JP3464217B2 - 鱗翅類害虫の防除方法 - Google Patents
鱗翅類害虫の防除方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
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Description
【発明の詳細な説明】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は放棄されている1991年１月16日に出願された
米国出願番号07/642,112の一部係属出願である1991年９
月12日に出願した米国出願07/758,020の一部係属出願で
ある。07/758,020は1991年２月21日に出願された米国出
願第07/658,935の一部係属出願でもある。
米国出願番号07/642,112の一部係属出願である1991年９
月12日に出願した米国出願07/758,020の一部係属出願で
ある。07/758,020は1991年２月21日に出願された米国出
願第07/658,935の一部係属出願でもある。
発明の背景
土壌微生物バシルスチューリンゲンシス（B.t.）はグ
ラム陽性の胞子形成性細菌であって、パラ胞子性結晶性
蛋白質封入物によって特徴付けられる。これらは顕微鏡
で一つ一つに区別された形状の結晶として見えることが
多い。この蛋白質は害虫に毒性であり、それらの活性は
特異的である。この毒素遺伝子は単離され、配列が決定
され、組替えDNAに基づくB.t.生成物がつくられ認めら
れている。さらに遺伝子工学技術の使用でB.t.エンドト
キシン（内毒素）を農業環境に送り込むための新方法が
現在開発中であり、これらには昆虫抵抗性を持たせるた
めに内毒素遺伝子で遺伝子工学処理された植物の使用、
及びB.t.内毒素配達ビヒクルとして安定化された無傷の
（細胞壁が破壊されていない）微生物細胞の使用が含ま
れる（ガートナー,F.H.、L.キム［1988］TIBTECH 6:S4
−S7）。従って単離されたB.t.内毒素遺伝子は商業的に
貴重なものとなりつつある。
ラム陽性の胞子形成性細菌であって、パラ胞子性結晶性
蛋白質封入物によって特徴付けられる。これらは顕微鏡
で一つ一つに区別された形状の結晶として見えることが
多い。この蛋白質は害虫に毒性であり、それらの活性は
特異的である。この毒素遺伝子は単離され、配列が決定
され、組替えDNAに基づくB.t.生成物がつくられ認めら
れている。さらに遺伝子工学技術の使用でB.t.エンドト
キシン（内毒素）を農業環境に送り込むための新方法が
現在開発中であり、これらには昆虫抵抗性を持たせるた
めに内毒素遺伝子で遺伝子工学処理された植物の使用、
及びB.t.内毒素配達ビヒクルとして安定化された無傷の
（細胞壁が破壊されていない）微生物細胞の使用が含ま
れる（ガートナー,F.H.、L.キム［1988］TIBTECH 6:S4
−S7）。従って単離されたB.t.内毒素遺伝子は商業的に
貴重なものとなりつつある。
バシルスチューリンゲンシスは感受性の昆虫宿主によ
って摂取されたときに毒性である蛋白質性のパラ胞子又
は結晶を製造する。過去30年間にわたってB.t.殺虫剤の
商業的な使用は主として鱗翅類（キャタピラー）害虫の
狭い範囲に制限されてきた。バシルスチューリンゲンシ
ス subsp.クルスタキの胞子と結晶の調製物が鱗翅類害
虫の商業的な殺虫剤として何年も使用されている。例え
ばB.チューリンゲンシス var.クルスタキ HD−１は数
多くの鱗翅類昆虫の幼虫に毒性であるデルタエンドトキ
シンと呼ばれる結晶を造る。
って摂取されたときに毒性である蛋白質性のパラ胞子又
は結晶を製造する。過去30年間にわたってB.t.殺虫剤の
商業的な使用は主として鱗翅類（キャタピラー）害虫の
狭い範囲に制限されてきた。バシルスチューリンゲンシ
ス subsp.クルスタキの胞子と結晶の調製物が鱗翅類害
虫の商業的な殺虫剤として何年も使用されている。例え
ばB.チューリンゲンシス var.クルスタキ HD−１は数
多くの鱗翅類昆虫の幼虫に毒性であるデルタエンドトキ
シンと呼ばれる結晶を造る。
しかし近年研究者等はB.t.殺虫剤であって、より広い
範囲の害虫に対し特異性を有するものを発見した。例え
ばB.t.の他の種、即ちイスラエレンシス及びサンジエゴ
（a.k.a. B.t.テネブリオニス（tenebrionis）、a.k.a.
M−７）がそれぞれ双翅類と鞘翅類の目の昆虫を抑制す
る為に商業的に使用されている（ガートナー,F.H.［198
9］「殺虫蛋白質の細胞配達系：生きた及び生きていな
い微生物」コントロールド デリバリー オブ クロッ
プ プロテクション エージェンツ（Controlled Deliv
ery of Crop Protection Agents）中、R.M.ウィルキン
ス編、テイラー及びフランシス、ニューヨーク及びロン
ドン、1990、245−255頁）。またコーチ,T.L.（1980）
「バシルスチューリンゲンシス var.イスラエレンシス
の蚊への病原性」デベロップメンツ イン インダスト
リアル マイクロバイオロジー（Developments in Indu
strial Microbiology）22:61:−76;ビーグル,C.C.,（19
78）「農業生態系における虫生細菌の使用」デベロップ
メンツ イン インダストリアル マイクロバイオロジ
（Developments in Industrial Microbiology）−20:97
−104。クリーグ A.,A.M.ハンガー、G.A.ランゲンブル
ヒ、W.シュネッター（1983）Z.ang.Ent.96:500−508は
バシルスチューリンゲンシス var.テネブリオニスと命
名されるB.t.単離体を記載しており、これは報告による
と鱗翅目の２つの甲虫に対し活性である。これらはコロ
ラドじゃがいもはむし（Colorado potato beetle）のレ
プチノタルサ デセムリネアタ（Leptinotarsa decemli
neata）及びアゲラスチカ アルニ（Agelastica alni）
である。
範囲の害虫に対し特異性を有するものを発見した。例え
ばB.t.の他の種、即ちイスラエレンシス及びサンジエゴ
（a.k.a. B.t.テネブリオニス（tenebrionis）、a.k.a.
M−７）がそれぞれ双翅類と鞘翅類の目の昆虫を抑制す
る為に商業的に使用されている（ガートナー,F.H.［198
9］「殺虫蛋白質の細胞配達系：生きた及び生きていな
い微生物」コントロールド デリバリー オブ クロッ
プ プロテクション エージェンツ（Controlled Deliv
ery of Crop Protection Agents）中、R.M.ウィルキン
ス編、テイラー及びフランシス、ニューヨーク及びロン
ドン、1990、245−255頁）。またコーチ,T.L.（1980）
「バシルスチューリンゲンシス var.イスラエレンシス
の蚊への病原性」デベロップメンツ イン インダスト
リアル マイクロバイオロジー（Developments in Indu
strial Microbiology）22:61:−76;ビーグル,C.C.,（19
78）「農業生態系における虫生細菌の使用」デベロップ
メンツ イン インダストリアル マイクロバイオロジ
（Developments in Industrial Microbiology）−20:97
−104。クリーグ A.,A.M.ハンガー、G.A.ランゲンブル
ヒ、W.シュネッター（1983）Z.ang.Ent.96:500−508は
バシルスチューリンゲンシス var.テネブリオニスと命
名されるB.t.単離体を記載しており、これは報告による
と鱗翅目の２つの甲虫に対し活性である。これらはコロ
ラドじゃがいもはむし（Colorado potato beetle）のレ
プチノタルサ デセムリネアタ（Leptinotarsa decemli
neata）及びアゲラスチカ アルニ（Agelastica alni）
である。
最近多くの新しいB.t.のサブスピーシーズ（亜種）が
同定されており、活性のδ−エンドトキシン蛋白質に対
し役割を持っている多くの遺伝子が単離されている（ホ
フテ,H.,H.R.ホワイトレー［1989］マイクロバイオロジ
カル レビューズ（Microbiological Reviews）52
（２）:242−255）。ホフテ及びホワイトレーは42個の
B.t.結晶蛋白質遺伝子を14の区別できる遺伝子に分類
し、アミノ酸配列及び宿主範囲に基づいて４つの主要な
クラスにグループ分けした。これらのクラスはCry I
（鱗翅目特異性）、Cry II（鱗翅目及び双翅目特異
性）、Cry III（鞘翅目特異性）及びCry IV（双翅目特
異性）である。原生動物病原菌、動物寄生性の肝臓吸虫
（トレマトダ）又はダニ（アカリ）に特異的に毒性の菌
株の発見はさらに可能性あるB.t.生成物スペクトラムを
広げた。独特の標的に対する活性を有することによって
これらの新規な菌株は非常の高い生物特異性を保持し、
非標的生物は影響を受けずにすむ。多くの多様なB.t.毒
素の入手可能なことは又、B.t.抵抗性の害虫が生じる危
険性を最少にする生成物使用戦略を採用することを農業
従事者に可能にし得る。
同定されており、活性のδ−エンドトキシン蛋白質に対
し役割を持っている多くの遺伝子が単離されている（ホ
フテ,H.,H.R.ホワイトレー［1989］マイクロバイオロジ
カル レビューズ（Microbiological Reviews）52
（２）:242−255）。ホフテ及びホワイトレーは42個の
B.t.結晶蛋白質遺伝子を14の区別できる遺伝子に分類
し、アミノ酸配列及び宿主範囲に基づいて４つの主要な
クラスにグループ分けした。これらのクラスはCry I
（鱗翅目特異性）、Cry II（鱗翅目及び双翅目特異
性）、Cry III（鞘翅目特異性）及びCry IV（双翅目特
異性）である。原生動物病原菌、動物寄生性の肝臓吸虫
（トレマトダ）又はダニ（アカリ）に特異的に毒性の菌
株の発見はさらに可能性あるB.t.生成物スペクトラムを
広げた。独特の標的に対する活性を有することによって
これらの新規な菌株は非常の高い生物特異性を保持し、
非標的生物は影響を受けずにすむ。多くの多様なB.t.毒
素の入手可能なことは又、B.t.抵抗性の害虫が生じる危
険性を最少にする生成物使用戦略を採用することを農業
従事者に可能にし得る。
大腸菌中でB.t.結晶蛋白質遺伝子のクローニング及び
発現をすることは出版された文献に記載されている（シ
ュネフ,H.E.,H.R.ホイットレー［1981］Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78:2893−2897）。米国特許4,448,885及び米
国特許4,467,036は両方とも大腸菌におけるB.t.結晶蛋
白質の発現を開示している。米国特許4,583,331は種々
の環境に於いて鞘翅類害虫を抑制するのに使用できるB.
チューリンゲンシス菌株サンジエゴ（a.k.a. B.t.テネ
ブリオニス、a.k.a. M−７）を開示している。米国特許
第4,849,217はアルファルファウィービル（ゾウ虫）に
対し活性のバシルスチューリンゲンシス単離体を開示し
ている。開示されている単離体の一つはバシルスチュー
リンゲンシスPS86A1（NRRL B−18400）である。
発現をすることは出版された文献に記載されている（シ
ュネフ,H.E.,H.R.ホイットレー［1981］Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78:2893−2897）。米国特許4,448,885及び米
国特許4,467,036は両方とも大腸菌におけるB.t.結晶蛋
白質の発現を開示している。米国特許4,583,331は種々
の環境に於いて鞘翅類害虫を抑制するのに使用できるB.
チューリンゲンシス菌株サンジエゴ（a.k.a. B.t.テネ
ブリオニス、a.k.a. M−７）を開示している。米国特許
第4,849,217はアルファルファウィービル（ゾウ虫）に
対し活性のバシルスチューリンゲンシス単離体を開示し
ている。開示されている単離体の一つはバシルスチュー
リンゲンシスPS86A1（NRRL B−18400）である。
発明の簡単なまとめ
本発明は鱗翅類害虫を抑制するための新規な方法に関
する。この方法はある種の鞘翅類活性B.t.単離体が鱗翅
類害虫、例えばダイアモンドバックモス（プルテラ ク
シロステラ Plutella xylostella）に活性を有すると
いう予想外の発見から生じた。この発見はバシルスチュ
ーリンゲンシス var.テネブリオニス（上記クリーグ
等）（以後Ｍ−７と呼ぶ）等の既知の鞘翅類活性単離体
は鱗翅類に毒性ではないから特に驚くべきことである。
する。この方法はある種の鞘翅類活性B.t.単離体が鱗翅
類害虫、例えばダイアモンドバックモス（プルテラ ク
シロステラ Plutella xylostella）に活性を有すると
いう予想外の発見から生じた。この発見はバシルスチュ
ーリンゲンシス var.テネブリオニス（上記クリーグ
等）（以後Ｍ−７と呼ぶ）等の既知の鞘翅類活性単離体
は鱗翅類に毒性ではないから特に驚くべきことである。
より詳しくは本発明は鱗翅類害虫を抑制するためにB.
