ES2330168T3 - Gen mopdificado de bacillus thuringiensis para combatir los lepidopteros en plantas. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN SECUENCIAS DE DNA SINTETICO OPTIMIZADAS PARA SU EXPRESION EN PLANTAS, ESPECIALMENTE EL MAIZ, Y QUE CODIFICAN UNA PROTEINA DE BACILLUS THURINGIENSIS QUE ES TOXICA PARA INSECTOS ESPECIFICOS, JUNTO CON METODOS PARA EL DESARROLLO DE CUALQUIER GEN INSECTICIDA SINTETICO EN EL MAIZ.

Description

Gen modificado de Bacillus thuringiensis para combatir los lepidópteros en plantas.

La presente invención se refiere al diseño, síntesis y expresión en plantas de una secuencia de ADN que está optimizada para la expresión en plantas, que codifica una proteína de Bacillus thuringiensis que es tóxica para insectos específicos. Más particularmente, la invención se refiere a una secuencia de ADN sintético que está optimizada para la expresión en plantas, a un vector que contiene la secuencia de ADN sintético que es adecuado para transformar plantas, y a plantas de maíz que expresan de forma estable la proteína codificada por la secuencia de ADN sintético.

Antecedentes de la invención

Un pesticida microbiano usado ampliamente procede del microbio del suelo Bacillus thuringiensis (Bt). Bt es una bacteria formadora de esporas, gram positiva, caracterizada por inclusiones proteicas cristalinas paraesporales. La proteína cristalina, a menudo denominada \delta-endotoxina, tiene dos formas: una protoxina no tóxica con un peso molecular (PM) aproximado de 130 kilodaltons (kD); y una forma tóxica que tiene un PM aproximado de 68 kD. Las inclusiones de proteína cristalina contienen la proteína protoxina que se activa en el intestino de las larvas de varias especies de insecto. Durante la activación, la protoxina se escinde, residiendo el resto tóxico en un polipéptido amino-proximal de 58-68 kD. In vivo, el cristal se activa al solubilizarse y convertirse en la forma tóxica por la alcalinidad y las proteasas del intestino del insecto.

La actividad tóxica de la proteína producida por Bt es muy específica para especies de insecto particulares y se considera segura para vertebrados superiores. Numerosos informes han demostrado que las proteínas cristalinas intraesporales aisladas a partir de muchas cepas de Bt poseen niveles extremadamente elevados de toxicidad específica para larvas de lepidópteros o larvas de coleópteros, con una concentración eficaz necesaria para inhibir 50% del crecimiento larvario en el intervalo de 1 ng/ml de dieta para los insectos más sensibles (Macintosh et al., J. Invert. Pathol. 565 (1990) 258).

Se ha descrito la clonación, secuenciación y expresión del gen de la proteína de Bt en otros hospedadores bacterianos (Publicación Internacional Nº WO 93/04587, Solicitud de Patente Europea Nº 89300388.9, Solicitud de Patente Europea Nº 90304996.3 y Patente de Estados Unidos Nº 5.286.485). Sin embargo, la expresión de genes de proteínas insecticidas procedentes de Bt en plantas ha sido extremadamente difícil y típicamente sólo se ha obtenido bajos niveles de proteína en plantas transgénicas (Vaeck et al., Nature, 328 (1987) 33; Barton et al., Plant Physiol., 85 (1987) 1103; y Fischoff et al., Bio/Technology, 5 (1987) 807).

Una posible explicación de la baja expresión del gen de Bt nativo en plantas transgénicas es que el uso de codones en un gen de proteína de Bt nativa es significativamente diferente del de un gen vegetal típico (Solicitud de Patente Europea Nº 89309069.6). El uso de codones puede influir en la expresión de genes a nivel de la traducción, transcripción o procesamiento del ARNm.

Otra razón posible de los bajos niveles de expresión del gen de Bt nativo en plantas transgénicas puede deberse a sitios de procesamiento de la transcripción fortuitos que producen formas aberrantes de ARNm (Publicación Internacional Nº WO 93/07278). Los posibles sitios de procesamiento incluyen sitios de poliadenilación, sitios de corte y empalme de intrones, señales de terminación de la transcripción y señales de transporte. La aparición fortuita de estos sitios de procesamiento en una región codificante puede complicar la expresión de un gen en un hospedador transgénico.

Para optimizar un gen insecticida para la expresión en plantas, se ha intentado alterar el gen de Bt nativo para que se parezca, en la medida de lo posible, a genes contenidos naturalmente dentro de la planta hospedadora que se desea transformar. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.380.831 de Adang et al. describe un gen sintetizado químicamente que codifica una proteína insecticida que es funcionalmente equivalente a una proteína insecticida nativa de Bt, y que está diseñada para expresarse en plantas a un nivel mayor que un gen de Bt nativo. El gen sintético tiene una homología de al menos aproximadamente 85% con un gen de proteína insecticida nativa de Bt que está diseñado de tal forma que su frecuencia de distribución del uso de codones no se desvía más de 25% de los genes de la planta de alta expresión, y preferiblemente no más de aproximadamente 10%. El gen sintético tiene índices de evitación de dobletes GC y TA, basados en la frecuencia en una secuencia de un gen del hospedador, que se desvían del de la planta hospedadora en no más de aproximadamente 10-15%, y tiene un contenido de GC de aproximadamente 45%.

La publicación Internacional Nº WO 93/07278 describe un gen de proteína cristalina de Bt sintético en el que el uso de codones se ha alterado para aumentar la expresión en maíz. El gen sintético tiene una homología de al menos aproximadamente 66% con un gen de proteína insecticida nativa de Bt y una homología de 98% con un gen optimizado de maíz puro. El gen sintético tiene un contenido de GC de 50-64% y no tiene prolinas en el extremo 3' de la secuencia.

El documento EP 0 385 962 se refiere a genes vegetales sintéticos. La expresión de un gen heterólogo (que codifica una ICP de Bt) se mejora en plantas modificando la secuencia codificante estructural de dicho gen, por ejemplo (i) reduciendo o eliminando la aparición de señales de poliadenilación y (ii) retirando secuencias ATTTA.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere al diseño, síntesis y expresión, tanto en células bacterianas como en células vegetales, de una secuencia de ADN optimizada en plantas que codifica una proteína HD73 de Bacillus thuringiensis que es tóxica para insectos lepidópteros. La solicitud además describe un método para diseñar un gen sintético. La secuencia de ADN optimizada en plantas comprende codones eficaces para codificar una proteína vegetal insecticida (en lo sucesivo ICP con aproximadamente 589 a aproximadamente 619 aminoácidos). La secuencia de nucleótidos que codifica ICP tiene una homología de aproximadamente 70 a aproximadamente 71% con una secuencia de nucleótidos de Bt nativa que codifica ICP, y una homología de aproximadamente 63% con una secuencia de nucleótidos de maíz puro. El uso de codones en la secuencia de nucleótidos optimizada en plantas tiene una desviación con respecto al de la planta hospedadora de aproximadamente 0,23 a aproximadamente 3,48, preferiblemente de aproximadamente 1,075.

La presente invención también se refiere a vectores de expresión en plantas que pueden expresarse en células vegetales, tales como maíz. El vector de expresión en plantas comprende, en secuencia 5' a 3', una secuencia promotora eficaz para iniciar la transcripción en células vegetales; una secuencia potenciadora de la traducción específica para maíz; un primer sitio de escisión para enzimas de restricción únicas en el vector; una secuencia codificante que codifica una proteína típicamente de menos de aproximadamente 620 aminoácidos, siendo la proteína preferiblemente sustancialmente homóloga con la parte amino-proximal de una ICP de Bt; un segundo sitio de escisión para enzimas de restricción únicas del vector; y una secuencia de poliadenilación.

Otro aspecto de la invención se refiere a una planta de maíz transgénica y a semillas de una planta transgénica. La planta transgénica y las semillas de planta transgénica comprenden en su genoma el gen de Bt sintético heredable descrito en la presente memoria. Este gen sintético de Bt se expresa en las células de la planta o en una planta cultivada a partir de las semillas de la planta transgénica, en cantidades suficientes para controlar insectos lepidóp-
teros.

La memoria descriptiva también describe métodos para obtener por ingeniería genética cualquier gen estructural de forma que pueda expresarse óptimamente en plantas, en particular en maíz. Debido a la plasticidad producida por la redundancia del código genético (es decir, algunos aminoácidos se especifican por más de un codón), la invención prescribe un método para modificar la secuencia genética de cualquier gen de forma que la proteína resultante que se expresa no cambia, pero los codones se modifican para optimizar la expresión de la proteína en la planta particular de interés.

En la puesta en práctica del método anterior, se determina la preferencia de codones de la planta. La preferencia de codones es la distribución estadística de codones que usa la planta para codificar sus proteínas. Después de determinar la preferencia, se determina el porcentaje de frecuencia de los codones en el gen de interés, tal como un Bacillus thuringiensis nativo. Las secuencia de aminoácidos de la proteína de interés se traduce de forma inversa de manera que la secuencia de ácido nucleico resultante codifica la misma proteína que el gen nativo, pero la secuencia de ácido nucleico resultante corresponde a los primeros codones preferidos de la planta deseada. La nueva secuencia se analiza con respecto a los sitios de enzimas de restricción que podrían haberse creado por la modificación. Los sitios identificados se modifican adicionalmente reemplazando los codones con un segundo o tercer codones preferidos de elección. Otros sitios en la secuencia que podrían afectar a la transcripción o la traducción del gen de interés son las uniones de exón:intrón 5' o 3', señales de adición de poli-A o señales de terminación de ARN polimerasa. La secuencia se analiza adicionalmente y se modifica para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Además de los dobletes, los bloques de secuencia G o C que tienen más de aproximadamente cuatro restos que son iguales pueden afectar a la transcripción de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques también se modifican reemplazando los codones de la primera o segunda elección, etc. con el siguiente codón de elección preferido. El método descrito anteriormente permite a un especialista en la técnica modificar uno o más genes que son extraños para una planta particular de forma que los genes se expresen de forma óptima en plantas.

Es un interés general de la presente invención proporcionar un medio para la protección de plantas contra lesiones producidas por insectos. Más específicamente, tiene un interés particular proporcionar una secuencia de nucleótidos optimizada para maíz que codifica una proteína insecticida procedente de Bt que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

También se describe un promotor 35S o 19S, doblemente potenciado que expresa proteínas extrañas, incluyendo la proteína cristalina de Bt o proteínas cristalinas insecticidas de Bt de forma más eficaz que un promotor 35S o 19S así como una secuencia líder de MSV que podría modificarse adicionalmente para uso con otros promotores.

En otro aspecto, la memoria descriptiva describe una secuencia líder que podría usarse para potenciar la expresión de cualquier promotor.

Otros aspectos, ventajas, características y rasgos de la presente invención serán más evidentes después de considerar la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 ilustra la estrategia de síntesis por PCR. La Fig. 1A es una representación gráfica del gen de ICP modificado con sitios de restricción claves indicados encima de la barra, los números de la parte inferior denotan sus localizaciones en el gen. Las tres partes de gen que se sintetizaron por separado se muestran debajo del gen, y los sitios de clonación incorporados en los extremos de cada parte se muestran en los extremos de cada fragmento. La Fig. 1B indica la síntesis por PCR del fragmento terminal 5' del gen de ICP. Los 12 oligonucleótidos usados en la síntesis se indican por flechas. La dirección de las flechas corresponde a la polaridad de la síntesis de la cadena de ADN naciente. La localización de cada oligonucleótido en el fragmento del gen se indica entre paréntesis, el orden inverso de la localización de nucleótidos de la serie de oligonucleótidos inferior indica su complementariedad inversa con la cadena superior (codificante) del gen.

La Fig. 2 muestra el gel resultante de la purificación de oligonucleótidos de ICP por PAGE de desnaturalización. Se fraccionaron oligonucleótidos de ICP Bt6 a Bt10 por electroforesis en PAGE de desnaturalización al 12% como se describe en el Ejemplo 1. Las identidades de los oligonucleótidos se muestran encima de cada calle, y el tamaño de cada uno (nucleótidos) se muestra debajo de la calle. Las movilidades de los colorantes de rastreo xileno cianol (XC) y azul de bromofenol (BPB) se indican a la derecha.

La Fig. 3 muestra un gel que ilustra la progresión en la síntesis de las tres partes del gen de ICP. Para cada sección se muestran productos de las etapas 1-6 (secciones 5' y 3') o 1-5 (sección central) de la PCR en las calles marcadas 1-6 ó 1-5, respectivamente. Cada calle contiene 5 \mul de ADN purificado en gel de la etapa de PCR previa. Las calles no marcadas en el exterior del gel contienen patrones de tamaño de ADN a escala de 100 pb (GIBCO/BRL).

La Fig. 4 muestra un gel que ilustra la expresión de ICP en E. coli. La ICP expresada en células E. coli a partir de un vector de expresión citoplásmico se analizó por SDS-PAGE y transferencia de Western como se describe en el Ejemplo 4. La calle 1 contiene una cantidad de proteína celular total de E. coli correspondiente a aproximadamente un sedimento de 50 ng de extracto de proteína de células E. coli que expresan el vector de expresión citoplásmico; la calle 2 contiene aproximadamente 50 ng de sedimento de extracto de vector de expresión citoplásmico; la calle 3 contiene aproximadamente 10 ng de extracto de sedimento. La calle 4 de control negativo contiene 100 ng de sedimento de extracto de células E. coli que expresan pET-9d. Las calles 5, 6 y 7 contienen 20, 50 y 100 ng, respectivamente, de ICP de Bt nativa purificada.

La Fig. 5 es una representación gráfica que presenta los resultados de bioensayos de Manduca sexta. Se realizaron ensayos de alimentación con 500 ng cada uno de proteína de extracto de E. coli (sedimento de pET-9d), proteína de sedimento de extracto de células que contenían el vector del plásmido de expresión citoplásmico de ICP (sedimento de CEV), células que expresaban el vector de expresión citoplásmico (células CEV) e ICP nativa (proteína de Bt) como se describe en el Ejemplo 6. El peso de las larvas y la mortalidad se evaluaron 4 días después de poner larvas recién nacidas en las dietas.

La Fig. 6 es un mapa del vector plasmídico pDAB 910 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

La Fig. 7 es un mapa del vector plasmídico pDAB 911 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

La Fig. 8 es un mapa del vector plasmídico pDAB 917 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

La Fig. 9 es un gel que ilustra la expresión de ICP en callos de MSD transgénicos. La ICP expresada en aislados de callos de MSD se detectó por SDS-PAGE y transferencia de western como se describe en el Ejemplo 8. Las calles 1 a 7 contienen extractos de callos de aislados de maíz obtenidos por transformación de la línea de MSD Nº 4 con el plásmido pDAB 911; la calle 8 contiene extracto de callo de la línea de MSD Nº 4 no transformada; las calles 9 y 10 contienen 10, y 1 ng, respectivamente, de ICP purificada.

La Fig. 10 es un mapa del vector plasmídico pDAB303 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

La Fig. 11 ilustra varios mapas de promotores ensayados en los plásmidos pKA882, PDAB305, pDAB310,
pDAB348 y pDAB353. Más específicamente,

pKA882 contiene el promotor 35S nativo, incorporado dentro de nt 6605 a 7439 de CaMV (MCASTRAS), seguido de la Secuencia Enlazadora A (SEC ID Nº 3)

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donde el ATG (subrayado) codificado dentro de la secuencia de reconocimiento Nco I es el codón de inicio de la traducción GUS. Los transcritos de este promotor contienen como secuencia líder no traducida 5' esencialmente la secuencia polienlazadora anterior.

pDAB348 contiene un promotor 35S potenciado con secuencias 3' adicionales e incorporado como nucleótidos 7093 a 7344 del ADN de CaMV, la secuencia enlazadora CATCGATG, los nucleótidos 7093 a 7439 de CaMV, seguido de la Secuencia Enlazadora A mencionada anteriormente.

pDAB305 contiene un promotor 35S potenciado con secuencias 3' adicionales e incorporado como nucleótidos 7093 a 7344 del ADN de CaMV, la secuencia enlazadora CATCGATG, los nucleótidos 7093 a 7439 de CaMV, la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAGGATCCAG (SEC ID Nº 4), los nucleótidos 167 a 186 de MSV, los nucleótidos 188 a 277 de MSV, un resto C seguido de los nucleótidos 120 a 210 de Adh1.S de maíz, los nucleótidos 555 a 672 de Adh1.S de maíz, la secuencia enlazadora GACGGATCTG (SEC ID Nº 5), los nucleótidos 278 a 317 de MSV y un resto G que representa la base final de una secuencia de reconocimiento Nco I CCATGG. Como se ha indicado anteriormente, el codón de inicio de la traducción GUS forma parte del sitio Nco I. Los transcritos de este promotor contienen como líder 5' no traducido esencialmente la secuencia líder de la proteína de la cubierta de MSV, en la que se ha insertado una versión delecionada del intrón 1 de Adh1.S de maíz.

pDAB310 contiene un promotor 35S potenciado con secuencias 3' adicionales e incorporado como nucleótidos 7093 a 7344 del ADN de CaMV, la secuencia enlazadora CATCGATG, los nucleótidos 7093 a 7439 de CaMV, la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAGGATCCAG (SEC ID Nº 6), los nucleótidos 167 a 186 de MSV, los nucleótidos 188 a 317 de MSV y un resto G que representa la base final de una secuencia de reconocimiento Nco I CCATGG. Como se ha indicado anteriormente, el codón de inicio de la traducción GUS forma parte del sitio Nco I. Los transcritos de este promotor contienen como líder 5' no traducido esencialmente la secuencia líder de la proteína de la cubierta de MSV.

pDAB353 contiene un promotor 35S potenciado con secuencias 3' adicionales e incorporado como nucleótidos 7093 a 7344 del ADN de CaMV, la secuencia enlazadora CATCGATG, los nucleótidos 7093 a 7439 de CaMV, la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAG (SEC ID Nº 7), los nucleótidos 120 a 210 de Adh1.S de maíz, los nucleótidos 555 a 672 de Adh1.S de maíz y la secuencia CCGTCGACCATGG (SEC ID Nº 8). Como se ha indicado anteriormente, el codón de inicio de la traducción GUS forma parte del sitio Nco I. Los transcritos de este promotor contienen como líder 5' no traducido esencialmente una versión delecionada del intrón 1 de Adh.S de maíz.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Las siguientes definiciones se proporcionan para esclarecer la intención o alcance de su uso en la memoria descriptiva y reivindicaciones.

Proteína cristalina o proteína cristalina insecticida (ICP) o toxina cristalina se refiere al componente proteico principal de los cristales paraesporales formados en las cepas de Bt. Este componente proteico presenta toxicidad selectiva para diferentes especies de insectos. El tamaño molecular de la proteína principal aislada a partir de cristales paraesporales varía dependiendo de la cepa de Bt de la que procede. Se han presentado proteínas cristalinas que tienen pesos moleculares de aproximadamente 132, 65 y 28 kDa. Se ha demostrado que la proteína de aproximadamente 132 kDa es una protoxina que se escinde para formar una toxina de insectos amino proximal de aproximadamente
65 kDa.

El gen de la proteína cristalina se refiere a la secuencia de ADN que codifica la proteína cristalina insecticida en forma de protoxina de longitud completa o toxina, dependiendo de la cepa de Bt de la que procede el gen.

