN114752578B - 玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中的应用 - Google Patents

玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT，其cDNA核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；还公开了通过降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用和提高柚皮素含量的应用。实验证实，通过对ZmNOMT转基因过表达阳性株系的病原真菌接种鉴定，发现ZmNOMT过表达阳性株系对多种玉米病害表现出感病表型，证明了ZmNOMT是一个新的感病基因。进一步利用CRISPR/CAS9技术，针对ZmNOMT设计两个靶点，对ZmNOMT进行基因编辑，发现ZmNOMT编辑株系中柚皮素含量显著提高；对ZmNOMT编辑株系进行病原菌接种鉴定，发现ZmNOMT编辑株系表现出对多种玉米真菌病害产生广谱抗病性。本发明为玉米的抗病育种提供了新基因、新材料和新方法，应用前景广阔。

Description

玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中 的应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其通过降低ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是我国第一大粮食作物，也是重要的饲料和工业原料，在国家粮食安全中占据重要地位。据预测，我国对玉米的需求会持续增加，年增长量将超过200万吨。受全球气候变化的影响，玉米病害日趋严重，给玉米的生产带来巨大损失。如黄淮海夏玉米区常年流行的茎腐病，1998年和2021年大流行的南方锈病，以及常年发生的穗腐病、大斑病和小斑病等。因而，培育优良玉米抗病新品种，对玉米的遗传改良和农业生产具有非常重要的意义。
除了抗病基因，植物中还存在很多感病基因。近年来，随着生物技术的发展，利用基因编辑技术对感病基因进行编辑改造，可以提高植物广谱抗病性。如大麦感病基因mlo隐性突变体对大麦白粉病表现出广谱、持久的防治作用，已经在欧洲大麦农业中有效使用了约40年。通过CRISPR/Cas9对六倍体小麦中的Tamlo三个同源基因进行编辑得到新的Tamlo突变体，使小麦表现出对白粉病的广谱抗性，并且该突变体的产量性状与野生型没有显著差别(LI S,LIN D,ZHANG Y,et al.Genome-edited powdery mildew resistance inwheat without growth penalties[J].Nature,2022,602(7897):455-460)。利用CRISPR/Cas9技术创制了易感基因Pi21和Bsr-d1的功能缺失突变体，增加了对稻瘟病菌的广谱抗性；易感基因Xa5的敲除突变体增加了对水稻黄单胞菌引起的白叶枯病的抗性，并且这三个易感基因的三重突变体显著增强了对水稻稻瘟病菌和白叶枯病的抗性，与野生型植物相比，三重突变体在主要农艺性状上没有显著差异(TAO H,SHI X,HE F,et al.Engineeringbroad-spectrum disease-resistant rice by editing multiple susceptibilitygenes[J].Journal of Integrative Plant Biology,2021,63(9):1639-1648)。因而，通过基因编辑改造感病基因，可以有效提高作物的广谱抗性，并且不影响作物的产量。但目前可供开发利用的候选基因较少，不能满足农业生产的需要，亟需挖掘新的感病基因作为基因编辑的靶点。
植物抗毒素是一类小分子次级代谢产物，在植物抗病中发挥重要功能，受病原菌侵染等生物胁迫和非生物胁迫诱导而大量积累。抗毒素可以通过抑制真菌菌丝生长而抑制病原菌的扩散，在水稻中已经分离出16种萜类抗毒素以及一个类黄酮抗毒素—樱花木素(sakuranetin)。樱花木素被认为是水稻中最重要的植物抗毒素之一，通常在未受胁迫的水稻叶片中很难检测到，但当受到生物或非生物胁迫(如水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、水稻黄单胞菌、水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)、紫外线(UV)照射、氯化铜或茉莉酸(JA)处理等)后会迅速诱导樱花木素的生物合成。水稻中樱花木素是由另一种黄酮类物质柚皮素(naringenin)经甲基化合成。柚皮素是多种黄酮和类黄酮类化合物合成过程中的关键中间体，在植物中将其作为一种防御化合物的研究并不多见。柚皮素对于一些细菌性病原菌具有较强的抗性，例如水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)、水稻黄单胞菌、菊基腐病菌(Erwinia chrysanthemi)，此外也对部分真菌，如水稻稻瘟病菌、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)具有微弱抑制作用。基于其相对于樱花木素对水稻稻瘟病菌菌丝生长的微弱抑制作用，柚皮素被认为是水稻稻瘟病菌产生的一种对樱花木素具有解毒作用的物质。催化柚皮素产生樱花木素这一反应的酶被称为柚皮素甲基转移酶(NOMT，naringenin 7-O-methyltransferase),它是以S-甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，在柚皮素第7位O原子上加上一个甲基而形成。目前对于NOMT的生物学功能研究较少，只在水稻中克隆到了OsNOMT并发现它能以柚皮素为底物催化生成樱花木素(SHIMIZU T,LIN F,HASEGAWA M,et al.Purification and identification of naringenin 7-O-Methyltransferase,akey enzyme in biosynthesis of flavonoid phytoalexin sakuranetin in rice.TheJournal of Biological Chemistry,2012,287:19315-19325)，而关于NOMT直接参与植物抗病的功能尚未见报道。
