JPH06510765A - 鱗翅類害虫の防除方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　鱗翅類害虫の防除方法 間　出願へのクロスリファレンス 本出願は放棄されている１９９１年１月１６日に出願された米国出願番号０７／ ６４２，１１２の一部係属出願である１９旧年９月１２日に出願した米国出願０ ７／７５８．０２０の一部係属出願である。　０７／７５８．０２０は１９９１ 年２月２１日に出願された米国出願第０７／６５８，９３５の一部係属出願でも ある。

Ｌｉ立ＩＪ 土壌微生物バシルスチューリンゲンシス（Ｂ、ｔ、）はダラム陽性の胞子形成性 細菌であって、バラ胞子性結晶性蛋白質封入物によって特徴付けられる。これら は顕微鏡で一つ一つに区別された形状の結晶として見えることが多い、この蛋白 質は害虫に前件であり、それらの活性は特異的である。この毒素遺伝子は単離さ れ、配列が決定され、組替えＤＮＡに基づ＜　ｅ、ｔ、生成物がつくられ認めら れている。さらに遺伝子工学技術の使用で８．ｔ、エンドトキシン（内毒素）を 農業環境に送り込むための新方法が現在開発中であり、これらには昆虫抵抗性を 持たせるために内毒素遺伝子で遺伝子工学処理された植物の使用、及び８．ｔ、 内毒嚢配達ビヒクルとして安定化された無傷の（Ｉｌ胞壁が破壊されていない） 微生物細胞の使用が含まれる（ガードナー、Ｆ、Ｈ，、し、キム［１９８８］　 ＴＩＢＴＥＣ１４６：５４−５７）、従って単離された８、ｔ、内毒素遺伝子は 商業的に責菫なものとなりつつある。

バシルスチューリンゲンシスは感受性の昆虫宿主によって摂取されたときに毒性 である蛋白質性のバラ胞子又は結晶を製造する。ｉ！１去３０年閏にわたってＢ 、ｔ、殺虫剤の商業的な使用は主として鱗翅類（キャタピラ−）害虫の狭い範囲 に制限されてきた。バシルスチューリンゲンシス　５ｕｂｓｐ　、クルスタキの 胞子と結晶のＦＡＩ！物が鱗翅類害虫の商業的な殺虫剤として何年も使用されて いる０例えば８．チューリンゲンシス　ｖａｒ　、クルスタキ　ＨＯ−１は数多 くの鱗翅類昆虫の幼虫に毒性であるデルタエンドトキシンと呼ばれる結晶を造る 。

しかし近年研究者等は８．ｔ、殺虫剤であって、より広い範囲の害虫に対し特異 性を有するものを発見した０例えばＢ、ｔ、の他の種、即ちイスラエレンシス及 びサンジエゴ（ａ、に、ａ、　Ｂ、ｔ、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉ ｓ）、ａ、に、ａ。

Ｍ−７）がそれぞれ双翅類と鞘ｖＢ類の目の昆虫を抑制する為に商業的に使用さ れている（ガードナー、Ｆ、Ｈ，［＋９８９］「殺虫蛋白質の細胞配達系：生き た及び生きていない微生物」コンドロールド　デリバリ−オプ　りロツブ　プロ テクション　エージエンツ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆＣ ｒｏｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｇｅｎｔｓ）中、Ｒ，Ｍ、ウイルキンス編、 ティラー及びフランシス、ニューヨーク及びロンドン、１９９０．２４５−２５ ５頁）。またコーチ、Ｔ、Ｌ、　（１９８０）　ｒバシルスチューリンゲンシス 　ｖａｒ、イスラエレンシスの蚊への病原性」デベロソブメンツ　イン　インダ ストリアル　マイクロバイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄ ｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ）　２２：６１−７６　；ビーグル 、Ｃ，Ｃ，、（＋９７８）　ｒ農業生態系における虫生纏菌の使用」デベロツブ メンツ　イン　インダストリアル　マイクロバイオロジ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔｓ　１ｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）−２０：９７− １０１ｉ＊クリーグ＾、。

Ａ、Ｍ、ハンガー、Ｇ、Ａ、ランゲンブルヒ、讐、シュネツタ−（１９８３）　 Ｚ、　ａｎｇ、　Ｅｎｔ、　９６：５００−５０８はバシルスチューリンゲンシ ス　ｖａｒ、テネブリオニスと命名される８、ｔ、単離体を記載しており、これ は報告によると鞘翅目の２つの甲虫に対し活性である。これらはコロラドじゃが いもはむしくＣｏ１ｏｒａｄｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｂｅｅｔｌｅ）のレブチノタル サ　デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ） 及びアゲラスチカ　アルコ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ　ａｌｎｉ）である・最近多 くの新しいｅ、ｔ、のサブスピーシーズ（亜種）が同定されており、活性のδ・ エンドトキシン蛋白質に対し役割を持フている多くの遺伝子が単離されている（ ホフテ、　Ｈ，、Ｈ，Ｒ，ホワイトレー［１９８９］マイクロノ（ビオロジカル 　レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）　５２（２ ）：２４２−２５５）　、ホフテ及びホワイトレーは４２個のＢ、ｔ、結晶蛋白 質遺伝子を１４の区別できる遺伝子に分類し、アミノ酸配列及び宿主範囲に基づ いて４つの主要なりラスにグループ分けした。これらのクラスは（ｒｙｌ　（鱗 翅目特異性）　、Ｃｒｙｌｌ　（鱗翅目及び双翅目特異性）　、　Ｃｒｙｌｌｌ 　（鞘翅目特異性）及びＣｒｙｌＶ　（双翅目特異性）である、原生動ｍ病原菌 、動物寄生性の肝臓吸虫（トレマトダ〉又はダニ（アカリ）に特異的に毒性の菌 株の発見はさらに可能性あるＢ、ｔ、生成物スペクトラムを広げた。独特の標的 に対する活性を有することによってこれらの新規な菌株は非常に高い生物特異性 を侃持し、非標的生物は影響を受けずにすむ、多くの多様なｅ、ｔ、毒素の入手 可能なことは又、Ｂ、ｔ、抵抗性の害虫が生じる危険性を最少にする生成物使用 戦略を採用することを農業従事者に可能にし得る。

大ｉＩＷ中でＢ、ｔ、結晶蛋白質遺伝子のクローニング及び発現をすることは出 版された文献に記載されてｔする（シュネフ、Ｈ，Ｅ、、　）１．Ｒ，ホイット レー　［＋９８１コＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７Ｂ：２８９３−２８９７）　、米国特許４， ４４８．８８５及び米国特許４，４６７．０３６は両方とも大關菌におけるＢ、 ｔ、結晶蛋白質の発現を量水している。米国特許４，８５３．３３１ｃｉ種々の 環境に於いて鞘翅類害虫を抑制するのζこ使用できるＢ、チューリンゲンシス　 菌株サンジエゴ（ａ、に、ａ、　Ｂ、ｔ。

テネブリオニス、ａ、に、ａ、　Ｍ−７）を量水して（洩る。米国特許＄　４． ８４９．２１７はアルファルファライ−ビル（ゾウ虫）に対し活性のバシルスチ ューリンゲンシス単離体を量水している０開示されている単離体の一つはノ＜シ ルレスチューりンゲンシスＰ　Ｓ　８６　Ａ　１　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４００ ）である。

本発明は鱗翅類害虫を抑制するための新規な方法に間する。この方法はある種の 鞘翅類活性ｅ、ｔ、単離体が鱗翅類害虫、例えばダイアモンドバックモス（プル テラ　クシロステラ　Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）に活性を有す るという予想外の発見から生した。この発見はバシルスチューリンゲンシス　ｖ ａｒ、テネブリオニス（上記クリーブ等）（以後Ｍ−７と呼ぶ）等の既知の鞘翅 類活性単層体は鱗翅類に毒性てはないから特に驚くべきことである。

より詳しくは本発明は鱗翅類害虫を抑制するためにＢ。

ｔ、微生物又はその変種、及び／又はそれらの毒素を使用する方法である０本発 明に従って有用な特定のＢ、ｔ、微生物はＢ、ｔ、　ＰＳ８６ＡＩ、Ｂ、ｔ、　 ＰＳ５０Ｃ１及びＢ、ｔ、　ＰＳ４３Ｆである。

さらに本発明はまた特定して例示した８、ｔ、単離体と実質的に同し鱗翅類活性 性質を有している本発明の８．ｔ、単離体の変種の使用を含んでいる。突然変異 体を造る手順は微生物技術で良く知られている。紫外線光及びニトロソグアニジ ンはこの目的のために広範囲に使用されている。

本発明は鱗翅類活性毒素をコードする本発明のＢ、ｔ、単離体からの遺伝子の使 用を含んでいる。

更に本発明はまた、実質的に無傷の細胞（細胞壁が破壊されていない細胞）が標 的害虫の環境に適用された時に対鱗翅類活性を長門化させるために本発明の遺伝 子を含有している実質的に無傷のＢ、ｔ、細胞及び組替え細胞を処理することを 含んでいる。そのような処理はこの技術が殺虫剤の性質に悪杉響をせず、また殺 虫剤を保護している！Ｉ胞の能力を減少させない限り化学的又は物理的手段、又 は化学的及び物理的手段の絹合せであり得る。処理された細胞は殺虫毒素の為の 保護コートとして作用する。を嚢は標的昆虫によって摂取されるとそのまま作用 するために利用できるようになる。

最後に本発明は更に、鱗翅類活性毒ををコードする遺伝子で形質転換された植物 に間している。

配列の簡単なＩＪ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１は５０Ｃと命名される遺伝子のヌクレオチド配列（オ ーブンリーディングフレームのみ）である。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２は毒素５０Ｃの予測アミノ酸配列である。

ＳＥｏ　１０　Ｎｏ、３は４３Ｆと命名される遺伝子の複合化したヌクレオチド とアミノ酸の配列である。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４は毒素４３Ｆの予測されるアミノ酸配列である。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５は８６Ａ１と命名される遺伝子のヌクレオチド配列（オ ーブンリーディングフレームのみ）である。

ＳＥＱ　ｌ［ｌ　）ｌｏ、６は毒素８６Ａ＋の予測アミノ酸配列である。

ＳＥＱ　１０　）ｆｏ、７は８６　Ａ　１−Ａと命名されるオリゴヌクレオチド プローブである。

本発明に従う有用なバシラス・チューリンゲンシス単離体は、生物学的に純粋な 形態で以下の特性をもつ。

Ｂ、ｔ、Ｐ　Ｓ　５０　Ｃの特徴 集落形態−ｅ、ｔ、に典型的な、大集落で表面はくすんでいる。

増殖期の細胞形態−Ｓ、ｔ、に典型的。

培養方法−Ｂ、ｔ、に典型的な方法。

鞭毛の血清型・−ＰＳ５０Ｃはセロタイプ１８．クマモトエンシスに属する。

結晶の杉態−球。

ＲＦＬＰ分析−全ＤＮＡのサザンハイプリダイゼーションにより、ＰＳ５０Ｃは Ｂ、ｔ、ｓ、ｄ、及び他のｅ、ｔ、単離体と区別される。

アルカリ可溶性蛋白質−Ｓ　Ｄ　Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動（５０５− ＰＡＧＥ）は１３０ｋＤａ（キロダルトン）のダブレットの蛋白質を示す。

コロニー影慈、成長細胞の形態、及び培養方法に間するＢ、ｔ、Ｐ　Ｓ　８６　 Ａ　１の特徴はｅ、ｔ、ｐ　Ｓ　５０　Ｃについて上に与えられる通りである。

しかしこれらの単離体は表１に示されるように封入物、血清型及び毒素の分子量 に関し異なる。

Ｂ、ｔ、Ｐ　Ｓ　４３　Ｆは米国特許４，９９６，１５５に記載されている。

本発明のＢ、チューリンゲンシス菌株の特徴を既知の８゜ｔ、ｇ株Ｂ、チューリ ンゲンシス　ｖａｒ、テネブリオニス（Ｍ−７）及びＢ、チューリンゲンシス　 νａｒ、クルスタキ（ＨＤ−１）の特徴と比較したものが表１に示される。

