HU220078B - Transzgénikus növények, inszekticid szerek és növényvédelmi eljárások - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya elsősorban transzgenikus növényekkel és növényisejtekkel foglalkozik, amelyek a rekombináns DNS-technikaalkalmazásával úgy vannak transzformálva, hogy az Arthropoda törzsképviselőiből, különösen az Arachnida (pókfélék) osztályánakképviselőiből, mindenekelőtt a Scorpiones rend képviselőiből, valamintelőnyösen a Chilopoda (százlábú) osztály képviselőiből való, rovarokraszelektíven ható toxinokat képesek szintetizálni fitopatogén rovarokellen. Ilyen toxin például a Leiurus quinquestriatus hebraeus skorpiómérgéből származó, VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGLYLQWAGKYGNACWCYA LPDNVPIRVP GKCR aminosavszekvenciájú toxin. A találmánytárgyát képezik a toxinok elleni antitestek és azok az inszekticidszerek is, amelyek a nevezett toxint tartalmazzák. A szereketnövényvédelmi eljárások keretében alkalmazzák. ŕ

Description

A találmány transzgenikus növényekkel és növényi sejtekkel foglalkozik, amelyek a rekombináns DNS-technika alkalmazásával úgy vannak transzformálva, hogy képesek rovarokra szelektíven ható mérgező toxinokat, előnyösen az Arachnida (pókfélék) osztályának képviselőiből, mindenekelőtt a Scorpiones rend képviselőiből, valamint különösen a Chilopoda (százlábú) osztály képviselőiből való toxinokat szintetizálni. A találmány további tárgyát képezik a nevezett toxinok és olyan inszekticid szerek, amelyek a nevezett toxinokat tartalmazzák.

A toxinok olyan anyagok keverékei, amelyek a mérgező állatok testében levő speciális mirigyekben keletkeznek. A méreg a prédaállatba vagy ellenségbe egy szúró-ütő berendezés segítségével jut be, hogy azt megbénítsa és/vagy elpusztítsa. A skorpiók mérge egy sor fehérjét, illetve neurotoxint tartalmaz, amelyek mérgezőek és az idegrendszerre hatnak. Az egyes neurotoxinok működése különbözik a különféle állatfajok esetében.

A skorpió mérge a polipeptid-neurotoxinoknak három fő csoportját tartalmazza, amelyek az axonális membrán-vezetőképességet nátriumra megváltoztatják. A neurotoxinok első csoportja az α-toxinokból keletkezik, amelyek speciális emlősállatokat az akciópotenciál rendkívüli meghosszabbodása révén gátolják, ami a nátriumcsatomák lelassítására vagy blokkolására vezethető vissza az aktiválásánál (Catterall, 1984; Rochat és munkatársai, 1979). Az AaHl és AaH2 α-toxinokat az Androctonus australis Hector mérge [amelyből az első izgató, rovarokra ható toxint, az AalT-t izolálták (Zlotkin és munkatársai, 1971a)] tartalmazza. Ezek az α-toxinok a dongólégylárvákra nem mutatnak hatást (Zlotkin és munkatársai, 1971c). A neurotoxinok második csoportja a rovarokra gátló hatású toxinokból keletkezik, amelyek a rovarok progresszíven kifejlődő, lassú bénulását okozzák, amelyben a nátriumáram elfojtása révén az akciópotenciál jelentősen blokkolódik (Lester és munkatársai, 1982; Zlotkin és munkatársai, 1985). A neurotoxinok harmadik csoportja az izgató, rovarokra szelektíven ható toxinokból keletkezik, amelyek a rovarok azonnali (knock down) görcsös bénulását idézik elő, amelyben a nátrium-csúcsáramlás növekedése és inaktiválásának feszültségfüggő lassítása a rovarok motorikus idegeiben ismételt izgalmi állapotot indukál (Walther és munkatársai, 1976; Pelhate és Zlotkin 1981).

A skorpióméregből származó, rovarokra ható toxinok kimutatását és ellenőrzését izolálásuk folyamán előnyösen a Sarcophaga-lárvák tipikus reakciójának segítségével végezzük, amely az azonnali és gyors összehúzódás-gátlásban mutatkozik meg az izgató toxin által, és a progresszíven kifejlődő elernyedésben mutatkozik meg a gátló toxin által (Zlotkin és munkatársai, 1971b; Lester és munkatársai, 1982). Az ellentétes kórtünettan ellenére, amely a fenti gátló és izgató, rovarokra ható toxinokkal indukálódik, mindkét csoport kizárólag a membrán nátriumra való áteresztőképességére hat, és mindkettő a rovameuronok membránjában levő ugyanazon kötőhelyen osztozik (Zlotkin és munkatársai, 1985; Gordon és munkatársai, 1984).

Rovarokra szelektív toxinok találhatók egy sor más Arthropoda mérgében is (Zlotkin, 1985). A fürkészdarazsak mérge rendkívül toxikus a lepkék lárváira. A Bracon hebetor fürkészdarázs mérge elernyesztő bénulást okoz a pillangólárvákban, amelyben a rovarok neuromuszkuláris véglapján az izgató glutaminerg-átvitelnek preszinaptikus megszakadása indukálódik (Piek és munkatársai, 1982). A remetedarázs mérge nagyszámú, különböző rendbe tartozó rovarra és pókra hat (Rathmeyer, 1962). Ezekre a mérgekre példa a Philanthus triangulum mérge, amely a rovarokban elernyesztő bénulást okoz; ez lényegében a neuromuszkuláris átvitel preszinaptikus blokádjára vezethető vissza; ez a méreg gátolja mind az izgató, mind a gátló átvitelt (May és Piek, 1979). A Latrodectus mactans, a „fekete özvegy” pók mérge olyan alkotórészeket tartalmaz, amelyek rovarokra neurotoxikusak, de emlősállatokra nem, és olyanokat, amelyek speciális rákokat gátolnak (Fritz és munkatársai, 1980; Omberg és munkatársai, 1976).

A Scolopendra nem százlábújainak mérgét Jangi (1984) ítja le. (Mivel a Scolopendra nem százlábújai csekély jelentőséggel bírnak a népegészségügyben, mérgüket eddig kimerítően nem tanulmányozták és jellemezték.)

A jelen találmány egyik célja olyan transzgenikus növények, amelyek genetikailag közvetített rezisztenciával bírnak rovarok ellen, kialakítása olyan módon, hogy azt a DNS-szekvenciát, amely a rovarokra szelektíven ható toxinok növényi szövetek általi termelését indukálja, bevezetjük. A jelen találmány szerinti egyik feladat a mérgekben található toxinokat olyan formába hozni, amely lényegében mentes a természetes szennyeződésektől. Az ilyen tisztított toxinok értékes inszekticidek.

A jelen találmány olyan, rovarok ellen szelektíven ható toxinokra vonatkozik, ahol a toxintermelők előnyösen az Arthropoda törzs képviselői, elsősorban az Arachnida (pókfélék) osztályának képviselői, mindenekelőtt a Scorpiones rend képviselői, valamint a Chilopoda (százlábúak) osztály képviselői.

A jelen találmány foglalkozik továbbá transzgenikus növények előállításával, amelyek rezisztenciája rovarok ellen azon alapszik, hogy a növényi genom tartalmazza azokat a géneket, amelyek a rovarokra szelektíven ható toxinok termelését indukálják a növényi szövetek révén. A találmány foglalkozik továbbá olyan rekombináns DNS-molekulákkal, amelyek olyan génszekvenciát foglalnak magukban, amely rovarok ellen szelektíven működő toxint kódol. így a rovarokra toxikus, transzformáit növényi sejtek és ezekből transzformált növények keletkeznek. A találmány szerint növényi sejteket transzformálunk, amely művelet a sejteknek a kifejeződés következében rovarok elleni toxicitást kölcsönöz.

A találmány tárgyát képezik a transzformált növényi sejtekből regenerált növények szaporítóanyagai is.

A jelen találmány magában foglal egy eljárást is növények vagy növényrészek védelmére rovartámadás ellen, amely azon alapszik, hogy a növényekre vagy növényrészekre, amelyeket védeni kívánunk, inszekticidként hatásos mennyiségű toxint viszünk rá.

ί

HU 220 078 B

Ez az eljárás azoknak a növényeknek vagy növényrészeknek védelmére hasznos, ideértve a növények magjait is, amelyeket a rovarok veszélyeztetnek.

A jelen találmány foglalkozik a klónozó vektorokkal és klónozó gazdaszervezetekkel, valamint azokkal az eljárásokkal, amelyek a növényeknek rovarok elleni tűrőképességet kölcsönöznek.

A találmány foglalkozik továbbá olyan antitestekkel is, amelyek ehhez a toxinhoz képesek kötődni.

Az alábbiakban az ábrák rövid magyarázatát adjuk meg.

1. ábra: A pRK252/Tn903/BglII megalkotása

2. ábra: A pCIB5 megalkotása

3. és 4. ábra: A pCIB4 megalkotása

5. ábra: A pCIB2 megalkotása

6. ábra: A pCIBIO, egy széles gazdatartománnyal bíró plazmid megalkotása, amely T-DNS-határszekvenciákat és egy növényszelekcióhoz szolgáló gént tartalmaz.

7. ábra: Különböző skorpiótoxinok aminosavszekvenciája, amelyek például a 10. példában vannak leírva. Az LqhIT2 a 10. példában példaszerűen leírt toxin. Az LqqIT2 rovarokra gátló toxin az L. quinquestriatus quinquestriatisból, amely toxin tisztítását Zlotkin és munkatársai (1985) írják le. A BjIT2 rovarokra gátló toxin Buthotus judaicusból, amelynek tisztítását Lester és munkatársai (1982) írják le. Az LqhP35 itt van leírva; ez olyan köztes toxin, amely a rovarok nátriumcsatomáját valamely módon korlátozza, amely nagyon hasonlít ahhoz a hatáshoz, amellyel az a-toxin az emlősállatok nátriumcsatomájára hat. Az smp-toxint a Scorpio maurus palmatus (Chactidaecsalád) mérgéből nyerjük. Az SmpIT2 rovarokra ható toxin, amelyek tisztítását Lazarovici és munkatársai (1982) írják le. Az SmpCT2 és SmpCT3 rákfélék (Crustaceae) ellen ható toxin, amelynek tisztítását Lazarovici és munkatársai (1984) írják le. Az SmpMT egy emlősállatok ellen ható toxin, tisztítását Lazarovici és Zlotkin (1982) írják le.

8. ábra: Az AalT-hez szolgáló gének szekvenciájának szintézise. Az la szekvencia a kódoló szál szekvenciáját mutatja. Az lb szekvencia a komplementer szál szekvenciáját mutatja. Az le szekvencia a szintetizált fragmentumok szekvenciáját mutatja. Az ld szekvencia a végleges gén szekvenciáját mutatja.

9. ábra: Annak a génnek a szekvenciája, amely a rovarok ellen ható LqhIT2 toxint kódolja.

Rövidítések

AalT: Az Androctonus australis rovarok ellen ható toxinja

LqhP35: Az Lqh jelzi a skorpiót, a P a paralízisre utal, és 35 az elúciós időnek felel meg a HPLC oszlopon

HPLC: nagyteljesítményű folyadékkromatográfia

MT: molekulatömeg

SDS-PAGE:	: nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélelektroforézis
PU:	bénítási egység (paralízisegység)
3,4-DAP:	3,4-diamino-piridin
LD:	halálos (letális) adag
pl:	izoelektromos pont
bp:	bázispár
CaMV:	karfiolmozaik-vírus
Asp-N:	Asp-N Pseudomonas fragi endoproteináz
Lys-C:	lizin-endopeptidáz
Glu-C:	V8 Staphylococcus aureus proteáz
RSA:	szarvasmarhaszérum-albumin
TTX:	tetradotoxin
PEG:	polietilénglikol
trisz.HCl:	trisz(hidroxi-metil)-metil-amin-hidroklorid
EDTA:	etilén-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav
TFA:	trifluor-ecetsav
4-AP:	4-amino-piridin
NPT:	neomicin-foszfotranszferáz
STX:	Saxitoxin
t/v:	tömeg/térfogat
TEA:	tetraetil-ammónium-hidroxid
ATCC:	American Type Culture Collection, Rockville, Maryland
D:	dalton

1. Állati mérgekből eredő, rovarok ellen szelektíven ható toxinok

Egy rovarok ellen működő toxin, egy Androctonus australisból való izgató toxin (AalT) aminosavszekvenciáját először Darbon és munkatársai (1982) határozták meg és hozták nyilvánosságra. Ennek a neurotoxinnak az aminosavszekvenciája a következő: KKNGYAVDSS GKAPECLLSN YCNNQCTKVH YADKGYCCLL SCYCFGLNDD KKVLEISDTR KSYCDTTIIN.

Az LqqIT2 egy, az L. quinquestriatus quinquestriatusból való, rovarokat gátló toxin (Zlotkin és munkatársai, 1985) az alábbi aminosavszekvenciáival: DGYIRKRDGC KLSCLFGNEG CNKECKSYGG SYGYCWTWGL ACWCEGLPDE KTWKSETNTC G.

A BjIT2 egy, a Buthotus judaicusból való, rovarokat gátló toxin (Lester és munkatársai, 1985). A BjIT2 két izo-formában létezik, amelyek az aminosavszekvencia 15. helyében különböznek. Az 1. forma ebben a helyben izoleucint, míg a 2. forma valint tartalmaz. Ennek a neurotoxinnak az aminosavszekvenciája az alábbi:

DGYIRKKDGC KVSC(V/I)IIGNEG CRKECVAHGG SFGYCWTWGL ACWCENLPDA VTWKSSTNTCG.

Az LqhIT2 az L. quinquestriatus hebraeusból való, rovarokat gátló toxin, amelyet fordított fázisú HPLCvel tisztítunk. Ennek a neurotoxinnak az aminosavszekvenciája az alábbi:

DGYIKRRDGC KVACLIGNEG CDKECKAYGG SYGYCWTWGL ACWCEGLPDD KTWKSETNTC G.

Az SmpIT2, a Scorpio maurus palmatus (Chactidae család) skorpióból való, rovarok ellen gátló hatású toxin (Lazarovici és munkatársai, 1982) az alábbi aminosavszekvenciájú: ALPLSGEYEP CVRPRKCKPG LVCNKQQICV DPK.

HU 220 078 Β

A találmány szerinti toxin, az LqhP35 a dongólégylárvák lassító és tartós kontrakcióbénulását indukálja. Ez valamilyen módon a rovarok nátriumcsatomáját korlátozza, amely nagyon hasonlít ahhoz a hatáshoz, amellyel az α-toxin az emlősállatok nátriumcsatomájára hat. Ez a neurotoxin egy sárga skorpióból, az L. quinquestriatus hebraeus, Buthinae, Buthidae-ből ered és az alábbi aminosavszekvenciával bír:

VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGYCQWAG KYGNACWCYA LPDNVPIRVP GK.CR.

Összehasonlítva az izgató és gátló, rovarokra ható toxinokkal, amelyek a Buthinae-skorpiók mérgéből származnak, (a) ez a toxin eltérő kórtünetet indukál dongólégylárvákban (PU: 14 ng/100 mg testtömeg); (b) ez a toxin nem képes arra, hogy a jelzett, rovarokra izgatóan ható ¹²⁵I AalT-t a rovarok neuronális membránján levő kötőhelyéről kiszorítsa; (c) ez a toxin nagyon hatásos Crustaceae ellen (20 ng/100 mg testtömeg) is, míg nagyon gyengén toxikus egerekre (100 pg/20 g testtömeg); és (d) ez a toxin teljesen más hatással van a nátriumvezetőképességre egy rovaraxon preparátumában.

Rendkívül alacsony toxicitása ellenére emlősállatok ellen az LqhP35 toxin erős funkcionális és szerkezeti hasonlóságot mutat az α-toxinokkal, amelyek az emlősállatokra hatnak és a Buthinae-skorpiók mérgéből származnak, és amelyek a gerinces állatokban a nátriumcsatorna feszültségfüggő vagy kapuszerkezetén kötődnek. Kimutatható (Catterall, 1984), hogy (a) ez az akciópotenciál rendkívüli megnyúlását okozza rovaraxonok preparátumában (mintegy két nagyságrenddel kisebb koncentráció, mint a hatékony, emlősállatok ellen ható AaH2 α-toxinnál) és a patkányok izolált vázizomrostjaiban (legalább egy nagyságrenddel nagyobb koncentráció, mint az AaH2 toxinnál), amely a nátriumcsatornák inaktiválási folyamatának meglassulására vezethető vissza; (b) a fent nevezett, emlősállatokra ható α-toxinokkal az aminosavszekvenciában mintegy 75%-os egyezést mutat.

Az LqhP35 toxin molekulatömegében, bázikusságában és amino-összetételében a skorpióméregből származó polipeptid-neurotoxinok tipikus tulajdonságait mutatja (Possani, 1984). Farmakológiája azonban határozott, egyedi tulajdonságokat mutat. Az LqhP35 toxin farmakológiai jelentőségének kutatása megkívánja a gerinces állatokra ható skorpiótoxinok vagy az emlősállatok ellen hatékony skorpiótoxinok rövid áttekintését. Ezek a toxinok jelentős szerepet játszanak az emlősállatok ingerelhető szöveteiben levő Na⁺-csatornák farmakológiai és kémiai jellemzésében (Catterall, 1984), és ezeket általában két kategóriába osztjuk: az α-toxinok, mint az AaH2 vagy LqqV, a nátrium-inaktiválásra hatnak és feszültségfüggő kötőképességgel, valamint zsíroldható alkaloidokkal, például veratridinnel pozitív együttműködési képességgel bírnak (Catterall, 1984; Zlotkin és munkatársai, 1985).

A Centuroides és Tityus skorpiók mérgéből származó β-toxinok a nátriumaktiválásra hatnak és lehetőleg független kötőhelyekkel bírnak, amelyek az a-toxinok kötőhelyeitől eltérnek, és veratridinnel szinergikusan nem reagálnak (Couraud és munkatársai, 1982;

Couraud és Jover, 1984).

A rovarok ellen izgatóan ható toxinok (amelyet az AalT képvisel) kölcsönhatása a rovarok neuronális membránjaival erősen hasonlít a β-toxinok hatására az emlősállatok idegrendszerében, amely az ismételt izgalmi állapotok (Pelhate és Zlotkin, 1981) és a feszültségfüggetlen kötés (Gordon és munkatársai, 1984) indukciójában mutatkozik meg. Ezen az alapon kimutatjuk, hogy az LqhP35 toxin nyilvánvalóan a-toxin-szerű hatással bír.

Az LqhP35 és a skorpiótoxinok összehasonlítása két lényeges szempont - elektrofíziológiai és szerkezeti alapján történhet. Az LqhP35 két különböző, ingerelhető szövetpreparátumban a nátrium-inaktiválására a „klasszikus” hatást indukálja, amelyet eddig a Buthinae-skorpiómérgeknél és az ezekből származó, gerinces állatok elleni toxinoknál mutattak ki (Catterall, 1980). A második hasonlóság az α-toxinokkal az LqhP35 primer szerkezetében mutatkozik. Az LqhP35 aminosavszekvenciája mintegy 75%-ban megegyezik az a-toxinokéval, de csak 17%-ban a rovarok ellen izgatóan ható toxinokéval. Más szavakkal a hasonlóság az LqhP35 toxin és az α-toxinok közt olyan nagy, mint az a-toxinok hasonlósága egymás között.

Bár az LqhP35 toxin nagy szerkezeti és farmakológiai hasonlósággal bír az α-toxinokkal, az LqhP35 toxin nagyon kis toxicitást mutat az emlősállatok ellen, ellentétben viszonylag nagy toxicitásával rovarok ellen. A tipikus α-toxinok, az AaHl és AaH2 és a Css2 βtoxin inaktívak Sarcophaga-lárvák ellen, és nem mutatnak fajlagos kötést rovarok neuronpreparátumaira (Zlotkin és munkatársai, 1971c; Gordon és munkatársai, 1984).

A szóban forgó LqhP35 erős toxicitása Arthropodák ellen azért is figyelmet érdemel, mivel modellként szolgálhat skorpiókból származó toxinok állatcsoportfajlagosságának tisztázásához. Az LqhP35 erős toxicitása rovarok ellen, összekapcsolva ennek erős hatásával a nátrium-inaktiválásra egy rovaraxonban, egyben jelentős farmakológiai eszköz a nátrium-vezetőképesség tanulmányozására a rovarok neuronális ingerelhetőségével összefüggésben.

Az LqhP35 neurotoxint, amint fentebb megadtuk, lehet a feszültségstimulált konformációváltozás (amely a csatomanyílások mechanizmusával összhangban megy végbe) vizsgáló mintájaként vagy markereként a nátrium-vezetőképesség kutatásában alkalmazni, amely változás a rovameuronok ingerelhetőségével kapcsolatos.

