MXPA06003596A - Metodos para mejorar la tolerancia al estres en plantas y metodos para el mismo. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un aumento en la tolerancia al estres abiotico en una planta introduciendo ADN que expresa una proteina de choque frio, por ejemplo, una proteina bacteriana de choque frio.

Description

METODOS PARA MEJORAR LA TOLERANCIA AL ESTRES EN PLANTAS Y METODOS PARA EL MISMO Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 USC §119(e) de la solicitud provisional de los Estados Unidos número de serie 60/506,717 presentada el 09/29/2003 y la número de serie 60/530453, presentada el 17 de diciembre del 2003.

INCORPORACION DE LISTA DE SECUENCIA En la presente se incorporan como referencia dos copias de la lista de secuencia (copia 1 de la lista de secuencia y copia 2 de la lista de secuencia) en una forma legible en computadora de la lista de secuencia, todas en CD-ROM, cada una con el archivo denominado CSP.ST25.txt, el cual es de aproximadamente 98 MB (medido en MS-DOS) y fue creado el 28 de septiembre del 2004.

CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con el frío, la sequía, la sal, la germinación en frío, el calor y otras tolerancias al estrés abiótico en plantas y la tolerancia al estrés viral, micótico, bacteriano y otros estréses abióticos en plantas. Específicamente, esta invención se relaciona con un método para incrementar la tolerancia al estrés biótico y abiótico de plantas al expresar una o varias proteínas de choque frío dentro de las células de la planta.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La producción de semillas y frutas son negocios comerciales de muchos miles de millones de dólares y fuentes principales de ingresos en numerosos estados de los Estados Unidos y de muchos países en el mundo. Las semillas comercialmente útiles incluyen, por ejemplo, ajonjolí, semilla de algodón y semilla de girasol, las cuales son valiosas para la producción de aceite vegetal que se pueden obtener de dichas semillas. Las semillas de plantas leguminosas tales como chícharos, frijoles y lentejas también son comercialmente útiles dado que son ricas en proteínas en donde la soya, por ejemplo, contiene 40-45% de proteína y 18% de grasas de aceites. Además, el café es una cosecha útil elaborada de semillas secas y tostadas de plantas de Coffea arábica mientras que el chocolate se elabora de la semilla o "frijol" de cacao. De manera similar, muchas frutas y semillas son útiles comercialmente e incluyen, por ejemplo, maíz, arroz, trigo, cebada y otros cereales, nueces, leguminosas, tomates y frutas cítricas. Por ejemplo, las semillas de maíz se elaboran en muchos artículos alimenticios o en productos utilizados en el cocinado tales como cubiertas para tacos, maíz palomero, tortillas, hojuelas de maíz, harina de maíz y muchos otros productos. El maíz también se utiliza como materia prima en muchos procedimientos de producción que incluyen pero que no se limitan a la producción de pienso y etanol. La producción de semillas y frutas está limitada inherentemente debido ai estrés biótico y abiótico. Por ejemplo, el frijol de soya {Glycine max.) es una especie de cosecha que sufre de la pérdida de germinación de semilla durante el almacenamiento y no germina cuando las temperaturas del suelo son frías (Zhang et al., Plant Soil 188:(1977)). Esto también es válido para el maíz y otras plantas de importancia agronómica. La mejora en la tolerancia al estrés abiótico en las plantas puede ser una ventaja agronómica para los agricultores lo que permite incrementar el crecimiento y/o germinación en ambientes fríos, secos, lodosos, calientes, con estrés por UV, por incrementos de ozono, lluvia ácida, contaminación, estrés por sal, metales pesados, suelos mineralizados y otros estréses abióticos. El estrés biótico, tales como la infección micótica y viral, también provocan pérdidas de cosechas grandes mundialmente. La cruza tradicional (cruza de alelos específicos de un genotipo en otro) se ha utilizado durante siglos para incrementar la tolerancia al estrés biótico, la tolerancia al estrés abiótico y. el rendimiento. La cruza tradicional inherentemente está limitada a un número limitado de alelos presentes en las plantas de origen. A su vez, esto limita la cantidad de variabilidad genética que se pueda agregar de esta manera. La biología molecular ha permitido a los inventores de la presente invención buscar lejos y de manera amplia por genes que mejoren la tolerancia al estrés en plantas. Nuestros inventores buscaron determinar de que manera los organismos reaccionan y toleran condiciones de estrés. Las proteínas de choque frío son parte de un sistema utilizado por las bacterias de otros organismos para sobrevivir a condiciones frías y con estrés. Los inventores han hecho posible el colocar genes que codifican para las proteínas de choque frío y proteínas relacionadas con las mismas, en plantas y que las exprese lo que puede incrementar la tolerancia al frío, sequía, calor, agua y otros estréses abióticos de plantas así como la tolerancia a hongos, virus y otros estréses bióticos de plantas. También se considera que la utilización de genes que son homólogos a las proteínas de choque frío o que tienen similitud en la secuencia, también pueden incrementar la tolerancia a los estréses biótico y abiótico. Esta invención es útil para agricultores para limitar sus pérdidas debido a estréses bióticos y abióticos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona una planta que expresa una proteína de choque frío (Csp) en las células de la planta. La expresión de esta csp genera una mayor tolerancia al estrés abiótico dentro de dicha planta. En una modalidad, se expresa una csp que codifica para un polinucleótido mediante un promotor unido operablemente que funciona en plantas y un terminador que funciona en plantas.

De manera más específica, la invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende, en la dirección 5' a 3', un primer polinucleotido de ADN que comprende un promotor que funcione en plantas, unido operablemente a un segundo polinucleotido de ADN que codifica para una proteína de choque frío, unida operablemente a un polinucleótido de ADN de terminación de transcripción 3' que proporciona un sitio de poliadenilación. El primer polinucleótido de ADN con frecuencia es ventajosamente heterólogo al segundo polinucleótido de ADN. La invención también proporciona una molécula de ADN recombinante que tiene un intrón insertado entre el primer polinucleótido de ADN y el segundo polinucleótido de ADN. La invención también proporciona una molécula recombinante de ADN en donde el segundo polinucleótido de ADN codifica para una proteína que comprende el motivo de la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 3. En modalidades específicas del ADN recombinante de está invención, el segundo polinucleótido de ADN codifica para una proteína que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una proteína con una secuencia de aminoácidos de identidad sustancial con una secuencia de aminoácidos de una proteína de choque frío a partir de bacterias grampositivas, (b) una proteína de choque frío de Bacillus subtilis, (c) un homólogo de ta proteína B de choque frío (CspB) de Bacillus subtilis. (d) una proteína con una secuencia de aminoácidos de identidad sustancial con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 2, (e) una proteína con una secuencia de aminoácidos de identidad sustancial con una secuencia de aminoácidos de una proteína de choque frío de una bacteria gramnegativa, (f) una proteína que comprende una proteína de choque frío de Escheríchia coli, (g) un homólogo de la proteína A de choque frpio (CspA) de Escheríchia coli, (h) una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene identidad sustancial con la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 , (i) una proteína de choque frío de Agrobacterium tumefaciens, y (j) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de identidad sustancial con cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63 ó 65. La invención también proporciona una molécula de ADN recombinante en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste de promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores temporales-regulados, promotores regulados por el desarrollo, promotores preferidos de tejido, promotores mejorados por el frío, promotores específicos para el frío, promotores mejorados por el estrés, promotores específicos del estrés, promotores inducibles por la sequía, promotores inducibles por deficiencia de agua y promotores específicos de tejido. La invención también proporciona células vegetales y plantas que contienen en su genoma moléculas de ADN recombinantes como se describe y los propágulos y la descendencia producida a partir de los mismos. Las plantas incluyen, pero no se limitan a plantas de cosecha, monocotiledóneas y dicotiledóneas. De manera más específica, estas pueden incluir soya, maíz, ajonjolí, arroz, algodón, cebada, avenas, céspedes, algodón y trigo. La invención también proporciona plantas transgénicas tolerantes al estrés abiótico que se han transformado con una molécula de ADN recombinante que expresa una proteína de choque frío. Tales plantas así como sus células y propágulos tales como semillas contienen en su genoma moléculas de ADN recombinante que expresan una proteína de choque frío. Tales plantas presenta una o más de las siguientes propiedades mejoradas: una velocidad mayor de crecimiento bajo condiciones en donde la temperatura fría sería limitante para el crecimiento de una planta no transformada de la misma especie, (a) una velocidad de crecimiento mayor bajo condiciones en donde la temperatura elevada sería un factor limitante para el crecimiento de una planta no transformada de la misma especie, (b) una velocidad mayor de crecimiento bajo condiciones en donde el agua sería un factor limitante para el crecimiento de una planta no transformada de la misma especie, (c) una velocidad mayor de crecimiento bajo condiciones en donde concentraciones aumentadas de sales o iones en el suelo y/o en el agua serían un factor limitante para el crecimiento de una planta no transformada de la misma especie, (d) que tiene un porcentaje mayor de plantas que sobreviven después de un choque frío en comparación con una planta no transformada de la misma especie, (e) un rendimiento aumentado cuando se compara con una planta no transformada de la misma especie, o (f) resistencia a la sequía en comparación con una planta no transformada de la misma especie. Un método de la invención comprende propagar plantas de esta invención, por ejemplo con el propósito de generar semillas al simplemente plantar tales semillas en el suelo y permitir que crezcan, por ejemplo, bajo condiciones de estrés. De manera más específica, esta invención proporciona un método para producir una planta que tiene un rasgo mejorado tal como tolerancia al estrés abiótico, un rendimiento aumentado o una masa de raíz aumentada. El método comprende las etapas de: a) insertar en el genoma de una o varias células vegetales una molécula de ADN recombinante que comprende ADN que codifica para una proteína de choque frío, b) obtener una o varias células vegetales transformadas, c) regenerar plantas a partir de una o varias de las células vegetales transformadas; y d) seleccionar plantas que presenten el rasgo mejorado. En un aspecto de la invención se seleccionan plantas las cuales presentan una tolerancia mejorada al estrés abiótico que se seleccionan del grupo que consiste de tolerancia al calor, tolerancia a la sal, tolerancia a la sequía y supervivencia después de choque frío. La invención también proporciona proteínas aisladas las cuales presentan por lo menos 40% de identidad con una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61, 63 y 65. En algunos aspectos se pueden obtener rasgos comparables al sustituir una proteína de choque en frío con una proteína que tiene una homología superior a 40% de identidad, por ejemplo con una proteína que es por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o por lo menos 95% idéntica a una proteína de choque frío descrita específicamente en la presente. De igual manera, esta invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para un motivo de proteína de choque frío la cual hibridiza con ácidos nucleicos con una secuencia de ADN que se selecciona del grupo que comprende las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 90 y 92. La invención también proporciona específicamente ácidos nucleicos aislados que codifican para una proteína de choque frío la cual tiene una secuencia de ADN que es sustancialmente idéntica a una secuencia en el grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 7, 9, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 53, 55, 57, 59, 61, 63 y 65. La invención también proporciona propágulos que contienen las moléculas recombinantes de ADN anteriores, cuando se plantan o se provoca que germine de alguna otra manera, en un campo de plantas germinado a partir de dichos propágulos, por ejemplo, cuando dichos propágulos son semillas. La invención también proporciona un método para producir una semilla que comprende plantar una semilla de conformidad con la reivindicación 59 en el suelo; b) cosechar la semilla a partir de las plantas; y la semilla producida a partir de las mismas. También se proporciona un método para producir una planta transgénica, el método comprende las etapas de: (i) introducir en el genoma de una célula vegetal una molécula de ADN que comprende un polinucleótido de ADN por lo menos 40% homólogo a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NUMEROS: 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63 y 65 o un fragmento o elemento cis del mismo, en donde el poiinucleótido de ADN está unido operablemente a un promotor y está unido operablemente a una terminación de transcripción 3' de un poiinucleótido de ADN; y (¡i) seleccionar dicha planta transgénica; y (iii) regenerar la célula vegetal transgénica en una planta transgénica; también se proporcionan plantas elaboradas por este método.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el mapa plasmídico de pMON57396. La figura 2 muestra el mapa plasmídico de pMON23450. La figura 3 muestra el mapa plasmídico de p ON57397. La figura 4 muestra el mapa plasmídico de pMON57398. La figura 5 muestra el mapa plasmídico de pMON23450. La figura 6 muestra el mapa plasmídico de pMON57399. La figura 7 muestra el mapa plasmídico de pMON48421. La figura 8 muestra el mapa plasmídico de pMON56609. La figura 9 muestra el mapa plasmídico de pMON56610. La figura 10 muestra el mapa plasmídico de pMON73607. La figura 1 muestra el mapa plasmídico de pMON61322.

La figura 12 muestra el mapa plasmidico de pMON73608. La figura 13 muestra el mapa plasmidico de pMON65 54. La figura 14 muestra el mapa plasmidico de pMON72472. La figura 15 muestra el mapa plasmidico de pENTRl La figura 16 muestra el patrón de crecimiento de plantas que expresan el gen indicado y controles, que muestran que los genes introducidos proporcionan tolerancia al estrés abiótico. La figura 17 muestra el mapa plasmidico de p ON429 6. La figura 18 muestra el mapa plasmidico de pMON73983. La figura 19 muestra el mapa plasmidico de pMON73984.

DESCRIPCION DETALLADA DE MODALIDADES ESPECIFICAS La presente invención proporciona una planta con tolerancia aumentada al estrés biótico y abiótico. La planta que se proporciona tiene una tolerancia aumentada al estrés debido a la expresión de una proteína de choque frío (csp) en las células de la planta. La invención proporciona ejemplos de varias modalidades y contempla otras modalidades que se espera funcionen en la invención. Se proporcionan las siguientes definiciones y métodos para definir de mejor manera la invención actual y para guiar aquellos habitualmente expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, debe entenderse los términos de I acuerdo con su uso convencional por aquellos familiarizados con la técnica. Por ejemplo, las definiciones de términos comunes utilizados en biología molecular y genética molecular se pueden encontrar en Lewin, Genes VII, Oxford University Press and Cell Press, New York, 2000; Buchanan, et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Courier Companies, E.U.A. 2000; Lodish, et al., Molecular Cell Biology, W.H. Freeman and CO., New York, 2000. Los términos comunes en genética se pueden encontrar en las referen>~''- s anten -res asi como Lynch, et al., Genetics and Analysis of Q>tr ,, Tr r . «uer and Associates, Sunderland, MA, 1998; Hartwell, et JL, Geneu. : From Genes to Genomes, McGraw-Hill Companies, Boston, MA 2000; Hartl, et al., Genetics, Analysis of Genes and Genomes, Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, MA; Strachan, et al., Human Molecular Genetics, John Wiley and Sons, New York, 999. Se utiliza la nomenclatura para las bases de ADN como se establece en 37 CFR §1 .822. Se utiliza la nomenclatura estándar de una y tres letras para los residuos aminoácidos. Muchos rasgos agronómicos pueden alterar el "rendimiento". Por ejemplo, estos pueden incluir, sin limitación, la altura de la planta, el número de vainas, la posición de la vaina en la planta, el número de nodos intermedios, la incidencia de destrucción de vaina, el tamaño de grano, la eficiencia de formación de nodulos y fijación de nitrógeno, la eficiencia de asimilación de nutrientes, la resistencia al estrés biótico y abiótico, la asimilación de carbono, la arquitectura de la planta, la resistencia a fijarse, el porcentaje de germinación de semillas, el vigor de las plántulas y los rasgos juveniles. Por ejemplo, estos también pueden incluir, sin limitación, la eficacia de germinación (que incluye la germinación en condiciones de estrés), la velocidad de crecimiento de cualquiera o la totalidad de las plantas (que incluye la velocidad de crecimiento en condiciones estresadas), el número de espigas, el número de semillas por espiga, el tamaño de la semilla, la composición de las semillas (almidón, aceite, proteína) y las características del relleno de ia semilla. El rendimiento se puede medir de muchas maneras, y estas pueden incluir el peso de prueba, el peso de la semilla, el número de semillas por planta, el peso de las semillas por planta, el número de semillas o peso por unidad de área (es decir, semillas o el peso de las semillas por acre), busheis por acre, toneladas métricas por acre, toneladas por acre, kilo por hectárea. En una modalidad, una planta de la presente invención presenta un rasgo mejorado que es un componente de rendimiento. Los términos "(secuencia de) ácido nucleico" o "(secuencia de) polinucleótidos" se refiere a ADN (ácido desoxirribonucleico) de cadena sencilla o de cadena doble o ARN (ácido ribonucleico) de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas, respectivamente, que se leen desde el extremo 5' al extremo 3'. El ácido nucleico puede representar una cadena directa (que se transcribe) o complementaria (antisentido). "Natural" se refiere a una secuencia de ácido nucleico como se encuentra en la naturaleza ("nativa").

