ES2666679T3 - Procedimientos para potenciar la tolerancia a la sequía en plantas y procedimientos de los mismos - Google Patents

Procedimientos para potenciar la tolerancia a la sequía en plantas y procedimientos de los mismos Download PDF

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Abstract

Una semilla transgénica que contiene en su genoma una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de choque frío que tiene al menos el 90 % de identidad con las SEC ID Nº: 63 ó 65, comprendiendo dicha proteína de choque frío la secuencia de dominio de choque frío [FY]-G-F-I-x(6,7)-[DER]-[LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x- [LIVMFY] de SEC ID Nº: 3 y que tiene una función de unión del ácido nucleico monocatenario, en la que la molécula de ADN recombinante expresa la proteína de choque frío en una planta transgénica que crece a partir de la semilla, en donde la planta transgénica tiene una velocidad de crecimiento más alta en condiciones en que el agua limitaría el crecimiento de una planta no transformada de la misma especie o en donde la planta transgénica es resistente a la sequía en comparación con una planta no transformada de la misma especie.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
Nº de ID de Genbank
Nombre del gen
12514257
Homólogo de proteína de choque frío de Salmonella [Escherichia coli 0157:H7
15981565
Proteína de choque frío principal Cspa1 [Yersinia pestis]
3249024
Proteína de choque frío CspB [Yersinia enterocolitica]
15979692
Proteína de choque frío [Yersinia pestis]
1742550
Proteína similar a choque frío CspB [Escherichia coli]
16419141
Chaperona de ARN, regulador negativo de la transcripción de cspA [Salmonella
10039151
Proteína similar a choque frío cspE [Buchnera sp. APS]
9957540
Proteína de choque frío B [Yersinia enterocolitica]
1778540
Proteína similar a choque frío [Escherichia coli]
471099
CspE (MsmC) [Escherichia coli]
2961317
cspB [Salmonella typhimurium]
16503235
Proteína de choque frío [Salmonella enterica subsp. enterica serovar
9658370
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Vibrio cholerae]
460698
CspC (MsmB) [Escherichia coli]
15980582
Proteína de choque frío putativa [Yersinia pestis]
10038996
Proteína similar a choque frío cspC [Buchnera sp. APS]
15979774
Proteína de choque frío [Yersinia pestis]
9657556
Regulador transcripcional de choque frío CspA [Vibrio cholerae]
4454361
Proteína de choque frío, CSPA [Vibrio cholerae]
2970685
Proteína de choque frío C [Salmonella typhimurium]
1402743
Proteína de choque frío principal [Citrobacter freundii]
5869509
CspG [Shewanella violacea]
5869504
CspA [Shewanella violacea]
9968446
Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]
1405474
Proteína CspC [Bacillus cereus]
3850776
Proteína de choque frío D [Lactococcus lactis]
10176234
Proteína de choque frío [Bacillus halodurans]
1869948
Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]
729220
PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPC
7379745
Regulador transcripcional putativo [Neisseria meningitidis Z2491]
1620431
csp [Lactobacillus plantarum]
1405472
Proteína CspB [Bacillus cereus]
3892590
Proteína de choque frío E [Lactococcus lactis]
8
Nº de ID de Genbank
Nombre del gen
7226073
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Neisseria meningitidis MC58]
2493766
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPLA (CSPL)
1001878
Proteína CspA [Listeria monocytogenes]
13623066
Proteína de choque frío putativa [Streptococcus pyogenes M1 GAS]
758663
Proteína de choque frío [Arthrobacter globiformis]
4468119
Proteína de choque frío A; proteína CspA [Bordetella pertussis]
2370256
Proteína de choque frío [Lactococcus lactis]
1405470
Proteína CspA [Bacillus cereus]
2226349
CspC [Staphylococcus aureus]
1405476
Proteína CspD [Bacillus cereus]
1513079
Proteína de aclimatación al frío A [Pseudomonas fragi]
7242722
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
2425105
Proteína de choque frío principal [Micrococcus luteus]
2105046
cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]
15023696
Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]
12720931
MsmB [Pasteurella multocida]
8101860
Proteína de choque frío principal CspA [Staphylococcus aureus]
1513081
Proteína de aclimatación al frío B [Pseudomonas fragi]
3097243
Proteína de choque frío pequeña [Mycobacterium leprae]
9587215
Proteína de choque frío CspA [Mycobacterium smegmatis]
9107526
Proteína de choque frío [Xylella fastidiosa 9a5c]
1256629
Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]
12054789
Proteína de choque frío (CspLB) [Listeria monocytogenes]
1864167
Homólogo de la proteína de choque frío principal CspB [Listeria monocytogenes]
1421212
Proteína de choque frío principal (Cspb)
297761
Proteína de choque frío (CspB) [Bacillus subtilis]
13625473
Proteína de aclimatación al frío CapB [Pseudomonas sp. 30/3]
9657576
Proteína del dominio de unión a ADN de choque frío [Vibrio cholerae]
11933043
Proteína similar a choque frío [Streptomyces nodosus]
11933034
Proteína similar a choque frío [Streptomyces hygroscopicus]
8248794
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
1778825
Proteína de choque frío principal CspA [Pseudomonas aeruginosa]
740006
Proteína de choque frío
2226347
CspB [Staphylococcus aureus]
9
Nº de ID de Genbank
Nombre del gen
1616777
Proteína similar a choque frío [Stigmatella aurantiaca]
7210998
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
729217
PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPB
1067201
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor]
7321274
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
1402789
Proteína de choque frío principal [Yersinia enterocolitica]
1513086
Proteína de aclimatación a la temperatura B [Pseudomonas fragi]
16411332
Similar a proteína de choque frío [Listeria monocytogenes]
5732895
F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)]
4193390
CspA [Myxococcus xanthus]
4193394
CspC [Myxococcus xanthus]
1405478
Proteína CspE [Bacillus cereus]
1402753
Proteína de choque frío principal [Klebsiella pneumoniae]
2983729
Proteína de choque frío [Aquifex aeolicus]
2815334
Proteína de dominio de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
4193398
CspE [Myxococcus xanthus]
4193396
CspD [Myxococcus xanthus]
2894098
Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]
15074838
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN SIMILAR A CHOQUE FRÍO PUTATIVA
1402731
Proteína de choque frío principal [Aeromonas hydrophila]
46789
Proteína similar a choque frío de 7 kDa [Streptomyces clavuligerus]
9946316
Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]
1402769
Proteína de choque frío principal [Proteus vulgaris]
456240
Proteína de choque frío principal (CspB) [Sporosarcina globispora]
19743
nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris]
15026046
Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]
11493820
Proteína de choque frío C [Yersinia enterocolitica]
4982460
Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]
15979415
Proteína similar a choque frío [Yersinia pestis]
16419455
Similar a CspA pero no inducida por choque frío [Salmonella typhimurium]
14523127
Proteína de choque frío putativa [Sinorhizobium meliloti]
9107847
Proteína de aclimatación a la temperatura B [Xylella fastidiosa 9a5c]
3036806
Proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana]
10
Nº de ID de Genbank
Nombre del gen
2182333
Y4cH [Rhizobium sp. NGR234]
1402733
Proteína de choque frío principal [Aeromonas salmonicida]
9655615
Proteína similar a choque frío CspD [Vibrio cholerae]
3831556
Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]
3821915
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris]
15160284
AGR_L_3376p [Agrobacterium tumefaciens]
6458627
Proteína de choque frío, familia CSD [Deinococcus radiodurans]
3821923
Proteína de choque frío principal [Lactobacillus helveticus]
3821911
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis]
15157349
AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens]
15154976
AGR_C_161p [Agrobacterium tumefaciens]
3831558
Proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus]
456238
Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]
117574
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD (CSP-D)
12620649
ID534 [Bradyrhizobium japonicum]
13424521
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus]
3776223
CspA [Sinorhizobium meliloti]
15075353
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium
15075133
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PROBABLE [Sinorhizobium
3821913
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis]
13476765
Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]
3821925
Proteína de choque frío principal [Streptococcus thermophilus]
3821921
Proteína de choque frío principal [Lactobacillus acidophilus]
729222
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPJ
15162334
AGR_pAT_762p [Agrobacterium tumefaciens]
13475232
Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]
9947082
Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]
13424199
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus]
9948689
Proteína de choque frío CspD [Pseudomonas aeruginosa]
4193392
CspB. [Myxococcus xanthus]
13488430
Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]
12720739
CspD [Pasteurella multocida]
11
Nº de ID de Genbank
Nombre del gen
3831560
Proteína de choque frío principal [Bifidobacterium animalis]
1513084
Proteína de aclimatación a la temperatura A [Pseudomonas fragi]
1169113
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD
5714745
Proteína de choque frío 7.4 [Rhodococcus sp. 7/1]
1402767
Proteína de choque frío principal [Photobacterium fosforeum]
14523160
Regulador transcripcional de la proteína de choque frío CspA5 probable
15979447
Proteína similar a choque frío [Yersinia pestis]
13488214
Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]
5714743
Proteína de choque frío A [Rhodococcus sp. 5/14]
3861208
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO (cspA) [Rickettsia prowazekii]
81624
Proteína rica en glicina 2 -Arabidopsis thaliana
15156913
AGR_C_3315p [Agrobacterium tumefaciens]
15074652
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium
7295442
Producto génico CG17334 [Drosophila melanogaster]
3850772
Proteína de choque frío A [Lactococcus lactis]
14334920
Proteína de unión a ADN de dedo de cinc rica en glicina putativa [Arabidopsis
3892588
Proteína de choque frío C [Lactococcus lactis]
2708747
Proteína de unión a ADN de dedo de cinc rica en glicina putativa [Arabidopsis
2739396
Proteína de Y-caja [Drosophila melanogaster]
1402763
Proteína de choque frío principal [Photobacterium mondopomensis]
15620137
Proteína similar a choque frío [Rickettsia conorii]
1402755
Proteína de choque frío principal [Lactobacillus casei]
409419
Factor de caja Y [Aplysia californica]
14039811
Proteína de unión a caja Y [Schistosoma japonicum]
9946868
Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]
1483311
Proteína de caja Y [Dugesia japonica]
1477478
Proteína de unión a caja Y [Schistosoma mansoni]
1402759
Proteína de choque frío principal [Listeria innocua]
15159048
AGR L 1288p [Agrobacterium tumefaciens]
2228815
Proteína de choque frío principal CspH [Salmonella typhimurium]
6911694
Proteína de choque frío A [Streptococcus thermophilus]
2970679
Proteína de caja Y [Drosophila silvestris]
14602477
Similar a proteína de dominio de choque frío A [Homo sapiens]
12
Nº de ID de Genbank
Nombre del gen
10727970
Producto génico yps [Drosophila melanogaster]
1402757
Proteína de choque frío principal [Listeria grayi]
1402751
Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]
1083796
Proteína RYB-A -rata
505133
RYB-a [Rattus norvegicus]
14523481
Regulador transcripcional de la proteína de choque frío CspA6 probable
8100512
Proteína de caja Y ZONAB-B [Canis familiaris]
8100510
Proteína de caja Y ZONAB-A [Canis familiaris]
15306095
Proteína hipotética XP_053028 [Homo sapiens]
10185725
Isoforma corta de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]
10185723
Isoforma larga de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]
7385223
Proteína de unión a ARN MSY4 [Mus musculus]
6166110
PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN A (PROTEÍNA DE DOMINIO DE CHOQUE FRÍO A)
1402783
Proteína de choque frío principal [Streptococcus pyogenes]
1167838
Proteína de unión a ADN [Homo sapiens]
1160331
Homólogo murino de dbpA [Mus musculus]
1101884
YB2 [Rattus norvegicus]
950340
Proteína de unión a ADN A [Homo sapiens]
532211
Proteína de unión a caja Y [Mus musculus]
87332
Proteína de unión a ADN A -humana (fragmento)
14742409
Proteína hipotética XP 046353 [Homo sapiens]
14270385
Proteína de dominio de choque frío [Takifugu rubripes]
9653686
Proteína 1 de unión al elemento supresor del receptor de TSH; TSEP-1
8249978
Proteína de choque frío B [Streptomyces coelicolor A3(2)]
3695368
zfY1 [Danio rerio]

Tabla 21. Algunas proteínas de choque frío y proteínas que contienen dominios de choque frío encontradas buscando con CspB de B. subtilis. Esta lista se compiló usando los parámetros de Blast Link (Blink) convencionales
CspB de Bacillus subtilis (B. subtilis) es una proteína que se acumula en respuesta a choque frío (Willimsky y col. Journal of Bacteriology 174:6326 (1992)). Tiene homología con CspA de E. coli (véase la Tabla I) y contiene un dominio de unión de ácido nucleico monocatenario (Lopez y col., The Journal of Biologic Chemistry 276:15511
5 (2001)). Usando la misma búsqueda de Blast básica en NCBI (Blink), las siguientes proteínas se designaron “éxitos”. El número de éxitos mostrados aquí está limitado a 200, pero se esperaría que muchas otras proteínas funcionaran en la invención.
