JPH02138977A - 新規なハリブリッド バシルス チューリンゲンシス遺伝子プラスミド及び形質転換されたシュードモナス フルオレスセンス - Google Patents
新規なハリブリッド バシルス チューリンゲンシス遺伝子プラスミド及び形質転換されたシュードモナス フルオレスセンスInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
最も広く使用されている微生物殺虫剤は細菌であるハシ
ルス チューリンケンシス（Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ ｔ
、ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来するものである。
ルス チューリンケンシス（Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ ｔ
、ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来するものである。
この細菌剤は広範囲の葉を食べる幼虫、マメコカネ（ｊ
ａ ｐ ａ ｎ ｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ）及び蚊を抑
制するのに使用される。ハシルス チューリンゲンシス
は感受性の昆虫宿主によって摂取されると毒性である、
蛋白質性のバラ胞子又は結晶を製造する。例えはバシル
ス チューリンケンシスＶａｒ、クルスタキ（ｋｕｒｓ
ｔａｋｉ） ＨＤ−１（以下Ｂ 、 ｔ 、 ｋ 、
Ｉｔ Ｄ −１と書くこともある）は多くの鱗翅類昆虫
の幼虫に毒性であるデルタトキシンと呼はれる結晶を製
造する。このＢ、ｔ、結晶蛋白遺伝子を大腸菌中てクロ
ーニングし、そして表現することは刊行された文献に記
載されている（シュネッフ エッチ、イー、及びフィッ
トレー エッチ。
ａ ｐ ａ ｎ ｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ）及び蚊を抑
制するのに使用される。ハシルス チューリンゲンシス
は感受性の昆虫宿主によって摂取されると毒性である、
蛋白質性のバラ胞子又は結晶を製造する。例えはバシル
ス チューリンケンシスＶａｒ、クルスタキ（ｋｕｒｓ
ｔａｋｉ） ＨＤ−１（以下Ｂ 、 ｔ 、 ｋ 、
Ｉｔ Ｄ −１と書くこともある）は多くの鱗翅類昆虫
の幼虫に毒性であるデルタトキシンと呼はれる結晶を製
造する。このＢ、ｔ、結晶蛋白遺伝子を大腸菌中てクロ
ーニングし、そして表現することは刊行された文献に記
載されている（シュネッフ エッチ、イー、及びフィッ
トレー エッチ。
アール、 ［＋９８１］Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７８：２８９３−２８９７）。
、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７８：２８９３−２８９７）。
米国特許４，４４８，８８５及び米国特許４，４６７゜
０３６は両方とも大腸菌中でＢ、ｔ、結晶蛋白を表現す
ることを開示している。米国特許４，４６７．０３６中
に於てＢ、チューリンゲンシス ｖａｒ、クルスタキ
ＨＤ−］がイリノイ州ペオリアの良く知られたＮＲＲＬ
培養基寄託所から入手できることが開示されている。そ
の寄託番号はＮＲＲＬ Ｂ−３７９２である。またＢ、
チューリンゲンシスｖａｒ、クルスタキ）１０−７３は
ＮＲＲＬから人手できる。その寄託番号はＮＲＲＬ
Ｂ−４４８８である。
０３６は両方とも大腸菌中でＢ、ｔ、結晶蛋白を表現す
ることを開示している。米国特許４，４６７．０３６中
に於てＢ、チューリンゲンシス ｖａｒ、クルスタキ
ＨＤ−］がイリノイ州ペオリアの良く知られたＮＲＲＬ
培養基寄託所から入手できることが開示されている。そ
の寄託番号はＮＲＲＬ Ｂ−３７９２である。またＢ、
チューリンゲンシスｖａｒ、クルスタキ）１０−７３は
ＮＲＲＬから人手できる。その寄託番号はＮＲＲＬ
Ｂ−４４８８である。
ここに開示され特許されているのは鱗翅類昆虫に毒性の
ある新規なハイブリッド毒素遺伝子である。この毒素遺
伝子はプラスミドベクターを経てシュードモナス フル
オレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｄｎｓ）宿主に移されている。
ある新規なハイブリッド毒素遺伝子である。この毒素遺
伝子はプラスミドベクターを経てシュードモナス フル
オレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｄｎｓ）宿主に移されている。
特定的には本発明はＢ、チューリンゲンシスｖａｒ。
クルスタキＨＤ−７３毒素遺伝子の一部、Ｂ、チューリ
ンゲンシスｖａｒ、クルスタキ系統ＨＤ−１からの毒素
遺伝子の一部を含んでいる新規なハイアリットデルタエ
ンドトキシン遺伝子からなる。このハイブリット遺伝子
は、適当な運搬ベクターに挿入され、これが次にシュー
ドモナス フルオレスセンス宿主を形質転換するのに用
いられる。Ｐ、フルオレスセンス宿主は、鱗翅類昆虫に
対し、活性のある殺虫剤として使用することが出来る。
ンゲンシスｖａｒ、クルスタキ系統ＨＤ−１からの毒素
遺伝子の一部を含んでいる新規なハイアリットデルタエ
ンドトキシン遺伝子からなる。このハイブリット遺伝子
は、適当な運搬ベクターに挿入され、これが次にシュー
ドモナス フルオレスセンス宿主を形質転換するのに用
いられる。Ｐ、フルオレスセンス宿主は、鱗翅類昆虫に
対し、活性のある殺虫剤として使用することが出来る。
より詳しくは、本発明は鱗翅類昆虫に対し、活性を有す
る新規な蛋白質をコードしている新規なハイブリット毒
素遺伝子（ＤＮＡ）に関するものである。表１は新規な
毒素をコードするＤＮＡを開示している。表■は新規な
ハイブリッド毒素のアミノ酸配列を開示している。表■
は表Ｉ及び表■の複合体である。
る新規な蛋白質をコードしている新規なハイブリット毒
素遺伝子（ＤＮＡ）に関するものである。表１は新規な
毒素をコードするＤＮＡを開示している。表■は新規な
ハイブリッド毒素のアミノ酸配列を開示している。表■
は表Ｉ及び表■の複合体である。
本発明の新規なハイブリット毒素遺伝子は、Ｂ。
チューリンゲンシスｖａｒ、クルスタキＨＤ−７３毒素
遺伝子の一部及びＢ、チューリンゲンシスｖａｒ、クル
スタキ系統ＨＤ−１毒素遺伝子の一部を含んでいる。
遺伝子の一部及びＢ、チューリンゲンシスｖａｒ、クル
スタキ系統ＨＤ−１毒素遺伝子の一部を含んでいる。
般にＢ、ｔ、、に、ＨＤ−７３遺伝子部分は、最初に（
１）既知の大腸菌ブラスミ）”ｐＢＲ３２２、（２）既
知のプラスミドρＲＯ１６１４からのシュードモナス中
で複製する能力、を有するＤＮＡセグメント及び（３）
ハイブリッドＴａＣプロモーターを表わしているＤＮＡ
セグメントから由来するＤＮＡ断片と結合された。
１）既知の大腸菌ブラスミ）”ｐＢＲ３２２、（２）既
知のプラスミドρＲＯ１６１４からのシュードモナス中
で複製する能力、を有するＤＮＡセグメント及び（３）
ハイブリッドＴａＣプロモーターを表わしているＤＮＡ
セグメントから由来するＤＮＡ断片と結合された。
生じるハイブリット遺伝子は、ｐＭ２．１６−ＩＩと呼
はれるプラスミド中に含まれる。このプラスミドはシュ
ードモナス フルオレスセンス微生物を形質転換するの
に使用され、ＭＲ４３６と命名される形質転換された系
統を与える。
はれるプラスミド中に含まれる。このプラスミドはシュ
ードモナス フルオレスセンス微生物を形質転換するの
に使用され、ＭＲ４３６と命名される形質転換された系
統を与える。
本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物宿主中に導入す
ることが出来る。毒素遺伝子の表現は直接又は間接に細
胞内生産を生じ、そして殺虫剤の保持を生しる。適当な
宿主、例えばシュードモナスで微生物は鱗翅類が増殖す
る鱗翅類昆虫のいる場所に適用出来、昆虫によって摂取
される。その結果望まれない昆虫が抑制される。別の方
法として毒素遺伝子を宿している微生物は細胞内で生産
される毒素の活性が持続される条件下で処理される。処
理された細胞を次に標的害虫の環境に適用することが出
来る。生しる生成物はＢ、ｔ、毒素の毒性を保持する。
ることが出来る。毒素遺伝子の表現は直接又は間接に細
胞内生産を生じ、そして殺虫剤の保持を生しる。適当な
宿主、例えばシュードモナスで微生物は鱗翅類が増殖す
る鱗翅類昆虫のいる場所に適用出来、昆虫によって摂取
される。その結果望まれない昆虫が抑制される。別の方
法として毒素遺伝子を宿している微生物は細胞内で生産
される毒素の活性が持続される条件下で処理される。処
理された細胞を次に標的害虫の環境に適用することが出
来る。生しる生成物はＢ、ｔ、毒素の毒性を保持する。
Ｂ、ｔ、毒素遺伝子が、適当なベクターを介して微生物
宿主に導入され、そしてその宿主が生きている状態で環
境に適用されたときは、ある種の宿主微生物が使用され
るのが必須である。微生物宿主中月又はそれ以上の問題
となる作物のフィトスフェア（ｐｈｙｔｏｓｐＨｅｒｅ
） （フィロプレイン（ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎｅ）、フ
ィロスフェア（ｐｈｙｌ １ｏｓｐｈｅｒｅ）、リゾス
フェア（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ）、及び／又はリソプ
レイン（ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ））を占有することが知
られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は
野性型の微生物と特定の環境（作物及び他の昆虫生息場
所）でうまく競争することが出来るように選択され、ポ
リペプチド殺虫剤を表現する遺伝子の安定した保持及び
表現を与え、そして望ましくは環境に於ける分解及び不
活性化から殺虫剤を保護することを改良する。
宿主に導入され、そしてその宿主が生きている状態で環
境に適用されたときは、ある種の宿主微生物が使用され
るのが必須である。微生物宿主中月又はそれ以上の問題
となる作物のフィトスフェア（ｐｈｙｔｏｓｐＨｅｒｅ
） （フィロプレイン（ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎｅ）、フ
ィロスフェア（ｐｈｙｌ １ｏｓｐｈｅｒｅ）、リゾス
フェア（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ）、及び／又はリソプ
レイン（ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ））を占有することが知
られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は
野性型の微生物と特定の環境（作物及び他の昆虫生息場
所）でうまく競争することが出来るように選択され、ポ
リペプチド殺虫剤を表現する遺伝子の安定した保持及び
表現を与え、そして望ましくは環境に於ける分解及び不
活性化から殺虫剤を保護することを改良する。
多種多用の重要な作物のフィロプレイン（植物の葉の表
面）及び／又はりラスフエア（植物の根のまわりの土壌
）に数多くの微生物が生息することが知られている。こ
れらの微生物には細菌、藻類、及び菌類が含まれる。特
に興味がもたれるのは、例えは細菌、例えはシュードモ
ナス、エルウィニア、セラチア、クレブシェラ、キサン
トモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム、ロド
シュードモナス、メチロフィラス、アグロバクテリウム
、アセトバクタ、ラクトバシルス（Ｌａｃｔ、ｏｂａｃ
ｉ Ｉ １ｕｓ）、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔ。
面）及び／又はりラスフエア（植物の根のまわりの土壌
）に数多くの微生物が生息することが知られている。こ
れらの微生物には細菌、藻類、及び菌類が含まれる。特
に興味がもたれるのは、例えは細菌、例えはシュードモ
ナス、エルウィニア、セラチア、クレブシェラ、キサン
トモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム、ロド
シュードモナス、メチロフィラス、アグロバクテリウム
、アセトバクタ、ラクトバシルス（Ｌａｃｔ、ｏｂａｃ
ｉ Ｉ １ｕｓ）、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔ。
ｂａｃｔｅｒ）、ロイコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ）、及びアルカリゲネス；菌類、特に酵母、例えば
サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ク
リプトコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クルイ
ヴエロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ）、ス
ポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、
ロトトルう（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ＋夏ｌａ）、及びオーレ
オバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓ ｉｄ ｉｕｍ）属
の微生物である。特に興味がもたれるのは、シュードモ
ナス シリンカニ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）・シュードモナ