Una secuencia "heteróloga" se refiere a una secuencia la cual se origina de una fuente o especie extraña o, si es de la misma fuente, que está modificada de su forma original. Por ejemplo, un promotor natural se puede utilizar para provocar la transcripción de un gen heterólogo del mismo o de una especie diferente. Las "partes" de una planta incluyen todas las partes o piezas de una planta que incluyen, pero que no se limitan a raíces, vástagos, hojas, tallos, polen, semillas, flores, estambre, pistilos, huevos, embriones, pétalos, filamentos, carpelos (que incluyen el estigma, ovario y el estilo), una o varias células o cualquier parte de las anteriores. El término "propágulo" incluye todos los productos de meiosis y mitosis, que incluyen pero que no se limitan a partes de la planta capaces de propagar una planta nueva. Por ejemplo, propágulo incluye el vástago, raíz u otra parte de la planta que es capaz de crecer en una planta completa. El propágulo también incluye injertos cuando una porción de una planta se injerta en otra porción de una planta diferente (incluso una de una especie diferente) para crear un organismo vivo. El propágulo también incluye todas las plantas y semillas producidas por clonación o al unir productos meioticos, o al permitir que los productos meioticos se unan para formar un embrión o un huevo fertilizado (de manera natural o con intervención humana). Una secuencia "aislada" de ácido nucleico está sustancialmente separada o purificada de otras secuencias de ácido nucleico con las cuales el ácido nucleico normalmente se asocia en la célula del organismo en el cual dicho ácido nucleico se encuentra en la naturaleza, es decir, otros ADN cromosómicos o extracromosomicos. El término abarca ácidos nucleicos que están purificados bioquímicamente de manera que se eliminan sustancialmente ácidos nucleicos contaminantes y otros componentes celulares. El término también abarca ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos sintetizados químicamente. Los términos "identidad" o "idéntico" como se utilizan en la presente, cuando se refieren a comparaciones entre una o varias proteínas o uno o varios ácidos nucleicos, significa 98% o mayo identidad. Una primera secuencia de ácido nucleico o proteína presenta una "identidad sustancial" o "similitud sustancial" con una secuencia de ácido nucleico de referencia o proteína si, cuando se alinean de manera óptima (con las inserciones o supresiones apropiadas de nucleótidos o aminoácidos que totalicen menos de 20 por ciento de la secuencia de referencia sobre el intervalo de comparación) con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria) o proteína, existe por lo menos aproximadamente 60% de equivalencia en la secuencia nucleotídica, incluso mejor deberá ser de 70%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 80% de equivalencia, y de manera más preferible por lo menos aproximadamente 85% de equivalencia, y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 90% de equivalencia sobre un intervalo de comparación de por lo menos 20 posiciones nucleotídicas o de aminoácidos, preferiblemente por lo menos 50 posiciones nucleotídicas o de aminoácidos y de manera más preferible por lo menos 100 posiciones nucleotídicas o de aminoácidos, y de manera mucho más preferible sobre toda la longitud del primer ácido nucleico o proteína. La alineación óptima de las secuencias para alinear un intervalo de comparación se puede llevar a cabo por uno o varios algoritmos de homología local, preferiblemente por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (las cuales se pueden encontrar, por ejemplo, en Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl). El ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud completa o una porción de una molécula más grande. Alternativamente, dos ácidos nucleicos tienen actividad sustancial si una hibridiza con la otra bajo condiciones rigurosas. Se pueden determinar empíricamente las condiciones de hibridación apropiadas o se pueden calcular en base, por ejemplo, en el contenido relativo de G+C de la sonda y el número de malos pareamientos entre la sonda y la secuencia objetivo, si se conoce. Se pueden ajustar las condiciones de hibridación según se desee al variar, por ejemplo, la temperatura de hibridación o la concentración de sal (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorry Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, 1989). Una primera secuencia de ácido nucleico está "unida operablemente" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias están distribuidas de manera tal que la primera secuencia de ácido nucleico altera la función de la segunda secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente, las dos secuencias son parte de una molécula continua única de ácido nucleico y de manera más preferible están adyacentes. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente a un gen si el promotor regula o media la transcripción del gen en una célula. Por ejemplo, una región de terminación transcripcional (terminador) está unido operablemente a un gen cuando dicho terminador induce la finalización de una transcripción por ARN polimerasa que contiene el gen en o cerca del terminador. Por ejemplo, con frecuencia un mejorador está adyacente al promotor que está presentando su efecto, pero generalmente está en la misma molécula de ácido nucleico. Un ácido nucleico o ADN o molécula de ARN "recombinante" se elabora por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otra manera estarían separados, por ejemplo por síntesis química o por la manipulación de los segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética. Son bien conocidas las técnicas para manipulación de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, 1989). Los métodos para la síntesis química de ácidos nucleicos se exponen, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981 y Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 03:3185, 1981. La síntesis química de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo, por ejemplo, en sintetizadores oligonucleotídicos automatizados comerciales. La "expresión" de un gen se refiere a la transcripción de un gen para producir el ARNm correspondiente y la traducción de este ARNm para producir el producto de gen correspondiente, es decir, un péptido, polipéptído o proteína. La expresión del gen se controla o modula por elementos reguladores que incluyen elementos reguladores 5' tales como promotores. Los términos "construcción de ADN recombinante", "vector recombinante", "vector de expresión" o "cásete de expresión" se refieren a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, BAC (cromosoma artificial bacteriano), secuencia replicante autónoma, fago o una secuencia nucleotídica de ADN o ARN de cadena sencilla o de cadena doble, lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integración genómica o de replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN en la cual una o más secuencias de ADN se han enlazado de una manera funcionalmente operativa. El término "complementario" se refiere a la asociación natural de secuencias de ácido nucleico por pareamiento de bases. La complementariedad entre dos moléculas de cadena sencilla puede ser parcial si solo parte de los pares de ácidos nucleicos son complementarios; o completa, si todas los pares de bases son complementarios. El grado de complementariedad altera la eficacia y fuerza de las reacciones de hibridación y amplificación. El término "homología" se refiere al nivel de similitud entre las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, en términos de identidad o similitud entre nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, es decir, la similitud o identidad de la secuencia. La homología, homólogo u homologa también se refiere al concepto de propiedades funcionales similares entre ácidos nucleicos o proteínas diferentes. Los homólogos incluyen genes que son ortólogos y parálogos. Los homólogos se pueden determinar utilizando la secuencia codificante para un gen, descrito en la presente o encontrada en una base de datos apropiada (tal como en NCBI u otras) en una o más de las siguientes maneras. Para una secuencia de proteína, las secuencias deben compararse utilizando algoritmos (por ejemplo, véase la sección de "identidad" e "identidad sustancial"). Para secuencias nucleotídicas, la secuencia de una molécula de ADN se puede comparar con la secuencia de un homólogo conocido o putativo de una manera muy similar. Los homólogos son por lo menos 20% idénticos, de manera más preferible 30%, de manera mucho más preferible 40%, de manera más preferible 50% idénticos, de manera más preferible 60%, de manera más preferible 70%, de manera más preferible 80%, de manera más preferible 88%, de manera más preferible 92%, y de manera mucho más preferible 95%, a través de cualquier región sustancial (25 nucleótidos o aminoácidos, de manera más preferible 50 nucleótidos o aminoácidos, de manera más preferible 100 nucleótidos o aminoácidos o de manera mucho más preferible la longitud completa de la secuencia más corta) de la molécula (ADN, ARN o molécula de proteína). De manera alternativa, dos secuencias o moléculas de ADN o ARN que codifican o que pueden codificar para secuencias de aminoácidos, son homologas o codifican para secuencias homologas, si las dos secuencias o el complemento de una o ambas secuencias, hibridiza con la otra bajo condiciones rigurosas y si presentan una función similar. Por lo tanto, si uno desea determinar si dos secuencias proteínicas son homologas, uno debe hacer ejercicios de cálculo descritos en la presente y generar secuencias codificantes degeneradas de todas las posibles secuencias de ácido nucleico que pueden codificar para las proteínas y determinar si pueden hibridizar bajo condiciones rigurosas. Las condiciones rigurosas apropiadas las cuales promueven la hibridación de ADN, po ejemplo 6.0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de 2.0 x SSC a 50°C, se conocen por aquellos expertos en la técnica o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar a partir de una rigurosidad baja de aproximadamente 2.0 x SSC a 50°C respecto a una de alta rigurosidad de aproximadamente 0.2 x SSC a 50°C. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede incrementar desde las condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alta rigurosidad de aproximadamente 65°C. Se pueden hacer variar tanto la temperatura como la concentración de sal, o la temperatura y la concentración de sal se pueden mantener constante mientras se cambian otras variables. En una modalidad preferida, un ácido nucleico que codifica para una proteína descrita en la presente invención hibridizará específicamente con una o más moléculas de ácido nucleico o complementos de las mismas o fragmentos de cualesquiera de las condiciones altamente rigurosas, por ejemplo de aproximadamente 2.0 x SSC y aproximadamente 65°C. La hibridación de la sonda a la molécula de ADN objetivo se puede detectar por cualquiera de numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, estos pueden incluir, pero no se limitan a etiquetas fluorescentes, etiquetas radioactivas, etiquetas basadas en anticuerpos y etiquetas quimioluminiscentes. Las "proteínas de choque frío" (Cps(s) o CSP(s)) son proteínas que tienen más de 40% de identidad con la proteína CspA de Escheríchia coli (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 ) o la proteína CspB de Bacillus subtilis (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 2), o de manera alternativa, se pueden encontrar proteínas de choque de frío mediante la utilización del dominio conservado, como se determina en la literatura. Por ejemplo, como se utiliza en la presente, una proteína de choque frío es 40% idéntica, de manera más preferible 50% idéntica, de manera más preferible 60% idéntica, de manera más preferible 70% idéntica, de manera más preferible 80% idéntica, de manera más preferible 90% idéntica, de manera más preferible 95% idéntica a CspA de E. coli o CspB de B. subtilis, a través de toda la longitud de la CspA de E. coli o CspB de B. subtilis. Están disponibles varias bases de datos para permitir a una persona experta en la técnica determinar si una proteína nueva o existente contiene un dominio de choque frío o si es una proteína de choque frío, a partir de Genbank a bases de datos de proteínas diseñadas para permitir la determinación de las relaciones de proteína y/o para encontrar proteínas relacionadas. Se incluyen en la presente dentro de la definición la totalidad de las proteínas de choque frías conocidas que incluyen pero que no se limitan a CspA, CspB, CspC, CspD, CspE. CspF, CspG, CspH, Cspl (Patente de los E.U.A. 6,610,533) de Escheríchia coli. El dominio de choque frío conservado se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 3 ([FY]-G-F-l-x(6,7)-[DER]-[LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY]) (Prosite motif PS00352; Bucher and Bairoch, (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman R., Brutlag, D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61 , AAAIPress, Menlo Park, 1994; Hoffman et al., Nucleic Acids Res. 27:215, 1999). De manera alternativa, las proteínas de choque frío se pueden encontrar utilizando la base de datos Sprint (una base de datos de característica de proteína relacionadas) (Attwood et al., Nucleic Acids Res. 28(1):225, 2000; Attwood, et al., Nucleic Acids Research, 30(1), ¡n press, 2002). De manera alternativa, las proteínas de choque frío se pueden encontrar utilizando una descripción basada en matriz de Pfam. Pfam es una colección grande de alineaciones de secuencia múltiple y modelos de marco ocultos que cubren muchos dominios de proteína comunes (Bateman et al., Nucleic Acids Research 28:263, 2000). En el momento de escribir esto (noviembre del 2001 ; Pfam, versión 6) existen 3071 familias. Las proteínas de choque frío se incluyen como PF00313. Las especies de árboles que muestran la distribución de proteínas de choque frío como se determina en la base de datos Pfam. Las "proteínas de choque frío" como se utilizan en la presente, también incluyen, pero no se limitan a alguna proteína que se encuentra en una búsqueda, utilizando una proteína de choque frío como una secuencia solicitada, de una base de datos utilizando la función "Blink" (enlace Blast) que se puede encontrar en el National Center for Biotechnology Information. "Blink" es una función de búsqueda rápida utilizada para encontrar proteínas con secuencias similares. Esta definición de "proteína de choque frío" o "dominio de choque frío" es además de los utilizados en lo anterior y no sustituye a dicha definición. Las proteínas de choque frío o las proteínas que contienen dominios de choque frío incluyen, pero no se limitan a todas las proteínas conocidas actualmente en bases de datos públicas y privadas así como aquellas que aún no han sido descubiertas que son suficientemente similares con las proteínas que se reclaman (por ejemplo CspA de E. coli y Csp de B. subtilis) para que sean "aciertos" bajo los ajustes de búsqueda Blast estándar utilizados actualmente en enlace Blast (con respecto al 1 de noviembre del 2001 ). Respecto a este documento, se está corriendo Blast 2, y se está corriendo Blast Link ("Blink") con los parámetros implícitos para búsquedas Blast proteína-proteína. Respecto a este documento, consideramos que los ajustes implícitos utilizados en Blink son los siguientes: se corre una matriz BLOSUM62, utilizando la base de datos "nr", se selecciona la búsqueda CD, así como estadísticas basadas en composición, con la complejidad seleccionada como "complejidad baja", la esperanza es 10, con un tamaño de palabra de 3, los costos de separación son: existencia 11 y extensión 1. La lista en la tabla I muestra los primeros 200 aciertos para CspA de E. coli utilizando estos ajustes estándar, pero no limitamos nuestra reivindicación a los primeros 200 aciertos. Una persona experta en la técnica puede observar que bajo este criterio muy riguroso se encontraron 167 proteínas de origen bacteriano, pero también 28 de metazoarios y 5 proteínas vegetales. Estas proteínas incluyen una gama amplia de proteínas, que debido a su homología con CspA, se puede esperar por los inventores que funcionen en la presente invención. Esto de ninguna manera es una lista incluyente, y se espera que funcionan en la presente invención otras proteínas. Cuadro 20. Algunas proteínas de choque frío y proteínas que contienen un dominio de choque frío encontradas por similitud con CspA de E. coli. Esta lista se compila utilizando los ajustes de enlace Blast estándar del National Center for Biotechnology informatlon. El ID de Genbank y el número de cada proteína se muestran. Nota: Debido a la manera en que son nombradas las proteínas, algunas proteínas y secuencias tendrán varias entradas, como proteínas, ADNc, alelos, etc. El ID de Genbank se puede considerar que son identificadores específicos de cada entrada. Las entradas están en orden aproximado de identidad más alta a la más baja, en comparación con la secuencia analizada. 10176234 proteína de choque frío [Bacillus halondurans] 1869948 proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum] 729220 PROTEINA DE CHOQUE FRIO CSPC 7379745 regulador transcrípcional putativo [Neisseria meningitidis Z2491] 1620431 csp [Lactobacillus plantarum] 1405472 proteina CspB [Bacillus cereus] 3892590 proteína de choque frío E [Lactococcus lactls] 7226073 proteína de la familia del dominio de choque frío [Neisseria meningitidis MC58] 2493766 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO CSPLA (CSPL) 1001878 proteína CspA [Listeria monocytogenes] 13623066 proteína de choque frío putativo [Streptococcus pyogenes M1 GAS] 758663 proteína de choque frío [Arthobacter globiformis] 4468 19 proteína de choque frío A; proteína CspA [Bordetella pertussis] 2370256 proteína de choque frío [Lactococcus lactis] 1405470 proteína CspA [Bacillus cereus] 2226349 CspC [Staphylococcus aureus] 1405476 proteína CspD [Bacillus cereus] 1513079 proteína A de aclimatación frió A [Pseudomonas fragi] 7242722 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 2425105 proteína de choque frío principal [Micrococcus luteus] 2105046 cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] 15023696 proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum] 12720931 MsmB [Pasteurella multocida] 8101860 proteína de choque frío principal CspA [Straphylococcus aureus] 1513081 proteína de aclimatación en frío B [Pseudomonas fragi] 3097243 proteína de choque frío pequeño [Mycobacterium leprae] 9587215 proteína de choque frío CspA [Mycobacterium smegmatis] 9107526 proteína de choque frío [Xylella fastidiosa 9a5c] 1256629 proteína de choque frío [Bacillus subtilis] 12054789 proteína de choque frío (CspLB) [Listeria monocytogenes] 1864167 proteína de choque frío principal homologa CspB [Listeria monocytogenes] 1421212 proteína de choque frío principal (Cspb) 297761 proteína de choque frío (CspB) [Bacillus subtilis) 13625473 proteína de aclimatación en frío CapB [Pseudomonas sp. 30/3] 9657576 proteína del dominio de unión de ADN de choque frío [Vibrio cholerae] 1 933043 proteína similar a choque frío [Streptomyces nodosus] 11933034 proteína similar a choque frío [Streptomyces hygroscopicus] 8248794 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 1778825 proteína de choque frío principal CspA [Pseudomonas aeruginosa] 740006 proteína de choque frío 2226347 CspB [Straphylococcus aureus] 1616777 proteína similar a choque frío [Stigmatella aurantiaca] 7210998 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 729217 PROTEINA DE CHOQUE FRIO CSPB 1067201 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor] 7321274 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 1402789 proteína de choque frío principal [Yersinia enterocolitica) 1513086 proteína B de temperatura de aclimatación [Pseudomonas fragi] 1641 332 proteína similar a choque frío [Listeria monocytogenes] 5732895 F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)] 4193390 CspA [Myxococcus xanthus] 4193394 CspC [Myxococcus xanthus] 1405478 proteína CspE [Bcillus cereus] 1402753 proteína de choque frío principal [Klebsiella pneumoniae] 2893729 proteína de choque frío [Aquifex aeolicus] 2815334 proteína de choque frío de dominio [Streptomyces coleicolor A3(2)] 4193398 CspE [Myxococcus xanthus] 4193396 CspD [Myxococcus xanthus] 2894098 proteína de choque frío [Thermotoga marítima] 15074838 PROTEINA REGULADORA DE TRANSCRIPCION DE CHOQUE FRIO PUTATIVO 1402731 proteína de choque frío principal [Aeromonas hydrophila] 46789 proteína similar a choque frío 7 kDa [Streptomyces clavuligerus] 9946316 proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa] 1402769 proteína de choque frío principal [Proteus vulgaris] 456240 proteína de choque frío principal (CspB) [Sporosarcina globispora] 19743 nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris] 15026046 proteína de choque frío [Clostridium acetobutylicum] 11493820 proteína de choque frío C [Yersinia enterocolitica] 4982460 proteína de choque frío [Terhmotoga marítima] 15979415 proteína similar a choque frío [Yersinia pestis] 16419455 similar a CspA pero no indujo choque frío [Salmonella typhimurium] 14523127 proteína de choque frío putativo [Sinorhizobium meliloti] 9107847 proteína B de temperatura de aclimatación [Xylella fastidiosa 9a5c] 3036806 proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana] 2182333 Y4cH [Rhizobium sp. NGR234] 1402733 proteína de choque frío principal [Aeromonas salmonicida] 9655615 proteína similar a choque frío CspD [Vibrio cholerae] 3831556 proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis] 3821915 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremorís] 15160284 AGR_L_3376p [Agrobacterium tumefaciens] 6458627 proteína de choque frío, familia CSD [Deinococcus radiodurans] 3821923 proteína de choque frío principal [Lactobacillus helveticus] 3821911 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis] 5157349 AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens] 15 54976 AGR_C_161p [Agrobacterium tumefaciens] 3831558 proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus] 456238 proteína de choque frío [Bacillus subtilis] 1 17574 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO CSPD (CSP-D) 12620649 1D534 [Bradyrhizobium japonicum] 13424521 proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus] 3776223 CspA [Sinorhizobium meliloti] 15075353 PROTEINA REGULADORA DE TRANSCRIPCION DE CHOQUE FRIO PUTATIVO [Sinorhizobium] 15075133 PROTEINA REGULADORA DE TRANSCRIPCION DE CHOQUE FRIO PROBABLE [Shinorhizobium] 3821913 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis] 13476765 proteína de choque frío [Mesorhizobium loti] 3821925 proteína de choque frío principal [Streptococcus thermopilus] 3821921 j proteína de choque frío principal [Lactobacillus acidophilus] 729222 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO CSPJ 5162334 AGR_pAT_762p [Agrobacterium tumefaciens] 13475232 proteína de choque frío [Mesorhizobium loti] 9947082 proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa] 13424199 proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus] 9948689 proteína de choque frío CspD [Pseudomonas aeruginosa] 4193392 CspB [Myxococcus xanthus] 13488430 proteína de choque frío [Mesorhizobium loti] 12720739 CspD [Pasteurella multocida] 3831560 proteína de choque frío principal [Bifidobacterium animalis] 1513084 proteína A de temperatura de aclimatación [Pseudomonas fragi] 1169113 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO CSPD 5714745 proteína de choque frío 7.4 [Rhodococcus sp. 7/1] 1402767 proteína de choque frío principal [Photobacterium phosphoreum] 14523160 regulador transcripcional de proteína de choque frío probable CspA5 15979447 proteína similar a choque frío [Yersinia pestis] 13488214 proteína de choque frío [Mesorhizobium loti] 5714743 proteína de choque frío A [Rhodococcus sp. 5/14] 3861208 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO (cspA) [Ricketísia prowazekii] 81624 proteína rica en glicina 2 - Arabidopsis thaliana 15156913 AGR C 3315p [Agobacterium tumefaciens] 15074652 PROTEINA REGULADORA DE TRANSCRIPCION DE CHOQUE FRIO PUTATIVO [Sinorhizobium] 7295442 producto del gen CG17334 [Drosophila melanogaster] 3850772 proteína de choque frío A [Lactococcus lactis] 14334920 proteína de unión de ADN de dedo de zinc rico en glicina putativo [Arabidopsis 3892588 proteína de choque frío C [Lactococcus lactis] 2708747 proteína de unión de ADN de dedo de zinc rico en glicina putativo [Arabidopsis 2739396 proteína de caja Y [Drosophila melanogaster] 1402763 proteína de choque frío principal [Photobacterium mondopomensis] 15620137 proteína similar a choque frío [Ricketísia conorif] 1402755 proteína de choque frío principal [Lactobacillus casei] 409419 factor de caja Y [Aplysia californica] 1403981 1 proteína de unión de caja Y [Schistosoma japonicum] 9946868 proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa] 1483311 proteína de caja Y [Dugesia japónica] 477478 proteína de unión de caja Y [Schistosoma mansoni] 1402759 proteína de choque frío principal [Listeria innocua] 15159048 AGR_L_1288p [Agrobacterium tumefaciens] 2228815 proteína de choque frío principal CspH [Salmonella typhimurium] 691 694 proteína de choque frío A [Streptococcus thermophilus] 2970679 proteína de caja Y [Drosophila silvestris] 14602477 proteína de la familia del dominio de choque frió A [Homo sapiens] 10727970 gen productor yps [Drosophila melanogaster] 1402757 proteína de choque frío principal [Listeria grayi] 1402751 proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis] 1083796 RYB-a proteína - rata 505133 RYB-a [Rattus norvegicus] 14523481 proteína transcripcional reguladora de choque frío probable CspA6 8100512 proteína Y box ZONA B-B [Canis familiaris] 8100510 proteína Y-box ZONA B-A [Canis familiaris] 15306095 proteína XP_053028 hipotética [Homo sapiens] 10185725 isoforma 3 corta de proteína de caja Y [Mus musculus] 10185723 isoforma 3 larga de proteína de caja Y [Mus musculus] 7385223 proteína de unión ARN SY4 [Mus musculus] 6166110 PROTEÍNA DE ADN DE UNION A (PROTEINA A DE DOMINIO A CHOQUE FRIO) 1402783 proteína de choque frío principal [Streptococcus pyogenes] 1167838 proteína de unión ADN [Homo sapiens] 160331 homólogo dbpA murino [Mus musculus] 1101884 YB2 [Rattus norvegicus] 950340 proteína A de unión de ADN [Homo sapiens] 5322 1 proteína de unión Y-box [Mus musculus] 87332 proteína A de unión de ADN - humano (fragmento) 14742409 proteína hipotética XP_046353 [Homo sapiens] 14270385 proteína de dominio de choque frío [Takifugu rubripes] 9653686 proteína de unión de elemento supresor del receptor TSH-1 ; TSEP-1 8249978 proteína de choque frío B [Streptomyces coelicolor A3(2)] 3695368 zfY1 [Danio rerio] CspB de Bacillus subtilis (B. subtilis) es una proteína que se acumula en respuesta a choque frío (Willimsky, et al., Journal of Bcteriology 174:6326 (1992)). Tiene homología con CspA de E. coli (véase cuadro I) y contiene un dominio de unión de ácido nucleico de cadena sencilla (López, et al., The Journal of Biological Chemistry 276:15511 (2001 )). Utilizando la misma búsqueda básica Blast en NCBI (Blink), las siguientes proteínas se denominan como "aciertos". El número de aciertos que se muestra aquí está limitado a 200, pero muchas otras proteínas se puede esperar que funcionen en la invención. Cuadro 21. Algunas proteínas de choque frío y proteínas que contienen dominios de choque frío encontradas al examinar con CspB de B. subtilis. Esta lista se compila utilizando ajustes para enlace Blast estándar (Blink) en el National Center for Biotchnology Information. Se muestra el ID de Genbank y el número de cada proteína. Nota: Debido a la manera en que se denominan a las proteínas, algunas proteínas y secuencias tendrán varias entradas, como proteínas, ADNc, alelos, etc. Se puede considerar que ID de Genbank son los identificadores específicos de cada entrada. Las entradas están en el orden aproximado de mayor identidad a menor identidad con respecto a la secuencia analizada. 9968446 proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum] 1402739 proteína de choque frío principal [Bacillus subtilis] 3892590 proteína de choque frío E [Lactococcus lactis] 2226347 CspB [Staphylococcus aureus] 3850776 proteína de choque frío D [Lactococcus lactis] 1402741 proteína de choque frío principal [Bacillus subtilis] 15979774 proteína de choque frío [Yersinia pestis] 10039151 proteína similar a choque frío cspE [Buchnera sp. APS] 8248794 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 460698 CspC (MsmB) [Escherichia coli] 933043 proteína similar a choque frío [Streptomyces nodosus] 11933034 proteína de choque frío [Streptomyces hygroscopicus] 1620431 csp [Lactobacillus plantarum] 16419141 ARN chapetón, regulador negativo de la transcripción de cspA [Salmonella typhimurium LT2] 15979692 proteína de choque frío [Yersinia pestis] 2894098 proteína de choque frío [Thermotoga marítima] 1869948 proteína de choque frío [Lactobacillus plantarum] 2370256 proteína de choque frío [Lactococcus lactis] 2970685 proteína de choque frío C [Salmonella typhimurium] 1778540 proteína similar a choque frío [Escherichia colí] 471099 CspE (MsmC) [Escherichia coli] 10038996 proteína similar a choque frío cspC [Buchnera sp. APS] 7242722 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A32(2)] 15026046 proteína de choque frío [Clostridium acetobutyllcum] 15980582 proteína de choque frío putativo [Yersinia pestis] 9657576 proteína de unión de dominio ADN de choque frío [Vibrio cholerae] 349561 proteína de unión ADN [Salmonella typhimurium] 4982460 proteína de choque frío [Thermotoga marítima] 1405478 proteína CspE [Bacillus cereus] 9946316 proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa] 9658370 proteína de la familia del dominio de choque frío [Vibrio cholerae] 5869509 CspG [Shewanella violácea] 1067201 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor] 9948689 proteína de choque frío CspD [Pseudomonas aeruginosa] 3891780 Cadena A, proteína de choque frío principal de solución de Escherichia coli estructura Nmr 576191 proteína de choque frío principal 7.4 (Cspa (Cs 7.4)) de (Escherichia coli) 72232 proteína de choque frío principal cspA - Escherichia coli 9657556 regulador transcripclonal de choque frío CspA [Vibrio choleraé] 6458627 proteína de choque frío, familia CSD [Deinococcus radiodurans] 3831556 proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis] 15023696 proteína de choque frío [Clostrídium acetobutylicum] 2425105 proteína de choque frío principal [Micrococcus luteus] 1402737 proteína de choque frío principal [Bacillus cereus] 9587215 proteína de choque frío CspA [Mycobacterium smegmatis] 7226073 proteína de la familia del dominio de choque frío [Neisseria meningitidis MC58] 4454361 proteína de choque frío, CSPA [Vibrio cholerae] 479003 proteína de choque frío [Escherichia coli] 3097243 proteína de choque frío pequeña [Mycobacterium leprae] 1778828 proteína de choque frío principal CSPA2 [Yersinia enterocolitica] 758663 proteína de choque frío [Arthrobacter globiformis] 2105046 cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] 7379745 regulador transcripcional putativo [Neisssería meningitidis Z2491] 3249024 proteína de choque frío CspB [Yersinia enterocolitica] 7210998 proteína de choque frío [Streptomyces coleicolor A3(2)] 1513081 proteína B de aclimantación fría [Pseudomonas fragi] 5869504 CspA [Shewanella violácea] 1778825 proteína de choque frío principal CspA [Pseudomonas aeruginosa] 1513086 proteína B de temperatura de aclimatación [Pseudomonas fragi] 12514257 proteína de choque frío homólogo de Salmonella [Escherichia coli 0157:H7 EDL933] 5732895 F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)] 3831558 proteína de choque frío principa! [Pediococcus pentosaceus] 1468921 proteína de choque frío CspG [Escherichia coli] 13625473 proteína de aclimatación fría CapB [Pseudomonas sp. 30/3] 6073870 proteína de choque frío principal CSPA1 [Yersinia enterocolitica] 1402771 proteína de choque frío principal [Staphylococcus aureus] 1402761 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris] 15981565 proteína de choque frío principal Cspal [Yersinia pestis] 9107847 proteína B de aclimatación de temperatura [Xylella fastidiosa 9a5c] 7321274 proteína de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 2815334 proteína de dominio de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 2275140 proteína hipotética [Yersinia pestis] 9947082 proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa] 2983729 proteína de choque frío [Aquitex aeolicus] 2961317 cspB [Salmonella typhimurium] 46789 proteína de choque frío 7 kDa [Streptomyces clavullgerus] 9107526 proteína de choque frío [Xylella fastidiosa 9a5c] 1513079 proteína A de aclimatación en frío [Pseudomonas fragi] 4193394 CspC [Myxococcus xanthus] 4193392 CspB [Myxococcus xanthus] 3821911 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis] 16503235 proteína de choque frío [Salmonella entérica subsp. entérica serovar Typhi) 9957540 proteína B de choque frío [Yersinia enterocolitica] 3821921 proteína de choque frío principal [Lactobacillus acidophilus] 1616777 proteína similar a choque frío [Stigmatella aurantiaca] 1402759 proteína de choque frío principal [Listeria innocua] 44681 19 proteína A de choque frío; proteína CspA [Bordetella pertussis] 1742550 proteína similar a choque frío CspB [Escherichia coli] 12720739 CspD [Pasteurella multocida] 3821915 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. cremoris] 1402765 proteína de choque frío principal [Pediococcus pentosaceus] 1513084 proteína A de temperatura de aclimatación [Pseudomonas fragi] 4193396 CspD [Myxococcus xanthus] 4193398 CspE [Myxococcus xanthus] 3831560 proteína de choque frío principal [Bifidobacterium animalis] 4193390 CspA [Myxococcus xanthus] 3821923 proteína de choque frío principal [Lactobacillus helveticus] 12720931 MsmB [Pasteurella multocida] 3850772 proteína A de choque frío [Lactococcus lactis] 9655615 proteína similar a choque frío CspD [Vibrio cholerae] 9946868 proteína de choque frío probable [Pseudomonas aeruginosa] 1402757 proteína de choque frío principal [Listeria grayi] 3821913 proteína de choque frío principal [Lactococcus lactis subsp. lactis] 1402735 proteína de choque frío principal [Bacillus atrophaeus] 1402751 proteína de choque frío principal [Enterococcus faecalis] 3892588 proteína C de choque frío [Lactococcus lactis] 1169113 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO CSPD 15979415 proteína similar a choque frío [Yersinia pestis] 7574 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO CSPD (CSP-D) 15075133 PROTEINA REGULARA DE TRANSCRIPCION DE CHOQUE FRIO PROBABLE [Sinorhizobium meliloti] 16419455 similar a CspA pero no induciendo choque frío [Salmonella typhimurium LT2] 11493820 proteína C de choque frío [Yersinia enterocolitica] 1402783 proteína de choque frío principal [Streptococcus pyogenes] 3821925 proteína de choque frío principal [Streptococcus thermophilus] 1402775 proteína de choque frío principal [Streptococcus dysgalactiae] 8249978 proteína B de choque frío [Streptomyces coelicolor A3(2)] 15160284 AGR_L_3376p [Agrobacterium fumefac/ens] 81624 proteina 2 rica en glicina - Arabidopsis thaliana 19743 nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris] 2916930 cspB [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] 3475232 proteína de choque frío [Mesorhizobium loti\ 3861208 PROTEINA SIMILAR A CHOQUE FRIO (cspA) [Rickettsia prowazekü] 2182333 Y4cH [Rhizobium sp. NGR234] 13476765 proteína de choque frío [Mesorhizobium loti] 3776223 CspA [Sinorhizoblum meliloti] 1402755 proteína de choque frío principal [Lactobacillus casei] 15620137 proteína similar a choque frío [Rickettsia conorii] 15154976 AGR C 161 p [Agrobacterium tumefaciens] 15074838 PROTEINA REGULARA DE TRANSCRIPCION SIMILAR A CHOQUE FRIO PUTATIVO [Sinorhizobium meliloti] 14548150 proteína de choque frío de unión ARN [uncultured crenarchaeote 4B7] 2440094 proteína de choque frío pequeño [Mycobacterium leprae] 14523127 proteína de choque frío putativo [Sinorhizobium meliloti] 12620649 ID534 [Bradyrhizobium japonicum] 1063684 AtGRP2b [Arabidopsis thaliana] 13424521 proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus] 3036806 proteína rica en glicina [Arabidopsis thaliana] 1402731 proteína de choque frío principal [Aeromonas hydrophila] 214642 p54 [Xenopus laevis] 15075353 PROTEINA REGULADORA DE TRANSCRIPCION DE CHOQUE FRÍO PUTATIVO [Sinorhizobium meliloti] 13424199 proteína de la familia del dominio de choque frío [Caulobacter crescentus] 14602477 similar a la proteína A del dominio de choque frío [Homo sapiens] 1175535 PROTEINA P56 DE UNION DE ARN CITOPLASMICO (PROTEINA DE UNION DE CAJA Y-2) (FACTOR DE TRANSCRIPCION DE CAJA Y) (MRNP4) 104266 proteína de unión de caja Y - rana africana con ganchos 15157349 AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens] 8100512 proteína de caja Y ZONA B-B [Canis familiaris] Los CSP son un grupo de proteínas que pueden o no ser incrementadas en cantidad cuando se hace descender la temperatura o se aplican otros estréses. De hecho, en el organismo mejor estudiado con respecto a las proteínas de choque frío, E. coli, algunas proteínas de choque frío se expresan de manera constitutiva mientras otras se inducen por el frío, y otras más parecen ser específicas para estréses específicos y/o condiciones o etapas de crecimiento. Una revisión de esto es Yamanaka, et al., Molecular Microbiology, 27:247 (1998). En esta revisión, Yamanaka y colaboradores presentan con detalle la manera en la cual las nueve proteínas de choque frío en £ coli (CspA a CspI) se expresan. CspA, CspB y CspG son inducibles por frío. CspD es inducida en la fase estacionaria del ciclo celular y durante la suspensión de alimento. CspC y E se han implicado en la división celular. CspA es la proteína de choque frío principal de Escherichia coli (E. coli) (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 ). CspA también se le denomina la proteína de choque frío principal 7.4. CspA es fuertemente inducida en respuesta al choque frío (Goldstein, et al., Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87:283 (1990)). En algunas condiciones de crecimiento más lento, los ribosomas se frenan debido a la formación de la estructura secundaria de ARN o ADN, y esto puede actuar como una señal para la síntesis aumentada de las CSP en su organismo de origen. Las CSP se unen a ADNss (de cadena sencilla) y ARN bajo condiciones in vitro (Phadtare, et al., Molecular Microbiology 33:1004 (1999)). Se considera que la CSP se unen a ARN de una manera relativamente no específica durante la traducción y evitan la formación de estructura secundaria y estabilizan el ARN (esta función algunas veces se denomina como un ARN chaperón). El ribosoma después puede desplazar fácilmente a las CSP e iniciar la traducción en una plantilla de ARN lineal. Consideramos que la presente invención puede involucrar la función de ácido nucleico de cadena sencilla de estas proteínas y esta función puede provenir de cualquier proteína de choque frío o proteína que contenga un dominio de choque frío la cual incluye, por ejemplo, proteínas de choque frío procarióticas, genes que contienen la caja Y eucarioticas, algunas proteínas con alta concentración de glicina (GRP, por sus siglas en inglés) y otras proteínas que contienen el dominio de choque frió. Estas proteínas incluyen, pero no se limitan a aquellas mostradas en la figura 4, Trends ¡n Biochemical Science, 23(8):289 (1998) (documento incluido, que se incorpora en la presente como referencia). Esta figura 4 muestra claramente la relación evolutiva entre estas proteínas. Probablemente, el origen de estas proteínas precede a la divergencia de las bacterias y eucariotas modernas de hoy en día y se ha postulado que estas proteínas pueden haber estado presentes en el momento del inicio de la evolución de una célula única, hace más de 3.5 miles de millones de años. Hemos seleccionado dos proteínas para transformarlas en plantas como ejemplos, como se muestra en la figura 4 mencionada en lo anterior, estas proteínas son divergentes en mayor manera entre sí que de muchas de sus contrapartes eucarioticas. Esperamos que la expresión ectópica de estas proteínas pueda mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos los cuales pueden incluir pero no se limitan al crecimiento, vigor, rendimiento y salud de las plantas bajo una diversidad de condiciones estresantes que pueden incluir, frío, sequía, estrés a concentración de sal, calor, supervivencia después de choque en frío, infección micótica, infección viral, infección microbiana y germinación en frío. Otra posible explicación para la velocidad aumentada de crecimiento de las plantas bajo estrés puede ser la dilucidación de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) proporcionada por la expresión de las CSP. En este modelo, una planta puede desarrollar una respuesta PAMP que puede inducir una respuesta vegetal muy similar a la resistencia sistémica adquirida (SAR) (de una manera muy similar a como funciona SAR para estreses bióticos) de manera tal que la planta puede estar "preparada" para los estreses antes de su aplicación. Para que este modelo funcione la planta debe ser señalizada de manera que este presente la CSP, este mecanismo recientemente puede haber sido proporcionada a través de un receptor vegetal que se une a las CSP (Félix, et al, Journal of Biological Chemistry 278(8):6201-8 (2003)). Este mecanismo puede significar que cualquier gen que se una a un receptor el cual induzca una respuesta de tipo PAMP puede funcionar en la invención. La dilucidación de respuesta de tipo PAMP generalmente es estudiado para estreses bióticos y con frecuencia se ha inducido a través de la administración exógena de agentes. En la presente buscamos inducir la respuesta tipo PAMP a las CSP producidas a partir del transgen para la CSP. El transgen transformado en una célula vegetal como parte de una construcción de ADN recombinante, a través de una pistola de partículas o transformación mediada por Agrobacterium. A su vez esto puede generar una respuesta de tipo de resistencia adquirida sistémica en la planta lo que a su vez incrementa la resistencia al estrés abiótico. Esta respuesta puede funcionar tanto en monocotiledóneas como en cotiledóneas que incluyen, pero que no se limitan a maíz, soya, arroz, Arabidopsis, ajonjolí y algodón. Si el método PAMP anterior es el modo de acción de las CSP, entonces se puede esperar que la CSP proporcione protección al estrés biótico así como protección al estrés abiótico. Ninguno de estos mecanismos significa que sea limitante y uno o ambos, o muchos otros, pueden estar involucrados en el fenotipo manifestado. Se ha supuesto que MF2, una proteína similar a Csp de Bacillus thuringensis proporciona cierta protección contra la infección viral en una planta. La patente de Estados Unidos, 6,528,480 muestra esta tolerancia a estrés biótico al frotar las hojas de la planta con un extracto que contiene la proteína y que infecta la planta con un virus. Contemplan, pero no crean, plantas transgénicas en la misma. El término "planta no transformada de la misma especie" significa la inclusión de todas las plantas de la misma especie como una planta transformada. En una modalidad, las plantas transformadas son de la misma especie y cepa que la planta transformada. En otra modalidad, la planta es tan idéntica como se pueda a la planta transformada.

