BRPI0414880B1 - métodos para a fabricação de uma semente transgênica tolerante a seca e de produção de uma safra de campo sob condições nas quais água seria limitativa para crescimento - Google Patents

Abstract

"métodos para intensificação da tolerância ao estresse em plantas e composições das mesmas". tolerância aumentada a estresse abiótico em uma planta é proporcionada através de introdução de dna expressando uma proteína de choque pelo frio, por exemplo, proteína de choque pelo frio bacteriana.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA A FABRICAÇÃO DE UMA SEMENTE TRANSGÊNICA TOLERANTE A SECA E DE PRODUÇÃO DE UMA SAFRA DE CAMPO SOB CONDIÇÕES NAS QUAIS ÁGUA SERIA LIMITATIVA PARA CRESCIMENTO".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica benefício sob a 35USC § 119(e) do Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 60/506,717 depositado em 29/09/2003 e N° de Série 60/530453, depositado em 17 de dezembro de 2003. Incorporação de Listagem de Sequência Duas cópias da listagem de seqüêncía (Cópia de Listagem de Seq. 1 e Cópia de Listagem de Seq. 2) em uma forma legível em computador da listagem de sequência, todas em CD-ROMs, cada uma contendo o arquivo denominado CSP.ST25.txt, o qual tem aproximadamente 98 Mbytes (medido no MS-DOS) e foram criados em 28 de setembro de 2004, são aqui incorporadas por referência.

Campo da invenção A presente invenção refere-se a tolerância ao frio, estiagem, sal, germinação no frio, calor e outros estresses abióticos em plantas e tolerância viral, fúngica, bacteriana e outros estresses abióticos em plantas. Especificamente, a presente invenção refere-se a um método de aumento da tolerância a estresses bióticos e abióticos de plantas através de expressão de uma proteína de choque pelo frio dentro das células da referida planta. Antecedentes A produção de sementes e frutos são indústrias comerciais mul-tibilionárias e fontes primárias de recursos para vários estados nos Estados Unidos e para muitos países no mundo. Sementes comercial mente valiosas incluem, por exemplo, canola, sementes de algodão e sementes de girassol, as quais são escolhidas pelo óleo vegetal que pode ser extraído da semente. As sementes de plantas legumínosas, tais como ervilhas, feijões e lentilhas também são comercialmente valiosas, uma vez que elas são ricas em proteínas, com sojas, por exemplo, consistindo em 40-45% de proteínas e 18% de gorduras e óleos. Além disso, café é uma safra valiosa feita das sementes secas e torradas de plantas Coffea arabica enquanto que o chocolate é feito das sementes ou "grão" de cacau. Similarmente, muitos frutos e sementes são comercialmente valiosos incluindo, por exemplo, milho, arroz, trigo, cevada e outras cereais, nozes, legumes, tomates e frutas cítricas. Por exemplo, sementes de milho são transformadas em muitos artigos alimentícios ou artigos usados em cozinha, tais como cascas de taco, óleo de milho, "tortillas", flocos de milho, farinha de milho e muitos outros. O milho também é usado como matéria-prima em muitos processos de produção incluindo, mas não limitado a, produção de alimentos e etanol. A produção de sementes e frutos é limitada ínerentemente em virtude de estresses bióticos e abióticos. Soja (Glycine max), por exemplo, é uma espécie de safra que sofre de perda de germinação de semente durante armazenamento e falha em germinar quando as temperaturas do solo são frias (Zhang et al, Plant Soil 188: (1997)). Isso também é verdadeiro em milho e outras plantas de importância agronômica. O aperfeiçoamento de tolerância a estresses abióticos em plantas seria uma vantagem agronômica para produtores, permitindo aumento do crescimento e/ou germinação no frio, estiagem, enchentes, calor, estresse por UV, aumentos em ozônio, chuva ácida, poluição, estresse por sal, metais pesados, solos mineralizados e outros estresses abióticos. Estresse biótico, tal como infecção fúngica e viral, também causam grandes perdas de safra no mundo todo. A reprodução tradicional (cruzamento de alelos específicos de um genótipo em outro) tem sido usada durante séculos para aumentar a tolerância a estresses bióticos, tolerância a estresses abióticos e rendimento. A reprodução tradicional é limitada inerentemente ao número limitado de alelos presentes nas plantas originais. Isso, por sua vez, limita a quantidade de variabilidade genética que pode ser adicionada dessa maneira. Biologia molecular permitiu que os inventores da presente invenção buscassem mais e mais genes que aperfeiçoarão a tolerância ao estresse em plantas. Os inventores pensaram determinar como outros orgânicos reagem a e toleram condições estressantes. As proteínas de choque pelo frio são parte de um sistema usado por bactérias e outros organismos para sobreviver ao frio e condições estressantes. Foi postulado peios inventores que a colocação de genes que codificam as proteínas de choque pelo frio, e proteínas relacionadas às mesmas, em plantas e expressão das mesmas aumentaria a tolerância ao frio, enchente, calor, água e outros estresses abióticos de plantas, bem como tolerância a estresses bióticos fúngicos, virais e outros de plantas. Eles também acreditam que o uso de genes que são homólogos às proteínas de choque pelo frio, ou têm similaridade de sequência, também aumentaria a tolerância a estresses bióticos e abióticos. A presente invenção é útil para fazendeiros para limitar suas perdas em virtude de estresses bióticos e abióticos.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona uma planta expressando uma proteína de choque pelo frio (Csp) nas células da planta. A expressão dessa csp leva a uma maior tolerância a estresses abióticos dentro da referida planta. Em uma modalidade, um polinucleotídeo que codifica uma csp é expresso por um promotor operavelmente ligado que funciona em plantas e um terminador que funciona em plantas.

Mais especificamente, a invenção proporciona uma molécula de DNA recombinante que compreende, na direção 5' para 3', um primeiro polinucleotídeo de DNA que compreende um promotor que funciona em plantas, operavelmente ligado a um segundo polinucleotídeo de DNA que codifica uma proteína de choque pelo frio, operavelmente ligado a um polinucleotídeo de DNA de término de transcrição 3' que proporciona um sítio de polia-denilação. O primeiro polinucleotídeo de DNA é, muitas vezes, vantajosamente heterólogo ao segundo polinucleotídeo de DNA. A invenção também proporciona uma molécula de DNA recombinante tendo um íntron inserido entre o primeiro polinucleotídeo de DNA e o segundo polinucleotídeo de DNA. A invenção também proporciona uma molécula de DNA recombinante onde o segundo polinucleotídeo de DNA codifica uma proteína compreendendo o motivo em SEQ ID N°: 3. Em modalidades específicas do DNA recombinante da presente invenção, o segundo polinucleotídeo de DNA codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo em: (a) uma proteína com uma sequência de aminoácidos de identidade substancial a uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de choque pelo frio de bactérias gram-positivas, (b) uma proteína de choque pelo frio de Bacillus subtilis, (c) um homólogo de proteína de choque pelo frio B de Bacillus subtiiis (CspB), (d) uma proteína com uma seqüência de aminoácidos de identidade substancial à SEQID N°: 2, (e) uma proteína com uma seqüência de aminoácidos de identidade substancial a uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de choque pelo frio de uma bactéria gram-negativa, (f) uma proteína compreendendo uma proteína de choque pelo frio de Escherichia coli (g) um homólogo de proteína de choque pelo frio A de Escherichia coli (CspA), (h) uma proteína com uma seqüência de aminoácidos que tem identidade substancial à SEQ ID N°:1, (i) uma proteína de choque pelo frio de Agrobacterium tumefaci- ense (j) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de identidade substancial a qualquer uma de SEQ ID N0: 5, 7, 9,11,13,15,17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63 ou 65, A invenção também proporciona uma molécula de DNA recom-binante em que o promotor é selecionado do grupo consistindo em promotores induzíveis, promotores constitutivos, promotores temporal-regulados, promotores desenvolvimento-regulados, promotores tecido-preferidos, promotores intensificados pelo frio, promotores frio-específicos, promotores es-tresse-intensificados, promotores estresse-específicos, promotores estia-gem-induziveis, promotores déficit de água-induzíveis e promotores tecido-específicos. A invenção também proporciona células de planta e plantas con- tendo em seu genoma, moléculas de DNA recombinante conforme descrito e os propágulos e prole produzida a partir dos mesmos. Plantas incluem, mas não estão limitadas a, plantas de safra, monocots e dicots. Mais especificamente, essas poderíam incluir soja, milho, canola, arroz, algodão, cevada, aveia, gramado, algodão e trigo. A invenção também proporciona plantas transgênicas tolerantes a estresse abiótico que foram transformadas com uma molécula de DIMA recombinante que expressa uma proteína de choque pelo frio. Tais plantas e suas células e propágulos, tais como sementes, contêm, em seu genoma, moléculas de DNA recombinante que expressam uma proteína de choque pelo frio. Tais plantas exibem uma ou mais das seguintes propriedades intensificadas: uma maior taxa de crescimento sob condições onde a temperatura fria seria limitativa de crescimento para uma planta não-transformada da mesma espécie, (a) uma maior taxa de crescimento sob condições onde temperatura elevada seria limitativa de crescimento para uma planta não-transformada da mesma espécie, (b) uma maior taxa de crescimento sob condições onde água seria limitativa de crescimento para uma planta não-transformada da mesma espécie, (c) uma maior taxa de crescimento sob condições onde teor aumentado de sal ou íons no solo e/ou água seria limitativa de crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, (d) tem um maior percentual de plantas que sobrevivem após um choque pelo frio do que uma planta não-transformada da mesma espécie, (e) um rendimento aumentado quando comparado a uma planta não-transformada da mesma espécie ou (f) resistência à estiagem comparado a uma planta não-transformada da mesma espécie.

Um método da invenção compreende propagação de plantas da presente invenção, por exemplo, para fins de geração de sementes, simplesmente através de plantio de tais sementes no solo e permitindo que as mesmas cresçam, por exemplo, sob condições de estresse. Mais especificamente, a presente invenção proporciona um método de produção de uma planta que tem traços intensificados, tais como tolerância a estresse abióti-co, rendimento aumentado ou massa de raiz aumentada. O método compreende as etapas de: a) inserção, no genoma de uma célula ou células de planta, de uma molécula de DNA recombinante compreendendo DNA que codifica uma proteína de choque pelo frio, b) obtenção de uma célula ou células de planta transformada, c) regeneração de plantas a partir da(s) referida(s) célula(s) de planta transformada; e d) seleção de plantas as quais exibem o traço intensificado.

Em um aspecto da invenção, são selecionadas plantas as quais exibem tolerância intensificada a estresse abiótico selecionadas do grupo consistindo em tolerância ao calor, tolerância a sal, tolerância à estiagem e sobrevivência após choque pelo frio. A invenção também proporciona proteínas isoladas as quais têm pelo menos 40% de identidade a uma proteína tendo uma sequência de a-minoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQID NoS: 5, 7,9,11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57,59,61, 63 e 65. Em determinados aspectos, traços comparáveis podem ser obtidos através de substituição de uma proteína de choque pelo frio por uma proteína tendo homologia maior do que 40% de identidade, por exemplo, por uma proteína que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma proteína de choque pelo frio especificamente divulgada aqui. Da mesma forma, a presente invenção também proporciona um ácido nucléico isolado que codifica um motivo de proteína de choque pelo frio o qual se hibridiza a ácidos nucléicos com uma sequência de DNA selecionada do grupo compreendendo SEQ ID Ν°ε: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58,60,62, 90 e 92. A invenção também proporciona, especificamente, ácidos nucléi- cos isolados que codificam uma proteína de choque pelo frio a qual tem uma seqüência de DNA que é substancialmente idêntica a uma seqüência no grupo consistindo em SEQ ID N05: 5, 7, 9, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41,43, 53, 55, 57, 59,61, 63 e 65. A invenção também proporciona propágulos contendo as moléculas de DNA recombinante acima, quando eles são plantados ou, de outro modo, levados a germinar e um campo de plantas germinadas dos referidos propágulos, por exemplo, onde tais propágulos são sementes. A invenção também proporciona um método de produção de sementes compreendendo: a) plantio de uma semente de acordo com a reivindicação 59 no solo; b) colheita de sementes das referidas plantas; e da semente produzida a partir das mesmas.

Um método de produção de uma planta transgênica é também proporcionado, o método compreendendo as etapas de: (i) introdução, no genoma de uma célula de planta, de uma molécula de DNA compreendendo um polinucleotídeo de DNA pelo menos 40% homólogo a uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS: 5, 7, 9, 11, 13,15,17,19, 21, 23,25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 e 65 ou fragmento ou cis elemento da mesma, em que o referido polinucleotídeo de DNA é operavelmen-te ligado a um promotor e operavelmente ligado a um polinucleotídeo de DNA de término de transcrição 3'; e (ii) seleção da referida célula de planta transgênica; e (iii) regeneração da referida célula de planta transgênica em uma planta transgênica; também proporcionadas são as plantas feitas por meio desse método.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 mostra um mapa do plasmídio pMON57396. A Figura 2 mostra um mapa do plasmídio pMON23450. A Figura 3 mostra um mapa do plasmídio pMON57397. A Figura 4 mostra um mapa do plasmídio pMON57398. A Figura 5 mostra um mapa do plasmídio pMON23450. A Figura 6 mostra um mapa do plasmídio pMON57399. A Figura 7 mostra um mapa do plasmídio pMON48421. A Figura 8 mostra um mapa do plasmídio pMON56609. A Figura 9 mostra um mapa do plasmídio pMON56610. A Figura 10 mostra um mapa do plasmídio pMON73607. A Figura 11 mostra um mapa do plasmídio pMON61322. A Figura 12 mostra um mapa do plasmídio pMON73608. A Figura 13 mostra um mapa do plasmídio pMON65154. A Figura 14 mostra um mapa do plasmídio pMON72472. A Figura 15 mostra um mapa do plasmídio pENTRI. A Figura 16 mostra o padrão de crescimento de plantas expressando o gene e controles indicados, mostrando que os genes introduzidos proporcionam tolerância a estresse abiótico. A Figura 17 mostra um mapa do plasmídio pMON42916. A Figura 18 mostra um mapa do plasmídio pMON73983. A Figura 19 mostra um mapa do plasmídio pMON73984. Descrição Detalhada de Modalidades Específicas A presente invenção proporciona uma planta com tolerância aumentada a estresse biótico e abiótico. A planta proporcionada tem tolerância aumentada a estresse em virtude da expressão de proteína de choque pelo frio (csp) nas células da referida planta. A invenção proporciona exemplos de várias modalidades e considera outras modalidades que se espera que funcionem na invenção.

As definições e métodos a seguir são proporcionados para definir melhor a presente invenção e orientar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outro modo observado, os termos devem ser compreendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica. Por exemplo, as definições de termos comuns usados em biologia molecular e genética molecular podem ser encontradas em Lewin, Genes VII, Oxford University Press and Cell Press, New York, 2000; Buchanan et al, Biochemistry e Molecular Biology of Plants, Courier Companies, USA, 2000; Lodish et al, Molecular Cell Biology, W.H. Freeman e Co., New York, 2000. Os termos comuns em genética podem ser encontrados nas referências anteriores, bem como em Lynch et al, Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauerand Associates, Sunderland, MA, 1998; Hartwell et al, Genetics: From Genes to Genomes, McGraw-HilI Companies, Boston, MA, 2000; Hartl et al, Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Jones e Bartlett Publishers, Sudbury, MA; Strachan et al, Human Molecular Genetics, John Wiley e Sons, New York, 1999. A nomenclatura para bases de DNA conforme apresentado em 37 CFR § 1.822 é usada. A nomenclatura padrão com uma e três letras para resíduos de aminoácidos é usada.

Muitos traços agronômicos podem afetar o "rendimento". Por exemplo, esses incluiríam, sem limitação, altura da planta, número de vagens, posição da vagem sobre a planta, número de internódulos, incidência de quebra de vagens, tamanho de grão, eficácia de nodulação e fixação de nitrogênio, eficácia de assimilação de nutrientes, resistência a estresse bióti-co e abiótico, assimilação de carbono, arquitetura da planta, resistência à queda, germinação percentual de semente, vigor da muda e traços juvenis. Por exemplo, esses também incluiríam, sem limitação, eficácia de germinação (incluindo germinação em condições de estresse), taxa de crescimento de qualquer parte ou toda a planta (incluindo taxa de crescimento em condições de estresse), números de espigas, número de sementes por espiga, tamanho de semente, composição de semente (amido, óleo, proteína), características de enchimento da semente. O rendimento pode ser medido de muitas formas, essas poderíam incluir peso de teste, peso da semente, número de sementes por planta, peso de sementes por planta, número ou peso de sementes por área unitária (isto é, sementes ou peso de sementes, por acre), alqueires por acre, toneladas métricas por acre, toneladas por acre, quilo por hectare. Em uma modalidade, uma planta da presente invenção exibe um traço intensificado que é um componente de rendimento. "Ácido nucléico (sequência)" ou "polinucleotídeo (sequência)" refere-se a DNA fita simples ou dupla (ácido desoxirribonucléico) ou RNA (áci- do ribonucléico) de origem genômica ou sintética, isto é, um polímero de bases de desoxirribonucleotídeo ou bases de ribonucleotídeo, respectivamente, lidas da extremidade 5’ (a montante) para a extremidade 3’ (a jusante). O ácido nucléico pode representar a fita sentido ou complementar (anti-sentido). "Nativa" refere-se a uma seqüéncia de ácido nucléico que ocorre naturalmente ("tipo selvagem"), Seqüéncia "heteróloga” refere-se a uma sequência a qual se origina de uma fonte ou espécie estranha ou, se da mesma fonte, é modificada com relação à sua forma original. Por exemplo, um promotor nativo podería ser usado para acarretar a transcrição de um gene heterólogo da mesma ou de uma espécie diferente. "Partes" de uma planta incluem todas as partes ou pedaços de uma planta incluindo, mas não limitado a, raízes, brotos, folhas, caules, pólen, sementes, flores, estame, pistilos, embriões, ovos, pétalas, filamentos, carpelos (incluindo estigma, ovário e estilo), célula(s) ou qualquer pedaço dos acima. "Propágulo" inclui todos os produtos de melose e mitose incluindo, mas não limitado a, sementes e partes de uma planta capazes de se propagar em uma nova planta. Por exemplo, propágulo inclui um broto, raiz ou outra parte da planta que é capaz de crescer em uma planta inteira. Propágulo também inclui enxertos onde uma parte de uma planta é enxertada em outra parte de uma planta diferente (mesmo uma de uma espécie diferente) para criar um organismo vivo. Propágulo também inclui todas as plantas e sementes produzidas através de clonagem ou levando produtos meió-ticos ou permitindo que produtos meióticos sejam mantidos juntos para formar um embrião ou ovo fertilizado (naturalmente ou com intervenção humana).

Uma seqüéncia de ácido nucléico "isolada" é substanciaimente separada ou purificada de outras seqüências de ácido nucléico com as quais o ácido nucléico está normalmente associado na célula do organismo no qual o ácido nucléico ocorre naturalmente, isto é, outro DNA cromossômico ou extracromossômico. O termo abrange ácidos nucléicos que são bioquimi-camente purificados de modo a remover substancialmente ácidos nucléicos e outros componentes celulares contaminantes. O termo também abrange ácidos nucléicos recombinantes e ácidos nucléicos quimicamente sintetizados. "identidade" ou "idêntica", conforme usado aqui quando de referência a comparações entre proteína(s) ou ácido nucléico(s), significa 98% ou mais de identidade.

Uma primeira seqüência de ácido nucléico ou proteína mostra "identidade substancial" ou "similaridade substancial" a uma seqüência de ácido nucléico ou proteína de referência se, quando otimamente alinhada (com as inserções ou deleções de nucleotídeo ou aminoácido totalizando menos do que 20 por cento da seqüência de referência sobre a janela de comparação) com o outro ácido nucléico (ou sua fita complementar) ou proteína, existe pelo menos cerca de 60% de equivalência de seqüência de nu-cleotídeos, ainda melhor seria 70%, de preferência pelo menos cerca de 80% equivalência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de equivalência e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de equivalência sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nu-cleotídeos ou aminoácidos, de preferência pelo menos 50 posições de nu-cleotídeos ou aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 100 posições de nucleotídeos ou aminoácidos e ainda mais preferivelmente sobre o comprimento todo do primeiro ácido nucléico ou proteína. Alinhamento ótimo de sequências para alinhamento a uma janela de comparação pode ser conduzido através de algoritmo(s) de homologia local, de preferência através de implementações computadorizadas desses algoritmos (os quais podem ser encontrados, por exemplo, em Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl). O ácido nucléico de referência pode ser uma molécula de comprimento total ou uma parte de uma molécula maior. Alternativamente, dois ácidos nucléicos têm identidade substancial se um se hibridiza ao outro sob condições estringen-tes. Condições de hibridização apropriadas podem ser determinadas empiri- camente ou podem ser estimadas baseado, por exemplo, no teor relativo de G+C da sonda e do número de combinações errôneas entre a sonda e a se-qüência alvo, se conhecida. As condições de hibridização podem ser ajustadas conforme desejado variando, por exemplo, a temperatura de hibridização ou a concentração de sal (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Labora-tory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989).

Uma primeira sequência de ácido nucléico é "operavelmente ligada" a uma segunda sequência de ácido nucléico quando as sequências estão dispostas de modo que a primeira sequência de ácido nucléico afeta a função da segunda seqüência de ácido nucléico. De preferência, as duas sequências são parte de uma única molécula de ácido nucléico contínua e, mais preferivelmente, são adjacentes. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a um gene se o promotor regula ou media a transcrição do gene em uma célula. Por exemplo, uma região de término de transcrição (terminador) está operavelmente ligada a um gene quando o referido termi-nador leva a uma RNA polimerase terminando um transcrito contendo o referido gene ou próximo do terminador. Por exemplo, um intensificador, fre-qüentemente, não é adjacente ao promotor que está exibindo seu efeito, mas geralmente está na mesma molécula de ácido nucléico.

Um ácido nucléico ou molécula de DNA ou RNA "recombinante" é feito através de uma combinação artificial de dois ou mais segmentos distintos de uma seqüência, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Técnicas para manipulação de ácido nucléico são bem-conhecidas (veja, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989). Métodos para a síntese química de ácidos nucléicos são discutidas, por exemplo, em Beaucage e Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862,1981 e Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981. A síntese química de ácidos nucléicos pode ser realizada, por exemplo, em sintetizadores de oligonucleotídeo automáticos comerciais. "Expressão" de um gene refere-se à transcrição de um gene para produzir o mRNA correspondente e tradução desse mRNA para produzir o produto genético correspondente, isto é, um peptídeo, polipeptídeo ou prote- ína. A expressão do gene é controlada ou modulada por elementos regulató-rios, incluindo elementos regulatórios 5', tais como promotores.

