CN117088951A - GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或生物量中的应用 - Google Patents
GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或生物量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或生物量中的应用，属于植物育种技术领域。本发明为了解决如何提高植物NO3 –吸收效率、提高叶绿素含量或生物量的问题。本发明提供GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用，所述GsNRT2.4a蛋白序列如SEQ ID NO.33所示。本发明涉及的GsNRT2.4a蛋白及其编码基因在植物高效吸收硝酸盐和氮素营养利用方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或生物量中的应用。
背景技术
氮是植物体内需求量最大的矿质营养元素，是氨基酸、蛋白质、激素、核酸以及叶绿素等关键有机分子的基本组成元素，也是调节植物体生长发育的必需营养元素，在生物体的物质和能量代谢活动中发挥重要作用。全世界每年施用氮肥约1.2亿吨，占作物总肥料需求的59％，但是植物仅能利用其中的50％-75％。氮肥的长期大量使用不仅增加农业生产成本，导致农作物肥料利用率的大幅度降低，还引起了一系列严重的生态问题(土壤酸化，水体富营养化，温室效应等)。因此培育氮高效吸收和利用的农作物新品种，实现“减氮增效”，提高作物氮素吸收和利用效率，同时降低过量施用氮肥带来的环境污染，是当今农业绿色发展中亟待解决的关键科学问题。
通过基因工程手段将功能显著的氮素高效吸收基因导入具有经济价值的农作物品种中以提高作物本身的氮素吸收和利用能力，无疑是最直接也最有效的提高植物氮素吸收和利用效率的措施之一。然而，其实现的关键是植物氮素吸收分子机制的阐明和功能显著的氮素高效吸收和利用基因的挖掘。野生大豆(Glycine soja)是大豆的野生近缘种，对于各种非生物胁迫具有很强的适应能力，而且具有比栽培大豆更高的遗传多样性。最近的研究也发现，相比于栽培大豆，野生大豆具有对低浓度NO3 –供应更强的适应性，推测这很可能与其独特的氮素吸收利用及其调控机制有关。因此从野生大豆中挖掘抗逆、氮素营养吸收和利用及其调控等优良基因资源具有很大的潜力。
我国大多数作物仍缺乏NO3 –高效吸收和利用的优良种质资源。因此本领域对提高农作物的氮素吸收和利用效率存在非常迫切的需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决如何提高植物NO3 –吸收效率、提高叶绿素含量或生物量的问题。
本发明提供一种GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用，所述GsNRT2.4a蛋白序列如SEQ ID NO.33所示。
本发明提供一种GsNRT2.4a基因在提高植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用，所述GsNRT2.4a基因序列如SEQ ID NO.34所示。
本发明提供一种含SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因或含有SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因和SEQ ID NO.35所示的GsSnRK1基因序列的重组载体、重组微生物细胞或植物在植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用。
进一步地限定，所述GsSnRK1基因序列为编码SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列的基因序列、编码以SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列为基础将176位的苏氨酸变成谷氨酸的基因序列或编码以SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列为基础将49位的赖氨酸变成甲硫氨酸的基因序列；所述GsNRT2.4a基因序列为编码以SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列为基础将518位的丝氨酸变成丙氨酸的基因序列。
进一步地限定，所述植物为大豆或拟南芥；所述生物量是指植物干重。
进一步地限定，所述应用处在的环境是低氮胁迫的环境。
本发明提供一种提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或植物生物量的育种方法，所述方法的步骤如下：
1)扩增SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因序列，将基因序列插入到表达载体；
2)将步骤1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆或拟南芥中得到转单基因大豆或拟南芥；
3)鉴定步骤2)获得的转基因大豆或拟南芥得到阳性转基因植株；
或者
(1)扩增SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因序列和SEQ ID NO.35所示的GsSnRK1基因序列，将基因序列插入到表达载体；
(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转双基因大豆或拟南芥；
(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆或拟南芥得到阳性转基因大豆或拟南芥。
进一步地限定，步骤1)或步骤(1)中所述表达载体为pCAMBIA1302和pCAMBIA2300。
进一步地限定，扩增GsNRT2.4a基因序列的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；扩增GsSnRK1基因序列的引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10示。
本发明提供一种提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或植物生物量的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：将大豆的SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因序列或SEQ ID NO.35所示的GsSnRK1基因序列在野生型大豆、野生型拟南芥或拟南芥2kinm/2nrtm突变体中超表达获得大豆转基因植株。
有益效果：本发明发现了一种与植物NO3 –高效吸收相关的NO3 –转运蛋白GsNRT2.4a，通过RT-qPCR和GUS染色分析表明GsNRT2.4a基因在野生大豆根中显性表达，且GsNRT2.4a受低氮胁迫诱导后表达量增加更多，能应答低浓度NO3 –供应胁迫，同时，GsNRT2.4a也受多种非生物胁迫(NaCl、NaHCO3、ABA)诱导表达。膜片钳实验表明GsNRT2.4a具有NO3 –跨膜转运的功能。通过酵母双杂交、GST Pull-down实验证实了GsNRT2.4a和GsSnRK1的物理互作关系。此外，通过体外磷酸化实验确定了GsSnRK1可以在Ser518位点磷酸化GsNRT2.4a。在拟南芥2nrtm突变体中回补GsNRT2.4a基因能显著增强植株对低浓度NO3 –供应的应答，表现为GsNRT2.4a基因回补植株中NO3 –含量显著增加，同时，叶绿素含量和植株生物量也显著增加，该结果揭示了GsNRT2.4a具有植物NO3 –高效吸收的功能。在拟南芥2kinm/2nrtm突变体中共表达GsSnRK1(K49M)和GsNRT2.4a基因或者GsSnRK1和GsNRT2.4a(S518A)基因均能增强植株对低浓度NO3 –供应下的适应，但共表达GsSnRK1和GsNRT2.4a基因的拟南芥植株在低浓度NO3 –供应下的生长状态更优，表现为植株中NO3 –含量、叶绿素含量和植株生物量均为最高。这为低浓度NO3 –供应环境下植物氮素高效吸收的调控机制研究提供了新的线索。
附图说明
图1为RT-qPCR分析野生大豆GsNRT2.4a基因的表达模式。图中A为GsNRT2.4a基因在野生大豆植株中不同组织(根、茎、叶、幼荚)的表达量；B为GsNRT2.4a基因在不同胁迫处理[LN(低浓度NO3 –供应)、盐(NaCl)、碱(NaHCO3)、ABA]下的表达量；
图2为GUS染色分析野生大豆GsNRT2.4a基因的表达模式。图中A为GsNRT2.4a基因在转基因拟南芥中不同组织[a全株；b根；c根(局部放大)；d花序；e茎；f子叶]的表达分析；B为GsNRT2.4a基因在不同胁迫处理[LN(低浓度NO3 –供应)、盐(NaCl)、碱(NaHCO3)、ABA]下的转基因拟南芥根中的表达分析；
图3为膜片钳技术鉴定GsNRT2.4a跨膜转运NO3 –的活性。图中A为采用膜片钳技术检测电极的电压-电流曲线；B为NO3 –相对渗透率的统计分析；
图4为GsNRT2.4a蛋白与GsSnRK1蛋白激酶的物理互作分析。图中A为基于膜蛋白系统的酵母双杂交技术验证GsNRT2.4a与GsSnRK1的互作；B为GST Pull-down技术鉴定GsNRT2.4a和GsSnRK1的互作；
图5为GsNRT2.4a蛋白的体外磷酸化鉴定结果。图中A为利用Phos-tag技术进行GsNRT2.4a蛋白的体外磷酸化分析结果；B为利用pPKD抗体进行GsNRT2.4a蛋白的体外磷酸化分析结果；
图6为低浓度NO3 –供应条件下拟南芥2kinm、2nrtm和2kinm/2nrtm突变体的鉴定。图中A为拟南芥2kinm/2nrtm突变体RT-PCR鉴定；B为拟南芥2kinm、2nrtm和2kinm/2nrtm突变体幼苗期主根伸长表型鉴定；C为拟南芥2kinm、2nrtm和2kinm/2nrtm突变体成苗期(三周龄)表型鉴定；D为拟南芥2kinm、2nrtm和2kinm/2nrtm突变体成苗期(三周龄)生理指标测定结果；
图7为GsNRT2.4a基因回补拟南芥2nrtm突变体NO3 –吸收功能的转基因植株鉴定结果。图中A为GsNRT2.4a基因回补拟南芥2nrtm突变体的转基因植株幼苗期主根伸长表型鉴定；B为GsNRT2.4a基因回补拟南芥2nrtm突变体的转基因植株成苗期(三周龄)生理指标测定结果；
