JP2007507229A - 植物においてストレス耐性を高める方法およびその方法 - Google Patents
植物においてストレス耐性を高める方法およびその方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2003年9月29日に出願した米国仮特許出願番号60/506,717および2003年12月17日に出願した出願番号60/530,453の35 USC§119(e)の利益を主張する。
ほぼ98メガバイトである(MS−DOSで測定して)、各々CSP.ST25.txtと命名したファイルを含む、すべてCD−ROMに存在する、配列表のコンピュータ読出し可能な形態の配列表の2のコピー(配列表コピー1および配列表2コピー2)は2004年9月28日に作製し、出典明示して本明細書の一部とみなす。
本発明は、植物における低温、渇水、塩、低温発芽、熱および他の非生物ストレス耐性、ならびに植物におけるウイルス、菌類、細菌および他の生物ストレス耐性に関する。
種子および果実生産は、数十億ドルの商用産業であり、合衆国の多くの州および世界中の多くの国々の主たる収入源である。商業的に価値のある種子には、種子から搾ることができる植物油にふさわしい、例えばキャノーラ、ワタ種子およびヒマワリ種子が含まれる。エンドウ、インゲンおよびヒラマメのごときマメ科植物の種子も、それらはタンパク質に富むため商業的に価値がある。例えば、ダイズに関しては、40−45%のタンパク質および18%の油脂からなる。また、コーヒーはCoffea arabica植物の乾燥およびローストした種子から生産される価値ある作物であり、一方、チョコレートはカカオの種子または"ビーン"から生産される。同様にして、例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギおよび他の穀物、堅果、豆果、トマトおよび柑橘類果実を含む多くの果実および種子は商業的に価値がある。例えば、トウモロコシ種子は、タコス、コーン油、トルティア、コーンフレーク、コーンミールおよび他の多くのもののごとき多くの食品品目または調理に使用する品目に製造される。トウモロコシは、限定するものではないが、飼料およびエタノール生産を含む多くの製造方法における原料としても使用される。
本発明は、植物の細胞中で低温ショックタンパク質(Csp)を発現する植物を提供する。このcspの発現は、該植物内におけるより大きな非生物的ストレス耐性に通じる。1の形態において、cspをコードするポリヌクレオチドは、作動可能に連結した植物中で機能するプロモーターおよび植物中で機能するターミネーターによって発現する。
(a)グラム陽性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)からの低温ショックタンパク質、
(c)バチルス・ズブチリス低温ショックタンパク質B(CspB)のホモログ、
(d)配列番号:2に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質、
(e)グラム陰性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(f)エスシェリキア・コリ(Escherichia coli)からの低温ショックタンパク質を含むタンパク質、
(g)エスシェリキア・コリ低温ショックタンパク質A(CspA)のホモログ、
(h)配列番号:1に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
(i)アグロバクテリウム・ツメファシエンスからの低温ショックタンパク質、および
(j)配列番号:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63または65のいずれかに実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(a)低温が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(b)高温が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(c)水分が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(d)土壌および/または水分中の高塩分または高イオンが同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(e)同種の非形質転換植物よりもコールドショック後に生存する植物のより高いパーセントを有すること、
(f)同種の非形質転換植物と比較した場合のより高い収量、または
(g)同種の非形質転換植物と比較した渇水に対する耐性。
a)低温ショックタンパク質をコードするDNAを含む組換えDNA分子を植物細胞または複数の細胞のゲノムに挿入し、
b)形質転換植物細胞または複数の細胞を得、
c)該形質転換植物細胞(または複数の細胞)から植物を再生し、ついで
d)高められた特性を示す植物を選択する
工程が含まれる。
本発明の1の態様において、熱耐性、塩耐性、渇水耐性および低温ショック後の生存よりなる群から選択される高められた非生物ストレス耐性を示す植物を選択する。
b)該植物から種子;およびそれから生成した種子を収穫することを含む種子の生産方法も提供する。
(i)配列番号:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63および65よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのフラグメントもしくはシス・エレメントに少なくとも40%相同であるDNAポリヌクレオチドを含むDNA分子を植物細胞のゲノムに導入し、ここに該DNAポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、3'転写終結DNAポリヌクレオチドに作動可能に連結されており;ついで、
(ii)該トランスジェニック植物細胞を選択し;ついで、
(iii)該トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に再生する工程を含み、またこの方法によって作製した植物も提供する。
"外来性"配列とは、外来起源または外来種から生じる配列をいい、あるいは同一起源からの場合にはその起源形態から修飾された配列をいう。例えば、自然のままのプロモーターを用いて、同一または異なる種からの外来性遺伝子の転写を引き起こし得る。
このリストはNational Center for Biotechnology Informationにおいて標準Blast Link設定を用いてコンパイルした。各タンパク質のGenbank配列番号および名称を示す:タンパク質を命名する方法に起因して、幾つかのタンパク質および配列は、タンパク質、cDNA、アレルほかのように幾つかのエントリーを有するであろう。Genbank配列番号は、各エントリーの特定の識別名と考えることができる。エントリーは、クエリー配列を用いる比較において、最高から最低のアイデンティティーの大体の順序で存在する。
このリストはNational Center for Biotechnology Informationにおいて標準Blast Link設定を用いてコンパイルした。各タンパク質のGenbank配列番号および名称を示す:タンパク質を命名する方法に起因して、幾つかのタンパク質および配列は、タンパク質、cDNA、アレルほかのように幾つかのエントリーを有するであろう。Genbank配列番号は、各エントリーの特定の識別名と考えることができる。エントリーは、クエリー配列に対する最高から最低のアイデンティティーの大体の順序で存在する。
実施例1
pMON57396(図1)は、アラビドプシス(Arabidopsis)におけるエスシェリキア・コリCspAと同様のタンパク質(配列番号:56)のアグロバクテリウム媒介形質転換および構成的発現のためのバイナリーベクターである。イー・コリCspA遺伝子をクリーニングするために、2の遺伝子特異的プライマー、MF1およびMFを、National Institutes of Health の一部分であるNational Library of Medicineの一部分であるNational Center for Biotechnology Information(NCBI)からのCspA配列情報(Genbank M30139, GI: 409136)に基づいて設計した。MF1の配列は、CspAの翻訳開始部位にアニールし、5'末端にNcoIサイトを導入するAGGTAATACACCATGGCCGGTAA(配列番号:66)であり、一方MF2の配列はCspAの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にEcoRIサイトを導入するTTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT(配列番号:67)である。PCRを行って、イー・コリCspAを単離した。詳細には、イー・コリDH5α細胞を溶解し、少量のライゼートを鋳型として用い、MF1およびMF2プライマー、ならびにRoche Molecular Biochemicals社(Indianapolis, IN)からのTaqポリメラーゼおよびdNTPを用いてCspA遺伝子を増幅した。温度サイクル条件は以下のとおりとした:94℃、1分、その後に94℃、16秒;55℃、1分および72℃、1分のサイクルを30回繰り返す。増幅したCspA DNAは、ゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびEcoRIで消化し、予めNcoIおよびEcoRIでの消化によって線状化しておいたバイナリーベクターpMON23450(図2)に連結した。連結はT4リガーゼを用い、および製造業者によって推奨された以下の手順に従って行った(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換した(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、 Cold Spring Harbor Press, 1989)。形質転換した細胞を適当な選択培地にプレートし(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版, Cold Spring Harbor Press, 1989)、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全インサート配列を決定した。
