CN111676241B - Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻的方法和应用 - Google Patents

Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻的方法和应用，属于水稻育种技术领域，所述应用包括：敲除水稻的CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505。敲除CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505的水稻提高了对稻瘟病的抗性，水稻种子增大，千粒重增加，单株产量提高了20～25％。

Description

Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻 的方法和应用
技术领域
本发明属于水稻育种技术领域，尤其涉及Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻的方法和应用。
背景技术
固定生长的植物无法逃脱不利的生活环境，因此它们已经进化出复杂而精细的信号网络以应对逆境，从而保证自身的生长发育和后代繁殖。植物强大的免疫系统可以抵抗病原微生物的入侵。由于资源的限制，植物防御的激活通常是以植物生长缺陷为代价的，这就是所谓的“生长-防御”权衡。植物通过复杂的信号传导网络来调节“生长-防御”的平衡，其中蛋白磷酸化是信号传导网络的主要机制。
MAPK激酶级联反应在胞外受体信号向胞内传递过程中发挥着至关重要的作用。拟南芥的许多研究结果表明MAPK信号通路广泛参与了植物PTI和ETI信号防御。MPK3、MPK6和MPK4的激活是植物启动免疫反应的标志。水稻中的同源基因OsMPK5(也被称为OsMPK3)和OsMPK6是水稻抗病信号通路中的关键组成部分，稻瘟病的入侵能够快速激活OsMPK5和OsMPK6。通过RNAi沉默技术降低水稻中MPK5的表达水平可以提高水稻防御相关基因PR5、PR10的组成型表达，提高水稻对稻瘟菌和白叶枯的抗性，这些结果表明OsMPK5是水稻广谱抗性的重要负调控因子。近年来对OsMPK5的进一步研究结果表明，OsMPK5介导了水稻抗病抗逆信号通路与ABA和乙烯信号通路的交互作用。基于此可知，OsMPK5广泛参与了水稻生长发育、抗病、抗逆信号途径的传导，是调节几种信号通路的关键枢纽。
CDPK基因家族是植物和少数原生生物中特有的一组钙离子蛋白激酶家族，CDPK蛋白包含N-端结构域、蛋白激酶结构域、自抑制结构域和C-端钙调结构域(CLD)四个结构域。蛋白激酶结构域和钙调结构域同时存在于同一个蛋白的特性使得CDPK家族蛋白既能够接收外界Ca2+信号的变化又可以将Ca2+信号转化为磷酸化事件向胞内传递。鉴于Ca2+信号在植物整个生命周期过程中的关键作用，能同时解码和传递Ca2+信号的CDPK蛋白家族在植物生长发育、抗病、抗旱等信号通路中发挥关键作用。最近研究证明，拟南芥中AtCPK28参与调节拟南芥渗透压变化、茎节生长、钙离子爆发、乙烯合成以及防御相关激素JA和GA的体内平衡。而水稻中同源基因OsCPK18的生物学功能却少有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻的方法和应用，敲除Thr505位点的水稻提高了水稻的抗病性和产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了Thr505位点在水稻育种中的应用，敲除水稻的CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505。
优选的，所述水稻育种的性状包括提高水稻抗病性和提高水稻产量。
优选的，所述水稻抗病性包括水稻抗稻瘟病。
优选的，通过增大水稻种子提高水稻产量。
优选的，通过增加水稻千粒重提高水稻产量。
优选的，通过提高水稻单株产量提高水稻产量。
优选的，所述MPK5磷酸化调控CPK18基因的Thr505位点。
本发明提供了一种获得敲除Thr505位点水稻的方法，包括：将水稻中的CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505敲除，获得敲除Thr505位点的水稻。
优选的，所述水稻的品种包括粳稻。
本发明还提供了CPK18基因在水稻育种中的应用。