发明内容
针对目前技术的不足，本发明的目的是提供一种玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其通过降低ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用。
本发明所述的玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT，其特征在于：所述基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT编码的氨基酸序列，其特征在于：所述基因ZmNOMT编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种含有上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为pCAMBIA3301::ZmNOMT。
本发明提供了一种通过降低上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用；其中，所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或是在包括编码区、启动子区和5'-、3'-非翻译区的玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的核苷酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列；该衍生所得的核苷酸序列编码的多肽与玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的核苷酸序列编码的多肽功能相同，则该衍生所得的核苷酸序列和其编码的多肽表达降低同样具有提高植物广谱抗病性的功能；所述降低基因ZmNOMT表达的方法中，除基因编辑外，还包括通过RNA干扰、转座子插入、如EMS诱变的化学诱变或物理诱变等任何一种降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT表达的方法；所述方法得到的广谱抗病材料包括将表现出增加抗病性的植物与第二亲本植物杂交；产生的子代具有与第二亲本植物相比增加抗病性，其中所述第二亲本植物包含优良种质和骨干自交系。
上述应用优选的实施方式是：所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述广谱抗病性中涉及的病害是玉米病害小斑病、大斑病、炭疽病和/或茎腐病；所述植物是玉米。
本发明提供了一种含有上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的CRISPR/CAS9基因编辑载体，其特征在于：所述编辑载体命名为CRISPR-ZmNOMT，该载体克隆区域ZmNOMT的两个靶点序列分别为gRNA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，对应于SEQ ID No.1中第26-45位核苷酸；gRNA2，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，对应于SEQ ID No.1中第328-347位核苷酸。
本发明提供了一种应用上述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的CRISPR/CAS9基因编辑载体获得广谱抗病性玉米突变体株系的方法，其特征在于：根据CRISPR/CAS9技术原理，将CRISPR-ZmNOMT载体遗传转化玉米受体后，经过筛选、鉴定，获得不含有CAS9但ZmNOMT基因被成功编辑的突变体株系。
其中：所述不含有CAS9但ZmNOMT基因被成功编辑的突变体株系优选是两个玉米突变体株系，分别命名为W2-3，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；W2-5，其核苷酸序列如SEQID No.6所示。
本发明提供了一种通过降低所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高柚皮素含量的应用。
实验证实：高效液相色谱测试ZmNOMT基因编辑株系出现了明显的柚皮素对应的峰，而其对应的阴性株系中则几乎检测不到柚皮素，证明ZmNOMT基因编辑株系中柚皮素含量显著提高。
具体的，玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中应用的例证。
申请人首次从玉米B73自交系中克隆了柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT，将其构建到过表达载体pCAMBIA3301::ZmNOMT，并遗传转化到玉米中，通过对ZmNOMT转基因过表达阳性株系的病原真菌接种鉴定，发现ZmNOMT过表达阳性株系对多种玉米病害表现出感病表型，证明了ZmNOMT是一个新的感病基因。进一步利用CRISPR/CAS9技术，针对ZmNOMT设计两个靶点gRNA1和gRNA2，对ZmNOMT进行基因编辑，获得含有基因ZmNOMT的CRISPR/CAS9基因编辑载体CRISPR-ZmNOMT，将CRISPR-ZmNOMT载体遗传转化玉米受体后，经过筛选、鉴定，获得不含有CAS9但ZmNOMT基因被成功编辑的突变体株系。实验发现ZmNOMT编辑株系中柚皮素含量显著提高；对ZmNOMT编辑株系进行病原菌接种鉴定，发现ZmNOMT编辑株系表现出对多种玉米真菌病害产生广谱抗病性，为通过降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用奠定了基础，也为玉米抗病育种提供了新手段和新材料。
本发明公开的玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其通过降低ZmNOMT的表达以提高植物广谱抗病性的应用为玉米的抗病育种提供了新基因、新材料和新方法，对玉米的抗病遗传育种意义重大，应用前景广阔。
附图说明