pMON57397(図2)は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびエスシェリキア・コリCspAのようなタンパク質の構成的発現のためのバイナリーベクターである。pMON57397を作製するためには、FlagエピトープタグによってC−末端で標識されたエスシェリキア・コリCspA遺伝子を含むバイナリーベクターpMON57396を制限酵素XhoIおよびSalIで消化してベクター中のこれらのサイトを切断し、FLAGエピトープタグを放出した(FLAGタグはオリゴペプチドDYKDDDK, Sigma, St. Louisをコードする)。ついで、線状化したプラスミドを精製し、再連結した。連結はT4リガーゼを用い、かつ、製造業者(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)によって推奨されている手法に従って行った。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリに形質転換した(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 1989)。形質転換細胞は適当な選択培地(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 1989)にプレートし、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全なインサート配列を決定した。前記クローニングは、配列番号:57に類似するタンパク質をコードするプラスミドを生じる。
pMON57398(図4)は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスCspBのようなタンパク質(配列番号:59)の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスCspB遺伝子をクローニングするためには、2の遺伝子特異的プライマーMF3およびMF4aを、National Institutes of Health の一部分であるNational Library of Medicineの一部分であるNational Center for Biotechnology Information(NCBI)からのCspB配列情報(Genbank U58859, gi:1336655)に基づいて設計した。MF3の配列は、CspBの翻訳開始部位にアニールし、5'末端にNcoIサイトを導入するAGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG(配列番号:69)であり、一方MF4aの配列はCspBの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にEcoRIサイトを導入するTCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT(配列番号:70)である。PCRを行って、ビー・ズブチリスCspBを単離した。バチルス・ズブチリス細胞はCarolina Biological Supply(Burlington, NC)から得、細胞を溶解し、少量のライゼートを鋳型として用い、MF3およびMF4aプライマー、ならびにRoche Molecular Biochemicals社(Indianapolis, IN)からのTaqポリメラーゼおよびdNTPを用いてCspB遺伝子を増幅した。温度サイクル条件は以下のとおりとした:94℃、1分、その後に94℃、16秒;55℃、1分および72℃、1分のサイクルを30回繰り返す。増幅したCspB DNAは、ゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびEcoRIで消化し、予めNcoIおよびEcoRIでの消化によって線状化しておいたバイナリーベクターpMON23450(図5)に連結した。連結はT4リガーゼを用い、および製造業者によって推奨された手順に従って行った(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換し(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、 Cold Spring Harbor Press, 1989)、後日、コロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全インサート配列を決定した。
pMON57399(図6)は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスCspBのようなタンパク質(配列番号:61)の構成的発現のためのバイナリーベクターである。pMON57399を作製するために、FlagエピトープタグによってC−末端で標識されたバチルス・ズブチリスCspB遺伝子を含有するバイナリーベクターpMON57398(前記実施例を参照されたい)を制限酵素XhoIおよびSalIで消化してベクター中のこれらのサイトを切断し、FLAGエピトープタグを放出した(FLAGタグはオリゴペプチドDYKDDDK, SIGMA, St Louisをコードする)。ついで、線状化したプラスミドを精製し、再連結した。連結はT4リガーゼを用い、かつ、製造業者(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)によって推奨されている手法に従って行った。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換した(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 1989)。形質転換細胞は適当な選択培地(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 1989)にプレートし、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全なインサート配列を決定した。このクローニングは、該プラスミドに挿入された配列番号:61に類似するタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを生じる。
アラビドプシス植物は、多くの利用可能な方法のうちのいずれか1によって形質転換し得る。例えば、アラビドプシス植物は、真空浸潤によるイン・プランタ形質転換法を用いて形質転換し得る(Bechtoldら, In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/life sciences 316: 1194-1199 (1993))。この例は、どのようにしてアラビドプシス植物を形質転換し得るかを説明する。
土壌を入れた2.5インチのポットを準備し、それを土壌が締まりすぎて充填されないようかつメッシュが土壌表面と接触することを確かめつつ、メッシュスクリーンでカバーする(これは、発芽する幼植物がメッシュを通して生長し得ることを保証する)。播種し、発芽ドームでカバーする。種子を3−4日春化処理する。16時間明所/8時間暗所、20−22℃、70%湿度の条件下で植物を生長させる。一週間に2回水を与え、1/2×(製造業者によって推奨されている強度の半分)のPeters 20-20-20肥料(Hummert International, Earth City, MOからのもの))を下方から与えた。微量元素(Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements)(製造業者によって推奨されている全部の強度で)を一週おきに添加した。約1−2週間後に、ドームを除去し、ポット当たり1または2の植物までポットを間引きした。発達した場合には第一の薹(primary bolt)を摘み取って、第2の薹形成をより促進する。5−7日内に、植物は浸潤する準備ができるであろう。
アグロバクテリウムABI株を、100mg/mLのスペクチノマイシン、100mg/Lのストレプトマイシン、25mg/Lのクロラムフェニコールおよび50mg/Lのカナマイシン(SSCKと表示する)を含有するLBプレートにストリークする。浸潤の2日前に、アグロバクテリウムのループを10mlのLB/SSCKを含有する試験管に入れ、シェーカーに設置し、暗所下、28℃にて一晩増殖させる。翌日、アグロバクテリウムを400mlのYEP/SSCK中に1:50で希釈し、シェーカーに設置し、28℃にて16−20時間増殖させる。(注記:本発明者らは、LBを最初の一晩培養に使用し、YEPを大スケールの一晩培養に使用した場合、形質転換率が顕著に良好であることを見出した)。