t.微生物またはその変種、及び／又はそれらの毒素を使
用する方法である。本発明に従って有用な特定のB.t.微
生物はB.t.PS86A1、B.t.PS50C、及びB.t.PS43Fである。
さらに本発明はまた特定して例示したB.t.単離体と実質
的に同じ鱗翅類活性性質を有している本発明のB.t.単離
体の変種の使用を含んでいる。突然変異体を造る手順は
微生物技術で良く知られている。紫外線光及びニトロソ
グアニジンはこの目的のために広範囲に使用されてい
る。
t.微生物またはその変種、及び／又はそれらの毒素を使
用する方法である。本発明に従って有用な特定のB.t.微
生物はB.t.PS86A1、B.t.PS50C、及びB.t.PS43Fである。
さらに本発明はまた特定して例示したB.t.単離体と実質
的に同じ鱗翅類活性性質を有している本発明のB.t.単離
体の変種の使用を含んでいる。突然変異体を造る手順は
微生物技術で良く知られている。紫外線光及びニトロソ
グアニジンはこの目的のために広範囲に使用されてい
る。
本発明は鱗翅類活性毒素をコードする本発明のB.t.単
離体からの遺伝子の使用を含んでいる。
離体からの遺伝子の使用を含んでいる。
更に本発明はまた、実質的に無傷の細胞（細胞壁が破
壊されていない細胞）が標的害虫の環境に適用された時
に対鱗翅類活性を長期化させるために本発明の遺伝子を
含有している実質的に無傷のB.t.細胞及び組替え細胞を
処理することを含んでいる。そのような処理はこの技術
が殺虫剤の性質に悪影響をせず、また殺虫剤を保護して
いる細胞の能力を減少させない限り化学的又は物理的手
段、又は化学的及び物理的手段の組合せであり得る。処
理された細胞は殺虫毒素の為の保護コートとして作用す
る。毒素は標的昆虫によって摂取されるとそのまま作用
するために利用できるようになる。
壊されていない細胞）が標的害虫の環境に適用された時
に対鱗翅類活性を長期化させるために本発明の遺伝子を
含有している実質的に無傷のB.t.細胞及び組替え細胞を
処理することを含んでいる。そのような処理はこの技術
が殺虫剤の性質に悪影響をせず、また殺虫剤を保護して
いる細胞の能力を減少させない限り化学的又は物理的手
段、又は化学的及び物理的手段の組合せであり得る。処
理された細胞は殺虫毒素の為の保護コートとして作用す
る。毒素は標的昆虫によって摂取されるとそのまま作用
するために利用できるようになる。
最後に本発明は更に、鱗翅類活性毒をコードする遺伝
子で形質転換された植物に関している。
子で形質転換された植物に関している。
配列の簡単な記載
SEQ ID No.1は50Cと命名される遺伝子のヌクレオチド
配列（オープンリーディングフレームのみ）である。
配列（オープンリーディングフレームのみ）である。
SEQ ID No.2は毒素50Cの予測アミノ酸配列である。
SEQ ID No.3は43Fと命名される遺伝子の複合化したヌ
クレオチドとアミノ酸の配列である。
クレオチドとアミノ酸の配列である。
SEQ ID No.4は毒素43Fの予測されるアミノ酸配列であ
る。
る。
SEQ ID No.5は86A1と命名される遺伝子のヌクレオチ
ド配列（オープンリーディングフレームのみ）である。
ド配列（オープンリーディングフレームのみ）である。
SEQ ID No.6は毒素86A1の予測アミノ酸配列である。
SEQ ID No.7は86A1−Ａと命名されるオリゴヌクレオ
チドプローブである。
チドプローブである。
本発明の詳細な開示
本発明に従う有用なバシラス・チューリンゲンシス単
離体は、生物学的に純粋な形態で以下の特性をもつ。
離体は、生物学的に純粋な形態で以下の特性をもつ。
B.t.PS50Cの特徴
集落形態−−B.t.に典型的な、大集落で表面はくすん
でいる。
でいる。
増殖期の細胞形態−−B.t.に典型的。
培養方法−−B.t.に典型的な方法。
鞭毛の血清型−−PS50Cはセロタイプ18,クマモトエン
シスに属する。
シスに属する。
結晶の形態−−球。
RFLP分析−−全DNAのサザンハイブリダイゼーション
により、PS50CはB.t.s.d.及び他のB.t.単離体と区別さ
れる。
により、PS50CはB.t.s.d.及び他のB.t.単離体と区別さ
れる。
アルカリ可溶性蛋白質−−SDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS−PAGE）は130kDa（キロダルトン）の
ダブレットの蛋白質を示す。
ル電気泳動（SDS−PAGE）は130kDa（キロダルトン）の
ダブレットの蛋白質を示す。
コロニー形態、成長細胞の形態、及び培養方法に関す
るB.t.PS86A1の特徴はB.t.PS50Cについて上に与えられ
る通りである。しかしこれらの単離体は表１に示される
ように封入物、血清型及び毒素の分子量に関し異なる。
るB.t.PS86A1の特徴はB.t.PS50Cについて上に与えられ
る通りである。しかしこれらの単離体は表１に示される
ように封入物、血清型及び毒素の分子量に関し異なる。
B.t.PS43Fは米国特許特許4,996,155に記載されてい
る。
る。
本発明のB.チューリンゲンシス菌株の特徴を既知のB.
t.菌株B.チューリンゲンシス var.テネブリオニス（Ｍ
−７）及びB.チューリンゲンシス var.クルスタキ（HD
−１）の特徴と比較したものが表１に示される。
t.菌株B.チューリンゲンシス var.テネブリオニス（Ｍ
−７）及びB.チューリンゲンシス var.クルスタキ（HD
−１）の特徴と比較したものが表１に示される。
本発明に従う有用なB.t.単離体は寄託されている。又
興味あるB.t.遺伝子を含む組替え微生物が寄託されてい
る。 培養基 寄託番号 寄託日 バシラス・チューリンゲンシスPS50C NRRL B−18746 1991年１月９日 大腸菌NM522［pMYC1638］ NRRL B−18751 1991年１月11日 バシラス・チューリンゲンシスPS86A1 NRRL B−18400 1988年８月16日 大腸菌NM522［pMYC2320］ NRRL B−18769 1991年２月14日 バシラス・チューリンゲンシスPS43F NRRL B−18298 1988年２月２日 大腸菌XL1−Blue［pM1,98−４］ NRRL B−18291 1988年１月15日 本出願に開示される培養基はアメリカ合衆国61604イ
リノイ州ペオリア、ノースユニバーシティーストリート
1815のノーザンリージョナルリサーチセンター，アグリ
カルチュラルリサーチサービスパテントカルチャーコレ
クション（NRRL）に寄託されている。
興味あるB.t.遺伝子を含む組替え微生物が寄託されてい
る。 培養基 寄託番号 寄託日 バシラス・チューリンゲンシスPS50C NRRL B−18746 1991年１月９日 大腸菌NM522［pMYC1638］ NRRL B−18751 1991年１月11日 バシラス・チューリンゲンシスPS86A1 NRRL B−18400 1988年８月16日 大腸菌NM522［pMYC2320］ NRRL B−18769 1991年２月14日 バシラス・チューリンゲンシスPS43F NRRL B−18298 1988年２月２日 大腸菌XL1−Blue［pM1,98−４］ NRRL B−18291 1988年１月15日 本出願に開示される培養基はアメリカ合衆国61604イ
リノイ州ペオリア、ノースユニバーシティーストリート
1815のノーザンリージョナルリサーチセンター，アグリ
カルチュラルリサーチサービスパテントカルチャーコレ
クション（NRRL）に寄託されている。
本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の下に特許庁
長官が権原ありと認める者が本特許出願の係属中に培養
基を入手できることを保証されるという条件下に寄託さ
れた。また、本出願又はその子孫の対応特許出願が提出
されている国々の外国特許法で要求されるならば、寄託
物は入手できる。しかし、寄託物が入手できるからとい
って、行政行為によって付与された特許権を損わしめて
本発明を実施する権利を構成するものではないことを理
解すべきである。
長官が権原ありと認める者が本特許出願の係属中に培養
基を入手できることを保証されるという条件下に寄託さ
れた。また、本出願又はその子孫の対応特許出願が提出
されている国々の外国特許法で要求されるならば、寄託
物は入手できる。しかし、寄託物が入手できるからとい
って、行政行為によって付与された特許権を損わしめて
本発明を実施する権利を構成するものではないことを理
解すべきである。
更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約
の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされ
る。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日か
ら少なくとも30年間か、又は培養期を開示して発行され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関するすべ
ての制限は、これらを開示した特許が付与されると永久
に取り除かれる。
の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされ
る。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請
求後少なくとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日か
ら少なくとも30年間か、又は培養期を開示して発行され
る特許の権利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生
育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあら
ゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託施設
が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関するすべ
ての制限は、これらを開示した特許が付与されると永久
に取り除かれる。
本発明の鱗翅類毒素は、既知の方法で単離出来、広範
囲の微生物宿主へ導入できる。毒素遺伝子の発現は、直
接又は間接に殺虫剤の細胞内生産と保持をもたらす。適
当な宿主、例えばシュードモナスの場合、微生物は鱗翅
類昆虫発生位置に施用されると、そこで増殖し、昆虫に
摂取される。その結果、望んでいない昆虫を防除でき
る。その代わりに、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞
内でつくられる毒素の活性を持続させるような条件下に
処理できる。次に処理細胞を目標害虫環境に施用でき
る。生ずる生成物はB.t.毒素の毒性を保持している。
囲の微生物宿主へ導入できる。毒素遺伝子の発現は、直
接又は間接に殺虫剤の細胞内生産と保持をもたらす。適
当な宿主、例えばシュードモナスの場合、微生物は鱗翅
類昆虫発生位置に施用されると、そこで増殖し、昆虫に
摂取される。その結果、望んでいない昆虫を防除でき
る。その代わりに、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞
内でつくられる毒素の活性を持続させるような条件下に
処理できる。次に処理細胞を目標害虫環境に施用でき
る。生ずる生成物はB.t.毒素の毒性を保持している。
B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを経て微生物宿主へ
導入されて、この宿主が生きている状態で環境へ施用さ
れる場合に、ある宿主微生物を使用することが重要であ
る。微生物宿主は、一つ以上の重要作物の「植物領域」
（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根表面）を占有す
ることが知られたものを選択する。これらの微生物は、
特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野性型微生物
とうまく競合できるように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤
を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を提供し、望ま
しくは殺虫剤が環境的に分解及び不活性化することから
の改良された保護を提供する。
導入されて、この宿主が生きている状態で環境へ施用さ
れる場合に、ある宿主微生物を使用することが重要であ
る。微生物宿主は、一つ以上の重要作物の「植物領域」
（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根表面）を占有す
ることが知られたものを選択する。これらの微生物は、
特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野性型微生物
とうまく競合できるように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤
を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を提供し、望ま
しくは殺虫剤が環境的に分解及び不活性化することから
の改良された保護を提供する。
広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領
域（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及び菌類を
包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュ
ードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwini
a）、セラティア（Serratia）、クレブシェラ（Klebsie
lla）、キサントモナス（Xanthomonas）、スレイプトミ
セス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、ロ
ードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィ
リウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agro
bacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、乳酸杆
菌（Lactobacillus）、アースロバクター（Arthrobacte
r）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストッ
ク（Leuconostoc）、及びアルカリゲネス（Alcaligene
s）属の細菌；真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセ
ス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcu
s）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、スポロボロ
ミセス（Sporobolomyces）、ロードトルラ（Rhodotorul
a）、及びオーレオバシディウム（Aureobasidium）属な
どの微生物である。特に重要なものは、シュードモナス
・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナ
ス・フルオレッセンス、セラティア・マルケスケンス
（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリヌ
ム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロー
ドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas
spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xan
thomonas campestris）、リゾビウム、メリオチ（Rhiz
obium melioti）、アルカリゲネス・エントロフス（Alc
aligenes entrophus）、及びアゾトバクター・ヴィンラ
ンディ（Azotobacter vinlandii）のような植物領域の
細菌種；及びロードトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubr
a）、R.グルチニス（R.glutinis）、R.マリーナ（R.mar
ina）、R.オーランティアカ（R.aurantiaca）、クリプ
トコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.
ジフルエンス（C.diffluens）、C.ローレンティ（C.lau
rentii）、サッカロミセス・ロゼイ（S.rosei）、S.プ
レトリエンシス（S.pretoriensis）、S.セレビシエ（S.
cerevisiae）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobol
omyces roseus）、S.オドルス（S.odorus）、クルイベ
ロミセス・ヴェローナエ（Kluyveromyces veronae）及
びオーレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium po
llulans）のような植物領域の酵母種である。特に重要
なのは有色素微生物である。
域（植物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及び菌類を
包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュ
ードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwini
a）、セラティア（Serratia）、クレブシェラ（Klebsie
lla）、キサントモナス（Xanthomonas）、スレイプトミ
セス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、ロ
ードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィ
リウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agro
bacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、乳酸杆
菌（Lactobacillus）、アースロバクター（Arthrobacte
r）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストッ
ク（Leuconostoc）、及びアルカリゲネス（Alcaligene
s）属の細菌；真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセ
ス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcu
s）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、スポロボロ
ミセス（Sporobolomyces）、ロードトルラ（Rhodotorul
a）、及びオーレオバシディウム（Aureobasidium）属な
どの微生物である。特に重要なものは、シュードモナス
・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナ
ス・フルオレッセンス、セラティア・マルケスケンス
（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリヌ
ム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロー
ドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas
spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xan
thomonas campestris）、リゾビウム、メリオチ（Rhiz
obium melioti）、アルカリゲネス・エントロフス（Alc
aligenes entrophus）、及びアゾトバクター・ヴィンラ
ンディ（Azotobacter vinlandii）のような植物領域の
細菌種；及びロードトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubr
a）、R.グルチニス（R.glutinis）、R.マリーナ（R.mar
ina）、R.オーランティアカ（R.aurantiaca）、クリプ
トコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.