El "dominio de choque frío" (CSD) es una secuencia proteínica que es homologa a la proteína de choque frío. Para los propósitos de esta invención, una proteína que contiene dominio de choque frío es una "proteína de choque frío" con más de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 98% de identidad de aminoácidos que se observa entre Csp A de E. coli o CspB de B. subtilís y los dominios de choque frío de las proteínas que contienen el dominio de choque frío (Wistow, Nature 344:823 (1990); Yamanaka, et al., Mol. Micro., 27:247, específicamente véase la figura 1 B en la referencia Yamanaka; Graumann, et al. TIBS 23:286). Como se utiliza en la presente, "levadura" se refiere regularmente a Saccharomyces cerevissiae pero también puede incluir Schizosacchoramyces pombe y otras variedades (por ejemplo del género Pichia). El término "maíz" se refiere a Zea mays y todas las especies y variedades que pueden ser producidas con la misma. "Trigo" se refiere a todas las variedades de Triticum aestivum que incluyen pero que no se limitan a las variedades de trigo de primavera, de verano y todas las variedades de trigo facultativas. "Trigo" incluye cualquier otra especie de trigo que incluye, pero que no se limita a trigo durum (Triticum durum), espelta {Triticum spelta), escandía {Triticum dicoccum) y trigo silvestre {Triticum monococcum). "Trigo" también incluye cualquier especie que pueda ser producida con cualquiera de las especies de trigo mencionadas antes y la descendencia de dichas cruzas (que incluye tritical, un híbrido de trigo y cebada). "Soya" se refiere a Glycine max o Glycine soja y cualquier especie o variedad que pueda ser producida con las mismas. "Arroz" se refiere a Oryza sativa y cualquier especie o variedad que pueda ser producida con la misma. "Cebada" se refiere a Hordeum vulgare y cualquier especie o variedad que pueda ser producida con la misma. "Avena" se refiere a Avena sativa y cualquier especie o variedad que pueda ser producida con la misma. "Colza" es un nombre acuñado recientemente que se le proporciona a las semillas, aceite y harina producida por plantas de rape modificadas genéticamente, semillas oleaginosas de rape (Brassica napus L.) y rape turnip (B. campestrís L), en la presente, colza incluye todas las plantas de rape y organismos que puedan ser producidoscon las mismas. E. coli y Escherichia coli, como se utilizan en la presente, incluye organismos de la especie Escherichia coli y todas las cepas de este organismo; es decir, E. coli, K12, E. coli y Escherichia coli, como se utilizan en la presente, también incluye cualquier organismo que pueda conjugarse con cualquier cepa de E. coli, en donde una es una cepa F+ o Hfr y la otra no. B. subtilis y Bacillus subtilis se refieren a todo organismo de género Bacillus especie subtilis. Agrobacterium tumefaciens como se utiliza en la presente, se refiere a todas las cepas y tipos de esta especie. "Césped" incluye todas las especies y cepas de pasto plantado o que pueda ser plantado para producir un césped, que incluyen pero que no se limitan a un prado, un campo para jugar un juego (por ejemplo fútbol, béisbol o fútbol soccer) y todas las áreas de un campo de golf (es decir, el punto de partida, la pista, el césped que rodea al hoyo, la maleza, etc.). "Algodón" se refiere a todas las plantas del género Gossypium y todas las plantas que puedan ser producidas con la misma. "Tolerancia al calor" en la presente significa una medida de la capacidad de las plantas para crecer bajo condiciones en donde el calor, o una temperatura más cálida pueden perjudicar el crecimiento, vigor, rendimiento, tamaño de la planta de la misma especie. Las plantas tolerantes al calor crecen mejor bajo condiciones de estrés de calor en comparación con las plantas no tolerantes al calor de la misma especie. "Tolerancia a sal" se refiere a la capacidad de algunas plantas para crecer bajo estrés osmótico, o estrés causado por sales o iones en el agua y suelo. Por ejemplo, una planta con una velocidad de crecimiento aumentada, en comparación con una planta de la misma especie y/o variedad, cuando se mojan con un líquido o se plantan con un medio que contiene una mezcla de agua y iones que perjudican el crecimiento de otra planta de la misma especie se puede decir que es tolerante a sal. Algunas plantas transformadas tienen una mayor tolerancia para estos tipos de condiciones en comparación con las plantas no transformadas de la misma especie y cepa. Todos los números utilizados en la presente deben considerarse modificados por el término "aproximadamente", el término aproximadamente significa que el número puede variar en cualquier dirección, hasta un 10% y aún así retiene el mismo significado. Por ejemplo, una solución 1 M puede incluir todas las soluciones de este tipo menores que, e incluyendo a .1 M y mayores de 0.9 M. Por ejemplo, un porcentaje también puede ser modificado, 10% es incluyente de todos los porcentajes desde 9% a 11 %. Los términos definidos por el adjetivo "exactamente" no están definidos por el término "aproximadamente". Una "proteína con alta concentración de glicina" se define como una proteína en una eucariota que es o que tiene identidad sustancial con, o que es homologa de una proteína que contiene un dominio de choque frío. "Supervivencia después de choque frío" se define como la capacidad de una planta para continuar creciendo por un período de tiempo significativo después de que se coloca a una temperatura por debajo de la que normalmente se encuentra para la planta de esa especie en la etapa de crecimiento. Debe hacerse notar que algunas plantas, incluso aquellas de la misma especie, se han seleccionado para crecimiento bajo condiciones frías. La cepa Wigor endogámica de maíz puede tolerar condiciones frías y tiene una tasa de supervivencia significativamente superior cuando se coloca en aquellas condiciones en donde la mayor parte de las líneas comerciales en Estados Unidos. Wigor se vende comercialmente en Polonia. De esta manera, la tolerancia al frío para las plantas transgénicas se debe comparar dentro de plantas de la misma especie a la misma edad relativa, así como plantas de las mismas especies, para obtener datos científicos con significado. Las plantas pueden ser clasificadas inmediatamente o uno o varios días o una o varias semanas después para determinar su viabilidad, velocidad de crecimiento y otros fenotipos después del choque.

"Sequía" o "agua que está limitada para el crecimiento" se define como un período de sequedad, especialmente cuando es prolongado, que provoca daño en las cosechas o que impide su crecimiento exitoso. Nuevamente, diferentes plantas de la misma especie y aquellas de cepas diferentes de la misma especie pueden tener una tolerancia diferente a la sequía, sequedad y/o carencia de agua. En el laboratorio, la sequía puede ser simulada al proporcionar a las plantas 95% o menos agua que una planta control y al observar las diferencias en vigor, crecimiento, tamaño, longitud de raíces y muchas otras medidas fisiológicas y físicas. La sequía también se puede simular en el campo al irrigar algunas plantas, pero no otras, y comparar su velocidad de crecimiento, especialmente cuando el agua está limitada notablamente para el crecimiento de dicha planta. La tolerancia al estrés abiótico incluye, pero no se limita a un rendimiento aumentado, crecimiento, biomasa, salud y otras medidas que indican la tolerancia a un estrés el cual incluye pero no se limita a estrés al calor, estrés a la sal, estrés al frío (que incluye estrés al frío durante la germinación), estrés al agua (que incluye pero que no se limita al estrés a la sequía), estrés al nitrógeno (que incluye nitrógeno en alta concentración y baja concentración). La tolerancia al estrés biótico incluye, pero no se limita a un rendimiento aumentado, crecimiento, biomasa, salud u otras medidas que indiquen tolerancia a un estrés el cual incluye, pero no se limita a infección micótica, infección bacteriana e infección viral de una planta.

Algunas de las secuencias de genes descritas como parte de la invención son de origen bacteriano, por ejemplo, ciertas proteínas de choque frío procarioticas. Se conoce por aquellos expertos en la técnica que los genes bacterianos no modificados algunas veces se expresan en células de plantas transgénicas. El uso de codón vegetal recuerda más estrechamente al de los humanos y de otros organismos superiores en comparación a los organismos unicelulares, tales como bacterias. Varios informes han descrito métodos para mejorar la expresión de genes recombinantes en plantas. Estos informes describen diversos métodos para la alteración de las secuencias codificantes para que representen secuencias las cuales son traducidas más eficazmente en base en las tablas de frecuencia de codón de plantas, mejorías en la desviación de posición de la tercera base de codón utilizando secuencias recombinantes las cuales evitan la poliadenilación sospechosa o dominios ricos en A/T o secuencias de consenso de empalme de intrón. Aunque estos métodos para la construcción de genes sintéticos son notables, los inventores han considerado crear genes sintéticos para proteínas de choque frío o proteínas que contienen dominios de choque frío de acuerdo con el método de Brown et al. (patente de E.U.A. No. 5,689,052, 1997, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia) y/o por lo mencionado antes, así como otros métodos. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para preparar genes sintéticos vegetales que se expresan in planta un producto de proteína deseado. Brevemente, de acuerdo con Brown et al., la frecuencia de codones de monocotiledóneas raros o semi-raros en una secuencia polinucleotídica que codifica para una proteína deseada se reducen y sustituyen con codones de monocotiledóneas más preferidos. La acumulación mejorada de un polipéptido deseado codificado por una secuencia polinucleotídica modificada en una planta monocotiledónea es el resultado de incrementar la frecuencia de codones preferidos al analizar la secuencia codificante en seis fragmentos nucleotídicos sucesivos y alterar la secuencia en base en la frecuencia de aparición de los hexámeros respecto a la frecuencia de aparición de los hexámeros 284, 484 y 664 más raros en plantas monocotiledóneas. Además, Brown et al describen la expresión mejorada de un gen recombinante al aplicar el método de reducir la frecuencia de codones raros con métodos para reducir la presentación de señales de poliadenilación y sitios de empalme de intrón en la secuencia nucleotídica, eliminar secuencias autocomplementanas en la secuencia nucleotídica y sustituir dichas secuencias con nucleótidos no autocomplementarios y al mismo tiempo mantener un gen estructural que codifique para el polipéptido y reducir la frecuencia de presentación de los pares dinucleótidos 5'-CG-3' en la secuencia nucleotídica. Estas etapas se realizan secuencialmente y tienen un efecto acumulativo que resulta en una secuencia nucleotídica que contiene una utilización preferencia de los codones de monocotiledóneas más preferidos para plantas monocotiledóneas para la mayor parte de los aminoácidos presentes en el polipéptido deseado. Específicamente, todas las proteínas mencionadas en la presente se contempla que están elaboradas en genes sintéticos como se discute en lo anterior, o utilizando métodos similares que incluyen, pero que no se limitan a CspA de Eschiríchia coli y CspB de Bacillus subtilis. El trabajo desarrollado en este documento ha identificado métodos para potencial la expresión in planta de proteínas de choque frío y proteínas que contienen dominios de choque frío, las cuales pueden conferir resistencia a muchos estreses de planta, los cuales pueden incluir pero no se limitan a frío, calor, sequía, sal y otros estreses o, fenotipos relacionados con estrés (germinación fría, supervivencia después de estrés frío y otros estreses abióticos) cuando se expresan ectópicamente después de la incorporación en un genoma nuclear, plástido o cloroplasto de plantas susceptibles. La patente de E.U. 5,500,365 (incorporada específicamente en la presente como referencia) describe un método para sintetizar genes vegetales para optimizar el nivel de expresión de la proteína para la cual codifica el gen sintetizado. Este método se relaciona con la modificación de las secuencias del gen estructural del transgen exógeno, para volverlo más "similar a planta" y por lo tanto para que con mayor probabilidad sea traducido y expresado en la planta, monocotiledónea o dicotiledónea. No obstante, el método como se describe en la patente de E.U. 5,689,052 proporciona expresión aumentada de transgenes, preferiblemente en plantas monocotiledóneas. Al desarrollar las construcciones de ácido nucleico de esta invención, los diferentes componentes de las construcciones o fragmentos de las mismas normalmente se insertan en un vector de clonación conveniente, por ejemplo un plásmido que es capaz de replicación en un hospedador bacteriano, por ejemplo, E. coli. Existen numerosos vectores que se han descrito en la literatura, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Después de cada clonación, el vector de clonación con el inserto deseado se puede aislar y someter a manipulación adicional, tal como digestión por restricción, inserción de fragmentos nuevos o nucleótidos, ligación, supresión, mutación, resección, etc., de manera que se adapten los componentes de la secuencia deseada. Una vez que se ha completado la construcción, posteriormente se puede transferir a un vector apropiado para manipulación adicional de acuerdo con la manera de transformación de la célula hospedadora. Una molécula de ADN de cadena doble de la presente invención contiene, por ejemplo, una proteína de choque frío en un cassette de expresión que se puede insertar en el genoma de una planta por cualquier método adecuado. Los vectores de transformación vegetal adecuados incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como aquellos descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella et al. (1983), Bevan (1984), Klee et al. ( 985) y la publicación EPO 120,516. Además de los vectores de transformación vegetales derivados de Ti o plásmidos inductores de raíz (Ri) de Agrobacterium, se pueden utilizar métodos alternativos para insertar las construcciones de ADN de esta invención en células vegetales. Tales métodos pueden involucrar, pero no se limitan, por ejemplo, al uso de liposomas, electroporación, sustancias químicas que incrementan la captación de ADN, suministro de ADN libre vía bombardeo con microproyectiles y transformación utilizando virus o polen. Un vector de expresión de plásmido adecuado para la introducción de un gen que codifica para una proteína de choque frío, o una proteína que contiene un dominio de choque frío en monocotiledóneas utilizando electroporacion puede estar constituido de lo siguiente: un promotor que funcione en plantas; un intrón que proporciona un sitio de empalme para facilitar la expresión del gen, tal como el intrón Hsp70 (Publicación PCT W093/19189); y una secuencia de poliadenilación 3' tal como la secuencia 3' de nopalina sintasa (NOS 3'). Este cassette de expresión se puede ensamblar en replicones con una alta cantidad de copias adecuado para la producción de grandes cantidades de ADN. Un ejemplo de un vector de cassette de plásmido Ti útil para transformación de plantas es pMON-17227. Este vector se describe en la publicación PCT WO 92/04449 y contiene un gen que codifica para una enzima que confiere resistencia a glifosfato (denominada CP4), la cual es un excelente gen marcador de selección para muchas plantas. El gen se fusiona al péptido de tránsito de cloroplastos (CTP2) de EPSPS de Arabidopsis y se expresa a partir del promotor FMV como se describe en la presente. Cuando se obtienen números adecuados de células (o protoplastos) que contienen el gen para sedoheptulosa-1 ,7-bisfosfatasa o ADNc, las células (o protoplastos), se regeneran en plantas completas. La selección de la metodología para la etapa de regeneración no es crítica, y están disponibles protocolos adecuados para hospedadores de Leguminosae (alfalfa, soya, trébol, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, parsnip), Cruciferae (calabaza, rábano, colza/rape, etc.), Cucurbitaceae (melones y pepinos), Gramineae (trigo, cebada, arroz, maíz, etc.), Solanaceae (papa, tabaco, tomate, pimientas), diversas cosechas florales tales como girasol y árboles con nueces tales como almendras, anacardos, nogales y pecanas. Las plantas que se pueden elaborar para que expresen proteínas de choque frío mediante la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a Acacia, alfalfa, aneth, albaricoque, alcachofa, arugula, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, bretones, calabaza, colza, melón de castilla, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, cilantro, sidra, clementines, café, maíz, algodón, pepino, pino oregón, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabacín, uva, toronja, ligamaza, jicama, klwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino del incienso, mango, melón, hongos, nuez, avena, quimbombó, cebolla, naranja y plantas de ornato, papaya, perejil, chícharo, durazno, cacahuate, pera, pimiento, placaminero, piña, plátano, ciruela, granada, álamo, papa, calabaza, membrillo, radiata pine, radicchio, rábano, frambuesa, arroz, cebada, sorgo, pino meridional, soya, espinaca, chayóte, fresa, remolacha de azúcar, caña de azúcar, girasol, camote, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, césped, viña, sandía, trigo, ñame, zapallito italiano o cualquier otra planta. El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN que se une a una ARN polimerasa (y con frecuencia a otros factores de transcripción) y que promueve la transcripción de una secuencia de ADN hacia el extremo 5'. Los promotores con frecuencia proporcionan expresión mejorada o reducida en algunos tejidos cuando se comparan con otros. La selección de promotor, específicamente selección de promotores que incrementan la selección cuando una planta está experimentando estrés abiótico, pueden ser particularmente útiles en la presente invención. Se ha observado en la técnica que algunas respuestas al estrés tienen efectos similares sobre la planta y la resistencia a uno puede proporcionar resistencia a otro. Esto se puede ver, por ejemplo en tres respuestas a la deshidratación y baja temperatura (Shinozaki, et al., Current Opinions in Plant Biology 3(3):217, 2000). Muchos otros documentos muestran la relación general entre diferentes estreses abióticos y pueden indicar que la tolerancia a un estrés puede generar una tolerancia mayor a otros estreses abióticos diferentes (Pernas, et al., FEBS Lett 467 (2-3):206, 2000; Knight, Innt Rev Cytol 195:269, 2000; Didierjean, et al., Planta 199: 1 , 1996; Jeong, et al., Mol Cells 12:185, 2001 ). Los cassettes de expresión y los elementos reguladores encontrados en el segmento de ADN fuera de los elementos de expresión vegetal contenidos en el T-ADN son comunes en muchas estructuras principales de ADN plasmídico y funcionan como elementos de mantenimiento del plásmido, estos incluyen, pero no se limitan al gen aad (Spc/Str) para resistencia bacteriana a espectinomicina/estreptomicina, el pBR322 ori (ori'322) que proporciona origen de replicación para el mantenimiento en £ coli, el sitio bom para la transferencia conjugacional en las células de Agrobacterium tumefaciens y un vector de ADN que es de 0.75 kb o oriV que contiene el origen de replicación del plásmido RK2. Además, aquellos plásmidos diseñados para transformación en plantas con frecuencia contienen los elementos necesarios para las proteínas de integración de ADN endógeno de Agrobacterium para que funcionen para insertar el elemento. Estos incluyen límites (límite derecho (RB) e izquierdo (LB)). Los procedimientos de laboratorio en tecnología de ADN recombinate utilizados en la presente son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en el arte. Las técnicas estándar se utilizan para clonación, aislamiento de ADN y ARN, amplificación y purificación. Generalmente, las reacciones enzimáticas que involucran ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Estas técnicas y diversas técnicas adicionales generalmente se realizan de acuerdo con Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Todas las publicaciones y documentos de patente publicados mencionados en esta especificación se incorporan en la presente como referencia en la misma medida a si cada publicación individual o solicitud de patente fuera implicada específica e individualmente para ser incorporada como referencia.

Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar modalidades de la invención. Deberá apreciarse por aquellos expertos en el arte que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores para que funcionen bien en la práctica de la invención. No obstante, aquellos con habilidad en el arte, en base en la presente descripción, podrán apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas las cuales se describen y aún así obtener un resultado parecido o similar sin que por esto se aparten del espíritu y alcance de la invención, por lo tanto todo el material establecido o mostrado en los dibujos y ejemplos anexos debe interpretarse como ilustrativo y no en un sentido limitante.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 El plásmido pMON57396 (Figura 1 ) es un vector binario de la transformación mediada por Agrobacteríum y la expresión constitutiva de una proteína (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:56) similar a CspA de Escherichla coli en Arabidopsis. El clon del gen para CspA de E. coli, dos iniciadores específicos de gen, MF1 y MF2, se diseñan en base en la información de secuencia de CspA del National Center for Biotechnology, el cual es parte del National Library of Medicine, a su vez parte del National Institutes of Health (NCBI). La secuencia para F1 es AGGTAATACACCATGGCCGGTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 66), el cual se reasocia en el sitio de inicio traduccional de CspA e introduce un sitio Ncol en el extremo 5' mientras que la secuencia MF2 es TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 67), la cual se reasocia con el último codón de CspA e introduce un sitio EcoRI en el extremo del iniciador. Se lleva a cabo PCR para aislar CspA de E. coli. Específicamente, se lisan células células E. coli, DH5V y se utiliza una cantidad pequeña de lisado como una plantilla para amplificar el gen CspA utilizando a los iniciadores MF1 y MF2, polimerasa Taq y dNTP de Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). Las condiciones de ciclos térmicos son como sigue: 94°C, 1 min, seguido por 30 ciclos de 94°C, 16 segundos; 55°C, 1 minuto y 72°C, 1 minuto. El ADN de CspA purificado se purifica por electroforesis en gel, se digiere con Ncol y EcoRI y se liga a un vector binario pMON23450 (figura 2) que previamente se ha vuelto lineal por digestión con Ncol y EcoRI, La ligación se utiliza usando ligasa T4 y siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, D). La mezcla de ligación se transforma en células £. coli, para propagación del plásmido (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las células transformadas se siembran en placas sobre medio selectivo apropiado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se clasifican horas o días después.

Se preparan plásmidos a partir de colonias individuales y se determina la secuencia de inserto completo. El plásmido resultante también se confirma por mapeado de restricción (por ejemplo, véase Griffiths, et al, An Introduction to Genetics Anaiysis, h Edition pp449-451 , ISBN 0-7167-2604-1 , W.H. Freeman y Col., New York) y secuenciado. Como el sitio de clonación seleccionado Ncol-EcoRI en el vector está flanqueado por un promotor e35S de CaMV hacia el extremo 5' y una etiqueta de epítope (Bandera, la cual codifica para el oligopéptido DYKDDDK (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 68), SIGMA, St Louis) hacia el extremo 3', la CspA de E. coli, en esta construcción de esta manera se etiqueta en la parte C terminal por la etiqueta de epítope Bandera y será impulsada transcripcionalmente por el promotor e35S de CaMV cuando se transforme en Arabldopsis. La clonación anterior resulta en un plásmido que codifica para una proteína similar a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 55. El plásmido resultante se denomina pMON57396.

EJEMPLO 2 El plásmido pMON57397 (figura 2) es un vector binario para la transformación mediada por Agrobacterium y expresión constitutiva de una proteína (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57), al igual que la proteína CspA de Escherichia coli en Arabidopsis. Para crear pMON57397, se digiere el vector binario pMON57396 que contiene el gen para CspA de Escherichia coli (véase ejemplo anterior), etiquetado en la parte C terminal por la etiqueta de epítope Bandera, con las enzimas de restricción Xhol y Salí para separar estos sitios en el vector y liberar la etiqueta de epítopo BANDERA (la etiqueta BANDERA que codifica para el oligopéptido DYKDDDK, SIGMA, St Louis). El plásmido linealizado después se purifica y se vuelve a ligar. La ligación se realiza utilizando ligasa T4 y siguiendo los procedimentos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La mezcla de ligación se transforma en células de E. coli, para propagación de plásmido (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las células transformadas se siembran en placa sobre medio selectivo apropiado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se clasifican horas o días después. Los plásmidos se preparan a partir de colonias individuales y se determina la secuencia de inserto completa. Los resultados anteriores de clonación en la creación de un plásmido codifican para una proteína similar a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 57. El plásmido resultante también se confirma por mapeo de restricción para asegurar que no están los sitios Xhol y Salí (por ejemplo, véase Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6th, Edition pp449-451 , ISBN 0-7167-2604- , W.H. Freeman y Co., New York) y secuenciado. El gen CspA de E. coli, en esta construcción no está etiquetado en la parte C terminal y es impulsado transcripcionalmente por el promotor e35S de CaMV.