500mlの遠心ボトルに注入し、ついで3500rpmにて20−25分間遠心することによってアグロバクテリウム細胞を集める。上清を捨てる。ペレットを乾燥し、ついで0.44nMのベンジルアミノプリン(BAP)(DMSO中の1.0mg/Lストック液をリットル当たり10μl)およびLehle Seeds社(Round Rock, TX)からの0.02%のVac-In-Stuffを含む25mlの浸潤培地(0.5%のMSベース塩、1%のGamborg’s B−5ビタミン、5%のスクロース、0.5g/LのMES、pH5.7)に再懸濁する。新たにBAPおよびSilwet L-77を浸潤の日に添加する。200μlのSilwet L-77および20μlのBAP(0.5mg/Lのストック液)を添加する。残余部(blank)として浸潤培地を用いて、1:10希釈のアグロバクテリウム懸濁液のOD600を測る。真空浸潤するための400mlのアグロバクテリウム懸濁液/浸潤培地、OD600=0.6に必要な体積を計算する。
ほぼ浸潤2週間後に、Lehle Aracons(Lehle Seeds, Round Rock, TX)を用いることによって、植物を個別に円錐形にする。すべての種子が成熟しおよび種子をつけた後(浸潤後〜4週間)、水から植物を取り出して種子を乾燥する。ほぼ2週間後に、円錐形の下方の枝を切り取ることによって種子を収穫する。篩を用いることによって種子を浄化して、長角果および枝材料を捕獲し、種子がそれを通ることを許容する。種子をエンベロープまたは15mlの三角試験管に入れる。
〜26℃および16/8の明暗サイクルにて5−10日後に、形質転換体は緑色植物体として見えるであろう。さらに1−2週間後に、植物は少なくとも1セットの本葉を有するであろう。植物を土壌に移し、発芽ドームでカバーし、正常なアラビドプシス生長条件を有する生長チャンバーに移動する。新たな生長が明らかになるまでカバーを維持する(通常5−7日)。
野生型非トランスジェニックおよびCspAまたはCspBトランスジェニック・アラビドプシス植物の生長を比較するために、滅菌ペトリ皿で垂直生長(verticle growth)させた:
野生型またはトランスジェニック種子は以下の方法を用いて液体滅菌した:
・70%エタノール中での5分インキュベートにつづくボルテックス混合
・30%Chlorox(6.15%次亜塩素酸ナトリウム)+0.01%Triton X-100中での5分インキュベートにつづくボルテックス混合
・5の連続滅菌水洗浄
導入:
これは、水平ペトリ皿中の寒天培地上で通常の温度にて発芽させて冷やすのにシフトする際に生長し続けたトランスジェニック・アラビドプシス種子の能力を評価する手順である。要するに、対照植物からの種子およびテスタートランスジェニック植物からの種子を滅菌し、等級別に分類し、ペトリ皿のいずれかの半分に6×8のグリッドでプレートした。プレートは水平位置、通常温度にて、1週間インキュベートし、ついで、プレートの水平位置を維持しつつ、さらに2週間冷蔵温度にシフトした。幼植物の天蓋領域をデジタル写真によって記録し、画像ソフトウェアを用いて定量化した。テスター幼植物の全天蓋領域の対照幼植物のそれとの比率は、トランスジェニックテスター系統において関心のある種々の遺伝子の低温耐性潜在性を比較することができる。
−ペトリ皿:Falcon #35-1112(100mm×深さ15mm)
−培地:Sigma M5519=Murashige & Skoog Basal Media
−Phytagel(Sigma #P-8169)
−寒天培地をオートクレーブ処理し、そこからプレートに注ぐ1リットルのガラスボトル。
−磁気スターラーおよび磁気攪拌バー
−50mlのプラスチック製ピペットを使用し得る電気ピペッター
−種子をプレートするためのプラスチック製拡大レンズを有する小さな蛍光ボックス
−P1000 Gilsonピペッター(または相等物)および無菌チップ
−P200 Gilsonピペッター(または相等物)および無菌チップ
−70%エタノール、無菌
−30%Chlorox漂白剤+0.1% Tween 20
−滅菌ろ過した脱イオン水
−無菌の小型遠心チューブおよび試験管ラック
−好ましくは暗所の、4℃低温室、冷温ボックスまたは冷蔵庫
−〜150μE/m2/秒の光源を含む、22℃のPercival植物生長チャンバーまたは相等物
−〜150μE/m2/秒の光源を含む、8℃のPercival植物生長チャンバー
−半透過性外科テープ3M Microporeテープ(3M #1530-1)
−黒色(Sharpie)マーカー
−トラップを有する真空吸引機
−グラシン・バランスウェイト紙(VWR #12578−165)
−計算機
−ノート
−IBM コンパチブル・コンピュータ
−Image-Pro Plusソフトウェア, version 4.1.0.0
−Microsoft Excelソフトウェア
1−保存バイアル用または無菌小型遠心チューブのエンベロープ用の小分けした種子
2−種子の同一性を保持するためのシャーピエで試験管を標識する
3−以下の溶液で順次洗浄し、ついで以下に示す時間待機することによる、試験管中の種子の表面滅菌。洗浄の間に少なくとも2回試験管をひっくり返して種子上の溶液の良好な表面接触を確実にする。種子は試験管の底部に沈み、柔軟なペレットを作る:
a.3ないし5分間の、70%エタノールでの滅菌
b.3ないし5分間の、30%Chlorox漂白剤+0.1% Tween 20
c.30秒間の滅菌ろ過した脱イオン水
d.c工程をさらに4回繰り返し、最後の回に〜0.5mlの滅菌水を種子ペレットの上に残す。
[別法として、種子は寒天培地ペトリ皿に直接的に置いてテープを貼って密閉し、ペトリ皿を、以下に示す8℃インキュベーションに先だって、暗所下、4℃にて3日間置くこともできる]
3−50ml無菌ピペットを付けた電動ピペッターを用いてプレートに層状流動フードで注いで各プレートに40mlの培地を配達し、直ちにプレートを蓋でカバーする。
5−プレートを標識し、種子をプレートする:
CspAおよびCspB遺伝子のPCR産物を、製造業者のプロトコール(Invitrogen, Carlsbad, CA)に従ってベクターpCR−TOPO2.1に連結した。pCR−TOPO2.1誘導体のNcoI/EcoRIフラグメントをpMON48421にサブクローニングし(図7)、同じ制限酵素によって線状化した。35Sプロモーター、Csp遺伝子およびe9ターミネーターを包含するpMON48421誘導体のNotIフラグメントを、NotIサイトでpMON42916にサブクローニングして(図17)、各々CspAおよびCspB遺伝子を含むpMON56609(図8)およびpMON56610(図9)を作製した。該プラスミドを、公知の方法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。pMON56609は配列番号:7に類似するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むと考えられる。pMON56610は配列番号:9に類似するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むと考えられる。
アグロバクテリウムの調製:
アグロバクテリウムEHA105株を、カナマイシン50mg/Lおよびハイグロマイシン50mg/Lを含有するLBプレート(LB/KHと表示する)上にストリークする。共培養の2日前に、アグロバクテリウムのループを10mlのLB/KHを含む試験管に移し、暗所下、28℃にて24時間、シェーカー上でインキュベートする。この培養物を20mlのLB/KH中で1:100に希釈し、暗所下、28℃にて一晩、シェーカー上でインキュベートする。翌日に、この培養物の1:2希釈物1mlをキュベットに採り、残部としてLB/KHを用いてOD600を採った。共培養のO.D. 1.0のアグロバクテリウム懸濁液5mlに必要な体積を計算する。
温室で生長した日本晴および台北309イネ品種から円錐花序を採取する。円錐花序は50%の市販の漂白剤に10分間浸漬し、つづいて滅菌蒸留水ですすぐことによって滅菌した。円錐花序を70%のアルコール処理に3分間付した。ついで、種子を円錐花序から採り、個々に殻を取り、0.1%のTween20溶液を含むFalcon試験管に移した。ついで、層状エア流動チャンバー中で、種子を70%アルコールで処理した。ついで、種子を無菌水ですすいだ。この後に、50%漂白剤処理を45分間行った。種子は無菌蒸留水で5回すすいだ。最後に、種子を0.1%の塩化水銀(II)処理に付した。種子は滅菌蒸留水で再度8回洗浄した。
第3本葉展開期における低温ストレス応答−CspBおよびCspAイネ・トランスジェニック植物
植物材料の調製:
発芽:種子は0.01%塩化水銀(II)で3分間処理することによって滅菌し、milique水中で10回よく洗浄して微量の塩化水銀(II)を除去した。滅菌種子は、milique水に3時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機(Serwell Instruments Inc.)を用いて、30℃および60%RH、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
プロトコール:第3本葉展開期のイネ幼植物(12日齢)を、100μmol./mt2/秒の光および70% RH(Percival生長チャンバー)の存在下、10℃にて4日間、低温ストレスに付した。ストレス処理の後に、植物を10日間温室内で回復させ、10日目に生存した植物の生長観察および写真証拠を記録した。各処理は1列当たり10回反復し、それらは完全に無作為化した。
プロトコール:第3本葉展開期の幼植物を、1000μmol./mt2/秒の光の存在下、8℃の低温ストレスに1日間曝した。その後に、幼植物を温室中、28℃にて15日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