图8为GsSnRK1通过磷酸化GsNRT2.4a调控植株NO3 –吸收功能分析。图中A为共转GsSnRK1和GsNRT2.4a或其突变基因拟南芥幼苗期主根伸长表型鉴定；B为共转GsSnRK1和GsNRT2.4a或其突变基因拟南芥成苗期(三周龄)表型鉴定；C为共转GsSnRK1和GsNRT2.4a或其突变基因拟南芥成苗期(三周龄)生理指标测定结果；D为利用Phos-tag技术鉴定共转GsSnRK1和GsNRT2.4a或其突变基因拟南芥转基因株系中GsSnRK1.1对GsNRT2.4a的磷酸化作用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的野生大豆G07256种子在文献“Yu Y,Liu A,Duan X,etal.GsERF6,an ethylene-responsive factor from Glycine soja,mediates theregulation of plant bicarbonate tolerance in Arabidopsis.Planta 2016 244(3):681-698”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)在文献“Chen J,Li Q,Zhang P,et al.·Cloning and functional characterization of two GsSnRK1 genepromoters from wild soybean[J].Plant Biotechnology Reports,2021,15(5):627-639.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的农杆菌GV3101在文献“李慧卿，陈超，陈冉冉，宋雪薇，李佶娜，朱延明，丁晓东。利用CRISPR/Cas9双基因敲除系统初步解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应。遗传。2018,40(6):496-507”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中用到的融合蛋白原核表达重组载体pGEX-4T-1、pGEX-4T-1-GsSnRK1、pET-32b、pET32b-Myc-GsSnRK1、pET32b-Flag-GsGRIK1及重组蛋白在文献“刘圆明,尤宏光,卢浩然,丁晓东.野生大豆GsPP2CA和GsPKA对GsSnRK1.1蛋白活性的调控.西北植物学报,2020,40(08):1277-1286.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中用到的哺乳动物荧光蛋白报告载体pEGFP-C1和HEK293细胞系在文献“Liu S,Fukumoto T,Gena P,et al.Ectopic expression of a rice plasma membraneintrinsic protein(OsPIP1；3)promotes plant growth and water uptake.PlantJ.2020May；102(4):779-796”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell和BL21(DE3)Chemically Competent Cell，克隆载体试剂盒pEASY-Blunt Simple Cloning Kit是全式金公司的产品。
下述实施例中涉及到的引物对应的核苷酸序列见表1。
表1引物对应的核苷酸序列
实施例1：野生大豆硝酸盐转运蛋白GsNRT2.4a基因的克隆及其表达模式分析
一、植物材料的处理
选取饱满的野生大豆(Glycine soja)G07256种子，经浓H2SO4处理10min，灭菌水冲洗3-4次后置于湿滤纸上，在4℃下黑暗处理进行春化3d。在人工气候室中，用1/4Hoagland营养液培养野生大豆幼苗，培养3周，获得3周龄的幼苗。生长条件为：24℃，相对湿度60％，光照周期为16h光照，8h黑暗。
二、RNA提取
参见Plant RNA Kit(OMEGA)说明书提取野生大豆幼苗的总RNA。将提取的总RNA立即进行反转录或置于-80℃保存备用。
三、RT-PCR扩增
以上述步骤二获得的总RNA为模板，采用TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录得到cDNA。以cDNA为模板，采用GsNRT2.4a-Clone-F(SEQ ID NO.1)和GsNRT2.4a-Clone-R(SEQ ID NO.2)引物及Pfu DNAPolymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约1.6kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)回收PCR扩增产物，将其与pEASY-Blunt SimpleCloning Kit载体(TRANSGEN BIOTECH)连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-BluntSimple-GsNRT2.4a，并将其转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为1593bp的扩增产物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.34所示，将其命名为GsNRT2.4a基因，ORF为SEQ ID NO.34的第1-1593位，编码GsNRT2.4a蛋白长度为530个氨基酸。GsNRT2.4a基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示。
SEQ ID NO.33：
MADIEGSPGSSMHGVTGREQTFIASVASPMVPTDTTANFALPVDSEHKAKIFKLFSLANPHMRTFHLSWI
SFFTCFVSTFAAAPLVPIIRDNLNLTKGDIGNAGVASVSGSIFSRLTMGAVCDLLGPRYGCAFLIMLSAPTV
FCMSFVNDAAGYIAVRFMIGFSLATFVSCQYWMSTMFNSKIIGLVNGTAAGWGNMGGGATQLIMPMVY
ELIRRAGATPFTAWRIAFFVPGWMHVVMGILVLTLGQDLPDGNLGALQKKGNVAKDKFSKVLWYAITN
YRTWVFALLYGYSMGVELTTDNVIAEYFYDRFNLKLHTAGIIAASFGMANLLARPFGGYTSDVAARLFG
MRGRLWNLWILQTLGGVFCIWLGRANSLPIAVLAMILFSIGAQAACGATFGIIPFISRRSLGIISGLTGAGG
NFGSGLTQLIFFSTSRFSTSTGLSLMGVMIVCCTLPVTLVHFPQWGSMFLPPSKDVNKSTEEYYYTAEWNEEEKQKGLHQNSLKFAENSRSERGKRVASAPTPPNTTPTHA；
SEQ ID NO.34：
ATGGCTGATATTGAGGGTTCTCCAGGAAGCTCCATGCATGGAGTAACTGGAAGGGAACAAACCTTCA
TAGCCTCAGTGGCTTCCCCTATGGTCCCTACAGACACCACAGCAAATTTCGCTTTGCCAGTAGATTCT
GAGCACAAGGCAAAAATTTTCAAGCTTTTTTCCTTAGCCAACCCTCACATGAGAACCTTCCACTTGT
CTTGGATATCCTTCTTCACTTGCTTTGTCTCAACCTTCGCGGCGGCGCCACTTGTCCCCATCATTCGCG
ACAACCTTAACCTCACCAAAGGCGACATCGGGAACGCCGGCGTTGCCTCTGTCTCCGGCAGCATCTT
CTCCAGGCTCACAATGGGCGCGGTTTGTGACCTACTTGGACCGCGTTACGGCTGTGCCTTCCTCATCA
TGCTCTCTGCACCAACCGTGTTCTGCATGTCTTTTGTGAATGATGCTGCTGGTTACATAGCAGTGAGG
TTCATGATAGGGTTTTCGTTGGCCACTTTTGTTTCATGCCAGTATTGGATGAGTACTATGTTTAATAGTA
AGATTATAGGGCTTGTGAATGGGACTGCTGCAGGGTGGGGGAACATGGGTGGTGGGGCCACTCAGC
TCATAATGCCTATGGTTTATGAGTTGATTAGAAGAGCTGGGGCTACTCCCTTTACGGCTTGGAGGATT
GCTTTCTTCGTCCCTGGTTGGATGCATGTGGTCATGGGGATCTTGGTCCTAACCCTAGGCCAAGATTT
ACCTGATGGAAACCTTGGTGCCTTGCAGAAGAAGGGTAATGTTGCCAAAGACAAATTCTCCAAGGT
GCTATGGTATGCCATAACAAATTACAGGACATGGGTTTTTGCCCTCCTCTATGGGTACTCGATGGGAG
TTGAATTAACCACTGACAATGTCATTGCTGAGTATTTCTATGACAGGTTTAATCTCAAGCTACACACTG
CTGGAATCATTGCTGCTTCATTTGGAATGGCAAATCTCCTAGCTCGTCCCTTTGGTGGATACACTTCTG
ATGTTGCAGCCAGGTTGTTTGGCATGAGGGGCAGGCTTTGGAACCTGTGGATCCTCCAAACCCTAGG
AGGCGTTTTCTGCATATGGCTTGGGCGTGCCAATTCCCTTCCCATTGCAGTCTTGGCCATGATCCTCTT
CTCCATTGGTGCTCAAGCTGCATGCGGTGCAACTTTTGGCATCATTCCCTTCATCTCAAGGCGTTCTC
TTGGGATCATATCAGGCCTAACTGGTGCAGGTGGAAACTTTGGTTCTGGTTTGACCCAATTAATCTTC
TTTTCAACCTCAAGGTTTTCTACTTCCACTGGTCTCTCCCTTATGGGTGTCATGATTGTGTGTTGCACT
CTTCCTGTGACTCTTGTTCACTTCCCTCAGTGGGGTAGCATGTTCCTCCCTCCTTCAAAGGATGTCAA