Os termos "constructo de DNA recombinante", "vetor recombi-nante", "vetor de expressão" ou "cassete de expressão" referem-se a qualquer agente, tal como um plasmídio, cosmídio, vírus, BAC (cromossoma artificial bacteriano), sequência de replicação autônoma, fago ou sequência de nucleotídeos de DNA ou RNA fita simples ou fita dupla linear ou circular, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de DNA na qual uma ou mais seqüên-cias de DNA foram ligadas de uma maneira funcionalmente operativa. "Complementar" refere-se à associação natural de sequências de ácido nucléico através de emparelhamento de base. A complementaridade entre duas moléculas fita simples pode ser parcial, se apenas alguns dos pares de ácido nucléico são complementares; ou completa, se todos os pares de base são complementares. O grau de complementaridade afeta a eficácia e resistência de reações de hibridização e amplificação. "Homologia" refere-se ao nível de similaridade entre sequências de ácido nucléico ou de aminoácidos em termos de identidade ou similaridade de nucleotídeo ou aminoácidos, respectivamente, isto é, similaridade ou de identidade de seqüência, Homologia, homólogo e homóloga também se referem ao conceito de propriedades funcionais similares entre diferentes ácidos nucléicos ou proteínas. Homólogos incluem genes que são ortólogos e parólogos. Homólogos podem ser determinados através de uso da seqüência de codificação para um gene divulgada aqui ou encontrada em bancos de dados apropriados (tal como aquele no NCBI ou outros) por meio de uma ou mais das seguintes formas. Para uma seqüência de proteína, as se-qüências deverão ser comparadas usando algoritmos (por exemplo, veja seção "identidade” e "identidade substancial"). Para sequências de nucleotídeo, a seqüência de uma molécula de DNA pode ser comparada à seqüên-cia de um homólogo conhecido ou putativo da mesma forma. Homólogos são pelo menos 20% idênticos, mais preferivelmente 30%, mais preferivelmente 40%, mais preferivelmente 50% idênticos, mais preferivelmente 60%, mais preferivelmente 70%, mais preferivelmente 80%, mais preferivelmente 88%, mais preferivelmente 92%, ainda mais preferivelmente 95%, com relação a qualquer região substancial (25 nucleotídeos ou aminoácídos, mais preferivelmente 50 nucleotídeos ou aminoácidos, mais preferivelmente 100 nucleotídeos ou aminoácidos ou ainda mais preferivelmente o comprimento todo da seqüência mais curta) da molécula (molécula de DNA, RNA ou proteína).

Alternativamente, duas seqüências ou moléculas de DNA ou RNA que codificam ou podem codificar sequências de aminoácidos são homólogas ou codificam seqüências homólogas se as duas seqüências ou o complemento de uma ou ambas as seqüências se hibridiza um ao outro sob condições estringentes e exibem função similar. Assim, se é desejado determinar se duas seqüências de proteína são homólogas, pode-se realizar os procedimentos computadorizados descritos aqui e criar seqüências de codificação degeneradas de todas as seqüências de ácido nucléico possíveis que poderíam codificar as proteínas e determinar se elas poderão se hibridi-zar sob condições estringentes. Condições de estringência apropriadas as quais promovem a hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 x cloreto de só-dio/citrato de sódio (SSC) em torno de 45°C, seguido por uma lavagem com 2,0 x SSC a 50°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0 x SSC a 50°C à elevada estringência de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência em temperatura ambiente, cerca de 22°C, para condições de elevada estringência em torno de 65°C. A temperatura e sal podem ser variados ou a temperatura e a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto que outra variável é alterada. Em uma modalidade preferida, um ácido nucléico que codifica uma proteína descrita na presente invenção se hibridizará especificamente a uma ou mais das moléculas de ácido nucléico ou complementos ou fragmentos das mesmas sob condições altamente estringentes, por exemplo, em torno de 2,0 x SSC e cerca de 65°C. A hibridização da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada através de qualquer um de uma série de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, esses podendo incluir, mas não estão limitados а, rótulos fluorescentes, rótulos radioativos, rótulos baseados em anticorpo e rótulos quimioluminescentes. "Proteína(s) de choque pelo frio" (Csp(s) ou CSP(s)) são proteínas que têm mais de 40% de identidade a uma proteína CspA de Escherichia coli {SEQ ID N°: 1) ou proteína CspB de Baciilus subtilis (SEQID N°: 2) ou, alternativamente, proteínas de choque pelo frio podem ser encontradas através de uso do domínio conservado, conforme determinado na literatura. Por exemplo, conforme usado aqui, uma proteína de choque pelo frio é 40% idêntica, mais preferivelmente 50% idêntica, mais preferivelmente 60% idêntica, mais preferivelmente 70% idêntica, mais preferivelmente 80% idêntica, mais preferivelmente 90% idêntica, mais preferivelmente 95% idêntica à CspA de E. coli ou CspB de B. subtilis através do comprimento todo da CspA de E. coli ou CspB de B. subtilis. Vários bancos de dados estão disponíveis do Genbank, os quais permitem que aqueles versados na técnica determinem se uma proteína nova ou existente contém um domínio de choque pelo frio ou é uma proteína de choque pelo frio, para bancos de dados de proteínas projetados para permitir a determinação de reiações de proteínas e/ou encontrar proteínas relacionadas. Incluídas aqui dentro da definição estão todas as proteínas de choque pelo frio incluindo, mas não limitado a, CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH e Cspl (Patente Ü.S. б. 610.533) de Escherichia coli. O domínio de choque pelo frio conservado é mostrado em SEQ ID N°: 3 ([FY]-G-F-l-x(6,7)-[DER]-[UVIVl]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY]) (Prosite Motif PS00352; Buchere Bairoch, (In) ISMB-94; Proceedings 2a International Conference on Inteiligent Systems for Molecular Biology, Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D. eds., páginas 53-61, AAAIPress, Menlo Park, 1994; Hofmann et al, Nucleic Acids Res. 27: 215, 1999). Alternativamente, proteínas de choque pelo frio podem ser encontradas usando o banco de dados Sprint (um banco de dados de proteínas relacionadas) (Att-wood et al, Nucleic Acids Res. 28(1): 225, 2000; Attwood et al, Nucleic Acids Research, 30(1) em impressão, 2002). Alternativamente, proteínas de choque pelo frio podem ser encontradas usando uma descrição baseada em matriz ou Pfam. Pfam é uma grande coleção de alinhamentos de seqüências múltiplas e modelos de Markov ocultos abrangendo muitos domínios de proteína comuns (Bateman et al, Nucleic Acids Research 28:263, 2000). Até o momento de elaboração deste (Novembro de 2001; Pfam Release 6) existem 3071 famílias. Proteínas de choque pelo frio são incluídas como PF00313. As árvores de espécies mostram a distribuição de proteínas de choque pelo frio, conforme determinado no banco de dados Pfam. "Proteínas de choque pelo frio", conforme usado aqui, também incluem, mas não estão limitadas a, qualquer proteína que é encontrada em uma pesquisa, usando uma proteína de choque pelo frio como uma seqüên-cia de investigação, de um banco de dados usando a função "Blink" (Blast Link) que pode ser encontrada no National Center for Biotechnology Information. "Blink" é uma função de busca rápida usada para encontrar proteínas com seqüências similares. Essa definição de "proteína de choque pelo frio" ou "domínio de choque pelo frio" é além daquela usada acima e não substitui a referida definição. Proteínas de choque pelo frio ou proteínas contendo domínios de choque pelo frio incluem, mas não estão limitadas a, todas as proteínas atualmente conhecidas em bancos de dados públicos e privados, bem como aqueles que ainda não foram descobertos os quais são similares o bastante às proteínas reivindicadas (por exemplo, CspA de £ coii e CspB de B. subtilis) aos "hits" sob os ajustes padrão de busca pelo Blast atualmente usados no Blast Link (em 1o de novembro de 2001). No momento de elaboração deste, o Blast 2 estava sendo operado e o Blast Link ("Blink") está operando sob os parâmetros de default para buscas por proteína-proteína no Blast. No momento de elaboração deste, acreditou-se que os ajustes de default usados no Blink são como segue: uma matriz BLOSUM62 está sendo utilizada, usando o banco de dados "nr", busca CD é selecionada, assim como estatísticas baseadas em composição, com a complexidade selecionada como "baixa complexidade" esperada sendo de 10, com um tamanho de palavra de 3, os custos porgap sendo: existência, 11 e extensão, 1. A lista na Tabela I mostra os 200 primeiros hits para CspA de E. coli usando esses ajustes padrão, mas não se limitou a reivindicação aos primeiros 200 hits. Aqueles versados na técnica observarão que, sob esses critérios razoavelmente estringentes, 167 proteínas de origem bacteri-ana são encontradas, mas também 28 proteínas de Metazoan e 5 de planta. Essas proteínas incluem uma ampla faixa de proteínas que, por sua homo-logia à CspA, os presentes inventores esperam que funcionem na presente invenção. Essa não significa uma lista inclusiva e espera-se que outras proteínas funcionem na presente invenção.

Tabeía 20. Algumas proteínas de choque pelo frio e proteínas contendo um domínio de choque pelo frio encontradas através de similaridade à CspA de E. Coli. Essa lista foi compilada usando os ajustes padrão do Blast Link no National Center for Biotechnology Information. A ID no Gen-bank e nome de cada proteína são mostrados. Nota: Em virtude da forma pela qual as proteína são denominadas, algumas proteínas e seqüências terão várias entradas, como proteínas, cDNAs, alelos, etc. A ID no Genbank pode ser considerada como sendo identificadores específicos de cada entrada. Entradas estão na ordem aproximada da maior para a menor identidade em comparação à seqüência de investigação. ___ A CpsB de Baciilus subtilis (B. subtilis) é uma proteína que acumula em resposta ao choque pelo frio (Willimsky et al, Journal of Bacteriology 174:6326 (1992)}. Ela tem homologia à CspA de E.coli (veja Tabela I) e contém um domínio de ligação a ácido nucléico fita simples (Lopez et al, The Journal of Biological Chemistry 276:15511 (2001)). Usando a mesma busca básica peío Blast no NCBI (Blink), as seguintes proteínas são designadas como "hits". O número de hits mostrado aqui está limitado a 200, mas é esperado que muitas outras proteínas funcionem na invenção.

Tabela 21. Algumas proteínas de choque pelo frio e proteínas contendo domínios de choque pelo frio encontradas buscando com CspB de B. subtilis. Essa lista foi compilada usando os ajustes padrão do Blast Link no National Center for Biotechnology Information. A ID no Genbank e nome de cada proteína são mostrados. Nota: Em virtude da forma pela qual as proteína são denominadas, algumas proteínas e sequências terão várias entradas, como proteínas, cDNAs, alelos, etc. A ID no Genbank pode ser considerada como sendo identificadores específicos de cada entrada. Entradas estão na ordem aproximada da maior para a menor identidade em comparação à sequência de Investigação.___________________ CSPs são um grupo de proteínas que pode ou não ter a quantidade aumentada quando a temperatura é diminuída ou outro estresse é apli- cado. Na verdade, no melhor organismo estudado com relação às proteínas de choque pelo frio, E. coli, algumas proteínas de choque pelo frio são cons-titutivamente expressas, enquanto que outras são induzidas pelo frio, ainda outras parecem ser específicas para estresses e/ou condições ou estágios de crescimento específicos. Uma revisão disso está em Yamanaka et al, Molecular Microbiology, 27: 247 (1998). Nessa revisão, Yamanaka et al detalham como as nove proteínas de choque pelo frio em E. coli (CspA a Cspl) são expressas. CspA, CspB e CspG são induzíveis pelo frio. CspD é induzida na fase estacionária do ciclo celular e durante privação. CspC e E foram implicadas em divisão celular. A CspA é a grande proteína de choque pelo frio de Escherichia coli (E. coli) (SEQ ID N°:1). A CspA é também denominada Grande proteína de choque pelo frio 7.4. A CspA é altamente induzida em resposta ao choque pelo frio (Goldstein et al, Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87: 283 (1990)). Em algumas condições de crescimento mais lento, ribossomas são diminuídos em virtude da formação de estrutura secundária de RNA ou DNA e isso pode atuar como um sinal para a síntese aumentada de CSPs em seu organismo nativo. As CSPs se ligam a ssDNA e RNA sob condições In vitro (Phadtare et al, Molecular Microbiology 33:1004 (1999)). Acredita-se que as CSPs se ligam ao RNA de uma maneira relativamente não-específica durante tradução e impedem a formação de estrutura secundária e estabilizam o RNA (essa função é, algumas vezes, referida como uma RNA chaperona). O ribossoma pode, então, deslocar facilmente as CSPs e iniciar a tradução sobre um RNA modelo linear. Acredita-se que a presente invenção podería envolver uma função de ligação de um ácido nu-cléico fita simples dessas proteínas e essa função pode se originar de qualquer proteína de choque pelo frio ou proteína contendo um domínio de choque pelo frio, o qual inclui, por exemplo, procariotas de choque pelo frio, genes contendo Y-Box eucariotas, algumas proteínas ricas em glicina (GRP) e outras proteínas contendo o domínio de choque pelo frio. Essas proteínas incluem, mas não estão limitadas, àquelas mostradas na Figura 4, Trends in Biochemical Science, 23(8): 289 (1998) (papel incluído, aqui incorporado por referência). Essa Figura mostra claramente a relação evolucionária entre essas proteínas. A origem dessas proteínas provavelmente precede a divergência de bactérias modernas e eucariotas e foi postulado que essas proteínas podem ter estado presentes no advento da evolução de uma única célula, 3,5 bilhões de anos atrás. Foram selecionadas duas proteínas para transformar em plantas como exemplos; conforme mostrado na Figura citada acima, essas proteínas são mais grandemente divergentes umas das outras do que de muitas de suas contrapartes eucariotas. Espera-se que a expressão ectópica dessas proteínas possa melhorar a tolerância a estresses bióti-cos e abióticos os quais incluem, mas não estão limitados, ao crescimento, vigor, rendimento e saúde de plantas sob uma variedade de condições de estresse que podem incluir frio, estiagem, estresse por sal, calor, sobrevivência após choque pelo frio, infecção fúngica, infecção viral, infecção mi-crobiana e germinação no frio.

Outra possível explicação para a taxa de crescimento aumentada de plantas sob estresse podería ser a estimulação de padrões moleculares patógeno-associados (PAMP) proporcionados por meio de expressão de CSPs. Nesse modelo, uma planta desenvolvería uma resposta PAMP que estimularia uma resposta da planta um pouco semelhante à resistência sistêmica adquirida (SAR) (a maior parte da SAR funciona para estresses bióti-cos), uma vez que a planta seria "preparada" para o estresse antes de sua aplicação. Para esse modelo funcionar, uma planta deve ser sinalizada de que a CSP está presente, esse mecanismo pode ter sido recentemente proporcionado por um receptor de planta que se liga à CSP (Felix et al, Journal of Biological Chemistry 278(8): 6201-8 (2003)). Esse mecanismo também significaria que qualquer gene que se liga a um receptor o qual estimula uma resposta do tipo PAMP pode funcionar na invenção. A estimulação de respostas do tipo PAMP foi estudada, de modo geral, para estresses bióticos e, frequentemente, têm sido estimuladas através de administração de agentes exógenos. Aqui, pôde-se estimular a resposta do tipo PAMP à CSP produzida a partir do transgene de CSP. O transgene se transforma em uma célula de planta como parte de um constructo de DNA recombinante, através de uma pistola de partículas ou transformação Agrobacterium-mediada. Isso, por sua vez, criaria uma resposta do tipo resistência sistêmica adquirida em uma planta para, por sua vez, aumentar a resistência a estresse abiótico. Essa resposta podería funcionar em monocots e dicots incluindo, mas não limitado a, milho, soja, trigo, arroz, Arabidopsis, canola e algodão. Se o método acima é o modo de ação para as CSPs, então, podería ser esperado que a CSP proporcione proteção contra estresse biótico, bem como proteção contra estresse abiótico. Nenhum desses mecanismos se destina a ser limitativo e um ou ambos ou outras miríades poderiam estar envolvidos no fenótipo manifestado.

Foi proposto que a MF2, uma proteína semelhante à Csp de Bacillus thuringensis, proporciona alguma proteção contra infecção viral em uma planta. A Patente dos Estados Unidos 6.528.480 mostra essa tolerância a estresse biótico esfregando as folhas de uma planta com um extrato contendo a proteína e infectando a planta com um vírus. Eles consideram, mas não criam, plantas transgênicas na mesma. "Planta não-transformada da mesma espécie" se destina a ser inclusiva de todas as plantas da mesma espécie que a planta transformada. Em uma modalidade, a planta transformada é da mesma espécie e cepa que a planta não-transformada. Em outra modalidade, a planta é tão idêntica quanto possível à planta não-transformada. O "domínio de choque pelo frio" (CSD) é uma seqüência de proteína que é homóloga a proteínas de choque pelo frio. Para fins da presente invenção, uma proteína contendo domínio de choque pelo frio é uma "proteína de choque pelo frio". Mais de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade de aminoácidos é observada entre CspA de E. coli ou CspB de B. subtilis e as proteínas contendo domínio de choque pelo frio (Wistow, Nature 344: 823 (1990); Yamanaka et al, Mol. Micro., 27: 247, veja especificamente a Figura 1B na referência de Yamanaka; Graumann et al TÍBS 23:286).

Conforme usado aqui, "levedura" refere-se, regularmente, a Sac-charomyces cerevisiae, mas também podería incluir Schizosacchoramyces pombe e outras variedades (do gênero Pichia, por exemplo). "Milho" refere- se a Zea Mays e toda as espécies e variedades que podem ser reproduzidas com o mesmo. ''Trigo" refere-se a todas as variedades Triticum aestivum incluindo, mas não limitado a, variedades de trigo de primavera, inverno e todas as facultativas. ''Trigo'1 inclui qualquer outra espécie de trigo incluindo, mas não limitado a, trigo-duro {Triticum durum), spelt (Triticum spelta), Em-mer (Triticum dicoccum) e trigo selvagem (Triticum monococcum). "Trigo" também inclui qualquer espécie que pode ser reproduzida com qualquer uma das espécies de trigo antes mencionadas e proles dos referidos cruzamentos (incluindo triticale, um híbrido de trigo e centeio). "Sojas" refere-se a Glycine max ou Glycine soja e quaisquer espécies ou variedades que podem ser reproduzidas com as mesmas. "Arroz" refere-se a Oryza sativa e quaisquer espécies ou variedades que podem ser reproduzidas com a mesma. "Cevada" refere-se a Hordeum vulgare e quaisquer espécies ou variedades que podem ser reproduzidas com a mesma. "Aveia" refere-se a Avena sativa e quaisquer espécies ou variedades que podem ser reproduzidas com a mesma. "Canola" é um nome conjunto recentemente fornecido à semente, óleo e farinha produzidos por plantas de colza geneticamente modificadas, colza com semente oleosa (Brassica napus L.) e rabanete (B. campestris L), aqui canola inclui todas as plantas de colza e organismos que podem ser reproduzidos com as mesmas. E. coli e Escherichia coli, conforme usado aqui, incluem organismos da espécie Escherichia coli e todas as cepas desse organismo; isto é E. coli K12. E. coli e Escherichia coli, conforme usado aqui, também pode incluir qualquer organismo que pode se conjugar a qualquer cepa de E. coli quando um é uma cepa F+ ou Hfr e o outro não. B. sub-tilis e Bacillus subtilis referem-se a todos os organismos do gênero Baciilus, espécie subtilis. Agrobacterium tumefaciens, conforme usado aqui, inclui todas as cepas e tipos dessa espécie. "Capins de gramas" incluem todas as espécies e cepas de gramíneas, quer plantadas ou que poderíam ser plantadas, para produzir um gramado incluindo, mas não limitado a; um gramado, um campo para jogos (isto é, futebol, baseball ou futebol americano) e todas as áreas de curso de golfe (isto é, montículo onde se coloca a bola de golfe quando se inicia um jogo, parte lisa dos campos de golfe entre os bu- racos, terreno em volta de cada buraco no jogo de golfe, parte não-tratada de um campo de golfe, etc.). "Algodão" refere-se a todas as plantas no gênero Gossypium e todas as plantas que podem ser reproduzidas com as mesmas. 'Tolerância ao calor" significa aqui uma medida da capacidade de crescimento de uma planta sob condições onde calor ou temperatura mais quente afetaria, de modo prejudicial, o crescimento, vigor, rendimento, tamanho de uma planta da mesma espécie. Plantas tolerantes ao calor crescem melhor sob condições de estresse pelo calor do que plantas não-tolerantes ao calor da mesma espécie. "Tolerância a sal" refere-se à capacidade de algumas plantas de crescer sob estresse osmótico ou estresse causado por sais ou íons na água e solo. Por exemplo, uma planta com taxa de crescimento aumentada, comparada com uma planta da mesma espécie e/ou variedade, quando aguada com um líquido ou plantada em um meio contendo uma mistura de água e íons que afetam, de modo prejudicial, o crescimento de outra planta da mesma espécie seria referida como sendo tolerante a sal. Algumas plantas transformadas têm uma maior tolerância para esses tipos de condições do que plantas não-transformadas da mesma espécie e cepa.

Todos os números usados aqui serão modificados pelo termo "cerca de", cerca de significando que o número pode variar em qualquer direção, de até 10 por cento e ainda reter o mesmo significado. Por exemplo, uma solução a 1M inclui todas as soluções desse tipo com menos do que e incluindo 1,1 M e mais do que 0,9M. Por exemplo, um percentual pode também ser modificado, 10% sendo inclusivo de todos os percentuais de 9% a 11%. Os termos definidos pelo adjetivo "exatamente" não são definidos pelo termo "cerca de".

Uma "proteína rica em glicina" é definida como uma proteína em um eucariota que é ou tem identidade substancial com ou é um homólogo de uma proteína contendo um domínio de choque pelo frio. "Sobrevivência após choque pelo frio" é definido como a capacidade de uma planta de continuar crescendo durante um período de tempo significativo após ser colocada em uma temperatura abaixo daquela normalmente encontrada por uma planta dessa espécie nesse estágio de crescimento. Deverá ser observado que algumas plantas, mesmo aquelas da mesma espécie, foram selecionadas com relação ao crescimento sob condições de frio. A cepa de milho endógamo Wigor pode tolerar condições de frio e tem uma taxa de sobrevivência significativamente maior quando colocada nessas condições do que a maioria das linhagens comerciais vendidas nos Estados Unidos. O Wigor é vendido comercialmente em Poland. Assim, a tolerância ao frio para plantas transgênicas deve ser comparada entre plantas da mesma cepa na mesma idade relativa, bem como plantas da mesma espécie, para obter dados científicos significativos. As plantas, então, seriam armazenadas imediatamente ou alguns dias ou semanas depois para determinar sua viabilidade, taxa de crescimento e outros fenótipos após o choque. "Estiagem" ou "água sendo (imitativa de crescimento" é definido como um período de secura que, quando especialmente prolongado, pode causar dano às safras ou impedir seu crescimento com sucesso. Novamente, diferentes plantas da mesma espécie e aquelas de diferentes cepas da mesma espécie, podem ter diferentes tolerâncias à estiagem, secura e/ou falta de água. No laboratório, a estiagem pode ser simulada por fornecimento às plantas de 95% ou menos de água do que uma planta de controle e busca por diferentes medidas de vigor, crescimento, tamanho, comprimento da raiz e outras miríades fisiológicas e físicas. A estiagem pode também ser simulada no campo aguando-se algumas plantas, mas não outras, e comparação de sua taxa de crescimento, especialmente onde água é gravemente limitada para o crescimento da planta.

Tolerância a estresse abiótico inclui, mas não está limitado a, rendimento aumentado, crescimento, biomassa, saúde ou outra medida que indica tolerância a estresse, a qual inclui, mas não está limitado a, estresse pelo calor, estresse por sal, estresse pelo frio (incluindo estresse pelo frio durante germinação), estresse pela água (incluindo, mas não limitado a, estresse por estiagem), estresse por nitrogênio (incluindo elevado e baixo teor de nitrogênio).

Tolerância a estresse biótico inclui, mas não está limitado a, rendimento aumentado, crescimento, biomassa, saúde ou outra medida que indica tolerância a estresse a qual inclui, mas não está limitado a, infecção fúngica, infecção bacteriana e infecção viral de uma planta.

