CN101037696B

CN101037696B - 一种水稻冷害基因及应用

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Publication number: CN101037696B
Application number: CN2006100185766A
Authority: CN
Inventors: 张启发; 李向俊; 吴昌银
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2026-03-16
Also published as: CN101037696A

Abstract

本发明公开了一种水稻冷害基因及应用，一种分离的水稻冷害基因的蛋白质，提供了这个基因的核酸序列、以及其蛋白序列。该基因失活可以导致水稻耐低温能力降低，同时该基因还影响水稻的正常生长发育，该基因的突变体表现为稍矮，分蘖减少，育性下降。对该基因进行超量表达可以提高水稻的耐寒性。低温胁迫实验表明，此基因在水稻耐寒育种中具有很好的应用前景。

Description

一种水稻冷害基因及应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。本发明利用T-DNA标签(T-DNA tagging)技术从水稻低温感突变体中鉴定并克隆了一种新的水稻冷害相关基因OsGPAT1，该基因失活可以导致水稻耐低温能力降低，同时该基因还影响水稻的正常生长发育，该突变体表现为稍矮，分蘖减少，育性下降。对该基因编码的氨基酸序列分析证明该基因所编码的蛋白是一个甘油-3-磷酸转酰酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)，该酶在植物抵抗低温胁迫的反应中起重要的作用。本发明提供了这个基因的核酸序列，以及其蛋白序列，同时还涉及该基因在水稻耐寒育种中的用途。低温胁迫实验表明，OsGPAT1基因在水稻的抗冻反应中起很重要的作用。OsGPAT1基因可以应用于水稻的抗冻育种，提高水稻优良品种的适应性，扩大其种植范围，促进其稳产、高产。

背景技术

植物在生长过程中会受到诸多环境因素的影响。温度是限制植物分布和作物产量的重要环境因素，低温会导致农作物的大规模减产。按照低温程度和受害情况，可分为冷害(chi1ling injury，零上低温对植物的伤害)和冻害(freezing injury，零下低温对植物的伤害)两大类，这两种情况都会对农作物的生产产生重大的影响。因此培育耐低温的农作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。

近年来对植物耐冷性分子机理进行了很多的研究，随着研究的不断深入，主要在以下4个方面取得了比较清楚的认识：1)植物的冷敏感性可以通过调节膜脂的不饱和脂肪酸水平得到调控，调节的途径是通过酰脂去饱和酶和甘油-3-磷酸酰基转移酶的作用；2)利用转基因技术在植物中超量表达抗氧化酶的基因，如编码超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)等基因，可望提高耐冷性；3)植物低温逆境信号转导的研究表明，ABA不仅是重要的低温逆境信号，而且可调节冷害下基因的表达，Ca²⁺是一个主要的第二信使，蛋白激酶途径也参与了植物冷害的信号转导；4)低温诱导的蛋白或酶类主要有脱水蛋白和热稳定蛋白。

植物对温度逆境的适应之一主要在于生物膜特别是质膜和类囊体膜的特性。植物的冷敏感性可以通过调节膜脂的不饱和脂肪酸水平得到调控，调节的途径是通过酰脂去饱和酶(acyl-lipid desaturases)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransfarase，GPAT)的作用。例如编码氨基磷脂移位酶的ALA1基因的表达导致重组酵母膜泡中氨基磷脂的转移增加，产生膜脂的非对称，使酵母突变体drs2的冷敏感性降低，同时拟南芥中表达反义ALA1则会使其冷敏感性增加。(王国莉等，植物耐冷性分子机理的研究进展，植物学通报，2003，20(6)：671～679)。

大量的研究表明植物生物膜中磷酯酰甘油(phosphate acyltransferase，PG)分子的饱和程度与植物耐低温能力密切相关，通过对甘油-3-磷酸转酰酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)的研究已经弄清了GPAT酶是磷酯酰甘油(PG)生物合成过程中的第一个酰基酯化酶，通过催化甘油-3-磷酸的Sn-1位的酰基化来起动甘油酯的合成，其对底物的选择性对决定PG分子中的不饱和程度起着关键性作用(Murata等，Composition and positional distribution of fatty acids in phospholipids from leaves of chilling sensitive and chilling resistant plants.Plant Cell Physiol.1982，23：1071-1079；Frentzen等，Specificities and selectivities of glycerol-3-phosphate acyltransferase and monoacylglycerol-3-phosphate acyltransferase from pea and spinach chloroplasts.Eur J Biochem.1983 Jan l；129(3)：629-36.)。不同耐低温植物中的GPAT酶对底物酰基具有不同的选择性，即耐低温强的植物其GPAT酶优先选择油酸，而对低温敏感的植物中的GPAT酶对棕榈酸和油酸具有相同的选择性。GPAT酶对底物的这种选择性差异，影响着植物生物膜中PG分子的饱和程度，从而决定了植物的耐低温性。把耐低温植物拟南芥中的GPAT基因转到对低温敏感的烟草中，得到了耐低温的烟草植株(Wolter等，Chilling sensitivity of Arabidopsis thaliana with genetically engineered membrane lipids.EMBOJ，1992.11：4685～4692)。将拟南芥的甘油-3-磷酸转酰酶cDNA转化水稻，转基因水稻提高了磷酸甘油非饱和脂肪酸的含量，也提高了低温下的光合速率和生长速率(Yokoi等，Molecular markers for resistance to Heterodera glycines in advanced soybean germplasm.Mol Bree，1998，4(3)：269～275；Ariizumi等，An Increase in Unsaturation of Fatty Acids in Phosphatidylglycerol from Leaves Improves the Rates of Photosynthesis and Growth at Low Temperatures in Transgenic Rice Seedlings.Plant Cell Physiol，2002，43(7)：751～758)。因此对GPAT基因进行遗传操作，对提高植物的耐寒性具有很重要的作用。

水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一，是全球近一半人口赖以生存的基本食粮，在我国有很大的种植面积，培育耐低温水稻品种对提高种植的适应性、扩大栽种面积、增加产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种水稻冷害基因OsGPAT1，该基因失活可以导致水稻耐低温能力降低，同时该基因还影响水稻的正常生长发育，该基因的突变体表现为稍矮，分蘖减少，育性下降。该基因可以应用于水稻抗冻育种，可以有效的提高水稻品种的抗冻性。本发明提供了这个基因的核苷酸序列和氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。本发明中的SEQ ID NO：2所示的蛋白质属於甘油-3-磷酸转酰酶，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸可以获得功能类似物。因此，本发明也包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少60％同源性的序列。

本发明的另一个目的在于提供一种水稻冷害基因在水稻耐寒育种中的应用。通过提高植物体内的OsGPAT1基因表达量来进行植物耐低温育种，以此来使植物的适宜种植范围扩大。

通过调节本发明所描述的基因OsGPAT1的表达，可以改变植物对冷的敏感性，这种方法切实可行。具体应用可以使用T-DNA插入的方法，或者使用其他使基因失活的方法来降低OsGPAT1的表达，以此来提高植物的对低温敏感性。通过超表达OsGPAT1也可以提高OsGPAT1的表达，以此来提高植物的耐低温的能力。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施。