图1为PCR克隆玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的CDS序列电泳图。
其中：M为Marker，扩增ZmNOMT基因CDS序列长度为1223bp。
图2为玉米ZmNOMT和水稻OsNOMT的核苷酸序列比对图，二者序列相似性为75.8％。
图3为玉米ZmNOMT和水稻OsNOMT的氨基酸序列比对图，二者序列相似性为66.5％。
图4为植物过表达载体pCAMBIA3301::ZmNOMT图谱。
图5为ZmNOMT转基因过表达阳性株系的Western blot鉴定。
其中：用GFP抗体对ZmNOMT转基因材料进行Western Blot鉴定。泳道M为Marker，泳道上方标的为四个转基因株系阳性(pos)和对应阴性(neg)植株的编号；1、2、3、4为来自不同的四个植株。
图6为ZmNOMT转基因过表达株系苗期对炭疽病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT阳性过表达系及其相应的野生型接种Colletotrichum graminicola后的表型。B.用Image J测量ZmNOMT阳性过表达系及其对应的野生型接种Colletotrichumgraminicola后的病变面积(**p<0.01,Student’s t-test)。
图7为ZmNOMT转基因过表达株系苗期对小斑病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT阳性过表达系及其相应的野生型对小斑病的抗病表型。B.用Image J测量ZmNOMT的阳性过表达系及其对应的野生型接种小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)后的病变面积(***p<0.001,Student’s t-test)。
图8为ZmNOMT转基因过表达株系成株期在大田对小斑病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT阳性过表达系及其相应的野生型对小斑病的抗病表型。B.用Image J测量ZmNOMT的阳性过表达系及其对应的野生型感染小斑病后的病变面积(**p<0.01；***p<0.001,Student’s t-test)。
图9为ZmNOMT转基因过表达株系成株期在大田对大斑病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT阳性过表达系及其相应的野生型对大斑病的抗病表型。B.用Image J测量ZmNOMT的阳性过表达系及其对应的野生型感染大斑病后的病变面积(*p<0.05,Student’s t-test)。
图10为ZmNOMT转基因过表达株系对茎腐病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT阳性过表达系及其相应的野生型对茎腐病的抗性表型。B.用Image J测量ZmNOMT阳性过表达系及其对应的野生型在接种轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)后的病变面积(**p<0.01,Student’s t-test)。
图11为ZmNOMT基因编辑阳性株系的鉴定。
A.ZmNOMT基因结构以及gRNA1和gRNA2位点的位置示意图。B.两个CRISPR/Cas9编辑系W2-3和W2-5的gRNA位点的序列变化以及测序色谱图。C.两个CRISPR/Cas9编辑系W2-3和W2-5中ZmNOMT被编辑后的氨基酸序列。
图12为ZmNOMT基因编辑株系苗期对炭疽病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT编辑系及其相应的野生型接种Colletotrichum graminicola后的表型。B.用Image J测量ZmNOMT编辑系及其对应的野生型接种Colletotrichum graminicola后的病变面积(***p<0.001,Student’s t-test)。
图13为ZmNOMT基因编辑株系苗期对小斑病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT两个编辑系及其相应的野生型对小斑病的抗病表型。B.用Image J测量ZmNOMT的两个编辑系及其对应的野生型接种小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)后的病变面积(***p<0.001,Student’s t-test)。
图14为ZmNOMT基因编辑株系成株期在大田对小斑病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT两个编辑系及其相应的野生型对小斑病的田间表型。B.根据病害严重程度对ZmNOMT两个编辑系及其对应的野生型材料的分级(0-9级，数值越小表示病害程度越严重)鉴定结果(*p<0.05；***p<0.001,Student’s t-test)。
图15为ZmNOMT基因编辑株系对茎腐病的抗病性鉴定。
A.ZmNOMT基因编辑系及其相应的野生型对茎腐病的抗性表型。B.用Image J测量ZmNOMT的基因编辑系及其对应的野生型在接种轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)后的病变面积(***p<0.001,Student’s t-test)。
图16为对玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT进行基因编辑后的株系通过小斑病菌处理后柚皮素含量显著增加。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。
如下下述实施例中，所使用的基因工程和分子生物学的技术和方法均为本领域公知的常规方法，未做具体说明的可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。本领域的技术人员可以在发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。本发明给出的例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。实施例中所使用的材料、试剂、质粒、菌株、试剂盒等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1、ZmNOMT的克隆