本発明に従う有用なり、ｔ、単離体は寄託されている。又興味ある８、ｔ、遺伝 子を含むＮｌｉ替え微生物が寄託されている。

培養基　寄託番号　寄託日 ハ゛ンラス・チ】−リシサーンソスＰＳ５０ＣＮＲＲＬ　Ｂ−１８７４６１９９ １年　１　月　９　日大腸菌聞５２２［ｐＭＶＣ＋６３８］　ＮＲＲＬ　Ｂ−１ ８７５１１９９１年！月１１日バー）５２・ｆ】−’ＩＷ−シソ２ＰＳ８６ＡＩ 　Ｎ　ＲＲＬ　Ｂ　−１８４００１９８８年　８月　！　６日入１１１１ＷＮＭ ５２２［４ｃ２３２０］　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７６９１９９１年２月目日１１− ．・ラス・チ】−リンケーンシスＰＳ４３Ｆ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２９８１９８ ８年　２月　２　日大腸菌ＸＬＩ−８１ｕｅ［ｐＭｌ、９８−４］　ＮＲＲＬ　 Ｂ−１８２９１１９８８年１月１５日本出願に開示される培養基はアメリカ合衆 国６１６０４イリノイ州ペオリア、ノースユニバーシティ−ストリート１８１５ のノーザンリージョナルリサーチセンター。

アグリカルチュラルリサーチサービスパテントカルチャーコレクション（ＮＲＲ Ｌ）に寄託されている。

本培養基は、３７　ＣＦＲｌ、＋４及Ｕ３５　ＵＳＣＩ２２（７）下に特許庁長 官が権原ありと認める者が本特許出願の係属中に培養基を人手できることを保証 されるという条件下に寄託された。また、本出順又はその子孫の対応特許出願が 提出されている国々の外国特許法で要求されるならば、寄託物は入手できる。し かし、寄託物が人手できるからといって、行政行為によって付与された特許権を 損わしめて本発明を実施する権利を構成するものではないことを理解すべきであ る。

更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約の規定に従って保存され、 一般の人々に入手可能とされる。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近 の請求後生なくとも５年閏、かつどんな場合も、寄託期日から少なくとも３００ 年閏、又は培養基を開示して発行される特許の権利行使可能な期間中、これらの 寄託物は、生育可能で汚染されていない状態に保つために必要なあらゆる配慮を もって保存される。要求を受けた受託施設が、寄託物の状態のために試料を供給 できない場合には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである０本培養 基寄託物の一般への入手可能性に間するすべての制限は、これらを開示した特許 が付与されると永久に取り除かれる。

本発明の鱗翅類毒素は、既知の方法で単離出来、広範囲の微生物宿主へ導入でき る。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の細胞内生産と保持をもたらす 、適当な宿主、例えばシュードモナスの場合、微生物は鱗翅類昆虫発生位置に施 用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結果、望んでいない昆虫を 防除できる。

その代わりに、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の活性を 持続させるような条件下に処理できる０次に処理細胞を目標害虫環境に施用でき る。生ずる生成物はＢ、ｔ、毒素の毒性を保持している。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子が適当なベクターを経て微生物宿主へ導入されて、この宿主 が生きている状態で環境へ施用される場合に、ある宿主微生物を使用することが 重要である。微生物宿主は、一つ以上の重要作物の「植物領域」（葉面、葉領域 、種領域、及び／又は根表面）を占有することが知られたものを選択する。これ らの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野性型微生物とうまく 競合できるように選ばれ、ポリペプチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持 と発現を提供し、望ましくは殺虫剤が環境的に分解及び不活性化することからの 改良された保護を提供する。

広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領域（ＭｅＩ５の根の周囲の 土壌）に生息する多数の微生物が知られている。これらの微生物は［［１煩及び 菌類を包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュードモナス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒ ｒａｔｉａ）、クレブシェラ（に１ｅｂｓｉｅｌｌａ）、キサントモナス（Ｘａ ｎｔｈｏｇ＋ｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ＋５ｙｃｅｓ）、 リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｇ＋）、ロードシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓ ｅｕｄｏｗｏｎａｓ）、メチロフイリウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉ　Ｉ　１ｕｓ ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｗ）、アセトバクター（Ａ ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アースロ バフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔ ｅｒ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びアルカリゲネス（ Ａｌｃａｌ　ｉ＠ｅｎｅｓ）属の細菌；真菌類、特に酵母、例えばサツカロミセ ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコツカス（ｃ　ｒ　ｙｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ）、クルイベロミセス（に１ｕｙｖｅｒｏｓｙｃｅｓ）、スポロボロミ セス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（ＲｈｏｄｏｔｏｒｕＩ ａ）、及びオーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属などの微生 物である。特に重要なものは、シュードモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス伊フルオレッセンス、セラティア ・マルケスケンス（Ｓ　ｅ　ｒ　ｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセト バクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｉ＋）、アグロ バクテリウムパンメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ）、ロードシュードモナス６スフエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄ ｏｗｏｎａｓ　５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ ａｎｔｈｏ＊ｏｎａｓ　ｃａ＋ｗｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム・メリオチ（Ｒ ｈｉｚｏｂｉｕｓ　ｗｅｌｉｏｔｉ）、アルカリゲネス・エントロフス（Ａｌｃ ａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）。

及びアゾトバクタ−・ヴインランデイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｌａｎ ｄｉｉ）のような植物領域の纏薗種；及びロードトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔ ｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）、Ｒ，グルチニス（Ｒ，ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ，マ リーナ（Ｒ，５ａｒｉｎａ）、Ｒ，オーランティアカ（Ｒ。

ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、クリプトコツカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃ。

ｃｃｕｓ　ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ，ジフルエンス（Ｃ，ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、 Ｃ，ローレンチ４　（Ｃ，１ａｕｒｅｎｔｉｉ）、サツカロミセス・ロゼイ（Ｓ 。

ｒｏｓｅｉ）、Ｓ、プレトリエンシス（Ｓ、　ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ 、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロミセス・ロゼウス（ Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ、オドルス（Ｓ、　ｏｄｏ ｒｕｓ）。

クルイベロミセス９ヴエローナエ（に＋ｕｙｖｅｒｏ＊ｙｃｅｓ　ｖｅｒｏｎａ ｅ）及びオーレオバシジウム・ポルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｏ ｌｌｕｌａｎｓ）のような植物領域の酵母種である。特に重要なのは有色素微生 物である。

遺伝子の安定な維持及び発現を可能とするような条件下に、毒嚢発ＴＭ　ｅ、ｔ 、遺伝子を微生物宿主に導入するには、広範囲の方法が利用できる。毒素遺伝子 発現用の転写及びｇｌ！駅調節信号と、そのｒ１４節制御下の毒素遺伝子、及び 絹込みを行なうための宿主生物内の配列と相同のＤＮＡ配列、及び／又は組込み や安定な保持が起こるための、宿主内でｌＩＮ能出来る複製系などを含んだＤＮ Ａ構造体を用！することができる。

転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含する。ある場合には、毒素 の調節的発現を提供して、毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにする のが望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチベータやエンハンサに 結合する領域、にょって達成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変 化によって誘発てきる０例えば、温度感受性調節領域を使用すると、生物は毒素 を発現せずに実験室で生育てき、環境へ放出されると発現が始まる。他の手法は 、実験室で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環境中での栄 養培地は青紫発現を可能とするものを使用できる。

翻訳開始には、リポソーム結合位置と開始コドンが存在する。

特に活性プロモータを使用し、並びにメツセンジャーＲＮＡの安定性を強化する 配列を使用することによって、メツセンジャーの発現を強化するために種々の操 作を使用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン、ターミネータ−領域を包 含し、任意付加的にポリアデニル化信号を包含してもよい。

転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の５′から３′への方向で、 構造体は、もしあれば転写調節領域とプロモータ（制御領域はプロモータの５′ 又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位置、開始コドン、閏始コドンと 相が合っているオーブンリーディングフレームをもった構造遺伝子、停止コドン 、もしあればポリアデニル化信号配列、及びターミネータ−Ｗ＠を含み得る。

二本鎖としてのこの配列はそれ自体微生物宿主の形質転換に使用できるが、通常 マーカーを伴うＤＮＡ配列を含んでおり、この第二のＤＮＡ配列を宿主へのＤＮ Ａ導入中に毒素発現構造体に結合させることができる。

マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選定を行なうための構造遺伝子の ことである。マーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や 重金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要求宿主に原栄養性を与える相補性 等を提供する。変更された宿主が選定されるだけでなく、野外で競合的であるよ うに、相補性を使用するのが好ましい、構造体の開発に、また宿主の変更に、一 つ以上のマーカーを使用できる。野外で他の野性型微生物に対する競合的利点を 提供することによりて、生物を更に変更できる０例えば、金属キレート剤、例え ばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と一緒に宿主へ導 入できる。この方法で、シブミツオアの強化された発現が青紫生産宿主に競合的 利点を提供するため、宿主は野性型微生物と効果的に競合し、環境中で安定した 生態的地位を占めるようになる。

安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、宿主中で機能出来る複製系 をもフたプラスミドが使用される。複製系は染色体、その宿主又は異なる宿主内 定通常存在するエピゾーム［３から、又は宿主内で安定なウィルス（７）　１１ ｉｌ系カラ誘４１　＃　ｈ　’＋　、　ｐ８Ｒ３２２、ｐＡｃＶｃＩ８４．６Ｆ ＩＯＩＯ１ｐＲＯＩ６＋４等のような多数のプラスミドが入手できる０例として 、オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら、（１９８２年）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　 １５０巻６０６９頁、及びバグダサリアン（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ）ら、（１ ９８１年）　Ｇｅｎｅ　１６巻２３７頁、並びに合衆国特許＠４，３５６．２７ ０号、ｍｌ！　４，３６２．８１７号、及び第４，３７１．６２５号を参照のこ と。

機能出来る複製系が存在しない場合、構造体は宿主内の配列と相同な、少なくと も５ｏ塩基対（ｂｐ）、好ましくは約１００　ｂｐ、そして通常的１．０００　 ｂｐｔｔ鴫えない配列も含む。

こうして合法的な組換えの確率が高められるため、遺伝子は宿主へ鞘み込まれ、 宿主にょフて安定に保持される。

毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接 しているのが望ましい、従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補 性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子も失う可能性が強く、このため 無傷の構造体を保持している遺伝子と環境中で競合できなくなる。

［Ｌバクテリオファージ、シアノバクテリア、ｆｌＱ、真菌類等のような広範囲 の微生物宿主から多数の転写調Ｉ！ｌｉＩ域が入手できる０種々の転写調節領域 は、ｔｒｐ遺伝子、Ｉａｃ遺伝子、３ａｌ遺伝子、ラムダ左及び右プロモータ、 ｔａｃプロモータ、及び宿主中で機能出来る場合は毒素遺伝子と関連した天然プ ロモータを含む０例として米国特許第４，３３２．８９８号、第４．３４２．８ ３２号、及び第４．３５６．２７０号を参照のこと、ターミネーション（終止） 領域は、普通はその転写開始領域と関連づけられたターミネーション領域か、又 は二つの領域が宿主内で適合性でＩｌ能出来る限りにおいて異なる転写開始領域 と関連づけられたターミネーション領域でありうる。

Ｂ、ｔ、遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、転写翻訳開始領域と転写 翻訳終結９Ｉ域との間に導入できる。

この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは少なくとも一つのａ！髪系を 包含するが、一つを越える複製系を包含でき、その場合一つのａ製糸はプラスミ ドの開発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最終宿主での機能発揮 に必要である。更に、すでに述へた一つ以上のマーカーが存在できる０組込みを 望む場合は、プラスミドは宿主ゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。

形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在する時は、それらに対して所 望生物を選定できるように、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離できる ０次に形質転換体を殺虫活性のために試験できる。

処理！ｌ胞を目標害虫環境に施用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるのに 適した宿主細胞は原核生物及び真核生物を包含するが、通常、哺乳類のような高 等動物に有毒な物質を生じない細胞に限定される。しかし、毒素が不安定か、哺 乳類宿主への毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準である場合には、 高等生物に有毒な物質をつくる生物も使用できる。宿主として特に興味あるもの は、原核生物と、真ｍ類のような低級真核生物である。ゲノム陰性・陽性双方の 原核生物の例はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒ ｗｉｎｉａ）、シアノ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌ ａ）及びプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）のような腸内細菌科（εｎｔｅｒｏｂａ ｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　；バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）　：リゾビ ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）のようなりゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ ）　＊発光！ｌＩＩ、ジモモナス（Ｚｙｓｏ＊ｏｎａｓ）、セラティア（Ｓｅｒ ｒａｔｉａ）、アエロモナス（＾ｅｒｏｓｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ）、デスルボビブリオ鋤５ｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌ ｌｕｍ）のようならせん菌科；乳酸かん菌科；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ ◇ｎａｓ）及びアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のようなシュードモ ナス科；アゾトバクタ−科及びニトロバクタ−科を包含する。