A találmány szerinti, százlábúakból kinyerhető, rovarokra szelektíven ható toxin HPLC, molekulaszitakromatográfia, elektroforézis stb. alkalmazása segítségével tisztítható. így például a toxin HPLC-vel választható szét, és az izolált frakciók olyan irányú képességükre vizsgálhatók, hogy hogyan bénítják vagy pusztítják el a rovarokat.

Egy inszekticid aktivitású anyag adott esetben további tisztításnak vethető alá addig, amíg a toxinminta a természetes szennyezésektől lényegében mentes lesz. A kromatográfiás technikák a szakterületen jól ismer4

HU 220 078 Β tek, és a szakemberek ezeket a találmány szerinti célra képesek alkalmazni.

Egy másik eljárás szerint a toxinmolekula immunológiai eszközökkel, elsősorban immun-affinitáskromatográfiával tisztítható.

Itt és a következőkben a „százlábúakból nyerhető, rovarokra szelektíven ható toxin” fogalom olyan kémiai toxint takar, amely azonos vagy lényegében azonos a százlábúmérgek inszekticid komponensével. A találmány szerinti „százlábúakból nyerhető, rovarokra szelektíven ható toxin” vagy valamely százlábúból vagy peptid- vagy más kémiai szintézis révén, vagy molekulárbiológiai technikák alkalmazása révén kapható meg. A toxin akkor számít szelektívnek, amikor képes valamely rovart gátolni, de a nem rovarokra nincs hatása vagy csak jelentéktelen hatása van.

II. Antitestek neurotoxinok ellen

A jelen találmány további tárgyai a találmány szerinti neurotoxinok elleni antitestek. Az alábbiakban különböző eljárásokra utalunk, amelyeket az immunológiában jártas szakemberek jól ismernek. Olyan standard munkák, amelyek az immunológia általános elveit megmagyarázzák, például Kelin (1982), Kennet és munkatársai (1980), Campbell (1984) és Eisen (1980) munkái.

A rovarokra szelektíven működő toxinok antitestaffinitáskromatográfiával való tisztításához olyan antitesteket szükséges alkalmazni, amelyek képesek megkötni a toxint. Az ilyen antitestek előnyösen monoklonális antitestek.

A találmány szerinti antitesteket sokféle eljárás valamelyikével állítjuk elő. így például olyan sejteket, amelyek a neurotoxint vagy valamely fragmentumát választják ki, valamely állatba adunk be, hogy szérumtermelése indukálódjék, amely szérum a neurotoxinok kötésére képes, poliklonális antitesteket tartalmaz. Ugyanúgy előnyösen lehet egy neurotoxin-ffagmentumot szintetizálni is, a szakemberek számára ismert eljárásokkal. Mind a tisztított fragmentumot, mind a szintetizált fragmentumot, mind a tisztított, természetes és szintetizált fragmentum kombinációját bevezethetjük valamely állatba, hogy nagyobb fajlagosságú, poliklonális antiszérumokat kapjunk.

A találmány szerinti legelőnyösebb eljárásokban az antitestek monoklonális antitestek. Az ilyen monoklonális antitestek a hibridómatechnika alkalmazásával állíthatók elő (Köhler és Milstein, 1975 és 1976; Köhler és munkatársai, 1976; Hammerling és munkatársai, 1981). Ez általában magában foglalja azokat az eljárásokat, amelyekben egy állatot valamely neurotoxin-antigénnel immunizálunk. Az ilyen állatok splenocitáit kivonjuk és megfelelő mielóma-sejtvonallal fuzionáljuk. Minden alkalmas mielóma-sejtvonalat alkalmazhatunk a találmány szerint; mégis előnyös az SP₂O szülő-mielómasejtet alkalmazni, amelyet az ATCC-től szerezhetünk be. A fúzió után az így létrejövő hibridómasejteket HAT tápközegben tenyésztjük, majd korlátozott hígítással klónozzuk, amint ezt Wands és Zurawski (1981) leírták. Az ilyen szelekcióval kapott hibridómasejteket ezután átvizsgáljuk, hogy izoláljuk azokat a kiónokat, amelyek a neurotoxin-antigénhez kötődni képes antitesteket választanak ki.

Amikor a toxinforrás nem tiszta, csak néhány hibridómasejt képez a toxinhoz kötődni képes antitesteket (a többi hibridómasejt olyan antitestet képez, amely a toxin tisztátalanságaihoz képes kötődni). így szükséges lehet a hibridómasejtek közül azokat kikeresni, amelyek képesek a toxinhoz kötődő antitesteket kiválasztani. Egy ilyen kikeresést előnyösen úgy végezhetünk, hogy a toxinok (vagy mérgek) mintáját valamely olyan monoklonális antitesttel inkubáljuk, amelyet hibridómasejtek meghatározott csoportja választ ki, és azonosítjuk azokat a hibridómasejteket, amelyek olyan antitesteket választanak ki, amelyek a méreg tulajdonságai szerint képesek valamely rovart bénítani, semlegesíteni vagy elgyengíteni. Amikor egy ilyen hibridómasejtet azonosítottunk, a szakterületen ismert eljárások segítségével ezt szaporíthatjuk, hogy előállítsunk toxinfajlagos, monoklonális antitesteket.

Miután egy toxinspecifikus, monoklonális antitestet megkaptunk, ezt egy szilárd hordozón való kötéssel immobilizálhatjuk és arra alkalmazhatjuk, hogy a toxint természetes méregből vagy más forrásokból tisztítsuk, amelyhez a szakemberek számára jól ismert immunaffinitásos kromatográfiát alkalmazunk. Az ilyen eljárással nagy tisztasági fokot érhetünk el, és ezáltal olyan toxint kaphatunk, amely lényegében mentes a természetes tisztátalanságoktól. Itt és a továbbiakban a „lényegében mentes a természetes tisztátalanságoktól” kifejezés azt jelenti, hogy a toxin olyan formában van, amely nem tartalmazza azokat az anyagokat, amelyekkel a toxin egyébként természetes vagy normál módon társulva van (például más fehérjék vagy zsírok, szénhidrátok stb.).

Amikor a toxint megtisztítottuk, arra alkalmazhatjuk, hogy egy állatot (például egeret vagy nyulat) immunizáljunk, így toxinfajlagos, poliklonális antitestek termelésére késztessük.

így a jelen találmány vonatkozik az ilyen toxinfajlagos mono- és poliklonális antitestekre is.

III. Géntechnika a rovarokra szelektíven ható toxinok körében

A jelen találmány olyan DNS-szekvenciákkal is foglalkozik, amelyek a rovarokra szelektíven toxinokat kódolnak.

Az egyes aminosav-alkotórészek szekvenciáját itt az általánosan alkalmazott, egybetűs megjelölésekkel írjuk le. Az egybetűs és hárombetűs megjelölések felsorolása tankönyvekben, például Lehninger (1975) könyvében olvasható. Az aminosavszekvencia horizontális leírási módjában az aminovég a baloldal és a karboxilvég a jobboldal.

Amennyiben az aminosavszekvencia ismert, úgy abból levezethetjük azt a DNS-szekvenciát, amely képes a kívánt fehérjét kódolni. Egy ilyen gént azután klónozhatunk. Mivel a genetikai klón degenerált, köztudott, hogy több, mint egy olyan kodon van, amely egy meghatározott aminosavat kódol (Watson, 1977).

Noha lehetséges a toxinok teljes aminosavszekvenciájának meghatározása, általában elég a molekulák egy

HU 220 078 Β fragmentumának szekvenciáját meghatározni és az így létrejött szekvenciaadatokat oligonukleotid-vizsgálóminta előállításához alkalmazni, amellyel a teljes toxingénszekvenciát meghatározhatjuk. A toxinpeptid-fragmentumokat az ép molekulák cián-bromiddal vagy proteázokkal, például papainnal, kimotripszinnel vagy tripszinnel végzett inkubálásával kapjuk meg (Oike és munkatársai, 1982; Liu és munkatársai, 1983).

A toxinpeptid-szekvencia tényleges azonosításával lehetséges egy olyan, elméletileg „nagy valószínűségű” DNS-szekvencia vagy DNS-szekvenciakészlet azonosítása, amely képes egy ilyen peptid kódolására. Amikor a peptid több, mint 10 aminosawal bír, a szekvenciainformáció általában már elegendő, hogy egy, a toxint kódoló génszekvencia klónozását biztosítsuk. Egy olyan oligonukleotid megalkotásával, amely az elméleti szekvenciával komplementer (vagy oligonukleotidok egy készletének megalkotásával, amely az oligonukleotidok készletével nagy valószínűséggel komplementer), egy olyan DNS-molekulát (vagy DNS-molekulák készletét) kapunk, amelyet vizsgálómintaként alkalmazhatunk a toxingének azonosításához és izolálásához.

Egy megfelelő oligonukleotidot vagy oligonukleotid-készletet, amely képes valamely toxinfragmentumot kódolni (vagy amely egy ilyen oligonukleotiddal vagy oligonukleotid-készlettel komplementer), és amelyet a fentebb leírt eljárásokkal azonosítottunk, szintetizálhatunk és szakemberek számára ismert eljárásokkal valamely DNS-sel, előnyösen valamely cDNS-készítménnyel hibridizálhatunk, amely DNS-ek olyan sejtekből származnak, amelyek a toxingén kifejezésére képesek. Az alkalmazott DNS vagy cDNS forrása előnyösen a toxinszekvenciákkal van dúsítva. Egy ilyen dúsítást legkönnyebben olyan cDNS-sel érhetünk el, amelyet RNS-ből kapunk, amikor RNS-t olyan sejtekből vonjuk ki, amelyek legnagyobb mennyiségben termelik a toxint. A nukleinsav-hibridizálás technikáit Maniatis és munkatársai (1982), valamint Hames és Higgins (1985) hozták nyilvánosságra.

Abból a célból, hogy a toxint kódoló szekvencia megtalálását megkönnyítsük, a DNS-vizsgálómintát valamely kimutatható csoporttal jelezhetjük. Ilyen kimutatható csoport lehet minden olyan anyag, amely megkülönböztethető kémiai vagy fizikai tulajdonságokkal rendelkezik. Az ilyen anyagok az immunassay területén jól kifejlesztettek. Csaknem minden ilyen, általában ezen a területen alkalmazott, megfelelő jelölés alkalmazható a jelen találmányban is. Különösen alkalmasak az enzimesen aktív csoportok, mint például az enzimek (Wisdom, 1976), enzimszubsztrátumok (GB 1,584,741), koenzimek (US 4,230,797 és US 4,238,565) és enzim-inhibitorok (US 4,134,792); a fluoreszcens színanyagok (Soini és Hemmilá, 1979); kromofór anyagok; lumineszcens színanyagok, mint a kémiai és biológiai lumineszcens színanyagok (Gorus és Schram, 1979); fajlagosan kötő ligandumok; proximális, együttműködő párok; és a radioizotópok, mint a ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I és ¹⁴C. Az ilyen jelölések és jelöléspárok saját fizikai tulajdonságaik (például fluoreszcenciás színanyagok, kromofór anyagok és radioizotópok) vagy reaktív vagy kötési tulajdonságaik (például enzimek, szubsztrátumok, koenzimek és inhibitorok) alapján mutathatók ki. így például egy kofaktorral jelölt vizsgálóminta kimutatható, ha az enzimet, amely a kofaktormarkerhez tartozik, és az enzim szubsztrátumát tesszük hozzá. így például használhatunk olyan enzimet, amely egy szubsztrátumra olyan módon hat, hogy mérhető fizikai tulajdonságokkal bíró termék keletkezik. Az ilyen enzimre példa lehet a βgalaktozidáz, alkálikus foszfatáz vagy peroxidáz, anélkül, hogy az eljárás csak ezekre korlátozódna.

Általános eljárásokat közöltek a hibridizálásra például Maniatis és munkatársai (1982), valamint Hames és Higgins (1985).

A toxint kódoló szekvenciákat, amelyeket a fentebb leírt eljárásokkal kapunk, működőképesen valamely kifejező vektorba rögzítjük, és például bakteriális vagy eukarióta sejtekbe vezetjük be, hogy előállítsuk a toxint. Az ilyen kezelés technikáit Maniatis és munkatársai (1982) hozták nyilvánosságra, és ezek a szakterületen jól ismertek.

A fentebb leírt rekombinációs eljárás helyett egy toxint kódoló szekvencia szintetikus úton is előállítható (például szerves kémiai szintézissel).

Egy másik eljárás szerint a toxint kódolni képes szekvencia előállítására az oligonukleotid-szintézist alkalmazhatjuk. Ez az eljárás 100 aminosavnál kevesebb aminosawal bíró fehéqéknél alkalmas, mint például a találmány szerinti toxinoknál. Az aminosavszekvenciát kódoló oligonukleotid-szekvencia meghatározására a genetikai kódot alkalmazzuk.

Ennek során szintetizálunk egy oligonukleotid-sorozatot, amely tagjainak hossza 20-50 bázist tesz ki; így átfedő fragmentumok sorozatát alakítjuk ki, amelyekből a gén szála képződik. Ezeket a fragmentumokat később párosítjuk és egymással összekötjük, a szakemberek számára jól ismert eljárásokkal (Maniatis és munkatársai, 1982). Az így létijövő DNS-fragmentumokat elektroforézissel izoláljuk, és a sokszorozáshoz és további kezeléshez alkalmas, klónozó vektorba rögzítjük. Ezt a szintetikus gént a fentebbiek szerint a genomikus DNS-ből és/vagy cDNS-ből izolált génnél leírt technikák szerint alkalmazhatjuk.

IV. A rovarokra szelektíven ható toxinok és funkcióképes származékaik kifejezése

A toxint kódoló szekvenciákat, amelyeket a fentebb leírt eljárásokkal kapunk, ismert eljárások szerint működőképesen, valamely kifejező vektorba iktathatjuk, és prokarióta vagy eukarióta sejtekbe vezethetjük, hogy előállítsuk a toxint vagy valamely fúnkcióképes származékát.

A leírásban alkalmazott „LqhP35”, az „LqhP35-neurotoxin” és az „LqhP35-toxin” kifejezések egymással felcserélhetők. A jelen találmány vonatkozik mind magára a neurotoxinra, mind fúnkcióképes származékaira.

A toxin „fúnkcióképes származék”-a olyan anyag, amely fúnkcionális, strukturális vagy olyan biológiai aktivitással bír, amely a toxin biológiai aktivitásával azonos. A „fúnkcióképes származék” kifejezést úgy kell érteni, hogy magában foglalja egy molekula „fragmentum”-ait is.

HU 220 078 Β

Egy DNS-szekvenciát, amely egy találmány szerinti toxint vagy annak funkcióképes származékát kódolja, szokásos technikák szerint vektor-DNS-sel rekombinálhatunk. Ilyen technikák például egyenes vagy kohézív végek alkalmazása az összekapcsolásnál, hasítás restrikciós enzimekkel, megfelelő végek létrehozására, a kohezív végek megfelelő betöltése, kezelés alkalikus foszfatázzal, hogy a nem kívánt kötéseket elkerüljük, és összekapcsolás megfelelő ligázokkal. Az ilyen kezelések technikáját például Maniatis és munkatársai (1982) hozták nyilvánosságra, és ezek a szakterületen jól ismertek.

Egy nukleinsav-molekulát akkor tekintünk valamely polipeptid „kifejezésére képes”-nek, amikor ez tartalmaz egy olyan nukleotidszekvenciát, amely a transzkripció és transzláció szabályozásához szükséges információkkal bír és amikor egy ilyen szekvencia „működőképesen összekapcsolt” egy olyan nukleotidszekvenciával, amely a polipeptidet kódolja.

Egy működőképes kapcsolás olyan kapcsolás, amelyben a szabályozó DNS-szekvenciák és a kifejezendő DNS-szekvenciák úgy vannak összekapcsolva, hogy a génkifejeződés lehetséges legyen. A génkifejeződéshez szükséges szabályozó terület pontos természete organizmusról organizmusra eltérő lehet, általában azonban tartalmaz egy promoter-területet, amely prokariótákban tartalmazza mind a promotort (amely az RNS-transzkripció beindítását irányítja), mind azt a DNS-szekvenciát, amely amikor az RNS-be átíródik, a toxinszintézis beindítására jelt ad. Az ilyen területek normálisan tartalmaznak olyan 5’-nem kódoló szekvenciákat, amelyek a transzkripció és transzláció beindításában részt vesznek, mint például a TATA-“doboz”, a befedő („capping”) szekvencia, a CAAT-szekvencia és hasonlók.

A toxin kifejezéséhez olyan transzkripciós és transzlációs jelek szükségesek, amelyeket a megfelelő gazdaszervezetek felismernek.

A jelen találmány a toxinfehéijék (vagy funkcióképes származékaik) kifejezésével is foglalkozik mind prokarióta, mind eukarióta sejtekben. Előnyös prokarióta gazdaszervezetek például a baktériumok, mint az E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia stb. A legelőnyösebb prokarióta gazdaszervezetek például az E. coli K12 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F~, λ^-, prototróf) (ATCC 27325) törzsek és más enterobaktériumok, mint a Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens és különböző Pseudomonos fajok. Ilyen körülmények között a toxin nincs glikozilezve. A prokarióta gazdaszervezetnek a kifejező plazmid replikonés kontrollszekvenciáival összeférhetőnek kell lennie.

Abból a célból, hogy egy találmány szerinti toxint (vagy valamely funkcióképes származékát) valamely prokarióta sejtben (például E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces stb.) kifejezzünk, szükséges, hogy a toxint kódoló szekvencia funkcióképesen össze legyen kapcsolva valamely funkcionális promotorral. Az ilyen promotorok konstitutívak vagy előnyösen szabályozhatók lehetnek (vagyis indukálhatok vagy derepresszálhatók). így például konstitutív promotorok a λ-bakteriofág int promotoija, a pBR322 β-laktamáz génjének bla promotorja, a pBR325 klóramfenikolacetil-transzferáz génjének CAT promotoija stb. Indukálható promotorra példák a bakteriofág jobb és bal promotoijai (P_L és Pr), az E. coli trp, recA, lacZ, Laci és gal promotoijai, a B. subtilis α-amiláz promotoija (Ulmanen és munkatársai, 1985) és ²⁸-fajlagos promotorja (Gilman és munkatársai, 1984), a Bacillus bakteriofágjának promotoijai (Gryczan, 1982) és a Streptomyces promotorok (Ward és munkatársai, 1986). A prokarióta promotorokról áttekintést adnak például Glick és Whitney (1987), Cenatiempo (1986) és Gottesman (1984).

Valamely prokarióta sejtben a hatékony kifejeződéshez szükséges egy riboszóma-kötőhely a gént kódoló szekvenciától fölfelé (upstream). Az ilyen riboszómahelyekről referálnak például Gold és munkatársai (1981).

Előnyös eukarióta gazdaszervezetként megnevezzük az élesztőket, gombákat, rovarsejteket és emlőssejteket, mind in vivő, mind szövettenyészetben. Gazdaszervezetként alkalmas emlőssejtek például azok a sejtek, amelyek fibroblasztokból, például VERŐ vagy CHO-K.1 sejtekből, vagy nyiroksejtekből erednek, például az SP2/=O-AG14 vagy a P3x63Sg8, valamint ezek származékai. Előnyös emlős gazdasejtek például az SP2/O és J558L, valamint az IMR 332 neuroblasztóma sejtvonalak, amelyek adott esetben a transzláció utáni feldolgozáshoz (processing) jobb képességekkel rendelkeznek.

Az élesztők jelentős előnye abban áll, hogy a transzláció utáni peptidmódosításokat is el tudják végezni. Sokféle stratégia van a DNS-rekombinációhoz, amely erős promotor-szekvenciákat és nagyszámú plazmidkópiákat alkalmaz, amely stratégiák a kívánt fehérje termeléséhez hasznosíthatók élesztőkben. Az élesztők felismerik a klónozott, emlős géntermékek úgynevezett vezető (leader) szekvenciáit és olyan peptideket választanak ki, amelyek ezeket a vezető szekvenciákat hordozzák (vagyis prepeptideket).

A sokféle, élesztőből származó, génkifejező rendszer mindegyikét fel lehet úgy építeni, hogy az aktívan kifejeződő génekből való promotor- és terminátorelemeket tartalmazzanak, amelyek glikolitikus enzimeket kódolnak. Ezek az enzimek nagy mennyiségben termelődnek, amikor az élesztőt glükózban gazdag tápközegben tenyésztjük. Az ismert glikolitikus gének a transzkripció nagyon hatékony kontrollszignáljait hordozzák, így például alkalmazható a foszfoglicerát-kináz gén promotor- és terminátorszignálja.

Másfajta előnyös gazdasejtek a rovarsejtek, például a Drosophila-lárvák. Amikor rovarsejteket alkalmazunk gazdaszervezetként, alkalmazhatjuk a Drosophila-alkohol-dehidrogenáz promotort (Rubin, 1988). Egy másik eljárás szerint Baculovírus-vektorokat alkothatunk meg, amelyek nagy mennyiségű toxint fejezhetnek ki rovarsejtekben (Jasny, 1987; Miller és munkatársai, 1986).