一、水稻冷敏突变体Osgpat1的获得和鉴定。

本发明是使用T-DNA标签的技术进行基因的分离和克隆。使用农杆菌介导的遗传转化(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)得到了大量的有T-DNA插入标签的水稻品种中花11号株系，转化使用的载体是pFX-E24.2-R15(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J.2003，35(3)：418-27.)，然后通过田间种植筛选得到了水稻突变体Osgpat1。该株系的T₀代种子经过浸种、催芽后栽种到大田，得到T₁代植株，T₁植株按5寸×8寸的间距种植，按常规的水稻种植方法(王维金等，作物栽培学.1998，76-127.)进行田间管理。该突变体在田间正常条件下种植时表现为植株半矮、分蘖较少的性状，如图1所示。遗传学实验表明Osgpat1是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。

使用TAIL-PCR(Liu等，Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics 1995，25，674-681.)的方法分离得到了这个株系T-DNA侧翼基因组序列，采用BLAST分析方法(Altschul等，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms.Nucleic Acids Res.1997，25：3389-3402)进行序列分析表明这个株系的T-DNA插入在水稻第1染色体，插入位点所在片断在公共核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陆号为AP003442.2，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AP003442.2的部分核苷酸片断，通过序列分析发现，该株系中T-DNA的插入造成了一个甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因的失活。此基因的核苷酸即为SEQ ID No：1所示的核苷酸，其蛋白质序列即为SEQ IDNo：2所示的蛋白质序列。根据分离得到的侧翼序列在基因组中设计引物，所设计的引物位于插入位点两侧，通过PCR(polymerase chain reaction)检测验证了这个T-DNA插入位点序列和突变表型是共分离的，从而确定了就是这个基因的失活造成了这种突变表型的出现。

二、OsGPAT1基因的功能鉴定。

取插入位点附近3kb的基因组序列进行BLAST(Altschul等，Gapped BLASTand PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.NucleicAcids Res.1997，25：3389-3402)分析，发现OsGPAT1基因编码的蛋白质与甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因有较高的同源性。将这个基因的序列在日本全长cDNA文库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中进行搜索，找到了这个基因的全长cDNA，克隆编号是AK070880，这个全长cDNA有3618bp，功能预测是一个甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因。由于GPAT基因在植物对低温反应中起很重要的作用，因此对OsGPAT1基因的突变体进行了冷胁迫处理，此突变体相对于对照对冷害表现出了很高的冷敏感性。由此证明了此突变体正是由于OsGPAT1基因的突变造成的。为了更进一步的对OsGPAT1基因的功能进行分析，将OsGPAT1基因在水稻中进行了超量表达，发现OsGPAT1基因超量表达的植株耐寒性得到了很好的增强，冷胁迫实验表明，与对照相比，超表达的植株在冷处理后存活率提高了59.2％。

OsGPAT1基因可以应用于水稻育种，通过使用组成型启动子在水稻品种中超量表达OsGPAT1基因，可以得到抗寒性提高的水稻新品种，扩大水稻优良品种的种植面积和种植时间，为水稻的稳产、高产打下良好的基础。

本发明的优点有：OsGPAT1基因在植物对冷冻反应中起很重要的作用，该基因的克隆对研究植物对冷害反应的机理有很重要的作用。同时通过应用基因工程技术调控此基因的表达可以调控植物对温度的适应性、培育耐低温的农作物品种。可以将本发明应用于水稻育种方面，例如通过超表达等方法提高OsGPAT1基因在植物体内的表达量，可以得到耐低温的水稻新品种。

附图说明

图1.水稻突变体Osgpat1的表型图。左边是野生型，右边是突变体。

图2.OsGPAT1基因的结构和T-DNA插入位点示意图。起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出，黑色方框表示osGPAT1基因的编码区，白色方框表示了5’非翻译区和3’非翻译区。方框之间的线条表示内含子，T-DNA插入在第5个内含子内。a，b，c分别表示用来验证共分离的引物。

图3.检测基因型的结构示意图。a表示在T-DNA插入位点下游设计的引物，b表示在插入位点T-DNA上游设计的引物，c表示根据T-DNA末端序列设计的引物。在T1代植株中，若为T-DNA插入位点纯合单株，由于T-DNA片段为10Kb以上，因此a与b配对的PCR扩增为阴性，但b和c配对可以扩增得到一个0.8Kb的产物。若扩增位点为没有T-DNA的插入的野生型单株，由于没有c引物结合的位点，则只有a和b配对是可以得到一个1.0kb的产物。而对于T-DNA插入位点杂合单株，则在b和c配对以及a和b配对时都可以扩增得到产物。

图4.20株T1代植株的检测结果图。泳道1、2、17是T-DNA插入位点纯合突变体，而泳道3、4、6、7、8、9、10、12、13、15、16、18、19、20为T-DNA插入位点杂合体。植株5、11、14为野生型。

图5.低温胁迫试验图。将Osgpat1突变体和野生型种子浸种、催芽后在水稻土中种植约20天，待水稻秧苗长到3叶期，将其放到12℃处理3个小时，左边4株是野生型，右边4株是突变体。

图6.超表达实验所用pU1301载体图。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa)突变体osgpat1，原始野生型材料为“中花11号”粳稻品种。此突变体的获得是使用农杆菌介导的遗传转化得到了大量的有T-DNA插入标签的中花11号株系，转化使用的载体是pFX-E24.2-R15(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J.2003，35(3)：418-27.)，转化子通过筛选得到。转化植株当代为T₀代，T₀代种子经过浸种、催芽后种植得到T₁代植株，将此植株按5寸×8寸的间距种植于水稻田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。通过筛选得到了表型稳定的水稻突变体Osgpat1，该突变体表现为略矮，分蘖少，同时对低温非常敏感。

2、T-DNA插入侧翼序列的分离。

使用TAIL-PCR的方法分离得到了这个突变体的T-DNA侧翼序列。具体操作步骤如下：使用CTAB法抽提osgpat1突变体的总DNA，然后进行PCR反应。根据转化载体pFX-E24.2-R15的T-DNA左侧末端设计的嵌套式特异引物序列和引物在载体上对应的位置如下：(后面的数字表示在载体上的位置)