Determinadas seqüências genéticas descritas como parte da invenção são de origem bacteriana, por exemplo, determinadas proteínas de choque pelo frio. É conhecido por aqueles versados na técnica que genes bacterianos não-modificados são, algumas vezes, baixamente expressos em células de plantas transgênicas. O uso de códon em plantas se aproxima mais intimamente do que em seres humanos e outros organismos superiores do que organismos unicelulares, tais como bactérias. Vários relatos divulgaram métodos para melhorar a expressão de genes recombinantes em plantas. Esses relatos divulgam vários métodos para manipulação de seqüências de codificação para representar seqüências as quais são mais eficazmente traduzidas baseado em tabelas de freqüência de códon de plantas, aperfeiçoamentos na tendência de posição de base do terceiro códon, uso de seqüências recombinantes as quais evitam poliadenilação suspeita ou domínios ricos em A/T ou seqüências de consenso de união de íntrons. Embora esses métodos para construção de gene sintético sejam notáveis, os inventores consideraram a criação de genes sintéticos para proteínas de choque pelo frio ou proteínas contendo domínio de choque pelo frio de acordo com o método de Brown et al (Pat. US N° 5.689.052 1997, a qual é aqui incorporada em sua totalidade por referência) e/ou através dos métodos citados acima, bem como outros. Assim, a presente invenção proporciona um método para a preparação de genes sintéticos de planta expressando in planta um produto de proteína desejado. Resumidamente, de acordo com Brown et al, a freqüência de códons de monocotiledôneas raros e semi-raros em uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada é reduzida e substituída por códons de monocotiledôneas mais preferidos, O acúmulo intensificado de um polipeptídeo desejado codificado por uma seqüência de polinucleotídeo modificada em uma planta monocotiledônea é o resultado de aumento da freqüência de códons preferidos através de análise da seqüên- cia de codificação em seis fragmentos de nucleotídeo sucessivos e alteração da seqüência baseado na frequência de aparecimento de seis-meros para a freqüência de aparecimento de seis-meros 284, 484 e 664 mais raros em plantas monocotiledôneas. Além disso, Brown et al divulgam a expressão intensificada de um gene recombinante através de aplicação do método para redução da freqüência de códons raros, com métodos de redução da ocorrência de sinais de poiiadenilação e sítios de união de íntrons na seqüência de nucleotídeos, removendo seqüências autocomplementares na seqüência de nucleotídeos e substituindo tais seqüências por nucleotídeos não-autocomplementares, ao mesmo tempo em que mantém um gene estrutural que codifica o polipeptídeo e reduz a freqüência de ocorrência de pares de dinucleotídeos 5'-CG-3' na seqüência de nucleotídeos, Essas etapas são realizadas seqüencialmente e têm um efeito cumulativo, resultando em uma seqüência de nucleotídeos contendo uma utilização preferenciai dos códons de monocotiledôneas mais preferidos para plantas monocotiledôneas para a maioria dos aminoácidos presentes no polipeptídeo desejado. Especificamente, todas as proteínas mencionadas aqui são consideradas como sendo feitas em genes sintéticos, conforme discutido acima, ou usando métodos similares incluindo, mas não limitado a, CspA de Escherichia coli e CspB de Baciílus subtilis. O trabalho descrito aqui identificou métodos de potencialização da expressão in planta de proteínas de choque pelo frio e proteínas contendo domínios de choque pelo frio os quais podem conferir resistência a muitos estresses em planta, os quais podem incluir, mas não estão limitados a, frio, calor, estiagem, sai e outros estresses ou fenótipos relacionados a estresse (germinação no frio, sobrevivência após estresse pelo frio e outros estresses abióticos) quando ectopicamente expressas após incorporação no genoma nuclear, de plastídio ou de cloroplasto de plantas suscetíveis. A Patente U.S. 5.500.365 (especificamente incorporada aqui por referência) descreve um método para síntese de genes de planta para otimizar o nível de expressão da proteína a qual o gene sintetizado codifica. Esse método refere-se à modificação das seqüências genéticas estruturais do transgene exó- geno, para torná-lo mais "semelhante a plantas" e, portanto, mais provável de ser traduzido e expresso por uma planta, monocot ou dicot. Contudo, o método conforme divulgado na Patente U.S. 5.689.052 proporciona expressão intensificada de transgenes, de preferência em plantas monocotiledô-neas.

No desenvolvimento de constructos de ácido nucléico da presente invenção, os vários componentes do constructo ou fragmentos da mesma normalmente serão inseridos em um vetor de clonagem conveniente, por exemplo, um plasmídio que é capaz de replicação em um hospedeiro bacte-riano, por exemplo, E. coli. Existem numerosos vetores que foram descritos na literatura, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Após cada clonagem, o vetor de clonagem com o inserto desejado pode ser isolado e submetido à manipulação adicional, tal como digestão por restrição, inserção de novos fragmentos ou nucleotídeos, ligação, deleção, mutação, resecção, etc. de modo a configurar os componentes da seqüência desejada. Uma vez que o constructo tenha sido terminado, ele pode, então, ser transferido para um vetor apropriado para manipulação adicional de acordo com o modo de transformação da célula hospedeira.

Uma molécula de DNA fita dupla da presente invenção contendo, por exemplo, uma proteína de choque pelo frio em um cassete de expressão, pode ser inserida no genoma de uma planta através de qualquer método adequado. Vetores de transformação de planta adequados incluem aqueles derivados de um plasmídio Ti de Agrobacteríum tumefaciens, bem como aqueles divulgados, por exemplo, por Herrera-Estrella et al (1983), Bevan (1984), Klee et a! (1985) e publicação EPO 120.516. Além de vetores de transformação de planta derivados dos plasmídios Ti ou de raiz-indução (Ri) de Agrobacteríum, métodos alternativos podem ser usados para inserir os constructos de DNA da presente invenção em células de planta. Tais métodos podem envolver, mas não estão limitados, por exemplo, ao uso de ele-troporação de lipossomas, produtos químicos que aumentam a captação de DNA livre, distribuição de DNA livre via bombardeamento de microprojéteis e transformação usando vírus ou pólen.

Um vetor de expressão de plasmídio adequado para a introdução de um gene que codifica uma proteína de choque pelo frio ou proteína contendo um domínio de choque pelo frio em monocots usando eletropora-ção podería ser composto do seguinte: um promotor que funciona em plantas; um íntron que proporciona um sítio de união para facilitar expressão do gene, tal como o íntron Hsp70 (Publicação PCT WO 93/19189); e uma se-qüência de poliadenilação 3', tal como a seqüência 3' de nopalina sintase (NOS 3'). Esse cassete de expressão pode ser montado sobre replicons com elevado número de cópias adequados para a produção de grandes quantidades de DNA.

Um exemplo de um vetor de cassete de plasmídio Ti útil para transformação de planta é pMON17227. Esse vetor é descrito na Publicação PCT WO 92/04449 e contém um gene que codifica uma enzima que confere resistência ao glifosato (denominada CP4), a qual é um gene marcador de seleção extracelular para muitas plantas. O gene é fundido ao peptídeo de trânsito em cloroplasto EPS PS de Arabidopsis (CTP2) e expresso a partir do promotor FMV, conforme descrito na mesma. Quando um número adequado de células (ou protoplastos) contendo o gene de sedoheptulose-1,7-bisfosfatase ou cDNA é obtido, as células (ou protoplastos) são regenerados em plantas inteiras, A escolha da metodologia para a etapa de regeneração não é crítica, com protocolos adequados estando disponíveis para hospedeiros de Leguminosae (alfafa, soja, trevo, etc.), Umbelliferae (cenoura, aipo, pastinaga), Cruciferae (couve, rabanete, canola/colza, etc.), Cucurbitaceae (melões e pepinos), Gramineae (trigo, cevada, arroz, milho, etc.), Solanace-ae (batata, tabaco, tomate, pimentas), várias safras florais, tais como girassol e árvores com noz tais como amêndoas, caju, nozes e noz-pecã.

Plantas que podem ser feitas para expressar proteínas de choque pelo frio através de prática da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, Acacia, alfafa, aneth, maçã, damasco, alcachofra, arugula, aspargo, abacate, banana, cevada, feijões, beterraba, amora-preta, vacínio, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, cantaiupo, cenoura, cassava, couve-flor, aipo, cereja, cilantro, cítricas, clementines, café, milho, algodão, pepino, pinheiro de Douglas, berinjela, endiva, escarola, eucalipto, erva-doce, figo, cabaça, uva, toranja, melão, jicama, kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinho Loblolly, manga, melão, cogumelo, noz, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental, papaia, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, pinho, abacaxi, banana-da-terra, ameixa, romã, álamo, batata, abóbora-moranga, marmelo, pinho radiata, radicchio, rabanete, framboesa, arroz, centeio, sorgo, Pinho do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, batata-doce, liquidâmbar, tangerina, chá, tabaco, tomate, turfe, uma uva, melancia, trigo, fibras, abobrinha ou qualquer outra planta, "Promotor" refere-se a uma seqüência de DNA que se liga a uma RNA polimerase (e freqüentemente outros fatores de transcrição) e promove a transcrição de uma seqüência de DNA a jusante. Promotores, freqüentemente, proporcionam expressão intensificada ou reduzida em alguns tecidos quando comparado a outros. A seleção de promotores, especificamente a seleção de promotores que aumentam a expressão quando uma planta está sob estresse abiótico, poderia ser proteína útil na presente invenção.

Foi observado na técnica que algumas respostas a estresse têm efeitos similares sobre uma planta e resistência a um pode proporcionar resistência a outro. Isso é observado, por exemplo, entre as respostas à desidratação e baixa temperatura (Shinozaki et al, Current Opinions in Plant Biology 3(3): 217, 2000). Muitos outros documentos mostram a inter-relação geral entre diferentes estresses abióticos e poderíam indicar que a tolerância a um estresse poderia levar a uma maior tolerância a vários outros estresses abióticos (Pernas et al, FEBS Lett 467(2-3): 206, 2000; Knight, Int Rev Cytol 195: 269, 2000; Didierjean et al, Plant 199: 1, 1996; Jeong et al, Mol Cells 12:185,2001).

Cassetes de expressão e elementos regulatórios encontrados no segmento de DNA externo a elementos de expressão de planta contidos no T-DNA são comuns em muitas partes principais de piasmídio e funcionam como elementos de manutenção do piasmídio, esse incluindo, mas não estando limitados a, o gene aad (Spc/Str) para a resistência bacteriana à es- pectinomicina/estreptomicina, a ori pBR322 (ori322) que proporciona a origem de replicação para manutenção em E. coli, o sítio bom para a transferência conjugacional em células de Agrobacteríum tumefaciens e um segmento de DNA com oriV de 0,75 kb contendo a origem de replicação do plasmídio RK2. Além disso, aqueles plasmídios destinados à transformação em plantas contêm, freqüentemente, os elementos necessários para a integração de DNA endógeno de proteínas de Agrobacteríum que funcionam para inserir o elemento. Esses incluem bordas (bordas direita (RB) e esquerda (LB)).

Os procedimentos de laboratório na tecnologia de DNA recombi-nante usada aqui são aqueles bem-conhecidos e comumente empregados na técnica. Técnicas padrão são usadas para clonagem, isolamento de DNA e RNA, amplificação e purificação. Geralmente, reações enzimáticas envolvendo DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e semelhantes são realizadas de acordo com as especificações do fabricante. Essas técnicas e várias outras técnicas são geralmente realizadas de acordo com o Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Todas as publicações e documentos de patente publicada citados na presente especificação são incorporadas aqui por referência até o ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.

Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas que os inventores verificaram funcionar bem na prática da invenção. Contudo, aqueles versados na técnica, à luz da presente descrição, apreciarão que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas as quais são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Portanto, toda matéria apresentada ou mostrada nos desenhos e exemplos em anexo deve ser interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitativo.

Exemplos Exemplo 1. pMON57396 (Figura 1) é um vetor binário para transformação Agrobacteríum-mediada e expressão constitutiva de uma proteína (SEQ ID N°: 56) similar à CspA de Escheríchia coli em Arabidopsis. Para clonar o gene CspA de E.coli, dois iniciadores gene-específicos, MF1 e MF2, foram projetados baseado na informação de seqüência de CspA (Genbank M30139, Gl:409136) do National Center for Biotechnology Information, o qual é parte da National Library of Medicine, por sua vez parte do National Institutes de Health (NCBI). A seqüência para MF1 é AGGTAATACACCATGGCCGGTAA (SEQ ID N°: 66), a qual se anela no sítio de início de transcrição de CspA e introduz um sítio Ncoi na extremidade 5', enquanto que a seqüência do MF2 é TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT (SEQ ID N°: 67), a qual se anela no último códon do CspA e introduz um sítio EcoRI na extremidade no iniciador. PCR foi realizada para isolar CspA de E.coli. Especificamente, células DH5a de E.coli foram submetida à lise e uma pequena quantidade do lisato foi usada como um modelo para amplificar o gene CspA usando os iniciadores MF1 e MF2, Taq polimerase e dNTPs da Roche Molecular Biochemicals (In-dianapolis, IN). As condições de ciclização térmica eram como segue: 94°C, 1 min, seguido por 30 ciclos de 94°C, 16 segundos; 55°C, 1 min e 72°C, 1 min. O DNA de CspA amplificado foi purificado através de gel-eletroforese, digerido com Ncol e EcoRI e ligado a um vetor binário pMON23450 (A Figura 2) que que tinha sido anteriormente linearizado através de digestão com Ncol e EcoRI. A ligação foi realizada usando T4 ligase e seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante (BRL/Life Technologies, lnc„ Gai-thersburg, MD). A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli para propagação de piasmídio (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989). As células transformadas foram colocadas sobre meios seletivos apropriados (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989) e colônias foram classificadas horas ou dias depois. Plasmídios foram preparados a partir de colônias individuais e a seqüência de compri- mento total foi determinada. O plasmídio resultante também foi confirmado através de mapeamento por restrição (por exemplo, veja Griffiths et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6a Edição páginas 449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman e Co., New York) e seqüenciamento. Como o sítio de clonagem Ncol -EcoRI escolhido no vetor foi flanqueado por um promotor CaMV 35S a montante (5’) e um rótulo de epítopo (Flag, o qual codifica o oligopeptídeo DYKDDDK (SEQ ID N°: 68), SIGMA, St Louis) a jusante (3’), o CspA de E.coii nesse constructo é, assim, rotulado no C-término pelo rótulo de epítopo Flag e será acionado transcricionalmente pelo promotor CaMV 35S quando de transformação em Arabidopsis. A clonagem acima resulta em um plasmídio que codifica uma proteína similar à SEQ ID N°: 55. O plasmídio resultante é denominado pMON57396.

Exemplo 2. pMON57397 (Figura 2) é um vetor binário para transformação Agrobacteríum-mediada e expressão constitutiva de uma proteína (SEQ ID N°: 57), semelhante à proteína CspA de Escherichia coli em Arabidopsis. Para criar o pMON57397, o vetor binário pMON57396 contendo o gene CspA de Escherichia coli (veja exemplo acima) rotulado no C-término pelo rótulo de epítopo Flag, foi digerido com as enzimas de restrição Xhol e Sail para clivar esses sítios no vetor e liberar o rótulo de epítopo FLAG (O rótulo FLAG codifica o oligopeptídeo DYKDDDK, SIGMA, St Louis). O plasmídio lineari-zado foi, então, purificado e religado. A ligação foi realizada usando T4 liga-se e seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli para propagação de plasmídio (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989). As células transformadas foram colocadas sobre meios seletivos apropriados (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989) e colônias foram classificadas horas ou dias depois. Plasmídios foram preparados a partir de colônias individuais e a seqüência de comprimento total foi determinada. A clonagem acima re- sulta na criação de um plasmídio que codifica uma proteína similar à SEQID N°: 57. O plasmídio resultante também foi confirmado através de mapeamento por restrição para assegurar que sítios Xhol e Sall estavam ausentes (por exemplo, veja Griffiths et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6a Edição páginas 449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman e Co., New York) e seqüenciamento. O gene CspA de E. coli nesse constructo é não-rotulado no C-término e é acionado transcricionalmente pelo promotor CaMV 35S.

Exemplo 3. pMON57398 (Figura 4) é um vetor binário para transformação Agrobacterium-meólada e expressão constitutiva de uma proteína (SEQ ID N°: 59) semelhante à CspB de Baciilus subtilis em Arabidopsis. Para clonar o gene Csp de B. subtilis B, dois iniciadores gene-específicos, MF3 e MF4a, foram projetados baseado na informação de seqüência de CspB (Genbank U58859, gi:1336655) do National Center for Biotechnology Information, o qual é parte da National Líbrary of Medicine, por sua vez parte do National Institutes de Health (NCBI). A seqüência para MF3 é AGGAGGAAATTC-CATGGTAGAAG (SEQ ID N°: 69), a qual se anela no sítio de início de transcrição de CspB e introduz um sítio Ncol na extremidade 5', enquanto que a seqüência do MF4a é TCAA II IATGAATTCGCTTCTTTAGT (SEQ ID N°: 70), a qual se anela no último códon do CspB e introduz um sítio EcoRI na extremidade no iniciador. PCR foi realizada para isolar CspB de B.subtilis, Células de Bacills subtilis foram obtidas do Carolina Biological Supply (Burlington, NC), as células foram submetidas à lise e uma pequena quantidade do lisato foi usada como um modelo para amplificar o gene CspB usando os iniciadores MF3 e MF4a, Taq polimerase e dNTPs da Roche Molecular Biochemicals. As condições de ciclização térmica eram como segue: 94°C, 1 min, seguido por 30 ciclos de 94°C, 16 segundos; 55°C, 1 min e 72°C, 1 min. O DNA de CspB amplificado foi purificado através de gel-eletroforese, digerido com Ncol e EcoRI e ligado a um vetor binário pMON23450 (Figura 5) que tinha sido anteriormente linearizado através de digestão com Ncol e E- coRI. A ligação foi realizada usando T4 ligase e seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli para propa- . gação de plasmídio. As células transformadas foram colocadas sobre meios seletivos apropriados (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989) e colônias foram classificadas um dia depois. Plasmídios foram preparados a partir de colônias individuais e a seqüência de comprimento total foi determinada. O plasmídio resultante também foi confirmado através de mapeamento por restrição (por exemplo, veja Griffiths et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6a Edição, páginas 449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman e Co., New York) e seqüenciamento. Como o sítio de clonagem Ncol -EcoRI escolhido no vetor foi flanqueado por um promotor CaMV 35S a montante (5’) e um rótulo de epítopo (Flag, o qual codifica o oligopeptídeo DYKDDDK (SIGMA, St Louis) a jusante (3’), o gene CspB de B.subtilis nesse constructo é, assim, rotulado no C-término pelo rótulo de epítopo Flag e será acionado transcricionalmente pelo promotor CaMV 35S quando de transformação em Arabidopsis. Essa clonagem resulta em um plasmídio com uma seqüência que codifica uma proteína similar à SEQ ID N°: 59 sendo inserida no referido plasmídio.

Exemplo 4. pMON57399 (Figura 6) é um vetor binário para transformação Agrobacterium-mediada e expressão constitutiva de uma proteína (SEQ ID N°: 61) semelhante à CspB de Bacillus subtilis em Arabidopsis. Para criar o pMON57399, o vetor binário pMON57398 contendo o gene CspB de Bacillus subtilis (veja exemplo acima) rotulado no C-término pelo rótulo de epítopo Flag, foi digerido com as enzimas de restrição Xhol e Sall para clivar esses sítios no vetor e liberar o rótulo de epítopo FLAG (O rótulo FLAG codifica o oligopeptídeo DYKDDDK, SIGMA, St Louis). O plasmídio linearizado foi, então, purificado e religado. A ligação foi realizada usando T4 ligase e seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante (BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). A mistura de ligação foi transformada em células de £ coli para propagação de plasmídio (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spríng Harbor Press, 1989). As células transformadas foram colocadas sobre meios seletivos apropriados (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, 1989) e colônias foram classificadas horas ou dias depois. Plasmídios foram preparados a partir de colônias individuais e a sequência de comprimento total foi determinada. Essa clonagem resulta em um plasmídio com uma seqüência que codifica uma proteína similar à SEQ ID N°: 61 sendo inserida no referido plasmídio. O plasmídio resultante também foi confirmado através de mapeamento por restrição para assegurar que sítios Xhol e Sail estavam ausentes (por exemplo, veja Griffiths et al, An introduction to Genetic Analysis, 6a Edição páginas 449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman e Co., New York) e seqüenciamento. Como o sítio de clonagem Ncol -EcoRI escolhido no vetor foi flanqueado por um promotor CaMV 35S a montante (5') N-término, o gene CspB de B. subtilis nesse constructo é não-rotulado no C-término e é acionado transcricionalmente pelo promotor CaMV 35S quando de transformação em Arabidopsis. Os referidos plasmídios foram transformados em Agrobacterium tumefaciens.

Exemplo 5.

Plantas Arabidopsis podem ser transformadas através de qualquer um de muitos métodos disponíveis. Por exemplo, plantas Arabidopsis podem ser transformadas usando métodos de transformação in planta através de infiltração a vácuo (veja, Bechtold et al em Plant Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sei. Paris Sciences of Ia vie/life Sciences 316:1194-1199 (1993). Esse exemplo ilustra como plantas Arabidopsis podem ser transformadas.

Estoque de material de planta e Condições de crescimento Preparar vasos de 6,35 cm (2,5 polegadas) com solo e cobrir os mesmos com uma tela, certificando-se que o solo não esteja muito compactado e a tela esteja em contato com a superfície do solo (isso assegura que as mudas em germinação sejam capazes de crescer através da tela). Plan- tar sementes e cobrir com um domo de germinação. Vernalizar as sementes durante 3-4 dias. Crescer as plantas sob condições de 16 horas de luz I 8 horas de escuro a 20-22° C, umidade de 70%. Aguar duas vezes por semana e fertilizar a partir de baixo com 1/2 X (metade da resistência recomendada pelo fabricante) fertilizante Peters 20-20-20 (da Hummert International Earth City, MO). Adicionar micronutrientes (Elementos Traço Solúveis Hum-merfs Dyna-grain) (na resistência total recomendada pelo fabricante) a cada semana. Após cerca de uma a duas semanas, remover o domo e deixar nos vasos uma ou duas plantas por vaso. Prender o ramo primário, quando ele se desenvolve, para encorajar mais formação de ramos secundários. Em 5-7 dias, as plantas estarão prontas para infiltração.

Preparação de Agrobacterium (culturas em pequena escala e larga escala): A cepa de Agrobacterium ABI é colocada sobre uma lâmina LB contendo 100 mg/L de Espectinomicina, 100 mg/L de Estreptomicina, 25 mg/L ■ de Cloranfenicol e 50 mg/L de Canamicina (denotada SSCK). Dois dias antes de infiltração, um loop de Agrobacterium é colocado em um tubo contendo 10 mis de LB/SSCK e colocado em um agitador no escuro a 28°C para desenvolver durante a noite. No dia seguinte, a Agrobacterium é diluída a 1:50 em 400 mis de YEP/SSCK e colocada em um agitador a 28°C para dei senvolver durante 16-20 horas. (Nota: foi verificado que a taxa de transformação é significativamente melhor quando LB é usado para o primeiro desenvolvimento durante a noite e YEP é usado para a cultura em larga escala durante a noite).

Infiltração i Coletar as células de Agrobacterium entornando em uma garrafa para centrifuga de 500 ml e centrifugar a 3500 rpm durante 20-25 minutos. Entornar o sobrenadante. Secar o pélete e, então, ressuspender em 25 ml de Meio de Infiltração (Sais de Base MS: 0,5%, Vitaminas B-5 de Gamborg: 1%, Sacarose: 5%, MES: 0,5 g/L, pH de 5,7) com benzilaminopurina a 0,44 nM ) (BAP) (10 μΙ de um estoque a 1,0 mg/L em DMSO por litro) e 0,02% de Vac-In-Stuff (Silwet L-77) da Lehle Seeds (Round Rock, TX). BAP e Silwet L-77 são adicionados frescos no dia de infiltração. Adicionar 200 μΙ de Silwet L-77 e 20 μ! de BAP (0,5 mg/L de estoque). Usando Meio de Infiltração como placebo, tomar a Οϋβοο de uma diluição a 1:10 das suspensões de Agrobacterium. Calcular o volume necessário para 400 ml de suspensão de Agrobac-teriumlmeio de infiltração, OD6oo = 0,6, para a infiltração a vácuo.