A toxinok kifejezése eukarióta gazdasejtekben eukarióta szabályozóterületek beiktatását igényli. Az ilyen

HU 220 078 Β területek általában magukban foglalnak egy olyan promotorterületet, amely az RNS-szintézis beindításához elegendő.

A találmány szerinti toxint kódoló szekvenciát és egy ezzel működőképesen összekapcsolt promotort beépíthetjük valamely prokarióta vagy eukarióta befogadósejtbe nem replikálódó DNS- (vagy RNS-) molekulaként, amely vagy lineáris molekula vagy előnyösen gyűrűbe zárt molekula lehet. Mivel az ilyen molekula nem képes autonóm replikációra, a toxin kifejeződése a bevezetett szekvencia átmeneti kifejezésével megy végbe. Egy másik eljárás szerint tartós kifejeződés mehet végbe a bevezetett szekvencia integrálásával a gazdakromoszómába.

A találmány további tárgyai közé tartoznak azok a vektorok, amelyek képesek a kívánt génszekvenciákat a gazdasejt kromoszómájába beépíteni. Azokat a sejteket, amelyek a bevezetett DNS-t a kromoszómába stabilan beépítették, olyan módon választhatjuk ki, hogy egy vagy több markert is bevezetünk, amelyek a kifejezővektort tartalmazó gazdasejteknek a kiválasztását lehetővé teszik. A marker egy auxotróf gazdaszervezetet prototróffá tehet vagy rezisztenciát adhat át biocidok, például antibiotikumok vagy nehézfémek, például réz stb. ellen. A szelektálható marker lehet közvetlenül összekapcsolva a kifejezendő DNS-szekvenciával, vagy lehet ugyanabba a sejtbe együtt-transzformációval bevezetve. Járulékos elemek is lehetnek szükségesek adott esetben egy egyszálú mRNS optimális szintéziséhez. Ezek az elemek például az összefonódási („splice”) szignálok, valamint az átírás promotoqai, erősítői és terminációs szignáljai. Azokat a cDNS kifejezővektorokat, amelyek ilyen elemeket tartalmaznak, írnak le például Okayama és Berg (1983).

Előnyösen a bevezetett szekvencia valamely olyan plazmid- vagy vírusvektorba van beépítve, amely a befogadó gazdasejtben autonóm replikációra képes. Éne a célra sokféle vektor alkalmas. A fontosabb tényezők, amelyek egy bizonyos plazmid- vagy vírusvektor kiválasztásánál szerepet játszanak, például: az egyszerűség, amellyel a befogadósejtek, amelyek a vektort tartalmazzák, felismerik ezt, és amellyel a sejtek, amelyek a vektort nem tartalmazzák, megkülönböztethetők a befogadósejtektől; a vektorkópiák száma, amely egy bizonyos gazdasejtben kívánatos, és vajon kívánatos-e, hogy a vektor különböző fajtájú gazdasejtek között ki- és belépni (ingázni) legyen képes (shuttle vektor). A vektorok például plazmidok, például olyanok, amelyek E. coliban replikációra képesek (például pBR322, ColEl, pSCIOl, pACYC184, nVX). Ilyen plazmidokat ismertetnek például Maniatis és munkatársai (1982). Bacillusplazmidok például a pC194, pC221, pT127 stb. Ilyen plazmidokat ismertet például Gryczan (1982). Alkalmas Streptomyces-plazmidok például a pIJlOl (Kendall és Cohen, 1987) és a Streptomyces-bakteriofágok, mint a <j>2C31 (Chater és munkatársai, 1986). Áttekintő közleményt jelentett meg a Pseudomonas-plazmidokról John és Twitty (1986), valamint Isaki (1978).

Előnyös eukarióta plazmidok például a BPV, Vaccinia, SV40, 2 μ-os kör és hasonlók, valamint ezek származékai. Az ilyen plazmidok a szakemberek számára jól ismertek (Botstein és munkatársai, 1982; Broach, 1981 és 1982; Bollon és Stauver, 1980; Maniatis, 1980).

Amikor a vektort vagy azt a DNS-szekvenciát, amely a konstrukciót tartalmazza, a kifejezéshez előkészítjük, a DNS-konstrukciót vagy konstrukciókat sokféle úton vezethetjük be az alkalmas gazdasejtekbe, ilyenek például a transzformáció, átfertőzés (transzfekció), konjugáció, protoplasztfüzió, elektroporáció, kalciumfoszfátos kicsapás, közvetlen mikroinjekció stb. A vektor bevezetése után a befogadósejteket valamely szelektív tápközegben, amely a vektort tartalmazó sejtek növekedésének kedves, tenyésztjük. A klónozott génszekvencia vagy génszekvenciák kifejezése a toxinok termelésében vagy ezen toxinok fragmentumainak termelésében jelentkezik. Ez magukban a transzformált sejtekben végbemehet vagy ezeknek a sejteknek az indukálásakor következik be (például neuroblasztóma-sejteken vagy hasonlókon bróm-dezoxi-uracil beadásával).

A kifejezett fehéijét szokásos eljárásokkal, például extrakcióval, kicsapással, kromatográíiával, affinitáskromatográfiával, elektroforézissel és hasonlókkal izoláljuk és tisztítjuk.

V. A rovarokra szelektíven ható toxinok alkalmazása növények transzformálására

A rovarokra szelektíven ható toxinoknak megfelelő DNS-t valamely növénybe bevezethetjük és ott kifejeződésre bírhatjuk. Az eredmény a toxinok jelenléte a növényi sejtben, amely a növényt rezisztenssé, illetve tűrőképessé teszi rovarok ellen, és így ezek fitopatogén rovarok elleni harchoz alkalmas szerként alkalmazhatók. A jelen találmány tárgya tehát továbbá a toxingén alkalmazása növények transzformálására, a növények rovarok elleni rezisztenciája, illetve tűrőképessége fokozására. A toxint kódoló DNS-szekvencia a toxint működőképes taxinként kell, hogy kifejezze és termelje az így létrejövő növénysejtben.

Mind a DNS-ből, mind a cDNS-ből származó DNS-t, mind a szintetikus DNS-t alkalmazhatjuk a találmány szerint. Az a DNS, amely a toxingént kódolja, különböző fajokból származó, idegen szekvenciákat tartalmaz.

A klónozó vektort a találmány szerint úgy alkalmazzuk, hogy a kópiaszámot fokozzuk. A megnövekedett kópiaszám eredményeképpen a nevezett vektorokat izolálni tudjuk és például arra használhatjuk, hogy a DNSszekvenciákat növényi sejtekbe vagy más gazdasejtekbe bevezessük.

Növényi szöveteket valamely fentebb leírt vektorral ismert eljárások szerint transzformálhatunk. Ilyenekre példák a közvetlen fertőzés vagy a növények, növényi szövetek vagy növényi sejtek együtttranszformálása A. tumefacienssel (Horsch és munkatársai, 1985; Marton, 1984), az exogén DNS közvetlen génátvitele protoplasztokban (Paszkowski és munkatársai, 1984; EP 129,668; EP 164,575; Shillito és munkatársai, 1985; Potrykus és munkatársai, 1985; Lörz és munkatársai, 1985; Fromm és munkatársai, 1985 és 1986; GB 2,140,822; és Negrutiu és munkatársai, 1987), az inkubálás PEG jelenlétében (Negrutiu és munkatársai, 1987), a mikroninjekció (Reich és munkatársai, 1986a

HU 220 078 Β és 1986b), valamint a bombázás mikrolövedékekkel (Klein és munkatársai, 1987).

Az egyik ismert eljárás a toxingén növényi sejtbe való bevezetésére az, hogy egy növényi sejtet Agrobacterium tumefacienssel, amely a toxin-DNS-sel van transzformálva, fertőzünk. Megfelelő, a szakemberek számára ismert körülmények között tenyésztjük a transzformált növényi sejteket, hogy szár és gyökér képződjék és végül transzformált, szaporodásra képes növények fejlődjenek ki. A toxinhoz tartozó génszekvenciákat megfelelő növényi sejtekbe, például az A. tumefaciens Ti-plazmidjának segítségével vezethetjük be. A Ti-plazmid az A. tumefaciens fertőzésekor bevezetődik a növényi sejtekbe és stabilan integrálódik a növényi genomba (Horsch és munkatársai, 1984; Fraley és munkatársai, 1983).

Jelenleg az alábbi két út áll rendelkezésre növények Agrobacteriummal való transzformálására:

(1) Agrobacterium együtttenyésztése izolált, tenyésztett protoplasztokkal; vagy (2) sejtek vagy szövetek transzformálása Agrobacteriummal.

Az (1) eljáráshoz egy szokásos tenyésztési rendszer szükséges, amely lehetővé teszi protoplasztok tenyésztését és növények regenerálását tenyésztett protoplasztokból.

A (2) eljáráshoz az szükséges, hogy (a) a növényi sejtek vagy szövetek Agrobacteriummal transzformálhatok legyenek, és (b) a transzformált sejtekben vagy szövetekben a teljes növényekké való regenerálás indukálható legyen. Abból a célból, hogy egy biner rendszerben fertőzést érjünk el, két plazmid szükséges: egy T-DNS-t tartalmazó plazmid és egy vir-plazmid.

A toxingén elektroporációval is bevezethető a növényi sejtbe (Fromm és munkatársai, 1985). Ennél a technikánál a növényi protoplasztokat elektroporézisnek vetjük alá olyan plazmidok jelenlétében, amelyek a toxingén-konstrukciót tartalmazzák. A nagy térerősségű, elektromos impulzusok reverzibilisen permeábilissá teszik a biomembránokat, és ezzel lehetővé teszik a plazmidok bevezetését. Az elektroporézisnek alávetett növényi protoplasztok új sejtfalakat képeznek, osztódnak és növényi kalluszokat képeznek. Azoknak a transzformáit növényi sejteknek, amelyek a toxint kifejezik, kiválasztását fenotípusos markerekkel végezhetjük, amint ezt fentebb leírtuk.

Az exogén DNS-t bármilyen formában beiktathatjuk a protoplasztokba, például csupasz lineáris, cirkuláris vagy túlcsavarodott DNS-ként, liposzómába bezárt DNS-ként, szferoplasztokban levő DNS-ként, más növényi protoplasztokban levő DNS-ként, sókkal komplexbe vitt DNS-ként stb.

A genetikai anyagot a növényi sejtbe úgy is átvihetjük, hogy PEG-t alkalmazunk, amely a genetikai anyaggal kicsapódó komplexet képez, amelyet a sejt befogad (Paszkowski és munkatársai, 1984).

A DNS-t a növényi sejtekbe úgy is átvihetjük, hogy ezt közvetlenül izolált protoplasztokba, tenyésztett sejtekbe és szövetekbe (Reich és munkatársai, 1986a és b), valamint csíranövények és növények merisztémaszöveteibe (de la Peria és munkatársai, 1987; Graves és Goldman, 1986; Hooykaas-Van Sloyteren és munkatársai, 1984; és Grimsley és munkatársai, 1987 és 1988) mikroinjektáljuk. A transzgenikus növényeket és utódjaikat a szakterületen ismert eljárásokkal kaphatjuk meg.

Egy másik eljárás az idegen DNS bevezetésére növényi sejtekbe magában foglalja a nevezett DNS felfűzését egy részecskére, amelyet azután valamely berendezés, például a Klein és munkatársai által (1988) leírt berendezés segítségével a növényi sejtbe iktatunk. Minden növényi szövet vagy növényi szerv alkalmazható ennek az eljárásnak a céljára, ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, az embriókat, az apikális és más merisztémákat, bimbókat, szomatikus és szexuális szöveteket in vivő és in vitro. A transzgenikus sejteket és kalluszt jól ismert eljárások segítségével választjuk ki, majd a szövetekben a szomatikus embriók képződését és a hajtások regenerálását indukáljuk, transzgenikus növények előállítására. A megfelelő eljárásokat értelemszerűen választhatjuk az alkalmazott növényfajtához.

Minden növényt, amely regenerálható protoplasztokat szolgáltat, a találmány szerint lehet transzformálni úgy, hogy kinőtt, transzgenikus növényeket kapjunk, amelyek az átvitt toxingént tartalmazzák és rovarok ellen tűrőképesek, illetve rezisztensek. Alkalmas növények például az alábbi nemzetségek fajtáinak képviselői : Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geránium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brasica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicum, Nicotiana, Solanum, Petúnia, Dactylis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum és Datura.

Gyakorlatilag minden növényt lehet regenerálni tenyésztett sejtekből vagy szövetekből, beleértve az összes főbb gabonaféléket, cukornádat, cukorrépát, gyapotot, gyümölcs- és egyéb fákat, hüvelyeseket és főzelékféléket.

Azok a fajták, amelyek az Agrobacterium természetes növényi gazdaszervezetei, in vitro transzformálhatok. Az egyszikű növények, elsősorban a gabonafélék és fufélék nem természetes gazdaszervezetei az Agrobacteriumnak. Csak nemrégiben voltak sikeresek az első olyan próbálkozások, amelyekben az Agrobacteriummal transzformálást végeztek (Hooykaas-van Slogteren és munkatársai, 1984).

Azokra a növénynemzetségekre, amelyek Agrobacteriummal transzformálhatok, példák lehetnek az Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubus, Populus, Santalum, Allium, Lilium, Narcissus, Ananas, Arachis, Phaseolus és Pisum nemzetségek.

A növények regenerálását tenyésztett protoplasztokból például Evans és Bravó (1983), Davey (1983), Dalé (1983) és Binding (1985) írják le.

A regenerálási eljárások növényről növényre változnak. Általában azonban először transzformált protoplasztok, amelyek a toxingén sokszoros kópiáját tartal9

HU 220 078 Β mázzák, szuszpenzióját állítjuk elő. Ezután a protoplaszt-szuszpenzióban embriók képződését indukáljuk az érés és csírázás stádiumáig, mint a természetes embrióknál. A tenyésztő tápközeg általában különböző aminosavakat és hormonokat is tartalmaz, például auxinokat és citokinineket, A tápközeg előnyösen glutaminsawal és prolinnal is ki van egészítve, elsősorban a kukorica- és alfafufajtáknál. A gyökerek és szárak egyidejűleg normálisan fejlődnek. A hatékony regenerálás általában függ a tápközegtől, a genotípustól és a tenyészet előtörténetétől. Amikor ezeket a változókat szabályozzuk, az ilyen regenerálások reprodukálhatók és ismételhetők.

Az érett, transzgenikus növényeket, amelyek a transzformált növényi sejtekből kinőnek, önmegtermékenyítésnek vetjük alá, beltenyésztett növények előállítására. A beltenyésztett növények olyan magokat hoznak létre, amelyek a toxinhoz szolgáló gént tartalmazzák. Ezeket a magokat kiültethetjük, hogy olyan transzgenikus növényeket állítsunk elő, amelyek a toxint tartalmazzák.

A találmány szerinti beltenyésztett növényeket alkalmazhatjuk például arra is, hogy rovarok ellen tűrőképes hibrideket állítsunk elő. Ebben az eljárásban valamely rovarok ellen tűrőképes beltenyésztett vonalat egy másik beltenyésztett vonallal keresztezünk úgy, hogy hibrid keletkezzék.

A regenerált növényekből kapott részek, például virágok, vetőmagok, levelek, ágak, gyümölcsök és hasonlók is részei a jelen találmánynak, feltéve, hogy ezek a részek rovarokra inszekticid vagy tűrőképes sejteket tartalmaznak. A regenerált növények utódai, amelyek a nevezett tulajdonságokkal bírnak, szintén részei a jelen találmánynak.

VI. A toxin alkalmazása inszekticidként növények körében

Egy vagy több toxin inszekticidként hatásos mennyiségének beadása külső hozzáadással is történhet. A toxin hozzáadása a növényekre vagy növényrészekre történhet vagy közvetlenül, vagy a növény, vagy növényrész környezetébe juttatva.

A toxint sokféle módon szerelhetjük ki és juttathatjuk ki, például por vagy kristály formában, szuszpenzióként, emulgeált szuszpenzióként, permetként, szemcseként, mag formában, kapszulában, mikrokapszulában, aeroszolként, oldatként, gélként vagy más diszperziók formájában. A jelen találmány tehát vonatkozik olyan szerekre is, amelyek egy vagy több toxint tartalmaznak járulékos anyagokkal együtt a növényekre juttatáskor.

A találmány szerinti szert a növényekre vagy növényrészekre általában mezőgazdaságilag szokásos kiszerelési formában juttathatjuk ki, amelyek egy vagy több mezőgazdasági hordozóanyagot tartalmaznak. Alkalmas mezőgazdasági hordozóanyagok azok az anyagok, amelyeket azért alkalmazunk, hogy valamely aktív alkotórészt valamely szerben oldjunk, eloszlassunk vagy felhígítsunk anélkül, hogy a készítmény biológiai hatását csökkentenénk. Egy ilyen hordozóanyag maga nem gyakorolhat káros hatást a talajra, a termelési eredményekre vagy az agronómiái környezetre. A találmány szerinti szer lehet szilárd vagy folyékony kiszerelésű, vagy lehet oldat is. Az anyagot nedvesíthető porként vagy emulgeálható koncentrátumként is kiszerelhetjük.

A járulékos anyagok, amelyeket segédanyagként alkalmazunk, magukban foglalják azokat az anyagokat, amelyeket a szokásos mezőgazdasági gyakorlatban nedvesítő-, szétterítő-, eloszlató- vagy kötőanyagként alkalmaznak.

A segédanyagok további csoportjai lehetnek a toxinaktivitás erősítői. Ilyen erősítők lehetnek a lektinek, az amfipatikus peptidek, amfipatikus fehérjék vagy proteázinhibitorok.

Az inszekticidekhez használt kiszerelési segédanyagok a szakemberek számára megfelelően ismertek.

Összefoglalva: a jelen találmány előnyös kiviteli alakjai a következők:

- egy rovarok ellen szelektíven ható toxin az alábbi aminosavszekvenciával:

VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGYCQWAG KYGNACWCYA LPDNVPIRVP GKCR;

- egy rekombináns DNS, amely idegen DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja;

- egy rekombináns DNS, amely egy DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia előnyösen Arthropodák, mindenekelőtt az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztály képviselőiből és különösen a Scorpiones rend, valamint a Scolopendra nemzetség képviselőiből nyerhető ki, amely nevezett DNS-szekvencia rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy annak működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és valamely növényben kifejezhető formában van;

- egy rekombináns DNS, amely egy DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia valamely, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és amely az alábbi aminosavszekvenciák közül való:

KKNGYAVDSS GKAPECLLSN YCNNQCTKVH YADKGYCCL SCYCFGLNDD KKVLEISDTR KSYCDTTIIN vagy

DGYIRKRDGC KLSCLFGNEG CNKECKSYGG SYGYCWTWGL ACWCEGLPDE KTWKSETNTCG,

DGYIRKKDGC KVSC(V/I)IIGNEG CRKECVAHGG SFGYCWTWGL ACWCENLPDA VTWKSSTNTC G,

DGYIKRRDGC KVACLIGNEG CDKECKAYGG SYGYCWTWGL ACWCEGLPDD KTWKSETNTCG,

ALPLSGEYEP CVRPRKCKPG LVCNKQQICV DPK, vagy

VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGYCQWAG KYGNACWCYA LPDNVPIRVP GKCR;

- egy vektor, amely idegen DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia rovarok ellen

HU 220 078 Β szelektíven ható toxint vagy annak működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és növényekben kifejezhető formában van;

egy gazdaszervezet, amely idegen DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy annak működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és növényekben kifejezhető formában van;

egy transzgenikus növényi sejt, amely Arthropodákból, mindenekelőtt az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztály képviselőiből és különösen a Scorpiones rend, valamint a Scolopendra nemzetség képviselőiből kinyerhető DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia egy rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja; egy transzgenikus növényi sejt, amely Arthropodákból, mindenekelőtt az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztály képviselőiből és különösen a Scorpiones rend, valamint a Scolopendra nemzetség képviselőiből kinyerhető DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia egy rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és ahol a nevezett DNS-szekvencia stabilan van integrálva a növényi genomba;

egy transzgenikus növényi sejt, amely Arthropodákból, mindenekelőtt az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztály képviselőiből és különösen a Scorpiones rend, valamint a Scolopendra nemzetség képviselőiből kinyerhető DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia egy rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és ahol a nevezett DNS-szekvencia növényekben kifejezhető formában van;

egy transzgenikus növényi sejt, amely a nevezett DNS-szekvencia által kódolt, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát fejezi ki;

egy transzgenikus növény, valamint ennek szexuális és aszexuális szaporítóanyagai, amelyek Arthropodákból, mindenekelőtt az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztály képviselőiből és különösen a Scorpiones rend, valamint a Scolopendra nemzetség képviselőiből kinyerhető DNS-szekvenciát tartalmaznak, ahol a nevezett DNS-szekvencia egy rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja;

egy transzgenikus növény, valamint ennek szexuális és aszexuális szaporítóanyagai, amelyek idegen, kinyerhető DNS-szekvenciát tartalmaznak, ahol a nevezett DNS-szekvencia egy rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja és stabilan integrálva van a növényi genomba;

egy transzgenikus növény, valamint ennek szexuális és aszexuális szaporítóanyagai, amelyek idegen DNSszekvenciát tartalmaznak, ahol a nevezett DNS-szekvencia egy rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és ahol a nevezett DNS-szekvencia kifejezhető formában van;

- egy transzgenikus növény, valamint ennek szexuális és aszexuális szaporítóanyagai, amelyek a nevezett DNS-szekvencia által kódolt, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát fejezik ki;

- egy antitest rovarokra szelektíven ható toxin vagy működőképes származéka vagy fragmentuma ellen, ahol a nevezett toxin a Scorpiones rend vagy a Scolopendra nemzetség képviselőiből származik;

- egy inszekticid szer, amely hatóanyagként egy állatokból kinyerhető, rovarok ellen szelektíven ható, előnyösen rekombináns toxint vagy ennek valamely működőképes származékát vagy fragmentumát tartalmazza;

- eljárás növénypatogén rovarok elleni küzdelemhez, azzal jellemezve, hogy a rovarhoz vagy annak életteréhez egy szert, amely hatóanyagként egy rovarok ellen szelektíven ható, előnyösen rekombináns toxint vagy ennek valamely működőképes származékát vagy fragmentumát tartalmazza, alkalmazunk inszekticid szempontból hatékony mennyiségben;

- eljárás kultúrnövények védelmére növénypatogén rovarok által okozott károktól, azzal jellemezve, hogy a kultúrnövényt valamely rekombináns DNS-sel transzformáljuk, ahol a rekombináns DNS egy idegen DNS-szekvenciát tartalmaz, amely DNS-szekvencia rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek valamely működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja, és hogy a nevezett, rovarok ellen szelektíven ható toxin vagy ennek működőképes származéka vagy fragmentuma inszekticid szempontból hatékony mennyiségben fejeződik ki a növényben.