Como se usa en este documento, el término nucleótido se refiere a la unidad monomérica de ADN o ARN que consiste en un resto de azúcar (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base se une al resto de azúcar a través del carbono glicosídico (carbono 1' de la pentosa). La combinación de la base y el azúcar se denomina nucleósido; la base caracteriza el nucleótido. Las cuatro bases del ADN son adenina ("A"), guanina ("G"), citosina ("C") y timina ("T"). Las cuatro bases de ARN son A, G, C y uracilo ("U").

Un gen estructural es la parte de un gen que comprende un segmento de ADN que codifica una proteína, polipéptido o una parte de la misma, y que excluye la secuencia 5' que dirige la iniciación de la transcripción. El gen estructural puede ser uno que se encuentra normalmente en la célula o uno que normalmente no se encuentra en la localización celular en la que se introduce, en cuyo caso se denomina gen heterólogo. Un gen heterólogo puede obtenerse en su totalidad o en parte de cualquier fuente conocida en la técnica, incluyendo un genoma bacteriano o episoma, ADN ecuariótico, nuclear o plasmídico, ADNc, ADN viral o ADN sintetizado químicamente. Un gen estructural puede contener una o más modificaciones en la región codificante o en las regiones no traducidas que podrían afectar a la actividad biológica o a la estructura química del producto de expresión, la velocidad de expresión o la manera de control de la expresión. Estas modificaciones incluyen, pero sin limitación, mutaciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más nucleótidos. El gen estructural puede constituir una secuencia codificante no interrumpida o puede incluir uno o más intrones, unidos por las uniones de corte y empalme apropiadas. El gen estructural puede ser un compuesto de segmentos procedentes de una pluralidad de fuentes (naturales o sintéticas, donde sintético se refiere a un ADN que se sintetiza químicamente). El gen estructural también puede codificar una proteína de fusión.

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Unido operativamente se refiere a una yuxtaposición donde los componentes se configuran para realizar su función habitual. De esta manera, las secuencias de control unidas operativamente a una secuencia codificante pueden efectuar la expresión de la secuencia codificante.

Tejido vegetal incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas, incluyendo pero sin limitación, raíces, vástagos, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células en cultivo tales como células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callos. El tejido vegetal puede estar en la planta o en un órgano, tejido o cultivo celular.

Célula vegetal, como se usa en este documento, incluye células vegetales en la planta y células vegetales y protoplastos en cultivo.

Homología se refiere a la identidad o casi identidad de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Como se entiende en la técnica, pueden producirse desacoplamientos de nucleótidos en la tercera base o en la base de tambaleo en el codón sin originar sustituciones de aminoácidos en la secuencia polipeptídica final. Además, pueden tolerarse modificaciones de nucleótidos minoritarias (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones) en ciertas regiones de la secuencia del gen siempre que dichas modificaciones produzcan cambios en la secuencia de aminoácidos que no alteren la funcionalidad del producto final. Se ha demostrado que copias sintetizadas químicamente de la totalidad o de partes de secuencias génicas pueden reemplazar a las regiones correspondientes en el gen natural sin perder la función del gen. Pueden identificarse homólogos de secuencias de ADN específicas por los especialistas en la técnica usando el ensayo de hibridación cruzada de ácidos nucleicos en condiciones de rigurosidad como es bien conocido en la técnica (como se describe en Hames et al., Nucleic Acid Hybridisation, (1985) IRL Press, Oxford, UK). El grado de homología a menudo se mide en términos de porcentaje de identidad entre las secuencias
comparadas.

Codón preferido o frecuencia de uso de codones preferidos se refiere a la preferencia presentada por una célula hospedadora específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Para determinar la frecuencia del uso de un codón particular en un gen, el número de apariciones de ese codón en el gen se divide por el número total de apariciones de todos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen. La frecuencia de uso de codones preferidos presentados por una célula hospedadora puede calcularse promediando la frecuencia de uso de codones preferidos en un gran número de genes expresados por la célula hospedadora.

El porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de codones preferidos para un gen sintético con respecto al empleado por una célula hospedadora se calcula primero determinando la desviación en porcentaje de la frecuencia del uso de un solo codón con respecto a la de la célula hospedadora seguido de la obtención de la desviación media de todos los codones. Como se define en la presente memoria, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG). En términos generales, la desviación media global del uso de codones de un gen sintético con respecto al de una célula hospedadora se calcula usando la ecuación

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donde X_{n} = frecuencia de uso para el codón n en la célula hospedadora; Y_{n} = frecuencia de uso para el codón n en el gen sintético; donde n representa un codón individual que específica un aminoácido; y donde el número total de codones es Z.

La expresión secuencia de nucleótidos optimizada para plantas pura se refiere a un gen o secuencia de ADN que comprende 100% de las secuencias de codones preferidos en la planta hospedadora para un polipéptido particular. Una secuencia optimizada para maíz pura es un gen o secuencia de ADN que comprende 100% de la secuencia de codones preferida en maíz para un polipéptido particular.

Como se usa en la presente memoria, una secuencia de nucleótidos optimizada en plantas se refiere a un gen o secuencia de ADN producida a partir de variaciones de la secuencia optimizada en la planta pura. Las variaciones descritas en la presente memoria incluyen alteraciones de la secuencia de nucleótidos optimizada en la planta pura para permitir la manipulación del gen, tal como por medio de la alteración de un nucleótido para crear o eliminar sitios de restricción; y variaciones para eliminar sitios de procesamiento potencialmente perjudiciales, tales como sitios de poliadenilación potenciales o sitios de reconocimiento de corte y empalme de intrones. Una secuencia de nucleótidos optimizada en maíz se refiere a un gen o secuencia de ADN producida a partir de variaciones de una secuencia optimizada en maíz pura. En un aspecto de la invención, la secuencia de nucleótidos optimizada en la planta tiene una homología de aproximadamente 70 a aproximadamente 71% con una secuencia de nucleótidos de Bt nativa que codifica ICP, y una homología de aproximadamente 63% basándose en el uso de codones de primera elección y una homología de aproximadamente 83% con una secuencia de nucleótidos optimizada en maíz pura.

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Procedente de se usa para hacer referencia a cogido, obtenido, recibido, localizado, replicado o descendido de una fuente (química y/o biológica). Un derivado puede producirse por manipulación química o biológica (incluyendo, pero sin limitación, sustitución, adición, inserción, deleción, extracción, aislamiento, mutación y replicación) de la fuente original.

Sintetizado químicamente, cuando se refiere a una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos componentes se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual del ADN puede realizarse usando procedimientos bien establecidos (Caruthers, Methodology of DNA and RNA Sequencing, (1983), Weissman (ed.), Praeger Publishers, Nueva York, Capítulo 1); la síntesis química automática puede realizarse usando una de varias máquinas disponibles en el mercado.

La expresión diseñado para tener una alta expresión, como se usa en la presente memoria, se refiere a un nivel de expresión de un gen diseñado donde la cantidad de sus transcritos de ARNm específicos de longitud completa producidos es suficiente como para cuantificarse en transferencias de Northern y, por lo tanto, representa un nivel de ARNm específico expresado que corresponde a una cantidad mayor o igual a aproximadamente 0,001% del poli(A)+ARNm. Antes de esta invención, los genes de Bt naturales se transcribían a niveles en los que la cantidad de ARNm específico de longitud completa producido era insuficiente como para estimarse usando la técnica de transferencia de Northern. Sin embargo, en la presente invención, la transcripción de un gen de ICP de Bt optimizado para maíz sintético diseñado para tener una alta expresión, aumenta hasta que se obtienen niveles suficientemente elevados de la ICP como para acumularse para destruir los insectos que se alimentan de la planta.

Diseño de una Secuencia de Gen de ICP de Bt Optimizada para Maíz

El diseño y la estrategia de síntesis presentadas en la presente memoria representan los métodos preferidos generalmente para el diseño y la síntesis de un gen de ICP optimizado en una planta, específicamente maíz. Los especialistas habituales en la técnica reconocerán que son posibles cambios en este protocolo sin experimentación indebida para el diseño y para sintetizar un gen de ICP para la expresión en otra especie vegetal.

La secuencia de ADN del gen de ICP de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki HD73, como se notifica por Adang et al., Gene, 36 (1985) 289, se usó como secuencia de partida para el diseño de un gen de ICP de Bt optimizado en maíz. El gen de ICP de Bt optimizado en maíz resultante se identifica en la SEC ID Nº 1. La secuencia del gen insecticida optimizado específico para maíz contiene aproximadamente 63% de codones de primera elección, entre aproximadamente 22% y aproximadamente 37% de codones de segunda elección y entre aproximadamente 15% y aproximadamente 0% de codones de tercera y/o cuarta elección, donde el porcentaje total es 100%. Más preferiblemente, la secuencia del gen insecticida optimizado específico para maíz contiene aproximadamente 63% de codones de primera elección, entre aproximadamente 22% y aproximadamente 37% de codones de segunda elección y entre 15% y 0% de codones de tercera elección, donde el porcentaje total es 100%. Más preferiblemente, la secuencia del gen insecticida optimizado específico para maíz contiene aproximadamente 63% de codones de primera elección, al menos aproximadamente 22% de codones de segunda elección, aproximadamente 7,5% de codones de tercera elección y aproximadamente 7,5% codones de cuarta elección, donde el porcentaje total es 100%.

Más específicamente, como material de partida se usó Cry1A(c) de B. thuringiensis. El análisis de la composición de bases del gen nativo revela una disparidad significativa de los genes de maíz. Por ejemplo, la composición de guanosina más citosina (G+C) del gen de ICP nativo es 37%, mientras que los genes de maíz están dentro del intervalo de G+C de 45-75% (Tabla 1).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1 Recopilación de contenidos de G+C de regiones codificantes de proteína de genes de maíz

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Para los datos de la Tabla 1, las regiones codificantes de los genes se extrajeron de las entradas del GenBank (Publicación 71), y las composiciones de bases se calcularon usando el programa MacVector^{TM} (IBI, New Haven, CT). En los cálculos se ignoraron las secuencias de los intrones. Las secuencias de genes de proteínas de almacenamiento de los Grupos I y II se distinguieron por sus notables diferencias en la composición de bases.

El extremadamente bajo contenido de G+C del gen de ICP de Bt nativo (y la consiguiente desviación hacia un alto contenido de A+T) tiene como resultado la generación de secuencias que imitan o duplican secuencias de control de genes de plantas que se sabe que son muy ricas en A+T. La presencia de algunas secuencias ricas en A+T dentro del ADN del gen introducido (por ejemplo, regiones de caja TATA que se encuentran normalmente en promotores génicos) puede producir una transcripción aberrante del gen. Por otra parte, la presencia de otras secuencias reguladoras que residen en el ARNm transcrito (por ejemplo, secuencias señal de poliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias a ARN nucleares pequeños implicados en el corte y empalme pre-ARNm) puede ocasionar inestabilidad del ARN. Por lo tanto, uno objetivo en el diseño de un gen de ICP de Bt optimizado en maíz fue generar una secuencia de ADN que tuviera un mayor contenido de G+C, y preferiblemente uno parecido al de los genes de maíz que codifican enzimas metabólicas. Otro objetivo en el diseño del gen de ICP de Bt optimizado en maíz fue generar una secuencia de ADN que no solo tuviera un contenido de G+C mayor, sino que por medio de una modificación pudieran realizarse cambios en la secuencia para no perjudicar a la traducción.

Debido a la plasticidad producida por la redundancia del código genético (es decir, algunos aminoácidos se especifican por más de un codón), la evolución de los genomas de diferentes organismos o clases de organismos ha dado como resultado el uso diferencial de codones redundantes. Esta "preferencia de codones" se refleja en la composición media de bases de regiones codificantes de proteínas. Por ejemplo, organismos con contenidos de G+C relativamente bajos utilizan codones que tienen A o T en la tercera posición de codones redundantes, mientras que los que tienen mayores contenidos de G+C utilizan codones que tienen G o C en la tercera posición. Se piensa que la presencia de codones "minoritarios" dentro del ARNm de un gen puede reducir la velocidad de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al codón minoritario es baja. Una extensión de esto es que la disminución de la velocidad de traducción por los codones minoritarios individuales sería al menos aditiva para múltiples codones minoritarios. Por tanto, los ARNm con contenidos relativos elevados de codones minoritarios tendrían velocidades de traducción correspondientemente bajas. Esta velocidad podría reflejarse por la síntesis de bajos niveles de la proteína codificada.

Una comparación de la composición de codones del gen de ICP de Bt y las composiciones de codones de genes de maíz (Tabla 2) revela una gran disparidad en la preferencia de codones.

TABLA 2 Comparación del uso de codones entre 26 genes de maíz y un gen que codifica una proteín Cry1A(c) de Bacillus thuringiensis Cry1A(c)^{a}

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Sin excepción, cualquier codón redundante presente en el gen de Bacillus es un codón de maíz no preferido. Estas diferencias en la preferencia de codones son particularmente evidentes en los casos en los que sólo existen dos elecciones de codón (es decir Glu, Asp, Lys, Asn, Cys, Tyr, Phe, Gln y His).

Para diseñar el gen de ICP de Bt optimizado en maíz, la secuencia de aminoácidos de ICP se tradujo de forma inversa en una secuencia de ADN, utilizando un código genético no redundante establecido a partir de la tabla de preferencia de codones recopilada para secuencias de ADN de genes de maíz. La secuencia de ADN resultante, que era completamente homogénea en el uso de codones, se modificó adicionalmente en cinco repeticiones para establecer una secuencia de ADN que, además de tener un mayor grado de diversidad de codones, también contuviera sitios de reconocimiento de enzimas de restricción colocados estratégicamente, una composición de bases deseable y la ausencia de secuencias que pudieran interferir con la transcripción del gen, o la traducción del ARNm producido.

Mze HD73 #1 trnc: Síntesis de un gen de ICP con codones preferidos en maíz. Como punto de partida para crear una nueva secuencia de gen de ICP se creó un "Código Genético de Maíz" donde cada aminoácido se especifica por un solo codón elegido basándose en los codones de maíz que aparecen con más frecuencia de la Tabla 2 (frecuencias como número subrayados en las columnas de "Maíz %"). La secuencia de ADN de ICP de Bt nativo se tradujo en la secuencia de proteína correspondiente, y los 610 aminoácidos amino-terminales (que constituyen el péptido insecticida mínimo de la ICP) se tradujeron de forma inversa en una nueva secuencia de ADN basándose en el Código Genético de Maíz. Esta secuencia, denominada Mze HD73 #1 trnc por lo tanto estaba compuesta completamente de codones de maíz "preferidos" y tenía un contenido de G+C de 66%, algo mayor que un gen de maíz "típico" (Tabla 1). La nueva secuencia de ADN tenía 624 cambios de bases con respecto a la secuencia de ADN de ICP de Bacillus nativa.

Mze HD73 #2 trnc: Eliminación de sitios de reconocimiento de enzimas. Las enzimas de restricción BamH I, Bgl II, Bcl I y Nco I se usan rutinariamente para la construcción de casetes de expresión génica. Por lo tanto, es preferible que una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés no contenga sitios de reconocimiento para esas enzimas. El análisis de la secuencia de ADN de Mze HD73 #1 trnc reveló secuencias de reconocimiento para tres sitios Bcl I, tres sitios Bgl I, dos sitios Bgl II, un sitio BamH I y un sitio Nco I. La alteración de la secuencia de ADN de esta manera para eliminar estos sitios fuerza al uso de codones que no son los codones de maíz "preferidos", sino que más bien son codones de segunda elección o de una elección menor. Por ejemplo, el nucleótido 249 de la secuencia se cambió de G a C, cambiando un codón de leucina de CTG (el codón preferido en maíz, que está presente 31% de la veces, Tabla 2) por CTC (el segundo codón de leucina usado con más frecuencia, que aparece 28% de las veces). Este único cambio eliminó un sitio de reconocimiento de Bcl I y un sitio Pvu II solapante. En la Tabla 3 se proporcionan otros 12 cambios y sus fundamentos.

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TABLA 3 Cambios realizados en Mze HD73 #1 trnc \rightarrow Mze HD73 #2 trnc

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La secuencia resultante se denominó Mze HD73 #2 trnc y codificaba una proteína idéntica a Mze HD73 #1 trnc.

El análisis de la secuencia reveló que no había sitios de reconocimiento para BamH I, Bgl II, Bel I, Nco I u otras diversas enzimas usadas comúnmente. El análisis también reveló que la cadena codificante de ICP de Mze HD73 #2 trnc contiene la Fase de Lectura Abierta (ORF) entera en las fases de lectura 1 y 3. La ORF en fase 1 corresponde a la de la ICP, y verifica que no se generaron sin querer codones de terminación por los cambios realizados en la secuencia. La única ORF en la fase 3 comienza con la G del codón de iniciación de ICP y continúa sin interrupción hasta el final de la secuencia.

Mze HD73 #3 trnc: Modificación de sitios de reconocimiento de enzimas para facilitar la síntesis. La tecnología actual (que usa una combinación de síntesis de ADN automática y enzimática) tiene un límite superior en el intervalo de unos pocos cientos de pares de bases para el tamaño de fragmentos que pueden sintetizarse razonablemente in vitro. Por consiguiente, era necesario dividir los 1830 pb de la secuencia de ADN para la ICP en varias secciones, cada una flanqueada por secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas. La separación de estos sitios era tal que los fragmentos de ADN correspondientes tenían un tamaño tal que podían sintetizarse fácilmente y manipularse in vitro. La introducción de sitios se realizó realizando 6 cambios de base en la secuencia de Mze HD73 #2 (resumido en la Tabla 4).

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TABLA 4 Cambios hechos en Mze HD73 #2 trnc \rightarrow Mze HD73 #3 trnc

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Estos cambios se realizaron para eliminar dos de tres sitios Sst II (dejando un solo sitio Sst II colocado de forma apropiada), y para crear nuevos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción con la separación apropiada. De nuevo, estos cambios no alteraban la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada y no utilizaban ningún codón de maíz con frecuencia muy baja. La estrategia empleada para identificar las posiciones de los nuevos sitios se basó en el análisis de las frecuencias de uso de codones (Tabla 2). Se eligieron pares de codones de maíz de uso preferido o frecuente que generaban sitios de restricción cuando se colocaban yuxtapuestos. Por ejemplo, los codones emparejados CTC (Leu) y GAG (Glu) forman un sitio de reconocimiento para Xho I (CTCGAG), y los codones emparejados GTC (Val) y GAC (Asp) forman un sitio Sal I (GTCGAC). El análisis de la secuencia de ICP identificó un par Leu/Glu en los restos 215/216, y un par Val/Asp en los restos 407/408. Se realizaron sustituciones de bases apropiadas para generar las secuencias de reconocimiento en estos sitios (Tabla 4). El análisis de la secuencia de este gen (Mze HD73 #3 trnc) reveló las mismas ORF que en la versión #2.

Una búsqueda de la secuencia de ADN de Mze HD73 #3 trnc con una secuencia consenso de plantas para uniones exón:intrón 5' [AG:GTAAGT] reveló un acoplamiento 4/8 [GGTA] en 629-632, y acoplamientos 3/8 entre [GGT] en otras ocho posiciones. La secuencia (T)GGTA(C) en 629 no pudo cambiarse sin cambiar los aminoácidos codificados, ya que el código genético utiliza un solo codón Trp (TGG), y los dos codones para la siguiente Tyr empiezan con TA [TAC y TAT]. Sin embargo, probablemente la secuencia GGTA no es suficiente para servir como sitio de reconocimiento de corte y empalme, ya que el resto A 5' de la secuencia consenso está muy conservado en sitios de reconocimiento de corte y empalme para ARN de plantas y animales, y la secuencia GGTA aparece en la región codificante de la \beta-glucuronidasa de E. coli (que se expresa bien en células vegetales), y en el exón 1 de la alcohol deshidrogenasa (Adh) 1 de maíz. Además, GGTA se encuentra como parte de todos los sitios de reconocimiento de Kpn I [GGTACC] que aparecen naturalmente en algunos genes vegetales, de forma que probablemente no representa un sitio donante de corte y empalme potencial per se.