真核生物にはｔｌ　Ｉｒ　ｎ　（Ｐｈｙｃｏｉｇｙｃｅｔｅｓ）と子のう１１１ １１（＾ｓｃｏｗｙｃｅｔｅｓ）のような真１ｒｌｌｌがあり、これはサツカロ ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｗｙｃｅｓ）とシゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓ ａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ）のような酵母、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、オーレ オバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｔｕ■）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏ ｂｏ　１ｏ＊ｙｃｅｓ）のような担子Ｉｒ類（８ａｓｉｄｉｏ＊ｙｃｅｔｅｓ） ｌｔｋ母を包含する。

細胞は通掌、簀傷であって、処理時に胞子型よりも実質的に増殖型にあるが、あ る場合には胞子も使用できる。

微生ｖ！Ｊ細胞、例えばＢ、ｔ、青票遺伝子を含有する微生物の処理は、毒素の 性状に悪影響を及ぼさないか、又は毒！を侃謹する細胞能力を消滅させない限り 、化学的又は′ｓ浬的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の朝合わせによ る。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子番号＋７−８０のハロゲンである 。もっと特定的には、ヨウ素を温和な条件下ζこ、所望の結果を達成するのに十 分な時間に使用できる。他の適当な手法は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデ ヒドのようなアルデヒド類：塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのような 抗感染剤；イソプロピルアルコールとエタノールのようなアルコールｎニブアン 固定剤、及びヘリ−固定剤［フマソン（Ｈｕｍａｓｏｎ）、グレッチェン・エル （Ｇｒｅｔｃｈ−ｅｎ、　Ｌ、）　ｒ動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリ ーマン社、１９６７年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での処理；又 は宿主動物に細胞を投与する時に細胞中につくられる毒素の活性を保持し、持続 させるような物理的処理（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。物理 的手段の例は、ガンマ故射線とＸ線のような短波長放射線、凍結、ＵＶ照射、凍 結乾燥等である。

一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するような、強化された構造安定性 をもつであろう、殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ 型から成熟型への処理を抑制しないように、不活性化方法を選定すべきである。

例太ばホルムアルデヒドはタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工 を抑制しうる。不活性化ないし殺虫方法は、毒素の少なくとも実賞量の生物学的 利用率又は生物活性を保持する。

生産目的のために宿主″ａ！Ｉｌｉ！を選択する上で特に重要な特性は、Ｂ、ｔ 、遺伝子の宿主への導入の容易さ、発現系の人手性、発現効率、宿主中の殺虫剤 の安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプセルとして 使用するのに興味ある特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケージング 又は封入体の形成のような殺虫剤保護性：葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害虫 に摂取させるための誘引力；毒素に損害を４丸ない殺菌固定の容易さ等を包含す る。他の考慮としては、処方と取扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。

特に重要な宿主生物は、ロートトルラ種、オーレオバシディウム種、サツカロミ セス種、スポロボロミセス種のような酵母；シュードモナス種、エルウィニア種 、及びフラボバクテリウム種のような葉面に生息する生物；又はエシェリキア、 乳酸杆菌Ｌバシラス種等の他の生物を包含する。特定的な生物は、シュードモナ ス・アエルギノサ（ＰｓｅｕｄｏＩｌｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュ ードモナス会フルオレッセンス（Ｐ、ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サツカロミ セス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バ シラス懺チューリンゲンシス、大腸菌、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）等を包 含する。

８、ｔ、鱗翅類遺伝子を含有する細胞宿主は任意慣用の栄ＩＩ培地で生育てきる が、ＤＮＡ構造体が選択的利点を提供するときは、細胞の全部又は実質的に全部 が８．ｔ、遺伝子を保持するように選択培地を与える０次にこれらの細胞を慣用 方法に従って収穫する。その代わりに、細胞を収穫前に処理することもできる。

ｅ、ｔ、細胞を種々の方法で処方できる。これらを種々の不活性材料、例えば、 無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植物材料（粉末トウ モロコシ穂軸、もみ殻、クルミ般等）と混合することにより、水和剤、粒剤又は 粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助剤、安定化剤、その他殺虫添加物、又 は表面活性剤を包含できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フ オーム、ゲル、Ｖ濁液、乳剤等として使用できる。成分はレオロジー剤、表面活 性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含できる。

殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮液か直接使用されるかによって、広範 囲にわたる、毒素は少なくとも約１［１て存在し、約１００重量Ｘでありうる。

乾燥処方剤は約１−９５重量２の毒素をもつが、液体処方剤は一般に約１−６０ １　ｆｆｉ　Ｘの固体を液相中にもつであろう、処方剤は概して一８当たり約１ ０２ないし約１０’ｌｌの細胞をもっであろう、これらの処方剤はへクタール当 たり約５０　ｍｇ（液体又は乾燥）ないしＩ　ｋｇ以上で投与されよう。

処方剤は鱗翅類害虫の環境、例えば植物、土壌、又は水に噴霧、散布、散水等に よって施用できる。

以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示した実施例である。これらの 例は限定的に考えられてはならない、他に注目がなければ、百分率はすべて重量 、溶媒混合物割合はすべて容量による。

実施例１　バシルスチューリンゲンシス単離体の培養本発明のバシルスチューリ ンゲンシスのサブカルチャーを次の培地、ペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種す るのに使用できる。

バクト・ペプトン　７．５０　ｇ／ｌ ブドウ糖　１．００　ｇ／ｌ に８２ＰＯａ　、３．４０　ｇ／Ｉ Ｋ２ＨＰＯａ　４．３５　ｇ／ｌ 塩ｉ液　５．００■１／ｌ ＣａＣｌ５−溶液　５．００　ｍｌ／ｌｐＨ７，２ 塩溶液（１００ｍｌ） ＭｇＳＯａ・７Ｈ２０２，４６３ ＭｎＳＯ４”Ｈ２Ｏ０，０４ｇ Ｚｎ５Ｏａ・７Ｈ２００，２８ｇ ＦｅＳＯ４・７８２０　０．４０　ｇ ＣａＣＩ２ｉ液（１００ｍｌ） ＣａＣＩ２・２Ｈ２０３，６６ｇ 塩溶液とＣａＣＩ□浴溶液濾過滅菌し、オートクレーブ処理し調理したブロスに 、接種時に添加する。２００　ｒｐ−で操作される回転振とう機で、フラスコを ３０℃、６４時間培養する。

上の手順は、この技術で周知の手順ζこ上り、大醗酵装置まで容易に規模拡大で きる。

上の醗酵で得られるｅ、ｔ、胞子及び結晶ζよ、この技術で周知の手順により単 離できる。しばし乞！用（１られる手順は、取り入れた醗酵液を分離手順、例え ζＩ遠ｒＱ分離りこｔ））けることである。

実８ｖ例２　Ｂ、ｔ、単離体ＰＳ５０Ｃからの毒素遺伝子のクローニング ６００ｎｍに於ける光学密度１．０に生育した１＜シルレス・チューリンゲンシ ス（８，ｔ、）細胞から、全細胞ＤＮＡを調製した。細胞を遠心分離によって回 収し、２０％庶糖と５０■濃度とした。膿胞材料を（最終濃度）　１００　ｗＭ の中性塩（ヒカリウム中、４℃で一夜沈殿させた。上澄みｔ夜をフェノールｌク ロロホルム（１：ｌ）で２回抽出した。核酸をエタノール中で沈殿させ、ＤＮＡ を塩化セシウム／臭化エチジウム勾配上の密度平衡バンディングによって精製し た。

Ｂ、ｔ、５ｕｂｓｐ、クマモトエンシス（Ｂ、ｔ、ｋｕｖ、）単離体ＰＳ５０Ｃ からの全細胞ＤＮＡを）Ｉｉｎｄｌｌｌで消化させ、０．８％（ｗ／ｖ）アガロ ースゲル−ＴＡＥ　（５０ｓ＋Ｍトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭＮａ０Ａｃ、２．５ 　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ＝８．０）緩衝化ゲル上の電気泳動によって分画した 。ゲルのサザンプロットを、［３２ｐ］放射性標識オリゴヌクレオチドプローブ とハイブリダイズした。結果は、ハイブリッド化したＰＳ５０Ｃ断片が１２　ｋ ｂ、及び１．７　ｋｂの大きさであることを示した。

Ｓ　ａｕ３Ａで部分消化されたＰＳ５０Ｃ全細胞ＤＮＡからライブラリーを構築 し、ゲル電気泳動によってサイズ分画した。ゲルの９−２３　ｋｂ領領域切り出 し、ＤＮＡを電気溶離し、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄＴ″イオン交換カラム（シュライヒ ヤー・エンド・シュニル社、ニューハンプシャー州キーン）を用いてＩＩＩｔｉ ａシた。単離されたＳ　ａｕ３Ａ断片をＢａ５ａｌ消化したラムダ（Ｌａｓｂｄ ａ）ＯＥＭ−Ｉｔ”　（ＰＲＯＭＥＧＡ）に連結した。

パッケージにしたファージを大腸菌にν２５＋細胞（ＰＲＯＭＥ（、Ａ）上で高 力価で平板培養し、放射性標識つきオリゴヌクレオチドを用いて選定した。ハイ ブリッド化プラークを精製し、低プラーク密度で再選定した。プローブとハイブ リッド形成させた単一単離精製プラークを用いて、ＤＮＡ単離用のファージ調製 のため、液体培養基中で大腸菌にν２５１ｍ胞に感染させた。ＤＮＡを標準手順 によって単離した０分離量のＤＮＡをＸｈｏ　ｌて消化しくラムダ配列から挿入 ＤＮＡを解放させる為）、そして０．６％アガロース−ＴＡＥゲル上の電気泳動 によって分離した。大きな断片をイオン交換クロマトグラフィによって上の様に 精製し、Ｘｈｏ　ｌ消化脱ホスホリル化ｐＨＴＢＩｕｅｌｌ　（ｐＢＩｕｅｓｃ ｒｉｐｔ　ｓ／ｋ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ］及びレジデントＢ、ｔ、プラスミド からの複製オリジンからなる大腸菌／Ｂ、チューリンゲンシスシャトルヘクター ［Ｄ、レレクラス等＋９８９．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

ｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　６０：２目−２１８１）に連結した。連結混合物をコン ピテント大Ｉｌｌ　＠　８Ｍ５２２細胞（ＡＴＣＣ４７０００）へ形質転換によ って導入し、アンピシリン、イソプロピル−（β）−〇−チオガラクトシド　（ ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ−４−クロロ−４−インドリル−（β）−〇−ガラク トシド　（ＸＧＡＬ）を含有するＬＢ寒天上にプレートした。　ｐＨＴＢｌｕｅ ｌｌの（β）−ガラクトシダーゼ遺伝子中に推、室上の制限断片挿入物を有する 白色集落を標準的な急速プラスミド精製手順にかけた。プラスミドを×ｈ０１消 化とアガロースゲル電気泳動て分析した。所望のプラスミド構築物ｐＭＹＣ１６ ３Ｂは＋２　ｋｂのＸｈｏｌ挿入物を含有していた。ヌクレオチド配列（オーブ ンリーディングフレームのみ）が配列ＩＤＮｏ。

１に示されている。毒素の予消されるペプチド配列が配列ＩＤＮｏ、２に示され ている。

プラスミドｐＭＹｃ１６３Ｂはエレクトロポレーション（電気穿孔法）によって 非結晶性（ａｃｒｙｓｔａｌｌｉｆｅｒｏｕｓ）（Ｃｒｙ−）　８．ｔ、宿主（ ブルード大学のＡ、アロンソンから得たＨＤ−１ｃｒｙＢ）に導入した。およそ １３０　ｋＤａの蛋白質の発現が５ＤＳ−ＰＡＧＥによって追認された。

