FI103796B

FI103796B - Proteiini, jolla on kasvinsuojelullisia ominaisuuksia

Info

Publication number: FI103796B
Application number: FI953688A
Authority: FI
Inventors: Timo Korpela; Vitali Djavakhia; Natalia Batchikova; Radii Khomutov; Oleg Nikolaev
Original assignee: Timo Korpela; Univ Helsinki Licensing; Natalia Batchikova; Radii Khomutov
Priority date: 1995-08-02
Filing date: 1995-08-02
Publication date: 1999-09-30
Also published as: WO1997005165A1; FI953688A; DE69634137T2; FI953688A0; EP0868431A1; EP0868431B1; DE69634137D1; US6528480B1; ATE286070T1; AU6659896A; FI103796B1

Description

103796

Proteiini, jolla on kasvinsuojelullisia ominaisuuksia

Keksintö koskee biotekniikkaa, ja erityisemmin virus- ja sieni-infektioiden vastais-5 ta biologista kasviensuojelua. Keksintö koskee uutta proteiinia, joka eristettiin Bacillus thuringiensis -bakteerista, ja jota voidaan käyttää kasvitautien vastustamiseen biologisesti sekä myös sellaisten siirtogeenisten kasvien valmistuksessa, jotka ovat moniresistenttejä erilaisia kasvi viruksia ja kasvipatogeenisia sieniä vastaan.

10

Biologit saivat aikaan ensimmäiset siirtogeeniset kasvit alle 12 vuotta sitten. Siitä lähtien tutkijat ovat soveltaneet geenitekniikkaa yli 50 kasvilajiin. Tekniikka on ratkaisevasti auttanut tutkijoita ymmärtämään kasvien kehittymistä sääteleviä olennaisia prosesseja, ja ensimmäiset tällaiset geneettisesti muunnellut kasvit ovat 15 kaupallisesti saatavilla. Vaikka geenitekniikka on paljon monimutkaisempaa kuin perinteiset kasvi nj ai ostusmenetelmät, se on aivan yhtä turvallista. Molemmissa menetelmissä uusi DNA siirtyy kasvin genomiin, ja se säilyy ja ekspressoituu stabiilisti.

: : : 20 Noin neljä vuotta sitten USA:n Kansallinen Tiedeakatemia tuli raportissaan siihen : : · tulokseen, että "molekyyli-ja solumenetelmin muunneltujen viljakasvien ei pitäisi \: poiketa riskiltään niistä kasveista, joiden vastaavat ominaisuudet on muunneltu ; klassisten geneettisten menetelmien avulla". Suunnilleen samoihin aikoihin • · S Valkoinen talo määräsi, että geneettisesti muunneltuja tuotteita ei pitäisi säännellä • · · • · e *·' ’ 25 liittovaltion lisäsäännöksin, koska ne eivät aiheuta kohtuutonta riskiä.

• · ·

Eräs lupaavimpia geenisiirron taijoamista ominaisuuksista on tautiresistenssi.

• · · « « « ...

Virusresistenttejä kasveja kehiteltäessä on saatu aikaan erittäin mielenkiintoisia • · · : tuloksia, mikä on tärkeää, koska tällä hetkellä virusinfektoituneiden kasvien • · · • · 30 hoitamiseksi ei ole olemassa suoranaista keinoa. Useimmat infektiot alentavat , satoa, mutta toisinaan jotkut osoittautuvat katastrofaalisiksi. Hyvät maan- viljelysmenetelmät, kuten vuoroviljely ja rikkaruohojen poistaminen sekä meristeemiviljelmän käyttäminen, saattavat pitää sisällään viruksia, mutta vain 2 10379( osittain. Joskus insektisidejä käytetään viruksien välittämisestä vastuussa olevien tuholaisten vastustamiseksi, mutta erittäin spesifisissä ja rajoitetuissa tapauksissa.

Monsanton ja eräiden muiden yritysten tutkijat konstruoivat vektorin kasviviruksen 5 geenien viemiseksi ja ilmentämiseksi erilaisissa kasveissa. Näin muunnelluilla kasveilla suoritetut kokeet ovat osoittaneet, että virusgeenien ilmentäminen käsittää ainoastaan samojen viruskantojen resistenssin. Tämä tarkoittaa sitä, että tällaisen spesifisen resistenssin omaavan kasvin käytännön sovellukset voivat olla rajoitetut. Siitä huolimatta työntekijät ovat nyt saaneet aikaan lukuisille kasvilajeille tehok-10 kaan sietokyvyn yli kahtatoista erilaista kasvivirusta vastaan /Baulcombe, 1994/. Mutta kussakin näistä tapauksista rajoitetun resistenssin aiheuttama ongelma vaikuttaa aina näiden kasvien käytännön sovelluksiin. Eräs tämän ongelman mahdollisista ratkaisutavoista on sellaisten tekijöiden geenien käyttäminen, jotka indusoivat kasvien moniresistenssiä.

15

Keksinnön kohteena on uuden rakenteen omaava MF2-proteiini, joka voi indusoida kasvien resistenssin virus- ja sieni-infektioita vastaan. Proteiinin rakenne kuvataan SEQ. ID. NO. 2:ssa, tai se on sen toiminnallinen johdannainen, jolla on samat ominaisuudet Ϊ; 20

Keksintö koskee myös mainittua proteiinia koodaavaa eristettyä DNA-sekvenssiä, ;·.·\ jonka DNA:n sekvenssi on kuvattu SEQ. ID. NO. l:ssä, sellaisenaan tai minkä ♦ · « · : .·. tahansa DNA-sekvenssin osana, tai sen fragmenttia, jolla on samat ominaisuudet • ♦ ♦ • · · · kuin SEQ. ID. NO. l:n mukaisella DNA-sekvenssillä tai se on DNA-sekvenssi, ♦ · · 25 jonka kodonit ovat degeneroituneita edellä kuvattuun DNA:han nähden, tai sen j*;*. fragmentti, jolla on samat ominaisuudet.

• · · ♦ · · • · « .·. Keksintö koskee myös menetelmää MF2-proteiinin eristämiseksi ja puhdis- • · · · .···. tamiseksi mainittua proteiinia ilmentävistä bakteerisoluista.

30 • · • «

Edelleen keksinnön kohteena on proteiinin tai sitä sisältävien koostumusten käyttö • · · kasvinsuojeluaineena indusoimaan kasvien resistenssi kasvipatogeenisia viruksia ja sieniä vastaan.