CAAGTCCACTGAGGAATACTATTACACCGCTGAGTGGAATGAGGAAGAGAAGCAAAAAGGGTTGCA
CCAGAATAGTCTCAAGTTTGCTGAGAATAGCCGTTCAGAGAGAGGTAAGCGTGTGGCCTCAGCACCAACACCACCAAACACAACTCCAACTCATGCCTAG；
四、实时荧光定量PCR分析GsNRT2.4a的表达模式
利用引物GsNRT2.4a-RT-qPCR-FW(SEQ ID NO.3)和GsNRT2.4a-RT-qPCR-RV(SEQID NO.4)对3周龄的野生大豆幼苗不同组织的cDNA进行RT-qPCR扩增。根据RT-qPCR结果可知GsNRT2.4a基因在野生大豆植株中各个器官中均有表达，其中根部表达量相对较高(见图1中的A)。取正常1/4Hoagland溶液(CK，5.7mMNO3 –和1mM NH4 +)中培养21天的野生大豆幼苗，分别置于含有低浓度NO3 –供应(LN，0.5mM NO3 –和1mM NH4 +)和NaCl(150mM)、NaHCO3(50mM)、ABA(15μM)的1/4Hoagland溶液中处理2h、4h、6h后的结果表明，GsNRT2.4a的表达能够受到LN(低浓度NO3 –供应)胁迫的诱导，且处理4h左右，基因表达水平达到最高。同时，NaCl、NaHCO3和ABA处理均引起野生大豆内源GsNRT2.4a表达水平的增加(见图1中的B)。
五、GUS活性染色分析GsNRT2.4a的组织表达模式及在LN、NaCl、NaHCO3和ABA胁迫下的表达模式
为了进一步探究野生大豆GsNRT2.4a的组织表达模式，选择GsNRT2.4a基因转录起始点上游2000bp序列作为GsNRT2.4a基因的启动子，构建了proGsNRT2.4a::GUS转基因拟南芥稳定表达株系。并对不同组织的转基因拟南芥进行GUS活性染色分析。
(一)proGsNRT2.4a启动子片段的获得
以野生大豆基因组DNA为模板，采用EcoR I-p3301-proGsNRT2.4a-F(SEQ IDNO.5)和NcoⅠ-p3301-proGsNRT2.4a-R(SEQ ID NO.6)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsNRT2.4a基因启动子，命名为proGsNRT2.4a。
(二)pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a载体的构建
用限制性内切酶EcoR I和Nco I(New England Biolabs)对pCAMBIA3301载体进行双酶切，回收大片段，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA3301载体和proGsNRT2.4a扩增产物进行无缝克隆，得到pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a重组载体，对pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a重组载体为将pCAMBIA3301载体的EcoR I和Nco I酶切位点切开，用proGsNRT2.4a启动子片段代替载体上原来的CaMV 35S启动子，且保持pCAMBIA3301载体的其它序列不变得到的载体。pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a重组载体能够通过proGsNRT2.4a启动子驱动下游GUS基因的表达。
(三)转化农杆菌GV3101
利用冻融法将构建好的pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a重组载体转化农杆菌GV3101感受态，待抗性平板长出单克隆后挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR鉴定。鉴定为阳性克隆后存菌备用。
(四)农杆菌介导的拟南芥遗传转化
利用Floral dip法用含有pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a重组载体的农杆菌菌液侵染野生型拟南芥Col-0的花序，待种子成熟后收取T1代种子，表面消毒后，播种于含50mg/LBasta除草剂(北京酷来博)的1/2MS固体培养基上进行筛选，将筛选获得的Tl代抗性苗移栽至营养钵中培养，单株收种子，并分别播种于含50μg/mL Basta除草剂的1/2MS固体培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到T3代转基因纯合体株系用于后续实验。
(五)GUS活性染色
用GUS染液(即用型)试剂盒(北京索莱宝)对proGsNRT2.4a::GUS纯合体转基因植物组织进行染色，观察植物组织染色结果。发现GsNRT2.4a在幼苗根中表达量较高，而在子叶、茎和花中表达量都较低(见图2中的A)，进一步说明GsNRT2.4a主要在根中发挥功能。将在1/2MS培养基上正常生长1周龄的proGsNRT2.4a::GUS转基因植株，分别置于含有正常1/4Hoagland溶液(CK，正常氮水平，5.7mM NO3 –和1mM NH4 +)及低浓度NO3 –供应(LN，0.5mM NO3 –和1mM NH4 +)和NaCl(150mM)、NaHCO3(50mM)、ABA(15μM)的Hoagland溶液中处理6h。GUS活性染色分析发现，与RT-qPCR结果(图1B)类似，低浓度NO3 –供应及NaCl、NaHCO3、ABA等非生物胁迫下，GsNRT2.4a基因表达量增加，GUS活性增强(见图2中的B)，这说明GsNRT2.4a能响应低浓度NO3 –供应及其它非生物胁迫。
实施例2：膜片钳技术鉴定野生大豆GsNRT2.4a的硝酸盐转运活性
一、pEGFP-C1-GsNRT2.4a载体的构建
(一)GsNRT2.4a基因的获得
以实施例1中获得的pEASY-Blunt Simple-GsNRT2.4a质粒为模板，采用Nhe I-pEGFP-GsNRT2.4a-F(SEQ ID NO.7)和Age I-pEGFP-GsNRT2.4a-R(SEQ ID NO.8)引物及PfuDNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即NRT2.4a基因。
(二)pEGFP-C1-GsNRT2.4a载体的构建
用限制性内切酶Nhe I和Age I(New England Biolabs)对pEGFP-C1载体进行双酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pEGFP-C1载体和上述GsNRT2.4a扩增产物进行无缝克隆，得到pEGFP-C1-GsNRT2.4a重组载体，对pEGFP-C1-GsNRT2.4a重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pEGFP-C1-GsNRT2.4a重组载体为将pEGFP-C1载体的Nhe I和Age I酶切位点切开，插入GsNRT2.4a片段，且保持pEGFP-C1载体的其它序列不变得到的载体。pEGFP-C1-GsNRT2.4a重组载体能够表达与eGFP融合表达的GsNRT2.4a蛋白。
二、转染哺乳动物HEK293细胞
使用Lipofectamine 2000将pEGFP-C1-GsNRT2.4a载体或空的pEGFP-C1载体转染到哺乳动物HEK293细胞中。
三、膜片钳鉴定GsNRT2.4a的硝酸盐转运活性
转染后48小时，对HEK293细胞进行胰蛋白酶解，并暴露于对照和NO3 –或HCO3 -/CO3 2-溶液中。采用膜片钳技术检测电极的电压-电流曲线。
结果(图3)发现，当含有EGFP-GsNRT2.4a的HEK293细胞暴露于0或150mM NO3 –时，电极的电压-电流曲线加速分离，而含有pEGFP-C1空载体的HEK293细胞在0或150mM NO3 –下电压-电流曲线几乎没有分离现象；此外，0或150mM HCO3 -/CO3 2-也未观察到分离现象。以上结果表明，GsNRT2.4a在哺乳动物细胞膜两侧能特异性跨膜转运NO3 –。
实施例3：GsNRT2.4a与GsSnRK1蛋白激酶的互作分析
一、酵母双杂交验证GsNRT2.4a与GsSnRK1的互作
(一)pBT3-STE-GsSnRK1和pPR-N-GsNRT2.4a表达载体的构建
GsNRT2.4a作为高亲和性硝酸盐转运蛋白，是典型的膜定位蛋白，因此采用基于膜蛋白的酵母双杂交系统来验证GsNRT2.4a与蛋白激酶GsSnRK1之间的物理互作关系。
1.GsSnRK1基因的获得
以野生大豆总cDNA为模板，采用PstⅠ-pBT3-STE-GsSnRK1-F(SEQ ID NO.9)和PstⅠ-pBT3-STE-GsSnRK1.1-R(SEQ ID NO.10)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。GsSnRK1基因CDS区全长为1548bp，其序列如SEQID NO.35所示，ORF为SEQ ID NO.35的第1-1548位，编码GsSnRK1蛋白长度为515个氨基酸。GsSnRK1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示。
SEQ ID NO.35：
ATGGACAGATCAACTGGCCGTGGTGGTGGTGGAAGTGTGGACATGTTTCTCCGAAATTATAAGTTGG
GAAAAACACTCGGCATTGGGTCCTTTGGCAAGGTGAAAATTGCTGAGCATGTACGGACTGGTCATAA
AGTTGCTATAAAGATCCTTAACCGCCACAAGATTAAAAACATGGAAATGGAAGAAAAAGTTAGAAG
AGAAATCAAAATTTTAAGATTGTTTATGCATCATCACATTATAAGACTATATGAGGTTGTAGAAACCCC
AACAGACATATATGTTGTTATGGAGTATGTGAAATCTGGAGAGCTCTTTGATTACATAGTAGAGAAGG
GTCGGCTGCAAGAGGATGAAGCCCGTCATTTTTTTCAGCAGATAATTTCTGGTGTGGAGTACTGTCA
CAGGAATATGGTGGTTCATAGAGACCTGAAGCCTGAGAATTTACTCTTGGACTCAAAATTTAACATCA
AGATTGCTGATTTTGGGTTGAGCAACATCATGCGTGATGGTCACTTTCTTAAGACAAGTTGTGGAAG