LSP2：5’-GAA GTA CTC GCC GAT AGT GGA AAC C-3’6701-6677；

LBT2：5’-ATA GGG TTT CGC TCA TGT GTT GAG CAT-3’6550-6524；

LBT3：5’-CCA GTA CTA AAA TCC AGA TCC CCC GAA T-3’6447-6420。

用于分离侧翼序列的简并引物及其序列为：

AD2a：5’-(AGCT)GT CGA(GC)(AT)G A(AGCT)A(AT)GA A-3’。

反应体系为：

第一轮：

DNA模板 1.0μl；

10×PCR buffer 2.0μl；

2mM dNTP 2.0μl；

25mM MgCl₂ 2.0μl；

10μM LSP2 0.2μl；

100μM AD2a 0.2μl；

Taq酶(rTaq Takara公司) 1U；

加ddH₂O至 20μl。

第二轮：

DNA模板 1.0μl；

10×PCR buffer 2.0μl；

2mM dNTP 2.0μl；

25mM MgCl₂ 2.0μl；

50％甘油 2.0μl；

10μM LBT2 0.2μl；

100μM AD2a 0.2μl；

Taq酶(rTaq Takara公司) 1U；

加ddH₂O至 20μl。

第三轮：

DNA模板 1.0μl；

10×PCR buffer 2.0μl；

2mM dNTP 1.5μl；

25mM MgCl₂ 1.2μl；

50％甘油 2.0μl；

10μM LBT3 0.2μl；

100μM AD2a 0.2μl；

Taq酶(rTaq Takara公司) 1U；

加ddH₂O至 20μl。

反应程序按照Liu的方法进行。反应完成后，取第三轮反应产物5μl在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测。挑出有有效扩增的剩余产物5μl用去磷酸化酶(SAP，Takara公司)和核酸外切酶(ExoI，NEB公司)消化，消化产物取2μl使用美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)进行测序反应，反应产物使用DNA自动测序仪进行序列测定(ABI377 Sequencher)，测序引物序列和在载体上的位置为：NTLB5 5’-AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA-3’6437-6418，具体操作按操作手册进行(PE公司)。得到序列后，采用BLAST分析方法(Altschul 等，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res.1997，25：3389-3402)将这条侧翼序列与公共核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色体位置的水稻基因组序列进行比较分析，定位结果发现这条侧翼序列定位于水稻1号染色体，所在片断在GenBank中的登陆号为AP003442.2，插入位点在这一段核酸序列中是150976，日本晴BAC克隆OSJNBa0022P13含有此部分核甘酸片断，取插入位点附近的10kb核甘酸采用BLAST分析，发现这个T-DNA的插入造成了一个甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因的失活。这个基因的核苷酸即为SEQ ID No：1所示的核苷酸，其蛋白质序列即为SEQ ID No：2所示的蛋白质序列。

所得到的侧翼序列：

tggccgttattagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtc

taagcgtcaatttatttacacggcatctctgcattaccgcatggaggaaa

ggaagaaagaaagggaaagcaagggccaccgtgggtctggcaggcacaga

cagcaccagctctgacgttttacgcgccagacgggcgatctccttcaatg

cggccgggacaaggcttgaattctcaccaaacaaccgtaaataatggagc

cagccagccggccggacggactgactcgaccgtggcatactggcatgagt

gaatccacgcattcaatccggcgggccacgggcgagtaaaaaccatcggc

ttccttccatgctctggctctgcccgcctccagattccttttcttatctt

tcgaccgagctttgcagttgttaagcttcaggtgaggatctagtatgtgc

gacgtagacgttttgtgagttctgataatgaccttgatccttattattag

tttactgattaaggatgttggtggaacagagcgacccggtcagtgcagga

agcttaaactgggtttcgcataatgggctgagcacatctacagatcagtg

tcataaatggcctgacatgactatacacccatgctgatcgcgtgctcgac

cactgtgcatactctactctgatctgaatcactctactctgatctgaaac

tctgcatgatcgtcagatgcagattatagtagcggtgtcattgcgtcgaa

ct

3、T-DNA插入侧翼序列与突变表型的共分离检测。

为了研究T-DNA的遗传分离，将T-DNA标记的水稻T₁代植株进行田间种植，并且进行了基因型的检测。从总共20株T₁代的幼嫩叶中提取的基因组DNA(CTAB法)用作基因型分析，以确定它们的纯合或杂合性。PCR反应条件：先94℃3分钟变性，然后94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟，总共进行35个循环，最后72℃7分钟延伸。下述引物a、b和c用于PCR反应。

引物a(OsGPAT1基因特异性反向引物)：

5’-CCCATTATGCGAAACCCAGT-3’

引物b(OsGPAT1基因特异性正向引物)：

5’-CGCCATGTACGCCAAACCTA-3’

引物c(T-DNA边缘特异性反向引物)：

5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’

如图2的示意图所示，引物b是位于OsGPAT1基因内含子的正向引物，引物a是来源于OsGPAT1基因内含子的反向引物。引物c是位于T-DNA区域的末端引物。T1代纯合植株只有引物b和c组合可以得到一个0.7kb的PCR片段，这是因为通过引物a和b组合扩增由于片段太大而不能扩增DNA片段(10Kb以上)(图3)。野生型植株由于在基因组中没有T-DNA插入，因此能够利用引物a和b的组合来得到一个0.9kb的PCR片段，而不能有引物b和c组合的PCR片段。杂合的T1代植物则可以分别通过bc和ab的组合来得到0.7kb和0.9kb的PCR扩增物。

实验结果如图4所示。在基因型的检测中发现，泳道1、2、17是T-DNA插入位点纯合单株，而泳道3、4、6、7、8、9、10、12、13、15、16、18、19、20为是T-DNA插入位点杂合单株，植株5、11、14为不含T-DNA插入的野生型单株。在进行田间种植时发现，T-DNA插入位点纯合单株，也就是1、2、17这几个单株在田间出现了半矮，分蘖少的田间表型，而其他的植株都表现出正常的表型。这个结果证明T-DNA插入与突变表型共分离，而且突变体是由于这个T-DNA插入造成的单位点隐性突变。

将T₁代植株的子代种植得到T₂代，将T₂代植株再次种植到田间进行表型与T-DNA共分离的分析，分析发现T₁代纯合突变体的子代(T₂代)不再分离，表型一致，T₁代杂合突变体的子代(T₂代)出现了正常植株和突变植株，正常植株和突变植株的比例是3∶1，使用同样的方法进行PCR检测，检测结果表明T-DNA的插入与突变表型仍然是共分离的。由此证明，这个突变体是由于这个T-DNA插入造成的单位点隐性突变。

4、基因的分析。

根据BLAST(Altschul等，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res.1997，25：3389-3402)分析结果，发现OsGPAT1基因编码的蛋白质与甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因有较高的同源性。将这个基因的序列在日本全长cDNA文库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中进行搜索，找到了这个基因的全长cDNA，克隆编号是AK070880，这个全长cDNA有3618bp，功能预测是一个甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因。这个全长cDNA的序列如下：