ジフルエンス（C.diffluens）、C.ローレンティ（C.lau
rentii）、サッカロミセス・ロゼイ（S.rosei）、S.プ
レトリエンシス（S.pretoriensis）、S.セレビシエ（S.
cerevisiae）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobol
omyces roseus）、S.オドルス（S.odorus）、クルイベ
ロミセス・ヴェローナエ（Kluyveromyces veronae）及
びオーレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium po
llulans）のような植物領域の酵母種である。特に重要
なのは有色素微生物である。
遺伝子の安定な維持及び発現を可能とするような条件
下に、毒素発現B.t.遺伝子を微生物宿主に導入するに
は、広範囲の方法が利用できる。毒素遺伝子発現用の転
写及び翻訳調節信号と、その調節制御下の毒素遺伝子、
及び組込みを行なうための宿主生物内の配列と相同のDN
A配列、及び／又は組込みや安定な保持が起こるため
の、宿主内で機能出来る複製系などを含んだDNA構造体
を用意することができる。
下に、毒素発現B.t.遺伝子を微生物宿主に導入するに
は、広範囲の方法が利用できる。毒素遺伝子発現用の転
写及び翻訳調節信号と、その調節制御下の毒素遺伝子、
及び組込みを行なうための宿主生物内の配列と相同のDN
A配列、及び／又は組込みや安定な保持が起こるため
の、宿主内で機能出来る複製系などを含んだDNA構造体
を用意することができる。
転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含
する。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、毒
素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするのが
望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチベ
ータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき、
これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によって
誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用する
と、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境へ
放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒素
の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境
中での栄養培養地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。翻訳開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在する。
する。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、毒
素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするのが
望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチベ
ータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき、
これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によって
誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使用する
と、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境へ
放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒素
の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境
中での栄養培養地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。翻訳開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在する。
特に活性プロモータを使用し、並びにメッセンジャー
RNAの安定性を強化する配列を使用することによって、
メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作を使
用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン、ターミ
ネーター領域を包含し、任意付加的にポリアデニル化信
号を包含してもよい。
RNAの安定性を強化する配列を使用することによって、
メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作を使
用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン、ターミ
ネーター領域を包含し、任意付加的にポリアデニル化信
号を包含してもよい。
転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の
5'から3'への方向で、構造体は、もしあれば転写調節領
域とプロモータ（制御領域はプロモータの5'又は3'のい
ずれかにある）、リボゾーム結合位置、開始コドン、開
始コドンと相が合っているオープンリーディングフレー
ムをもった構造遺伝子、停止コドン、もしあればポリア
デニル化信号配列、及びターミネーター領域を含み得
る。二本鎖としてのこの配列はそれ自体微生物宿主の形
質転換に使用できるが、通常マーカーを伴うDNA配列を
含んでおり、この第二のDNA配列を宿主へのDNA導入中に
毒素発現構造体に結合させることができる。
5'から3'への方向で、構造体は、もしあれば転写調節領
域とプロモータ（制御領域はプロモータの5'又は3'のい
ずれかにある）、リボゾーム結合位置、開始コドン、開
始コドンと相が合っているオープンリーディングフレー
ムをもった構造遺伝子、停止コドン、もしあればポリア
デニル化信号配列、及びターミネーター領域を含み得
る。二本鎖としてのこの配列はそれ自体微生物宿主の形
質転換に使用できるが、通常マーカーを伴うDNA配列を
含んでおり、この第二のDNA配列を宿主へのDNA導入中に
毒素発現構造体に結合させることができる。
マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選定を
行なうための構造遺伝子のことである。マーカーは通
常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重
金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要求宿主に原
栄養性を与える相補性等を提供する。変更された宿主が
選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、相
補性を使用するのが好ましい。構造体の開発に、また宿
主の変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野外で
他の野性型微生物に対する競合的利点を提供することに
よって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート
剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素発現
用の構造遺伝子と一緒に宿主へ導入できる。この方法
で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産宿主に競
合的利点を提供するため、宿主は野性型微生物と効果的
に競合し、環境中で安定した生態的地位を占めるように
なる。
行なうための構造遺伝子のことである。マーカーは通
常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重
金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要求宿主に原
栄養性を与える相補性等を提供する。変更された宿主が
選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、相
補性を使用するのが好ましい。構造体の開発に、また宿
主の変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野外で
他の野性型微生物に対する競合的利点を提供することに
よって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート
剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素発現
用の構造遺伝子と一緒に宿主へ導入できる。この方法
で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産宿主に競
合的利点を提供するため、宿主は野性型微生物と効果的
に競合し、環境中で安定した生態的地位を占めるように
なる。
安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、
宿主中で機能出来る複製系をもったプラスミドが使用さ
れる。複製系は染色体、その宿主又は異なる宿主内に通
常存在するエピゾーム要素から、又は宿主中で安定なウ
イルスの複製系から誘導される。pBR322、pACYC184、RS
F1010、pR01614等のような多数のプラスミドが入手でき
る。例として、オルソン（Olson）ら、（1982年）J.Bac
teriol.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasaria
n）ら、（1981年）Gene 16巻237頁、並びに合衆国特許
第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を
参照のこと。
宿主中で機能出来る複製系をもったプラスミドが使用さ
れる。複製系は染色体、その宿主又は異なる宿主内に通
常存在するエピゾーム要素から、又は宿主中で安定なウ
イルスの複製系から誘導される。pBR322、pACYC184、RS
F1010、pR01614等のような多数のプラスミドが入手でき
る。例として、オルソン（Olson）ら、（1982年）J.Bac
teriol.150巻6069頁、及びバグダサリアン（Bagdasaria
n）ら、（1981年）Gene 16巻237頁、並びに合衆国特許
第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を
参照のこと。
機能出来る複製系が存在しない場合、構造体は宿主内
の配列と相同な、少なくとも50塩基対（bp）、好ましく
は約100bp、そして通常約1,000bpを越えない配列も含
む。こうして合法的な組換えの確率が高められるため、
遺伝子は宿主へ組み込まれ、宿主によって安定に保持さ
れる。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合
的利点を提供する遺伝子に近接しているのが望ましい。
従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。
の配列と相同な、少なくとも50塩基対（bp）、好ましく
は約100bp、そして通常約1,000bpを越えない配列も含
む。こうして合法的な組換えの確率が高められるため、
遺伝子は宿主へ組み込まれ、宿主によって安定に保持さ
れる。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合
的利点を提供する遺伝子に近接しているのが望ましい。
従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う
可能性が強く、このため無傷の構造体を保持している遺
伝子と環境中で競合できなくなる。
細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻
類、真菌類等のような広範囲の微生物宿主から多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域は、trp
遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモ
ータ、tacプロモータ、及び宿主中で機能出来る場合は
毒素遺伝子と関連した天然プロモータを含む。例として
米国特許第4,332,898号、第4,342,832号、及び第4,356,
270号を参照のこと。ターミネーション（終止）領域
は、普通はその転写開始領域と関連づけられたターミネ
ーション領域か、又は二つの領域が宿主内で適合性で機
能出来る限りにおいて異なる転写開始領域と関連づけら
れたターミネーション領域でありうる。
類、真菌類等のような広範囲の微生物宿主から多数の転
写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域は、trp
遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び右プロモ
ータ、tacプロモータ、及び宿主中で機能出来る場合は
毒素遺伝子と関連した天然プロモータを含む。例として
米国特許第4,332,898号、第4,342,832号、及び第4,356,
270号を参照のこと。ターミネーション（終止）領域
は、普通はその転写開始領域と関連づけられたターミネ
ーション領域か、又は二つの領域が宿主内で適合性で機
能出来る限りにおいて異なる転写開始領域と関連づけら
れたターミネーション領域でありうる。
B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、転
写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つを越える複
製系を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの
開発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最
終宿主での機能発揮に必要である。更に、すでに述べた
一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドは宿主ゲノムと相同の配列を含むのが望
ましい。
写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つを越える複
製系を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの
開発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最
終宿主での機能発揮に必要である。更に、すでに述べた
一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドは宿主ゲノムと相同の配列を含むのが望
ましい。
形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在す
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
る時は、それらに対して所望生物を選定できるように、
慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次
に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。
処理細胞を目標害虫環境に施用する時に、細胞内毒素
の活性を持続させるのに適した宿主細胞は原核生物及び
真核生物を包含するが、通常、哺乳類のような高等動物
に有毒な物質を生じない細胞に限定される。しかし、毒
素が不安定か、哺乳類宿主への毒性の可能性を回避する
のに十分な低い施用水準である場合には、高等生物に有
毒な物質をつくる生物も使用できる。宿主として特に興
味あるものは、原核生物と、真菌類のような低級真核生
物である。グラム陰性・陽性双方の原核生物の例はエシ
ェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、
シゲラ（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）及びプ
ロテウス（proteus）のような腸内細菌科（Enterobacte
riaceae）；バシラス科（Bacillaceae）；リゾビウム
（Rhizobium）のようなリゾビウム科（Rhizobiacea
e）；発光細菌、ジモモナス（Zymomonas）、セラティア
（Serratia）、アエロモナス（Aeromonas）、ビブリオ
（Vibrio）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、ス
ピリルム（Spirillum）のようならせん菌科；乳酸かん
菌科；シュードモナス（Pseudomonas）及びアセトバク
ター（Acetobacter）のようなシュードモナス科；アゾ
トバクター科及びニトロバクター科を包含する。真核生
物には藻菌類（Phycomycetes）と子のう菌類（Ascomyce
tes）のような真菌類があり、これはサッカロミセス（S
accharomyces）とシゾサッカロミセス（Schizosaccharo
myces）のような酵母、ロードトルラ（Rhodotorula）、
オーレオバシジウム（Aureobasidium）、スポロボロミ
セス（Sporobolomyces）のような担子菌類（Basidiomyc