1.1玉米自交系B73总RNA的提取
(1)将玉米B73叶片材料放入高温灭菌的研钵中，倒入液氮将其研磨成粉末；研磨过程中不断添加液氮防止融化；
(2)将研磨好的叶片粉末转入到1.5ml离心管中，迅速加入1ml RNAiso Plus提取液，涡旋震荡，室温静置10min；
(3)加入200μl三氯甲烷，轻柔摇晃混匀直至液体分层，室温放置5min；
(4)4℃，12,000rpm，离心15min，吸取500μl上清液转移到新的1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇，上下翻转混匀，室温放置10mim；
(5)4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，用1ml 75％的乙醇清洗沉淀，轻弹管底让沉淀充分与液体接触；4℃，7,500rpm，离心5min；重复上述步骤清洗第二次；
(6)吸出残留上清，置于超净工作台中干燥约3min，加入30μl RNase-Free水溶解；
(7)用紫外分光光度计或Nanodrop测量RNA样品的OD值和浓度，以A260/A280达到1.8-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。
1.2 RNA反转录成cDNA
(1)向离心管中依次加入下列试剂(20μl反应体系)：
(2)用移液枪轻轻吸打混匀，42℃，2min；
(3)向离心管中加入4μl 5×HiScriptⅢqRT SuperMix；
(4)轻轻混匀后，37℃1.5h，85℃5sec，然后-20℃保存备用。
1.3 ZmNOMT基因克隆
所用引物序列为：
ZmNOMT-F1：5’-ATGGCCTGCACGACGGC-3’
ZmNOMT-R1：5’-CTTGGTGAACTCGAGCGCC-3’
利用高保真酶PFU进行扩增的反应体系如下(25μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，向反应液中加入5×loading Buffer后进行TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。
利用聚合美DNA纯化试剂盒对克隆基因片段进行纯化回收。
1.4目的基因与入门载体的连接
反应体系如下：
25℃反应20min。
1.5质粒或DNA连接产物转化大肠杆菌感受态
(1)将1μl质粒DNA或者6ul连接产物加入50μl感受态细胞DH5α中，轻柔混匀，冰浴30min；
(2)42℃，温水浴热激1min，立即冰浴2min；
(3)加入800μl LB培养基，混匀，37℃，220rpm振荡1h；
(4)室温，5000rpm，离心2min，弃上清，用剩下的少量上清悬浮菌体沉淀；
(5)将悬浮的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜；
(6)培养16h后，挑取单克隆做菌落PCR鉴定，选取阳性克隆测序，测序结果正确的克隆命名为ZmNOMT，所述基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
1.6 ZmNOMT与水稻OsNOMT的序列比对
利用DNAMAN软件对ZmNOMT与水稻OsNOMT的核苷酸和氨基酸序列进行比对，其核苷酸序列比对图如图2所示，其氨基酸序列比对图如图3所示。
实施例2、ZmNOMT过表达载体的构建和转基因株系的抗病功能验证
2.1玉米ZmNOMT过表达载体的构建
(1)用BamH1和Xma1对玉米过表达载体pCAMBIA3301进行双酶切；
(2)在基因ZmNOMT两端分别加入BamH1和Xma1酶切位点；
(3)将基因双酶切后胶回收目的条带，通过T4 DNA连接酶连接到pCAMBIA3301载体上；
(4)转化大肠杆菌感受态DH5α，通过菌落PCR鉴定后的阳性克隆提前质粒并进行测序，测序正确后的质粒载体命名为pCAMBIA3301::ZmNOMT，其图谱见图4。
2.2质粒转化农杆菌
(1)将1μg质粒载体加入到50μl农杆菌感受态EHA105中，混匀，冰浴30min；
(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴3min；
(3)加入800μl LB液体培养基，混匀，28℃，220rpm振荡3h；
(4)室温，5,000rpm，离心2min，弃上清，用剩下的少量上清悬浮菌体沉淀；
(5)将菌涂布于含有相应抗生素的LB培养平板上，28℃倒置培养48h，挑取单克隆做菌落PCR鉴定，保存阳性克隆于-80℃冰箱中。
2.3玉米的遗传转化
将含有质粒载体的农杆菌EHA105，送到生物公司转化玉米自交系B104，得到转基因株系。
2.4 ZmNOMT转基因玉米植株的Western blot检测
(1)SDS-PAGE浓缩胶与分离胶的配制：
组装好制胶装置，先配置10％分离胶，每块胶需要约5ml分离胶，配好分离胶后用ddH2O液封使液面平行，等待20～30min至分离胶凝固，直至与ddH2O形成分明的分界线后将上层液体倒掉，并用吸水纸吸走多余水分；配制5％浓缩胶，每块胶需要约2ml浓缩胶，浓缩胶制备完要立刻插入梳子，静置20～30min至浓缩胶凝固。
10％分离胶配方：
5％浓缩胶配方：
(2)样品的制备
取适量叶片于2ml离心管中，加入瓷珠，放入液氮中冷冻30s，打样器(40HZ，30s)打样，重复两次使叶片完全打碎至粉末，迅速加入200μl蛋白提取缓冲液，研磨混匀，放置冰上冰浴30min。
蛋白提取缓冲液配方：
(3)12000rpm 4℃离心15min，吸取15μl上清与15μl 2×laemmlli(含有5％巯基乙醇)混匀，准备点样。
(4)将SDS-PAGE胶安装到电泳槽中，倒入1×Running buffer(ddH2O:10×Runningbuffer＝9：1)，从胶中竖直取出梳子，点样前用移液枪吸打每一个孔排出多余的气泡，取15μl样品点样，80V跑20min，150V跑1小时。
10×跑胶缓冲液配方：
(5)转膜
