JP7039625B2 - Ｄｈａおよびｅｐａを生産する細菌、細菌のゲノムの６つの遺伝子断片およびそれらの使用 - Google Patents

Ｄｈａおよびｅｐａを生産する細菌、細菌のゲノムの６つの遺伝子断片およびそれらの使用 Download PDF

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Description

CGMCC 13746
本発明は、産業用の微生物、食品、および飼料の産業の分野に、特に、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡを生産する細菌の株、細菌ゲノム内の６つの遺伝子断片、ならびにそれらの応用に関するものであり、ここで、６つの遺伝子断片もまた、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡ合成に関連する。
ポリ不飽和脂肪酸は、１８～２２炭素原子の炭素鎖長を典型的に有する、２つまたはそれより多くの二重結合を含有する直鎖脂肪酸のクラスである。二重結合の位置に従って、ポリ不飽和脂肪酸をω－３およびω－６に分けることができる。カルボキシル基から最も遠い末端にある二重結合が末端から３番目の炭素原子上にあるポリ不飽和脂肪酸分子は、ω－３と呼ばれる。カルボキシル基から最も遠い末端にある二重結合が末端から６番目の炭素原子上にあるポリ不飽和脂肪酸分子は、ω－６と呼ばれる。ポリ不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などを主に含む、ヒトの体内における必須脂肪酸のクラスである。
ＤＨＡは、ポリ不飽和脂肪酸の最も重要なクラスである。分子構造では、ＤＨＡは、２２の炭素原子および６つの二重結合を含有する直鎖脂肪酸である。その最初の二重結合が脂肪酸鎖のメチル末端の３番目の炭素原子上にあるため、ＤＨＡは、ω－３シリーズの脂肪酸（ＯＭＥＧＡ－３）に属する。ＤＨＡはヒトの身体の脳および網膜において主に見られ、神経系の発生の促進、網膜機能の向上、視力の向上、心血管疾患の予防、心血管疾患の処置、炎症への抵抗、およびアレルギー反応の抑制などの、重要な生理学的機能を有する。ヒトの身体自体は十分なＤＨＡを合成できないため、ＤＨＡは、食品の摂取によって主に得られる。ＤＨＡは日々の食事では不十分であることが多いため、食品または粉ミルクにＤＨＡを補充することまたはＤＨＡを添加することは、ヒト、特に、乳児および高齢者にとって重要である。
現在のところ、ＤＨＡを生産するための２つの主な方法がある。１つは、海水魚（マス、サバ、サケ、およびイワシを主に含む）の組織から抽出される従来のＤＨＡの供給源であるが、抽出によって得られる魚油の質は、魚の種、季節、および漁場の変化に影響され、また、魚油の質は、漁業資源が不足してきていることおよび環境汚染の影響も受ける。他方は、ＤＨＡの発酵生産に海洋微生物を使用する、新たに出現してきているＤＨＡ生産方法であり、この方法は、短期間である、客観的条件に影響されない、魚臭さがないなどの利点を有し、大きな将来性を有する。ＤＨＡの発酵生産に使用される海洋微生物は、主にＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍである。しかし、ＤＨＡの発酵生産に現在使用されているＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍは、それ自体の総脂肪酸含有量、ＤＨＡ含有量、成長速度、および他の技術的指標に限りがあり、収量をさらに増大させることおよびコストを削減することができない。
ＤＨＡ生産株において、ＤＨＡ生合成経路は、関連する同化作用経路における一連の酵素によって触媒される。ＤＨＡ生合成経路に関連する遺伝子の穿孔、形質転換、および異種発現は、ＤＨＡの収量をさらに増大させるために好都合な条件をもたらす。したがって、ＤＨＡ生合成経路における新規な鍵となる遺伝子を得ることは、ＤＨＡ生産株の修飾およびプロセス最適化を容易にする。以下の２つのＤＨＡ合成経路が天然に存在する：（１）脂肪酸合成経路に基づき、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用によってＤＨＡをさらに合成する伸長－不飽和化経路（Ｅ－Ｄ経路）、（２）主にポリケチドシンターゼの作用下でＤＨＡを合成するための前駆体としてアセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを使用するポリケチドシンターゼ経路（ＰＫＳ経路）。これらのうち、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍでは、ＤＨＡの合成は主にＰＫＳ経路を採用している。現在、ＤＰＡおよびＥＰＡの合成もまた、Ｅ－Ｄ経路およびＰＫＳ経路を有すると考えられている。
本発明の目的は、ＤＰＡおよび／またはＥＰＡを調製することである。
本発明は、第１に、以下の（Ｘ１）または（Ｘ２）または（Ｘ３）または（Ｘ４）であり得る、ＤＰＡおよび／またはＥＰＡを調製するためのタンパク質の組み合わせを保護する：
（Ｘ１）タンパク質１、タンパク質２、タンパク質３、タンパク質４、タンパク質５、およびタンパク質６を含む、タンパク質の組み合わせ、
（Ｘ２）タンパク質１、タンパク質２、タンパク質３、タンパク質４、タンパク質５、およびタンパク質６からなる、タンパク質の組み合わせ、
（Ｘ３）タンパク質１、タンパク質２、タンパク質３、タンパク質４、タンパク質５、およびタンパク質６のいずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、またはいずれか５つからなる、タンパク質の組み合わせ、
（Ｘ４）タンパク質１、タンパク質２、タンパク質３、タンパク質４、タンパク質５、またはタンパク質６。
タンパク質１は、ａ１）またはａ２）またはａ３）またはａ４）またはａ５）であり得る：
ａ１）配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
ａ２）タグを配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
ａ３）配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
ａ４）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
ａ５）配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
タンパク質２は、ｂ１）またはｂ２）またはｂ３）またはｂ４）またはｂ５）であり得る：
ｂ１）配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｂ２）タグを配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
ｂ３）配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
ｂ４）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
ｂ５）配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
タンパク質３は、ｃ１）またはｃ２）またはｃ３）またはｃ４）またはｃ５）であり得る：
ｃ１）配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｃ２）タグを配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
ｃ３）配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
ｃ４）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
ｃ５）配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
タンパク質４は、ｄ１）またはｄ２）またはｄ３）またはｄ４）またはｄ５）であり得る：
ｄ１）配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｄ２）タグを配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
ｄ３）配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
ｄ４）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
ｄ５）配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
タンパク質５は、ｅ１）またはｅ２）またはｅ３）またはｅ４）またはｅ５）であり得る：
ｅ１）配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｅ２）タグを配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
ｅ３）配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
ｅ４）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
ｅ５）配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
タンパク質６は、ｆ１）またはｆ２）またはｆ３）またはｆ４）またはｆ５）であり得る：
ｆ１）配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
ｆ２）タグを配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
ｆ３）配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
ｆ４）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
ｆ５）配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
ここで、配列表の配列番号９は６６９のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号１０は１１９３のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号１１は７７３のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号１２は２１８９のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号１３は１６７２のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号１４は２１のアミノ酸残基からなる。
ａ１）のタンパク質の精製を容易にするために、表１に示すタグを、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。ｂ１）のタンパク質の精製を容易にするために、表１に示すタグを、配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。ｃ１）のタンパク質の精製を容易にするために、表１に示すタグを、配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。ｄ１）のタンパク質の精製を容易にするために、表１に示すタグを、配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。ｅ１）のタンパク質の精製を容易にするために、表１に示すタグを、配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。ｆ１）のタンパク質の精製を容易にするために、表１に示すタグを、配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。
Figure 0007039625000001