Abból a célból, hogy jobban megérhető legyen, a leírást az alábbiakban nem korlátozó jellegű, kiviteli példákkal egészítjük ki.

Példák

1. példa.

Az LqhP35 tisztítása, primer szerkezete és hatásmódja

Az L. quinquestriatus hebraeus skorpió nyers mérgét a mezőn gyűjtött skorpiók elektromos fejésével (Zlotkin és Gordon, 1985) és az ezt követő liofilezésével kapjuk meg. Az izgató, rovarokra szelektíven ható AalT toxint, amely az Androctonus australis skorpióból származik, Zlotkin és munkatársai (1971a) szerint tisztítjuk.

A Sarcophaga falculata lárvákat (100-130 mg testtömeg) laboratóriumban tenyésztjük Zlotkin és munkatársai (1971b) szerint. A Hemilepistus fajt (ászkák, földirákok) (300-400 mg testtömeg) mezőn gyűjtjük, és az albínó laboratóriumi egereket („Sabra” variáns) a Hadassah Medical School (Jeruzsálem) laboratóriumi állatfarmjáról vásároljuk.

HU 220 078 Β

A sáskák szinoptoszómáit és az ezekből származó membránvezikulumokat a Locusta migratoria összevágott központi idegrendszerének homogenizátumából kapjuk Zlotkin és Gordon (1985) szerint.

A toxikus anyagok letális és bénító hatását szubkután injekcióval határozzuk meg. Az egyik vizsgálatban dongólégylárvákat alkalmazunk, amelyek egy új kórtünettant, amely lassított és hosszan tartó, görcsös bénulásként nyilvánul meg, mutatnak; az eljáráshoz 2-10 μ1/100 mg testtömeg mennyiségben injektáljuk ezeket a hasi szegmentum szegmentumközti membránjában. A bénító egység (PU) meghatározása azon a mozdulatlanságon alapul, amely az állat összehúzódását követi, 5 perccel az injekció után. Olyan ászkákat, amelyeket 1-5 μ1/300 mg testtömeg mennyiségben injektálunk a has és a mellkas között, alkalmazunk a PU meghatározására, a teljes mozdulatlanságot véve alapul 5 perccel az injekció után. Az LD₅₀ (az az adag, amely az állatok 50%-ára halálos) meghatározására egereket alkalmazunk, ahol a meghatározást 24 óra múlva végezzük. A mintavételt és az 50%-os végpont meghatározását (PU- és LD₅₀-adagok) Reed és Muench (1938) eljárása szerint végezzük.

Három különböző oszlopkromatográfiás eljárást alkalmazunk:

(a) Sephadex G50 géllel (Pharmacia, Svédország) töltött molekulaszita-oszlopok négy oszlopból [4 χ (100 χ 3,2 cm)] álló sorozatára folyékony ammónium-acetát-puffer: 1650 A_2g0 egység L. quinquestriatus hebraens méreg (amely 2 g nyers méregnek felel meg vizes extrahálás és kétszeres oszlopkromatografálás után Sephadex G50 oszlopon) keveréket viszünk fel, amely oszlopsort 45 ml/óra sebességgel egyensúlyozunk ki és eluálunk 0,1 mol/literes ammónium-acetát-pufferral (pH 8,5) (Zlotkin és munkatársai, 1971a). A különböző frakciókat az elúciós profilnak megfelelően gyűjtjük össze. AIV. frakció (A₂₈₀=2OO egység) bénuláshoz és pusztuláshoz vezet dongólegyeknél, ászkáknál és egereknél.

(b) A kationcserélő kromatográfiánál karboxi-metilcellulózon (CM 52, Whatman, Anglia) koncentrációgradiens elúciót végzünk olyan módon, hogy a CM52 CM-cellulóz kationcserélővei töltött 10 mles oszlopra ammónium-acetát: 23 mg (31,5 A₂₈₀ egység), (a) pont szerinti IV. frakciókeveréket viszünk fel és 10 ml/óra sebességgel 0,01 mol/literes ammónium-acetát-pufferral (pH 6,4) kiegyensúlyozunk. Az első elúciós lépést egyensúlyi körülmények között hajtjuk végre, ez az (a) és (b) frakciókhoz vezet, amelyek a Sarcophaga-lárváknál bénuláshoz vezetnek. A második elúciós lépést lineáris koncentrációgradienssel végezzük 0,1 és 0,5 mol/liter között; ez a c, d és e frakciókhoz vezet, amelyek toxicitása légylárvák és egerek ellen az 1. táblázatban olvasható.

(c) HPLC fordított fázisú kromatográfia TSK-RP-CL8 oszloppal (LKB, Svédország). „A” puffer: 0,1%, „B” puffer: 0,1% TFA, acetonitril:izopropanol 1:1. B gradiens: 0 időpont: 5%; 15 perc: 20%; 75 perc: 50%. Átfolyási sebesség: 1 ml/perc.

Lemez-gélelektroforézist két formában végzünk:

(a) SDS-PAGE karbamid jelenlétében (Swank és

Munkres, 1971); a kifejlesztést folyamatos minigélben (60x80x1,5 mm) hajtjuk végre, 12,5% poli(akril-amid)-koncentrációnál és 8 mol/1 karbamid jelenlétében.

(b) Analitikai, izoelektromos fókuszálás poliakrilamidban amfolinok (LKB, Technical Bulletin 1217-2001 ME) jelenlétében.

A fehérjetartalmat Lowry és munkatársai szerint határozzuk meg, összehasonlító anyagként szarvasmarhaszérum-albumint alkalmazva (J. Bioi. Chem., 193, 265, 1951).

Az LqhP35 toxint alkilezzük és 4-vinil-piridinnel redukáljuk olyan módon, hogy a mintákat 6 mol/1 guanidin. HCl-t, 1 mol/1 trisz.HCl-t (pH 8,6), 10 mmol/1 EDTA-t és 20 mmol/1 ditiotreitolt tartalmazó oldattal inkubáljuk, 37 °C hőmérsékleten, 1 órán át, majd 4-vinil-piridint (Sigma, USA) adunk hozzá 50 mmol/1 végkoncentrációig, és az inkubálást tovább folytatjuk szobahőmérsékleten egy órán át. A módosított fehérjét HPLC-vel sómentesítjük Vydac-C-8 vagy Hypersil-ODS oszlopon, 0,1% izopropanol: acetonitrilben. Peptideket kapunk meg a redukált és alkilezett fehérjének Asp-N-nel, Lys-C-vel és tripszinnel (Boehringer Mannheim, USA) a gyártó által megadott előírások szerint végzett elbontásával. Peptideket kapunk savas részhidrolízissel is. A peptideket HPLC-vel, Hypersil-ODS oszlopon, 0,1% TFA-ban választjuk szét, izopropanol: acetonitril 1:1 gradienssel 0% és 60% között. Az aminosavszekvencia-elemzést automatizált Edman-lebontással végezzük Applied Biosystems 470A gázfázisú szekvenciaelemzőn (USA). A fenil-tiohidantoin-aminosavak elemzését az On-line Applied Biosystems 120APTH Analyzer berendezés segítségével végezzük. Minden szekvenciát legalább két elválasztási eljárással bizonyítunk [Allén, 1981, Inglis, 1980 (Inglis A. és munkatársai: a „Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, Proc. Int. Conf., 3rd” című kiadványban; szerkesztő: Birr C., kiadó: Elsevier, Amszterdam, 1980, 329. oldal)]. A szekvenciaösszehasonlításnál az aminosavszekvenciákat a maximális homológia eléréséhez a Wisconsin University Genetics Computing Group-ja profilelemzésének segítségével hasonlítjuk össze [Devereux és munkatársai (1984)]. Az összes helyzetek, amelyek azonos gyököket tartalmaznak, részarányát kiszámítjuk.

Zlotkin és Gordon (1985) szerint ¹²⁵I-vel jelzett AalT-t állítunk elő, és kötési tanulmányokat végzünk a versengő kicserélhetőséghez.

Rovaraxonok előállítása. Az úgynevezett „voltageclamp” és „current-clamp” kísérleteket óriás axonokkal végezzük, amelyek a Periplaneta americana csótány hasi idegszálaiból metszünk ki (Pichon és Boistel, 1967). A normál fiziológiás konyhasóoldat az alábbi összetételű: 200 mmol/1 NaCl, 1,3 mmol/1 KC1, 5,4 mmol/1 CaCl₂, 5,0 mmol/1 MgCl₂. A pH-t foszfátkarbonát-pufferral (2 mmol/1 NaHCO₃, 0,1 mmol/1 NaH₂PO₄) 7,2 értéken tartjuk. A „current-clamp” kísérleteket 12±0,5 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.

HU 220 078 Β gátlást és letalitást egerekre. A d frakciót, amely a legmagasabb toxicitást mutatja a dongólegyek ellen és a legkisebb toxicitást egerek ellen, tovább tisztítjuk.

4-AP-t alkalmazunk, hogy a káliumáramot szelektíven blokkoljuk (Pelhate és Pichon, 1974) és szintetikus STX-et (2.10^-7 mol/1) alkalmazunk a nátriumáram szelektív, reverzibilis blokkolásához (Sattelle és munkatársai, 1979). A tisztított skorpiótoxinokat 1:10 arányban (tömeg/térfogat), RSA jelenlétében (V. frakció, Armour Co., USA) liofilezzük.

Egyedi vázizomrost preparálása emlősállatokból. A „voltage-clamp” kísérleteket és „current-clamp” kísérleteket szobahőmérsékleten (18-22 °C) egyedi izomrostokon végezzük, amelyeket a Rattus norvegicus patkány úgynevezett „slow twitch soleus” izmából izolálunk (Duval és Léoty, 1978). A normális fiziológiás konyhasóoldat az alábbi összetétellel bír: 140 mmol/1 NaCl, 6 mmol/1 KC1, 3 mmol/1 CaCl₂, 5,0 mmol/1 glükóz. A pH-t 6,5 mmol/literes trisz.HCl-lel 7,3-ra állítjuk be. 10 mmol/1 TEA-t és 2 mmol/1 3,4-DAP-t adunk a fürdőbe, hogy a káliumáramot blokkoljuk, és 1 pmol/l TTX-et alkalmazunk, hogy a nátriumáramot blokkoljuk (Duval és Léoty, 1980).

B. Egy faktor izolálása, amely a dongólégylárvák késleltetett és megnyújtott összehúzódását indukálja. Az L. q. hebraeus skorpió 3,7 g liofilezett nyersmérgét az alábbi módon kapjuk meg: (1) vizes extrahálás és liofilezés; (2) a liofilezett, vizes extraktumok felvitele Sephadex G50 oszlopra 0,1 mol/1 ecetsavval, hogy a nagy molekulatömegű mukoproteineket eltávolítsuk;

(3) a liofilezett toxikus frakciók, amelyeket a fenti Sephadex-jégecet oszlopból kapunk meg, elválasztása 0,1 mol/literes ammónium-acetát-puffert tartalmazó Sephadex G50 oszlopon, hogy a kis molekulatömegű pigmenteket, amelyek nem feltétjéből állnak, eltávolítsuk. A liofilezett, toxikus frakciókat, amelyeket a fenti (3) lépésben kapunk, ismételt átjuttatással négy Sephadex G50 oszlop sorozatán a korábban megnevezett körülmények között szétválasztjuk. Ezek az eljárások négy főfrakció (I—>IV) elválasztását eredményezik. A IV. frakció (amely a beterhelt fehérje mintegy 12%ának felel meg) a légylárvába adott injekció után tünetek rendkívül szokatlan keverékét indukálja, beleértve az elernyedést (amely a rovarokra gátló hatású toxinokra tipikus) és az összehúzódást (amely a rovarokra izgató hatású toxinokra tipikus), amelyek azonban bizonyos késedelem után lépnek fel és megnyújtott ideig tartanak. A IV. frakció mérsékelten letális egerekre (LD₅₀=50 pg/20 g testtömeg). Ez a letalitás a mérgezés izgató tüneteit kíséri, amely a Buthinae-skorpiók mérgére és az ebből levezethető, emlősállatokra ható toxinokra tipikus.

A fenti, IV. frakció szétválasztása kationcserélő (CM52) oszlopon egy sor frakciót (a-»c) eredményez. Az (a) és (b) frakciók a dongólégylárvák elernyesztő bénulását indukálják, amely a rovarokra gátló hatású toxinokra jellemző (Zlotkin, 1986). A c, d és e frakciók viszont egerek elleni toxicitást mutatnak és világosan új tünettant dongólégylárvák ellen, amely egy késleltetett és megnyújtott (hosszan tartó) összehúzódás-bénulás előfordulásában jelentkezik. Amint az 1. táblázatban bemutatjuk, a c, d és e frakciók különböző mértékben mutatják a fenti késleltetett, megnyújtott összehúzódás1. táblázat

A c, d és e frakciók (CM52-kromatográfia) toxicitása dongólégylárvák és egerek ellen

	Frakció
Vizsgálat	c	d	e
Dongólégylárvák PU50 a (pg/100 mg testtömeg)	0,054	0,028	0,7
Egérletalitás LD50 b	12,0	120,0	25,0

^a 5 perccel az injekció után a mozdulatlan és összehúzódott lárvákat pozitív értéknek tekintjük.

^b A letalitást 24 óra múlva határozzuk meg. AIV. frakció LD_S0-értéke egerekre 40 pg/20 g testtömegnek felel meg.

Az új, dongólégy lárvákat károsító faktor végleges tisztítását egy további kromatográfiás lépéssel éljük el fordított fázisú oszlopon, HPLC-rendszerben. A végleges terméket tekintjük LqhP35 toxinnak (az Lqh jelzi a skorpiót, P a bénítást, és a 35 a szétválasztási időnek felel meg). Az így létrejövő termék a CM52 „d” frakciója fehérjéjének mintegy 30%-át tartalmazza és ezen frakció dongólégylárvák elleni aktivitásának mintegy 60%át. Ennek tisztaságát és tulajdonságait SDS-PAGE-val (amely mintegy 5 kD molekulatömeget mutat) és analitikai izoelektromos fókuszálással (amely mintegy pH 9,0 pl-értéket mutat) bizonyítjuk.

C. Az LqhP35 toxin primer szerkezetének meghatározása. Az LqhP35 egyszerű láncú, 64 aminosavból álló fehétje mintegy 7 kD molekulatömeggel (molekulatömeg=7255), amely tipikus a skorpióméregből származó különböző toxinokra (Possani, 1984). A jelen molekulatömeg-meghatározás lényegében összhangban van a fenti SDS-PAGE-val, amely csak körülbelüli adatokat eredményez legalább 20% várt pontatlansággal (Swank és Munkres, 1971). A magas, izoelektromos pont (pl), amelyet az analitikai izoelektromos fókuszálással kapunk, lényegében megfelel a szekvenciaelemzésnek, amely a pozitív töltésű alkotórészek fölöslegéből nyilvánvaló a negatívan töltött alkotórészekkel szemben, beleértve három arginin (pK = 12,48) előfordulását is. A hidrofób aminosavak, amelyek az alkotórészek egyharmadát alkotják, ugyanakkor megoszlanak a molekula hosszán. Feltételezhető, hogy a nyolc cisztein négy diszulfidhidat képez. Ezt a feltételezést az LqhP35 toxin pl-értéke (pH 9,0-9,2) közvetett módon alátámasztja. A fenti pH-értéknél a szulfhidrilcsoportok, amikor szabaddá válnak, negatív töltéseket hordoznak, amelyek ionizáláskor visszavezetődnek, és így a pl-érték csökken. Egy cisztein-arginin jelenlétét a C-terminálison, amint ez az LqhP35 toxinnál van, már kimutatták az emlősállatok ellen ható, az L. q. quinquestriatus-rokon skorpiók mérgéből ható LqqlV α-toxinnál (Possani, 1984).

D. Az LqhP35 toxinok biológiai aktivitása. Kórtünettan. Elleniében a rovarokra ható izgató toxinokkal,

HU 220 078 Β amelyek a dongólégylárvák azonnali és gyorsan múló összehúzódását okozzák, az LqhP35 toxin késleltetett és hosszantartó összehúzódás-gátlást indukál.

Toxicitás. Az LqhP35 toxin bénító és letális erejét Arthropodák és egerek ellen a 2. táblázat mutatja be.

2. táblázat

Az LqhP35 toxin toxikus aktivitása

Vizsgált állat	Hatás	ED50-érték
Dongólégylárva	késleltetett, hosszan tartó összehúzódásbénítás (PU)	14 ng/100 mg testtömeg
Ászka	bénulás 5 percen belül (PU)	20 ng/100 mg testtömeg
Egér	Letalitás 24 órán belül (LD50)	100 pg/20 g testtömeg3

³ Mintegy két nagyságrenddel kevésbé toxikus, mint a közönséges, az emlősállatra ható, skorpióméregből származó toxin (Rochat és munkatársai, 1979).

Kötési kísérletek. 210 pl reakciókeverék 1,5 mmol/1 ¹²⁵I AalT-t, 40 pg fehérjét sáskákból származó szinaptoszomális membrán-vezikulumok formájában (Zlotkin és Gordon, 1985) és a versengő anyagok növekvő koncentrációit tartalmazza standard kötőközegben [0,15 mol/1 kolin-klorid, 1 mmol/1 MgSO₄, 2 mmol/1 CaCl₂, 0,1% RSA (Zlotkin és Gordon, 1985)]. A membránokat 40 percig inkubáljuk 22 °C hőmérsékleten. Az elválasztást a szabad és membránkötött ¹²⁵I AalT között gyors szűrési eljárással hajtjuk végre (Zlotkin és Gordon, 1985). A jelzett toxinok kötését, amelyet nagy felesleg jelenlétében mérünk a nem jelzett toxinnál, nem fajlagos kötésként határozzuk meg.

Az izgató (Zlotkin és munkatársai, 1985; Gordon és munkatársai, 1984) és a bénító (LqyIT2, Zlotkin és munkatársai, 1985) toxinokkal ellentétben az LqhP35 toxin képes arra, hogy a ¹²⁵I AalT toxint egy szinaptoszomális sáskapreparátumban kiszorítsa. Ez azt mutathatja, hogy az LqhP35 toxin meghatározott kötőhelyekkel bír, amelyek a fenti izgató és bénító, rovarok ellen ható toxinok kötőhelyeitől különböznek.

Elektrofiziológiai tanulmányok. Az LqhP35 toxint a „current and voltage clamp” körülményei között egy ingerelhető membrán két különböző készítményén vizsgáljuk: a Periplaneta americana izolált, óriás axonján és a patkány izolált vázizomrostján. Az LqhP35 toxin hatását a csótányaxon akciópotenciáljára úgy határozzuk meg, hogy akciópotenciált idézünk elő a toxin jelenlétében rövid (0,5 msec) depolarizáló árammal (10 nA). Az LqhP35 toxin hatását a csótányaxon Na⁺-áramára egy úgynevezett „voltage clamp” kísérletben határozzuk meg 2.10^-4 3,4-DAP jelenlétében. Az LqhP35 toxin hatását a patkány izolált vázizomrostjának akciópotenciáljára úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk az akciópotenciált normál Ringer-oldatban és a toxin külső beadása után. Az LqhP35 hatását a patkány izolált vázizomrostjának ionáramára úgy határozzuk meg, hogy a membránpotenciáit meghatározott értéken rögzítjük („voltage clamp” kísérlet) (egy nyugalmi potenciál lépésenként! depolarizálása -90 mV-ról -40 mV-ig).