CCCTAATTATGCGGCTCCAGAGGTTATCTCTGGAAAATTGTATGCTGGACCAGAAGTAGATGTCTGGA
GCTGTGGTGTAATTTTATATGCTCTTCTCTGTGGCACTCTTCCTTTTGATGATGAAAACATTCCCAATC
TCTTCAAAAAAATAAAGGGTGGGATATACACTCTTCCTAGTCATCTATCACCTGGTGCTAGAGATTTG
ATACCAAGGATGCTTGTGGTGGATCCCATGAAGAGGATGACCATACCTGAGATACGCCAACACCCAT
GGTTCCAAGTTCATCTACCGCGTTATTTAGCAGTGCCACCACCAGATACACTGCAACAAGCCAAAAA
GATTGATGAGGAGATTCTTCAGGAAGTGGTTAATATGGGATTTGACAGGAATCAATTGGTTGAATCTC
TTAGCAACAGGATACAAAATGAGGGTACTGTAACATACTATTTGTTATTGGACAACCGGTTTCGTGTT
TCTAGTGGTTATCTTGGAGCTGAATTTCAAGAGACAATGGATTCTGGTTTTAACCGTATGCATTCCGG
CGAAGTTGCTTCTCCAGTTGTTGGACACCACAGCACAGGGTATATGGATTATCAAGGGGTAGGAATG
CGGCAACAGTTCCCTGTTGAGAGAAAATGGGCCCTTGGGCTTCAGTCTCGAGCCCAACCACGTGAA
ATAATGACTGAGGTCCTTAAAGCTCTACAAGAATTAAATGTTTGTTGGAAGAAGATTGGACACTATAA
CATGAAGTGCAGATGGGTTGCTGGCACTGCTGGTCATCATGAAGGAATGATTAACAATTCTCTGCATA
GTAATCATTACTTTGGAAATGATTCCGGCATTATTGAAAATGAAGCTGTTTCTAAGTCAAATGTGGTC
AAGTTTGAAGTGCAGCTTTACAAAACTCGTGAGGAGAAATATCTGCTTGATCTTCAAAGGGTCCAGGGCCCACAGTTTCTTTTCTTGGATCTGTGCGCTGCTTTCCTTTCACAGCTACGTGTTCTCTAG；
SEQ ID NO.36：
MDRSTGRGGGGSVDMFLRNYKLGKTLGIGSFGKVKIAEHVRTGHKVAIKILNRHKIKNMEMEEKVRREI
KILRLFMHHHIIRLYEVVETPTDIYVVMEYVKSGELFDYIVEKGRLQEDEARHFFQQIISGVEYCHRNMV
VHRDLKPENLLLDSKFNIKIADFGLSNIMRDGHFLKTSCGSPNYAAPEVISGKLYAGPEVDVWSCGVILY
ALLCGTLPFDDENIPNLFKKIKGGIYTLPSHLSPGARDLIPRMLVVDPMKRMTIPEIRQHPWFQVHLPRYL
AVPPPDTLQQAKKIDEEILQEVVNMGFDRNQLVESLSNRIQNEGTVTYYLLLDNRFRVSSGYLGAEFQET
MDSGFNRMHSGEVASPVVGHHSTGYMDYQGVGMRQQFPVERKWALGLQSRAQPREIMTEVLKALQE
LNVCWKKIGHYNMKCRWVAGTAGHHEGMINNSLHSNHYFGNDSGIIENEAVSKSNVVKFEVQLYKTREEKYLLDLQRVQGPQFLFLDLCAAFLSQLRVL；
2.GsNRT2.4a基因的获得
以实施例2中获得的GsNRT2.4a全长CDS为模板，采用SmaⅠ-pPR3-N-HA-NRT2.4a-F(SEQ ID NO.11)和SmaⅠ-pPR3-N-HA-NRT2.4a-R(SEQ ID NO.12)引物及Pfu DNAPolymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsNRT2.4a基因。
3.重组载体pBT3-STE-GsSnRK1的构建
用限制性内切酶Pst I(New England Biolabs)对pBT3-STE载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pBT3-STE载体和上述PCR扩增产物进行无缝克隆，得到pBT3-STE-GsSnRK1重组载体，对pBT3-STE-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBT3-STE-GsSnRK1重组载体为将pBT3-STE载体的Pst I酶切位点切开，插入GsSnRK1基因，且保持pBT3-STE载体的其它序列不变得到的载体。pBT3-STE-GsSnRK1重组载体能够表达GsSnRK1蛋白。
4.重组载体pPR-N-GsNRT2.4a的构建
用限制性内切酶Sma I(New England Biolabs)对pPR3-N载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pPR3-N载体和PCR产物GsNRT2.4a进行无缝克隆，得到pPR3-N-HA-NRT2.4a重组载体，对pPR3-N-HA-NRT2.4a重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pPR3-N-HA-GsNRT2.4a重组载体为将pPR3-N载体的Sma I酶切位点切开，插入HA-GsNRT2.4a基因，且保持pPR-N载体的其它序列不变得到的载体。pPR3-N-GsNRT2.4a重组载体能够表达GsNRT2.4a蛋白。
(二)转化酵母菌NMY51
分别将pBT3-STE-GsSnRK1和pPR3-N-HA-GsNRT2.4a两个载体及pBT3-STE-empty和pPR3-N-HA-GsNRT2.4a两个载体及pBT3-STE-GsSnRK1和pPR3-N-empty两个载体及作为阴性对照的pBT3-STE和pPR3-N两个空载体和作为阳性对照的pBT3-STE-GsSnRK1和pBT3-STE-GsSnRK1β载体分别共转化酵母菌NMY51，分别得到含质粒pBT3-STE-GsSnRK1和pPR3-N-HA-GsNRT2.4a、pBT3-STE-empty和pPR3-N-HA-GsNRT2.4a、pBT3-STE-GsSnRK1和pPR3-N-empty、pBT3-STE和pPR3-N两个空载体、pBT3-STE-GsSnRK1和pBT3-STE-GsSnRK1β的酵母菌NMY51，分别在SD二缺和三缺培养基上培养。
结果如图4中的A所示，在SD/-Trp/-Leu/-His(含5mM 3-AT)培养基上，阳性对照组pBT3-STE-GsSnRK1和pBT3-STE-HA-GsSnRK1β和试验组含有pBT3-STE-GsSnRK1和pPR3-N-HA-GsNRT2.4a重组载体的酵母菌株能够正常生长，而空白对照组pPR3-N-empty和pBT3-STE及负对照组pBT3-STE-empty和pPR3-N-HA-GsNRT2.4a、pBT3-STE-GsSnRK1和pPR3-N-empty的酵母菌株均不能正常生长，这一结果表明了GsSnRK1蛋白激酶与GsNRT2.4a蛋白的互作关系。
二、GST Pull-down验证GsNRT2.4a与GsSnRK1的互作
(一)表达载体的构建
1.重组载体pGEX-4T-1-GsSnRK1的构建
1)GsSnRK1基因的获得
以上述pBT3-STE-GsSnRK1质粒为模板，采用SmaI-pGEX-4T-GsSnRK1-F(SEQ IDNO.13)和SmaI-pGEX-4T-GsSnRK1-R(SEQ ID NO.14)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。
2)pGEX-4T-1-GsSnRK1表达载体的构建
用限制性内切酶Sma I(New England Biolabs)对pGEX-4T-1载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pGEX-4T-1载体和GsSnRK1扩增产物进行无缝克隆，得到pGEX-4T-1-GsSnRK1重组载体，对pGEX-4T-1-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGEX-4T-1-GsSnRK1重组载体为将pGEX-4T-1载体的Sma I酶切位点切开，插入GsSnRK1基因，且保持pGEX-4T-1载体的其它序列不变得到的载体。pGEX-4T-1-GsSnRK1重组载体能够表达N端带有GST标签的GsSnRK1蛋白。
2.重组载体pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD的构建
1)GsNRT2.4aCTD基因片段的获得
由于GsNRT2.4a是典型的膜定位蛋白，难以利用原核表达系统进行表达，故选择表达了C末端57个氨基酸残基组成的片段(命名为GsNRT2.4aCTD)的蛋白。以上述pPR-N-GsNRT2.4a质粒为模板，采用pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD-F(SEQ ID NO.15)和pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD-R(SEQ ID NO.16)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即HA-GsNRT2.4aCTD基因片段。
GsNRT2.4aCTD的核苷酸序列：(SEQ ID NO.37)GATGTCAACAAGTCCACTGAGGAATACTATTACACCGCTGAGTGGAATGAGGAAGAGAAGCAAAAA GGGTTGCACCAGAATAGTCTCAAGTTTGCTGAGAATAGCCGTTCAGAGAGAGGTAAGCGTGTGGCC TCAGCACCAACACCACCAAACACAACTCCAACTCATGCC；
GsNRT2.4aCTD的氨基酸序列：(SEQ ID NO.38)DVNKSTEEYYYTAEWNEEEKQKGLHQNSLKFAENSRSERGKRVASAPTPPNTTPTHA。
2)pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD表达载体