ｅ、ｔ、毒素遺伝子を含有しているプラスミドｐＭＹｃ１６３日は標準の良く知 られた手順を用いて形質転換された宿主微生物から除くことが出来る０例えば、 大腸菌ＮＭ５２２［ｐＭＹＣ１６３８］ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７５１を透明にした 溶菌物の密度勾配平衡手順などにかけてｐＭＭＣ１６３Ｂを回収する。

実施例３　Ｂ、ｔ、単離体ＰＳ４３Ｆからの毒素遺伝子のクローニング及びシュ ードモナスへの形質転換全細胞ＤＮＡを、Ｂ、ｔ、単離体ＰＳ４３Ｆ及Ｕ　Ｍ− ７の細胞を低い光学密度（００８゜。＝　１．０）に生育させ、遠心分離機で菌 体を回収することによって造った。菌体な２０％蔗糖及び５０ｍｇ／ｍ　ｌリゾ チームを含有する緩衝液中にプロトプラスト化した原形質体をＳＯ５を最終濃度 ４％に添加することによって溶菌した。細胞物質を４℃で１００−門中性塩化カ リウム中で一夜沈殿させた。上澄みはフェノールｌクロロホルム抽出を２回し、 ＤＮＡを６８％エタノール中で沈殿させた。ＤＮＡを塩化セシウム勾配物上で精 製した。

４３Ｆと阿り菌株からのＤＮＡ（Ｍ−７は参照用標準）をＥｃｏＲｌで消化し、 そして０．８％アガロースゲル上で走らせた。

ゲルをサザンプロットにし、Ｈづから単離された毒素コ−ド遺伝子のニックトラ ンスレーションされたＯＲＦ　Ｘ５ｎｌからＰｓｔｌの断片（これを以後プロー ブと呼ぶ）でプローブした。結果は４３Ｆがプローブに対し？、５ｋｂでハイブ リット化することを示し、これは標準とは異なっていた。

４３ＦのＤＮＡの分ｌｌＩ量をＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル上 で走らせた８分離用ゲルの７．５ｋｂ領域を単離し、ＥＬＵＴＩＰＴ門−ｄにュ ーハンプシャー州、キーレのシュライヒャーアントシュエル）イオン交換カラム を使用してＤＮＡを電気溶離しａｌｉＩシた。試料をブトットし、プローブし、 断片が実際単離されたことを確認した。７．５ｋｂＥｃｏＲｌ断片をラムダ（Ｌ ａｍｂｄａ）ＺＡＰＴ″ＥｃｏＲ１アームに連結した。パッケージにした組替＾ ファージを大腸菌菌株ＢＢ４と共に（カリフォルニア州、ライクのストラテジン 　クローニング　システ１１ズＵ）プレートにし、高いプラーク密度を得た。

これらのプラークをプローブで標準手順でスクリーニングした。ハイブリット化 したプラークを精製し、低いプラーク密度で再スクリーニングした。生じるファ ージを１３へルバーファージ（スタラテジーン製）と共に生育させ、朝替えＢＬ ＵＥＳＣＲＩＰＴＴ″プラスミドを自動的に切取りパッケージにした。「ファー ジミド」を自動切出しプロセスの一祁としてＸＬ−１ブルー（ｂｌｕｅ）大腸菌 細胞（ストラテジーン！り中で再感染された。１ｓ染した×Ｌ−１ツー１ブルー 菌 生しるコロニーをミニブレツブし、所望のプラスミド哨１、９８−４を見出した ，紺替え大ＩＩＩ　［　ＸＬ−１ブルー（Ｂｌｕｅ）（ＣＭｌ。

９８−４）Ｉｉ株をＭＲ３８１と呼ぶ。

プラスミドｐ１．９８−４は７．５ｋｂのＥｃｏＲ１挿入物を含有していた．こ の挿入物が興味あるものの−っであることを確認するためにサンプルツクを実施 し、プローブした。

プローブとハイブリット化する７．５ｋｂのバンドは、断片がクローン化されて いることを確認しているａ　７　−　５　ｋ　ｂ　Ｅ　ｃ。

Ｒ１断片の酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｐｓｔｌ、５ｐｅｌ、ＢａｍＨｌ，　Ｘｂａｌ による制限エンドヌクレアーゼ分析を、Ｍ−７がクローン化されたものとは遺伝 子が異なることを示すために行った．７。

５ｋｂＥｃｏＲＩ断片内に切込まれる酵素はＨｉｎｄｌｌｌ（２　ｒＭ所）、Ｓ ｐｅｌ（２ｗＪ所）、及び、Ｐｓｔｌ（ｌｆｔｌ所）であった、４３Ｆ遺伝子の オーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、Ｈｉｎｄｌｌｌで１箇所、５ｐｅ ｌで２箇所カツトされ、Ｘｂａ　Ｉ、ε（ｏＲ　Ｉ又はＲａｗ旧てはカットされ ない．配列データは１９６３ｂｐのオーブンリーディングフレームを示し、最高 で７０％の１７の毒素コード化遺伝子に対する配列類似性を有している。

ＰＳ４３Ｆからのクローン化毒素遺伝子を次の方法でＰ．フルオレッセンス中で 発現させる冷めに変更することができる。

（１）　Ｐｔａｃ−プロモーチットｃｒｙｌＡ（ｂ）様毒素遺伝子を含有するア ラ；１．ミＦを、ｐＭ３，＋３０−７　（米国特許第，５，０５５，２９４中に 開示されるＭＲ４２０、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３３２からのもの）からの約４５０ ０ｂｐのＢａ＋ｗＨｌ−Ｐｓｔｌ断片上、ｐＴＪｓ２６０　（　Ｕ．Ｃ．サンジ エゴのトクタートナルトへリンスキから人手できるテトラライクリン抵抗性遺伝 子を含有しているもの）からの約５５００ｂｐのＮｏＬｌ−Ｂａａ＋Ｈｌ断片上 、及びｐＴ．１２６０（複製領域を含有している）からの約６１００ｂｐのＮｏ ｔｌ−Ｐｓｔｌ断片上の、Ｐ置プロモーターと毒素遺伝子とを伴う３ウエイのリ ゲーションを用いて造ることがてきる．Ｍ立られたプラスミドは大ＨＭの形質転 換、そしてテトラサイクリン選択下での生育の後に回収される。

（２）　Ｐｔａｃ−プロモーチット′４３ＦＩ　Ｗ遺伝子を含有するプラスミド は、ｐ旧，９Ｂ−４　（　ＭＲ３８１（ｐ旧，９８−４）、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８ ２９１からのもの）の約２２００ｂ１１の前嚢遺伝子含有Ｆｓｐｌ−Ｓｓｐｌ断 片を大％１Ｍヘクターｐにに２２３−３　（ファルマシア）の５ＩＩａｌ場所に 連結することによって造ることができる，　Ｐｔａｃ−プロモーチット４３Ｆｌ 素プラスミドは大ｌｉｌ！菌の形質転換、アンピシリン遇択下ての生育及びこの 分野で良く知られた技術によるｔａｃプロモーターからの発現の為の適正な方向 性で挿入物が存在するプラスミドのスクリーニングに続いて回収することができ る。

（３）　Ｐｔ．ａｃ−プロモーチット４３Ｆ１１素はＢａｍＨｌと上の段階１か ら生しるプラスミドからのフィルインされたＮ５ｉｌ末端を有する１２．６ｋｂ Ｄ　Ｎ　Ａ断片を使用する、Ｂａ５Ｈ１−Ｎｓｉｌ　Ｐｔａｃ−含有断片的１． ２ｋｂ及びＮ５ｉｌ−５ｃａｌ断片約２．　Ｉｋｂであって、４３Ｆ＠素遺伝子 の３′末端を含有するもの、及び上の段階２から生しるプラスミドからの隣接ベ クターＤＮＡへの３様のリゲーションに於いて、例えばｐＴＪｓ２６０に由来す るベクターに組込できる。

生じるｐＴＪｓ２６０に由来する４３Ｆ毒素発現プラスミドは、電気穿孔法くエ レクトロポレーション）によってシュードモナスフルオレッセンス中に導入でき る。

上記のクローニング手順は別途記載されない限り標準手順を使用して実施された 。

プラスミドの製造及び宿主生物の形質転換で使用する種々の方法はこの分野で良 く知られている．これらの手順はマニアテス，Ｔ．．　Ｔ．Ｆ．フリッシュ、Ｊ ．サンプルツク（　＋９８２）モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　ＣＩｏｎｉｎｇ）：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ニューヨー クのコートスプリングハーバ−ラボラトリ−に記載されている．従って微生物！ ！鞄からＤＮＡを抽出し制限＃素消化を実施し、ＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、 プラスミドＤＮＡ及び挿入ＤＮＡをティリング及びアニーリングし、ＤＮＡを連 結し、細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡを製造し、蛋白質を電気泳動にかけ 、ＤＮＡの配列を決定することは遺伝子工学分野の当業者がなしうろことである 。

本明細書に開示された制限酵素はインジアナ州インジアナポリスのボエリンガー マンハイム、又はマサチューセッツ州バーバリーのニューイングランドバイオラ ブズから購入できる．これらの酵素は供給者にょフて提供される指示書に従フて 使用された。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含有するプラスミドル門１．９Ｂ−４は標準の良く知られ た手順を使用することによって形質転換された宿主微生物から除去できる０例え ば大Ｉｉ　Ｉ　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（ｐＭＩ、８９−４）は透明化溶菌物密度勾配 平衡手順などにかけられｐＭｌ、９８−４を回収する。

６００ロｌで１．０の光学密度に生育させたＰＳ８６ＡＩｍ胞から全細胞ＤＮＡ をｖ４！！シた。細胞を遠心分離によってベレット化し、原形質緩衝液（０，３ Ｍ庶塘中２０　Ｂ／ｍｌリゾチーム、２５■門トリス−Ｃ１、ｐＨ８，０，２５ ｓＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。３７℃で１時間環ｌＩ後、２周朋の冷１− 解凍によって原形質を溶菌化した。　Ｏ，１Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％ＳＯ５，Ｏ ，１Ｍトリス−Ｃ１の溶液９倍量を加えて溶菌化を完了させた。

透明溶Ｍ液をフェノール：クロロボルム（１：ｌ）で２回抽出した。核酸を２倍 容量のエタノールで沈殿させ、遠心分離によってベレット化した。ペレットを１ ０１）リス−Ｃ１，１■Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）　（ｐｈ　８．０）中に再懸濁し 、ＲＮＡ５ｅを５０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。３７℃で１時間培養後、 溶液をフェノール、クロロホルム（１：ｌ）及びＴＥ飽和クロロホルムでそれぞ れ１回抽出した。　Ｉ／ｌｏ量の３Ｍ！１ａＯＡｃ及び２倍量のエタノールを添 加して、ＤＮＡを水相から沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離によってベレット化し 、７０％エタノールで洗い、乾燥し、ＴＥに再懸濁した。

ＰＳ８ＧＡＩＤ　Ｎ　Ａのサザーンプロットと、８６ＡＩ−Ａ１７指定されるｆ ｆ２ｐ−標識つきオリゴヌクレオチドプローブとの標準ハイブリット形成によっ て、制限断片長の冬型現象（ＲＦＬＰ）分析を行なった。８６ＡＩＡブロー・ブ の配列（よ以下のとおりであった。

５“　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡＣＣ Ａ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＴＣＴ／Ａ　ＴＴＡ　ＡＴＴ／Ａ　ＣＡＴＡＣＴ／Ａ　Ａ ＴＴ／Ａ　ＡＡ　３’　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ，’？）プローブを図に示すよう に、４位置で混合した。ハイブリット形成バントは、約３．６　ｋｂｐ　Ｈｉｎ ｄｌｆｌ断片と約９．３ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ断片を包含した。