EJEMPLO 3 El plásmido pMON57398 (figura 4) es un vector binario para la transformación mediada por Agrobacterium y la expresión constitutiva de una proteína (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 59) similar a CspB de Bacillus subtilis en Arabidopsis. Para clonar el gen CspB de B. subtills, se diseñan dos iniciadores específicos de gen, F3 y MF4a, en base en la información de secuencia CspB (Genbank U58859, gi:1336655) del National Center for Biotechnology Information, el cual es parte de la National Library of Medicine que a su vez es parte del National Institute Health (NCBI). La secuencia para MF3 es AGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 69), la cual se reasocia en el sitio de inicio traduccional de CspB e introduce un sitio Ncol en el extremo 5', mientras que la secuencia de MF4a es TCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 70), la cual se reasocia en el último codón de CspB e introduce un sitio EcoRl en el extremo del iniciador. Se realiza PCR para aislar CspB de B. subtilis. Las células de Bacillus subtilis se obtienen de Carolina Biological Supply (Burlington, NC), las células se lisan y se utiliza una cantidad pequeña de lisado como una plantilla para amplificar el gen CspB utilizando los iniciadores MF3 y MF4a, polimerasa Taq y los dNTP de Roche Molecular Biochemicals. Las condiciones de ciclado térmico son las siguientes: 94°C, 1 min, seguido por 30 ciclos de 94°C, 16 segundos; 55°C, 1 minuto y 72°C, 1 min. El ADN de CspB amplificado se purifica por electroforesis en gel, se digiere con Ncol y EcoRI y se liga a un vector binario pMON23450 (figura 5) que previamente ha sido linealizado por digestión con Ncol y EcoRI. La ligación se realiza utilizando ligasa T4 y siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, D). La mezcla de ligación se transforma en células E. coli, para propagación del plásmido. Las células transformadas se siembran en placa sobre medio selectivo apropiado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se clasifican un día después. Los plásmidos se preparan a partir de colonias individuales y se determina la secuencia de inserto completa. El plásmido resultante también se confirma por mapeado de restricción (por ejemplo, véase Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6th, Edition pp449-451 , ISBN 0-7167-2604-1 , W.H. Freeman y Co., New York) y secuenciado. Como el sitio de clonación Ncol-EcoRI seleccionado en el vector está flanqueado por un promotor e35S de CaMV hacia la parte 5' y una etiqueta de epítopo (Bandera, la cual codifica para el oligopéptido DYKDDDK (SIGMA, St Louis) en el extremo 3', el gen similar a CspB de B. subtilis en esta construcción de esta manera se etiqueta en la parte C terminal por la etiqueta de epítopo Bandera y se impulsará transcripcionalmente por el promotor e35S de CaMV ante transformación en Arabidopsis. Esta clonación resulta en un plásmido con la secuencia que codifica para una proteína similar a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:59 que se inserta en el plásmido.

EJEMPLO 4 El vector pMON57399 (figura 6) es un vector binario para transformación mediada por Agrobacteríum y expresión constitutiva de una proteína (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61) similar a CspB de Bacillus subtilis en Arabidopsis. Para crear pMON57399, se digiere el vector binario pMON57398 que contiene el gen CspB de Bacillus subtilis (véase ejemplo anterior) etiquetado en la parte C terminal por la etiqueta de epítopo BANDERA, con las enzimas de restricción Xhol y Salí para separar estos sitios en el vector y liberar la etiqueta de epítopo BANDERA (La etiqueta BANDERA codifica para el oligopéptido DYKDDDK, SIGMA, St. Louis). El plásmido linealizado después se purifica y se vuelve a ligar. La ligación se realiza utilizando ligasa T4 y siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La mezcla de ligación se transforma en células de E. coli, para propagación de plásmidos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989). Las células transformadas se siembran en placas sobre un medio selectivo apropiado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) y las colonias se clasifican horas o días después. Los plásmidos se preparan a partir de colonias individuales y se determina la secuencia de inserto completa. Esta clonación resulta en un plásmido con una secuencia que codifica para una proteína similar a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 61 que es insertada dentro del plásmido. El plásmido resultante también se confirma por mapeado de restricción para asegurar que están ausentes los sitios Xhol y sal I (por ejemplo, véase Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6th, Edition pp449-451 , ISBN 0-7167-2604-1 , W.H. Freeman y Co., New York) y secuenciado. Dado que el sitio de clonación Ncol-EcoRI seleccionado en el vector está planteado por un promotor e35S de CaMV hacia la parte 5' de la sección N terminal, el gen CspB de ß. subtilis en esta construcción está sin etiquetar en la parte C terminal y es impulsado transcripcionalmente por el promotor e35S de CaMV ante transformación en Arabldopsls. Dichos plásmidos se transforman en Agrobacterium tumefaciens.

EJEMPLO 5 Se transforman las plantas de Arabidopsis por cualquiera de los muchos métodos disponibles. Por ejemplo, las plantas de Arabidopsis se pueden transformar utilizando el método de transformación In planta por infiltración de vacío (véase Bechtold et al., In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltraron of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/life sciences 316: 1194-1 99 (1993). Este ejemplo ilustra la manera en que las plantas de Arabidopsis se pueden transformar.

Material vegetal concentrado y condiciones de crecimiento Se preparan macetas de 6.4 cm (2.5 pulgadas) con un tamiz de sedazo, asegurándose de que la tierra no se aprieta demasiado estrechamente y que el tamiz está en contacto con la superficie de la tierra (esto asegura que las plántulas en germinación serán capaces de crecer a través del sedazo). Se entierran las semillas y se cubren con un domo de germinación. Se vernalizan las semillas durante 3-4 días. Las plantas que crecen bajo condiciones de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 20-22°C y 70% de humedad. Se agrega agua dos veces a la semana y se fertilizan desde la parte inferior con 1/2 X (la mitad de la fuerza recomendada por el fabricante) de fertilizante Peters 20-20-20 (de Hummert International, Earth City, MO). Se agregan micronutrientes (Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements) (de fuerza completa, recomendado por el fabricante) cada semana alternada. Después de aproximadamente 1-2 semanas, se retira el domo y se reducen las macetas a una o dos plantas por maceta. Se pone un broche de lactosa primaria cuando se desarrolla, para alentar la formación de troza más secundaria. En 5-7 días las plantas estarán listas para infiltración.

Preparación de Agrobacterium (Cultivos a pequeña escala y a gran escala): Agrobacterium cepa ABI, se coloca por estrías sobre una placa LB que contiene 100 mg/l de espectinomicina, 100 mg/l de estreptomicina, 25 mg/i de cloramfenicol y 50 mg/l de canamicina (indicada SSCK). Dos días antes de la infiltración, se coloca una asada de Agrobacterium en un tubo que contiene 10 mi de LB/SSCK y se coloca en un agitador a la oscuridad a 28°C para que crezca durante la noche. Al día siguiente, se diluye Agrobacterium 1 :50 en 400 mi de YEP/SSCK y se coloca en un agitador a 28°C para que crezca durante 16-20 horas (nota: hemos encontrado que la velocidad de transformación es significativamente mejor cuando se utiliza LB para el primer crecimiento durante la noche y si se utiliza YEP para el cultivo durante la noche a gran escala).

Infiltración Se cosechan las células de Agrobacterium al verterlas en un frasco de centrífuga de 500 mi y al centrifugar a 3,500 rpm durante 20-25 minutos. Se elimina por decantación el sobrenadante. Se seca el sedimento y después se resuspende en 25 mi de medio de infiltración (sales básales MS 0.5%, vitaminas B-5 de Gamborg 1 %, sacarosa 5%, MES 0.5 g/l, pH 5.7) con bencilaminopurina 0.44 nM (BAP) (10 µ? de un concentrado de 1.0 mg/l en DMSO por litro) y Vac-ln-Stuff (Silwet L-77) 0.02% de Lehle Seeds (Round Rock, TX). Se agregan BAP y Silwet L-77 frescos el día de la infiltración. Se agregan 200 pl de Silwet L-77 y 20 µ? de BAP (concentrado de 0.5 mg/l). Utilizando medio de infiltración como su blanco, se toma la D06oo a una dilución 1 :10 de las suspensiones de Agrobacterium. Se calcula el volumen necesario para 400 mi de suspensión de Agroj acfer/um/medio de infiltración, D06oo = 0.6, para la infiltración al vacío.

Ecuación: volumen final) * (DOgnn final) = Volumen necesario para una D060o final de 0.6. DO600 Se coloca el cultivo resuspendido en un recipiente Rubbermaid dentro de un desecador al vacío. Se invierten las macetas que contienen las plantas para que se infiltren en la solución de manera que la planta completa queda cubierta, incluyendo la roseta, pero no se sumerge demasiado del suelo. Se remojan las plantas con agua durante por lo menos 30 min antes de la infiltración (esto evita el remojado del suelo hacia arriba de la suspensión de Agrobacterium). Se realiza extracción de vacío de -584-686 mmHg (23- 27 pulgadas de Hg) durante 0 min. Se libera rápidamente al vacío. Se drenan brevemente las macetas, se les coloca sobre sus lados en una bandeja revestida con un pañal, se cubre la bandeja con un domo para mantener la humedad y se regresa a la cámara de crecimiento. Al día siguiente se descubren las macetas, se les coloca verticales y se retira el pañal. No se riegan las plantas durante ~5 días. Después de que han transcurrido los 5 días, se permite que las plantas se irriguen y se continúe el crecimiento bajo las mismas condiciones que en lo anterior. (Las hojas que fueron infiltradas pueden degenerarse pero la planta debe sobrevivir hasta que termina la floración).

Cosechado y esterilizado de semillas Se colocan en cono las plantas, individualmente, mediante la utilización de Lehle Aracons (Lehle Seeds, Round Rock, TX) aproximadamente 2 semanas después de la infiltración. Después la totalidad de las semillas se maduran y se establecen (~4 semanas después de la infiltración), se retiran las plantas del agua para secar y reducir las semillas. Aproximadamente 2 semanas después se cosechan semillas al cortar las ramas por debajo del cono. Se limpian las semillas utilizando un tamiz para retener silique y el material de las ramas y permitir que las semillas avancen. Se colocan las semillas en una envoltura o en tubos cónicos de 15 mi. Se transfiere la cantidad deseada de semillas a tubos cónicos de 15 mi antes de la esterilización. Se aflojan las tapas de los recipientes cónicos y se les coloca con su lado en un desecador al vacío en un vaso de precipitados que contienen 400 mi de blanqueador Chlorox (Chlorox Company, Oakland, CA) y 4 mi de ácido clorhídrico. (Se agrega el HCI al cloro en una campana de seguridad). Se extrae el vacío justo para sellar el desecador y se cierra la succión (es decir, de manera que el desecador aún está bajo vacío pero el vacío no es jalado directamente) durante -16 h. Después de la esterilización, la liberación del vacío y la colocación de los tubos que contienen las semillas en una campana estéril (se mantienen las tapas flojas de manera que el gas aún puede ser liberado). Se siembran en placa ("asperjado") la semilla sobre placas de selección que contienen sales básales MS, 4.3 g/l, Gamborg'a B-5 (500 X) 2.0 g/l, sacarosa 10 g/l, MES 0.5 g/l y 8 g/l de Phytagar (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) con 250 mg/l de Carbenicilina, 100 mg/l de Cefotaxima. Los niveles de selección serán con 60 mg/l de canamicina, glifosato 60 µ? o 10 mg/l de Bialaphos. Una cantidad muy pequeña de semillas se siembra en placa por primera vez para verificar si existe contaminación. En caso de que exista contaminación se vuelven a esterilizar las semillas durante ~ 4 horas más y se verifica nuevamente la contaminación. Habituaimente no es necesaria la segunda esterilización, pero algunas veces las semillas albergan un contaminante micótico y se necesitan esterilizaciones repetidas (la duración de la esterilización generalmente es más corta de 16 horas debido a las velocidades de germinación disminuidas significativamente comenzando a las 24 h de duración de esterilización). Se sellan las placas con Parafilm y se colocan en un cuarto frío para vernalizar durante ~ 2-4 días. Después de que las semillas vernalizan, se colocan en Percival con bulbos blancos fríos.

Transferencia al suelo Después de 5-10 días a ~26°C y un ciclo de iluminación 16/8, los transformantes serán visibles como plantas verdes. Después de otros 1 -2 semanas, las plantas tendrán por lo menos un conjunto de hojas verdaderas. Las plantas se transfieren al suelo, se cubren con un domo de germinación y se mueven a una cámara de crecimiento con condiciones de crecimiento normales para Arabidopsis. Se mantienen cubiertas hasta que es evidente un crecimiento nuevo (habitualmente 5-7 días).

EJEMPLO 6 Con el fin de comparar el crecimiento de plantas de Arabidopsis naturales no transgénicas y transgénicas CspA o CspB, se permite el crecimiento del verticilo en cajas de Petri estériles: Las semillas naturales o transgénicas se esterilizan en líquido utilizando el siguiente método: Incubación durante 5 minutos en etanol 70% seguido por mezclado en remolino Incubación durante 5 minutos en Chlorox 30% (hipoclorito de sodio 6.15%) + Tritón X-100 0.01 %, seguido por mezclado con remolino 5 lavados consecutivos en agua estéril Las semillas se colocan en placas sobre cajas de Petri de plástico cuadradas de 100 x 15 mm (Becton Dickinson - Falcon # 35 - 112), cada una con 40 mi de medio agar elaborado como sigue: 0.5X de medio Murashige y Skoog con macronutrientes, micronutrientes y vitaminas (Sigma #M5519), ajustado a pH 5.8 con hidróxido de amonio y que contiene Phytagel 1% para soporte sólido (Sigma # P8 69). Se siembran en placas diez semillas de Arabidopsis naturales a través de la mitad de la caja de Petri, separadas de manera uniforme aproximadamente 1 cm del borde. Esto se realiza con un equipo Gilson P-200 Pipetteman utilizando puntas estériles. De manera similar se siembran en placas diez semillas de Arabidopsis transgénicas CspA o CspB en la otra mitad de la caja de Petri, separadas uniformemente. Se etiquetan las placas con una pluma marcadora para indicar cual mitad contiene las semillas transgénicas. Las cajas de Petri se colocan a 4°C durante 3 días en la oscuridad para estratificar y las semillas y después se colocan en un incubador Percival (modelo AR-36L) a 8°C durante 6 semanas a 24 horas de luz constante de 120 microeinstenios/metro cuadrado. Al final de esta incubación, el tamaño de las rosetas CspA y CspB se comparan con la natural y se encuentra que son más grandes. Esto puede ser en la figura 16. Esto se puede ver en la primera, segunda y última placa dibujada cuando se utiliza el ensayo anterior. En la figura 16, la tercera imagen (CspB + Bandera, pMON57399) presenta una placa en donde las plantas se colocan a través de un ensayo de choque frío similar al descrito en lo siguiente.

Determinación de vigor de las plántulas por choque frío de semillas transgénicas de Arabidopsis thaliana: Ensayo en placa horizontal.

Introducción: Este es un procedimiento para determinar la capacidad de las semillas transgénicas de Arabidopsis que han germinado a temperaturas normales en medio de agar en cajas de Petri horizontales para continuar creciendo después de un desplazamiento a enfriamiento. Brevemente, las semillas de plantas control y las semillas de plantas transgénicas de prueba se esterilizan, estratifican y se siembran en placas, en rejillas de 6 x 8 en cualquier mitad de una caja de Petri. Se incuba la placa a temperatura normal en una posición horizontal durante una semana y después se desplaza a una temperatura de enfriamiento durante dos semanas adicionales, manteniendo la posición horizontal de la placa. El área de cubierta de las plántulas se registra por fotografía digital y se cuantifica utilizando software de generación de imágenes. La proporción del área de cubierta total de las plántulas de prueba respecto a las plántulas control se puede utilizar como un parámetro cuantitativo para comparar el potencial de tolerancia al frío de diversos genes de interés en líneas de prueba transgénicas.

Materiales: lo siguiente supone equipo básico normal disponible en un laboratorio de biotecnología estándar (autoclave, báscula, campana de flujo laminar, etc.) Semilla de Arabidopsis: los protocolos aquí se han utilizado con Arabidopsis thaliana cv. Columbia pero también puede ser adecuado para otras especies de Arabidopsis. Cajas de Petri: Falcon #35-1112 (cuadrados de 100 mm x profundidad de 15 mm) Medio: Sigma M5519 = Murashige & Skoog Basal Media Phytagel (Sigma #P-8169) Botellas de vidrio de 1 litro en las cuales se esteriliza medio de agar y de las cuales se vierten placas. Utilizamos botellas de vidrio Corning con tapones de rosca naranjas - Agitadores magnéticos y barras de agitación magnéticas Pipeteador eléctrico utiüzable con pipetas de plástico de 50 mi Caja de luz fluorescente pequeña con una lupa de plástico para sembrado en placas de las semillas - Pipeteador P1000 Gilson (o equivalente) y puntas estériles Pipeteador P200 Gilson (o equivalente) y puntas estériles. Etanol 70%, estéril Blanqueador Chlorox 30% + Tween 20 0.1 % Agua desionizada filtrada estéril - Tubos de microcentrífuga estériles y anaqueles para tubos Cuarto frío a 4°C, caja fría o refrigerador, preferiblemente en la oscuridad Cámara de crecimiento de plantas Percival de 22°C o equivalente con -150 E/m2/seg de fuente de luz - Cámara de crecimiento de plantas Percival de 8°C o equivalente con -150 pE/m2/seg de fuente de luz Cinta Micropore 3M o cinta quirúrgica semipermeable (3M #1530-1 ) Marcador negro (Sharpie) Aspirador de vacío con trampa Balanza Glassine que pese papel (VWR #12578-165) Calculadora Cuaderno Computadora compatible con IBM Software Image-Pro Plus, versión 4. .0.0 Software Microsoft Excel Protocolo: 1- Se toman alícuotas de las semillas para almacenamiento en frascos o envolturas a tubos de microcentrífuga estériles 2- Se etiquetan los tubos con el marcador para retener la identidad de las semillas 3- Se esteriliza la superficie de las semillas en los tubos mediante lavado sucesivo con las siguientes soluciones y tiempos de espera indicados en lo siguiente. Nota, se invierten los tubos durante lavado por lo menos dos veces para asegurar un buen contacto en la superficie de las soluciones sobre las semillas. Las semillas descenderán al fondo del tubo, formando un sedimento suave: a. Etanol 70%, estéril, durante 3 a 5 minutos b. Blanqueador Chlorox 30% + Tween 20 0.1% durante 3 a 5 minutos c. Agua desionizada filtrada estéril, durante 30 segundos d. Repetir el paso c. cuatro veces más y la última vez, dejar -0.5 mi de agua estéril remanente sobre el sedimento de semilla. 1- Colocar tubos de microcentrífuga en la oscuridad a 4°C durante tres días para estratiricar las semillas para una germinación más uniforme cuando se siembran en placa. [De manera alternativa, las semillas se pueden sembrar en placa directamente sobre cajas de Petri con medio agar, se pueden sellar con cinta y la caja de Petri se puede colocar a 4°C en la oscuridad durante tres días antes de ¡a incubación en frío a 8°C - véase abajo]. 2- Elaborar placas al preparar alícuotas de 1 -litro de medio 0.5 X de Murashige y Skoog en botellas de vidrio, ajustar a pH de 5.8 con hidróxido de amonio y después agregar 10 gramos de Phytagel. Utilizar un agitador magnético cuando se ajusta el pH y mezclar el Phytagel uniformemente, después esterilizar en un ambiente líquido (escape lento) durante 45 minutos. 3- Colocar las placas en la campana de flujo laminar utilizando un pipeteador eléctrico con la pipeta estéril de 50 mi para suministrar 40 mi de medio a cada placa, inmediatamente cubrir la placa con la tapa. 4- Permitir que las placas se enfríen en una campana de flujo laminar durante por lo menos 2 horas con el ventilador apagado y almacenar en bolsas de plástico con fecha, a 4°C. 5- Etiquetar las placas y las semillas en la placa: 1- Colocar cinta en los cuatro bordes de la placa con cinta micropore semipermeable, etiquetar con la fecha y colocar las plantas en un incubador Percival ajustado a 22°C y un ciclo de 16 horas de luz diurna a ~100 µ?/m2 seg. Colocar las placas en una posición horizontal únicamente con una capa de espesor e incubar durante 7 días. Fotografiar cada placa con una cámara digital y almacenar los datos en un disco compacto. 2- Transferir las placas a un incubador Percival ajustado a 8°C y un ciclo de iluminación diario de 24 horas a ~100 µ?/m2 seg, colocar las placas en una posición horizontal, únicamente una capa de espesor e incubar hasta por 3 semanas adicionales. Fotografiar cada placa con una cámara digital y almacenar los datos en un disco compacto. 3- Observar las placas cada 2 a 3 días para ver cómo el plasma germinal de prueba está avanzando en comparación con los controles y fotografiar digitalmente en tiempos en que sea representativo del desempeño general de los plasmas germinales. Esto puede requerir menos de 2 semanas (3 semanas como máximo) de incubación a 8°C. Los plasmas germinales que requieran más para crecer muestran una diferencia que necesita ser sembrada en placa a una densidad de semilla menor para evitar un hacinamiento en el momento en que se tomen las fotografías digitales. 4- Medir el área de la cubierta de roseta utilizando una fotografía de cámara digital y el software Image-Pro Plus. Calcular la cubierta de plántula promedio para las poblaciones control y de prueba, eliminar semillas del análisis que nunca hayan germinado. Calcular la proporción entre el área de cubierta de la planta promedio después del desplazamiento de temperatura para las plántulas control y de las plántulas de prueba, la desviación estándar y el error estándar para los conjuntos de plántulas tanto control como de prueba. Determinar si existe una diferencia estadística entre las plántulas de prueba y las plántulas control. Registrar los resultados en un cuaderno. 5- Desechar las placas y las plántulas en recipientes de desecho apropiados para materiales vegetales transgénicos (bandejas grises con bolsas de desperdicio de plástico transparente).

EJEMPLO 7 Los productos de PCR de los genes CspA y CspB se ligan al vector pCR-TOPO 2.1 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los fragmentos Ncol/EcoRI de los derivados de pCR-TOPO 2.1 se subclonan en pMON48421 (figura 7), linealizado por las mismas enzimas de restricción. Los fragmentos Notl de los derivados de p ON48421 que abarcan el promotor 35S, los genes Csp y el terminador e9 se subclonan en pMON42916 (figura 17) en el sitio Notl para crear p ON56609 (figura 8) y p ON56610 (figura 9) los cuales contienen los genes CspA y CspB, respectivamente. Dichos plásmidos se transforman en Agrobacterium tumefaciens por métodos conocidos. Se considera que p ON56609 contiene una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína similar a la de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7. Se considera que pMON56610 contiene una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína similar a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9.

EJEMPLO 8 Preparación de Agrobacterium Se siembra por estrías Agrobacterium EHA105 en una placa LB que contiene 50 mg/l de canamicina y 50 mg/l de higromicina (indicado como LB/KH). Dos días antes del cocultivo, se transfiere una asada de Agrobacterium a un tubo que contiene 10 mi de LB/KH y se incuba en un agitador en la oscuridad a 28°C durante 24 horas. Este cultivo se diluye 1 :100 en 20 mi de LB/KH y se incuba en un agitador en la oscuridad a 28°C durante la noche. Al día siguiente 1 mi de la dilución 1 :2 de este cultivo se toma en una cubeta y se realiza una determinación a ??ß?? con LB/KH como blanco. Se calcula el volumen necesario para 5 mi de suspensión de Agrobacterium con una DO de 1.0 para cocultivo.

Ecuación: volumen final) * (DOgnn final) = Volumen necesario para una D06M> final de 1.0 DO600 Se toma el volumen requerido de cultivo de Agrobacterium en un tubo de centrífuga de 40 mi y se centrífuga a 7000 rpm durante 7 minutos. Se desecha el sobrenadante y se seca el sedimento. Se resuspende el sedimento en 5 mi de medio de cocultivo (sales básales de CC EDIA-MS, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 0.5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 15 mg/l de L-prolina, 2 mg/l de 2,4-D) con 20 mg/l de acetosiringona.

Transformación de embriones de error: Se cosechan los panículos de variedades de arroz que crecieron en invernadero Nipponbare and Taipai 309. Se esterilizan los panículos al sumergirlos en blanqueador comercial 50% durante 10 minutos seguido por enjuague con agua destilada estéril. A los panículos se les suministra un tratamiento con alcohol 70% durante 3 minutos. Después se retira la semilla de los panículos y se descascaran individualmente y se transfieren a un tubo Falcon que contiene una solución Tween 20 0.1 %. Las semillas después se tratan con alcohol 70% en una cámara de flujo de aire laminar. Posteriormente la semilla se enjuaga con agua estéril. Esto es seguido por un tratamiento con blanqueador 50% durante 45 minutos. Las semillas se enjuagan 5 veces en agua destilada estéril. Finalmente a las semillas se les proporciona un tratamiento con cloruro mercúrico 0.1 % durante 5 minutos. Las semillas se lavan nuevamente 8 veces con agua destilada estéril. Se cortan asépticamente los embriones de las semillas estériles en la cámara de flujo laminar y se colocan en un medio de cocultivo sólido (CC MEDIA con 2 g/l de fitagel). Se colocan gotas de 50 µ? de la suspensión de Agrobacterium en una placa de Petri estéril. Se transfieren 0 embriones a cada gota. Se permite la infección durante 15 minutos. Se retira la suspensión de Agrobacterium con una punta de pipeta estéril. Los embriones infectados se transfieren a una placa de CC MEDIA sólido fresco y se mantienen en la oscuridad durante 2 días. Al tercer día, se lavan los embriones con 500 mg/l de cefotaxima. Posteriormente los embriones se secan en papel filtro estéril y se colocan en medio Delay (sales MS Basal, 1 mg/l de clorhidrato de tiamina, 500 mg/l de glutamina, 750 mg/l de cloruro de magnesio, 100 mg/l de hidroiizado de caseína, 20 mg/l de sacarosa, 2 mg/l de 2,4-D, 2.2 mg/l de Pichloram y 250 mg/l de Cefotaxima). Los embriones se mantienen en el medio de retraso en la oscuridad por un período de 7 días. Durante este período se forman callos. Los callos se transfieren al medio de selección (medio Delay con 50 mg/l de higromicina) y se almacenan en la oscuridad durante 10 días. Los callos se subcultiva en un medio de selección fresco después de un período de 10 días. Después de otros 10 días los callos se transfieren a medio de regeneración (sales MS Basal, 30 mg/l de sacarosa, 2 mg/l de Kinetin, 0.2 mg/l de NAA, 250 mg/l de cefotaxima y 25 mg/l de higromicina) y se mantiene en la oscuridad durante 7 días. Los callos después se transfieren a medio de regeneración fresco y se mueven a un fotoperíodo de 16 horas, a 30°C. Los vástagos desarrollados en estos callos se transfieren a un medio para generación de raíces (sales MS Basal de fuerza media, 15 g/l de sacarosa, 250 mg/l de cefotaxima, 25 mg/l de higromicina). Los vástagos con raíces se transfieren a tubos de ensayo que contienen agua y se colocan en una cámara de humedad para endurecimiento.