プロトコール:第3本葉展開期のイネ幼植物(12日齢)を、生長チャンバー中、1000μmol./mt2/秒の光および70%RHの存在下、10℃の低温ストレスに3日間付した。ストレス処理の後、植物を温室中で15日間回復させ、15日目に生長観察を記録した。各値は12の観察の平均値であり、実験は以下の完全無作為化(CRD)実験法によって行った。
実験I
プロトコール:第3本葉展開期の幼植物を、1000μmol.の光の存在下、10℃の低温ストレスに3日間曝した。その後に、幼植物を温室中、28℃にて30日間回復させ、回復の終期に植物の高さおよびパーセント幼植物生存を記録した(この実験においては、各トランスジェニック系統について8の反復を用い、野生型については10の反復を用いた)。
プロトコール:第3本葉展開期の幼植物を、1000μmol.の光の存在下、10℃の低温ストレスに1日間曝した。その後に、幼植物を温室中、28℃にて30日間回復させ、回復の終期に植物の高さおよびパーセント幼植物生存を記録した。
植物材料の調製:
発芽:種子は0.01%塩化水銀(II)で3分間処理することによって滅菌し、よく洗浄して微量の塩化水銀(II)を除去した。滅菌種子は、milique水に3時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機(Serwell Instruments Inc.)を用いて、30℃および60%RH、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
プロトコール:第3本葉展開期のイネ幼植物(12日齢)を、70%RHの存在下、50℃の熱ストレスに3時間付した。ストレス処理の後に、植物を温室中で15日間回復させ、15日目に生長観察を記録した。各値は12の観察の平均値である。
プロトコール:第3本葉展開期の幼植物を、53℃の高温ストレスに2時間曝し、その後に、幼植物を温室中、28℃にて15日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
実験I
プロトコール:第3本葉展開期の幼植物を、53℃の高温ストレスに3時間曝し、その後に、幼植物を温室中、28℃にて30日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
プロトコール:第3本葉展開期の幼植物を、1000μmol.の光の存在下、50℃の高温ストレスに1日間曝し、その後に、幼植物を温室中、28℃にて30日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
植物材料の調製:
発芽:種子は0.01%塩化水銀(II)で3分間処理することによって滅菌し、その後にmilique水で10回よく洗浄して微量の塩化水銀(II)を除去した。滅菌種子は、milique水に3時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機(Serwell Instruments Inc.)を用いて、30℃および60%RH、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
実験プロトコール
発芽した幼植物(3日齢)を、容水量(FC)の点からみてバーミキュライトを含有するPVCポット中に作製した、2の異なるレベルの水ストレスに移した。FC−100%は飽和条件(すなわち、100gのバーミキュライトは350mlの水を必要とする)である(Sharpら, 1988, Planl Physiol. 87: 50-57)。必要な量の水を添加することによって、バーミキュライトを含有するPVCポットに異なるレベルの水ストレス(すなわち、50%FCおよび25%FC)を作製した。異なるストレスレベルにおける水の状態は、実験を通して、蒸発散に起因して損失した水の量を毎日添加することによって一定に維持した。幼植物は800μmol./mt2/秒の光強度および60%RHの存在下、温室中で、水ストレス条件にて15日間生長させた。15日目に、根およびシュートの生長を記録し、写真を撮影した。各処理を列当たり10回繰り返し、それらを完全に無作為化した。
a.植物材料の調製:
発芽:種子は0.01%塩化水銀(II)で3分間処理することによって滅菌し、その後にmilique水で10回よく洗浄して微量の塩化水銀(II)を除去した。滅菌種子は、milique水に3時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機(Serwell Instruments Inc.)を用いて、30℃および60%RH、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
CspB−R3植物の分析
プロトコール:発芽種子(48時間齢)を、200mMのNaClを含有するバーミキュライトを含むPVCポットに移すことによって塩ストレスに付し、ついで10日間生長させた。ストレスの10日後に、幼植物を水を含有するバーミキュライトの新たなトレイに移すことによって15日間回復させた。植物の高さのごとき生長観察は回収の終期に記録した。この実験は、完全無作為化法(CRD)に従って温室中で行い、処理当たり8回の繰り返しを維持した。
CspAおよび野生型(日本晴−農林5号)の4の独立したトランスジェニック系統(1、2、3、4)からの発芽幼植物を、バーミキュライトを含有するポットに移すことによって水ストレスに付した。3のレベルの水様式を維持し、それらは100%容水量(FC−100=3.72mlの水/gバーミキュライト)、25%容水量(FC25=0.93mlの水/gバーミキュライト)、15%容水量(FC15=0.558ml/gバーミキュライト)である。幼植物は、温室中、800μmol./mt2/秒の光強度および60%RHの存在下で30日間、異なる水様式で生長した。異なるストレスレベルにおける水の状態は、実験を通して、蒸発散に起因して損失した水の量を毎日添加することによって一定に維持した。30日の終期に、植物に水を添加することによって回復させ、レベルをFC100とし、15日間維持した。実験の間、ストレスの終期(ES)の植物の高さ(pl.ht)および根(R)シュート(S)の長さおよび乾燥重量を記録した。
各処理は系統当たり10回繰り返し、それらを完全に無作為化した。
cspA
pMON73607の構築(図10)
1.ベクターpMON61322をNcoIおよびApaIで切断して、バックボーンを開け、CspA遺伝子を取り出す。バックボーンフラグメントをゲル精製によって単離する。
2.イー・コリcspA遺伝子をpMON56609(図8)ベクターからPCR増幅する。PCRプライマーは遺伝子の5'末端のNcoIサイトの左で使用し、3'末端にSwaIおよびApaIサイトを作製する。
3.PCRフラグメントおよびpMON61322(図11)バックボーンを連結する。ライブラリー有効DH5α細胞に形質転換する。ApaIおよびNcoIを用いてコロニーをスクリーニングしてインサートを含むクローンを同定する。
4.ベクターを配列決定して、プラスミドのcspA遺伝子および他の選択した領域の忠実性を確認する。
pMON73608の構築(図12)
1.ベクターpMON61322をNcoIおよびApaIで切断して、バックボーンを開け、HVA1遺伝子を取り出す。バックボーンフラグメントをゲル精製によって単離する。
2.ビー・ズブチリスcspB遺伝子をpMON56610ベクターからPCR増幅する。PCRプライマーは遺伝子の5'末端のNcoIサイトの左で使用し、3'末端にSwaIおよびApaIサイトを作製する。
3.PCRフラグメントおよびpMON61322バックボーンを連結する。ライブラリー有効DH5α細胞に形質転換する。ApaIおよびNcoIを用いてコロニーをスクリーニングしてインサートを含むクローンを同定する。
4.ベクターを配列決定して、プラスミドのCspB遺伝子および他の選択した領域の忠実性を確認する。
トウモロコシ植物は、当該技術分野で知られている方法(例えば本明細書中の実施例20−25を参照されたい)によって形質転換し得る。
コピー数についてのトランスジェニック植物の分析は、以下の様式で行う。
葉組織は若葉から、出来るだけ基部近くからかつ葉の1の側から収集する。試料は96ウェルプレートに入れ、一晩凍結乾燥する。組織は各ウェルに3の3mm金属ボールを入れ、Mega Grinderを用いて1200rpmにて2分間振盪することによってホモジナイズする。DNAはβ−メルカプトエタノール、pH8に緩衝化したTris、EDTA、NaClおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有する標準的な緩衝液を用いて抽出する。抽出は酢酸カリウムにつづいてクロロホルムを用いて行い、沈殿はイソプロパノールを用いて行う。遠心した後に、エタノール溶液で洗浄し、乾燥し、DNAをさらに分析する前にTris−EDTA緩衝液に再懸濁する。
本発明者らは、His−標識抗原を合成および精製し得るベクター(Novagen, Merck KgaA, Darmstadt, Germanyの系列会社)を用いてイー・コリ中で発現させるために、cspAおよびcspBの全長オープンリーディングフレームを用いる。精製した抗原を用いて、市場の供給業者、例えばStrategic Biocolutionsを用いてポリクローナル抗体を生成する。生成した抗体を用いて、CSPタンパク質の発現について植物を試験する。
トランスジェニック・トウモロコシ系統の発達