etes）酵母を包含する。
の活性を持続させるのに適した宿主細胞は原核生物及び
真核生物を包含するが、通常、哺乳類のような高等動物
に有毒な物質を生じない細胞に限定される。しかし、毒
素が不安定か、哺乳類宿主への毒性の可能性を回避する
のに十分な低い施用水準である場合には、高等生物に有
毒な物質をつくる生物も使用できる。宿主として特に興
味あるものは、原核生物と、真菌類のような低級真核生
物である。グラム陰性・陽性双方の原核生物の例はエシ
ェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、
シゲラ（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）及びプ
ロテウス（proteus）のような腸内細菌科（Enterobacte
riaceae）；バシラス科（Bacillaceae）；リゾビウム
（Rhizobium）のようなリゾビウム科（Rhizobiacea
e）；発光細菌、ジモモナス（Zymomonas）、セラティア
（Serratia）、アエロモナス（Aeromonas）、ビブリオ
（Vibrio）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、ス
ピリルム（Spirillum）のようならせん菌科；乳酸かん
菌科；シュードモナス（Pseudomonas）及びアセトバク
ター（Acetobacter）のようなシュードモナス科；アゾ
トバクター科及びニトロバクター科を包含する。真核生
物には藻菌類（Phycomycetes）と子のう菌類（Ascomyce
tes）のような真菌類があり、これはサッカロミセス（S
accharomyces）とシゾサッカロミセス（Schizosaccharo
myces）のような酵母、ロードトルラ（Rhodotorula）、
オーレオバシジウム（Aureobasidium）、スポロボロミ
セス（Sporobolomyces）のような担子菌類（Basidiomyc
etes）酵母を包含する。
細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子型よりも実
質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。
質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用でき
る。
微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有する微生物
の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒
素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は
物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合
わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子
番号17−80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ
素を温和な条件下に、所望の結果を達成するのに十分な
時間に使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒ
ドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼ
フィランと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤；
イソプロピルアルコールとエタノールのようなアルコー
ル類；ブアン固定剤、及びヘリー固定剤［フマソン（Hu
mason）、グレッチェン・エル（Gretch−en,L.）「動物
組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、1967
年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での処
理；又は宿主動物に細胞を投与する時に細胞中につくら
れる毒素の活性を保持し、持続させるような物理的処理
（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。物理
的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長放射
線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。
の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒
素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的又は
物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合
わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子
番号17−80のハロゲンである。もっと特定的には、ヨウ
素を温和な条件下に、所望の結果を達成するのに十分な
時間に使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒ
ドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；塩化ゼ
フィランと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤；
イソプロピルアルコールとエタノールのようなアルコー
ル類；ブアン固定剤、及びヘリー固定剤［フマソン（Hu
mason）、グレッチェン・エル（Gretch−en,L.）「動物
組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、1967
年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での処
理；又は宿主動物に細胞を投与する時に細胞中につくら
れる毒素の活性を保持し、持続させるような物理的処理
（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。物理
的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長放射
線、凍結、UV照射、凍結乾燥等である。
一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するよう
な、強化された構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプ
ロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型か
ら成熟型への処理を抑制しないように、不活性化方法を
選定すべきである。例えばホルムアルデヒドはタンパク
を架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制しう
る。不活性化ないし殺虫方法は、毒素の少なくとも実質
量の生物学的利用率又は生物活性を保持する。
な、強化された構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプ
ロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型か
ら成熟型への処理を抑制しないように、不活性化方法を
選定すべきである。例えばホルムアルデヒドはタンパク
を架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制しう
る。不活性化ないし殺虫方法は、毒素の少なくとも実質
量の生物学的利用率又は生物活性を保持する。
生産目的のために宿主細胞を選択する上で特に重要な
特性は、B.t.遺伝子宿主への導入の容易さ、発現系の入
手性、発現効率、宿主中の殺虫剤の安定性、及び補助的
遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプセルとし
て使用するのに興味ある特性は厚い細胞壁、色素形成、
及び細胞内パッケージング又は封入体の形成のような殺
虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂
取させるための誘引力；毒素に損害を与えない殺菌固定
の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処方と取扱
いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。
特性は、B.t.遺伝子宿主への導入の容易さ、発現系の入
手性、発現効率、宿主中の殺虫剤の安定性、及び補助的
遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプセルとし
て使用するのに興味ある特性は厚い細胞壁、色素形成、
及び細胞内パッケージング又は封入体の形成のような殺
虫剤保護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂
取させるための誘引力；毒素に損害を与えない殺菌固定
の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処方と取扱
いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。
特に重要な宿主生物は、ロードトルラ種、オーレオバ
シディウム種、サッカロミセス種、スポロボロミセス種
のような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種、及
びフラボバクテリウム種のような葉面に生息する生物；
又はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等の他の生
物を包含する。特定的な生物は、シュードモナス・アエ
ルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス
・フルオレッセンス（P.fluorescens）、サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バシラ
ス・チューリンゲンシス、大腸菌、枯草菌（B.subtili
s）等を包含する。
シディウム種、サッカロミセス種、スポロボロミセス種
のような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種、及
びフラボバクテリウム種のような葉面に生息する生物；
又はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等の他の生
物を包含する。特定的な生物は、シュードモナス・アエ
ルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス
・フルオレッセンス（P.fluorescens）、サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バシラ
ス・チューリンゲンシス、大腸菌、枯草菌（B.subtili
s）等を包含する。
B.t.鱗翅類遺伝子を含有する細胞宿主は任意慣用の栄
養培地で生育できるが、DNA構造体が選択的利点を提供
するときは、細胞の全部又は実質的に全部がB.t.遺伝子
を保持するように選択培地を与える。次にこれらの細胞
を慣用方法に従って収穫する。その代わりに、細胞を収
穫前に処理することもできる。
養培地で生育できるが、DNA構造体が選択的利点を提供
するときは、細胞の全部又は実質的に全部がB.t.遺伝子
を保持するように選択培地を与える。次にこれらの細胞
を慣用方法に従って収穫する。その代わりに、細胞を収
穫前に処理することもできる。
B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これらを種々の
不活性材料、例えば、無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植物材料（粉末トウモロコ
シ穂軸、もみ殻、クルミ殻等）と混合することにより、
水和剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘
着助剤、安定化剤、その他殺虫添加物、又は表面活性剤
を包含できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤の
もので、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用で
きる。成分はレオロジー剤、表面活性剤、乳化剤、分散
剤又は重合体を包含できる。
不活性材料、例えば、無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植物材料（粉末トウモロコ
シ穂軸、もみ殻、クルミ殻等）と混合することにより、
水和剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘
着助剤、安定化剤、その他殺虫添加物、又は表面活性剤
を包含できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤の
もので、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用で
きる。成分はレオロジー剤、表面活性剤、乳化剤、分散
剤又は重合体を包含できる。
殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮液か直接使
用されるかによって、広範囲にわたる。毒素は少なくと
も約１重量％で存在し、約100重量％でありうる。乾燥
処方剤は約１−95重量％の毒素をもつが、液体処方剤は
一般に約１−60重量％の固体を液相中にもつであろう。
処方剤は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞をも
つであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約50mg
（液体又は乾燥）ないし1kg以上で投与されよう。
用されるかによって、広範囲にわたる。毒素は少なくと
も約１重量％で存在し、約100重量％でありうる。乾燥
処方剤は約１−95重量％の毒素をもつが、液体処方剤は
一般に約１−60重量％の固体を液相中にもつであろう。
処方剤は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞をも
つであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約50mg
（液体又は乾燥）ないし1kg以上で投与されよう。
処方剤は鱗翅類害虫の環境、例えば植物、土壌、又は
水に噴霧、散布、散水等によって施用できる。
水に噴霧、散布、散水等によって施用できる。
以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示し
た実施例である。これらの例は限定的に考えられてはな
らない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶
媒混合物割合はすべて容量による。
た実施例である。これらの例は限定的に考えられてはな
らない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶
媒混合物割合はすべて容量による。
実施例１ バシルスチューリンゲンシス単離体の培養
本発明のバシルスチューリンゲンシスのサブカルチャ
ーを次の培地、ペプトン・ブドウ糖、塩培地に接種する
のに使用できる。
ーを次の培地、ペプトン・ブドウ糖、塩培地に接種する
のに使用できる。
バクト・ペプトン 7.50g/l
ブドウ糖 1.00g/l
KH2PO4 3.40g/l
K2HPO4 4.35g/l
塩溶液 5.00ml/l
CaCl2溶液 5.00ml/l
pH7.2
塩溶液（100ml）
MgSO4・7H2O 2.46g
MnSO4・H2O 0.04g
ZnSO4・7H2O 0.28g
FeSO4・7H2O 0.40g
CaCl2溶液（100ml）
CaCl2・2H2O 3.66g
塩溶液とCaCl2溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処
理し調理したブロスに、接種時に添加する。200rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。
理し調理したブロスに、接種時に添加する。200rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。
上の手順は、この技術で周知の手順により大醗酵装置
まで容易に規模拡大できる。
まで容易に規模拡大できる。
上の醗酵で得られるB.t.胞子及び結晶は、この技術で
周知の手順により単離できる。しばしば用いられる手順
は、取り入れた醗酵液を分離手順、例えば遠心分離にか
けることである。
周知の手順により単離できる。しばしば用いられる手順
は、取り入れた醗酵液を分離手順、例えば遠心分離にか
けることである。
実施例２ B.t.単離体PS50Cからの毒素遺伝子のクロー
ニング 600nmに於ける光学密度1.0に生育したバシルス・チュー
リンゲンシス（B.t.）細胞から、全細胞DNAを調製し
た。細胞を遠心分離によって回収し、20％蔗糖と50mg/m
lリゾチームを含有するTES緩衝液（30mMトリス−HCl、1
0mM EDTA、50mM NaCl、pH＝8.0）中で原形質体を調製し
た。原形質体をSDS添加によって溶菌し、４％の最終濃
度とした。細胞材料を（最終濃度）100mMの中性塩化カ
リウム中、４℃で一夜沈殿させた。上澄み液をフェノー
ル／クロロホルム（1:1）で２回抽出した。核酸をエタ
ノール中で沈殿させ、DNAを塩化セシウム／臭化エチジ
ウム勾配上の密度平衡バンディングによって精製した。