a.跑完胶后将SDS-PAGE胶从双层胶板中取出，切去上层浓缩胶，将分离胶置于装有ddH2O的玻璃皿中清洗5～10min，并将剪好的NC膜(5.8×8.5cm)放入1×转膜缓冲液(1.1L1×转膜缓冲液＝110ml 10×转膜缓冲液+190ml甲醇+800ml ddH2O)中清洗15min，提前剪好滤纸(8×10cm)备用，1×转膜缓冲液需提前放置于-20℃预冷。
b.安装转膜装置:将转膜夹子黑色一面置于最下层，依次放入海绵、四层滤纸、分离胶、NC膜、四层滤纸、海绵，每次放之前赶气泡，将转膜夹子透明一面盖在最上层，固定好放入转膜槽中，槽中放入冰袋，加入提前预冷的1×转膜缓冲液。
c.将电泳槽置于4℃冰箱中转膜，45V，2.5h，电流保持在160～200mA。
10×转膜缓冲液配方：
(6)考马斯亮蓝染色：将切去上层浓缩胶的SDS-PAGE胶用提前配好的考马斯亮蓝染色液染色30min，用ddH2O清洗3次，每次10min，用冰醋酸清洗至无色后拍照。
(7)封闭
转完膜后先将NC膜放在装有ddH2O的玻璃皿中清洗10min，然后将膜转到由4％脱脂奶粉(30ml 1×PBS中加入1.2g脱脂奶粉)配置的封闭液中封闭1.5h。
(8)一抗
倒掉封闭液，将NC膜转到一抗溶液(1×PBST中加入3％的脱脂奶粉，再加入1：5000的一抗)中，水平摇床上室温孵育2小时。
(9)二抗
将一抗倒出，用1×PBST洗膜3次，每次10min，加入二抗(1×PBST中加入3％的脱脂奶粉，再加入1：4000的二抗)，水平摇床上室温孵育1.5h。
(10)将二抗倒出，用1×PBST洗膜2次，1×PBS洗膜1次，每次10min。
(11)使用ECL试剂盒，将显色液A与B按照1：1混合，吸取适量的混合液加到NC膜正面，使显色液均匀的铺在NC膜表面，最后用化学发光仪曝光显影。ZmNOMT转基因过表达植株的Western blot鉴定结果见图5。
2.5玉米叶片离体小斑病和炭疽病的接种鉴定
(1)将分别引起玉米小斑病和炭疽病的玉蜀黍平脐蠕孢菌和禾生炭疽菌在V8培养基上生长，接菌前两周挑取菌块于新的V8培养基正中间，避光培养于28℃培养箱中；
(2)孢子洗脱液的配置：琼脂粉0.5g/L，Tween-20 0.5ml/L，用ddH2O定容至1L；
吸取5ml的孢子洗脱液于菌板上，用1ml枪头的背面刮取菌板表面，收集菌液；
(3)用三层滤纸过滤菌液于新的50ml离心管，吸取20μL菌液于细胞计数板上，盖好盖玻片，在显微镜下进行计数；
(4)用孢子洗脱液将菌液稀释至5×105个/ml；
(5)在黑色托盘上铺三层滤纸，用灭菌水浸湿，将叶片均匀铺展在滤纸上，用注射器针头在叶片上扎孔；
(6)吸取10μl菌液滴加在叶片上方，用保鲜膜将托盘密封好从而保湿，避光处理一晚后移至弱光条件下两天；
(7)第三天拍照观察病斑表型，并用Image J软件统计病斑面积。鉴定发现ZmNOMT过表达株系比其对应的阴性株系对炭疽病更加感病，鉴定结果见图6；ZmNOMT过表达株系比其对应的阴性株系对小斑病更加感病，鉴定结果见图7。
2.6田间小斑病的抗病鉴定
将玉米材料于5月中旬在青岛种植，在开花后一周统计其在田间自发感染小斑病的表型。各个材料根据病害的严重程度进行分级鉴定，一共分为9个等级(1-9)，病害面积越大等级越低。ZmNOMT过表达株系比其对应的阴性株系对田间小斑病更加感病，鉴定结果见图8。
2.8田间大斑病的抗病鉴定
将玉米材料于4月下旬在吉林长春种植，在开花后一周统计其在田间自发感染小斑病的表型。各个材料根据病害的严重程度进行分级鉴定，一共分为9个等级(1-9)，病害面积越大等级越高。ZmNOMT过表达株系比其对应的阴性株系对田间大斑病更加感病，鉴定结果见图9。
2.9玉米茎腐病的抗病鉴定
(1)将轮枝镰刀菌生长在PDA培养基上，接菌一周前挑取菌丝于新的PDA培养基正中间，封口膜封好，避光培养于28℃培养箱中；
(2)挑取轮枝镰刀菌菌块于事先灭菌的绿豆培养基中，置于28℃，200rpm的摇床上培养2天；
(3)用三层纱布过滤菌液，收集于50ml离心管中，1000g离心5min，弃上清，重复收集2-3次；
(4)吸取适量灭菌ddH2O于50ml离心管中，涡旋，直至菌块完全溶解，吸取20μl菌液于细胞计数板上，盖好盖玻片，在显微镜下进行计数；
(5)用灭菌ddH2O将菌液稀释至1×106个/ml；
(6)用10ml注射器吸取500μl菌液，缓慢注射于玉米的第三节间，用胶带将接种部位封住，接种两周后，将玉米第三节砍下，从中间劈开，拍照并用Image J软件统计病斑面积。ZmNOMT过表达株系比其对应的阴性株系对茎腐病更加感病，鉴定结果见图10。
实施例3、ZmNOMT基因编辑载体的构建和编辑株系的抗病功能验证
3.1玉米ZmNOMT基因编辑载体构建
用HindⅢ对CRISPR/CAS9基础载体进行单酶切。基于CRISPR/CAS9技术原理，根据ZmNOMT基因组序列，设计了两个靶点gRNA1和gRNA2，gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。以U-S(U6-gRNA-sgRNA cassette)片段为模板设计带载体切口同源臂及重叠PCR重叠部分(20bp gRNA部分)的特异性扩增引物，以U-S为模板扩增目标片段U6-2启动子和sgRNA scanfold片段，最终通过重叠PCR得到CPB::U6-2::gRNA ::sgRNA::CPB重叠片段，将重叠PCR产物测序无误后，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接到CRISPR/CAS9基础载体，获得的含有玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的CRISPR/CAS9基因编辑载体命名为CRISPR-ZmNOMT。
连接后的载体转化E.coli，涂布LB+Kana平板，经Sanger测序得到的阳性克隆寄给转基因公司进行玉米转化。
3.2玉米的遗传转化
将含有CRISPR-ZmNOMT的质粒载体转化农杆菌EHA105，挑取阳性克隆送到生物公司转化玉米自交系B104，得到转基因株系。
3.3 CTAB法提取玉米基因组DNA
(1)取适量叶片于2ml离心管中，加入瓷珠，放入液氮中冷冻30s，打样器(40HZ，30s)打样，重复两次使叶片完全打碎至粉末。
(2)向管中加入650μl，65℃预热的CTAB提取液，上下充分混匀，放入65℃烘箱中孵育30min，每10min拿出来上下混匀一次。