５ａｕ３Ａで部分消化させたＰＳ８６ＡＩＤ　Ｎ　Ａから遺伝子ライブラリーを 構築した。部分的制限消化物をアガロースゲル電気泳動によって分画した。　６ ．６−２３　ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をゲルから切出し、ゲルスライスから 電気溶離し、エルチップ−Ｄイオン交換カラムでの精製後、エタノール沈殿によ って回収したａ　Ｓ　ａｕ　３　Ａ挿入物をＢ＆１ＩＨ１で消化させたラムダＧ ｅｍ−１１（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）へ連結させた０組替えフ ァージをパッケージし、大腸菌ＫＷ２５１！１胞（プロメガ社）へプレートした 。放射性標識つき８６ＡｉＡオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成 によって、プラークを選別した。ハイブリット形成ファージをプラーク精製し、 これを用いて標準手１１１ｉによってファージＤＮＡの単離のため大１＋ｌｌｌ ＫＷ２５１ｍ泡の液体培養基に感染させた［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら ［１９８２年コ　「分子クローニング゛実験マニュアル」コールドスプリングハ ーバ−研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−］。二次クローニン グに；ま、ＤＮＡの調髪量をＥｃｏＲＩとＳ　ａｌ　Ｉで消化させ、アガロース ゲル上の電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有する約２．９　ｋｂｐのバンドを ゲルから切出し、ゲルスライスから電気ＮＭし、上のようにイオン交換クロマト グラフィによって精製した。精製されたＤＮＡ挿入体を、ＥｃｏＲＩ＋５ａｌｌ て消化させたｐＨＴＢ　１ｕｅｌｌ　［即ち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ／に （ストラタジーノン土、カリフォルトニアすサンディエゴ）を含む大腸菌／Ｂ、 ｔ、シャトルベクター］とレジデントｅ、　ｔ、プラスミドからの複製開始点［ ディー・レレクラス（Ｄ、　Ｌｅｒｅｃｌｕｓ）ら、［１９８９年］　ＦＥＭＳ 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　６０巻２＋１−２１８頁］へ連結させた 。

この連結混合物を使用して、冷イ東されたコンピテント大Ｒ［ｉ　’１Ｍ５２２ ！ａｉ吃（ＡＴ（Ｃ４７０００）を形質転換させた。形質転換体を、アンピシリ ン、イソプロピル−（β）−〇−チオガラクトント（ｌ　ＰＴＧ）及び５−ブロ モ−４−クロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ−ガラクトノＦ（ＸＧＡＬ）を含 有するＬＢ寒天（前掲マニアチスら）上にプレートした。アルカリ溶Ｍ（前掲マ ニアチス）によつＣ推定上の朝替え型からプラスミドをｍｕし、アガロースゲル 上てＥｃｏＲＩ及びＳ　ａｌ　Ｉ消化物の電気泳動によって分析した。所望のプ ラスミド構造体ｐＭＹｃ２３２０は、本発明の毒素遺伝子を含有している。この 遺伝子のＤＮＡ配列を配列ＩＤＮｏ、５に示す、この遺伝子で発現される毒素を 、配列ＩＤＮｏ、６に示す。

プラスミドｐｌｃ２３２０は、エレクトロポレーションによッテ結晶非形成（Ｃ ｒｙ−）　Ｂ４．宿主（Ｂ、ｔ、ＨＤ−Ｉ　Ｃｒｙ　Ｂ、　エイ・アイ・アロン ソン、バーデユー大学、インディアナ州ウエストラフフイアット）に導入された 。およそ５８ｋＤａ蛋白質の発現が５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認された。

Ｂ、　ｔ、毒素遺伝子を含有するプラスミドｐＭＹｃ２３２０は、周知の標準的 な手順を用いて、形質転換宿主微生物から除去Ｔｌル、ＦＭ、ｔｌｆ、大ＩＩＩ Ｎ　ＮＭ５２２　（ｐＭＹｃ２３２０）を透明溶Ｎ液密度勾配平衡手順などにか けると、ｐＭＹｃ２３２０が回収される。

実施例５　形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス宿主による４３Ｆｌ ｌ　緊の生産 ＰＳ４３Ｆ遺伝子を含有している形質転換されたシュードモナスフルオレッセン スは３０μｇ／−１のテトラサイクリンを有するＬＢ培地中で生育された１％の 接種物を使用して次の培地中で生育された。

グリセロール　６５ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム・２８２０　７．１４ＨＣＴ　２０ アンバレツクス（Ａｍｂｅｒｅｘ）　１００３　２０ＮａＮ０．　５ （ＮＨａ）２ｓＯ４２，３ ３００ｒｐ−で３２℃ ７２時間の発酵がなされ、誘発と補充が２４時間においてなされた。これらは２ １Ｍ　ＩＰＴＧで誘発され、次が補充された。

アミソイ（Ａｍ　ｉ　５ｏｙ）　２０．０ｇ／ＬＭｇＳＯ，・７Ｈ２００，４ に２ＨＰＯ４１，６ に（１１，６ 青紫濃度はＳＯ５を含有しているポリアクリロアミドゲルのクマッシー染色後、 Ｐ、フルオレッセンス宿主中に見出されるおよそ７０ｋＤａ毒素蛋白質を定量す るために、レーザーデンシトメトリー（ＬＫＢ）を使用して決定できる。

実施例６　ダイヤモンドバックモスに対するＢ、ｔ、毒素のに１ （Ａ）　ＰＳ８６ＡＩ遺伝子を含んでいるｅ、ｔ、クローンの胞子結晶調製物は １．５％の寒天人工ダイエツトアッセイ中で、ダイヤモンドバックモスであるプ ルテラ　クリロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）鱗翅類害虫 に対し毒性であった。

ｅ、ｔ、クローンを、実施例１に記載するように生育した。

１００μｇ蛋白質／＠ｇよりも大きな比率は６日以内にこの害虫の１００％抑制 を生じた。

（Ｂ）　ＰＳ５０Ｃ遺伝子を含んでいるＢ、ｔ、クローンの胞子結晶ｒＩ４ｉＩ 物は１．５％寒天人工餌アッセイに於いてダイヤモンドバックモスである鱗翅類 害虫に対し毒性であフた。

Ｂ、　ｔ、クローンを実施例１に開示するように生育させた。

１００μ８蛋白質／Ｉｇよりも大きな比率は６日間内にこの害虫の１００％抑制 を生じた。

（Ｃ）　ＰＳ４３Ｆ遺伝子を含んでいるシュードモナスフルオレッセンスクロー ンは１．５％寒天人工ダイエット検定中に於いてダイヤモンドバックモスである 鱗翅類害虫に対し毒性であった。　４０Ｍｇ蛋白質ｌ餌ｇよりも大きな比率は６ 日内にこの害虫の１００％抑制を与えた。

実施例７　ダイヤモンドバックモスに対するＢ、ｔ、毒素のさらに別の試験 本発明の毒素を、本発明に従う遺伝子で形質転換されているＩＩｉ讐え細胞によ って造った０組替え細胞によって造られた毒素は次にダイヤモンドバックモスに 対するそれらの活性に対し試験された。これらの実験の結果は表２に示される。

これらの実験は実施例日に記載されるように実施された。

ＰＳ８６ＡＩ　８６ＡＩ　Ｂ、チューリンケーン’ｔｌ　ＭＲ５０６７９ＰＳ５ ０Ｃ５０ＣＢ、デ】−リンケーンシス　ＭＲ５０５１９ＰＳ４３Ｆ　４３Ｆ　Ｐ 、フルオレッセンス　ＭＲ８１６１１実施例８　毒素遺伝子の植物への挿入 本発明の一つの面は植物を鱗翅類毒素をコードする遺伝子で形質転換することで ある。形質転換された植物は鱗翅類による攻撃に対し抵抗性である。

本明細書に開示される鱗翅類活性毒素をコードする遺伝子はこの分野で良く知ら れた種々の技術を使用して植物細胞に挿入できる。例えば大腸菌中の複製系及び 形質転換細胞の選択を可能とするマーカーを含んでいる数多くのクローニングベ クターが外来遺伝子を高等植物に挿入するために準備するために人手できる。こ のベクターは例えばｐＢＲ３２２、ｐＵｃ　シリーズ、ＭＩ３ｖｐシリーズ、ｐ ＡｃＹｃ！８４などを含む、従ってＢ、ｔ、毒素をコードした配列は適当な制限 場所でベクターに挿入できる。生じるプラスミドは大腸菌への形質転換に使用さ れる。大腸菌細胞は適当な栄養培地中で培養され、次に収穫され溶菌される。プ ラスミドは回収される。配列分析、制限分析、電気泳動及び他の生化学−分子生 物学方法は一般に分析方法として実施される。各々の操作の後、使用されたＤＮ Ａ配列は解裂され、次のＤＮＡ配列に接合される。各プラスミド配列は同じ又は 異なるプラスミド中にクローン化できる。所望の遺伝子を植物に挿入する方法に 依存して他のＤＮＡ配列が必要かもしれない０例えばもし、Ｔｉ又はＲｉプラス ミドを植物細胞の形質転換に使用するときはＴｔ又はＲ１ブラスミＦＴ−ＤＮＡ の少なくとも右ボーダー、そして多くの場合台及び左のボーダーが挿入されるべ き遺伝子のフランキング領域として連結されなければならない。

植物細胞の形質転換の為のＴ−ＤＮＡの使用は、ＥＰＩ２０５１６；ホエケマ（ ＋９５５）ザバイナリー　プラント　ベクター　システムズ（Ｔｈｅ　Ｂｉｎａ ｒｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）、オフセット　ドルッケリジ 　ヵンタース　ｅ、ｖ、、アルプラッサーダム第５章；フラリー等、Ｃｒ１ｔ、 　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ。

４：１−４６；及びアン等（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、　４：２７？−２８７中 に広範囲に研究され、十分に記載されている。

一旦挿入ＤＮＡがゲノム中に統合化されたならば、これはそこで比較的安定であ り、当然再び出現することはない０通常はなかでもカナマイシン、０４１８、プ レオマイシン、ヒグロマイシン又はクロラムフェニコール等の殺生物剤又は抗生 物貿に対し形質転換された植物細胞に抵抗性を与える選択マーカーを含有してい る０個々に用いられたマーカーは従って挿入ＤＮＡを含有していない細胞よりも 形質転換された細胞を選択を選択できるようにする。

ＤＮＡを植物宿主ＩＩ胞に挿入するために数多くの技術が利用できる。これらの 技術は形質転換剤としてアグロバクテリウムッネファシエンス又はアグロバクテ リウムリゾゲネスを使用するＴ−ＤＮＡでの形質転換、融合、注入又は電気穿孔 法（エレクトロポレーション）並びに他の可能な方法を含んでいる。形質転換の ためにもしアグロバクテリアが使用されるならば、挿入されるべきＤＮＡは特定 のプラスミド、即ち中閏体ベクター又はバイナリ−ベクターの何れかにクローン 化されなければならない。

中間体ベクターはＴ−ＤＮＡ中の配列に対する相同性を有する配列のために、相 同のＡｌ１替えによってＴｉ又は１プラスミド中に統合化できる。Ｔ１又はＲ１ プラスミドもＴ−ＤＮＡの運搬に必要なＶげ領域を含んでいる。中閏体ベクター はアグロバクテリウム中でそれら自体複製できない。

中間体ベクターはヘルパープラスミドによってアグロバクテリウムツメファシェ ンス中に移されることが出来る（コンジュゲーション）、バイナリ−ベクターは 大腸菌でもアゲロバクチリア中でもそれら自体複製できる。これらは選択マーカ ー遺伝子及び右及び左Ｔ−ＤＮＡボーダー領域によってフレームされるリンカ− 又はポリリンカーを含んでいる。これらは直接アゲロバクチリア中に形質転換で きる（ホルスタ−等［＋９７８］　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

＋６３：１８１−１８７）　、宿主細胞として使用されるアグロバクテリウムは ｖｉｒ領域を持っているプラスミドを含むはずである。ｖｌ「領域はＴ−Ｄ　Ｎ 　Ａを植物細胞に移すのに必要である。追加のＴ−ＤＮＡが含有され得る。その ようζこ形質転換された細菌は植物細胞を形質転換するのに使用される。植物の 外植片はＤＮＡを植物細胞に移す為にアグロバクテリウムツメファシェンス又は アグロバクテリウムリゾゲネスと共に培養されるのが有利であり得る。全植物を 次に適当な培地中で完成されたり物物質（Ｖ１４えば葉の一片、茎、根のセグメ シト、但しそれらに限らず原杉貢又はり濁培養細胞）から再生でき、上記適当な 培地は選択のための抗生物質又は殺生物剤を含有し得る。そのようにして得た植 物を次に挿入されたＤＮＡの存在について試験できる。注入と電気穿孔法（エレ クトロポレーション）の場合には、プラスミドｉ、こ特別な請求がなされない。