GGCGGACCCAACTAGGGCGGCACGCCGCCGGCCGCCCCAAGGGCCAAGAGGCTTCCTCCG

CGAGTCCGCCTCCGCCTCTCTCCTCCTCGGCCGGCAACACGCCATGATGACGCCAACACG

ACGGCGGCCGACCAATCTACACTCGGAGTCCGGCGAGTTCGTGTAGATTTCTATTGGGGG

ATGCAGAACCACTATTCCTTTCCTCTATGGTACTGGCCTGCTCATATTTATTCACCCTGA

ACCTGCAAGTTTTCAGTAATCAGTTTGCACGATTACTAAGACTTGTTTTAATTGTTATGC

TGGTGCAACCTAGACCTGGTATATATGTTGCCCAACAATCATGTCATAACTGTGACATGT

AAAGAGTGTCCATTATGAACTGCTTAATTTGTCAGCATGATAACGAAATTTTGTTTTCTT

CCCAACAAAAAGTTGGGGGCGTCACTCTTTTTCCAGTTTCTTCACTGCCAAGGAGCAGAG

TTAAAGGTAGACTTGGAAATTGACAGTGACATATCAGAATTCAGAGCATAAATCCAAACA

GCAATATTTATTATGGTTGTTGAATGGGTGCTGATGTGGAACTAAAGCAAACGATGCCAT

TAGAAGAACTACAAAAATATCTATTAGTTTCTTTTCAAAGAATTCACAATACTGTTGCTG

CGGTGATTGAGAATTGGGGCAATGTTCAGAACAGATGGCCTTGATCATGTTTGAATGGAG

ACGTCGATTCATCTCCCAGCTTCTCAACTGACTACATGGCTTCGATAATGTTCGAAGATG

GGATCCATAGAGGCGCACCATCGTGTATCAGACATGTTGGATATTACTAAGAAGATAATA

GGAGCAGTATTGCAAATTTGCCACATCGAACCAAGTACTGCTGTAAAATTTCTATCTTCA

TTCTGCCGTATGTTAAAAAATACTCTATCTTGCAGAATAAACACAAATACGCAACTCAAG

CAGGTAAGTTGTAAGAGTTTCCCTTTCTGGTGGAGAGTAAACTTTTGCAGAGGTTCAACT

ATACCATATTTTCTATCATGCGGTTCTTCAGATTTCAGTACAGTTGAAAGTTGCCAAAAC

ACCACCAGAACATCAGAAACAACGACGGTTGTTGAATGAGACGTTGAAGTTTGCCTTTGT

GCACATTCTGCCGCAAAGGATCTGTTCAGCCGCGAGACCTGTATGTTTTACTTATTTCAG

CTTATGGAGGCCTATTCTTTTGAGCTAATCGTTGACGGATTCCCAAGATCCTAAATGCTG

TCTGGTACTTGGTTGACTCTTGCACCTGCTCCATGACGAAGGTAACGAGTGGCTACGTAC

GCCGTGGCCGTGCTAATCAATGGGCGAGCTCTGTGAAGAAGCTAACTCCCAACCAACTAT

TCCAACTCGGTTATTAAAGCCAATGGTAATCGCCCAACGCTGCATGCTGCACTTTACCCT

TGTAAAACTGTGAGCGTTTTCCTTTGGTGGATAGAACAGTTGGGATGCGATGCACGGGGA

AAAGGGAATTGCAGACACGCCAGAAAGGCAGAGACATTGCCGGTATCTATCACGTGAAAA

TGTGATGCTGCAACTTGTCCGTCCCATGTATGAATTCAACATTTTGGGTGAGAAAACATG

TTTTTGCTGTTGTTTACGTAGCTTACCGCAGGGATTACCTCCTGCGTGTTAGACTGCACC

AGTCAAGAAAACCCACTACGTTACGTGAAGCTAGCAGCATCGATCGCACTAGTGTCGCTC

TCTGGAAGTAATAGCCTCTTAAGTTAGCTGCGAGCTAAGCCTGCAATTATACACCGTCTC

CGCCTCCCCTTCCCATGTCACAACCAACCTTGGATATATTAACTCCCTCTCCCGCTGCTC

CACTCCACTCCCACACCATCAGCGAGCACCTAGCGGTCGCATCGCTAGCTGCCATCTCCT

GGTGAGATCCATCGAGACGCCCGGCACGACGACGATGGTGTCGCGGAGGTTCAAGCCCGT

GGAGGAGTGCAGCTCGGATGGGAGGTCGGAGCAGACGGTGGCCGCCGACTTCGACGGCAC

GCTGGTCAGGTCGCGGAGCGCCTTCCCGTACTACCTCCTCGTCGCGCTCGAGGCCGGCAG

CGTGCTCCGCGCCGTCGTGCTGCTGCTGTCCGTGCCGTTCGTCTACGTGACCTACATTTT

CTTCTCCGAGTCGCTGGCCATCAGCACGCTGGTGTACATCTCCGTGGCGGGGCTCAAGGT

GAGGAACATCGAGATGGTGGCGCGGTCGGTGCTGCCCAAGTTCTACGCGGAGGACGTGCA

CCCGGAGAGCTGGAGGGTGTTCAACTCCTTCGGCAAGCGGTACATCATCACGGCGAGCCC

CAGGATCATGGTGGAGCACTTCGCCAAGACGTTCCTCGGCGCCGACAAGGTGGTCGGGAC

GGAGCTGGAGGTCGGCAAGAACGGCAAGGCCACGGGGTTCATGGTGAAGCCCGGAGTGCT

CGTGGGCGACCACAAGAGGCAGGCCGTCGTCAAGGAGCTACGCGACGCGGTGCCCGACGT

CGGCTTGGGCGACAGGGAGACGGATTTCGACTTCATGTCCATATGCAAGGAGGCCTACCT

CGTGACATCAAGGAAGTACAGCGCGGTGCCCAAGAACCAGCTGCTGAGCCCACTCATCCT

CCACGACGGCCGCCTCGTGCAGCGTCCGACGCCGCTGGTGGCGCTCGTCACCTTCCTGTG

GATGCCGTTCGGCTTCGCGCTCGCGCTCCTCCGCGTGTACGTCAACCTGCCACTCCCGGA

GCGGATCGTCTTCTACACCTACAAGCTCATGGGCATCCGCCTCATCGTGAAGGGCAACCC

GCCGCCTCCCCCCAAGAAGGGACATCCTGGCGTCCTCTTCGTCTGCAACCACCGCACCGT

GCTCGACCCGGTTGAGGTCGCCGTGGCGCTGCGCCGCAAGGTCAGCTGCGTCACGTACAG

CATCTCCAAGTTCTCGGAGCTCATCTCGCCGATCAAGGCCGTCGCGCTGTCGCGGGAGCG

CGAGAAGGACGCCGAGAACATCCGGCGGCTGCTGGAGGAGGGCGACCTGGTGATCTGCCC

CGAGGGCACCACCTGCCGCGAGCCGTTCCTGCTGCGGTTCAGCGCGCTCTTCGCCGAGCT

CACCGACCGCATCGTGCCGGTGGCGATCAACACCAAGGAGAGCATGTTCCACGGCTCCAC

CGTGCGGGGCTTCAAGCTCATGGACCCCTACTTCTTCTTCATGAACCCGCGGCCGACGTA

CGAGATCACCTTCCTGAACCAGCTGCCCAAGGAGCTCACTTGCAGCGGCGGCAAGTCGCC

CATCGAGGTGGCCAACTACATCCAGAAGACGCTCAGCGGCCAGCTCGGCTTCGAGTGCAC

CGCCATAACGCGCAAGGAGAAGTACAGCATACTCGCCGGGACCGACGGCCGCGTCCCTTC

CAAGAACAAGGAGAAGGAAAAGAACTAGCGAGTCACAGCCTCCTATCGATCGGAGTACTC

CGTATTCGCCCAGCCGACTAGTGTCACTCATGGCTTCTATCTATTGTTTACGATTTATTG

TTGTTTTTCAAGAAGTTGGTAAATTACATATTGTTTCCGAGAAGGATCTCCTTGGAAAGA

ATTCTTTTGCACTTCTTT

实施例2：突变体与对照苗期低温胁迫试验

将Osgpat1突变体和野生型种子于25℃浸种3天、37℃催芽2天后在水稻土中种植约20天，待水稻秧苗长到3叶期，将其放到12℃处理3个小时，20株突变体中有17株出现了很明显的变化，叶片卷曲，枯萎严重，而野生型20个单株则没有什么变化(图4)。这说明OsGPAT1基因的突变对植物抗冻性方面产生了很重要的影响。