(3)待冷却至室温后，加入650μl三氯甲烷：异戊醇＝24：1的混合液，室温放置数分钟至分层。
(4)12000rpm，25℃离心15min。
(5)吸取400μl上清至新的1.5ml离心管中，加入400μl 4℃预冷的异丙醇，上下翻转混匀，-20℃冰置2h。
(6)12000rpm，25℃离心15min。
(7)倒掉上清，加入1ml预冷的70％的乙醇，轻弹管底悬浮沉淀，12000rpm，25℃离心5min，重复上述步骤一次。
(8)弃上清，并吸尽多余酒精，在通风橱将酒精彻底吹干。
(9)根据沉淀多少加入适量ddH2O溶解沉淀，轻弹管壁使沉淀溶解充分，4℃保存备用。
CTAB提取液配方：
3.4 ZmNOMT基因编辑玉米株系的鉴定
所用引物序列：
ZmNOMT-gDNA-F1：GGCCCTCTTCGACTGCACTG
ZmNOMT-gDNA-R1：GACTGCGACTGACCTTGGACC
Cas9-F：CTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGA
Cas9-R：CAGAGTTGGTGCCGATGTC
检测是否含有Cas9，反应体系如下：
选取不含Cas9的玉米材料进行PCR扩增，反应条件如下：
PCR反应结束后，吸取5μl反应液，加入2μl 5×loading Buffer，3μl ddH2O后进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余反应液送测序公司用ZmNOMT-gDNA-F2和ZmNOMT-gDNA-R2引物测序。
经过测序鉴定，获得不含有CAS9但ZmNOMT基因被成功编辑的两个突变体株系，分别命名为W2-3，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；W2-5，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。两个基因编辑突变体株系编辑后的序列变化见图11。
3.5玉米叶片离体小斑病和炭疽病的接种鉴定
(1)将分别引起玉米小斑病和炭疽病的玉蜀黍平脐蠕孢菌和禾生炭疽菌在V8培养基上生长，接菌前两周挑取菌块于新的V8培养基正中间，避光培养于28℃培养箱中；
(2)孢子洗脱液的配置：琼脂粉0.5g/L，Tween-20 0.5ml/L，用ddH2O定容至1L；
吸取5ml的孢子洗脱液于菌板上，用1ml枪头的背面刮取菌板表面，收集菌液；
(3)用三层滤纸过滤菌液于新的50ml离心管，吸取20μL菌液于细胞计数板上，盖好盖玻片，在显微镜下进行计数；
(4)用孢子洗脱液将菌液稀释至5×105个/ml；
(5)在黑色托盘上铺三层滤纸，用灭菌水浸湿，将叶片均匀铺展在滤纸上，用注射器针头在叶片上扎孔；
(6)吸取10μl菌液滴加在叶片上方，用保鲜膜将托盘密封好从而保湿，避光处理一晚后移至弱光条件下两天；
(7)第三天拍照观察病斑表型，并用Image J软件统计病斑面积。ZmNOMT基因编辑株系比其对应的阴性株系对炭疽病更加抗病，鉴定结果见图12；ZmNOMT基因编辑株系比其对应的阴性株系对小斑病更加抗病，鉴定结果见图13。
3.6田间小斑病的抗病鉴定
将玉米材料于5月中旬在青岛种植，在开花后一周统计其在田间自发感染小斑病的表型。各个材料根据病害的严重程度进行分级鉴定，一共分为9个等级(1-9)，病害面积越大等级越低。ZmNOMT基因编辑株系比其对应的阴性株系对田间小斑病更加抗病，鉴定结果见图14。
3.7玉米茎腐病的抗病鉴定
(1)将轮枝镰刀菌生长在PDA培养基上，接菌一周前挑取菌丝于新的PDA培养基正中间，封口膜封好，避光培养于28℃培养箱中；
(2)挑取轮枝镰刀菌菌块于事先灭菌的绿豆培养基中，置于28℃，200rpm的摇床上培养2天；
(3)用三层纱布过滤菌液，收集于50ml离心管中，1000g离心5min，弃上清，重复收集2-3次；
(4)吸取适量灭菌ddH2O于50ml离心管中，涡旋，直至菌块完全溶解，吸取20μl菌液于细胞计数板上，盖好盖玻片，在显微镜下进行计数；
(5)用灭菌ddH2O将菌液稀释至1×106个/ml；
(6)用10ml注射器吸取500μl菌液，缓慢注射于玉米的第三节间，用胶带将接种部位封住，接种两周后，将玉米第三节砍下，从中间劈开，拍照并用Image J软件统计病斑面积。ZmNOMT基因编辑株系比其对应的阴性株系对茎腐病更加抗病，鉴定结果见图15。
3.8 ZmNOMT基因编辑株系中柚皮素含量测定
用高效液相色谱仪(岛津，京都，日本)检测NOMT的酶活。取0.1g小斑病菌处理过的玉米叶片，液氮速冻，置于2ml离心管加入瓷珠，打样器(40HZ，30s)打样，立即加入250μl80％的甲醇，60℃水浴2h，12000g离心5min，吸取上清。为了更精确的检测NOMT的酶活，用咖啡酸作为本次实验的内标物质。水相中加入1％的甲酸，有机相为乙腈。柚皮素和樱花木素的检测波长为306nm。以1ml/min的流速采用C18色谱柱进行检测。
结果显示：ZmNOMT基因编辑株系出现了明显的柚皮素对应的峰，而其对应的阴性株系中则几乎检测不到柚皮素，说明ZmNOMT基因编辑株系中柚皮素含量显著提高，测定结果见图16。
序列表
<110>山东大学
<120>玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT及其在植物广谱抗病性中的应用
<141> 2022-5-18
<160> 6
<210> 1
<211> 1098
<212> CDS
<213>玉蜀黍属玉米（Zea mays L.）
<221>玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT基因核苷酸序列
<222>（1）…（1098）
<400> 1
atggcctgca cgacggcagc atccctgcag catgacaggg ccaacgacga cgaggcgtgc 60
atgtacgcgc aggagctcct gagctgcttc gtcgtgccca tgacactgaa ggcggtcatc 120
gagctgggcc tcatcgacga cctcctcgcg gccgacgggc gcttcgtgac cccagaggag 180