10 en el Centro nacional para información biotecnológica. Se muestra el ID de Genbank y el nombre de cada proteína. Nota: debido a la forma en la que se nombran las proteínas, algunas proteínas y secuencias tendrán varias entradas, como proteínas, ADNc, alelos, etc. La ID de Genbank puede considerarse que son identificadores específicos para cada entrada. Las entradas están en el orden aproximado de mayor a menor identidad con la secuencia de búsqueda.
13
Nº de ID de GenBank
Nombre del gen
1421212
Proteína de choque frío principal (Cspb)
1405476
Proteína CspD [Bacillus cereus]
729217
PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPB
456240
Proteína de choque frío principal (CspB) [Sporosarcina globispora]
1256629
Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]
740006
Proteína de choque frío
456238
Proteína de choque frío [Bacillus subtilis]
12054789
Proteína de choque frío (CspLB) [Listeria monocytogenes]
1864167
Homólogo de proteína de choque frío principal CspB [Listeria monocytogenes]
1405472
Proteína CspB [Bacillus cereus]
8101860
Proteína de choque frío principal CspA [Staphylococcus aureus]
16411332
Similar a proteína de choque frío [Listeria monocytogenes]
10176234
Proteína de choque frío [Bacillus halodurans]
2493766
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPLA (CSPL)
1001878
Proteína CspA [Listeria monocytogenes]
1405470
Proteína CspA [Bacillus cereus]
1405474
Proteína CspC [Bacillus cereus]
13623066
Proteína de choque frío putativa [Streptococcus pyogenes M1 GAS]
729220
PROTEÍNA DE CHOQUE FRÍO CSPC
2226349
CspC [Staphylococcus aureus]
9968446
Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]
1402739
Proteína de choque frío principal [Bacillus subtilis]
3892590
Proteína de choque frío E [Lactococcus lactis]
2226347
CspB [Staphylococcus aureus]
3850776
Proteína de choque frío D [Lactococcus lactis]
1402741
Proteína de choque frío principal [Bacillus subtilis]
15979774
Proteína de choque frío [Yersinia pestis]
10039151
Proteína similar a choque frío cspE [Buchnera sp. APS]
8248794
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
460698
CspC (MsmB) [Escherichia coli]
11933043
Proteína similar a choque frío [Streptomyces nodosus]
11933034
Proteína similar a choque frío [Streptomyces hygroscopicus]
1620431
csp [Lactobacillus plantarum]
16419141
Chaperona de ARN, regulador negativo de la transcripción de cspA [Salmonella typhimurium LT2]
14
Nº de ID de GenBank
Nombre del gen
15979692
Proteína de choque frío [Yersinia pestis]
2894098
Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]
1869948
Proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum]
2370256
Proteína de choque frío [Lactococcus lactis]
2970685
Proteína de choque frío C [Salmonella typhimurium]
1778540
Proteína similar a choque frío [Escherichia coli]
471099
CspE (MsmC) [Escherichia coli]
10038996
Proteína similar a choque frío cspC [Buchnera sp. APS]
7242722
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
15026046
Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]
15980582
Proteína de choque frío putativa [Yersinia pestis]
9657576
Proteína del dominio de unión a ADN de choque frío [Vibrio cholerae]
349561
Proteína de unión a ADN [Salmonella typhimurium]
4982460
Proteína de choque frío [Thermotoga maritima]
1405478
Proteína CspE [Bacillus cereus]
9946316
Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]
9658370
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Vibrio cholerae]
5869509
CspG [Shewanella violacea]
1067201
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor]
9948689
Proteína de choque frío CspD [Pseudomonas aeruginosa]
3891780
Cadena A, proteína de choque frío principal de estructura de RMN de disolución de Escherichia coli
576191
Proteína de choque frío principal 7.4 (Cspa (Cs 7.4)) de (Escherichia Coli)
72232
Proteína de choque frío principal cspA -Escherichia coli
9657556
Regulador transcripcional de choque frío CspA [Vibrio cholerae]
6458627
Proteína de choque frío, familia CSD [Deinococcus radiodurans]
3831556
Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]
15023696
Proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum]
2425105
Proteína de choque frío principal [Micrococcus luteus]
1402737
Proteína de choque frío principal [Bacillus cereus]
9587215
Proteína de choque frío CspA [Mycobacterium smegmatis]
7226073
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Neisseria meningitidis MC58]
4454361
Proteína de choque frío, CSPA [Vibrio cholerae]
479003
Proteína de choque frío [Escherichia coli]
3097243
Proteína de choque frío pequeña [Mycobacterium leprae]
15
Nº de ID de GenBank
Nombre del gen
1778828
Proteína de choque frío principal CSPA2 [Yersinia enterocolitica]
758663
Proteína de choque frío [Arthrobacter globiformis]
2105046
cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]
7379745
Regulador transcripcional putativo [Neisseria meningitidis Z2491]
3249024
Proteína de choque de frío CspB [Yersinia enterocolitica]
7210998
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
1513081
Proteína de aclimatación al frío B [Pseudomonas fragi]
5869504
CspA [Shewanella violacea]
1778825
Proteína de choque frío principal CspA [Pseudomonas aeruginosa]
1513086
Proteína de aclimatación a la temperatura B [Pseudomonas fragi]
12514257
Homólogo de proteína de choque frío de Salmonella [Escherichia coli O157:H7 EDL933]
5732895
F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)]
3831558
Proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus]
1468921
Proteína de choque frío CspG [Escherichia coli]
13625473
Proteína de aclimatación al frío CapB [Pseudomonas sp. 30/3]
6073870
Proteína de choque frío principal CSPA1 [Yersinia enterocolitica]
1402771
Proteína de choque frío principal [Staphylococcus aureus]
1402761