初代形質転換体はCORN OF GERMPLASM A、CORN OF GERMPLASM CおよびCORN OF GERMPLASM Dのごとき生殖質において作製する。初代形質転換体は自殖(self)ならびに同系遺伝子型の非トランスジェニック植物に戻し交配する。自殖植物からの種子を圃場に植え、Taqman接合子アッセイによってアッセイして、推定ホモ接合選択体、推定ヘテロ接合選択体および陰性選択体を同定する。推定ヘテロ接合選択体は、適当なテスター、例えばCORN OF GERMPLASM BおよびCORN OF GERMPLASM Dの複数の植物と交配する。雑種種子を収穫し、手で殻を剥き、選択によって保存する。他の繁殖方法を用いることもできる。例えば、本明細書の実施例29を参照されたい。
幼植物は、処理が測定可能な表現型応答を生じるように、最適下限レベルに利用可能な水を限定する処理を受ける。例えば、この処理は、進行的な水不足に通じる長期間にわたって水の量を制限する形態、または、幼植物を水耕的にまたは塩処理で浸透的にストレスをかけることによる急激な欠乏の態様をとる。トランスジーン陽性植物は、処理に対する改善された表現型応答でスクリーニングされる。測定する表現型応答には、処理の間または処理後回復期間後のシュート生長速度または乾燥重量蓄積、しおれもしくは立枯れまたは立枯れ回復、および根の増殖速度および乾燥重量蓄積が含まれ得る。改善された応答を有するものは、圃場効率試験に進める。スクリーニングには、生長チャンバーまたは温室のごとき制御された環境中の小ポットで生長させた多くのトランスジーン陽性およびトランスジーン陰性の植物が必要であろう。スクリーニングした植物の数は、適用した処理および測定した表現型と関連する分散によって示す。
圃場生長植物は、処理が測定可能な表現型応答を生じるように最適下限レベルまで利用可能な水を限定する処理を受ける。例えば、この処理は、植物の後期栄養または早期繁殖発育のいずれかの間に進行的な水不足に通じる、長期間にわたり植物の利用可能な水の量を制限する形態をとり得る。トランスジーン陽性植物は、トランスジーン陰性植物に対して、処理に対する改善された表現型応答についてスクリーニングされるであろう。測定される表現型応答には、処理の間のシュート生長速度、葉のしおれまたは立枯れ(leaf wilting)、穀物収量、ならびに穀粒数および穀粒重量のごとき穂収量要素が含まれ得る。改善された応答を有するこれらの事象は、初年収量試行を促進するであろう。スクリーニングは、制御可能な潅漑を有する2の乾燥圃場場所において典型的な栽培密度で適用するであろう。スクリーニングされた植物の数は、適用した処理および測定された表現型と関連する変化によって指図される。
記載した遺伝子の幾つかを、以下(実施例17−30)同様にしてクローニングし、植物に形質転換し、表現型決定する。例えば、ヌクレオチドおよび配列番号:4−53をコードするヌクレオチド。
GATEWAY(登録商標)デスティネーション(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)植物発現ベクターは、当業者に知られている方法を用いて構築した。発現ベクターのエレメントを表17に要約する。イー・コリで発現する細菌複製機能を含むプラスミドpMON65154のバックボーンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子はプラスミドpSK−に由来する。pMON64154における植物発現エレメントは当業者が入手可能であり、各エレメントについて表17に参照を記載する。位置に関する表17中のすべての参照は、図13に開示するプラスミドマップ上の各エレメントの塩基対座標を示す。一般的に、pMON65154はネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼII(nptII)をコードする遺伝子に作動可能に連結したカリフラワーモザイクウイルスS35プロモーターを含む選択マーカー発現カセットを含む。選択マーカー発現カセットの3'領域には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子(nos)の3'領域につづいて3'にジャガイモプロテイナーゼ・インヒビターII(pinII)遺伝子の3'領域が含まれる。プラスミドpMON65154には、さらに、GATEWAY(登録商標)クローニング法を用いて関心のある遺伝子を挿入することができる植物発現カセットが含まれる。GATEWAY(登録商標)クローニングカセットは、イネ・アクチン1プロモーター、エキソンおよびイントロンによって5'で挟まれ、かつ、ジャガイモpinII遺伝子の3’領域によって3'で挟まれている。GATEWAY(登録商標)法を用いて、クローニングカセットを関心のある遺伝子によって置き換えた。関心のある遺伝子を含むベクターpMON65154およびその誘導体は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメントのごとき直接DNAデリバリーを介する植物形質転換の方法に特に有用であった。当業者であれば、当業者に知られている方法を用いて、同様の特徴を有する発現ベクターを構築し得るであろう。なお、当業者であれば、他のプロモーターおよび3'領域が関心のある遺伝子の発現に有用であり、他の選択マーカーを使用し得ることを認識するであろう。
プラスミドベクターpRG81に存在するエレメントを表18に記載する。
コード配列は、pMON65154(図13)のごときGATEWAY(登録商標)デスティネーション植物発現ベクターにインサートする前に、PCRによって増幅した。すべてのコード配列は、クローニングした完全長配列またはcDNAライブラリーから所望の配列の増幅を許容するDNA配列情報のいずれかとして入手可能であった。PCR増幅用のプライマーは、5'および3'非翻訳領域の大部分を排除するために、コード配列の開始コドンおよび終止コドンにおいてまたはその付近において設計した。GATEWAY(登録商標)ベクター(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)への組換えによるクローニングを許容するために、PCR産物にattB1およびattB2配列を付けた。
attB1フォワード・プライマー:
5' GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN鋳型特異的配列3’(配列番号:71)
5'GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN鋳型特異的配列3'(配列番号:72)
attB1遺伝子特異的フォワード・プライマー:
5' CCTGCAGGACCATGフォワード遺伝子特異的プライマー3'(配列番号:73)
5' CCTGCAGGCTCGAGCTAリバース遺伝子特異的プライマー3’(配列番号:74)
attB1アダプターフォワードプライマー:
5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3'(配列番号:75)
5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA 3'(配列番号:76)
GATEWAY(登録商標)クローニング法(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて、トウモロコシ形質転換に使用するための発現ベクターを構築した。GATEWAY(登録商標)法は、GATEWAY(登録商標)Cloning Technology Instruction Manual(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)に十分に記載されている。GATEWAY(登録商標)システムの使用により、植物発現ベクターへのコード配列のハイスループットクローニングが促進される。attB1およびattB2配列によって挟まれた遺伝子配列は、前記のようにPCRによって作製した。いずれの組換え配列、attB1およびattB2がコード配列の5'および3'に位置するかに依存して、センスおよびアンチセンス発現ベクターが作製された。センスまたはアンチセンス向きでいずれかのコード配列をインサートし得る植物発現ベクター、pMON65154(図13)は、実施例1に記載したように構築し、GATEWAY(登録商標)クローニング手法におけるデスティネーションベクターとして使用した。
生殖質のトウモロコシ 植物は温室で生育させた。雌穂は、胚が1.5ないし2.0mm長である場合、通常は授粉10ないし15日後、たいていの場合は授粉11ないし12日後に植物から収穫した。雌穂は80%エタノールを雌穂に噴霧するかまたは浸漬し、その後に風乾することによって表面滅菌した。別法として、雌穂は10%SDSを含有する50%CLOROX(登録商標)中に20分間浸漬し、その後に滅菌水で3回濯ぐことによって表面滅菌した。
トウモロコシ細胞および他の単子葉植物のアグロバクテリウム媒介形質転換の方法は知られている(Hieiら, 1997; 米国特許第5,591,616号;米国特許第5,981,840号;公開欧州特許出願 EP 0 672 752)。種々の菌株のアグロバクテリウムを使用し得る(前記参考文献を参照されたい)が、本発明者らはABI株を好ましく用いた。アグロバクテリウムのABI株は、37℃にて培養することによりTiプラスミドを排除した、さらに修飾したTiプラスミドpMP90RK(KonczおよびSchell, 1986)を含むC58ノパリン型菌株であるA208株に由来する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのバイナリーベクターシステム(Anら, 1998)を、トウモロコシを形質転換するために好ましく使用した。別の同時組込みTiプラスミドベクターが記載されており(Rogersら, 1988)、トウモロコシを形質転換するために使用し得た。関心のある1またはそれを超える遺伝子を含むバイナリーベクターは、エレクトロポレーション(Wen-junおよびForde, 1989)またはtriparental mating(Dittaら, 1980)を用いて、無力化したアグロバクテリウム株に導入し得る。バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子、スクリーニングマーカー遺伝子および/または形質転換植物に所望の表現型特性を付与する1もしくはそれを超える遺伝子を含み得る。例示的なバイナリーベクター、pMON30113を図4に示す。他のバイナリーベクターを用いることができ、それらは当業者に知られている。