A toxin mindkét készítményben lényegében azonos hatást indukál, az indukált akciópotenciál meghosszabbodását, amely a nátrium-inaktiválás nyilvánvaló gátlására vezethető vissza. A toxin nem károsítja vagy nem változtatja meg (a) az akciópotenciál amplitúdóját, (b) a membrán nyugalmi potenciáljának magasságát és (c) a kálium-vezetőképességet.

Az LqhP35 toxin kitüntetetten hat a rovarok izgatható membránjai ellen, amikor ennek aktivitását az emlősállatok ellen nagyhatású, AaH2 toxin aktivitásával hasonlítjuk össze, amelyet azonos készítményeken vizsgálunk. A jelen „current clamp” körülmények között az akciópotenciál meghosszabbodása az LqhP35 révén olyan koncentrációt idéz elő, amely mintegy két nagyságrenddel kisebb, mint az, amely a rovaraxon készítményben az AaH2 toxinhoz szükséges (Pelhate és Zlotkin, 1981), és legalább egy nagyságrenddel nagyobb, mint az AaH2-nél a patkány vázizommembránjában. Az utóbbi esetben az akciópotenciál maximális időtartama nyilvánvalóan kisebb az LqhP35 toxinnál (IO ⁶ mol/1, 2234±584 msec, n=7), mint az AaH2 toxinnál (10~⁷ mol/1, 700±420 msec, n=8).

2. példa

A százlábúmérgek előállítása

S. canidenst gyűjtünk Jeruzsálem és a Holt-tenger környékén. A mezőn gyűjtött százlábúakat egyenként laboratóriumi tartályokban tartjuk, amelyek nedvességet abszorbeáló anyagot tartalmaznak és vízellátásuk van. A százlábúakat élő rovarokkal tápláljuk (minden második héten).

A százlábúak mérgét úgy nyerjük ki, hogy ezeket az alábbi módon megfejjük: a „méregfogak” tövét elektromosan stimuláljuk, és a mérget műanyagból készült, kapilláris csövecskékben gyűjtjük, amely csövecskék a „méregfogak” csúcsához vannak rögzítve.

A 3. táblázat bemutatja a százlábúak testhosszát, a fejősenként kinyert méreg térfogatát és az izolált mérgek fehérjekoncentrációját.

3. táblázat

A százlábúmérgek térfogata és fehéqekoncentrációja

Százlábú	Testhossz (cm)	Méregtérfogat fejesenként (μΐ)	Fehérjetartalom3 (pg/pl)
S. canidens (Holt-tenger)	6-8	0,29; 0,2 és 0,4 között (5)	210
S. canidens (Jeruzsálem)	11-14	4,33; 3,7 és 5,0 között (3)	190

^a Lowry és munkatársai szerint (1951) meghatározva.

3. példa

A S. canidens mérgek stabilitása A Holt-tenger környékéről való S. canidens százlábú mérgét a fentebb leírtak szerint izoláljuk és stabilitását szobahőmérsékleten való tartásnál vagy liofilezés után

HU 220 078 Β vizsgáljuk. A S. canidensnek ugyanazt az értékelését végezzük, amelyet a 2. példában alkalmaztunk. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 4. táblázatban foglaljuk össze.

4. táblázat

A százlábúméreg stabilitása (S. canidens a Holt-tenger környékéről)

Körülmé- nyek0	Frissen fejt méreg	Ötnapos tárolás	Mélyhűtés és liofilezés
aktivitásb	2,6	2,5	31

⁰ A mérget az összes kezelésnél vízzel hígítjuk.

^b Az aktivitást Sarcophaga-légylárvák ellen bénító egységben határozzuk meg, ng fehétje (Lowry és munkatársai, 1951)/100 mg testtömegben kifejezve.

4. példa

A Scolopendra nemzetség különböző százlábúját mérgének toxicitása különböző állatokra

5. táblázat

A Scolopendra nemzetség különböző százlábúját mérgének toxicitása különböző állatokra

Százlábú vizsgálat0	S. cingulata (pg)	S. canidens (Jeruzsálem) (Rg)	S. canidens (Holt-tenger) (Rg)
Sarcophagalégylárvák bénítása	0,13	0,14	0,005
Sarcophagalégylárvák letalitása	0,075	0,10	0,04
Spodoptera-lárvák bénítása	8,23	8,82	2,99
Spodoptera-lárvák letalitása	8,23	8,82	2,99
Felnőtt Locusták bénítása	0,65	0,64	0,031
Felnőtt Locusták letalitása	0,16	0,15	0,043
Egerek LD5„-értékeb	350	245	>1000

^a A bénítást PU₅₀-ként határozzuk meg, μ g/100 mg testtömegben kifejezve, 30 másodperc múlva Sarcophaga-lárváknál és 5 perc múlva Spodopteránál és Locustánál. A letalitást 24 óra múlva 50%-os letális dózisként (LD₅₀) határozzuk meg, μ g/100 mg testtömegben meghatározva. A kísérletet (5 vagy 7 állat adagonként) és az 50% hatóanyag becslését Reed és Muench (1938) szerint visszük végbe. A különböző állatok átlagos testtömege Sarcophaga-lárváknál 130-150 mg, a Spodoptera-lárváknál 70-400 mg, a felnőtt, hím Locustáknál 1,3 -1,6 g és az albínó egereknél 7-12 g.

^b μ10 g/10 g testtömegben kifejezve.

Háromféle százlábúból gyűjtünk mérget: S. canidensből (Holt-tenger), S. canidensből (Jeruzsálem) és

S. cingulatából (Felső-Galileából és a Golan-fennsíkról gyűjtve). A liofilizált mérgek toxicitása a három rovarfajtánál és egereknél az 5. táblázatban van bemutatva. A Holt-tenger környékéről származó S. canidens mérge mutatja a legmagasabb toxieitást rovarok ellen, míg gyakorlatilag inaktív egerek ellen, az ebben a méregben levő toxin tehát rovarokra szelektív. Még 1 mg/10 g egér mennyiségben adott injekció sem indukálja a mérgezés egyszeri tüneteit.

5. példa

Százlábú reakciója azonos fajú állatokból való méregre

6. táblázat

Százlábú (Holt-tenger környékéről gyűjtött S. canidens) reakciója egy hasonló fajú állat mérgére

Százlábú	Tömeg (mg)	Injektált méreg	Hatás
(Mg fehéije)0	Sáska- bénító egység6	azonnali	24 óra múlva
1	420	2,2	25	nincs	nincs
2	460	7,4	75	nincs	nincs
3	490	10,5	100	nincs	nincs
4	580	18,7	150	nincs	nincs
5	580	18,7	150	gyorsan múlóc	bénító
6	580	18,7	150	gyorsan múlóc	pusztu- lás, bénulás

^a Loviy és munkatársai szerint (1951) meghatározva ^b A Locusta migratoria méregmintájának bénítóképessége 21,5 mg/100 mg testtömeg. A sáskabénító egység számértéke olyan testtömegű sáskának felel meg, amely a megfelelő százlábú testtömegével azonos.

^c A bénulás az injekciós hely körül lokalizálódik és 20 perc múlva eltűnik.

A Holt-tenger környékéről való S. canidens rezisztens azonos fajú állatok mérgével szemben, és egy olyan méregadagnak is ellenáll, amely legalább 150 azonos testtömegű sáskát képes megbénítani (6. táblázat).

6. példa

A toxieitás elvesztése melegítésre

Meghatározzuk a melegítés (80 °C, 5 perc) hatását a mérgek stabilitására Sarcophaga-légylárvákkal. Amint a 7. táblázat bemutatja, a százlábúmérgek toxicitása egy vizsgálati kezeléssel elpusztul, amint ezt a Sarcophagalárvákra való bénító hatással meghatározzuk.

7. táblázat

A toxieitás elvesztése melegítésre³

A méreg forrása	Kezeletlen 2pl(2PU50)	Melegített (80 °C, 5 perc) 10pl(10PU50)
S. canidens (Holt-tenger)	aktív	inaktív
S. canidens (Jeruzsálem)	aktív	inaktív

⁰ A PU₅₀-érték a Sarcophaga-légylárváknál 5 ng/100 mg testtömeg, amikor egy, a Holt-tenger-kömycki százlábú mérgéből, és 150 ng/100 mg, amikor egy Jeruzsálem-kömyéki százlábú mérgéből származik.

HU 220 078 Β

7. példa

Proteolitikus enzimek befolyása a százlábúméreg toxicitására Sarcophaga-lárváknál A százlábúméreg toxicitását a szokásos proteolitikus enzimpreparátumok elpusztítják (8. táblázat). A tripszin hatásosabbnak bizonyul, mint a pronáz. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a százlábúméreg fehéije.

8. táblázat

A tripszin és a pronáz (Pronase E, Sigma, USA) befolyása 5% enzim/szubsztrátum aránynál az S. canidens (Jeruzsálem) mérgének toxicitására Sarcophaga-lárváknál

Kezelés	Inkubálási időtartam (óra)
1	5
Proteáz nélkül, 2 PU50 injektálva	+	+
Tripszin és 10 PU50 injektálva	-	-
Pronase E és 10 PU50 injektálva	+	-
Tripszin injektálva	-	-
Pronáz injektálva	-	-

“ A közeg foszfáttal pufferolt konyhasóoldat (pH 7,4-Sigma, USA). A méreg PU₅₀-értékc 150 ng/100 mg testtömeget tesz ki.

8. példa

A százlábúméreg tisztítása

A százlábúmérget analitikai HPLC molekulaszitaoszlopon végzett részleges ffakcionálással és fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk.

A molekulaszita-oszlop [Suprose 12 10/30, Pharmacia; 0,05 mol/1 ammónium-acetát-puffer (pH 8,5); átfolyási sebesség 0,5 ml/perc] alkalmazásával végzett elemzés azt mutatja, hogy a légylárvákra való toxicitásnak csak 20%-a marad meg a Holt-tenger-kömyéki százlábúak mérgéből. Egy kvalitatív megkülönböztetés köztes faktorokat észlel, amelyek elernyedést indukálnak és így a légylárvákra összehúzólag hatnak. A Holt-tengerkömyéki százlábúakban az utóbbi faktor 15-20 kD-s becsült molekulatömegnek felel meg.

A fordított fázisú HPLC-elemzéshez C-8-at (Merck); A keveréket (viz+0,1% TFA) és B keveréket (izopropanol+acetonitril+0,1% TFA) alkalmazunk.

A három méreg elúciós profilja nem egyezik meg a százlábúfajok „hivatalos” taxonómiai definíciójával. A Jeruzsálem környékéről való S. canidens és a S. cingulata azonos elúciós profilt mutat molekulaszita- és fordított fázisú kromatográfiánál, és mindkettő eltérő profilt mutat a Holt-tenger-kömyéki S. canidenstől. Ennek háttereként azt is kell látni, hogy mindhárom csoport könnyen megkülönböztethető nagyságuk és színmintájuk alapján.

9. példa

Ti-plazmidból származó vektor megalkotása

A pCIBIO vektor (Rothstein és munkatársai, 1987) egy Ti-plazmidból származó vektor, amelyet a kiméra gének átviteléhez alkalmazhatunk A. tumefaciens révén. A vektor a pRK252 plazmidból származik, amely széles gazdatartománnyal bír, és amely dr. Bames W.-től (Washington University, St. Louis) szerezhető be. A vektor továbbá tartalmaz egy olyan gént, amely Agrobacteriumban kanamicinrezisztenciát ad át és a Tn903 transzpozonból származik, továbbá tartalmaz jobb és bal T-DNS-határszekvenciákat a pTiT37 Ti-plazmidból. A határterületek között található egy polilinker-terület a pUC18 plazmidból, továbbá egy kiméra gén, amely a növényekben kanamicinrezisztenciát idéz elő.

Egy első eljárási lépésben a pRK252 plazmidot olyan módon módosítjuk, hogy a tetraciklin-rezisztencia gén a Tn903 transzpozonból (Oka és munkatársai, 1981) származó kanamicinrezisztencia génre ki legyen cserélve. Egy további módosítás tárgya az egyedi EcoRI hasítási hely kicserélése a pRK252-ben BglII hasítási helyre (az 1. ábra összefoglalja a módosításokat). A pRK252 plazmidot ezután a Sáli és Smal endonukleázokkal hasítjuk, és végül a DNS-polimeráz-I nagy alegységével kezeljük, sima végek előállítása érdekében. A nagy vektorfragmentumot agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk. Ezt követően a p368 plazmidot, amely a Tn903-at egy mintegy 1050 bp nagyságú, BamHI-fragmentumban tartalmazza, BamHI-endonukleázzal hasítjuk és a DNS-polimeráz nagy fragmentumával kezeljük. A mintegy 1050 bp-t átfogó fragmentumot agarózgélelektroforézist végezve tisztítjuk. Ez a fragmentum olyan gént tartalmaz a Tn903 transzpozonból, amely rezisztenciát ad át a kanamicin antibiotikum ellen [Oka és munkatársai (1981)]. A p368 plazmid az ATCC-nél 67700 deponálási számon van deponálva. Abból a célból, hogy sima végeket állítsunk elő, mindkét fragmentumot a DNS-polimeráz nagy alegységével kezeljük. Végül a két fragmentumot összekeverjük és egy éjszakán át 50 °C hőmérsékleten T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Az E. coli HB101 törzs transzformálása és kanamicinrezisztens telepek szelektálása után kapjuk meg a pRK252/Tn903 plazmidot.

Az így kapott pRK252/Tn903 plazmidot egyedi EcoRI hasítóhelyén hasítjuk és sima végek kialakítása érdekében E. coli DNS-polimeráz nagy alegységével kezeljük. Ezt a fragmentumot szintetikus kapcsolóval, úgynevezett linkerrel, amely BglII restrikciós hasítóhelyet tartalmaz összekeveijük, és egy éjszakán át T4 DNSligázzal inkubáljuk. Az ebből a kezelésből kialakult DNS-t BglII restrikciós endonukleáz fölöslegével hasítjuk, és a nagy vektorfragmentumot agaróz-gélelektroforézis segítségével tisztítjuk. Az így létrejövő fragmentumot újból inkubáljuk T4 DNS-ligázzal, hogy a fragmentum újonnan hozzátoldott, kohezív BglII végeivel újból körré alakuljon. Az E. coli HB101 törzs transzformálása után kapjuk meg a pRK252/Tn903/BglII plazmidot (1. ábra).

A következő eljárási lépésben a pBR322 plazmid származékát alkotjuk meg, amely a Ti-plazmidból származó T-DNS-határszekvenciák és a pUC19 plazmidból származó polilinker-terület mellett egy kanamicinrezisztencia szerint a növényben szelektálható gént is tartalmaz (2. ábra). A pBR325/Eco29 plazmid tartalmazza

HU 220 078 Β a pTiT37 nopalin Ti-plazmidból származó, 1,5 kbp-t behatároló EcoRI-fragmentumot. Ez a fragmentum tartalmazza a bal T-DNS-határszekvenciát (Yadav és munkatársai, 1982). Ezen fragmentum EcoRI végeinek kicserélésére HindlII-végekre a pBR325/Eco29 plazmidot EcoRI-gyel hasítjuk, majd SÍ nukleázzal inkubáljuk. Ezt inkubálás követi a DNS-polimeráz nagy fragmentumával, sima végek előállítása érdekében. Ezt a reakciókeveréket szintetikus HindlII-kapcsolókkal keveijük össze és T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Az így létrejövő DNS-t Clal endonukleázzal és HindlII fölöslegével elhasítjuk; az így létrejövő, 1,1 kbp-t behatároló fragmentumot, amely a bal T-DNS-határszekvenciát tartalmazza, gélelektroforézis segítségével tisztítjuk. Ezután a pUC19 plazmid polilinker területét izoláljuk úgy, hogy a plazmid DNS-t EcoRI és HindlII endonukleázokkal hasítjuk, és a kisebbik fragmentumot (mintegy 53 bp) agaróz-gélelektroforézissel izoláljuk. Ezután a pBR322 plazmidot EcoRI és Clal endonukleázokkal hasítjuk, a két másik, korábban izolált fragmentummal összekeverjük, T4 DNS-ligázzal inkubáljuk, és ezzel E. coli HB101 törzset transzformálunk. Az így létrejövő pCIB5 plazmid a polilinker-területet és a bal T-DNShatárszekvenciát tartalmazza a pBR322 plazmid egy származékába integrálva (2. ábra).

Ezután egy plazmidot alkotunk meg, amely olyan gént tartalmaz, amely a kanamicinrezisztencia kifejezését közvetíti növényekben (3. és 4. ábra). A Bin 6 plazmid (Bevan, 1984) dr. Bevan M.-től (Plánt Breeding Institute, Cambridge, Egyesült Királyság) szerezhető be. A Bin 6 plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk. A mintegy 1,5 kbp-t behatároló plazmidot, amely a kiméra NPT-gént tartalmazza, izoláljuk, majd agaróz-gélelektroforézissel tisztítjuk. A fragmentumot pUC18 DNS-sel, amelyet előzőleg EcoRI és HindlII endonukleázokkal hasítottunk, összekeveijük. T4 DNS-ligázzal végzett inkubálás után az így létrejövő DNS-sel az E. coli HB101 törzset transzformáljuk. Az így keletkezett plazmidot pUC18/neo-nak nevezzük. Ez a plazmid egy nem kívánt BamHI hasítási helyet tartalmaz az NPT-gén és a nopalin-szintáz gén terminátorszekvenciája között (Bevan, 1984). Abból a célból, hogy ezt a felismerő szekvenciát eltávolítsuk, a pUC18/neo plazmidot BamHI endonukleázzal hasítjuk, majd a DNS-polimeráz nagy alegységével kezeljük, hogy sima végeket kapjunk. Abból a célból, hogy a fragmentumot újból kör alakúvá képezzük, ezt ezután T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Ezzel a fragmentummal E. coli HB101 törzset transzformálunk. Az így létrejövő pUC18/neo(Bam) plazmid már nem tartalmaz BamHI felismerő szekvenciát.

Ezután a jobb T-DNS-határszekvenciát beiktatjuk közvetlenül a kiméra NPT gén mellett (4. ábra). A pBR325/Hind23 plazmidot SacII és HindlII endonukleázokkal hasítjuk, és egy 1,0 kbp-t tartalmazó fragmentumot, amely a jobb határszekvenciát tartalmazza, agaróz-gélelektroforézis segítségével, tisztított formában izolálunk. A pUC18/neo(Bam) plazmidot SacII és HindlII endonukleázokkal hasítjuk, és a 4,0 kbp-s vektorfragmentumot agaróz-gélelektroforézis segítségével tisztítjuk. A két fragmentumot egymással összekeveijük, T4 DNS-ligázzal inkubáljuk, és ezzel E. coli HB101 törzset transzformálunk. Az így létrejövő pCIB4 plazmid (4. ábra) tartalmazza a jobb T-DNShatárszekvenciát, valamint tartalmazza a növényben szelektálható kanamicinrezisztencia-markert a pUC18 plazmid egy származékában.

Egy további eljárási lépésben olyan plazmidot alkotunk meg, amely tartalmazza mind a jobb, mind a bal T-DNS-határszekvenciát, és ezek között a határszekvenciák között a növényben szelektálható kanamicinrezisztencia gént és a pUC18 plazmid polilinkerjét (5. ábra). Ezután a pCIB4 plazmidot HindlII endonukleázzal hasítjuk, majd a DNS-polimeráz nagy alegységgel kezelést végzünk, sima végek előállítása érdekében, és fragmentálunk EcoRI endonukleázzal. A 2,6 kbp-s fragmentumot, amely a kiméra kanamicinrezisztencia gént és a jobb T-DNS-határszekvenciát tartalmazza, agaróz-gélelektroforézis segítségével izoláljuk. Ezután a pCIB5 plazmidot az AatlI endonukleázzal hasítjuk, a sima végek kialakítása érdekében T4 DNS-polimerázzal kezelünk, majd EcoRI endonukleázzal hasítunk. A nagyobbik vektorfragmentumot agaróz-gélelektroforézis segítségével tisztítjuk, a pCIB4 fragmentummal összekeveijük és T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Ezzel a fragmentummal E. coli HB101 törzset transzformálunk. Az így létrejövő pCIB2 plazmid (5. ábra) a pBR322 plazmid származéka, amely tartalmazza a kívánt szekvenciákat a két T-DNS-határszekvencia között.