3 103796

Olemme eristäneet Bacillus (huringiensis -mikro-organismista MF2-tekijän homogeenisena koostumuksena, joka indusoi alhaisena konsentraationa erilaisten kasvien moniresistenssiä virustartuntoja vastaan. Mainittu MF2-tekijä on lämmönkestävä, alhaisen molekyylipainon (7239 D) omaava proteiini. Tekijä on mitä ilmeisimmin 5 uusi proteiini, koska emme löytäneet täyttä homologiaa perusteellisen proteiinitie-tokantoihin kohdistuneen tietokonehaun avulla. Proteiini vaikuttaa olevan erittäin homologinen Bacillus-\a)in kylmäshokkiproteiinien kanssa /Schröder et ai., 1993, Willimsky et ai., 1992/, ja vähemmän homologinen E. colin kylmäshokkiproteiinien kanssa /Lee et ai., 1994/.

10

Keksinnön mukaista proteiinia voidaan käyttää kasvitauteihin liittyvien ongelmien ratkaisemiseksi. Lämmönkestäviä proteiinivalmisteita voidaan käyttää kasvien viruksettomassa meristeemiviljelytekniikassa. Vaikuttaa siltä, että tämän ekologisesti puhtaan kasveille myrkyttömän aineen käyttö voisi olla tehokasta erilaisten 15 maatalouskasvien viruksettomien kloonien saamiseksi. Tämän proteiinin rakenteen tunteminen tarjoaa mahdollisuuden geenirakenteiden konstruoimiseksi virus- ja muille taudeille resistenttien siirtogeenisten kasvien aikaansaamiseksi.

Tällaisilla siirtogeenisillä kasveilla on eräitä etuja. Tiedetään, että virusgenomin • i t .V. 20 osia sisältävät siirtogeeniset kasvit ovat yleensä erityisen resistenttejä tälle tietylle 4 I · . virukselle. Keksinnön mukaisesti käytetyllä mikro-organismilla ei ole mitään teke- * · · mistä luonnossa esiintyvien kasvipatogeenisten virusten kanssa, me olemme osoit- • · • ;1. taneet, että proteiini indusoi tupakkakasvien ei-spesifistä resistenssiä tupak- * · · « :2·1: kamosaiikkivirusta (TMV) sekä perunan X-virusta (PVX) vastaan.

25 : Perunakasvien käsitteleminen MF2:lla on toisaalta johtanut resistenssin indusoitu- • · · V 2 miseen Phytophtora infestansin late blight -tautia vastaan. Osoitettiin myös, että m ··. MF2-proteiini kykenee indusoimaan riisikasvien resistenssin riisin nokisienisai- «·<« :3: rautta vastaan, Pyricularia oryzae.

30 • ! · 2 • · · « «· 3 • · 103796 4

Olemme myös kloonanneet proteiinin geenin ja määrittäneet tämän geenin sekvenssin. Olemme myös määrittäneet koko aminohapposekvenssin MF2-pro-teiinin N-päästä lähtien.

5 Esillä oleva keksintö koskee aikaisemmin tuntematonta proteiinirakennetta, jolla on todistetusti aktiivisuutta erilaisia kasviviruksia ja kasvipatogeenisia sieniä vastaan. Tämän proteiinin geenin käyttäminen voisi ratkaisevasti lyhentää maatalouden uusien siirtogeenisten kasvilajikkeiden kehittämiseen kuluvaa aikaa, jolloin saadaan aikaan pysyvä ja stabiili moniresistenttisyys taloudellisesti tärkeitä kas-10 vipatogeenisia viruksia ja sieniä vastaan.

Siirtogeenisten kasvien, joihin tämän proteiinin geeni on konstruoitu, viljeleminen voisi korvata erittäin kalliin, käsityönä tehtävän meristeemiviljelyn, ja joissakin tapauksissa se voisi korvata viruksia välittävien tuholaisten vastaisten kemiallisten 15 insektisidien ja kasvipatogeenisten sienien vastaisten kemiallisten fungisidien käytön.

Edelleen eräs keksinnön kohde on menetelmä MF2-proteiinin eristämiseksi ja • · puhdistamiseksi sanottua proteiinia ilmentävistä bakteerisoluista, joka menetelmä 20 käsittää (a) bakteerisolujen uuttamisen sopivalla puskuriliuoksella kuumentamalla * ♦" korotettuun lämpötilaan, edullisesti kiehuvassa vesihauteessa, jotta suurin osa ···/ lämpöherkistä aineista voidaan poistaa uuteväliaineesta, ♦ · · φ · · * (b) raakapolypeptidin saostamisen alhaisessa lämpötilassa sopivalla saos- . 25 tusaineella, alhaisen molekyylipainon omaavien orgaanisten aineiden pois- « · · • · » lii tamiseksi proteiinifraktiosta, ♦ (c) saostuman suspension fraktioinnin anioninvaihtokromatografiapylvään läpi, ja • · · *./ antiviraalisen tai antifungaalisen aktiivisuuden omaavien fraktioiden i**': keräämisen, 30 (d) PAG-elektroforeesin suorittamisen antiviraalisen tai antifungaalisen ak tiivisuuden omaaville fraktioille, ja (e) geelistä eluoituneen proteiinin talteenottamisen.

103796 5

Kuumennusvaiheessa bakteerisolut, kuten Bacillus thuringiensis, edullisesti uutetaan kaliumfosfaattipuskurilla, pH:ssa 7,4, joka sisältää EDTA:ta, PMSF:ää (fe-nyylimetyylisulfonyylifluoridia), ME:tä (merkaptoetanolia) ja Triton X 100:aa (polyoksieteenieetteriä). Saostaminen suoritetaan edullisesti 2-6 °C:een läm-5 pötilassa viileän kloroformi-ja/tai propanoli- ja/tai ammoniumsulfaattiliuoksen avulla.

Edelleen eräs keksinnön kohde on MF2-proteiinin tai sanottua MF2-proteiinia sisältävän koostumuksen käyttö sekä tekniikan tason mukaisina kantajina ja apuai-10 neina että kasvinsuojeluaineena. Olemme osoittaneet kasvinsuojeluaktiivisuutta erityisesti tupakkakasveissa tupakkamosaiikkivirusta ja perunan X-virusta vastaan. Olemme myös osoittaneet perunakasveja suojaavaa aktiivisuutta Phyiophtora in-festansia vastaan ja riisikasveja suojaavaa aktiivisuutta Pyricularia oryzaeta vastaan.

15

Piirustuksessa, kuviossa 1 esitetään Bacillus thuringiensisista eristetyn proteiinitekijän antiviraali-. , nen aktiivisuus, ! ! 20 kuviossa 2 esitetään antiviraalisen tekijän puhdistaminen DEAE-Sepharosella, kuvioissa 3 ja 4 esitetään analyyttisen PAGE:n Triton X-100:n avulla saadut pro-teiinivyöhykkeet, • « • · : .·. kuviossa 5 esitetään analyyttisen SDS-PAGE:n proteiinivyöhykkeet, ja • · · e •*j·. kuviossa 6 esitetään Bacillus thuringiensisin MF2-proteiinin geeni- ja aminohap- 25 posekvenssit.