本发明提供了Thr505位点在水稻育种中的应用，敲除水稻的CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505。敲除CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505的水稻提高了水稻对稻瘟病的抗性，水稻种子增大，千粒重增加，单株产量提高了20～25％。
附图说明
图1为通过RNA干扰技术抑制CPK18基因的表达降低了水稻的种子大小和株高、分蘖数；其中A和B，CPK18-RNAi水稻RI-10和RI-13的株高和分蘖数较野生型显著降低；与之相反，CPK18组成型激活的CPK18-AC水稻AC-1和AC-2的株高和分蘖数较野生型略微提高；C和D，CPK18-RNAi水稻RI-10和RI-13的种子较野生型显著变小；
图2为通过RNA干扰技术抑制CPK18基因的表达提高了水稻抗病性；稻瘟病接种后的水稻叶片上的平均病斑数量，CPK18-RNAi水稻家系的较野生型降低了2-3倍；同时，检测平均每片叶片中的稻瘟病菌的生物量，CPK18-RNAi水稻家系的较野生型降低了3-5倍；综合图1和图2，得知CPK18-RNAi水稻材料的稻瘟病抗性显著提高，但是将CPK18沉默后却大大影响了水稻的生长发育和农业生产性状，因此无法作为可用的遗传育种资源；
图3为MPK5磷酸化CPK18的Thr505位点；A，CPK18蛋白序列中共有三个MPK5潜在的磷酸化位点，分别为T15P,T282P和T505P；图B，体外磷酸化实验；由于被磷酸化的蛋白在phos-tagSDS-PAGE胶中的迁移速率下降，因此可以用来分离磷酸化和非磷酸化的蛋白条带；在ATP存在下，MPK5能够磷酸化CPK18-DA(自磷酸化失活状态)蛋白(第三泳道)，也能够磷酸化CPK18-DA-T15D(第五泳道)和CPK18-DA-T282D(第六泳道)蛋白，说明Thr15和Thr282都不是MPK5的磷酸化位点；MPK5不能够磷酸化CPK18-DA-T505D(第四泳道)蛋白，说明只有Thr505位点为MPK5的磷酸化位点。C，这个磷酸化位点存在于所有CDPKgroupIV家族蛋白中并且周围蛋白序列也相对保守，说明MPK5磷酸化CDPKgroupIV家族蛋白的分子事件在植物界保守存在，具有广泛的生物学意义；
图4为精准基因编辑获得CPK18磷酸化位点Thr505敲除的基因编辑水稻CPK18-GE；图A，靶位点gRNA设计图示；剪刀表示Cas9导致的双链断裂位置，可以敲除MPK5的磷酸化位点Thr505(剪刀前T位点)；B，两个纯合突变的CPK18-GE水稻GE-3和GE-8的基因编辑情况及相应的氨基酸移码情况；图C，两个纯合突变的CPK18-GE水稻GE-3和GE-8的基因组测序结果；黑色下划线表示被编辑后的靶位点序列，红色下划线表示PAM序列；
图5为CPK18在C末端区域的基因组编辑不影响突变体CPK18-GE3和CPK18-GE8的蛋白质稳定性和亚细胞定位；A，蛋白质稳定性；NanoLuc标记的CPK18和两个突变体CPK18-GE3和CPK18-GE8分别转化水稻原生质体；蛋白的亮度用ImageJ进行了半定量，结果显示三者的蛋白稳定性没有明显差异；CBB染色凝胶作为上样对照；B，CPK18-YFP融合蛋白和两个突变体CPK18融合蛋白CPK18-GE3-YFP和CPK18-GE8-YFP的共聚焦显微镜图像；共聚焦图像显示三者均定位于细胞膜上，说明CPK18-GE3和CPK18-GE8的亚细胞定位与CPK18相同；
图6为基因编辑水稻的T-DNA free家系筛选；用Cas9-F和Cas-R一对引物扩增基因编辑水稻基因组中的Cas9基因片段，若未扩增到则为T-DNAfree家系；因此，GE-3的2和3家系和GE-8的1和2家系为T-DNA free家系，可作为潜在的优良育种资源；
图7为CPK18-GE两个家系GE-3和GE-8的稻瘟病抗性均显著高于野生型水稻；图A，CPK18-GE基因编辑水稻中防御相关基因PR5，Hin1和Chitinase11的表达水平较野生型水稻分别提高了约4-7倍，5倍和3倍；B，稻瘟喷施接种后的水稻叶片；图C和D，GE-3和GE-8水稻发病叶片中病斑大小和病斑数量均显著少于野生型水稻粳稻品种中花11(简称ZH11)；
图8为CPK18-GE两个家系GE-3和GE-8的产量潜能显著高于野生型水稻；图A，成熟期的CPK18-GE表型图片；B，CPK18-GE水稻的株高和分蘖数与野生型无明显差异；C，CPK18-GE水稻的种子表型；D，CPK18-GE水稻的种子长度和宽度均显著高于野生型；E，CPK18-GE水稻的单穗枝梗数与野生型无明显差异；F，CPK18-GE水稻的穗粒数与野生型无明显差异；G，CPK18-GE水稻的千粒重显著高于野生型；H，CPK18-GE水稻的单株产量较野生型提高了约20％-25％。