上記のａ３）のタンパク質１、上記のｂ３）のタンパク質２、上記のｃ３）のタンパク質３、上記のｄ３）のタンパク質４、上記のｅ３）のタンパク質５、および上記のｆ３）のタンパク質６に関して、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加は、１０以下のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または付加である。
上記ａ３）のタンパク質１、上記のｂ３）のタンパク質２、上記のｃ３）のタンパク質３、上記のｄ３）のタンパク質４、上記のｅ３）のタンパク質５、および上記のｆ３）のタンパク質６は全て、人工的に合成することができるか、または、それらのコード遺伝子を合成し、次いで生物学的発現を行うことによって得ることができる。
上記のａ３）のタンパク質１のコード遺伝子は、配列表の配列番号９で示されるＤＮＡ配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに／または１つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに／または表１に示すタグのコード配列をその５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
上記のｂ３）のタンパク質２のコード遺伝子は、配列表の配列番号１０で示されるＤＮＡ配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに／または１つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに／または表１に示すタグのコード配列をその５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
上記のｃ３）のタンパク質３のコード遺伝子は、配列表の配列番号１１で示されるＤＮＡ配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに／または１つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに／または表１に示すタグのコード配列をその５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
上記のｄ３）のタンパク質４のコード遺伝子は、配列表の配列番号１２で示されるＤＮＡ配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに／または１つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに／または表１に示すタグのコード配列をその５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
上記のｅ３）のタンパク質５のコード遺伝子は、配列表の配列番号１３で示されるＤＮＡ配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに／または１つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに／または表１に示すタグのコード配列をその５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
上記のｆ３）のタンパク質６のコード遺伝子は、配列表の配列番号１４で示されるＤＮＡ配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに／または１つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに／または表１に示すタグのコード配列をその５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
上記で使用する場合、用語「同一性」は、ネイティブのアミノ酸配列に対する配列類似性を指す。「同一性」は、本発明によって提供されるタンパク質のアミノ酸配列と８０％、または８５％もしくはそれを超える、または９０％もしくはそれを超える、または９５％もしくはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む。
タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子もまた、本発明の範囲内である。
タンパク質１をコードする核酸分子は、以下のＡ１）またはＡ２）またはＡ３）またはＡ４）で示されるＤＮＡ分子であり得る：
Ａ１）そのコード領域が配列表の配列番号３の５’末端から１０４４～３０５０位で示される、ＤＮＡ分子、
Ａ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号３で示される、ＤＮＡ分子、
Ａ３）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、タンパク質１をコードする、Ａ１）またはＡ２）によって規定されるヌクレオチド配列と７５％またはそれを超える同一性を有するＤＮＡ分子、
Ａ４）ストリンジェントな条件下でＡ１）またはＡ２）によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質１をコードするＤＮＡ分子。
タンパク質２をコードする核酸分子は、以下のＢ１）またはＢ２）またはＢ３）またはＢ４）で示されるＤＮＡ分子であり得る：
Ｂ１）そのコード領域が配列表の配列番号４の５’末端から１０６８～２７３７位および３２５４～５１６２位で示される、ＤＮＡ分子、
Ｂ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号４で示される、ＤＮＡ分子、
Ｂ３）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、タンパク質２をコードする、Ｂ１）またはＢ２）によって規定されるヌクレオチド配列と７５％またはそれを超える同一性を有するＤＮＡ分子、
Ｂ４）ストリンジェントな条件下でＢ１）またはＢ２）によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質２をコードするＤＮＡ分子。
タンパク質３をコードする核酸分子は、以下のＣ１）またはＣ２）またはＣ３）またはＣ４）で示されるＤＮＡ分子であり得る：
Ｃ１）そのコード領域が配列表の配列番号５の５’末端から１０９４～３４１５位で示される、ＤＮＡ分子、
Ｃ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号５で示される、ＤＮＡ分子、
Ｃ３）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、タンパク質３をコードする、Ｃ１）またはＣ２）によって規定されるヌクレオチド配列と７５％またはそれを超える同一性を有するＤＮＡ分子、
Ｃ４）ストリンジェントな条件下でＣ１）またはＣ２）によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質３をコードするＤＮＡ分子。
タンパク質４をコードする核酸分子は、以下のＤ１）またはＤ２）またはＤ３）またはＤ４）で示されるＤＮＡ分子であり得る：
Ｄ１）そのコード領域が配列表の配列番号６の５’末端から１４０９～５０４４位、７００４～７２３４位、および７７００～１０３９９位で示される、ＤＮＡ分子、
Ｄ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号６で示される、ＤＮＡ分子、
Ｄ３）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、タンパク質４をコードする、Ｄ１）またはＤ２）によって規定されるヌクレオチド配列と７５％またはそれを超える同一性を有するＤＮＡ分子、
Ｄ４）ストリンジェントな条件下でＤ１）またはＤ２）によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質４をコードするＤＮＡ分子。
タンパク質５をコードする核酸分子は、以下のＥ１）またはＥ２）またはＥ３）またはＥ４）で示されるＤＮＡ分子であり得る：
Ｅ１）そのコード領域が配列表の配列番号７の５’末端から１４７３～６４８８位で示される、ＤＮＡ分子、
Ｅ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号７で示される、ＤＮＡ分子、
Ｅ３）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、タンパク質５をコードする、Ｅ１）またはＥ２）によって規定されるヌクレオチド配列と７５％またはそれを超える同一性を有するＤＮＡ分子、
Ｅ４）ストリンジェントな条件下でＥ１）またはＥ２）によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質５をコードするＤＮＡ分子。
タンパク質６をコードする核酸分子は、以下のＦ１）またはＦ２）またはＦ３）またはＦ４）で示されるＤＮＡ分子であり得る：
Ｆ１）そのコード領域が配列表の配列番号８の５’末端から９５３～９９１位および１０６３～１０９０位で示される、ＤＮＡ分子、
Ｆ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号８で示される、ＤＮＡ分子、
Ｆ３）Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来し、タンパク質６をコードする、Ｆ１）またはＦ２）によって規定されるヌクレオチド配列と７５％またはそれを超える同一性を有するＤＮＡ分子、
Ｆ４）ストリンジェントな条件下でＦ１）またはＦ２）によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質６をコードするＤＮＡ分子。
ここで、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または組換えＤＮＡなどのＤＮＡであり得、核酸分子はまた、ｍＲＮＡまたはｈｎＲＮＡなどのＲＮＡでもあり得る。核酸分子は、タンパク質の組み合わせおよびその調節配列をコードする遺伝子によって形成される核酸分子であり得る。
ここで、配列表の配列番号３は４１００のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号３で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号４は６２００のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号４で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号５は４５００のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号５で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号６は１１１００のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号６で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号７は７７６７のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号７で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号８は７８００のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号８で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードする。
当業者であれば、指向性進化法および点変異法などの公知の方法を使用して、本発明のタンパク質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を容易に変異させることができる。本発明のタンパク質の組み合わせのヌクレオチド配列に対して７５％またはそれを超える相同性を有する、これらの人工的に修飾されたヌクレオチドは全て、それらがタンパク質の組み合わせをコードし、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来する限り、本発明のヌクレオチド配列に由来するものであり、本発明の配列に同一である。本明細書において使用する用語「同一性」は、ネイティブの核酸配列に対する配列類似性を指す。「同一性」は、本発明のタンパク質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列と７５％もしくはそれを超える、８０％もしくはそれを超える、または８５％もしくはそれを超える、または９０％もしくはそれを超える、または９５％もしくはそれを超える同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