本実施例では、アグロバクテリウムを用いたトウモロコシカルスの形質転換の方法を記載する。該方法を、nptII選択マーカー遺伝子およびパロモマイシン選択剤を用いて例示する。当業者は、その代わりに他の選択マーカーおよび選択剤の組合せを使用し得ることに気付くであろう。
に移すことによって開始した。暗所下、27ないし28℃にて2週間培養した後に、カルスは20μM硝酸銀、500mg/Lカルベニシリンおよび50mg/Lパロモマイシンを含むmedium 211(medium 211QRG)に移した。カルスは2週間後に新鮮なmedium 211 QRGに継代培養し、さらに暗所下、27ないし28℃にて2週間培養した。ついで、カルスは、20μM硝酸銀、500mg/Lカルベニシリンおよび75mg/Lパロモマイシンを含むmedium 211に移した。暗所下、27ないし28℃にて2−3週間培養した後に、パロモマイシン抵抗性カルスを同定した。当業者は、カルスの継代培養の間の期間が概算であって、より頻繁な間隔、例えば2週間よりも1週間で組織を移すことによって選択プロセスを加速し得ることを認識するであろう。
マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントのほぼ4時間前に、未熟胚をmedium 211SV(12%までスクロースを添加したmedium 211V)に移した。25の未熟胚を、胚盤の子葉鞘の末端を20°の角度で培養培地に僅かに押しつけつつ5×5のグリッドで配置して、好ましくは60×15mmペトリ皿に置いた。組織はボンバードメントの前に暗所下で維持した。
形質転換体は、トランスジェニック・ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼII(nptII)遺伝子の発現に基づいて、パロモマイシンを含む培養培地上で選択した。DNAデリバリーの24時間後に、組織は25mg/Lパロモマイシンを含有する211V培地(medium 211HV)に移した。暗所下、27℃にて3週間インキュベートした後に、組織を50mg/Lパロモマイシンを含有するmedium 211(medium 211G)に移した。組織は3週間後に75mg/Lパロモマイシンを含有するmedium 211(medium 211XX)に移した。形質転換体は、選択の9週間後に単離した。表Yは、本明細書に開示したマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの方法を用いた形質転換体実験の結果を開示する。
繁殖性トランスジェニック植物は、形質転換したトウモロコシ細胞から作製した。形質転換カルスをmedium 217(N6塩、1mg/Lチアミン−HCl、0.5mg/Lナイアシン、3.52mg/Lベンジルアミノプリン、0.91mg/L L−アスパラギン一水和物、100mg/Lミオイノシトール、0.5g/L MES、1.6g/L MgCl2・6H2O、100mg/Lカゼイン加水分解物、0.69g/L L−プロリン、20g/Lスクロース、3g/L GERGRO(登録商標)、pH5.8)に暗所下、27℃にて5ないし7日間移した。体細胞胚成熟およびシュート再生はmedium 217で開始した。組織は、シュート発達のために、medium 127T(MS塩、0.65mg/Lナイアシン、0.125mg/Lピリドキシン−HCl、0.125mg/Lチアミン−HCl、0.125mg/L パントテン酸カルシウム、150mg/L L−アスパラギン、100mg/Lミオイノシトール、10g/Lグルコース、20g/L L−マルトース、100mg/Lパロモマイシン、5.5g PHYTAGAR(登録商標)、pH5.8)に移した。
核酸はR0植物の葉組織から単離し、収集し、96ウェル収集ボックスで瞬間凍結させ、0ないし2週間後に苗木を土壌に移した。ほぼ100mgの組織を各植物から収集し、分析まで−80℃にて保存した。
R0植物中のトランスジーンのコピー数を、TAQMAN(登録商標)法を用いて決定した。pMON65154およびpRG76 GATEWAY(登録商標)デスティネーションベクターは、トランスジーン挿入のコピー数をアッセイするのに使用し得たジャガイモpinII遺伝子の3'領域由来の配列を用いて構築した。pinIIフォワードおよびリバース・プライマーは以下の通りであった:
フォワード・プライマー 5'ccccaccctgcaatgtga 3'(配列番号:77)
リバース・プライマー 5'tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3'(配列番号:78)
5'cctagacttgtccatcttctggattggcca 3'(配列番号:79)であった。
プローブは蛍光色素FAM(6−カルボキシフルオレセイン)で5'末端を標識し、クエンチャー色素TAMRA(6−カルボキシ−N,N,N',N'−テトラメチルローダミン)をリンカーを介してプローブの3'末端に結合した。TAQMAN(登録商標)プローブは、Applied Biosystems(Foster City, CA)から得た。 SAT、単一コピーのトウモロコシ遺伝子を、TAQMAN(登録商標)コピー数アッセイにおける内部対照として使用した。SATプライマーは以下の通りであった:
フォワード・プライマー 5'gcctgccgcagaccaa 3'(配列番号:80):
リバース・プライマー 5'atgcagagctcagcttcatc 3'(配列番号:81)。
5'tccagtacgtgcagtccctcctcc 3'(配列番号:82)であり、プローブはその5'末端を蛍光色素VIC(登録商標)(Applied Biosystems, Foster City, CA)で、その3'末端をクエンチャー色素TAMRAで標識した。
本発明のトランスジーンの発現は、Applied Biosystems(Foster City, CA)からのTAQMAN(登録商標)EZ RT−PCRキットを用いるTAQMAN(登録商標)RT−PCRによってアッセイした。RNA発現は、トランスジェニック標準における発現、pinII3'非翻訳領域に作動可能に連結したビー・チューリンジエンシス(B. thuringiensis)cryIAI遺伝子を含むDBT418と命名したトランスジェニック・トウモロコシ事象に対してアッセイした。DBT418事象は、アワノメイガのごとき鱗翅目昆虫に対する商業レベルの抵抗性を付与するレベルでcryIAI遺伝子を発現し、ブランド名DEKAKBt(登録商標)でDEKALB Genetics Corporationによって市販されている。pMON65154およびpRG76 GATEWAY(登録商標)デスティネーションベクターは、デスティネーションベクターに挿入したいずれかのコード配列についてトランスジーン転写レベルをアッセイするために使用し得るジャガイモpinII遺伝子の3'領域由来の配列を用いて構築した。pinIIプライマーおよび以前に記載したプローブを、TAQMAN(登録商標)RT−PCRに使用した。ユビキチン融合タンパク質(UBI)RNAを、すべてのTAQMAN(登録商標)RT−PCRアッセイにおける内部対照として使用した。使用したUBIプライマーは以下の通りであった:
フォワード・プライマー 5'cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3'(配列番号:83):
リバース・プライマー 5'ccaacaggtgaatgcttgatagg 3'(配列番号:84)。
5'catgcgccgctttgcttc 3'(配列番号:85)であった。UBI TAQMAN(登録商標)プローブはその5'末端を蛍光色素VIC(登録商標)(Applied Biosystems, Foster City, CA)で、およびその3'末端をクエンチャー色素TAMRAで標識した。
として報告する。
戻し交雑を用いて、出発植物を改良し得る。戻し交雑は、特定の所望の特性を1の源から同系へとまたはその特性を欠いている他の植物へと移行する。これは、例えば、最初に優れた同系繁殖体(A)(反復親)を、問題の特性に関する適当な遺伝子(または複数の遺伝子)、例えば本発明により調製した構築物、を運搬している供与同系繁殖体(非反復親)に交雑することによって成し得る。この交雑の子孫は、最初に非反復親から移行すべき所望の特性について得られた子孫において選択され、ついで選択された子孫を優れた反復親(A)に戻し交配する。所望の特性について選択された5またはそれを超える戻し交雑世代の後、子孫は移行する特性を制御する遺伝子座についてはヘミ接合であるが、大部分またはほぼすべての他の遺伝子については優れた親と同様である。最後の戻し交雑世代は自家受粉させて、移行すべき遺伝子(または複数の遺伝子)について純粋な家系、すなわち1またはそれを超える形質転換事象、である子孫を得る。
本発明の遺伝子の発現は、形質転換細胞および植物において本明細書に開示するような種々の表現型に通じる。表現型データは、カルスの形質転換プロセスならびに植物再生の間、ならびに植物および子孫において収集する。表現型データは、形態的外観ならびにカルスの生長、例えばシュートの性質、根の性質、デンプン質、粘液質、非胚形成性、増大した生長速度、低下した生長速度、死滅、に関して形質転換カルスにおいて収集する。当業者は、形質転換カルスにおける他の表現型特徴を認識し得るであろう。