具体实施方式
本发明还提供了Thr505位点在水稻育种中的应用，敲除水稻的CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505。在本发明中，所述水稻育种的性状优选包括提高水稻抗病性和提高水稻产量，所述水稻抗病性优选包括水稻抗稻瘟病。本发明优选通过增大水稻种子提高水稻产量，优选通过增加水稻千粒重提高水稻产量，优选通过提高水稻单株产量提高水稻产量。在本发明中，所述MPK5磷酸化调控CPK18基因的Thr505位点。
本发明还提供了一种获得敲除Thr505位点水稻的方法，包括：将水稻中的CPK18基因的MPK5磷酸化位点Thr505敲除，获得敲除Thr505位点的水稻。
本发明优选将所述敲除载体利用农杆菌遗传转化方法转化到水稻中，使用含潮霉素的培养基进行筛选，获得敲除Thr505位点的水稻。在本发明中，所述水稻的品种优选包括粳稻。
在本发明中，所述敲除载体的构建方法优选包括以下步骤：
1)将L5AD5-F和CPK18-gR3-R合成L5AD5-CPK18片段，所述L5AD5-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述CPK18-gR3-R的核苷酸序列如SEQID No.2所示；
将CPK18-gR3-F和L3AD5-R合成CPK18-L3AD5片段，所述CPK18-gR3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述L3AD5-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
2)将所述步骤1)得到的L5AD5-CPK18片段和CPK18-L3AD5片段连接，得到预PTG片段；
3)将所述步骤2)得到的预PTG片段进行循环扩增，得到PTG片段；
4)将所述步骤3)得到的PTG片段经FokI酶酶切，得到酶切片段；
将pRGEB32载体经BsaI酶酶切、去磷酸化，得到酶切pRGEB32载体；
将所述酶切片段和酶切pRGEB32载体连接，得到连接产物，将所述连接产物转化感受态大肠杆菌，提取质粒，得到敲除载体。
在本发明中，所述PTG片段优选经过纯化后再进行酶切，本发明对所述纯化的步骤没有特殊限定，采用常规纯化步骤即可。
本发明优选使用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化。
本发明还提供了CPK18基因在水稻育种中的应用。
以下实施例使用到的引物序列如表1所示：
表1引物列表
Figure BDA0002566314090000051
Figure BDA0002566314090000061
注：Sequence(5’->3’)下划线表示BsaI的酶切位点，双下划线标注的序列为BsaI酶切后的粘端序列。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
MPK5磷酸化位点鉴定
重组蛋白的诱导和表达：
MPK5通常磷酸化底物的丝氨酸(Ser/S)或者苏氨酸(Thr/T)，并且依赖于脯氨酸(Pro/P)，因此MPK5的磷酸化位点必须为SP或者TP。分析CPK18的氨基酸序列发现，CPK18中仅存在三个可能的磷酸化位点，即T15P、T282P、T505P，如图3中的A所示。
1.将五个载体pDEST17-MPK5，pET28c-CPK18-DA(自磷酸化失活状态，将Asp178突变为Ala178)，以及在自磷酸化失活状态CPK18-DA的基础上突变各候选磷酸化位点的三个载体pET28c-DA-T15D(Asp178突变为Ala178，Thr15突变为Asp15)，pET28c-DA-T282D(Asp178突变为Ala178，Thr282突变为Asp282)，pET28c-DA-T505D(Asp178突变为Ala178，Thr505突变为Asp505)分别转化表达蛋白的大肠杆菌感受态pDEST17-MPK5转化BL21(DE3)pLysS，其余四个CPK18相关点突变的载体转化BL21(DE3)Codon RIL(Stratagene公司)。
2.挑选单菌落接种于约3ml含有抗生素的LB液体培养基中，37℃摇培过夜。
3.取0.5ml过夜培养的菌液接种至新鲜的200ml LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6左右。
4.加入IPTG诱导大肠杆菌中重组蛋白的表达。pDEST17-MPK5的菌液加入终浓度为0.01mM IPTG于16℃摇培过夜。而其余四个CPK18相关点突变载体的菌液加入1mM IPTG于37℃摇培4-6小时。