Se seleccionan las plantas positivas. Esto se puede realizar, por ejemplo, utilizando métodos similares a los descritos en los ejemplos 12-14 y 26-29. Se incluyen métodos de cruza descritos para crear la siguiente generación de plantas transgénicas.

EJEMPLO 9 Respuesta de estrés frío en tres etapas de hoja - plantas transgénicas de arroz CspB y CspA Preparación del material vegetal: Germinación: Se esterilizan las semillas al tratarlas con cloruro mercúrico 0.01% durante 3 minutos y se lavan perfectamente durante 10 minutos en agua milique para eliminar los trazos de cloruro mercúrico. Se permite que las semillas esterilizadas se impregnen por remojado en agua milique durante 3 horas. Las semillas impregnadas se hacen germinar en un papel filtro humedecido y esterilizado, a una temperatura de 30°C y una humedad relativa (RH) de 60% utilizando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.). Establecimiento de las tres etapas de hojas de las plántulas: Se transfieren plántulas germinadas de tres días de edad a cajones de transferencia (52.5 mm (largo) x 26 mm (profundidad) x 5.2 mm (diámetro)) en el invernadero que tiene una intensidad de luz de 800 M/m2/seg a 60% de RH. Las plántulas se hacen crecer hasta la etapa de tres hojas (aproximadamente 12 días) en cajones para transferencia que contienen suelo de tierra negra arenoso rojo. La solución fertilizante se aplica a las plántulas una vez a la semana hasta la finalización de los experimentos (N-75 ppm, P-32 ppm, K-32 ppm, Zn-8 ppm, Mo-2 ppm, Cu-0.04 ppm, B-0.4 ppm y Fe-3.00 ppm).

Análisis de la planta CspB- R2 Protocolo: plántulas de arroz en etapa de tres hojas (12 días de edad) se someten a tensión fría de 10°C durante 4 días en presencia de 00 p /m2/seg de luz y 70% de RH (cámara de crecimiento Percival). Después del tratamiento de estrés, se permite que las plantas se recuperen en el invernadero durante 10 días y al décimo día se registran las observaciones de crecimiento para las plantas que sobrevivieron y se registran las pruebas fotográficas. Cada tratamiento tiene 10 duplicados por línea y son aleatorizados por completo: Resultados: De ocho líneas diferentes probadas para determinar la tolerancia el estrés frío, seis líneas presentaron una tolerancia al frío significativamente mayor en comparación con la línea natural. Las líneas, que incluyen a R2-226-6-9-3, R2-226-29-1-1 , R2-257-20-2-1 , R2-238-1-1-3, R2-230-4-4-2 y R2-257-3-1-3 muestran una elevada tolerancia al frío al presentar un alto crecimiento de recuperación y un porcentaje de reducción menor en el crecimiento (en comparación con controles que no se sometieron a estrés), y en comparación con la línea natural (cuadro - 1, placa - 1). La línea R2-230- 4-42 se comportó extremadamente bien, y presentó 100% de supervivencia y mantuvo un buen crecimiento durante la recuperación (cuadro 1 ).

CUADRO 1 Observaciones de crecimiento de recuperación por tensión en frío en la etapa de tres hojas de líneas transgénicas de CspB R2 (índice: WT = natural) Análisis de planta CspB- R3 Protocolo: Se exponen plántulas en etapa de tres hojas a estrés por frío de 8°C durante 1 día en presencia de 1000 ?/G?2/eß9 de luz. Posteriormente se permite que las plántulas se recuperen a 28°C en el invernadero durante 15 días y al final de la recuperación se registra la altura de la planta. Resultados: Se probaron ocho líneas diferentes para la tolerancia al estrés por frío y la totalidad de las ocho líneas mostró una tolerancia mejorada en comparación con las plantas naturales (no transgénicas). Estos resultados confirman los datos de análisis R2 que muestran una mejoría en la tolerancia al frío (cuadro 2).

CUADRO 2 Observaciones de crecimiento de recuperación ante estrés por frío en la etapa de 3 hojas de líneas transgénicas CspB R3.

Análisis de la planta CspA- R2 Protocolo: Se someten plántulas de arroz en etapa de tres hojas (12 días de edad) a estrés por frío de 10°C durante 3 días en presencia de 1000 ^M/n\zlseg y 70% de RH en una cámara de crecimiento. Después del tratamiento de estrés, se permite las plantas se recuperen en el invernadero durante 15 días y al día décimo quinto se registran las observaciones de crecimiento. Cada valor es el promedio de 12 observaciones y el experimento se lleva a cabo siguiendo un diseño experimental completamente aleatorizado (CRD).

Resultados: De siete líneas transgénicas independientes CspA probadas, seis líneas mostraron una tolerancia mejorada al frío en comparación las naturales. En este experimento se redujo la altura de la planta a cerca de 50% en las plantas control tratadas con frío (WT) en comparación con las plantas no estresadas. Al igual que en las plantas transgénicas con una reducción del gen CspA en la altura de la planta por tratamiento frío el cual varía de 4.5% a 22.50% entre líneas independientes diferentes (excepto una línea en donde la reducción en crecimiento es de 47.09%). Este resultado sugiere que CspA mejora la tolerancia al frío en el arroz (cuadro 3).

CUADRO 3 Observaciones de crecimiento de recuperación después de estrés por frío en etapa de tres hojas de líneas de arroz transgénicas de CspA R2 Líneas Altura de la planta al final de la Porcentaje de recuperación (cm) reducción en la Estresadas No estresadas altura de la planta con respecto a las no estresadas R2-362-3-1-2 28.75 + 3.11 30.08 ± 2.9 4.5 R2-328-2-1-1 29.5 ± 2.92 35.58 ± 3.12 17.08 R2-362-7-1-2 15.83 ± 2.92 29.92 ± 1.73 47.09 R2-365-4-5-3 26.8 ± 3.75 32.08 ± 2.27 18.7 R2-362-6-1-6 27.17 + 2.25 32.00 + 1.76 15.05 R2-362-3-1-10 29.58 ± 3.50 38.17 ± 2.59 22.50 R2-362-7-1-2 24.58 + 3.42 27.25 + 2.01 9.79 WT - Nipponbare 20.58 ± 1.73 37.92 ± 8.59 46.05 Análisis de planta CspA- R3 Experimento I Protocolo: Se exponen plántulas en la etapa de tres hojas a estrés por frío de 10°C durante 3 días en presencia de 1000 µ? de luz. Posteriormente las plántulas se permite que se recuperen a 28°C en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registra la altura de la planta así como el porcentaje de supervivencia de las plántulas (en este experimento se utilizan 8 duplicados de cada línea transgénica y se utilizan 10 duplicados para la natural). Resultados: Las seis líneas transgénicas sometidas a estrés por frío se desempeñaron mejor bajo estrés por frío en comparación con las naturales. Estos resultados confirman además los datos de análisis R2 al mostrar una tolerancia mejorada al frío (cuadro 4).

CUADRO 4 Observaciones de crecimiento de recuperación ante estrés por frío en etapa de tres hojas de líneas de arroz transgénicas CspA R3.

Nota: La altura de la planta se registra únicamente para las plantas que sobrevivieron y sus promedios se proporcionan en lo anterior.

Experimento II Protocolo: Se exponen plántulas en la etapa de tres hojas a estrés por frío de 10°C durante 1 día en presencia de 1000 µ? de luz. Posteriormente las plántulas se permite que se recuperen a 28°C en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registra la altura de la planta así como el porcentaje de supervivencia de las plántulas. Resultados: Las cinco líneas transgénicas sometidas a estrés por frío se desempeñaron mejor bajo estrés por frío en comparación con las naturales. Estos resultados confirman adicionalmente los datos de análisis R2 al mostrar una tolerancia mejorada al frío (cuadro 5).

CUADRO 5 Observaciones de crecimiento de recuperación ante el estrés por frío en la etapa de tres hojas de líneas de arroz transgénicas CspA R3 Respuesta al estrés por calor en la etapa de tres hojas Preparación del material vegetal: Germinación: Se esterilizan semillas al tratarlas con cloruro murcúrico 0.01% durante 3 minutos y se lavan perfectamente (~10 veces en agua desionizada) para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se permite que las semillas esterilizadas se impregnen por remojado en agua milique durante 3 horas. Las semillas impregnadas se hacen germinar en papel filtro humedecido y esterilizado, a 30°C de temperatura y 60% de RH utilizando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.).

Establecimiento de las plántulas en la etapa de tres hojas: Se transfieren plántulas germinadas de tres días de edad a cajones de transferencia (52.5 mm (largo) x 26 mm (profundidad) x 5.2 mm (diámetro)) en el invernadero que tiene una intensidad de luz de 800 pM/m2/seg a 60% de RH. Las plántulas se hacen crecer hasta la etapa de tres hojas (aproximadamente 2 días) en cajones para transferencia que contienen suelo rojo. Se rocía solución fertilizante a las plántulas una vez a la semana hasta la finalización de los experimentos (N-75 ppm, P-32 ppm, K-32 ppm, Zn-8 ppm, Mo-2 ppm, Cu-0.04 ppm, B-0.4 ppm y Fe-3.00 ppm).

Análisis de plantas CspA- R2 Protocolo: Se someten plántulas de arroz en etapa de tres hojas (12 días de edad) a estrés por calor de 50°C durante 3 horas en presencia de 70% de RH. Después del tratamiento de estrés, se permite que las plantas se recuperen en el invernadero durante 15 días y en el día décimo quinto de crecimiento se registran las observaciones. Cada valor es un promedio de 12 observaciones. Resultados: De las siete líneas transgénicas CspA independientes probadas, seis líneas mostraron una tolerancia mejorada al calor en comparación con las naturales. En este experimento, la altura de la planta se reduce en más de 50% en plantas control tratadas con calor (WT) en comparación con plantas no estresadas. Al igual que en las plantas transgénicas con reducción de gen CspA en la altura de la planta al someterlo a tratamiento con calor, el cual varía de 9.5% a 35% entre las diferentes líneas independientes. Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia al calor del arroz (cuadro 6).

CUADRO 6 Observaciones de crecimiento de recuperación ante el estrés por calor de una planta en etapa de tres hojas de las líneas de arroz transgénicas CSPA R2 Análisis de planta CspB- R3 Protocolo: Se exponen plántulas en la etapa de tres hojas a estrés de alta temperatura de 53°C durante 2 horas y posteriormente se permite que las plántulas se recuperen a 28°C en invernadero durante 15 días al final de la recuperación se registra la altura de la planta.

Resultados: De las ocho líneas transgénicas probadas, siete líneas funcionaron mejor bajo la prueba de estrés por calor en comparación con las naturales. Estos resultados sugieren que CspB mejora la tolerancia al calor en el arroz (cuadro 7).

CUADRO 7 Observaciones de crecimiento de recuperación ante estrés por calor en plantas en la etapa de tres hojas de líneas de arroz transgénicas CSPB R3 Análisis de plantas CspA-R3 Experimento I Protocolo: Se exponen plántulas en la etapa de tres hojas estrés de alta temperatura de 53°C durante 3 horas y posteriormente permite que las plántulas se recuperen a 28°C en invernadero durante 30 días al final de la recuperación se registra la altura de la planta. Resultados: Estos resultados confirman los datos del análisis R2 al mostrar una tolerancia mejorada al calor (cuadro 8).

CUADRO 8 Observaciones de crecimiento de recuperación ante el estrés por calor en una planta en etapa de tres hojas de líneas de arroz transgénicas CspA R3 Experimento II Protocolo: Se exponen plántulas en la etapa de tres hojas a estrés de alta temperatura de 50°C durante 1 horas en presencia de 1000 µ? de luz y posteriormente se permite que las plántulas se recuperen a 28°C en el invernadero durante 30 días y al final de la recuperación se registra la altura de la planta.

Resultados: Estos resultados confirman los datos del análisis R2 al mostrar una tolerancia mejorada al calor (cuadro 9).

CUADRO 9 Observaciones de crecimiento de recuperación ante el estrés por calor en plantas en etapa de tres hojas de líneas de arroz transgénicas CspA R3 Respuesta al estrés por agua Preparación del material vegetal: Germinación: Se esterilizan las semillas por tratamiento con cloruro mercúrico 0.01 % durante 3 min y posteriormente lavado profundo durante 10 veces en agua milique para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se permite que las semillas esterilizadas se impregnen por remojado en agua milique durante 3 horas. Las semillas impregnadas se hacen germinar en un papel filtro humedecido y esterilizado, a una temperatura de 30°C y 60% de RH utilizando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.).

Análisis de planta CspB-R2 Protocolo experimental Se transfieren plántulas germinadas (tres días de edad) a dos niveles diferentes de estrés por agua, generado en recipientes de PVC que contienen vermiculita, lo cual se mide en términos de la capacidad de campo (F). FC- 100% es una condición saturada (es decir, 100 g de vermiculita requieren 350 mi de agua) (Sharp et. al., 1988, Plant physiol. 87: 50-57). Las diferentes concentraciones de estrés de agua (es decir, 50% FC y 25%FC) se generan en recipientes de PVC que contienen vermiculita al agregar la cantidad requerida de agua. El estado de agua en los diferentes niveles de estrés se mantiene constantemente, al agregar cada día la cantidad de agua perdida debido a transpiración, durante el experimento. Se permite que las plántulas crezcan durante 15 días en condición de estrés de agua en el invernadero en presencia de 80 M/m2/seg de intensidad de luz y 60% de RH. En el día décimo quinto se registra el crecimiento de la raíz y el vástago y se toman fotografías. Cada tratamiento tiene 10 duplicados por línea y son aleatorizados completamente.

El porcentaje de reducción en el crecimiento se calcula al adoptar la siguiente fórmula.

Crecimiento de raíz / vástagode control absoluto , , , , - crecimiento de raíz I vástagode FC- 25% ?„ ?? % de reducción sobre = X 100 Crecimiento de raíz í vástagode control absoluto el control absoluto Resultados: Se analizan cuatro líneas transgénicas diferentes de CspB para determinar la tolerancia al estrés al agua. Todas las líneas transgénicas CspB probadas mostraron crecimiento significativamente mayor durante el estrés en comparación con las plantas normales. Las líneas transgénicas incluyen a R2-257- 5-1-1 , R2-238-1-1-3, R2-257-3-1-6 y R2-226-6-9-3 y presentaron menos porcentaje de reducción en el crecimiento de raíz y vástagos con respecto al control sin estrés (FC -100%). La reducción en el crecimiento de raíz y vástagos en estas líneas varía entre 11 y 25%. Mientras tanto, las plantas naturales presentan una reducción máxima en el crecimiento, el cual es cercano al 50%. Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia del arroz al estrés por agua (cuadro - 10 y cuadro - 11 ).

CUADRO 10 Comparación del crecimiento de raíz y vástagos al final del estrés por agua de líneas transgénicas cspB y naturales (Indice: WT = natural, R:S = Proporción Raíz a Vástago) CUADRO 11 Comparación del porcentaje de reducción en el crecimiento de raíz y vástagos de líneas transgénicas cspB y naturales Líneas % de reducción % de reducción % de reducción en el crecimiento en el crecimiento en el crecimiento de raíz de vástagos de raíz y vástagos R2-257-15-1-1 11 23.8 20 R2-238-1-1-3 25 31 30 R2-257-3-1-6 6 25.2 21 R2-226-6-9-3 19 30.5 27.5 WT - Taipei 28.4 47.9 42.8 Análisis de planta CspA-R2 a. Preparación de material vegetal: Germinación: Se esterilizan semillas por tratamiento con cloruro mercúrico 0.01 % durante 3 minutos y se lavan perfectamente durante 10 minutos en agua milique para eliminar las trazas de cloruro mercúrico. Se permite que las semillas esterilizadas se impregnen por remojado en agua milique durante 3 horas. Las semillas impregnadas se hacen germinar en un papel filtro humedecido y esterilizado, a una temperatura de 30°C y 60% de RH utilizando un germinador de semillas (Serwell Instruments Inc.). Establecimiento de las tres etapas de hojas de las plántulas: Se transfieren plántulas germinadas de tres días de edad a cajones de transferencia (52.5 mm (largo) x 26 mm (profundidad) x 5.2 mm (diámetro)) en el invernadero que tiene una intensidad de luz de 800 pM/m2/seg y 60% de RH. Las plántulas se hacen crecer hasta la etapa de tres hojas (aproximadamente 2 días) en cajones para transferencia que contienen suelo de tierra negra arenoso rojo. La solución fertilizante se aplica a las plántulas una vez a la semana hasta la finalización de los experimentos (N-75 ppm, P-32 ppm, K-32 ppm, Zn-8 ppm, Mo-2 ppm, Cu-0.04 ppm, B-0.4 ppm y Fe-3.00 ppm). Protocolo: Se someten plántulas de un mes de edad a tensión por agua durante 3 días en presencia de 800 M/m2/seg de luz y 60% de RH en el invernadero. Se impone un estrés de agua por suspensión de irrigación.

Al final de los tres días las plantas comienzan a mostrar el síntoma de marchitamiento. Se elimina el estrés al irrigar las plantas con agua y 24 horas después se registran las observaciones en el porcentaje de plantas que muestran síntomas de marchitamiento. Se mantienen un mínimo de 12 plantas por línea, por tratamiento. Resultados: De 7 líneas transgénicas CspA independientes probadas, seis líneas mostraron una tolerancia mejorada al estrés por agua en comparación con las naturales. Un 66% de las plantas control no se recuperaron del marchitamiento después de la irrigación mientras que en las plantas transgénicas CspA el porcentaje de plantas que muestran síntomas de marchitamiento después de la irrigación varía de 5% a 43% entre diferentes líneas independientes (excepto una línea, en donde el porcentaje de plantas demostró marchitamiento de 85%). Estos resultados sugieren que CspA mejora la tolerancia al estrés por agua en arroz (Cuadro 12).

CUADRO 12 Respuesta al estrés por agua de líneas de arroz transgénicas CspA R2 Líneas Porcentaje de plantas que muestran marchitamiento R2-362-3-1-2 17 R2-238-2-1-1 43 R2-362-7-1-2 85 R2-365-4-5-3 5 R2-362-6-1-6 Nil R2-362-3-1-10 15 R2-362-7-1-2 8 WT - Nipponbare 66 Respuesta al estrés por sal Análisis de planta CspB-R3 Protocolo: Se someten plántulas germinadas (48 h de edad) a estrés por salinidad al transferirlas a macetas de PVC con vermiculita que contiene 200 mM de NaCI y se hacen crecer durante 10 días. Después de 10 días de estrés se permite que las plántulas se recuperen durante 15 días por su transferencia a bandejas frescas de vermiculita que contiene agua. Se registra la observación de crecimiento de la altura de las plantas al final de la recuperación. Este experimento se lleva a cabo en el invernadero siguiendo un diseño completamente aleatorizado (CRD) y se mantienen ocho duplicados por tratamiento. Resultados: Se someten siete líneas transgénicas CspB y plantas naturales que se someten a estrés con NaCI 200 mM. Bajo esta condición 5 líneas transgénicas funcionaron mejor en comparación con las naturales. Estos resultados sugieren que CspB mejora la tolerancia de las plantas de arroz al estrés por sal (Cuadro 13).

CUADRO 13 Observaciones de crecimiento de recuperación de estrés por sal de las líneas de arroz transgénicas CspA R2 Ensayo de estrés por agua R3 Se someten plántulas germinadas (3 días de edad) de cuatro líneas transgénicas independientes (1 ,2,3,4) de cspA y una natural (Nipponbare - Número .5) a estrés por agua al transferirlas a una maceta que contiene vermiculita. Se mantienen tres concentraciones de regímenes de agua, estos son 00% de capacidad de campo (FC - 100 = 3.72 mi de agua/g de vermiculita). 25% de capacidad de campo (FC25 = 0.93 mi de agua/g de vermiculita) 15% de capacidad de campo (FC15 = 0.558 ml/g de vermiculita). Las plántulas se hacen crecer en diferentes regímenes de agua durante 30 días en presencia de 800 pM/m2/seg de intensidad de luz y 60% de RH en el invernadero. El estado de agua en los diferentes niveles de estrés se mantiene constantemente al agregar cada día la cantidad de agua perdida durante la vapotranspiración, a través del experimento. Al final de los 30 días se permite que las plantas se recuperen al agregar agua para llevar el nivel de FC100 y mantenerlo durante 15 días. Durante el experimento se registraron las observaciones de crecimiento tales como altura de la planta (pl. ht.) al final del estrés (ES) y la longitud de la raíz (R), los vástagos y el peso seco al final de la recuperación. Cada tratamiento tiene 0 duplicados por línea y se aleatorizaron completamente.

CUADRO 14 Longitud promedio de la raíz y vástagos (cm) al final de la recuperación Código Líneas FC100_Raíz FC100_ FC25_Raiz FC25_ FC15_Raíz FC15_ de Vástago Vástago Vástago línea 1 R2-362-3-1- 24.5 + 1.9 49.19 + 3.6 17.0 ± 2.6 34.5 ± 2.4 12.5 ± 1.4 31.2 + 1.8 3-4 2 R2-362-6-1- 23.3 + 1.3 45.6 ± 1.5 17.5 ± 1.8 31.5 ± 1.5 17.6 ± 2.3 320 ± 0.7 2-2 3 R2-362-7-1- 24.5 + 1.3 47.6 ± 3.3 17.8 ± 2.0 33.5 ± 1.7 15.9 ± 1.7 31.9 ± 1.7 3-3 4 R2-365-10-1- 24.03 ± 1.5 44.4 + 2.2 13.8 ± 1.3 30.24 ± 1.1 13.9 ± 1.3 28.9 ± 0.9 2-1 5 WT - 23.84 ± 44.8 ± 2.0 12.9 ± 1.8 31.6 ± 1.2 13.9 ± 1.9 31.5 ± 1.2 Nipponbare 1.25 CUADRO 15 Peso seco promedio de vástagos y raíz (cm) al final de la recuperación CUADRO 16 Longitud promedio del vástago (cm) al final del estrés EJEMPLO 10 cspA Construcción de pMON73607 (figura 10) 1. Se corta el vector pMON61322 con Ncol y Apal para abrir la estructura principal y separar el gen CspA. El fragmento de estructura principal se aisla por purificación en gel. 2. El gen de cspA de E. coli se amplifica por PCR a partir del vector pMON56609 (figura 8). Los iniciadores de PCR utilizados dejan el sitio Ncol en el extremo 5' del gen y generan un sitio Swal y un sitio Apal en el extremo 3'. 3. Se liga el fragmento PCR y la estructura principal p ON61322 (figura 1 ). Se transforma en una biblioteca eficientemente células DH5a. Se criban las colonias utilizando Apal y Ncol para identificar clones con insertos. 4. Se secuencia el vector para confirmar fidelidad del gen cspA y otras regiones seleccionadas del plásmido- cspB Construcción de pMON73608 (figura 12) 1. Se corta el vector pMON61322 con Ncol y Apal y se abre la estructura principal y se extrae el gen HVA1. El fragmento de estructura principal se aisla por purificación en gel. 2. El gen cspB de Bacillus subtilis se amplifica por PCR a partir del vector pMON56610. Los iniciadores de PCR utilizados dejan el sitio Ncol en el extremo 5' del gen y generan un sitio Swal y un sitio Apal en el extremo 3'. 3. Se liga el fragmento de PCR y la estructura principal pMON61322. Se transforma en una biblioteca eficientemente en células DH5a. Se criban las colonias utilizando Apal y Ncol para identificar clones con insertos. 4. Se secuencia el vector para confirmar el gen CspB y otras regiones seleccionadas del plásmido.

EJEMPLO 11 Transformación de la planta de maíz Se pueden transformar plantas de maíz por los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, véanse los ejemplos 20-25 en la presente.

EJEMPLO 12 Análisis de plantas transgénicas para número de copias el cual se realizará de la siguiente manera.

Se recolecta tejido de hoja de una hoja joven, tan cerca de la base como se pueda y desde un lado de la hoja. Las muestras se colocan en placas de 96 pozos y se liofilizan durante la noche. Los tejidos se homogeinizan al colocar 3 esferas de metal de 3 mm en cada pozo y agitar utilizando un equipo Mega Grinder a 1200 rpm durante 2 minutos. Se extrae el ADN utilizando amortiguadores estándar que contienen ß-mercaptoetanol. Tris amortiguado a pH 8, EDTA, NaCI y dodeciisulfato de sodio. La extracción se realiza con acetato de potasio seguido por cloroformo y la precipitación se realiza con isopropanol. Después de la centrifugación, lavado con solución de etanol y secado se resuspende el ADN en amortiguador Tris-EDTA antes de análisis posterior. El ADN se digiere con endonucleasas de restricción múltiples y los fragmentos se separan por electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante. El ADN se desnaturaliza por una solución de NaOH. El gel se neutraliza en amortiguador Tris que contiene NaCI y se transfiere a filtros de nylon por acción capilar. Los filtros de nylon se prehibridizan en solución amortiguadora que contiene ADN de esperma de salmón antes de la adición de las sondas apropiadas, ya sea marcadas de manera radioactiva o con DIG. Después de la hibridación, los puntos se lavan y se detectan por exposición a una película de autorradiografía o detección de DIG con conjugados de anticuerpo anti-DIG y sustratos apropiados.

EJEMPLO 13 Se está utilizando el marco de lectura abierto de longitud completa cspA y cspB para la expresión en E. coli utilizando vectores (Novagen, un afiliado de Merck KgaA, Darmstadt, Alemania) que permite la síntesis y purificación de antígeno etiquetado con His. El antígeno purificado se utilizará para generar anticuerpos policlonales utilizando un proveedor comercial, por ejemplo Strategic Biosolutions. Los anticuerpos producidos se utilizarán para probar plantas para expresión de proteínas CSP.

EJEMPLO 14 Avance de línea de maíz transgénico. Se generan transformantes primarios en plasma germinal tal como CORN OF GERMPLASM A, CORN OF GERMPLASM C y CORN OF GERMPLAS D. Los transformantes primarios se autopolinizan y se retrocruzan a plantas no transgénicas del mismo genotipo endogámico. Las semillas de las plantas autopulinizadas se plantan en el campo y se someten a ensayos por medio del ensayo de formación de cigotos Taqman para identificar selecciones homocígotas putativas, selecciones heterocigotas putativas y selecciones negativas. Las selecciones de heterocigotos putativas se cruzan con plantas múltiples de probadores apropiados, por ejemplo CORN OF GERMPLASM B y CORN OF GERMPLASM D. La semilla híbrida se cosecha, se descascara a mano y se acumula por selección. También se pueden utilizar otros métodos de producción, por ejemplo, véase el ejemplo 29 en la presente.