ス フルオレスセンス、セラチア マルセスセンス（ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター クシリウム（
ｘｙｌ ｉｕｍ）、アグロバクテリウム テウメファシ
ェンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドシュードモナ
ス スフェロイデス（ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キサン
トモナス カンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔ、ｒｉｓ）
、リゾビウム メリトティ（ｍｅｌ １ｏｔｉ）、アル
カリゲネスエントロファス（ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）、及
びアゾトハクタヴインランデイ−（ｖｉｎｌａｎｄｉ
ｉ）なとのフィトスフェア細菌種；ロドトルラルブラ（
ｒｕｂｒａ）、ロドトルラ グルティニス（ｇｌｕｔｉ
ｎｉｓ）、ロドトルラ マリナ（ｍａｒｉｎａ）、ロド
トルラ アラランチイカ（ａ ｕ ｒａｎｔｉａｃａ）
、クリプトコツカス アルビダス（Ｂｌｌ）ｉｄｕｓ）
、クリプトコツカス デイフルエンス（ｄｉｆｆｌｕｅ
ｎｓ）、クリプトコツカス ローレンチイー（１ａｕｒ
ｅｎｔｔ ｉ）、サツカロミセス ロセイ（ｒｏｓｅ
ｉ ）、サツカロミセスブレトリエンシス（ｐｒｅｔ、
ｏｒｉｅｎｓｉｓ）・サツカロミセス セレヴイシアエ
（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロマイセス ロセ
ウス（ｒｏｓｅｕｓ）、スポロボロマイセス オドラス
（ｏｄｏｒｕｓ）、クルイヴエロマイセス ヴエロナエ
（ｖｅｒｏｎａｅ）、及びオーレオバシディウムボルラ
ンス（Ｐｏ Ｉ Ｉｕ ｌ ａｎｓ）などのフィトスフ
ェア酵母種である。特に興味がもたれるのは、染色され
る微生物である。
ｏｃ）、及びアルカリゲネス；菌類、特に酵母、例えば
サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ク
リプトコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クルイ
ヴエロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ）、ス
ポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、
ロトトルう（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ＋夏ｌａ）、及びオーレ
オバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓ ｉｄ ｉｕｍ）属
の微生物である。特に興味がもたれるのは、シュードモ
ナス シリンカニ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）・シュードモナ
ス フルオレスセンス、セラチア マルセスセンス（ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター クシリウム（
ｘｙｌ ｉｕｍ）、アグロバクテリウム テウメファシ
ェンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドシュードモナ
ス スフェロイデス（ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キサン
トモナス カンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔ、ｒｉｓ）
、リゾビウム メリトティ（ｍｅｌ １ｏｔｉ）、アル
カリゲネスエントロファス（ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）、及
びアゾトハクタヴインランデイ−（ｖｉｎｌａｎｄｉ
ｉ）なとのフィトスフェア細菌種；ロドトルラルブラ（
ｒｕｂｒａ）、ロドトルラ グルティニス（ｇｌｕｔｉ
ｎｉｓ）、ロドトルラ マリナ（ｍａｒｉｎａ）、ロド
トルラ アラランチイカ（ａ ｕ ｒａｎｔｉａｃａ）
、クリプトコツカス アルビダス（Ｂｌｌ）ｉｄｕｓ）
、クリプトコツカス デイフルエンス（ｄｉｆｆｌｕｅ
ｎｓ）、クリプトコツカス ローレンチイー（１ａｕｒ
ｅｎｔｔ ｉ）、サツカロミセス ロセイ（ｒｏｓｅ
ｉ ）、サツカロミセスブレトリエンシス（ｐｒｅｔ、
ｏｒｉｅｎｓｉｓ）・サツカロミセス セレヴイシアエ
（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロマイセス ロセ
ウス（ｒｏｓｅｕｓ）、スポロボロマイセス オドラス
（ｏｄｏｒｕｓ）、クルイヴエロマイセス ヴエロナエ
（ｖｅｒｏｎａｅ）、及びオーレオバシディウムボルラ
ンス（Ｐｏ Ｉ Ｉｕ ｌ ａｎｓ）などのフィトスフ
ェア酵母種である。特に興味がもたれるのは、染色され
る微生物である。
毒素を表現するＢ、ｔ、遺伝子を安定な保持及び遺伝子
の表現を可能とする条件下で微生物宿主に導入する多種
多様の方法が利用できる。毒素遺伝子の表現のための転
写及び翻訳制御シグナル、制御された下に於ける毒素遺
伝子、及びインテグレーションを生じさせる宿主生物の
配列と相同のＤＮＡ配列、及び／又はインテグレーショ
ン又は安定な保持を生しさせる宿主中で機能できる複製
系、を含むＤＮＡ構築物を与えることが出来る。
の表現を可能とする条件下で微生物宿主に導入する多種
多様の方法が利用できる。毒素遺伝子の表現のための転
写及び翻訳制御シグナル、制御された下に於ける毒素遺
伝子、及びインテグレーションを生じさせる宿主生物の
配列と相同のＤＮＡ配列、及び／又はインテグレーショ
ン又は安定な保持を生しさせる宿主中で機能できる複製
系、を含むＤＮＡ構築物を与えることが出来る。
転写開始信号は、プロモーター及び転写開始出発位置を
含んでいる。ある場合には毒素の調節的表現を与えるこ
とが望ましく、その場合毒素の表現は環境中に放出され
たときのみにおきる。これは微生物の物理的又は化学的
な環境の変化によって誘発を行なうことの出来るオペレ
ーター、又はアクティベーター若しくはエンヘンサーに
対し結合している領域によって達成できる。例えば温度
感受性の制御領域を使用することが出来、ここでは生物
は毒素の表現なしに実験室中で生育されるが、環境に放
出されると表現が開始する。他の技術は実験室中に於い
て特定の毒性の表現を阻害、する栄養培地を使用し、こ
こでは環境に於ける栄養培地は毒素の表現を可能にする
。翻訳開始に対してはリポソーム結合位置及び開始コド
ンが存在するであろう。
含んでいる。ある場合には毒素の調節的表現を与えるこ
とが望ましく、その場合毒素の表現は環境中に放出され
たときのみにおきる。これは微生物の物理的又は化学的
な環境の変化によって誘発を行なうことの出来るオペレ
ーター、又はアクティベーター若しくはエンヘンサーに
対し結合している領域によって達成できる。例えば温度
感受性の制御領域を使用することが出来、ここでは生物
は毒素の表現なしに実験室中で生育されるが、環境に放
出されると表現が開始する。他の技術は実験室中に於い
て特定の毒性の表現を阻害、する栄養培地を使用し、こ
こでは環境に於ける栄養培地は毒素の表現を可能にする
。翻訳開始に対してはリポソーム結合位置及び開始コド
ンが存在するであろう。
種々のマニピユレーションをメツセンジャーの表現を強
めるために使用することが出来、特に活性プロモーター
を使用すること並ひにメッセンジャーＲＮＡの安定性を
強める配列を用いることによって出来る。開始及び翻訳
停止領域は、ストップコドン、停止領域、及び任意付加
的にポリアデニル化信号を含むであろう。
めるために使用することが出来、特に活性プロモーター
を使用すること並ひにメッセンジャーＲＮＡの安定性を
強める配列を用いることによって出来る。開始及び翻訳
停止領域は、ストップコドン、停止領域、及び任意付加
的にポリアデニル化信号を含むであろう。
翻訳方向に於いて、即ちコード又はセンス配列の５′か
ら３′への方向に於いて構築物は、もしあるならば転写
制御領域及び制御領域がプロモータの５′又は３′のい
ずれかであるプロモーター リポソーム結合位置、開始
コドン、開始コドンと同調したオーブン リーディング
フレーム（開放読み枠）を有する構造遺伝子、ストッ
プコドン、もしあるならばポリアデニル化信号配列、及
びターミネータ−領域を含むであろう。二重鎖としての
この配列はそれ自身微生物宿主の形質転換に使用できる
が、通常はマーカーを含んでいる［ＩＮＡ配列とともに
含まれ、ここでは第二のＤＮＡ配列はＤＮＡを宿主に導
入する間に於いて毒素表現構築物と一緒になる。
ら３′への方向に於いて構築物は、もしあるならば転写
制御領域及び制御領域がプロモータの５′又は３′のい
ずれかであるプロモーター リポソーム結合位置、開始
コドン、開始コドンと同調したオーブン リーディング
フレーム（開放読み枠）を有する構造遺伝子、ストッ
プコドン、もしあるならばポリアデニル化信号配列、及
びターミネータ−領域を含むであろう。二重鎖としての
この配列はそれ自身微生物宿主の形質転換に使用できる
が、通常はマーカーを含んでいる［ＩＮＡ配列とともに
含まれ、ここでは第二のＤＮＡ配列はＤＮＡを宿主に導
入する間に於いて毒素表現構築物と一緒になる。
マーカーというのは修飾又は形質転換された宿主の選択
を与える構造遺伝子という意図である。
を与える構造遺伝子という意図である。
マーカーは通常、選択的な利点、例えば殺生物抵抗、例
えば抗生物質に対する抵抗性又は重金属に対する抵抗性
；無機栄養宿主に対し、原栄養を与えるための相補性な
どの選択的な利点を通常与える。好ましくは修飾された
宿主が選択されるのみならず、フィールドに於いて競争
的でもあり得るように相補性が用いられる。構築物の開
発には並びに宿主の修飾には、ｌ又はそれ以上のマーカ
ーを使用できる。生物は更にフィールド中の他の野性型
の微生物に対して競争的な利点を与えることによって修
飾することが出来る。例えは、金属キレート剤を表現す
る遺伝子、例えはシデロフォア（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒ
ｅｓ）を毒素を表現する構造遺伝子と共に宿主に導入で
きる。この方法ではシデロフォアの強められた表現が毒
素生産宿主に対する競争的な利点を与え、従ってこれは
野性型の微生物と効果的に競争出来、そして環境のニラ
チエを安定に占有することが出来る。
えば抗生物質に対する抵抗性又は重金属に対する抵抗性
；無機栄養宿主に対し、原栄養を与えるための相補性な
どの選択的な利点を通常与える。好ましくは修飾された
宿主が選択されるのみならず、フィールドに於いて競争
的でもあり得るように相補性が用いられる。構築物の開
発には並びに宿主の修飾には、ｌ又はそれ以上のマーカ
ーを使用できる。生物は更にフィールド中の他の野性型
の微生物に対して競争的な利点を与えることによって修
飾することが出来る。例えは、金属キレート剤を表現す
る遺伝子、例えはシデロフォア（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒ
ｅｓ）を毒素を表現する構造遺伝子と共に宿主に導入で
きる。この方法ではシデロフォアの強められた表現が毒
素生産宿主に対する競争的な利点を与え、従ってこれは
野性型の微生物と効果的に競争出来、そして環境のニラ
チエを安定に占有することが出来る。
機能的な複製系が存在しない場合は、構築物は又少なく
とも５０塩基対（ｂｐ）、好ましくは少なくとも１００
塩基対、そして通常は約１０００塩基対を越えない宿主
の配列の相同の配列を含む。この方法によって合法的な
絹み替えの確立が強められ、従って遺伝子は宿主中に統
合され、安定に宿主によって保持される。望ましくは毒
素遺伝子は相補性を与える遺伝子並びに競争的な利点を
与える遺伝子に接近しているのが好ましい。従って毒素
遺伝子が失われた場合には生じる生物は、相補性の遺伝
子及び／又は競争的な利点を与える遺伝子を失う場合が
多く、従って無傷の構築物を保持している遺伝子と一緒
には環境中で競争するのに不安定である。
とも５０塩基対（ｂｐ）、好ましくは少なくとも１００
塩基対、そして通常は約１０００塩基対を越えない宿主
の配列の相同の配列を含む。この方法によって合法的な
絹み替えの確立が強められ、従って遺伝子は宿主中に統
合され、安定に宿主によって保持される。望ましくは毒
素遺伝子は相補性を与える遺伝子並びに競争的な利点を
与える遺伝子に接近しているのが好ましい。従って毒素
遺伝子が失われた場合には生じる生物は、相補性の遺伝
子及び／又は競争的な利点を与える遺伝子を失う場合が
多く、従って無傷の構築物を保持している遺伝子と一緒
には環境中で競争するのに不安定である。
多数の翻訳制御領域が多様な微生物宿主から入手出来、
例えば細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、
藻類、菌類などから人手できる。
例えば細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、
藻類、菌類などから人手できる。
種々の翻訳制御領域は、ｔｒｐ遺伝子、ｌａｃ遺伝子、
ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び右プロモーター、Ｔａｃプ
ロモーター、宿主中で機能的である場合には毒素遺伝子
と組み合わされている天然のプロモーターを含んでいる
。例えは、米国特許４，３３２，８９８．４，３４２．
８３２及び４，３５６，２７０を参照。停止領域は二つ
の領域が両立可能で宿主中で機能的である限りに於いて
転写開始領域又は異なる転写開始領域と通常関連するこ
とが出来る。
ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び右プロモーター、Ｔａｃプ
ロモーター、宿主中で機能的である場合には毒素遺伝子