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris]
15981565
Proteína de choque frío principal Cspa1 [Yersinia pestis]
9107847
Proteína de aclimatación a la temperatura B [Xylella fastidiosa 9a5c]
7321274
Proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
2815334
Proteína de dominio de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)]
2275140
Proteína hipotética [Yersinia pestis]
9947082
Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]
2983729
Proteína de choque frío [Aquifex aeolicus]
2961317
cspB [Salmonella typhimurium]
467897
Proteína similar a choque frío de kDa [Streptomyces clavuligerus]
9107526
Proteína de choque frío [Xylella fastidiosa 9a5c]
1513079
Proteína de aclimatación al frío A [Pseudomonas fragi]
4193394
CspC [Myxococcus xanthus]
4193392
CspB [Myxococcus xanthus]
3821911
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis]
16503235
Proteína de choque frío [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi]
9957540
Proteína de choque frío B [Yersinia enterocolitica]
16
Nº de ID de GenBank
Nombre del gen
3821921
Proteína de choque frío principal [Lactobacillus acidophilus]
1616777
Proteína similar a choque frío [Stigmatella aurantiaca]
1402759
Proteína de choque frío principal [Listeria innocua]
4468119
Proteína de choque frío A; proteína CspA [Bordetella pertussis]
1742550
Proteína similar a choque frío CspB [Escherichia coli]
12720739
CspD [Pasteurella multocida]
3821915
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris]
1402765
Proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus]
1513084
Proteína de aclimatación a la temperatura A [Pseudomonas fragi]
4193396
CspD [Myxococcus xanthus]
4193398
CspE [Myxococcus xanthus]
3831560
Proteína de choque frío principal [Bifidobacterium animalis]
4193390
CspA [Myxococcus xanthus]
3821923
Proteína de choque frío principal [Lactobacillus helveticus]
12720931
MsmB [Pasteurella multocida]
3850772
Proteína de choque frío A [Lactococcus lactis]
9655615
Proteína similar a choque frío CspD [Vibrio cholerae]
9946868
Proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa]
1402757
Proteína de choque frío principal [Listeria grayi]
3821913
Proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis]
1402735
Proteína de choque frío principal [Bacillus atrophaeus]
1402751
Proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis]
3892588
Proteína de choque frío C [Lactococcus lactis]
1169113
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD
15979415
Proteína similar a choque frío [Yersinia pestis]
117574
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO CSPD (CSP-D)
15075133
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PROBABLE [Sinorhizobium meliloti]
16419455
Similar a CspA pero no inducida por choque frío [Salmonella typhimurium LT2]
11493820
Proteína de choque frío C [Yersinia enterocolitica]
1402783
Proteína de choque frío principal [Streptococcus pyogenes]
3821925
Proteína de choque frío principal [Streptococcus thermophilus]
1402775
Proteína de choque frío principal [Streptococcus dysgalactiae]
8249978
Proteína de choque frío B [Streptomyces coelicolor A3(2)]
15160284
AGR_L_3376p [Agrobacterium tumefaciens]
17
Nº de ID de GenBank
Nombre del gen
81624
Proteína rica en glicina 2 -Arabidopsis thaliana
19743
nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris]
2916930
cspB [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]
13475232
Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]
3861208
PROTEÍNA SIMILAR A CHOQUE FRÍO (cspA) [Rickettsia prowazekii]
2182333
Y4cH [Rhizobium sp. NGR234]
13476765
Proteína de choque frío [Mesorhizobium loti]
3776223
CspA [Sinorhizobium meliloti]
1402755
Proteína de choque frío principal [Lactobacillus casei]
15620137
Proteína similar a choque frío [Rickettsia conorii]
15154976
AGR_C_161p [Agrobacterium tumefaciens]
15074838
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN SIMILAR A CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium meliloti]
14548150
Proteína de choque frío de unión a ARN [crenarchaeote 4B7 sin cultivar]
2440094
Proteína de choque frío pequeña [Mycobacterium leprae]
14523127
Proteína de choque frío putativa [Sinorhizobium meliloti]
12620649
ID534 [Bradyrhizobium japonicum]
1063684
AtGRP2b [Arabidopsis thaliana]
13424521
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus]
3036806
Proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana]
1402731
Proteína de choque frío principal [Aeromonas hydrophila]
214642
p54 [Xenopus laevis]
15075353
PROTEÍNA REGULADORA DE LA TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE FRÍO PUTATIVA [Sinorhizobium meliloti]
13424199
Proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus]
14602477
Similar a proteína de dominio de choque frío A [Homo sapiens]
1175535
PROTEÍNA DE UNIÓN A ARN CITOPLÁSMICO P56 (PROTEÍNA 2 DE UNIÓN A CAJA Y) (FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE CAJA Y) (MRNP4)
104266
Proteína 2 de unión a caja Y – Rana africana de uñas
15157349
AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens]
8100512
Proteína de caja Y ZONAB-B [Canis familiaris]
8100510
Proteína de caja Y ZONAB-A [Canis familiaris]
1483311
Proteína de caja Y [Dugesia japonica]
1402767
Proteína de choque frío principal [Photobacterium fosforeum]
1402733
Proteína de choque frío principal [Aeromonas salmonicida]
18
Nº de ID de GenBank
Nombre del gen
15306095
Proteína hipotética XP_053028 [Homo sapiens]
14742409
Proteína hipotética XP_046353 [Homo sapiens]
14270385
Proteína de dominio de choque frío [Takifugu rubripes]
10185725
Isoforma corta de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]
10185723
Isoforma larga de la proteína 3 de caja Y [Mus musculus]
9653686
Proteína 1 de unión al elemento supresor del receptor de TSH; TSEP-1 [Rattus sp.]