各トランスジェニックロットについて、トウモロコシ種子を50mlの0.01%Triton X-100を含有する30%漂白剤(過酸化水素ナトリウム溶液=Chloroxまたは等価物)を入れた無菌の500mlのエルレンマイヤーフラスコに入れ、フラスコをオービタルシェイカーで5分間回転することによってそれらを表面滅菌する。ついで、漂白剤溶液を注ぎ出し、約100mlの滅菌脱イオン水で洗浄し、水洗浄液を注ぎ出す。無菌水洗浄をさらに4回繰り返し、再度の水洗浄液を種子上に残す。エアバブリング下(0.2μmフィルターを通す)での吸収のために、種子をこの水の中で、室温にて24時間インキュベートする。
幾つかのファイトトレイ用の水−寒天培地を調製する。本発明者らは、容器の長い方の深さの側部が底面上にあり、小さい方の側部が蓋として使用されるような逆さにした位置でファイトトレイII(またはプラスチックボックス:60×30×15cm)を使用している。脱イオン水中の0.3%BactoAgarを液体サイクル上の45分間オートクレーブ処理することによって、ファイトトレイ当たり100mlに対して十分な水−寒天培地を調製する。容易に取扱いし得る程度まで培地を冷却し、溶解したままでファイトトレイ当たりほぼ100mlを注入する。
・培地が固化したら、それと無菌種子を層状流動蓋(laminar flow hood)にする。
・無菌ピンセットを用いて、20の健全な最も均一な種子を選択し、アッセイに使用する各ファイトトレイに、後に個々の種子を簡単に取り出し得るように均等に種子を離しながら、種子を置く。
・胚の側が下方に斜めに挿入し、種子がちょうど寒天の表面下となるように種子を置く。この位置では、現れるシュートおよび根は束縛されることなる直接的に伸長することができるであろう。
・種子を培地中、22℃にて1週間または大部分の種子が小根を押出し、寒天から現れ始めるまでインキュベートする。
・層状流動蓋中の10の最も均一に生長した幼植物を除いてすべてを除去する。
・ファイトトレイを16時間日照サイクルで10℃に設定した定温植物生長チャンバーに移し、そこで2週間インキュベートする。
・ファイトトレイを1週間22℃に戻す。
・幼植物を取り出し、幼植物毎に根の長さおよびシュートの長さを測定し、新鮮重g/3幼植物を測定し、ノートに記録する。
以下の点を除いて前記と同様である:
・Iにおける最後の水洗の後に、一晩吸収工程の間にフラスコを10℃に置く。
・固化した培地と一緒にファイトトレイを10℃に置く。
・冷却したファイトトレイに低温吸収種子を播種した後に、それを10℃のチャンバーに直接置く。
・約5日後に、小根がほぼ同じ長さである10の最も均一に発芽した種子を除いて、すべてを除去する。ファイトトレイを1−2週間10℃のチャンバーに戻す。幼植物を取り出し、各々の幼植物について根の長さおよびシュートの長さを測定し、3の幼植物ごとに新鮮重を測定し、ノートに記録する。
・第2のセットのファイトトレイを22℃に1週間移す。
実施例(CspAおよびB構築物−pMON73983および73984)
pMON73983(図18)は、アグロバクテリウム媒介形質転換およびダイズにおけるバチルス・ズブチリスCspAのようなタンパク質(配列番号:1)を構成的に発現するためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスCspA遺伝子をクローニングするためには、2の遺伝子特異的プライマーMSA452およびMS453を、National Institute of Health (NCBI)の一部であるNational Library of Medicineの一部であるNational Center for Biotechnology InformationからのCspA配列の情報(Genbank# M30139)に基づいて設計した。MSA452の配列は:
CspAの翻訳開始サイトにアニールし、StuIおよびBglIIサイトを5'末端に導入する
GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG(配列番号:86)であり、一方、MSA453の配列は:
CspAの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にBamHIおよびEcoRIサイトを導入する
CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC(配列番号:87)である。リバース・プライマーMSA453はGenbank遺伝子配列の3'末端にマッチするように設計した。PCR反応はプライマーMSA452およびMSA453、High Fidelity Taqポリメラーゼ(BRL)およびpMON57397(図3)を鋳型として使用して行った。この鋳型は遺伝子CspAの3'末端で、GenBank配列のものとは異なる。増幅したCspB DNAをゲル電気泳動によって精製し、pCR−XL−TOPOベクター(Invitrogen)に連結した。連結反応物を、製造業者のプロトコールに従ってイー・コリTop10細胞(Invitrogen)に形質転換した。4の形質転換体コロニーを取り、Qiagen Miniprepキットを用いてminiprep DNAを調製した。M13−特異的フォワードおよびリバース・プライマーを用いてインサートを配列決定した。正確な配列を有するクローンをpMON73981と命名し、さらなるサブクローニングに使用した。
CspBの翻訳開始サイトにアニールし、StuIおよびBglIIサイトを5'末端に導入する
GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG(配列番号:88)であり、一方、MSA455の配列は:
CspBの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にBamHIおよびEcoRIサイトを導入する
CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG(配列番号:89)である。リバース・プライマーMSA455はGenBank遺伝子配列の3'末端にマッチするように設計した。PCR反応はプライマーMSA454およびMSA455、High Fidelity Taqポリメラーゼ(BRL)およびpMON57399を鋳型として使用して行った。この鋳型は遺伝子CspBの3'末端で、GenBank配列のものとは異なる。増幅したCspB DNAをゲル電気泳動によって精製し、pCR−XL−TOPOベクター(Invitrogen)に連結した。連結反応物を、製造業者のプロトコールに従ってイー・コリTop10細胞(Invitrogen)に形質転換した。4の形質転換体コロニーを取り、Qiagen Miniprepキットを用いてminiprep DNAを調製した。M13−特異的フォワードおよびリバース・プライマーを用いてインサートを配列決定した。正確な配列を有するクローンをpMON73982と命名し、さらなるサブクローニングに使用した。
前記実施例10および11からのDNA構築物で形質転換したトウモロコシ植物を実験した。
温室
・渇水耐性について1は10のcspA事象を試験し、1は10のcspB事象を試験する2の実験を行った。
・各事象からの24のトランスジーン陽性および24のトランスジーン陰性ハイブリッド幼植物を試験した(すべて、分離したハイブリッドの雌穂に由来する種子)。
・試験は温室のベンチ上で行った。
・処理は水を差し控えることおよび植物を含有する各ポットの総ポット重量をモニターすることからなる。完全に給水したポットは各々約1000gと秤量され、各ポットの重量が400gに達するまで水を差し控え、ついで処理の残りの期間はポットをその重量で維持した。
・処理の全体を通して、ポットの土壌の表面から"最も高い"葉の先端までの距離を測定することによって植物の高さを決定した。これらの測定から、測定の間の間隔における高さを比較することによって、LER(leaf extension rates、葉伸長速度)を決定した。
・渇水の間のLER比較は、事象内のトランスジーン陰性およびトランスジーン陽性植物の間で作成した。
・試験した10の事象のうちの3については、cspAトランスジェニック植物は処理の間にLERについて有意に(p<0.10)改善された。
・試験した10の事象のうちの3については、cspBトランスジェニック植物は処理の間にLERについて有意に(p<0.10)改善された。
・ハイブリッド種子を用いて3の実験を行った。生長の後期生長期の渇水耐性について、1は16のcspB事象(CA)を試験し;1は21のcspB事象(KS)を試験し;1は14のcspA事象(HI)を試験した。
・CAおよびHI試行については、トランスジーンの存在について分離している〜34の植物を含む列が各々6および4の反復で存在した。分離している列は、分離している雌穂から由来した。
・KS実験については、列は6の反復でもって、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの対を形成をする列として〜34の植物を含ませた。
・処理は、生長の後期生長期の間にほぼ10日水を差し控える(生存植物を維持するために必要な少量の水を与えつつ)ことからなった。10日の終期において、植物は収穫までよく潅漑した。
・処理の全体を通して、LER、クロロフィル(SPADメーターによって)および光合成率を含む多くの表現型を測定した。処理の後には、花粉を収めるまでおよびトウモロコシの毛(silk)が出現するまでの日数、ならびに穀粒/雌穂のごとき雌穂コンポーネント、穀粒を有する雌穂、穀粒重量および収量:を含む測定したさらなる表現型を含めた。
・事象内および構築物を横切って、トランスジーン陽性および陰性植物の間で表現型比較を作成した。