• ·· * · · « · · ϊ Γ: Seuraavissa kokeissa käytettiin Bacillus thuringiensis-kantuz VNPB-17-3 (Ali- .:. Russian Microbiological Collection), joka on eräs Moskovan alueen Odintsovo- • « « « piirikunnan maatilan pellolta peräisin olevan perunakasvin lehdistä eristetyistä 30 bakteerikannoista.

· • « < « 4 « · 4 « · « · 103796 6

Kannan VNPB-17-3 viljely-ja morfologiset ominaisuudet: Solut ovat sauvan-muotoisia (1,0-1,2 x 3-5 nm), suurin osa liikkuvia, flagella tyypillisesti lateraalinen. Muodostuu lämmönkestäviä endosporeja, ei useampaa kuin yksi itiöpesäkesoluihin. Gram-positiivinen. Itiöt ovat ellipsinmuotoisia. Itiöt ovat val-5 litsevasti keskellä. Glukoosin (ei arabinoosin, ksyloosin tai mannitolin, kun glukoosi korvataan näillä aineilla) vaikutuksesta syntyvät tuotteet: happoa kasvatettaessa seuraavalla kasvatuasalustalla (grammaa litraa kohti): (NH4)2HP04, 1,0; KC1, 0,2; MgS04 x 7 H20, 0,2; hiivauute, 0,2; agar, 15; bromikresolipurppura, 0,008; glukoosi (lisätty steriloinnin jälkeen), 5; käytetään vinopintoina. Toinen 10 glukoosin vaikutuksesta syntyvä tuote on asetoiini, kun viljellään seuraavalla kasvatusalustalla (grammaa litraa kohti): proteaasipeptoni, 7; glukoosi, 5; NaCl, 5. Kasvun optimilämpötila on 30 °C, minimi on 10 °C ja maksimi 45 °C. Optimi-pH on 7,0. Bakteeri kykenee sitomaan ilmakehän typpeä. Bakteeri on katalaasipositiivinen organismi. Tämä kanta ei kyennyt hajottamaan tyrosiinia.

15 Morfologisen, viljelyksellisen, fysiologisen ja biokemiallisen analyysin tulosten perusteella olemme päätelleet, että eristetty bakteerikanta kuuluu Bacillus thuringiensis -lajiin (suppeampi Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1980; de Barjac & Bonnefoi, 1967; Krieg A., 1968).

« * *’·* 20 Bacillus thuringiensis -kannan VNPB-17-3 keitetyn uutteen antiviraalinen aktiivisuus « · ί : : *11.* Esimerkki 1. Β. thuringiensis -proteiinin keitetyn uutteen valmistus • · · • · · 25 Bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 6 000 20 minuutin ajan • · ! * * * (Sorvall-RC28S-sentrifugi, GS-3-roottori) ja pestiin kahdesti tislatulla vedellä.

* · ·

Aines suspendoitiin uudelleen 100 ml.aan 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,4, • · · *..! joka sisälsi 4 mM EDTA:a, 1 mM PMSF:ää, 1 % merkaptoetanolia (ME) ja 0,1 % j

Triton X-100:aa. Bakteerisolut tuhottiin kuumentamalla 20 minuutin ajan kiehuvas-···· 30 sa vesihauteessa, ja niitä sentrifugoitiin nopeudella 6 000 20 minuutin ajan.

103796 7

Kaikki seuraavat puhdistusvaiheet suoritettiin alhaisessa lämpötilassa (2-6 °C). Supematantti käsiteltiin yhdellä tilavuudella kylmää kloroformia ja sentrifugoitiin nopeudella 3 000 20 minuutin ajan ja sen jälkeen nopeudella 20 000 (Sorvall-RC28S-sentrifugi, F26/50-roottori) 15 minuutin ajan. Sakka poistettiin ja aines 5 käsiteltiin 5 tilavuudella kylmää propanolia. Seosta säilytettiin yön yli -20 °C:ssa ja sentrifugoitiin sen jälkeen nopeudella 20 000 15 minuutin ajan. Supematantti lyofilisoitiin.

Esimerkki 2. MF2:n suojaavat ominaisuudet tupakkakasveissa tupak-10 kamosaiikkivirusta (TMV) vastaan

Seuraavat esimerkit havainnollistavat tiettyjä menetelmiä keksintömme toteuttamiseksi. Näissä kokeissa käytettiin B. thuringiensis -kannan VNPB-17-3 keitettyä uutetta. Tämä valmiste saatiin edellä kuvatun menetelmän mukaisesti.

15

Tupakkakasveja (Nicotiana tabacum var. Virginia ja Nicotiana glutinosa) kasvatettiin (noin kolme viikkoa) kuusilehtivaiheeseen ruukuissa mullassa, ilmas-tointikammiossa 60 %:n RH:ssa (suhteellisessa kosteudessa) ja 24 °C:een läm-Potilassa valoisia ja pimeitä jaksoja (12 tuntia kumpikin) käyttäen. Tupakanlehdet V.' 20 ympättiin siveltimen avulla käyttäen karborundumia hankausaineena. Kukin *·* kolmen viikon vanhan tupakanlehden puolikas hangattiin (karborundumin avulla)

; ·’ 0,3 milliä keitettyä B. thuringiensis -uutetta (50 g/ml lyofilisoitua uutetta 10 mM

| · ·

"// K-fosfaattipuskurissa, pH 7,0, 4 mM EDTAia, 1 mM PMSFia, 1 mM

| · · * ditiotreitolia). Samojen lehtien vastakkainen puoli käsiteltiin puskurilla (kontrolli).

. 25 Kahta päivää myöhemmin samojen lehtien molemmat puolet hangattiin tupak- T.:.; t'.Y. kamosaiikkivirussuspensiolla (200 g/ml, 10 mM K-fosfaattipuskurissa, pH 7,0, 0,3 • · · ml/lehdenpuolikas). Tyypillisiä taudin kehittymisen oireita (lehden vasen puoli) ja ·"·*· \/’ eristetyn MF2-tekijän antiviraalinen aktiivisuus (oikea puoli) esitetään kuviossa 1.

> * *": 30 Infektiovaurioiden määrä kussakin lehdenpuolikkaassa laskettiin kolmen päivän kuluttua. Taudin kehitys (%) mitattiin kokeessa syntyneiden vaurioiden 103796 8

Taulukko 1. Keitetyn B. thuringiensis-baktetriuuttecn (MF2) antiviraalinen aktiivisuus

Vaurioiden lukumäärä: MF2:lla käsitellyt lehdenpuolikkaat/käsittelemättömät leh-5 denpuolikkaat N. tabacum var. Virginia N. glutinosa 20/69 15/101 25/78 5/23 0/8 6/15 10 lukumäärän suhteessa kontrolliin. Tulokset esitetään taulukossa 1. B. thuringien-sisin keitetty uute on osoittanut TMV-infektion vastaista suojaavaa vaikutusta tup akk akasveissa.

Esimerkki 3.