Después se buscaron en la secuencia de ADN de Mze HD73 #3 trnc secuencias similares o idénticas al consenso de señal de sitio de adición de poli A AATAAA. Se encontró un emparejamiento perfecto en la secuencia del gen de ICP nativo, pero no se encontró homología con esta secuencia modificada por ingeniería genética, o versiones más cortas de ella (debajo de AATA) en Mze HD73 #3 trnc.

Se buscaron secuencias parecidas a una secuencia de terminación de la ARN polimerasa II usando la plantilla CAN_{7-9}AGTNNAA, donde N representa cualquiera de las cuatro bases encontradas en el ADN. No hubo emparejamientos en ningún nivel con N fijado de 7 a 9.

Se cree que la formación de estructuras autocomplementarias intracatenarias ("horquillas") en los ARNm inhibe la progresión de los ribosomas a lo largo del ARNm durante la traducción, y que los formadores de horquilla CTTCGG y su complemento en la misma cadena CCGAAG son particularmente desfavorables. Se encontraron dos emparejamientos perfectos de CTTCGG en Mze HD73 #3 trnc (en 201-206 y 1707-1712). Sin embargo, no había emparejamientos con CCGAAG, CCGAA, CGAAG o CGAA. Como la importancia de las horquillas es incierta, no se examinó en la secuencia de ICP ningún otro bloque de secuencia autocomplementario.

Mze HD73 #3 trnc: Eliminación de dobletes TA o GC. Los genes eucarióticos son relativamente deficientes en los dobletes de nucleótidos TA y GC, y están enriquecidos en dobletes TG y CT. Sólo dos codones "preferidos" de maíz (Tabla 2) contienen dobletes TA o CG: TAC (Tyr) y CGC (Arg). El uso de estos codones en la secuencia sintética necesita la generación de dobletes que se desean evitar. Por lo tanto, la ventaja de usar el codón preferido debe equilibrar el perjuicio del crear un exceso de abundancia de dobletes "prohibidos". En el caso de Tyr, la sustitución por el codón de segunda elección no elimina el doblete TA, ya que también es un componente de este codón (TAT). En el caso de Arg, sin embargo, el codón de segunda elección (AGG) se usa en maíz únicamente con una frecuencia ligeramente menor que la primera elección (26% frente a 40% de las veces), de forma que se completó la sustitución de CGC por AGG. Los otros codones que contiene dobletes TA o CG [GTA (Val); ATA (lle); TAG, TAA (Terminación); TTA, CTA (Leu); GCG (Ala); CGG, CGA, CGT (Art); ACG (Thr); y CCG (Pro)] no son aceptables para uso en las regiones codificantes (por ejemplo, los codones de terminación), se encuentran tan pocas veces en los genes de maíz que no son adecuados para incluirse en una secuencia con preferencia de codones, o son miembros de series de codones que tienen sinónimos aceptables (Tabla 2).

Además de existir dentro de un solo codón, los dobletes CG y TA se generan por yuxtaposición de codones que terminan en C o T y codones que empiezan con G o A. Como ninguno de los codones preferidos en maíz termina en T, necesariamente las yuxtaposiciones T/A se deben a dobletes internos en codones individuales, en versiones génicas que usan sólo codones preferidos. Los dobletes CG generados por pares de aminoácidos se localizan revisando la secuencia de la proteína para encontrar yuxtaposiciones de aminoácidos que se representan por codones preferidos en maíz que terminan en C, con aminoácidos representados por codones preferidos en maíz que empiezan con G. Los "terminados en C" son Gly (GGC), Asp (GAC), Ala (GCC), Arg (CGC, Ser (AGC), Asn (AAC), lle (ATC), Thr (ACC), Cys (TGC), Tyr (TAC), Phe (TTC), His (CAC y Pro (CCC); los "empezados en G" son Gly (GGC), Glu (GAG), Asp (GAC), Val (GTG) y Ala (GCC) (Tabla 5).

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TABLA 5 Yuxtaposiciones de Aminoácidos que Generan Dobletes CG

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Habiendo identificado dichos dobletes de aminoácidos, se podría intentar cambiar cualquiera de los codones para minimizar la aparición de dobletes CG, sin sacrificar una cantidad excesiva de preferencias de codones. Sin embargo, como todos los codones alternativos para los "empezados en G" de codones preferidos también empiezan con G, la G de estos dobletes CG no puede cambiarse, y se debe limitar a cambios en los codones para el primer aminoácido del par, cuando existan codones alternos apropiados. En algunos casos [por ejemplo Asp: GAC (76) > GAT (24); Asn AAC (81) > AAT (19); Cys TGC (79) > TGT (21); Tyr TAC (86) > TAT (14); Phe TTC (80) > TTT (20); y His: CAC (71) > CAT (29)], el codón alternativo se encuentra en genes de maíz a una frecuencia significativamente menor que los codones preferidos de tal forma que la sustitución no es una opción. Por lo tanto, pueden ignorarse los dobletes generados por estas yuxtaposiciones.

Por consiguiente, se recopiló una lista de 128 dobletes que comprendían yuxtaposiciones de los aminoácidos anteriores que generan CG en la secuencia de la proteína Mze HD73 #3 trnc (Tabla 6). Se realizaron cambios en la secuencia de los codones correspondientes a 74 de los dobletes de aminoácidos (números de posición subrayados en la Tabla 6) para eliminar los dobletes de bases CG.

TABLA 6 Yuxtaposiciones de Aminoácidos en Mze HD73 #3 trnc Que Generan Dobletes CG^{a}

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La elección de los codones alternativos para sustituir los preferidos se determina en gran medida por el hecho de que el alternativo no debe estar entre la clase de codones usados muy pocas veces. Un factor a considerar es que una secuencia de ADN compuesta únicamente por los codones preferidos en maíz puede tener problemas de expresión, ya que una dependencia no natural de un solo codón para cada aminoácido puede reducir la reserva de ARNt o aminoacil-ARNt sintetasas para ese codón. Se cree que es beneficioso introducir alguna diversidad en la composición de codones usando codones de segunda (o tercera) elección, siempre que el uso natural de los codones en los genes de maíz parezca acomodarse a la elección. A este respecto, es importante indicar que la frecuencia de aparición de codones en los genes de cualquier organismo debe sopesarse con respecto al número de codones sinónimos que existen para el aminoácido particular en el código genético universal. Por ejemplo, las frecuencias relativas del uso en maíz del codón de Phe TTT (20%) refleja claramente una mayor cantidad de contraselección (preferencia de codones) que la frecuencia relativa idéntica del codón de Pro CCT (20%), ya que hay sólo dos codones de Phe y cuatro codones de Pro (Tabla 2). La aceptabilidad de un codón alternativo como sustituto de uno preferido por lo tanto no es una elección sencilla.

Cuando se realiza la elección de codones alternativos aceptables para reducir los números de dobletes CG intervienen otros factores. Por ejemplo, cuando el codón de Arg preferido CGC (40%) aparece en el contexto CGCG, se eliminan dos dobletes CG simultáneamente por sustitución con el codón de Arg AGG de segunda elección (26%). Claramente, estas sustituciones son deseables desde el punto de vista doble de reducir los dobletes CG, así como generar un diversidad de codones. En una base más sutil, la sustitución del codón preferido de Thr ACC (47%) en el contexto ACCG por el codón de segunda elección ACG (26%), o la sustitución del codón preferido de Ser AGC (28%) en el contexto AGCG por el codón de tercera elección TCG (16%), no cambia el número total de dobletes CG pero genera una diversidad de codones deseable. Finalmente, la sustitución del codón preferido de Ser AGC (28%) en el contexto AGCG con el codón de cuarta elección TCT (14%) elimina el doblete CG, genera diversidad de codones y también aumenta el número total de dobletes CT.

La Tabla 7 resume estos y otros cambios realizados en la secuencia de Mze HD73 #3 trnc para generar Mze HD73 #4 trnc.

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TABLA 7 Cambios realizados en Mze HD73 #3 trnc \rightarrow Mze HD73 #4 trnc

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En el extremo de la secuencia se añadieron dos codones de prolina y un codón de terminación (TAG) (en los aminoácidos totales ahora son 612), produciéndose de esta manera MZE HD73 #4 trnc+. Se cree que la presencia de los restos de prolina terminales reduce la proteolisis en el extremo carboxi. En la secuencia resultante se exploraron los sitios de restricción. Se realizaron cambios de bases para eliminar un sitio Sal I en la posición 1219, crear uno nuevo en la posición 181, eliminar un sitio Nar I en la posición 158, y crear un nuevo sitio Kpn I en la posición 1217. Una búsqueda de ORF reveló la ORF de ICP en la fase 1, y una ORF pequeña en cada una de las fases 2 y 3. La ORF grande de la fase 3 presente en versiones previas del gen se interrumpió por un codón de terminación en la base 78; en la fase 3 no estaba presente ninguna otra ORF que empezara con un ATG y mayor de 25 aminoácidos.

Mze HD73 #5 trnc+: Reducción del contenido de GC y aumento de la diversidad de codones. La comparación de las frecuencias de dobletes de bases entre las versiones #4 trnc+ y las versiones previas de la secuencia (Tabla 3) reveló que la composición de bases se había alterado hacia reducciones en los pares de bases CG, y hacia abundancias en los pares de bases TG y CT. Sin embargo, la versión #4 trnc+ aún tenía un contenido de G+C relativamente elevado (62%) en comparación con la diana de 55-60% para genes de maíz. La reducción de este parámetro necesitaba usar más codones alternativos que contuvieran A y/o T.

La Tabla 8 resume los cambios realizados en la secuencia de Mze HD73 #4 trnc+ para generar Mze HD73 #5 trnc+.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 8 Cambios realizados en Mze HD73 #4 trnc+ \rightarrow Mze HD73 #5 trnc+

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Como se muestra por los Códigos de Bases de la tabla, estos cambios se realizaron para reducir el contenido de G+C del ADN y para introducir una diversidad de codones adicional, sin sacrificar una cantidad excesiva de preferencia de codones. Cuando fue posible, los bloques de secuencia con alto contenido de G+C se interrumpieron por la adición de sustituciones T o A. Además, se creó un solo sitio EcoR I cerca del extremo 3' del gen para proporcionar cuatro posibles adiciones de secuencia futuras. Las selecciones de codones sustitutos útiles para reducir el contenido de GC se indican en la Tabla 9.

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TABLA 9 Codones alternativos usados para reducir el contenido de G+C o aumentar los dobletes CT o TG

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Las sustituciones (indicadas en la Tabla 9) se realizaron con los siguientes fundamentos indicados a continuación:

i) Aunque todos los codones de Pro son sustitutos aceptables entre sí, CCT genera un doblete CT, además de reducir el contenido de G+C.

ii) Los dos codones de Gln están presentes en genes de maíz con frecuencias aproximadamente iguales, y por lo tanto pueden sustituirse fácilmente entre sí. De forma similar, los codones de Ser AGC y TCC se consideran intercambiables. Existen similitudes de frecuencias análogas para los codones de Val GTG y GTC, los codones de Leu CTG y CTC y los codones minoritarios de Ala GCT y GCG.

iii) Son aceptables los codones minoritarios de Leu y Ser TTG y TCT cuando siguen un codón de extremo C, de forma que se generan dobletes CT adicionales. TTG ofrece la característica añadida de aumentar la cantidad de doblete TG.

iv) El codón de Arg AGG puede sustituir al codón preferido CGC (véase el análisis en la sección previa). Aunque AGG aparece en genes de maíz con una frecuencia sustancialmente menor que el codón preferido, se encuentra con una frecuencia dos veces mayor que el codón de tercera elección.

v) Si es posible, deben usarse moderadamente codones minoritarios tales como GAT (Asp), GAA (Glu), ATT (lle), ACT (Thr) y GTT (Val), que evidentemente han tenido una selección negativa en maíz. Es preferible que se pongan antes o después de codones que contribuirán a la formación de un doblete CT o TG. Como son una característica de los genes de maíz nativos, no es necesario evitar totalmente su inclusión en un gen sintético.

Mze HD73 #6 trnc+. Sólo se realizaron unos pocos cambios en la secuencia de Mze HD73 #5 trnc+ para generar la versión final del gen, Mze HD73 #6 trnc+. (resumido en la Tabla 10).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 10 Mze HD73 #5 trnc+ \rightarrow Mze HD73 #6 trnc+

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Como se resume en la Tabla 11, los cambios que produjeron Mze HD73 #5 trnc+ y Mze HD73 #6 trnc+ disminuyeron los números de dobletes CG casi en 50%, y claramente aumentaron los dobletes TG y CT. Además, el contenido de G+C de 56% está dentro del intervalo de genes metabólicos de maíz.

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TABLA 11 Comparaciones de números de dobletes de bases y composiciones de bases de genes de ICP

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El examen de la secuencia de ADN que expresó satisfactoriamente Perlak et al. (PNAS, 88 (1991) 3324) en plantas transgénicas reveló que el gen codificaba 615 aminoácidos de la ICP nativa (en lugar de los 610 codificados por MZE HD73 #5 trnc+). Por lo tanto, los codones para los cinco (5) aminoácidos adicionales se añadieron entre el codón 610 y los dos (2) codones de Pro añadidos en la versión #4. MZE HD73 #6 trnc+ por lo tanto codifica 615 aminoácidos de la ICP de HD73 nativa, y dos restos de prolina en el extremo carboxi (SEC ID Nº 1).

La Tabla 12 presentada a continuación indica los patrones de uso de codones del gen de HD73 de Bacillus nativo, el gen de Mze HD73 #1 trnc+ y Mze HD73 #6 trnc+.

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TABLA 12 Comparaciones de números de codones de genes de ICP

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En la Tabla 13 se indica el análisis de Mze HD73 #6 trnc+ y la comparación con genes de dicotiledóneas y de maíz.

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TABLA 13 Desviación del uso de codones entre MZE HD73 #6 trnc+, dicotiledóneas y maíz

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En comparación con la secuencia bacteriana, Mze HD73 #6 trnc+ tiene 538 cambios de bases dentro de los 1845 pb de la región codificante de ICP (538/1845 x 100 = 29% de diferencia) y 6 cambios adicionales debidos a la adición de dos codones de Pro, para un total de 544 diferencias en 1851 pb. La comparación con la secuencia de ADN publicada por Perlak et al. (PNAS, 88 (1991) 3324) revela que el presente gen de ICP de Bt optimizado para maíz difiere en 422 posiciones de 1845 (23% de diferencia) y las proteínas codificadas difieren en los aminoácidos 206, 227, 245, 254, 289 y 313 (6 cambios de 615 aminoácidos, sin incluir las prolinas terminales).

La Tabla 14 presentada a continuación ilustra adicionalmente las enseñanzas del método para modificar un gen usando codones preferidos y no preferidos en maíz para obtener una secuencia de nucleótidos optimizada en plantas.

TABLA 14 Uso de Codones de Maíz No Preferidos en MZE HD73 #6 trnc+

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En MZE HD73 #6 trnc+, las preferencias de codones en maíz se distribuyen como se indica a continuación:

19 de los 20 codones de primera elección se usan un total de 389 de 618 veces posibles, o 63% de la veces.

13 de los 18 codones de segunda elección se usan un total de 136 veces de las 618 veces posibles, o 22% de la veces.

5 de los 10 codones de tercera elección se usan un total de 46 veces de las 618 veces posibles, o 7,5% de la veces.

6 de los 8 codones de cuarta elección se usan un total de 47 veces de las 618 veces posibles, o 7,5% de la veces.

se usan 0 de los 3 codones de quinta elección.

se usan 0 de los 3 codones de sexta elección.

Basándose en la frecuencia de uso de codones de maíz de primera elección, MZE HD73 #6 trnc+ tiene una homología de 63% con una secuencia de nucleótidos optimizada en plantas pura.

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Síntesis de Gen de ICP de Bt Optimizado en Maíz

Se sintetizó una secuencia de nucleótidos correspondiente a Mze HD73 #6 trnc+ en una serie de Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) como se enseña en la Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202 de Mullis y en la Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195 de Mullis et al., mediante la adición por etapa de oligonucleótidos solapantes. El procedimiento se basa en amplificación por PCR del producto de síntesis intermedio, seguido de la amplificación de fragmentos de ADN grandes modificados extensivamente antes de la clonación. Después de una vuelta de amplificación, el producto intermedio se purifica, se hibrida con la siguiente serie de cebadores solapantes y se amplifica. De esta manera pueden sintetizarse genes enteros sin el templado, ligamiento, transformación y selección de productos de reacción intermedios; etapas que son necesarias con otras estrategias.

La Taq polimerasa, la enzima usada en la amplificación por PCR, carece de actividad exonucleasa 3'-5' y por lo tanto no puede "corregir" la secuencia naciente y retirar los nucleótidos incorporados de forma errónea. En cierta condiciones (temperatura de hibridación de 55ºC y una concentración de desoxinucleótidos 200 \muM), se calculó que la polimerasa incorporaba nucleótidos de forma errónea a una frecuencia de 5 x 10^{-6} (Gelfland et al., PCR Protocols, (1989), Academic Press, Inc., San Diego, CA). La probabilidad de que se produzca un error en una cierta secuencia aumenta al aumentar el número de ciclos de amplificación y por lo tanto los genes de mayor tamaño se sintetizan mejor en varias partes separadas de tamaño intermedio (500-700 nucleótidos) que posteriormente se une entre sí por amplificación por PCR, o se unen entre sí por ligamiento tradicional de extremos. Esta estrategia también permite modificar las diferentes partes o cambiarlas sin afectar a la secuencia entera del gen.

En un aspecto de la invención para el diseño del gen de ICP de Bt, se introdujeron varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción únicos en la secuencia para permitir la unión de partes sintetizadas por separado (SEC ID Nº 1). Además se añadieron dos restos C al extremo 5' de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 para generar un sitio Nco I, y se añadió un sitio BamH I al extremo 3' del gen (cadena abajo de la región codificante) de forma que el gen de ICP completo pudiera insertarse en sitios Nco I y BamH I (u otros sitios con extremos compatibles con BamH I) en algunos de los vectores. La secuencia de ICP de 1854 nt se dividió en tres partes de tamaño aproximadamente equivalente. Cada parte, después de finalizar la síntesis, se diseñó para que contuviera en cada uno de sus extremos un sitio de restricción único. Estos sitios se usaron para unir las partes individuales entre sí para construir la secuencia contigua que codificaba 617 aminoácidos. La parte 5' se diseñó para tener sitios Nco I 5' y Xho I 3' únicos en los extremos, la parte central se diseñó para tener sitios Xho I 5' y Kpn I 3' únicos en los extremos, y la parte 3' se diseñó para tener sitios Kpn I 5' y BamH I 3' únicos (véase la Figura 1A).