7385223
Proteína de unión a ARN MSY4 [Mus musculus]
6166110
PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN A (PROTEÍNA DE DOMINIO DE CHOQUE FRÍO A) (PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN MONOCATENARIO NF-GMB)
3695368
zfY1 [Danio rerio]
2745892
Factor de transcripción de caja Y [Mus musculus]
2073109
Proteína de caja Y 1 [Carassius auratus]
1353778
Proteína de unión a caja Y [Columba livia]
1167838
Proteína de unión a ADN [Homo sapiens]
1160331
Homólogo murino de dbpA [Mus musculus]
1101884
YB2 [Rattus norvegicus]
1083796
Proteína RYB-a -rata
988283
mYB-1b [Mus musculus]
988281
mYB-1a [Mus musculus]
950340
Proteína de unión a ADN A [Homo sapiens]
608518
p50 [Oryctolagus cuniculus]
532211
Proteína de unión a caja Y [Mus musculus]
516701
Similar a dbpB/YB-1 de ratón [Gallus gallus]
505133
RYB-a [Rattus norvegicus]
457262
Proteína 1 de unión a elemento sensible a nucleasa [Homo sapiens]
423015
Proteína 1 de unión a elemento sensible a nucleasa -humano
289797
Proteína YB-1 [Gallus gallus]
203398
Putativa [Rattus norvegicus]
199821
Factor de transcripción de caja Y [Mus musculus]
189299
Proteína de unión a ADN [Homo sapiens]
162983
Factor de transcripción EF1 (A) [Bos taurus]
115848
PROTEÍNA 1 DE UNIÓN A CAJA Y (FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE CAJA Y) (YB-1) (SUBUNIDAD A DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN I DE UNIÓN A CCAAT) (CBF-A) (SUBUNIDAD A DEL FACTOR I POTENCIADOR) (EFI-A) (PROTEÍNA DE UNIÓN A ADN B) (DBPB)
112410
Proteína 1 de unión a caja Y -rata
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Las CSP son un grupo de proteínas que pueden o no aumentarse en cantidad cuando se reduce la temperatura o se aplica otro estrés. En realidad, en el organismo mejor estudiado con respecto a las proteínas de choque frío, E. coli, algunas proteínas de choque frío se expresan constitutivamente mientras que otras se inducen por frío, aún otras parecen ser específicas para estreses específicos y/o condiciones o estadios de crecimiento. Una revisión de esto es Yamanaka y col., Molecular Microbiology, 27:247 (1998). En esta revisión, Yamanaka y colaboradores detallan cómo se expresan las nuevas proteínas de choque frío en E. coli (CspA a CspI). CspA, CspB y CspG son inducibles por frío. CspD se induce en la fase estacionaria del ciclo celular y durante la inanición. CspC y E participan en la división celular.
CspA es la proteína de choque frío principal de Escherichia coli (E. coli) (SEC ID Nº: 1). CspA también se llama proteína de choque frío principal 7.4. CspA es altamente inducida en respuesta a choque frío (Goldstein y col., Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87:283 (1990)). En algunas condiciones de crecimiento más lento, los ribosomas se ralentizan debido a la formación de estructuras secundarias de ARN o ADN, y esto puede actuar de señal para el aumento de la síntesis de CSP en su organismo nativo. Las CSP se unen a ADNmc y ARN bajo condiciones in vitro (Phadtare y col., Molecular Microbiology 33:1004 (1999)). Se cree que las CSP se unen a un ARN en un modo relativamente no específico durante la traducción y previenen la formación de estructuras secundarias y estabilizan el ARN (esta función se denomina algunas veces una chaperona de ARN). Entonces, el ribosoma puede desplazar fácilmente las CSP e iniciar la traducción sobre un molde de ARN lineal. Los inventores creen que esto podría implicar la función de unión del ácido nucleico monocatenario de estas proteínas, y esta función puede proceder de cualquier proteína de choque frío o proteína que contenga un dominio de choque frío, que incluye, por ejemplo, proteínas de choque frío procariotas, genes que contienen caja Y eucariotas, algunas proteínas ricas en glicina (GRP) y otras proteínas que contienen el dominio de choque frío. Estas proteínas incluyen, pero no se limitan a, aquellas mostradas en la Figura 4, Trends in Biochemical Science, 23(8):289 (1998) (documento incluido, incorporado en el presente documento por referencia). Esta figura muestra claramente la relación evolutiva entre estas proteínas. El origen de estas proteínas probablemente precede a la divergencia de bacterias y eucariotas de ahora, y se ha postulado que estas proteínas pueden haber estado presentes en la aparición de la evolución de una única célula hace 3,5 billones de años. Los presentes inventores han seleccionado dos proteínas para transformar en plantas como ejemplos, como se muestra en la figura citada anteriormente. Estas proteínas son más enormemente divergentes entre sí que de muchos de sus homólogos eucariotas. Los presentes inventores esperan que la expresión ectópica de estas proteínas pueda mejorar la tolerancia a la sequía.