ニング 600nmに於ける光学密度1.0に生育したバシルス・チュー
リンゲンシス（B.t.）細胞から、全細胞DNAを調製し
た。細胞を遠心分離によって回収し、20％蔗糖と50mg/m
lリゾチームを含有するTES緩衝液（30mMトリス−HCl、1
0mM EDTA、50mM NaCl、pH＝8.0）中で原形質体を調製し
た。原形質体をSDS添加によって溶菌し、４％の最終濃
度とした。細胞材料を（最終濃度）100mMの中性塩化カ
リウム中、４℃で一夜沈殿させた。上澄み液をフェノー
ル／クロロホルム（1:1）で２回抽出した。核酸をエタ
ノール中で沈殿させ、DNAを塩化セシウム／臭化エチジ
ウム勾配上の密度平衡バンディングによって精製した。
B.t. subsp.クマモトエンシス（b.t.kum.）単離体PS5
0Cからの全細胞DNAをHind IIIで消化させ、0.8％（w/
v）アガロースゲル−TAE（50mMトリス−HCl、20mM NaOA
c、2.5mM EDTA、pH＝8.0）緩衝化ゲル上の電気泳動によ
って分画した。ゲルのサザンブロットを、［32P］放射
性標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし
た。結果は、ハイブリッド化したPS50C断片が12kb、及
び1.7kbの大きさであることを示した。
0Cからの全細胞DNAをHind IIIで消化させ、0.8％（w/
v）アガロースゲル−TAE（50mMトリス−HCl、20mM NaOA
c、2.5mM EDTA、pH＝8.0）緩衝化ゲル上の電気泳動によ
って分画した。ゲルのサザンブロットを、［32P］放射
性標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし
た。結果は、ハイブリッド化したPS50C断片が12kb、及
び1.7kbの大きさであることを示した。
Sau3Aで部分消化されたPS50C全細胞DNAからライブラ
リーを構築し、ゲル電気泳動によってサイズ分画した。
ゲルの９−23kb領域を切り出し、DNAを電気溶離し、Elu
tip−dTMイオン交換カラム（シュライヒャー・エンド・
シュエル社、ニューハンプシャー州キーン）を用いて濃
縮した。単離されたSau3A断片をBamH I消化したラムダ
（Lambda）GEM−11TM（PROMEGA）に連結した。パッケー
ジにしたファージを大腸菌KW251細胞（PROMEGA）上で高
力価で平板培養し、放射性標識つきオリゴヌクレオチド
を用いて選定した。ハイブリッド化プラークを精製し、
低プラーク密度で再選定した。プローブとハイブリッド
形成させた単一単離精製プラークを用いて、DNA単離用
のファージ調製のため、液体培養基中で大腸菌KW251細
胞に感染させた。DNAを標準手順によって単離した。分
離量のDNAをXho Iで消化し（ラムダ配列から挿入DNAを
解放させる為）、そして0.6％アガロース−TAEゲル上の
電気泳動によって分離した。大きな断片をイオン交換ク
ロマトグラフィによって上の様に精製し、Xho I消化脱
ホスホリルpHTBlue II（pBluescript s/k［Stratagen
e］及びレジデントB.t.プラスミドからの複製オリジン
からなる大腸菌/B.チューリンゲンシスシャトルベクタ
ー［D.レレクラス等1989,FEMS Microbiology Letters 6
0:211−218］）に連結した。連結混合物をコンピテント
大腸菌NM522細胞（ATCC47000）へ形質転換によって導入
し、アンピシリン、イソプロピル−（β）−Ｄ−チオガ
ラクトシド（IPTG）及び５−ブロモ−４−クロロ−４−
インドリル−（β）−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含有
するLB寒天上にプレートした。pHTBlue IIの（β）−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子中に推定上の制限断片挿入物を有
する白色集落を標準的な急速プラスミド精製手順にかけ
た。プラスミドをXho I消化とアガロースゲル電気泳動
で分析した。所望のプラスミド構築物pMYC1638は12kbの
Xhol挿入物を含有していた。ヌクレオチド配列（オープ
ンリーディングフレームのみ）が配列ID No.1に示され
ている。毒素の予測されるペプチド配列が配列ID No.2
に示されている。
リーを構築し、ゲル電気泳動によってサイズ分画した。
ゲルの９−23kb領域を切り出し、DNAを電気溶離し、Elu
tip−dTMイオン交換カラム（シュライヒャー・エンド・
シュエル社、ニューハンプシャー州キーン）を用いて濃
縮した。単離されたSau3A断片をBamH I消化したラムダ
（Lambda）GEM−11TM（PROMEGA）に連結した。パッケー
ジにしたファージを大腸菌KW251細胞（PROMEGA）上で高
力価で平板培養し、放射性標識つきオリゴヌクレオチド
を用いて選定した。ハイブリッド化プラークを精製し、
低プラーク密度で再選定した。プローブとハイブリッド
形成させた単一単離精製プラークを用いて、DNA単離用
のファージ調製のため、液体培養基中で大腸菌KW251細
胞に感染させた。DNAを標準手順によって単離した。分
離量のDNAをXho Iで消化し（ラムダ配列から挿入DNAを
解放させる為）、そして0.6％アガロース−TAEゲル上の
電気泳動によって分離した。大きな断片をイオン交換ク
ロマトグラフィによって上の様に精製し、Xho I消化脱
ホスホリルpHTBlue II（pBluescript s/k［Stratagen
e］及びレジデントB.t.プラスミドからの複製オリジン
からなる大腸菌/B.チューリンゲンシスシャトルベクタ
ー［D.レレクラス等1989,FEMS Microbiology Letters 6
0:211−218］）に連結した。連結混合物をコンピテント
大腸菌NM522細胞（ATCC47000）へ形質転換によって導入
し、アンピシリン、イソプロピル−（β）−Ｄ−チオガ
ラクトシド（IPTG）及び５−ブロモ−４−クロロ−４−
インドリル−（β）−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含有
するLB寒天上にプレートした。pHTBlue IIの（β）−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子中に推定上の制限断片挿入物を有
する白色集落を標準的な急速プラスミド精製手順にかけ
た。プラスミドをXho I消化とアガロースゲル電気泳動
で分析した。所望のプラスミド構築物pMYC1638は12kbの
Xhol挿入物を含有していた。ヌクレオチド配列（オープ
ンリーディングフレームのみ）が配列ID No.1に示され
ている。毒素の予測されるペプチド配列が配列ID No.2
に示されている。
プラスミドpMYC1638はエレクトロポレーション（電気
穿孔法）によって非結晶性（acrystalliferous）（Cr
y-）B.t.宿主（プルード大学のA.アロンソンから得たHD
−1 cryB）に導入した。およそ130kDaの蛋白質の発現が
SDS−PAGEによって追認された。
穿孔法）によって非結晶性（acrystalliferous）（Cr
y-）B.t.宿主（プルード大学のA.アロンソンから得たHD
−1 cryB）に導入した。およそ130kDaの蛋白質の発現が
SDS−PAGEによって追認された。
B.t.毒素遺伝子を含有しているプラスミドpMYC1638は
標準の良く知られた手順を用いて形質転換された宿主微
生物から除くことが出来る。例えば、大腸菌NM522［pMY
C1638］NRRL Ｂ−18751を透明にした溶菌物の密度勾配
平衡手順などにかけてpMYC1638を回収する。
標準の良く知られた手順を用いて形質転換された宿主微
生物から除くことが出来る。例えば、大腸菌NM522［pMY
C1638］NRRL Ｂ−18751を透明にした溶菌物の密度勾配
平衡手順などにかけてpMYC1638を回収する。
実施例３ B.t.単離体PS43Fからの毒素遺伝子のクロー
ニング及びシュードモナスへの形質転換 全細胞DNAを、B.t.単離体PS43F及びＭ−７の細胞を低
い光学密度（0D600＝1.0）に生育させ、遠心分離機で菌
体を回収することによって造った。菌体を20％蔗糖及び
50mg/mlリゾチームを含有する緩衝液中にプロトプラス
ト化した原形質体をSDSを最終濃度４％に添加すること
によって溶菌した。細胞物質を４℃で100mM中性塩化カ
リウム中で一夜沈殿させた。上澄みはフェノール／クロ
ロホルム抽出を２回し、DNAを68％エタノール中で沈殿
させた。DNAを塩化セシウム勾配物上で精製した。43Fと
Ｍ−７菌株からのDNA（Ｍ−７は参照用標準）をEcoR I
で消化し、そして0.8％アガロースゲル上で走らせた。
ゲルをサザンブロットにし、Ｍ−７から単離された毒素
コード遺伝子のニックトランスレーションされたORF Xm
n IからPst Iの断片（これを以後プローブと呼ぶ）でプ
ローブした。結果は43Fがプローブに対し7.5kbでハイブ
リット化することを示し、これは標準とは異なってい
た。
ニング及びシュードモナスへの形質転換 全細胞DNAを、B.t.単離体PS43F及びＭ−７の細胞を低
い光学密度（0D600＝1.0）に生育させ、遠心分離機で菌
体を回収することによって造った。菌体を20％蔗糖及び
50mg/mlリゾチームを含有する緩衝液中にプロトプラス
ト化した原形質体をSDSを最終濃度４％に添加すること
によって溶菌した。細胞物質を４℃で100mM中性塩化カ
リウム中で一夜沈殿させた。上澄みはフェノール／クロ
ロホルム抽出を２回し、DNAを68％エタノール中で沈殿
させた。DNAを塩化セシウム勾配物上で精製した。43Fと
Ｍ−７菌株からのDNA（Ｍ−７は参照用標準）をEcoR I
で消化し、そして0.8％アガロースゲル上で走らせた。
ゲルをサザンブロットにし、Ｍ−７から単離された毒素
コード遺伝子のニックトランスレーションされたORF Xm
n IからPst Iの断片（これを以後プローブと呼ぶ）でプ
ローブした。結果は43Fがプローブに対し7.5kbでハイブ
リット化することを示し、これは標準とは異なってい
た。
43FのDNAの分離量をEcoR Iで消化し、0.8％アガロー
スゲル上で走らせた。分離用ゲルの7.5kb領域を単離
し、ELUTIPTM−ｄ（ニューハンプシャー州、キーレのシ
ュライヒャーアンドシュエル）イオン交換カラムを使用
してDNAを電気溶離し濃縮した。試料をブトットし、プ
ローブし、断片が実際単離されたことを確認した。7.5k
bEcoR I断片をラムダ（Lambda）ZAPTMEcoR Iアームに連
結した。パッケージにした組替えファージを大腸菌菌株
BB4と共に（カリフォルニア州、ラオラのストラテジン
クローニング システムズ製）プレートにし、高いプ
ラーク密度を得た。
スゲル上で走らせた。分離用ゲルの7.5kb領域を単離
し、ELUTIPTM−ｄ（ニューハンプシャー州、キーレのシ
ュライヒャーアンドシュエル）イオン交換カラムを使用
してDNAを電気溶離し濃縮した。試料をブトットし、プ
ローブし、断片が実際単離されたことを確認した。7.5k
bEcoR I断片をラムダ（Lambda）ZAPTMEcoR Iアームに連
結した。パッケージにした組替えファージを大腸菌菌株
BB4と共に（カリフォルニア州、ラオラのストラテジン
クローニング システムズ製）プレートにし、高いプ
ラーク密度を得た。
これらのプラークをプローブで標準手順でスクリーニ
ングした。ハイブリット化したプラークを精製し、低い
プラーク密度で再スクリーニングした。生じるファージ
をM13ヘルパーファージ（スタラテジーン製）と共に生
育させ、組替えBLUESCRIPTTMプラスミドを自動的に切取
りパッケージにした。「ファージミド」を自動切出しプ
ロセスの一部としてXL−１ブルー（blue）大腸菌細胞
（ストラテジ−ン製）中で再感染された。感染したXL−
１ブルー菌体をアンピシリン抵抗性についてスクリーニ
ングし、生じるコロニーをミニプレップし、所望のプラ
スミドpM1,98−４を見出した。組替え大腸菌XL−１ブル
ー（Blue）（pM1,98−４）菌株をMR381と呼ぶ。
ングした。ハイブリット化したプラークを精製し、低い
プラーク密度で再スクリーニングした。生じるファージ
をM13ヘルパーファージ（スタラテジーン製）と共に生
育させ、組替えBLUESCRIPTTMプラスミドを自動的に切取
りパッケージにした。「ファージミド」を自動切出しプ
ロセスの一部としてXL−１ブルー（blue）大腸菌細胞
（ストラテジ−ン製）中で再感染された。感染したXL−
１ブルー菌体をアンピシリン抵抗性についてスクリーニ
ングし、生じるコロニーをミニプレップし、所望のプラ
スミドpM1,98−４を見出した。組替え大腸菌XL−１ブル
ー（Blue）（pM1,98−４）菌株をMR381と呼ぶ。
プラスミドpM1,98−４は7.5kbのEcoR I挿入物を含有
していた。この挿入物が興味あるものの一つであること
を確認するためにサザンブロットを実施し、プローブし
た。プローブとハイブリット化する7.5kbのバンドは、
断片がクローン化されていることを確認している。7.5k
bEcoR I断片の酵素Hind III、Pst I、Spe I、BamH I、X
ba Iによる制限エンドヌクレアーゼ分析を、Ｍ−７がク
ローン化されたものとは遺伝子が異なることを示すため
に行った。7.5kbEcoR I断片内に切込まれる酵素はHind
III（２箇所）、Spe I（２箇所）、及び、Pst I（１箇
所）であった。43F遺伝子のオープンリーディングフレ
ーム（ORF）は、Hind IIIで１箇所、Spe Iで２箇所カッ
トされ、Xba I、EcoR I又はBamH Iではカットされな
い。配列データは1963bpのオープンリーディングフレー
ムを示し、最高で70％のＭ−７の毒素コード化遺伝子に
対する配列類似性を有している。
していた。この挿入物が興味あるものの一つであること
を確認するためにサザンブロットを実施し、プローブし
た。プローブとハイブリット化する7.5kbのバンドは、
断片がクローン化されていることを確認している。7.5k
bEcoR I断片の酵素Hind III、Pst I、Spe I、BamH I、X
ba Iによる制限エンドヌクレアーゼ分析を、Ｍ−７がク
ローン化されたものとは遺伝子が異なることを示すため
に行った。7.5kbEcoR I断片内に切込まれる酵素はHind
III（２箇所）、Spe I（２箇所）、及び、Pst I（１箇
所）であった。43F遺伝子のオープンリーディングフレ
ーム（ORF）は、Hind IIIで１箇所、Spe Iで２箇所カッ
トされ、Xba I、EcoR I又はBamH Iではカットされな
い。配列データは1963bpのオープンリーディングフレー
ムを示し、最高で70％のＭ−７の毒素コード化遺伝子に
対する配列類似性を有している。
PS43Fからのクローン化毒素遺伝子を次の方法でP.フ
ルオレッセンス中で発現させるために変更することがで
きる。
ルオレッセンス中で発現させるために変更することがで
きる。
（１） Ptac−プロモーテッドcry IA（ｂ）様毒素遺伝
子を含有するプラスミドを、pM3,130−７（米国特許第
5,055,294中に開示されるMR420、NRRL B−18332からの
もの）からの約4500bpのBamH I−Pst I断片上、pTJS260
（U.C.サンジエゴのドクタードナルドヘリンスキから入
手できるテトラライクリン抵抗性遺伝子を含有している
もの）からの約5500bpのNot I−BamH I断片上、及びpTJ
260（複製領域を含有している）からの約6100bpのNot I
−Pst I断片上の、Ptacプロモーターと毒素遺伝子とを
伴う３ウェイのリゲーションを用いて造ることができ
る。組立られたプラスミドは大腸菌の形質転換、そして
テトラサイクリン選択下での生育の後に回収される。
子を含有するプラスミドを、pM3,130−７（米国特許第
5,055,294中に開示されるMR420、NRRL B−18332からの
もの）からの約4500bpのBamH I−Pst I断片上、pTJS260
（U.C.サンジエゴのドクタードナルドヘリンスキから入
手できるテトラライクリン抵抗性遺伝子を含有している
もの）からの約5500bpのNot I−BamH I断片上、及びpTJ
260（複製領域を含有している）からの約6100bpのNot I
−Pst I断片上の、Ptacプロモーターと毒素遺伝子とを
伴う３ウェイのリゲーションを用いて造ることができ
る。組立られたプラスミドは大腸菌の形質転換、そして
テトラサイクリン選択下での生育の後に回収される。
（２） Ptac−プロモーテッド43F毒素遺伝子を含有す
るプラスミドは、pM1,98−４（MR381（pM1,98−４）、N
RRL B−18291からのもの）の約2200bpの毒素遺伝子含有
Fsp I−Ssp I断片を大腸菌ベクターpKK223−３（ファル
マシア）のSma I場所に連結することによって造ること
ができる。Ptac−プロモーテッド43F毒素プラスミドは
大腸菌の形質転換、アンピシリン選択下での生育及びこ
の分野で良く知られた技術によるtacプロモーターから
の発現の為の適正な方向性で挿入物が存在するプラスミ
ドのスクリーニングに続いて回収することができる。
るプラスミドは、pM1,98−４（MR381（pM1,98−４）、N
RRL B−18291からのもの）の約2200bpの毒素遺伝子含有
Fsp I−Ssp I断片を大腸菌ベクターpKK223−３（ファル
マシア）のSma I場所に連結することによって造ること
ができる。Ptac−プロモーテッド43F毒素プラスミドは
大腸菌の形質転換、アンピシリン選択下での生育及びこ
の分野で良く知られた技術によるtacプロモーターから
の発現の為の適正な方向性で挿入物が存在するプラスミ
ドのスクリーニングに続いて回収することができる。
（３） Ptac−プロモーテッド43F毒素はBamH Iと上の
段階１から生じるプラスミドからのフィルインされたNs
i I末端を有する12.6kbDNA断片を使用する、BamH I−Ns
i I Ptac−含有断片約1.2kb及びNsi I−Sca I断片約2.1