と組み合わされている天然のプロモーターを含んでいる
。例えは、米国特許４，３３２，８９８．４，３４２．
８３２及び４，３５６，２７０を参照。停止領域は二つ
の領域が両立可能で宿主中で機能的である限りに於いて
転写開始領域又は異なる転写開始領域と通常関連するこ
とが出来る。
安定なエピゾームの保持又は統合化が望まれる場合には
宿主中で機能する複製系を有しているプラスミドを用い
る。複製系はクロモソーム、宿主又は異なる宿主中に通
常存在するエピゾームエレメント又は宿主中で安定であ
るビールスからの複製系であり得る。ｐＢＲ３２２、ｐ
ＡｃＹｃ１８４、Ｒ５ＦＩＯＩＯ５１〕ＲＯＩ６１４な
どの多数のプラスミドが人手可能である。
宿主中で機能する複製系を有しているプラスミドを用い
る。複製系はクロモソーム、宿主又は異なる宿主中に通
常存在するエピゾームエレメント又は宿主中で安定であ
るビールスからの複製系であり得る。ｐＢＲ３２２、ｐ
ＡｃＹｃ１８４、Ｒ５ＦＩＯＩＯ５１〕ＲＯＩ６１４な
どの多数のプラスミドが人手可能である。
例えばオルソン等、（１９Ｂ２） 、１ 、８ａｃｔｅ
ｒ ｔｏ ｌ 、 ＋５０ ＋６０６９、及びバグダサ
リアン等、（＋９８１）Ｇｅｎｅ １６：２３７、及び
米国特許４，３５６，２７０．４，３６２，８１７、及
び４，３７１．６２５を参照。
ｒ ｔｏ ｌ 、 ＋５０ ＋６０６９、及びバグダサ
リアン等、（＋９８１）Ｇｅｎｅ １６：２３７、及び
米国特許４，３５６，２７０．４，３６２，８１７、及
び４，３７１．６２５を参照。
Ｂ、ｔ、遺伝子は開始領域及び調節制御の下にあるよう
に転写及び翻訳開始領域と転写及び翻訳停止領域の間に
導入できる。この構築物はプラスミド中に含められ、こ
のプラスミドは少なくとも一つの複製系を含んでいるが
、１以上のものを含むことが出来、この場合−つの複製
系はプラスミドの開発の間クローニングに用いられ、第
二の複製系は最終的な宿主中で機能するのｔこ必要であ
る。更に、ｌそれ以上のマーカーが存在出来、これは前
に述べた。統合化が望まれるときにはプラスミドは宿主
ゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。
に転写及び翻訳開始領域と転写及び翻訳停止領域の間に
導入できる。この構築物はプラスミド中に含められ、こ
のプラスミドは少なくとも一つの複製系を含んでいるが
、１以上のものを含むことが出来、この場合−つの複製
系はプラスミドの開発の間クローニングに用いられ、第
二の複製系は最終的な宿主中で機能するのｔこ必要であ
る。更に、ｌそれ以上のマーカーが存在出来、これは前
に述べた。統合化が望まれるときにはプラスミドは宿主
ゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。
形質転換体は慣用の方法に従って単離出来、通常は未修
飾の生物又は存在する場合には運搬する生物に対して所
望の生物が選択することが出来る選択技術を用いる。形
質転換体は、次に殺虫活性について試験される。
飾の生物又は存在する場合には運搬する生物に対して所
望の生物が選択することが出来る選択技術を用いる。形
質転換体は、次に殺虫活性について試験される。
処理細胞が標的害虫の環境に適用されたときに細胞の毒
素活性を長引かせるように殺虫剤含有細胞が処理される
場合には、適当な宿主細胞は原核生物又は真核生物のい
ずれかを含むことが出来、通常は哺乳類などの高等生物
に毒性の物質を生産しない細胞に限定される。しかしな
がら高等生物に毒性の物質を生産する生物もその毒素が
不安定であるか、又は適用水準が哺乳類宿主への毒性の
可能性なずへて避は得るほど十分低い場合には使用する
ことが出来る。特に興味のある宿主としては原核細胞及
び低級真核細胞、例えば菌類である。
素活性を長引かせるように殺虫剤含有細胞が処理される
場合には、適当な宿主細胞は原核生物又は真核生物のい
ずれかを含むことが出来、通常は哺乳類などの高等生物
に毒性の物質を生産しない細胞に限定される。しかしな
がら高等生物に毒性の物質を生産する生物もその毒素が
不安定であるか、又は適用水準が哺乳類宿主への毒性の
可能性なずへて避は得るほど十分低い場合には使用する
ことが出来る。特に興味のある宿主としては原核細胞及
び低級真核細胞、例えば菌類である。
原核細胞の例は、ゲノム陰性菌及び陽性菌であり、エン
テロバクテリアセアエ、例えばエセリキア、エルウィニ
ア、シジエラ、サルモネラ、及びプロテウス；バシラセ
アエ；リソビセアエ、例えばリゾビウム：スビリラセア
エ、例えばフォトバクテリウム、ジモモナス、セラチア
、アエロモナス、ヴイブリオ、デサルフＡ・ヴオブリオ
、スビリリウム；ラクトバシラセアエ；シュートモナセ
アエ、例えばシュードモナス及びアセトバクター；アゾ
トハクテラセアエ及びニトロバクテラセアエが含まれる
。真核生物の中には菌類、例えば藻状菌及び子嚢菌があ
り、これここは酵母、例えばサツカロマイセス及びシゾ
サッ力ロマイセスが含まれ、担子菌酵母、例えばロドト
ルラ、オーレオバシディウム、スポロボロマイセスなど
がある。
テロバクテリアセアエ、例えばエセリキア、エルウィニ
ア、シジエラ、サルモネラ、及びプロテウス；バシラセ
アエ；リソビセアエ、例えばリゾビウム：スビリラセア
エ、例えばフォトバクテリウム、ジモモナス、セラチア
、アエロモナス、ヴイブリオ、デサルフＡ・ヴオブリオ
、スビリリウム；ラクトバシラセアエ；シュートモナセ
アエ、例えばシュードモナス及びアセトバクター；アゾ
トハクテラセアエ及びニトロバクテラセアエが含まれる
。真核生物の中には菌類、例えば藻状菌及び子嚢菌があ
り、これここは酵母、例えばサツカロマイセス及びシゾ
サッ力ロマイセスが含まれ、担子菌酵母、例えばロドト
ルラ、オーレオバシディウム、スポロボロマイセスなど
がある。
生産の目的のための宿主細胞を選択するのに特に興味の
ある特徴にはＲ，ｔ、ｉ、遺伝子を宿主に導入する容易
さ、表現系の人手しやすさ、表現の効率、宿主中の殺虫
剤の安定性、及び補助的な遺伝的能力の存在が含まれる
。殺虫剤ミクロカプセルとしての使用のための興味ある
特徴には、殺虫剤の保護的な性質、例えば厚い細胞壁、
染色性、及び細胞内パッケージ又は封入体の形成、葉へ
の親和性、哺乳類に対する毒性が無いこと、害虫が摂取
する魅力、毒素の破壊なしに殺虫及び固定の容易さなど
が含まれる。他の考慮点には処方の容易さ及び取り扱い
の容易さ、経済性、強い安定性などが含まれる。
ある特徴にはＲ，ｔ、ｉ、遺伝子を宿主に導入する容易
さ、表現系の人手しやすさ、表現の効率、宿主中の殺虫
剤の安定性、及び補助的な遺伝的能力の存在が含まれる
。殺虫剤ミクロカプセルとしての使用のための興味ある
特徴には、殺虫剤の保護的な性質、例えば厚い細胞壁、
染色性、及び細胞内パッケージ又は封入体の形成、葉へ
の親和性、哺乳類に対する毒性が無いこと、害虫が摂取
する魅力、毒素の破壊なしに殺虫及び固定の容易さなど
が含まれる。他の考慮点には処方の容易さ及び取り扱い
の容易さ、経済性、強い安定性などが含まれる。
特に興味のある宿主生物には酵母、例えばロドトルラの
種、オーレオバシディウムの種、サツカロマイセスの種
、及びスポロボロマイセスの種；フィロプレイン生物、
例えはシュードモナスの種、エルウィニアの種及びフォ
トバクテリウムの種、又はエセリキア、ラクトバシルス
の種、バシルスの種などの他の生物が含まれる。特定生
物にはシュードモナス アエルキノサ、シュードモナス
フルオレスセンス、サツカロマイセス セレヴイシア
エ、ハシルス チューリンケンシス、大腸菌、バシルス
スブティリスなどが含まれる。
種、オーレオバシディウムの種、サツカロマイセスの種
、及びスポロボロマイセスの種；フィロプレイン生物、
例えはシュードモナスの種、エルウィニアの種及びフォ
トバクテリウムの種、又はエセリキア、ラクトバシルス
の種、バシルスの種などの他の生物が含まれる。特定生
物にはシュードモナス アエルキノサ、シュードモナス
フルオレスセンス、サツカロマイセス セレヴイシア
エ、ハシルス チューリンケンシス、大腸菌、バシルス
スブティリスなどが含まれる。
細胞は通常無傷（細胞壁が破壊されていない）であり、
場合によっては胞子も用いられるけれとも処理されると
きは胞子形であるよりも実質的に増殖形である。
場合によっては胞子も用いられるけれとも処理されると
きは胞子形であるよりも実質的に増殖形である。
微生物細胞の処理、例えばＳ、ｔ、毒素遺伝子を含有す
る微生物の処理は、化学的又は物理的手段によるもので
あることが出来るか、又は化学的及び／又は物理的手段
の絹み合わせであり得、この技術が毒素の性質に悪影響
を与えず、また毒素を保護する細胞の能力を消失させな
い限り用いられ得る。化学剤の例は、ハロゲン化剤、特
に原子番号１７〜８０のハロゲンである。より詳しくは
、所望の結果を達成するために温和な条件下そして十分
な時間、ヨウ素を使用することが出来る。他の適当な技
術にはアルデヒド、例えばボルムアルデヒド及びグルタ
ルアルデヒドでの処理、抗感染剤、例えばセフイラン
クロライド及びセチルピリジニウム クロライドての処
理、アルコール、例えばイソプロピルアルコール及びエ
タノールでの処理、種々の細胞固定剤、例えばボーイン
固定剤及びヘリ−固定剤での処理（ヒューメイソン、グ
レッチエンエル０、アニマルティッシュ テクニック、
ダブリュー、エッチ、フリーマン アンド カンパニー
、１９６７） 、又は細胞が宿主動物に投与されるとき
細胞中で製造される毒素の活性を保持し、長期化する物
理的（熱）及び化学的薬剤の糾み合わせが含まれる。物
理的手段の例は、短波長照射、例えばγ照射及びＸ線照
射、凍結、紫外線照射、凍結乾燥などである。
る微生物の処理は、化学的又は物理的手段によるもので
あることが出来るか、又は化学的及び／又は物理的手段
の絹み合わせであり得、この技術が毒素の性質に悪影響
を与えず、また毒素を保護する細胞の能力を消失させな
い限り用いられ得る。化学剤の例は、ハロゲン化剤、特
に原子番号１７〜８０のハロゲンである。より詳しくは
、所望の結果を達成するために温和な条件下そして十分
な時間、ヨウ素を使用することが出来る。他の適当な技
術にはアルデヒド、例えばボルムアルデヒド及びグルタ
ルアルデヒドでの処理、抗感染剤、例えばセフイラン
クロライド及びセチルピリジニウム クロライドての処
理、アルコール、例えばイソプロピルアルコール及びエ
タノールでの処理、種々の細胞固定剤、例えばボーイン
固定剤及びヘリ−固定剤での処理（ヒューメイソン、グ
レッチエンエル０、アニマルティッシュ テクニック、
ダブリュー、エッチ、フリーマン アンド カンパニー
、１９６７） 、又は細胞が宿主動物に投与されるとき
細胞中で製造される毒素の活性を保持し、長期化する物
理的（熱）及び化学的薬剤の糾み合わせが含まれる。物
理的手段の例は、短波長照射、例えばγ照射及びＸ線照
射、凍結、紫外線照射、凍結乾燥などである。
細胞は一般に強められた構造的安定性を有し、このこと
は環境条件に対する抵抗を強める。殺虫剤がプロフオー
ム（ｐ＋・ｏｆｏｒｍ）である場合には、標的害虫病原
体によるプロフオームから殺虫剤の成熟形態への過程を
阻１ヒしないように不活性方法は選ばれるへきである。
は環境条件に対する抵抗を強める。殺虫剤がプロフオー
ム（ｐ＋・ｏｆｏｒｍ）である場合には、標的害虫病原
体によるプロフオームから殺虫剤の成熟形態への過程を
阻１ヒしないように不活性方法は選ばれるへきである。
例えはホルムアルデヒドは蛋白質を架橋させ、ポリペプ
チド殺虫剤のプロフオームの処理を阻害し得る。不活性
化又は殺菌方法は毒素の生物利用可能性又は生物活性の
少なくとも実質的な部分を保持する。
チド殺虫剤のプロフオームの処理を阻害し得る。不活性
化又は殺菌方法は毒素の生物利用可能性又は生物活性の
少なくとも実質的な部分を保持する。
Ｂ、ｔ、殺虫遺伝子を含有する細胞宿主は、ＤＮＡ構築
物が選択的な利点を与え、実質的に全て、又は全ての細
胞がＢ、ｔ、遺伝子を保持するように選択培地を与える
任意の慣用の栄養培地中で生育され得る。これらの細胞
は次に慣用の方法にしたがって収穫される。別の方法と
して細胞は収穫前に処理できる。
物が選択的な利点を与え、実質的に全て、又は全ての細
胞がＢ、ｔ、遺伝子を保持するように選択培地を与える
任意の慣用の栄養培地中で生育され得る。これらの細胞
は次に慣用の方法にしたがって収穫される。別の方法と
して細胞は収穫前に処理できる。
Ｂ、ｔ、細胞は種々の方法で処方できる。これらは水和
粉末、顆粒又は散剤として使用出来、種々の不活性物質
、例えは無機物質（フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩
、燐酸塩など）又は植物性物質（粉末化したトウモロコ
シの穂軸、籾殻、くるみの殻など）と混合することによ
って使用することが出来る。処方物は展開粘着助剤、安
定化剤、他の殺虫添加物、又は表面活性剤を含み得る。
粉末、顆粒又は散剤として使用出来、種々の不活性物質
、例えは無機物質（フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩
、燐酸塩など）又は植物性物質（粉末化したトウモロコ
シの穂軸、籾殻、くるみの殻など）と混合することによ
って使用することが出来る。処方物は展開粘着助剤、安
定化剤、他の殺虫添加物、又は表面活性剤を含み得る。
液体処方剤は水を基盤としたもの又は非水性のものであ
り得、フオーム、ゲル、！Ｌｆ：濁液、乳化可能な濃縮
物などとして使用できる。成分はレオロジー剤、表面活
性剤、乳化剤、分散剤、又は重合体を含有できる。
り得、フオーム、ゲル、！Ｌｆ：濁液、乳化可能な濃縮
物などとして使用できる。成分はレオロジー剤、表面活
性剤、乳化剤、分散剤、又は重合体を含有できる。
殺虫剤濃度は特定の処方剤の性質、特にそれが濃縮物で
あるか又は直接使用されるかに依存して広く変化し得る
。殺虫剤は少なくとも１重量％て存在し、１００重量％
であってもよい。乾燥処方剤は殺虫剤の約１〜９５重量
％を有し得るが、一方液体処方剤は一般に液相中の約１
〜９５重量％固体である。処方剤は一般に約１０２〜約