实施例3：对Osgpat1基因的超表达

进行超表达所用载体是我们实验室构建的pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferringresistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37：517-527)基础上改建的(图6)，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。

设计PCR引物gpatoef和gpatoer把OsGPAT1基因的完整ORF从水稻基因组中扩增出来，在PCR引物上分别加上Kpn I和BamH I的酶切位点。

gpatoef和gpatoer的序列分别是：

gpatoef：CGCGGTACCAGCTGCCATCTCCTGGTGAG

gpatoer：CTCGGATCCCTAGTCGGCTGGGCGAATAC

PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3单位rTaq酶(Takara公司)，加ddH2O至20μl。反应程序为：94℃变性3min，94℃1min、55℃1mins、72℃4min、35cycles，72℃延伸10min，扩10管，收集PCR产物于1.5ml离心管，加等体积24∶1氯仿异戊醇(v/v)，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500ul 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75ulddH₂O溶解。把纯化的PCR产物及pU1301载体分别进行双酶切，酶切体系是：总体积100ul，PCR产物或载体质粒75ul，限制性内切酶BamH1 30U(Takara公司)，限制性内切酶Kpn1 30U(Takara公司)，10X K buffer 5ul，ddH₂O 16ul，37℃酶切5小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加10ul ddH₂O溶解。连接反应：10ul酶切产物全部用于连接反应，载体0.5ul，2U T4 ligase(NEB公司)，5X buffer3ul，总15ul体积，连接24小时。取1ul连接产物，电压18000V，电转到大肠杆菌DH10B，加800ul LB，复苏45分钟，取200ul涂于含卡那霉素的LA平板，37℃，过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，按前面所述体系进行PCR检测，挑取PCR阳性克隆，按前文所述方法进行双酶切验证，得到外源大小符合的质粒，将此质粒命名为pUGPATOE，这个质粒包含了完整的OsGPAT1基因的ORF区段。将这个质粒20ng通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中。采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)将超表达基因导入正常的中花11水稻品种。同时使用pU1301空载体按此方法转化正常中花11水稻作为对照。

农杆菌介导的遗传转化步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)组织培养的溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

(3)培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 20g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蛋白胨 2.5g

酵母粉 1.25g

氯化钠 2.5g

琼脂粉 3.2g

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20-25℃保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

4.1愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养5周，温度25-27℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25-27℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度25-27℃。

4.4农杆菌培养

(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

4.7分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(2000lx)下培养，温度26℃，5-7周。

4.8生根

(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

在转化过程中共得到了186块转pUGPATOE超表达基因的抗性愈伤组织，对这些抗性愈伤进行分化，最后有95块长成水稻小苗，移栽后有86株得以成活。对这86株超表达植株进行PCR检测，结果PCR阳性植株为72株。另外还得到了转pU1301空载体的转基因植株48株。从这70株PCR检测阳性植株中取40株进行低温胁迫实验，同时取30株转pU1301空载体的转基因植物作为对照。低温胁迫实验按如下方案进行：将生根得到的3叶期大小的超表达转基因植株和对照都放置于8℃冰柜中处理30小时，然后放于22℃恢复5小时后观察植株对低温处理的反应。观察结果表明，在40株转pUGPATOE阳性的水稻转基因植株中有29株表形没有发生明显的变化，而在30株转pU1301空载体的对照转基因植株中有26株出现了叶片卷曲、枯萎的现象。与对照相比，超表达的植株在冷处理后存活率提高了59.2％。因此通过冷胁迫实验表明，在OsGPAT1基因超量表达的植株中，水稻的抗寒性出现了很明显的增强。

SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>一种水稻冷害基因及应用

<130>一种水稻冷害基因及应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7919

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(4809)..(5423)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(6871)..(7746)