A következő lépés teszi teljessé a pCIBIO vektor megalkotását (6. ábra). A pCIB2 plazmidot EcoRV endonukleázzal hasítjuk, és amint az előzőekben leírtuk, olyan szintetikus kapcsolókkal látjuk el, amelyek egy BglII felismerőhelyet tartalmaznak. A vágás után BglII fölöslegével a mintegy 2,6 kbp-s fragmentumot agaróz-gélelektroforézis segítségével izoláljuk. A korábban már leírt pRK252/Tu903/BglII plazmidot (1. ábra) BglII endonukleázzal hasítjuk, majd foszfotázzal kezeljük, hogy az újra kör alakú rendeződést meggátoljuk. Ezt a két DNS-fragmentumot összekeverjük egymással és T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Ezt azután E. coli HB101 törzsbe transzformáljuk. Az így létrejövő plazmid a teljessé vált pCIBIO vektor.

A pCIBIO plazmid körülöleli azokat a T-DNS-határszekvenciákat, amelyek egy növényekben kifejezhető NPT-gént és a T-DNS-határszekvenciákon belüli beiktatáshoz szükséges restrikciós helyeket záiják be.

10. példa

Rovarokra szelektíven ható toxinokat kódoló gének szintézise

A. Rovarokra szelektív toxinok tisztítása. A különböző rovarokra szelektív toxinok tisztítását Zlotkin már több munkában leírta (Zlotkin és munkatársai, 1971a és 1985; Lester és munkatársai, 1982). Egy másik eljárás, amellyel korlátozott mennyiségű génnél magas kitermelés érhető el, a HPLC. Ezt a technikát például az LqhIT2 tisztításának segítségével szemléltetjük.

Az LqhIT2 tisztításához a L. quinquestriatus hebraeus fagyasztva szárított mérgét (Sigma) háromszor

HU 220 078 Β extraháljuk 0,5 ml víz/20 mg méreg arányban. A vizes extraktumokat egyesítjük és ioncserélő kromatográfíának vagy szulfoetil-aszpartamid-HPLC-oszlopkromatográfiának (Nest Group) vetjük alá. Az extraktumot az előzőleg 25% acetonitrilben levő 5 mmol/1 KPO₄-gyel (pH 3) kiegyensúlyozott oszlopra visszük fel, és az oszlopot KC1 gradienssel (0->0,5 mol/1 ugyanebben a pufferban) 60 percen át eluáljuk. Az egyes frakciókat sómentesítjük és további szétválasztást végzünk fordított fázisú kromatográfiával Vydac C-8-oszlopon, amely 0,1% TFA-ban van kiegyensúlyozva és 75 perces, 0—>70% B gradienssel (B=acetonitril-izopropanol 1:1 0,1%-os TFA-ban) eluáljuk. Az egyes frakciók toxicitását rovarok ellen Sarcophaga- vagy Heliothis-lárvákba injektálással vizsgáljuk, amint ezt Zlotkin és munkatársai leírták (1985).

B. A rovarokra ható toxinok aminosavszekvenciaelemzése. A rovarokra ható toxinokat redukáljuk olyan módon, hogy a mintákat 6 mmol/1 guanidin.HCl-t, 1 mol/1 trisz.HCl-t (pH 8,6), 10 mmol/1 EDTA-t és 20 mmol/1 ditiotreitolt tartalmazó oldatban inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 1 órán át. 4vinil-piridint (Sigma) adunk hozzá 50 mmol/1 végkoncentrációig, és az inkubálást további egy órán át folytatjuk szobahőmérsékleten. A módosított fehérjét a fentebb leírtak szerint Vydac C-8-oszlopon sómentesítjük. Tripszinnel, Lys-C-vel vagy Glu-C-vel végzett enzimes bontással, vagy részleges savas hidrolízissel, standard eljárások szerint (Allén, 1981) peptideket állítunk elő. A szekvenciaelemzés előtt a peptidet fordított fázisú HPLC-vel elkülönítjük. Az ép toxin vagy az egyes peptidek aminosavszekvenciáját automatizált Edman-lebontással határozzuk meg, ahol Model 470A protein Sequencer elemzőberendezést (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) alkalmazunk, amely on-line, fordított fázisú HPLC-vel van ellátva az aminosavak fenil-hidantoin-származékainak elemzéséhez, továbbá Model 900 adatelemző rendszerrel van ellátva.

Más, rovarokra ható toxinok szekvenciáit, amelyeket azonos eljárás alkalmazásával kapunk meg, a 7. ábrában ábrázoljuk.

C. Olyan gének szintézise, amelyek rovarokra ható toxint kódolnak. Mivel a rovarokra ható toxinok kis fehéijék (<80 aminosav), egy olyan gént, amely egy toxint kódol, DNS-szintézissel meg lehet alkotni. A későbbiekben leírjuk egy olyan gén szintézisét, amely AalT-t kódol, ez az Androctonus australis rovarokra ható toxinja.

Az ismertetett szekvenciát (Darbon és munkatársai, 1982) visszafordítjuk olyan módon, hogy azt a genetikai kódot alkalmazzuk, amelybe be van számítva az a kodongyakoriság, amely a Wisconsin University Genetics Computer Group számítógépes programjának segítségével létrehozott GenBank adatbankban az összes kukoricafehérjéből adódik. Néhány esetben eltérő kodont is választhatunk abból a célból, hogy megkönnyítsük a szintézist és/vagy jól illeszkedő restrikciós hasítási helyekről gondoskodjunk. A transzláció stop- és startszignáljait a következő kezelések megkönnyítéséhez alkalmazott BamHI-kapcsolókkal együtt mindkét végre hozzátoldjuk. Ennek a munkamenetnek a segítségével az la és lb szekvenciákat (8. ábra) tartalmazó szekvenciákat kapjuk meg.

Azokat az oligonukleotidokat, amelyek az l->20 területnek felelnek meg (c-szekvencia), Model 380A típusú DNS-szintetizáló berendezés (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) segítségével szintetizáljuk a β-ciano-etil-kémia alkalmazásával.

A gént az alábbi lépésekkel állítjuk össze.

(1) Az alábbi reakciókeverékek előállítása, amelyek az egyes fragmentumokból 40-40 pmol/litert tartalmaznak.

A. 2,12,13 fragmentum

B. 3,4,14,15 fragmentum

C. 5,6,7,16,17,18 fragmentum

D. 8, 9,19,20 fragmentum

E. 10,11, 21 fragmentum (2) Az egyes keverékekben a fragmentumok 5’végére 5’-foszfátot toldunk úgy, hogy T4 polinukleotid-kinázt alkalmazunk a Maniatis és munkatársai (1982) által leírt eljárás szerint.

(3) A fölösleges reagensek eltávolítása után fenil/kloroformos extrakcióval, kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással, az egyes keverékek csapadékát, amelyek a foszforilezett fragmentumokat tartalmazzák, T4 ligáz-pufferban oldjuk. 40 pmol/1 1. fragmentumot adunk az A keverékhez, és 40 pmol/1 22. fragmentumot adunk az E keverékhez. A keverékeket 85 °C hőmérsékletre melegítjük, majd lassan 15 °C hőmérsékletre lehűtjük, és ezen a hőmérsékleten legalább 4 órán át inkubáljuk, amellyel a fragmentumok hibridizálódhatnak.

(4) ATP-t adunk hozzá összesen 1 mmol/1 koncentrációig T4-ligázzal együtt, és az inkubálást további 4 órán át folytatjuk. A fölösleges reagenseket az (1) lépésben leírtak szerint extrahálással és kicsapással eltávolítjuk. Abból a célból, hogy a reakció hatékonyságát ellenőrizzük, a termék egy alikvotját 10-15%-os akril-amidgélen elemezzük. Amennyiben szükséges, a megfelelő fragmentumokat preparatív gélelektroforézissel tisztíthatjuk, és a gélről kinyerhetjük. A tisztátalanságokat kicsapással is eltávolíthatjuk.

Az alábbi fragmentumnagyságok várhatók az első kapcsolási lépés után:

A keverék: 49 bp B keverék: 45 bp C keverék: 65 bp D keverék: 45 bp E keverék: 46 bp.

(5) Az A és B első kapcsolásának termékét az F reakciókeverékké keveijük össze. A D és E kapcsolásának termékét a G reakciókeverékké keverjük össze. A (3) és (4) lépéseket az F és G ke18

HU 220 078 Β verékekkel megismételjük. Az F reakciókeverékből egy 89 bp-s fragmentum alakul ki, míg a G reakciókeverékből egy 86 bp-s fragmentum.

(6) Az F, G és C tisztított fragmentumokat összekeveijük egymással, és a (3) és (4) lépéseket megismételjük, hogy a végső gént 230 bp-vel és BamHI végekkel megkapjuk. A végső szekvencia azonos az ld szekvenciánál bemutatottal (8. ábra). A tisztított fragmentumot BamHI hasítóhelyekkel ellátott, megfelelő vektorokhoz való kapcsoláshoz alkalmazzuk.

(7) Abból a célból, hogy a DNS-t sokszorozzuk, a tisztított fragmentumot a pUC18 BamHI hasítóhelyeivel kapcsoljuk, és egy alkalmas E. coliba klónozzuk. A beiktatások DNS-szekvenciáját szabványosított szekvenciaelemzési eljárások alkalmazásával ellenőrizzük.

11. példa

Transzformációs vektor növényekhez, amely vektor a kiméra CaMV 35 promotor/toxin gént tartalmazza

Azok a vektorok, amelyek egy növényekben kifejezhető promotort és kódolandó heterológ szekvenciák beiktatásához hasítóhelyeket tartalmaznak, a pCIBlO-ből származnak (Rothstein és munkatársai, 1987). A pCIB770 plazmid növényekben kifejeződni képes promotorként a CaMV 35S promotort tartalmazza. Az inszekticid aktivitású, toxint kódoló szekvenciát a promotortól lefelé (downstream) egy BamHI-gyel kialakított hasítóhellyel kapcsoljuk.

Az ezzel a vektorral transzformált növényi szöveteket kanamicin vagy G418 antibiotikumok alkalmazásával szelektáljuk, amint a későbbiekben leírjuk és a szakemberek számára ismert.

12. példa

Transzformációs vektorok növényekhez, amely vektorok kiméra, növényekben kifejezhető toxingént és növényekben való szelekcióhoz alkalmas higromicinrezisztencia-markert tartalmaznak

A pCIB743 plazmid (Rothstein és munkatársai, 1987) a T-DNS-határokon belül egy növényekben kifejezhető higromicinrezisztencia gént tartalmaz. Egy második, növényekben kifejezhető kiméra gént iktatunk be az egyedi restrikciós hasitóhelyek alkalmazásával, és növényekbe vezetjük be.

Az ezzel a vektorral transzformált növényi szöveteket higromicin vagy analóg antibiotikum alkalmazásával szelektáljuk, amint ezt a későbbiekben leírjuk, és amint ez a szakemberek számára jól ismert.

13. példa

Dohány-levéllemezek transzformálása

A. A növényi anyag transzformálása Agrobacteriummal. Az A. tumefaciens különböző genotípusait AB minimál tápközegben (Watson és munkatársai, 1975), amely még mannitot vagy glutamátsót is tartalmaz, tenyésztjük 48 órán át, 28 °C hőmérsékleten. A baktériumokat kiülepítjük, MSBN tápközegben való kétszeres hígítással újra szuszpendáljuk és órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az

MSBN tápközeg az úgynevezett komplett fő- és mellék- („major and minor”) sókat tartalmazza Murashige és Skoog szerint (1962) (KC Biologicals), az alábbi kiegészítésekkel (végkoncentrációk): 6-benzil-adenin (1 mg/liter); nikotinsav (1 mg/liter); piridoxin (1 mg/liter); tiamin HC1 (10 mg/liter) és szacharóz (30 g/liter). A pH-t 5,8-ra állítjuk be. Levéllemezeket vágunk ki 5-7 mm átmérővel, aszeptikusán in vitro tenyésztett Nicotiana tabacum xanti sp-ből, és 10 percen át Horsch és munkatársai (1985) megváltoztatott eljárása szerint baktériumszuszpenzióba merítjük. A levéllemezeket ezután szűrőpapírra helyezzük, amely MSBN tápközeget tartalmaz. 48 óra múlva a levéllemezeket a transzformált sejtek kiválasztása céljából olyan folyékony MSBN tápközegbe merítjük, amely 500 mg/liter karbenicillint is tartalmaz, és olyan szilárd MSBN tápközegre (0,8% agar) helyezzük, amely 100 mg/liter kanamicint és 500 mg/liter karbenicillint is tartalmaz.

B. A növények érlelése és önbeporzás. Azokat a hajtásokat, amelyek MSBN szelekciós tápközegben létrejött kalluszokból valók, OMS tápközegre visszük át, amely tartalmazza az MS fő- és melléksóit, továbbá Fe-EDTA-t (Gibco # 500-1117; 4,3 g/liter), B5 vitamint (Gamborg és munkatársai, 1968), 100 mg/liter mio-inozitot és 30 g/liter szacharózt tartalmaz (pH 5,8) és ki van egészítve 100 mg/liter kanamicinnel és 250 mg/liter karbenicillinnel. A kanamicint és a karbenicillint szűréssel sterilezett oldatként adjuk hozzá, miután a tápközeg többi alkotórészeit autoklávozással sterileztük. A növénykéket legalább 3 hétig hagyjuk növekedni. A növénykéket szétdaraboljuk, hogy szeletkékben sok másolatot kapjunk, amelyeket legalább három héten át hagyunk kifejlődni és gyökerezni. A kigyökerezett növénykéket azután földvermikulit-keverékbe ültetjük át, és melegházba visszük. A frissen átültetett növénykéket a hozzászoktatás érdekében egy nedvességet és árnyékot biztosító, körülvevő műanyag pohár alatt tartjuk. A virágzás időszakában az önbeporzást indukáljuk. Az érés után a magvakat learatjuk.

14. példa

Transzgenikus dohánykallusz és dohánynövény előállítása

A T-DNS-t tartalmazó vektort vagy a növényekben kifejezhető gént tartalmazó vektort E. coli SM17-ből (Simon és munkatársai, 1983) keresztezéssel visszük át A. tumefaciens CIB542-be. Egy másik eljárás szerint az Agrobacterium CIB542-t a vektorral Holsters és munkatársai (1978) eljárása szerint transzformáljuk. Az Agrobacterium CIB542 az EHA101 törzs (Hood és munkatársai, 1986), amelybe a plazmid kanamicin markere a Tn7 spektinomicin/streptomicin részével van kicserélve. Az Agrobacterium törzset, amely a T-DNS-ből származó plazmidot hordozza és a pCIB542-t alkalmazzuk,

HU 220 078 Β hogy a dohányt a fentebb leírt levéllemezes eljárással transzformáljuk. A kanamicinrezisztens, transzformált növényeket érésig tenyésztjük. Egy másik eljárás szerint a kalluszt, amely levéllemezekből kanamicintartalmú MSBN szelekciós tápközegen fejlődött ki, kallusznövesztő tápközegre visszük, amely az MS fő- és melléksókat tartalmazza, továbbá tartalmaz Fe-EDTA-t (Gibco # 500-1117; 4,3 g/liter), MS-vitaminokat, 100 mg/liter mio-inozitot, 20 g/liter szacharózt, 2 mg/liter naftil-ecetsavat és 0,3 mg/liter kinetint.

A kalluszt arra használhatjuk fel, hogy transzgenikus növényeket regeneráljunk olyan módon, hogy kalluszdarabokat viszünk át MSBN tápközegre és a fentebb leírt eljárást követjük.

15. példa

Zea mays transzformálása és regenerálása

Zea mayst transzformálunk és regenerálunk a 9. táblázatban megnevezett tápközegekben.

9. táblázat

Az alkalmazott tápközegek összefoglalása A makro- és mikroelemek, valamint az Fe-EDTA ugyanazok, mint amelyeket az irodalom megad a KM tápközegnél Kao és Michayluk (1975) szerint és az N6 tápközegnél Chu és munkatársai (1975) szerint.

Tápközeg	KM-8p	N6
A szerves anyagok és vitaminok, amelyeket a tenyészközegben alkalmazunk (mg/liter):
Biotin	0,01
Piridoxin.HCl	1,00	0,5
Tiamin.HCl	10,00	0,1
Nikotinamid	1,00
Nikotinsav	0,10	0,5
Folsav	0,40
D-Ca-pantotenát	1,00
p-Amino-benzoesav	0,02
Kolin-klorid	1,00
Riboflavin	0,20
B12-vitamin	0,20
Glicin	0,10	2,0
Cukrok és cukoralkoholok (g/liter)
Szacharóz	0,25	30,0
Glükóz	68,40
Mannit	0,25
Szorbit	0,25
Cellobióz	0,25
Fruktóz	0,25
Mannóz	0,25
Ribóz	0,25

Tápközeg	KM-8p	N6
Xilóz	0,25
Mio-inozit	0,10
Végső pH	5,8	5,6
Sterilezés	szűrés	autoklávozás

A makroelemeket általában tízszeresen koncentrált törzsoldatként alkalmazzuk, míg a mikroelemeket ezerszeresen koncentrált törzsoldatként.

A citrom-, fumár- és almasavat (végkoncentráció 40-40 mg/liter), valamint a nátrium-piruvátot (végkoncentráció 20 mg/liter) százszorosán koncentrált törzsoldatként készítjük el, NH₄OH-val állítjuk be pH-ját 6,5re és így adjuk a tápközeghez.

Az adenint (végkoncentráció 0,1 mg/liter) és guanint, timidint, uracilt, hipoxantint és citozint (0,03-0,03 mg/liter) ezerszeresen koncentrált törzsoldatként állítjuk elő, NH₄OH-val állítjuk be pH-ját 6,5-re és így adjuk a tápközegbe.

Az alábbi aminosavakat tízszeresen koncentrált törzsoldatként (pH 6,5 NH₄OH-val) adjuk a tápközeghez, és így az alábbi végkoncentrációkat éljük el: glutamin (5,6 mg/liter), alanin, glutaminsav (0,6-0,6 mg/liter), cisztein (0,2 mg/liter), aszparagin, aszparaginsav, cisztin, hisztidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenil-alanin, prolin, szerin, treonin, triptofán, tirozin és valin (0,1-0,1 mg/liter).

A vitamintörzsoldatokat általában százszorosán koncentrált formában készítjük el.

16. példa.

A rovarokra szelektíven ható toxinok elleni antitestek előállítása

A. Immunogének előállítása. Szabványos számítógépes elemzést (Hopp és Woods, 1983) végzünk a rovarokra szelektíven ható toxinok aminosavszekvenciájából az antigén terület becslésére. Olyan szintetikus peptideket állítunk elő, amelyek ezeknek a tartományoknak felelnek meg. A peptideket egy cisztein összekötő taggal ovalbumin-hordozóhoz kötjük olyan módon, hogy N-szukcinimidil-3-(2-piridiltio)-propionát reagenst (Pierce Chemical Co.) alkalmazunk (Carlsson és munkatársai, 1978). Az összekapcsolás mértékét a konjugátum aminosavelemzésével becsüljük meg.

B. Antiszérumok előállítása. Nyulakat immunizálunk 0,5-1,0 mg, komplett Freund-adjuvánsban emulgeált antigénnel, és havonta adunk emlékeztető oltást nem komplett Freund-adjuvánsban. A szérumok titerét szokásos ELISA-vizsgálattal határozzuk meg olyan módon, hogy egy heterológ hordozóhoz (általában szarvasmarhaszérum-albuminhoz) kapcsolt peptidet alkalmazunk. A pozitív szérumokat a rovarokra ható toxinok ellen titráljuk.

C. Eredmények. Tipikusan 1:10 000 hígítással 1-10 ng homológ peptidet mutathatunk ki. Az 1:300 hígítás 3-10 ng ép toxinfehéije kimutatását teszi lehetővé (10. táblázat).

i

HU 220 078 B

10. táblázat

Toxinpeptidek elleni antiszérumok kimutathatósági határai ELISA-vizsgálatban

Toxin	Immunizáló peptid	A peptid kimutatása	A toxin kimutatása
AalT	N-terminális 1-16.	3 ng 1:10 000-nél	3 ng 1:300-nál
AalT	C-terminális 52-70.	3 ng 1:10 000-nél	3 ng 1:300-nál
LqhIT2	N-terminális 1-13.	1 ng l:1000-nél
LqhIT2	C-terminális 46-61.	1 ng 1:10 000-nél
BjIT2	N-terminális 1-13.	0,3 ng l:3000-nél
BjIT2	C-terminális 46-60	10 ng l:3000-nél	1 ng 1:300-nál

17. példa

Kukorica, amely az AalT kifejezése révén rezisztens Diabrotica ellen

A. A vektor megalkotása. A 9. példában előállított, szintetikus AalT gént a fentebb leírt módon a pCIB710 BamHI hasítóhelyeihez kapcsoljuk. A kívánt, szelektív marker génjét (például az NPT gént, amely kanamicinrezisztenciát ad át) valamely gyakran rendelkezésre álló klónozóhelyhez kapcsoljuk, szabványos technikák alkalmazásával.