15 MF2:n suojaavat vaikutukset tupakkakasveissa perunan X-virusta vastaan

Kummastakin kasvilajikkeesta (Nicotiana tabacum, lajikkeet Xanthy ja Virginia) • · · käytettiin neljää kolmen viikon ikäistä tupakkakasvia. Kasvien kolmatta ja neljättä ’·’· 20 lehteä (ylhäältäpäin laskettuna) hangattiin 0,5 ml:lla MF2-uutetta (50 pg/ml lyofi- • · · [;*·’ lisoitua uutesakkaa liuotettiin 10 mM:iin KH2P04-puskuria, pH 7). Kummankin • « · • ·* lajikkeen neljää kontrollikasvia käsiteltiin samalla puskurilla ilman uutetta. Päivän • · · • · · ’1.* kuluttua kaikki kasvit ympättiin perunan X-viruksella (PVX). PVX:ää käytettiin • · · • ♦ · täysin PVX:llä infektoituneiden perunoiden lehtiuutteena, jota säilytettiin pakastet- ... 25 tuna -70 °C:ssa.

• ♦ · • ♦ · ♦ » · • · · • ♦ · \ Kahden viikon kuluttua ymppäämisestä PVX:ää testattiin kaikissa käsitellyissä • · · • ....

lehdissä käyttäen standardi-ELISA-määritystä. ELISA-määritykset suoritettiin käyt- • « täen PVX-ELISA-kittiä (All-Russian Potato Research Institute, Malakhovka, Mos- • · · ♦ · *···' 30 kovan alue). Absorbanssit mitattiin käyttäen 0,1 % lehtinestettä standar- ’· dimääritysmenetelmien mukaisesti. Näiden kokeiden tulokset esitetään taulukossa 103796 9

Taulukko 2. MF2:n antiviraalinen aktiivisuus PVX:ää vastaan tupak-kakasveissa

Koevariantit Absorptio aallonpituudella 490 nm 5 var. Xanthy var. Virginia PVX +puskuri 2,47 ± 0,05 2,74 ± 0,15 PVX + MF2 0,15 ± 0,07 0,09 db 0,03

Negatiiivinen kontrolli 0,04 ± 0,02 0,03 ± 0,01

Positiivinen kontrolli 2,53 ± 0,14 2,63 ±0,15 10 2. Nämä tulokset osoittivat, että MF2:n suojaava aktiivisuus PVX:ää vastaan tupakkakasveissa on korkeaa tasoa.

15 MF2:n eristäminen ja puhdistaminen Bacillus Ihuringiensisistä • · ·

Esimerkki 4. Bakteerisolujen tuhoaminen ja fraktiointi orgaanisten liuot- • · · . .·. timien avulla.

• » · ♦ · j 20 Bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 6 000 20 minuutin ajan (So- • · · · j*:*: rvall-RC28S-sentrifugi, GS-3-roottori) ja pestiin kahdesti tislatulla vedellä. Aines suspendoitiin uudelleen 100 ml.aan 50 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,4, joka sisälsi 4 mM EDTA:a, 1 mM PMSF:ää, 1 % merkaptoetanolia (ME) ja 0,1 % • « « · Triton X-100:aa. Bakteerisolut rikottiin kuumentamalla 20 minuutin ajan kiehuvas- ·*·’; 25 sa vesihauteessa ja sentrifugoitiin edellä kuvatulla tavalla. Kaikki seuraavat puh- • · i * * ’: distusvaiheet suoritettiin alhaisessa lämpötilassa (2-6 °C). Supematantti käsiteltiin yhdellä tilavuudella kylmää kloroformia ja sentrifugoitiin aluksi nopeudella 3 000 ....: 20 minuutin ajan ja sen jälkeen nopeudella 20 000 (Sorvall-RC28S-sentrifugi, F26/50-roottori) 15 minuutin ajan. Sakka poistettiin ja aines käsiteltiin 5 103796 10 tilavuudella kylmää propanolia. Seosta säilytettiin yön yli -20 °C:ssa ja sentrifugoitiin sen jälkeen nopeudella 20 000 15 minuutin ajan.

Esimerkki 5. Anioninvaihtokromatografia 5

Sakka suspendoitiin 250 ml:aan 20 mM trietanoliamiinipuskuria, pH 7,5, joka sisälsi 1 mM EDTA:a, 1 mM PMSF:ää, 1 mM ditiotreitolia, ja pantiin (virtausnopeus 3 ml/min) pylvääseen, joka oli esitäytetty DEAE-Sepharose Fast Flow -geelillä (20 ml), ja tasapainotettiin samalla puskurilla. Eluointi suoritettiin 50 ml:n li-10 neaarisesti kasvavalla 0,3 M NaCl:n suolagradientilla (0-100 %, virtausnopeus 5 ml/min, fraktiotilavuus - 2,4 ml) ja havaittiin 280 nm:ssä (0,1 AU). Anioninvaih-tokromatografian DEAE-Sepharosella tulokset esitetään kuviossa 2. Antiviraalista aktiivisuutta sisältävät fraktiot (piikit Π, lilja IV) otettiin talteen, sekoitettiin, tyhjökuivattiin, saostettiin uudelleen 5 tilavuudella etanolia, pestiin kahdesti 70 % 15 etanolilla ja käytettiin seuraavassa preparatiivisessa PAGE-puhdistuksessa.

Esimerkki 6. Preparatiivinen PAGE

« · Käytettiin Mini-Protein II Electrophoresis System -systeemiä ("Bio-Rad"), 17,5 % 20 akryyliamidigeeliä (paksuus 1,6 mm) ja Laemmli-puskurisysteemiä, joka sisältää -SDS'- tai Triton X-100 -detergenttejä tai kaotrooppista ainetta, 8 M ureaa. Ajo- • olosuhteet olivat 200 volttia jatkuvalla jännitteen säädöllä ja ajoaika noin 1 tunti t : : *”.* kylmässä huoneessa. Elektroforeesin jälkeen geelin kontrolli kaista leikattiin ja • « · • · · * värjättiin Coomassie-sinisellä R-250 50 % metanolissa. Sen jälkeen kun väri oli . 25 poistettu 10 % etanolilla ja 5 % etikkahapolla taustan poistamiseksi, proteiini- « · t '1"·' vyöhykkeet leikattiin värjäämättömästä geelistä, homogenoitiin 50 mM kalium- • · · fosfaattipuskurilla, pH 7,5, joka sisälsi 1 mM EDTA:a, 1 mM PMSF:ää, 1 % • · · ME:ä, 0,1 % detergenttiä (SDS:ää tai Triton X-100:aa) ja ravisteltiin yön yli kyl- i : ‘' mässä huoneessa ravistaen. Näytteet haihdutettiin, pestiin kahdesti 70 % etanolilla, < 30 suspendoitiin uudelleen 10 mM kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka sisälsi 1 mM EDTA:a, 1 mM PMSF:ää, 1 mM ditiotreitolia, ja sen antiviraalinen aktiivisuus määritettiin.