核酸分子を含有する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物、またはトランスジェニック細胞系もまた、本発明の保護範囲内にある。
組換えベクターは、タンパク質１をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号３で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質２をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号４で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質３をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号５で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質４をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号６で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質５をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号７で示されるＤＮＡ分子）、およびタンパク質６をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号８で示されるＤＮＡ分子）を出発プラスミド内に挿入することによって得られる組換えプラスミドであり得る。
組換え微生物は、組換えベクターを出発微生物内に導入することによって得ることができる。出発微生物は、酵母、細菌、藻類、または真菌であり得る。真菌は、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍであり得る。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍは、具体的には、株Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ Ｈｏｎｄａ ｅｔ Ｙｏｋｏｃｈｉ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１であり得る。組換え微生物は、具体的には、実施例で言及されるＧＳ－Ｃ０６株であり得る。
ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの生産における、上記のうちのいずれか１つに従ったタンパク質の組み合わせ、または上記のうちのいずれか１つに従った核酸分子、または上記のうちのいずれか１つに従った核酸分子を含有する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物、もしくはトランスジェニック細胞系の使用もまた、本発明の保護範囲内である。
本発明はまた、組換え株Ｂを保護し、その調製方法は、以下の通りであり得る：出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させて、組換え株、すなわち、組換え株Ｂを得ること。「出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる」ステップは、タンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる物質を出発株に導入することによって実現される。「タンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる物質を出発株に導入する」ステップは、タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子を出発株に導入することによって実現される。出発株は、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍであり得る。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍは、具体的には、株Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ Ｈｏｎｄａ ｅｔ Ｙｏｋｏｃｈｉ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１であり得る。
組換え株Ｂは、具体的には、実施例で言及されるＧＳ－Ｃ０６株であり得る。
本発明は、以下のステップを順に含み得る、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡを生産する方法をさらに保護する：
（１）出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させて、組換え株Ａを得るステップであって、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡを生産する組換え株Ａの能力が、出発株と比較して向上する、ステップ、
（２）組換え株Ａを発酵させて、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡを得るステップ。
上記の方法において、組換え株Ａは組換え株Ｂであり得る。
上記の方法において、「出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させて、組換え株Ａを得る」ステップは、タンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる物質を出発株に導入することによって実現される。
上記の方法において、「タンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる物質を出発株に導入する」ステップは、タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子を出発株に導入することによって実現される。
上記の方法において、出発株は、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍであり得る。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍは、具体的には、株Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ Ｈｏｎｄａ ｅｔ Ｙｏｋｏｃｈｉ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１であり得る。
上記の方法において、組換え株Ａは、具体的には、実施例で言及されるＧＳ－Ｃ０６株であり得る。
上記において、「タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子を出発株に導入する」ステップは、組換えベクターを出発株に導入することによって実現することができ、組換えベクターは、タンパク質１をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号３で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質２をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号４で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質３をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号５で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質４をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号６で示されるＤＮＡ分子）、タンパク質５をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号７で示されるＤＮＡ分子）、およびタンパク質６をコードする核酸分子（すなわち、配列表の配列番号８で示されるＤＮＡ分子）を発現ベクター内に挿入することによって得られる組換えプラスミドであり得る。
本発明は、ドコサヘキサエン酸および／またはＥＰＡを生産する細菌の株をさらに保護し、この株は、中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心での受託番号ＣＧＭＣＣ第１３７４６号を有するＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１である。
本発明は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または上記のうちのいずれか１つに従った組換え株Ｂを含む微生物剤をさらに提供する。
ドコサヘキサエン酸および／またはＥＰＡの生産における、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または上記のうちのいずれか１つに従った組換え株Ｂ、または微生物剤の使用もまた、本発明の保護範囲内である。
本発明は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または上記のうちのいずれか１つに従った組換え株Ｂを発酵させて、ドコサヘキサエン酸および／またはＥＰＡを得るステップを含む、ドコサヘキサエン酸および／またはＥＰＡを生産する方法をさらに保護する。
上記の方法において、発酵培養において使用される発酵培地溶質およびその溶解度は、グルコース２０～１２０ｇ／Ｌ（２０～６０ｇ／Ｌ、６０～１２０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、または１２０ｇ／Ｌなど）、グルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム５～１５ｇ／Ｌ（５～１０ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌなど）、コーンシロップ乾燥粉末３～１５ｇ／Ｌ（３～１０ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌなど）、Ｎａ２ＳＯ４ ５～２４ｇ／Ｌ（５～１４ｇ／Ｌ、１４～２４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、または２４ｇ／Ｌなど）、ＫＣｌ ０．１～１．０ｇ／Ｌ（０．１～０．５ｇ／Ｌ、０．５～１．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、または１．０ｇ／Ｌなど）、ＭｇＳＯ４ １．０～３．０ｇ／Ｌ（１．０～２．０ｇ／Ｌ、２．０～３．０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、または３．０ｇ／Ｌなど）、Ｋ２ＳＯ４ ０．３～１．５ｇ／Ｌ（０．３～１．０ｇ／Ｌ、１．０～１．５ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌなど）、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５～１．５ｇ／Ｌ（０．５～１．０ｇ／Ｌ、１．０～１．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌなど）、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５～１．５ｇ／Ｌ（０．５～１．０ｇ／Ｌ、１．０～１．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌなど）、ＣａＣｌ２ ０．１～１．０ｇ／Ｌ（０．１～０．５ｇ／Ｌ、０．５～１．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、または１．０ｇ／Ｌなど）であり得、溶媒は水であり得、ｐＨは、５．０～６．５（５．０、６．０、または６．５など）の範囲であり得る。発酵培地は、具体的には、６０ｇのグルコース、１０ｇのグルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム、１０ｇのコーンシロップ乾燥粉末、１４ｇのＮａ２ＳＯ４、０．５ｇのＫＣｌ、２．０ｇのＭｇＳＯ４、１．０ｇのＫ２ＳＯ４、１．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および０．５ｇのＣａＣｌ２が１Ｌの蒸留水中に溶解され、ｐＨが６．０に調整されているものであり得る。
