ES2623610T3

ES2623610T3 - Moléculas de ácido nucleico de ácido graso poliinsaturado sintasas, y polipéptidos, composiciones y métodos de preparación y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2623610T3
Application number: ES10754185.6T
Authority: ES
Inventors: Kirk E. Apt; Leslie Richter; David Simpson; Ross Zirkle
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2030-03-19
Also published as: CA3012998A1; US20200199598A1; BRPI1006435B1; AU2010226440B2; AR075897A1; US20170088841A1; EP2408797B1; TWI600762B; US8940884B2; ES2717102T3; CN102741267B; CA2755639A1; JP2015231384A; CN102741267A; US20100266564A1; JP6432867B2; WO2010108114A3; EP2408797A2; EP3192871A1; TW201038734A

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 5, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que consiste en actividad de ß-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA (DH) y actividad de enoil-ACP reductasa (ER); (b) una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 5; (c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER; y (d) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEQ ID NO: 6.

Description

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contener una o más bases o cadenas principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. En ADN y ARN se pueden hacer una diversidad de modificaciones; por lo tanto, "polinucleótido" incluye formas modificadas química, enzimática, o metabólicamente. La expresión molécula de ácido nucleico se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Por lo tanto, esta expresión incluye ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. Al discutir la estructura de moléculas de ADN de bicatenarias en particular, las secuencias se pueden describir en el presente documento de acuerdo con la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra de ADN no transcrita (es decir, la hebra que tiene una secuencia homóloga a la del ARNm).

La expresión molécula de ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno nativo. Los ejemplos adicionales de moléculas de ácido nucleico aislado incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente invención incluyen adicionalmente las moléculas de este tipo producidas por vía sintética. Además, una molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma, o un terminador de la transcripción.

Un "gen" se refiere a un conjunto de nucleótidos que codifican un polipéptido, e incluye ADNc y ácidos nucleicos de ADN genómico. "Gen" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias de intervención (intrones) entre segmentos codificante sin individuales (exones), así como secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes en la posición 5') y que siguen (secuencias no codificantes en la posición 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la secuencia de polinucleótidos de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (SEQ ID NO: 5), en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de β-hidroxiacil-ACP deshidrasa similar a FabA (DH) y actividad de enoil-ACP reductasa (ER).

Las actividades de PUFA sintasa están asociadas con uno o más dominios en cada polipéptido de sintasa, en las que los dominios se pueden identificar mediante sus motivos estructurales o funcionales conservados basándose en su homología con motivos conocidos y también se pueden identificar basándose en sus actividades bioquímicas específicas. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.º 7.217.856, incorporado por referencia en el presente documento en su totalidad. Los ejemplos de dominios de PUFA sintasa incluyen: el dominio de beta-cetoacil-ACP sintasa (KS), dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT), dominios de proteína de vehículo de acilo (ACP), dominio de cetorreductasa (KR), y dominio de beta-hidroxiacil-ACP deshidrasa (DH) en Pfa1p; el dominio de KS, el dominio de factor de longitud de cadena (CLF), dominio de aciltransferasa (AT), y dominio de enoil-ACP reductasa (ER) en Pfa2p; y los dominios DH y el dominio de ER en Pfa3p.

Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad biológica (función) de beta-cetoacil-ACP sintasa (KS) es capaz de realizar la etapa inicial del ciclo de reacción de elongación de ácido graso. La expresión "beta-cetoacil-ACP sintasa" se ha usado indistintamente con las expresiones "3-ceto acil-ACP sintasa", "beta-cetoacil-ACP sintasa", y "ceto-acil ACP sintasa". En otros sistemas, se ha mostrado que el grupo acilo para elongación está relacionado con un resto de cisteína en el sitio activo de KS mediante un enlace tioéster, y el acil-KS experimenta condensación con malonil-ACP para formar -cetoacil-ACP, CO2, y KS sin unir ("libre"). En los sistemas de este tipo, se ha mostrado que KS posee una especificidad de sustrato mayor que otros polipéptidos del ciclo de reacción. Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de KS mediante homología con secuencias conocidas de KS.

Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT) es capaz de transferir el resto malonilo de malonil-CoA a ACP. La expresión "malonil-CoA:ACP aciltransferasa" se ha usado indistintamente con "malonil aciltransferasa". Además del motivo de sitio activo (GxSxG), se ha mostrado que las MAT poseen un motivo ampliado (aminoácidos R y Q en posiciones fundamentales). Los polipéptidos (o dominios de polipéptidos) se pueden identificar fácilmente como pertenecientes a la familia de MAT mediante homología con secuencias conocidas de MAT y mediante su estructura de motivo ampliado. Previamente se ha mostrado que un polipéptido o un dominio de un polipéptido que tiene actividad de proteína transportadora de acilo (ACP) es capaz de funcionar como un vehículo para crecimiento de cadenas de acilo graso a través de un enlace tioéster a un cofactor unido de manera covalente. Las ACP por lo general tienen una longitud de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 aminoácidos y se ha mostrado que se convierte en de formas apo inactivas a formas holo funcionales mediante transferencia del resto fosfopanteteinilo de CoA a un resto de serina altamente conservado de la ACP. También se ha mostrado por los grupos acilo según en a las ACP mediante un

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La molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos dentro de PFA3 (SEQ ID NO: 5) que codifica un dominio de DH (tal como SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 110, o SEQ ID NO: 112), y un dominio de ER (SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 114). La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 5, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 39, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de DH.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 110, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de DH.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 112, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de DH.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 114, en la que la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende actividad de ER.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aisladas que comprende secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos, en la que los polipéptidos comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de Pfa3p (SEQ ID NO: 6), en la que the polinucleótidos codifican polipéptidos que tienen actividades de PUFA sintasa que consisten en actividad de DH y actividad de ER.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere una molécula de ácido nucleicos que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos dentro de Pfa3p (SEQ ID NO: 6) que comprende uno o más dominios de PUFA sintasa tales como un dominio de DH (tal como SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 111, o SEQ ID NO: 113), un dominio de ER (SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 115), y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 109, y en la que el polipéptido comprende actividad de ER.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico comprenden secuencias de polinucleótidos idénticas en al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, o 90 % a las secuencias de polinucleótidos informadas en el presente documento, o al menos idénticas en aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a las secuencias de polinucleótidos informadas en el presente documento. La expresión "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, tal como se determina mediante comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de las secuencias entre secuencias de aminoácidos o polinucleótidos, según pueda ser el caso, tal como se determina mediante el emparejamiento entre hebras de tales secuencias.

Por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos "idénticas" en al menos, por ejemplo, un 95 % a una secuencia de polinucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende hacer referencia a que la secuencia de polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco diferencias de nucleótidos por cada 100 nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia de polinucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia.