EJEMPL0 15 Las plántulas recibirán un tratamiento que limita el agua disponible a un nivel subóptimo de manera tal que el tratamiento resulte en una respuesta fenotípica mensurable. Por ejemplo, este tratamiento puede adquirir la forma de limitación de la cantidad de agua con respecto al número de días lo que genera una deficiencia progresiva de agua o la forma de una deficiencia agua, al estresar osmóticamente las plántulas hidropónicamente o con tratamiento con sal. Las plantas positivas al transgen se cribarán para determinar una respuesta genotípica mejorada al tratamiento. Las respuestas fenotípicas medidas pueden incluir la velocidad de crecimiento de los vástagos o la acumulación de peso seco durante el tratamiento o posterior a un período de recuperación post-tratamiento, marchitamiento o recuperación de la condición de marchitamiento y velocidades de crecimiento de raíz así como acumulación de peso seco. Aquellas con respuesta mejorada avanzarán a el ensayo de eficacia en el campo. Los cribados requerirán cierta cantidad de plantas positivas al transgen y negativas al transgen las cuales van a crecer en macetas pequeñas en un ambiente controlado tal como una cámara de crecimiento o de invernadero. El número de plantas cribadas se determina por la varianza asociada con tratamientos aplicados y fenotipos medidos.

EJEMPLO 16 Las plantas que crecen en el campo recibirán un tratamiento que limita el agua disponible a un nivel subóptimo de manera tal que el tratamiento resulte en una respuesta fenotípica mensurable. Por ejemplo, este tratamiento puede adquirir la forma de limitación en la cantidad de agua disponible a las plantas con respecto al número de días lo que genera una deficiencia progresiva de agua ya sea durante el desarrollo vegetativo tardío o reproductivo temprano de las plantas. Las plantas positivas a transgen se cribarán para determinar una respuesta fenotípica mejorada para el tratamiento en relación a las plantas nativas transgénicas. Las respuestas fenotípicas medidas pueden incluir la velocidad de crecimiento del vástago durante el tratamiento, marchitamiento de las hojas, rendimiento de grano y componentes de rendimiento de espiga tales como número se semillas y peso de las semillas. Estos eventos con una respuesta mejorada avanzarán a un ensayo de rendimiento del primer año. Los cribados se aplicarán a densidad de plantación típicas en dos lugares de campo de terreno seco con irrigación controlable. El número de plantas cribadas estará determinado por la variación relacionada con los tratamientos aplicados y los fenotipos medidos.

EJEMPL0 17 Varios de los genes descritos serán clonados, transformados en plantas y se establecerá el fenotipo de una manera similar a lo siguiente (ejemplos 17-30). Por ejemplo los nucleótidos y los nucleótidos que codifican para las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4-53.

Construcción del vector de destino Se construye un vector de expresión vegetal GATEWAYMR Destination (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) (pMON65154, figura 13) utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los elementos del vector de expresión se resumen en el cuadro 17. La estructura principal del plásmido pMON54 54 que comprende las funciones de replicación bacteriana y un gen de resistencia a ampicilina expresado en E. coli se derivan del plásmido pSK-. Los elementos de expresión vegetales en pMON64154 están disponibles para aquellos expertos en la técnica y las referencias se proporcionan para cada elemento en el cuadro 17. Todas las referencias en el cuadro 17 respecto a la ubicación se refieren a las coordenadas de pares de bases para cada elemento en el mapa plasmídíco descrito en el figura 13. De manera general, pMON65154 comprende un cassette de expresión marcador seleccionable que comprenden el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor unido operablemente a un gen que codifica para neomicina fosfotransferasa II (npt\\). La región 3' del cassette de expresión marcador seleccionable comprende la región 3' del gen para nopalina sintasá de Agrobacterium tumefaciense (nos) seguido 3' por la región 3' del gen inhibidor II de proteinasa de papa (p/nll). El plásmido pMON65 54 comprende además un cassette de expresión vegetal en el cual se puede insertar un gen de interés utilizando los métodos de clonación GATEWAYMR. El cassette de clonación GATEWAYMR está flanqueado 5' por un promotor de actina 1 de arroz, un exon y un intrón, y está flanqueado 3' por la región 3' del gen para pintt de papa. Utilizando los métodos GATEWAY , el cassette de clonación se sustituye por un gen de interés. El vector pMON65154 y los derivados del mismo que comprenden un gen de interés, son particularmente útiles en métodos de transformación vegetal vía un suministro directo de ADN, tal como bombardeo con microproyectiles. Una persona experta en la técnica puede construir un vector de expresión con características similares utilizando métodos conocidos en el arte. Además, una persona experta en la técnica puede apreciar que otros promotores y regiones 3' pueden ser útiles para la expresión de un gen de interés y se pueden utilizar otros marcadores seleccionares.

CUADRO 17 Elementos del plásmido pMON65154 CASSETTE FUNCION ELEMENTO UBICACION REFERENCIA Gen vegetal Promotor Actina 1 de arroz 1796-2638 Wang ef a/., 1992 de expresión de interés Mejorador Exón 1 de actina 1 2639-3170 Wang eí al., 1992 de arroz, intrón 1 Clonación Recombinación / ÍÍR1 3188-3312 G ATEWAYMRClon ing WATEWAYMR Technology Instruction Manual (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Gen de Gen CmR 3421-4080 GATEWAYMRC!oning resistencia Technology bacteriana a Instruction Manual cloranfenicol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Marcadores Genes ccdA, cccB 4200-4727 GATEWAYMRCloning seleccionabas Technology negativos Instruction Manual bacterianos (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Sitio de attR2 4768-4892 GATEWAYMRCloning recombinación Technology GATEWAYMR Instruction Manual (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Gen vegeta! Región 3' pinll de papa 4907-5846 An ef a/., 1989 de un cassette de expresión de interés Marcador Promotor Virus de mosaico 5895-6218 Patente de E.U. A. seleccionable de coliflor 35S No. 5,352,605 vegetal del gen de cassette de expresión nntll Patento Ho P I i ? región 3' nos 7072-7327 Bevan et ai, 1983 región 3' pinll 7339-8085 Añ er a/., 1989 Mantenimiento Origen de ColE1 858-1267 Oka et ai, 1979 en E. co// replicacion Mantenimiento Origen de £1 8273-3673 Ravetch et ai, en £ coli replicacion 1977 Mentenimiento Resistencia a bla 8909-551 Heffron ef a/., 1979 en £ coli ampicilina Se construye un vector plasmídico separado (pMON72472, figura 14) para uso en métodos mediados por Agrobacterium de transformación de plantas. El plásmido pRG76 comprende el gen de la expresión vegetal de interés, clonación GATEWAYMR y cassettes de expresión marcadores seleccionables vegetales presentes en pMON65154. Además, las secuencias límite de T-ADN izquierda y derecha de Agrobacterium se agregaron al plásmido. La secuencia del límite derecho se localiza 5' respecto al promotor de actina 1 de arroz y la secuencia límite izquierda se localiza 3' respecto a la secuencia pin\\ 3', situada 3' respecto al gen npt\\. Además, la estructura principal de pSK- de pMON65164 se sustituye por una estructura principal plasmídica para facilitar la replicacion del plásmido tanto en E. coli como en Agrobacterium tumefaciens. La estructura principal comprende un origen de intervalo de hospedador amplio or/V de replicacion de ADN funcional en Agrobacterium, la secuencia rop, un origen pBR322 de replicacion de ADN funcional en E. coli y un gen de resistencia a espectinomicina/estreptomicina para selección, para determinar la presencia del plásmido tanto en E. coli como en Agrobacterium.

Los elementos presentes en el vector plasmídico pRG81 se describen en el cuadro 18.

CUADRO 18 Elementos genéticos del vector plasmídico pRG81 CASSETTE FUNCION ELEMENTO UBICACIÓN REFERENCIA Gen vegetal Promotor Actina 1 de arroz 5610-6452 Wang eí a/., 1992 de expresión de interés Mejorador Actina 1 de arroz, 6453-6984 Wang er a/., 1992 exon 1, intrón 1 Clonación Recombinación AUR 7002-7126 GATEWAYMRCloning WATEWAYMR Technology Instruction Manual (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Gen de Gen CmR 7235-7894 GATEWAYMRCloning resistencia Technology bacteriana a Instruction Manual cloranfenicoi (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Marcadores Genes ccdA, ccdB 8014-8541 GATEWAYMRCloning seleccionabas Technology negativos Instruction Manual bacterianos (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Sitio de affR2 8582-8706 GATEWAYMRCloning recombinación Technology GATEWAYMR Instruction Manual (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) Gen vegetal Región 3' pin II de papa 8721-9660 An ef a/., 1989 de un cassette de expresión de interés Marcador Promotor Virus de mosaico 1-324 Patente de E.U.A. seleccionable de coliflor 35S No. 5,352,605 vegetal del gen de cassette de expresión Gen marcador nptll 358-1152 Patente de E.U.A. seleccionable No. 6,174,724 región 3' nos 1178-1433 Bevan et ai, 1983 región 3' pinll 1445-2191 An er a/., 1989 Transformación ADN de Límite izquierdo 2493-2515 Zambryski ef al., mediada por transferencia 1982; GenBank Agrobacterium Accession AJ237588 Mantenimiento Origen de Ori-V 2755-3147 Honda eí a/., 1988 del plásmido replicación en £ co// o Agrobacterium Mantenimiento Origen de ColE1 3545-4199 Oka et ai, 1972 del plásmido replicación en E coli Mantenimiento Resistencia a Soc/Str 4242-5030 Fling eí a/., 1985 del plásmido espectinomiclna/ en £ co/Zo estreptomicina Agrogacterium Transformación ADN de Límite derecho 5514-5538 Zambryski ef al., mediada por transferencia 1982 ; GenBank Agrobacterium Accession AJ237588 EJEMPLO 18 Se amplifican secuencias codificantes por PCR antes de la inserción en un vector de expresión vegetal GATEWAYMR Destination tal como pMON65154 (figura 13). Todas las secuencias codificantes están disponibles ya sea como una secuencia de longitud completa clonada o como una información de secuencia de ADN la cual permite la amplificación de la secuencia deseada a partir de una biblioteca de ADNc. Los iniciadores para amplificación por PCR se diseñan en o cerca de los codones de inicio y de detención de la secuencia codificante, con el fin de eliminar la mayor parte de las regiones 5' y 3' no traducidas. Los productos de PCR se adecúan con secuencia a#B1 y atiB2 con el fin de permitir la clonación por recombinación en los vectores GATEWAY R (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Se utilizan dos métodos para producir secuencias amplificadas por PCR flanqueadas por affB de interés. Ambos métodos se describen con detalle en el manual de instrucciones de GATEWAYMR Cloning Technology (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). En el primer método, un conjunto de iniciador único que comprende a#B y secuencias específicas de plantilla es el que se utiliza. Las secuencias iniciadoras son como siguen: iniciador directo a#B1: 5' GGG CAC ?G? GTA CAA GAA AGC TGG GTN secuencia específica de plantilla 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 71 ) iniciador inverso atíB2 5' GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN secuencia específica de plantilla 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 72) De manera alternativa, se utiliza PCR de adaptador de attB para preparar productos de PCR flanqueados por aííB. El PCR adaptador de a^ utiliza dos conjuntos de iniciadores, es decir, iniciadores específicos para gen y iniciadores para instalar las secuencias at&. Los iniciadores de secuencias de ADN deseados se diseñan, los cuales incluyen 12 pares de bases de las secuencias aflB1 o affB2 en el extremo 5'. Los iniciadores que se utilizan son los siguientes: iniciador directo específico para el gen affB1 5'CCTGCAGGACCATG iniciador específico de gen directo 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 73) iniciador inverso específico de gen aííB2 5'CCTGCAGGCTCGAGCTA iniciador específico de gen inverso 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 74) El segundo conjunto de iniciadores son iniciadores de adaptador de afíB con las siguientes secuencias: iniciador directo de adaptador a#B1 5 ' G G G G AC AAG TTTGT AC AAA A AAG C AG GCTCCTG C AG G ACC ATG3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 75) iniciador inverso de adaptador a#B2 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCT CGAGCTA 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 76) Las secuencias flanqueadas a#B1 y a#B2 se amplifican por PCR de acuerdo con los métodos descritos por Invitrogen Life Technologies (Carisbad, CA). Los productos de PCR flanqueados por atiB se purifican y recuperan de un gen como se describe en lo anterior. En algunos casos, las secuencias flanqueadas por aííB se recuperan de PCR, pero no se pueden insertar en el vector donador utilizando la tecnología GATEWAYMR. Los métodos de clonación convencionales utilizan ligasas y se usan para insertar una secuencia de ADN en un vector de entrada (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) cuando falla la recombinación GATEWAYMR en el vector donador. La selección del vector de entrada depende de la compatibilidad de los sitios de endonucleasa de restricción en el vector de entrada en la secuencia de inserto deseada. El vector de entrada se digiere con una endonucleasa de restricción seleccionada para remover el gen ccc8, se desfosforila y se purifica en gel. La endonucleasa de restricción seleccionada depende del vector de entrada utilizado y la secuencia de la secuencia de inserto deseada. Por ejemplo, se separa el gen ccdB de pENTR11 (figura 15) utilizando EcoR1 u otras combinaciones de endonucleasas de restricción tales como EcoRV y Xmal o Ncol y Xhol. Se pueden utilizar otras endonucleasas de restricción con otros vectores de entrada para uso en el proceso GATEWAYMR. Para utilizar endonucleasa de restricción digerida por vectores de entrada, es necesario ser capaces de producir extremos pegajosos compatibles en el producto PCR deseado. Los extremos pegajosos se pueden producir por numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica tales como digestión con endonucleasa de restricción, ligación de adaptador o adición de sitios de restricción durante PCR. En algunos casos, no es posible producir extremos pegajosos compatibles en un fragmento de PCR y un vector de entrada. De manera alternativa, los extremos pegajosos compatibles pueden producirse dirigidos por digestión con enzimas de restricción de un clon de ADNc. No obstante, es posible volver romos los extremos que ligan los fragmentos de PCR en un vector de entrada. Utilizando este método, el vector de entrada se corta con una endonucleasa de restricción para separar el gen ccdB. Un vector de entrada lineal purificado en gel se vuelve de extremos romos con ADN polimerasa T4. Un experto en la técnica es capaz de encontrar otros métodos para producir moléculas de ADN de extremo romo, tales como el uso de ADN polimerasa klenow. El producto de PCR se vuelve de extremo romo y preferiblemente se desfosforila por incubación con ADN polimerasa T4 u otra polimerasa adecuada, polinucleótido cinasa T4 y una enzima fosfatasa. El vector de entrada y el producto de PCR se vuelve extremo romo y se ligan utilizando métodos conocidos en la técnica. Los productos de ligación se transforman en E. coli y los plásmidos de las colonias individuales se analizan para determinar la presencia del inserto de ADN en la orientación deseada en relación a los sitios atíL en el vector de entrada. Los clones con la secuencia a#L1 cercanos al extremo amino del marco de lectura abierta son los que se seleccionan. Preferiblemente, el método TA de clonación de productos de PCR (Marchuk et al., 1991) es el que se utiliza cuando los productos de PCR flanqueados con at& no pueden insertarse dentro de un plásmido utilizando los métodos GATEWAYMR. El método TA aprovecha la actividad de transferasa terminal de polimerasa Taq. Se corta un vector de entrada con una endonucleasa de restricción y se producen extremos romos utilizando los métodos que se describen en la presente. El vector de entrada lineal de extremo romo se incuba con dTTP y polimerasa Taq lo que resulta en la adición de un residuo timidina único en el extremo 3' de cada cadena de ADN. Dado que la polimerasa Taq tiene una preferencia fuerte por dATP, los productos de PCR se producen con mayor frecuencia con una adenosina única agregada al extremo 3'. Por lo tanto, el vector de entrada y el producto de PCR tienen partes sobresalientes 3' de base única complementarias. Siguiendo la ligación bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, los plásmldos se transforman en E. coli: Los plásmidos se aislan de colonias individuales y se analizan para identificar plásmidos con el inserto deseado en la orientación correcta. De manera alternativa, los productos de PCR, que tienen una cola con sitios aífB se clonan TA en un vector de clonación TA comercial, tal como pGEM-T EASY (Promega Corporation, Madison, Wl). Todos los productos de amplificación de PCR se secuencian antes de la introducción en la planta. Los insertos de PCR en los vectores de expresión de destino producidos por los métodos GATEWAYMR se secuencian para confirmar que se ha insertado y secuenciado de manera codificada la secuencia de aminoácidos que se espera. Sí se producen vectores de entrada utilizando métodos de ligación, la secuencia insertada se secuencia en el vector de entrada antes de la producción del vector de expresión de destino utilizando la tecnología GATEWAYMR . Las mutaciones puntuales no afectan la secuencia de codificación de aminoácidos, es decir, se aceptan mutaciones que no se expresan.

EJEMPLO 19 Construcción de los Vectores de Expresión Se utilizan métodos de clonación GATEWAYMK (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para construir vectores de expresión para uso en la transformación de maíz. Los métodos GATEWAYMR se describen completamente en el manual de instrucción de tecnología de clonación GATEWAYMR (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). El uso del sistema GATEWAYMR facilita la clonación de alto rendimiento de secuencias codificantes en un vector de expresión vegetal. Las secuencias de gen flanqueadas por las secuencias a#B1 y affB2 se producen por PCR como se describe en lo anterior. Dependiendo de cual secuencia de recombinación, a#B1 o a#B2, se coloque 5' y 3' respecto a la secuencia codificante, se producen vectores de expresión directos o antisentido. Un vector de expresión vegetal, pMON65 54 (figura 13) en cual cualquier secuencia codificante se puede insertar en una orientación directa o antisentido, se construye como se describe en el ejemplo 1 y se utiliza en un vector de destino en el proceso de clonación GATEWAY R. Se utilizan dos procedimientos alternativos para insertar una secuencia codificada, amplificada por PCR, en un vector de expresión vegetal. En el primer método, se incuba un producto PCR que comprende la secuencia codificante de interés flanqueada por las secuencias a#B1 y a#B2 en los extremos 5' y 3', con el vector donador (pDONR201MR, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en presencia de clones de entrada BP CLONASEMR GATEWAYMR, que se producen a partir de esta reacción y se transforman en E. coli. El ADN plasmídico se aisla de los clones de entrada. Las secuencias codificantes insertadas se pueden secuenciar a partir de los vectores de entrada con el fin de confirmar la fidelidad de la amplificación por PCR. El ADN plasmídico, aislado de las colonias de E. coli del clon de entrada se incuban con un vector de destino linealizado, preferiblemente pMON65154, en presencia de LR CLONASEM para producir vectores de expresión en plantas que comprenden la secuencia codificante de interés. El ADN de la reacción con LR CLONASEMR se transforma en E. coli. El ADN plasmídico de los vectores de expresión de destino se aisla y se secuencia con el fin de determinar la orientación correcta y la secuencia del vector de expresión en planta. En el segundo método de generación de vectores de expresión de plantas, se incuba un producto de PCR flanqueado por las secuencias a#B1 y atB2 con un vector donador (pDONR201MR, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) y BP CLONASEM , como se describe en lo anterior. Después de la incubación se incuba adicionalmente una alícuota de la mezcla de reacción con un vector de destino linealizado y LR CLONASEMR. El ADN resultante se transforma en E. coli y los vectores de expresión de plantas que contienen la secuencia codificante de interés seleccionado utilizando PCR o técnicas de análisis de transferencia Southern conocidas en el arte. Ambos métodos de producción de vectores de expresión de plantas comprenden una secuencia codificante de interés y se describen en Invitrogen Life Technologies (GATEWAYMR Cloning Technology Instruction Manual). De manera alternativa, se producen vectores de entrada utilizando endonucleasa de restricción y ligasas. Los vectores de entrada están disponibles de Invitrogen Life Technologies (Carisbad, CA). Cada vector de entrada, por ejemplo pENTRIA, pENTR2B, pENTR3C, pENTR4 y pENTR11 , tiene características únicas de clonación y expresión. Se utiliza de manera preferible pENTR 1 en la práctica de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica reconocerán la utilidad de otros vectores de entrada. Antes de utilizar endonucleasas de restricción y ligasas para insertar secuencias deseadas dentro de uno de los vectores de entrada, es necesario digerir por restricción el vector de entrada en cada lado del gen ccdB. Se utilizan numerosas combinaciones diferentes de endonucleasas de restricción dependiendo de los sitios de restricción presentes en la secuencia de ADN que se va a insertar dentro del vector de entrada. Preferiblemente, el vector de entrada se desfosforila y se purifica en gel después de la digestión por restricción. La secuencia de ADN deseada se inserta dentro del vector de entrada utilizando métodos convencionales de biología molecular conocidos por aquellos expertos en la técnica. La clonación TA (Patente de E. U. A. No. 5,827,657) es un método preferible de clonación de fragmentos de PCR en un vector de entrada. Los vectores (denominados como pMON y un número de 5 dígitos) y las secuencias codificantes contenidas en la presente que se producen utilizando los métodos de clonación GATEWAYM son, por ejemplo, las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMEROS: 4-28. Se espera que algunas de las secuencias codificantes de la presente invención pueden ser clonadas en vectores de expresión vegetales utilizando los métodos que se describen en la presente.

EJEMPLO 20 Se hacen crecer en un invernadero plantas CORN OF GERMPLASM A. Se cosechan las espigas de las plantas cuando los embriones son de 1.5 a 2.0 mm de longitud, habitualmente 10 a 15 días después de la polinización y, con mayor frecuencia, 11 a 12 días después de la polinización. Se esterilizan en la superficie las espigas al rociar o remojar las espigas en etanol 80%, seguido por secado al aire. De manera alternativa, se esterilizan en la superficie las espigas por inmersión en CLOROXMR 50% que contiene SDS 10% durante 20 minutos, seguido por tres enjuagados con agua estéril. Se aislan embriones inmaduros de semillas individuales utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los embriones inmaduros se cultivan en medio 2 1 (sales N6, sacarosa 2%, 1 mg/l de 2,4-D, 0.5 mg/l de niacina, 1.0 mg/l de clorhidrato de tiamina, 0.91 g/l L-asparagina, 100 mg/l de mioinositol, 0.5 g/l de MES, 00 mg/l de hidrolisato de caseína, 1.6 g/l de MgCI2, 0.69 g/l de L-prolina, 2 g/l de GELGROMR, pH 5.8) que contiene 16.9 mg/l de AgN03 (medio designado 21 1V) durante 3-6 días, preferiblemente 3-4 días antes del bombardeo con microproyectiles.

EJEMPLO 21 Se conocen métodos de transformación de células de maíz mediada por Agrobacterium y otras monocotiledonias (Hiei et al., 1997; Patentes de E. U. A. No. 5,591 ,616; Patentes de E. U. A. No. 5,981 ,840; solicitud de patente EP publicada EP 0 672 752). Aunque se pueden utilizar diversas cepas de Agrobacterium (véase las referencias anteriores), se utiliza preferiblemente en la presente invención la cepa ABI. La cepa ABI de Agrobacterium se deriva de la cepa A208, una cepa de tipo nopalina C58 de la cual se elimina el plásmido Ti por cultivo a 37°C y que contiene adicionalmente el plásmido modificado por Ti, pMP90RK (Koncz and Schell, 1986). Preferiblemente se utiliza un sistema de vector binario de Agrobacterium tumefaciens (An et al., 1998) para transformar maíz. De manera alternativa, la cointegración de vectores plasmídicos Ti se ha descrito (Rogers et al., 1988) y se puede utilizar para transformar maíz. Un vector binario que comprende uno o más genes de interés se puede introducir en una cepa de Agrobacterium desarmada utilizando electroporación (Wen-jun and Forde, 1989) o coincidencia triparental (Ditta et al., 1980). Un vector binario puede contener un gen marcador seleccionable, un gen marcador susceptible de ser cribado y/o uno o más genes que confieren un rasgo fenoíípico deseable en la planta transformada. Un vector binario ejemplar, pMON301 3 se muestra en la figura 4. Se pueden utilizar otros vectores binarios y se conocen por aquellos expertos en la técnica. Antes del cocultivo de células de maíz, las células de Agrobacterium se pueden hacer crecer a 28°C en medio líquido LB (DIFCO) que comprende antibióticos apropiados para seleccionar, para mantenimiento del plásmido Ti modificado por vector binario. Por ejemplo, se puede hacer crecer ABI/pMON30 3 en medio LB que contiene 50 µg/ml de canamicina para selección, para mantenimiento del plásmido Ti modificado con pMP90RK y 100 µg/ml de espectinomicina para selección para mantenimiento del vector binario pMON30113. Sería obvio para una persona experta en la técnica utilizar agentes de selección apropiados para mantener los plásmidos en la cepa de Agrobacterium hospedadora. Antes de inoculación de células de maíz, las células de Agrobacterium se hacen crecer durante la noche a temperatura ambiente en medio AB ( Chilton et al., 1974) que comprenden los antibióticos apropiados para el mantenimiento del plásmido y acetosiringona 200 µ?. Inmediatamente antes de la inoculación de las células de maíz, el Agrobacterium preferiblemente se sedimenta por centrifugación, se lava con 0.5 de medio MSVI (2.2 g/l de sales MS GIBCO (Carlsbad, CA), 2 mg/l de glicina, 0.5 g/i de niacina, 0.5 g/l de clorhidrato de L-piridoxina, 0.1 mg/l de tiamina, 115 g/l de L-prolina, 10 g/l de D-glucosa y 10 g/l de sacarosa, pH 5.4) que contiene acetosiringona 200 µ? y se resuspende de 0.1 a 1.0 x 109 células/ml en 0.5 de medio MSPL (2.2 g/l de sales MS GIBCO (Carlsbad, CA), 2 mg/l de glicina, 0.5 g/l de niacina, 0.5 g/l de clorhidrato de L-piridoxina, 0.1 mg/l de tiamina, 1 15 g/l de L-prolina, 26 g/l de D-glucosa, 68.5 g/l de sacarosa, pH 5.4) que contiene acetosiringona 200 µ?. Una persona experta en la técnica puede sustituir otro medio por 0.5 MSVI o 0.5 MSPL. Los embriones inmaduros de maíz se aislan como se describe previamente. Los embriones se inoculan con Agrobacterium 0-7 días después del corte, preferiblemente, inmediatamente después del corte. De manera alternativa, los embriones inmaduros se pueden cultivar durante más de 7 días. Por ejemplo, se pueden iniciar callos embriogénicos como se describe en lo anterior y se pueden cocultivar con Agrobacterium. Preferiblemente, los embriones de maíz inmaduros se cortan, se sumergen en una suspensión de Agrobacterium en medio 0.5 MSPL como se describe en lo anterior y se incuban a temperatura ambiente con Agrobacterium durante 5-20 minutos. Después de la inoculación los embriones se transfieren a medio MS de fuerza media (Murashige and Skoog, 1962) que contienen 3.0 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1% de D-glucosa, 2% de sacarosa, 0.115 g/l de L-prolina, 0.5 mg/l de clorhidrato de tiamina, acetosiringona 200 µ?, y nitrato de plata 20 µ? o tíosulfato de plata. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium durante 1 a 3 días a 23°C en la oscuridad. Una persona experta en la técnica puede sustituir otro medio por el medio descrito. Los embriones cocultivados se transfieren al medio 15AA (462 mg/l de (NH4)S04, 400 mg/l de KH2P04, 186 mg/l de MgS04-7H20, 166 mg/l de CaCl2-2H20, 10 mg/l de MnS04-H20, 3 mg/l de H3B03l 2 mg/l de ZnS04-7H20, 0.25 mg/l de NaMo04-2H20, 0.025 mg/l de CuS04-5H20, 0.025 mg/l de CoCI2-6H20, 0.75 mg/l de Kl, 2.83 g/l de KN03, 0.2 mg/l de niacina, 0.1 mg/l de clorhidrato de tiamina, 0.2 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 0.1 mg/l de D-biotina, 0.1 mg/l de cloruro de colina, 0.1 mg/l de pantotenato de calcio, 0.05 mg/l de ácido fólico, 0.05 mg/l de ácido p-aminobenzoico, 0.05 mg/l de riboflavina, 0.015 mg/l de vitamina B12, 0.5 g/l de casaminoácidos, 33.5 mg/l de Na2EDTA, 1.38 g/l de L-prolina, 20 g/l de sacarosa y 10 g/l de D-glucosa) o medio MS que contiene 1.5 mg/l de 2,4-D, 500 mg/l de carbenicilina, sacarosa 3%, 1.38 g/l de L-prolina y nitrato de plata o tiosulfato de plata 20 µ , y se cultiva durante 0 a 8 días en la oscuridad a 27°C sin selección. El medio de cultivo utilizado para selecciones transformantes y regeneración de plantas preferiblemente contiene 500 mg/l de carbenicilina. Una persona experta en la técnica puede sustituir otros antibióticos que controlen el crecimiento de Agrobacteríum. Se puede utilizar alternativamente otro medio de cultivo que soporte el cultivo de células. En ausencia de un retraso de selección (cultivo de día 0), la selección se puede iniciar en 25 mg/l de paromomicina. El medio de selección puede comprender el medio 211 (descrito antes) o una variante del medio 211 en la cual las sales N6 se sustituyen por sales MS. Después de dos semanas, los callos embrlogénicos se transfieren a medio de cultivo que contienen 100 mg/l de paromomicina y se subcultivan con intervalos de aproximadamente dos semanas. Cuando la selección se retrasa después del cocultivo, los embriones inicialmente se cultivan en un medio que contiene 50 mg/l de paromomicina seguido por cultivo subsecuente de callos embriogénicos en medio que contiene 100-200 mg/l de paromomicina. Una persona experta en la técnica cultivará tejido en concentraciones de paromomicina las cuales inhiban el crecimiento de células que carezcan del gen marcador seleccionable, pero una concentración en la cual los callos transformados proliferarán. De manera alternativa, uno puede utilizar otros marcadores seleccionares para identificar células transformadas. Se considera que el cultivo inicial en 25 a 50 mg/l de paromomicina durante aproximadamente dos semanas, seguido por cultivo en 50-200 mg/l de paromomicina resultará en recuperación de callos transformados. Los transformantes se recuperan 6 a 8 semanas después del inicio de la selección. Las plantas se regeneran a partir de callos embriogénicos transformados como se describe en lo anterior para transformantes recuperados después del bombardeo con microproyectiles.