<223>

<400>1

tgcggaccca actagggcgg cacgccgccg gccgccccaa gggccaagag gcttcctccg 60

cgagtccgcc tccgcctctc tcctcctcgg ccggcaacac gccatgatga cgccaacacg 120

acggcggccg accaatctac actcggagtc cggcgaggta actaaaaccc ctagttgctc 180

ttccctctct cggtacaatc taacacggca agttcgagcc gcgttttcca gatctcgatt 240

tttatttttt ttgaaaccga gccagacttt gctgatgttt taagcagaga gaaagttatt 300

tacagatctc gaattctcga ttccctgctg aaatagtcta ggcaatttga tggagtacta 360

gtaacttcac cggatactct caccaatacg gcaaagtttt gtacggtcgc ccgtttcgtt 420

tgcaagtact ccacttgtcg cctagtatat gttttctgcc gggtcggccg aaaggaacgg 480

cgaccaaatt tcattaagat ggggacgcct agtatatgtg aagcagtcat ttttcaccaa 540

gtattagcat cccctagtcc tctctagtcc ttgaaatgcg tatttgaatg tgtggttgcc 600

cttccgcttg attgtgaagc ttttccgtgt ttggaaaaaa aaatacatgt tgaaatttgt 660

tgatcattct gattttctca acctaactct tatgcaattg cccgtatgaa ctgcaaggtt 720

tagtcagggc gcctgcgcct cgtttccctg ttagttacac cggcccacaa cttgcttagt 780

ttccatgtga gaatttgctt gcgaaaaagt gaaagtcctt ttcctccctg cttttgcctt 840

tcatttcctt gtgacgatag acaagatttt ttccagtcgt gtgcttgttt tggattattg 900

caacttttgt ggataataaa gccgctactt gtaagtaaac gaaaaaaaaa tgttggctca 960

gcatgaacac acgtttgttg ttccttcaat tttctttttg taccaagatg tttcctgaag 1020

ttagcatggc aagtaggaaa tactgatctg tcttgacgtt gattcttcta tgaacattgt 1080

atcgatgaac atccaggttg cctccaatct gtcgcctcta atctgtatgc atcatcttaa 1140

gcaaactatc acttctaatc tttagctaaa atcgttaaaa cgaccttttg ttttctgtgt 1200

tctgtggagg cttcaggctt gtatagttgt atttaggacc actgatctta aaatcttcat 1260

aacatatgtt tatgagtaca tttccttcat tggaccacca agcattaatt ttgataagct 1320

tttgcaatgc agtttttcca tcactgtttc tctataattt cattctccta tactacagaa 1380

actaccagct cattgagaca atgctaaagt tatcctaagg agttgactga ctagaaattt 1440

gtaatgtact acagttcgtg tagatttcta ttgggggatg cagaaccact attcctttcc 1500

tctatggtac tggcctgctc atatttgtaa gtatgctaca attcttagac tagaagacat 1560

gtgcctttca acattctcgt ggcattgaag aatacttgtt tcacaatatc aacatctaac 1620

aaactgtcta acaactcaag gaaagggtaa agcatttggc tacgagaagt ttctgtttgg 1680

agggtaatgt ataagtgatt ctgtactaaa agaaaataga tcgtcgcgtt gtttttcttt 1740

aaagttgcta gagagtgact gaagatttag agatcctctc attaatgtgg aaaaatgagt 1800

agcaaagtta gatggattaa caagggctca gtagttcgtt ttcatctgcg actctgcgtc 1860

gggtggagta atactaatag atatgcgtag gcactatgga ggggtcaaaa agtactatta 1920

ttaggacctc caatataacg ccaaatagac tcattactcc taaggacaaa tgaacataca 1980

aaagggataa gcaaagcaga aatgatggga aaaattacag tgagtgcgta actcctgtat 2040

gtactcagaa tttaatcctt gctcagggtt gagtcattta attatgcatc cttttgtgtt 2100

gcagattcac cctgaacctg caagttttca gtaatcagtt tgcacgatta ctaagacttg 2160

ttttaattgt tatgctggtg caacctagac ctggtatata tgttgcccaa caatcatgtc 2220

ataactgtga catgtaaaga gtgtccatta tgaactgctt aatttgtcag catgataacg 2280

aaattttgtt ttcttcccaa caaaaagttg ggggcgtcac tctttttcca gtttcttcac 2340

tgccaaggag cagagttaaa ggtagacttg gaaattgaca gtgacatatc agaattcaga 2400

gcataaatcc aaacagcaat atttattatg gttgttgaat gggtgctgat gtggaactaa 2460

agcaaacgat gccattagaa gaactacaaa aatatctatt agtttctttt caaagaattc 2520

acaatactgt tgctgcggtg attgagaatt ggggcaatgt tcagaacaga tggccttgat 2580

catgtttgaa tggagacgtc gattcatctc ccagcttctc aactgactac atggcttcga 2640

taatgttcga agatgggatc catagaggcg caccatcgtg tatcagacat gttggatatt 2700

actaagaaga taataggagc agtattgcaa atttgccaca tcgaaccaag tactgctgta 2760

aaatttctat cttcattctg ccgtatgtta aaaaatactc tatcttgcag aataaacaca 2820

aatacgcaac tcaagcaggt aagttgtaag agtttccctt tctggtggag agtaaacttt 2880

tgcagaggtt caactatacc atattttcta tcatgcggtt cttcagattt cagtacagtt 2940

gaaagttgcc aaaacaccac cagaacatca gaaacaacga cggttgttga atgagacgtt 3000

gaagtttgcc tttgtgcaca ttctgccgca aaggatctgt tcagccgcga gacctgtaag 3060

tatcacggta ttatgagaga aaagaactct tttgagcatt gtagtagtgt tccttgaatt 3120

ttatttttca attattccct attattttct gcaggtatgt tttacttatt tcagcttatg 3180

gaggcctatt cttttgagct aatcgttgac ggattcccaa gatcctaaat ggtatgtttt 3240

ttgcaaaaga ctttcttcat cataatttct ttgagaaatt tttgcaacaa aatttccact 3300

ttctaatatt aaattcattt gtttgtgccc caaataattg tcataaactc agtttcatcc 3360

atcatctata tagaaatggc ctagtacaga tacagttgct gtaatgcgct gcgcttgatt 3420

ttaagttgct tggaaaacta aaacttgtat tcattataac ttgttccatt gttatggtta 3480

aggaaacatg ttatctaact gtcatgcttc tctcaattgt ttcaaattcg ggatgcaata 3540

atgttttttt acactgaaga ttaattttga ggaaaattga tggtggtttg cgttttactg 3600

tactactatt actattacaa ttttggagta aacaatgcaa atactagtgt ttgtctaacc 3660

gaccacgtct ttactctgtt ggttttacaa atgtatcata aaacatcatg acttgtgtag 3720

actttatact gcctctgttc ctaaaatgtt gtcgccattg gtaactaatt tagtttcgat 3780

ccctaataat tagatggtta ggctacatga aaatccctaa aatcccttat attttaggat 3840

cgggggagta cctactatat gcaactaata aggtagtata cccctgatat ccatttctat 3900

caccatccgg ttacatcccc agcattcagt aaaaattcag cattcactgc tacactactt 3960

atacacactg gatgcagcag aaacgaaaaa agaataccat cttcttttcc tgtccactct 4020

ggcgtccggc ctataggaga tcttgaaatc ataccgtgag gagtattgag catgtgattc 4080

tattgtggtt gtgatgagcc tgctgtttca gctgtctggt acttggttga ctcttgcacc 4140

tgctccatga cgaaggtaac gagtggctac gtacgccgtg gccgtgctaa tcaatgggcg 4200

agctctgtga agaagctaac tcccaaccaa ctattccaac tcggttatta aagccaatgg 4260

taatcgccca acgctgcatg ctgcacttta cccttgtaaa actgtgagcg ttttcctttg 4320

gtggatagaa cagttgggat gcgatgcacg gggaaaaggg aattgcagac acgccagaaa 4380

ggcagagaca ttgccggtat ctatcacgtg aaaatgtgat gctgcaactt gtccgtccca 4440

tgtatgaatt caacattttg ggtgagaaaa catgtttttg ctgttgttta cgtagcttac 4500

cgcagggatt acctcctgcg tgttagactg caccagtcaa gaaaacccac tacgttacgt 4560

gaagctagca gcatcgatcg cactagtgtc gctctctgga agtaatagcc tcttaagtta 4620

gctgcgagct aagcctgcaa ttatacaccg tctccgcctc cccttcccat gtcacaacca 4680

accttggata tattaactcc ctctcccgct gctccactcc actcccacac catcagcgag 4740

cacctagcgg tcgcatcgct agctgccatc tcctggtgag atccatcgag acgcccggca 4800

cgacgacg atg gtg tcg cgg agg ttc aag ccc gtg gag gag tgc agc tcg 4850

Met Val Ser Arg Arg Phe Lys Pro Val Glu Glu Cys Ser Ser

1 5 10

gat ggg agg tcg gag cag acg gtg gcc gcc gac ttc gac ggc acg ctg 4898

Asp Gly Arg Ser Glu Gln Thr Val Ala Ala Asp Phe Asp Gly Thr Leu

15 20 25 30

gtc agg tcg cgg agc gcc ttc ccg tac tac ctc ctc gtc gcg ctc gag 4946

Val Arg Ser Arg Ser Ala Phe Pro Tyr Tyr Leu Leu Val Ala Leu Glu

35 40 45

gcc ggc agc gtg ctc cgc gcc gtc gtg ctg ctg ctg tcc gtg ccg ttc 4994

Ala Gly Ser Val Leu Arg Ala Val Val Leu Leu Leu Ser Val Pro Phe

50 55 60

gtc tac gtg acc tac att ttc ttc tcc gag tcg ctg gcc atc agc acg 5042

Val Tyr Val Thr Tyr Ile Phe Phe Ser Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr

65 70 75

ctg gtg tac atc tcc gtg gcg ggg ctc aag gtg agg aac atc gag atg 5090

Leu Val Tyr Ile Ser Val Ala Gly Leu Lys Val Arg Asn Ile Glu Met

80 85 90

gtg gcg cgg tcg gtg ctg ccc aag ttc tac gcg gag gac gtg cac ccg 5138

Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Lys Phe Tyr Ala Glu Asp Val His Pro

95 100 105 110

gag agc tgg agg gtg ttc aac tcc ttc ggc aag cgg tac atc atc acg 5186

Glu Ser Trp Arg Val Phe Asn Ser Phe Gly Lys Arg Tyr Ile Ile Thr

115 120 125

gcg agc ccc agg atc atg gtg gag cac ttc gcc aag acg ttc ctc ggc 5234

Ala Ser Pro Arg Ile Met Val Glu His Phe Ala Lys Thr Phe Leu Gly

130 135 140

gcc gac aag gtg gtc ggg acg gag ctg gag gtc ggc aag aac ggc aag 5282

Ala Asp Lys Val Val Gly Thr Glu Leu Glu Val Gly Lys Asn Gly Lys

145 150 155

gcc acg ggg ttc atg gtg aag ccc gga gtg ctc gtg ggc gac cac aag 5330

Ala Thr Gly Phe Met Val Lys Pro Gly Val Leu Val Gly Asp His Lys

160 165 170

agg cag gcc gtc gtc aag gag cta cgc gac gcg gtg ccc gac gtc ggc 5378

Arg Gln Ala Val Val Lys Glu Leu Arg Asp Ala Val Pro Asp Val Gly

175 180 185 190

ttg ggc gac agg gag acg gat ttc gac ttc atg tcc ata tgc aag 5423

Leu Gly Asp Arg Glu Thr Asp Phe Asp Phe Met Ser Ile Cys Lys

195 200 205

gtaaatttga cgccccctca aactcatttt ttgctcatag taatagtact gtcgtgttga 5483

ttgttaattg cagtgatcaa gtcctgcgac gaattagtag tagcactgcc aattactggc 5543

aactacgaac tggttagacc atcttgtaca taaattccgt atagaatgct ctgtttattt 5603

cggaattact gcattccaaa caagaaacat gaaaattgga attaagtata gtctccatca 5663

cacatattac tttcataacg tggaattagc acatcagtta caattgattt ttgctatgac 5723

gaagctatga acaccgccta ctataaattc tgcaatctgt acaaacatgc agaggtttca 5783

gatcagagta gagtggtttc agatcagagt agagtatgcc acagtggtcg agcacgcgaa 5843

cagcaggggt gtatagtcat tgtcaggcca tttatgacac tgatctgtag atgttgctca 5903

gcccattatg cgaaacccag tttaagcttc ctgcactgac cggtcgctct gttccaccaa 5963

catccttaat cagtaaacta ataataagga tcaaggtcat tatcagaact cacaaaacgt 6023

ctacgtcgca catactagat cctcacctga agcttaacaa ctcgaaagct cgagcaaatg 6083

atcagaaaag gaatctggag gcgggcagag ccagagcatg gaaggaagcc gatggttttt 6143

actcgcccgt ggcccgccgg attgaatgcg tggattcact catgccagta tgccacggtc 6203

gagtcagtcc gtccggccgg ctggctggct ccattattta cggttgtttg gtgagaattc 6263

aagccttgtc ccggccgcat tgaaggagat cggccggctg gcgcgtgaga catcagagct 6323

ggtgctggct gtgcctgcca gatccacggc tgcccttgct ttccctttct ttcttccttt 6383

cttccagccg gtaatgcaga gaaccactga aataaatact gccattcatg gtcttgcccc 6443

ttctttccct tctccatggg acccgtcttt ctgtcactgc cccgggggta taacgaattt 6503

ctctcgtgga ggggaaatca cccatttatg ggcgccagtc ttgcagttgt tgcggtacag 6563

taatcgctgt acttctttac cactgctctg gtctactctc gcctattgat tggctgatac 6623

acgtcaactt aaatccaaca gtttaactcc gaaaaaacat aattttgatt aagcatgtga 6683

agatctgtca tctgtggaac catcagtagt ggactgtact gaattgtaat cgtggtagga 6743

tgtaggtttg gcgtacatgg cgagatgaac aagcatttat atattcgata aaataagaag 6803

tgatggtgat gctgtgattt ttgcatcagt gaagtgtttg taacatgcat gctgcgtgtc 6863

tgtgcag gag gcc tac ctc gtg aca tca agg aag tac agc gcg gtg ccc 6912

Glu Ala Tyr Leu Val Thr Ser Arg Lys Tyr Ser Ala Val Pro

210 215

aag aac cag ctg ctg agc cca ctc atc ctc cac gac ggc cgc ctc gtg 6960

Lys Asn Gln Leu Leu Ser Pro Leu Ile Leu His Asp Gly Arg Leu Val

220 225 230 235

cag cgt ccg acg ccg ctg gtg gcg ctc gtc acc ttc ctg tgg atg ccg 7008

Gln Arg Pro Thr Pro Leu Val Ala Leu Val Thr Phe Leu Trp Met Pro

240 245 250

ttc ggc ttc gcg ctc gcg ctc ctc cgc gtg tac gtc aac ctg cca ctc 7056

Phe Gly Phe Ala Leu Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Asn Leu Pro Leu