Equação: (volume final) * (QD600 final) = Volume necessário para OD60Q final de 0,6 OD600 Colocar a cultura ressuspensa em um recipiente Rubbermaid dentro de um dissecador a vácuo. Inverter os vasos contendo plantas a serem infiltradas na solução de modo que a planta todas seja coberta, incluindo a roseta, mas não muito do solo sendo submerso. Embeber as plantas com água durante pelo menos 30 minutos antes de infiltração (isso mantém o solo embebido na suspensão de Agrobacterium).

Extrair um vácuo de -584,2 - 685,8 mm (~ 23-27 polegadas). Hg durante 10 min. Liberar rapidamente o vácuo. Drenar rapidamente os vasos, colocar os mesmos de lado em uma bandeja revestida com lenço, cobrir a bandeja com um domo para manter a umidade e retornar para a câmara de crescimento. No dia seguinte, descobrir os vasos, colocar os mesmos de pé e remover o lenço. Não aguar as plantas durante - 5 dias. Após 5 dias, permitir que as plantas sejam aguadas e continuem crescendo sob as mesmas condições conforme antes. (As folhas que foram infiltradas podem degenerar, mas uma planta sobreviverá até que tenha terminado a floração). Colheita e Esterilização da Semente Dar forma cônica às plantas, individualmente, através de uso do Lehle Aracons (Lehle Seeds, Round Rock, TX) aproximadamente duas semanas após infiltração. Após todas as sementes terem amadurecido e terem ajustado (-4 semanas pós-infiltração), remover as plantas da água para secar as sementes. Aproximadamente duas semanas depois, colher as sementes através de corte das ramificações abaixo do cone. Limpar as sementes através de uso de uma peneira para separar a silíqua e material de ramificação e permitir que as sementes passem. Colocar as sementes em um envelope ou em tubos cônicos de 15 ml.

Transferir a quantidade desejada de sementes para tubos cônicos de 15 ml antes de esterilização. Afrouxar a tampa dos tubos cônicos e colocar os mesmos de lado em um dissecador a vácuo com um béquer contendo 400 ml de alvejante Clorox (Clorox Company, Oakland, CA) e 4 ml de Ácido clorídrico. (Adicionar ao HCI o Clorox em um fumegador). Puxar vácuo apenas para vedar o dissecador e fechar a sucção (isto é, do modo que o dissecador ainda esteja sob vácuo, mas o vácuo não esteja sendo diretamente puxado) durante ~16 horas. Após esterilização, liberar o vácuo e colocar os tubos contendo sementes em uma chaminé estéril (manter as tampas frouxas de modo que gás ainda possa ser liberado).

Colocar (“borrifar”) as sementes sobre lâminas de seleção contendo: Sais de Base MS: 4,3 g/L, Gamborg’a B-5 (500 X): 2,0 g/L, Sacarose: 10 g/L, MES: 0,5 g/L e 8 g/L de Phytagar (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) com 250 mg/L de Carbenicilina, 100 mg/L de Cefotaxima. Os níveis de seleção serão 60 mg/L de canamicina, Glifosato a 60 μΜ ou 10 mg/L de Biala-phos.

Uma quantidade muito pequena de semente pode ser primeiro colocada em lâminas para verificar a contaminação. Se existe contaminação, reesterilizar as sementes durante ~ mais 4 horas e verificar a contaminação novamente. A segunda esterilização usualmente não é necessária, mas, algumas vezes, as sementes trazem um contaminante fúngico e esterilizações repetidas são necessárias. (A duração de esterilização geralmente é menor do que 16 horas porque taxas de germinação significativamente diminuídas começam em uma duração de esterilização de 24 horas). Vedar as lâminas com parafilme e colocar as mesmas em uma sala gelada para vemalizar durante -2-4 dias. Após as sementes serem vemalizadas, colocar em Percival com bulbos de luz fria.

Transferência oara o Solo Após 5-10 dias a ~26°C e um ciclo de luz de 16/8, os transformantes serão visíveis como plantas verdes. Após mais uma a duas semanas, as plantas terão pelo menos um conjunto de folhas verdadeiras. Transferir as plantas para o solo, cobrir com um domo de germinação e mover para uma câmara de crescimento com condições normais de desenvolvimento de Ara- bidopsis. Manter coberto até que novo crescimento seja evidente (usualmente 5-7 dias), Exemplo 6 De forma a comparar o crescimento de plantas Arabidopsis transgênicas para CspA ou CspB e não-transgênicas do tipo selvagem, o crescimento vertical foi permitido em placas de Petri estéreis: Sementes transgênicas ou do tipo selvagem foram esterilizadas em líquido usando o seguinte métodos: • 5 minutos de incubação em etanol a 70% após mistura por tur-bilhonamento • 5 minutos de incubação em 30% de Clorox (hipoclorito de sódio a 6,15%) + 0,01% de Triton X-100 após mistura porturbilhonamento • 5 lavagens consecutivas com água estéril As sementes foram plantadas sobre placas de Petri quadradas de 100 x 15 mm (Becton Dickinson -Falcon n° 35-1112), cada uma contendo 40 ml de meio de ágar feito como segue: 0,5X meio de Murashige e Skoog com macronutrientes, micronu-trientes e vitaminas (Sigma n° M5519), ajustado para um pH de 5,8 com hidróxido de amônio e contendo 1% de Phytagel (Sigma n° P8169) para suporte sólido.

Dez sementes de Arabidopsis do tipo selvagem foram colocadas em metade de uma placa de Petri, aproximadamente 1 cm da borda e uniformemente espaçadas. Isso foi feito com um Gilson P-200 Pipetteman usando pontas estéreis. Dez sementes de Arabidopsis transgênicas ao CspA ou CspB foram similarmente colocadas na outra metade da placa de Petri uniformemente espaçadas. As lâminas foram rotuladas com uma caneta de marcação para indicar qual metade continha as sementes transgênicas.

As placas de Petri foram colocadas a 4°C durante 3 dias no escuro para estratificar as sementes e, então, colocadas em um incubador Percival (modelo AR-36L) a 8°C durante 6 semanas a 24 horas de luz constante de 120 microeinsteins/metro quadrado. Ao final dessa incubação, o tamanho das rosetas de CspA e CspB foi comparado com aquela do tipo selvagem e verificou-se que eram maiores. Isso pode ser observado na Figura 16. Isso pode ser observado nas primeira, segunda e última lâminas representadas onde o ensaio acima foi usado. Na Figura 16, a terceira representação (CspB + Flag, pMON57399) mostra uma lâmina em que as plantas foram colocadas sob um ensaio de choque pelo frio similar àquele descrito abaixo.

Avaliação do vigor de uma muda em choque pelo frio de sementes de Arabidopsis thaliana transaênicas: ensaio em lâmina horizontal.

Introdução: Esse é um procedimento para avaliar a capacidade de sementes de Arabidopsis transgênicas que foram germinadas em temperaturas normais sobre meios de ágar em lâminas de Petri horizontais de continuar crescendo até um desvio para resfriamento. Em resumo, sementes de plantas de controle e sementes de plantas transgênicas de teste são esterilizadas, es-tratificadas e colocas em grades de 6 x 8 sobre metade de uma placa de Petri. A lâmina é incubada em temperatura normal em uma posição horizontal durante uma semana e, então, desviada para a temperatura de resfriamento durante mais duas semanas, mantendo-se a posição horizontal da lâmina. A área de canopia das mudas é registrada através de fotografia digital e quantificada usando um software de formação de imagem. A proporção de área de canopia total das mudas de teste para aquela das mudas de controle pode ser usada como um parâmetro quantitativo para comparar o potencial de tolerância ao frio de vários genes de interesse em linhagens de teste transgênicas.

Materiais: o seguinte admite o equipamento de capital normal disponível em um laboratório de biotecnologia padrão (autoclave. balança, haste de fluxo laminar, etc.) - Sementes de Arabidopsis: os protocolos aqui foram usados com Arabidopsis thaliana cv. Columbia, mas poderíam ser adequados para outras espécies de Arabidopsis também. - Placas de Petri: Falcon #35-1112 (100 mm quadrado x 15 mm profundidade). - Meio: Sigma M5519 = Meio de Base de Murashige & Skoog. - Phytagel (Sigma #P-8169). - garrafas de vidro de 1 litro nas quais meio de ágar para auto-dave e das quais usou-se lâminas. Foram usadas garrafas de vidro Corning com as tampas de rosca laranja. - Agitadores magnéticos e barras de agitação magnéticas. - Pipetador elétrico utilizável com pipetas de plástico de 50 ml. - Pequena caixa com luz fluorescente com lentes de ampliação de plástico para colocação em lâminas das sementes. - Pipetador P1000 Gilson (ou equivalente) e pontas estéreis. - Pipetador P200 Gilson {ou equivalente) e pontas estéreis. - Etanol a 70%, estéril. - 30% de alvejante Chlorox + 0,1 % de Tween 20 - Água desionizada filtrada estéril. - Tubos estéreis para microcentrífuga e racks para tubos. - Sala a 4°C, caixa fria ou refrigerador, de preferência escuro. - Câmara de crescimento de planta Percival a 22 graus C ou equivalente com fonte de luz de Ί50 pE/mz/s. - Câmara de crescimento de planta Percival a 8 graus C ou equivalente com fonte de luz de ~150 pE/m2/s. - Fita cirúrgica semipermeável 3M Micropore (3M n° 1530-1). - Marcador Black (Sharpie). - Aspirador a vácuo com sifão. - Balança Glassine para pesagem de papel (VWR n° 12578165). - Calculadora. - Notebook. - Computador IBM compatível. - Software Image-Pro Plus, versão 4.1.0.0 - Software Microsoft Excel.

Protocolo: 1- Transformar as sementes em alíquotas para frascos de ar- mazenamento ou envelopes para tubos estéreis para microcentrífuga. 2- Rotular os tubos com Sharpie para manter a identidade das sementes. 3- Esterilizar a superfície das sementes nos tubos através de lavagem sucessiva com as seguintes soluções e tempos de manutenção listados abaixo. Nota: inverter os tubos durante as lavagens pelo menos duas vezes para assegurar bom contato de superfície das soluções sobre as sementes. As sementes cairão para o fundo do tubo, fazendo um pélete macio: a. Etanol a 70%, estéril, durante 3 a 5 minutos b. 30% de alvejante Chlorox + 0,1% de Tween 20, durante 3 a 5 minutos c. Água desionizada filtrada estéril, durante 30 segundos d. Repetir c. mais quatro vezes e, da última vez, deixar ~ 0,5 ml de água estéril restando sobre o pélete de sementes. 1 - Colocar os tubos para microcentrífuga no escuro a 4°C durante três dias para estratificar as sementes para germinação mais uniforme quando de plantio.

[Alternativamente, as sementes podem ser diretamente colocadas sobre discos de Petri com meio de ágar, vedadas e os discos de Petri podem ser colocados a 4°C no escuro durante três dias antes da incubação a 8°C-veja abaixo.] 2- Fazer lâminas através de preparação de alíquotas de 1 litro de 0,5 X meio de Murashige e Skoog nas garrafas de vidro, ajustar o pH para 5,8 com hidróxido de amônio, então, adicionar 10 gramas de Phytagel. Usar um agitador magnético quando de ajuste do pH e misturar o Phytagel uniformemente, então, submeter à autoclave sobre ajuste líquido (exaustão lenta) durante 45 minutos. 3- Entornar lâminas na haste de fluxo laminar usando o pipeta-dor elétrico com a pipeta estéril de 50 ml para distribuir 40 ml de meio a cada lâmina, cobrindo imediatamente a lâmina com a tampa. 4- Permitir que as lâminas esfriem na haste de fluxo laminar du- rante pelo menos 2 horas com o soprador desligado e armazenar em sacos plásticos com data a 4CC. 5- Rotular as lâminas e sementes nas lâminas: 1- Vedar todas as quatro bordas da lâmina com fita Micropore semipermeável, rotular com a data e colocar as lâminas em uma incubadora Percival ajustada a 22°C e ciclo de luz do dia de 16 horas a ~ 100 μΕ/m2 s. Colocar as lâminas na posição horizontal apenas uma camada de espessura e incubar durante 7 dias. Fotografar cada lâmina com uma câmera digital e armazenar os dados em um compact disk. 2- Transferir as lâminas para uma incubadora Percival ajustada a 8°C e ciclo de luz do dia de 24 horas a ~ 100 μΕ/m2 s. Colocar as lâminas em uma posição horizontal apenas uma camada de espessura e incubar durante até mais 3 semanas. Fotografar cada lâmina com uma câmera digital e armazenar os dados em um compact disk. 3- Observar as lâminas a cada 2 a 3 dias para observar como os germplasmas de teste estão prosseguindo comparado aos controles e fotografar digitalmente em tempos que são representativos do desempenho geral dos germplasmas. Isso levaria menos do que duas semanas (3 semanas no máximo) de incubação a 8°C. Aqueles germplasmas que levam mais tempo para mostrar uma diferença precisam ser colocados em lâminas em uma menor densidade de semente para evitar superamontoamento no momento em que a fotografia digital é tirada. 4- Medir a área de canopia da roseta usando a fotografia da câmera digital e o software Image-Pro Plus. Calcular a canopia média da muda para controle e populações de teste, eliminando sementes da análise que nunca germinaram. Calcular a proporção entre a área de canopia média das mudas pós-desvio de temperatura para as mudas de controle e mudas de teste, o desvio padrão e erro padrão para conjuntos de mudas de controle e de teste. Determinar se existe uma diferença estatística entre as mudas de teste e as mudas de controle. Registrar os resultados em um notebook. 5- Descartar as lâminas e mudas em recipientes de descarte apropriados para materiais de plantas transgênicas (lixeiras cinzas com sacos de lixo plásticos transparentes).

Exemplo 7.

Os produtos de PCR dos genes de CspA e CspB foram ligados ao vetor pCR-TOPO 2.1 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os fragmentos Ncol/EcoRI dos derivados de pCR-TOPO 2.1 foram subclonados em pMON48421 (Figura 7), linearizados pelas mesmas enzimas de restrição. Os fragmentos Notl de derivados de pMON48421 abrangendo o promotor 35S, genes Csp e o terminador e9 foram subclonados no pMON42916 (Figura 17) no sítio Notl para criar o pMON56609 (Figura 8) e pMON56610 (Figura 9), os quais contêm os genes de CspA e CspB, respectivamente. Os referidos plasmídios foram transformados em Agrobacteri-um tumefaciens através de métodos conhecidos. Acredita-se que o pMON56609 contenha uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína similar à SEQ ID N°: 7. Acredita-se que o pMON56610 contenha uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína similar à SEQ ID N°: 9.

Exemplo 8.

Preparação de Agrobacterium: A cepa de Agrobacterium EHA105 é colocada sobre lâminas LB contendo 50 mg/L de Canamicina e 50 mg/L de Higromicina (denotado LB/KH). Dois dias antes de co-cultura, um loop de Agrobacterium é transferido para um tubo contendo 10 ml de LB/KH e incubado sobre um agitador no escuro a 28°C durante 24 horas. Essa cultura é diluída a 1:100 em 20 ml de LB/KH e incubada sobre um agitador no escuro a 28°C durante a noite. No dia seguinte, 1 mi de diluição a 1:2 dessa cultura é captado em um cadinho e a OD60O é tomada com LB/KH como um placebo. Calcular o volume necessário para 5 ml de suspensão de Agrobacterium com O.D de 1,0 para co-cultura.

Equação: (volume final) * (QD600 final) = Volume necessário para OD600 final de 1,0 OD600 Tomar o volume requerido da cultura de Agrobacterium em um tubo para centrífuga de 40 ml e centrifugar a 7000 rpm durante 7 minutos.

Descartar o sobrenadante e secar o pélete. Ressuspender o pélete em 5 ml de meio de co-cultura (Sais de Base CC MEDIA-MS, Sacarose: 20 g/L, Glicose: 10g/L, HCI tiamina: 0,5 mg/L, L-Prolina: 115 mg/L, 2,4-D: 2mg/L) com 20 mg/L de aceto-siringona.

Transformação de embriões de arroz: Panículos foram colhidos das variedades de arroz Nipponbare e Taipai 309 crescidas em estufa. Os panículos foram esterilizados através de imersão em um alvejante comercial a 50% durante 10 minutos, seguido por enxágue em água destilada estéril. Aos panículos foi fornecido um tratamento com álcool a 70% durante 3 minutos. As sementes foram, então, removidas dos panículos e descascadas individualmente e transferidas para um tubo Falcon contendo solução de Tween 20 a 0,1%. As sementes foram, então, tratadas com álcool a 70% na câmara de fluxo de ar laminar. Então, as sementes foram enxaguadas com água estéril. Isso foi seguido por um tratamento com alvejante a 45% durante 45 minutos. As sementes foram enxaguadas 5 vezes em água destilada estéril. Finalmente, às sementes é fornecido tratamento com cloreto mercúrico a 0,1% durante 5 minutos. As sementes foram novamente lavadas 8 vezes com água destilada estéril.

Os embriões foram excisados assepticamente das sementes estéreis na câmara de fluxo laminar e colocados sob meio de co-cultura sólido (CC MEDIA com 2 g/L de Phytagel). Gotas de 50 pL da suspensão de Agro-bacteríum foram colocadas sobre uma lâmina de Petrí estéril. 10 embriões foram transferidos para cada gota. A infecção foi permitida durante 15 minutos, A suspensão de Agrobacterium foi removida com uma ponta de pipeta estéril. Os embriões infectados foram transferidos para uma lâmina com CC MEDIA sólido fresco e mantidos no escuro durante 2 dias. No terceiro dia, os embriões foram lavados com 500 mg/L de cefotaxima. Os embriões foram, então, secos sobre papel filtro estéril e colocados sobre meio Delay (Sais de Base MS, HCI Tiamina: 1 mg/L, Glutamina: 500 mg/L, Cloreto de Magnésio: 750 mg/L, hidrolisato de caseína: 100 mg/L, Sacarose: 20 mg/L, 2,4-D: 2mg/L, Picloram: 2,2 mg/L, Cefotaxima: 250 mg/L). Os embriões são mantidos em meio Delay durante um período de 7 dias. Durante esse período, caules são formados. Os caules são transferidos para meio de seleção (meio Delay com 50 mg/L de Higromicina) e armazenados no escuro durante 10 dias. Após mais 10 dias, os caules são transferidos para meio de regeneração (Sais de Base MS, sacarose: 30 mg/L, Cinetina: 2 mg/L, NAA: 0,2 mg/L, Cefotaxima: 250 mg/L, higromicina: 25 mg/L) e mantidos no escuro durante 7 dias. Os caules são, então, transferidos para meio de regeneração fresco e movidos para um fotoperíodo de 16 horas a 30°C. Os brotos desenvolvidos sobre esses caules são transferidos para meio de enraizamento (Sais de Base MS com metade da resistência, sacarose: 15 g/L, Cefotaxima: 250 mg/L, Higromicina: 25mg/L). Os brotos enraizados são transferidos para tubos de ensaio contendo água e colocados em uma câmara úmida para endurecimento.

Plantas foram selecionadas como positivas. Isso poderia ser feito, por exemplo, usando métodos similares àqueles descritos nos Exemplos 12-14 e 26-29, incluindo métodos de reprodução descritos para criar a próxima geração de plantas transgênicas.

Exemplo 9.

Resposta ao estresse pelo frio no estágio de três folhas - plantas de arroz transgênicas ao CsdB e CspA Preparação de material de planta: Germinação: Sementes foram esterilizadas através de tratamento com cloreto mercúrico a 0,01 por cento durante 3 minutos e lavadas totalmente dez vezes em água Milique para remover os vestígios de cloreto mercúrico. Sementes esterilizadas foram deixadas embeberem água Milique durante 3 horas. As sementes embebidas foram germinadas sobre um papel filtro úmido esterilizado em uma temperatura de 30 °C e VR de 60% usando um germinador de sementes (Serwell Instruments Inc.).

Estabelecimento de mudas no estágio de três folhas: As mudas germinadas durante três dias foram transferidas para bandejas (52,5 mm (comprimento) x 26 mm (profundidade) x 5,2 mm (diâmetro)) na estufa tendo uma intensidade de luz de 800 micromoles/mt2/s. e VR de 60%. As mudas foram crescidas até o estágio de três folhas (aproximadamente durante 12 dias) em bandejas contendo solo arenoso vermelho. Solução de fertilizante foi aplicada às mudas uma vez por semana até término dos experimentos (N - 75 PPM, P - 32 PPM, K - 32 PPM, Zn - 8 PPM, Mo - 2 PPM, Cu - 0,04 PPM, B - 0,4 PPM e Fe - 3,00 PPM).

Análise de plantas CspB-R2 Protocolo: Mudas de arroz no estágio de três folhas (12 dias de idade) foram submetidas a um estresse pelo frio de 10°C durante 4 dias na presença de 100 micromoles/mt2/s. de luz e VR de 70% (câmara de crescimento Percival). Após o tratamento de estresse, as plantas foram deixadas recuperarem na estufa durante 10 dias e, no 10° dia, o crescimento foi observado para as plantas que sobreviveram e as evidências fotográficas foram registradas. Cada tratamento tinha 10 réplicas por linhagem e eles eram totalmente aleatórios.

Resultado: Entre oito linhagem diferentes testadas com relação à tolerância a estresse pelo frio, seis linhagens exibiram tolerância ao frio significativamente maior comparado ao tipo selvagem. As linhagens incluindo R2-226-6-9-3, R2-226-29-1-1, R2-257-20-2-1, R2-238-1-1-3, R2-230-4-4-2 e R2-257-3-1-3 mostraram elevada tolerância ao frio através de exame do elevado crescimento de recuperação e menor redução percentual no crescimento (sobre o controle sem estresse) comparado ao tipo selvagem (Tabe-Ia -1, lâmina 1). A linhagem R2-230-4-42 teve um desempenho extremamente bom, exibindo 100 por cento de sobrevivência e manteve bom crescimento durante recuperação (Tabela 1).

Tabela 1. Observações do crescimento em recuperação de estresse pelo frio no estágio de três folhas de linhagens R2 transgênicas ao CspB_____________ (índice: WT - tipo selvagem) Análise de plantas CspB-R3 Protocolo: Mudas no estágio de três folhas foram expostas a estresse pelo frio de 8 graus Celsius durante 1 dia na presença de 1000 mi-cromoles/mt2/s. de luz. Depois, as mudas foram deixadas recuperar a 28 graus Celsius na estufa durante 15 dias e, ao finai da recuperação, a altura da planta foi registrada.

Resultados: Oito linhagens diferentes foram testadas com relação à tolerância a estresse pelo frio e todas as oito linhagens mostraram tolerância aperfeiçoada comparado a plantas do tipo selvagem (não-transgênicas). Esses resultados confirmaram os dados de análise de R2, mostrando tolerância aperfeiçoada ao frio (Tabela 2).

Tabela 2: Observações do crescimento em recuperação de estresse pelo frio no estágio de três folhas de linhagens R3 transgênicas ao CspB_____ Análise de plantas CspA-R2 Protocolo: Mudas de arroz no estágio de três folhas (12 dias de idade) foram submetidas a um estresse pelo frio de 10°C durante 3 dias na presença de 1000 micromoles/mt2/s. e VR de 70% em uma câmara de crescimento. Após o tratamento por estresse, as plantas foram deixadas recuperar na estufa durante 15 dias e, no 15° dias, as observações de crescimento foram registradas. Cada valor é uma média de 12 observações e o experimento foi conduzido seguindo o projeto experimental totalmente aleatório (CRD).