用限制性内切酶EcoR V(New England Biolabs)对pET-32b载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pET-32b载体和GsNRT2.4aCTD扩增产物进行无缝克隆，得到pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD重组载体，对pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD重组载体为将pET-32b载体的EcoR V酶切位点切开，插入GsNRT2.4aCTD片段，且保持pET-32b载体的其它序列不变得到的载体。pET-32b-HA-GsNRT2.4aCTD重组载体能够表达带有HA和6×His标签的GsNRT2.4aCTD蛋白片段。
(二)转化大肠杆菌BL21(DE3)
分别将pGEX-4T-1-GsSnRK1、pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD以及作为对照的pGEX-4T-1和pET-32b空载体分别转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL株系(Stratagene)，分别得到含有pGEX-4T-1-GsSnRK1、pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD、pGEX-4T-1和pET-32b质粒的BL21大肠杆菌并诱导表达，分别提取含有各载体菌株的诱导蛋白，进行镍柱和GST亲和纯化。
(三)Pull-down鉴定蛋白互作
分别将等量的6×His-GsNRT2.4aCTD和6×His蛋白溶液加入含GST或GST-GsSnRK1的蛋白溶液中，再加入GST beads，孵育2h后清洗去除未特异结合的蛋白，进行SDS-PAGE，并分别用抗6×His或抗GST抗体进行Western blot分析。
Pull-down结果如图4中的B所示，由GST抗体检测到了GST和GST-GsSnRK1蛋白的存在，而进行His抗性检测，只在添加了GST-GsSnRK1和6×His-GsNRT2.4aCTD泳道中检测到了His抗体的信号，这进一步表明GsSnRK1和GsNRT2.4a之间确实存在物理相互作用，而且相互作用区域位于GsNRT2.4a的C端。
实施例4：蛋白激酶GsSnRK1对GsNRT2.4a与的体外磷酸化分析
一、GsSnRK1执行磷酸化功能和GsNRT2.4a磷酸化位点的预测
将GsSnRK1与动物中的同源蛋白激酶AMPK及酵母的SNF1的氨基酸进行比对，发现它们具有很高的同源性，其中第176位苏氨酸(T)是物种间高度保守的位点，与GsSnRK1执行磷酸化功能密切相关，我们前期的研究结果也已证明T176位点是GsSnRK1被上游激酶磷酸化位点，T176位点突变成谷氨酸(E)后会导致GsSnRK1处于常激活状态。GsGRIK1是GsSnRK1的上游激酶，作用的磷酸化位点为GsSnRK1的T176位点，能够将176位的苏氨酸(T)磷酸化从而激活GsSnRK1的活性。
通过在线工具(http://ppsp.biocuckoo.org)预测GsNRT2.4a序列中潜在的磷酸化位点，发现GsNRT2.4a蛋白第518位点处的丝氨酸(S)为AMPK(GsSnRK1同源蛋白激酶)可能磷酸化位点的概率很高。
二、蛋白表达载体的构建
1.重组载体pET32b-Myc-GsSnRK1的构建
1)GsSnRK1基因的获得
以上述pBT3-STE-GsSnRK1质粒为模板，采用EcoR V-pET32b-Myc-GsSnRK1-F(SEQID NO.17)和EcoR V-pET32b-Myc-GsSnRK1-R(SEQ ID NO.18)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。
2)重组载体pET32b-Myc-GsSnRK1的构建
用限制性内切酶EcoR V(New England Biolabs)对pET-32b载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pET-32b载体和Myc-GsSnRK1扩增产物进行无缝克隆，得到pET32b-Myc-GsSnRK1重组载体，对pET32b-Myc-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-Myc-GsSnRK1重组载体为将pET-32b载体的EcoR V酶切位点切开，插入Myc-GsSnRK1片段，且保持pET-32b载体的其它序列不变得到的载体。pET32b-Myc-GsSnRK1重组载体能够表达带有Myc标签的GsSnRK1蛋白片段。
2.重组载体pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)的构建
1)GsSnRK1(T176E)基因的获得
将GsSnRK1基因序列上编码第176位氨基酸的碱基ACA替换为GAA，使GsSnRK1蛋白的第176位氨基酸由苏氨酸(T)突变为谷氨酸(E)，我们重新人工合成了突变过的GsSnRK1基因并命名为GsSnRK1(T176E)，GsSnRK1(T176E)基因编码的GsSnRK1(T176E)蛋白不具有磷酸化的功能。
以GsSnRK1(T176E)基因为模板，采用EcoR V-pET32b-Myc-GsSnRK1-F(SEQ IDNO.17)和EcoR V-pET32b-Myc-GsSnRK1-R(SEQ ID NO.18)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有Myc标签的GsSnRK1(T176E)基因。
2)重组载体pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)的构建
用限制性内切酶EcoR V(New England Biolabs)对pET-32b载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pET-32b载体和Myc-GsSnRK1(T176E)扩增产物进行无缝克隆，得到pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)重组载体，对pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)重组载体为将pET-32b载体的EcoR V酶切位点切开，插入Myc-GsSnRK1(T176E)片段，且保持pET-32b载体的其它序列不变得到的载体。pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)重组载体能够表达带有Myc标签的GsSnRK1(T176E)蛋白片段。
3.重组载体pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD的构建(见实施例3)
4.重组载体pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)的构建
1)GsNRT2.4aCTD(S518A)基因片段的获得
将GsNRT2.4a基因序列上编码第518位氨基酸的碱基TCG替换为GCC，使GsNRT2.4a蛋白的第518位氨基酸由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，我们重新人工合成了突变过的GsNRT2.4a基因并命名为GsNRT2.4a(S518A)，GsNRT2.4a(S518A)基因编码的GsNRT2.4a(S518A)蛋白不具有被GsSnRK1蛋白磷酸化的能力。
以GsNRT2.4a(S518A)基因为模板，采用pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD-F(SEQ IDNO.15)和pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD-R(SEQ ID NO.16)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有HA标签的GsNRT2.4aCTD(S518A)基因片段。
2)重组载体pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)的构建
用限制性内切酶EcoR V(New England Biolabs)对pET-32b载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pET-32b载体和HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)扩增产物(引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)进行无缝克隆，得到pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)重组载体，对pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)重组载体为将pET-32b载体的EcoR V酶切位点切开，插入HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)片段，且保持pET-32b载体的其它序列不变得到的载体。pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)重组载体能够表达带有HA标签的GsNRT2.4aCTD(S518A)蛋白片段。
三、蛋白的表达和纯化
将蛋白表达载体pET32b-Myc-GsSnRK1、pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)、pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD、pET32b--HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)分别转化大肠杆菌BL21感受态(TRANSGENBIOTECH)，具体操作步骤详见BL21(DE3)Chemically Competent Cell说明书。分别获得含有pET32b-Myc-GsSnRK1、pET32b-Myc-GsSnRK1(T176E)、pET32b-HA-GsNRT2.4aCTD、pET32b--HA-GsNRT2.4aCTD(S518A)蛋白表达载体的BL21大肠杆菌并诱导蛋白表达。