・CA試行、(栄養繁殖特性についてはすべての事象を横切り、生殖特性については"最良の"6の事象を横切る)構築物としてcspBにおいては、トランスジーン陽性植物は渇水処理の間または後にLER、葉の温度、および穀粒/雌穂cspBについて有意に(p<0.10)改善されていた。
・CA試行において、個々の事象は、渇水処理の間または後のLER、平均雌穂長、穀粒体積/雌穂、気孔コンダクタンス、および開花までの日数について有意に(p<0.10)改善されたいた。
・KS試行、(栄養繁殖特性についてはすべての事象を横切り、生殖特性については"最良の"6の事象を横切る)構築物としてcspBにおいて、トランスジーン陽性植物は、LER、穀粒を結んでいる雌穂/列、穀粒/雌穂、穀粒/植物、殻重量および収量について有意に(p<0.10)改善されていた。
・KS試行において、個々の事象は、LER、光合成率、気孔コンダクタンス、雌穂/列、および穀粒/植物について有意に(p<0.10)改善されたいた。
・HI試行において、3の事象は、LER(クロロフィル含量はHIにおいて測定した唯一の他の表現型であった)について有意に(p<0.10)改善されていた。
cspB−KSサイト圃場効率結果の概要
1.植物を植えるおよびサンプリングする圃場設計、サイト均一性および完成は、有益なデータセットを生成することができる高品質な実験ですべて一致した。
2.水を制限した処理、測定したすべての表現型、特にLER、クロロフィルおよび光合成率に対して
3.栄養繁殖および生殖表現型に対する処理の影響は、統計学的に真正であるのに十分であり、統計学的に有意なレベルで観察されるトランスジーン媒介改善を許容するのに十分であった。
4.LER、クロロフィル、光合成率、気孔コンダクタンス、葉の温度、花粉を収めるまでの日数、開花までの日数、開花−トウモロコシの毛が出現する間隔、雌穂/区画、穀粒/雌穂、穀粒/植物、殻重量および概算収量を含む1またはそれを超える事象が統計学的に改善された。
5.乾燥処理におけるLER、雌穂/区画、穀粒/雌穂、穀粒/植物、殻重量および概算収量について、ならびに湿潤処理におけるLERについて、構築物レベルの統計学的改善がp<0.10で観察された。
1.植物を植えるおよびサンプリングする圃場設計、サイト均一性および完成は、有益なデータセットを生成することができる高品質な実験ですべて一致した。
2.水を制限した処理は、測定したすべての栄養繁殖表現型、詳細にはLER、クロロフィルおよび光合成率に処理の影響を生じるが、すべての生殖表現型に処理の影響が生じないように適用した。
3.関心のある表現型(栄養繁殖)に対する処理の影響は、統計学的に真正であるのに十分であり、統計学的に有意なレベルで観察されるトランスジーン媒介改善を許容するのに十分であった。
4.LER、クロロフィル、光合成率、気孔コンダクタンス、葉の温度、花粉を収めるまでの日数、開花までの日数、開花−トウモロコシの毛が出現する間隔、穀粒/雌穂、平均雌穂長、および穀粒体積/雌穂について、1またはそれを超える事象がトランスジーンを含む植物において統計学的に改善された。
5.乾燥処理におけるLER、葉の温度、および花粉を収めるまでの日数、および湿潤処理におけるASIについては、構築物レベルの有意な改善が観察された。
Claims (20)
- 5'から3'の方向で
a)植物中で機能し、かつ、下記のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む第1のDNAポリヌクレオチド;
b)下記のポリヌクレオチドに作動可能に連結された、低温ショックタンパク質をコードする第2のDNAポリヌクレオチド;
c)ポリアデニル化配列として機能する3'転写終結DNAポリヌクレオチド
を含む組換えDNA分子。 - 該第1のDNAポリヌクレオチドと該第2のDNAポリヌクレオチドとの間に植物DNAイントロンが挿入された請求項1記載の組換えDNA分子。
- 該第2のDNAポリヌクレオチドが、配列番号:3のアミノ酸モチーフを含むタンパク質をコードする請求項1記載の組換えDNA分子。
- 該第2のDNAポリヌクレオチドが、
(a)グラム陽性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)からの低温ショックタンパク質、
(c)バチルス・ズブチリスの低温ショックタンパク質B(CspB)のホモログ、
(d)配列番号:2に実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(e)グラム陰性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(f)エスシェリキア・コリ(Escherichia coli)からの低温ショックタンパク質を含むタンパク質、
(g)エスシェリキア・コリの低温ショックタンパク質A(CspA)のホモログ、
(h)配列番号:1に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
(i)アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)からの低温ショックタンパク質、および
(j)配列番号:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63または65のいずれかに実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
よりなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項3記載の組換えDNA分子。 - プロモーターが、誘導性プロモーター(inducible promoter)、構成的プロモーター(constitutive promoter)、時期調節型プロモーター(temporal-regulated promoter)、発生段階調節型プロモーター(developmentally-regulated promoter)、組織優先型プロモーター(tissue-preferred promoter)、低温亢進型プロモーター(cold enhanced promoter)、低温特異的プロモーター(cold-specific promoter)、ストレス亢進型プロモーター(stress enhanced promoter)、ストレス特異的プロモーター(stress specific promoter)、渇水誘導性プロモーター(drought inducible promoter)、水分欠乏誘導性プロモーター(water deficit inducible promoter)および組織特異的プロモーター(tissue-specific promoter)よりなる群から選択される、請求項1記載の組換えDNA分子。
- 低温ショックタンパク質を発現するDNA分子で形質転換されている非生物ストレス耐性のトランスジェニック植物。
- 請求項6記載の植物の伝播体。
- 請求項6記載の植物の子孫。
- 穀物植物である請求項6記載の植物。
- 単子葉植物である請求項6記載の植物。
- 双子葉植物である請求項6記載の植物。
- 植物が、ダイズ、トウモロコシ、キャノーラ、イネ、ワタ、オオムギ、エンバク、シバ、ワタおよびコムギよりなる群から選択される請求項6記載の植物。
- (a)低温が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(b)高温が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(c)水が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(d)土壌および/または水分中の高濃度の塩またはイオンが同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
(e)同種の非形質転換植物よりも低温ショック後に生存する植物のより高いパーセントを有すること、
(f)同種の非形質転換植物と比較した場合のより高い収量、または
(g)同種の非形質転換植物と比較した渇水に対する耐性
を有する請求項6記載の植物。 - 種子である請求項13記載の植物の伝播体。
- 請求項14記載の種子を土壌中に植え、ついで生長させる方法。
- a)請求項1記載の組換えDNA分子を植物細胞のゲノムに挿入し;
b)該組換えDNAを含む形質転換植物細胞を得;
c)該植物細胞から植物を再生し、ついで
d)高められた非生物ストレス耐性または高められた根の生長について植物を選択する
工程を含む、トランスジェニック植物の作製方法。 - 請求項16記載の方法によって作製したストレス耐性植物。
- 該非生物ストレスが、熱耐性、塩耐性、渇水耐性および低温ショック後の生存よりなる群から選択される請求項16記載の方法。
- (a)配列番号:5、7、9、29、31、33、35、37、39、41、43、53、55、57、59、61、63および65よりなる群から選択される少なくとも1のタンパク質に対して少なくとも40%同一であるか、
(b)配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、90および92よりなる群から選択される核酸に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、
(c)配列番号:5、7、9、29、31、33、35、37、39、41、43、53、55、57、59、61、63および65のいずれかに実質的に同一であるアミノ酸配列を有する
単離されたタンパク質。 - 原核生物低温ショックタンパク質を含む伝播体から発芽した植物の少なくとも50%を含む圃場穀物。
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