En otro aspecto de la invención, el fragmento de gen de ICP en posición más 5' de 653 pares de bases (pb) se sintetizó a partir de 12 oligonucleótidos largos de 61 a 86 bases solapantes en 6 etapas de PCR. Todos los oligonucleótidos se diseñaron para producir solapamientos de 18 a 20 bases durante las etapas de PCR sucesivas. En cada caso, la síntesis del fragmento se realizó desde "dentro hacia fuera", como se ejemplifica en la Figura 1B. La etapa 1 del proceso de síntesis empezó hibridando los oligonucleótidos Bt1 y Bt2. Sólo en el área central de solapamiento entre los dos está la molécula hibridada bicatenaria. El resto de la molécula se hizo bicatenaria por extensión con la Taq Polimerasa durante 30 ciclos de amplificación. En la segunda etapa, esta molécula bicatenaria se desnaturalizó, después se hibridó y reamplificó con los oligonucleótidos Bt3 y Bt4. En la tercera etapa, esta molécula bicatenaria (correspondiente a la secuencia de Bt3, Bt1, Bt2 y Bt4) se desnaturalizó, se hibridó y se amplificó con los oligonucleótidos Bt5 y Bt6. Este proceso se repitió hasta que la secuencia se extendió hasta una molécula bicatenaria de 653 pb correspondiente a la secuencia entera de la parte 5' del gen de Bt (véase la Figura 1B). De forma similar, el fragmento central de 584 pb se sintetizó usando 10 oligonucleótidos solapantes con una longitud de 75 a 83 bases en 5 etapas de PCR y el fragmento del gen de ICP en posición más 3' de 657 pb se sintetizó usando 12 oligonucleótidos solapantes de 59 a 84 bases en 6 etapas de PCR. Después de la síntesis, cada una de las partes del gen clonadas en vectores pBlueScript ("pBS", Stratagene, La Jolla, CA) se verificaron por análisis de la secuencia. Cuando fue necesario se realizaron correcciones usando una estrategia de mutagénesis de PCR. Las correcciones se resecuenciaron antes de la unión de los fragmentos individuales en el gen completo.

El gen de ICP de Bt se construyó a partir de un total de 34 oligonucleótidos que variaban en tamaño de 59 a 86 nt. La secuencia de los 34 oligonucleótidos se presenta en la Tabla 15.

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TABLA 15 Oligonucleótidos Usados en la Síntesis del gen de ICP de Bt.^{a}

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En el diseño de los oligonucleótidos se siguieron varias condiciones: i) Todos los oligonucleótidos solapan en un mínimo de 18 nt; ii) La base en posición más 3' de cada oligonucleótido se eligió como G o C; iii) La base en posición más 5' de cada oligonucleótido se eligió adyacente y cadena abajo de un resto T en la secuencia, para evitar problemas con la adición sin plantilla de restos A en el extremo 3' de la cadena opuesta (Clark et al., Nucl. Acids Res., 16 (1988) 9677); iv) Cuando fue posible se evitó un emparejamiento de bases internas extensivo en cada oligonucleótido; y v) También se evitó cuando fue posible un emparejamiento de bases entre los oligonucleótidos usados en todas las etapas excepto la primera etapa (hibridación de oligonucleótidos) para cada fragmento.

Expresión de Genes en E. coli

Para demostrar que se codificaba por la secuencia de nucleótidos sintetizada se codificaba una proteína funcional de tamaño correcto, antigenicidad y toxicidad para insectos lepidópteros, se realizaron estudios de expresión en E. coli antes de iniciar los experimentos de transformación de plantas. Para este fin, la secuencia de ADN optimizada para maíz que codificaba ICP se insertó en plásmidos de expresión de T7, y se prepararon extractos de E. coli muy enriquecidos en el producto génico de ICP. El análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia demostró que el producto génico era del tamaño correcto y presentaba reacción cruzada con antisuero inducido contra la endotoxina delta de B. thuringiensis nativa purificada (Figura 4). La acción biológica de la proteína se demostró en ensayos de alimentación de M. sexta (Figura 5). Se proporcionó una verificación adicional del éxito de las estrategias de ingeniería genética y de síntesis por medio de la demostración de que el gen de ICP produjo una proteína antigénicamente activa del tamaño correcto en las células de callos de maíz transformadas (Figura 6). Los bioensayos de alimentación con larvas de H. virescens revelaron la actividad insecticida de la proteína obtenida por ingeniería genética. Conjuntamente, estos datos demuestran que la secuencia de nucleótidos optimizada en maíz produce una proteína que comparte varias características biológicas (por ejemplo, antigenicidad, tamaño, actividad biológica) con la ICP de tipo silvestre aislada a partir de la naturaleza.

Preparación de Vectores de ADN Recombinantes que Contienen el Gen de ICP de Bt Optimizado en Maíz Sintético

La secuencia de nucleótidos optimizada en maíz que codifica ICP de Bt se expresa en plantas a un mayor nivel en comparación con el observado con los genes estructurales de Bt naturales. La expresión de la secuencia de nucleótidos de ICP de Bt optimizada en maíz requiere la transformación de una célula vegetal con un vector apropiado. La secuencia de nucleótidos optimizada en maíz para ICP de Bt se combinó con un promotor funcional en plantas, estando el gen estructural y la región promotora en tal posición y orientación entre sí que el gen estructural puede expresarse en una célula en la que la región promotora es activa, formando de esta manera un gen funcional. Las regiones promotoras incluyen, pero sin limitación, regiones promotoras bacterianas y vegetales. En otro aspecto de la invención, el promotor se selecciona entre el grupo consistente en promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores temporales o regulados en el desarrollo, promotores preferidos en tejidos y promotores con especificidad de tejido.

En un aspecto importante de la invención, el vector incluye una secuencia líder de MSV (Virus del Estriado del Maíz), un promotor 35S, y un potenciador específico para el maíz, tal como un intrón 1 de Adh o un intrón 6 de Adh como se describe adicionalmente en los Ejemplos.

Para expresar la combinación de región promotora/gen estructural, el segmento de ADN que lleva la combinación está contenido en una célula. Las combinaciones que incluyen regiones promotoras de plantas están contenidas en células vegetales que, a su vez, pueden estar contenidas en plantas o semillas. Las combinaciones que incluyen regiones promotoras bacterianas están contenidas en bacterias, por ejemplo, Bt o E. coli. Los especialistas en la técnica reconocerán que en algunas circunstancias puede ser deseable la expresión en tipos de microorganismos distintos de bacterias y, dada la presente descripción, esto es factible sin experimentación indebida.

En la presente memoria, en los ejemplos, se describen adicionalmente vectores de ADN recombinantes apropiados con los puede combinarse el gen de ICP de Bt optimizado en maíz.

Transformación de Maíz con el Vector del Gen de ICP Sintético y Transformación de Todas las Plantas con el Promotor Doblemente Potenciado

La molécula de ADN recombinante que lleva un gen de ICP de Bt optimizado en maíz bajo el control del promotor puede introducirse en tejido vegetal por cualquier medio conocido por los especialistas en la técnica. La técnica usada para una especie vegetal dada o un tipo específico de tejido vegetal depende de las técnicas satisfactorias conocidas. Según se desarrollen nuevos medios para la inserción estable de genes extraños en las células vegetales y para manipular las células modificadas, los especialistas en la técnica podrán seleccionar entre los medios conocidos para conseguir un resultado deseado.

Los promotores doblemente potenciados pueden usarse para expresar genes extraños en maíz así como en dicotiledóneas u otras monocotiledóneas. Más específicamente, las dicotiledóneas incluyen, pero sin limitación, soja, legumbres, colza, algodón, girasol, tomates, patatas, remolacha, alfalfa, clavo y cacahuetes. Las monocotiledóneas incluyen, pero sin limitación, maíz, trigo, sorgo, avena, centeno, cebada, arroz, mijo, caña de azúcar y pastos.

Además de usar un promotor 35S o 19S doblemente potenciado procedente del virus del mosaico de la coliflor, otros promotores pueden modificarse por las enseñanzas descritas en la presente memoria. Más específicamente, los promotores que pueden modificarse con la secuencia líder de MSV adh1, adh6 u otros intrones (SEC ID Nº 43, 44, 45, 46 y 47) incluyen, pero sin limitación, el promotor de la octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa y el promotor de la manopina sintetasa.

Los promotores vegetales también pueden modificarse adicionalmente por las enseñanzas de la presente memoria e incluyen, pero sin limitación, la subunidad pequeña de la ribulosa-1,6-bifosfato (RUBP) carboxilasa (ssu), el promotor de la beta-conglicinina, promotor de faseolina, promotor de ADH, actina, ubiquitina, zeína, oleosina, napina, ACP, promotores de choque térmico y promotores con especificidad de tejido o con especificidad de polen, promotores con especificidad de embriones, promotores con especificidad de barbas del maíz, con especificidad de fibras de algodón, con especificidad de raíces, promotores con especificidad de endospermo de semillas y similares.

Existen varias técnicas para introducir material genético extraño en células vegetales y para obtener plantas que mantengan y expresen de forma estable el gen introducido. Estas técnicas incluyen la aceleración de material genético aplicado como recubrimiento sobre partículas directamente en las células (Patentes de Estados Unidos 4.945.050 de Cornell, y 5.141.131 de DowElanco). Las plantas pueden transformarse usando la tecnología de Agrobacterium, véanse la Patente de Estados Unidos 5.177.010 de la Universidad of Toledo, 5.104.310 de Texas A&M, Solicitud de Patente Europea 0131624B1, las Solicitudes de Patente Europea 120516, 159418B1 y las Solicitudes de Patente Europea 120516,159418B1 y 176.112 de Schilperoot, las Patentes de Estados Unidos 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 de Schilperoot, las Solicitudes de Patente Europea 116718, 290799, 320500 todas de Max Planck, las Solicitudes de Patente Europea 604662 y 627752 de Japan Tobacco, las Solicitudes de Patente Europea 0267159 y 0292435 y la Patente de Estados Unidos 5.231.019 todas de Ciba Geigy, las Patentes de Estados Unidos 5.463.174 y 4.762.785 ambas de Calgene y las Patentes de Estados Unidos 5.004.863 y 5.159.135 ambas de Agracetus. Otra tecnología de transformación incluye la tecnología de filamentos, véanse las Patentes de Estados Unidos 5.302.523 y 5.464.765 ambas de Zeneca. También se ha usado tecnología de electroporación para transformar plantas, véase el documento WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute, los documentos 5.472.869 y 5.384.253 ambos de Dekalb, los documentos WO9209696 y WO9321335 ambos de PGS. Además de las numerosas tecnologías para transformar las plantas, también puede variar el tipo de tejido que entra en contacto con los genes extraños. Este tejido incluiría, pero sin limitación, tejido embriogénico, tejido calloso de tipo I, II, hipocotilo, meristemo y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación usando técnicas apropiadas dentro de la experiencia de un especialista en la técnica.

Otra variable es la elección de un marcador de selección. La preferencia por un marcador particular se realiza a la discreción del especialista, pero puede usarse cualquiera de los siguientes marcadores selección junto con cualquier otro gen no indicado en la presente memoria que pueda funcionar como marcador de selección. Estos marcadores selección incluyen, pero sin limitación, el gen de aminoglicósido fosfotransferasa del transposón Tn5 (Aph II) que codifica resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, así como los genes que codifican la resistencia o la tolerancia al glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bar); imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas de triazolopirimidina tales como clorosulfurón; bromoxinil, dalapon y similares.

Además de un marcador de selección, puede ser deseable usar un gen indicador. En algunos casos puede usarse un gen indicador sin un marcador selección. Los genes indicadores son genes que típicamente no están presentes o se expresan en el organismo o tejido receptor. El gen indicador típicamente codifica una proteína que proporciona algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Se proporcionan ejemplos de dichos genes en K. Weising et al. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988), que se incorpora en la presente memoria como referencia. Un gen indicador preferido es el gen de la glucuronidasa (GUS).

Una vez introducido en el tejido vegetal, la expresión del gen estructural puede ensayarse por cualquier medio conocido en la técnica y la expresión puede medirse como ARNm transcrito o como una proteína sintetizada. Se conocen técnicas para el cultivo in vitro de tejido vegetal, y en varios casos, para la regeneración de plantas enteras (Solicitud de Patente EP Nº 88810309.0). Los especialistas en la técnica conocen procedimientos para transferir el complejo de expresión introducido en cultivares comercialmente útiles.

Una vez que se han obtenido células vegetales que expresan el gen bajo el control de un promotor expresable en plantas, pueden regenerarse tejidos vegetales y plantas enteras a partir de ellas usando métodos y técnicas bien conocidos en este campo. Las plantas regeneradas después se reproducen por medios convencionales y los genes introducidos pueden transferirse a otras cepas y cultivares por técnicas de reproducción de plantas convencionales.

Expresión del Gen de ICP en Células de Maíz

La funcionalidad del gen de ICP de Bt optimizado en maíz en células vegetales se ha ensayado en sistemas de transformación de maíz, en protoplastos de maíz Black Mexican Sweet (BMS) y en cultivos de callos de maíz transformados de forma estable. Estos estudios indicaron que el gen de ICP obtenido por ingeniería genética se expresaba bien en maíz y que los niveles de ICP acumulada eran suficientes para proporcionar un control de insectos en ensayos de alimentación in vitro.

La introducción del gen en cultivos de maíz regenerables por transformación por bombardeo por helio como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.141.131, proporcionó plantas fértiles que expresaban el gen. Las plantas cultivadas a partir de las semillas de plantas de maíz transgénicas también expresaron el gen de ICP en generaciones posteriores.

Los siguientes ejemplos ilustran métodos para realizar la invención y deben considerarse ilustrativos pero no limitantes del alcance de la invención que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de Oligonucleótidos

Se sintetizaron oligonucleótidos en el sintetizador de ADN Applied Biosystems Inc. modelo 380A o modelo 390 usando columnas de 0,2 \muM y la química de fosforamiditas FOD y de cianoetilo convencional; la síntesis se realizó en el modo sin tritilo. Después de la síntesis en el sintetizador de Modelo 380A, cada oligonucleótido se escindió de la columna, se desprotegió a 50ºC durante 1 h y se secó por evaporación a 50ºC. Los oligonucleótidos se resuspendieron en 300 \mul de tampón TE (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y la concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm.

Los oligonucleótidos se purificaron por electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 12% (PAGE). Se preparó una solución madre de gel PAGE de 300 ml disolviendo 126 g de urea en 30 ml de tampón Tris Borato EDTA 10x (TBE; 1x TBE es Tris-Borato 0,9 M, EDTA 2 mM) y 90 ml de solución madre de acrilamida al 40% y ajustando el volumen de la solución a 300 ml con H_{2}O. La solución de gel se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. Para verter un gel en 5 pocillos usando un aparato de gel Hoeffer Sturdier se usaron 40 ml de la solución madre de PAGE. La polimerización se inició por la adición de 350 \mul de persulfato amónico al 10% y 35 \mul de TEMED antes del vertido.

Cada oligonucleótido se preparó como se indica a continuación: se diluyeron de 300 a 500 \mug de oligonucleótido a 60 \mul con tampón TE, después se añadieron 60 \mul de tampón de carga de gel de formamida (10 ml de formamida, 10 mg de xileno cianol FF, 10 mg de azul de bromofenol, 200 \mul de EDTA 0,5 M pH 8,0) y la muestra se hirvió durante 5 minutos y se enfrió con hielo. Las muestras se cargaron en el gel usando una punta de pipeta de secuenciación. Se realizó electroforesis en TBE 1x a 300 voltios durante 3 h.

Después del ensayo, el gel de acrilamida se transfirió a SaranWrap^{TM}, colocado en un fondo blanco (por ejemplo, pantalla de intensificación de rayos X) y se expuso a luz UV de onda corta. La presencia de las bandas de ADN, así como la localización de los marcadores de xileno cianol y el colorante azul de bromofenol se visualizaron como una sombra sobre el fondo blanco.

Las bandas de ADN del tamaño apropiado se escindieron del gel y el ADN se eluyó por difusión. Cada corte de gel se maceró con una varilla de vidrio y se incubó en 1,5 ml de tampón de elución de oligo (Tris HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM) con agitación constante en un tambor giratorio a 37ºC durante 16 horas. La suspensión de poliacrilamida se filtró a través de una jeringa de 3 cc que contenía un tapón de lana de vidrio y un filtro acoplado de 0,2 \mum. El oligonucleótido eluido se concentró por centrifugación durante 2 h a 3000 x g en una columna de centrifugación Centricon 10 (límite de peso molecular 10.000 D) a temperatura ambiente, y se lavó con 2 ml de tampón TE por centrifugación como se ha indicado anteriormente en el mismo tubo. El oligonucleótido purificado se recuperó en un volumen final de 30 a 40 \mul. La concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm.

Como ejemplo del resultado de la síntesis de oligonucleótidos, en la Figura 2 se muestra la purificación en gel de los oligonucleótidos Bt6-Bt10. La Figura 2 también muestra dos síntesis satisfactorias con el sintetizador 380A (Bt9 y Bt10) y dos síntesis satisfactorias con el sintetizador 390 (Bt6 y Bt7).

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Ejemplo 2 Amplificación por PCR

Todas las amplificaciones por PCR se realizaron en reacciones de 100 \mul que contenían Tris HCl 20 mM pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 25 mM, 200 \muM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, y 5 unidades de Taq Polimerasa (Perkin Elmer Cetus). Las concentraciones de plantilla y de cebador de PCR se variaron dependiendo de la etapa del protocolo. En la primera etapa de la PCR, se generó una plantilla para cada fragmento para amplificación con 0,5 \muM de cada uno de los cebadores de la primera serie (véase la Figura 1) en el siguiente régimen: 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, 2 minutos de hibridación a 55ºC y 3 minutos de extensión a 72ºC durante 30 ciclos, seguido por un periodo de extensión adicional de 7 minutos a 72ºC. Los productos de reacción se cargaron en un gel de poliacrilamida nativo al 5% y se sometieron a electroforesis a 40 voltios durante 2,5 horas en TBE 1x. Como patrón de tamaños se usó una escala de BRL de 123 pb procesada en una calle paralela. Después de la electroforesis el gel se tiñó durante 1 h en agua que contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Los fragmentos de tamaño esperado se cortaron del gel y se purificaron a partir del corte del gel como se ha descrito para la purificación de oligonucleótidos (véase anteriormente), con la excepción de que después de la filtración a través de lana de vidrio y un filtro de 0,2 \mum, el ADN se concentró por precipitación con 2,5 volúmenes de etanol, 20 \mug de glucógeno y un volumen de 0,05 de LiCl 8 M. El ADN se resuspendió en 40 \mul de tampón TE. La segunda etapa de la PCR en la síntesis de cada fragmento se realizó en la misma mezcla de reacción que la primera etapa con la excepción de que se usaron 5 \mul del producto purificado en gel de la etapa 1 como plantilla y la concentración de oligonucleótido era de 0,2 \muM. La reacción de PCR entera se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y las bandas del tamaño esperado se escindieron y el ADN se purificó de los cortes de gel usando el Kit GeneClean (Bi0101) y se eluyeron en un volumen final de 50 \mul de TE. Todas las reacciones posteriores se realizaron como se ha descrito para la etapa 2.