上記の方法において、発酵培養における最初のバイオマスは、１．０×１０８～２．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ（１．０×１０８～１．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１．５×１０８～２．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、または２．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬなど）であり得る。
上記の方法において、発酵培養における最初のバイオマスは、５．０×１０８～３．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ（５．０×１０８～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１．０×１０９～３．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ、５．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ、または３．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬなど）であり得る。
上記の方法において、発酵培養の接種材料は、３～１０％（３～５％、５～１０％、３％、５％、または１０％など）であり得る。
上記の方法において、発酵培養の培養条件は、２２～２８℃（２２～２５℃、２５～２８℃、２２℃、２５℃、または２８℃など）で７２～１２０時間（７２～１００時間、１００～１２０時間、７２時間、１００時間、または１２０時間など）であり得、溶存酸素濃度は、５～８０％（５～５０％、５０～８０％、５％、５０％、または８０％など）である。
上記の方法において、「Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または上記のうちのいずれか１つに従った組換え株Ｂを発酵させること」は、一次シード培養ブロスを調製すること、および／または二次シードブロスを調製すること、および／または発酵した一次シードブロスを調製すること、および／または発酵した二次シードブロスを調製することをさらに含み得る。
一次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る：Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または上記のうちのいずれか１つに従った組換え株Ｂを振とうフラスコ培養して、一次シードブロスを得ること；
二次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る：一次シードブロスを振とうフラスコ培養して、二次シードブロスを得ること；
発酵した一次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る：二次シードブロスを発酵させて、発酵した一次シードブロスを得ること；
発酵した二次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る：発酵した一次シードブロスを発酵させて、発酵した二次シードブロスを得ること。
一次シードブロスの調製および二次シードブロスの調製において、振とうフラスコ培養において使用される振とうフラスコ培地溶質およびその溶解度は、グルコース１０～９０ｇ／Ｌ（１０～５０ｇ／Ｌ、５０～９０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、または９０ｇ／Ｌなど）、酵母粉末５～２５ｇ／Ｌ（５～１５ｇ／Ｌ、１５～２５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、または２５ｇ／Ｌなど）であり得、溶媒は水であり得、ｐＨは自然のものであり得る。「振とうフラスコ培養」の培養条件は、２２～２８℃（２２～２５℃、２５～２８℃、２２℃、２５℃、または２８℃など）で、１５０～２５０ｒｐｍ／分（１５０～２００ｒｐｍ／分、２００～２５０ｒｐｍ／分、１５０ｒｐｍ／分、２００ｒｐｍ／分、または２５０ｒｐｍ／分など）で２４～４８時間（２４～３６時間、３６～４８時間、２４時間、３６時間、または４８時間など）、培養することである。振とうフラスコ培養の接種材料の量は、３～１０％（３～５％、５～１０％、３％、５％、または１０％など）である。振とうフラスコ培地は、具体的には、５０ｇのグルコースおよび１５ｇの酵母粉末が１Ｌの蒸留水に溶解され、ｐＨが自然のものであり得る。
発酵した一次シードブロスの調製および発酵した二次シードブロスの調製において、発酵培養で使用されるシード培地溶質およびその溶解度は、グルコース２０～１００ｇ／Ｌ（２０～６０ｇ／Ｌ、６０～１２０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、または１２０ｇ／Ｌなど）、酵母粉末５～１５ｇ／Ｌ（５～１０ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌなど）、Ｎａ２ＳＯ４ ５～２４ｇ／Ｌ（５～１０ｇ／Ｌ、１０～２４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、または２４ｇ／Ｌなど）、ＫＣｌ ０．１～１．０ｇ／Ｌ（０．１～０．５ｇ／Ｌ、０．５～１．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、または１．０ｇ／Ｌなど）、ＭｇＳＯ４ １．０～３．０ｇ／Ｌ（１．０～２．０ｇ／Ｌ、２．０～３．０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、または３．０ｇ／Ｌなど）、Ｋ２ＳＯ４ ０．３～１．５ｇ／Ｌ（０．３～１．０ｇ／Ｌ、１．０～１．５ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌなど）、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５～１．５ｇ／Ｌ（０．５～１．０ｇ／Ｌ、１．０～１．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌなど）、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５～１．５ｇ／Ｌ（０．５～１．０ｇ／Ｌ、１．０～１．５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、または１．５ｇ／Ｌなど）、ＣａＣｌ２ ０．１～１．０ｇ／Ｌ（０．１～０．５ｇ／Ｌ、０．５～１．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、または１．０ｇ／Ｌなど）であり得、溶媒は水であり得、ｐＨは５．０～６．５（５．０、６．０、または６．５など）であり得る。「発酵培養」の培養条件は、２２～２８℃（２２～２５℃、２５～２８℃、２２℃、２５℃、または２８℃など）で２４～４８時間（２４～３６時間、３６～４８時間、２４時間、３６時間、または４８時間など）培養することであり、溶存酸素濃度は、１０～８０％（１０～５０％、５０～８０％、１０％、５０％、または８０％など）である。発酵培養の接種材料の量は、３～１０％（３～５％、５～１０％、３％、５％、または１０％など）である。シード培地は、具体的には、６０ｇのグルコース、１０ｇの酵母粉末、１０ｇのＮａ２ＳＯ４、０．５ｇのＫＣｌ、２．０ｇのＭｇＳＯ４、１．０ｇのＫ２ＳＯ４、１．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および０．５ｇのＣａＣｌ２を１Ｌの蒸留水に溶解し、ｐＨが６．０に調整されているものであり得る。
発酵ブロスは、上記のうちのいずれか１つに従ったＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１または組換え細菌Ｂを発酵させることによって得られる。結果は、ＤＨＡが発酵ブロス中の油脂の４５．０％～６０．０％を占め、ＥＰＡが油脂の０．２％～１．０％を占めることを示す。
したがって、本発明によって提供されるＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の使用は、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡを生産し得、重要な応用価値を有する。本発明によって提供される、ＤＨＡおよびＥＰＡ合成に関連する遺伝子断片のセットは、遺伝子断片１から遺伝子断片６からなり、それらのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３から配列番号８で順に示される。実験は、遺伝子断片１から遺伝子断片６がＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＭＹＡ－１３８１に導入されて、組換え株が得られ、ＤＨＡおよびＥＰＡを生産する組換え株の能力が大きく増強されていることを示している。したがって、本発明によって提供される６つの遺伝子断片、これらの６つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質、およびこれらの６つの遺伝子断片を含有するベクター、細胞、または生物は、ＤＨＡおよびＥＰＡの生産において重要な応用価値を有する。
図１は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のコロニー形態学的特徴を示す図である。 図２は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の株の形態学的特徴を示す図である。
寄託の説明
株の名称：Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ
学名：Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ
株番号：ＨＳ０１
寄託機関：中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心
寄託機関の略記：ＣＧＭＣＣ
住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号
寄託日：２０１７年３月１０日
保蔵中心における受託番号：ＣＧＭＣＣ第１３７４６号
本発明の詳細な説明
本発明を、具体的な実施形態を参照して、さらに以下に詳細に記載する。実施例は、本発明を説明するためのみに提供されており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
以下の実施例における実験方法は、別段の特定がない限り、従来の方法である。
以下の実施例において使用される材料、試薬などは、別段の特定がない限り、市販されている。
以下の実施例における全ての定量的試験で、３回の反復実験を設定し、結果を平均した。
以下の実施例において使用する培地は、以下の通りである。
麦汁寒天培地：１５０ｇの麦芽抽出粉末を１Ｌの混合溶液（１容量部の天然海水および１容量部の蒸留水を混合することによって形成される）中に溶解し、ｐＨは自然のものであり、次いで、寒天粉末を１００ｍＬ当たり１５ｇの濃度まで添加して、培地を得た。
スクリーニング用液体培地：５０ｇのグルコースおよび１５ｇの酵母粉末を１Ｌの混合物（１容量部の天然海水および１容量部の蒸留水を混合することによって形成される）中に溶解し、ｐＨは自然のものである。