Otra posible explicación para el aumento de la velocidad de crecimiento de plantas bajo estrés podría ser la provocación de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) proporcionados por la expresión de CSP. En este modelo, una planta desarrollaría una respuesta de PAMP que provocaría una respuesta de la planta algo similar a resistencia sistémica adquirida (SAR) (al igual que SAR funciona para estreses bióticos), ya que la planta se “prepararía” para el estrés antes de su aplicación. Para que funcione este modelo, la planta debe ser una señal de que la CSP está presente, este mecanismo puede haberse proporcionado recientemente mediante un receptor de planta que se une a CSP (Felix y col., Journal of Biological Chemistry 278(8):6201-8 (2003)). Este mecanismo significaría que cualquier gen que se une a un receptor que provoca una respuesta tipo PAMP funcionaría en la invención. La provocación de respuestas tipo PAMP se ha estudiado generalmente para estreses bióticos, y frecuentemente ha sido provocada por administración exógena de agentes. En el presente documento los inventores podrían estar provocando respuesta de PAMP a la CSP producida a partir del transgén de CSP. El transgén se transformó en una célula de planta como parte de una construcción de ADN recombinante, mediante una pistola de partículas o transformación mediada por Agrobacterium. Esto podría estar creando a su vez una respuesta tipo resistencia adquirida sistémica en la planta, aumentando a su vez la resistencia a estrés abiótico. Esta respuesta podría funcionar en tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas que incluyen, pero no se limitan a, maíz, soja, trigo, arroz, Arabidopsis, canola y algodón. Si el procedimiento de PAMP anterior es el modo de acción para las CSP, entonces podría esperarse que la CSP proporcionara protección contra el estrés biótico, además de protección contra el estrés abiótico. Ninguno de estos mecanismos se indica que sea limitante y uno o ambos, u otra infinidad, podrían participar en el fenotipo manifestado.
Se ha afirmado que MF2, una proteína similar a Csp de Bacillus thuringiensis, proporciona alguna protección contra infección vírica en una planta. La patente de Estados Unidos 6.528.480 muestra esta tolerancia a estrés biótico frotando las hojas de una planta con un extracto que contiene la proteína e infectando la planta con un virus. Contemplan, pero no crean, plantas transgénicas en su interior.
“Planta no transformada de la misma especie” indica que incluye todas las plantas de la misma especie como una planta transformada. En una realización, la planta transformada es de la misma especie y cepa que la planta transformada. En otra realización, la planta es tan idéntica como sea posible a la planta transformada.
El “dominio de choque frío” (CSD) es una secuencia de proteínas que es homóloga a las proteínas de choque frío. Para los fines de la presente invención, un dominio de choque frío que contiene proteína es una “proteína de choque frío”. Se observa más del 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o el 98 % de identidad de aminoácidos entre CspA de E. coli o CspB de B. subtilis y los dominios de choque frío de las proteínas que contienen dominios de choque frío (Wistow, Nature 344:823 (1990); Yamanaka y col., Mol. Micro., 27:247, véase específicamente la Figura 1B en la referencia de Yamanaka; Graumann y col. TIBS 23:286).
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Ejemplo 9.
Respuesta al estrés por frío en el estadio de tres hojas -Plantas transgénicas de arroz para CspB y CspA
Preparación del material de planta:
Germinación: Se esterilizaron semillas tratando con 0,01 por ciento de cloruro mercúrico durante 3 minutos y se lavaron minuciosamente durante diez veces en agua MilliQ para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se dejó que las semillas esterilizadas se empaparan poniéndolas en remojo en agua MilliQ durante 3 horas. Las semillas empapadas germinaron sobre un papel de filtro húmedo esterilizado a 30 ºC de temperatura y al 60 % de HR usando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.).
Establecimiento de plantas de semillero en el estadio de tres hojas: Las plantas de semillero germinadas de tres días de edad se transfirieron a bandejas (52,5 mm (longitud) x 26 mm (profundidad) x 5,2 mm (diámetro)) en el invernadero que tenía intensidad de luz de 800 micromol.m2/s y 60 % de HR. Las plantas de semillero se cultivaron hasta el estadio de tres hojas (aproximadamente durante 12 días) en bandejas que contenían tierra de marga arenosa roja. Se aplicó disolución de fertilizante a las plantas de semillero una vez a la semana hasta la completitud de los experimentos (N-75 PPM, P-32 PPM, K-32 PPM, Zn-8 PPM, Mo-2 PPM, Cu-0,04 PPM, B-0,4 PPM y Fe-3,00 PPM).
Análisis de plantas R2 de CspB
Protocolo: Plantas de semillero de arroz en el estadio de tres hojas (12 días de edad) se sometieron a un estrés por frío de 10 ºC durante 4 días en presencia de 100 micromol/m2/s de luz y el 70 % de HR (cámara de crecimiento Percival). Después del tratamiento del estrés se dejó que las plantas se recuperaran en el invernadero durante 10 días y en el 10º día el crecimiento se registraron las observaciones para plantas supervivientes y evidencias fotográficas. Cada tratamiento tuvo 10 replicaciones por línea y se aleatorizaron completamente.
Resultados: Entre las ocho líneas diferentes probadas para tolerancia al estrés por frío, seis líneas presentaron significativamente mayor tolerancia al frío en comparación con la natural. Las líneas que incluyen R2-226-6-9-3, R2226-29-1-1, R2-257-20-2-1, R2-238-1-1-3, R2-230-4-4-2 y R2-257-3-1-3 mostraron alta tolerancia al frío presentando alto crecimiento de recuperación y menos porcentaje de reducción en el crecimiento (con respecto a control no estresado) en comparación con la natural (Tabla -1, placa-1). La línea R2-230-4-42 ha rendido extremadamente bien, presentó el 100 por ciento de supervivencia y mantuvo un buen crecimiento durante la recuperación (Tabla 1).
Tabla 1. Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas transgénicas R2 de CspB.