5.4℃12000rmp离心3分钟收集菌体，于-80℃保存过夜。
6.用20ml自行配制的Binding buffer(25mM Tris-HCl pH7.5，500mMNaCl,20mMImidizole，2mM PMSF)重悬菌体，轻摇使菌体完全融化促使大肠杆菌体内的溶菌酶表达裂解细菌，表现为菌液变得非常粘稠，因为大肠杆菌裂解释放了大量的基因组DNA所致。
7.用超声波破碎基因组DNA使菌液变得澄清，并4℃12000rmp离心30分钟沉淀菌体碎片，收集上清溶液。
8.用10ml自行配制的Binding buffer平衡His GraviTrap Column(GE公司)后加入收集的上清溶液。
9.每个His GraviTrap Column用20ml Washing buffer(50mM Tris-HClpH7.5，500mM NaCl,50mM Imidizole，1mM PMSF，1mM DTT)清洗，重力作用流尽。
10.加入10ml Elution buffer(50mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl,300mMImidizole，1mM PMSF，1mM DTT)洗脱目标重组蛋白，每1ml洗脱液收集一管，做好标记备用。
11.SDS-PAGE胶检测各不同Eppendorf离心管中的蛋白质量。
12.选择含目标重组蛋白溶液的组分，加入透析袋(Thermo,68100)中，在2L透析液(50mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl)中透析三次，每次4个小时更换一次透析液。
13.透析后的蛋白溶液用酶标仪测定蛋白浓度，保存于-80℃备用。
体外磷酸化反应：
His-MPK5为激酶，His-CPK18-DA等四个CPK18突变体蛋白为底物。蛋白磷酸化反应如下：25mM Tris pH 7.5，10mM MgCl2，5mM MnCl2，0.2mMATP并加入5μg His-MPK5激酶和20μg蛋白底物，室温3小时。然后加入SDS-sample buffer，终止反应。
蛋白的磷酸化水平使用Phos-tag SDS-PAGE的方法进行分析。由于被磷酸化的蛋白在phos-tag SDS-PAGE胶中的迁移速率下降，因此可以用来分离磷酸化和非磷酸化的蛋白条带。结果如图3中的B所示，第三泳道(CPK18-DA)中出现迁移速率下降的磷酸化蛋白条带，说明MPK5能够磷酸化CPK18-DA(自磷酸化失活状态)蛋白。同样的，第五(CPK18-DA-T15D)、六(CPK18-DA-T282D)泳道中也出现磷酸化蛋白条带，说明Thr15和Thr282被替换后，不影响MPK5的磷酸化；而第四泳道(CPK18-DA-T505D)未检测到迁移率变化的磷酸化蛋白条带，说明Thr505位点为MPK5的磷酸化位点。
通过对CDPK Group IV家族的蛋白序列比对得知，这个T505位点在所有CDPKgroup IV家族蛋白中保守，如图3中的C所示。这说明MPK5磷酸化CDPK group IV家族蛋白的分子事件在植物界保守存在，具有广泛的生物学意义。
实施例2
MPK5磷酸化位点敲除基因编辑水稻的获取
靶向敲除载体骨架为pRGEB32载体。选择gRNA序列并构建最终的基因编辑载体pRGEB32-T505。流程如下：
1.靶位点的选择。如图4中的A所示，CPK18的Thr505位点位于该基因基因的3’末端。CPK18蛋白的最后12个氨基酸为SRNVQTPRSVHRS*(SEQID No.21)，其密码子序列为：
Figure BDA0002566314090000091
Figure BDA0002566314090000092
选择位于AGG前面的5’-CACGC AATGTA CAAACT CCG-3’作为基因编辑的靶位点序列。预期Cas9将在T505和P506间引入突变，从而破坏这两个氨基酸序列，使之不能被MPK5磷酸化。
2.tRNA-gRNA片段的合成。将L5AD5-F和CPK18-gR3-R合成L5AD5-CPK18片段，所述L5AD5-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述CPK18-gR3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；将CPK18-gR3-F和L3AD5-R合成CPK18-L3AD5片段，所述CPK18-gR3-F的核苷酸序列如SEQID No.3所示，所述L3AD5-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；将得到的L5AD5-CPK18片段和CPK18-L3AD5片段连接，得到PTG片段。