ctggcggcgc ggtgggcgcg gccggccgag gcggccgccg cggtggaccg catgctgcgg 240
ttcctcgcgt cgcacagcgt cgtccggtgc acgacggagg cggcggggcc agacgggagg 300
gcccgccgga gctacgcggc ggcgccggtg tgcaagtggc tcatcgctcg gaacggcacc 360
gggcagggct cgtgggctcc gatcgggctg atgaacctga acaaggggtt catggagacc 420
tggtactaca tgaaggacgc cgtggcggaa ggggcgacgc cgaccgagaa ggcctacggc 480
atgccgctgt tcgagcacct ggggtcggac gaggcgttga acacgctctt caaccaggcc 540
atggccggtc actcggagat cgtaatcagc aagcttctcg aggtgtaccg cggcttcgag 600
ggcgtcgacg tgctggtcga cgtcggcggc ggcaccggct ccacgctgcg gatggtcacc 660
gcccagtaca agcacctgag aggcgtcaac tacgacctcc cccacgtcat cgcgcaggcg 720
ccgccggtcc aaggtgtgga acatgctggt ggtagcatgt ttgagtacat tccgagcgga 780
aacgcaattt tgctgaagtg gattctgcac ctgtggcgcg acgaggagtg catcaagatc 840
ctcaagaact gccaccgggc gctcccggcg aacgggaagg tgatcgtggt ggagtgcgtg 900
ctcccggcca gcccggagcc gacgcaggtt gcgcagggcg cgctgctcct ggacgtggtg 960
atgctgaacc gcctcagggg cgccaaggag cggacggagc gggagttcac cgagctggcc 1020
gcggaggccg gcttctccgg cggatgcagg gccacctacg tcttcaccgg cgcctgggcg 1080
ctcgagttca ccaagtag 1098
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213>玉蜀黍属玉米（Zea mays L.）
<221>玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT基因编码的氨基酸序列
<222>（1）…（365）
<400> 2
MACTTAASLQ HDRANDDEAC MYAQELLSCF VVPMTLKAVI ELGLIDDLLA ADGRFVTPEE 60
LAARWARPAE AAAAVDRMLR FLASHSVVRC TTEAAGPDGR ARRSYAAAPV CKWLIARNGT 120
GQGSWAPIGL MNLNKGFMET WYYMKDAVAE GATPTEKAYG MPLFEHLGSD EALNTLFNQA 180
MAGHSEIVIS KLLEVYRGFE GVDVLVDVGG GTGSTLRMVT AQYKHLRGVN YDLPHVIAQA 240
PPVQGVEHAG GSMFEYIPSG NAILLKWILH LWRDEECIKI LKNCHRALPA NGKVIVVECV 300
LPASPEPTQV AQGALLLDVV MLNRLRGAKE RTEREFTELA AEAGFSGGCR ATYVFTGAWA 360
LEFTK 365
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>玉蜀黍属玉米（Zea mays L.）
<221>CRISPR-ZmNOMT载体克隆区域ZmNOMT的靶点1序列gRNA1
<222>（1）…（20）
<400> 3
gttggccctg tcatgctgca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>玉蜀黍属玉米（Zea mays L.）
<221>CRISPR-ZmNOMT载体克隆区域ZmNOMT的靶点的靶点2序列gRNA2
<222>（1）…（20）
<400> 4
gcgatgagcc acttgcacac 20
<210> 5
<211> 1072
<212> DNA
<213>玉蜀黍属玉米（Zea mays L.）
<221>通过CRISPR/CAS9对玉米柚皮素甲基转移酶基因 ZmNOMT进行基因编辑后得到的新编辑系W2-3的基因序列
<222>（1）…（1072）
<400> 5
atggcctgca cgacggcagc atccctgcaa gcatgacagg gccaacgacg acgaggcgtg 60
catgtacgcg caggagctcc tgagctgctt cgtcgtgccc atgacactga aggcggtcat 120
cgagctgggc ctcatcgacg acctcctcgc ggccgacggg cgcttcgtga ccccagagga 180
gctggcggcg cggtgggcgc ggccggccga ggcggccgcc gcggtggacc gcatgctgcg 240
gttcctcgcg tcgcacagcg tcgtccggtg cacgacggag gcggcggggc cagacgggag 300
ggcccgccgg agctacgcgg ctcggaacgg caccgggcag ggctcgtggg ctccgatcgg 360
gctgatgaac ctgaacaagg ggttcatgga gacctggtac tacatgaagg acgccgtggc 420
ggaaggggcg acgccgaccg agaaggccta cggcatgccg ctgttcgagc acctggggtc 480
ggacgaggcg ttgaacacgc tcttcaacca ggccatggcc ggtcactcgg agatcgtaat 540