１０’細胞／ｍｇを有する。これらの処方剤はヘクター
当たり約５０ｍｇ（液体又は乾燥物）〜Ｉｋｇ又はそれ
以上投与される。
あるか又は直接使用されるかに依存して広く変化し得る
。殺虫剤は少なくとも１重量％て存在し、１００重量％
であってもよい。乾燥処方剤は殺虫剤の約１〜９５重量
％を有し得るが、一方液体処方剤は一般に液相中の約１
〜９５重量％固体である。処方剤は一般に約１０２〜約
１０’細胞／ｍｇを有する。これらの処方剤はヘクター
当たり約５０ｍｇ（液体又は乾燥物）〜Ｉｋｇ又はそれ
以上投与される。
処方剤は鱗翅類害虫の環境、例えは植物、土壌又は水に
対してスプレー、ダスト、ふりかけ、などにより適用す
ることが出来る。
対してスプレー、ダスト、ふりかけ、などにより適用す
ることが出来る。
以下は本発明の実施のため最良の態様を含む手順を例示
する実施例である。これらの実施例は限定するものと解
釈されるべきでない。全てのパーセントは他に記載され
ていない限り重量であり、全ての溶媒混合物は容量割合
である。
する実施例である。これらの実施例は限定するものと解
釈されるべきでない。全てのパーセントは他に記載され
ていない限り重量であり、全ての溶媒混合物は容量割合
である。
実施例】−新規なハリブリット毒素遺伝子の構築及びシ
ュードモナス フルオレスセンスへの形質転換 出発ＡＴＧ（即ち、出発メチオニン）ないしＨｉｎｄｍ
位置までの全ての毒素をコードしたＤＮＡを含んでいる
バシルス チューリンゲンシスｖａｒ、クルスダキＨＤ
−７３遺伝子の部分を、Ｔａｃ−プロモートされたプラ
スミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）中に挿入した
。
ュードモナス フルオレスセンスへの形質転換 出発ＡＴＧ（即ち、出発メチオニン）ないしＨｉｎｄｍ
位置までの全ての毒素をコードしたＤＮＡを含んでいる
バシルス チューリンゲンシスｖａｒ、クルスダキＨＤ
−７３遺伝子の部分を、Ｔａｃ−プロモートされたプラ
スミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）中に挿入した
。
これはｐＫＫ２２３−３中のリポソーム結合位置から少
し下流のこの遺伝子のブラント融合を作ることによって
なされた。これによってプラスミドｐＫＫ２が形成され
た。次に、Ｂ 、 ｔ 、のベルリナー（Ｂｅｒｌｉｎ
ｅｒ）系統からの毒素遺伝子の３１部分（ＤＮＡ ５：
３０５−３１４［＋９８６］）をＳａｃ ＩからＰｓｔ
Ｉへの断片としてｐＫＫ２／５ａｃＩ＋Ｐｓｔ、Ｉ中に
クローン化し、このようにして新しいｐＫＫ７３ＢＢ−
９と命名される新しいプラスミド中に組み替え毒素遺伝
子を作った。この遺伝子は５ａｃＩ位置を越えた全ての
配列（３’から）に対しヘルリナ−（Ｂｅｒｌ １ｎｅ
ｒ）起源のものであった（ＤＮＡ ５：３０５−３１４
．１９８６）。
し下流のこの遺伝子のブラント融合を作ることによって
なされた。これによってプラスミドｐＫＫ２が形成され
た。次に、Ｂ 、 ｔ 、のベルリナー（Ｂｅｒｌｉｎ
ｅｒ）系統からの毒素遺伝子の３１部分（ＤＮＡ ５：
３０５−３１４［＋９８６］）をＳａｃ ＩからＰｓｔ
Ｉへの断片としてｐＫＫ２／５ａｃＩ＋Ｐｓｔ、Ｉ中に
クローン化し、このようにして新しいｐＫＫ７３ＢＢ−
９と命名される新しいプラスミド中に組み替え毒素遺伝
子を作った。この遺伝子は５ａｃＩ位置を越えた全ての
配列（３’から）に対しヘルリナ−（Ｂｅｒｌ １ｎｅ
ｒ）起源のものであった（ＤＮＡ ５：３０５−３１４
．１９８６）。
次に、ｐＫＫ７３ＢＢ−９をＮ５ｉＴて開裂し、毒素Ｄ
ＮＡの内部部分を開放し、細菌アルカリフオルファター
ゼで処理し、ゲル精製し、Ｎ５ｉｌ末端と部分的ＨＤ７
３−様の毒素遺伝子断片をサブクローン化するのに使用
した。生しるプラスミドはｐＫＫＩ−７３と呼ばれる。
ＮＡの内部部分を開放し、細菌アルカリフオルファター
ゼで処理し、ゲル精製し、Ｎ５ｉｌ末端と部分的ＨＤ７
３−様の毒素遺伝子断片をサブクローン化するのに使用
した。生しるプラスミドはｐＫＫＩ−７３と呼ばれる。
）ｌＤ７３−様の断片は、Ｂ、ｔ、毒素に一般的に見ら
れる二つのＮ５ｉＩ位置の間の全てのＤＮＡ配列を表わ
している。次に、ｐＫＫＩ−７３をＴｔ、ｈｌｌｌｌで
開裂し、クレノー（Ｋｌｅｎｏν）断片プラスｄＮＴＰ
で処理してプラント末端とし、ＢａｍＨｌに対しリンカ
−にし、ＢａｍＨｌで消化し、連結し、形質転換し、ス
クリーニングし、部分的なテトラサイクリン遺伝子が欠
失したプラスミドを見出した（ ｐＫＫ２２３−３に由
来）。これによってプラスミドｐｉ、＋２３−１が生し
た。プラスミドｐｌ、１２３−１をＰｖｕ Ｉで開裂し
、手短にＢａ１３１で処理し、クレノーでプラント末端
にし、同様にプラント末端化したテトラサイクリン抵抗
性のｐＢＲ３２２からの遺伝子をクローン化するのに使
用したく地図部分はＥｃｏＲｌ −Ａｖａ Ｉ ）。テ
トラサイクリン抵抗性のコロニーのスクリーニングによ
って所望のプラスミドｐ＋、］３０−６を生成した。こ
のプラスミドをＢａｍＨｌでの部分的な消化によって線
形化し、ゲル精製し、ｐＲＯ＋６１４からの複製のＢａ
ｍＨ１末端シュードモナス起源を受は入れるのに使用し
た。最終的な結果はプラスミドｐＭ２．１６−Ｉｆとな
った。
れる二つのＮ５ｉＩ位置の間の全てのＤＮＡ配列を表わ
している。次に、ｐＫＫＩ−７３をＴｔ、ｈｌｌｌｌで
開裂し、クレノー（Ｋｌｅｎｏν）断片プラスｄＮＴＰ
で処理してプラント末端とし、ＢａｍＨｌに対しリンカ
−にし、ＢａｍＨｌで消化し、連結し、形質転換し、ス
クリーニングし、部分的なテトラサイクリン遺伝子が欠
失したプラスミドを見出した（ ｐＫＫ２２３−３に由
来）。これによってプラスミドｐｉ、＋２３−１が生し
た。プラスミドｐｌ、１２３−１をＰｖｕ Ｉで開裂し
、手短にＢａ１３１で処理し、クレノーでプラント末端
にし、同様にプラント末端化したテトラサイクリン抵抗
性のｐＢＲ３２２からの遺伝子をクローン化するのに使
用したく地図部分はＥｃｏＲｌ −Ａｖａ Ｉ ）。テ
トラサイクリン抵抗性のコロニーのスクリーニングによ
って所望のプラスミドｐ＋、］３０−６を生成した。こ
のプラスミドをＢａｍＨｌでの部分的な消化によって線
形化し、ゲル精製し、ｐＲＯ＋６１４からの複製のＢａ
ｍＨ１末端シュードモナス起源を受は入れるのに使用し
た。最終的な結果はプラスミドｐＭ２．１６−Ｉｆとな
った。
プラスミＦ’ ｐＭ２．１６−１１を標準の形質転換手
順を用いてシュードモナス フルオレスセンスを形質転
換するのに使用した。
順を用いてシュードモナス フルオレスセンスを形質転
換するのに使用した。
上で議論したＨＤ？３−様のＮｓｉ Ｔ断片を次の様に
構築した。Ｈｉｎｄｍ−末端化部分的ＨＤ？３遺伝子の
３′末端にハシルス チューリンゲンシスｖａｒ、クル
スタキ■０−１からクローン化されたＨ Ｉｎｄ ｍ〜
Ｎｄｅ Ｉヘルリナー様毒素配列を加えた。
構築した。Ｈｉｎｄｍ−末端化部分的ＨＤ？３遺伝子の
３′末端にハシルス チューリンゲンシスｖａｒ、クル
スタキ■０−１からクローン化されたＨ Ｉｎｄ ｍ〜
Ｎｄｅ Ｉヘルリナー様毒素配列を加えた。
上記のクローニング手順は、他に記載されていない限り
標準の手順を使用した。
標準の手順を使用した。
プラスミドの製造及び宿主生物の形質転換に用いた種々
の方法は、この技術で良く知られている。
の方法は、この技術で良く知られている。
これらの手順は全てマニアティス、ティー８、フリッシ
ュ、イー、エフ０、及びサンプルツク、ジエイ−（１９
８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験室
手順。
ュ、イー、エフ０、及びサンプルツク、ジエイ−（１９
８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験室
手順。
コールド スプリングハーバ−ラボラトり一ニューヨー
クに記載されている。従ってＤＮＡを微生物細胞から抽
出し、制限酵素消化を実施し、ＤＮＡ断片を電気泳動に
かけ、テーリングしてプラスミド及び挿入ＤＮＡをアニ
ーリングさせ、ＤＮＡを連結させ、細胞を形質転換し、
プラスミドＤＮＡを製造し、蛋白質を電気泳動にかけ、
そしてＤＮＡの配列を決定することは遺伝子工学技術分
野の当業者の成し得ることである。
クに記載されている。従ってＤＮＡを微生物細胞から抽
出し、制限酵素消化を実施し、ＤＮＡ断片を電気泳動に
かけ、テーリングしてプラスミド及び挿入ＤＮＡをアニ
ーリングさせ、ＤＮＡを連結させ、細胞を形質転換し、
プラスミドＤＮＡを製造し、蛋白質を電気泳動にかけ、
そしてＤＮＡの配列を決定することは遺伝子工学技術分
野の当業者の成し得ることである。
本明細書に開示された制限酵素は、ベセスダリサーチ
ラボラトリーズ、ミツトランド州、ゲイサースバーグ、
又はニューイングランド バイオラブ、マサチューセッ
ツ州、ベベリーから購入することが出来る。酵素は供給
者によって与えられた説明に従って使用した。
ラボラトリーズ、ミツトランド州、ゲイサースバーグ、
又はニューイングランド バイオラブ、マサチューセッ
ツ州、ベベリーから購入することが出来る。酵素は供給
者によって与えられた説明に従って使用した。
Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含有しているプラスミドｐＭ２゜
１６−１１は、標準の良く知られた手順を用いることに
よって形質転換された宿主微生物から除去できる。例え
ば、Ｐ、フルオレスセンス（ｐＭ２．１６−１１）を透
明化した溶菌物密度勾配平衡手順にかけるなどしてｐＭ
２．１６−１１を回収する。
１６−１１は、標準の良く知られた手順を用いることに
よって形質転換された宿主微生物から除去できる。例え
ば、Ｐ、フルオレスセンス（ｐＭ２．１６−１１）を透
明化した溶菌物密度勾配平衡手順にかけるなどしてｐＭ
２．１６−１１を回収する。
Ｐ、フルオレスセンス（ｐＭ２．１６１１）のサブカル
チャーは１９８８年１月１５日にアメリカ合衆国６１６
０４イリノイ州、ペオリア、ノース ユニバーシティ
ストリ−１−１８１５のリージョナル リサーチ セン
ターアグリカルチュラル リサーチ サービスパテント
カルチャー コレクション（ＮＲＲＬ）の永久寄託さ
れている。この培養基には寄託所から寄託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１８２９２が与えられている。この寄託物は開示
している特許の付与に基づいて公衆に入手可能となる。
チャーは１９８８年１月１５日にアメリカ合衆国６１６
０４イリノイ州、ペオリア、ノース ユニバーシティ
ストリ−１−１８１５のリージョナル リサーチ セン
ターアグリカルチュラル リサーチ サービスパテント
カルチャー コレクション（ＮＲＲＬ）の永久寄託さ
れている。この培養基には寄託所から寄託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１８２９２が与えられている。この寄託物は開示
している特許の付与に基づいて公衆に入手可能となる。
この寄託物はまた、この出願の対応物又はその子孫出願
が出願されている国に於いて外国特許法に要求されるに
従って人手可能である。しかしながら寄託物が入手可能
であることは、行政行為によって与えられた特許権を損
って本発明を実施する実施権を構成するものではない。
が出願されている国に於いて外国特許法に要求されるに
従って人手可能である。しかしながら寄託物が入手可能
であることは、行政行為によって与えられた特許権を損
って本発明を実施する実施権を構成するものではない。
更にこの培養基寄託は微生物の寄託に対するブタペスト
条約の条項に従って一般に保存されて入手可能とされる
。Ｉｌｌち培養基はこれを生きた状態で汚染されないよ
うに保つのに必要な全ての注意を払って寄託物の試料を
提供する要求の最も細菌のものから少なくとも５年間の
期間、そしてどんな場合にも培養基を開示して発行され
る任意の特許の権利行使可能な寿命の間、又は寄託の後
少なくとも３０年間の期間保存される。寄託者は寄託物
の状態のために寄託所が試料を要求されたときに提供す
ることが出来ないことがあった場合に寄託物を取替える
義務を認めるものである。この培養基寄託の一般への入
手可能性の全ての制限は、寄託物を開示している特許が
付与されると永久に除かれる。
条約の条項に従って一般に保存されて入手可能とされる
。Ｉｌｌち培養基はこれを生きた状態で汚染されないよ
うに保つのに必要な全ての注意を払って寄託物の試料を
提供する要求の最も細菌のものから少なくとも５年間の
期間、そしてどんな場合にも培養基を開示して発行され
る任意の特許の権利行使可能な寿命の間、又は寄託の後
少なくとも３０年間の期間保存される。寄託者は寄託物
の状態のために寄託所が試料を要求されたときに提供す
ることが出来ないことがあった場合に寄託物を取替える
義務を認めるものである。この培養基寄託の一般への入
手可能性の全ての制限は、寄託物を開示している特許が
付与されると永久に除かれる。
実施例２−毒素遺伝子を植物に挿入すること本明細書に
開示されている新規な殺虫毒素のコードしている新規な
遺伝子は、アクロバクタートウメファシェンスからのＴ
１プラスミドを用いて植物細胞に挿入することが出来る
。植物細胞を次に植物中に再生させる（ザンブルスキー
ピー０、ジョーズ、エッチ８、ゲンテロ、シー９、リ
ーマン、ジエイ９、パンモンターグ、エム、及びシェル
、ジェイ、 ［１９８３］ Ｃｅ１ｌ ３２：ｌ０３３
−１０４３） 、この点に関する特に有用なベクターは
ｐＥＮ０４にである（クリ−、エッチ、ジェイ０、ヤノ
フスキー、エム、エフ、及びネスター、イー、ダブリュ
ー、［１９８５］ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３
：６３７−６４２） 、このプラスミドは、植物細胞及
び細菌中の両方で複製出来、パラセンジャー遺伝子に対
する複数のクローニング位置を有している。毒素遺伝子
は、例えばｐＥＮＤ４にのＢａｍＨＩの位置に挿入出来