255 260 265

ccg gag cgg atc gtc ttc tac acc tac aag ctc atg ggc atc cgc ctc 7104

Pro Glu Arg Ile Val Phe Tyr Thr Tyr Lys Leu Met Gly Ile Arg Leu

270 275 280

atc gtg aag ggc aac ccg ccg cct ccc ccc aag aag gga cat cct ggc 7152

Ile Val Lys Gly Asn Pro Pro Pro Pro Pro Lys Lys Gly His Pro Gly

285 290 295

gtc ctc ttc gtc tgc aac cac cgc acc gtg ctc gac ccg gtt gag gtc 7200

Val Leu Phe Val Cys Asn His Arg Thr Val Leu Asp Pro Val Glu Val

300 305 310 315

gcc gtg gcg ctg cgc cgc aag gtc agc tgc gtc acg tac agc atc tcc 7248

Ala Val Ala Leu Arg Arg Lys Val Ser Cys Val Thr Tyr Ser Ile Ser

320 325 330

aag ttc tcg gag ctc atc tcg ccg atc aag gcc gtc gcg ctg tcg cgg 7296

Lys Phe Ser Glu Leu Ile Ser Pro Ile Lys Ala Val Ala Leu Ser Arg

335 340 345

gag cgc gag aag gac gcc gag aac atc cgg cgg ctg ctg gag gag ggc 7344

Glu Arg Glu Lys Asp Ala Glu Asn Ile Arg Arg Leu Leu Glu Glu Gly

350 355 360

gac ctg gtg atc tgc ccc gag ggc acc acc tgc cgc gag ccg ttc ctg 7392

Asp Leu Val Ile Cys Pro Glu Gly Thr Thr Cys Arg Glu Pro Phe Leu

365 370 375

ctg cgg ttc agc gcg ctc ttc gcc gag ctc acc gac cgc atc gtg ccg 7440

Leu Arg Phe Ser Ala Leu Phe Ala Glu Leu Thr Asp Arg Ile Val Pro

380 385 390 395

gtg gcg atc aac acc aag gag agc atg ttc cac ggc tcc acc gtg cgg 7488

Val Ala Ile Asn Thr Lys Glu Ser Met Phe His Gly Ser Thr Val Arg

400 405 410

ggc ttc aag ctc atg gac ccc tac ttc ttc ttc atg aac ccg cgg ccg 7536

Gly Phe Lys Leu Met Asp Pro Tyr Phe Phe Phe Met Asn Pro Arg Pro

415 420 425

acg tac gag atc acc ttc ctg aac cag ctg ccc aag gag ctc act tgc 7584

Thr Tyr Glu Ile Thr Phe Leu Asn Gln Leu Pro Lys Glu Leu Thr Cys

430 435 440

agc ggc ggc aag tcg ccc atc gag gtg gcc aac tac atc cag aag acg 7632

Ser Gly Gly Lys Ser Pro Ile Glu Val Ala Asn Tyr Ile Gln Lys Thr

445 450 455

ctc agc ggc cag ctc ggc ttc gag tgc acc gcc ata acg cgc aag gag 7680

Leu Ser Gly Gln Leu Gly Phe Glu Cys Thr Ala Ile Thr Arg Lys Glu

460 465 470 475

aag tac agc ata ctc gcc ggg acc gac ggc cgc gtc cct tcc aag aac 7728

Lys Tyr Ser Ile Leu Ala Gly Thr Asp Gly Arg Val Pro Ser Lys Asn

480 485 490

aag gag aag gaa aag aac tagcgagtca cagcctccta tcgatcggag 7776

Lys Glu Lys Glu Lys Asn

495

tactccgtat tcgcccagcc gactagtgtc actcatggct tctatctatt gtttacgatt 7836

tattgttgtt tttcaagaag ttggtaaatt acatattgtt tccgagaagg atctccttgg 7896

aaagaattct tttgcacttc ttt 7919

<210>2

<211>497

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Val Ser Arg Arg Phe Lys Pro Val Glu Glu Cys Ser Ser Asp Gly

1 5 10 15

Arg Ser Glu Gln Thr Val Ala Ala Asp Phe Asp Gly Thr Leu Val Arg

20 25 30

Ser Arg Ser Ala Phe Pro Tyr Tyr Leu Leu Val Ala Leu Glu Ala Gly

35 40 45

Ser Val Leu Arg Ala Val Val Leu Leu Leu Ser Val Pro Phe Val Tyr

50 55 60

Val Thr Tyr Ile Phe Phe Ser Glu Ser Leu Ala Ile Ser Thr Leu Val

65 70 75 80

Tyr Ile Ser Val Ala Gly Leu Lys Val Arg Asn Ile Glu Met Val Ala

85 90 95

Arg Ser Val Leu Pro Lys Phe Tyr Ala Glu Asp Val His Pro Glu Ser

100 105 110

Trp Arg Val Phe Asn Ser Phe Gly Lys Arg Tyr Ile Ile Thr Ala Ser

115 120 125

Pro Arg Ile Met Val Glu His Phe Ala Lys Thr Phe Leu Gly Ala Asp

130 135 140

Lys Val Val Gly Thr Glu Leu Glu Val Gly Lys Asn Gly Lys Ala Thr

145 150 155 160

Gly Phe Met Val Lys Pro Gly Val Leu Val Gly Asp His Lys Arg Gln

165 170 175

Ala Val Val Lys Glu Leu Arg Asp Ala Val Pro Asp Val Gly Leu Gly

180 185 190

Asp Arg Glu Thr Asp Phe Asp Phe Met Ser Ile Cys Lys Glu Ala Tyr

195 200 205

Leu Val Thr Ser Arg Lys Tyr Ser Ala Val Pro Lys Asn Gln Leu Leu

210 215 220

Ser Pro Leu Ile Leu His Asp Gly Arg Leu Val Gln Arg Pro Thr Pro

225 230 235 240

Leu Val Ala Leu Val Thr Phe Leu Trp Met Pro Phe Gly Phe Ala Leu

245 250 255

Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Asn Leu Pro Leu Pro Glu Arg Ile Val

260 265 270

Phe Tyr Thr Tyr Lys Leu Met Gly Ile Arg Leu Ile Val Lys Gly Asn

275 280 285

Pro Pro Pro Pro Pro Lys Lys Gly His Pro Gly Val Leu Phe Val Cys

290 295 300

Asn His Arg Thr Val Leu Asp Pro Val Glu Val Ala Val Ala Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Val Ser Cys Val Thr Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Ser Glu Leu

325 330 335

Ile Ser Pro Ile Lys Ala Val Ala Leu Ser Arg Glu Arg Glu Lys Asp

340 345 350

Ala Glu Asn Ile Arg Arg Leu Leu Glu Glu Gly Asp Leu Val Ile Cys

355 360 365

Pro Glu Gly Thr Thr Cys Arg Glu Pro Phe Leu Leu Arg Phe Ser Ala

370 375 380

Leu Phe Ala Glu Leu Thr Asp Arg Ile Val Pro Val Ala Ile Asn Thr

385 390 395 400

Lys Glu Ser Met Phe His Gly Ser Thr Val Arg Gly Phe Lys Leu Met

405 410 415

Asp Pro Tyr Phe Phe Phe Met Asn Pro Arg Pro Thr Tyr Glu Ile Thr

420 425 430

Phe Leu Asn Gln Leu Pro Lys Glu Leu Thr Cys Ser Gly Gly Lys Ser

435 440 445

Pro Ile Glu Val Ala Asn Tyr Ile Gln Lys Thr Leu Ser Gly Gln Leu

450 455 460

Gly Phe Glu Cys Thr Ala Ile Thr Arg Lys Glu Lys Tyr Ser Ile Leu

465 470 475 480

Ala Gly Thr Asp Gly Arg Val Pro Ser Lys Asn Lys Glu Lys Glu Lys

485 490 495

Asn

Claims

1.一种调控水稻耐冷害的基因OsGPAT1，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种调控水稻耐冷害的基因OsGPAT1在水稻耐寒育种中的应用。