Resultados: De sete linhagens transgênicas ao CspA independentes testadas, 6 linhagens mostraram tolerância aperfeiçoada ao frio comparado a um tipo selvagem. Nesse experimento, a altura da planta foi reduzida para próximo de 50% em plantas de controle tratadas pelo frio (WT) comparado a plantas sem estresse, em que as plantas transgênicas com gene CspA mostrando redução na altura da planta quando de tratamento pelo frio variavam de 4,5% a 22,50% entre diferentes linhagens diferentes (exceto uma linhagem onde a redução no crescimento era de 47,09%). Esses resultados sugerem que o CspA melhora a tolerância ao frio do arroz (Tabela 3).

Tabela 3: Observações de crescimento em recuperação de estresse pelo frio no estágio de três fo has de linhagens R2 transgênicas ao CspA_____________ Análise de plantas CspA-R3 Experimento I

Protocolo: Três mudas no estágio folha foram expostas a estresse pelo frio de 10 graus Celsius por 3 dias na presença de 1000 micromoles de luz. Depois, as mudas foram deixadas recuperar a 28 graus Celsius na estufa durante 30 dias e, ao final de recuperação, a altura da planta e sobrevivência percentual de mudas foram registradas. (Nesse experimento, 8 réplicas foram usadas para cada linhagem transgênica e 10 réplicas foram usadas para tipo selvagem).

Resultados: As seis linhagens transgênicas submetidas a estresse pelo frio tiveram um desempenho melhor sob estresse pelo frio do que o tipo selvagem. Esses resultados confirmaram adicionalmente os dados de análise de R2 mostrando tolerância aperfeiçoada ao frio (Tabela 4).

Tabela 4: Observações de crescimento em recuperação ao estresse pelo frio no estágio de três folhas de linhagens de arroz R3 transgênicas à CspA

Nota: A altura da planta foi registrada apenas para plantas que sobreviveram e suas médias são fornecidas acima.

Experimento II

Protocolo: Mudas no estágio de três folhas foram expostas a estresse pelo frio de 10 graus Celsius durante 1 dia na presença de 1000 micromoles de luz. Depois, as mudas foram deixadas recuperar a 28 graus Celsius na estufa durante 30 dias e, ao final da recuperação, a altura da planta e sobrevivência percentual de mudas foram registradas.

Resultados: As cinco linhagens transgênicas submetidas a estresse pelo frio obtiveram melhor desempenho sob estresse pelo frio do que o tipo selvagem. Esses resultados confirmaram adicionalmente os dados de análise de R2 mostrando tolerância aperfeiçoada ao frio (Tabela 5).

Tabela 5: Observações de crescimento em recuperação de estresse pelo frio no estágio de três folhas de linhagens de arroz R3 transgênicas à CspA

Resposta ao estresse pelo calor no estágio de três folhas Preparação de material de planta: Germinação: Sementes foram esterilizadas através de tratamento com cloreto mercúrico a 0,01 por cento durante 3 minutos e lavadas totalmente (~ dez vezes em água desionizada)para remover os vestígios de cloreto mercúrico. Sementes esterilizadas foram deixadas embeber em água Milique durante 3 horas. As sementes embebidas foram germinadas sobre um papel filtro úmido esterilizado em uma temperatura de 30°C e VR de 60% usando um germinador de sementes (Serwel! Instruments Inc.).

Estabelecimento de mudas no estágio de três folhas: As mudas germinadas durante três dias foram transferidas para bandejas (52,5 mm (comprimento) x 26 mm (profundidade) x 5,2 mm (diâmetro)) na estufa tendo uma intensidade de luz de 800 micromofes/mt2/s. e VR de 60%. As mudas foram crescidas até o estágio de três folhas (aproximadamente durante 12 dias) em bandejas contendo solo arenoso vermelho. Solução de fertilizante foi aplicada às mudas uma vez por semana até término dos experimentos (N - 75 PPM, P - 32 PPM, K - 32 PPM, Zn - 8 PPM, Mo - 2 PPM, Cu - 0,04 PPM, B - 0,4 PPM e Fe - 3,00 PPM).

Análise de plantas CspA-R2 Protocolo: Mudas de arroz no estágio de três folhas (12 dias de idade) foram submetidas a estresse pelo calor de 50°C durante 3 horas na presença de 70% de VR. Após o tratamento de estresse, as plantas foram deixadas recuperar na estufa durante 15 dias e, no 15° dia, as observações de crescimento foram registradas. Cada valor é uma média de 12 observações.

Resultados: De sete linhagens independentes transgênicas ao CspA, 6 linhagens transgênicas testadas mostraram tolerância aperfeiçoada ao calor comparado ao tipo selvagem. Nesse experimento, a altura da planta foi reduzida em mais de 50% das plantas de controle tratadas pelo calor (WT) comparado às plantas sem estresse, em que as plantas transgênicas ao gene CspA mostrando redução na altura da planta quando de tratamento pelo calor variavam de 9,5% a 35% entre diferentes linhagens independentes. Esses resultados sugerem que a CspA melhora a tolerância ao calor do arroz (Tabela 6).

Tabela 6: Observações de crescimento em recuperação de estresse pelo calor no estágio de três folhas de linhagens de arroz R2 transgênicas à Cs-JA______________________________________________ Análise de plantas CspB-R3 Protocolo: Mudas no estágio de três folhas foram expostas a estresse por temperatura elevada de 53 graus Celsius durante duas horas e, depois, as mudas foram deixadas recuperar a 28 graus Celsius na estufa durante 15 dias e, no final de recuperação, a altura da planta foi registrada.

Resultados: De oito linhagens transgênicas testadas, sete linhagens tiveram melhor desempenho sob estresse pelo calor, comparado ao tipo selvagem. Esses resultados sugerem que a CspB melhora a tolerância ao calor do arroz (Tabela 7).

Tabela 7: Observações de crescimento em recuperação de estresse pelo calor de plantas no estágio de três folhas de linhagens de arroz R3 transgê-nicas a CspB __________________________________________________________ Análise de plantas CspA-R3 Experimento I

Protocolo: Mudas no estágio de três folhas foram expostas a estresse por temperatura elevada de 53 graus Celsius durante 3 horas e, depois, as mudas foram deixadas recuperar a 28 graus Celsius na estufa durante 30 dias e, ao final de recuperação, a altura da planta foi registrada.

Resultados: Esses resultados confirmaram os dados de análise de R2 mostrando tolerância aperfeiçoada ao calor (Tabela 8).

Tabela 8: Observações de crescimento em recuperação de estresse pelo calor de plantas no estágio de três folhas de linhagens de arroz R3 transgê-nicas à CspA_______________________________________________________ Experimento II

Protocolo: Mudas no estágio de três folhas foram expostas a estresse por temperatura elevada de 50 graus Celsius durante uma hora na presença de 1000 micromoles de luz e, depois, as mudas foram deixadas recuperar a 28 graus Celsius na estufa durante 30 dias e, no final de recuperação, a altura da planta foi registrada.

Resultados: Esses resultados confirmaram os dados de análise de R2 mostrando tolerância aperfeiçoada ao calor (Tabela 9).

Tabela 9: Observações de crescimento em recuperação de estresse pelo calor de plantas no estágio de três folhas de linhagens de arroz R3 transgê-nicas à CspA______________________________________________________________ Resposta a estresse pela água Preparação de material de planta: Germinação: Sementes foram esterilizadas através de tratamento com cloreto mercúrico a 0,01 por cento durante 3 minutos e lavadas totalmente dez vezes em água desionizada para remover os vestígios de cloreto mercúrico. Sementes esterilizadas foram deixadas embeber em água Milique durante 3 horas. As sementes embebidas foram germinadas sobre um papel filtro úmido esterilizado em uma temperatura de 30°C e VR de 60% usando um germinador de sementes (Serwell Instruments Inc.).

Análise de plantas CspB-R2 Protocolo Experimental As mudas germinadas (3 dias de idade) foram transferidas para dois níveis diferentes de estresse pela água, criados em vasos de PVC contendo vermiculite, o qual é medido em termos de capacidade de campo (FC). A FC - 100% é uma condição saturada (isto é, 100 g de vermiculite requerem 350 ml de água) (Sharp et al, 1988, Plant Physiol. 87: 50 -57). Os diferentes níveis de estresse pela água (isto é, FC de 50% e FC de 25%) foram criados em vasos de PVC contendo vermiculite através da adição da quantidade requerida de água. O estado de água em diferentes níveis de estresse foi constantemente mantido, através de adição, a cada dia, da quantidade de água perdida em virtude de evaporação no decorrer do experimento. As mudas foram deixadas crescer durante 15 dias na condições de estresse pela água na estufa na presença de 800 micromoles/mt2/s. de intensidade de luz e VR de 60%. No 15° dia, o crescimento de raiz e broto foi registrado e fotografias foram tiradas. Cada tratamento tinha 10 réplicas por linhagem e eles eram totalmente aleatórios. A redução percentual no crescimento foi computada adotando a seguinte fórmula: Resultados: Quatro linhagens transgênicas ao CspB diferentes foram analisadas com relação à tolerância ao estresse pela água. Todas as linhagens transgênicas ao CspB testadas exibiram crescimento significativamente maior durante estresse comparado a plantas do tipo selvagem. As linhagens transgênicas incluindo R2-257-15-1-1, R2-238-1-1-3, R2-257-3-1-6 e R2-226-6-9-3 exibiram menos redução percentual no crescimento de raiz e broto com relação a um controle sem estresse (FC -100%). A redução no crescimento de raiz e broto nessas linhagens oscilava entre 11 a 25%, em que as plantas do tipo selvagem exibiram redução máxima no crescimento, o que está próximo de 50%. Esses resultados sugerem que CspA melhora a tolerância ao estresse pela água do arroz (Tabela -10 e Tabela -11).

Tabela 10,: Comparação de crescimento de raiz e broto ao final de estresse pela água de linhagens transgênicas ao CspB e do tipo selvagem. (índice: WT = tipo selvagem, R:S = Proporção Raiz para Broto) Tabela 11: Comparação de redução percentual no crescimento de raiz e broto de linhagens transgênicas a CspB e do tipo selvagem.___________________ Análise de plantas CspA-R2 a. Preparação de material de planta: Germinação: Sementes foram esterilizadas através de tratamento com cloreto mercúrico a 0,01 por cento durante 3 minutos e lavadas totalmente dez vezes em água Mílique para remover os vestígios de cloreto mercúrico. Sementes esterilizadas foram deixadas embeber em água Milique durante 3 horas. As sementes embebidas foram germinadas sobre um papel filtro úmido esterilizado em uma temperatura de 30 °C e VR de 60% usando um germinador de sementes (Serwell Instruments Inc.).

Estabelecimento de mudas no estágio de três folhas: As mudas germinadas durante três dias foram transferidas para bandejas (52,5 mm (comprimento) x 26 mm (profundidade) x 5,2 mm (diâmetro)) na estufa tendo uma intensidade de luz de 800 micromoles/mt2/s. e VR de 60 %. As mudas foram crescidas até o estágio de três folhas (aproximadamente durante 12 dias) em bandejas contendo solo arenoso vermelho. Solução de fertilizante foi aplicada às mudas uma vez por semana até término dos experimentos (N - 75 PPM, P - 32 PPM, K - 32 PPM, Zn - 8 PPM, Mo - 2 PPM, Cu - 0,04 PPM, B - 0,4 PPM e Fe - 3,00 PPM).

Protocolo: Mudas de um mês de idade foram submetidas a estresse pela água durante três dias na presença de 800 micromoles/ mt2/s. de luz e VR de 60% na estufa. Estresse pela água foi imposto através de privação de irrigação. Ao final de três dias, as plantas começaram a mostrar sintomas de ficarem murchas. O estresse foi aliviado através de irrigação das plantas com água e, 24 horas depois, as observações sobre o percentual de plantas mostrando sintomas de ficarem murchas foram registradas. O mínimo de 12 plantas foi mantido por linhagem por tratamento.

Resultados: De sete linhagens independentes transgênicas ao CspA testadas, 6 linhagens mostraram tolerância aperfeiçoada a estresse pela água comparado ao tipo selvagem. Sessenta e seis por cento das plantas de controle não se recuperaram de murchar após irrigação, em que o percentual de plantas transgênicas ao CspA de plantas mostrando sintomas de murchar após irrigação variava de 5% a 43% entre diferentes linhagens independentes (exceto uma linhagem onde o percentual de plantas mostrando sintomas de murchar era de 85%). Esses resultados sugerem que o CspA melhora a tolerância a estresse pela água em arroz (Tabela 12).

Tabela 12: Resposta ao estresse pela água de linhagens de arroz R2 trans-gênicas à CspA R2 .......................;..............................

Resposta a estresse por sal Análise de plantas CspB-R3 Protocolo: Mudas germinadas mudas (48 horas de idade) foram submetidas a estresse por salinidade através de transferência das mesmas para vasos de PVC com vermiculite contendo NaCI a 200 mM e crescidas durante 10 dias. Após 10 dias de estresse, as mudas foram deixadas recuperar durante 15 dias transferindo as mesmas para bandejas novas de vermiculite contendo água. A observação do crescimento, tal como altura da planta, foi registrada ao final da recuperação. Esse experimento foi conduzido na estufa seguindo o Projeto Totalmente Aleatório (CRD) e manteve oito réplicas por tratamento.

Resultados: Sete linhagens de plantas transgênicas ao CspB e do tipo selvagem foram submetidas a estresse com NaCI a 200 mM. Sob essas condições, cinco linhagens transgênicas obtiveram melhor desempenho comparado ao tipo selvagem. Esses resultados sugerem que o CspB melhora a tolerância de plantas de arroz a estresse por sal (Tabela 13).

Tabela 13: Observações de crescimento em recuperação de estresse por sal de linhagens de arroz R2 transgênicas CspA

Ensaio de estresse pela água em R3 Mudas germinadas (3 dias de idade) de quatro linhagens transgênicas a CspA independentes (1,2,3,4) e do tipo selvagem (Nipponbare -Número 5) foram submetidas a estresse pela água transferindo as mesmas para um vaso contendo vermiculite. Três níveis de regimes de água foram mantidos, tendo uma capacidade no campo de 100% (FC-100 = 3,72 ml de água/g de vermiculite), capacidade no campo de 25% (FC25 = 0,93 ml de água/g de vermiculite), capacidade no campo de 15% (FC15 = 0,558 ml / g de vermiculite). As mudas foram crescidas em diferentes regimes de água durante 30 dias na presença de 800 micromoles/mt2/s. de intensidade de luz e VR de 60% na estufa. O estado de água em diferentes níveis de estresse foi mantido constantemente através de adição, a cada dia, da quantidade de água perdida em virtude de evaporação no decorrer do experimento. Ao final do 30° dia, as plantas foram deixadas recuperar através de adição de água para manter o nível de FC100 e mantidas durante 15 dias. Durante o experimento, as observações de crescimento, tal como altura da planta (pl. ht.) ao finai de estresse (ES) e comprimento de raiz (R) broto (S) e peso seco ao fina! da recuperação, foram registradas.

Cada tratamento teve 10 réplicas por linhagens e eles foram totalmente aleatórios. . ....................

Tabela 16: Comprimento médio de broto (cm) ao final de recuperação____ Exemplo 10.

cspA

Construção de pMON736Q7 (Figura 10) 1. Vetor pMON61322 cortado com Ncol e Apal para abrir a parte principal e inserir um gene de CspA. Fragmento da parte principal isolado através de purificação em gel. 2. Gene de CspA de E. coíi amplificado por PCR a partir do vetor pMON56609 (Figura 8). Iniciadores de PCR usados à esquerda do Ncol na extremidade 5’ do gene e criados sítios Swal e Apal na extremidade 3’. 3. Fragmentos de PCR e parte principal do pMON61322 (Figura 11) ligados. Transformados em biblioteca de células DH5a eficazes. Colônias selecionadas usando Apal e Ncol para identificar clones com insertos. 4. Vetor seqüenciado para confirmar a fidelidade do gene de CspA e outras regiões selecionadas do plasmídio.

csoB

Construção de pMON736Q8 (Figura 12) 1. Vetor pMON61322 cortado com Ncol e Apal para abrir a parte principal e inserir o gene HVA1. Fragmentos da parte principal isolados através de purificação em gel. 2. Gene de CspB de Bacillus subtilis amplificado por PCR a partir do vetor pMON56610. Iniciadores de PCR usados à esquerda do Ncol na extremidade 5' do gene e criados sítios Swal e Apal na extremidade 3'. 3. Ligados PCR fragmento de PCR e parte principal do pMON61322 ligados. Transformados em biblioteca de células DH5a eficazes. Colônias selecionadas usando Apal e Ncol para identificar clones com insertos. 4. Vetor seqüenciado para confirmar o gene de CspB e outras regiões selecionadas do piasmídio.

Exemplo 11. Transformação de plantas de milho Plantas de milho podem ser transformadas através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, veja Exemplos 20-25 aqui.

Exemolo 12 Análise de plantas transgênicas com relação ao número de cópias será feita da seguinte maneira.

Tecido de folha é coletado de uma folha jovem, tão próximo da base quanto possível e de um lado da folha. As amostras são colocadas em lâminas com 96 cavidades liofilizadas durante a noite. Os tecidos são homogeneizados colocando três esferas de metal de 3 mm em cada cavidade e agitando usando tampões contendo beta-mercaptoetanol, Tris tamponado para um pH de 8, EDTA, NaCI e dodecil sulfato de sódio. A extração é realizada com acetato de potássio, seguido por cadeia leve e precipitação é realizada com isopropanol. Após centrifugação, lavagem com solução de etanol e secagem, DNA é ressuspenso em tampão de Tris-EDTA antes de análise adicional. DNA é digerido com múltiplas endonucleases de restrição e fragmentos são separados através de eletroforese em gel de agarose de não-desnaturação. DNA é desnaturado através de solução de NaOH. O gel é neutralizado em tampão de Tris contendo NaCI e blotted sobre filtros de náilon através de ação capilar. Filtros de náilon são pré-hibridizados em solução tamponada contendo DNA de esperma de salmão antes de adição das sondas apropriadas radioativas ou rotuladas com DIG. Após hibrídização, as blots são lavadas e detectadas através de exposição a um filme de auto-radiografia ou detecção de DIG com conjugados de anticorpo anti-DIG e substratos apropriados.

Exemplo 13 Foi usado o quadro de leitura aberto de comprimento total de CspA e CspB para expressão em E. coli usando os vetores (Novagen, uma afiliada da Merck KgaA, Darmstadt, Alemanha) que permite a síntese e purificação de antígeno His-rotulado. Antígeno purificado será usado para gerar anticorpos policíonais usando um fornecedor comercial, por exemplo, Strategic Biosolutions. Anticorpos produzidos serão usados para testar plantas com relação à expressão de proteínas CSP.

Exemplo 14 Avanço em linhagem de milho transgênico. Transformantes primários são gerados em germplasma, tais como MILHO DE GERMPLASMA A, MILHO DE GERMPLASMA C e MILHO DE GERMPLASMA D. Os transformantes primários são reproduzidos, bem como cruzados com plantas não-transgênicas do mesmo genótipo endógamo. Sementes de plantas reproduzidas são plantadas no campo e analisadas através do ensaio de zigo-sidade Taqman para identificar seleções homozigóticas putativas e seleções negativas. Seleções heterozigóticas putativas são cruzadas com múltiplas plantas de teste apropriadas, por exemplo, MILHO DE GERMPLASMA B e MILHO DE GERMPLASMA D. Sementes híbridas são colhidas, selecionadas e empoçadas através de seleção. Outros métodos de reprodução também podem ser empregados, por exemplo, veja exemplo 29 aqui.

Exemplo 15 Mudas receberão um tratamento que limita a água disponível para um nível subótimo, de modo que o tratamento resulta em uma resposta fenotípica mensurável. Por exemplo, esse tratamento podería tomar a forma de restrição da quantidade de água durante uma série de dias, levando a um déficit progressivo de água ou na forma de um déficit agudo através de estresse osmótico das mudas hidroponicamente ou com um tratamento com sal. Plantas transgene-positivas serão selecionadas com relação a uma resposta fenotípica aperfeiçoada ao tratamento. As respostas fenotípicas medidas podem incluir taxa de crescimento de broto ou acúmulo de peso seco durante o tratamento ou após um período de recuperação pós-tratamento, sintomas de murchar ou recuperação de sintomas de murchar e taxa de crescimento de raiz e acúmulo de peso seco. Aquelas com resposta aperfeiçoada serão levadas para um experimento de eficácia no campo. Seleções requererão que uma série de plantas transgene-positivas e transgene-negativas sejam crescidas em pequenos vasos em um ambiente controlado, tal como uma câmara de crescimento ou estufa. O número de plantas selecionadas é orientado pela variância associada aos tratamentos aplicados e fenótipos medidos.

Exemplo 16 Safras crescidas no campo receberão um tratamento que limita a água disponível para um nível subótimo, de modo que o tratamento resulta em uma resposta fenotípica mensurável. Por exemplo, esse tratamento podería tomar a forma de restrição da quantidade de água disponível às plantas durante uma série de dias, levando a um déficit progressivo de água durante o desenvolvimento vegetativo posterior ou reproduzido precoce de uma planta. Plantas transgene-positivas serão selecionadas no que se refere a uma resposta fenotípica aperfeiçoada ao tratamento com relação à plantas transgene-negativas. As respostas fenotípicas medidas podem incluir taxa de crescimento de broto durante o tratamento, sintomas de murchar das folhas, componentes de rendimento de grão e rendimento de espiga, tais como número de sementes e peso de sementes. Aqueles eventos com resposta aperfeiçoada serão levados para experimento de rendimento durante o primeiro ano. As seleções serão aplicadas em densidades típicas de plantio em dois locais em um campo seco com irrigação controlável. O número de plantas selecionadas é orientado pela variância associada aos tratamentos aplicados e fenótipos medidos.

Exemplo 17 Vários dos genes descritos serão clonados, transformados em plantas e serão fenotipificados de uma maneira similar ao seguinte (Exemplos 17-30). Por exemplo, nucleotídeos e nucleotídeos que codificam SEQ ID NQS: 4-53.

Construção do vetor de destino Um vetor de expressão de planta GATEWAY® Destination (Invi-trogen Life Technologies, Carlsbad, CA) foi construído (pMON65154, Figura 13) usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os elementos do vetor de expressão são resumidos na Tabela 17. A parte principal do plasmídiç plVION65154 compreendendo a replicação bacteriana funciona e um gene de resistência à ampicilina expresso em E. coii foi derivado do plasmídio pSK-. Os elementos de expressão em planta no pMON64154 estão disponíveis para aqueles versados na técnica e referências são proporcionadas para cada elemento na Tabela 17. Todas as referências na Tabela 17 a local referem-se às coordenadas de pares de base para cada elemento sobre o mapa do plasmídio divulgado na Figura 13. Geralmente, o pMON65154 compreende um cassete de expressão de marcador selecioná-vel compreendendo um promotor do Vírus Mosaico da Couve-Flor 35S ope-ravelmente ligado a um gene que codifica fosfotransferase II de neomicina (npfll). A região 3’ do cassete de expressão de marcador selecionável compreende a região 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefad-ens (nos), seguido 3’ pela região 3’ do gene inibidor de proteinase de batata II (pin\\). O plasmídio pMON 65154 ainda compreende um cassete de expressão em planta no qual um gene de interesse pode ser inserido usando métodos de clonagem GATEWAY®. O cassete de clonagem GATEWAY® é flanqueado 5’ por um éxon e íntron de promotor de actina 1 e flanqueado 3’ pela região 3’ do gene pin\\ de batata. Usando os métodos GATEWAY®, um cassete de clonagem foi substituído por um gene de interesse. O vetor pMON65154 e derivados do mesmo compreendendo um gene de interesse eram particularmente úteis em métodos de transformação de planta via distribuição direta de DNA, tal como bombardeamento de microprojéteis. Aqueles versados na técnica saberão construir um vetor de expressão com características similares usando métodos conhecidos na técnica. Além disso, aqueles versados na técnica apreciarão que outros promotores e regiões 3' serão úteis para expressão de um gene de interesse e outros marcadores selecionáveis podem ser usados.