スクリーニング用固体培地：寒天粉末をスクリーニング用液体培地に１００ｍＬ当たり１５ｇの濃度まで添加して、培地を得た。
スクリーニング用プレート：固体プレートを、約５５℃のスクリーニング用固体培地を培養皿に注ぎ、冷却することによって調製した。
振とうフラスコ培地：５０ｇのグルコースおよび１５ｇの酵母粉末を１Ｌの蒸留水に溶解し、ｐＨは自然のものであった。
シード培地：グルコース６０ｇ、酵母粉末１０ｇ、Ｎａ２ＳＯ４ １０ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ２．０ｇ、Ｋ２ＳＯ４ １．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０ｇ、およびＣａＣｌ２ ０．５ｇを１Ｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを６．０に調整した。
発酵培地：グルコース６０ｇ、グルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム１０ｇ、コーンシロップ乾燥粉末１０ｇ、Ｎａ２ＳＯ４ １４ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ２．０ｇ、Ｋ２ＳＯ４ １．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０ｇ、およびＣａＣｌ２ ０．５ｇを１Ｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを６．０に調整した。
コーンシロップ乾燥粉末は、Ｓｏｌａｒｂｉｏ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳの製品であり、カタログ番号はＦＡ００１０である。酵母粉末は、Ａｎｇｅｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．の製品であり、カタログ番号はＬＭＯ２である。酵母ゲノム抽出キットは、ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．の製品であり、カタログ番号はＤＰ３０７である。高忠実度ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈの製品であり、カタログ番号はＡＰ２２１である。アガロースゲルＤＮＡ回収キットは、ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．の製品であり、カタログ番号はＤＰ２１０である。ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔベクターは、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈの製品であり、カタログ番号はＣＢ３０１－０１である。
株Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ Ｈｏｎｄａ ｅｔ Ｙｏｋｏｃｈｉ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、住所：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ）に寄託されており、一般人は、この株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手することができる。株Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ Ｈｏｎｄａ ｅｔ Ｙｏｋｏｃｈｉ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１は、以下、簡単に、ＭＹＡ－１３８１と呼ぶ。
（実施例１：Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号の単離、同定、および寄託）
Ｉ． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の単離
１．本出願発明者らは、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍを、福建省ショウ州市雲霄県のマングローブ内の複数の場所から集め、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍを混合して混合溶液を得た。０．５ｍＬの混合溶液を５ｍＬのスクリーニング用液体培地に接種し、次いで、２５℃、２００ｒｐｍ／分で２日間培養した後、培養ブロスを得た。
２．ステップ１で得た培養ブロスをスクリーニング用プレート上に均一に広げ、２５℃で２日間、静止培養して、単一コロニーを得た。
３．ステップ２が完了した後、単一コロニーをつまみ取り、５ｍＬの発酵培地に接種し、次いで、２５℃、２００ｒｐｍ／分で２日間培養して、培養ブロスを得た。
４．ステップ３で得た培養ブロスを４℃、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、細胞を回収した。
５． １．０～２．０ｇの細胞を、プラグを有するメスシリンダー（仕様：１００ｍＬ）に入れ、８．３ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ水溶液１５ｍＬをまず添加し、蓋を覆い、メスシリンダーを７０～８０℃の水浴中に置き、５０～６０分加水分解した（この間、プラグを有するメスシリンダーを１０分間に１回、ボルテックスミキサーで振とうする）。室温に冷却した後、１０ｍＬの９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液をまず添加し、十分に一様に振とうした後、２０ｍＬの無水エーテルをさらに添加して、１～２分間、十分な振とうおよび抽出を行い、最後に、２０ｍＬの石油エーテルを添加した。混合物を、１～２分間、十分な振とうおよび抽出を行い、静置して層状化させた。上方の有機相をガラス製の秤量皿（これは乾燥しており、空の重量を秤量している）に置いた。ガラス製の秤量皿を、沸騰している水浴中の換気フードの中に置いて、有機相を完全に蒸発させ（完全に蒸発させなくてはならない）、液相は油脂であった。
６．ステップ５で抽出した油脂を取り、ＧＢ２６４００－２０１１食品安全国家基準に従ってＤＨＡ含有量を試験し、ＡＯＡＣ９９６．０６の方法に従って脂肪酸の組成および含有量を試験した。
ＤＨＡ含有量がより高い株を選択し、２４回繰り返し精製した。スクリーニングしたＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ株の１つを、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１と名付けた。
Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１単クローンを発酵培地に接種し、１２回連続して継代し、ＤＨＡ含有量を上記のステップに従って測定した。結果は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１によって生産されたＤＨＡの安定性が良好であることを示した。
ＩＩ． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の同定
１．形態学的同定
Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１を麦汁寒天培地に接種し、２５℃の暗所で培養した。５日後、コロニーの形態学を観察し、株の形態学的特徴を分析し、高解像度の透過型電子顕微鏡法によって観察した。
実験結果を図１および２に示す。結果は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のコロニー直径が２～４．３ｍｍであり、白色（その後のステージでは明るいオレンジ色）であり、縁の形が整っていないことを示した。分裂によって増殖した株では、細胞壁は薄く、球状で、無色または明るいオレンジ色で、透明であり、サイズは４．５～１５．５μｍであり、遊走子および外部原形質ネットは見られなかった。
２． １８ｓ ｒＤＮＡの配列相同性分析
Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の１８ｓ ｒＤＮＡの部分配列を、配列表の配列番号１に示す。
Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の１８ｓ ｒＤＮＡの部分配列を、配列表の配列番号２に示す。
上記の同定の結果に基づくと、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍである。
ＩＩＩ．Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の寄託
Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１は、２０１７年３月１０日に、中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心（略記：ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託されており、受託番号はＣＧＭＣＣ第１３７４６号である。Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のフルネームは、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号であり、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１と省略される。
（実施例２：Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の発酵によるＤＨＡの生産）
Ｉ． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の発酵によるＤＨＡの生産
１． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の単クローンを、２ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（仕様：１０ｍＬ）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、一次シードブロスを得た。
２．一次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で２５０ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（１Ｌの振とうフラスコ仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、二次シードブロスを得た。
３．二次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で３Ｌのシード培地を含有する発酵槽（５Ｌの発酵槽仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃で２４～４８時間培養して（溶存酸素は１０～８０％であった）、発酵した一次シードブロスを得た。
４．発酵した一次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５０Ｌの発酵培地を含有する発酵槽に接種し（発酵槽の仕様は１００Ｌであり、接種後の最初のバイオマスは１．０×１０８～２．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった）、２２～２８℃で７２～１２０時間培養して（溶存酸素は５～８０％であった）、発酵ブロスを得た。発酵ブロスはＤＨＡを含有していた。
ＩＩ．発酵ブロスにおける脂肪酸組成の分析
実施例１におけるステップＩのステップ５の方法に従って、発酵ブロスの油脂を抽出し、次いで、ＤＨＡ含有量をＧＢ２６４００－２０１１食品安全国家基準に従って検出し、脂肪酸の組成および含有量をＡＯＡＣ９９６．０６の方法に従って検出した。
実験結果を表２に示す。結果は、ＤＨＡが油脂の４５．０％～６０．０％を占めることを示した。
Figure 0007039625000002
ＩＩＩ．発酵ブロス中のＤＨＡの分離および質の同定