Cada una de las etapas de PCR individuales proporcionó grandes cantidades de producto del tamaño esperado. Además, en la mayoría de los casos pudieron verse bandas del doble que el tamaño esperado así como otras bandas minoritarias. Todos los productos de ADN del tamaño apropiado se purificaron en gel y se procesaron en el gel mostrado en la Figura 3. Esta figura demuestra claramente la adición por etapas de la secuencia de ADN en etapas de PCR consecutivas. Las bandas de tamaño de dímeros en cada calle se consideraron artefactos de electroforesis, porque el ADN purificado en gel a partir de las bandas de tamaño monomérico cuando se volvieron a procesar en un gel también dieron esta banda de tamaño dimérico. El producto final para cada uno de los fragmentos génicos se digirió con las enzimas que reconocían los sitios de restricción construidos al final de cada fragmento (véase la Figura 1A) y se unieron al ADN de pBS cortado con las mismas enzimas. Los productos de ligamiento se utilizaron para transformar células E. coli DH5\alpha competentes y se identificaron los aislados que llevaban plásmidos pBS que contenían los fragmentos apropiados. Se determinó la secuencia de ADN de la parte del gen de ICP de estos plásmidos y se encontraron cinco diferencias de nucleótidos de la secuencia de Mze HD73 #6 trnc+. Estos cambios fueron: 1) un cambio de base conservativo (de G a T) en el fragmento 5' en nt 639. (La "A" del codón de iniciación ATG se denomina base Nº 1); 2) un cambio de base conservativo (de A a G) en el fragmento central en nt 1038. 3) una deleción de dos nucleótidos de G en el fragmento central en nt 657-658 que produciría un desplazamiento de fase en el polipéptido codificado; 4) un cambio de base (de T a C) en el fragmento central en nt 877 que produciría un cambio de serina a prolina; y 5) una deleción de un nucleótido C en el fragmento 3' en nt 1401, que también produciría un cambio de fase. Los tres últimos errores, que habrían dado como resultado un cambio de fase extensivo y cambios de aminoácidos, se corrigieron por mutagénesis de PCR como se describe en el Ejemplo 3 (véase más adelante). Después de la corrección de la PCR, los fragmentos central y 3' se digirieron y clonaron en pBS y los insertos de los plásmidos resultantes se secuenciaron para verificar que durante el proceso de corrección no se introdujeron otros cambios. Aparte de los cambios de bases conservativos ya existentes en los fragmentos 5' y central (que no se corrigieron) las secuencias eran idénticas a la ICP diseñada (Mze HD73 #6 trnc+) de la SEC ID Nº 1.

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Ejemplo 3 Corrección de Fragmentos del Gen de ICP

Todas las manipulaciones de ADN y las transformaciones de E. coli se realizaron de acuerdo con procedimientos convencionales (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989) 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987) John Wiley and Sons, New York, NY). Después de la clonación de los tres fragmentos del gen de ICP individuales en pBluescript, se determinó la secuencia usando el Kit Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) usando cebadores de secuenciación basados en la secuencia de ICP modificada o usando algunos de los cebadores de síntesis de PCR descritos anteriormente.

Los errores en los fragmentos de los genes de ICP se corrigieron por mutagénesis de PCR. Para cada corrección se prepararon dos reacciones de PCR. Una reacción de PCR amplificó la mitad 5' del fragmento, usando un oligonucleótido de extremo 5' y el oligonucleótido corrector de errores. La otra reacción de PCR amplificó la mitad 3' del fragmento usando el oligonucleótido de corrección de errores complementario y un oligonucleótido de extremo 3'. Los fragmentos corregidos 5' y 3' se purificaron en gel y se unieron entre sí en una segunda reacción de PCR por etapas por amplificación únicamente con el oligonucleótido del extremo 5' y el oligonucleótido del 3' como cebadores. Los oligonucleótidos usados en la corrección de errores se sintetizaron y se purificaron en gel como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de reacción de PCR fueron como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que la hibridación se realizó a 50ºC y se usaron 25 ciclos. Los fragmentos se purificaron en gel usando el Kit GeneClean disponible en Bi0101.

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Ejemplo 4 Expresión en E. coli

Para la expresión en E. coli, la ICP se insertó como un fragmento de ADN Nco I BamH I de 1862 pares de bases en los sitios Nco I y BamH I del vector de expresión citoplásmico pET-9d (Novagen, Madison, WI.). Con un microgramo de plásmido se transformaron 0,2 ml de células competentes de la cepa de E. coli BL21 (que estaba disponible para la adquisición de Novagen, Madison, WI.) y se cultivaron en placas LB que contenían kanamicina a 25 \mug/ml (para el plásmido pET-9d). Después de la incubación durante una noche a 37ºC, las colonias se rasparon de la placa y se resuspendieron en 10 ml de Caldo LB que contenía el antibiótico apropiado e isopropil-\beta-D-tiogalactosido (IPTG) a 1 mM. Se dejó que las células expresaran la proteína durante 3 h durante agitación vigorosa a 37ºC y después se recogieron por centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos a 4ºC.

Para la expresión de las construcciones pET-9d, se prepararon fracciones de proteína soluble y agregada como se indica a continuación. Se congeló sedimento celular y se descongeló dos veces, para ayudar en la lisis celular y el lisado se resuspendió en 1 ml de tampón de lisis (Tris HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, Triton X100 al 0,1%, 100 g/ml de DNasa1, 100 \mug/ml RNasaH, 1 mg/ml de lisozima) y se incubó a 37ºC hasta que ya no era viscosa. La proteína soluble se separó de las proteínas desnaturalizadas agregadas por centrifugación a 4ºC durante 10 minutos. El sedimento insoluble se resuspendió en aproximadamente 300 \mul del tampón de lisis anterior. Las dos fracciones tenían un volumen final de 0,5 ml.

En la fracción de sedimento de los dos extractos producidos a partir de células E. coli que contenían el vector de expresión citoplásmico estaba presente una proteína abundante con un peso molecular de 69 kD. Esta proteína presentó reacción cruzada con antisuero inducido contra delta-endotoxina nativa purificada a partir de cultivos de Cry1A(c) de B. thuringiensis; los resultados de una inmunotransferencia en gel de proteína representativa se muestran en la Figura 4. Tanto E. coli (calle 1) como la fracción de sedimento preparada a partir del extracto de las células que contenían el vector de expresión citoplásmico (calles 2 y 3) contenían proteína que presentaba reacción cruzada. No se vio ninguna otra proteína con reacción cruzada en cantidades equivalentes de proteínas de sedimento de extracto preparado a partir de células que contenían el vector de expresión citoplásmico (calle 4).

El tamaño de la proteína con reactividad cruzada anti-ICP producida en E. coli corresponde estrechamente al tamaño de 68 kD previsto por la secuencia del gen de ICP. La ICP nativa es ligeramente menor (Pm 66 kD) que el producto del gen de ICP modificado (calles 5, 6 y 7). En B. thuringiensis, la toxina se produce como una protoxina de 130 kD. Después de la ingestión por insectos lepidópteros, la protoxina se solubiliza y activa por escisión proteolítica. Esta proteolisis produce un resto de toxina activa de 60-70 kD, dependiendo de la cepa de B. thuringiensis. En todas las ICP Cry1, se produce el procesamiento proteolítico en el centro de la protoxina, y separa el resto de toxina del dominio C-terminal. También se produce procesamiento en el extremo N-terminal entre los aminoácidos Arg 28 y Ile 29 y probablemente se realiza por una proteasa de tipo serina. La secuenciación de la proteína amino-terminal de la protoxina activada por tripsina de Cry1A(b) y Cry1C identificó isoleucina en la posición 29 como extremo N (Hofte et al., Microbiological Rev., 53 (1989) 242). Como la secuencia del gen Mze HD73 #6 trnc+ incluye este supuesto sitio de proteasa de serina, la escisión en este sitio por la actividad proteasa de serina en el extracto de E. coli eliminaría los 28 aminoácidos N-terminales. El resultado sería un producto que es \approx3 kD más pequeño que el producto génico previsto a partir de la secuencia del gen. Una proteína de este tamaño se observa como una banda débil (a \approx66 kD) que migra conjuntamente con la toxina ICP nativa. La proteína extraída no se cuantificó porque la propia proteína es insoluble y forma agregados con el desecho celular.

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Ejemplo 5 Concentraciones de Proteínas Expresadas por E. coli

Las concentraciones de proteínas se determinaron usando el ensayo de proteína BioRad. Las proteínas se analizaron en geles de dodecil sulfato sodico-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12,5% obtenidos en un dispositivo de minigel Hoeffer Mighty Small o en un dispositivo de minigel Daiichi de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. La tinción para la proteína se realizó como se describe (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), la ICP se detectó específicamente por análisis de transferencia en gel de la proteína (transferencia de Western) con antisuero de conejo inducido contra la toxina HD73 de B. thuringiensis purificada, usando el sistema de transferencia de Western y de detección ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). Las proteínas se transfirieron desde el gel a una membrana de nitrocelulosa Hybond-ECL (Amersham) por transferencia usando un secante Hoeffer SemiDry a 0,5 mA/cm^{2} de gel durante 90 min. La membrana se incubó con el reactivo de bloqueo TBS-Tween-Milk (TBTM: Tris HCl 25 mM pH 7,4, NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, Tween 20 al 0,1%, leche desnatada en polvo al 5%) a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, la membrana se incubó con antisuero primario a una dilución de 1:500 en reactivo de bloqueo, seguido de lavado tres veces en 100 ml de TBS-Tween (sin leche) a temperatura ambiente durante 10 minutos. La membrana se incubó durante 1 h en reactivo de bloqueo que contenía antisuero secundario (IgG de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), y después se lavó tres veces en 100 ml de TBS-Tween a temperatura ambiente durante 10 minutos. El filtro se incubó en 10 ml de reactivo A+B (1:1; kit ECL) durante 1 minuto, el exceso de líquido se drenó y la membrana se expuso a una película Hyperfilm-ECL durante 10 s a 1 minuto. La película ECL se procesó usando un revelador y fijador convencionales. Las señales de ICP se exploraron con un video densitómetro Modelo 620 (Bio-Rad) y la concentración se determinó por comparación con exploraciones de patrones de ICP sometidos a electroforesis en el mismo gel usando el software 1-D Analyst (Bio-Rad). La Figura 4 ilustra la expresión de ICP en E. coli y la concentración de estas expresiones.

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Ejemplo 6 Ensayos de Alimentación

Se usó ICP expresada en E. coli y extraída como se indica en el Ejemplo 4 se usó para ensayos de alimentación en Manduca sexta (gusano cornudo del tabaco). Las larvas recién nacidas se dejaron alimentar en dietas artificiales en las que se incorporaron muestras de ICP o de control. Después de 4 días, se determinaron sus pesos y la mortalidad.

Los resultados del ensayo de los extractos de E. coli en ensayos de alimentación de M. sexta (Figura 5) indicaron que la ICP codificada por Mze HD73 #6 trnc+ tiene toxicidad para lepidópteros. Tanto la fracción de sedimento de los extractos de E. coli como las células que expresaban la ICP produjeron una inhibición significativa del crecimiento y mortalidad. Sin embargo, los extractos de E. coli que contenían ICP y las células eran menos tóxicas para las larvas de Manduca que la ICP nativa purificada. Esto puede explicarse por el hecho de que la ICP producida en E. coli era muy insoluble. Es posible que, debido a la agregación, la concentración de ICP eficaz sea mucho menor que lo que indicaría la concentración de proteínas.

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Ejemplo 7 Construcción de Plásmidos de Expresión en Plantas A. Construcción de un promotor 35S de CaMV doblemente potenciado

Esta sección describe manipulaciones moleculares que darían como resultado una duplicación del elemento potenciador de la expresión de un promotor de planta. Esta duplicación, según se ha demostrado (Kay et al., Science 236 (1987) 1299) produce una mayor expresión en plantas de tabaco de genes marcadores cuya expresión se controla por dicho promotor modificado. [Nota: Las secuencias a las que se hace referencia en este análisis proceden de la cepa Cabb S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV). Están disponibles como la secuencia MCASTRAS del GenBank y publicada por Franck et al. (Cell 21 (1980) 285). Todas las secuencias de ADN se proporcionan en la dirección convencional 5' a 3'. El material de partida es el plásmido pUC13/35S(-343) como se describe por Odell et al. (Nature 313 (1985) 810). Este plásmido comprende, empezando en el extremo 3' del sitio Sma I de pUC13 (Messing, Methods in Enzymology 101 (1983) 20) y leyendo en la cadena contigua a la cadena no codificante del gel lacZ de pUC13, los nucleótidos 6495 a 6972 de CaMV, seguido de la secuencia enlazadora CATCGATG (que codifica un sitio de reconocimiento Cla I), seguido de los nucleótidos 7089 a 7443 de CaMV, seguido de la secuencia enlazadora CAAGCTTG, comprendiendo esta última secuencia la secuencia de reconocimiento para Hind III, que después se continúa por el resto del ADN plasmídico de pUC13.

1. El ADN de pUC13/35S(-343) se digirió con Cla I y Nco I, el fragmento grande de 3429 pares de bases (pb) se separó del fragmento pequeño de 66 pb por electroforesis en gel de agarosa y después se purificó por métodos convencionales.

2. El ADN de pUC13/35S(-343) se digirió con Cla I y los extremos salientes se hicieron romos por tratamiento con la ADN polimerasa de T4. El ADN de extremos romos después se unió a enlazadores de oligonucleótidos sintéticos que tenían la secuencia CCCATGGG, que incluye un sitio de reconocimiento de Nco I. La reacción de ligamiento se usó para transformar células Escherichia coli competentes y se identificó un transformante que contenía un plásmido (denominado pOO#1) que tenía un sitio Nco I colocado en el primer sitio Cla I. El ADN de pOO#1 se digirió con Nco I y los extremos compatibles del fragmento grande se religaron, dando como resultado la deleción de 70 pb de pOO#1, para generar el plásmido intermedio pOO#1 Nco \Delta.

3. El ADN de pOO#1 Nco \Delta se digirió con EcoR V, y los extremos romos se ligaron a enlazadores Cla I que tenían la secuencia CATCGATG. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que tenía un nuevo sitio Cla I en la posición del sitio EcoR V previo y el plásmido se denominó pOO#1 Nco \Delta RV>Cla.

4. El ADN de pOO#1 Nco \Delta RV>Cla se digirió con Cla I y Nco I y el fragmento pequeño (268 pb) se purificó en un gel de agarosa. Este fragmento después se ligó al fragmento Cla I/Nco I de 3429 pb de pUC13/35S(-343) preparado anteriormente en la etapa 1 y se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que tenía fragmentos Cla I/Nco I de 3429 y 268 pb. Este plásmido se denominó pUC13/35S En.

5. El ADN de pUC13/35S En se digirió con Nco I y los extremos salientes se hicieron romos por tratamiento con la ADN polimerasa de T4. El ADN tratado después se cortó con Sma I y se unió a enlazadores Bgl II que tenían la secuencia CAGATCTG. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido en el que el fragmento Sma I/Nco I de 416 pb se había reemplazado por al menos dos copias de los enlazadores de Bgl II, y se denominó p35S En^{2}. [Nota: La aleatorización de estos enlazadores Bgl II genera además de sitios de reconocimiento Bgl II, sitios de reconocimiento Pst I, CTGCAG].

La estructura de ADN de p35s En^{2} es la siguiente: Empezando con el nucleótido que sigue al tercer resto C del sitio Sma I en la cadena contigua a la cadena no codificante del gen lacZ de pUC13; la secuencia enlazadora CAGATCTGCAGATCTGCATGGGCGATG (SEC ID Nº 48), seguida de los nucleótidos 7090 a 7344 de CaMV, seguido de la secuencia enlazadora Cla I CATCGATG, seguido de los nucleótidos 7089 a 7443 de CaMV, seguido de la secuencia enlazadora Hind III CAAGCTT, seguido del resto de la secuencia de pUC13. Esta estructura tiene la característica de que las secuencias potenciadoras del promotor 35S de CaMV, que están en la región cadena arriba del sitio EcoR V en el genoma viral (nts 7090 a 7344), se han duplicado. Esta construcción de promotor incorpora el sitio de inicio de la transcripción de 35S nativo que está 11 nucleótidos cadena arriba del primer resto A del sitio
Hind III.

Ejemplo 7B

Plásmidos que utilizan el promotor de 35S y las secuencias Poli A de NOS de Agrobacterium : El material de partida para la primera construcción es el plásmido pBI221, adquirido en CLONTECH (Palo Alto, CA). Este plásmido contiene una copia ligeramente modificada del promotor 35S de CaMV, como se describe en Bevan et al. (1985), Baulcombe et al., (1986), Jefferson et al., (1986, 1987) y Jefferson (1987). Empezando en el extremo 3' del sitio Pst I de pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) y leyendo la misma cadena que la que codifica el gen lacZ de pUC19, la secuencia comprende los nucleótidos del enlazador GTCCCC, seguido de los nucleótidos 6605 a 7439 de CaMV (como se describe en el Ejemplo 7A), seguido de la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAGGATCCCCGGGTGGTCAGTCCCTT (SEC ID Nº 49), donde las bases subrayadas representan la secuencia de reconocimiento BamH I. Estas bases después se continúan por 1809 pb que comprenden la secuencia codificante del gen uidA de E. coli, que codifica la proteína \beta-glucuronidasa (GUS) y 55 pb de las bases flanqueantes 3' que proceden del genoma de E. coli (Jefferson, 1986), seguido de la secuencia enlazadora Sac I GAGCTC, que después se continúa por la secuencia enlazadora GAATTTCCCC (SEC ID Nº 50). Estas bases se continúan por las secuencias señal de terminación de la transcripción de ARN/poliadenilación derivadas del gen de la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, y comprenden el fragmento Sau3A I de 256 pb que corresponde a los nucleótidos 1298 a 1554 de DePicker et al. (1982), seguido de dos restos C, la secuencia de reconocimiento Eco RI GAATTC y el resto de pUC19.

1. Se digirió ADN de pBI221 con EcoR I y BamH I y el fragmento de 3507 pb se purificó en un gel de agarosa. El ADN de pRAJ275 (CLONTECH, Jefferson, 1987) se digirió con EcoR I y Sal I y el fragmento de 1862 pb se purificó en un gel de agarosa. Estos dos fragmentos se mezclaron entre sí y se añadieron oligonucleótidos sintéticos complementarios que tenían la secuencia GATCCGGATCCG (SEC ID Nº 51) y TCGACGGATCCG (SEC ID Nº 52). [Estos oligonucleótidos, cuando hibridaron, tenían extremos monocatenarios salientes compatibles con los extremos salientes generados por BamH I y Sal I.] Los fragmentos se unieron entre sí y se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que tenía la estructura de ADN apropiada por análisis de enzimas de restricción. El ADN de este plásmido, denominado pKA881, se digirió con Bal I y Eco RI y el fragmento de 4148 pb se aisló en un gel de agarosa. El ADN de pBI221 se digirió de forma similar y el fragmento Eco RI/Bal I de 1517 pb se purificó en gel y se ligó al fragmento pKA881 anterior para generar el plásmido pKA882.

2. El ADN de pKA882 se digirió con Sac I, los extremos salientes se hicieron romos por tratamiento con la ADN polimerasa de T4 y el fragmento se ligó a enlazadores BamH I sintéticos que tenían la secuencia CGGATCCG. Se identificó un transformante E. coli que llevaba un plásmido que tenía fragmentos BamH I de 3784 y 1885 pm y se denominó pKA882B.

3. El ADN de pKA882B se digirió con BamH I y la mezcla de fragmentos se ligó. Se identificó un transformante E. coli que llevaba un plásmido que generaba un sólo fragmento de 3783 pb después de la digestión con BamH I y se denominó p35S/NOS. Este plásmido tiene la estructura de ADN esencial de pBI221, con la excepción de que las secuencias codificantes del gen GUS se han delecionado. Por lo tanto, los nucleótidos 6605 a 7439 de CaMV se continúan por la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAGGATCCCGAATTTCCCC (SEC ID Nº 53), donde las bases individuales subrayadas representan un sitio Xba I y las bases dobles subrayadas representan un sitio BamH I. La secuencia enlazadora después se continúa por las secuencias de poliadenilación de NOS y el resto de pBI221.