103796 11

Proteiinivyöhykkeiden tehokkaampi erottuminen saatiin aikaan, kun käytettiin PAGE:a SDS:n tai 8 M urean kanssa, mutta näissä tapauksissa aines menetti an-tiviraalisen aktiivisuutensa. Myös geelin värjääminen Coomassie-sinisellä poisti aktiivisuuden. Tästä syystä bioaktiivisten proteiinivyöhykkeiden etsintään käytettiin 5 ei niin tehokasta, mutta denaturoimatonta PAGE:a Triton X-100:n kanssa ilman värjäystä. Eluoinnin jälkeen osasta ainesta mitattiin antiviraalisuus, toisesta osasta analysoitiin homogeenisuus analyyttisen PAGE:n avulla.

Esimerkki 7. Analyyttinen PAGE SDStllä ja Triton X-100:lla 10 Käytettiin Mini-Protein Π Electrophoresis System-nimistä systeemiä ("Bio-Rad”) ja Laemmli-puskurisysteemiä. Ajo-olosuhteet olivat samat kuin preparatiiviselle PAGE.lle. SDS:n tapauksessa käytettiin akiyyliamidigeelin vaiheittaista konsentraatiogradienttia 5, 12,5, 15 ja 17,5 %. Tätä menetelmää käytettiin myös 15 antiviraalisen tekijän detektoimiseksi eristyksen eri vaiheissa ja sen molekyylipai-non määrittämiseksi. Nämä tulokset on esitetty kuvioissa 3, 4 ja 5. Aktiivista näytettä B (kuv. 3) haihdutettiin ja käytettiin sekvenssianalyysiin.

• · *.·.· Kuviossa 3 preparatiivisesta PAGErsta eluoidut proteiinivyöhykkeet analysoitiin • * *·'·' 20 17,5 %:isella PAGE:lla käyttäen Triton X-100:a:. F tarkoittaa alkuperäistä bioak- • · * *·'·* tiivistä fraktiota DEAE-Sepharosen jälkeen (kuv. 2), A-E preparatiivisesta PA- Λ * 4 ' ·' GE:sta eluoituja proteiinivyöhykkeitä. B, C ja F ovat antiviraalisen aktiivisuuden 1 ♦ * • · ·

*;*.* omaavia vyöhykkeitä ja A, D ja E ovat inaktiivisia vyöhykkeitä. Symboli AVF

« · _ tarkoittaa antiviraalista MF2-tekijää.

. 25 t jiz

Kuviossa 4 analysoitiin DEAE-Sepharose-pylväästä eluoidut proteiinipiikit. F

• · · tarkoittaa alkuperäistä bioaktiivista fraktiota DEAE-Sepharosen jälkeen. D tarkoit- » /· taa piikkiä I, A piikkiä Π, B piikkiä ΠΙ ja C piikkiä IV. A, B ja C ovat antivi-raalisen aktiivisuuden piikkejä, D on inaktiivinen.

3o

Kuvio 5 esittää analyyttistä SDS-PAGE:a. Käytettiin akryyliamidigeelin vaiheittaista konsentraatiogradienttia 5, 12,5, 15 ja 17,5 %. I - IV ovat DEAE-Sepha- 103796 12 rosesta eluoituja proteiinipiikkejä, A on hiilihappoanhydraasi (mp 29 000), B on sytokromi C (mp 12 400), C on aktiivifraktio DEAE-Sepharose-pylväästä, D-E ovat preparatiivisesta PAGE:sta eluoituja proteiinivyöhykkeitä. II, IV, C ja E ovat antiviraalisen aktiivisuuden omaavia vyöhykkeitä, I ja D ovat inaktiivisia vyöhyk-5 keitä.

Johtopäätös.

Olemme eristäneet B. thuringiensis -bakteerista tekijän, joka voi suojata tupakka-kasveja TMV-tartuntaa vastaan. Tällä tekijällä on proteiiniluonne ja sen molekyy-10 lipaino on noin 8 000. Se on lämmönkestävä peptidi, mutta menettää raakauut- teena nopeasti aktiivisuutta (2 tuntia huoneen lämpötilassa), mikä voi johtua prote-aasiaktiivisuudesta. Tätä tukee antiviraalisen aktiivisuuden lisääntyminen puhdistuksen aikana (kts. taulukko 3). MF2 menetti antiviraalisen aktiivisuutensa, kun sitä oli käsitelty SDS:lla tai urealla. Voitiin todeta, että tämän proteiinin an-15 tiviraalinen aktiivisuus johtuu sen rakenteesta.

· * · · \v 20 • « • » · t ·

« I

• t : : 4 · · 4 • · · : : : . 25 • « «- • 4 · • 4 4 • •4 • · < • · 4 • · · • · # * · • · • 4 4 < f t » 4 1 · 4 30 4

< I J I I « I

103796 13

Taulukko 3. Antiviraalinen aktiivisuus MF2-puhdistuksen eri vaiheissa

Infektiotäplien lukumäärä 5 - _ kokeellinen / kontrolli

Preparaatti (kolme toistoa) 1. Elävä bakteeri, pesty kahdesti vedellä 102/96 112/120 45/36 10 2. Viljelysuodos 60/85 62/96 84/120 3. Keitetty uute 17/54 62/145 44/110 15 4. Propanolisaostus .V. 2 til.osaa propanolia 16/120 0/40 14/102 »y. 5 til.osaa propanolia 0/62 2/112 3/110 v f » * * • < » 5. Piikkien seos (II-IV) • » 20 DEAE-Sepharosen jälkeen 14/268 15/293 10/223 ··* f · · • » 6. MF2 preparatiivisen PAGE:n jälkeen (50 ng/ml)* 0/52 2/55 3/70 • · · • · « * · # m ·· * — - - . — — _ . | . ..I ------- . ..

t « K - " ' - " - = ' ! -u • · • · • · r 25 * Tämä on proteiinin pienin aktiivinen konsentraatio. Alkuperäinen proteiinimäärä, * yj· eluoitu geelistä (noin 10 pg) määritettiin Bredfordin (1976) menetelmällä ja sen '»•'J jälkeen se laimennettiin useita kertoja.

103796 14 MF2-vaImisteiden suojaavat vaikutukset sienisairauksia vastaan Esimerkki 8. MF2:n aktiivisuus nokisienisairautta vastaan S Sieni Käytettiin Pyricularia oryzae Cav.'in, riisin nokisienisairauden aiheuttajan luonnollista isolaattia H-5-3. Sientä viljeltiin 28 0 C:ssa agar-minimaalialustalla joka sisälsi 3 mg/ml kaseiinihydrolysaattia. Itiöt (konidiat) pestiin pois 10 vuorokautta vanhoista viljelmistä tislatulla vedellä (4°C). Myseeliepäpuhtaudet poistettiin 10 suodattamalla Miracloth-kankaan (Calbiochem-Behring Corp) ja kahden ruos tumatonta terästä olevan verkon (huokoskoko 50 μ) läpi. Itiösuspensio pestiin kaksinkertaisella sentrifugoinnilla 15 min nopeudella 7 000 x g ja suspendoitiin uudestaan tislattuun veteen. Itiökonsentraatio laskettiin hemosytometrissä mikroskoopin alla.