１．ステップＩで得た発酵ブロスを取り、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの細胞壁破壊およびＤＨＡ藻類油の粗油の抽出を逐次的に行った（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの細胞壁破壊およびＤＨＡ藻類油の粗油の抽出の方法は、中国特許第ＣＮ１０１８１７７３８Ｂにおいて記録されている）。
２．ステップ１において抽出されたＤＨＡ藻類油の粗油を精錬した（精錬方法は、中国特許第ＣＮ１０３８６５６４２Ｂにおいて記録されている）。
精錬後のＤＨＡ藻類油の粗油の質の指標を表３に示す。
Figure 0007039625000003
（実施例３：Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１によるＤＨＡの大規模発酵）
１． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の単一コロニーを、２０ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（２５０ｍＬの振とうフラスコ仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、一次シードブロスを得た。
２．一次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で２５０ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（２Ｌの振とうフラスコ仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、二次シードブロスを得た。
３．二次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５００Ｌのシード培地を含有する発酵槽（１０００Ｌの発酵槽仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃で２４～４８時間培養して（溶存酸素は１０～８０％であった）、バイオマスが１５～３０ｇ／Ｌの発酵した一次シードブロスを得た。
４．発酵した一次シードブロスを取り、５～１５％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５０００Ｌのシード培地を含有する発酵槽（８０００～１００００Ｌの発酵槽仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃で２４～４８時間培養して（溶存酸素は１０～８０％であった）、１５～３０ｇ／Ｌのバイオマスを伴う発酵した二次シードブロスを得た。
５．発酵した二次シードブロスを取り、５～１５％（ｖ／ｖ）の接種材料量で３００００Ｌの発酵培地を含有する発酵槽に接種し（発酵槽の仕様は７５０００Ｌであり、接種後の最初のバイオマスは、５．０×１０８～３．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬであった）、２２～２８℃で７２～１２０時間で培養して（溶存酸素は５～８０％であった）、発酵ブロスを得た。発酵ブロスはＤＨＡを含有していた。
発酵ブロス中の脂肪酸の組成を、実施例２におけるステップＩＩの方法に従って分析した。結果は、発酵ブロス中において、ＤＨＡが油脂の３５．０～６０．０％を占めたことを示した。
（実施例４：ＤＨＡおよびＥＰＡ合成に関連する遺伝子断片の発見）
Ｉ． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１によるポリ不飽和脂肪酸の発酵
１． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１の単クローンを、２ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（仕様：１０ｍＬ）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、一次シードブロスを得た。
２．一次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で２５０ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（１Ｌの振とうフラスコ仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、二次シードブロスを得た。
３．二次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で３Ｌのシード培地を含有する発酵槽（５Ｌの発酵槽仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃で２４～４８時間培養して（溶存酸素は１０～８０％であった）、発酵した一次シードブロスを得た。
４．発酵した一次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５０Ｌの発酵培地を含有する発酵槽に接種し（発酵槽の仕様は１００Ｌであり、接種後の最初のバイオマスは、１．０×１０８～２．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった）、２２～２８℃で７２～１２０時間培養して（溶存酸素は５～８０％であった）、発酵ブロスを得た。
５．実施例１におけるステップＩのステップ５の方法に従って、発酵ブロスの油脂を抽出し、次いで、ＤＨＡ含有量をＧＢ２６４００－２０１１食品安全国家基準に従って検出し、ＤＰＡ含有量をＧＢ２８４０４－２０１２食品安全国家基準に従って検出し、ＥＰＡ含有量をＧＢ５００９．１６８－２０１６食品安全国家基準に従って検出し、脂肪酸の組成および含有量をＡＯＡＣ９９６．０６の方法に従って検出した。
実験結果を表４に示す。結果は、ＤＨＡが油脂の４５．０％～６０．０％を占め、ＤＰＡが油脂の９．０％～１７．０％を占め、ＥＰＡが油脂の０．２％～１．０％を占めることを示した。
Figure 0007039625000004
ＩＩ． ＭＹＡ－１３８１によるポリ不飽和脂肪酸の発酵
ステップＩの方法に従って、「Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１」を「ＭＹＡ－１３８１」で置き換え、他のステップは変えなかった。結果は、ＤＨＡが油脂の１２％～２３％を占め、ＤＰＡが油脂の２０％～３９％を占め、ＥＰＡが油脂の０．５％～３％を占めることを示した。
上記の結果に基づくと、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１は、ＤＨＡおよびＥＰＡの合成について高収量株であり、ＭＹＡ－１３８１は、ＤＨＡおよびＥＰＡの合成について低収量株である。
ＩＩＩ． ＤＨＡおよびＥＰＡ合成に関連する遺伝子断片の発見
Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１およびＭＹＡ－１３８１のゲノムＤＮＡを、酵母ゲノム抽出キットを使用してそれぞれ抽出し、次いで、全ゲノム配列決定を、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩおよびＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００を使用して、Ｎｏｖｏｇｅｎｅによって行った。
結果は、ＭＹＡ－１３８１と比較して、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１が６つの固有の遺伝子断片を含有していたことを示し、この遺伝子断片を、遺伝子断片１、遺伝子断片２、遺伝子断片３、遺伝子断片４、遺伝子断片５、および遺伝子断片６とそれぞれ名付けた。それらのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３～配列番号８で順に示される。
配列表の配列番号３の５’末端から１０４４～３０５０位のヌクレオチド配列は、タンパク質１をコードし、タンパク質１のアミノ酸配列は配列表の配列番号９で示される。配列表の配列番号４の５’末端から１０６８～２７３７位および３２５４～５１６２位のヌクレオチド配列は、タンパク質２をコードし、タンパク質２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０で示される。配列表の配列番号５の５’末端から１０９４～３４１５位のヌクレオチド配列は、タンパク質３をコードし、タンパク質３のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１で示される。配列表の配列番号６の５’末端から１０４９～５０４４位、７００４～７２３４位、および７７００～１０３９９位のヌクレオチド配列は、タンパク質４をコードし、タンパク質４のアミノ酸配列は配列表の配列番号１２で示される。配列表の配列番号７の５’末端から１４７３～６４８８位のヌクレオチド配列は、タンパク質５をコードし、タンパク質５のアミノ酸配列は配列表の配列番号１３で示される。配列表の配列番号８の５’末端から９５３～９９１位および１０６３～１０９０位のヌクレオチド配列は、タンパク質６をコードし、タンパク質６のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４で示される。
（実施例５：６つの遺伝子断片の増幅およびその対応するプライマーの合成）
１． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のゲノムＤＮＡを、酵母ゲノム抽出キットを使用して抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、高忠実度ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー対（プライマー対ＨＳ０１－１、プライマー対ＨＳ０１－２、プライマー対ＨＳ０１－３、プライマー対ＨＳ０１－４、プライマー対ＨＳ０１－５、プライマー対ＨＳ０１－６）を使用してＰＣＲ増幅を行って、ＰＣＲ増幅産物を得た。
各プライマー対を構成する上流プライマーおよび下流プライマーのヌクレオチド配列を表５に示す。
反応手順：９８℃で２分間；９８℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル；７２℃で５分間。
Figure 0007039625000005
２．ステップ１が完了した後、ＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲルＤＮＡ回収キットを使用して回収した。
３．ステップ２が完了した後、回収したＰＣＲ増幅産物をｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションして、組換えプラスミドを得た。
４．ステップ３が完了した後、組換えプラスミドを配列決定した。
配列決定の結果は、プライマー対ＨＳ０１－１によって増幅されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号３で示され（すなわち、遺伝子断片１）、プライマー対ＨＳ０１－２によって増幅されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号４で示され（すなわち、遺伝子断片２）、プライマー対ＨＳ０１－３によって増幅されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号５で示され（すなわち、遺伝子断片３）、プライマー対ＨＳ０１－４によって増幅されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号６で示され（すなわち、遺伝子断片４）、プライマー対ＨＳ０１－５によって増幅されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号７で示され（すなわち、遺伝子断片５）、プライマー対ＨＳ０１－６によって増幅されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号８で示される（すなわち、遺伝子断片６）ことを示した。したがって、６つの遺伝子断片は、表２のプライマーを使用して増幅することができる。
（実施例６：ＤＨＡおよびＥＰＡの生産における６つの遺伝子断片の増幅）
この実施例において、関与するプライマーのヌクレオチド配列を表６に示す。