EJEMPLO 22 Transformación Mediada por Aqrobacterium de Callo de Maíz Este ejemplo describe métodos para la transformación de callos de maíz utilizando Agrobacterium. El método se ejemplifica utilizando un gen marcador seleccionable nptU y un agente selectivo para paromomicina. Una persona experta en la técnica tendrá conocimiento de otro marcador seleccionable y combinaciones de agentes selectivos que pueden ser utilizados de manera alternativa. Los callos se inician a partir de embriones inmaduros utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se cortan embriones inmaduros de 1.5 mm a 2.0 mm de semillas de maíz en desarrollo de un genotipo tal como CORN OF GERMPLASM A y se cultivan con el lado del eje embriónico hacia abajo, en medio 21 V, habitualmente durante 8-21 días después del corte. De manera alternativa, una vez establecido un cultivo de callo establecido se puede iniciar y mantener por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se prepara Agrobacterium para inoculación de tejido vegetal de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 21. Se transfieren de 50 a 100 piezas de callos a una caja de Petri de 60 mm X 20 mm que contiene aproximadamente 15 mi de suspensión de Agrobacterium a 0.1 a 1.0 x 109 ufc/ml. Una pieza del callo habitualmente es la totalidad del callo producida por un embrión inmaduro hasta en 21 días de cultivo o una pieza del callo establecido de un diámetro de 2 mm a 8 mm. Los callos se incuban durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente con la suspensión de Agrobacterium, seguido por separación del líquido por aspiración. Se agregan aproximadamente 50 µ? de agua destilada estéril a un papel filtro Whatman #1 en una caja de Petri de 60 mm x 20 mm. Después de 1-5 minutos, se transfieren 15 a 20 piezas del callo a cada papel filtro y la placa se sella, por ejemplo, con PARAFILMMR. El callo y Agrobacterium se cocultivan durante aproximadamente 3 días a 23°C en la oscuridad.

Los callos se transfieren de papel filtro al medio 21 con nitrato de plata 20 µ? y 500 mg/l de carbenicilina y se cultivan en la oscuridad a 27°C hasta 28°C durante 2-5 días, preferiblemente 3 días. La selección se inicia por transferencia del callo al medio 211 que contiene nitrato de plata 20 µ?, 500 mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de paromomicina. Después de 2 semanas de cultivo en la oscuridad a una temperatura de 27°C a 28°C, los callos se transfieren a medio 211 con nitrato de plata 20 µ?, 500 mg/l de carbenicilina y 50 mg/l de paromomicina (medio 211 QRG). Los callos se subcultivan después de dos semanas a medio fresco 2 1 QRG y se cultivan adicionalmente durante dos semanas en la oscuridad a una temperatura de 27°C a 28°C. Los callos después se transfieren al medio 211 con nitrato de plata 20 µ?, 500 mg/l de carbenicilina y 75 mg/l de paromomicina. Después de 2-3 semanas de cultivo en la oscuridad a una temperatura de 27°C a 28°C, se identifican los callos resistentes a paromomicina. Una persona experta en la técnica puede reconocer las veces entre los subcultivos de callos las cuales son aproximadas y uno puede ser capaz de acelerar el procedimiento de selección al transferir tejido a intervalos más frecuentes, por ejemplo semanalmente en vez de hacerlo cada quince días. Las plantas se regeneran a partir de callos transformados, se transfieren al suelo y se hacen crecer en un invernadero como se describe en el ejemplo. Después de la transformación mediada por Agrobacterium, el medio 217 (véase ejemplo 9) que contiene adicionalmente 500 mg/l de carbenicilina y medio 127T (véase ejemplo 9) que contiene además 250 mg/l de carbenicilina. Se producen plantas de maíz transformadas que comprenden genes de la presente invención utilizando transformación mediada por Agrobacterium y se resumen el cuadro Y.

EJEMPLO 23 Métodos de bombardeo con microproyectiles Aproximadamente 4 horas antes del bombardeo con microproyectiles se transfieren embriones inmaduros al medio 21 SV (medio 211V con la adición de sacarosa a 12%). Preferiblemente se colocan 25 embriones inmaduros en una caja de Petri de 60 x 15 mm, distribuidos en una rejilla de 5 x 5 con el extremo de la parte coleoptilar del escutelo presionada ligeramente dentro del medio de cultivo en un ángulo de 20 grados. El tejido se mantiene en la oscuridad antes del bombardeo. Antes del bombardeo con microproyectiles se prepara una suspensión de partículas de oro sobre la cual se precipita el ADN deseado. Se suspenden 10 mg de partículas de oro de 0.6 µ?t? (BioRad) en 50 µ? de amortiguador (NaCI 150 m , Tris.HCI 10mM, pH 8.0). Se agregan a la suspensión de partículas de oro 25 µ? de una solución 2.4 nM dei ADN deseado y se somete a remolino suavemente durante aproximadamente cinco segundos. Se agregan 75 µ? de espermidina 0.1 y la solución se somete a remolino suavemente durante aproximadamente 5 segundos. Se agregan 75 µ? de una solución 25% de políetilenglicol (3000-4000 de peso molecular, American Type Culture Collection) y la solución se somete a remolino suavemente durante 5 segundos. Se agregan 75 µ? de CaC 2.5 M y la solución se somete a remolino durante 5 segundos. Después de la adición de CaC , la solución se incuba a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Posteriormente la suspensión se centrifuga durante 20 segundos a 12,000 rpm (centrifuga Sorval MC-12V) y se desecha el sobrenadante. El sedimento de partículas de oro/ADN se lava dos veces con etanol 100% y se resuspende en 10 mi de etanol 100%. La preparación de partículas de oro/ADN se almacena a -20°C hasta por dos semanas. Se introduce el ADN dentro de las células de maíz utilizando el dispositivo de suministro de genes por aceleración de partículas de descarga eléctrica (Patente de E. U. A. No. 5,015,580). La suspensión de partículas de oro/ADN se recubre sobre láminas de Mylar (película de poliéster Du Pont Mylar tipo SMMC2, recubierta con aluminio en un lado, sobre recubierta con copolímero de PVDC en ambos lados, y se corta en cuadrados de 18 mm) por dispersión de 310 a 320 µ? de una suspensión de partícula de oro/ADN sobre una hoja. Después de que la suspensión de partículas de oro sedimenta durante 1 a 3 minutos, se separa el exceso de etanol y las láminas se secan al aire. El bombardeo con microproyectiles del tejido de maíz se lleva a cabo como se describe en la patente de E. U. A. No. 5,015,580. Se puede hacer variar el voltaje de corriente alterna en el dispositivo de suministro de partículas de descarga eléctrica. Para el bombardeo de microproyectiles de embriones inmaduros precultivados de CORN OF GERMPLASM A, se utiliza preferiblemente 35% a 45% del voltaje máximo. Después del bombardeo con microproyectiles, el tejido se cultiva en la oscuridad a 27°C.

EJEMPLO 24 Selección de las células transformadas Se seleccionan los transformantes sobre medio de cultivo que comprende paromomicina, en base en la expresión de un gen para neomicina fosfotransferasa II (npfll) transgénico. Veinticuatro horas después del suministro de ADN, el tejido se transfiere a medio 2 1V que contiene 25 mg/l de paromomicina (medio 211 HV). Después de tres semanas de incubación en la oscuridad a 27°C, el tejido se transfiere al medio 211 que contiene 50 mg/l de paromomicina (medio 21 G). El tejido se transfiere al medio 21 que contiene 75 mg/l de paromomicina (medio 211 XX) después de tres semanas. Los transformantes se aislan después de 9 semanas de selección. El cuadro Y describe los resultados de los experimentos transformantes utilizando los métodos de bombardeo con microproyectiles descrito en la presente.

EJEMPLO 25 Regeneración de plantas transgénicas fértiles Se producen plantas transgénicas fértiles a partir de células de maíz transformadas. Los callos transformados se transfieren al medio 217 (sales N6, 1 mg/l de clorhidrato de tiamina, 0.5 mg/l de niacina, 3.52 mg/l de bencilamlno purina, 0.91 mg/l de monohidrato de L-asparagina, 100 mg/l de mio-inositol, 0.5 g/l de MES, 1.6 g/l de MgCI2-6H20, 100 mg/l de hidrolisato de caseína, 0.69 g/l de L-prolina, 20 g/l de sacarosa, 2 g/l de GELGROMR, pH 5.8) durante 5 a 7 días en la oscuridad, a 27°C. Los embriones somáticos maduran y la regeneración de los vástagos comienza en medio 217. Se transfiere el tejido a medio 127T (sales MS, 0.65 mg/l de niacina, 0.125 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 0.125 mg/l de clorhidrato de tiamina, 0.125 mg/l de pantotenato de calcio, 150 mg/l L-asparagina, 100 mg/l de mio-inositol, 10 g/l de glucosa, 20 g/l de L-maltosa, 100mg/l de paromomicina, 5.5 g de PHYTAGARMR, pH 5.8) para el desarrollo de vástagos. El tejido en el medio 127T se calcula a la luz, a 400-600 lúmenes a 26°C. Las plántulas se transfieren al piso, preferiblemente en macetas de 7.6 cm (3 pulgadas), aproximadamente 4 a 6 semanas después de la transferencia al medio 127T cuando las plántulas tienen una altura de aproximadamente 7.6 cm (3 pulgadas) y tienen raíces. Las plantas se mantienen durante dos semanas en una cámara de crecimiento a 26°C, seguido durante dos semanas en un gabinete de humedad en un invernadero antes de trasplantarlas a macetas de 19 I (5 galones) para crecimiento en invernadero. Las plantas se hacen crecer en el invernadero hasta la madurez y se realizan polinizaciones reciprocas con la cepa endogámica CORN OF GERMPLASM A. Se recolectan las semillas de las plantas y se utilizan para actividades de producción adicionales.

EJEMPLO 26 Aislamiento de ácidos nucleicos de plantas Se aislan ácidos nucleicos de tejido de las hojas de plantas RO, se recolectan y se congelan rápidamente en una caja de recolección de 96 pozos, 0 a 2 semanas después las plántulas se transfieren al suelo. Se recolectan aproximadamente 100 mg de tejido de cada planta y se almacena a -80°C hasta su análisis. El ADN y ARN se aislan de una muestra de tejido única utilizando el equipo Qiagen Rneasy 96MR (Qiagen Inc. , Valencia, CA) con modificaciones. Se homogenizan 100 mg de tejido congelado en 700 µ? de amortiguador RneasyMR RTL (Qiagen Inc., Valencia, CA) utilizando Bead Beater1^ (Biospec Products, Bartlesville, OK). Las muestras se centrifugan a 3200 rpm durante 15 minutos y la totalidad del sobrenadante se transfiere a los pozos de una placa de depuración Promega WIZARDMR (Promega Corporation, Madison, Wl). Las soluciones de muestra se depuran por filtración al vacío a través de una placa de depuración. El sobrenadante depurado se utiliza para extracciones de ácido nucleico. Para extracciones de ADN, se transfieren 70 µ? de la muestra depurada a una placa de PCR de pozo en V, cubierto con una lámina delgada adhesiva y se calienta a 95°C durante 8 minutos. Las muestras se incuban a 0°C durante cinco minutos, seguido por centrifugación durante 3 minutos para eliminar materiales insolubles. Se acondiciona una caja de filtración de gel Sephadex G-50 (Edge Biosystems, Gaithersburg, MO) durante 2 min a 2000 rpm. Se cargan 40 µ? del sobrenadante tratado con calor dentro de cada pozo y la caja se centrifuga 2 minutos a 2500 rpm. Se agregan 20 µ? adicionales de amortiguador TE al efluente de la columna y la placa de la muestra se almacena -20°C hasta análisis. Para extracciones de ARN, se transfieren 500 µ? de solución depurada a una caja de muestra de 96 pozos limpia. Se agregan 250 µ? de etanol 100% a cada muestra y la muestra se mezcla profundamente. La totalidad de aproximadamente 750 µ? de solución y después se cargan en los pozos de una placa de unión Qiagen RneasyMR en una unidad de filtración Promega WIZARDMR. Se agregan a cada pozo 500 µ? de amortiguador RW1 (Qiagen Inc., Valencia, CA) y cada pozo y amortiguador se separan por filtración al vacío. Se agregan a cada pozo 8 µ? de ribonucleasa libre de desoxirribonucleasa (Qiagen Inc., Valencia, CA), se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos la solución de desoxirribonucleasa extraída a través de los pozos por filtración al vacío. Se agrega a los pozos 500 microlitros adicionales de amortiguador RW1 (Qiagen Inc., Valencia, CA) y el amortiguador se retira por filtración al vacío. La muestra se lava adicionalmente por filtración al vacío con 500 µ? de amortiguador RPE 2X (Qiagen, Valencia, CA). La placa de extracción se coloca sobre una placa de microtitulación y se centrifuga durante 3 minutos a 3000 rpm para eliminar cualquier solución amortiguadora de RPE residual en el filtro. Se agregan a cada pozo 80 µ? de agua grado ARN (sin desoxirribonucleasa), seguido por incubación a temperatura ambiente durante 2 minutos. La placa de extracción y la placa de microtitulación se centrifugan durante 3 minutos a 3000 rpm y la preparación de ARN se almacena congelada en la placa de recolección a -80°C.

EJEMPLO 27 Ensayos para el número de copias Se determina el número de copias de los transgenes en plantas R0 utilizando los métodos TAQMANMR. Se construyen los vectores de destino pMON65154 y pRG76 GATEWAYMR con una secuencia derivada de la región 3' del gen pin\\ de papa, el cual puede ser utilizado para realizar un ensayo del número de copias de inserciones de transgen. Los iniciadores directo e inverso de p/nll son como sigue: Iniciador directo 5'ccccaccctgcaatgtga3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 77) Iniciador inverso 5'tgtgcatccttttatttcatacattaattaa3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 78) La secuencia de la sonda p/nll TAQMANMR es 5'cctagacttgtccatcttctggattggcca3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 79) La sonda se marca en el extremo 5' con el colorante fluorescente FAM (6-carboxifloresceína) y el colorante extintor TAMRA (6-carboxi- ?,?,?',?'-tetrametilrodamina) se une por medio de un enlazante al extremo 3' de la sonda. La sonda TAQMANMR se obtiene de Applied Biosystems (Foster City, CA). _SAT, un gen de maíz de una sola copia se utiliza como un control interno en los ensayos de número de copia TAQMAN R. Los iniciadores de SAT son los siguientes: Iniciador directo 5' gcctgccgcagaccaa 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 80) Iniciador inverso 5' atgcagagctcagcttcatc 3 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 81 ) La secuencia de la sonda SAT TAQMANMR es: 5' tccagtacgtgcagtccctcctcc 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 82) La sonda se marca en su extremo 5' con el colorante fluorescente VICMR (Applied Biosystems, Foster City, CA) y el extintor de colorante TAMRA en su extremo 3'. Se realiza PCR de TAQMANMR, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (applied Biosystems, Foster City, CA). En cada ensayo se utilizan de 5 a 100 ng de ADN. La amplificación por PCR y la detección de sonda TAQMANMR se realiza en 1X TAQMANMR Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) el cual contiene la ADN poiimerasa AmpliTaq GoldMR, UNG AmpEraseMR, los dNTP con dUTP, referencia pasiva 1 y un amortiguador optimizado. Se utilizan en el ensayo TAQMANMR 800 nM de cada uno de los iniciadores pinU directo e inverso y 150 nM de sonda TAQMAN p/'nll. Se utilizan 200 nM de cada uno de los iniciadores directo e inverso Sat y 150 nM de la sonda Sat TAQMANMR en el ensayo del número de copia TAQMANMR. Se lleva a cabo PCR por TAQMANMR durante 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C seguido por 40 ciclos de 5 segundos a 95°C y un minuto a 60°C. Se mide la fluorescencia de la sonda TAQMANMR en tiempo real utilizando un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700 o un sistema de detección de secuencia ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se calculan los valores CT de acuerdo con el manual de instrucciones del equipo TAQMANMR EZ RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se calcula el valor ?? CT como CT (gen de control interno (Sat)) -CT (transgen) - CT (gen de control interno (Sat) en planta no transgénica). El número de copias se asigna como sigue, de acuerdo con el criterio en el cuadro 2.

CUADR0 19 Criterio para la determinación del número de coplas por TAQMAN1 Las plantas que comprenden genes de la presente invención se analizarán por los métodos TAQMANMR para el número de copias. El análisis de transferencia Southern para confirmar la determinación del número de copias TAQMANMR en aproximadamente 80% de las plantas que fueron analizadas tanto por TAQMAN como por hibridación de transferencia Southern.

EJEMPLO 28 Ensayos para la expresión de genes La expresión de un transgen de la presente invención se determina por TAQ AN R RT-PCR utilizando el equipo TAQMANMR EZ RT-PCR de Applied Biosystems (Foster City, CA). La expresión de ARN se determina en relación a la expresión en un estándar transgénico, un suceso de maíz transgénico denominado DBT418, que comprende un gen c lAI de B. thuringiensis unido operablemente a una región no traducida pinW 3'. El suceso DBT418 expresa el gen c/ylAI a un nivel el cual le confiere niveles comerciales de resistencia a insectos lepidópteros tales como el oradador de maíz europea y se vende comercialmente por DEKALB Genetics Corporation bajo el nombre comercial DEKALBtMR. Los vectores de destino pMON65154 y pRG76 GATEWAYMR se construyen con una secuencia derivada de la región 3' del gen pinW de papa el cual puede ser utilizado para realizar ensayos de niveles de transcrito de transgen para cualquier secuencia codificante insertada dentro del vector de destino. Los iniciadores p/'nll y las sondas descritas previamente se utilizan para TAQMANMR RT-PCR. Se utiliza el ARN para proteína de fusión de ubiquitina (UBI) como un control interno en todos los ensayos TAQMANMR RT-PCR. Los iniciadores UBI utilizados son los siguientes: iniciador directo 5' cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 83) iniciador inverso 5' ccaacaggtgaatgcttgatagg 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 84) La secuencia de la sonda UBI TAQMANMR es: 5' catgcgccgctttgcttc 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 85) La sonda UBI TAQMANMR se etiqueta en su extremo 5' con el colorante fluorescente VICMR (Applied Biosystems, Foster City, CA) y el eliminador de colorante TAMRA en su extremo 3'. La transcripción inversa, la amplificación por PCR y el sondeado por TAQMANMR se realizan de acuerdo con el procedimiento de una etapa descrito en el equipo TAQMANMR EZ RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). En cada ensayo se utilizan 5 a 100 ng de ARN total. El ARN control transcrito in vitro del suceso DBT4 8 se incluye como un control en cada placa y se corre sobre un intervalo de concentración de 0.01 pg a 10 pg. El ARN total de una hoja DBT418 y de una cepa endogamica no transgénica de CORN OF GERMPLASM A se corren como controles positivo y negativo, respectivamente. Se realiza RT-PCR en amortiguador TAQMANMR EZ (vicien 50 mM, acetato de potasio 115 mM, EDTA 0.01 mM, Referencia pasiva 1 60 mM, gliceros, 8%, pH 8.2, Applied Biosystems, Foster City, CA) que contiene acetato de manganeso 3 mM, 300 µ? de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dUTP, 100 unidades de ADN polimerasa rTthMK (Applied Biosystems, Foster, City, CA) y 25 unidades de AmpErase UNG (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se lleva a cabo RT-PCR como sigue: 2 minutos a 50°C, 30 minutos a 60°C, 5 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de 20 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. Se utilizan 400 nM de cada uno de los iniciadores directo e inverso para amplificación de la secuencia p¡n\\ y se utiliza la sonda pin\\ TAQMANMR 200 mM para detección. El ARN UBI se amplifica utilizando 400 nM de cada uno de los iniciadores directo e inverso y se utiliza la sonda UBI TAQMAN R 200 nM para detección. Se mide la fluorescencia TAQMANMR utilizando un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700 o un sistema de detección de secuencia ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión de los transgenes de la presente invención se cuantifica en relación a la expresión del transgen en DBT418 y se reporta como la proporción de expresión de transgen respecto a la expresión de DBT418, es decir, 2-(???t) (DBT418).

EJEMPLO 29 Producción de plantas Se puede utilizar la retrocruza para mejorar una planta inicial. La retrocruza transfiere un rasgo deseable específico a partir de una fuente a una raza ondogámica u otra planta que carece de dicho rasgo. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al primero cruzar una cepa endogámica superior (A) (padre recurrente) a una cepa endogámica donadora (padre no recurrente), el cual presenta uno o varios genes apropiados, para el rasgo en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada de acuerdo con la presente invención. La progenie de esta cruza primero se selecciona en la progenie resultante para el rasgo deseado el cual se va a transferir desde el padre no recurrente y después la progenie seleccionada se cruza nuevamente con el padre recurrente superior (A). Después de 5 o más generaciones de retrocruza con selección por el rasgo deseado, la progenie son homocigotas para los loci que controlan las características que se transfieres, pero son similares al padre superior para la mayor parte o casi la totalidad de los otros genes. La última generación de retrocruza puede autopolinizarse para proporcionar progene la cual sea de cría de producción pura para uno o varios de los genes que van a ser transferidos, es decir, uno o más eventos de transformación. Por lo tanto, a través de una serie de manipulaciones de producción, un transgen seleccionado se puede mover de una línea a otra línea completamente diferente sin necesidad de manipulación recombinante adicional. Los transgenes son útiles en la medida en que típicamente se comportan genéticamente como cualquier otro gen y pueden ser manipulados por técnicas de producción de una manera idéntica a cualquier otro gen de maíz. Por lo tanto, uno puede producir plantas endogámicas las cuales son la producción verdadera para uno o más transgenes. Al cruzar plantas endogámicas diferentes, uno puede generar un número grande de híbridos diferentes con combinaciones diferentes de transgenes. De esta manera se pueden producir plantas las cuales tienen las propiedades agronómicas deseables asociadas frecuentemente con híbridos ("vigor híbrido") así como las características deseables impartidas por uno o más transgenes. Es deseable introducir los genes de la presente invención en híbridos de maíz para caracterización del fenotipo conferido por cada gen en una planta transformada. El genotipo hospedador en el cual se introduce el transgen, preferiblemente CORN OF GERMPLASM A, es una cepa endogámica élite y por lo tanto únicamente es necesaria la crianza con el fin de producir híbridos de maíz de alto rendimiento. La planta transformada, regenerada de tallos se cruza con el mismo genotipo, por ejemplo CORN OF GERMPLASM A. La progenie se autopoliniza dos veces y se identifican las plantas homocigotas para el transgen. Las plantas transgénicas homocigotas se cruzan con un padre de cruce de prueba con el fin de producir híbridos. El padre de cruce de prueba es una cepa endogámica que pertenece a un grupo heterótico el cual es diferente de aquel del padre transgénico y para el cual se sabe que se puede generar híbridos con alto rendimiento, por ejemplo se producen híbridos de cruzas de CORN OF GERMPLASM A ya sea con CORN OF GERMPLASM E o CORN OF GERMPLASM B.