15

Kasvit Käytettiin edellä mainitulle sienikannalle herkkää riisiä Oryza sativa L. cv. Sha-tiao-tsao. Taimet kasvatettiin nelilehtivaiheeseen (noin 13-15 päivää) ruukuissa (10 tainta ruukkua kohti) mullassa ilmastointikammiossa 95 %:n suhteellisessa kos-20 teudessa, lämpötiloissa 30 °C ja 23 °C, valoisia ja pimeitä jaksoja (12 tuntia kumpikin) käyttäen. Valolähde (20 klux) oli 10 kW:n ksenonlamppu (DKsT-10000) jossa oli vesisuodatin.

• · • · • · • · · ♦ · · • » · i

Ymppäys ja taudin arviointi 25 Riisintaimet ruiskutettiin itiösuspensiolla (100 000 itiötä per ml, 5 ml suspensiota : ruukkua kohti). Käsitellyt taimet inkuboitiin 18-24 tuntia kosteuskammiossa pi- • · · meässä 23 °C:ssa ja sijoitettiin sitten valon alle ilmastoidussa kammiossa. Tautioi-reet määritettiin 10 päivän kuluttua. Ympin elävyyden testaamiseksi itiösuspension • · .*··. pisaroita inkuboitiin 15 tuntia kuoppalevyllä pimeässä 23 °C:ssa. Sen jälkeen 30 laskettiin itiöiden itävyys.

• ♦ * · • · 103796 15 Käsittely MF2-vaImisteilIa MF2-valmisteiden puskuriliuoksia lisättiin ymppiin (loppukonsentraatio oli 50 pg lyofilisoitua uutetta per ml itiösuspensiota). Kontrollinäytteet sisälsivät saman tilavuuden puskuria.

5 MF2-valmisteista ei mikään käytetyissä konsentraatioissa estänyt P. oryzae- itiöiden itämistä vedessä. Päinvastoin, valmisteiden lisääminen ymppiin suojasi riisin-taimet huomattavassa määrin nokisienisairaudelta (taulukko 4) 10 Taulukko 4. B. thuringiensis'istä saatujen MF2-valmisteiden aktiivisuus no-kisienisairautta vastaan

Bakteerivalmiste Proteiini Taimien Infektoituneiden Taudin ** (pg/ml) lukumäärä taimien lukumää- kehitys yksikkö) rä x infektio- (%) tyyppi * (a x b)

Keitetty uute 100 24 6 x 0,1; 4 x 1: 50 15 11x2; 3x3;

Sakka propanoli-käsittelyn jälkeen . . (5 til. osaa) 50 23 18x0,1; 5x1; 8,5 20 23 1x0; 13x0,1; 17 20 7x1; 2x2 '·*·* 5 26 1x0; 6x0, 1,5x1 46 : 12x2; 2x3 .. . Fraktiot pylväästä ; , * (eluointitilavuus : 25 52-54 ml) 3 22 2x0, 5x0,1; 31 • a · · i0xi; 5x2 • Kontrolli 23 1x0,1; 4x1; 70 13x2; 5x3 • · · • · · m *Infektiotyyppi määritettiin Latterelin menetelmän mukaisesti (Latterel et ai., ·*'*' 1964).

30 "Taudin kehitys laskettiin kaavasta: *: · R = X/ (a x b) x 100 , jossa .!!!: N x 3 R - taudin kehitys (%); 35 a - infektoituneiden taimien lukumäärä; 16 103796 b - infektiotyyppi; N - taimien kokonaismäärä; 3 - korkein infektiotyyppi.

S Esimerkki 9. MF2-valmisteiden suojaava vaikutus perunaruttoa vastaan

Koekasvit: Peruna (lajike Lorkh) viisi viikkoa vanha. Viidennestä (ylhäältäpäin laskettuna) täysin avautuneesta lehdestä leikattiin neljä pientä lehteä kutakin varianttia kohden ja käsiteltiin MF2-uutteella, joka lisättiin Phylophtora infestans -10 itiösuspensioon (103 itiötä/ml). MF2:n lopullinen konsentraatio seoksessa oli 50 pg lyofilisoitua uutetta ml:aa suspensiota kohti.

Kontrollivariantissa tartutettiin perunan lehtiä saman konsentraation omaavalla Ph. infestans -itiösuspensiolla. MF2-uutteen asemesta tähän suspensioon lisättiin sama 15 määrä puskuria.

Ymppiä (0,5 ml lehteä kohti) ruiskutettiin lehden pinnalle. Tartunnan jälkeen lehdet pantiin kosteuskammioon 2-3 päivän ajaksi 18-20 °C:ssa.

20 Tunkeutumisintensiteetti määritettiin laskemalla vauriokohtien lukumäärä leh- tipinnan cm2:ä kohti. Näiden kokeiden tulokset on esitetty taulukossa 5.

Taulukko 5. MF2:lla käsiteltyjen perunanlehtien pinta-alan cmz:ä kohti * ** olevien vauriokohtien lukumäärä

Kontrollivariantti 2,5 2,2 1,05 1,9 1,91 ± 0,62 ··· Koevariantti 0,02 0,08 0,10 0,001 0,05 ± 0,047 • · · • · · _______ _____ m mm m m + (P= 0,95) ‘30 «44 17 103796

Taulukon 5 tulokset osoittavat MF2-uutteen korkeata suoja-aktiivisuutta perunarut-toa vastaan. Koska mitään MF2:n inhiboivaa vaikutusta (käytetyissä konsentraati-oissa) itiöiden itämiseen ei havaittu, näyttää siltä, että suojaavaan aktiivisuuteen liittyy indusoidun resistenssin mekanismi.

5

Esimerkki 10. MF2:n N-pään sekvensointi

Suolat poistettiin MF2-proteiininäytteen puhtaimmasta fraktiosta käyttämällä Pro-Spin-kasettia (Applied Biosystems) valmistajan ohjeiden mukaisesti. NH2-pään 10 aminohapposekvenssianalyysi suoritettiin käyttämällä Applied Biosystems mallia 477A olevaa proteiinisekvenaattoria, joka oli varustettu on-line Applied Biosystems mallia 120A PTH olevalla aminohappoanalysaattorilla. Käytettiin standardi-sykliparametreja. MF2:n N-pään aminohapposekvenssi on esitetty taulukossa 6.