cagcaagctt ctcgaggtgt accgcggctt cgagggcgtc gacgtgctgg tcgacgtcgg 600
cggcggcacc ggctccacgc tgcggatggt caccgcccag tacaagcacc tgagaggcgt 660
caactacgac ctcccccacg tcatcgcgca ggcgccgccg gtccaaggtg tggaacatgc 720
tggtggtagc atgtttgagt acattccgag cggaaacgca attttgctga agtggattct 780
gcacctgtgg cgcgacgagg agtgcatcaa gatcctcaag aactgccacc gggcgctccc 840
ggcgaacggg aaggtgatcg tggtggagtg cgtgctcccg gccagcccgg agccgacgca 900
ggttgcgcag ggcgcgctgc tcctggacgt ggtgatgctg aaccgcctca ggggcgccaa 960
ggagcggacg gagcgggagt tcaccgagct ggccgcggag gccggcttct ccggcggatg 1020
cagggccacc tacgtcttca ccggcgcctg ggcgctcgag ttcaccaagt ag 1072
<210> 6
<211> 1025
<212> DNA
<213>玉蜀黍属玉米（Zea mays L.）
<221>通过CRISPR/CAS9对玉米柚皮素甲基转移酶基因 ZmNOMT进行基因编辑后得到的新编辑系W2-5的基因序列
<222>（1）…（1025）
<400> 6
atggcctgca cgacggcagc atcccatgac actgaaggcg gtcatcgagc tgggcctcat 60
cgacgacctc ctcgcggccg acgggcgctt cgtgacccca gaggagctgg cggcgcggtg 120
ggcgcggccg gccgaggcgg ccgccgcggt ggaccgcatg ctgcggttcc tcgcgtcgca 180
cagcgtcgtc cggtgcacga cggaggcggc ggggccagac gggagggccc gccggagcta 240
cgcggcggcg ccggtgttgc aagtggctca tcgctcggaa cggcaccggg cagggctcgt 300
gggctccgat cgggctgatg aacctgaaca aggggttcat ggagacctgg tactacatga 360
aggacgccgt ggcggaaggg gcgacgccga ccgagaaggc ctacggcatg ccgctgttcg 420
agcacctggg gtcggacgag gcgttgaaca cgctcttcaa ccaggccatg gccggtcact 480
cggagatcgt aatcagcaag cttctcgagg tgtaccgcgg cttcgagggc gtcgacgtgc 540
tggtcgacgt cggcggcggc accggctcca cgctgcggat ggtcaccgcc cagtacaagc 600
acctgagagg cgtcaactac gacctccccc acgtcatcgc gcaggcgccg ccggtccaag 660
gtgtggaaca tgctggtggt agcatgtttg agtacattcc gagcggaaac gcaattttgc 720
tgaagtggat tctgcacctg tggcgcgacg aggagtgcat caagatcctc aagaactgcc 780
accgggcgct cccggcgaac gggaaggtga tcgtggtgga gtgcgtgctc ccggccagcc 840
cggagccgac gcaggttgcg cagggcgcgc tgctcctgga cgtggtgatg ctgaaccgcc 900
tcaggggcgc caaggagcgg acggagcggg agttcaccga gctggccgcg gaggccggct 960
tctccggcgg atgcagggcc acctacgtct tcaccggcgc ctgggcgctc gagttcacca 1020
agtag 1025

Claims (2)

1.一种通过降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的表达以提高玉米抗病性的应用；其中，所述抗病性中涉及的玉米病害是指小斑病、大斑病、炭疽病和/或茎腐病；所述玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述降低基因ZmNOMT表达的方法中，除基因编辑外，还包括通过RNA干扰、转座子插入、EMS诱变的任何一种降低玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT表达的方法。
2.一种获得抗小斑病、炭疽病或茎腐病的玉米突变体株系的方法，其特征在于：根据CRISPR/CAS9技术原理，构建编辑载体命名为CRISPR-ZmNOMT，其中玉米柚皮素甲基转移酶基因ZmNOMT的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述编辑载体克隆区域ZmNOMT的两个靶点序列分别为gRNA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，对应于SEQ IDNo.1中第26-45位核苷酸；gRNA2，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，对应于SEQ ID No.1中第328-347位核苷酸；将CRISPR-ZmNOMT载体遗传转化玉米受体后，经过筛选、鉴定，获得抗小斑病、炭疽病或茎腐病的玉米突变体株系。
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