Figure 0007039625000006
Ａ． ＧＳ－Ｃ０６株の獲得
Ｉ．標的断片ＨＳ０１－１－Ｚｅｏの調製
１．組換えプラスミドｐＵＣ５７－ＬＺは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された。組換えプラスミドｐＵＣ５７－ＬＺは、配列表の配列番号１５で示すヌクレオチド配列をｐＵＣ５７ベクターとライゲーションすることによって得た。配列表の配列番号１５において、５’末端から２５～５８位はＬｏｘ６６配列であり、６２６～９９７位はゼオシン耐性遺伝子であり、２２９３～２３２６位はＬｏｘ７１配列である。
２． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のゲノムＤＮＡを、酵母ゲノム抽出キットを使用して抽出した。
３． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、ＨＳ０１－１－ＵＦおよびＨＳ０１－１－ＵＲをプライマーとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。約３１００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ、このＰＣＲ増幅産物は、ＨＳ０１－１の上流の相同断片ＡＵであった。
４． Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、ＨＳ０１－１－ＤＦおよびＨＳ０１－１－ＤＲをプライマーとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。約１０００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ、このＰＣＲ増幅産物は、ＨＳ０１－１の下流の相同断片ＡＤであった。
５．ステップ１で合成された組換えプラスミドｐＵＣ５７－ＬＺを鋳型として使用し、Ｚｅｏ－ＦおよびＺｅｏ－Ｒをプライマーとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。約２３５０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ（ヌクレオチド配列を配列表の配列番号１５で示す）、このＰＣＲ増幅産物はＺｅｏ断片であった。
６． ＨＳ０１－１の上流の相同断片ＡＵ、ＨＳ０１－１の下流の相同断片ＡＤ、およびＺｅｏ断片を鋳型として使用し、ＨＳ０１－１－ＵＦおよびＨＳ０１－１－ＤＲをプライマーとして使用して、オーバーラップ増幅を行った。約６４５０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られた。ＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲルＤＮＡ回収キットを使用して回収して、標的断片ＨＳ０１－１－Ｚｅｏを得た。
ＩＩ．前処理したＭＹＡ－１３８１の獲得
１．無菌の事前冷却したポリプロピレン試験管（仕様：５０ｍＬ）を取り、１０ｍＬのＭＹＡ－１３８１溶液（濃度：１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を添加し、４℃、５０００ｒ／分で１０分間、遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を回収した。
２．ステップ１が完了した後、以下のステップを２回繰り返した：ポリプロピレン試験管を取り、１０ｍＬの事前冷却した滅菌水を添加して細胞を洗浄し、得られた混合物を４℃、４４７２ｇで１０分間、遠心分離し、細胞を回収した。
３．ステップ２が完了した後、ポリプロピレン試験管を取り、１０ｍＬの事前冷却した１ｍｏｌ／Ｌのソルビトール水溶液を添加することによって再懸濁し、４℃、５０００ｒ／分で１０分間、遠心分離し、細胞を回収した。
４．ステップ３が完了した後、ポリプロピレン試験管を取り、１０ｍＬの事前冷却した１ｍｏｌ／Ｌのソルビトール水溶液を添加することによって再懸濁して、前処理したＭＹＡ－１３８１を得た。
ＩＩＩ．電気的形質転換
１． ３０μＬの前処理したＭＹＡ－１３８１を取り、１μｇの標的断片ＨＳ０１－１－Ｚｅｏをそれに添加した。得られた混合物を穏やかに混合して、氷浴中で５分間静置し、次いで、電気ショックのために、氷冷したｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒキュベットに移した（電気ショックのパラメータ：０．７５ＫＶ、５０μＦ）。
２．ステップ１が完了した後、ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒキュベットを取り、１ｍＬのシード培地をそれに添加した。得られた混合物を３０℃、２００ｒ／分で１時間培養し、次いで、１０℃、５０００ｒ／分で１０分間、遠心分離した。細胞および少量の上清を混合し、耐性プレート上に均一に広げ、逆さまにした状態で、３０℃で４８時間培養して、疑似形質転換体を得た。
耐性プレート：ゼオシンを、約５５℃のスクリーニング用固体培地に、２００μｇ／ｍＬの濃度まで添加し、次いでペトリ皿に注ぎ、冷却した後に固体プレートを得た。
ＩＶ．陽性の形質転換体の獲得および同定
疑似形質転換体のゲノムＤＮＡを、酵母ゲノム抽出キットによって抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、ＨＳ０１－１－ＦおよびＨＳ０１－１－Ｒをプライマーとして使用してＰＣＲ増幅を行って、ＰＣＲ増幅産物を得た。
疑似形質転換体のＰＣＲ増幅産物のサイズが４１００ｂｐである場合（またはそのヌクレオチド配列が配列表の配列番号３で示される場合）、疑似形質転換体は陽性の形質転換体であった。
Ｖ． ＧＳ－Ｃ０１の獲得。
プラスミドｐＳＨ６５（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．の製品；このプラスミドはＣｒｅ酵素を含有する）を陽性の形質転換体に導入し、次いで、Ｚｅｏ遺伝子をプラスミドｐＳＨ６５の指示の手順に従って除去して、形質転換体ＧＳ－Ｃ０１を得た。
上記のステップＩからＶに従って、「ＨＳ０１－１－ＵＦ」を「ＨＳ０１－２－ＵＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＵＲ」を「ＨＳ０１－２－ＵＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＦ」を「ＨＳ０１－２－ＤＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＲ」を「ＨＳ０１－２－ＤＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｆ」を「ＨＳ０１－２－Ｆ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｒ」を「ＨＳ０１－２－Ｒ」で置き換え、「ＭＹＡ－１３８１」を「形質転換体ＧＳ－Ｃ０１」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体ＧＳ－Ｃ０２を得た。
上記のステップＩからＶに従って、「ＨＳ０１－１－ＵＦ」を「ＨＳ０１－３－ＵＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＵＲ」を「ＨＳ０１－３－ＵＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＦ」を「ＨＳ０１－３－ＤＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＲ」を「ＨＳ０１－３－ＤＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｆ」を「ＨＳ０１－３－Ｆ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｒ」を「ＨＳ０１－３－Ｒ」で置き換え、「ＭＹＡ－１３８１」を「形質転換体ＧＳ－Ｃ０２」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体ＧＳ－Ｃ０３を得た。
上記のステップＩからＶに従って、「ＨＳ０１－１－ＵＦ」を「ＨＳ０１－４－ＵＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＵＲ」を「ＨＳ０１－４－ＵＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＦ」を「ＨＳ０１－４－ＤＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＲ」を「ＨＳ０１－４－ＤＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｆ」を「ＨＳ０１－４－Ｆ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｒ」を「ＨＳ０１－４－Ｒ」で置き換え、「ＭＹＡ－１３８１」を「形質転換体ＧＳ－Ｃ０３」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体ＧＳ－Ｃ０４を得た。
上記のステップＩからＶに従って、「ＨＳ０１－１－ＵＦ」を「ＨＳ０１－５－ＵＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＵＲ」を「ＨＳ０１－５－ＵＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＦ」を「ＨＳ０１－５－ＤＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＲ」を「ＨＳ０１－５－ＤＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｆ」を「ＨＳ０１－５－Ｆ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｒ」を「ＨＳ０１－５－Ｒ」で置き換え、「ＭＹＡ－１３８１」を「形質転換体ＧＳ－Ｃ０４」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体ＧＳ－Ｃ０５を得た。
上記のステップＩからＶに従って、「ＨＳ０１－１－ＵＦ」を「ＨＳ０１－６－ＵＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＵＲ」を「ＨＳ０１－６－ＵＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＦ」を「ＨＳ０１－６－ＤＦ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－ＤＲ」を「ＨＳ０１－６－ＤＲ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｆ」を「ＨＳ０１－６－Ｆ」で置き換え、「ＨＳ０１－１－Ｒ」を「ＨＳ０１－６－Ｒ」で置き換え、「ＭＹＡ－１３８１」を「形質転換体ＧＳ－Ｃ０５」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体ＧＳ－Ｃ０６を得た。
形質転換体ＧＳ－Ｃ０６は、ＧＳ－Ｃ０６株であった。
Ｂ． ＤＨＡおよびＥＰＡの生産における６つの遺伝子断片の応用
試験対象の株は、Ｓｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１、ＭＹＡ－１３８１、またはＧＳ－Ｃ０６株であった。
１．試験対象の株の単クローンを、２ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（仕様：１０ｍＬ）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、一次シードブロスを得た。
２．一次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５０ｍＬの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ（５００ｍＬの振とうフラスコ仕様を伴う）に接種し、２２～２８℃、１５０～２５０ｒｐｍ／分で２４～４８時間培養して、二次シードブロスを得た。
３．二次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５００ｍＬのシード培地を含有する発酵槽（発酵槽の仕様：１Ｌ）に接種し、２２～２８℃で２４～４８時間培養して（溶存酸素は１０～８０％であった）、三次シードブロスを得た。