15 Taulukko 6 MF2-proteiinin N-pään sekvenssi 1. Met (M) 11. Ser (S) :Y: 2. Gin (Q) 12. Glu (E) 20 3. Thr (T) 13. Lys (K) 4. Gly (G) 14. Gly (G) : Y 5. Lys (K) 15. Phe (F) • · i.i : 6. Vai (V) 16. Xaa (X) • · · : 7. Lys (K) 17. Phe (F) 25 8. Thr (W) 18. Ile (I) • · · 9. Phe (F) 19. Glu (E) • · · \ * 10. Asn (N) 20. Vai (V) ♦ ♦ · . ----- — * · 30 103796 18

Esimerkki 11. Ä thuringiensisista saadun MF2-geenin kloonaus ja sekvensointi N-pään aminohapposekvenssin mukaisesti syntetisoitiin degeneroitu 5'-ATG-5 CA(A/G)ACIGGIAA(A/G)GTIAA(A/G)TGGTT(T/C)AA(T/C)-3'. Suurimole- kyylipainoista DNA:ta eristettiin B. thuringiensis -soluista ja käsiteltiin 8 restrik-taasilla (BamHI, EcoRI, Hindlll, Sali, Sacl, PstI, Sphl ja Ndel) erikseen ja pareittain. Restriktiotuotteet erotettiin molekyylipainon mukaan agaroosigeelielektro-foreesilla ja siirrettiin HybondN-membraanille blotting-tekniikkaa käyttäen. Syn-10 teettistä oligonukleotidia leimattiin T4-polynukIeotidikinaasilla ja [-32P]ATP:lla ja käytettiin radioaktiivisena koettimena Southem-hybridisaatiokokeissa. Röntgen-filmeillä esiintyi vain yksi positiivinen vyöhyke restriktiota kohti. Positiivisesti hybridisoitujen fragmenttien molekyylipainojen perusteella konstruoitiin MF2:n kromosomaalisen geenin restriktiokartta. Kromosomaalisen DNA:n Pstl-diges-15 tiotuote siirrettiin 0,65%:iselle alhaisessa lämpötilassa geeliytyvälle agaroosille ja elektroforeesin jälkeen eristettiin geelistä noin 5,6 kbp:n kokoa olevat DNA-fragmentit. Nämä pilkottiin edelleen HindIII:lla ja BamHLlla, siirrettiin 0,8 %:iselle alhaisessa lämpötilassa geeliytyvälle agaroosigeelille, ja elektroforeesin jälkeen eristettiin noin 1,6-1,7 kbp:n DNA-fragmentit. Nämä liitettiin HindllLlla ja ' ' ‘ 20 BamHLlla pilkottuun pUC18-vektoriin. Kompetentit E. coli -solut (kanta XL1- ' blue) transformoitiin tällä ligaatioseoksella ja kasvatettiin LB-maljoilla, jotka sisäl- sivät ampisilliiniä (50 mg/1). Pesäkkeet siirrettiin HybondN-membraanille ja niille • · I *. suoritettiin pesäkehybridisaatiokäsittely käyttäen radioaktiivista oligonukleotidia | : : 'V..' koettimena. Noin 70 %:lla pesäkkeistä oli positiivinen hybridisaatio.

25 . .·. Eristettiin plasmidi-DNA positiivisesta kloonista ja käytettiin insertin sekvensoin- • · · • · · tiin. Antiviraalisen proteiinin N-päätä koodaava DNA-sekvenssi näytti sijaitsevan lähellä Hindlll-kohtaa. Löydettiin avoin lukukehys, 198 bp, alkaen ATG:sta ja » » · * -. * päättyen TAA:han. DNA-koodausalueen mukaisesti antiviraalinen proteiini koostuu ·* 30 66 aminohappotähteestä (Kuv. 6). Laskettu molekyylipaino on 7239 D, laskettu • « · ’·*, isoelektrinen piste on 4,43 ja molaarinen absorptiviteetti on 5690.

• « 103796 19 Tässä esimerkissä kuvataan MF2:n B. (huringiensis -geenin siirtoa E. colin kloo-nausvektoriin.

Käyttämällä luonnollisten restriktiokohtien synteettisiä oligonukleotideja geeni 5 voidaan siirtää kyseiselle organismille spesifisten transkriptio- ja translaatiosääte-lyelementtien ohjauksen alla, Sambrook et ai., (1989) mukaisesti.

MF2-proteiinia koodava DNA-sekvenssi voidaan kloonata mihin tahansa kloonaus-ja/tai ekspressiovektoriin mitä tahansa organismia varten, bakteereista korkeampiin 10 eukaryootteihin, kasvit mukaanlukien, käyttämällä apuna yleisesti käytössä olevia geenitekniikan menetelmiä, kuten on selitetty esimerkiksi teoksessa Sambrook et ai. (1989).

• « · • · • · • ♦ · • · · I I | « · ·

• t I

• 4 • · 4 · 4 4 4 4 4 4 444 4 ··· 4 4 4 ♦ · · «·· * 4 4 • 4 « 4 4 4 4 4 4 ♦ * 4 4 « • • · 4 4

I I I I

• « ·

♦ I

• · • « · « «44 • | • Φ • f ♦ ♦ • · · • 4 4 » 103796

VIITE JULKAISUT

de Barjac H, ja A.Bonnefoi. 1967. A classification of strains of Bacillus thurin-giensis Berliner with a key to their differentiation. // J. Invertebr. Pathol. 11, 5 s.335-347.

Baulcombe D. 1994. Novel strategies for engineering virus resistance in plants. // Current Opinion in Biotechnology. Vol. 5, nro 2, s.l 17-124.

Bredford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal.

10 Biochem.. Vol. 72. s.276-287.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4,// Nature, Vol. 227, s.680-685,

Latterell F.M., Marchetti M.A., Grove B.R. 1964. Co-ordination of effort to establish an international system for race identification in Pyricularia oryzae // The 15 Rice Blast Disease. Baltimor, Maryland: The Johns Hopkins Press: s. 257-268.

Lee S. J., Xie A., Jiang W., Etchegaray J.-P., Jones P.G. ja Inouye M. 1994. Family of the major cold-shock protein, CspA (CS7.4), of Escherichia coli, whose members show a high sequence similarity with the eukariotic Y-box binding pro-. . teins. // Molecular Microbiology, 11 (5), s.833-839.

! ' 20 Krieg A. 1968. A taxonomic study of Bacillus thuringiensis Berliner.// J. Invertebr.

Pathol. 12, s.366-378.

« · * '

Sambrook J., Fritsch E.F. ja Maniatis T., 1989. Molecular cloning, Cold Spring • · ; .·. Harbor Laboratory Press.

• « ·

Schröder K., ZuberP., Willimsky G., Wagner B. ja Marahiel M.AA993. Mapping 25 of the Bacillus subtilis csp B gene and cloning of its homologs in thermophilic, ; mesophilic and psychrotrophic bacilli. // Gene, 136, s.277-280.