Tabela 17 Elementos do Plasmídio pMON65154 _______________________________ Um vetor de piasmídio (pMON72472, Figura 14) foi construído para uso em métodos de transformação de planta Agrobacterium-meáiaáos. O piasmídio pRG76 compreende o vetor de expressão do gene de planta de interesse, clonagem GATEWAY® e cassetes de expressão de marcador se-lecionável de planta presentes no pMON65154. Além disso, seqüências de borda de T-DNA direta e esquerda de Agrobacterium foram adicionadas ao piasmídio. A sequência de borda direita está localizada 5' ao promotor de actina 1 de arroz e a seqüência de borda esquerda está localizada 3' à sequência pinII 3’ situada 3’ ao gene npfll. Além disso, a parte principal pSK-do pMON65164 foi substituída pela parte principal de um piasmídio para facilitar a replicação do piasmídio em E. coli e Agrobacterium tumefaciens. A parte principal compreende uma origem de replicação de DNA de ampla faixa de hospedeiro orN funcional em Agrobacterium, a seqüência rop, uma origem de replicação de DNA pBR322 funcional em E.coli e um gene de resistência à espectinomicina/estreptomicina para seleção com relação à presença do piasmídio em £ coli e Agrobacterium.

Os elementos presentes no vetor de piasmídio pRG81 são descritos na Tabela 18.

Tabela 18. Elementos genéticos do vetor de Plasmídio pRG81________ Exemplo 18 Seqüências de codificação foram amplificadas através de PCR antes de inserção em um vetor de expressão de planta GATEWAY® Destina-tion, tal como pMON65154 (Figura 13). Todas as seqüências de codificação estavam disponíveis como uma sequência de comprimento total clonada ou como informação de seqüência de DNA, as quais permitiam amplificação da seqüência desejada a partir de uma biblioteca de cDNA. Iniciadores para amplificação por PCR foram projetados em ou próximo dos códons iniciais e terminais da seqüência de codificação de forma a eliminar a maioria das regiões não-traduzidas 5’ e 3’. Os produtos de PCR foram configurados com seqüências afíB1 e afíB2 de forma a permitir clonagem através da recombi-nação em vetores GATEWAY® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).

Dois métodos foram usados para produzir seqüências amplificadas por PCR affB flanqueadas de interesse. Ambos métodos são descritos em detalhes no GATEWAY® Cloning Technology Instruction Manual (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). No primeiro método, um único conjunto de iniciadores compreendendo affB e seqüências modelo específicas foram usadas. As seqüências de inicrador são como segue: Iniciador dianteiro affB1: 5’ GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN seqüência modelo específica 3' (SEQID N°: 71) Iniciador reverso affB2 5’ GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN seqüência modelo específica 3’ (SEQ ID N°: 72) Alternativamente, PCR adaptadora affB foi usada para preparar produtos de PCR affB fianqueados. PCR adaptadora a/fB1 usa dois conjuntos de iniciadores, isto é, iniciadores gene específicos e iniciadores para instalar a seqüência affB. Iniciadores de seqüência de DNA desejados foram projetados, os quais incluíam 12 pares de base das seqüências affB1 ou affB2 na extremidade 5’. Os iniciadores que foram usados eram como segue: Iniciador dianteiro gene afíB1 específico 5’ CCTGCAGGACCATG iniciador dianteiro gene específico 3' (SEQ ID N°: 73) Iniciador reverso gene affB2 específico 5’ CCTGCAGGCTCGAGCTA iniciador reverso gene específico 3’ (SEQ ID N°: 74) O segundo conjunto de iniciadores eram iniciadores adaptadores affB com as seguintes seqüências: Iniciador dianteiro adaptador affB1 5’ GGGGACAAGTTTGTACAAAAMGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3’ (SEQ ID N°: 75) Iniciador reverso adaptador affB2 5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA 3’ (SEQ ID N°: 76) As seqüências aííB1 e afíB2 flanqueadas foram amplificadas através de PCR de acordo com os métodos descritos pela Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Produtos de PCR af/B flanqueados foram purificados e recuperados de um gel conforme descrito acima.

Em alguns casos, seqüências aífB flanqueadas foram recuperadas a partir de PCR, mas não puderam ser inseridas no vetor Doador usando a tecnologia GATEWAY®. Métodos de clonagem convencionais usando ligases foram usados para inserir uma seqüência de DNA em um Vetor de entrada (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) quando recombinação GATEWAY® no Vetor Doador falhava. A escolha do Vetor de entrada dependia da compatibilidade dos sítios de endonucleases de restrição no Vetor de entrada e da seqüência de inserção desejada. O Vetor de entrada foi digerido com a endonuclease de restrição selecionada para remover o gene ccc/B, desfosforilada e purificada em gel. A endonuclease de restrição selecionada dependia do Vetor de entrada usado e da seqüência da seqüência de inserção desejada. Por exemplo, o gene ccdQ foi removido do pENTR11 (Figura 15) usando EcoR1 ou outras combinações de endonucleases de restrição, tais como EcoRV e Xmal ou Ncol e Xhol. Outras nucleases de restrição poderíam ser usadas com outros Vetores de entrada para uso no processo GATEWAY®. Para usar Vetores de entrada digeridos com endonuclease de restrição, foi necessário ser capaz de produzir extremidades de adesão compatíveis sobre o produto de PCR desejado. Extremidades de adesão poderíam ser produzida através de uma série de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, taí como digestão com endonuclease de restrição, ligação de adaptador ou adição de sítios de restrição durante PCR.

Em alguns casos, não foi possível produzir extremidades de adesão compatíveis sobre um fragmento de PCR e um Vetor de Entrada. Alternativamente, extremidades de adesão compatíveis poderíam ser produzidas diretamente através de digestão com enzima de restrição de um clone de cDNA. Foi possível, contudo, ligar na extremidade cega fragmentos de PCR em um Vetor de Entrada. Usando esse método, o Vetor de Entrada foi cortado com uma endonuclease de restrição para remover o gene ccc/B. Um Vetor de Entrada linear gel-purificado foi feito com extremidade cega com DNA polimerase T4. Aqueles versados na técnica estarão cientes de outros métodos de fabricação de moléculas de DNA com extremidade cega, tal como o uso de DNA polimerase Klenow. O produto de PCR foi feito com extremidade cega e, de preferência, desfosforilado através de incubação com DNA polimerase T4 ou outra polimerase adequada, quínase de polinucleotí-deo T4 e uma enzima fosfatase. O Vetor de Entrada e produto de PCR foram ligados pela extremidade cega usando métodos conhecidos na técnica. Os produtos de ligação foram transformados em E. coli e plasmídios de colônias individuais analisados com relação à presença do DNA do inserto e a orientação relativa aos sítios afl no Vetor de Entrada. Clones com a se-qüência afL1 próxima da extremidade amino do quadro de leitura aberto foram selecionados.

De preferência, o método TA de clonagem de produtos de PCR (Marchuk et al, 1991) foi usado quando produtos de PCR attB flanqueados não puderam ser inseridos em um plasmídio usando os métodos GATEWAY®. O método TA toma vantagem da atividade de transferase terminal da Taq polimerase. Um Vetor de Entrada foi cortado com uma endonuclease de restrição e a extremidade tornada cega usando os métodos descritos aqui. O Vetor de Entrada linear com extremidade cega foi incubado com dTTP e Taq polimerase, resultando na adição de um único resíduo de timidina na extremidade 3' de cada fita de DNA. Uma vez que a Taq polimerase tem uma forte preferência por dATP, os produtos de PCR são, na maioria das vezes, produzidos com uma única adenosina adicionada à extremidade 3’. Portanto, o Vetor de Entrada e produto de PCR têm saliências 3' complementares a uma única base. Após ligação sob condições conhecidas por aqueles versados na técnica, os plasmídios foram transformados em E. coli. Os plasmí-dios foram isolados de colônias individuais e analisados para identificar plasmídios com o inserto desejado na orientação correta. Alternativamente, produtos de PCR, configurados com sítios attB, foram TA-clonados em um vetor de clonagem TA comercial, tal como pGEM-T EASY (Promega Corporation, Madison, Wl).

Todos os produtos de amplificação por PCR foram seqüenciados antes de introdução em uma planta. Os insertos de PCR em vetores de expressão Destination produzidos através dos métodos GATEWAY® foram seqüenciados para confirmar que a seqüência inserida codificava a seqüência de aminoácidos esperada. Se Vetores de Entrada foram produzidos usando métodos de ligação, a seqüência inserida foi seqüenciada no Vetor de Entrada antes de produção do vetor de expressão Destination usando a tecnologia GATEWAY®. Mutações por pontos as quais não afetam a seqüência de codificação de aminoácido, isto é, mutações silenciosas, eram aceitas. Exemolo 19. Estruturação de Vetores de Expressão Métodos de clonagem GATEWAY® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) foram usados para construir vetores de expressão para uso em transformação de milho. Os métodos GATEWAY® são totalmente descritos no GATEWAY® Cloning Technology Instruction Manual (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). O uso do sistema GATEWAY® facilita a clonagem em elevado rendimento de sequências de codificação em um vetor de expressão de planta. Seqüências de gene flanqueadas por seqüên-cias attB1 e attB2 foram produzidas através de PCR conforme descrito acima. Dependendo de qual seqüência de recombinação, afíB1 e attB2, foi colocada 5’ e 3’ à seqüência de codificação, vetores de expressão sentido ou anti-sentido foram produzidos. Um vetor de expressão de planta, pMON65154 (Figura 13), no qual qualquer seqüência de codificação podería ser inserida em uma orientação sentido ou anti-sentido, foi construído conforme descrito no Exemplo 1 e foi usado como um vetor de destino no processo de clonagem GATEWAY®.

Dois processos alternativos foram usados para inserção de uma seqüéncia de codificação amplificada por PCR em um vetor de expressão de planta. Em um primeiro método, um produto de PCR compreendendo a se-qüência de codificação de interesse flanqueada por seqüências affB1 e affB2 nas extremidades 5’ e 3' foi incubado com o vetor doador (pDONR201®, Invi-trogen Life Technologies, Carlsbad, CA) na presença de BP CLONASE®. Clones de entrada no GATEWAY® foram produzidos a partir dessa reação e transformados em E. coli. DNA de plasmídio foi isolado dos clones de entrada. As seqüências de codificação inseridas puderam ser seqüenciadas a partir de Vetores de Entrada de forma a confirmar a fidelidade de amplificação por PCR. DNA de plasmídio, isolado de colônias de E. coli de clones de entrada, foi incubado com vetor de destino linearizado, de preferência pMON65154, na presença de LR CLONASE® para produzir vetores de expressão de planta compreendendo a seqüéncia de codificação de interesse. DNA da reação com LR CLONASE® foi transformado em E. coli. DNA de plasmídio de vetores de expressão Destination foi isolado e seqüenciado de forma a determinar a orientação correta e a seqüéncia de um vetor de expressão de planta.

No segundo método de geração de vetores de expressão de planta, um produto de PCR flanqueado por seqüências affB1 e attB2 foi incubado com um vetor doador (pDONR201®, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e BP CLONASE® conforme descrito acima. Após incubação, uma alíquota da mistura de reação foi ainda incubada com vetor de destino linearizado e LR CLONASE®. O DNA resultante foi transformado em E. coli e vetores de expressão de planta contendo a seqüéncia de codificação de interesse selecionada usando métodos de PCR ou Southern blot conhecidos na técnica. Ambos os métodos de produção de vetores de expressão de planta compreendendo uma seqüéncia de codificação de interesse foram descritos pela Invitrogen Life Technologies (GATEWAY® Cloning Technology Instruction Manual).

Alternativamente, vetores de entrada foram produzidos usando endonucleases de restrição e ligases. Vetores de entrada estão disponíveis da Invitrogen Life Technlogies (Carlsbad, CA). Cada vetor de entrada, por exemplo, pENTRIA, pENTR2B, pENTR3C, pENTR4 e pENTR11, tem características únicas de clonagem e expressão. O pENTR11 foi, de preferência, usado na prática da presente invenção. Aqueles versados na técnica reconhecerão a utilidade de outros Vetores de Entrada. Antes de uso de endonucleases de restrição e tigases para inserir as seqüências desejadas em um dos Vetores de Entrada, foi necessário digerir por restrição o Vetor de Entrada sobre cada lado do gene ccdB. Uma série de diferentes combinações de endonucleases de restrição foi usada, dependendo dos sítios de restrição presentes sobre a seqüência de DNA a ser inserida no Vetor de Entrada. De preferência, o Vetor de Entrada foi desfosforilado e purificado em gel após digestão por restrição. A seqüência de DNA desejada foi inserida no Vetor de Entrada usando métodos convencionais de biologia molecular conhecidos por aqueles versados na técnica. Clonagem TA (Patente US N° 5.827. 657) é um método de clonagem preferido de fragmentos de PCR em um Vetor de Entrada.

Vetores (designados como pMON e um dígito de 5 números) e seqüências de codificação contidas no mesmo que foram produzidas usando os métodos de clonagem GATEWAY® são, por exemplo, SEQ ID NoS: 4-28. Espera-se que algumas das seqüências de codificação da presente invenção possam ser clonadas em um vetor de expressão de planta usando os métodos descritos aqui.

Exemplo 20 Plantas de MILHO DE GERMPLASMA A foram crescidas na estufa. Espigas foram colhidas de plantas quando os embriões tinham 1,5 a 2,0 cm de comprimento, usualmente 10 a 15 dias após polinização e, mais fre-qüentemente, 11 a 12 dias após polinização. As espigas tiveram a superfície esterilizada através de pulverização ou embebimento das espigas em etanol a 80%, seguido por secagem a ar. Aiternativamente, as espigas tiveram a superfície esterilizada através de imersão em CLOROX® a 50% contendo 10% de SDS durante 20 minutos, seguido por três enxágües com água estéril.

Embriões imaturos foram isolados de sementes individuais usando métodos conhecidos por aqueies versados na técnica. Embriões imaturos foram cultivados sobre meio 211 (sais N6, 2% de sacarose, 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 mg/L de niacina, 1,0 mg/L de tiamina-HCI, 0,91 g/L de L-asparagina, 100 mg/L de mioinositol, 0,5 g/L de MES, 100 mg/L de hidrolisa-to de caseína, 1,6 g/L de MgCI2, 0,69 g/L de L-prolina, 2 g/L de GELGRO®, pH de 5,8) contendo 16,9 mg/L de AgNC>3, (designado meio 211V) durante 3-6 dias, de preferência 3-4 dias antes de bombardeamento de microprojétil. Exemplo 21 Métodos de transformação Agrobacterium-meàiaáa de células de milho e outras monocots são conhecidos (Hiei et al, 1997; Patente U.S. N° 5.591.616; Patente U.S. N° 5.981.840; pedido de patente publicado EP 0 672 752). Embora vários gêneros de Agrobacterium possam ser usados (veja referências acima), o gênero ABI é usado, de preferência, pelos presentes inventores. O gênero ABI de Agrobacterium é derivado do gênero A208, um gênero do tipo C58 nopalina, a partir do qual o plasmídio Ti foi eliminado através de cultura a 37°C e ainda contendo o plasmídio Ti modificado pMP90RK (Koncz e Schell, 1986). Um sistema de vetor binário de Agrobacterium tumefaciens (An et al, 1998) é, de preferência, usado para transformar milho. Vetores de plasmídio Ti de co-integração alternativos foram descritos (Rogers et al, 1988) e poderiam ser usados para transformar milho. Um vetor binário compreendendo um ou mais genes de interesse podem ser introduzidos em um gênero de Agrobacterium desarmado usando eletroporação (Wen-jun e Forde, 1989) ou equivalência triparental (Ditta et al, 1980). Um vetor binário pode conter um gene marcador selecionável, um gene marcador passível de triagem e/ou um ou mais genes que conferem um traço fenotípico desejado sobre a planta transformada. Um vetor binário exemplificativo, pMON30113, é mostrado na FIG. 4. Outros vetores binários podem ser usados e são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Antes de co-cultura de células de milho, células de Agrobacterium podem ser desenvolvidas a 28°C em meio líquido LB (DIFCO) compreendendo antibióticos apropriados para selecionar manutenção do plasmídio Ti modificado e do vetor binário. Por exemplo, ABI/pMON30113, pode ser desenvolvido em meio LB contendo 50 ug/ml de canamicina para selecionar manutenção no plasmídio Ti pMP90RK modificado e 100 ug/ml de especti-nomicina para selecionar manutenção do vetor binário pMON30113. Será óbvio para aqueles versados na técnica usar agentes de seleção apropriados para manter os plasmídios no gênero de Agrobacterium hospedeiro. Antes de inoculação de células de milho, células de Agrobacterium são desenvolvidas durante a noite em temperatura ambiente em meio AB (Chilton et al, 1974) compreendendo antibióticos apropriados para manutenção de plasmídio e aceto-siringona a 200 uM. Imediatamente antes de inoculação de células de milho, Agrobacterium é, de preferência, peletizada através de centri-fugação, lavada em meio Vt MSVI (2,2 g/L de Sais MS GIBCO (Carlsbad, CA), 2 mg/L de glicina, 0,5 g/L de niacina, 0,5 g/L de L-piridoxina-HCI, 0,1 mg/L de tiamina, 115 g/L de L-prolina, 10 g/L de D-glicose e 10 g/L de saca-rose, pH de 5,4) contendo aceto-siringona a 200 uM e ressuspensas a 0,1 a 1,0 x 109 células/ml em meio 1/2 MSPL (2,2 g/L de sais MS GIBCO (Carlsbad, CA), 2 mg/L de glicina, 0,5 g/L de niacina, 0,5 g/L de L-piridoxina-HCI, 0,1 mg/L de tiamina, 115 g/L de L-prolina, 26 g/L de D-glicose, 68,5 g/L de saca-rose, pH de 5,4) contendo aceto-siringona a 200 uM. Aqueles versados na técnica podem substituir outros meios por % MSVI ou % MSPL.

Embriões imaturos de milho são isolados conforme descrito anteriormente. Embriões são inoculados com Agrobacterium 0-7 dias após ex-cisão, de preferência imediatamente após excisão. Alternativamente, embriões imaturos podem ser cultivados durante mais de 7 dias. Por exemplo, caule embriogênico pode ser iniciado conforme descrito acima e co-cultivados com Agrobacterium. De preferência, embriões de milho imaturos são excisados, imersos em uma suspensão de Agrobacterium em meio Vi MSPL preparado conforme descrito acima e incubado em temperatura ambiente com Agrobacterium durante 5-20 minutos.

Após inoculação, os embriões são transferidos para meio MS com resistência de 1/2 (Murashige e Skoog, 1962) contendo 3,0 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1% de D-glicose, 2% de sacarose, 0,115 g/L de L-profina, 0,5 mg/L de tiamina-HCI, aceto-siringona a 200 uM e nitrato de prata ou tiossulfato de prata a 20 uM. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacteríum durante 1 a 3 dias a 23°C no escuro. Aqueles versados na técnica podem substituir outros meios pelos meios descritos.

Embriões co-cultivados são transferidos para meio 15AA (462 mg/L de (NH4)S04, 400 mg/L de KH2P04, 186 mg/L de MgS04-7H20, 166 mg/L de CaCI2-2H20, 10 mg/L de MnS04-H20, 3 mg/L de H3B03, 2 mg/L de ZnSO4-7H20,0,25 mg/L de NaMoO4-2H20,0,025 mg/L de CuSO4-5H20, 0,025 mg/L de CoCI2-6H20, 0,75 mg/L de Kl, 2,83 g/L de KN03, 0,2 mg/L de niacina, 0,1 mg/L de tiamina-HCI, 0,2 mg/L de piridoxina-HCI, 0,1 mg/L de D-biotina, 0,1 mg/L de cloreto de colina, 0,1 mg/L de pantotenato de cálcio, 0,05 mg/L de ácido fólico, 0,05 mg/L de ácido p-aminobenzóico, 0,05 mg/L de riboflavina, 0,015 mg/L de vitamina B12, 0,5 g/L de casaminoácidos, 33,5 mg/L de Na2EDTA, 1,38 g/L de L-prolina, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de D-glicose) ou meio MS contendo 1,5 mg/L de 2,4-D, 500 mg/L de carbenicilina, 3% de sacarose, 1,38 g/L de L-prolina e nitrato de prata ou tiossulfato de prata a 20 uM e cultivadas durante 0 a 8 dias no escuro a 27°C sem seleção. Meios de cultura usados durante seleção de transformantes e regeneração de plantas contêm, de preferência, 500 mg/L de carbenicilina. Aqueles versados na técnica poderão substituir outros antibióticos que controlam o crescimento de Agrobacteríum. Outros meios de cultura que suportam cultura de células podem ser usados, alternativamente. Na ausência de um retardo de seleção (0 dia de cultura), seleção pode ser iniciada sobre 25 mg/L de paro-momicina. Meio de seleção pode compreender meio 211 (descrito acima) ou uma variante do meio 211 na qual sais N6 são substituídos por sais MS. Após duas semanas, caule embriogênico é transferido para meio de cultura contendo 100 mg/L de paromomicina e subcultivado em intervalos de cerca de duas semanas. Quando seleção é retardada após co-cultura, os embriões são inicialmente cultivados sobre meio contendo 50 mg/L de paromomicina, seguido por subsequente cultura de caule embriogênico sobre meio contendo 100-200 mg/L de paromomicina. Aqueles versados na técnica cultivarão tecido sobre as concentrações de paromomicina as quais exibem desenvol- vimento de células contendo o gene marcador selecionável, mas uma concentração na qual caule transformado proliferará. Alternativa mente, pode-se usar outros marcadores selecionáveis para identificar células transformadas. Acredita-se que cultura inicial sobre 25 a 50 mg/L de paromocina durante cerca de duas semanas, seguido por cultura sobre 50-200 mg/L de paromo-micina, resultará em recuperação de caule transformado. Os transformantes são recuperados 6 a 8 semanas após inicio de seleção. As plantas são regeneradas a partir de caule embriogênico transformado, conforme descrito acima, para transformantes recuperados após bombardeamento de micrpro-jétil.

Exemplo 22. Transformação de Caule de Milho Agrobacterium-Mediada Esse exemplo descreve métodos para a transformação de caule de milho usando Agrobacterium. O método é exemplificado usando um gene marcador selecionável npfll e agente seletivo paromomicina. Aqueles versados na técnica estarão cientes de outras combinações de marcadores selecionáveis e agentes seletivos que poderíam ser usadas, alternativamente.

Caule foi iniciado a partir de embriões imaturos usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, embriões imaturos de 1,5 mm a 2,0 mm foram excisados de semente de milho em desenvolvimento de um genótipo tal como MILHO DE GERMPLASMA A e cultivados com o lado do eixo embriônico para baixo sobre meio 211V, usualmente durante 8-21 dias após excisão. Alternativamente, culturas de caule estabelecidos podem ser iniciadas e mantidas por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

Agrobacterium foi preparada para inoculação de tecido de planta de acordo com os métodos descritos no Exemplo 21. Cinqüenta a 100 pedaços de caule foram transferidos para uma placa de Petri de 60 mm X 20 mm contendo cerca de 15 ml de suspensão de Agrobacterium a 0,1 a 1,0 x 10® cfu/ml. Um pedaço de caule era, usualmente, todo do caule produzido por um embrião imaturo em até 21 dias de cultura ou um pedaço de caule estabelecido de 2 mm a 8 mm de diâmetro. Caule foi incubado durante cerca de 30 minutos em temperatura ambiente com a suspensão de Agrobacterium, seguido por remoção do líquido através de aspiração.