、大腸菌中で増殖され、適当な植物細胞に形質転換され
る。
開示されている新規な殺虫毒素のコードしている新規な
遺伝子は、アクロバクタートウメファシェンスからのＴ
１プラスミドを用いて植物細胞に挿入することが出来る
。植物細胞を次に植物中に再生させる（ザンブルスキー
ピー０、ジョーズ、エッチ８、ゲンテロ、シー９、リ
ーマン、ジエイ９、パンモンターグ、エム、及びシェル
、ジェイ、 ［１９８３］ Ｃｅ１ｌ ３２：ｌ０３３
−１０４３） 、この点に関する特に有用なベクターは
ｐＥＮ０４にである（クリ−、エッチ、ジェイ０、ヤノ
フスキー、エム、エフ、及びネスター、イー、ダブリュ
ー、［１９８５］ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３
：６３７−６４２） 、このプラスミドは、植物細胞及
び細菌中の両方で複製出来、パラセンジャー遺伝子に対
する複数のクローニング位置を有している。毒素遺伝子
は、例えばｐＥＮＤ４にのＢａｍＨＩの位置に挿入出来
、大腸菌中で増殖され、適当な植物細胞に形質転換され
る。
本発明の新規なハイブリッド遺伝子は、オートゲラファ
ー カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｔ
１ｆｏｒｎｉｃａ）核ポリへトロシス ウィルス（Ａｃ
ＮＰＶ）などのバキュロウィルスにクローン化出来る。
ー カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｔ
１ｆｏｒｎｉｃａ）核ポリへトロシス ウィルス（Ａｃ
ＮＰＶ）などのバキュロウィルスにクローン化出来る。
ｐｌＪｃ８なとの市販のクローニングベクター中にクロ
ーン化されたＡｃＮＰＶゲノムを含有しているプラスミ
ドを構築できる。ＡｃＮＰＶケノムはポリへドリン遺伝
子のコーディング領域が除去され、そしてパラセンジャ
ー遺伝子に対する独特のクローニング位置がポリヘトリ
ン プロモーターのすく後に位置されているように修飾
される。そのようなベクターの例はペノック等（ペノッ
ク、ジー、デイ−０、シュエマ−カー、シー、及びミラ
ー、エル、ケイ、［１９８４］ Ｍｏ１． Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ４：３９９−４０６）によって記載され
たｐＧＰ−８６８７４及びスミス等（スミス、ジーイー
０、サマーズ、エム、デイ−８及びフレーザ、エム、ジ
エイ、 ［＋９８３］ Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ３：２＋５６−２
１６５）により記載されたｐＡｃ３８０である。本発明
の新規な蛋白毒素に対し、コードしている遺伝子はコー
ディング領域から上流及び下流の両方の適当な領域に於
いてＢａｍＨＩリンカ−で修飾することが出来、ＡｃＮ
ＰＶベクターの一つのパラセンジャー位置に挿入される
。
ーン化されたＡｃＮＰＶゲノムを含有しているプラスミ
ドを構築できる。ＡｃＮＰＶケノムはポリへドリン遺伝
子のコーディング領域が除去され、そしてパラセンジャ
ー遺伝子に対する独特のクローニング位置がポリヘトリ
ン プロモーターのすく後に位置されているように修飾
される。そのようなベクターの例はペノック等（ペノッ
ク、ジー、デイ−０、シュエマ−カー、シー、及びミラ
ー、エル、ケイ、［１９８４］ Ｍｏ１． Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ４：３９９−４０６）によって記載され
たｐＧＰ−８６８７４及びスミス等（スミス、ジーイー
０、サマーズ、エム、デイ−８及びフレーザ、エム、ジ
エイ、 ［＋９８３］ Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ３：２＋５６−２
１６５）により記載されたｐＡｃ３８０である。本発明
の新規な蛋白毒素に対し、コードしている遺伝子はコー
ディング領域から上流及び下流の両方の適当な領域に於
いてＢａｍＨＩリンカ−で修飾することが出来、ＡｃＮ
ＰＶベクターの一つのパラセンジャー位置に挿入される
。
前に記載したように新規なり、ｔ、毒素遺伝子をコード
しているヌクレオチド配列は、表１に示されている。推
測されたアミノ酸配列が表Ｈに示されている。
しているヌクレオチド配列は、表１に示されている。推
測されたアミノ酸配列が表Ｈに示されている。
蛋白質のアミノ酸配列はＤＮＡのヌクレオチド配列によ
り決定されることがこの技術でよく知られている。遺伝
子コードの冗長性のために、即ち１以上のコードしてい
るヌクレオチド トリプレット（コドン）が蛋白質を作
るアミノ酸のほとんどに使用できるので異なるヌクレオ
チド配列が一つの特定のアミノ酸に対し、コードし得る
。従って遺伝子コードは次の様に述べることが出来る。
り決定されることがこの技術でよく知られている。遺伝
子コードの冗長性のために、即ち１以上のコードしてい
るヌクレオチド トリプレット（コドン）が蛋白質を作
るアミノ酸のほとんどに使用できるので異なるヌクレオ
チド配列が一つの特定のアミノ酸に対し、コードし得る
。従って遺伝子コードは次の様に述べることが出来る。
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
ロイシン（Ｌｅｕ）
イソロイシン（ｌｌｅ）
メチオニン（Ｎｅｔ、）
バリン（Ｖａｌ）
セリン（Ｓｅｒ）
プロリン（Ｐｒｏ）
スレオニン（Ｔｈｒ）
アラニン（Ａｌａ）
チロシン（Ｔｙｒ）
末端信号
ヒスチジン（Ｈｉｓ）
グルタミン（Ｇｌｎ）
アスパラギン（Ａｓｎ）
リジン（Ｌｙｓ）
アスパラギン酸（Ａｓｐ）
グルタミン酸（Ｇｌｕ）
システィン（Ｃｙｓ）
ＴＫ
ＴＹ
ＴＭ
ＴＧ
ＴＬ
Ｒ５
ＣＬ
ＣＬ
ＣＬ
ＡＫ
ＡＪ
ＡＫ
ＣＡ、Ｉ
ＡＫ
ＡＡ、Ｉ
ＧＡに
ＧＡ、Ｉ
ＧＫ
トリプトファン（Ｔｒｐ） ＴＧＧ
アルキニン（Ａｒｇ） リＧＺ
グリシン（Ｇｌｙ） ＧＧＬ
キー：各々の３文字のデオキシヌクレオチド トリプレ
ットがｍＲＮＡのトリヌクレオチドであって、左に５′
−末端を右に３′＝末端を有しているものに対応する。
ットがｍＲＮＡのトリヌクレオチドであって、左に５′
−末端を右に３′＝末端を有しているものに対応する。
ここに与えられる全てのＤＮＡ配列は、その配列がｍＲ
ＮＡ配列に対応する鎖のものであり、ウラシルがチミン
に置き換えられている。デオキシヌクレオチド配列を形
成しているプリン又はピリミジンに対して次の文字で表
わされる。
ＮＡ配列に対応する鎖のものであり、ウラシルがチミン
に置き換えられている。デオキシヌクレオチド配列を形
成しているプリン又はピリミジンに対して次の文字で表
わされる。
Ａ＝アデニン
Ｇ＝ニブアニ
ン＝シトシン
Ｔ＝チミン
Ｘ＝ＹがＡ又はＧのときＴ叉はＣ
Ｘ＝ＹがＣ叉はＴであるならばＣ
Ｙ＝ＸがＣならばＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ
Ｙ＝ＸがＴならはＡ又はＧ
Ｗ＝ＺがＡ又はＧならはＣ又はＡ
Ｗ＝ＺがＣ又はＴならばＣ
Ｚ＝ＷがＣならばＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ
Ｚ＝ＷがＡならはＡ又はＧ
ＱＲ＝ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴならばＴＣｌ又はＱＲ＝Ｓ
がＴ又はＣならばＡＧ Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ叉はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ、Ｃ又はＴ 上記はＢ、ｔ、毒素の新規なアミノ酸配列が蛋白質の同
しアミノ酸配列をコードしている均等なヌクレオチド配
列によって製造できることをボしている。従って本発明
はそのような均等なヌクレオチド配列も含む。更に同し
構造のそして同し機能の蛋白質は変化が蛋白質の二次構
造を変えないならば、アミノ酸配列を変更することによ
って作ることが出来ることが示されている（カイザー、
イティー、及びケズディー、エフ、シエイ、 ［１９８
４］５ｃｉｅｎｃｅ ２２３：２４９−２５５） ｏ従
って、本発明は蛋白質の二次構造を変化しない本明細書
に記載されてるアミノ酸配列の突然変異体も又はもしも
構造が変更されているならば生物活性が成る程度保持さ
れている突然変異体を含む。
がＴ又はＣならばＡＧ Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ叉はＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ Ｍ＝Ａ、Ｃ又はＴ 上記はＢ、ｔ、毒素の新規なアミノ酸配列が蛋白質の同
しアミノ酸配列をコードしている均等なヌクレオチド配
列によって製造できることをボしている。従って本発明
はそのような均等なヌクレオチド配列も含む。更に同し
構造のそして同し機能の蛋白質は変化が蛋白質の二次構
造を変えないならば、アミノ酸配列を変更することによ
って作ることが出来ることが示されている（カイザー、
イティー、及びケズディー、エフ、シエイ、 ［１９８
４］５ｃｉｅｎｃｅ ２２３：２４９−２５５） ｏ従
って、本発明は蛋白質の二次構造を変化しない本明細書
に記載されてるアミノ酸配列の突然変異体も又はもしも
構造が変更されているならば生物活性が成る程度保持さ
れている突然変異体を含む。
表■
１０ ２０ ：Ｉ
ＯＩ ＡＴＧＧＡ丁ＡＡＣＡ ＡＴＣＣＧＡＡＣＡ
Ｔ ＣＡＡＴＧＡＡＴＩ６１ Ｃ１ＴＡＧＡＡＧＴ
ＡＴ ＴＡＧＧＴＧＧＡＧＡ ＡＡＧＡＡＴＡＧ。
ＯＩ ＡＴＧＧＡ丁ＡＡＣＡ ＡＴＣＣＧＡＡＣＡ
Ｔ ＣＡＡＴＧＡＡＴＩ６１ Ｃ１ＴＡＧＡＡＧＴ
ＡＴ ＴＡＧＧＴＧＧＡＧＡ ＡＡＧＡＡＴＡＧ。
１２１ ＴＣＩＥＣＴＡＡＣＩＥＣ＾＾ＴＴＴＣＴＴ
ＴＴ ＧＡ６ＴＧＡＡＴＩＥＩＩ ｅＴＴＧＡＴＡ
Ｔ＾＾ ＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴ ＴＴＴＴＧＧＴＣＩ
２４１ ＋ＥＡＡＣＡＧＴＴＡＡ ＴＴＡＡＣＣＡＡ
ＡＧ ＡＡＴ＾ＧＡＡＧ；：３１０ ３２
０ ：Ｅ：！０４ＥｌＩ ＴＡＴｒｉ
ＴＴＣＡＡＧ ＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴ ＡＣＡＴＴ
ＴＡＴＩ５４１ ＡＧＧＴＧＩＥＧＧＡＴ ＴＴＧ
ＡＴＧＣＣＧＣＧＡＣＴＡＴＣＡＡ丁 ＡＧＴＣＧＴＴ
＾Ｔ＾ ＡＴＧＡＴＴＴＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡ丁Ｔｂ
１０ ６２１） ６６
０１ ＧＩＥＣＡＡＣＴＡＴＡ ＣＡＧＡＴＴＡＴ
ＧＣＴｒ３Ｔ＾ＣＧＣＴ＋６６１ ＣＣＧＩＥＡＴＴ
ＣＴＡ ［ＥＡＧＡＴＴＧＧＧＴ ＡＡＧＧＴ八Ｔ
Ａ＋へ２１ ＴＴＡＧＡＴＡＴＣＩＥ ＴＴＧＣＴ
ＣＴＧＴＴ ＣＣＣＧＡＡＴＴＡＴ ＧＡＴＡＧＴ
ＡＧＡＡ ＧＡＴＡ丁ＣＣＡＡＴ ＴＣＧＡＡＣＡ
ＧＴ丁９１０ ９２０
９ＥＯ９０１ＡＡＣＡＧＴ＾丁ＡＡ ＣＣＡＴＣＴＡ
ＴＡＣＣ１ＧＡＴＧＣＴＣ＋９６１ ＡＴＡＡＴＧＧ
ＣＴＴ ＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧ ＧＴＴＴＴＣＧＧ
＋１０２１ ＡＴＧＧＧＡＡＡＴＧ ＣＡＧＣＴＣ
ＣＡＣＡ ＡＣ＾ＡＣＧＴ＾′３Ａ ＣＣＡＧＧＡ
丁ＴＴＡ ＣＴＧＧＴＧＧＧＩＥＡ ＣＴＴＡＧＴ
ＴＡＧＡ表■ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｎ ＡＳｎ Ｐｒｏ
ＡＳｎ ｒｌｅ Ａｓｎ２′５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＧＬｙ Ｇ
ｌｕ ＡｒｇＳｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｉｎ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＳｅｒＶａｌ Ａｓ
ｐ ｌｉｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈ
ｅＧｌｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＡＳｎ Ｇｉ
ｎ Ａｒｇ Ｉ１２Ｑ５ ＧＬｕ Ｇｌｙ ＬｅｕＳｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ ＧｉｎＰｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｒｇ ＧｌｕＬｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
＾ｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＰｈｅＴｙ
ｒ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ａｌｃｓ、Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ｈ１ｓＢ５ ＾ｒ９Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｔｈｒ１３１ｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａ１Ｐｒｏ ＡＳＰ Ｓｅｒ
Ａｒｇ＾Ｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｃ
１ｎ Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａ１Ｌ！？ｕ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ ＾ｌ’９ 丁ｙｒ Ｐｒｏ Ｉ
ｌｅ ＾ｒ−９Ｔｈｒ Ｖａ１Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ＾ｒ９Ｇｌｕ ｌ１ｅＴｙｒ Ｔｈｒ−＾
ｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ＾ｓｎ Ｐｈｅ
＾ｓｐ Ｇｌｙ ｓｅｔ’ Ｐｈｅ４〇 − 表■（続き） Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｅｈｎ Ｓ２ｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒｌｌｅ Ｍ
ｅｔ ＾ｌａ ＳｅｒＭｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ
八１ａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ５ｅｒＳｅｒ Ｖａ
ｌ Ｌ＝ｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ ５ｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｎ ５ｅｒ Ａ；ｎ Ｓｅｒ ５ｅｒＧｌｕ Ｆ’ｈ
ｅ Ａｃ１ｎ ＡｓｎＰｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ ５ｅｒＰｒｏ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ ＥｉｅｒＧｉｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｕ １１ｅ Ｔｙｒ ＴｈＬ＋ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｆ’ｒｏ Ｇｉｎ ＧｉｎＴｈｒ Ｌ
ｅｕ 丁ｙｒ Ａｒ６３日３ ＋３１ｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｆｈｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｈｉｓ νａｌ Ｓｅｒ ｒ１１？ １１ｅ１１！！ Ｉｌ
ｅ Ａｌａ ５ｅｒ４日５ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ １１１ｅ コ２５ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｒｇ ２９０ ２９５
３０ＱＡｒ９！Ｅｅｒ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｅｉｅｒ Ｐｒｏ ＨｉＳＬｅｕ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ ｒｌａ Ｌｅｕ：！１０
３１５
３２＋）Ａｌａ ）−１ｉｓ〜・ｇ Ｇｌｙ Ｔｙ
ｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔ＋″ｐ Ｅｉｅｒ Ｇｌｙ Ｈ
ｉｓ Ｇｉｎ：５３０
：ｌ：５５ ３４０Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ｌ２ＬＩ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｉｒ３５ｉ
Ｑ ３５５
３６０＾ｒｇ ｌｉｅ Ｖａ
ｌ Ａｌａ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｉ
ｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｒｇ：５７０
：５７５
３９１）八ｒｃ４ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
３９０ ：５９？；
４００Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓ＝ｒ Ｅｅｒ ＾Ｓｎ
Ｌｓａ Ｐｒｏ Ｓｗｒ ＾１ａνる１表■ （続き ５コ５ｉ ５６０Ａｓ
ｎ Ｔｈｒ νａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ
＾ｌａ ＴｈｒＡｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＡｓｎＧｌｕ Ａｒｇ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｅｉｅｒ Ａｓｎ
Ｐｈｅ ＬｙｓＡｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｒ３ Ｇｌ
ｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ ＧｌｙＴｒｐ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ ｌ１２Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ＾ｓｐ＾ｓＰνａｌ Ｐｈ
ｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ＾ｓｎ Ｔｙｒ７二５ 、
７３０
７３５ ７４０Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ｒ３１ｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉ：ｉｉｎ Ｌｙｓ ｌ１２
ＡｓｐＧｌｕ Ｓｅｒ ＬｙＳＬＥ５Ｕ Ｌｙｓ＾ｌａ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ １１２ ＧＩＵ ＡＳＰ
Ｓｅｒ Ｇ１ｎ７６５
７７０ ７７５
７日０ＡＳｐ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ １．１ｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ７９５
Ｅｌｏｏｌｌ
ｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｆ’ｒ
ｏ＾ｓｎ表■（続き） Ａｒｇ ＣｙＳＡｌａ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌ）／ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒ４３ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｌａ ＾ｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ ｒ３１ｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌ）／ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ ＡＳｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌ２ｕ Ｇｌｕ ＴｒｐＨｌｓ ）
−１ｉｓ Ｅｉｅｒ Ｈｌｓ Ｈｉｓ日４５ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａ１日６５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＧｌｕＢ
日５ Ｇｌｕ Ｌｙｃｉ Ｌｙｓ Ｔｒｐ ＡｒｇＧｌｕ Ａ
ｌａ ＬｙｓＧｌｕ ＳｅｒＡｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｉｌｅ ＡｌａＴｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ ＩＥｌｕ
Ｌｅｕｒｉｌｙ Ａｒｇ ｌ１ｅＰｈｅＴｈｒＦ’
ｈｅ Ａｓｎ ＡＳｎ Ｇｌｙ ＬｅｕＡｓｎ Ｈｉｓ
Ａｒ３ Ｓｅｒ Ｖａ１ｏ２５ Ｖａｌ Ｃ＞’Ｓ Ｆ’＋’ＯＧ１ｙＡｒｇＧｌｙ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＩｌｅＶａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌｌｌ０ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｆ’ｈｅ Ｓｅｒ Ｌ９ＬＩ Ａｓｐ １１ｅ Ｐｈｅ Ｌ）／Ｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａ＋−９３ＬＬ＋ Ｖａｌ ＡＳＰ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｈｉｓ ＡｌａＳｅｒ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｐｒ。
ＴＴ ＧＡ６ＴＧＡＡＴＩＥＩＩ ｅＴＴＧＡＴＡ
Ｔ＾＾ ＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴ ＴＴＴＴＧＧＴＣＩ
２４１ ＋ＥＡＡＣＡＧＴＴＡＡ ＴＴＡＡＣＣＡＡ
ＡＧ ＡＡＴ＾ＧＡＡＧ；：３１０ ３２
０ ：Ｅ：！０４ＥｌＩ ＴＡＴｒｉ
ＴＴＣＡＡＧ ＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴ ＡＣＡＴＴ
ＴＡＴＩ５４１ ＡＧＧＴＧＩＥＧＧＡＴ ＴＴＧ
ＡＴＧＣＣＧＣＧＡＣＴＡＴＣＡＡ丁 ＡＧＴＣＧＴＴ
＾Ｔ＾ ＡＴＧＡＴＴＴＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＡ丁Ｔｂ
１０ ６２１） ６６
０１ ＧＩＥＣＡＡＣＴＡＴＡ ＣＡＧＡＴＴＡＴ
ＧＣＴｒ３Ｔ＾ＣＧＣＴ＋６６１ ＣＣＧＩＥＡＴＴ
ＣＴＡ ［ＥＡＧＡＴＴＧＧＧＴ ＡＡＧＧＴ八Ｔ
Ａ＋へ２１ ＴＴＡＧＡＴＡＴＣＩＥ ＴＴＧＣＴ
ＣＴＧＴＴ ＣＣＣＧＡＡＴＴＡＴ ＧＡＴＡＧＴ
ＡＧＡＡ ＧＡＴＡ丁ＣＣＡＡＴ ＴＣＧＡＡＣＡ
ＧＴ丁９１０ ９２０
９ＥＯ９０１ＡＡＣＡＧＴ＾丁ＡＡ ＣＣＡＴＣＴＡ
ＴＡＣＣ１ＧＡＴＧＣＴＣ＋９６１ ＡＴＡＡＴＧＧ
ＣＴＴ ＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧ ＧＴＴＴＴＣＧＧ
＋１０２１ ＡＴＧＧＧＡＡＡＴＧ ＣＡＧＣＴＣ
ＣＡＣＡ ＡＣ＾ＡＣＧＴ＾′３Ａ ＣＣＡＧＧＡ
丁ＴＴＡ ＣＴＧＧＴＧＧＧＩＥＡ ＣＴＴＡＧＴ
ＴＡＧＡ表■ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｎ ＡＳｎ Ｐｒｏ
ＡＳｎ ｒｌｅ Ａｓｎ２′５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＧＬｙ Ｇ
ｌｕ ＡｒｇＳｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｉｎ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＳｅｒＶａｌ Ａｓ
ｐ ｌｉｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈ
ｅＧｌｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＡＳｎ Ｇｉ
ｎ Ａｒｇ Ｉ１２Ｑ５ ＧＬｕ Ｇｌｙ ＬｅｕＳｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ ＧｉｎＰｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｒｇ ＧｌｕＬｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
＾ｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＰｈｅＴｙ
ｒ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ａｌｃｓ、Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ｈ１ｓＢ５ ＾ｒ９Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｔｈｒ１３１ｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａ１Ｐｒｏ ＡＳＰ Ｓｅｒ
Ａｒｇ＾Ｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｃ
１ｎ Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａ１Ｌ！？ｕ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ ＾ｌ’９ 丁ｙｒ Ｐｒｏ Ｉ
ｌｅ ＾ｒ−９Ｔｈｒ Ｖａ１Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ＾ｒ９Ｇｌｕ ｌ１ｅＴｙｒ Ｔｈｒ−＾
ｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ＾ｓｎ Ｐｈｅ
＾ｓｐ Ｇｌｙ ｓｅｔ’ Ｐｈｅ４〇 − 表■（続き） Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｅｈｎ Ｓ２ｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒｌｌｅ Ｍ
ｅｔ ＾ｌａ ＳｅｒＭｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ
八１ａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ５ｅｒＳｅｒ Ｖａ
ｌ Ｌ＝ｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ ５ｅｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｎ ５ｅｒ Ａ；ｎ Ｓｅｒ ５ｅｒＧｌｕ Ｆ’ｈ