♦ · ·

The shorter Bergey's manual of determinative bacteriology // The Williams and Wilkins Company, Baltimore. Ed. by Holt. 1980. s.495.

,1" . Willimsky G., Bang H., Fisher G., Marahiel M.A., Characterization of csp B, ’ . 30 a Bacillus subtilis-'mdndble cold shock gene affecting cell viability at low temperatures.// J. Bacteriol. 174: 6326-6335 (1992).

103796 21

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT: {i) HAKIJA: (A) NIMI: Helsinki University Licensing Ltd Oy (B) KATU: Koetilantie 3 (C) KAUPUNKI: Helsinki (E) MAA: Finland (F) POSTINUMERO: 00710 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Proteiini, jolla on kasvinsuojelullisia ominaisuuksia (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 2 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, Versio #1.25 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 201 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genomi) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Bacillus thuringiensis (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: väli 1..201 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1: ATG CAA ACA GGT AAA GTT AAA TGG TTC AAC AGC GAA AAA GGT TTC GGT 48 ! Met Gin Thr Gly Lys Vai Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly :,i,: 15 10 15

(I I 4 4 S

• ·* TTC ATC GAA GTT GAA GGT GGA GAC GAT GTA TTC GTT CAC TTC TCA GCT 96 J J*J Phe Ile Glu Vai Glu Gly Gly Asp Asp Vai Phe Vai His Phe Ser Ala *".* 20 25 30 • e e • · « ATC CAA GGT GAC GGA TTC AAA ACT TTA GAA GAA GGT CAA GAA GTT TCT 144

Ile Gin Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gin Glu Vai Ser 35 40 45 e

«M

V * TTC CAA ATC GTT GAA GGT AAC CGT GGA CCA CAA GCT GCT AAC GTT ACA 192 • Phe Glu Ile Vai Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gin Ala Ala Asn Vai Thr •f* 50 55 60 • a < · « « « AAA AAC TAA 201

Lys Asn 65 • ·

• · S

• · · • · 22 103796 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 66 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 2:

Met Gin Thr Gly Lys Vai Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly 15 10 15

Phe Ile Glu Vai Glu Gly Gly Asp Asp Vai Phe Vai His Phe Ser Ala 20 25 30

Ile Gin Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gin Glu Vai Ser 35 40 45

Phe Glu Ile Vai Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gin Ala Ala Asn Vai Thr 50 55 60

Lys Asn 65 • * • · • · j : : • · · · « ·· i : : • · · • · · • · · » · · • I · • · · • · · • · · i'' : IM·

Claims

103796

1. Eristetty DNA-sekvenssi, joka sisältää MF2-proteiinia koodaavan nukleotidi-sekvenssin, jolla proteiinilla on SEQ. ID. NO. 2:ssa kuvattu aminohapposekvenssi, S tai sen funktionaalisen johdannaisen, jolla on samat ominaisuudet.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, joka on (a) DNA-sekvenssi, joka on esitetty SEQ. ID. NO. l:ssa, sellaisenaan, tai osana mitä tahansa DNA-sekvenssiä, tai sen fragmentti, jolla on samat ominaisuu- 10 det kuin SEQ. ID. NO. l:n mukaisella DNA-sekvenssillä, tai (b) DNA-sekvenssi, jossa on degeneroituneet kodonit kohdassa (a) esitetyn DNA-sekvenssin suhteen, tai sen fragmentti, jolla on samat ominaisuudet.

3. MF2-proteiini, jolla on SEQ. ID. NO. 2:ssa esitetty aminohapposekvenssi, sel-15 laisenaan, tai osana suurempaa proteiinia, tai sen funktionaalinen johdannainen, jolla on samat ominaisuudet.

4. Menetelmä patenttivaatimuksessa 3 määritellyn MF2-proteiinin eristämiseksi ja puhdistamiseksi sanottua proteiinia ilmentävistä bakteerisoluista, joka menetelmä 20 käsittää (a) bakteerisolujen uuttamisen sopivalla puskuriliuoksella kuumentamalla koro- '·'·* tettuun lämpötilaan, jotta suurin osa lämpötilaherkistä aineista voidaan pois- • · · ’···* taa uuteväliaineesta, ·· · • · « | ·* (b) raakaproteiinin saostamisen alhaisessa lämpötilassa sopivalla saostusaineella ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ · *'*.* 25 alhaisen molekyylipainon omaavien orgaanisten aineiden poistamiseksi pro- • · · • · · teiinifraktiosta, . (c) saostuman suspension fraktioinnin anioninvaihtokromatografiapylvään läpi, ja • · · antiviraalisen tai antifungaalisen aktiivisuuden omaavien fraktioiden kerää-• · · ' misen, 4 4 ' • · · ’ ’ 30 (d) PAG-elektroforeesin suorittamisen antiviraalisen tai antifungaalisen ak- . tiivisuuden omaaville proteiinifraktioille, ja • · * ’* (e) geelistä eluoidun proteiinin talteenottamisen. ♦ ♦ · • « • · 103796

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisolut ovat Bacillus thuringiensisistä.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuumennus (a)-5 vaiheessa tapahtuu kiehuvassa vesihauteessa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerisolut uutetaan kalium-fosfaattipuskurilla pH 7,4, joka sisältää EDTA:ta, PMSF:ää, merkap-toetanolia ja Triton X-100:aa. 10

8. Jonkin patenttivaatimuksista 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostus (b)-vaiheessa suoritetaan noin 2-6 °C:ssa viileällä kloroformilla ja/tai propanolilla ja/tai ammoniumsulfaattiliuoksella.

9. Vektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen DNA-sekvenssin.

10. Kasvinsuojeluaine, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaista MF2-proteiinia sekä mahdollisesti tavanomaisia kantaja-aineita ja/tai lisäaineita.

11. Patenttivaatimuksen 3 mukaisen proteiinin käyttö kasvinsuojeluaineena. • « «

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö kasvinsuojeluaineena kasvien viruksetta- • · · : V massa meristeemiviljelyssä. • · • · · • · · • · · I • · · • · · ’·' 1 25 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö suojan antamiseksi tupakan mosaiikkivirusta tai perunan X-virusta vastaan tupakkakasveilla. • · 1 · · • · ·

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö perunakasvien suojelemiseksi Phytophtora • · ·: infestansin aiheuttamaa perunaruttoa vastaan. '···' 30

15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö riisikasvien suojelemiseksi Pyricularia ·.1·: oryzaen aiheuttamaa riisin nokisienisairautta vastaan. 103796

16. Menetelmä kasviresistenssin indusoimiseksi virus- tai sienikasvipatogeeneja vastaan, tunnettu siitä, että kasveille levitetään kasvin suojelemiseksi tarvittava määrä patenttivaatimuksen 10 mukaista kasvinsuojeluainetta. 5