Cerca de 50 μί de água diluída estéril foram adicionados a um papel filtro Whatman n° 1 em uma placa de Petri de 60 mm x 20 mm. Após 1-5 minutos, 15 a 20 pedaços de caule foram transferidos para cada papel filtro e a lâmina vedada com PARAFILM®, por exemplo. Os caules e Agrobacterium foram co-cultivados durante cerca de 3 dias a 23°C no escuro.

Os caules foram transferidos de papel filtro para meio 211 com nitrato de prata a 20 μΜ e 500 mg/L de carbenicilina e cultivados no escuro a 27°C a 28°C durante 2-5 dias, de preferência 3 dias. Seleção foi iniciada através de transferência dos caules para meio 211 contendo nitrato de prata a 20 μΜ, 500 mg/L de carbenicilina e 25 mg/L de paromomicina. Após duas semanas de cultura no escuro a 27°C a 28°C, os caules foram transferidos para meio 211 com nitrato de prata a 20 μΜ, 500 mg/L de carbenicilina e 50 mg/L de paromomcina (médio 211QRG). Os caules foram subcultivados após duas semanas em meio fresco 211 QRG e ainda cultivados durante duas semanas no escuro a 27°C a 28°C. Os caules foram, então, transferidos para meio 211 com nitrato de prata a 20 μΜ, 500 mg/L de carbenicilina e 75 mg/L de paromomicina. Após 2-3 semanas de cultura no escuro a 27°C a 28°C, caules resistentes à paromomicina foram identificados. Aqueles versados na técnica reconhecerão que os tempos entre as subculturas de caule são aproximados e podería ser capaz de acelerar o processo de seleção através de transferência de tecido em intervalos mais freqüentes, por exemplo, semanalmente ao invés de a cada duas semanas.

Plantas foram regeneradas a partir de caule transformado, transferidas para solo e crescidas na estufa, conforme descrito em Exemplo. Após transformação Agrobacteríum-mediada, meio 217 (veja Exemplo 9) ainda continha 500 mg/L de carbenicilina e meio 127T (veja Exemplo 9) ainda continha 250 mg/L de carbenicilina. Plantas de milho transformadas compreendendo genes da presente invenção que foram produzidas usando transformação Agrobacterium-meòlaóa são resumidas na Tabela Y.

Exemplo 23. Métodos de bombardeamento de microproiétil Aproximadamente quatro horas antes de bombardeamento de microprojétil, embriões imaturos foram transferidos para meio 211SV (meio 211V com a adição de sacarose a 12%). Vinte e cinco embriões imaturos foram, de preferência, colocados em uma placa de Petri de 60 x 15 mm, disposto em uma grade de 5 x 5 com a extremidade coleoptilar do escutelo comprimida ligeiramente no meio de cultura em um ângulo de 20 graus. O tecido foi mantido no escuro antes de bombardeamento.

Antes de bombardeamento de microprojétil, uma suspensão de partículas de ouro foi preparada, da qual o DNA desejado foi precipitado. Dez miligramas de partículas de ouro a 0,6 pm (BioRad) foram suspensos em 50 pL de tampão (NaCI a 150 mM, Tris-HCI a 10 mM, pH de 8,0). Vinte e cinco pL de uma solução a 2,4 nM do DNA desejado foram adicionados à suspensão de partículas de ouro e submetidos a turbilhonamento suave durante cerca de cinco segundos. Setenta e cinco pL de espermidina a 0,1 M foram adicionados e a solução submetida a turbilhonamento suave durante cerca de 5 segundos. Setenta e cinco pL de solução a 25% de polietileno glicol (peso molecular de 3000-4000, American Type Culture Collection) foram adicionados e a solução foi submetida a turbilhonamento suave durante cinco segundos. Setenta e cinco pL de CaCI2 a 2,5M foram adicionados e a solução submetida a turbilhonamento durante cinco segundos. Após a adição de CaCI2, a solução foi incubada em temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. A suspensão foi subsequentemente centrifugada durante 20 segundos a 12.000 rpm (centrífuga Sorval MC-12V) e o sobrenadante descartado. O péiete de partículas de ouro/DNA foi lavado duas vezes com etanol a 100% e ressuspenso em 10 mL de etanol a 100%. O preparado de partículas de ouro/DNA foi armazenado a -20°C durante até duas semanas. DNA foi introduzido em células de milho usando o dispositivo de distribuição de gene por aceleração de descarga de partículas (Patente US N° 5.015.580). A suspensão de partículas de ouro/DNA foi revestida sobre folhas Mylar (filme de poliéster da Du Pont Mylar tipo SMMC2, revestido com alumínio de um lado, sobrerrevestido com copolímero de PVDC sobre ambos os lados, cortado em quadrados de 18 mm) através de dispersão de 310 a 320 pL da suspensão de partículas de ouro/DNA sobre uma folha. Após a suspensão de partículas de ouro assentar durante um a três minutos, o excesso de etanol foi removido e as folhas foram secas ao ar. Bombardeamento de microprojétil de tecido de milho foi conduzido conforme descrito na Patente U.S. N° 5.015.580. A tensão de AC pode ser variada com o dispositivo de distribuição de partículas por descarga elétrica. Durante bombardeamento de microprojétil de embriões imaturos pré-cultivados de MILHO DE GERMPLASMA A, 35% a 45% de tensão máxima foram, de preferência, usadas. Após bombardeamento de microprojétil, o tecido foi cultivado no escuro a 27°C.

Exemplo 24. Seleção de células transformadas Transformantes foram selecionados sobre meio de cultura compreendendo paramomicina, baseado na expressão de um gene de fosfo-transferase II de neomicina (npt\\). Vinte e quatro horas após distribuição de DNA, o tecido foi transferido para meio 211V contendo contendo 25 mg/L de paramomicina (meio 211HV). Após três semanas de incubação no escuro a 27°C, tecido foi transferido para meio 211 contendo 50 mg/L de paromomici-na (meio 211G). Tecido foi transferido para meio 211 contendo 75 mg/L de paramomicina (meio 211XX) após três semanas. Os transformantes foram isolados após 9 semanas de seleção. A Tabela Y divulga os resultados de experimentos com transformantes usando os métodos de bombardeamento de microprojétil divulgados aqui.

Exemplo 25. Reoeneração de plantas transaênicas férteis Plantas transgênicas férteis foram produzidas a partir de células de milho transformadas. Caule transformado foi transferido para meio 217 (sais N6,1 mg/L de tiamina-HCI, 0,5 mg/L de niacina, 3,52 mg/L de benzila-minopurina, 0,91 mg/L de monohidrato de L-asparagina, 100 mg/L de mioi-nositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2-6H20,100 mg/L de hidrolisato de caseína, 0,69 g/L de L-prolina, 20 g/L de sacarose, 2 g/L de GELGRO®, pH de 5,8) durante cinco a sete dias no escuro a 27°C. Embriões somáticos maduros e regeneração de brotos começa sobre meio 217. Tecido foi transferido para meio 127T (sais MS, 0,65 mg/L de niacina, 0,125 mg/L de pirido-xina-HCI, 0,125 mg/L de tiamina-HCI, 0,125 mg/L de pantotenato de Ca, 150 mg/L de L-asparagina, 100 mg/L de mio-inositol, 10 g/L de glicose, 20 g/L de L-maltose, 100 mg/L de paromomicina, 5,5 g de PHYTAGAR®, pH de 5,8) para desenvolvimento de broto. Tecido sobre meio 127T foi cultivado no cia-ro a 400-600 lux a 26°C. Mudas são transferidas para o solo, de preferência vasos de 7,62 cm (3 polegadas), cerca de quatro a 6 semanas após transferência para meio 127T quando as mudas têm cerca de 7,62 cm (3 polegadas) de altura e têm raízes. As plantas foram mantidas durante duas semanas em uma câmara de crescimento a 26°C, seguido por duas semanas sobre uma bancada úmida em uma estufa antes de transplante para vasos de 18,93 I (5 galões) para crescimento na estufa, As plantas foram desenvolvidas na estufa até maturidade e polinizações recíprocas foram feitas com o MILHO DE GERMPLASMA A endógamo. Sementes foram coletadas das plantas e usadas para outras atividades de reprodução.

Fxamplo 26. Isolamento de Ácidos nucleicos de Piantas Ácidos nucleicos foram isolados de cada tecido de folha de plantas RO, coletados e congelados em uma caixa de coleta com 96 cavidades, 0 a 2 semanas após as mudas serem transferidas para o solo. Aproximadamente 100 miligramas de tecido foram coletados de cada planta e armazenados a -80°C até análise. DNA e RNA foram isolados de uma única amostra de tecido usando o kit Qiagen Rneasy 96® (Qiagen Inc., Valencia, CA) com modificações. Cem miligramas de tecido congelado foram homogeneizados em 700 pL de tampão Rneasy® RTL (Qiagen Inc., Valencia, CA) usando Bead Bea-ter® (Biospec Products, Bartlesville, OK). As amostras foram centrifugadas a 3200 rpm durante 15 minutos e todo o sobrenadante foi transferido para cavidades de uma lâmina de liberação Promega WÍZARD® (Promega Corporation, Madison, Wl). As soluções de amostra foram clarificadas por meio de filtração a vácuo através da lâmina de liberação. O sobrenadante liberado foi usado para extrações de ácido nucléico.

Para extrações de DNA, 70 pL da amostra liberada foram transferidos para uma lâmina de PCR com cavidades em V, coberta com uma folha adesiva e aquecida a 95°C durante 8 minutos. As amostras foram in- cubadas a 0°C durante cinco minutos, seguido por centrífugação durante 3 minutos para remover os materiais insolúveis. Uma caixa de filtração em gel Sephadex G-50 (Edge Biosystems, Gaithersburg, MO) foi condicionada durante 2 min a 2000 rpm. Quarenta μΙ_ do sobrenadante tratado pelo calor foram carregados em cada cavidade e a caixa centrifugada durante dois minutos a 2500 rpm. Mais 20 μί de tampão TE foram adicionados ao efluente da coluna e a lâmina com amostra foi armazenada a -20°C até análise.

Para extrações de RNA, quinhentos microlitros de solução liberada foram transferidos para uma caixa de amostra com 96 cavidades. Duzentos e cinqüenta microlitros de etanol a 100% foram adicionados a cada amostra e a amostra foi totalmente misturada, aproximadamente setecentos e cinqüenta microlitros de solução foram, então, carregados às cavidades de uma lâmina de ligação Qiagen Rneasy™ em uma unidade de filtração Promega WIZARD®. Quinhentos microlitros de tampão RW1 (Qiagen Inc., Va-lencia, CA) foram adicionados a cada cavidade e o tempão removido através de filtração a vácuo. Oitocentos microlitros RNAase isento de DNAase (Qiagen Inc., Valencia, CA) foram adicionados a cada cavidade, incubados em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de DNAase foi extraída das cavidades por meio de filtração a vácuo. Mais quinhentos microlitros de tampão RW1 (Qiagen Inc., Valencia, CA) foram adicionados às cavidades e o tampão removido através de filtração a vácuo. A amostra foi ainda lavada através de filtração a vácuo com 500 μί de tampão RPE 2X (Qiagen, Valencia, CA). A lâmina de extração foi colocada sobre uma lâmina de microtitula-ção e centrifugada durante três minutos a 3000 rpm para remover qualquer solução de tampão RPE residual no filtro. Oitocentos microlitros de água de grau para RNA (isenta de DNAse) foram adicionados a cada cavidade, seguido por incubação em temperatura ambiente durante dois minutos. A lâmina de extração e a lâmina de microtitulação foram centrifugadas durante três minutos a 3000 rpm e o preparado de RNA armazenado congelado na lâmina de coleta a -80°C.

Exemplo 27. Ensaios para número de cópias O número de cópias de transgenes em plantas R0 foi determi- nado usando métodos TAQMAN®. Os vetores de destino pMON65154 e pRG76 GATEWAY® foram construídos com uma sequência derivada da região 3' do gene p/nll de batata, o qual também podería ser usado para analisar o número de cópias de inserções de transgene. Os iniciadores reverso e dianteiro pin\\ eram como segue: Iniciador reverso 5’ ccccaccctgcaatgtga 3’ (SEQ ID N°: 77) Iniciador reverso 5’ tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3’ (SEQ ID N°: 78) A seqüência da sonda p/nll TAQMAN® era: 5’ cctagacttgtccatcttctggattggcca 3’ (SEQ ID N°: 79) A sonda foi rotulada na extremidade 5' com o corante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) e o corante "quencher" TAMRA (6-carbóxi-Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametil-rodamina) foi preso via um ligante à extremidade 3’ da sonda. A sonda TAQMAN® foi obtida da Applied Biosystems (Foster City, CA)._____SAT, um gene de milho com uma única cópia foi usado como um controle interno em ensaios do número de cópias TAQMAN®. Os iniciadores SAT eram como segue: Iniciador dianteiro 5’ gcctgccgcagaccaa 3’ (SEQ ID N°: 80) Iniciador Reverso 5’ atgcagagctcagcttcatc 3’ (SEQ ID NO:81) A seqüência da sonda SAT TAQMAN® era: 5’ tccagtacgtgcagtccctcctcc 3’ (SEQ ID N°: 82) A sonda foi rotulada em sua extremidade 5’ com o corante fluorescente VIC® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e o corante "quencher" TAMRA na extremidade 3’. TAQMAN® PCR foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cinco a 100 nanogramas de DNA foram usados em cada ensaio. Amplificação por PCR e detecção por sonda TAQMAN® foram realizadas em 1X TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a qual contém DNA poli-merase AmpliTaq Gold® DNA, AmpErase® UNG, dNTPs com dUTP, Passive Reference 1 e tampão otimizado. Iniciadores dianteiro e reverso p/nll a 800 nM e sonda p/nll TAQMAN® a 150 nM foram usados no ensaio TAQMAN®.

Iniciadores dianteiro e reverso Sat a 200 nM e sonda TAQMAN® Sat a 150 nM foram usados no ensaio de número de cópias TAQMAN®. TAQMAN® PCR foi realizada durante 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e um minuto a 60°C. A fluorescência da sonda TAQMAN® em tempo real foi medida usando um Sistema de Detecção de Seqüência ABI Prism 7700 ou Sistema de Detecção de Seqüência ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA), Os valores de CT foram calculados de acordo com o manual de instruções do kit TAQMAN® EZ RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). O valor de ΔΔ Cj foi calculado como Cj (gene de controle interno (Sat)) - Cj (transgene) - CT (gene de controle interno (Sat) em plantas não-transgênicas). O número de cópias foi atribuído como segue de acordo com os critérios na Tabela 12.

Tabela 19. Critérios para Determinação do Número de Cópias através de TAQMAN® Plantas compreendendo genes da presente invenção serão analisados através de métodos TAQMAN® com relação ao número de cópias. Análise por Southern blot para confirmar a determinação do número de cópias por TAQMAN® em torno de 80% das plantas que foram analisadas através de TAQMAN® e hibridização de Southern blot.

Exemplo 28. Ensaios de expressão de gene A expressão de um transgene da presente invenção foi analisada através de TAQMAN® RT-PCR usando o kit TAQMAN® EZ RT-PCR da Applied Biosystems (Foster City, CA). Expressão de RNA foi avaliada com relação à expressão em um padrão transgênico, um evento de milho trans-gênico designado DBT418, compreendendo um gene aylAI de B. thuringi-ensis operavelmente ligado a uma região não-traduzida 3' pin\\. O evento DBT418 expressa o gene c/ylAI em um nível o qual confere níveis comerei- ais de resistência a inseticidas para lepidópteros, tal como Broca do Milho Europeu e era comercialmente vendido pela DEKALB Genetics Corporation sob a marca comercial DEKALBt®. Os vetores de destino pMON65154 e pRG76 GATEWAY® foram construídos com uma seqüência derivada da região 3' do gene pinW de batata, o qual podería ser usado para avaliar os níveis de transcrito de transgene para qualquer seqüência de codificação inserida no Vetor Destination. Os iniciadores e sonda pinW anteriormente descritos foram usados para TAQMAN® RT-PCR. Proteína de fusão de ubiquitina (UBI) RNA foi usada como um controle interno em todos os ensaios de TAQMAN® RT-PCR. Os iniciadores UBI usados eram como segue: Iniciador dianteiro 5’ cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3’ (SEQ ID N°: 83) Iniciador Reverso 5’ ccaacaggtgaatgcttgatagg 3’ (SEQ ID N°: 84) A seqüência da sonda UBI TAQMAN® era: 5’ catgcgccgctttgcttc 3’ (SEQ ID N°: 85) A sonda UBI TAQMAN® foi rotulada em sua extremidade 5’ com o corante fluorescente VIC® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e o corante "quencher" TAMRA na extremidade 3'.

Transcrição reversa, amplificação por PCR e uso de sonda TAQMAN® foram realizados de acordo com o procedimento em uma etapa descrito no kit TAQMAN® EZ RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cinco a 100 nanogramas de RNA total foram usados em cada ensaio. RNA de controle transcrito in vitro do evento DBT418 foi incluído como um controle sobre cada lâmina e operado sobre uma faixa de concentração de 0,01 picograma a 10 picogramas. RNA total de folhas DBT418 e de MILHO DE GERMPLASMA A endógamo não-transgênico foram operados como controles positivo e negativo, respectivamente. RT-PCR foi realizada em Tampão TAQMAN® EZ (Bicina a 50 mM, acetato de potássio a 115 mM, EDTA a 0,01 mM, Passive Reference 1 a 60 mM, 8% de glicerol, pH de 8,2, Applied Biosystems, Foster City, CA) contendo acetato de manganês a 3 mM, dATP, dCTP, dGTP e dUTP a 300 μΜ cada, 100 unidades de DNA polimerase rT- th® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e 25 unidades de AmpErase UNG (Applied Biosystems, Foster City, CA). RT-PCR foi realizada como segue: 2 minutos a 50°C, 30 minutos a 60°C, 5 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de 20 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. Iniciadores dianteiro e reverso a 400 nM cada um foram usados para amplificação da sequência pin\\ e sonda TAQMAN® pin\\ a 200 nM usada para seleção. UBI RNA foi amplificado usando iniciadores dianteiro e reverso a 400 nM sonda UBI TAQMAN® a 200 nM foi usada para seleção. A fluorescência de TAQMAN® foi medida usando um Sistema de Detecção de Seqüência ABI Prism 7700 ou Sistema de Detecção de Seqüência ABI7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de transgenes da presente invenção foi quantificada com relação à expressão do transgene em DBT418 e reportada como a proporção de expressão de transgene para expressão de DBT418, isto é, 2'(44CV (transgene) / 2"·ΜίΥ (DBT418).

Exemplo 29. Reprodução de Planta Recruzamento pode ser usado para aperfeiçoar uma planta de iniciação. Recruzamento transfere um traço desejável específico de uma fonte para uma planta endógama ou outra que carece de um traço. Isso pode ser realizado, por exemplo, primeiro através de cruzamento de um endó-gamo superior (A) (original recorrente) para um endógamo doador (original não-recorrente), o qual traz o(s) gene(s) apropriado(s) para o traço em questão, por exemplo, um constructo preparado de acordo com a presente invenção. A prole desse primeiro cruzamento é selecionada na prole resultante para o traço desejado a ser transferido do original não-recorrente, então, a prole selecionada é combinada novamente com o original recorrente superior (A). Após cinco ou mais gerações de recruzamento com seleção durante o traço desejado, a prole é hemizigótica para loci que controlam a característica que está sendo transferida, mas é semelhante ao original superior para a maioria ou quase todos os outros genes. A última geração de recruzamento seria auto para proporcionar uma prole a qual é reproduzida pura para o(s) gene(s) que está(ão) sendo transferido(s), isto é, um ou mais eventos de transformação.

Portanto, através de uma série de manipulações de reprodução, um transgene selecionado pode ser movido de uma linhagem para uma linhagem totalmente diferente sem a necessidade de outra manipulação re-combinante. Transgenes são valiosos pelo fato de que eles se comportam, de modo típico, geneticamente como qualquer outro gene e podem ser manipulados através de técnicas de reprodução de uma maneira idêntica a qualquer outro gene de milho. Portanto, pode-se produzir plantas endóga-mas as quais são reprodutores verdadeiros para um ou mais transgenes. Através de cruzamento de diferentes plantas endógamas, pode-se produzir um grande número de diferentes híbridos com diferentes combinações de transgenes. Dessa forma, plantas podem ser produzidas as quais têm propriedades agronômicas desejáveis frequentemente associadas com híbridos ("vigor de híbrido"), bem como as características desejáveis conferidas por um ou mais transgenes. É desejável introduzir os genes da presente invenção em híbridos de milho durante caracterização do fenótipo conferido através de cada gene em uma planta transformada. O genótipo hospedeiro no qual o transgene foi introduzido, de preferência MILHO DE GERMPLASMA A, é um en-dógamo de elite e, portanto, apenas reprodução limitada é necessária de forma a produzir híbridos de milho em elevado rendimento. A planta transformada, regenerada a partir de caule, é cruzada com o mesmo genótipo, por exemplo, MILHO DE GERMPLASMA A. A prole é autopolinizada duas vezes e plantas homozigóticas para o transgene são identificadas. Plantas transgênicas homozigóticas são cruzadas com um original de teste de forma a produzir híbridos. O original de cruzamento de teste é um endógamo pertencendo a um grupo heterótico o qual é diferente daquele do original írans-gênico e para o qual se sabe que híbridos de elevado rendimento podem ser gerados, por exemplo, híbridos são produzidos a partir de cruzamentos de MILHO DE GERMPLASMA A com MILHO DE GERMPLASMA E ou MILHO DE GERMPLASMA B.

Exemplo 30, Métodos de Avaliação de Fenótipo A expressão do genes da presente invenção leva a vários fenó- tipos conforme divulgado aqui em células e plantas transformadas. Dados fenotípicos são coletados durante o processo de transformação em caule, bem como durante regeneração de planta, bem como em plantas e prole. Dados fenotípicos são coletados em caule transformados com relação à aparência morfológica, bem como crescimento do caule, por exemplo, taxa de crescimento aumentada de broto, raiz, amido, micóide, não-embriogênico, taxa diminuída de crescimento, morte. Espera-se que aqueles versados na técnica possam reconhecer outras características fenotípicas em caule transformado.

Dados fenotípicos são também coletados durante o processo de regeneração de planta, bem como em plantas regeneradas transferidas para o solo. Dados fenotípicos incluem características tais como plantas normais, plantas de arbustos, folhas estreitas, folhas riscadas, fenótipo de nós, cloro-se, albino, produção de anticianina, "buggy whipped" (um fenômeno conhecido na técnica no qual as folhas que emergiram mais recentemente são alongadas e enroladas em torno umas das outras) ou espigas com pendões ou raízes alteradas. Espera-se que aqueles versados na técnica possam reconhecer outras características fenotípicas em plantas transformadas.