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Como una cuestión práctica, cualquier secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos en particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos de la presente invención se puede determinar de manera convencional usando programas informáticos conocidos. Un método para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de búsqueda (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto se puede determinar usando el alineamiento de secuencias y cálculo de puntuaciones de identidad. Los alineamientos se realizaron usando el programa informático AlignX, que es un componente del paquete Vector NTI Suite 10.0 de Invitrogen (www.invitrogen.com). Los alineamientos se realizaron usando un alineamiento ClustalW (Thompson, J.D., et al., Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)) para alineamientos de secuencias tanto de aminoácidos como de polinucleótidos. Las matrices de puntuación por defecto, Blosum62mt2 y swgapdnamt, se usaron para alineamientos de secuencias de aminoácidos y polinucleótidos, respectivamente. Para secuencias de aminoácidos, la penalización de apertura de hueco por defecto es 10 y la penalización por extensión del hueco es 0,1. Para secuencias de polinucleótidos, la penalización de apertura de hueco por defecto es 15 y la penalización por extensión del hueco es 6,66.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de ER y actividad de DH, en la que el polinucleótido se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente.

Una molécula de ácido nucleico se puede "hibridar" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico se puede hibridar a la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se ejemplifican. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell

D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para identificar sistemáticamente fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos relacionados de manera alejada, a fragmentos altamente similares, tales como genes quintuplican enzimas funcionales de organismos muy relacionados. Los lavados después de la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones usa una serie de grabados que parte de 6X SSC, SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 15 min, a continuación se repite con 2X SSC, SDS al 0,5 % a 45 ºC durante 30 min, y a continuación se repite dos veces con 0,2X SSC, SDS al 0,5 % a 50 ºC durante 30 min. Para condiciones más rigurosas, se realizan lavados a temperaturas más elevadas en que los lavados son idénticos a los mencionados anteriormente excepto para temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0,2X SSC, SDS al 0,5 % que aumentan a 60 ºC. Otro conjunto de condiciones altamente rigurosos usados lavados finales en 0,1X SSC, 0,1 % SDS a 65 ºC. Un conjunto adicional de condiciones altamente rigurosas se definen mediante hibridación a 0,1X SSC, 0,1 % SDS, 65 ºC y se lava con 2X SSC, SDS al 0,1 % seguido de 0,1X SSC, SDS al 0,1 %.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que es totalmente complementaria a cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente. El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina.

En ciertas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido puede incluir normalmente un promotor y/o otros elementos de control de la transcripción o de la traducción asociados de manera operativa con una o más regiones codificantes. Una asociación operable se produce cuando la región codificante para un producto genético, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de una manera tal que se coloca la expresión del producto genético bajo la influencia o control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) se "asocian de manera operativa" si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto genético deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto genético o interferir con la capacidad del molde de ADN a transcribir. Por lo tanto, una región promotora se podría asociar de manera operativa con una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido si el promotor fuera capaz de realizar la transcripción de una secuencia de polinucleótidos. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirija la transcripción sustancial del ADN solamente en células predeterminadas. En general, una región codificante se sitúa en la posición 3' con respecto a un promotor. Los promotores se pueden obtener en su totalidad a partir de un gen nativo, o pueden estar formados por diferentes elementos obtenidos a partir de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso pueden comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la materia entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes estadios del desarrollo, o como respuesta a diferentes condiciones ambientales o psicológicas. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares la mayoría de las veces comúnmente se denominan "promotores constitutivos". Además se reconoce que dado que en la mayoría

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de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica. Un promotor por lo general se une en su extremo 3' terminal mediante el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro del promotor se encontrará sitio de inicio de la transcripción (definido de forma conveniente por ejemplo, mediante formación de mapas con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa.

Las regiones reguladoras adecuadas incluyen regiones de ácido nucleico situadas cadena arriba (secuencias no codificantes en la posición 5'), dentro, o cadena abajo (secuencias no codificantes en la posición 3') de una región codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión a efector y estructuras de tallo-lazo. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, se pueden asociar de forma operativa con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. Los límites de la región codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' terminal (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' terminal (carboxilo). Una región codificante puede incluir, pero no se limita a, regiones procariotas, ADNc de ARNm, moléculas de ADN genómico, moléculas de ADN sintético, o moléculas de ARN. Si la región codificante está destinada a la expresión en una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se situarán normalmente en la posición 3' con respecto a la región codificante.

En ciertos aspectos de la invención, como cebadores de PCR se pueden usar secuencias de polinucleótidos que tengan al menos 20 bases, al menos 30 bases, al menos 50 bases y que se hibridan con una secuencia de polinucleótidos de la presente invención. Por lo general, en técnicas de amplificación de tipo PCR, los cebadores tienen secuencias diferentes y no son complementarios entre sí. Dependiendo de las condiciones de ensayo deseadas, las secuencias de los cebadores se deberían diseñar para proporcionar una replicación tanto eficaz como fiel del ácido nucleico diana. Los métodos de diseño de cebadores de PCR son comunes y se conocen bien en la técnica. Por lo general se pueden usar dos segmentos cortos de las secuencias presentes en protocolos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican genes homólogos a partir de ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también se puede realizar en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados en los que la secuencia de un cebador se obtiene a partir de los presentes fragmentos de ácido nucleico y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de los tramos de ácido poliadenílico con respecto al extremo en la posición 3' del precursor de ARNm que codifica genes microbianos. Como alternativa, la segunda secuencia de cebadores se puede basar en secuencias obtenidas a partir del vector de clonación.

Además, se pueden diseñar cebadores específicos y usar para amplificar una parte o una longitud completa de las presentes secuencias. Los productos de amplificación resultantes se pueden etiquetar directamente durante las reacciones de amplificación o se pueden etiquetar después de reacciones de amplificación, y se pueden usar como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa en condiciones de rigurosidad apropiada.

Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden usar para aislar genes que codifican proteínas homólogas de la misma especie o de otras especies bacterianas. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos dependientes de secuencia se conoce bien en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación de ácidos nucleicos y métodos de amplificación de ADN y ARN como se usa a modo de ejemplo mediante diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, Mullis et al., documento de Patente de Estados Unidos N.º 4.683.202; reacción en cadena de ligasa (LCR) (Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA 82: 1074 (1985)); o amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA; Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 89: 392 (1992)).

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención se usan para aislar moléculas de ácido nucleico homólogas de otros organismos con el fin de identificar PUFA sintasas que produzcan perfiles de PUFA similares o mejorados. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención se usan para aislar moléculas de ácido nucleico homólogas de otros organismos que están involucrados en la producción de altas cantidades de DHA.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican un gen de PUFA sintasa, un dominio de un gen de PUFA sintasa, un fragmento del gen de PUFA sintasa fusionado en marco a una secuencia marcadora que permite la detección del polipéptido de la presente invención. Las secuencias marcadoras incluyen marcadores auxotróficos o dominantes conocidos por alguien con una experiencia habitual en la materia tal como ZEO (zeocina), NEO (G418), higromicina, arsenito, HPH, NAT, y similares.