kbであって、43F毒素遺伝子の3'末端を含有するもの、
及び上の段階２から生じるプラスミドからの隣接ベクタ
ーDNAへの３様のリゲーションに於いて、例えばpTJS260
に由来するベクターに組込できる。
段階１から生じるプラスミドからのフィルインされたNs
i I末端を有する12.6kbDNA断片を使用する、BamH I−Ns
i I Ptac−含有断片約1.2kb及びNsi I−Sca I断片約2.1
kbであって、43F毒素遺伝子の3'末端を含有するもの、
及び上の段階２から生じるプラスミドからの隣接ベクタ
ーDNAへの３様のリゲーションに於いて、例えばpTJS260
に由来するベクターに組込できる。
生じるpTJS260に由来する43F毒素発現プラスミドは、
電気穿孔法（エレクトロポレーション）によってシュー
ドモナスフルオレッセンス中に導入できる。
電気穿孔法（エレクトロポレーション）によってシュー
ドモナスフルオレッセンス中に導入できる。
上記のクローニング手順は別途記載されない限り標準
手順を使用して実施された。
手順を使用して実施された。
プラスミドの製造及び宿主生物の形質転換で使用する
種々の方法はこの分野で良く知られている。これらの手
順はマニアテス,T.、T.F.フリッシュ、J.サンブルック
（1982）モレキュラークローニング（Molecular Clonin
g）:A Laboratory Manual、ニューヨークのコートスプ
リングハーバーラボラトリーに記載されている。従って
微生物細胞からDNAを抽出し制限酵素消化を実施し、DNA
断片を電気泳動にかけ、プラスミドDNA及び挿入DNAをテ
イリング及びアニーリングし、DNAを連結し、細胞を形
質転換し、プラスミドDNAを製造し、蛋白質を電気泳動
にかけ、DNAの配列を決定することは遺伝子工学分野の
当業者がなしうることである。
種々の方法はこの分野で良く知られている。これらの手
順はマニアテス,T.、T.F.フリッシュ、J.サンブルック
（1982）モレキュラークローニング（Molecular Clonin
g）:A Laboratory Manual、ニューヨークのコートスプ
リングハーバーラボラトリーに記載されている。従って
微生物細胞からDNAを抽出し制限酵素消化を実施し、DNA
断片を電気泳動にかけ、プラスミドDNA及び挿入DNAをテ
イリング及びアニーリングし、DNAを連結し、細胞を形
質転換し、プラスミドDNAを製造し、蛋白質を電気泳動
にかけ、DNAの配列を決定することは遺伝子工学分野の
当業者がなしうることである。
本明細書に開示された制限酵素はインジアナ州インジ
アナポリスのボエリンガーマンハイム、又はマサチュー
セッツ州バーバリーのニューイングランドバイオラブズ
から購入できる。これらの酵素は供給者によって提供さ
れる指示書に従って使用された。
アナポリスのボエリンガーマンハイム、又はマサチュー
セッツ州バーバリーのニューイングランドバイオラブズ
から購入できる。これらの酵素は供給者によって提供さ
れる指示書に従って使用された。
B.t.毒素遺伝子を含有するプラスミドpM1,98−４は標
準の良く知られた手順を使用することによって形質転換
された宿主微生物から除去できる。例えば大腸菌XL1−B
lue（pM1,89−４）は透明化溶菌物密度勾配平衡手順な
どにかけられpM1,98−４を回収する。
準の良く知られた手順を使用することによって形質転換
された宿主微生物から除去できる。例えば大腸菌XL1−B
lue（pM1,89−４）は透明化溶菌物密度勾配平衡手順な
どにかけられpM1,98−４を回収する。
実施例４ バチルス・チューリンゲンシス菌株PS86A1か
らの新規な毒素をコードした遺伝子の分子クローニング 600nmで1.0の光学密度に生育させたPS86A1細胞から全
細胞DNAを調製した。細胞を遠心分離によってペレット
化し、原形質緩衝液（0.3M蔗糖中20mg/mlリゾチーム、2
5mMトリス−Cl、pH8.0、25mM EDTA）中に再懸濁させ
た。37℃で１時間培養後、２周期の冷凍−解凍によって
原形質を溶菌化した。0.1M NaCl、0.1％ SDS、0.1Mトリ
ス−Clの溶液９倍量を加えて溶菌化を完了させた。透明
溶菌液をフェノール：クロロホルム（1:1）で２回抽出
した。核酸を２倍容量のエタノールで沈澱させ、遠心分
離によってペレット化した。ペレットを10mMトリス−C
l、1mM EDTA（TE）（pH8.0）中に再懸濁し、RNAseを50
μg/mlの最終濃度に添加した。37℃で１時間培養後、溶
液をフェノール：クロロホルム（1:1）及びTE飽和クロ
ロホルムでそれぞれ１回抽出した。1/10量の3M NaOAc及
び２倍量のエタノールを添加して、DNAを水相から沈殿
させた。DNAを遠心分離によってペレット化し、70％エ
タノールで洗い、乾燥し、TEに再懸濁した。
らの新規な毒素をコードした遺伝子の分子クローニング 600nmで1.0の光学密度に生育させたPS86A1細胞から全
細胞DNAを調製した。細胞を遠心分離によってペレット
化し、原形質緩衝液（0.3M蔗糖中20mg/mlリゾチーム、2
5mMトリス−Cl、pH8.0、25mM EDTA）中に再懸濁させ
た。37℃で１時間培養後、２周期の冷凍−解凍によって
原形質を溶菌化した。0.1M NaCl、0.1％ SDS、0.1Mトリ
ス−Clの溶液９倍量を加えて溶菌化を完了させた。透明
溶菌液をフェノール：クロロホルム（1:1）で２回抽出
した。核酸を２倍容量のエタノールで沈澱させ、遠心分
離によってペレット化した。ペレットを10mMトリス−C
l、1mM EDTA（TE）（pH8.0）中に再懸濁し、RNAseを50
μg/mlの最終濃度に添加した。37℃で１時間培養後、溶
液をフェノール：クロロホルム（1:1）及びTE飽和クロ
ロホルムでそれぞれ１回抽出した。1/10量の3M NaOAc及
び２倍量のエタノールを添加して、DNAを水相から沈殿
させた。DNAを遠心分離によってペレット化し、70％エ
タノールで洗い、乾燥し、TEに再懸濁した。
PS86A1DNAのサザーンブロットと、86A1−Ａで指定さ
れる32P−標識つきオリゴヌクレオチドプローブとの標
準ハイブリッド形成によって、制限断片長の多型現象
（RFLP）分析を行なった。86A1−Ａプローブの配列は以
下のとおりであった。
れる32P−標識つきオリゴヌクレオチドプローブとの標
準ハイブリッド形成によって、制限断片長の多型現象
（RFLP）分析を行なった。86A1−Ａプローブの配列は以
下のとおりであった。
プローブを図に示すように、４位置で混合した。ハイ
ブリッド形成バンドは、約3.6kbp Hind III断片と約9.3
kbp EcoR V断片を包含した。
ブリッド形成バンドは、約3.6kbp Hind III断片と約9.3
kbp EcoR V断片を包含した。
Sau3Aで部分消化させたPS86A1DNAから遺伝子ライブラ
リーを構築した。部分的制限消化物をアガロースゲル電
気泳動によって分画した。6.6−23kbpの大きさのDNA断
片をゲルから切出し、ゲルスライスから電気溶離し、エ
ルチップ−Ｄイオン交換カラムでの精製後、エタノール
沈殿によって回収した。Sau3A挿入物をBamH Iで消化さ
せたラムダGem−11（プロメガ社、ウィスコンシン州マ
ジソン）へ連結させた。組替えファージをパッケージ
し、大腸菌KW251細胞（プロメガ社）へプレートした。
放射性標識つき86A1−Ａオリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリッド形成によって、プラークを選別した。ハ
イブリッド形成ファージをプラーク精製し、これを用い
て標準手順によってファージDNAの単離のため大腸菌KW2
51細胞の液体培養基に感染させた［マニアチス（Maniat
is）ら［1982年］「分子クローニング：実験マニュア
ル」コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク
州コールドスプリングハーバー］。二次クローニングに
は、DNAの調製量をEcoR IとSal Iで消化させ、アガロー
スゲル上の電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有する約
2.9kbpのバンドをゲルから切出し、ゲルスライスから電
気溶離し、上のようにイオン交換クロマトグラフィによ
って精製した。精製されたDNA挿入体を、EcoR I＋Sal I
で消化させたpHT Blue II［即ち、pBlueScript S/K（ス
トラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）を含
む大腸菌/B.t.シャトルベクター］とレジデントB.t.プ
ラスミドからの複製開始点［ディー・レレクラス（D.Le
reclus）ら、［1989年］FEMS Microbiol.Lett.60巻211
−218頁］へ連結させた。この連結混合物を使用して、
冷凍されたコンピテント大腸菌NM522細胞（ATCC 4700
0）を形質転換させた。形質転換体を、アンピシリン、
イソプロピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）
及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（β）
−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天（前掲マ
ニアチスら）上にプレートした。アルカリ溶菌（前掲マ
ニアチス）によって推定上の組替え型からプラスミドを
精製し、アガロースゲル上でEcoR I及びSal I消化物の
電気泳動によって分析した。所望のプラスミド構造体pM
YC2320は、本発明の毒素遺伝子を含有している。この遺
伝子のDNA配列を配列ID No.5に示す。この遺伝子で発現
される毒素を、配列ID No.6に示す。
リーを構築した。部分的制限消化物をアガロースゲル電
気泳動によって分画した。6.6−23kbpの大きさのDNA断
片をゲルから切出し、ゲルスライスから電気溶離し、エ
ルチップ−Ｄイオン交換カラムでの精製後、エタノール
沈殿によって回収した。Sau3A挿入物をBamH Iで消化さ
せたラムダGem−11（プロメガ社、ウィスコンシン州マ
ジソン）へ連結させた。組替えファージをパッケージ
し、大腸菌KW251細胞（プロメガ社）へプレートした。
放射性標識つき86A1−Ａオリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリッド形成によって、プラークを選別した。ハ
イブリッド形成ファージをプラーク精製し、これを用い
て標準手順によってファージDNAの単離のため大腸菌KW2
51細胞の液体培養基に感染させた［マニアチス（Maniat
is）ら［1982年］「分子クローニング：実験マニュア
ル」コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク
州コールドスプリングハーバー］。二次クローニングに
は、DNAの調製量をEcoR IとSal Iで消化させ、アガロー
スゲル上の電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有する約
2.9kbpのバンドをゲルから切出し、ゲルスライスから電
気溶離し、上のようにイオン交換クロマトグラフィによ
って精製した。精製されたDNA挿入体を、EcoR I＋Sal I
で消化させたpHT Blue II［即ち、pBlueScript S/K（ス
トラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）を含
む大腸菌/B.t.シャトルベクター］とレジデントB.t.プ
ラスミドからの複製開始点［ディー・レレクラス（D.Le
reclus）ら、［1989年］FEMS Microbiol.Lett.60巻211
−218頁］へ連結させた。この連結混合物を使用して、
冷凍されたコンピテント大腸菌NM522細胞（ATCC 4700
0）を形質転換させた。形質転換体を、アンピシリン、
イソプロピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）
及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（β）
−Ｄ−ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天（前掲マ
ニアチスら）上にプレートした。アルカリ溶菌（前掲マ
ニアチス）によって推定上の組替え型からプラスミドを
精製し、アガロースゲル上でEcoR I及びSal I消化物の
電気泳動によって分析した。所望のプラスミド構造体pM
YC2320は、本発明の毒素遺伝子を含有している。この遺
伝子のDNA配列を配列ID No.5に示す。この遺伝子で発現
される毒素を、配列ID No.6に示す。
プラスミドpMYC2320は、エレクトロポレーションによ
って結晶非形成（Cry-）B.t.宿主（B.t.HD−1 Cry B、
エイ・アイ・アロンソン、パーデュー大学、インディア
ナ州ウエストラファイアット）に導入された。およそ58
kDa蛋白質の発現がSDS−PAGE分析によって確認された。
って結晶非形成（Cry-）B.t.宿主（B.t.HD−1 Cry B、
エイ・アイ・アロンソン、パーデュー大学、インディア
ナ州ウエストラファイアット）に導入された。およそ58
kDa蛋白質の発現がSDS−PAGE分析によって確認された。
B.t.毒素遺伝子を含有するプラスミドpMYC2320は、周
知の標準的な手順を用いて、形質転換宿主微生物から除
去できる。例えば、大腸菌NM522（pMYC2320）を透明溶
菌液密度勾配平衡手順などにかけると、pMYC2320が回収
される。
知の標準的な手順を用いて、形質転換宿主微生物から除
去できる。例えば、大腸菌NM522（pMYC2320）を透明溶
菌液密度勾配平衡手順などにかけると、pMYC2320が回収
される。
実施例５ 形質転換されたシュードモナスフルオレッセ
ンス宿主による43F毒素の生産 PS43F遺伝子を含有している形質転換されたシュード
モナスフルオレッセンスは30μg/mlのテトラサイクリン
を有するLB培地中で生育された１％の接種物を使用して
次の培地中で生育された。
ンス宿主による43F毒素の生産 PS43F遺伝子を含有している形質転換されたシュード
モナスフルオレッセンスは30μg/mlのテトラサイクリン
を有するLB培地中で生育された１％の接種物を使用して
次の培地中で生育された。
グリセロール 65g/L
クエン酸ナトリウム・2H2O 7.14
HCT 20
アンバレックス（Amberex）1003 20
NaNO3 5
（NH4）2SO4 2.3
300rpmで32℃
72時間の発酵がなされ、誘発と補充が24時間において
なされた。これらは2mM IPTGで誘発され、次が補充され
た。
なされた。これらは2mM IPTGで誘発され、次が補充され
た。
アミソイ（Amisoy） 20.0g/L
MgSO4・7H2O 0.4
K2HPO4 1.6
KCl 1.6
毒素濃度はSDSを含有しているポリアクリロアミドゲ
ルのクマッシー染色後、P.フルオレッセンス宿主中に見
出されるおよそ70kDa毒素蛋白質を定量するために、レ
ーザーデンシトメトリー（LKB）を使用して決定でき
る。
ルのクマッシー染色後、P.フルオレッセンス宿主中に見
出されるおよそ70kDa毒素蛋白質を定量するために、レ
ーザーデンシトメトリー（LKB）を使用して決定でき
る。
実施例６ ダイヤモンドバックモスに対するB.t.毒素の
試験 （Ａ） PS86A1遺伝子を含んでいるB.t.クローンの胞子
結晶調製物は1.5％の寒天人工ダイエットアッセイ中
で、ダイヤモンドバックモスであるプルテラ クリロス
テラ（Plutella xylostella）鱗翅類害虫に対し毒性で
あった。B.t.クローンを、実施例１に記載するように生
育した。100μｇ蛋白質／餌ｇよりも大きな比率は６日
以内にこの害虫の100％抑制を生じた。
試験 （Ａ） PS86A1遺伝子を含んでいるB.t.クローンの胞子
結晶調製物は1.5％の寒天人工ダイエットアッセイ中
で、ダイヤモンドバックモスであるプルテラ クリロス
テラ（Plutella xylostella）鱗翅類害虫に対し毒性で
あった。B.t.クローンを、実施例１に記載するように生
育した。100μｇ蛋白質／餌ｇよりも大きな比率は６日
以内にこの害虫の100％抑制を生じた。
（Ｂ） PS50C遺伝子を含んでいるB.t.クローンの胞子
結晶調製物は1.5％寒天人工餌アッセイに於いてダイヤ
モンドバックモスである鱗翅類害虫に対し毒性であっ
た。B.t.クローンを実施例１に開示するように生育させ
た。100μｇ蛋白質／餌ｇよりも大きな比率は６日間内
にこの害虫の100％抑制を生じた。
結晶調製物は1.5％寒天人工餌アッセイに於いてダイヤ
モンドバックモスである鱗翅類害虫に対し毒性であっ
た。B.t.クローンを実施例１に開示するように生育させ
た。100μｇ蛋白質／餌ｇよりも大きな比率は６日間内
にこの害虫の100％抑制を生じた。
（Ｃ） PS43F遺伝子を含んでいるシュードモナスフル
オレッセンスクローンは1.5％寒天人工ダイエット検定
中に於いてダイヤモンドバックモスである鱗翅類害虫に
対し毒性であった。40μｇ蛋白質／餌ｇよりも大きな比
率は６日内にこの害虫の100％抑制を与えた。
オレッセンスクローンは1.5％寒天人工ダイエット検定
中に於いてダイヤモンドバックモスである鱗翅類害虫に
対し毒性であった。40μｇ蛋白質／餌ｇよりも大きな比
率は６日内にこの害虫の100％抑制を与えた。
実施例７ ダイヤモンドバックモスに対するB.t.毒素の
さらに別の試験 本発明の毒素を、本発明に従う遺伝子で形質転換され
ている組替え細胞によって造った。組替え細胞によって
造られた毒素は次にダイヤモンドバックモスに対するそ
れらの活性に対し試験された。これらの実験の結果は表
２に示される。これらの実験は実施例６に記載されるよ
うに実施された。
さらに別の試験 本発明の毒素を、本発明に従う遺伝子で形質転換され
ている組替え細胞によって造った。組替え細胞によって
造られた毒素は次にダイヤモンドバックモスに対するそ