例えばｐｌＪｃ誘導体等の通常のプラスミドを使用することが可能である。

形質転換された細胞は通常の方法で植物内で生育する。

これらは生殖細胞を形成し、そして子孫植物に対し形質転換された性質を伝達す る。そのような植物は通常の方法で生育でき、同じ形質転換された遺伝因子を有 する植物又は他の遺伝因子を有する植物とかけ合わせることができる。生しるハ イブリット個体は対応する表現型性質を有している。

実施例９Ｍ規なり、ｔ、遺伝子の昆虫ウィルスへのり、とニング 数多くのウィルスが昆虫に感染することが知られている。これらのウィルスには 例えばバクロウィルス及びエントモポックスウィルスが含まれる０本発明の一翼 体例に於いて、本明細書で開示される鱗翅類に活性の遺伝子は昆虫ウィルスのゲ ノムと一緒にすることが出来、従ってウィルスの病原性を強めることができる。

　Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含んでいる昆虫ウィルスを造る方法は良く知られ、当業 者に容易に実施され得る。これらの手順は例えばメリウェザー等（メリウエザー 、Ａ、Ｔ、、Ｕ、ウニイヤー、門、Ｐ。

６、ハリス、門、ヒルスト、Ｔ、ブース、Ｒ，Ｄ、ポジー［１９９０］　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　７１：ｌ５３５−１５４４）中に、そしてマルテンス 等（マルテンス、Ｊ、Ｗ、Ｍ、、Ｇ、ホネー、Ｄ、ズイデマ、Ｊ　、　Ｗ　、Ｍ 。

バンレント、Ｂ、ピッセル５．Ｉ　、　Ｍ　、プラク［＋９９０コＡｐｐ１．　 Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５６（９）：２７６４− ２７７０）中に記載されている。

本明細書に記載の実施例及び具体例は例示目的のみのものであり、それらにてら し、種々の変更及び修飾が当業者に示唆され、本願の精神と範囲内に含まれ、そ して添付の特許請求の範囲内に含まれるべきである。

配列リスト （１）一般情報 （１）出願人：ウィエダ、ケンドリック　Ａ。

プラトフィッシュ、グレゴリ−Ａ。

（ｉｉ）　発明の名称：鱗ｍｕ害虫の防除方法（ｉｉｉ）配列数ニア （ｉｖ）通信住所 （Ａ）宛先：デビット　Ｒ，サリヮンチック（Ｂ）街路：　２４２１　）１．Ｗ 、　４１ｓｔ　ストリート、スウィートＡ−１ （Ｃ）シティ−名ニゲインスピル （０）州名：フロリダ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　３２６０６ （ν）次のコンピューターから読取り可能（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター＋　ＩＢＮ　ＰＣとコンパチブルのもの （Ｃ）　オヘ０トチインク゛システム：　ＰＣ−００５／ＭＳ−００５（Ｄ）　 ソフトウｘ１：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　＆リース１１．０．　バーーシ゛３ンｓ１ ．２（■１）現時点の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）前の出願データ （＾）出願番号：　ＵＳ　０７／７５８．０２０（Ｂ）出願日：　１９９１年９ 月Ｉ２日（Ｃ）分ｎ： （Ｖ目）ｌｆＪの出願データ （Ａ）出願番号：ＵＳ　０７／６５８．９３５（Ｂ）出願日：　１９９１年２月 ２１日（Ｃ）分類： （ν１１）前の出願データ （Ａ）出願番号：　ＬＩＳ　０７／６４２．１１２（Ｂ）出願日：　１９９＋年 １月１６日（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報 （Ａ）氏名：サリワンチク、デビット　Ｒ１（Ｂ）登録番号：　３１，７９４ （１ｘ）テレコミュニケーション情報 （Ａ）電話：　９０４−３７５−８１００（Ｂ）　フックス：　９０４−３７２ −５８００（２）　ＳＥＱ　１０　ＪｉＯ：Ｉ：に間する情報（１）配列の特ｔ ｓｔｈ： （Ａ）長さ：　３４７１塩基対 （８）種ｎ：核酸 （Ｃ）ストラント：二本鎖 （０）トポロジー：線状 （１１）分子ＷＩ類：ＤＮＡ（ゲノミック）（１１）仮説か？コノ− （１ｖ）アンチセンス二ノー （ｖｉ）元々の給Ｒ： （Ａ）生物：バシラス・子ューリンゲンシス（Ｂ）菌株：クマモトエンシス （Ｃ）　Ｗ々の単履体名：　ＰＳ５０Ｃ（ｖｉｉ）すぐの供給ＷＪ： （Ｂ）クローン：大１１１ｉ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　８Ｍ５２２（ｐＭＹＣ１６３ ８）、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７５１ （ｘｌ）配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：Ｉ：ＡＷｅ入ＧＣＴＧＡ↑？ＣＧ ＡＣＣＧＴ　ＡＡＣＡ？ＡＣＡＣ＾ＧＣτＡ入Ｔテ入ＣＧＧτｃａ＾＾τＣ＾Ｃ ！τＣＡＧＡＡＪＩＡＧ　１２O０ （２）　ｓＥＱ　＋ｏ　ＮＯ：２：ニＨする情噌（１）配ダリの特徴： （＾）長さ：１１５７アミノ酸 （Ｂ）種ｎ二アミノ酸 （Ｃ）ストランドニ一本鎖 （０）トボロシー二線状 （１）分子種ｔＩ：蛋白質 （Ｊ目）仮説が？：イエス （ｉν）アンチセンス：ノー （ｖｉ）元々の給源： （＾）生物：バシラス・チューリンゲンシス（Ｅｌ）菌株コクマモトエンンス （Ｃ）！’？Ｃ７）１１１１１体名：　Ｐ　Ｓ　５０　Ｃ（ｖｉ　ｉ）すぐの供 給ｆｆ： （Ｂ）クローンコ大１１１Ｆ（ε、　ｃｏｌｉ）　１１５２２（ｐＭＶｃｆ６３ ８）、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７５１ （ｘｉ）　配ＩＩＩ　（Ｄ　記述：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２：８°ｔ　ｓｉｒ 　Ｐｒｏ　Ａｓ＋ｉ　ｘｓｎ　＋：Ｊｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ｑｒ　Ｇｌｕ　ＸＬ ＊　Ｈ＠　Ｊｕｐ　Ａｌａ　ｙｉ”　Ｐｒ。

ｓ＠ｒ　ＴｈｒＳｉｒ　Ｖａｌｓｉｒ　Ｂａｒ　Ａｓｐ　Ｂａｒ　Ａｓｎ　）Ｌ ｑ　Ｔ７ｔ’　Ｐｒｏ　’Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｊｎ　ＧｌｕＰＴｏ　Ｔｈｒ　Ｍ ｐ　Ａｌａ　ｒ、＠ｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａ口ｎ　ｑｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｐ　Ｉｒ　Ｌｍｕ　ｚｙｓ　ｏａｔｓｅｒ　ｇａｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌ旧ｕｎ　Ｐｒ ｏ　ｇｉｕ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　ＧｌｙＡ−ｎ　ｊｒｏ　Ｇｌｕτｈｒ　Ｐｈ噂、 、１１＊Ｓ＠ｔ　Ｓｅ３”　Ｂａｒ　Ｔｈｒ　工Ｌｍ　ａｌｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ 　Ｘ１ｍ　Ｇｌｙ　ＸＬ＊　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｗｑ　ＩＩｓ　ＩａｕＧｌｙ　Ｊ ｕａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｂａ　Ａｌａ　５ｅｒ　ｃｌｎ　Ｘ ｉｓ　Ａｌａ　Ｂａｒ　Ｐｈａ　７１；ａｘ：ｐｈ＠ＸＬ＠　Ｖａｌ　ＧＡＫ　 Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　〒計ｙｓ　Ｂａｒ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　ｒｌｅ 　Ｔｒｐ　ＧＡＹＧｌｕ工１＠　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　ｋｒｑ　ＶａＩＧｌｕ　Ｇｉ ｕ　！Ｊｕ　Ｖａｌ　Ａｊｐ　ＧＡＴｌ　Ｌ’ｆ、：工１・Ｇｌｕ　ＬｙｓＴｙ ｒ　ｖａｌ　ＬＹＩ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｔ、３ｕ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｌ ａｕ　Ｌｙｓ　ＧｉＫ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　入ｊｎ　Ａｌ■ を１号入！ｐ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｊｎ　ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　” Ｐ、Ｔ”！　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｊｎ　入ｒｇ　ｘｓｎＡｓｐ　ｋｌｏｋｘｑ　 Ｔｈｒ　ｘｒｇ　Ｓｓｒ　Ｖａｎ　Ｖｏｌ　ｓｓｒ　Ｈｇ　Ｇｉｎ　Ｐｂａ　ｒ ｌｓ　Ａｌａ　Ｌｍ、ビ１ｐＬ＠ｕ　Ａｊｎ　ｐｈａ　￥Ｈ”　Ｓ°藝ａｒ　Ｘ Ｌ＠　ｐｒｏ　ＹＨｊ　Ｐｂａ　ＪＬＬＪＬ　Ｖａｌ　釦ｒ　ＴＮＴ、　Ｂｉｇ 　６１ｕＶａｌ　Ｌｌｌｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔ′ｙｒ　Ａｌ ａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ｌ／ａｌ　Ａｇｎ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　ｒ−ｍｕ@Ｘ４ｕ Ｌｌｌｕ　Ｌａｕ　Ａ′ｒｑ　Ａｍｐ　Ａｌａ　ｆ；＠ｒ　ｐｇ　Ｐｈａ　Ｇｌ ｙ　Ｃ１°Ｇｌｕ　？ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ＰｒB 宙Ｇｌｕ　ｘｉ°５°ｒ　Ａｒｇ　Ｐｂａ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｔｈｘ　Ａｌａ　Ｇｌｕｑｒ　Ｓｅｒ　ＡＬＰ　Ｔｙ ｒ　Ｃ１ｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　′ｒｒｐ　Ｔｙｒ　ｒｄｇ　工１＠　Ｇｌｙ　Ｌ ｓｕ　Ａｓｐ　Ｌ（ｇ　Ｌ＊ｕＬｙ＃　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｓｅｒ　Ｌｙ Ｍ　Ｂａｒ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　１ｌｉｓ　Ｇｉｎ　Ｐｂａ　ｋ ｘｑ　入ｒX ２６０　２６５　２）Ｏ Ｇｌｕ　Ｍｔ　ＴＭ　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｓｇ　Ｌａｕ　Ｖａ ｌ　入１ａ　Ｌａｕ　￥ｉｓ　！ｔｏ　Ａｓｎ　ＴｙｒＧｉｎ　Ｇｌｙ　ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｐｈ＊τｈｒ　ａｌｙ　ＧＩＹ　Ａｓｐ工１＠　Ｌａｕ　ｌ１ｙＳ　 ＡＪ＋ｑτ肚ん＊ｎ　Ｐｒ。