ｅ Ａｃ１ｎ ＡｓｎＰｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ ５ｅｒＰｒｏ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ ＥｉｅｒＧｉｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｕ １１ｅ Ｔｙｒ ＴｈＬ＋ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｆ’ｒｏ Ｇｉｎ ＧｉｎＴｈｒ Ｌ
ｅｕ 丁ｙｒ Ａｒ６３日３ ＋３１ｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｆｈｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｈｉｓ νａｌ Ｓｅｒ ｒ１１？ １１ｅ１１！！ Ｉｌ
ｅ Ａｌａ ５ｅｒ４日５ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ １１１ｅ コ２５ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｒｇ ２９０ ２９５
３０ＱＡｒ９！Ｅｅｒ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｅｉｅｒ Ｐｒｏ ＨｉＳＬｅｕ Ｍ
ｅｔ Ａｓｐ ｒｌａ Ｌｅｕ：！１０
３１５
３２＋）Ａｌａ ）−１ｉｓ〜・ｇ Ｇｌｙ Ｔｙ
ｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔ＋″ｐ Ｅｉｅｒ Ｇｌｙ Ｈ
ｉｓ Ｇｉｎ：５３０
：ｌ：５５ ３４０Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ｌ２ＬＩ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｉｒ３５ｉ
Ｑ ３５５
３６０＾ｒｇ ｌｉｅ Ｖａ
ｌ Ａｌａ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｉ
ｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｒｇ：５７０
：５７５
３９１）八ｒｃ４ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
３９０ ：５９？；
４００Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓ＝ｒ Ｅｅｒ ＾Ｓｎ
Ｌｓａ Ｐｒｏ Ｓｗｒ ＾１ａνる１表■ （続き ５コ５ｉ ５６０Ａｓ
ｎ Ｔｈｒ νａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ
＾ｌａ ＴｈｒＡｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＡｓｎＧｌｕ Ａｒｇ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｅｉｅｒ Ａｓｎ
Ｐｈｅ ＬｙｓＡｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｒ３ Ｇｌ
ｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ ＧｌｙＴｒｐ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ ｌ１２Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ＾ｓｐ＾ｓＰνａｌ Ｐｈ
ｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ＾ｓｎ Ｔｙｒ７二５ 、
７３０
７３５ ７４０Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ｒ３１ｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉ：ｉｉｎ Ｌｙｓ ｌ１２
ＡｓｐＧｌｕ Ｓｅｒ ＬｙＳＬＥ５Ｕ Ｌｙｓ＾ｌａ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ １１２ ＧＩＵ ＡＳＰ
Ｓｅｒ Ｇ１ｎ７６５
７７０ ７７５
７日０ＡＳｐ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ １．１ｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ７９５
Ｅｌｏｏｌｌ
ｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｆ’ｒ
ｏ＾ｓｎ表■（続き） Ａｒｇ ＣｙＳＡｌａ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌ）／ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒ４３ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｌａ ＾ｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ ｒ３１ｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌ）／ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ ＡＳｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌ２ｕ Ｇｌｕ ＴｒｐＨｌｓ ）
−１ｉｓ Ｅｉｅｒ Ｈｌｓ Ｈｉｓ日４５ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａ１日６５ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＧｌｕＢ
日５ Ｇｌｕ Ｌｙｃｉ Ｌｙｓ Ｔｒｐ ＡｒｇＧｌｕ Ａ
ｌａ ＬｙｓＧｌｕ ＳｅｒＡｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ
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Ｌｅｕｒｉｌｙ Ａｒｇ ｌ１ｅＰｈｅＴｈｒＦ’
ｈｅ Ａｓｎ ＡＳｎ Ｇｌｙ ＬｅｕＡｓｎ Ｈｉｓ
Ａｒ３ Ｓｅｒ Ｖａ１ｏ２５ Ｖａｌ Ｃ＞’Ｓ Ｆ’＋’ＯＧ１ｙＡｒｇＧｌｙ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＩｌｅＶａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌｌｌ０ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｆ’ｈｅ Ｓｅｒ Ｌ９ＬＩ Ａｓｐ １１ｅ Ｐｈｅ Ｌ）／Ｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａ＋−９３ＬＬ＋ Ｖａｌ ＡＳＰ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｈｉｓ ＡｌａＳｅｒ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｐｒ。
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ＬｅｕＳｅｒ ＣｙＳ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌ９ＬＩ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒ。
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌ９ＬＩ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒ。
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ １１ｅ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ
８１５ 日２０Ａ
ｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ” ０７％ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇ
ｌｙ ｒ３１ｕ１１ｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｃｙ
−Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ日５５
８６０Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ
＋３１ｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｒｇ８７５
日日０Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａ１日９５
９００Ｌｙｓ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ ｌ
１ｅＰｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｔｙ
ｒ ＡＳｐ Ｇ１ｎＡｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ ｌ１ｅ９５５ｉ
９６０Ａｌａ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ９７５
’９８０Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｒ９ＡＳｎ Ｖａ
ｌ １１ｅ ＬｙｓＶａｌ ＬｙｓＧｌｙ ＨｉｓＶ
ａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｃ１１ｕＧｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｅｉｅｒ Ｇ１ｎ０Ａ
ｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
ＧｌｙＡＳｎ ＡＳｎ Ｔｌｙ Ａｓｐ ＩＥｌｕ
ＬＥＩＩＪ Ｌｙｓ Ｆ’ｈｅＴｔｙ Ｖａｌ Ｔｌｙ
ＣｙＳＡＳｎ ＡＳｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ表■ （続き） Ａｒ９Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ１１１５ １
１２Ｏ５２ｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ５／
９； Ａｌａ ＴｙｒＡｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ
１Ｅ１ｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＭｅｔＭｅｔ
Ａｓｐ Ａｓｎ ＡＳｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ａｓｎ １Ｅ１ｕ Ｃｙｅ； 工１１ｉ’ Ｐｒ。
ｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ” ０７％ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇ
ｌｙ ｒ３１ｕ１１ｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｃｙ
−Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ日５５
８６０Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ
＋３１ｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｒｇ８７５
日日０Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａ１日９５
９００Ｌｙｓ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ ｌ
１ｅＰｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｔｙ
ｒ ＡＳｐ Ｇ１ｎＡｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ ｌ１ｅ９５５ｉ
９６０Ａｌａ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ９７５
’９８０Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｒ９ＡＳｎ Ｖａ
ｌ １１ｅ ＬｙｓＶａｌ ＬｙｓＧｌｙ ＨｉｓＶ
ａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｃ１１ｕＧｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｅｉｅｒ Ｇ１ｎ０Ａ
ｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
ＧｌｙＡＳｎ ＡＳｎ Ｔｌｙ Ａｓｐ ＩＥｌｕ