４．三次シードブロスを取り、３～１０％（ｖ／ｖ）の接種材料量で５Ｌの発酵培地を含有する発酵槽（発酵槽の仕様は１０Ｌであり、接種後の最初のバイオマスは、０．３×１０８～０．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった）に接種し、２２～２８℃で７２～１２０時間培養して（溶存酸素は５～８０％であった）、発酵ブロスを得た。発酵ブロスはＤＨＡ、ＤＰＡ、およびＥＰＡを含有していた。
５．実施例１におけるステップＩのステップ５の方法に従って、発酵ブロスの油脂を抽出し、次いで、ＤＨＡ含有量をＧＢ５００９．１６８－２０１６食品安全国家基準に従って検出し、ＤＰＡ含有量をＧＢ２８４０４－２０１２食品安全国家基準に従って検出し、ＥＰＡ含有量をＧＢ５００９．１６８－２０１６食品安全国家基準に従って検出した。
実験結果を表７に示す。結果は、本発明によって得られた６つの遺伝子断片をＭＹＡ－１３８１に形質転換することによって、ＤＨＡおよびＥＰＡの合成についての高収量株（すなわち、ＧＳ－Ｃ０６株）を得ることができることを示した。したがって、本発明によって提供される６つの遺伝子断片、６つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質、およびこれらの６つの遺伝子断片を含有するベクター、細胞、または生物は、ＤＨＡおよびＥＰＡの生産において重要な応用価値を有する。これらの６つの遺伝子セグメントによってコードされるタンパク質を出発株において作出することによって、ＤＨＡおよびＥＰＡの高収量作出株を構築することができる。
Figure 0007039625000007
本発明によって提供されるＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１は、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの生産について高い生産値を有する。ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの合成についての高収量株は、本発明によって得られる６つの遺伝子断片を、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの合成についての低収量株に形質転換することによって得ることができる。したがって、本発明によって提供される６つの遺伝子断片、これらの６つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質、およびこれらの６つの遺伝子断片を含有するベクター、細胞、または生物は、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの生産において重要な応用価値を有する。これらの６つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質を出発株において作出することによって、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの高収量作出株を構築することができる。

Claims (11)

  1. タンパク質１、タンパク質２、タンパク質３、タンパク質４、タンパク質５、およびタンパク質６からなる、タンパク質の組み合わせであって、
    前記タンパク質１が、ａ１）またはａ２）：
    ａ１）配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    ａ２）タグを配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
    であり、
    前記タンパク質２が、ｂ１）またはｂ２）：
    ｂ１）配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    ｂ２）タグを配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
    であり、
    前記タンパク質３が、ｃ１）またはｃ２）：
    ｃ１）配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    ｃ２）タグを配列表の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
    であり、
    前記タンパク質４が、ｄ１）またはｄ２）：
    ｄ１）配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    ｄ２）タグを配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
    であり、
    前記タンパク質５が、ｅ１）またはｅ２）：
    ｅ１）配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    ｅ２）タグを配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
    であり、
    前記タンパク質６が、ｆ１）またはｆ２）：
    ｆ１）配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
    ｆ２）タグを配列表の配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端または／およびＣ末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
    である、タンパク質の組み合わせ。
  2. 請求項１に記載のタンパク質の組み合わせをコードする核酸分子の組み合わせ。
  3. 前記タンパク質１をコードする核酸分子が、以下のＡ１）またはＡ２）：
    Ａ１）そのコード領域が配列表の配列番号３の５’末端から１０４４～３０５０位で示される、ＤＮＡ分子、
    Ａ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号３で示される、ＤＮＡ分子、
    で示されるＤＮＡ分子であり、
    前記タンパク質２をコードする核酸分子が、以下のＢ１）またはＢ２）：
    Ｂ１）そのコード領域が配列表の配列番号４の５’末端から１０６８～２７３７位および３２５４～５１６２位で示される、ＤＮＡ分子、
    Ｂ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号４で示される、ＤＮＡ分子、
    で示されるＤＮＡ分子であり、
    前記タンパク質３をコードする核酸分子が、以下のＣ１）またはＣ２）：
    Ｃ１）そのコード領域が配列表の配列番号５の５’末端から１０９４～３４１５位で示される、ＤＮＡ分子、
    Ｃ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号５で示される、ＤＮＡ分子、
    で示されるＤＮＡ分子であり、
    前記タンパク質４をコードする核酸分子が、Ｄ１）またはＤ２）：
    Ｄ１）そのコード領域が配列表の配列番号６の５’末端から１４０９～５０４４位、７００４～７２３４位、および７７００～１０３９９位で示される、ＤＮＡ分子、
    Ｄ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号６で示される、ＤＮＡ分子、
    で示されるＤＮＡ分子であり、
    前記タンパク質５をコードする核酸分子が、以下のＥ１）またはＥ２）：
    Ｅ１）そのコード領域が配列表の配列番号７の５’末端から１４７３～６４８８位で示される、ＤＮＡ分子、
    Ｅ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号７で示される、ＤＮＡ分子、
    で示されるＤＮＡ分子であり、
    前記タンパク質６をコードする核酸分子が、以下のＦ１）またはＦ２）：
    Ｆ１）そのコード領域が配列表の配列番号８の５’末端から９５３～９９１位および１０６３～１０９０位で示される、ＤＮＡ分子、
    Ｆ２）そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号８で示される、ＤＮＡ分子、
    で示されるＤＮＡ分子である、
    請求項２に記載の核酸分子の組み合わせ。
  4. 請求項２または３に記載の核酸分子の組み合わせを含有する、
    発現カセット、組換えベクター、組換え微生物、またはトランスジェニック細胞系。
  5. ＤＨＡおよび／またはＥＰＡの生産における、組換え株の使用であって、
    前記組換え株が、請求項２または３に記載の核酸分子の組み合わせを含む組換えＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍである、使用。
  6. 組換え株であって、出発株における請求項１に記載のタンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる調製方法によって得られる組換え株であって、
    前記「出発株における請求項１に記載のタンパク質の組み合わせの発現および／または活性を増大させる」ステップが、請求項２または３に記載の、前記タンパク質の組み合わせをコードする前記核酸分子の組み合わせを、前記出発株に導入することによって実現され、
    前記出発株がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍである、組換え株。
  7. 前記Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍが、株Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ Ｈｏｎｄａ ｅｔ Ｙｏｋｏｃｈｉ ＡＴＣＣ ＭＹＡ－１３８１である、請求項６に記載の組換え株。
  8. 中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心での受託番号ＣＧＭＣＣ第１３７４６号を有するＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１。
  9. 請求項８に記載のＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または請求項６または７に記載の組換え株を含む微生物剤。
  10. 請求項８に記載のＳｃｈｉｚｏｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＨＳ０１ ＣＧＭＣＣ第１３７４６号、または請求項６または７に記載の組換え株を発酵させて、ドコサヘキサエン酸および／またはＥＰＡを得るステップを含む、ドコサヘキサエン酸および／またはＥＰＡを生産する方法。
  11. 発酵培養で使用される発酵培地の溶質およびその溶解度が、グルコース２０～１２０ｇ／Ｌ、グルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム５～１５ｇ／Ｌ、コーンシロップ乾燥粉末３～１５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳＯ４ ５～２４ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．１～１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ １．０～３．０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＳＯ４ ０．３～１．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５～１．５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５～１．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．１～１．０ｇ／Ｌであり、溶媒が水であり、ｐＨが５．０から６．５である、請求項１０に記載の方法。
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