3.基因编辑载体的构建。将PTG片段插入pRGEB32载体。PTG片段经FokI酶酶切，得到酶切片段；将pRGEB32载体经BsaI酶酶切、去磷酸化，得到酶切pRGEB32载体；将所述酶切片段和酶切pRGEB32载体连接，得到连接产物，将所述连接产物转化感受态大肠杆菌，提取质粒，得到基因编辑载体pRGEB32-T505。
CPK18-GE基因编辑水稻材料的获得主要分为以下几个步骤：
获得丢失磷酸化位点T505的基因编辑水稻
材料：基因编辑载体pRGEB32-T505利用农杆菌遗传转化方法稳定转化粳稻品种中花11(ZH11)，使用含有潮霉素的组织培养基筛选成功转入pRGEB32-T505载体的水稻，最终得到具有潮霉素抗性的基因编辑水稻20棵。将这20棵转基因材料移栽到土壤中培养至三叶期，每棵水稻剪取一段叶片用CTAB法抽提基因组DNA，用Cas9-F和Cas9-R为引物进行PCR检测，结果表明20株水稻均含基因编辑元件。
T0代植株基因型鉴定和结果统计：用跨T505靶位的引物gR3-F和gR3-R从以上20株水稻种扩增目标片段，PCR产物经Sanger测序鉴定各T0家系靶位点的编辑情况。结果表明，20株T0家系种T505靶位点均被编辑(表1)，基因编辑效率为100％，各家系基因编辑后靶位点序列见表2。
表2水稻突变体T0代测序结果
Lines Edited gene sequence<sup>a</sup>
WT TCA CGC AAT GTA CAA ACT CCG
3,5,10-14, 纯合突变，TCA CGC AAT GTA CAA A—CCG
8,9 纯合突变，TCA CGC AAT GTA CAA AC-CCG
1,2,4-7,15-20 杂合突变
a表中-表示缺失突变。
由结果可知，获得了-1bp和-2bp的移码突变水稻，分别改变了T505后面的7个氨基酸，获得了两种不同的CPK18末端氨基酸序列(图4中的B)。将含T505位点发生-1bp和-2bp两种不同移码突变的基因编辑水稻材料各选一个家系用于后续研究，包括CPK18-GE3(简称为GE-3)和CPK18-GE8(简称为GE-8)，其中GE-3水稻中CPK18在Cas9剪切位点前敲除两个碱基，而GE-8水稻中CPK18在Cas9剪切位点前敲除一个碱基，从而造成不同的移码突变使得CPK18-GE3和CPK18-GE8两个家系中的CPK18蛋白具有不同C末端氨基酸序列。如图4所示。
GE-3和GE-8突变不改变CPK18的蛋白稳定性和亚细胞定位(图5)。将GE-3和GE-8突变产生的CPK18等位基因(表示为CPK18GE-3和CPK18GE-8)与荧光素酶NanoLuc(19kD，可作为蛋白标签与蛋白融合)融合后在水稻原生质体中瞬时表达，结果表明两个等位基因与野生型CPK18蛋白均能正确表达且表现相同的蛋白稳定性。如图5中的A所示。将CPK18GE-3和CPK18GE-8与GFP融合后在烟草中瞬时表达，结果表明两个等位基因都与野生型CPK18蛋白一样定位于细胞质膜。如图5中的B所示。
T-DNA free基因编辑水稻筛选。为了获得无外源DNA的基因编辑水稻材料，在T1用Cas9-F和Cas9-R为引物进行了PCR筛选。结果如图6，共获得了xx无外源T-DNA的GE-3和GE-8家系，用于后续分析。
GE-3和GE-8两个基因编辑家系的抗病性鉴定
GE-3和GE-8提高了防御相关基因的表达。利用qRT-PCR，检测了PR5(AK241419)、Hin1(AK068115)和Chitinase11(AK059871)基因等病程相关基因的表达。
1.抽提土壤中生长15天的GE-3和GE-8两个家系T3代水稻幼苗叶片的RNA，RNA抽提流程如下：研钵中加入适量液氮将水稻叶片研磨成粉状，用冷冻的药匙将粉末加入到1.5mlRNase-Free Eppendorf管中，使用TRIzol(life technologies)试剂抽提，RNA抽提的操作按公司说明完成。