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Los polipéptidos, como se describe en el presente documento, pueden incluir fragmentos, variante o moléculas derivadas de los mismos sin limitación. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo", cuando se refieren a un polipéptido, incluyen cualquier polipéptido que retenga al menos una cierta actividad biológica. Los fragmentos de polipéptidos pueden incluir fragmentos proteolíticos, fragmentos de deleción, y fragmentos que alcancen más fácilmente el sitio de acción cuando se administran a un animal. Los fragmentos de polipéptidos incluyen adicionalmente cualquier porción del polipéptido que comprende un epítopo antigénico o inmunogénico del polipéptido nativo, incluyendo epítopos lineales así como tridimensionales. Los fragmentos de polipéptidos pueden comprender regiones variantes, incluyendo fragmentos como se ha descrito anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes se pueden producir de manera natural, tal como una variante alélica. Por una "variante alélica" se hace referencia a formas alternas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Se pueden producir variantes de origen no natural usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los fragmentos de polipéptidos de la invención pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas

o no conservativas. En el presente documento los polipéptidos variantes también se pueden denominar "análogos de polipéptido". Los fragmentos de polipéptido de la presente invención también pueden incluir moléculas derivadas. Como se usa en el presente documento un "derivado" de un polipéptido o un fragmento de polipéptido se refiere a un polipéptido objeto que tiene uno más restos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional. Como "derivados" también se incluyen los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina; 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina; 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; homoserina se puede sustituir por serina; y ornitina se puede sustituir por lisina.

Los polipéptidos de la invención se pueden codificar mediante cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención.

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de Pfa3p (SEQ ID NO: 6), y combinaciones de los mismos, en las que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.

La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a una secuencia de aminoácidos dentro de Pfa3p (SEQ ID NO: 6) que comprende dominios de PUFA sintasa.

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido tiene una actividad de PUFA sintasa que consiste en actividad de DH y actividad de ER.

En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden secuencias de aminoácidos al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, o un 90 % idénticas a las secuencias de aminoácidos informadas en el presente documento, o al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % idénticas a las secuencias de aminoácidos informadas en el presente documento.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de búsqueda de la presente invención, se hace referencia a que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto es idéntica a la secuencia de búsqueda excepto en que la secuencia de polipéptidos objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de búsqueda. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de búsqueda, hasta un 5 % de los restos de aminoácidos en la secuencia objeto se puede insertar, suprimir, (indels) o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea de forma individual entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como una cuestión práctica, cualquier polipéptido en particular que tenga una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la presente invención se puede determinar de manera convencional usando programas informáticos conocidos. Como se ha analizado anteriormente, un método para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de búsqueda (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto se puede determinar usando el alineamiento de secuencias y cálculo de puntuaciones de identidad. Los alineamientos se realizaron usando el programa informático AlignX, que es un componente del paquete Vector NTI Suite 10.0 de Invitrogen (www.invitrogen.com). Los alineamientos se realizaron usando un alineamiento ClustalW (J. Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22 (22): 4673-4680 (1994). Se usó la matriz Blosum62mt2 de puntuación por defecto. La penalización de apertura de hueco por defecto es 10 y la penalización por extensión del hueco es 0,1.

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En aspectos adicionales de la invención, las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de polinucleótidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idénticas a las secuencias de polinucleótidos desveladas en el presente documento, codifican un polipéptido que tiene una o más actividades de PUFA sintasa. Los polipéptidos que tienen una o más actividades de PUFA sintasa presentan una o más actividades similares a, pero no necesariamente idénticas a, una o más actividades de una PUFA sintasa de la presente invención.

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguien con experiencia habitual en la materia reconocerá inmediatamente que una gran parte de las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de polinucleótidos al menos un 80%, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o un 99 % idénticas a las secuencias de polinucleótidos que se describen en el presente documento codificarán polipéptidos "que tengan actividad funcional de PUFA sintasa". De hecho, dado que todas las variantes degeneradas de cualquiera de estas secuencias de polinucleótidos codifican el mismo polipéptido, en muchos casos, el experto en la materia puede predecir, basándose en el conocimiento de sustituciones conservativas así como de dominios funcionales conservados, qué polipéptidos presentarán actividad. En ciertos aspectos de la invención, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan en una forma aislada, por ejemplo, purificada hasta homogeneidad. Como alternativa, los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden producir de forma sintética mediante sintetizadores convencionales.

Como se sabe en la técnica, la "similitud" entre todos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sustitutos de aminoácidos conservados de la misma del polipéptido con respecto a la secuencia de un segundo polipéptido.

En algunas realizaciones, un polipéptido de la invención es un polipéptido de fusión.

Como se usa en el presente documento, "polipéptido de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende un primer polipéptido conectado de manera lineal, a través de enlaces peptídicos, a un segundo polipéptido. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden ser idénticos o diferentes, y se pueden conectar directamente, o se pueden conectar a través de un conector peptídico. Como se usa en el presente documento, los términos "unido", "fusionado", o "fusión" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión en conjunto de dos o más elementos o componentes mediante cualquier medio que incluye medios de conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos para formar un marco de lectura abiertos más largo continuo, de una manera que mantenga el marco de lectura correcto de los marcos de lectura abiertos originales. Por lo tanto, la proteína de fusión recombinante resultante es una sola proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los marcos de lectura abiertos originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos a la naturaleza). Aunque el marco de lectura por lo tanto se hace continuo a través de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, mediante secuencia conectora en marco. Una secuencia "conectora" es una serie de uno o más aminoácidos que separan dos regiones codificantes de polipéptidos en una proteína de fusión.

También se describe una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención y un vehículo biológicamente aceptable.

En algunas composiciones, la composición incluye un "excipiente" biológicamente aceptable, en la que el excipiente es un componente, o mezcla de componentes, que se usa en una composición de la presente invención para dar características deseables a la composición, y también incluyen vehículos. "Biológicamente aceptable" se refiere a un compuesto, material, composición, sal, y/o forma de dosificación que, dentro del alcance del criterio médico sensato, es adecuado para su contacto con los tejidos de células vivas sin una toxicidad, irritación, respuesta inflamatoria excesivas, otras complicaciones problemáticas con respecto a la duración deseada del contacto o proporcionar con una relación razonable de beneficio/riesgo. Se pueden usar diversos excipientes. En algunas realizaciones, el excipiente puede ser, pero no se limita a, un agente alcalino, un estabilizante, un antioxidante, un agente de adhesión, un agente de separación, un agente de revestimiento, un componente de fase exterior, un componente de liberación controlada, un disolvente, un tensioactivo, un humectante, un agente de tamponamiento, una carga, un emoliente, o combinaciones de los mismos. Los excipientes, además de los que se discuten en el presente documento, pueden incluir excipientes que se enumeran en, aunque no se limitan a to, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª ed. (2005). La inclusión de un excipiente en una clasificación en particular en el presente documento (por ejemplo, "disolvente") pretende ilustrar más que limitar el papel del excipiente. Un excipiente en particular puede entrar dentro de múltiples clasificaciones.