ＬＥＩＩＪ Ｌｙｓ Ｆ’ｈｅＴｔｙ Ｖａｌ Ｔｌｙ
ＣｙＳＡＳｎ ＡＳｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ表■ （続き） Ａｒ９Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ１１１５ １
１２Ｏ５２ｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ５／
９； Ａｌａ ＴｙｒＡｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ
１Ｅ１ｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＭｅｔＭｅｔ
Ａｓｐ Ａｓｎ ＡＳｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ａｓｎ １Ｅ１ｕ Ｃｙｅ； 工１１ｉ’ Ｐｒ。
ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＡＣＡＡＴ ＣＣＧ ＡＡ
ＣＡＴＣＡＡＴ ＧＡＡ ＴＧＣ＾ＴＴ ＣＣＴ
ＴＣＧ ＣＴＡ ＡＣｒ３ ＣＡＡ ＴＴＴ ０
１丁 ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＴ
Ｔ Ｃ口ＣＣＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ’ ＧＣＴ
ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ｒｉＣＡ
ＧＴＴ ＣＡＡ ＡＡＴ表■ （続き） 二日５ ３二５ ：５４５ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｕ ＰｈｅＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＡＣＧＧＧ
ＡＣＡ ＧＡＡ ＴＴＴ表■ （続き） ５０〔１ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｆ’ｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ
＾ｌａ ＴｈｒＴＣＣＡＴＴ ＴＴＴ ７口口
ＡＡＴ ＡＣＡ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ
Ａ口Ａ ＧＣＴ ＾ＣＧ５ｉ７０
５７５
５８０＾ｓｐ ＰｈｅｌＥｌｙ ＴｙｒＦ’
ｈｅ ＧＩＬＩ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｆ
’ｈｅ ＴｈｒＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡ丁
ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＣＴ ＴＴＴ ＡＣＡ表■ （続き） ６０（〕 ７０（＋ ７二〇 ７９５ ＢＯＯｌｌ
ｅ Ｇｌｙ ＬｙＳＣ７５Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ ＾
５ｎＡＴＣＧＧＡ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＧＡ
ｒ３ＡＧ ＣＣＧ ＡＡＴ表■ （続き） ８日５
ＣＡＴＣＡＡＴ ＧＡＡ ＴＧＣ＾ＴＴ ＣＣＴ
ＴＣＧ ＣＴＡ ＡＣｒ３ ＣＡＡ ＴＴＴ ０
１丁 ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＴ
Ｔ Ｃ口ＣＣＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ’ ＧＣＴ
ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ｒｉＣＡ
ＧＴＴ ＣＡＡ ＡＡＴ表■ （続き） 二日５ ３二５ ：５４５ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｕ ＰｈｅＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＡＣＧＧＧ
ＡＣＡ ＧＡＡ ＴＴＴ表■ （続き） ５０〔１ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｆ’ｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ
＾ｌａ ＴｈｒＴＣＣＡＴＴ ＴＴＴ ７口口
ＡＡＴ ＡＣＡ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ
Ａ口Ａ ＧＣＴ ＾ＣＧ５ｉ７０
５７５
５８０＾ｓｐ ＰｈｅｌＥｌｙ ＴｙｒＦ’
ｈｅ ＧＩＬＩ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｆ
’ｈｅ ＴｈｒＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡ丁
ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＣＴ ＴＴＴ ＡＣＡ表■ （続き） ６０（〕 ７０（＋ ７二〇 ７９５ ＢＯＯｌｌ
ｅ Ｇｌｙ ＬｙＳＣ７５Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ ＾
５ｎＡＴＣＧＧＡ ＡＡＧ ＴＧＴ ＧＧＡ
ｒ３ＡＧ ＣＣＧ ＡＡＴ表■ （続き） ８日５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、表IIに示されるアミノ酸配列を有するバシルスチュ
ーリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ＝Ｂ．ｔ．）毒素をコードしたＤＮＡ。 ２、表 I に示されたヌクレオチド配列を有する特許請
求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ３、上記配列がストップコドンで停止している表 I に
示されたヌクレオチド配列を有する特許請求の範囲第１
項に記載のＤＮＡ。 ４、表IIに示されるアミノ酸配列を有する鱗翅類の昆虫
に対して活性のある毒素、及び蛋白質の二次構造を変化
させない、又は蛋白質の二次構造が変化していたとして
も生物活性がある程度保持されているその突然変異体。 ５、表IIに示されたアミノ酸配列に対しコードするヌク
レオチド配列の全て又は一部を有するＤＮＡを含んでい
る組み替えＤＮＡ運搬ベクター。 ６、原核宿主又は真核宿主中に移され、そして複製され
る特許請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ運搬ベクター。 ７、表IIに示されるアミノ酸配列を有するＢ．ｔ．毒素
を表現するように形質転換された細菌宿主。 ８、表IIに示されるアミノ酸配列を有するＢ．ｔ．毒素
をコードするＢ．ｔ．毒素遺伝子を含有するプラスミド
ベクターで形質転換された特許請求の範囲第７項に記載
のシュードモナスフルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）。 ９、特許請求の範囲第８項に記載のシュードモナスフル
オレスセンスであるＮＲＲＬＢ−１８２９２の同定特性
を有するシュードモナスフルオレスセンス（ｐＭ２、１
６−１１）。 １０、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ア
ゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニ
ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）
、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、リゾビウム
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏ
ｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウス（Ｍ
ｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウム（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又はアルカリゲネス（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ）の種である特許請求の範囲第７項に記載
の微生物。 １１、上記微生物が色素を有し、そしてフィロプレイン
（Ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎｅ：葉の表面）に付着している
特許請求の範囲第１０項に記載の微生物。 １２、特許請求の範囲第１０項に記載の微生物を鱗翅類
昆虫又はその昆虫の環境に投与することからなる鱗翅類
昆虫を抑制する方法。 １３、上記投与がリゾスフェア（根のまわり）になされ
る特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４、上記投与がフィロプレイン（葉の表面）になされ
る特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５、投与が水の中になされる特許請求の範囲第１２項
に記載の方法。 １６、標的害虫の環境に適用されたときに長い殺虫活性
を有する実質的に無傷の処理された細胞を含んでいる殺
虫剤を含み、上記殺虫剤が鱗翅類昆虫に毒性を有するポ
リペプチドであり、細胞内部のものであって、表IIに示
されるアミノ酸配列を有するＢ．ｔ．毒素を表現する能
力のある形質転換された微生物の表現の結果生じるもの
である殺虫剤組成物。 １７、上記処理された細胞が、環境中で殺虫活性を長期
化させるために化学的又は物理的な手段で処理されてい
る特許請求の範囲第１６項に記載の殺虫組成物。 １８、上記細胞が、原子核細胞又は低級真核細胞である
特許請求の範囲第１７項に記載の殺虫組成物。 １９、上記原核細胞がエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バシラセアエ（
Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、リゾビセアエ（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉａｃｅａｅ）、スピリラセアエ（Ｓｐｉｒｉｌｌａ
ｃｅａｅ）、ラクトバシラセアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌａｃｅａｅ）、シユードモナダセアエ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾトバクテラセアエ（Ａ
ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）及びニトロバクテラ
セアエ（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）からなる
群から選ばれる特許請求の範囲第１８項に記載の殺虫組
成物。 ２０、上記低級真核細胞が双状菌類、子嚢菌類、及び担
子菌類からなる群から選ばれる特許請求の範囲第１８項
に記載の殺虫組成物。 ２１、上記細胞が色素を有した細菌、酵母、又は菌類（
フンガス）である特許請求の範囲第１６項に記載の殺虫
組成物。 ２２、表IIに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド毒素に対しコードする鱗翅類昆虫に毒性を有するバシ
ルスチューリンゲンシス毒素遺伝子の表現の結果である
細胞内の毒素を含有する処理された実質的に無傷の単細
胞微生物細胞であって、この細胞が標的昆虫の環境に適
用されたときに長期化された殺虫活性をもたらす条件下
に処理されている細胞。 ２３、細胞が環境中に於て殺虫活性を長期化させるため
に化学的又は物理的手段で処理されている特許請求の範
囲第２２項に記載の細胞。 ２４、上記微生物がシュードモナスであり、上記毒素が
表IIに示されるアミノ酸配列を有するＢ．ｔ．毒素であ
る特許請求の範囲第２２項に記載の細胞。 ２５、上記細胞がヨウ素で処理されたものである特許請
求の範囲第２４項に記載のシュードモナス細胞。 ２６、シュードモナスフルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｄｎｓ）である特許請
求の範囲第２２項に記載の細胞。 ２７、シュードモナスフルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｄｎｓ）（ｐＭ２、１
６−１１）である特許請求の範囲第２６項に記載の細胞
。 ２８、ｐＫＫ２、ｐＫＫ７３ＢＢ−９、ｐＫＫ１−７３
、ｐ１、１２３−１、ｐ１、１３０−６及びｐＭ２、１
６−１１からなる群から選ばれるプラスミド。 ２９、特許請求の範囲第２８項に記載のｐＭ２、１６−
１１であるプラスミド。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JPH0829100B2 JPH0829100B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
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- 1989-01-20 JP JP1013021A patent/JPH0829100B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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