2.反转录合成cDNA。反转录流程如下：在1.5ml RNase Free管中加入100ng从原生质体中提取的RNA，加入1.5μl 10×DNase I buffer，0.25μl DNaseI(Takara，5U/μl)，补足DEPC-H2O至15μl，室温静置10min，以去除RNA中的DNA。再加入1.5μl RNase-Free EDTA(25mM)，70℃处理10min。处理后的RNA加入1μl dNTP(10mM)，1μl oligo-dT(100μM)，70℃水浴5min后，立即置于冰上。待冷却后中加入2μl 10x RT buffer(NEB)，0.5μl M-Mulv反转录酶(NEB，200U/μl)，0.5μl RNase抑制剂(NEB，40U/μl)，42℃反应1h，完成cDNA第一条链的合成。最后90℃水浴10min，失活反转录酶。最后将反转录所得的cDNA产物稀释20倍，作为后续定量PCR的cDNA模板。
3.定量PCR。以10倍稀释的cDNA为模板，以UBI10为内参基因，检测了xx、xx等x个基因的表达水平(基因引物见表1)。qPCR用10μl反应体系，包括以下成分：5μl 2×SYBR GreenSupermix(BIO-RAD)，0.2μlexon1-qF/exon2-qR(10μM)，4μl cDNA模板。qPCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃延伸1min，共40个循环。在BIO-RAD S1000型荧光定量PCR仪上进行qPCR反应。反应结束后，用Livak(2-ΔΔCt)法计算相对表达量(图7)。
实验结果表明，基因编辑水稻中PR5(AK241419)基因提高了4-7倍，Hin1(AK068115)基因提高了3-4倍，Chitinase11(AK059871)基因提高了2-3倍。因此得知CPK18-GE基因编辑水稻的防御相关基因表达水平显著高于野生型水稻。如图7中的A所示。
GE-3和GE-8两个基因编辑家系的抗病性鉴定
选择粳稻品种中花11(ZH11)水稻感病的稻瘟菌生理小种99-20-2，稻瘟菌孢子的培养基为燕麦番茄培养基，配方如下:番茄汁20ml，CaCO3 0.4g，琼脂2g，去离子水80ml。121℃高温高压灭菌后倒板使用。土壤栽培15天的水稻ZH11(野生型对照)，GE-3和GE-8各16棵，并设置三个生物学重复。稻瘟喷施接种步骤如下：用含0.5％吐温的去离子水稀释将稻瘟孢子稀释至2×105/ml，稀释好的稻瘟孢子用小喷壶均匀的喷施于土壤中生长15天的GE-3和GE-8两个家系的T4代水稻和野生型水稻ZH11并同时选取4片第四叶片进行离体稻瘟接种，在高湿度并避光的条件下处理24小时后，将水稻移到正常光照条件下生长，并持续保持高湿度环境培养7天后，计算水稻叶片上病斑数量和离体接种叶片的病斑大小。实验结果表明，GE-3家系和GE-8家系平均每个水稻叶片的病斑数量比野生型水稻平均每个水稻叶片的病斑数量分别降低了2倍和3倍；GE-3家系和GE-8家系水稻叶片上的病斑平均面积比野生型叶片上的病斑面积分别降低了2倍和3倍。因此得知CPK18-GE两个家系的稻瘟病抗性显著高于野生型水稻ZH11。如图7中的B-D所示。
GE-3和GE-8两个基因编辑家系提高了水稻产量
最后，考察了种植于武汉华中农业大学大田中的T4代成熟期水稻GE-3和GE-8的产量相关农艺性状。包括，株高、分蘖数、种子大小、千粒重、穗粒数、单穗枝梗数和单株产量。其中粳稻品种中花11(ZH11)为野生型。
表3各家系种子大小统计结果(平均值，n＝20)
Line 种子长度(mm) 种子宽度(mm) 种子厚度(mm)
ZH11 6.86±0.30 3.23±0.16 2.39±0.07
GE-3 8.23±0.30 3.60±0.10 2.38±0.09
GE-8 8.44±0.28 3.43±0.11 2.34±0.09
表4各家系农艺性状统计结果(平均值，n＝20)
Figure BDA0002566314090000131
据显示，GE-3和GE-8水稻的种子显著变大，千粒重增加，从而保证了GE-3和GE-8两个基因编辑水稻家系的单株产量提高了约20％-25％，如图8所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> Thr505位点在水稻育种中的应用和获得敲除Thr505位点水稻的方法和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc aacaaagcac cagtgg 46
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggtctcaa cattgcgtgt gcaccagccg gg 32
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggtctcca tgtacaaact ccggttttag agctag 36