También se describe un fragmento, variante, derivado, o análogo de cualquiera de los polipéptidos que se desvelan en el presente documento.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural, o un polipéptido sintético.

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Las células hospedadoras pueden incluir células microbianas; células animales; células vegetales; y células de insecto. Los ejemplos representativos de los predadores apropiados incluyen células bacterianas; bacterias termófilas o mesófilas; bacterias marinas; traustoquítridos; células fúngicas, tales como levadura; células vegetales; células de insecto; y células animales aisladas. Las células hospedadoras pueden ser células no transfectadas o células que ya están transfectadas con al menos otra molécula de ácido nucleico recombinante. Las células hospedadoras también pueden incluir células transgénicas que se han diseñado para expresar una PUFA sintasa. Se considera que la selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas en el presente documento.

Las células hospedadoras incluyen cualquier microorganismo del orden Thraustochytriales, tal como microorganismos de un género que incluye, pero no se limita a: Thraustochytrium Labyrinthuloides, Japonochytrium, y Schizochytrium. Las especies dentro de estos géneros incluyen, pero no se limitan a: cualquier especie de Schizochytrium, incluyendo Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum; cualquier especie de Thraustochytrium (incluyendo las especies anteriores de Ulkenia tales como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U. radiata, U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), e incluyen Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier especie de Japonochytrium. Las cepas de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a: Schizochytrium sp., (S31) (ATCC 20888); Schizochytrium sp., (S8) (ATCC 20889); Schizochytrium sp., (LC-RM) (ATCC 18915); Schizochytrium sp., (SR21); Schizochytrium aggregatum (Goldstein et Belsky) (ATCC 28209); Schizochytrium limacinum (Honda et Yokochi) (IFO 32693); Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (ATCC 28207). Otros jemplos de microorganismos hospedadores adecuados para modificación genética incluyen, pero no se limitan a, levaduras que incluyen including Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, u otras levaduras tales como Candida, Kluyveromyces, u otros hongos, por ejemplo, hongos filamentosos tales como Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. Las células bacterianas también se pueden usar como hospedadores. Esto incluye Escherichia coli, que puede ser útil en procesos de fermentación. Como alternativa, un hospedador tal como una especie de Lactobacillus o una especie de Bacillus se puede usar como un hospedador.

Las células hospedadoras vegetales incluyen, pero no se limitan a cualquier planta superior, incluyendo plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, y tantas consumibles, incluyendo plantas de cultivo y plantas usadas por sus aceites. Las plantas de este tipo pueden incluir, por ejemplo: canola, sojas, colza, lino, maíz, cártamos, girasoles, y tabaco. Otras plantas incluyen las plantas que se conocen porque producen compuestos usados como agentes farmacéuticos, agentes saborizantes, agentes nutracéuticos, ingredientes alimentarios funcionales, agentes cosméticamente activos, o plantas que se modifican genéticamente para producir estos compuestos/agentes. Por lo tanto, se puede seleccionar cualquier especie vegetal o célula vegetal. Los ejemplos de plantas y células vegetales, y plantas cultivadas u obtenidas a partir de las mismas, incluyen, pero no se limitan a, plantas y células vegetales obtenidas a partir de canola (Brassica rapa L.); variedades de cultivo de canola NQC02CNX12 (ATCC PTA-6011), NQC02CNX21 (ATCC PTA-6644), y NQC02CNX25 (ATCC PTA-6012) así como variedades de cultivo, variedades de cultivo de cría, y partes de plantas obtenidas a partir de variedades de cultivo de canola NQC02CNX12, NQC02CNX21, y NQC02CNX25 (véanse, los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 7.355.100, 7.456.340, y 7.348.473, respectivamente); soja (Glycine max); colza (Brassica spp.); lino/linaza (Linum usitatissimum); maíz (maíz) (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girasol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana, de Brasil (Betholettia excelsa); semilla de ricino (Riccinus communis); coco (Cocus nucifera); cilantro (Coriandrum sativum); algodón (Gossypium spp.); cacahuete (Arachis hypogaea); yoyoba (Simmondsia chinensis); mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba); aceite de palma (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa); calabacín (Cucurbita maxima); cebada (Hordeum vulgare); trigo (Traeticum aestivum); y lentejas de agua (Lemnaceae sp.). Las líneas de plantas a partir de estas y otras plantas se pueden producir, seleccionar, u optimizar para un rasgo deseado tal como hubo asociado con, pero que no se limita a, rendimiento de la semilla, resistencia a la fijación en la siembra, aparición, resistencia o tolerancia enfermedades, madurez, nivel de integridad de la planta en estación tardía, altura de la planta, resistencia a la destrucción, facilidad de transformación de la planta, contenido de aceite, o perfil del aceite. Las líneas de plantas se pueden seleccionar a través de cultivo de plantas tales como cultivo de pedigrí, cultivo de de selección recurrente, cultivo intercruzado y retrocruzado, así como métodos tales como reproducción asistida por marcador y labranza. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.º 7.348.473.

Las células animales incluyen cualquier célula animal aislada.

La presente invención se refiere a una célula hospedadora que expresa una o más moléculas de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico recombinante, incluyendo vectores, de la invención.

La presente invención se refiere a un método para preparar una célula hospedadora recombinante que comprende introducir un vector recombinante en una célula hospedadora.

Las células hospedadoras se pueden modificar modificar por ingeniería genética (transducir o transformar o transfectar) con los vectores de la presente invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector se puede encontrar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un

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membranas de las células vegetales. Véase, por ejemplo, Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79: 206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992), y los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 5.015.580 y 5.322.783. También se describen técnicas para acelerar el material genético revestido sobre micropartículas dirigidas en células, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 4.945.050 y 5.141.141. Otro método para administración física de ADN a plantas es la sonicación de células diana. Véase, por ejemplo, Zhang et al., Bio/Technology 9: 996 (1991). Como alternativa, para introducir vectores de expresión en plantas se ha usado fusión de liposomas o esferoplastos. Véase, por ejemplo, Deshayes et al., EMBO J., 4: 2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84: 3962 (1987). La absorción directa de ADN en protoplastos usando precipitación de CaCl2, inyección de ADN, alcohol polivinílico o poli-L-ornitina también se informado. Véase, por ejemplo, Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199: 161 (1985) y Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982). También se ha descrito la electroporación de protoplastos y células y tejidos completos. Véase, por ejemplo, Donn et al., en Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992); Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24: 51-61 (1994); Publicaciones de Solicitud Internacional N.ºs WO 87/06614, WO 92/09696, y WO 93/21335; y en los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 5.472.869 y 5.384.253. Otra tecnología de transformación incluye tecnología de partículas, véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 5.302,523 y 5.464.765.