Líneas
% Supervivencia al final de la recuperación Altura de la planta (cm) Estresada Sin estresar % Reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar
R2-257-17-1-1
13 21,5 ± 11 43,44 ± 4,09 50,38
R2-230-34-1-2
53 20,78 ± 6,3 45,0 ± 3,51 53,82
R2-226-6-9-3
60 27,5 ± 7 33,74 ± 4,65 18,49
R2-226-29-1-1
53 27,6 ± 10,7 35,22 ± 4,06 21,63
R2-257-20-2-1
93 32,39 ± 5,48 44,0 ± 2,95 27,27
R2-238-1-1-3
80 29,25 ± 8,19 40,72 ± 5,8 25
R2-230-4-4-2
100 33,95 ± 4,10 45 ± 3,98 24
R2-257-3-1-3
40 29,80 ± 2,66 42 ± 4,11 28,5
WT-Taipei
26 23,93 ± 5,61 45,0 ± 3,7 46,6
(Índice: WT = Natural)
Análisis de plantas R3 de CspB
Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por frío de 8 grados Celsius durante 1 día en presencia de 1000 micromol/m2/s de luz. Después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 15 días y al final de la recuperación se registró la altura
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Análisis de plantas R3 de CspA
Experimento I
Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por frío de 10 grados Celsius durante 3 días en presencia de 1000 micromol de luz. Después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran
5 a 28 grados Celsius en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registraron la altura de la planta y el porcentaje de supervivencia de las plantas de semillero (En este experimento se usaron 8 replicaciones para cada línea transgénica y se usaron 10 replicaciones para natural).
Resultados: Las seis líneas transgénicas sometidas a estrés por frío rindieron mejor bajo estrés por frío que la natural. Estos resultados confirmaron adicionalmente los datos de análisis de R2 demostrando tolerancia al frío
10 mejorada (Tabla 4).
Tabla 4: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R3 de CspA.
Líneas
Altura de la planta estresada (cm) al final de la recuperación Altura de la planta sin estresar (cm) al final de la recuperación Porcentaje de reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar Porcentaje de la supervivencia de plantas de semillero
R3-362-3-1-2-2
25,5 ± 4,46 32,25 ± 5,03 20,93 100
R3-362-3-1-3-2
25,62 ± 3,36 34,43 ± 6,24 25,58 66
R3-365-10-1-2-3
27,35 ± 3,24 33,75 ± 4,58 18,96 100
R3-362-6-1-2-1
28 ± 2,45 34,45 ± 2,29 18,72 100
R3-362-7-1-2-3
27,5 ± 24,17 29,94 ± 5,03 8,1 100
R3-362-7-1-3-3
27,88 ± 4,22 31,92 ± 2,89 12,65 100
WT-Nipponbare
26,25 ± 3,95 36,34 ± 4,06 27,76 40
Nota: La altura de la planta sólo se registró para plantas supervivientes y sus promedios se facilitan anteriormente.
Experimento II
15 Protocolo: Plantas de semillero en el estadio de tres hojas se expusieron a estrés por frío de 10 grados Celsius durante 1 día en presencia de 1000 micromol de luz. Después se dejó que las plantas de semillero se recuperaran a 28 grados Celsius en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registraron la altura de la planta y el porcentaje de supervivencia de las plantas de semillero.
Resultados: Las cinco líneas transgénicas sometidas a estrés por frío rindieron mejor bajo estrés por frío que la
20 natural. Estos resultados confirmaron adicionalmente los datos de análisis de R2 mostrando tolerancia mejorada al frío (Tabla 5).
Tabla 5: Observaciones del crecimiento de recuperación del estrés por frío en el estadio de tres hojas de líneas de arroz transgénico R3 de CspA.
Líneas
Altura de la planta estresada (cm) al final de la recuperación Altura de la planta sin estresar (cm) al final de la recuperación Porcentaje de reducción en la altura de la planta con respecto a sin estresar
R3-362-3-1-2-2
32,76 ± 3,49 32,25 ± 5,03 Cero
R3-362-3-1-3-2
36,11 ± 2,04 34,43 ± 6,24 Cero
R3-365-10-1-2-3
35,85 ± 2,94 33,75 ± 4,58 Cero
R3-362-6-1-2-1
21,54 ± 5,84 34,45 ± 2,29 37,4
R3-362-7-1-2-3
32,55 ± 2,73 29,94 ± 5,03 Cero
32
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Tabla 14: Longitud de brotes y raíces promedio (cm) al final de la recuperación
Código de línea
Líneas CC100_Raíz CC100_Brote CC25_Raíz CC25_Brote CC15_Raíz CC15_Brote
1
R2-362-3-1-3-4 24,5 ± 1,9 49,1 ± 3,6 17,0 ± 2,6 34,5 ± 2,4 12,5 ± 1,4 31,2 ± 1,8
2
R2-362-6-1-2-2 23,3 ± 1,3 45,6 ± 1,5 17,5 ± 1,8 31,5 ± 1,5 17,6 ± 2,3 32,0 ± 0,7
3
R2-362-7-1-3-3 24,5 ± 1,3 47,6 ± 3,3 17,8 ± 2,0 33,5 ± 1,7 15,9 ± 1,7 31,9 ± 1,7
4
R2-365-10-1-2-1 24,03 ± 1,5 44,4 ± 2,2 13,8 ± 1,3 30,24 ± 1,1 13,9 ± 1,3 28,9 ± 0,9
5
WT-Nipponbare 23,84 ± 1,25 44,8 ± 2,0 12,9 ± 1,8 31,6 ± 1,2 13,9 ± 1,9 31,5 ± 1,2

Tabla 15: Peso seco de brotes y raíces promedio (mg) al final de la recuperación
Código de línea
Líneas CC100_Raíz CC100_Brote CC25_Raíz CC25_Brote CC15_Raíz CC15_Brote
1
R2-362-3-1-3-4 231 ± 21,8 563,9 ± 60,7 57,6 ± 6,8 189 ± 16,3 44,7 ± 6,3 152,9 ± 22,1
2
R2-362-6-1-2-2 226 ± 14,2 531,8 ± 63 72,1 ± 5,1 179,8 ± 17 53,9 ± 7,9 146,3 ± 21,1
3
R2-362-7-1-3-3 229,5 ± 30,2 533 ± 48,5 66,1 ± 11,9 183 ± 13,9 60,6 ± 5,7 147,4 ± 14,7
4
R2-365-10-1-2-1 219 ± 43,5 557 ± 71,9 56,2 ± 9,3 173,9 ± 27,3 47,3 ± 3,1 133,7 ± 7,7
5
WT-Nipponbare 226 ± 34,5 525 ± 31,3 61,1 ± 4,2 151,1 ± 16,8 45,2 ± 7,5 132,2 ± 11,03
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expresión de planta en el que un gen de interés puede insertarse usando procedimientos de clonación GATEWAY™. El casete de clonación GATEWAY™ está flanqueado en 5' por un promotor, exón e intrón de la actina 1 de arroz y flanqueado en 3' por la región 3' del gen pinII de patata. Usando procedimientos GATEWAY™, el casete de clonación se sustituyó por un gen de interés. El vector pMON65154 y derivados del mismo que comprenden un gen
5 de interés fueron particularmente útiles en procedimientos de transformación de plantas mediante la administración de ADN directo tal como bombardeo de microproyectiles. Un experto en la materia podría construir un vector de expresión con características similares usando procedimientos conocidos en la técnica. Además, un experto en la materia apreciaría que otros promotores y regiones de 3' serían útiles para la expresión de un gen de interés y pueden usarse otros marcadores de selección.