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa caaaaaaaaa agcaccgact cg 52
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc a 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtaccacct cggctatcca ca 22
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacctgcag gcatgcacgc gctaaaaacg gactagc 37
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagaatgctg gcctctgcc 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctctctgat gggcttatcc cg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agatgaattt cgcaggctcc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcttcagtc ctacatgtcc a 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggtcagtaa tcagccagtt tg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaatacttg acgaacagag gc 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tacaacgtcg ccatgagctt ct 22
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgggcagaag acgacttggt agtt 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attgacgtgt tcgtgtcact gat 23
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttcccagcc gaggagttc 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acatgttccg cgtaggatac g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atatccgcga acgctctctg 20
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ser Arg Asn Val Gln Thr Pro Arg Ser Val His Arg Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcacgcaatg tacaaactcc gaggagtgtt cacagatcgt ag 42

Claims (7)

1.水稻的CPK18蛋白的Thr505位点在提高水稻抗稻瘟病或提高水稻产量中的应用，其特征在于，敲除水稻的CPK18蛋白的MPK5磷酸化位点Thr505。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过增大水稻种子提高水稻产量。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过增加水稻千粒重提高水稻产量。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过提高水稻单株产量提高水稻产量。
5.一种获得敲除水稻的CPK18蛋白的Thr505位点的水稻的方法，包括：将水稻中的CPK18蛋白的MPK5磷酸化位点Thr505敲除，获得敲除Thr505位点的水稻。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水稻的品种为粳稻。
7.水稻CPK18基因在提高水稻抗稻瘟病或提高水稻产量中的应用；所述CPK18基因编码的CPK18蛋白的MPK5磷酸化位点Thr505被敲除。
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