4. Se digirió ADN de p35S/NOS con EcoR V y Pst I, y el fragmento de 3037 pb se purificó y ligó con el fragmento de 534 pb obtenido de la digestión del ADN de p35S En^{2} con EcoR V y Pst I. Se identificó un transformante E. coli que llevaba un plásmido que generaba fragmentos de 3031 y 534 pb tras la digestión con EcoR V y Pst I, y el plásmido se denominó p35S En^{2}/NOS. Este plásmido contiene la región potenciadora del promotor de 35S duplicada descrita para p35S En^{2} en el Ejemplo 7A Etapa 5, estando separadas las secuencias promotoras de las secuencias de poliadenilación de NOS por secuencias enlazadoras que incluyen sitios únicos Xba I y BamH I.

Ejemplo 7C

Construcción de un líder sintético no traducido

Este ejemplo describe las manipulaciones moleculares usadas para construir un fragmento de ADN que incluye secuencias que comprenden la porción líder 5' no traducida del transcrito directo principal del genoma del Virus del Estriado del Maíz (MSV). La secuencia genómica de MSV se publicó por Mullineaux et al., (1984) y Howell (1984), y el transcrito se describió por Fenoll et al. (1988). La secuencia entera, que comprende 154 pb, se construyó en tres etapas (A, B y C) ensamblando bloques de oligonucleótidos sintéticos.

1. El Bloque A: Se sintetizaron oligonucleótidos complementarios que tenían la secuencia

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y se purificaron por procedimientos convencionales. La hibridación de estos nucleótidos en estructuras bicatenarias deja extremos salientes monocatenarios de 4 bases [denominados en lo sucesivo "extremos cohesivos"] que son compatibles con los generados por BamH I en un extremo de la molécula (GATC) y con los extremos monocatenarios generados por Hind III en el otro extremo de la molécula (AGCT). Estas moléculas hibridadas se ligaron al plásmido pBluescript SK(-) [denominado en lo sucesivo pBSK; Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA], que se había digerido con BamH I y Hind III. La secuencia de estos oligonucleótidos es tal que, cuando se liga en los extremos cohesivos BamH I y Hind III respectivos, se mantienen las secuencias de los sitios de reconocimiento respectivos. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que contenía la secuencia oligonucleotídica por análisis de enzimas de restricción y el plásmido se denominó pMSV A.

2. El Bloque B: Se sintetizaron oligonucleótidos complementarios que tenían las secuencias

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y se purificaron por procedimientos convencionales. Las bases subrayadas representan la secuencia de reconocimiento para enzimas de restricción Sma I y Xma I. La hibridación de estos nucleótidos en estructuras bicatenarias deja extremos cohesivos de 4 bases que son compatibles con los generados por Hind III en un extremo de la molécula (AGCT) y con los extremos cohesivos generados por Sal I en el otro extremo de la molécula (TCGA). La secuencia de estos oligonucleótidos es tal que, cuando se ligan en extremos cohesivos Hind III, se destruye la secuencia de reconocimiento para Hind III.

El ADN de pMSV A se digirió con Hind III y Sal I y se ligó con los oligonucleótidos hibridados anteriores. Se identificó un transformante E. coli que llevaba un plásmido que contenía los nuevos oligonucleótidos por mapeo de sitios de enzimas de restricción y se denominó pMSV AB.

3. El Bloque C: Se sintetizaron oligonucleótidos complementarios que tenían las secuencias

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y se purificaron por procedimientos convencionales. Los oligonucleótidos incorporan bases que comprenden sitios de reconocimiento (subrayados) para Nco I (CCATGG), EcoR V (GATATC), Hind III (AAGCTT) y BamH I (GGATCC). La hibridación de estos nucleótidos en estructuras bicatenarias deja extremos cohesivos de 4 bases que son compatibles con los generados por Xma I en un extremo de la molécula (CCGG) y con extremos cohesivos generados por Xho I en el otro extremo de la molécula (TCGA). Estas moléculas hibridadas se ligaron al ADN de pMSV AB que se había digerido con Xma I y Xho I. Se identificó un transformante E .coli que llevaba un plásmido que contenía la secuencia oligonucleotídica por análisis de enzimas de restricción y la estructura del ADN se verificó por análisis de la secuencia. El plásmido se denominó pMSV CPL; contiene los bloques A, B y C de nucleótidos en orden secuencial ABC. Conjuntamente, éstos constituyen la secuencia líder no traducida 5' ("L") del gen de la proteína de la cubierta ("CP") de MSV. Éstos corresponden a los nucleótidos 167 a 186 y 188 a 317 de la secuencia de MSV de Mullineaux et al., (1984) y están flanqueados en el extremo 5' de la secuencia enlazadora BamH I GGATCCAG y en el extremo 3' por la secuencia enlazadora GATATCAAGCTTGGATCCC (SEC ID Nº 60). [Nota: Sin querer se delecionó un resto A correspondiente a la base 187 de la secuencia de MSV de tipo silvestre durante la clonación].

4. Inserción de Sitio Bgl II: Se digirió ADN de pMSV CPL en el sitio Sma I correspondiente a la base 277 de la secuencia genómica de MSV y el ADN se ligó a enlazadores Bgl II que tenían la secuencia CAGATCTG. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que tenía un sólo sitio Bgl II en la posición del primer sitio Sma I y se verificó por análisis de la secuencia de ADN, y el plásmido se denominó pCPL-Bgl.

Ejemplo 7D

Construcción de una versión delecionada del intrón 1 de la alcohol deshidrogenasa 1 (Adh1) de maíz

El material de partida es el plásmido pVW119, que se obtuvo en V. Walbot, Stanford University, Stanford, CA. Este plásmido contiene la secuencia de ADN del gen de Adh1.S de maíz, incluyendo el intrón 1, desde el nucleótido 119 al 672 [numeración de Dennis et al. (1984)] y se describió en Callis et al. (1987). En pVW119, la secuencia que sigue a la base 672 de Dennis et al. (1984) es GACGGATCC, donde las bases subrayadas representan un sitio de reconocimiento BamH I. La secuencia entera del intrón 1, con 14 bases del exón 1 y 9 bases del exón 2, puede obtenerse a partir de este plásmido en un fragmento de 556 pb después de la digestión con Bcl I y BamH I.

1. Se digirió ADN del plásmido pSG3525a(Pst) con BamH I y Bcl I y el fragmento de 3430 pb se purificó en un gel de agarosa. [Nota: La estructura del plásmido pSG3525a(Pst) no es directamente relevante para el resultado final de esta serie de construcción. Se construyó durante una serie no relacionada y se eligió porque contenía sitios de reconocimiento de restricción para Bcl I y BamH I, y carece de sitios Hind III y Stu I. Los especialistas en la técnica observarán que en esta etapa pueden utilizarse otros plásmidos con resultados equivalentes]. El ADN del plásmido pVW119 se digirió con BamH I y Bcl I y el fragmento de 546 pb purificado en gel se ligó al fragmento de 3430 pb. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que generó fragmento de 3430 y 546 tras la digestión con BamH I y Bcl I. Este plásmido se denominó pSG AdhA1.

2. Se digirió ADN de pSG AdhA1 con Hind III, [que corta entre las bases 209 y 210 de la secuencia de Dennis et al., (1984), cadena de abajo], y con Stu I, que corta entre las bases 554 y 555. Los extremos se hicieron romos por tratamiento con la ADN polimerasa de T4 y después se unieron. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que carecía de sitios Hind III y Stu I y la estructura del ADN se verificó por análisis de la secuencia. El plásmido se denominó pSG AdhA1 \Delta. En esta construcción, se han delecionado 344 pb de ADN del interior del intrón 1. La pérdida de tres bases no afecta al corte y empalme de este intrón. Las secuencias de intrones funcionales se obtienen en un fragmento de 213 pb después de la digestión con Bcl I y BamH I.

3. Se digirió ADN del plásmido pCPL-Bgl (Ejemplo 7C Etapa 4), con Bgl II y el ADN linealizado se ligó con el fragmento Bcl I/BamH I de 213 pb que contenía la versión delecionada de las secuencias del intrón de Adh1.S de pSG AdhA1 \Delta. [Nota: Los extremos cohesivos generados por digestión de ADN con Bgl II, Bcl I y BamH I son compatibles, pero el ligamiento de los extremos cohesivos BamH I o Bcl I en los generados por Bgl II crea una secuencia no escindida por ninguna de estas tres enzimas.] Se identificó un transformante de E. coli por mapeo de sitios de enzimas de restricción que llevaba un plásmido que contenía la secuencia del intrón ligada al sitio Bgl II, en una orientación tal que la unión Bgl II/Bcl I estaba próxima al extremo 5' de la secuencia líder de CPL de MSV, y la unión Bgl II/ BamH I estaba próxima al extremo 3' de CPL. Esta orientación se confirmó por análisis de la secuencia de ADN. El plásmido se denominó pCPL A1I1 \Delta. Las secuencias líder de MSV/intrón pueden obtenerse a partir de este plásmido por digestión con BamH I y Nco I y purificación del fragmento de 373 pb.

Ejemplo 7E

Construcción de vectores de expresión en plantas basados en el promotor 35S potenciado, el CPL de MSV y la versión de delecionada del intrón 1 de Adh1

1. Se digirió ADN del plásmido p35S En^{2}/NOS con BamH I y el fragmento lineal de 3562 pb se ligó a un fragmento de 171 pb preparado a partir de ADN de pMSV CPL digerido con BamH I. Este fragmento contiene la secuencia entera de CPL de MSV descrita en el Ejemplo 7C. Se identificó un transformante de E. coli por mapeo de sitios de enzimas de restricción, que llevaba un plásmido que contenía estas secuencias en una orientación tal que el sitio Nco I se colocó cerca de las secuencias Poli A de NOS. Este plásmido se denominó p35S En^{2} CPL/NOS. Contiene la versión potenciada del promotor 35S directamente contiguo a las secuencias líder de MSV, de tal forma que el transcrito obtenido incluirá las secuencias de MSV en su parte 5' no traducida.

2. El ADN del plásmido pKA882 (véase el Ejemplo 7B Etapa 1) se digirió con Hind III y Nco I y el fragmento grande de 4778 pb se ligó a un fragmento Hind III/Nco I de 802 pb que contenía las secuencias del promotor 35S potenciado y secuencias líder de MSV de p35S En^{2} CPL/NOS. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que contenía fragmentos de 4778 y 802 pb después de la digestión con Hind III y Nco I y se denominó pDAB310. En este plásmido, la versión potenciada del promotor 35S se usa para controlar la expresión del gen GUS. La porción líder 5' no traducida del transcrito contiene la secuencia líder del gen de la proteína de la cubierta de MSV.

3. Se digirió el ADN del plásmido pDAB310 con Nco I y Sac I. El fragmento grande de 3717 pb se purificó en un gel de agarosa y se ligó con oligonucleótidos sintéticos complementarios que tenían las secuencias CGGTACCTC
GAGTTAAC (SEC ID Nº 61) y CATGGTTAACTCGAGGTACCGAGCT (SEC ID Nº 62). Estos oligonucleótidos, cuando se hibridaron en estructuras bicatenarias, generaron moléculas que tenían extremos cohesivos compatibles con los que dejó Sac I, en un extremo de la molécula, y con Nco I en el otro extremo de la molécula. Además de restaurar la secuencias de los sitios de reconocimiento para estas dos enzimas, se forman nuevos sitios para las enzimas Kpn I (GGTACC), Xho I (CTCGAG) y Hpa I (GTTAAC). Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que contenía sitios para estas enzimas, y la estructura de ADN se verificó por análisis de la secuencia. Este plásmido se denominó pDAB1148.

4. Se digirió ADN del plásmido pDAH1148 con Bam HI y Nco I, se purificó el fragmento grande de 3577 pb en un gel de agarosa y se ligó a un fragmento de 373 pb purificado a partir de pCPL A1I1\Delta (Ejemplo 7D Etapa 3) después de la digestión con Bam HI y Nco I. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido con BamH I y Nco I y el plásmido se denominó pDAB303. Este plásmido tiene la siguiente estructura de ADN: empezando con la base después del resto G final del sitio Pst I de pUC19 (base 435), y leyendo en la cadena contigua a la cadena codificante del gen lacZ, la secuencia enlazadora ATCTGCATGGGTG (SEC ID Nº 63), nucleótidos 7093 a 7344 del ADN de CaMV, la secuencia enlazadora CATCGATG, nucleótidos 7093 a 7439 de CaMV, la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAGGATCCAG (SEC ID Nº 64), nucleótidos 167 a 186 de MSV, nucleótidos 188 a 277 de MSV, un resto C seguido de los nucleótidos 119 a 209 de Adh1.S, nucleótidos 555 a 672 de Adh1.S de maíz, la secuencia enlazadora GACGGATCTG, nucleótidos 278 a 317 de MSV, la secuencia polienlazadora GTTAACTCGAGGTACC
GAGCTCGAATTTCCCC (SEC ID Nº 65) que contiene sitios de reconocimiento para Hpa I, Xho I, Kpn I y Sac I, nucleótidos 1298 a 1554 de NOS y un resto G seguido por el resto de la secuencia de pUC19 (incluyendo el sitio EcoR I). Debe tenerse en cuenta que la unión entre el nucleótido 317 de MSV y la secuencia polienlazadora larga crea un sitio de reconocimiento Nco I.

5. Se digirió ADN del plásmido pDAB303 con Nco I y Sac I y el fragmento de 3939 pb se ligó al fragmento de 1866 pb que contenía la región codificante de GUS preparada a partir de un ADN digerido de forma similar de pKA882. El plásmido apropiado se identificó por mapeo de sitios de enzimas de restricción y se denominó pDAB305. Este plásmido tiene el promotor potenciado, el líder de MSV y la ordenación del intrón de Adh1 de pDAB303, colocados para controlar la expresión del gen de GUS.

6. Se digirió ADN del plásmido pKA882 con Xba I y Nco I y el fragmento de 5687 pb se ligó a oligonucleótidos sintéticos hibridados que tenían la secuencia CTAGAGGATC (SEC ID Nº 66) y CATGGATCCT (SEC ID Nº 67). Estos oligonucleótidos, cuando hibridan, forman un estructura bicatenaria que tiene extremos cohesivos compatibles Xba I y Nco I. Se identificó un plásmido recombinante que carecía de un sitio Sal I por mapeo de enzimas de restricción, verificado por análisis de la secuencia de ADN, y se denominó pDAB349.

7. Se digirió ADN del plásmido p35S En^{2}/NOS con Xba I y EcoR I, y el fragmento grande (3287 pb) se ligó a un fragmento de 2152 pb que contenía la región codificante de GUS y la región de poliadenilación de NOS procedente de pDAB349 digerido de forma similar. Se identificó un plásmido que tenía la estructura apropiada por mapeo de sitios de restricción y se denominó pDAB313.

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8. Se digirió ADN del plásmido pDAB313 con Xba I y Sac I, y el fragmento grande de 3558 pb se ligó a un fragmento de 1889 pb preparado a partir de ADN cortado de forma similar de pKA882. Se identificó un plásmido que tenía la estructura apropiada por mapeo de sitios de restricción y se denominó pDAB348.

9. Se digirió ADN del plásmido pDAB348 con BamH I y el fragmento grande (5437 pb) se ligó a un fragmento Bcl I/BamH I de 213 pb que contenía la versión delecionada del intrón 1 de Adh1.S, procedente de pSG AdhA1\Delta (Ejemplo 7D Etapa 2). Se identificó un plásmido que tenía la estructura apropiada por mapeo de sitios de restricción y se denominó pDAB353.

Ejemplo 7F

El material de partida el es plásmido pIC35. Este plásmido contiene el fragmento Sma I/Hind III de 845 pb procedente de 355 de pUC13 (-343) (véase la Sección C de este ejemplo) ligado a los sitios Nru I y Hind III de pIC19R (Marsh et al., Gene, 32 (1984) 481), en tal orientación que se mantiene el sitio de reconocimiento Hind III. La fuente de las secuencias ORF25/26 de A. tumefaciens es el plásmido pIC1925. Este plásmido contiene el fragmento Hinc II de 713 pb compuesto por los nucleótidos 21728 a 22440 del ADN-T de pTI 15955 de A. tumefaciens (Barker et al., Plant Molec. Biol. 2 (1983) 335), ligado en el sitio Sma I de pIC19H (Marsh et al., Gene, 32 (1984) 481) en tal orientación que el sitio BamH I de pIC19H está adyacente al extremo de la ORF 25 del fragmento de
ADN-T.

1. pIC 19R35/A: Se digirió ADN del plásmido pIC35 con BamH I y se ligó al fragmento de 738 pb preparado por digestión de ADN de pIC1925 con BamH I y Bgl II. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido en el que estaba presente un sitio BamH I colocado entre el fragmento del promotor 35S y el fragmento ORF 25/26 Poli A. Este plásmido se denominó pIC 19R35/A. (Nota: El ligamiento de los extremos cohesivos compatibles generados por BamH I y Bgl II genera una secuencia que no es un sitio de reconocimiento para ninguna de las enzimas).

2. pIC35/A: Se digirió ADN de pIC 19R35/A con Sma I en su único sitio, y el ADN se ligó a enlazadores Bgl II que tenía la secuencia CAGATCTG. [Nota: La aleatorización de estos enlazadores Bgl II genera, además de sitios de reconocimiento Bgl II, también sitios de reconocimiento Pst I CTGCAG]. Se identificó un transformante de E. coli que tenía al menos dos copias de los enlazadores (y por lo tanto nuevos sitios Bgl II y Pst I) en la posición del primer sitio Sma I. Este plásmido se denominó pIC35/A.

3. pIC 20R\Delta: Se digirió ADN del plásmido pIC 20R (Marsh et al., Gene, 32 (1984) 481) con Nru I y Sma I y los extremos romos del fragmento grande se ligaron entre sí. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que carecía de los sitios Nru I, Sma I, Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Xba I y BamH I. Este plásmido se denominó pIC 20R\Delta.

4. pSG Bgl 3525 (Pst): Se digirió ADN de pIC 20R \Delta con Bgl II y se ligó al fragmento Bgl II de 1625 pb de pIC35/A. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que contenía las secuencias promotor 35S/ORF 25 poli A. El mapeo de sitios de enzimas de restricción reveló que estas secuencias estaban en tal orientación que los sitios Kpn I y Xho I únicos de pIC 20R\Delta están colocados en el extremo 3' de las secuencias de ORF 25 Poli A. Este plásmido se denominó pSG Bgl 3525 (Pst).

5. pSG 3525 a (Pst): Se digirió ADN de pSG Bgl 3525 (Pst) con Bgl II en condiciones en las que sólo se escindía uno de los dos sitios Bgl II de la molécula. Los fragmentos lineales de 4301 pb se ligaron a oligonucleótidos adaptadores sintéticos que tenían la secuencia GATCGTGA TCAC (SEC ID Nº 68), donde las bases subrayadas representan la secuencia de reconocimiento de Bcl I. Se identificó un transformante de E. coli que tenía un sitio Bcl I en la posición del primer sitio Bgl II colocado 5' con respecto al promotor 35S. Este plásmido se denominó pSG 3525 a (Pst).

6. pDAB 218: Se digirió ADN del plásmido pIJ4104 (véase el Ejemplo 8) con Sma I y el fragmento de 569 pb se purificó en un gel de agarosa. El ADN del plásmido pSG 3525 a (Pst) (véase anteriormente) se linealizó por digestión en el único sitio Hinc II que está entre el promotor 35S y las secuencias de la ORF 25 poli A y el fragmento lineal se ligó al fragmento génico bar de 569 pb. Se identificó un transformante de E. coli por mapeo de sitios de enzimas de restricción que llevaba un plásmido que contenía el gen bar en tal orientación que la digestión con Bgl II generó fragmentos de 4118 y 764 pb. Este plásmido se denominó pDAB 218.