れらの活性に対し試験された。これらの実験の結果は表
２に示される。これらの実験は実施例６に記載されるよ
うに実施された。
実施例８ 毒素遺伝子の植物への挿入
本発明の一つの面は植物を鱗翅類毒素をコードする遺
伝子で形質転換することである。形質転換された植物は
鱗翅類による攻撃に対し抵抗性である。
伝子で形質転換することである。形質転換された植物は
鱗翅類による攻撃に対し抵抗性である。
本明細書に開示される鱗翅類活性毒素をコードする遺
伝子はこの分野で良く知られた種々の技術を使用して植
物細胞に挿入できる。例えば大腸菌中の複製系及び形質
転換細胞の選択を可能とするマーカーを含んでいる数多
くのクローニングベクターが外来遺伝子を高等植物に挿
入するために準備するために入手できる。このベクター
は例えばpBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC1
84などを含む。従ってB.t.毒素をコードした配列は適当
な制限場所でベクターに挿入できる。生じるプラスミド
は大腸菌への形質転換に使用される。大腸菌細胞は適当
な栄養培地中で培養され、次に収穫され溶菌される。プ
ラスミドは回収される。配列分析、制限分析、電気泳動
及び他の生化学−分子生物学方法は一般に分析方法とし
て実施される。各々の操作の後、使用されたDNA配列は
解裂され、次のDNA配列に接合される。各プラスミド配
列は同じ又は異なるプラスミド中にクローン化できる。
所望の遺伝子を植物に挿入する方法に依存して他のDNA
配列が必要かもしれない。例えばもし、Ti又はRiプラス
ミドを植物細胞の形質転換に使用するときはTi又はRiプ
ラスミドＴ−DNAの少なくとも右ボーダー、そして多く
の場合右及び左のボーダーが挿入されるべき遺伝子のフ
ランキング領域として連結されなければならない。
伝子はこの分野で良く知られた種々の技術を使用して植
物細胞に挿入できる。例えば大腸菌中の複製系及び形質
転換細胞の選択を可能とするマーカーを含んでいる数多
くのクローニングベクターが外来遺伝子を高等植物に挿
入するために準備するために入手できる。このベクター
は例えばpBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC1
84などを含む。従ってB.t.毒素をコードした配列は適当
な制限場所でベクターに挿入できる。生じるプラスミド
は大腸菌への形質転換に使用される。大腸菌細胞は適当
な栄養培地中で培養され、次に収穫され溶菌される。プ
ラスミドは回収される。配列分析、制限分析、電気泳動
及び他の生化学−分子生物学方法は一般に分析方法とし
て実施される。各々の操作の後、使用されたDNA配列は
解裂され、次のDNA配列に接合される。各プラスミド配
列は同じ又は異なるプラスミド中にクローン化できる。
所望の遺伝子を植物に挿入する方法に依存して他のDNA
配列が必要かもしれない。例えばもし、Ti又はRiプラス
ミドを植物細胞の形質転換に使用するときはTi又はRiプ
ラスミドＴ−DNAの少なくとも右ボーダー、そして多く
の場合右及び左のボーダーが挿入されるべき遺伝子のフ
ランキング領域として連結されなければならない。
植物細胞の形質転換の為のＴ−DNAの使用は、EP12051
6;ホエケマ（1955）ザ バイナリー プラント ベクタ
ー システムズ（The Binary Plant Vector System）、
オフセット ドルッケリジ カンタース B.V.、アルブ
ラッサーダム第５章；フラリー等、Crit.Rev.Plant Sc
i.4:1−46;及びアン等（1985）EMBO J. 4:277−287中に
広範囲に研究され、十分に記載されている。
6;ホエケマ（1955）ザ バイナリー プラント ベクタ
ー システムズ（The Binary Plant Vector System）、
オフセット ドルッケリジ カンタース B.V.、アルブ
ラッサーダム第５章；フラリー等、Crit.Rev.Plant Sc
i.4:1−46;及びアン等（1985）EMBO J. 4:277−287中に
広範囲に研究され、十分に記載されている。
一旦挿入DNAがゲノム中に統合化されたならば、これ
はそこで比較的安定であり、当然再び出現することはな
い。通常はなかでもカナマイシン、G 418、ブレオマイ
シン、ヒグロマイシン又はクロラムフェニコール等の殺
生物剤又は抗生物質に対し形質転換された植物細胞に抵
抗性を与える選択マーカーを含有している。個々に用い
られたマーカーは従って挿入DNAを含有していない細胞
よりも形質転換された細胞を選択を選択できるようにす
る。
はそこで比較的安定であり、当然再び出現することはな
い。通常はなかでもカナマイシン、G 418、ブレオマイ
シン、ヒグロマイシン又はクロラムフェニコール等の殺
生物剤又は抗生物質に対し形質転換された植物細胞に抵
抗性を与える選択マーカーを含有している。個々に用い
られたマーカーは従って挿入DNAを含有していない細胞
よりも形質転換された細胞を選択を選択できるようにす
る。
DNAを植物宿主細胞に挿入するために数多くの技術が
利用できる。これらの技術は形質転換剤としてアグロバ
クテリウムツネファシエンス又はアグロバクテリウムリ
ゾゲネスを使用するＴ−DNAでの形質転換、融合、注入
又は電気穿孔法（エレクトロポレーション）並びに他の
可能な方法を含んでいる。形質転換のためにもしアグロ
バクテリアが使用されるならば、挿入されるべきDNAは
特定のプラスミド、即ち中間体ベクター又はバイナリー
ベクターの何れかにクローン化されなければならない。
中間体ベクターはＴ−DNA中の配列に対する相同性を有
する配列のために、相同の組替えによってTi又はRiプラ
スミド中に統合化できる。Ti又はRiプラスミドもＴ−DN
Aの運搬に必要なvir領域を含んでいる。中間体ベクター
はアグロバクテリウム中でそれら自体複製できない。中
間体ベクターはヘルパープラスミドによってアグロバク
テリウムツメファシエンス中に移されることが出来る
（コンジュゲーション）。バイナリーベクターは大腸菌
でもアグロバクテリア中でもそれら自体複製できる。こ
れらは選択マーカー遺伝子及び右及び左Ｔ−DNAボーダ
ー領域によってフレームされるリンカー又はポリリンカ
ーを含んでいる。これらは直接アグロバクテリア中に形
質転換できる（ホルスター等［1978］Mol.Gen.Genet.16
3:181−187）。宿主細胞として使用されるアグロバクテ
リウムはvir領域を持っているプラスミドを含むはずで
ある。vir領域はＴ−DNAを植物細胞に移すのに必要であ
る。追加のＴ−DNAが含有され得る。そのように形質転
換された細菌は植物細胞を形質転換するのに使用され
る。植物の外植片はDNAを植物細胞に移す為にアグロバ
クテリウムツメファシエンス又はアグロバクテリウムリ
ゾゲネスと共に培養されるのが有利であり得る。全植物
を次に適当な培地中で完成された植物物質（例えば葉の
一片、茎、根のセグメント、但しそれらに限らず原形質
又は懸濁培養細胞）から再生でき、上記適当な培地は選
択のための抗生物質又は殺生物剤を含有し得る。そのよ
うにして得た植物を次に挿入されたDNAの存在について
試験できる。注入と電気穿孔法（エレクトロポレーショ
ン）の場合には、プラスミドに特別な要求がなされな
い。例えばpUC誘導体等の通常のプラスミドを使用する
ことが可能である。
利用できる。これらの技術は形質転換剤としてアグロバ
クテリウムツネファシエンス又はアグロバクテリウムリ
ゾゲネスを使用するＴ−DNAでの形質転換、融合、注入
又は電気穿孔法（エレクトロポレーション）並びに他の
可能な方法を含んでいる。形質転換のためにもしアグロ
バクテリアが使用されるならば、挿入されるべきDNAは
特定のプラスミド、即ち中間体ベクター又はバイナリー
ベクターの何れかにクローン化されなければならない。
中間体ベクターはＴ−DNA中の配列に対する相同性を有
する配列のために、相同の組替えによってTi又はRiプラ
スミド中に統合化できる。Ti又はRiプラスミドもＴ−DN
Aの運搬に必要なvir領域を含んでいる。中間体ベクター
はアグロバクテリウム中でそれら自体複製できない。中
間体ベクターはヘルパープラスミドによってアグロバク
テリウムツメファシエンス中に移されることが出来る
（コンジュゲーション）。バイナリーベクターは大腸菌
でもアグロバクテリア中でもそれら自体複製できる。こ
れらは選択マーカー遺伝子及び右及び左Ｔ−DNAボーダ
ー領域によってフレームされるリンカー又はポリリンカ
ーを含んでいる。これらは直接アグロバクテリア中に形
質転換できる（ホルスター等［1978］Mol.Gen.Genet.16
3:181−187）。宿主細胞として使用されるアグロバクテ
リウムはvir領域を持っているプラスミドを含むはずで
ある。vir領域はＴ−DNAを植物細胞に移すのに必要であ
る。追加のＴ−DNAが含有され得る。そのように形質転
換された細菌は植物細胞を形質転換するのに使用され
る。植物の外植片はDNAを植物細胞に移す為にアグロバ
クテリウムツメファシエンス又はアグロバクテリウムリ
ゾゲネスと共に培養されるのが有利であり得る。全植物
を次に適当な培地中で完成された植物物質（例えば葉の
一片、茎、根のセグメント、但しそれらに限らず原形質
又は懸濁培養細胞）から再生でき、上記適当な培地は選
択のための抗生物質又は殺生物剤を含有し得る。そのよ
うにして得た植物を次に挿入されたDNAの存在について
試験できる。注入と電気穿孔法（エレクトロポレーショ
ン）の場合には、プラスミドに特別な要求がなされな
い。例えばpUC誘導体等の通常のプラスミドを使用する
ことが可能である。
形質転換された細胞は通常の方法で植物内で生育す
る。これらは生殖細胞を形成し、そして子孫細胞に対し
形質転換された性質を伝達する。そのような植物は通常
の方法で生育でき、同じ形質転換された遺伝因子を有す
る植物又は他の遺伝因子を有する植物とかけ合わせるこ
とができる。生じるハイブリット個体は対応する表現型
性質を有している。
る。これらは生殖細胞を形成し、そして子孫細胞に対し
形質転換された性質を伝達する。そのような植物は通常
の方法で生育でき、同じ形質転換された遺伝因子を有す
る植物又は他の遺伝因子を有する植物とかけ合わせるこ
とができる。生じるハイブリット個体は対応する表現型
性質を有している。
実施例９ 新規なB.t.遺伝子の昆虫ウイルスへのクロー
ニング 数多くのウイルスが昆虫に感染することが知られてい
る。これらのウイルスには例えばバクロウイルス及びエ
ントモポックスウイルスが含まれる。本発明の一具体例
に於いて、本明細書で開示される鱗翅類に活性の遺伝子
は昆虫ウイルスのゲノムと一緒にすることが出来、従っ
てウイルスの病原性を強めることができる。B.t.毒素遺
伝子を含んでいる昆虫ウイルスを造る方法は良く知ら
れ、当業者に容易に実施され得る。これらの手順は例え
ばメリウェザー等（メリウェザー,A.T.、U.ウエイヤ
ー、M.P.G.ハリス、M.ヒルスト、T.ブース、R.D.ポシー
［1990］J.Gen.Virol.71:1535−1544）中に、そしてマ
ルテンス等（マルテンス,J.W.M.、G.ホネー、D.ズイデ
マ、J.W.M.バンレント、B.ビッセル、J.M.ブラク［199
0］Appl.Environmental Microbiol.56（９）:2764−277
0）中に記載されている。
ニング 数多くのウイルスが昆虫に感染することが知られてい
る。これらのウイルスには例えばバクロウイルス及びエ
ントモポックスウイルスが含まれる。本発明の一具体例
に於いて、本明細書で開示される鱗翅類に活性の遺伝子
は昆虫ウイルスのゲノムと一緒にすることが出来、従っ
てウイルスの病原性を強めることができる。B.t.毒素遺
伝子を含んでいる昆虫ウイルスを造る方法は良く知ら
れ、当業者に容易に実施され得る。これらの手順は例え
ばメリウェザー等（メリウェザー,A.T.、U.ウエイヤ
ー、M.P.G.ハリス、M.ヒルスト、T.ブース、R.D.ポシー
［1990］J.Gen.Virol.71:1535−1544）中に、そしてマ
ルテンス等（マルテンス,J.W.M.、G.ホネー、D.ズイデ
マ、J.W.M.バンレント、B.ビッセル、J.M.ブラク［199
0］Appl.Environmental Microbiol.56（９）:2764−277
0）中に記載されている。
本明細書に記載の実施例及び具体例は例示目的のみの
ものであり、それらにてらし、種々の変更及び修飾が当
業者に示唆され、本願の精神と範囲内に含まれ、そして
添付の特許請求の範囲内に含まれるべきである。
ものであり、それらにてらし、種々の変更及び修飾が当
業者に示唆され、本願の精神と範囲内に含まれ、そして
添付の特許請求の範囲内に含まれるべきである。
配列リスト
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ウィエダ，ケンドリック A.ブラドフ
ィッシュ，グレゴリー A. （ii）発明の名称：鱗翅類害虫の防除方法 （iii）配列数:7 （iv）通信住所 （Ａ）宛先：デビッド R.サリワンチック （Ｂ）街路:2421 N.W.41st ストリート，スウィ
ート Ａ−１ （Ｃ）シティー名：ゲインスビル （Ｄ）州名：フロリダ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:32606 （ｖ）次のコンピューターから読取り可能 （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCとコンパチブルのも
の （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:Patentlnレリーズ＃1.0,バー
ジョン＃1.25 （vi）現時点の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）前の出願データ （Ａ）出願番号:US 07/758,020 （Ｂ）出願日:1991年９月12日 （Ｃ）分類： （vii）前の出願データ （Ａ）出願番号:US 07/658,935 （Ｂ）出願日:1991年２月21日 （Ｃ）分類： （vii）前の出願データ （Ａ）出願番号:US 07/642,112 （Ｂ）出願日:1991年１月16日 （Ｃ）分類： （viii）弁護士／代理人情報 （Ａ）氏名：サリワンチク，デビッド R. （Ｂ）登録番号:31,794 （ix）テレコミュニケーション情報 （Ａ）電話:904−375−8100 （Ｂ）ファクス:904−372−5800 （２）SEQ ID NO:1:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:3471塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノミック） （iii）仮説か?:ノー （iv）アンチセンス：ノー （vi）元々の給源： （Ａ）生物：バシラス・チューリンゲンシス （Ｂ）菌株：クマモトエンシス （Ｃ）個々の単離体名:PS50C （vii）すぐの供給源： （Ｂ）クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC163
8）、NRRL Ｂ−18751 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:1: （２）SEQ ID NO:2:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1157アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）ストランド：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類：蛋白質 （iii）仮説か?:イエス （iv）アンチセンス：ノー （vi）元々の給源： （Ａ）生物：バシラス・チューリンゲンシス （Ｂ）菌株：クマモトエンシス （Ｃ）個々の単離体名:PS50C （vii）すぐの供給源： （Ｂ）クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC163
8）、NRRL Ｂ−18751 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:2: （２）SEQ ID NO:3:に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:1953塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｃ） 鎖:2本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ:DNA（ゲノミック） （iii）仮定的か?:ノー （iv）アンチセンス?:ノー （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｂ） 菌株：トルウォースィ （Ｃ） 個別的単離体:43F （vii）直近給源 （Ｂ） クローン：大腸菌（E.coli）XL1−Blue（p
M1,98−４）、NRRL B−18291 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー:CDS （Ｂ） 位置:1..1953 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:3: （２）SEQ ID NO:4:に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:651個のアミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｃ） 鎖：一本 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：蛋白質 （iii）仮定的か?:イエス （iv）アンチセンス?:ノー （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｂ） 菌株：トルウォースィ （Ｃ） 個別的単離体:43F （vii）直近給源 （Ｂ） クローン：大腸菌（E.coli）XL1−Blue（p