B. A kukorica transzformálása és regenerálása. Kukoricaszövetet transzformálunk olyan pCIB710 vektorral, amely az AalT génbeiktatást hordozza, és a növényeket a korábbi példákban már leírtak szerint regeneráljuk. Kontrollként olyan növényeket állítunk elő azonos módon, amelyek csak a pCIB710 vektorral vannak transzformálva. A kialakult növényeket önbeporzáshoz segítjük, és így magokat kapunk (TI magok).

C. Növények vizsgálata AalT kifejezésre. Olyan növényeket, amelyek az TI magokból nőttek ki, vizsgálunk meg az AalT gén létezésére és kifejezésére, ehhez különböző vizsgálatokat alkalmazunk.

(1) DNS-t izolálunk, és ezt BamHI-gyel hasítjuk; a hasítási terméket 1,5%-os agarózgélen elektroforézisnek vetjük alá. A DNS-fragmentumokat nitrocellulózra visszük át és az AalT génnel, amelyet nick (hézag) transzlációval ³²P-vei jeleztünk, hibridizáljuk (Maniatis és munkatársai, 1982). Az AalT gén jelenlétét egy olyan csíkkal igazoljuk, amely mintegy 30 bp-nek felel meg, és a vizsgálómintával hibridizál.

(2) RNS-t mutatunk ki a Northem-folt eljárással (Maniatis és munkatársai, 1982) olyan csíkként, amely mintegy 230 bázisnak felel meg és hibridizál a fentebb leírt ³²P-AaIT génnel.

(3) AalT fehérjét mutatunk ki szabványos immunológiai technikák segítségével valamely poliklonális nyúl antitesttel, amelyet olyan szintetikus peptid ellen alakítottunk ki, amely az AalT 16. N-terminálisának és 19. C-terminálisának felel meg (lásd a 16. példát).

(4) AalT aktivitást mutatunk ki olyan módon, hogy a növényi kivonatokból immunológiai eljárásokkal anyagot tisztítunk, nyulakból származó poliklonális anti-AalT antitestet és „A”-fehérje Sepharose-t alkalmazva, és az izolált anyagot rovarok elleni toxicitásra vizsgáljuk úgy, hogy az anyagot Sarcophaga-lárvákba injektáljuk a 10. példában leírt eljárás szerint.

D. Transzformált kukoricanövények rezisztenciája

Diabrotica által okozott károk ellen. TI magokból kapott csíranövényeket 100 mm-es Petri-csészékben durva vermikulitba ültetünk (csészénként 5 darab, 5 csésze). Amikor a csíranövényen a második levelek megjelennek, mindegyik csészét 20, második vedlési stádiumban levő Diabrotica-lárvával fertőzünk. 7 nap múlva túlélők számát és tömegét és a kukoricanövény kinőtt gyökereinek tömegét meghatározzuk. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodásának statisztikusan szignifikáns (Student-féle vizsgálatban p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési arányának csökkenésével vagy a gyökértömeg károsodásában való csökkenéssel határozzuk meg, összehasonlítva a rovarmentes növények adataival, olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek az AalT gént kifejezik, összehasonlítjuk azokkal a kontrollnövényekkel, amelyek csak a génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy amelyek nincsenek transzformálva.

18. példa

Burgonya és paradicsom, amely az AalT kifejezése révén rezisztensek Leptinotarsa decemlineata (burgonyabogár) ellen

A. A vektor megalkotása. Az AalT gént szintetizáljuk és a pCIB710 vektorral összekapcsoljuk, amint ezt a 17. példa A. részében leírtuk. Az AalT gént a 35S CaMV promotorral együtt a pCIB710 vektorból vágjuk ki és a pCIBIO vektorba visszük be olyan módon, hogy a pCIB710-et Xbal-gyel és EcoRIgyel hasítjuk, az ezáltal keletkező 1460 bp-s fragmentumot izoláljuk és a korábban Xbal-gyel és EcoRI-gyel hasított pCIBlO-zel összekapcsoljuk, hogy a pCIBlO-AalT vektort megkapjuk.

B. Növények transzformálása és regenerálása. A pCIBlO-AalT vektort olyan A. tumefaciensbe vezetjük be, amely valamely virulens plazmidot, például LBA 4404-et vagy pCIB542-t hordoz. A pCIB452 egy A. tumefaciens plazmid, amely egy kialakított, pTiBo542-ből származó vir plazmidot (Hood és munkatársai, 1986) tartalmaz. A pCIB452nél a bakteriális kanamicinrezisztencia gén ki van cserélve egy bakteriális streptomicin/spektinomicin rezisztencia génre. Azt a törzset, amely mind a pCIB710-AaIT-t, mind a pCIB542-t tartalmazza, alkalmazzuk, hogy paradicsomnövénykéket transzfor21

HU 220 078 Β máljunk Fischoff és munkatársai (1987) szerint. Azokat a burgonyanövényeket, amelyek pCIBlO-AalT-t tartalmaznak, Stockhaus és munkatársai (1987) szerint kapjuk meg.

C. A transzformánsok vizsgálata AalT kifejezésre. A transzformánsokat az AalT kifejezésére olyan módon vizsgáljuk meg, amint ezt a 17. példa C. részében leírtuk.

D. A transzformált növények rezisztenciája a burgonyabogár okozta kár ellen. 10 négy hetes korú növényt 5-5, második vedlési stádiumban levő burgonyabogár-lárvával fertőzünk. 4 nap múlva a rovarok mortalitását, a rovarok tömeggyarapodását és a növényeken okozott károk nagyságát meghatározzuk. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodásának statisztikusan szignifikáns (Student-féle vizsgálatban p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési arányának csökkenésével vagy a növénykárosodások csökkenésével határozzuk meg úgy, hogy azokat a növényeket, amelyek az AalT gént kifejezik, összehasonlítjuk azokkal a kontrollnövényekkel, amelyek csak a génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy amelyek nincsenek transzformálva.

19. példa

Dactylis glomerata (csomós ebir), amely az AalT kifejezése révén rovarok ellen rezisztens

A. A vektor megalkotása. Az AalT gént szintetizáljuk és a pCIB710 vektorral együtt a kanamicinrezisztencia génnel összekapcsoljuk, amint ezt a 17. példa

A. részében leírtuk.

B. A növények transzformálása és regenerálása. A transzformált növényeket úgy kapjuk meg, amint korábban leírtuk.

C. A transzformánsok átvizsgálása AalT kifejezésre. A transzformánsokat az AalT kifejezésre úgy vizsgáljuk át, amint ezt a 17. példa C. részében leírtuk.

D. Transzformált növények rezisztenciája Diabrotica undecimpunctata által okozott károk ellen. TI magokból kapott csíranövényeket 100 mm-es Petri-csészékben, durva vermikulitba ültetünk (csészénként 5 darab, 5 csésze). Amikor a csiranövényen a második levelek megjelennek, mindegyik csészét 20, második vedlési stádiumban levő Diabrotica undecimpunctata lárvával fertőzzük. 7 nap múlva túlélők számát és tömegét és a kukoricanövény kinőtt gyökereinek tömegét meghatározzuk. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodásának statisztikusan szignifikáns (Student-féle vizsgálatban p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési arányának csökkenésével vagy a gyökértömeg károsodásában való csökkenéssel határozzuk meg, összehasonlítva a rovarmentes növények adataival olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek az AalT gént kifejezik, összehasonlítjuk azokkal a kontrollnövényekkel, amelyek csak a génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy amelyek nincsenek transzformálva.

20. példa

Gyapot, amely az AalT kifejezése révén rezisztens a gyapotmagtokbogár (Anthonomus grandis) ellen

A. A vektor megalkotása. Az AalT gént a pCIB 10-ben úgy állítjuk elő, amint ezt a 18. példa A. részében leírtuk.

B. A növények transzformálása és regenerálása. A transzformált növényeket úgy kapjuk meg, amint korábban leírtuk.

C. A transzformánsok átvizsgálása AalT kifejezésre. A transzformánsokat úgy határozzuk meg, amint ezt a 17. példa C. részében leírtuk.

D. Transzformált növények rezisztenciája Anthonomus grandis által okozott károk ellen. 10 transzformáit növényt tenyésztünk, amíg tokot képeznek. Az egyes növényeket három felnőtt, nőnemű Anthonomus grandissal fertőzzük. A növények károsodását egy hét múlva meghatározzuk, és a túlélő felnőtt rovarokat eltávolítjuk. A lárvákon okozott károkat, a lárvaszámot és az egyes növények tömegét egyhetes időközönként négy héten át mérjük. A transzformáit növények rezisztenciáját a károsodás! hányad statisztikusan szignifikáns (Student-féle vizsgálatban p<0,05) csökkenésével, a lárvaszám csökkenésével vagy a lárvák tömeggyarapodásának csökkenésével határozzuk meg úgy, hogy azokat a növényeket, amelyek az AalT gént kifejezik, összehasonlítjuk azokkal a kontrollnövényekkel, amelyek csak a génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy amelyek nincsenek transzformálva.

21. példa

Kukorica, amely az LqhIT2 kifejezése révén rezisztens pillangók ellen

A. A pCIB710-LqhIT2 vektor megalkotása. LqhIT2höz szintetikus gént állítunk elő olyan módon, ahogyan ezt korábban a 9. példában az AalT génhez általában leírtuk. Az így létrejövő génnek olyan szekvenciája van, mint amelyet a 2. szekvenciában (9. ábra) bemutatunk. Az így létrejött 200 bp-s fragmentumot izoláljuk és a pCIB710 vektor BamHI hasítóhelyeihez kapcsoljuk, amint ezt a 17. példában, az A. részben leírtuk. A gént a kívánt, szelektív markerhez kapcsoljuk (ilyen például az NPT-gén, amely kanamicinrezisztenciát ad át) a nagyszámú klónozóhelyek valamelyikénél. Az így létrejövő vektort pCIB710-LqhIT2-nek nevezzük.

B. A kukorica transzformálása és regenerálása. A kukorica transzformálását és regenerálását úgy hajtjuk végre, amint ezt a 17. példában, a B. részben leírtuk.

C. A növények vizsgálata LqhIT2 kifejezésére. Azokat a növényeket, amelyek TI magokból nőttek ki, az LqhIT2 gén létezésére elemezzük, amelyben különböző vizsgálatokat alkalmazunk.

(1) DNS-t izolálunk és BamHI-gyel hasítjuk; a bomlási termékeket 1,5%-os agarózgélen végzett elektroforézissel szétválasztjuk. A DNS-fragmentumokat nitrocellulózra visszük át és az LqhIT2 génnel, amely ³²P-vel van jelezve nick22

HU 220 078 Β transzláció segítségével, hibridizáljuk (Maniatis és munkatársai, 1982). Az LqhIT2 gén jelenlétét olyan csíkként mutatjuk ki, amely mintegy 200 bp-nek felel meg, és a vizsgálómintával hibridizál.

(2) RNS-t mutatunk ki a Northem-folt eljárással (Maniatis és munkatársai, 1982) olyan csíkként, amely mintegy 200 bázisnak felel meg és a ³²P-LqhIT2 génnel, amelyet korábban leírtunk, hibridizál.

(3) LqhIT2 fehérjét mutatunk ki poliklonális nyúl antitestekkel, standard immunológiai technikák segítségével, amely antitestek az LqhIT2 szintetikus N- és C-terminális peptidjei ellen alakulnak ki, a 16. példában leírtak szerint.

(4) Az LqhIT2 aktivitást úgy határozzuk meg, hogy az anyagot a növényi extraktumokból megtisztítjuk immunológiai eljárásokkal olyan módon, hogy nyulakból származó poliklonális antiLqhIT2 antitesteket és ,,Α’’-fehérje Sepharose-t alkalmazunk, és az izolált anyagot rovarok elleni toxicitásra megvizsgáljuk olyan módon, hogy az anyagot Heliothis-lárvákba injektáljuk, amint ezt a 10. példában leírtuk.

D. A transzformált növények rezisztenciája a pillangólárvák okozta károk ellen. TI magokat csíráztatunk ki, és a négyleveles stádiumban levő csíranövények levéldarabjait frissen kibújt Ostrinia nubilalisvagy Heliothis zea-lárvákkal etetjük fel. A frissen kikelt lárvákat egyenként helyezzük 1 cm²-es levéldarabokra egy etetőedényben. Csoportonként 50 rovart vizsgálunk. 5 nap múlva meghatározzuk a rovarok tömegét, a túlélők számát és a megevett levelek mennyiségét. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodása statisztikusan szignifikáns (Student-féle vizsgálat: p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési hányadának csökkenésével vagy a megevett levélmennyiség csökkenésével határozzuk meg olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek LqhIT2 gént fejeznek ki, összehasonlítjuk olyan kontrollnövényekkel, amelyek csak génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy olyan kontrollnövényekkel, amelyek nincsenek transzformálva.

22. példa

Gyapot, amely LqhlT2 kifejezése révén rezisztens pillangók ellen

A. A vektor megalkotása. Az LqhIT2 gént a 355 CaMV promotorral együtt pCIB710-ből eltávolítjuk és megfelelő restrikciós enzimek alkalmazásával pCIBlO-hez kapcsoljuk. Ezt a vektort pCIB10-LqhIT2-nek nevezzük.

B. A növények transzformálása és regenerálása. A transzformált növényeket úgy kapjuk meg, amint korábban leírtuk.

C. A transzformánsok átvizsgálása LqhIT2 kifejezésére. A transzformánsokat úgy vizsgáljuk meg LqhIT2 kifejezésére, amint ezt a 21. példa C. részében leírtuk.

D. A transzformált növények rezisztenciája lepkelárvák okozta károk ellen. Négyhetes transzformált növények levéldarabjait frissen kibújt Heliothis virescens-sel, Heliothis zea-val vagy Pectonophora gossypiella-val etetjük. A frissen kibújt lárvákat egyenként helyezzük 1 cm²-es levéldarabokra egy etetőedényben. Csoportonként 50 rovart vizsgálunk. 5 nap múlva meghatározzuk a rovarok tömegét, a túlélők számát és a megevett levelek mennyiségét. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodása statisztikusan szignifikáns (Studendt-féle vizsgálat p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési hányadának csökkenésével vagy a megevett levélmennyiség csökkenésével határozzuk meg olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek LqhIT2 gént fejeznek ki, összehasonlítjuk olyan kontrollnövényekkel, amelyek csak génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy olyan kontrollnövényekkel, amelyek nincsenek transzformálva.

23. példa

Paradicsom, amely LqhIT2 kifejezése révén rezisztens pillangók ellen

A. A vektor megalkotása. A pCIB10-LqhIT2 vektort úgy állítjuk elő, amint a 22. példa A. részében leírtuk.

B. Növények transzformálása és regenerálása. A transzformált növényeket úgy állítjuk elő, amint ezt a 17. példa B. részében leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a pCIBlO-AalT vektor helyett pCIB10-LqhIT2 vektort alkalmazunk.

C. A transzformánsok vizsgálata LqhIT2 kifejezésére. A transzformánsokat olyan módon vizsgáljuk LqhIT2 kifejezésére, amint ezt a 21. példa C. részében leírtuk.

D. A transzformált növények rezisztenciája a pillangók okozta károsodás ellen. Négyhetes, transzformált növények levéldarabjait frissen kibújt Heliothis zea-val vagy Manduca sexta-val etetjük. A frissen kibújt lárvákat egyenként helyezzük 1 cm²-es levéldarabokra egy etetőedényben. Csoportonként 50 rovart vizsgálunk. 5 nap múlva meghatározzuk a rovarok tömegét, a túlélők számát és a megevett levelek mennyiségét. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodása statisztikusan szignifikáns (Studentféle vizsgálat p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési hányadának csökkenésével vagy a megevett levélmennyiség csökkenésével határozzuk meg olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek LqhIT2 gént fejeznek ki, összehasonlítjuk olyan kontrollnövényekkel, amelyek csak génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy olyan kontrollnövényekkel, amelyek nincsenek transzformálva.

24. példa

Dohány, amely LqhIT2 kifejezése révén rezisztens pillangók ellen

A. A vektor megalkotása. A pCIB10-LqhIT2 vektort úgy állítjuk elő, amint a 22. példa A. részében leírtuk.

HU 220 078 Β

Β. A növények transzformálása és regenerálása. A transzformált növényeket úgy állítjuk elő, amint ezt korábban leírtuk, olyan módon, hogy a pCIB10-LqhIT2 vektort alkalmazzuk.

C. A transzformánsok vizsgálata LqhIT2 kifejezésére. A transzformánsokat olyan módon vizsgáljuk LqhIT2 kifejezésére, amint ezt a 21. példa C. részében leírtuk.

D. A transzformált növények rezisztenciája a pillangók okozta károsodás ellen. Négyhetes, transzformált növények levéldarabjait frissen kibújt Heliothis zea-val vagy Manduca sexta-val etetjük. A frissen kibújt lárvákat egyenként helyezzük 1 cm²-es levéldarabokra egy etetőedényben. Csoportonként 50 rovart vizsgálunk. 5 nap múlva meghatározzuk a rovarok tömegét, a túlélők számát és a megevett levelek mennyiségét. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodása statisztikusan szignifikáns (Studentféle vizsgálat p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési hányadának csökkenésével vagy a megevett levélmennyiség csökkenésével határozzuk meg olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek LqhIT2 gént fejeznek ki, összehasonlítjuk olyan kontrollnövényekkel, amelyek csak génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy olyan kontrollnövényekkel, amelyek nincsenek transzformálva.

25. példa

Csomós ebír, amely LqhIT2 kifejezése révén rezizstens pillangók ellen

A. A vektor megalkotása. Az LqhIT2 gént a 21. példa A. részében leírtak szerint szintetizáljuk, és a pCIB710 vektorral kapcsoljuk össze.

B. A növények transzformálása és regenerálása. A transzformált növényeket a korábban leírtak szerint kapjuk meg.

C. A transzformánsok vizsgálata LqhIT2 kifejezésére. A transzformánsokat olyan módon vizsgáljuk LqhIT2 kifejezésére, amint ezt a 21. példa C. részében leírtuk.

D. A transzformált növények rezisztenciája a pillangók okozta károsodás ellen. TI magokból kapott csíranövényeket 100 mm-es, Petri-csészében levő tiszta földbe ültetünk (10 darab csészénként, 5 csésze). Amikor a csíranövényen a második levelek megjelennek, az egyes csészéket 20 darab, második vedlési stádiumban levő Crambus caliginosellussal fertőzzük. 7 nap múlva meghatározzuk a túlélők számát és tömegét, valamint a kialakult fugyökerek tömegét. A transzformált növények rezisztenciáját a lárvák tömeggyarapodása statisztikusan szignifikáns (Student-féle vizsgálat p<0,05) csökkenésével, a lárvák túlélési hányadának csökkenésével vagy a gyökértömeg károsodásában való csökkenéssel határozzuk meg, összehasonlítva a rovarmentes növények adataival olyan módon, hogy azokat a növényeket, amelyek az AalT gént kifejezik, összehasonlítjuk azokkal a kontrollnövényekkel, amelyek csak a génbeiktatás nélküli vektorral vannak transzformálva, vagy amelyek nincsenek transzformálva.

Az alábbiakban megadjuk a hivatkozott irodalmi helyek listáját.

Allén G.: Sequencing of Proteins and Peptices [kiadó: North Holland, Amszterdam (1981)], 43. oldal.

Bevan M., Bames W. M., Chilton M.-D.: Nucl. Acids Rés., 11, 369 (1983).

Bevan M.: Nucl. Acids. Rés., 12., 8711 (1984).

Binding H. a „Plánt Protoplasts” című kiadványban [szerkesztők: Fowke L. C. és munkatársai, kiadó: CRC Press, Boca Raton (1985)], 21. oldal.

Bollon A. P., Stauver M.: J. Clin. Hematol. Oncol., 10, 39 (1980).

Botstein D., Shortle D., Rose M.: a „From Gene to Protein: Translation intő Biotechnology; 19. Miami Winter Symposia” című kiadványban [szerkesztők: Ahmad F., Schultz J., Smith Ε. E., Whelan W. J.; kiadó: Academic Press, New York (1982)], 265. oldal.

Broach J. R. a „The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces” című kiadványban [szerkesztők: Strathem J. N., Jones E. W., Broach J. R.; kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1981)], 445. oldal.

Broach J. R.: Cell, 28, 203 (1982).

Campbell A. M. a „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology” című kiadványában,

13. kötet [szerkesztők: Burdon R. H., van Knippenberg P. H.; kiadó: Elsevier, Amszterdam (1984)].

Carlsson J., Drevin H., Axén R.: Biochem J., 173, 723 (1978).

Catterall W. A.: Ann Rév. Pharmacol. Toxicol., 20, 15 (1980).

Catterall W. A.: Science, 223, 653 (1984).

Cenatiempo Y.: Biochimie, 68, 505 (1986).

Chater K. F., Lomovskaya N. D., Voeykova T. A., Sladkova I. A., Mkrtumian N. M., Murkavnik G. L. a „Sixth Int. Symp. on Actinomyces Biology” című kiadványban [szerkesztők: Szabó G., Bíró S., Goodfellow M,; kiadó: Akadémiai Kiadó, Budapest (1986)], 45. oldal.