Uma ampla variedade de fenótipos são monitorados durante o processo de reprodução e testagem de plantas em plantas endógamas e híbridas. Por exemplo, em plantas RO e R1 (plantas diretamente regeneradas a partir de caule e a prole direta dessas plantas), tipo de planta (características morfológicas gerais, tais como aquelas descritas acima para pequenas mudas) e composição nutricional de grãos produzidos pelas plantas são registrados. A análise de composição nutricional pode incluir composição de aminoácidos, quantidade de proteína, amido e óleo, características de proteína, amido e óleo, fibra, cinzas, teor de minerais, todos podem ser medidos. Espera-se que aqueles versados na técnica possam incluir análises de outros componentes do grão. Em plantas R2 e R3, dias para liberar o pólen, dias até seda e tipo de planta são observados. Além disso, o perfil de metabólitos de plantas R2 é obtido. Usando métodos disponíveis para aqueles versados na técnica, 50 a 100 ou mais metabólitos podem ser analisa- dos em uma planta, desse modo, estabelecendo uma impressão digital me-tabólica da planta. Além disso, em plantas R3, a taxa de extensão de folha é medida sob condições no campo. Uma variedade de fenótipos será analisada em híbridos compreendendo um transgene da presente invenção. Por exemplo, rendimento, umidade, peso de teste, composição nutricional, teor de clorofila, temperatura da folha, posição ereta, vigor da muda, altura da planta, número de folhas, raízes de fixação, sustentação de verde, abrigo de caule, abrigo de raiz, saúde da planta, esterilidade/fertilidade, pedaços verdes, resistência a pestes (incluindo doenças, vírus e insetos) e perfis meta-bólicos serão registrados. Além disso, características fenotípicas de grãos colhidos de híbridos serão registrados, incluindo número de sementes por fileira sobre a espiga, número de fileiras de sementes sobre a espiga, absorção de sementes, peso de sementes, tamanho de sementes, densidade de sementes e qualidade física dos grãos. Além disso, características tais como fotossíntese, área da folha, estrutura da casca, taxa de secagem de semente e comprimento de internódulo podem ser medidos em híbridos ou endóga-mos. Espera-se que o perfil transcricional possa ser obtido em plantas trans-gênicas expressando os genes da presente invenção.

De forma a determinar o rendimento de híbrido em plantas transgênicas expressando genes da presente invenção, é reconhecido que os híbridos devem ser testados em locais múltiplos em uma localização geográfica onde o milho é convencionalmente desenvolvido, por exemplo, lowa, Illinois ou outros locais no meio-oeste dos Estados Unidos. Espera-se que uma testagem de rendimento de mais de um ano seja desejável de forma a identificar transgenes os quais contribuem para aperfeiçoamento de um híbrido de milho. Portanto, híbridos transgênicos serão avaliados em um primeiro ano em um número suficiente de locais para identificar uma diferença de pelo menos aproximadamente 10% no rendimento a partir de uma contra-parte híbrida não-transgênica. Um segundo ano de testes de rendimento é conduzido em locais suficientes e com repetições suficientes para ser capaz de identificar uma diferença de rendimento de 4-5% em dois híbridos. Além disso, no segundo ano de testes de rendimento, híbridos serão avaliados sob condições normais no campo, bem como sob condições de estresse, por exemplo, sob condições de estresse pela água ou densidade de população. Aqueles versados na técnica saberão como projetar um experimento de rendimento de modo que uma diferença de rendimento estatisticamente significativa possa ser detectada entre dois híbridos na taxa de precisão desejada. Exemplo 31. Esterilização de superfície e embebimento de sementes de mi-Iho.

Para cada lote transgênico, esterilizar a superfície de cerca de 50 sementes de milho colocando as mesmas em um frasco de Erlenmeyer estéril de 500 ml com 50 ml de alvejante a 30% (solução de hipoclorito de sódio = Chlorox ou equivalente) contendo 0,01% de Triton X-100 e girando o frasco sobre um agitador orbital durante 5 minutos. Então, descartar a solução de alvejante e lavar com cerca de 100 ml de água desionizada estérii e descartar a lavagem de água. Repetir a lavagem com água estéril mais 4 vezes, deixando a última lavagem com água sobre as sementes. Incubar as sementes nessa água em temperatura ambiente durante 24 horas durante embebimento sob borbulhamento de ar (passar através de um filtro de 0. 2 pm). 1. Preparação de meio em Phvtotravs Preparar meio com água - ágar para várias Phytotrays. Foi usado Phytotray II (ou caixa plástica: 60 x 30 x 15 cm)na posição invertida de modo que o lado com maior profundidade do vaso estivesse sobre o fundo e o lado menor fosse usado como a tampa. Preparar meio com água - ágar suficiente para 100 ml por Phytotray através de sujeição à autoclave de 0,3% de BactoAgar em água desionizada durante 45 minutos sobre o ciclo líquido. Esfriar o meio até o ponto em que ele possa ser manipulado facilmente e entornar aproximadamente 100 ml por Phytotray enquanto ainda fundido. II. Ensaio de vigor da muda de milho no frio • Quando o meio se solidificou, levar o mesmo e as sementes estéreis a uma haste de fluxo laminar. • Usando um fórceps estéril, selecionar as 20 sementes saudáveis mais uniformes e colocar as sementes em cada Phytotray usada duran- te o ensaio, espaçando as sementes uniformemente de modo que qualquer uma possa ser facilmente removida depois. • Colocar as sementes de modo que o lado do embrião esteja diagonalmente inserido para baixo e a semente esteja exatamente sob a superfície do ágar. Nessa posição, o broto e raiz em emergência serão capazes de se alongar diretamente sem obstáculos. • Incubar as sementes no meio a 22 °C durante uma semana ou até que a maioria das sementes tenha extrudado radículos e estejam começando a emergir do ágar. • Remover todas, mas as 10 mudas com crescimento mais uniforme em uma haste de fluxo laminar. • Desviar as Phytotrays para uma câmara de crescimento de planta fria ajustada a 10 °C com um ciclo de claro de 16 horas e incubar durante 2 semanas. • Desviar as Phytotrays novamente para 22 °C durante uma semana. • Remover as mudas, medir comprimento da raiz e comprimento do broto para cada muda e medir o peso fresco em g/3 mudas, registrar em um notebook.

Adaptação durante germinação no frio e ensaio de emergência.

Mesmo conforme acima, com as seguintes exceções: • Após a última lavagem com água em I., colocar os frascos a 10°C durante a etapa de embebimento durante a noite. Também, pré-resfriar as Phytotrays com meio solidificado a 10°C. • Após cultura das Phytotrays resfriada com sementes embebidas a frio, elas são colocadas diretamente na câmara a 10°C, • Após cerca de 5 dias, remover todas, mas as 10 sementes mais uniformemente germinadas, cujos radículos tem em torno do mesmo comprimento. Retornar as Phytotrays para a câmara a 10°C durante 1-2 semanas. Remover mudas, medir o comprimento da raiz e comprimento do broto durante cada muda e medir o peso fresco de cada 3 mudas, registrar no notebook. • Desviar ο 2o conjunto de Phytotrays para 22°C durante uma semana. • Remover mudas, medir o comprimento da raiz e comprimento do broto para cada muda, registrarem um notebook. i Exemplo 31. Criação de plasmídios para transformação de soja.

Exemplo (para constructos CspA e B - pMON73983 e 73984) pMON73983 (Figura 18) é um vetor binário para transformação Agrobacterium-mediada e expressão constitutiva de uma proteína (SEQ ID N°: 1) semelhante à CspA de Bacillus subtilis em Soja. Para clonar o gene i CspA de B. subtilis, dois iniciadores gene-específicos, MSA452 e MSA453 foram projetados baseado na informação de sequência do CspA (Genbank n° M30139) do National Center for Biotechnology Informação, o qual é parte da National Library of Medicine, por sua vez parte do National Institutes de Health (NCBI). A seqüência para MSA452 é GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAA TGG (SEQ ID N°: 86), a qual se anela no sítio de início de transcrição de CspA e introduz sítios Stul e Bglli na extremidade 5\ enquanto que a seqüência do MSA453 é CQCGAA^(^<^JCCUmkCkGGCTGQ^ACGUkCCAGCTGCC (SEQ ID N°: 87), a qual se anela no último códon do CspA e introduz sítios BamHI e EcoRI na extremidade do iniciador. O iniciador reverso MSA453 foi projetado para equivaler à extremidade 3' da seqüência genética do Genbank. A reação de PCR foi realizada usando iniciadores MSA452 e MSA453, High Fidelity Taq Polimerase (BRL) e pMON57397 (Figura 3) como o modelo. Esse modelo difere na extremidade 3' do gene CspA daquela da seqüência do Genbank. O DNA de CspB amplificado foi purificado através de gel-eletroforese e ligado ao vetor pCR-XL-TOPO (Invitrogen). A reação de ligação foi transformada em células Top10 de E. coii (Invitrogen) conforme o protocolo do fabricante. Quatro colônias de transformantes foram selecionadas e DNA miniprep foi preparado usando Qiagen Miniprep Kit. Os insertos foram seqüenciados usando iniciadores reverso e dianteiro M13-específicos. O clone com a seqüência correta foi denominado pMON73981 e usado para outra subclonagem. DNA de pMON73881 foi digerido com Stul e BamHI para isolar o fragmento de gene CspA. DNA de pMON73980 foi digerido com Stul e Ba-mHI seqüencialmente e, então, purificado através do kit Gene Clean II. O fragmento de CspB e esse vetor purificado pMON73980 foram ligados e a reação de ligação foi eletrotransformada em células DH10B de E. coli. Os íransformaníes foram seiecionaaas sobre meio contendo Espectinomicina. O DNA miniprep foi preparado a partir dos transformantes e o DNA foi verificado com relação à presença do inserto através de uso do iniciador dianteiro promotor CaMV35S-específico. O clone contendo esse inserto foi denominado pMON73983. Um DNA prep maior foi feito e uma série de digestões confirmatórias foram realizadas, incluindo Bglll ecoRI, Pstl ecoRI+BamHI, Stul+Xhol. Essas confirmaram a clonagem correta. pMON73984 é um vetor binário para transformação e expressão constitutiva Agrobacterium-meólaóa de uma proteína (SEQ ID N°: 2) semelhante à CspB de Bacilius subtilis em Arabidopsis. Para clonar o gene CspB de B. subtilis, dois iniciadores gene-específicos, MSA454 e MSA455 foram projetados baseado na informação de seqüência do CspB (Genbank n° X59715) do National Center for Biotechnology Informação, o qual é parte da National Library of Medicine, por sua vez parte do National Institutes of Health (NCBI). A seqüência para MSA454 é GCGCAG GCCTAGATGT ACCAT GTTAG AAG GT AAAGTAAAATGGTT CAAC TCTG (SEQ ID N°: 88), a qual se anela no sítio de início de transcrição de CspB e introduz sítios Stul e Bglll na extremidade 5', enquanto que a seqüência do MSA455 é CGCGAAUCGGAlCCTTAJlACGCnCTJlAGJAACGTlAGCAGCTJGJG G (SEQ ID N°: 89), a qual se anela no último códon do CspB e introduz sítios BamHI e EcoRI na extremidade do iniciador. O iniciador reverso MSA455 foi projetado para equivaler à extremidade 3' da seqüência genética do Genbank. A reação de PCR foi realizada usando iniciadores MSA454 e MSA455, High Fedelity Taq Polimerase (BRL) e pMON57399 como o modelo. Esse modelo difere na extremidade 3' do gene CspB daquela da seqüência do Genbank. O DNA de CspB amplificado foi purificado através de gel- eletroforese e ligado ao vetor pCR-XL-TOPO (Invitrogen). A reação de ligação foi transformada em células Top10 de E. coli (Invitrogen) conforme o protocolo do fabricante. Quatro colônias de transformantes foram selecionadas e DNA miniprep foi preparado usando Qiagen Miniprep Kit. Os insertos foram seqüenciados usando iniciadores reverso e dianteiro M13-específicos. O clone com a seqüência correta foi denominado pMON73982 e usado para outra subclonagem. DNA de pMON73882 foi digerido com Stul e BamHI para isolar o fragmento do gene CspB. DNA de pMON73980 foi digerido com Stul e Ba-mHI seqüencialmente e, então, purificado através do kit Gene Clean Ei. O fragmento de CspB e esse vetor purificado pMON73980 foram ligados e a reação de ligação foi eletrotransformada em células DH10B de E. coli. Os transformantes foram selecionadas sobre meio contendo Espectinomicina. O DNA miniprep foi preparado a partir dos transformantes e o DNA foi verificado com relação à presença do inserto através de uso do iniciador dianteiro promotor de CaMV35S-específico. O clone contendo esse inserto foi denominado pMON73984. Um DNA prep maior foi feito e uma série de digestões confirmatórias foram realizadas, incluindo Bglll ecoRI, Pstl ecoRI+BamHI, Stul+Xhol. Essas confirmaram que a clonagem estava correta.

Plantas de soja foram criadas, através de transformação, com os constructos pMON acima estavelmente integrados em seu genoma.

Exemplo 32.

Plantas de milho transformadas com os constructos de DNA dos exemplos 10 e 11, acima, foram estudadas.

Estufa • Dois experimentos foram realizados, um testando 10 eventos de cspA e um testando 10 eventos de cspB para tolerância à estiagem. • 24 mudas híbridas transgene positivas e 24 transgene negativas de cada evento foram testadas (todas as sementes derivadas de espigas segregando híbridos). • O teste foi realizado sobre bancadas em uma estufa. • O tratamento consistia em privação de água e monitoramento do peso totaí do vaso de cada vaso contendo uma planta. Vasos totalmente aguados pesam cerca de 1000 gramas cada e água foi privada até que o peso de cada vaso atingisse 400 gramas, então, os vasos foram mantidos nesse peso durante o restante do tratamento. • No decorrer do tratamento, a altura da planta foi determinada através de medição da distância da superfície do solo no vaso para a ponta da folha "mais alta". A partir dessas medições, a LER (taxa de extensão de folha) foi determinada por meio de comparação das alturas em intervalos entre as medições. • Comparações da LER durante a estiagem foram feitas entre plantas transgene negativas e transgene positivas dentro de um evento. • Para três de dez eventos testados, plantas transgênicas à Cs-pA eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoadas com relação à LER durante o tratamento. • Para três de dez eventos testados, plantas transgênicas à CspB eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoadas com relação à LER durante o tratamento.

Eficácia no Campo • Três experimentos foram realizados usando sementes híbridas, um testando 16 eventos de CspB (CA), um testando 21 eventos de CspB (KS) e um testando 14 eventos de CspA (Hl) para tolerância à estiagem durante o estágio vegetativo posterior de crescimento. • Para os experimentos CA e Hl, fileiras contendo - 34 plantas, segregando a presença do transgene, estavam presentes em seis e quatro réplicas, respectivamente. Fileiras de segregação foram derivadas de espigas de segregação. • Para KS, fileiras experimentais continham ~34 plantas; como fileiras transgênicas e não-transgênicas emparelhadas, com seis réplicas. • O tratamento consistia em privação de água durante aproximadamente dez dias durante fase vegetativa posterior de crescimento (proporcionando uma pequena quantidade, conforme necessário, para manter plantas viáveis). Ao final do período de dez dias, as plantas foram, então, bem irrigadas até colheita. • No decorrer do tratamento, uma série de fenótipos foram medidos, incluindo LER, clorofila (através de um medidor SPAD) e taxa de fotos-síntese. Após o tratamento adicional, os fenótipos medidos incluíam: dias para liberar pólen e emergência de seda e componentes de espiga, tais como sementes/espigas com sementes, peso das sementes e rendimento. • Comparações de fenóotipo foram feitas entre plantas transgene positivas e negativas dentro de um evento e através do constructo. • No experimento CA, CspB como um constructo (através de todos os eventos para traços vegetativos e através dos seis "melhores" eventos para traços reprodutivos), plantas transgene positivas eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoadas com relação à LER, temperatura da folha e sementes/espiga durante ou após o tratamento de estiagem. • No experimento CA, eventos individuais eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoados com relação à LER, comprimento médio da espiga, massa da semente/espiga, condutância estomatal e dias até seda durante ou após o tratamento de estiagem. • No experimento KS, CspB como um constructo (através de todos os eventos para traços vegetativos e através dos seis "melhores" eventos para traços reprodutivos), plantas transgene positivas eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoadas com relação à LER, espigas trazendo semen-tes/fileira, sementes/espiga, sementes/planta, peso da casca e rendimento. • No experimento KS, eventos individuais eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoados com relação à LER, taxa de fotossintese, condutância estomatal espigas/fileira e sementes/planta. • No experimento Hl, três eventos eram significativamente (p<0,10) aperfeiçoados com relação à LER (teor de clorofila foi o único fenó-tipo adicional medido em Hl).

Resumo de Resultados de Eficácia no Campo para Cspb - Sítio Ks 1. O projeto no campo, uniformidade do local e execução de plantio e amostragem eram todos consistentes com um experimento de alta qualidade capaz de geração de conjuntos de dados informativos. 2. 0 tratamento de privação de água foi aplicado de uma maneira que resultou em impacto do tratamento sobre todos os fenótipos medidos, particularmente LER, clorofila e taxa de fotossíntese. 3. O impacto do tratamento sobre os fenótipos vegetativos e fenótipos reprodutivos era suficiente para ser estatisticamente real e permitir que aperfeiçoamentos transgene-mediados fossem observados em níveis estatisticamente significativos. 4. Um ou mais eventos foram estatisticamente aperfeiçoados em plantas contendo transgene com relação à LER, clorofila, taxa de fotossíntese, condutância estomatal temperatura da folha, dias para liberar pólen, dias até seda, intervalo de produção de seda, espigas/iote, sementes/espiga, sementes/planta, peso da casca e rendimento estimado. 5. Aperfeiçoamento estatístico a nível de constructo foi observado a p<0,10 no tratamento a seco com relação à LER, espigas/lote, sementes/espiga, sementes/planta, peso da casca e rendimento estimado e LER no tratamento a úmido.

Tabela 20 Evento Tratamento Fenótipo aperfeiçoado Valor P

Constructo Seco LER(T1-T0) 0,009 Seco LER (T2-T0) 0,009 Seco LER(T2-T1) 0,096 Seco Condutância estomatal 0,150 Seco Fotossíntese 0,141 Seco Espigas/lote 0,012 Seco Sementes/espiga 0,062 Seco Sementes/planta 0,006 Seco Peso da casca 0,009 Seco Est, Rendimento 0,008 Úmido LER (T2-T1) 0,025 Úmido Clorofila (-) 0,062 Úmido Espigas/lote (-) 0,185 Úmido Sementes/espiga (-) 0,121 Tabela 20 (continuação) Evento Tratamento Fenótipo aperfeiçoado Valor P Úmido Sementes/planta (-) 0,083 Úmido Peso da casca (-) 0,132 Úmido Est, Rendimento (-) 0,101 ZMJ/138835 Seco LER (T1-T0) 0,008 Seco Fotossíntese 0,066 Seco Condutância estomatal 0,064 Seco Transpiração 0,126 Seco Sementes/planta 0,160 Seco Peso da casca 0,149 Seco Rendimento 0,153 Úmido LER (T1-T0) 0,099 Úmido LER (T2-T1) (-) 0,026 ZMJVI38737 Seco Fotossíntese 0,108 Resumo dos Resultados de Eficácia no Campo para Cspb - Sítio Cs (troca de fonte) 1. O projeto no campo, uniformidade do local e execução de plantio e amostragem eram todos consistentes com um experimento de alta qualidade capaz de geração de conjuntos de dados informativos. 2. O tratamento de privação de água foi aplicado de uma maneira que resultou em impacto do tratamento sobre todos os fenótipos vegetati-vos medidos, particularmente LER, clorofila e taxa de fotossíntese, mas nem todos os fenótipos reprodutivos. 3. O impacto do tratamento sobre os fenótipos (vegetativos) de interesse era suficiente para ser estatisticamente real e permitir que aperfeiçoamentos transgene-mediados fossem observados em níveis estatisticamente significativos. 4. Um ou mais eventos eram estatisticamente aperfeiçoados em plantas contendo transgene com relação à LER, clorofila, taxa de fotossíntese, condutância estomatal temperatura da folha, dias para liberar pólen, dias até seda, intervalo até seda, sementes/espiga, comprimento médio da espi- ga e massa da semente/espiga. 5. Aperfeiçoamento estatístico a nível de constructo foi observado no tratamento a seco com relação à LER, temperatura da folha e dias para liberar pólen e ASI no tratamento a úmido.

Tabela 21 Evento Tratamento Fenótipo aperfeiçoado Valor P

Constructo Seco LER 0,009 Seco Temperatura da folha 0,027 Seco Dias para liberar pólen 0,192 Seco Sementes/espiga 0,080 Seco Massa da semente/espiga 0,197 Seco Peso de teste (Ib/bu) Neg 0,084 Úmido LER 0,157 Úmido Dias para liberar pólen 0,098 Úmido Comprimento médio da espiga 0,091 Úmido Massa da semente/espiga 0,010 Úmido Peso de teste (Ib/bu) Neg 0,188 ZM_M39583 Seco LER 0,051 Seco Sementes/espiga 0,200 Úmido Comprimento médio da espiga 0,058 Úmido Massa da semente/espiga 0,070 ZM_M39872 Seco LER 0,159 Úmido Dias até seda 0,024 Úmido ASI 0,064 ZMJ/I40946 Seco LER 0,201 ZMJM38238 Seco Dias até seda 0,176 Seco Sementes/espiga 0,192 Úmido LER 0,151 Úmido Massa da semente/espiga 0,034 ZM_M38244 Seco Condutância estomatal 0,092 Seco Fotossíntese 0,132 Seco Temperatura da folha 0,155 Tabela 21 Evento Tratamento Fenótipo aperfeiçoado Valor P ZM_M38230 Seco Dias até seda 0,176 ZMJVI38721 Seco Dias até seda 0,066 Seco ASI 0,109 Úmido Dias até seda 0,117 ZMJVI38714 Úmido Dias até seda 0,010 Úmido ASI 0,025 ZM_M40939 Seco ASI 0,109 Muitos desses eventos foram subseqüentemente testados com relação a aperfeiçoamentos na eficácia de germinação no frio e crescimento de mudas sob condições de frio e não provaram ser eficazes. Assim, não é provável que esses genes acionados pelo presente promotor funcionem em milho para aperfeiçoamento da germinação no frio ou crescimento de mudas sob condições de frio, mas diferentes promotores que acionam os mesmos genes ou proteínas de choque pelo frio diferentes podem funcionar em milho para aperfeiçoar esses fenótipos.

REIVINDICAÇÕES

Claims (7)

1. Método para produzir uma semente transgênica compreendendo um DNA recombinante que compreende a sequência de SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:64, que codifica uma proteína compreendendo um domínio de choque pelo frio, em que a expressão da referida proteína confere tolerância à seca a uma planta transgênica crescida a partir da semente comparada com uma planta não transformada da mesma espécie, a seca sendo simulada dando às plantas 95% ou menos água que uma planta controle e determinando diferenças em vigor, crescimento, tamanho ou comprimento de raiz, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) seleção de uma primeira planta compreendendo o DNA recombinante que compreende a sequência de SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:64; (b) introdução do referido DNA recombinante em uma segunda planta; (c) crescimento de sementes da segunda planta para produzir uma população de plantas; (d) seleção, na população de plantas, de plantas que exibem tolerância a estresse abiótico; (e) seleção, na referida população, de uma ou mais plantas que exibem tolerância a seca; (f) verificar se o referido DNA recombinante está estavelmente integrado nas referidas plantas selecionadas; (g) determinar se a planta selecionada expressa a proteína; e (h) coleta de sementes de uma planta selecionada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA recombinante é homozigótico.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido DNA recombinante compreende a sequência de SEQ ID NO:64.

4. Método de produção de uma safra de campo sob condições nas quais água seria limitativa para crescimento, caracterizado pelo fato de que compreende crescer plantas transgênicas tendo inserido, em seu genoma, um DNA recombinante que codifica uma proteína compreendendo a sequência de SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:64, que codifica uma proteína compreendendo um domínio de choque pelo frio, em que a expressão da referida proteína confere tolerância a seca a uma planta transgênica crescida a partir da semente comparada com uma planta não transformada da mesma espécie, a seca sendo simulada dando às plantas 95% ou menos água que uma planta controle e determinando diferenças em vigor, crescimento, tamanho ou comprimento de raiz.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de milho.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de soja.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de algodão.