Ｓａｒ　Ｚｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｂａ　入１ａ　ｖａｌ　Ｔｂｘ　 Ｖａｌ　人ａｎ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｌｅａ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎＡｒｇ　’ｒｙｒ　 ｓｘｑ　Ｖａｎ　Ａｒｑ工１＠ＡＸｑ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　ｓａｒ　Ｔｈｒτｈｒ 　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ＰｈｔｓＴｈｒ　Ｌａｕ　吊ｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　 ＡＪｐ　Ｔｈｒ　ＬＸ　ｃＪ、ｕ　Ｌｙｊ　ａｓｎ　）Ｘｑ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　 Ｘ、ｙｓ　ＴｈｒＭａｔ　Ａｓｇ　ＡｓｎＧｌｙ　Ａｌａ　５＠１″ｚｅｕ　Ｔ ｈｒ　ｑｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｌｌ　Ｐｂａ　Ａｌａ　５ｉｒＰｈ ｓ　Ｚｌａ　Ｔｈｒ　ｋｓｐ　！’ｈａ　Ｇｉｎ　ｐｈｅ　Ｍｑ　ａｌｕ　Ｔｈ ｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　工ｌ＠　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕｓａｒ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ 　ｉｖｐ　ｐｉｅ　ｓｅｒ　ｓｕｒ　ＧｌＹ　ｃｌｎ　ｃｊｕ　Ｖａｌ　’ｉｒ 　１１°Ａｓｐ　ｋｘｇ　ｌｌ５ｃｌｕ　ｐｈ＠　Ｚｌａ　ＰＫｏ　ｖａｌ　ｈ ａｐ　ｃｌｕ　Ｔｈｘ　’ＩＫ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　？９Ｂ＋　 Ｌａｕ　Ｇｌ■ Ａｌａ　Ａｌａ　”Ｙｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｖａｌ　Ａｓｎ　”’　Ｌａｕ　Ｐ ｈａ　Ｔｈｒ　細’！’ｈｒ　Ｉ、Ｙｌ　ａｓｐ　ＧｌｙＬｅｕ　）Ｊ：”＆　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＡＳＫ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　 ９Ａｎ　ｘｌａ　Ａｌａ　Ａｊｎ　Ｌ■■ ”’　Ｇｌｕ　ＣＹＩＩ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　？？ｇ　入ｓｐ　Ｔ′ａｕ　Ｔｙｒ 　Ｐｒｏ　９＊ｇ　（Ｚｌｕ　Ｌｙｅ　入ｒｇ　Ｌａｕ　Ａ鰍氏Aｇ Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　！、ｙｓ　ｋｒｑ 　ｔａｕ　Ｓｉｒ　ＧｌｙＡｌａ　Ａｒｇ　９３ｎ　ＬｍｕＬａｕ　Ｇｉｎ　ｉ ｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｂａ　ａｌｎ　ａＬｕ　ｊ閂＠　Ａｊｎ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｕ　Ａｓｎ　揃τ９ｉＡｌａ　Ｂａｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　工１１１　Ｇｌｕ　 工ｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｐｂａ　Ｌｙｓ　 Ｇｌ■ Ａｒｇ　ｍ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　ｐｒｏ　Ｇｌ、Ｘ　Ａｈ１吻Ｇｌｕ　Ｘ Ｌ＊　９ｊＪ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｘ　ＱｒＰｒｏ　ＴＭ　ｑｒ　ｚａｕ　Ｔ ｙｒ　ｃａｎ　Ｌｙｓ　ｖａｎ　ａＬｕ　ａｌｕ　９１．Ｋ　Ｖａｌ　ｒ、°ｕ 　ＬＭｇ　Ｐｒｏ　’ｎ”Ｔｈｒ　ｈＸｑ　’ｒｙｒ　ｘｒ９　Ｌｌｌｕ　紅ｑ 　Ｇｌｙ　Ｐｂａ　Ｖａｌ　ＧＩＫ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　社ｕ　 Ｇｌｕ工１＠　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　！Ｉｉｓ　Ｇｉｎτｈｒ　ｘ ｓｎ　ｋｒｑｒｌｓ　Ｖａｌ　ｒ、ｙｓ　ｘｓｎ　Ｖａｔ　Ｐｒ。

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１１＊　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ｖａｎ、ｙｈｒ　Ｐｈｓ　Ｘ１°ｐｒｏ　’ ＩＴｒ、Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｍａｔ　Ｔｑｆ、Ｘ１＠Ｇｌｕ工１＊　ｓｅ ｒ　ａｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ｃｌｙ　Ｔｈｒ　ｐｈｓ　Ｔｙｒ　１１＠　ａｌ ｕ　Ｓｅｘ　ｖａｌ　ａｌｕ　ＭｕＸ１ｇｍ　Ｖａｌｔ〒ｇ５ｖ″′１（１ｕ（ ２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３：に関する情報（１）配列特性 （Ａ）　長さ二１９５３塩基対 （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）ｉｌ：２本鎖 （ｉｉｉ）仮定的か？：ノー （Ｂ）　菌株：トルウオースイ （Ｃ）　Ｉｔ別別車単離体４３Ｆ （ν１１）直近給源 （ｘｌ）配列（７）記述：　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：３：ｃｃｘ　ａｒｒ　ＧＧＧ 　λＣＡ　ＧＧＡ　Ａ’ｆｆ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＡＭ 　？？Ａ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ@２４０ Ａｉ；　Ｖａｎ　にｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｘ？　Ｓｓｒ　Ｖａ工Ｖａｌ　Ｇｌ ｙ　Ｍｎ　１１°Ｉａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　ＶＡＧＧＧ　ＧＴＴ　Ｃ（Ｊ　ｆｆ ｒ　ＧｅＴ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣＡＣ’ｒ　ＴｅＡ　ｆｆｌ　τ入ＴＣ入Ａ 　ＴｅＡ　ＴでＴＣ’ｎ　スW８ ａ１ｙ　ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｂａ　Ａｌａ　ａｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ｂａｒ　Ｐｈ＠Ｑｒ　Ｇｉｎ　！Ｉ＊ｒ　ｔｈｅ　ＬａｕＡＡＣＧＣＴ　ＡＴＡ 　ＴＧＧ　ＣＣＡ　ＡＧ？　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧｋＣＣＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　 ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＡＴＧＧＣＡ　３３U ＡＪｎ　Ａｌａ　ＺｌａＰｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｇ　Ｐｒ ｏ　ｒｒｐ　Ｌｙｓ　ＡＩＪＩ　Ｐｈｓ　ｏａｔ　１ｌａＧτＡ　ＡＡＴ　ＧＣ Ｇ　世ＧＡＴ　ＴＣＣＴＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＣＧＴ　ＧＴＡ　ＡＡ Ｔ　責Ａ　ＣＧＡ八〇へｒ　４８０￥ｒＲＡｓｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　５ ｅｒ　Ｔｒｐ　ｒ、ｙｓ　ＬＹＩＩ　Ｊｕａ　Ｐｒｏ　Ｖａｉ　ＭＱ　ｘａｕ　 Ａｒｑ　５ｉｒＣＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＣＣＡＡ　ＧＡＴ　ＣＧＡ　ＡｒＡ　Ａに Ａ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡＧＣ５Q８ ｋｘｑ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ａ、：！　ｕｑ　Ｈｅ　Ａｒｇｏｌｕ　Ｌ、 ；ｇ　ｌ’ｈｓ　５ｅｒ　Ｇｉｎ　ＡＩＪＬ　冑ｇｅｒ（ＪＴ　ＴＴＴ　ＣＧＴ 　ＡＡＴτｅｃ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴｅＡ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＧＴＴ　ＴＣＣＡ ＡＡ　ＴＴＣＧＪ講ＧＴＴ　５７６Ｅｌｉ！　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ｘｓｎ　Ｂａｒ 　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈ＠Ａｌａ　Ｖａｌ　ｓｉｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈｓ　 Ｇｌｕ　ｖａ１２認ｎ：治；孟治工９Ｔ尽出瓜尽分治２↑冨士π８２盈　６２４ デ？Ａ　大入Ａ　ＯＡＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　 Ｇλ入↑ｃａ　ｃａｘ　τＡ’ｒ　〒（：Ｔ　ＴＣＡ　ＣＡ`　６）２ Ｌａｕ　Ｌ（ｓ　Ａ′ｐ　ＡＬＪＩ　Ｇ１１）　ＶＪＬｌＰｈｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ宙？ｙｒ　ｆ；°ｒ　Ｓｅｘ　ＧｌｕＧＡ丁　入ＴＴ　Ｇｅ Ｔ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　入ＧＡＣ大入　ＴＴＡ　Ａ入ＡＣ〒？　 ＡｅＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＴＪＬｅ　V２０ ：：Ｅ　Ｘ１＠　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　？Ｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒ９°Ｌｎ　Ｌ ｅｕ　Ｔ、５ｓ　ｋｕ　Ｔｂｘ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　’ＱｇＡＣ？　ＧＡＣＱＴ　 ＴＧＴ　ＧＴＣＡＡＴ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　入λ丁　ＧＡＴ　ｅｃ入　ＴＴＡ　＾ ＾でＡＧＴ　τテ入ＡＧＡ　フロ８Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｈｘｓ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　 ｋｘｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｒｓ　ｔＦａｌ　Ｇｌｙ　ｚａｕ　１ｗ　ｓａｒ 　Ｌｅｕ　＾ｘ■ ＧＧ？　ＴＣＡ　ＡＣ？’　ＴＡＴ　ＧＡＴ　Ｇａ　ＴＧＧ　ＧＴＣＡＡＡ　Ｔ ’ｌテＡＡＣαｆｆ　ｆｆｉ　ＣＧＣＡＧＡ　ＧＡＡ　＋１P６ ａｌｙ　ｓｅｒ　Ｔｈｒ　′￥ＩＴ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　ＶａＬ　Ｌｌ： ：　Ｐｈｓ　Ａｓｎ　ｋｒｑ　２ｈ＠　朔紅ｑ　ｃｌｕ入ＴＧ　入ＣＡ　’ｌ” ＴＡ　ｋｃＴ　ＧＴＡ　′ＴＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　入ＴτＧＴＡ　ＴＴＡ　Ｔ ＴＣＣＣ入Ｔτ丁？ＡＴ　ＧＡＴ　撃P６４ Ｍ＠ｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　ＡＪＰ　Ｌ＊ｕ工ｉｓ　Ｖ ａｌ　Ｌ・ｕ　Ｆｈａ　Ｐｆｏ　Ｐｈｓ　ＴＹｒ　ＪＬｓｐＧＴ？　ＣＧＧ　Ｔ ＴＡ　ＴＡ（：　ＴＣＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　 ＣτＡＡＩ：Ｊ　入ＧＡ　ＧｈＣ入Ｔ〒@９１ス ＶａＬ　？ｇ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　ＧＩＸ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔ ｈＸ　ＧＬｕ　５３ｇ　丁ｈｒ　ｘｒｇ　Ｊｕｐ　ＸＬ嗜’！”ｌｆ’？　ＡＣ Ａ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ｆｆｉ　ＡＣＡ　ＣＴＣ入ＡＴＧＣτ　Ｃ’Ｔτ 　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　bＣＡ　９６０ Ｐｈｅτｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ工ｌｅ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｌｏｕ　Ａｓｎ　ｘｌａ −Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ｙｒ　Ｇｕｙ　Ｐｒ。