Los cloroplastos o plástidos también se pueden transformar directamente. Como tal, se pueden producir plantas recombinantes en las que solamente se ha modificado el ADN de cloroplasto o plástido con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico y moléculas de ácido nucleico recombinante descritas anteriormente así como combinaciones de las mismas. En la técnica se conocen promotores que funcionan en cloroplastos o plástidos. Véase, por ejemplo, Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12: 67-70 (1987). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en las que se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 5.693.507 y 5.451.513.

También se puede usar cualquier otro método que proporcione una transformación eficaz.

En la técnica se conocen vectores adecuados para su uso en transformación de plantas. Véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N.ºs 6.495.738; 7.271.315; 7, 348,473; 7.355.100; 7.456.340; y referencias desveladas en los mismos.

Los vectores de expresión pueden incluir al menos un marcador genético, unido de forma operativa a un elemento regulador (un promotor, por ejemplo) que permite que las células transformadas que contienen el marcador se recuperen mediante selección negativa, es decir, que inhiben el crecimiento de las células que lo contienen el gen marcador seleccionable, o mediante selección positiva, es decir, identificando sistemáticamente el producto codificado por el marcador genético. Muchos genes marcadores seleccionables usados comúnmente para transformación de plantas se conocen bien en las técnicas de transformación, e incluyen, por ejemplo, genes que codifican enzimas que detoxifican por vía metabólica un agente químico selectivo que puede ser un antibiótico o un herbicida, o genes que codifican una diana alterada que es insensible al inhibidor. Los marcadores seleccionables adecuados para su uso en transformación de plantas incluyen, pero no se limitan a, el gen de aminoglicósido fosfotransferasa del transposón Tn5 (Aph II) que codifican resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina, y G418, así como esos genes que codifican resistencia o tolerancia a herbicidas glifosato, higromicina, metotrexato, fosfinotricina (bialophos), imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina, tales como clorsulfurón, bromoxinilo, dalapón, y similares. Un gen marcador seleccionable usado comúnmente para transformación de plantas es el gen de neomicina fosfotransferasa II (nptII) bajo el control de señales reguladoras de plantas que confiere resistencia a la kanamicina. Véase, por ejemplo, Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Otro gen de marcador seleccionable usado comúnmente es el gen de higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico higromicina. Véase, por ejemplo, Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985). Los genes de marcador seleccionable adicionales de origen bacteriano que confieren resistencia a antibióticos incluyen gentamicin acetil transferasa, estreptomicina fosfotransferasa, aminoglicósido-3'-adenil transferasa, y el determinante de resistencia a bleomicina. Véase, por ejemplo, Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986). Otros genes de marcador seleccionables confieren resistencia a herbicidas tales como glifosato, glufosinato, o bromoxinilo. Véase, por ejemplo, Comai et al., Nature 317: 741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) y Stalker et al., Science 242: 419-423 (1988). Otros genes de marcador seleccionables para transformación de plantas no son de origen bacteriano. Estos genes incluyen, por ejemplo, dihidrofolato reductasa de ratón, 5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa vegetal y acetolactato sintasa vegetal. Véase, por ejemplo, Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet.

13: 67 (1987), Shah et al., Science 233: 478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).

Un gen indicador se puede usar con o sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son genes que por lo general no están presentes en el organismo tejido del receptor y por lo general codifican proteínas que dan como resultado algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Véase, por ejemplo, K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics

22: 421 (1988). Los genes indicadores incluyen, pero no se limitan a genes de beta-glucuronidasa (GUS), betagalactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, proteína fluorescente de color verde, y luciferasa. Véase, por ejemplo, Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl.

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contenga una secuencia señal (también denominado péptido de tránsito de cloroplasto (CTP)) que dirige la proteína dirigida a cloroplasto. Las proteínas dirigidas a cloroplasto de este tipo se conocen bien en la técnica. Las proteínas dirigidas a cloroplasto se sintetizan como proteínas precursoras más grandes que contienen un CTP amino-terminal, que dirige el precursor a la maquinaria de importación de cloroplasto. Por lo general, los CTP se escinden con endoproteasas específicas situadas dentro del orgánulo del cloroplasto, liberando de ese modo la proteína madura dirigida, incluyendo proteínas activas tales como enzimas, del precursor en el medio del cloroplasto. Los ejemplos de secuencias que codifican péptidos adecuados para dirigir un gen o producto genético al cloroplasto o plástido o de la célula vegetal incluyen el CTP de EPSPS de petunia, el CTP2 e intrón de EPSPS de Arabidopsis, y otras secuencias conocidas en la técnica. Los ejemplos específicos de CTP incluyen, pero no se limitan a, el péptido de tránsito de ats1A de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato de Arabidopsis thaliana, un péptido de tránsito de EPSPS de Arabidopsis thaliana, y un péptido de tránsito de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa de maíz Zea. Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, en Van den Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985). Las secuencias de señal procariotas y eucariotas se desvelan, por ejemplo, en Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol.

36: 425 (1982). Los ejemplos adicionales de péptidos de tránsito que se pueden usar en la invención incluyen péptidos de tránsito de cloroplasto descritos en Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988); Chen y Jagendorf, J. Biol. Chem. 268: 23632367 (1993); un péptido de tránsito del gen rbcS de Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)); y un péptido de tránsito obtenido a partir de acil-ACP tioesterasa de Brassica napus (Loader et al., Plant Mol. Biol. 23: 769-778 (1993); Loader et al., Plant Physiol. 110: 336-336 (1995).

Las plantas modificadas genéticamente se prevé modificar adicionalmente para producir deleción o inactiva una ácido grasa sintasa endógena, para reducir la competición endógena con el sistema de PUFA sintasa exógena para malonil CoA, para aumentar el nivel de malonil CoA en el organismo, y combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Estados Unidos N.º 2007/0245431.

Una planta modificada genéticamente se puede cultivar en un medio de fermentación o puede crecer en un medio de adecuado tal como el suelo. Un medio de crecimiento adecuado para plantas superiores f incluye cualquier medio de crecimiento para plantas, tal como, pero no se limita a, suelo, arena, cualquier otro medio de partículas que soporten el crecimiento de la raíz (por ejemplo, vermiculita, perlita, etc.) o cultivo hidropónico así como luz, agua, y suplementos nutricionales adecuados que optimicen el crecimiento de la planta superior. Los PUFA se pueden recuperar de las plantas modificadas genéticamente a través de procesos de purificación que extraen los compuestos de la planta. Los PUFA se pueden recuperar cosechando la planta así como cosechando la aceite de la planta (por ejemplo, de las semillas oleaginosas). La planta también se puede consumir en su estado natural o procesar adicionalmente en productos consumibles. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una planta modificada genéticamente, en la que la planta produce al menos un PUFA como resultado de la modificación genética, y en la que el perfil de ácido graso total en la planta, o la parte de la planta que acumula los PUFA, comprende la cantidad detectable del PUFA producido como resultado de la modificación genética de la planta. En algunas realizaciones, la planta es una planta de semillas oleaginosas. En algunas realizaciones, la planta de semillas oleaginosas produce los PUFA en sus semillas maduras o contiene los PUFA en el aceite de sus semillas.