7. pDAB 219: Se digirió ADN del plásmido pDAB 218 con Bcl I y el fragmento lineal de 4882 pb se ligó a un fragmento Bgl II de 3133 pb preparado a partir de ADN de pKA882-2xBg (véase la etapa 10 más adelante). Este último fragmento contiene la región codificante de GUS, bajo el control de la transcripción del promotor 35S, con las señales de terminación de la transcripción Nos Poli A. Se identificó un transformante de E. coli que contenía las regiones codificantes de GUS y PAT, y el mapeo de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción reveló que las dos regiones codificantes se codificaban por la misma cadena de ADN. Este plásmido se denominó pDAB 219.

8. El ADN del plásmido pDAB 219 se usó como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, (Saiki et al., Science, 239 (1988) 487)) usando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: i) CTCGAGATCTA
GATATCGATGAATTCCC (SEC ID Nº 69), y ii) TATGGATCCTGTGATAACCGACATATGCCCCGGTTTCGTTG (SEC ID Nº 70). El Cebador i) representa los nucleótidos 419 a 446 de pDAB 219 e incluye bases correspondientes a los sitios de reconocimiento de Xho I (CTCGAG), Bgl II (AGATCT), Xba I (TCTAGA), EcoR V (GATATC), Cla I (ATCGAT) y EcoR I (GAATTC). Las bases individuales subrayadas en el Cebador ii) representan las secuencias de reconocimiento de BamH I y las bases doblemente subrayadas representan los nucleótidos 1138 a 1159 de pDAB 219, y corresponden a los nucleótidos 21728 a 21749 del fragmento ORF 25 Poli A (véase anteriormente). La amplificación por PCR generó un producto de 760 pb.

9. pKA882-Bg: Se digirió ADN de pKA882 con Pst I y los fragmentos lineales se ligaron a adaptadores sintéticos que tenían la secuencia CAGATCT GTGCA (SEC ID Nº 71) (Nota: Cuando hibridan, estas moléculas forman moléculas bicatenarias que tienen extremos cohesivos compatibles con los generados por Pst I. El ligamiento de estas moléculas a ADN digerido con Pst I produce una secuencia que ya no se escinde por Pst I e introduce un nuevo sitio Bgl II). Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que no se escindía por Pst I y que tenía un único sitio Bgl II. El plásmido se denominó pKA882-Bg.

10. pKA882-2xBg: Se digirió ADN de pKA882-Bg con EcoR I y los fragmentos lineales se ligaron a adaptadores sintéticos que tenían la secuencia AATTGAGATCTC (SEC ID Nº 72). El ligamiento de estas moléculas hibridadas con ADN digerido con EcoR I produce una secuencia que ya no se escinde por EcoR I e introduce un nuevo sitio Bgl II. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que no se escindía por EcoR I y que generaba fragmentos Bgl II de 3027 y 2658 pb. Este plásmido se denominó pKA882-2xBg.

11. pDAB 305 Bg: Se digirió el plásmido pDAB305 completamente con EcoR I y el ADN linealizado se ligó a adaptadores oligonucleotídicos auto-complementarios tratados con quinasa que tenían la secuencia AATTGA
GATCTC (SEC ID Nº 73). El ligamiento de este adaptador a los extremos salientes generados por EcoR I recircularizó el ADN plasmídico, introdujo un nuevo sitio de reconocimiento Bgl II y destruyó el primer sitio de reconocimiento EcoR I. El plásmido resultante se denominó pDAB 305 Bg.

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Ejemplo 8 Construcción de vectores de transformación de plantas que contienen el gen bar de Streptomyces hygroscopicus

El material de partida es el plásmido pIJ4104 (White et al., Nucl. Acid Res. 18 (1990) 1062), que contiene la región codificante del gen bar de S. hygroscopicus y se obtuvo a partir de M.J. Bibb (John Innes Institute, Norwich, Reino Unido). El gen bar codifica la enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT).

pDAB 219\Delta: El ADN del plásmido pDAB 219 se digirió con Bgl II, el fragmento de 7252 pb se purificó en un gel de agarosa y se ligó al fragmento de 747 pb generado por digestión del producto de PCR del Ejemplo 7F Etapa 8 por Bgl II y BamH I. Se identificó un transformante de E. coli que llevaba un plásmido que contenía un único sitio Bgl II colocado en el extremo 3' del fragmento de la ORF 25 Poli A. La estructura de ADN del extremo 3' de la secuencia codificante de PAT se confirmó por análisis de la secuencia de ADN. Este plásmido se denominó pDAB 219\Delta.

La secuencia de ADN de pDAB 219\Delta es la siguiente: Empezando con la base que sigue al último resto A del sitio Xba I en la cadena codificante de lac Z de pIC20R (Marsh et al., Gene, 32 (1984) 481), el enlazador TCCT
GATCTGTGCAGGTCCCC (SEC ID Nº 74), seguido de los nucleótidos de CaMV 6605 a 7439, seguido de la secuencia enlazadora GGGGACTCTAGAGGATCCGGATCCGTCGACCATGGTC (SEC ID Nº 75), seguido del resto de la región codificante de GUS con 44 pb del ADN genómico de E. coli flanqueante 3' (nucleótidos 306 a 2152 de Jefferson et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., 83 (1986) 8447). Las bases subrayadas representan los codones para los dos primeros aminoácidos de la proteína GUS, de los que el segundo se cambió de leucina en el gen uid A de E. coli original (Jefferson et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., 83 (1986) 8447) a valina en pRAJ275 (Jefferson et al., Plant Molec. Biol, Reporter, 5 (1987) 387). Estas bases se continúan por la secuencia enlazadora GGGGAATTGGAGAGCTC
GAATTTCCCC (SEC ID Nº 76), y después por las bases 1298 a 1554 de la secuencia Nos Poli A (DePicker et al., J. Molec. Appl. Genet., 1 (1982) 5561). La secuencia enlazadora GGGAATTGAGATCAGGATCTCGAGCTCGGG (SEC ID Nº 77) se continúa por las bases 6495 a 6972 de CaMV, el enlazador CATCGATG y las bases de CaMV 7090 a 7443. Estas bases se continúan por el enlazador CAAGCTTGGCTGC AGGTC (SEC ID Nº 78), después por las bases correspondientes a los nucleótidos 20 a 579 del clon bar en pIJ4104 (White et al., Nucl. Acids Res. 18 (1990) 1062), el enlazador CTGTGATAACC (SEC ID Nº 79), los nucleótidos 21728 a 22440 de ORF 25/26 poli A (1), el enlazador GGGAATTCATCGATATCTAGATCTCGAGCTCGGGGTACCGAGCTCGAATTC (SEC ID Nº 80) y el resto de pIC20R. El sitio de reconocimiento Bgl II (subrayado) representa un único sitio en el que pueden introducirse otros genes.

Para la expresión en tejidos de plantas transgénicas y en plantas, el ICP de Bt se subclonó en tres vectores diferentes. En primer lugar, para la cotransformación con plásmidos que llevaban marcadores seleccionables y explorables, el gen de ICP se clonó en el plásmido DAB305Bg. El sitio BamH I situado cadena abajo del gen de ICP se modificó a un sitio Sst I por inserción de un adaptador BamH I/Sst I. El fragmento Nco I-Sst I de 1854 pares de bases que llevaba el gen de ICP se insertó bajo el control del promotor 35S doblemente potenciado de alta expresión y las secuencias de adición de poli A de la nopalina sintasa (Nos), dando como resultado el plásmido pDAB910 (Figura 6). En segundo lugar, para la transformación en protoplastos de cultivo MSD y selección con kanamicina, el casete 35S/Bt/Nos potenciado se subclonó desde pDAB910, como un fragmento Bgl II de 3150 pares de bases, en el único sitio Bgl II de pDAB199, donde la preparación de este plásmido se describe por Sukhapinda et al. (Plant Cell Reports 13 (1993) 63), dando como resultado la transformación de protoplastos de maíz (Zea maysl) y la regeneración del plásmido pDAB911 (Figura 7). En tercer lugar, el mismo casete 35SEn^{2}/Bt/Nos se subclonó en el único sitio Bgl II de pDAB219\Delta, dando como resultado el plásmido pDAB917 (Figura 8), para la transformación por bombardeo de callos de Tipo II y selección con Basta^{TM}.

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Ejemplo 9 Construcción de un Gen de Referencia que Codifica la Luciferasa de Luciérnaga

La producción de la proteína GUS a partir de genes controlados por diferentes versiones de promotores a menudo se comparó con un gen de control interno que producía luciferasa de luciérnaga (DeWet et al., Molec. Cell Biol. 7 (1987) 725). Se adquirió un plásmido (pT3/T7-1 LUC) que contenía la región codificante de luciferasa (LUC) en CLONTECH (Palo Alto, CA) y la región codificante se modificó en sus extremos 5' y 3' por métodos convencionales. En resumen, las secuencias que rodeaban al codón de inicio de la traducción (ATG) se modificaron para incluir un sitio Nco I (CCATGG) y un codón de alanina (GCA) en la segunda posición. En el extremo 3', un sitio de reconocimiento Ssp I colocado 42 pb cadena abajo del codón de terminación de la región codificante de luciferasa se transformó en un con extremos romos con la ADN polimerasa de T4 y se ligó a enlazadores oligonucleotídicos sintéticos que codificaban la secuencia de reconocimiento de Bgl II. Estas modificaciones permiten el aislamiento de la región codificante de luciferasa intacta en un fragmento de 1702 pb después de la digestión por Nco I y Bgl II. Este fragmento se usó para reemplazar el gen de GUS del plásmido pDAB305 (véase el Ejemplo 7E, etapa 5), de tal forma que la región codificante de luciferasa se expresó a partir del promotor 35S potenciado, dando como resultado el plásmido pDeLux. El líder no traducido 5' del transcrito primario incluye la secuencia de líder de MSV/intrón de Adh modificada.

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Ejemplo 10 Transformación de Células

Como materiales vegetales de partida se usaron cultivos de suspensión celular procedentes de microsporas de maíz inmadura. Estos cultivos derivados de microsporas (MSD) se mantuvieron como se describe por Mitchell et al., J. Plant Physiol., 137 (1991) 530. Los cultivos son haploides y algunas líneas celulares pudieron regenerar plantas haploides. Para el aislamiento de protoplastos se usaron cultivos de suspensión de células de 8 a 20 meses de edad. La densidad de los protoplastos se ajustó a 4 x 10^{6} protoplastos/ml de solución de electroporación [KH_{2}PO_{4} a 20 mg/l, NaH_{2}PO_{4} a 115 mg/l, CaCl_{2} a 444 mg/l, NaCl a 7,5 g/l, manitol a 36,4 g/l, pH 7,2 (Fromm et al., Nature, 319 (1986) 791]. La suspensión de protoplastos se sometió a choque térmico a 42ºC durante 5 minutos y después se puso en hielo. En los experimentos de transformación de protoplastos se usaron plásmidos pDAB 911 solos o pDAB 910 junto con pDAB 326. Se usaron cantidades de ADN equimolares de los plásmidos (por ejemplo 64 \mug de pDAB 911, 31,6 \mug de pDAB 910 y 46 \mug de pDAB 326). El ADN plasmídico, en 20-40 \mul de Tris 1,0 mM estéril, pH 8,0, EDTA 1,0 mM se puso en una cubeta de electroporación de poliestireno de 1 ml que contenía un volumen de la solución de la solución de electroporación para obtener un volumen total de 0,5 ml. Se pipetearon 0,5 ml de la suspensión de protoplastos en la cubeta inmediatamente antes de aplicar un solo pulso eléctrico (400 \muF, 300 v/cm) desde una unidad IBI Gene Zapper. La cubeta se puso inmediatamente en hielo durante 10 minutos. Se extendió un volumen de doscientos cincuenta \mul de la suspensión de protoplastos (aproximadamente 5 x 10^{5} protoplastos) en un filtro (47 mm nylon; Micron Separations, Inc.) que se puso sobre las células de alimentación (300 mg de células MSD, Línea 34) extendida sobre un medio sólido Ml en una placa Petri de poliestireno de 60 x 15 mm. Una semana después de la colocación en la placa, el filtro se transfirió a un medio de selección que contenía 100 mg/l de sulfato de kanamicina. Después de cuatro a seis semanas en el medio que contenía kanamicina, pudieron observarse y seleccionarse aislados de callos resistentes. A partir de un total de cuatro experimentos de transformación con los plásmidos mencionados, se seleccionaron más de 400 aislados. Estos aislados de callos se desarrollaron en el mismo medio hasta que se acumuló suficiente tejido para un análisis adicional.

Para determinar si estos aislados seleccionados se transformaban y expresaban los genes marcadores introducidos, los tejidos de callos se ensayaron con respecto a la actividad \beta-glucuronidasa (GUS) usando la técnica histoquímica descrita por Jefferson, Plant Molec. Biol. Rep., 5 (1987) 387, y para la actividad neomicina fosfotransferasa (NPT II) usando la técnica descrita por Reiss et al., Gene, 30 (1984) 211. Los aislados seleccionados se ensayaron con respecto a la expresión del gen de ICP introducido por análisis de inmunotransferencia como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 16.

TABLA 16 Resumen de expresión de \beta-glucuronidasa (GUS), neomicina fosfotransferasa II (NPT II), y proteína cristalina insecticida de Bt (ICP) en callos de MSD transformados

38

Un total de cuatro aislados mostraron niveles detectables de la ICP. Dos aislados se transformaron con pDAB 911 y su nivel de expresión de ICP corresponde a aproximadamente 0,1% de la proteína extraíble total (Figura 9). Los otros dos aislados, obtenidos a partir de la cotransformación de pDAB 910 y pDAB 326, también expresaron ICP a aproximadamente 0,1% de la proteína extraíble total (datos no mostrados). El tejido de callo de un aislado (transformado con pDAB 911) se usó en un ensayo de alimentación de 3 días de larvas recién nacidas de Heliothis virescens. Los resultados (Tabla 17) indicaron que el tejido de callo produjo suficiente ICP para destruir la mayoría de las larvas, e inhibir seriamente el crecimiento de los supervivientes.

TABLA 17 Actividad insecticida de callos de MSD transformados con el gen de ICP en un bioensayo de alimentación de Heliothis virescens de 3 días

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Ejemplo 11 Transformación de Células

Parte A

Establecimiento de Cultivos de Callos Embriogénicos

Se iniciaron cultivos de callos embriogénicos a partir de embriones inmaduros de genotipos reproducidos especialmente por la susceptibilidad a la manipulación in vitro. Se usaron cultivos que representan dos genotipos: i) "Backcrossed B73" es un BC_{3} endogámico derivado del cruce B73x(B73xA188), y ii) "High II" es un híbrido obtenido por inter-acoplamiento de dos líneas S_{3} derivadas de un cruce B73xA188. Cuando se exponen a las condiciones de cultivo apropiadas, los embriones inmaduros de estos dos genotipos presentan niveles consistentemente elevados de formación de callos capaces de regenerar plantas fértiles.

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Se sembraron semillas de dos parentales S_{3} de "High II" y B73 individualmente en tiestos que contenían aproximadamente 4 kg de mezcla de sustrato seco Nº 3 (Conrad Fafard, Inc., Springfield, MA) humedecido y ajustado a pH 6,0. Las plantas se mantuvieron en un invernadero con un fotoperiodo de 16/8. La luz ambiente se suplementó con una combinación de lámparas de sodio de alta presión y haluro metálico de tal forma que la intensidad mínima de luz 2 m por encima del nivel del tiesto era de aproximadamente 1.500 ft-candles. La temperatura del invernadero se mantuvo a 28ºC \pm 3ºC, durante el día y a 22ºC durante la noche. Las plantas se regaron cuando fue necesario con una solución que contenía 400 mg/l de fertilizante 20-20-20 (W.R. Grace & Co., Fogelsville, PA), más 8 mg/l de hierro quelado (CIBA-GEIGY, Greensboro, NC).

Se desprendió polen y empezó la emergencia de barbas 50-60 días después de la plantación. Se prepararon plantas hembra para la polinización el día antes de la disponibilidad del polen cortando la punta de las cascarillas y barbas de brotes de espigas no fertilizadas. Al día siguiente, después de que las barbas hubieran crecido para formar un "cepillo" espeso con todas las barbas de la misma longitud, se recogió polen poniendo bolsas de papel sobre las borlas y se aplicaron cuidadosamente a las barbas. Los embriones "Backcrossed B73" se produjeron en plantas B73 por polinización con plantas regeneradas a partir de cultivos BC_{2} (como se describe más adelante). Los embriones "High II" se produjeron a partir del interemparejamiento de las líneas S_{3}.

Cuando los embriones en desarrollo alcanzaron una longitud de aproximadamente 1,5-2,0 mm (10-14 días después de la polinización), se escindió la espiga y la superficie se esterilizó por inmersión en etanol al 70% v/v durante 10 minutos seguido de humedecimiento en blanqueador comercial al 20% v/v (hipoclorito sódico al 1%) durante 30 minutos. Después de un aclarado estéril en agua destilada los embriones inmaduros se aislaron asépticamente y se pusieron sobre un medio de "iniciación" con el eje del embrión en contacto con el medio (con el lado escutelar alejado del medio). El medio de "iniciación" consistía en los siguientes componentes: sales basales N6 y vitaminas (Chu, Proc. Symp. Plant Tissue Culture, (1978), Peking Press, pág. 43-56), 20 g/l de sacarosa, 2,9 g/l de prolina, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 1 mg/l de ácido 2,4-dicloro-fenoxiacético (2,4-D), 10 mg/l de AgNO_{3} y 2,5 g/l de gelrite (Kelco, Inc., San Diego, CA) ajustado a pH 5,8.

Los embriones inmaduros se incubaron a 28ºC en la oscuridad durante 10-30 días, tiempo durante el cual el tejido del callo, que presentaba diversos tipos de morfología, proliferó desde la región escutelar. El tejido del callo producido durante este tiempo se clasificó en tres tipos distintos: i) callo blando, granular translúcido que carecía de cualquier organización morfológica aparente (conocido como no embriogénico), ii) callo compacto, nodular, de amarillento a blanco que consistía en grupos de embriones somáticos (con frecuencia fusionados) con distintas estructuras de tipo escutelar y de coleóptilo (conocido como Tipo I), y iii) callo blando con numerosos embriones somáticos globulares y alargados en estructuras de tipo suspensor (conocidos como Tipo II). El callo de Tipo II fue el más adecuado para establecer cultivos embriogénicos friables. Algunas veces proliferó la escutela entera con este tipo de tejido o en algunas ocasiones sólo se desarrollaron pequeños sectores que presentaban esta morfología. Después se realizó un subcultivo selectivo, con lo que sólo el tejido con embriones somáticos globulares y alargados bien definidos junto con algún tejido blando indiferenciado delimitante se transfirió a medio de "iniciación" nuevo. Después de 2-3 subcultivos en medio de "iniciación", el callo se transfirió a medio de "mantenimiento". El medio de "Mantenimiento" difería del medio de "iniciación" en que contenía 690 mg/l de prolina y no contenía AgNO_{3}. Después de 8-16 semanas de enriquecimiento preferencial para el callo de Tipo II, los cultivos embriogénicos bien establecidos estaban listos para el bombardeo con helio.