分别对表达的GsGRIK1、GsSnRK1、GsSnRK1(T176E)、GsNRT2.4aCTD和GsNRT2.4aCTD(S518A)蛋白进行纯化。GsSnRK1和GsSnRK1(T176E)蛋白的纯化采用上海谷研实业有限公司提供的Myc融和蛋白纯化试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书；GsNRT2.4aCTD、GsNRT2.4aCTD(S518A)的纯化采用武汉戴安生物技术有限公司提供的HA标签融合蛋白纯化试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书。
四、Phos-tagTM检测GsSnRK1对GsNRT2.4a的磷酸化
采用Phos-tagTM试剂盒(Wako)分别检测GsSnRK1(T176E)对GsNRT2.4aCTD和GsNRT2.4aCTD(S518A)的磷酸化水平，具体操作步骤详见Phos-tagTM试剂盒说明书。
结果如图5中的A所示：处于常激活状态的GsSnRK1(T176E)对GsNRT2.4aCTD有磷酸化的作用，而GsSnRK1(T176E)对GsNRT2.4aCTD(S518A)没有磷酸化作用。证明了GsSnRK1蛋白对GsNRT2.4a蛋白具有磷酸化作用，GsNRT2.4a的第518位丝氨酸是GsSnRK1关键的磷酸化位点。
五、利用pPKD抗体检测GsSnRK1对GsNRT2.4a的磷酸化
对表达的GsGRIK1、GsSnRK1、GsNRT2.4aCTD和GsNRT2.4aCTD(S518A)蛋白进行Western blot分析，采用HA抗体检测GsNRT2.4aCTD和GsNRT2.4aCTD(S518A)的含量，采用Myc抗体检测GsSnRK1的含量，采用FLAG抗体检测上游激酶GsGRIK1的含量，采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸特异性抗体pPKDsub(Cell Signaling Tech))分别检测GsSnRK1对GsNRT2.4aCTD和GsNRT2.4aCTD(S518A)的磷酸化水平。
结果如图5中的B所示：采用pPKDsub抗体检测到在上游激酶GsGRIK1存在的情况下，GsSnRK1蛋白激酶对GsABF2(正对照)和GsNRT2.4aCTD均有磷酸化作用，而GsSnRK1对GsNRT2.4aCTD(S518A)没有磷酸化作用。再一次证明了GsSnRK1蛋白对GsNRT2.4a蛋白具有磷酸化作用，且GsNRT2.4a的第518位丝氨酸是GsSnRK1关键的磷酸化位点。
实施例5：GsSnRK1和GsNRT2.4a协同调控植物NO3 –高效吸收的功能分析
一、拟南芥突变体2nrtm、2kinm和2kinm/2nrtm的获得和鉴定
文献报道拟南芥2nrtm(nrt2.1/nrt2.2)双突变体能降低根部80％以诱导型高亲和性转运方式的NO3 –摄入(Li et al.,2007,Plant Physiol.143(1):425-433)，因此非常适合作为验证GsNRT2.4a基因NO3 –吸收功能的受体材料。拟南芥中共有3个基因编码SnRK1激酶催化亚基，其中只有AtSnRK1.1(KIN10)和AtSnRK1.2(KIN11)基因是在植物主要组织中能够表达的，因此2kinm(kin10kin11)突变体能几乎完全抑制拟南芥植株中的SnRK1激酶活性(Chen et al.,2021,Plant Biotechnology Reports.15:627-639)。
(一)拟南芥突变体2nrtm、2kinm和2nrtm/2kinm的获得和PCR鉴定
拟南芥AtNRT2.1/AtNRT2.2双突变体2nrtm(SALK_035429)由拟南芥生物资源中心(ABRC)购得；AtSnRK1.1/AtSnRK1.2双突变体2kinm是在AtSnRK1.1(kin10)敲除突变体中通过β-雌二醇诱导AtSnRK1.2(KIN11)基因敲减产生，由Baena-Gonzalez博士提供(Sci.Rep.2016,6:31697.)；2kinm/2nrtm四突变体是由2nrtm突变体和2kinm缺失突变体杂交产生F1种子，继续自交产生F2后代。对F2代种子长出的幼苗提取基因组DNA，并通过引物对nrt2.1-mutant screening-F(SEQ ID NO.19)/nrt2.1-mutant screening-R(SEQ IDNO.20)，nrt2.2-mutant screening-F(SEQ ID NO.21)/nrt2.2-mutant screening-R(SEQID NO.22)和atkin10-mutant screening-F(SEQ ID NO.23)/atkin10-mutant screening-R(SEQ ID NO.24)进行PCR鉴定，鉴定结果如图6中的A所示，野生型拟南芥(Col-0)中AtNRT2.1、AtNRT2.2、AtKIN10均能正常表达，而在未诱导条件下，这三个基因在2kinm/2nrtm突变体中均无表达。
(二)拟南芥突变体2nrtm、2kinm和2kinm/2nrtm低浓度NO3 –供应表型鉴定
将拟南芥突变体2nrtm、2kinm和2kinm/2nrtm在含有不同浓度NO3 –水平(CK，在正常NO3 –，5.7mM NO3 –和1mM NH4 +；LN，低浓度NO3 –，0.5mM NO3 –和1mM NH4 +)的1/2MS培养基上培养七天，如图6中的B所示，在正常NO3 –(5.7mM NO3 –)供应条件下拟南芥各缺失突变体幼苗期主根伸长表型与Col-0相比没有显著性差异。在低浓度NO3 –(0.5mM NO3 –)供应下，三个突变体2kinm，2nrtm和2nrtm/2kinm植株主根伸长受到明显抑制，叶片也明显泛黄、叶片更小，甚至出现干枯死亡的现象，其中2nrtm/2kinm突变体生长受低浓度NO3 –的供应抑制最为显著。
将拟南芥突变体2nrtm、2kinm和2kinm/2nrtm种于土：蛭石＝1：2的方钵中，于21℃，16h光照/8h黑暗培养1周后进行不同浓度NO3 –供应处理，每三天浇灌一次1/4Hoagland溶液(CK，5.7mM NO3 –和1mM NH4 +；LN，0.5mM NO3 –和1mM NH4 +)。两周后进行表型观察，结果如图6中的C所示，在正常NO3 –供应条件下各拟南芥缺失突变体成苗期的表型和生长趋势与Col-0相比没有显著性差异，而在低浓度NO3 –供应条件下生长趋势与图6中的B幼苗期表现基本一致，即三个突变体2kinm，2nrtm和2nrtm/2kinm植株生长均受到一定程度抑制，其中2nrtm/2kinm四突变体生长受低浓度NO3 –的供应抑制最为显著。
对不同NO3 –供应条件下的三周龄土培苗进行生理指标测定，结果如图6中的D和表1所示，与正常NO3 –供应条件相比，低浓度NO3 –的供应导致拟南芥植株总的生物量(植株干重)、叶绿素含量、NO3 –野生型Col-0，其中2kinm/2nrtm突变体降低幅度最大，表明其对NO3 –的营养限制更加敏感，说明在拟南芥中，SnRK1.1/1.2与NRT2.1/2,2在同一信号通路中起作用。低浓度NO3 –供应条件下，ANRT2.1/AtNRT2.2和AtKIN10/AtKIN11基因的缺失影响了植株对NO3 –的吸收和利用，导致植物发育不良。
表1
二、GsNRT2.4a回补拟南芥2nrtm突变体的NO3 –吸收功能分析
(一)表达载体的构建
1.proGsNRT2.4a::GFP表达载体的构建
以实施例1中获得的pCAMBIA3301-proGsNRT2.4a质粒为模板，采用EcoRⅠ-p1302-proGsNRT2.4a-F(SEQ ID NO.25)和NcoⅠ-p1302-proGsNRT2.4a-HA-R(SEQ ID NO.26)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即proGsNRT2.4a启动子片段。用限制性内切酶EcoR I和Nco I(New England Biolabs)对pCAMBIA1302载体进行双酶切，回收大片段，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA1302载体和proGsNRT2.4a启动子片段扩增产物进行无缝克隆，得到proGsNRT2.4a::GFP重组载体,对proGsNRT2.4a::GFP表达载体进行测序验证。
测序结果表明：proGsNRT2.4a::GFP表达载体为将pCAMBIA1302载体的EcoR I和NcoⅠ酶切位点切开，用proGsNRT2.4a代替载体上原来的CaMV 35S启动子，且保持pCAMBIA1302载体的其它序列不变得到的载体。proGsNRT2.4a::GFP表达载体能够通过proGsNRT2.4a启动子驱动下游GFP的表达。
2.proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a表达载体的构建
以实施例1中获得的pEASY-Blunt Simple-GsNRT2.4a质粒为模板，采用Bgl II-p1302-HA-GsNRT2.4a-F(SEQ ID NO.27)和Bgl II-p1302-HA-GsNRT2.4a-R(SEQ ID NO.28)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即HA-GsNRT2.4a基因片段。用限制性内切酶Bgl II(New England Biolabs)对pCAMBIA1302载体进行酶切，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA1302载体和HA-GsNRT2.4a基因片段扩增产物进行无缝克隆，得到proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a重组载体,对proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a表达载体进行测序验证。
测序结果表明：proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a重组载体为将proGsNRT2.4a::GFP载体的Bgl II酶切位点切开，插入GsNRT2.4a基因，且保持proGsNRT2.4a::GFP载体的其它序列不变得到的载体。proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a重组载体能够通过proGsNRT2.4a自身启动子驱动GsNRT2.4a与GFP的融合表达。