Para expresar proteína recombinante también se pueden usar diversos sistemas de cultivo de células de mamífero. Los vectores de expresión comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y receptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo en la posición 5'.

Métodos que implican expresión heteróloga

La presente invención se refiere a un método para producir al menos un PUFA que comprende la expresión de un sistema de PUFA sintasa en una célula hospedadora en condiciones eficaces para producir PUFA, en el que el sistema de PUFA sintasa comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas, en el que se produce al menos un PUFA. En algunas realizaciones, el al menos un PUFA incluye DHA, EPA, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula vegetal, una célula animal aislada, o una célula microbiana. En algunas realizaciones la célula hospedadora es un traustoquítrido.

La presente invención se refiere a un método para producir lípidos enriquecidos con DHA, EPA, o una combinación de los mismos, que comprende expresar un gen de PUFA sintasa en una célula hospedadora en condiciones eficaces para producir lípidos, en el que el gen de PUFA sintasa comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas en la célula hospedadora, en el que se producen lípidos enriquecidos con DHA, EPA,

o una combinación de los mismos.

La invención se refiere a un método para aislar lípidos a partir de una célula hospedadora, que comprende expresar un gen de PUFA sintasa en la célula hospedadora en condiciones eficaces para producir lípidos, y aislar lípidos a partir de la célula hospedadora, en el que el sistema de PUFA sintasa en la célula hospedadora comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en

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el presente documento así como combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, una o más fracciones lipídicas que contienen los PUFA se aíslan de las células hospedadoras. En algunas realizaciones, la una o más fracciones aisladas de la célula hospedadora incluyen la fracción total de ácido graso, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicérido, la fracción de ácido graso libre, la fracción de esterol, la fracción de diglicerol, la fracción de fosfolípido, o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los PUFA se aíslan de las células hospedadoras, en las que los PUFA están enriquecidos con ácidos grasos omega-3 ácidos, grasos omega-6, o combinaciones de los mismos basándose en la composición del sistema de PUFA sintasa introducido en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, dos PUFA están enriquecidos con DHA, EPA, DPA n-6, ARA, o combinaciones de los mismos basándose en la composición del sistema de PUFA sintasa introducido en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, los PUFA están enriquecidos con DHA, EPA, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA de los PUFA aislados de una célula hospedadora incluye concentraciones elevadas de DHA y concentraciones más bajas de EPA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA de los PUFA aislados de una célula hospedadora incluye concentraciones elevadas de DHA y EPA, y concentraciones más bajas de ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA de los PUFA aislados de una célula hospedadora incluye concentraciones elevadas de EPA y concentraciones más bajas de DHA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos.

La invención se refiere a un método para reemplazar una actividad de PUFA sintasa inactiva o con deleción, introducir una nueva actividad de PUFA sintasa, o mejorar una actividad de PUFA sintasa existente en un organismo que tiene actividad de PUFA sintasa, que comprende la expresión de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas en el organismo en condiciones eficaces para expresar la actividad de PUFA sintasa. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una o más secuencias de polinucleótido de PUFA sintasa de PFA1, PFA2, o PFA3 descritas en el presente documento que codifican uno o más dominios de PUFA sintasa. En algunas realizaciones, los perfiles de PUFA de los organismos se alteran mediante la introducción de la una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. En algunas realizaciones, los perfiles de PUFA alterados incluyen un aumento de ácidos grasos omega-3 y una disminución de ácidos grasos omega-6. En algunas realizaciones, los perfiles de PUFA alterados incluyen un aumento de ácidos grasos omega-6 y una disminución de ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, los ácidos grasos tanto omega-3 como omega-6 aumentan. En algunas realizaciones, la cantidad de DHA aumenta mientras que las cantidades de uno o más de t EPA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos se mantienen o disminuyen. En algunas realizaciones, las cantidades de EPA y DHA aumentan mientras que las cantidades de ARA, DPA n-6, o una combinación de los mismos se mantienen o disminuyen. En algunas realizaciones, la cantidad de EPA aumenta mientras que las cantidades de uno o más de EPA, ARA, DPA n-6, o combinaciones de los mismos se mantienen o disminuyen. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de PFA3 o uno o más dominios en la misma. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de PFA3 o uno o más dominios en la misma y la cantidad de ácidos grasos omega-3 en el organismo aumenta mientras que la cantidad de ácidos grasos omega-6 disminuye. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de PFA2 o uno o más dominios en la misma y la cantidad de DHA en el organismo aumenta mientras que la cantidad de EPA disminuye.

La invención se refiere a métodos para aumentar la producción de DHA, EPA, o una combinación de los mismos en un organismo que tiene actividad de PUFA sintasa, que comprende la expresión de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento así como combinaciones de las mismas en el organismo en condiciones eficaces para producir DHA, EPA, o una combinación de los mismos, en los que la actividad de PUFA sintasa reemplaza una actividad inactiva o con deleción, introduce una nueva actividad, o mejor a una actividad existente en el organismo, y en los que la producción de DHA, EPA, o una combinación de los mismos en el organismo aumenta.

Por lo general habiendo descrito la presente invención, se puede obtener una comprensión adicional por referencia a los ejemplos que se proporcionan en el presente documento. Estos ejemplos son solo para fines de ilustración y no pretenden ser limitantes.

EJEMPLO 1

Se diseñaron cebadores degenerados para los dominios de KS y DH de PUFA sintasa para aislar las secuencias correspondientes a partir del microorganismo aislado depositado con el N.º PTA-9695 de Registro en la ATCC, también conocido como cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.

Se diseñaron cebadores degenerados para la región de KS de f PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., (es decir, la región que contiene el dominio de KS) basándose en las secuencias publicadas de PFA1 (denominadas previamente orfA u ORF 1) para Shewanella japonica, la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), y ATCC 20892 de Thraustochytrium sp. 23B:

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prDS173 (directo): GATCTACTGCAAGCGCGGNGGNTTYAT (SEQ ID NO: 62), y

prDS174 (inverso): GGCGCAGGCGGCRTCNACNAC (SEQ ID NO: 63).