Parte B

Transformación por Bombardeo con Helio

El bombardeo con helio implicaba la aceleración de partículas de tamaño micrométrico, recubiertas con ADN plasmídico, hasta velocidades de penetración. El dispositivo usado se describió en la Patente de Estados Unidos Nº 5.141.131. En resumen, el dispositivo consistía en una fuente de helio de alta presión, un deposito de micropartículas de oro recubiertas de ADN en suspensión y una válvula universal que proporcionaba comunicación selectiva entre la salida de la fuente de helio y la entrada de la suspensión de oro. Las partículas de oro se recubrieron con ADN plasmídico (pDAB917) que contenía secuencias codificantes de genes marcadores de selección y explorables.

El gen marcador de selección era bar que codifica la enzima fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) y confiere resistencia al herbicida Basta^{TM}. El gen marcador de exploración era uidA que codifica la \beta-glucuronidasa (GUS), cuya actividad se controló histoquímicamente. Los dos genes se dirigieron por el promotor constitutivo 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor. De esta forma, se seleccionaron células transformadas raras de un fondo de tejido no transformado por exposición al herbicida Basta^{TM} y se ensayaron con respecto a la presencia de la actividad \beta-glucuronidasa usando un ensayo histoquímico en el que el tejido se volvió azul cuando era positivo.

Se adsorbió ADN plasmídico en la superficie de partículas de oro antes del uso en los experimentos de transformación. Las partículas de oro eran esféricas con diámetros que variaban de aproximadamente 1,5-3,0 micrómetros (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). La adsorción se realizó añadiendo 74 \mul de cloruro cálcico 2,5 M y 30 \mul de espermidina 0,1 M a 300 \mul de suspensión de ADN/oro (140 \mug de pDAB917, tampón Tris 0,01 M y EDTA 1 mM). Las partículas de oro recubiertas con ADN se sometieron a agitación vorticial inmediatamente y después se dejaron sedimentar en el fondo de un tubo Eppendorf y el líquido transparente resultante se retiró completamente. Las partículas de oro recubiertas con ADN después se resuspendieron un 1 ml de etanol al 100%. Después, la suspensión se diluyó a 15 mg de ADN/oro por ml de etanol para uso en los experimentos de bombardeo con helio.

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Aproximadamente 250 mg de tejido de callo embriogénico, 5-7 días después del subcultivo, se dispusieron en una capa circular fina directamente en la superficie de medio de "mantenimiento". El tejido se dejó secar ligeramente dejando las placas en reposo sin cubrir en una campana de flujo laminar durante varios minutos antes del uso. En la preparación para el bombardeo con helio, el callo se cubrió con una malla de acero inoxidable de 104 micrómetros. Las partículas de oro recubiertas con ADN después se aceleraron en el tejido de callo. Cada muestra de tejido de callo se bombardeo 10-15 veces liberando cada bombardeo aproximadamente 1 \mul de suspensión de oro recubierto con ADN.

Parte C

Selección de Tejido Transgénico y Regeneración de Plantas

Después del bombardeo, el tejido de callo se dejó incubar durante 1-2 días en las condiciones descritas anteriormente. Cada muestra de tejido después se dividió en aproximadamente 60 piezas iguales (de 1-3 mm de diámetro) y se transfirió a medio de "mantenimiento" nuevo que contenía 30 mg/l de Basta^{TM}. Cada tres semanas, el tejido de callos se transfirió de forma no selectiva (sin tener en cuenta la morfología del tejido) a medio de "mantenimiento" que contenía Basta^{TM} nuevo. A esta concentración de herbicida, se produjo, muy poco crecimiento. Después de 8-16 semanas, se podían ver sectores que proliferaban a partir de un fondo de tejido con el crecimiento inhibido. Este tejido se aisló a partir de los otros callos y se mantuvo por separado en medio de "mantenimiento" que contenía Basta^{TM} y se subcultivó selectivamente (solo tejido de Tipo II) cada 10-14 días. En este momento, se realizó un ensayo histoquímico para la expresión de GUS como se describe más adelante.

Todos los callos resistentes a Basta^{TM}(fueran positivos o negativos para GU) se subcultivaron selectivamente en medio de "inducción" y se incubaron a 28ºC con poca luz (125 ft-candles) durante una semana seguido de una semana con alta intensidad de luz (325 ft-candles) proporcionada por lámparas fluorescentes frías. El medio de "inducción" estaba compuesto de sales MS y vitaminas (Murashige et al., Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de mio-inositol, 5 mg/l de bencil-amino purina, 0,025 mg/l de 2,4-D y 2,5 g/l gelrite ajustado a pH 5,7. Después de este periodo de inducción de dos semanas, el callo se transfirió de forma no selectiva a medio de "regeneración" y se incubó con alta intensidad de luz a 28ºC.

El medio de "regeneración" estaba compuesto de sales MS y vitaminas, 30 g/l de sacarosa y 2,5 g/l gelrite ajustado a pH 5,7. Cada 14-21 días el callo se subcultivó en medio de "regeneración" nuevo seleccionando el tejido que parecía diferenciarse en hojas y raíces. Tanto el medio de "inducción" como el medio de "regeneración" contenían 30 mg/l de Basta^{TM}. Las plántulas se transfirieron a tiestos de 10 cm que contenían aproximadamente 0,1 kg de mezcla de sustrato seca y después se humedecieron minuciosamente y se cubrieron con tapas de plástico transparente durante aproximadamente 4 días. En la fase de 3-5 hojas, las plantas se transplantaron a tiestos más grandes y se dejaron crecer hasta la madurez como se ha descrito previamente. Se realizaron autopolinizaciones o polinizaciones entre plantas hermanas en las plantas regeneradas a partir del mismo cultivo o se cruzaron con plantas procedentes de semillas no transformadas para obtener progenies transgénicas.

Ejemplo 12 Ensayos en el Campo

Usando los procedimientos y la descendencia transgénica descrita en el Ejemplo 11, se prepararon cuatro (4) plantas endogámicas transgénicas usando técnicas de reproducción convencionales. Las plantas endogámicas resultantes se usaron para desarrollar cuatro híbridos transgénicos.

Se plantaron semillas de cada uno de cuatro (4) híbridos transgénicos en tiestos de una sola fila usando un diseño de bloque completo aleatorizado. Las localizaciones incluían secciones de investigación en Indiana, Illinois, Minnesota e Iowa. Se usaron tiestos de control (híbridos de control no transgénicos) para medir la cantidad de lesiones debidas a los insectos por infestaciones naturales (Control A) y artificiales (Control B). En todas las localizaciones se evaluó un control de segunda generación de Perforador del Maíz Europeo (ECB). El ECB de primera generación y el gusano de las espigas del maíz se evaluaron únicamente en las estaciones de investigación de campo en Indiana e Illinois. Todos los insectos se obtuvieron a partir de una sola fuente. Cada ensayo se infestó dos veces (con una separación de 4-6 días) con larvas recién nacidas. Para los estudios de ECB de primera generación, se aplicaron 40-80 larvas en plantas en la fase de desarrollo de espira media, mientras que se aplicaron el mismo número de larvas en la fase de barba media en los estudios de ECB de segunda generación. Las lesiones en las plantas se determinaron 6 semanas después cortando los tallos y los brotes de espigas cuando estaban presentes. Se registraron el número de larvas de ECB y túneles para cada grupo de 10 plantas por duplicado. Los estudios sobre el gusano de las espigas de maíz requirieron 10 plantas por réplica para infestarse artificialmente con la larva en primera fase larvaria de gusano de la espiga de maíz a aproximadamente 5-10 por espiga. Aproximadamente 3 semanas después, se evaluaron las espigas con respecto al número de larvas presentes.

Se realizó un análisis combinado de varianza sobre los datos recogidos para los estudios de ECB de la primera generación (Tabla 18). Los controles infestados de forma artificial tuvieron una media de un túnel por tallo y tenían un nivel de infestación de más de 70 por ciento. Las líneas transgénicas mostraron pocos o ningún túnel de ECB (\leq0,06 túneles por callo) y tuvieron niveles de infestación inferior es a 7 por ciento. Se demostró una diferencia significativa (p<0,05) entre los controles y las líneas transgénicas para larvas y túneles por tallo así como el porcentaje de plantas infestadas. No se encontraron diferencias estadísticas entre los híbridos transgénicos individuales para el control de ECB de la primera generación.

TABLA 18 Datos de ECB de Primera Generación

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Para el ECB de segunda generación, los controles infestados de forma artificial tuvieron una media comprendida entre 1 y 3 túneles por tallo; los niveles de infestación variaban de 72 a 100 por cien (Tabla 19). Los daños en los híbridos transgénicos variaban de ninguno a pocos (\leq 0,25 túneles por tallo) con niveles de infestación que variaban de 0 a 23 por ciento (Tabla 19). Las mediciones realizadas sobre las longitudes de los túneles mostraron que los túneles encontrados en las líneas transgénicas eran significativamente más pequeños (p< 0,5) en comparación con los controles (Tabla 19). Sólo se calcularon la media y el error típico de la media para la medición de la longitud media del túnel; otros análisis estadísticos no eran válidos debido a la ausencia de túneles en las muchas réplicas de los organismos transgénicos que que hizo que faltarán datos. Con la excepción del estudio en Minnesota, estos datos demuestran que la longitud media del túnel entre los híbridos transgénicos era similar y más pequeña que en los controles. Las líneas transgénicas tuvieron significativamente menos espigas dañadas por ECB (p< 0,05) que los controles. En general, se encontraron diferencias significativas (p< 0,05) entre los controles y las líneas transgénicas. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre híbridos transgénicos individuales y su nivel de control para ECB de la segunda generación.

TABLA 19 Datos de ECB de Segunda Generación

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Los controles infestados de forma artificial tuvieron una media de aproximadamente una larva de gusano de espiga por espiga como para un intervalo de infestación entre 40 y 90 por ciento. Los híbridos transgénicos fueron significativamente diferentes (p< 0,05) de los controles tanto para el gusano de espiga por espiga y el porcentaje de plantas infestadas. Aunque no se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre híbridos transgénicos, el híbrido Nº 1 mostró lesiones por el gusano de la espiga en las dos localizaciones (Tabla 20). Los híbridos 2, 3 y 4 mostraron pocas o ninguna lesión por el insecto.

TABLA 20 Datos del Gusano de la Espiga de Maíz

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Es de esperar que a los especialistas en la técnica se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la invención después de considerar la descripción detallada anterior de la invención.

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Ejemplo 13 Determinación de Potencia Relativa del Promotor por Expresión Transitoria en Organismos Sometidos a la Electroporación

Se mantuvieron cultivos de Black Mexican Sweet (BMS) (V. Walbot, Stanford University) como suspensiones en medio líquido (Fromm et al., PNAS USA 82 (1985) 351). Se aislaron protoplastos a partir de cultivos de 4 días de edad por suspensión de las células en volúmenes 4X de solución de aislamiento de protoplastos (Fromm et al., Enzymol. 153 (1987) 351) que contenían 0,5% de celulasa Onozuka RS, 0,5% de hemicelulasa y 0,02% de pectinasa (Karlan Research Products, Santa Rosa, CA), seguido de agitación suave. Después de una digestión de 3,5 horas, las células y protoplastos se recogieron por centrifugación (208 x g, 25ºC, 5 min) y se lavaron dos veces por resuspensión suave en solución de aislamiento de protoplastos. La purificación de los protoplastos se realizó por flotación en Solución de Lavado de Maíz (Shanin, Theor. Appl. Genet. 69 (1985) 235). Los protoplastos se lavaron dos veces en solución de electroporación (Fromm et al., Enzymol. 153 (1987) 351), y se llevaron a una densidad final de 4 x 10^{6} protoplastos/ml. Antes de la electroporación, los protoplastos se sometieron a choque térmico durante 5 minutos a 42ºC y después se pusieron en hielo hasta el uso. Se sometieron a electroporación alícuotas de aproximadamente 2 x 10^{6} protoplastos con la mezcla de ADN apropiada en un volumen de 1 ml. Típicamente, las mezclas de ADN contenían (por 2 x 10^{6} protoplastos en 1 ml), 60 \mug de ADN plasmídico de ensayo y 4,5 \mug de ADN plasmídico de referencia. Las condiciones de electroporación fueron: 1500 \muF, 200-400V a través de un hueco de 1 cm, tiempo de pulso de 25 mseg (Promega Model 240/250, Madison, WI). Después de la electroporación, los protoplastos se pusieron en hielo durante 10 minutos y después se cultivaron en placas Petri de plástico (previamente recubiertas con una capa fina de agarosa SeaPlaque al 1,2%; FMS BioProducts, Rockland, ME) que contenía medio de crecimiento de protoplastos (Fromm et al., PNAS USA 82 (1985) 351) a una densidad de 2,5 x 10^{5} protoplastos/ml.

Los ensayos fluorométricos para la actividad de GUS usando 4-metil-umbeliferil-glucurónido como sustrato fueron esencialmente como se describe por Jefferson (Plant Molec. Biol. Reporter 5 (1987) 387), y los ensayos para la actividad de la luciferasa usando luciferasa como sustrato se basaron en los métodos de DeWet et al. (Molec. Cell. Biol. 7 (1987) 725), Ow et al. (Science 234 (1986) 856), Ow et al. (PNAS USA 84 (1987) 4870) y Howell et al., (Plant Molecular Biology Manual (1989) Cap. B8,1). En algunos casos, los genes de GUS y LUC se sometieron a electroporación conjuntamente en plásmidos separados, y en otros casos se introdujeron en un solo plásmido.

Los resultados de los estudios de fuerza comparativa de promotor se proporcionan a continuación

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TABLA 21

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Estos datos demuestran que no se obtiene ninguna ventaja de expresión por la duplicación del elemento potenciador 35S en protoplastos de maíz, ni la secuencia líder de la proteína de la cubierta de MSV confiere un aumento de la traducción por sí misma. Se observa algún aumento de la expresión cuando la versión delecionada del intrón 1 de Adh1.S de maíz se coloca dentro del líder 5' no traducido. Sin embargo, se observa un aumento de aproximadamente 40 veces en la expresión de GUS con respecto al promotor 35S nativo cuando el promotor 35S potenciado se acopla al líder de MSV que contiene la versión delecionada del intrón 1 de Adh1.S. La secuencia de la combinación promotor/líder se presenta como SEC ID Nº 43, que no forma parte de la invención.

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Ejemplo 14 Clonación del Intrón 6

Este ejemplo describe la clonación del intrón 6 del gen de Adh1.S de maíz y su incorporación en la secuencia líder no traducida 5' sintética derivada del gen de la proteína de la cubierta de Virus del Estriado del Maíz (MSV/CPL, véase anteriormente).

El material de partida es el plásmido pB428, obtenido en J. Bennetson, Purdue University. Éste es un clon de un fragmento BamH I de aproximadamente 11,5 kpb de ADN genómico de maíz insertado en el sitio BamH I de pBR322, y que contiene el gen de Adh1.S (Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 3983). Un fragmento de 396 pb que contenía la secuencia del intrón 6 y partes de los exones flanqueantes 6 y 7 se amplificó a partir de 10 ng de ADN de la plantilla de pB428 usando 100 pmol de cada uno de los cebadores directos que tienen la secuencia CGACCTGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGG (SEC ID Nº 81) y cebadores inverso de secuencia TTCAGTGGATCCGAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG (SEC ID Nº 82). Estos cebadores contienen las secuencias de reconocimiento para Bcl I (TGATCA, subrayado en el cebador directo) y BamH I, (GGATCC, subrayado en cebadores inversos). Están diseñados para introducir el sitio Bc I inmediatamente antes del nucleótido 2162 y el sitio BamH I inmediatamente después del nucleótido 2534, de la secuencia de Adh1.S de Dennis et al. (Nucl. Acids Res. 12 (1984) 3983). El fragmento de PCR resultante, con un tamaño esperado de 396 pb, contiene 20 bases del exón 6 de Adh1.S, todo el intrón 6 y 11 bases del exón 7, como se presenta en (SEC ID Nº 83).

Las reacciones (100 \mul de volumen final) contenían, aparte de la plantilla y los cebadores, tampón de reacción de PCR 1 x (como se describe en el Ejemplo 2), una concentración final 0,2 mM de dATP, dTTP, dGTP y dCTP y 5 unidades de ADN Taq polimerasa (Perkin Elmer/Cetus). Los ciclos de temperatura fueron: 94º (1 min; 25 ciclos de 94º (1 min), 55º (30 seg), 72º (30 seg), seguido de un periodo de extensión de 72º, 10 min. Los fragmentos de tamaño apropiado se extrajeron de un gel de agarosa, se digirieron con enzimas de restricción Bcl I y BamH I y se ligaron en ADN digerido con Bgl II de pCPL-Bg (véase anteriormente). Se identificó un plásmido que tenía un mapa de enzimas de restricción apropiado y se denominó pCPL-Adh6.

La estructura de pCPL-Adh6 es la siguiente (no se incluyen las secuencias del vector de pBSK, véase el Ejemplo 7C etapa 1): la secuencia enlazadora GGATCCAG que incluye un sitio de reconocimiento BamH I, nucleótidos 167 a 186 de MSV, nucleótidos 188 a 277 de MSV, la secuencia enlazadora GATCA, nucleótidos 2162 a 2534 de Adh1.S de maíz, la secuencia enlazadora GGATCTG, y finalmente los nucléotidos 278 a 317 de MSV, incluyendo una secuencia de reconocimiento Nco I (SEC ID Nº 84). De forma análoga a pCPL A1I1\Delta (véase el Ejemplo 7D etapa 3) las secuencias de líder de MSV/intrón pueden obtenerse a partir del plásmido por digestión con BamH I y Nco I y purificación del fragmento de 541 pb. Este fragmento por lo tanto es el equivalente funcional del fragmento análogo que contiene el fragmento del intrón 1 de Adh1.S utilizado en plásmidos descritos en los Ejemplos 7 y 13.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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En la Tabla 22 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida de Bt que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

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Claims (8)

1. Una secuencia de nucleótidos optimizada para plantas que codifica una proteína cristalina insecticida (ICP), donde la secuencia de nucleótidos optimizada para plantas es la SEC ID Nº 1.

2. Un gen de ICP purificada que tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEC ID Nº 1.

3. Una construcción genética sintética que se expresa en células vegetales que comprende en secuencia 5' a 3':

una secuencia promotora que inicia la transcripción en células vegetales;

una secuencia potenciadora de la traducción;

una secuencia génica de nucleótidos optimizada para plantas que codifica una proteína cristalina insecticida (ICP), donde la secuencia génica es la SEC ID Nº 1; y

una secuencia de poliadenilación,

donde dicha secuencia promotora, secuencia potenciadora de la traducción, secuencia de nucleótidos optimizada para plantas y secuencia de poliadenilación están unidas operativamente.

4. Una construcción de gen sintético de acuerdo con la reivindicación 3, donde el promotor se selecciona entre el grupo consistente en promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores regulados en el tiempo, promotores regulados en el desarrollo, promotores preferidos en tejidos y promotores específicos de tejidos.

5. Una construcción de genética sintética de acuerdo con la reivindicación 3, donde el promotor es 35S de CAMV.

6. Una construcción genética sintética de acuerdo con la reivindicación 3, donde la secuencia potenciadora de la traducción es un intrón de maíz.

7. Una planta de maíz transgénica que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

8. Una semilla de planta que tiene en su genoma un gen sintético no heredable, donde el gen sintético comprende una secuencia de nucleótidos optimizada para plantas que codifica una proteína cristalina insecticida (ICP), donde la secuencia de nucleótidos optimizada para plantas es la SEC ID Nº 1.