(二)转化农杆菌GV3101
利用冻融法将构建好的proGsNRT2.4a：：GFP和proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a重组载体分别转化农杆菌GV3101感受态，待抗性平板长出单克隆后挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR鉴定。鉴定为阳性克隆后存菌备用。
(三)农杆菌介导的拟南芥遗传转化
利用Floral dip法用含有proGsNRT2.4a::GFP和proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a重组载体的农杆菌菌液分别侵染拟南芥突变体2nrtm的花序，待种子成熟后收取T1代种子，表面消毒后，播种于含25mg/L潮霉素B(赛因百奥生物技术有限公司)的1/2MS固体培养基上进行筛选，将筛选获得的Tl代抗性苗移栽至营养钵中培养，单株收种子，并分别播种于含25mg/L潮霉素B的1/2MS固体培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到以2nrtm突变体为背景的T3代转基因纯合体株系proGsNRT2.4a::GFP/2nrtm和proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a/2nrtm用于后续实验。
(四)GsNRT2.4a回补2nrtm突变体的NO3 –吸收功能分析
为验证GsNRT2.4a在低浓度NO3 –供应下对植物NO3 –吸收利用的功能，对野生型拟南芥Col-0、2nrtm突变体、proGsNRT2.4a::GFP/2nrtm和proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a/2nrtm材料进行了低浓度NO3 –供应下，各拟南芥株系生长表型没有明显差距；在低浓度NO3 –供应条件下，2nrtm和proGsNRT2.4a::GFP的主根伸长受到明显抑制，而叶片大小和鲜绿程度也明显处于劣势。对2nrtm突变体回补GsNRT2.4a(proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a/2nrtm)则弥补了低浓度NO3 –供应条件下2nrtm突变体的主根伸长和发育不良。
对不同浓度NO3 –供应条件下的三周龄土培苗进行生理指标测定，结果如图7中的B和表2所示，经低浓度NO3 –供应处理后各株系的生物量、叶绿素含量以及植株NO3 –含量与CK组相比均呈现下降趋势，2nrtm突变体与proGsNRT2.4a::GFP转基因株系下降趋势最为显著。由此可以得出拟南芥AtNRT2.1和AtNRT2.2基因介导了低浓度NO3 –供应下NO3 –的吸收利用，当外界NO3 –浓度较低时，AtNRT2.1和AtNRT2.2基因的表达可以弥补植物体NO3 –的吸收利用不足，而2nrtm突变体由于基因的缺失导致拟南芥在外界NO3 –浓度较低时，NO3 –的吸收利用不足，植株生长不良。proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a转基因植株在低浓度NO3 –供应下植株生长发育情况明显优于2nrtm突变体，可以看出野生大豆GsNRT2.4a基因的转入弥补了由于AtNRT2.1和AtNRT2.2基因的缺失导致的NO3 –吸收不足。
表2
三、GsSnRK1和GsNRT2.4a协同调控植物NO3 –高效吸收的功能分析
(一)表达载体的构建
1.pro GsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)表达载体的构建
以实施例4中获得的GsNRT2.4a(S518A)基因为模板，采用Bgl II-p1302-HA-GsNRT2.4a-F(SEQ ID NO.27)和Bgl II-p1302-HA-GsNRT2.4a-R(SEQ ID NO.28)引物及PfuDNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即HA-GsNRT2.4a(S518A)基因片段。用限制性内切酶Bgl II(New England Biolabs)对pCAMBIA1302载体进行酶切，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA1302载体和HA-GsNRT2.4a(S518A)基因片段扩增产物进行无缝克隆，得到proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)重组载体,对proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)表达载体进行测序验证。
测序结果表明：proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)重组载体为将proGsNRT2.4a::GFP载体的Bgl II酶切位点切开，插入GsNRT2.4a(S518A)基因，且保持proGsNRT2.4a::GFP载体的其它序列不变得到的载体。proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)重组载体能够通过proGsNRT2.4a启动子驱动GsNRT2.4a(S518A)与GFP的融合表达。
2.proGsSnRK1::GsSnRK1表达载体的构建
以野生大豆基因组DNA为模板，采用EcoR I-p2300-proGsSnRK1-F(SEQ ID NO.29)和KpnⅠ-p2300-proGsSnRK1-R(SEQ ID NO.30)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因启动子，命名为proGsSnRK1。用限制性内切酶EcoR I和Kpn I(New England Biolabs)对pCAMBIA2300载体进行双酶切，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA2300载体和proGsSnRK1启动子片段扩增产物进行无缝克隆，得到pCAMBIA2300-proGsSnRK1重组载体。
以上述pBT3-STE-GsSnRK1质粒为模板，采用Sma I-p2300-Myc-GsSnRK1-F(SEQ IDNO.31)和Sal I-p2300-GsSnRK1-R(SEQ ID NO.32)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即Myc-GsSnRK1基因。用限制性内切酶Sma I和Sal I对上述构建的pCAMBIA2300-proGsSnRK1重组载体进行双酶切，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA2300-proGsSnRK1载体和Myc-GsSnRK1基因扩增产物进行无缝克隆，得到proGsSnRK1::GsSnRK1重组载体,对proGsSnRK1::GsSnRK1表达载体进行测序验证。
测序结果表明：proGsSnRK1::GsSnRK1重组载体为将pCAMBIA2300-proGsSnRK1载体的Sma I和Sal I酶切位点切开，插入Myc-GsSnRK1基因，且保持pCAMBIA2300-proGsSnRK1载体的其它序列不变得到的载体。proGsSnRK1::GsSnRK1重组载体能够通过proGsSnRK1自身启动子驱动GsSnRK1的表达。
3.proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)表达载体的构建
GsSnRK1位于激酶结构域第49位赖氨酸(K)与GsSnRK1执行磷酸化功能密切相关，该位点突变成甲硫氨酸(M)后会导致GsSnRK1失去磷酸化下游底物的活性。我们将GsSnRK1基因序列上编码第49位氨基酸的碱基AAG替换为ATG，使GsSnRK1蛋白的第49位氨基酸由赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)，我们重新人工合成了突变过的GsSnRK1基因并命名为GsSnRK1(K49M)，GsSnRK1(K49M)基因编码的GsSnRK1(K49M)蛋白不具有使下游底物磷酸化的功能。
以GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用Sma I-p2300-Myc-GsSnRK1-F(SEQ ID NO.29)和Sal I-p2300-GsSnRK1-R(SEQ ID NO.30)引物及Pfu DNA Polymerase(Promega)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有Myc标签的GsSnRK1(K49M)基因，用限制性内切酶Sma I和Sal I对上述构建的pCAMBIA2300-proGsSnRK1重组载体进行双酶切，获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA2300-proGsSnRK1载体和Myc-GsSnRK1(K49M)基因扩增产物进行无缝克隆，得到proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)重组载体,对proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)表达载体进行测序验证。
测序结果表明：proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)重组载体为将pCAMBIA2300-proGsSnRK1载体的Sma I和Sal I酶切位点切开，插入Myc-GsSnRK1(K49M)基因，且保持pCAMBIA2300-proGsSnRK1载体的其它序列不变得到的载体。proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)重组载体能够通过proGsSnRK1自身启动子驱动GsSnRK1(K49M)的表达。
(二)转化农杆菌GV3101