Se diseñaron cebadores degenerados para la región de DH de PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp. (denominado previamente orfC u ORF 3) basándose en las secuencias publicadas para Moritella marina; la cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.; SCRC-2738 de Shewanella sp.; Photobacter profundum; y23B ATCC 20892 de Thraustochytrium sp.:

JGM190 (directo): CAYTGGTAYTTYCCNTGYCAYTT (SEQ ID NO: 64); y

BLR242 (inverso): CCNGGCATNACNGGRTC (SEQ ID NO: 65).

Las condiciones de PCR con molde de ADN cromosómico fueron las que siguen a continuación: dNTPs 0,2 µM, 0,1 uM cada cebador, DMSO al 8 %, 200 ng de ADN cromosómico, 2,5 U de polimerasa de fusión Herculase® II (Stratagene), y 1X de tampón Herculase® (Stratagene) en un volumen total de 50 µl. El Protocolo de PCR incluía las siguientes etapas: (1) 98 ºC durante 3 minutos; (2) 98 ºC durante 30 segundos; (3) 50 ºC durante 30 segundos; (4) 72 ºC durante 2 minutos; (5) etapas 2-4 repetidas durante 40 ciclos; (6) 72 ºC durante 5 minutos; y (7) se mantiene a 6 ºC.

Para ambos pares de cebadores, la PCR proporcionó productos de ADN distintos con los tamaños esperados usando moldes cromosómicos a partir de la cepa de Schizochytrium sp., con N.º PTA-9695 de Registro en la ATCC. Los respectivos productos de PCR se clonaron en el vector pJET1.2/blunt (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la secuencia del inserto se determinó usando cebadores convencionales suministrados.

Las secuencias de ADN obtenidas a partir de los productos de PCR se compararon consecuencias conocidas disponibles a partir del GenBank de NCBI en una búsqueda de BLASTx convencional (parámetros de BLASTx: Filtro de baja complejidad activado; Matriz: BLOSUM62; Coste de hueco; Existence 11, Extenstion1. Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997), " Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.).

Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos deducida obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de KS de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad A de ácido graso poliinsaturado sintasa" (Identidad = 87 %; positivos = 92 %); Shewanella oneidensis MR-1 "beta-cetoacil sintasa de múltiples dominios" (Identidad = 49 %; positivos = 64 %); y Shewanella sp. MR-4 "beta-cetoacil sintasa" (Identidad = 49 %; positivos = 64 %).

Al nivel del aminoácido, las secuencias con el nivel de homología más elevado con respecto a la secuencia de aminoácidos deducida obtenida a partir del ADN clonado que contenía el fragmento de DH de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., fueron: cepa 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp., "subunidad C de ácido graso poliinsaturado sintasa " (Identidad = 61 %; positivos = 71 %); cepa 700345 de la ATCC de Shewanella pealeana "Beta-hidroxiacil-(proteína transportadora de acilo) deshidratasa FabA/FabZ" (Identidad = 35 %; positivos = 50 %); y Shewanella sedimines HAW-EB3 "PfaC de ácido graso poliinsaturado sintasa omega-3" (Identidad = 34 %; positivos = 50 %).

EJEMPLO 2

Los genes de PUFA sintasa se identificaron a partir de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.

El ADN genómico se preparó a partir del microorganismo mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. En resumen: (1) se sedimentaron 500 µl de células a partir del cultivo de logaritmo medio. Las células se volvieron a centrifugar, y todas las trazas de líquido se retiraron del sedimento celular con una punta de calibre pequeño; (2) los sedimentos se volvieron a suspender con 200 µl de tampón de lisis (Tris 20 mM a pH 8,0, 125 µg/ml de Proteinas K, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM a pH 8,0, SDS al 0,5 %); (3) las células se lisaron a 50 ºC durante 1 hora; (4) la mezcla de lisis se pipeteó en tubos de 2 ml de gel en fase de bloqueo (PLG -Eppendorf); (5) se añadió un volumen igual de P:C:I y se permitió la mezcla durante 1,5 horas; (6) los tubos se centrifugaron a 12k x g durante 5 minutos; (7) la fase acuosa se retiró del gel mencionado anteriormente dentro del tubo de PLG y se añadió un volumen igual de cloroformo a la fase acuosa, y se mezcló durante 30 minutos; (8) los tubos centrifugaron a 14k durante aproximadamente 5 minutos; (9) la fase superior (fase acuosa) se retiró mediante pipeteo del cloroformo, y se colocó en un nuevo tubo; (10) se añadieron 0,1 volúmenes de NaOAC 3 M se y se mezcló (se invirtió varias veces); (11) se añadieron 2 volúmenes de EtOH al 100 % y se mezcló (se invirtió varias veces) con precipitante de ADN genómico formándose en esta etapa; (12) los tubos se centrifugaron a 4 ºC en una microcentrifugadora a 14k durante aproximadamente 15 minutos; (13) el líquido se vertió suavemente con el ADN genómico restante en el fondo del tubo; (14) del sedimento se lavó con 0,5 ml de EtOH al

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La Tabla 2 muestra identidades para las secuencias de aminoácidos de Pfa1p (SEQ ID NO: 2), Pfa2p (SEQ ID NO: 4), y Pfa3p (SEQ ID NO: 6) de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., en comparación con secuencias de aminoácidos de PUFA sintasa publicadas previamente. Las identidades se determinaron a través del uso de la matriz de puntuación "blosum62mt2" dentro del programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de proteínas.

Tabla 2: Porcentaje de Identidad para Secuencias de Aminoácidos de Pfa1p, Pfa2p, y Pfa3p

Fuente de Secuencias de Pfa1p, Pfa2p, y Pfa3p Publicadas: % de Identidad de Pfa1p (OrfA) a Pfa1p publicadas (SEQ ID NO: 2) % de Identidad de Pfa2p (OrfB) a Pfa2p publicadas (SEQ ID NO: 4) % de Identidad de Pfa3p (OrfC) a Pfa3p publicadas (SEQ ID NO: 6)

ATCC 20888 de Schizochytrium sp.: 60 53 70

ATCC 34304 de Thraustochytrium aureum: 60 54 no publicado

23B ATCC 20892 de Thraustochytrium sp.: 52 52 70

EJEMPLO 3

10 El análisis de dominios se realizó para anotar las coordenadas de la secuencia para los dominios de PUFA sintasa y sitios activos de PFA1, PFA2, y PFA3 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp., respectivamente. Los dominios identificaron basándose en homología con respecto a dominios conocidos de PUFA sintasa, ácido graso sintasa, y policéptido sintasa.

15 La Tabla 3 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.

Tabla 3: Análisis de Dominio de PFA1 de la cepa PTA-9695 de la ATCC de Schizochytrium sp.