10 Tabla 17.
Elementos del plásmido pMON65154
CASETE
FUNCIÓN ELEMENTO LOCALIZACIÓN REFERENCIA
Gen de planta de la expresión de interés
Promotor Actina 1 de arroz 1796-2638 Wang y col., 1992
Potenciador
Exón 1, , intrón 1 de actina 1 de arroz 2639-3170 Wang y col., 1992
Clonación GATEWAY™
Recombinación AttR1 3188-3312 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Gen de resistencia a cloranfenicol bacteriano
Gen CmR 3421-4080 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Marcadores de selección negativos bacterianos
Genes ccdA, ccdB 4200-4727 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Sitio de recombinación de GATEWAY™
attR2 4768-4892 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Gen de planta del casete de expresión de interés
Región 3' pinII de patata 4907-5846 An y col., 1989
Casete de expresión del gen marcador de selección de planta
Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor 5895-6218 Patente de EE.UU. nº 5352605
Gen marcador de selección
nptII 6252-7046 Patente de EE.UU. nº 6174724
Región 3'
nos 7072-7327 Bevan y col., 1983
Región 3'
pinII 7339-8085 An y col., 1989
Mantenimiento en E. coli
Origen de replicación ColE1 858-1267 Oka y col., 1979
Mantenimiento en E. coli
Origen de replicación F1 8273-3673 Ravetch y col., 1977
Mantenimiento en E. coli
Resistencia a ampicilina bla 8909-551 Heffron y col., 1979
42
Se construyó un vector de plásmido separado (pMON72472, Figura 14) para su uso en procedimientos mediados
por Agrobacterium de la transformación de plantas. El plásmido pRG76 comprende el gen de expresión de la planta
de interés, clonación GATEWAY™ y casetes de expresión de marcadores de selección de planta presentes en
pMON65154. Además, las secuencias límite de T-ADN izquierdas y derechas de Agrobacterium se añadieron al
5 plásmido. La secuencia del límite derecho está localizada 5' con respecto al promotor de actina 1 de arroz y la
secuencia del límite izquierdo está localizada 3' con respecto a la secuencia de 3' de pinII situada 3' con respecto al
gen nptII. Además, el esqueleto de pSK-de pMON65164 fue sustituido por un esqueleto de plásmido para facilitar la
replicación del plásmido en tanto E. coli como Agrobacterium tumefaciens. El esqueleto comprende un origen con
amplio espectro de huéspedes oriV de replicación de ADN funcional en Agrobacterium, la secuencia rop, un origen 10 pBR322 de replicación de ADN funcional en E.coli y un gen de resistencia a espectinomicina/estreptomicina para la
selección para la presencia del plásmido en tanto E. coli como Agrobacterium.
Los elementos presentes en el vector de plásmido pRG81 se describen en la Tabla 18.

Tabla 18. Elementos genéticos del vector de plásmido pRG81
CASETE
FUNCIÓN ELEMENTO LOCALIZACIÓN REFERENCIA
Gen de planta de expresión de interés
Promotor Actina 1 de arroz 5610-6452 Wang y col., 1992
Potenciador
Exón 1, intrón 1 de actina 1 de arroz 6453-6984 Wang y col., 1992
Clonación GATEWAY™
Recombinación AttR1 7002-7126 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Gen de resistencia a cloranfenicol bacteriano
Gen CmR 7235-7894 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Marcadores de selección negativos bacterianos
Genes ccdA, ccdB 8014-8541 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Sitio de recombinación de GATEWAY™
attR2 8582-8706 Manual de instrucciones de la tecnología de clonación GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)
Gen de planta del casete de expresión de interés
Región 3' pinII de patata 8721-9660 An y col., 1989
Casete de expresión del gen marcador de selección de planta
Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor 1-324 Patente de EE.UU. nº 5352605
Gen marcador de selección
nptII 358-1152 Patente de EE.UU. nº 6174724
Región 3'
nos 1178-1433 Bevan y col., 1983
Región 3'
pinII 1445-2191 An y col., 1989
Transformación mediada por Agrobacterium
Transferencia de ADN Límite izquierdo 2493-2516 Zambryski y col., 1982; acceso de GenBank AJ237588
Mantenimiento de plásmido en E. coli o Agrobacterium
Origen de replicación Ori-V 2755-3147 Honda y col., 1988
43
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