EJEMPLO 30 Métodos para evaluación del fenotipo La expresión de los genes de la presente invención que generan diversos fenotipos se describen en la presente en células y plantas transformadas. Se recolectan los datos fenotípicos durante el procedimiento de transformación en el callo así como durante la regeneración de la planta y también en las plantas y su descendencia. Se recolectan datos fenotípicos en callos transformados en relación a la apariencia morfológica así como el crecimiento del callo, por ejemplo, con vástagos, con raíces, con corteza, mucoide, no embriogénico, de velocidad de crecimiento aumentada, de velocidad de crecimiento disminuida o muerte. Se espera que una persona experta en la técnica pueda reconocer otras características fenotípicas en callos transformados. También se recolectan datos fenotípicos durante el procedimiento de regeneración de la planta así como en plantas regeneradas transferidas al suelo. Los datos fenotípicos incluyen características tales como plantas normales, plantas en forma de arbusto, hojas estrechas, hojas en tiras, fenotipo nudoso, clorosis, albino, producción de antocianina, buggy whipped (un fenómeno conocido en la técnica en la cual las hojas que han surgido más recientemente están alargadas y enrolladas unas sobre otras) o táselos, espigas o raíces alteradas. Se espera que una persona experta en la técnica pueda reconocer otras características fenotípicas en plantas transformadas. Se analizan una amplia variedad de fenotipos durante el procedimiento de producción de la planta y se prueban en plantas tanto endogámicas como híbridas. Por ejemplo, en plantas RO y R1 (plantas regeneradas directamente del tallo y la descendencia directa de estas plantas), se registran en tipo de plantas (características morfológicas generales tales como las descritas en lo anterior para plántulas) y composición nutricional del grano producido por las plantas. El análisis de composición nutricional puede incluir composición de aminoácidos, cantidad de proteína, almidón y aceite, características de la proteína, almidón o aceite, fibra, cenizas, contenido mineral y todos pueden cuantificarse. Se espera que un experto en la técnica pueda incluir análisis y otros componentes del grano. En plantas R2 y R3, se observan los días para la dispersión del polen, días para maduración y tipo de planta. Además, se lleva a cabo una determinación del perfil de metabolitos de las plantas R2. Utilizando los métodos disponibles para aquellos expertos en la técnica se pueden analizar en una planta 50 a 100 o más metabolitos y de esta manera se establecen rasgos definitorios metabólicos de la planta. Además en las plantas R3 se mide la velocidad de extensión de las hojas bajo condiciones de campo. Se realizarán ensayos de una diversidad de fenotipos en híbridos que comprenden un transgen de la presente invención. Por ejemplo, se registrarán el rendimiento, humedad, peso de prueba, composición nutricional, contenido de clorofila, temperatura de las hojas, erección, vigor de las plántulas, altura de la planta, número de hojas, formación de retoños, raíces fortalecidas, permanencia verde, colocación del tallo, colocación de la raíz, salud de la planta, improductividad/proliferación, vigor verde, resistencia a plagas (que incluye enfermedades, virus e insectos) y perfiles metabólicos. Además, las características fenotípicas de los granos cosechados a partir de los híbridos se registrarán, incluyendo el número de semillas o granos por hilera en la espiga, número de hileras de granos en la espiga, aborto de granos, peso del grano, tamaño del grano, densidad de los granos y calidad física de ios granos. Además, las características tales como fotosíntesis, área de hoja, estructura de la cascarilla, velocidad de secado del grano y longitud entre los nodos se pueden medir en híbridos o en cepas endogámicas. Se espera que el perfilado transcripcional se pueda realizar sobre plantas transgénicas que expresan genes de la presente invención. Con el fin de determinar el rendimiento híbrido en plantas transgénicas que expresan genes de la presente invención, se reconoce que los híbridos deben probarse en lugares múltiples en una ubicación geográfica en donde convencionalmente crece maíz, por ejemplo lowa, Illinois u otros lugares en la parte del medio Oeste de los Estados Unidos. Se espera que sea deseable más de un año de pruebas de rendimiento con el fin de identificar transgenes que contribuyan al mejoramiento de un híbrido de maíz. Por lo tanto, los híbridos transgénicos se valuaran en un primer año en una cantidad suficiente de lugares para identificar por lo menos una diferencia de aproximadamente 10% de rendimiento en comparación con un híbrido no transgénico. Se lleva a cabo un segundo año de rendimiento en lugares suficientes y con repeticiones suficientes para ser capaces de identificar una diferencia de rendimiento de 4-5% entre los dos híbridos. Además, en el segundo año de pruebas de rendimiento se evaluarán los híbridos bajo condiciones de campo normales así como bajo condiciones de estrés, por ejemplo bajo condiciones de estrés de agua o de densidad de población. Una persona experta en la técnica sabe como diseñar un ensayo de rendimiento de manera tal que se pueda detectar una diferencia de rendimiento estadísticamente significativa entre dos híbridos a la tasa deseada de precisión.

EJEMPLO 31 Esterilización de superficie e impregnación de las semillas de maíz Para cada lote transgénico, se esterilizan en la superficie aproximadamente 50 semillas de maíz al colocarlas en un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mi con 50 mi de una solución de blanqueador 30% (solución de hipoclorito de sodio = clorox o equivalente) que contiene tritón X-100 0.01% y se hace girar el matraz en un agitador orbital durante 5 minutos. Después se elimina por decantación la solución de blanqueado y se lava con aproximadamente 100 mi de agua desionizada estéril y se elimina por decantación el agua de lavado. Se repite el lavado con agua estéril 4 veces más, dejando la última agua de lavado en las semillas. Se incuban las semillas en esta agua a temperatura ambiente durante 24 h para impregnación, bajo burbujeo con aire (que se hace pasar a través de un filtro 0.2 \im).

I. Preparación de los medios en Phvtotravs Se prepara medio de agua-agar para variar Phytotrays. Se utiliza Phytotrays II (o caja de plástico: 60 x 30 x 15 cm) en la posición invertida de manera que el lado de profundidad mayor del recipiente está en el fondo y el lado más pequeño se utiliza como la tapa. Se prepara suficiente medio agua-agar para 100 mi por Phytotray al estabilizar Bacto Agar 0.3% en agua desionizada durante 45 minutos en un ciclo líquido. Se enfría el medio hasta el grado que puede ser manejado fácilmente y se vierten aproximadamente 00 mi por Phytotray mientras aún está fundido.

II. Ensayo de vigor de plántulas de maíz frías • Cuando el medio ha solidificado, se le colocan semillas estériles en una campana de flujo laminar. Utilizando unas pinzas estériles, se seleccionan 20 semillas sanas, la mayor parte uniforme y se colocan las semillas en cada Phytotray utilizado para el ensayo, separando las semillas uniformemente de manera que los individuos puedan ser separados posteriormente.

Se colocan las semillas de manera tal que el lado del embrión se inserte diagonalmente de manera descendente y la semilla se encuentra justo por debajo de la superficie de agar. En esta posición, la germinación del vástago y la raíz será capaz de alargarse directamente sin trabas. Se incuban las semillas en el medio a 22°C durante una semana, o hasta que la mayor parte de las semillas han extruido las radículas y comienzan a germinar del agar. Se retiran la totalidad excepto 10 plántulas que crecieron de manera uniforme en una campana de flujo lamilar. Se cambian las Phytotrays a una cámara de crecimiento en plantas fría ajustada a 10°C con un ciclo de 6 horas diarias y se incuban en ese lugar durante 2 semanas. Se cambia las Phytotray de regreso a 22°C durante una semana. Se extraen las plántulas, se mide la longitud de la raíz y la longitud de los vástagos por cada plántula y se registra en el cuaderno el peso fresco medido g/3 plántulas. Adaptación para germinación en frío y ensayo de surgimiento. Igual que en lo anterior con las siguientes excepciones: Después del último lavado con agua en I, se colocan los matraces a 10°C durante la etapa de impregnación durante la noche. También se preenfrían las Phytotray con medio solidificado a 10°C.

Después las semillas en Phytotray enfriadas con semillas impregnadas frías, se colocan directamente en la cámara de 10°C. Después de aproximadamente 5 días, se retiran todas excepto 10 de las semillas que germinaron de manera más uniforme, aquellas cuyas radículas son aproximadamente de la misma longitud. Se regresan las Phytotray a la cámara de 10°C durante 1-2 semanas. Se retiran las plántulas, se mide la longitud de la raíz y la longitud del vástago para cada plántula y se mide el peso fresco de cada 3 plántulas, y se registra en un cuaderno. Se cambia el segundo conjunto de Phytotray a 22°C durante 1 semana. Se retiran las plántulas, se mide la longitud de la raíz y la longitud de los vástagos para cada plántula y se registra en un cuaderno.

EJEMPLO 32 Creación de plásmidos para transformación de soya Ejemplo (para las construcciones CspA y B - pMON73983 y 73984) El plásmido pMON73983 (figura 8) es un vector binario para la transformación mediada por Agrobacterium y la expresión constitutiva de una proteína (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 1 ) similar a CspA de Bacillus subtilis en soya. Para clonar el gen CspA de B. subtilis, se diseñan dos iniciadores específicos de gen, MSA452 y MSA453 en base en la información de secuencia CspA (Genbank # M30139) del National Center for Biotechnology Information, el cual es parte del National Library of Medicine, a su vez que es parte del National Institutes of Health (NCBI). La secuencia para MSA452 es GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAAT GG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 86), la cual se reasocia en el sitio de inicio traduccional de CspA e introduce sitios Stl y Bglll en el extremo 5', mientras que la secuencia de MSA453 es CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 87), la cual reasocia por lo menos el codón de CspA e introduce los sitios BamHI y EcoRI en el extremo del iniciador. El iniciador inverso MSA453 se diseña para que coincida con el extremo 3' de la secuencia de gen de Genbank. La reacción de PCR se lleva a cabo utilizando los iniciadores MSA452 y MSA453, High Fidelity Taq Polymerase (BRL) y pMON57397 (figura 3) como la plantilla. Esta plantilla difiere en el extremo 3' del gen CspA en comparación a la de la secuencia de Genbank. El ADN de CspB amplificado se purifica por electroforesis en gel y se liga al vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen). La reacción de ligación se transforma en células de E. co// Top 0 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se toman cuatro colonias transformantes y se prepara el ADN de miniprep (minipreparación) utilizando el equipo Qiagen Miniprep. Se secuencian los insertos utilizando iniciadores directo e inverso específicos para M13. El clon con la secuencia correcta se denomina pMON73981 y se utiliza para .subclonación adicional. Se digiere el ADN para pMON73881 con Stul y BamHI para aislar el fragmento del gen CspA. Se digiere ADN de pMON73980 con Stul y BamHI, secuencialmente, y después se purifica con el equipo Gene Clean II. El fragmento CspB y este vector purificado pMON73980 se ligan y la reacción de ligación se electrotransforma en células E. coli DH10B. Los transformantes se seleccionan en medio que contiene espectrinomicina. El ADN de la minipreparación se prepara a partir de los transformantes y se verifica el ADN para determinar la presencia del inserto mediante la utilización de un iniciador directo específico para promotor CaMV35S. El clon que contiene este inserto se denomina como pMON73983. Se elabora una preparación de ADN más grande y se llevan a cabo una serie de digestiones de confirmación, que incluyen Bglll, EcoRI, Pstl, EcoRI + BamHI, Stul + Xhol. Esto confirma la clonación correcta. El plásmido pMON73984 es un vector binario de transformación mediada por Agrobacterium y la expresión constitutiva de una proteína (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 2) como CspB de Bacillus subtilis en Arabidopsis. El clon del gen de CspB de B. subtilis, dos iniciadores específicos para gen, MSA454 y MSA455, se diseñan en base en la información de secuencia CspB (Genbank #X59715) del National Center for Biotechnology Information, el cual es parte del National Library of Medicine que a su vez es parte del National Institutes of Health (NCBI). La secuencia para MSA454 es GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGGTAAAGTAAAATGGT TCAACTCTG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 88), la cual se reasocia en el sitio de inicio traduccional de CspB e introduce los sitios Stul y Bglll en el extremo 5', mientras que la secuencia de MSA455 es CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTG G (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 89), la cual se reasocia en el último codón de CspB e introduce los sitios BamHI y EcoRI en el extremo del iniciador. Se diseña un iniciador inverso MSA455 para que coindica con el extremo 3' de la secuencia del gen Genbank. Se lleva a cabo la reacción de PCR utilizando los iniciadores MSA454 y MSA455, High Fedelity Taq Polymerase (BRL) y pMON57399 como la plantilla. Esta plantilla difiere en el extremo 3* del gen CspB con respecto a la secuencia de Genbank. El ADN de CspB amplificado se purifica por electroforesis en gel y se liga al vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen). La reacción de ligación se transforma en células E. coli Top10 (Invitrogen) como lo indican las instrucciones del fabricante. Se toman cuatro colonias transformantes en ADN de minipreparación el cual se prepara utilizando el equipo Qiagen Miniprep. Se secuencían los insertos utilizando iniciadores directo e inverso específicos para M13. El clon con la secuencia correcta se denomina pMON73982 y se utiliza para subclon adicional. Se digiere el ADN de pMON73882 con Stul y BamHI para aislar el fragmento del gen CspB. Se digiere el ADN de pMON73980 con Stl y BamHI secuencialmente, y después se purifica con el equipo Gene Clean II. El fragmento CspB y este vector purificado pMON73980 se ligan y la reacción de ligación se electrotransforma en células E. coli DH10 B. Los transformantes se seleccionan en un medio que contiene espectinomicina. El ADN de minipreparación se prepara a partir de los transformantes y se verifica el ADN para determinar la presencia del inserto mediante la utilización de un iniciador directo específico para el promotor CaMV35S. El clon que contiene el inserto se denomina como pMON73984. Se elabora una preparación de ADN más grande y se llevan a cabo una serie de digestiones de confirmación que incluyen Bglll, EcoRI, Pstl, EcoRI + BamHI, Stul + Xhol. Esto confirma la clonación correcta. Se generan mediante transformación plantas de soya con las construcciones pMON anteriores integrada de manera estable en su genoma.

EJEMPLO 33 Se estudian plantas de maíz transformadas con construcciones de ADN de los ejemplos 10 y 1.

Invernadero • Se realizan dos experimentos, uno que prueba 10 eventos cspA y uno que prueba 10 eventos cspB para tolerancia a la sequía.

• Se prueban de cada evento 24 plántulas híbridas transgénicas positivas y 24 transgénicas negativas (todas las semillas derivadas de espigas híbridas segregantes). • La prueba se realiza en anaqueles en un invernadero. · El tratamiento consiste en evitar el suministro de agua y determinar el peso total de la maceta de cada maceta que contiene una planta. Las macetas completamente irrigadas con un peso de aproximadamente 1000 gramos cada una y se suspende el suministro de agua hasta que el peso de cada maceta es de 400 gramos, después las macetas se mantienen en ese peso durante el resto del tratamiento. • Durante el tratamiento, se determina la altura de las plantas al medir la distancia desde la superficie del suelo en la maceta hasta la punta de la hoja "más alta". A partir de estas mediciones se determina la LER (tasa de extensión de hoja) al comparar las alturas a intervalos entre mediciones. * Se realizan comparaciones de LER durante la sequía entre las plantas transgénicas negativas y transgénicas positivas dentro de un evento. • Para tres de diez eventos probados, las plantas transgénicas cspA mejoran de manera significativa (p<0.10) para LER durante el tratamiento. · Para tres de diez eventos probados, las plantas transgénicas cspB mejoran de manera significativa (p<0.10) para LER durante el tratamiento Eficacia en el campo • Se realizan tres experimentos utilizando semillas híbridas, uno que prueba 16 eventos cspB (CA); uno que prueba 21 eventos cspB (KS) y uno que prueba 14 eventos cspA (Hl) para tolerancia a la sequía durante la etapa vegetativa tardía del crecimiento. • Para los ensayos CA y Hl, las hileras que contienen ~ 34 plantas, que se segregan para presencia del transgen, están presentes en seis y cuatro duplicados, respectivamente. Las hileras segregantes se derivan de espigas segregantes. · Para KS, las hileras experimentales contienen ~ 34 plantas; hileras pariadas transgénica y no transgénica, con seis duplicados. • El tratamiento consiste en reducir el suministro de agua durante diez días, durante la fase vegetativa tardía de crecimiento (suministrando una cantidad pequeña según se requiera para mantener plantas viables). Al final del período de diez días las plantas se irrigan bien nuevamente hasta la cosecha. • Durante el tratamiento se miden numerosos fenotipos que incluyen LER, clorofila (por un medidor SPAD) y velocidad de fotosíntesis. Después del tratamiento los fenotipos adicionales medidos incluyen: días para la dispersión de polinización y surgimiento de maduración y componentes de las espigas tales como granos/espiga, espigas con granos, peso del grano y rendimiento.

• Se realizan comparaciones de fenotipo entre las plantas transgénícas positivas y negativas dentro de un evento y a través de la construcción. • En el ensayo CA, las plantas transgénícas positivas cspB como una construcción (a través de todos los eventos para rasgos vegetativos y a través de seis "mejores" eventos para rasgos reproductivos), mejoraron de manera significativa (p<0.10) para LER, temperatura de hoja y granos/espigas durante después de tratamiento con sequía. • En el ensayo CA, los eventos individuales mejoraron de manera significativa (p<0.10) para LER, longitud promedio de la espiga, masa de granos/espiga, conductancia del estomato y días para la maduración durante o después del tratamiento con sequía. • En el ensayo KS, las plantas transgénícas positivas de cspB como una construcción (a través de todos los eventos para los rasgos vegetativos y a través de los seis "mejores" eventos para los rasgos reproductivos), mejoraron de manera significativa (p<0.10) para LER, espigas con granos/hilera, granos/espiga, granos/planta, peso de la cubierta y rendimiento. • En el ensayo KS, los eventos individuales mejoraron de manera significativa (p<0.10) para LER, tasa de fotosíntesis, conductancia del estomato, espiga/hilera y granos/planta.

• En el ensayo Hl tres eventos mejoraron de manera significativa (p<0.10) para LER (el contenido de clorofila II es el único fenotipo adicional medido en Hl).

Resúmenes de los resultados CA v KS: Resumen de los resultados de eficacia de campo para el sitio cspB - KS 1. El diseño de campo, la uniformidad de sitio y ejecución de el plantado y el muestreado fueron todos consistentes con un experimento de alta calidad capaz de generar conjuntos de datos informativos. 2. Se aplicó un tratamiento con una cantidad limitada de agua de manera tal que resultara en impacto de tratamiento en todos los fenotipos medidos, particularmente LER, clorofila y tasas de fotosíntesis. 3. Los impactos del tratamiento sobre los fenotipos vegetativos y reproductivo son suficientes para que sean estadísticamente verdaderos y permitan que se observen mejoras mediadas por el transgen a niveles estadísticamente significativos. 4. Uno o más eventos mejoraron estadísticamente en plantas que contienen el transgen para LER, clorofila, tasa de fotosíntesis, conductancia del estomato, temperatura de las hojas, día de dispersión del polen, días para maduración, intervalo de maduración de las anteras, espigas/campo, granos/espiga, granos/planta, peso de la cubierta y rendimiento calculado. 5. Se observa una mejoría estadística a nivel de construcción a p<0.10 en el tratamiento seco para LER, espigas/campo, granos/espiga, granos/planta, peso de la cubierta y rendimiento calculado, y para LER en el tratamiento en húmedo.

CUADRO 20 Evento Tratamiento Fenotipo mejorado Valor P Construcción Seco LER (T1 -T0) 0.009 Seco LER (T2-T0) 0.009 Seco LER (T2-T1 ) 0.096 Seco Conductancia del estomato 0.150 Seco Fotosíntesis 0.141 Seco Espigas/campo 0.012 Seco Granos/espiga 0.062 Seco Granos/planta] 0.006 Seco Peso de la cubierta 0.009 Seco Rendimiento calculado 0.008 Húmedo LER (T2-T ) 0.025 Húmedo Clorofila (-) 0.062 Húmedo Espigas/campo (-) 0.185 Húmedo Granos/espiga (-) 0.121 Húmedo Granos/planta (-) 0.083 Húmedo Peso de la cubierta (-) 0.132 Húmedo Rendimiento calculado (-) 0.101 ZM_M38835 Seco LER (T1-T0) 0.008 Seco Fotosíntesis 0.066 Seco Conductancia del estomato 0.064 Seco Transpiración 0.126 Seco Granos/planta 0.160 Seco Peso de la cubierta 0.149 Seco Rendimiento 0.153 Húmedo LER (T1-T0) 0.099 Húmedo LER (T2-T1 ) (-) 0.026 ZM M38737 Seco Fotosíntesis 0.108 Resumen de los resultados de eficacia de campo para el sitio cspB - CS (cambio de tipo de letra) 1. El diseño de campo, la uniformidad de sitio y la ejecución de la plantación y el muestreado son todos consistentes con un experimento de alta calidad capaz de generar conjuntos de datos informativos. 2. El tratamiento con una limitación de agua se aplicó de manera tal que resultara en impactos de tratamiento sobre todos los fenotipos vegetativos utilizados, particularmente LER, clorofila y tasas de fotosíntesis, pero en todos los fenotipos reproductivos. 3. Los impactos del tratamiento sobre fenotipos (vegetativos) de interés son suficientes para que sean estadísticamente válidos y permitan que se observen mejorías mediadas por el transgen a niveles estadísticamente significativos. 4. Uno o más eventos fueron mejorados estadísticamente en las plantas que contienen el transgen para LER, clorofila, velocidad de fotosíntesis, conductancia del estomato, tempertura de las hojas, día para dispersión del polen, días para la maduración, intervalo de maduración de las anteras, granos/espiga, promedio de la longitud de la espiga y masa del grano/espiga. 5. Se observa una mejoría estadística a nivel de construcción en el tratamiento seco para LER, temperatura de la hoja, y días para dispersión del polen, y para ASI en el tratamiento en húmedo.

CUADRO 21 Evento Tratamiento Fenotipo mejorado Valor P Construcción Seco LER 0.009 Seco Temperatura de la hoja 0.027 Seco Días para dispersión del polen 0.192 Seco Granos/espiga 0.080 Seco Masa del grano/espiga 0.197 Seco Peso de prueba (lb/bu)Neg 0.084 Húmedo LER 0.157 Húmedo Días para dispersión del polen 0.098 Húmedo Longitud de la espiga promedio 0.091 Húmedo Masa de grano/espiga 0.010 Húmedo Peso de prueba (lb/bu)Neg 0.188 ZM M39583 Seco LER 0.051 Seco Granos/espiga 0.200 Húmedo Longitud de la espiga promedio 0.058 Húmedo Masa de grano/espiga 0.070 ZM M39872 Seco LER 0.159 Húmedo Días para maduración 0.024 Húmedo ASI 0.064 ZM_M40946 Seco LER 0.201 ZM M38238 Seco Días para maduración 0.176 Seco Granos/espiga 0.192 Húmedo LER 0.151 Húmedo Masa de grano/espiga 0.034 A 38244 Seco Conductancia del estomato 0.092 Seco Fotosíntesis 0.132 Seco Temperatura de la hoja 0.155 ZM_M38230 Seco Días para maduración 0.176 ZM M38721 Seco Días para maduración 0.066 Seco ASI 0.109 Húmedo Días para maduración 0.117 ZM M387 4 Húmedo Días para maduración 0.010 Húmedo ASI 0.025 ZM M40939 Seco ASI 0.109 Muchos de estos eventos han sido probados subsecuentemente para determinar mejorías en la eficiencia de germinación en frío y el crecimiento de las plántulas bajo condiciones de frío y no han probado ser eficaces. Por lo tanto, estos genes impulsados por este promotor es poco probable que funcionen en maíz para mejoramiento de la germinación en frío o crecimiento de plántulas bajo condiciones de frío, pero diferentes proimpulsores que impulsan a los mismos genes, o a proteínas de choque frío diferentes pueden funcionar en el maíz para mejorar estos fenotipos. .

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una planta caracterizada porque tiene insertado en el genoma de sus células un ADN recombinante que codifica para una proteína que comprende un dominio de choque frío en donde la expresión de la proteína confiere tolerancia a la sequía en la planta.

2. - Una planta caracterizada porque tiene insertado en el genoma de sus células un ADN recombinante que codifica para una proteína de choque frío bacteriana en donde la expresión de la proteína confiere tolerancia a la sequía en la planta.

3. - Una célula vegetal caracterizada porque tiene un ADN recombinante insertado en su genoma, en donde el ADN recombinante codifica para una proteína con un dominio en choque frío y la expresión de la proteína confiere tolerancia a la deficiencia de agua a la célula vegetal.

4. - Una célula vegetal caracterizada porque tiene un ADN recombinante insertado en su genoma, en donde el ADN recombinante codifica para una proteína de choque frío bacteriana y la expresión de la proteína confiere tolerancia a la deficiencia de agua a la célula vegetal.

5. - Una célula vegetal caracterizada porque tiene un ADN recombinante insertado en su genoma, en donde el ADN recombinante codifica para una proteína con un dominio en choque frío y la expresión de la proteína confiere tolerancia a estrés abiótlco en una planta que comprende la célula vegetal.

6. - Un método para fabricar semillas transgénicas que comprenden un ADN recombinante que codifica para una proteína que contiene un dominio de choque frío que puede ser utilizado para producir una cosecha de plantas transgénicas con tolerancia a estrés abiótico, el método está caracterizado porque comprende: (a) seleccionar una primera planta que comprende un ADN recombinante que codifica para una proteína que contiene un dominio de choque frío; (b) introducir el ADN recombinante en una segunda planta; (c) hacer crecer la semilla de la segunda planta para producir una población de plantas; (d) cribar la población de plantas en búsqueda de plantas que presenten tolerancia a estrés abiótico; (e) seleccionar de la población una o más plantas que presenten tolerancia a estrés abiótico; (f) verificar que el ADN recombinante se ha integrado de manera estable en las plantas seleccionadas; (g) determinar si la planta seleccionada expresa la proteína que contiene el dominio del choque frío; y (h) recolectar semillas de una planta seleccionada.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el ADN recombinante es homocigoto.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la tolerancia al estrés abiótico es una eficiencia mejorada al uso de agua, una eficiencia mejorada a la germinación en frío y una tolerancia mejorada a sal.

9. - Un método para producir una cosecha de campo bajo condiciones en donde el agua sería limitante para el crecimiento, el método está caracterizado porque comprende hacer crecer plantas transgénicas que tienen insertado en su genoma un ADN recombinante que codifica para una proteína que comprende un dominio de choque frío, en donde el agua se suministra en poca cantidad durante la fase vegetativa tardía de crecimiento.

10. - Una célula, planta o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína es heteróloga a la planta.

11.- Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 5-9, en donde la proteína es una proteína de choque frío, bacteriana, micótica o vegetal.

12. - Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína tiene el dominio de choque frío conservado del motivo Prosite PS00352.

13. - Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína tiene una identidad sustancial con CspB. subtilis o es un fragmento del mismo, que comprende un dominio de choque frío.

14.- Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína tiene una identidad sustancial con la proteína de choque frío de £ cotí CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH o Cspl o es un fragmento del mismo que comprende un dominio de choque frío.

15. - Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha proteína es codificada y es una proteína vegetal homologa de una proteína de choque frío bacteriano o es un fragmento de la misma que comprende un dominio de choque frío.

16. - Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la planta es una planta de maíz.

17.- Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la planta es una planta de frijol de soya.

18.- Una célula, planta o método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la planta es una planta de algodón.