利用冻融法将构建好的proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a、proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)、proGsSnRK1::GsSnRK1和proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)重组载体分别转化农杆菌GV3101感受态，待抗性平板长出单克隆后挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR鉴定，鉴定为阳性克隆后存菌备用。
(三)农杆菌介导的拟南芥遗传转化
利用Floral dip法用含有pCAMBIA1302空载体、pCAMBIA2300空载体、proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a、proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)、proGsSnRK1::GsSnRK1和proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)重组载体的农杆菌菌液分别侵染拟南芥突变体2kinm/2nrtm的花序，待种子成熟后收取T1代种子，表面消毒后，播种于含25mg/L潮霉素B(赛因百奥生物技术有限公司)(以pCAMBIA1302为骨架载体的株系)或50mg/L卡那霉素(哈尔滨制药总厂)(以pCAMBIA2300为骨架载体的株系)的1/2MS固体培养基上进行筛选，将筛选获得的Tl代抗性苗移栽至营养钵中培养，单株收种子，并分别播种于含25mg/L潮霉素B(以pCAMBIA1302为骨架载体的株系)或50mg/L卡那霉素(以pCAMBIA2300为骨架载体的株系)的1/2MS固体培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到以2kinm/2nrtm突变体为背景的T3代转基因纯合体株系proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a/2kinm2nrtm、proGsNRT2.4a::GsNRT2.4a(S518A)/2kinm2nrtm、proGsSnRK1::GsSnRK1/2kinm2nrtm和proGsSnRK1::GsSnRK1(K49M)/2kinm2nrtm用于后续实验。
(四)转基因拟南芥株系间杂交
获得纯合转基因株系后，含有pCAMBIA1302空载体的纯合株系与含有pCAMBIA2300空载体的纯合株系通过杂交获得pCAMBIA1302/pCAMBIA2300株系，含有GsNRT2.4a或GsNRT2.4a(S518A)基因的纯合株系通过与含有GsSnRK1或GsSnRK1(K49M)基因的纯合株系杂交获得GsSnRK1/GsNRT2.4a(S518A)、GsSnRK1(K49M)/GsNRT2.4a和GsSnRK1/GsNRT2.4a杂交株系。
(五)GsSnRK1和GsNRT2.4a协同调控植物NO3 –高效吸收的功能分析
对上述各拟南芥转基因杂交株系(pCAMBIA1302/pCAMBIA2300、GsSnRK1/GsNRT2.4a(S518A)、GsSnRK1(K49M)/GsNRT2.4a和GsSnRK1/GsNRT2.4a)进行了低浓度NO3 –供应处理并进行了幼苗期主根伸长表型观察。结果如图8中的A所示，在正常浓度NO3 –供应下，各拟南芥株系生长表型没有明显差距。在低浓度NO3 –供应条件下，pCAMBIA1302/pCAMBIA2300转基因株系对NO3 –的供应不足最为敏感，主根根长最短，侧根发育不良，叶片发黄干枯，严重影响了植株的发育，GsSnRK1/GsNRT2.4a(S518A)和GsSnRK1(K49M)/GsNRT2.4a转基因株系的主根伸长也受到了低浓度NO3 –供应的影响，两者平均根长接近，但都长于作为对照的pCAMBIA1302/pCAMBIA2300株系，而GsSnRK1/GsNRT2.4a杂交株系的生长受低浓度NO3 –供应的影响最小，平均主根长显著长于其它杂交转基因株系。
对不同浓度NO3 –供应条件下的三周龄土培苗进行表型观察，结果如图8中的B所示，在正常NO3 –供应条件下各杂交转基因株系成苗期的表型和生长趋势没有显著差异，而在低浓度NO3 –供应条件下各杂交转基因株系生长均受到一定程度的抑制，但其中作为对照的空载转基因株系(pCAMBIA2300/pCAMBIA1302)对低浓度NO3 –供应最敏感，而含有GsSnRK1/GsNRT2.4a组合的转基因株系生长受低浓度NO3 –供应抑制程度最小。
对不同NO3 –供应条件下的三周龄土培苗进行生理指标测定，结果如图8中的C和表3所示，经低浓度NO3 –供应处理后各转基因杂交株系的生物量(植株干重)、叶绿素含量以及植株NO3 –含量与CK组相比均呈现下降趋势，其中pCAMBIA1302/pCAMBIA2300转基因株系变化最为显著，而GsSnRK1/GsNRT2.4a转基因株系受低浓度NO3 –供应处理影响最小。这表明，GsSnRK1.1和GsNRT2.4a可以协同弥补2kinm/2nrtm突变体在低浓度NO3 –供应中生长受限表型。但无论是GsSnRK1.1还是GsNRT2.4a的突变都会导致GsNRT2.4的NO3 –吸收活性不足，进而不能完全弥补2kinm/2nrtm突变体在低浓度NO3 –中生长受限表型。
采用phos-Tag技术对低浓度NO3 –供应处理下GsSnRK1.1对GsNRT2.4a的磷酸化作用进行鉴定，结果如图8中的D所示，只有GsSnRK1.1/GsNRT2.4a转基因杂交株系中GsSnRK1.1对GsNRT2.4a蛋白进行了磷酸化激活。由此可以得出结论，GsSnRK1.1蛋白激酶通过磷酸化GsNRT2.4a蛋白提高了低浓度NO3 –供应条件下植株NO3 –的吸收活性。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
表3
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Claims (10)
1.GsNRT2.4a蛋白在提高植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用，其特征在于，所述GsNRT2.4a蛋白序列如SEQ ID NO.33所示。
2.GsNRT2.4a基因在提高植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用，其特征在于，所述GsNRT2.4a基因序列如SEQ ID NO.34所示。
3.含SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因或含有SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因和SEQ ID NO.35所示的GsSnRK1基因序列的重组载体、重组微生物细胞或植物在植物硝酸盐吸收效率、提高植物叶绿素含量或植物生物量中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述GsSnRK1基因序列为编码SEQ IDNO.36所示的氨基酸序列的基因序列、编码以SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列为基础将176位的苏氨酸变成谷氨酸的基因序列或编码以SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列为基础将49位的赖氨酸变成甲硫氨酸的基因序列；所述GsNRT2.4a基因序列为编码以SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列为基础将518位的丝氨酸变成丙氨酸的基因序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆或拟南芥；所述生物量是指植物干重。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述应用处在的环境是低氮胁迫的环境。
7.一种提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或植物生物量的育种方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
1)扩增SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因序列，将基因序列插入到表达载体；
2)将步骤1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆或拟南芥中得到转单基因大豆或拟南芥；
3)鉴定步骤2)获得的转基因大豆或拟南芥得到阳性转基因植株；
或者
(1)扩增SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因序列和SEQ ID NO.35所示的GsSnRK1基因序列，将基因序列插入到表达载体；
(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转双基因大豆或拟南芥；
(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆或拟南芥得到阳性转基因大豆或拟南芥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)或步骤(1)中所述表达载体为pCAMBIA1302和pCAMBIA2300。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，扩增GsNRT2.4a基因序列的引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；扩增GsSnRK1基因序列的引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10示。
10.一种提高植物硝酸盐吸收效率、提高叶绿素含量或植物生物量的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：将大豆的SEQ ID NO.34所示的GsNRT2.4a基因序列或SEQ IDNO.35所示的GsSnRK1基因序列在野生型大豆、野生型拟南芥或拟南芥2kinm/2nrtm突变体中超表达获得大豆转基因植株。
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