３０５　３１０　３１５　コ２゜ ＡＣで　ＴＴＴ　τＣａ　ｈＧＴ　ＪｖｒＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣテＣＴ　Ａｒ　Ｃ ＧＡ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　Ｃ入’ｒ　ＴＴＡ　？’Ｔτ　ＧＡs　１００８ ？ｈｒ　Ｐｈ＠Ｓｅｒ　Ｓａｒ　希＠　ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＩＬｅ　Ａｒ ｇ　Ｌｙｓ　ｐｒｏ　Ｈｌｓ　木Ｐｈｅ　ＡｓｐτＡＴ　ＴＴＧ　ＣＧＴ　ＧＧ Ｇ　ＡＴＴ　ＧＪＬＡ　’ｎｏｒ　ＧＡＴ　ＡｃＧ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　Ｃ（ａ　 ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＴＡｃ　ＴbＴ　１０５６ Ｔｙｒ　Ｌｏｕ　ｐｗｑ　ａＨｇＨｌｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ａｚｓ　Ｔｈｒ　Ａ ｒ９　Ｌａｕ　Ｊｕ−９Ｐｒｏ　Ｇｉｇ　？７ｆ　５ｅｒＧＧＧ　ＡＪｕ　（ａ Ｔ　Ｔ：Ｔ　ＴＴＣＡＡＴ　ＴＡＴ　！　ＴＣＴ　ＧＧで　大入τ　τ入’ｌ’ 　Ｇ１”Ａ　ＣＡＡ　ＡＩＪ　ＡＣＡ@１１０４ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｍ！　Ｅａｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｔ　Ｓａｒ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｎ　Ｑｒ￥：ｉ　Ｇｌｕ　ＴｈＸ　ＡＪ”９ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　 ＧＧＡ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　Ｃ１丁　ＡＣＡ　ＡＴＣＡＣで　丁ＣＣＣＣＡ　ｆｆ １Ｔλ〒　ＣＧＡ　ＧＡＴ　１１T２ Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　１１＠Ｇｌｙ　５＠ｒ　Ａｌｎ　Ａｓｇ　Ｔｈｒ　ＩｌａＴｈ ｒ　Ｂａｒ　Ｐｒｏ　ＰｈｏＱｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ入入大入　ＴＣＴ　ＡＴＴ　 Ｇ）ＪＬ　ＣＣＴ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　大入Ｇ　ＣＴＡ　入ＧＣＴ！？　ＧＡＴ　 ＣＧＡ　ＣＡλλＡＡ　６？！f　１２００ ｈａｓ　Ｂａｒ　ＸＬａ　ＧＬｕ　Ｉ’ｒｏ　昔Ｇｉｎ　ｚｙｓ　Ｌｓｕ　Ｓａ ｒ：　Ｆｈａ　Ｊｕｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ＬＹＩ　’ＨＡ丁λＴ　ｃｃｘ　ＡＣ Ｔ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　Ａ（：Ａ　ＧＡＣＡＴｋ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　Ｔ’ ＴＴ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＧＧＣＡＡＧ@１２４８ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　工１＠　ＡＡｇ　入場ｎＴｈｒ　Ａａｐ　ｌ１ｍ　１ ２’ｌ、３　人１ａ　！’ｈｅ　Ｐｒｏ　ｋｓｐ　Ｇｉｎ　kｙｅ ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＧＧＴ　Ｇｎ　ＡｅＧ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　Ｔ ＴＴ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＧＭＴ　Ｃ）Ａ　h２９＋１ ｘｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　”ｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｘ、ｙｊＶａｌ　捌Ｐｈｓ　 ｊａｒ　ａｌｐ　？７ｒ　ＡＪ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎ１Ｊｋ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　Ａｅ Ｔ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣ入大入入　ＡＧＡ 　ＴＡｃ　ＡＡＴ　ＧＧＣ１R４４ Ｌｙｓ　Ｊｕｎ　Ｇｊｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　’ｒｙｒ 　Ａｍｐ　ｓｉｒ　ｘ、ｙｓ　Ａｒｇ　’ｒｙｒ　ｘｓｎ　fｕｙ ＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＡＴＴＣＴｋＴＣＧ＾ＣＣＡＡＴ？ＡＣＣｋ ＣＣＡにＡＡＡＣ入ＡｅＡヱ３９２Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　 Ａｌｐ　ＧｅＴ：工１ｅ　ｈｓｐ　ｃｌｎ　ｚａｕ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　Ｇｌｕτ ｈｒ　ＴｈＸＧＡＴ　Ｇｋｋ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＴＡ Ｔ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　Ｃ’ｌｌ？　大入Ｔ　丁ＡＣＧＣＡ　Ｏ入■@１ ４４゜ 髭Ｗ　ｃｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｉｕ　シＹさ　入１・　丁ｙｒ　ｓｅｒ　Ｅ ｌｓ　ｃａｎ　Ｌａ礒　Ａｊｎ　Ｔｙｒ　Ｊｄａ　Ｇ比Ｃｙｓ　Ｐｈ＠ｈａｕ　 Ｍａｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｍｑ　ｋｒｑ　ＧＬＹ　Ｔｈｒ：　Ｉｌａ　Ｐｒｏ　 Ｐｈａ　Ｆｈａ　Ｔｈｒ　ＴｒｐＡＣＴ　ＣＡＡ　Ｃｒ　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴ Ｇ　ＡＡＡ　ＧｅＡ　ＴＡＴ　ＧＣＣＴＴＣＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧｅ　ＣＣＴ　 ？ＣＣ１５１{４ Ｔｂｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ｐｒｏ　Ｖａｌ　ｖａｌ　Ｉ、ｙｓ　ｋｈａ　？’ｙ ｒ　ＡＩＪＩ　ＬａＬｌ　ｓｉｒ　ｓｅｒ　ａｌｙ　Ａｌａ@５ｅｒ ２Ｔλ〒ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＣ入ＧＧＡ工、。工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｇ□、 ｒｏｃｌｙ　Ｚ　舗卦卦ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴｋｉＣＴＡ　ｋｋｋ　１６３２、 ｏｓ３ｓ　ｈｓｎ　社：　Ｌａｕ　Ｐｈ＠ｋｕ　ＬＹｊＧＡ入ＴＣＴ’　ＡＧＴ 　ＪＬＡ？　ＴＣＡ　ＡＴＴｃｌｕ　ｓｅｒ　５１１！−ＪＩＪ、、ｓｅｘ：　 Ｋｌ。ｆｆＸ　ＨＺ　州洲］＝　Ｈ：　Ｈ’Ａ　ＸＨ尽ｔｇｓ。

５４５　５５０　５５５　’　５６０ ＧＣＣＴＴＣＴＴＡ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＴＡＴ　ＣＧＣＣＴＡ　ＡＧＡ　ＡＨＡ 　ＣＧＣＴＡＴ　ＧＣＴ　Ｔ（Ｊ　Ａｃｅ　ＡＣＴ　１７２■ Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　’ｒｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒ９ 　””　Ａｒ９　’ｌｌ７ｒ　ＡＩＪＬ　ｓｓｒ　Ｔｈｒ　Hｈｒ 入入大入τ入　ＣＧＡ　Ｃ７丁　ＴｉＣＧＴＧ　ＣＡＡ　大入τ　？ｅ入大入Ｃ ＡＡτ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＧＴ’ｅ　ＡＴＣ１７）U Ａｊｎｚｓｉｕ　ｋｘｑ　Ｌａｕ　Ｐｈｓ　Ｖａｌ　ａｌｎ　ｘｓｎ　ｓｅｒ＾ ５ｎＡｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ工ｌ・ｓｅａ　ｓｓｓ　ｓり０ ＴｋＣＡＴＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＡＨＡ　ＧＡＴ　Ｃ ＧＴ　ＧｋＴ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　入１：Ａ@１１１２４ ｉｒ　工１ｅ　ｈｌｌｎ　ｒ、ｙｓ　ｒｈｘ　Ｍａｔ　Ａｊｎ　Ｉｌａ　人ｓｐ 　ＧＩＹ　ｘｓｐ　ｒ、ｅｕ　丁ｈｒ　ＴＴＴ−Ｇｉｎ　Ｔ■w （２）　ＳＥＱ　１０１１０：４：に関する情報（１）配列特性 （Ａ）　長ざ：６５１１１のアミノ隋 （Ｂ）　タイプ：アミノ隋 （Ｃ）　鎖ニ一本 （Ｄ）トポロジー；線形 （ｉｉ）分子タイプ：蛋白質 （ｉｉｉ）仮定的か？：イエス （１ｖ）アンチセンス？：ノー （ｖｉ）オリジナル給源 （Ａ）　生ｖＲ：バシルス　チュ一リンゲンシス（Ｂ）　１株：トルウォースイ （Ｃ）　個別的単離体：４３Ｆ （ｖ目）直近１ＩｉｌＩＲ （Ｂ）　クローン二大關菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（ｐＭｌ。

９８−４）、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２９１（１ｘ）特徴 （Ａ）　名前／キー：蛋白質 （Ｅｌ）　位置：　１．．６５１ （に１ン配列の記述：　ＳＥＱ　Ｉ［）　）ｉθ：４：Ａｓｎ　ｋｌｘ　ｒｌｏ Ｔｒｇ　Ｐｒｏ　ｓｏｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａ：ｆ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　 ＡＬＩＩ　ｐｈａ　Ｍｅｔ　Ａ１ｍＢ１５　Ｆｈａ　入ｘｑ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　 Ｍａｔ　Ｐｒｏ　Ｂａｒ　Ｐｈｓ　Ｊｕａ　ＶａＬ　’Ｓ＠ｒ　Ｌｙｅ　Ｆｈａ 　Ｏｌｕ　ＶａP Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＴｈＸ　’Ｑｇ　入ｓｐ　Ａｉａ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　”ｉ”　 ｔｈｅ　＾・・入ｒｑ　ｐｈａ　ｙｔｌ　入ｒｇ　ＧｌｕＩ４ａｔ　Ｔｋｕ−甫 Ｔｈｘ　ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｊｕｐ　ｚｅｕ　Ｘｉｓ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　ｔｈｅ　 Ｐｒｏ　Ｆｈａ　Ｔｙｒ　ＪｕｐＶａＬ　ｇｅｇ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　ｓａｒ　Ｌ ｙｓ　”Ｘ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＴｈＸ　ａｌｕ　Ｌｇｕ　ＴｈＸ　入ｒｇ　入ｓ ｐ　ｎ。

Ｐｈｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｅｌｓ　ｔｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌ低Ａｓｎ　Ｊｕ ａ　Ｌｅｕ　ｃｌｎ　Ｇｌｕテ１１ｙ　Ｐｒ。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　 ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲＩ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．鱗翅類昆虫の害虫を、Ｂ．ｔ．ＰＳ４３Ｆ、Ｂ．ｔ．ＰＳ５０Ｃ及びＢ．ｔ ．ＰＳ８６Ａ１及びそれらの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）か、らなる群から選択さ れる、バシルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓ）単離体の昆虫抑制有効量と接触することからなる、鱗翅類昆虫の害虫を抑 制する方法。
2. ２．バシルスチューリンゲンシスがＢ．ｔ．ＰＳ４３Ｆである請求項１に記載の 方法。
3. ３．バシルスチューリンゲンシスがＢ．ｔ．ＰＳ５０Ｃである請求項１に記載の 方法。
4. ４．バシルスチューリンゲンシスがＢ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１である請求項１に記載 の方法。
5. ５．該昆虫の害虫がダイヤモンドバックモス（ブルテラ　クシロステラＰｌｕｔ ｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｌｌａ）である請求項１に記載の方法。
6. ６．バシルスチューリンゲンシスを含む殺虫組成物を植物または土壌に適用する ことを含む請求項１に記載の方法。
7. ７．殺虫組成物が液体である請求項６に記載の方法。
8. ８．殺虫組成物が顆粒形である請求項６に記載の方法。
9. ９．殺虫組成物がとうもろこし又は大豆の種が植えられる時に適用される請求項 ６に記載の方法。
10. １０．該バシルスチューリンゲンシスが標的害虫の環境に於ける殺虫活性を長期 化するために処理されている請求項１に記載の方法。
11. １１．Ｂ．ｔ．ＰＳ４３Ｆ、Ｂ．ｔ．ＰＳ５０Ｃ及びＢ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１及び それらのバリアントからなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス単離 体から得ることができ、鱗翅類害虫に対し活性の毒素をコードしている遺伝子に よって形質転換された植物に、鱗翅類害虫を暴露することを含心、鱗翅類害虫を 防除する方法。
12. １２．該遺伝子がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１のＤＮＡ又は鱗翅類活性毒素をコード するその一部である請求項１１に記載の方法。
13. １３．該遺伝子かＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３のＤＮＡ又は鱗翅類活性毒素をコード するその一部を含んでいる請求項１１に記載の方法。
14. １４．該遺伝子がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５のＤＮＡ又は鱗翅類活性毒素をコード するその一部を含んでいる請求項１１に記載の方法。
15. １５．Ｂ．ｔ．ＰＳ４３Ｆ、Ｂ．ｔ．ＰＳ５０Ｃ及びＢ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１及び それらの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）からなる群から選択されるバシルスチューリ ンゲンシス単離体から得ることができ、鱗翅類害虫に対し活性の毒素をコードし ている遺伝子によって形質転換された微生物な、鱗翅類害虫又はその害虫の環境 に対し投与することを含む、鱗翅類害虫の防除方法。
16. １６．該遺伝子がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１のＤＮＡ又は鱗翅類活性毒素をコード するその一部である請求項１５に記載の方法。
17. １７．該遺伝子がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３のＤＮＡ又は鱗翅類活性毒素をコード するその一部である請求項１５に記載の方法。
18. １８．該遺伝子がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５のＤＮＡ又は鱗翅類活性毒素をコード するその一部である請求項１５に記載の方法。
19. １９．微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｍｏｎａｓ）である請求項１ ５に記載の方法。
20. ２０．形質転換された微生物が標的害虫の環境に於ける殺虫活性を長期化させる ために処理されている請求項１５に記載の方法。