Dominio: Posición de ADN Posición de AA Sitios Posición de ADN Posición de AA

KS: 7-1401 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 7) 3-467 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 8) Activo -DXAC* (SEQ ID NO: 43) 607-609 de SEQ ID NO: 1 C203 de SEQ ID NO: 2

Terminal -GFGG (SEQ ID NO: 44): 1363-1374 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 45) 455-458 de SEQ ID NO: 2

MAT: 1798-2700 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 9) 600-900 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 10) GHS*LG Activo (SEQ ID NO: 46) 2095-2097 de SEQ ID NO: 1 S699 de SEQ ID NO: 2

ACP: 3298-5400 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 11) 1100-1800 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 12) Dominio de ACP1 3325-3600 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 13) 1109-1200 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 14)

ACP1 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 3454-3456 de SEQ ID NO: 1 S1152 de SEQ ID NO: 2

Dominio: Posición de ADN Posición de AA Dominio de ACP2 Sitios 3667-3942 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 15) Posición de ADN 1223-1314 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 16) Posición de AA

ACP2 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 3796-3798 de SEQ ID NO: 1 S1266 de SEQ ID NO: 2

Dominio de ACP3: 4015-4290 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 17) 1339-1430 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 18)

ACP3 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 4144-4146 de SEQ ID NO: 1 S1382 de SEQ ID NO: 2

Dominio de ACP4: 4363-4638 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 19) 1455-1546 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 20)

ACP4 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 4492-4494 de SEQ ID NO: 1 S1498 de SEQ ID NO: 2

Dominio de ACP5: 4711-4986 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 21) 1571-1662 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 22)

ACP5 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 4840-4842 de SEQ ID NO: 1 S1614 de SEQ ID NO: 2

Dominio de ACP6: 5053-5328 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 23) 1685-1776 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 24)

ACP6 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 5182-5184 de SEQ ID NO: 1 S1728 de SEQ ID NO: 2

KR: 5623-7800 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25) 1875-2600 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 26) "región núcleo" 5998-6900 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 48) 2000-2300 de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 49)

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Terminal -GFGG (SEQ ID NO: 44): 1351-1362 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 45) 451-454 de SEQ ID NO: 69

MAT: 1783-2703 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 76) 595-901 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 77) GHS*LG Activo (SEQ ID NO: 46) 2083-2085 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 116) S695 de SEQ ID NO: 69

ACP: 3208-6510 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 78) 1070-2170 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 77) Dominio de ACP1 3280-3534 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 80) 1094-1178 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 81)

ACP1 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 3403-3405 de SEQ ID NO: 68 S1135 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP2: 3607-3861 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 82) 1203-1287 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 83)

ACP2 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 3730-3732 de SEQ ID NO: 68 S1244 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP3: 3934-4185 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 84) 1312-1396 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 85)

ACP3 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 4057-4059 de SEQ ID NO: 68 S1353 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP4: 4261-4515 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 86) 1421-1505 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 87)

ACP4 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 4384-4386 de SEQ ID NO: 68 S1462 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP5: 4589-4842 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 88) 1530-1614 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 89)

imagen19 Dominio: imagen20Posición de ADN Posición de AA ACP5 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47) Sitios 4711-4713 de SEQ ID NO: 68 Posición de ADN S1571 de SEQ ID NO: 69 Posición de AA

Dominio de ACP6: 4915-5169 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 90) 1639-1723 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 91)

ACP6 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 5038-5040 de SEQ ID NO: 68 S1680 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP7: 5242-5496 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 92) 1748-1832 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 93)

ACP7 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 5365-5367 de SEQ ID NO: 68 S1789 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP8: 5569-5823 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 94) 1857-1941 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 95)

ACP8 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 5692-5694 de SEQ ID NO: 68 S1898 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP9: 5896-6150 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 96) 1966-2050 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 97)

ACP9 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 6019-6021 de SEQ ID NO: 68 S2007 de SEQ ID NO: 69

Dominio de ACP10: 6199-6453 de SEQ ID NO: 68 (SEQ ID NO: 98) 2067-2151 de SEQ ID NO: 69 (SEQ ID NO: 99)

ACP10 Activo LGIDS* (SEQ ID NO: 47): 6322-6324 de SEQ ID NO: 68 S2108 de SEQ ID NO: 69

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Dominio: Posiciones de ADN Posiciones de AA Sitios Posiciones de ADN Posiciones de AA

Terminal -GFGG (SEQ ID NO: 44): 1312-1323 de SEQ ID NO: 70 423-426 de SEQ ID NO: 71

CLF: 1378-2700 de SEQ ID NO: 70 (SEQ ID NO: 104) 460-900 de SEQ ID NO: 71 (SEQ ID NO: 105)

AT: 2848-4200 de SEQ ID NO: 70 (SEQ ID NO: 106) 950-1400 de SEQ ID NO: 71 (SEQ ID NO: 107) GxS*xG (SEQ ID NO: 52) 3361-3363 de SEQ ID NO: 70 S1121 de SEQ ID NO: 71

ER: 4498-5700 de SEQ ID NO: 70 (SEQ ID NO: 108) 1500-1900 de SEQ ID NO: 71 (SEQ ID NO: 109)

El primer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de KS. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de KS de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 102, que corresponde a las posiciones 10-1320 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de KS de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 103, que corresponde a las posiciones 4-440 de SEQ ID NO: 71. El dominio de KS contiene un motivo de sitio activo: DXAC* (SEQ ID NO: 43), con un *sitio de unión a acilo que corresponde a C191 de SEQ ID NO: 71. Además, un motivo característico está presente en el extremo del dominio de KS: GFGG (SEQ ID NO: 44), que corresponde a las posiciones 423-426 de SEQ ID NO: 71 y a las posiciones 1267-1278 de SEQ ID NO: 70.

El segundo dominio en Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de CLF. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de CLF de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 104, que corresponde a las posiciones 1378-2700 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de CLF de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 105, que corresponde a las posiciones 460-900 de SEQ ID NO: 71.

El tercer dominio en Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de AT. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica the el dominio de AT de Pfa2 de la cepa PTA10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 106, que corresponde a las posiciones 2848-4200 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de AT de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 107, que corresponde a las posiciones 950-1400 de SEQ ID NO: 71. El dominio de AT contiene un motivo de sitio activo de GxS*xG (SEQ ID NO: 50) que es característico de proteínas aciltransfersa (AT), con un resto de serina de sitio activo que corresponde a S1121 de SEQ ID NO: 71.

El cuarto dominio de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. es un dominio de ER. La secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia que codifica el dominio de ER de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 108, que corresponde a las posiciones 4498-5700 de SEQ ID NO: 70. La secuencia de aminoácidos que contiene el dominio de ER de Pfa2 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp. en el presente documento se representa como SEQ ID NO: 109, que corresponde a las posiciones 1500-1900 de SEQ ID NO: 71.

La Tabla 11 muestra los dominios y los sitios activos asociados con PFA3 de la cepa PTA-10212 de la ATCC de Thraustochytrium sp.

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Claims

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