M1,98−４）、NRRL B−18291 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー：蛋白質 （Ｂ） 位置:1..651 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:4: （２）SEQ ID NO:5:に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:1425塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｃ） 鎖:2本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ:DNA（ゲノミック） （iii）仮定的か?:ノー （iv）アンチセンス?:ノー （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｃ） 個別的単離体:PS86A1 （vii）直近給源 （Ｂ） クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC
2320）NRRL B−18769 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー:mat ペプチド （Ｂ） 位置:1..1425 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:1（多分本当は５）： （２）SEQ ID NO:2（多分本当は６）：に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:475個のアミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｃ） 鎖：一本 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：蛋白質 （iii）仮定的か?:イエス （iv）アンチセンス?:ノー （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｃ） 個別的単離体:PS86A1 （vii）直近給源 （Ｂ） クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC
2320）NRRL Ｂ−18769 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー：蛋白質 （Ｂ） 位置:1..475 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:2（多分本当は６）： （２）SEQ ID NO:7:に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:53塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｃ） 鎖:1本 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ:DNA（ゲノミック） （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｂ） 菌株:PS86A1 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:7:
ィッシュ，グレゴリー A. （ii）発明の名称：鱗翅類害虫の防除方法 （iii）配列数:7 （iv）通信住所 （Ａ）宛先：デビッド R.サリワンチック （Ｂ）街路:2421 N.W.41st ストリート，スウィ
ート Ａ−１ （Ｃ）シティー名：ゲインスビル （Ｄ）州名：フロリダ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:32606 （ｖ）次のコンピューターから読取り可能 （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCとコンパチブルのも
の （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:Patentlnレリーズ＃1.0,バー
ジョン＃1.25 （vi）現時点の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）前の出願データ （Ａ）出願番号:US 07/758,020 （Ｂ）出願日:1991年９月12日 （Ｃ）分類： （vii）前の出願データ （Ａ）出願番号:US 07/658,935 （Ｂ）出願日:1991年２月21日 （Ｃ）分類： （vii）前の出願データ （Ａ）出願番号:US 07/642,112 （Ｂ）出願日:1991年１月16日 （Ｃ）分類： （viii）弁護士／代理人情報 （Ａ）氏名：サリワンチク，デビッド R. （Ｂ）登録番号:31,794 （ix）テレコミュニケーション情報 （Ａ）電話:904−375−8100 （Ｂ）ファクス:904−372−5800 （２）SEQ ID NO:1:に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:3471塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子種類:DNA（ゲノミック） （iii）仮説か?:ノー （iv）アンチセンス：ノー （vi）元々の給源： （Ａ）生物：バシラス・チューリンゲンシス （Ｂ）菌株：クマモトエンシス （Ｃ）個々の単離体名:PS50C （vii）すぐの供給源： （Ｂ）クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC163
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M1,98−４）、NRRL B−18291 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー：蛋白質 （Ｂ） 位置:1..651 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:4: （２）SEQ ID NO:5:に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:1425塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｃ） 鎖:2本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ:DNA（ゲノミック） （iii）仮定的か?:ノー （iv）アンチセンス?:ノー （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｃ） 個別的単離体:PS86A1 （vii）直近給源 （Ｂ） クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC
2320）NRRL B−18769 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー:mat ペプチド （Ｂ） 位置:1..1425 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:1（多分本当は５）： （２）SEQ ID NO:2（多分本当は６）：に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:475個のアミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｃ） 鎖：一本 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ：蛋白質 （iii）仮定的か?:イエス （iv）アンチセンス?:ノー （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｃ） 個別的単離体:PS86A1 （vii）直近給源 （Ｂ） クローン：大腸菌（E.coli）NM522（pMYC
2320）NRRL Ｂ−18769 （ix）特徴 （Ａ） 名前／キー：蛋白質 （Ｂ） 位置:1..475 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:2（多分本当は６）： （２）SEQ ID NO:7:に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ） 長さ:53塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｃ） 鎖:1本 （Ｄ） トポロジー：線形 （ii）分子タイプ:DNA（ゲノミック） （vi）オリジナル給源 （Ａ） 生物：バシルス チューリンゲンシス （Ｂ） 菌株:PS86A1 （xi）配列の記述:SEQ ID NO:7:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｃ
Ｃ１２Ｒ 1:07）
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８４００
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８７４６
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８７５１
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８７６９
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８２９１
(72)発明者 ブラドフィッシュ，グレゴリー，エイ.
アメリカ合衆国 92127 カリフォルニ
ア州 サン ディエゴ パラシオ プレ
イス 17046
(56)参考文献 特開 昭61−181372（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−5874（ＪＰ，Ａ)
米国特許4849217（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A01N 63/00
A01N 63/02
Claims (20)
- 【請求項１】鱗翅類昆虫の害虫を、B.t.PS43F、B.t.PS5
0C及びB.t.PS86A1からなる群から選択される、バシルス
チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）単離体
の昆虫抑制有効量と接触することからなる、鱗翅類昆虫
の害虫を抑制する方法。 - 【請求項２】バシルスチューリンゲンシスがB.t.PS43F
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】バシルスチューリンゲンシスがB.t.PS50C
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】バシルスチューリンゲンシスがB.t.PS86A1
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】該昆虫の害虫がダイヤモンドバックモス
（プルテラ クシロステラ Plutella xylostella）で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】バシルスチューリンゲンシスを含む殺虫組
成物を植物または土壌に適用することを含む請求項１に
記載の方法。 - 【請求項７】殺虫組成物が液体である請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】殺虫組成物が顆粒形である請求項６に記載
の方法。 - 【請求項９】殺虫組成物がとうもろこし又は大豆の種が
植えられる時に適用される請求項６に記載の方法。 - 【請求項１０】該バシルスチューリンゲンシスが標的害
虫の環境に於ける殺虫活性を長期化するために処理され
ている請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】B.t.PS43F、B.t.PS50C及びB.t.PS86A1か
らなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス単
離体から得ることができ、鱗翅類害虫に対し活性の毒素
をコードしている遺伝子によって形質転換された植物
に、鱗翅類害虫を暴露することを含む、鱗翅類害虫を防
除する方法。 - 【請求項１２】該遺伝子がSEQ ID No.1のDNA又は鱗翅類
活性毒素をコードするその一部である請求項11に記載の
方法。 - 【請求項１３】該遺伝子がSEQ ID No.3のDNA又は鱗翅類
活性毒素をコードするその一部を含んでいる請求項11に
記載の方法。 - 【請求項１４】該遺伝子がSEQ ID No.5のDNA又は鱗翅類
活性毒素をコードするその一部を含んでいる請求項11に
記載の方法。 - 【請求項１５】B.t.PS43F、B.t.PS50C及びB.t.PS86A1か
らなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス単
離体から得ることができ、鱗翅類害虫に対し活性の毒素
をコードしている遺伝子によって形質転換された微生物
を、鱗翅類害虫又はその害虫の環境に対し投与すること
を含む、鱗翅類害虫の防除方法。 - 【請求項１６】該遺伝子がSEQ ID No.1のDNA又は鱗翅類
活性毒素をコードするその一部である請求項15に記載の
方法。 - 【請求項１７】該遺伝子がSEQ ID No.3のDNA又は鱗翅類
活性毒素をコードするその一部である請求項15に記載の
方法。 - 【請求項１８】該遺伝子がSEQ ID No.5のDNA又は鱗翅類
活性毒素をコードするその一部である請求項15に記載の
方法。 - 【請求項１９】微生物がシュードモナス（Pseudomona
s）である請求項15に記載の方法。 - 【請求項２０】形質転換された微生物が標的害虫の環境
に於ける殺虫活性を長期化させるために処理されている
請求項15に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/758,020 US5286485A (en) | 1991-01-16 | 1991-09-12 | Process for controlling lepidopteran pests |
| US758,020 | 1991-09-12 | ||
| US941,650 | 1992-09-08 | ||
| US07/941,650 US6294184B1 (en) | 1991-01-16 | 1992-09-08 | Process for controlling lepidopteron pests |
| PCT/US1992/007697 WO1993004587A1 (en) | 1991-09-12 | 1992-09-11 | Process for controlling lepidopteran pests |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06510765A JPH06510765A (ja) | 1994-12-01 |
| JP3464217B2 true JP3464217B2 (ja) | 2003-11-05 |
Family
ID=27116480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50551093A Expired - Lifetime JP3464217B2 (ja) | 1991-09-12 | 1992-09-11 | 鱗翅類害虫の防除方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0605586B1 (ja) |
| JP (1) | JP3464217B2 (ja) |
| AT (1) | ATE178456T1 (ja) |
| AU (1) | AU2651992A (ja) |
| CA (1) | CA2116126C (ja) |
| DE (1) | DE69228876T2 (ja) |
| ES (1) | ES2129456T3 (ja) |
| IL (1) | IL103144A0 (ja) |
| WO (1) | WO1993004587A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO1994005771A2 (en) * | 1992-08-27 | 1994-03-17 | Plant Genetic Systems N.V. | New bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins |
| US6156308A (en) * | 1992-12-15 | 2000-12-05 | Valent Biosciences, Inc. | Bacillus thuringiensis strains active against lepidopteran and coleopteran pests |
| US5879676A (en) * | 1992-12-15 | 1999-03-09 | Abbott Laboratories | Bacillus thuringiensis strains active against lepidopteran and coleopteran pests |
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| WO1994024264A1 (en) | 1993-04-09 | 1994-10-27 | Plant Genetic Systems N.V. | New bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins |
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