Chu C., Wang C., Sun C., Hsü C., Yin K., Chu C., Bi F.: Scientia Sinica, 18, 659 (1975).

Couraud F., Jover E. a „Handbook of natural toxins” című kiadvány 2. kötetében [szerkesztő: Tu A. T.; kiadó: Dekker, New York (1984)], 659. oldal.

Dalé P. J. a „Protoplasts 1983, Lecture Proceedings 6th Inti. Protoplast Symposium, Basel 1983” című kiadványában [szerkesztők: Potrykus I., Harms C. T., Hinnen A., Hütter R., King P. J., Shillito R. D.; kiadó: Birkháuser, Basel (1983)], 31. oldal.

Darbon H., Zlotkin E., Kopeyan C., van Rietschoten J., Rochat H.: Int. J. Peptide Protein Rés., 20, 320 (1982).

Davey M. R. a „Protoplasts 1983, Lecture Proceedings 6th Inti. Protoplast Symposium, Basel 1983” című kiadványában [szerkesztők: Potrykus I., Harms C. T., Hinnen A., Hütter R., King P. J., Shillito R. D.; kiadó: Birkháuser, Basel (1983)], 19. oldal.

Devereux J., Haeberli P., Smithies O.: Nucleic Acids Rés., 72, 387(1984).

Duval A., Léoty C.: J. Physiol., 278, 403 (1978).

HU 220 078 Β

Duval A., Léoty C.: J. Physiol., 307, 43 (1980).

Eisen Η. N. a „Microbiology” című szakkönyvben [szerkesztő: Davis B. D.; kiadó: Harper and Row, Philadelphia (1980)], 287. oldal.

Evans D. A., Bravó J. E. a „Handbook of Plánt Cell Culture” című kiadvány 1. kötetében: Techniques fór propagation and breeding [kiadó: MacMillan Publ. Co., New York (1983)], 124. oldal.

Fischoff D. A., Bowdish K. S., Perlak F. J., Marrone P. G., McCormick S. M., Niedermeyer J. G., Dean D. A., Kusano-Kretzmer K., Mayer E. J., Rochester D. E., Rogers S. G., Fraley R. T.: Biotechnology, 5, 807 (1987).

Fraley R. T., Rogers S. G., Horsch R. B„ Sander P. R., Flick J. S., Adams S. P., Bittner M. L„ Brand L. A., Fink C. L., Fry J. S., Galluppi G. R., Goldberg S. B., Hoffmann N. L., Woo S. C.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 4803 (1983).

Fritz L. C., Tzeng M.-C., Mauro A.: Natúré, 283, 486 (1980).

Fromm M., Taylor L. P., Walbot V.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 5824 (1985).

Fromm Μ. E., Taylor L. P., Walbot V.: Natúré, 319, 791 (1986).

Gamborg D. L., Miller R. A., Ojima K.: Exptl. Cell Rés., 50, 151 (1986).

Gilman Μ. Z., Glenn J. S., Singer V. L., Chamberlin M. J.: Gene, 32, 11 (1984).

Glick B. R., Whitney G. K.: J. Ind. Microbiol., 1, 277 (1987).

Gold L., Pribnow D., Schneider T., Shinedling S., Swebilius Singer B., Stormo G.: Ann. Rév. Microbiol., 35, 365 (1981).

Gordon D., Jover E., Couraud F., Zlotkin E.: Biochem. Biophys. Acta, 778, 349 (1984).

Gorus F., Schram E.: Clin. Chem., 25, 512 (1979).

Gottesman S. az „Annual Review of Genetics” című kiadvány 18. kötetében [szerkesztők: Román H. L., Campbell A., Sandler L. M.; az „Annual Reviews” sorozatban; Palo Alto (1984)], 415. oldal.

Graves A. C. F., Goldman S. L.: Plánt Mól. Bioi., 7, 43 (1986).

Grimsley N., Hohn T., Davies J. W., Hohn B.: Natúré, 325, 177 (1987).

Grimsley N. H., Ramos C., Hein T., Hohn B.: Biotechnology, 6, 185 (1988).

Gryczan T. J. a „The Molecular Biology of the Bacilli I.” című kiadványban [szerkesztő: Dubnau D. A.; kiadó: Academic Press, New York (1982)], 307. oldal.

Hames B. D., Higgins S. J. (szerkesztők): Nucleic Acid Hybridisation [kiadó: IRL Press, Oxford (1985)].

Hammerling G. J., Hammerling U., Keamey J. F. (szerkesztők) a „Research Monographs in Immunology” című kiadvány 3. kötetében: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas [kiadó: Elsevier, New York (1981)].

Holsters M., de Waele D., Depicker A., Messens E., van Montagu M., Schell J.: Mól. Gén. Génét., 163, 181 (1978).

Hood E. E., Helmer G. L., Fraley R. T., Chilton M.D.: J. Bacteriol., 168, 1291 (1986).

Hooykaas-Van Slogteren G. M. S., Hooykaas P. J. J., Schilperoort R. A.: Natúré, 31, 763 (1984).

Hopp Τ. P., Woods K. R.: Molec. Immunoi., 20, 483 (1983).

Horsch R. B., Fraley R. T., Rogers S. G., Sanders P. R., Lloyd A., Hoffmann N.: Science, 223, 496 (1984).

Horsch R. B., Fry J. E., Hoffmann N. L., Eichholtz

D., Rogers S. G., Fraley R. T.: Science, 227, 1229 (1985).

Hultmark D., Engström Á., Bennick H., Kapur R., Boman H. G.: Eur. J. Biochem., 127, 207 (1982).

Inglis A. a „Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis, Proc. 3rd Inti. Conf., Heidelberg, 1979” című kiadványban [szerkesztő: Birth C.; kiadó: Elsevier, Amszterdam (1980)].

Isaki K.: Jpn. J. Bacteriol., 33, 729 (1978).

Jangi B. S. a „Handbook of natural toxins” című kiadvány 2. kötetében [szerkesztő: Tu A. T.; kiadó: Dekker, New York (1984)].

Jasny B. R.: Science, 238, 1653 (1987).

John J. F. Jr., Twitty J. A.: Rév. Infect Dis., 8, 693 (1986).

Kao K. N„ Michayluk M. R.: Planta, 126, 105 (1975).

Kendall K. J., Cohen S. N.: J. Bacteriol., 169, 4177 (1987).

Kennett R. H., McKeam T. J.: Bechtol K. B. (szerkesztők): Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses [kiadó: Plenum Press, New York (198\*)].

Klein J.: Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination [kiadó: J. Wiley, New York (1982)].

Klein Τ. M„ Wolf E. D„ Wu R„ Sanford J. C.: Natúré, 327, 70 (1987).

Klein Τ. M., Gradziel T., Fromm Μ. E., Sanford J. C.: Biotechnology, 6, 559 (1988).

Knott T. J., Rali S. C. Jr., Innerarity T. L., Jacobson

S. F., Urdea M. S., Levy-Wilson B., Powell L. M., Pease R. J., Eddy R., Nakai H., Byers M., Priestley L. M., Robertson E., Rali L. B., Betsholtz C., Shows T. B., Mahley R. W., Scott J.: Science, 230, 37 (1985).

Köhler G., Milstein C.: Natúré, 256, 495 (1975).

Köhler G., Milstein C.: Eur. J. Immunoi., 6, 511 (1976).

Köhler G., Howe S. C., Milstein C.: Eur. J. Immunoi., 6, 292 (1976).

Kopeyan C., Martinez G., Rochat H.: FEBS Letters, 89, 54 (1978).

Kopeyan C., Martinez G., Rochat H.: Toxicon, 20, 71 (1982).

Lathe R.: J. Mól. Bioi., 183, 1 (1985).

Lazarovici P., Zlotkin E.: Comp. Biochem. Physiol., 71C, 177 (1982).

Lazarovici P., Yanai P., Pelhate M., Zlotkin E.: J. Bioi. Chem., 257, 8397 (1982).

Lazarovici P., Menashe M., Zlotkin E.: Arch. Biochem. Biophys., 229, 270 (1984).

HU 220 078 Β

Lehninger A. L.: Biochemistry, Worth Publ., New York (1975).

Lester D., Lazarovici P., Pelhate M., Zlotkin E.: Biochim. Biophys. Acta, 701, 370 (1982).

Liu C. S., Wu T.-C., Lo T.-B.: Peptide Protein Rés., 21, 209 (1983).

Lörz H., Baker B., Schell J.: Mól. Gén. Génét., 199, 178 (1985).

Lowry Ο. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J.: J. Bioi. Chem., 193, 265 (1951).

Maniatis T. a „Cell Biology: a Comprehensive Treatise” című kiadvány 3. kötetében: Gene Expression [szerkesztők: Goídstein, Lester, Prescott; kiadó: Academic Press, New York (1980)], 563. oldal.

Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J.: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982.

Marton L. a „Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants” című kiadvány 1. kötetében (1984), 514. oldal.

May T. E., Piek T.: J. Insect. Physiol., 25, 685 (1979).

Miller D. W., Safer P., Miller L. K. a „Genetic Engineering” című kiadvány 8. kötetében [szerkesztők: Setlow J. K., Hollaender A.; kiadó: Plenum, New York (1986)], 277. oldal.

Murashige T., Skoog F.: Physiol. Plánt, 75, 473 (1962).

Nakagawa S. H., Lau H. S. H., Kézdy F. J., Kaiser Ε. T.: J. Am. Chem. Soc., 107, 7087 (1985).

Negrutiu I., Shillito R., Potrykus I., Biasini G., Sala F.: Plánt Mól. Bioi., 8, 363 (1987).

Oike Y., Kimata K., Shinomura T., Suzuki S., Takahashi N, Tanabe K.: J. Bioi. Chem., 257, 9751 (1982).

Oka A., Sugisaki H., Takanami M.: J. Mól. Bioi., 747,217(1981).

Omberg R. L., Smyth T., Benton A. W.: Toxicon, 14, 329 (1976).

Paszkowski J., Shillito R. D., Saul M., Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I.: EMBO J., 3, 2717 (1984).

Pelhate M., Pichon Y.: J. Physiol., 242, 90P (1974).

Pehalte M., Zlotkin E.: J. Physiol. (London), 319, 30P (1981).

De la Pena A., Lörz H., Schell I: Natúré, 325, 274 (1987).

Pichon Y., Boistel J.: J. Exp. Bioi., 47, 343 (1967).

Pick T., Veenendaal R. L., Mantel P.: Comp. Biochem. Physiol., 72C, 303 (1982).

Possani L. D. a „Handbook of natural toxins” című kiadvány 2. kötetében [szerkesztő: Tu A. T.; kiadó: Dekker, New York (1984)], 513. oldal.

Potrykus I., Saul M. W., Petruska J., Paszkowski J., Shillito R. D.: Mól. Gén. Génét., 199, 183 (1985).

Rathmeyer W.: Zeitsch. Vergl. Physiol., 45, 413 (1962).

Reed L. J„ Muench H.: Am. J. Hyg., 27, 493 (1938).

Reich T. J., Iyer V. N., Haffher M., Holbrook L. A., Miki B. L.: Can. J. Bot., 64, 1259 (1986a).

Reich T. J., Iyer V. N., Miki B. L.: Biotechnology, 4, 1001 (1986b).

Rochat M., Rochat C., Sampieri F., Miranda F.: Eur. J. Biochem., 28, 381 (1972).

Rochat H., Bemard P., Couraud F.: Adv. Cytopharmacol., 3, 325 (1979).

Rothstein S. J., Lahners K. N., Lotstein R. J., Carozzi Ν. B., Jayne S. M„ Rice D. A.: Gene, 53, 153 (1987).

Rubin G. M.: Science, 240, 1453 (1988).

Sattelle D. B., Pelhate M., Hue B.: J. Exp. Bioi., 83, 41 (1979).

Shillito R. D., Saul M. W., Paszkowski J., Müller M., Potrykus I.: Biotechnology, 3, 1099 (1985).

Silver P. A., Keegan L. P., Ptashne M.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5951 (1984).

Simon R., Priefer U., Pühler A.: Biotechnology, 7, 784 (1983).

Soini E., Hemmilá I.: Clin. Chem., 25, 353 (1979).

Stockhaus J., Eckes P., Blau A., Schell I, Willmitzer L.: Nucl. Acids Rés., 75, 3479 (1987).

Swank R. T., Munkres K. D.: Anal. Biochem., 39, 462 (1971).

Ulmanen I., Lundström K., Lehtovaara P., Sarvas M., Ruohonen M., Palva I.: J. Bacteriol., 162, 176 (1985).

Walther C., Zlotkin E., Rathmeyer W.: J. Insect. Physiol., 22, 1187 (1976).

Wands J. R., Zurawski V. R. Jr.: Gastroenterology, 80, 225 (1981).

Ward J. M., Janssen G. R., Kieser T., Bibb M. J., Buttner M. J.: Mól. Gén. Génét., 203, 468 (1986).

Watson B., Currier T. C., Gordon Μ. P., Chilton M.-D., Nester E. W.: J. Bacteriology, 123, 255 (1975).

Watson J. D., Hopkins Ν. H., Roberts J. W., Argetsinger Steitz J., Weiner A. M.: „Molecular biology of the gene” [kiadó: Benjamin/Cumings, Menlo Park (1977)].

Wisdom G. B.: Clin. Chem., 22, 1243 (1976).

Yadav N. S., Vanderleyden J., Bennett D. R., Bames W. M., Chilton M. D.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 5449 (1987).

Zlotkin E., Rochat H., Kopeyan C., Miranda F., Lissitzky S.: Biochemie, 53, 1073 (1971b).

Zlotkin E., Fraenkel G., Miranda F., Lissitzky S.: Toxicon, 9, 1 (1971b).

Zlotkin E., Miranda F., Kupeyan C., Lissitzky S.: Toxicon, 9, 9 (1971c).

Zlotkin E. a „Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology” című kiadvány 10. kötetében [szerkesztők: Kerkut G. A., Gilbert L. I.; kiadó: Pergamon Press, Oxford (1985)], 499. oldal.

Zlotkin E., Kadouri D., Gordon D., Pelhate M., Martin M. F., Rochat M.: Arch. Biochem. Biophys., 240, 877 (1985).

Zlotkin E., Gordon D. a „Neurochemical Techniques in Insect Research” című kiadványban [szerkesztők: Breer H., Miller T. A.; kiadó: Springer, Berlin (1985)], 243. oldal.

Zlotkin E.: „Neuropharmacology and Pesticide Action” (1986), 352. oldal.

Claims (15)

1. Idegen DNS-szekvenciát tartalmazó transzgén növényi sejtek, azzal jellemezve, hogy ez a DNS-szekvencia

a) Arthropodákból származó, rovarok ellen szelektíven ható inszekticid toxint vagy ennek funkcióképes származékát vagy fragmentumát kódolja;

b) további, regulátor DNS-szekvenciákat tartalmaz, aminek eredményeként növényekben kifejezhető alakban van jelen; és

c) a növényben való kifejeződés során a növényt a rovarok számára toxikussá teszi.

2. Az 1. igénypont szerinti transzgén növényi sejt, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztályának képviselőiből állítható elő.

3. Az 1. igénypont szerinti transzgén növényi sejt, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia a Scorpiones rend képviselőiből állítható elő.

4. Az 1. igénypont szerinti transzgén növényi sejt, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia a Scolopendra nemzetség képviselőiből állítható elő.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti transzgén növényi sejt, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNSszekvencia stabilan van integrálva a növényi genomba.

6. Az 5. igénypont szerinti transzgén növényi sejt, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia kifejezhető formában van jelen.

7. A 6. igénypont szerinti transzgén növényi sejt, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia által kódolt toxint vagy ennek funkcióképes származékát vagy fragmentumát fejezi ki.

8. Idegen DNS-szekvenciát tartalmazó transzgén növény, valamint ennek szexuális és aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy ez a DNS-szekvencia

a) Arthropodákból származó, rovarok ellen szelektíven ható inszekticid toxint vagy ennek funkcióképes származékát vagy fragmentumát kódolja;

b) további, regulátor DNS-szekvenciákat tartalmaz, aminek eredményeként növényekben kifejezhető alakban van jelen; és

c) a növényben való kifejeződése során a növényt a rovarok száma toxikussá teszi.

9. A 8. igénypont szerinti transzgén növény, valamint ennek szexuális és aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztályának képviselőiből nyerhető ki.

10 kultúrnövényt valamely, a 15. igénypont szerinti rekombináns DNS-sel transzformáljuk, majd a 15. igénypontban nevezett, rovarok ellen ható toxint vagy funkcióképes származékát vagy fragmentumát inszekticidként, hatásos mennyiségben a növényben kifejezzük.

10. A 8. igénypont szerinti transzgén növény, valamint ennek szexuális vagy aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia a Scorpiones rend képviselőiből nyerhető ki.

11. A 8. igénypont szerinti transzgén növény, valamint ennek szexuális vagy aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia a Scolopendra nemzetség képviselőiből nyerhető ki.

12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti transzgén növény, valamint ennek szexuális vagy aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a nevezett

DNS-szekvencia stabilan van integrálva a növényi genomba.

13. A 12. igénypont szerinti transzgén növény, valamint ennek szexuális vagy aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia kifejezhető formában van jelen.

14. A 13. igénypont szerinti transzgén növény, valamint ennek szexuális vagy aszexuális szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-szekvencia által kódolt toxint vagy ennek funkcióképes származékát vagy fragmentumát fejezi ki.

15. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy egy, Arthropodákból eredő, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely DNS-szekvencia további, regulátor DNS-szekvenciákat tartalmaz, és ennek eredményeként növényekben kifejezhető formában van jelen, és kifejeződése során a növényt a rovarok számára toxikusé teszi.

16. A 15. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS valamely, az Arachnida (pókfélék) vagy Chilopoda (százlábúak) osztálya képviselőiből származó, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja.

17. A 15. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS valamely, a Scorpiones rend képviselőiből származó, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja.

18. A 15. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS a Scolopendra nemzetség képviselőiből származó, rovarok ellen szelektíven ható toxint vagy ennek működőképes származékát vagy fragmentumát kódolja.

19. A 15. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS az alábbi aminosavszekvenciával

KKNGYAVDSS GKAPECLLSN YCNNQCTKVH YADKGYCCLL SCYCFGLNDD KKVLEISDTR KSYCDTTIIN;

DGYIRKRDGC KLSCLFGNEG CNKECKSYGG SYGYCWTWGL ACWCEGLPDE KTWKSETNTC G; DGYIRKKDGC KVSC(V/I)IIGNEG CRKECVAHGG SFGYCWTWGL ACWCENLPDA VTWKSSTNTC G; DGYKRRDGC KVACLIGNEG CDKECKAYGG SYGYCWTWGL ACWCEGLPDD KTWKSETNTC G;

ALPLSGEYEP CFRPRKCKPG LVCNKQQICV DPK; vagy

VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGYCQWAG KYGNACWCYA LPDNVPIRVP GKCR rendelkező toxint vagy ennek fúnkcióképes származékát vagy fragmentumát kódolja.

20. A 15. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS a VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGYCQWAG KYGNACWCYA LPDNVPIRVP GKCR

HU 220 078 Β aminosavszekvenciával rendelkező toxint vagy ennek funkcióképes származékát vagy fragmentumát kódolja.

21. Vektor, azzal jellemezve, hogy valamely, a 15-20. igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.

22. Prokarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, a 21. igénypont szerinti vektort tartalmaz.

23. Eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, a 21. igénypont szerinti vektort tartalmaz.

24. Növényi gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, a 21. igénypont szerinti vektort tartalmaz.

25. Antitest a 19. vagy 20. igénypont szerinti rekombináns DNS által kódolt, rovarokra szelektíven ható (inszekticid) toxinok vagy származékaik vagy fragmentumaik ellen, amely a Scorpiones rend vagy a Scolopendra nemzetség képviselőiből nyerhetők ki.

26. Inszekticid szer, azzal jellemezve, hogy az ebben található toxin vagy rekombináns toxin, amelyet egy, a 19. vagy 20. igénypont szerinti rekombináns

DNS kódol, és amely egy ezzel transzformált gazdasejtből nyerhető ki.

27. Eljárás növénypatogén rovarok elleni védekezésre, azzal jellemezve, hogy a rovarokhoz vagy életterük5 höz vagy növényekhez vagy növényrészekhez inszekticidként hatásos mennyiségben egy, a 26. igénypont szerinti szert juttatunk el.

28. Eljárás kultúrnövények védelmére növénypatogén rovarok okozta károktól, azzal jellemezve, hogy a

15 29. Rovarok ellen szelektíven ható toxin, azzaljellemezve, hogy a VRDAYIAKNY NCVYECFRDA YCNELCTKNG ASSGYCQWAG KYGNACWCYA LPDNVPIRVP GKCR aminosavszekvenciával rendelkezik.