JP7039625B2 - Bacteria that produce DHA and EPA, 6 gene fragments of the bacterial genome and their use - Google Patents
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Description
本発明は、産業用の微生物、食品、および飼料の産業の分野に、特に、DHAおよび/またはEPAを生産する細菌の株、細菌ゲノム内の6つの遺伝子断片、ならびにそれらの応用に関するものであり、ここで、6つの遺伝子断片もまた、DHAおよび/またはEPA合成に関連する。 The present invention relates to the industrial fields of industrial microorganisms, foods and feeds, in particular strains of bacteria producing DHA and / or EPA, six gene fragments within the bacterial genome, and their applications. Here, the six gene fragments are also associated with DHA and / or EPA synthesis.
ポリ不飽和脂肪酸は、18~22炭素原子の炭素鎖長を典型的に有する、2つまたはそれより多くの二重結合を含有する直鎖脂肪酸のクラスである。二重結合の位置に従って、ポリ不飽和脂肪酸をω-3およびω-6に分けることができる。カルボキシル基から最も遠い末端にある二重結合が末端から3番目の炭素原子上にあるポリ不飽和脂肪酸分子は、ω-3と呼ばれる。カルボキシル基から最も遠い末端にある二重結合が末端から6番目の炭素原子上にあるポリ不飽和脂肪酸分子は、ω-6と呼ばれる。ポリ不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、エイコサペンタエン酸(EPA)などを主に含む、ヒトの体内における必須脂肪酸のクラスである。 Polyunsaturated fatty acids are a class of straight chain fatty acids that typically have a carbon chain length of 18-22 carbon atoms and contain two or more double bonds. Polyunsaturated fatty acids can be divided into ω-3 and ω-6 according to the position of the double bond. The polyunsaturated fatty acid molecule whose double bond at the farthest end from the carboxyl group is on the third carbon atom from the end is called ω-3. The polyunsaturated fatty acid molecule whose double bond at the farthest end from the carboxyl group is on the sixth carbon atom from the end is called ω-6. Polyunsaturated fatty acids are a class of essential fatty acids in the human body, mainly containing docosahexaenoic acid (DHA), docosapentaenoic acid (DPA), eicosapentaenoic acid (EPA) and the like.
DHAは、ポリ不飽和脂肪酸の最も重要なクラスである。分子構造では、DHAは、22の炭素原子および6つの二重結合を含有する直鎖脂肪酸である。その最初の二重結合が脂肪酸鎖のメチル末端の3番目の炭素原子上にあるため、DHAは、ω-3シリーズの脂肪酸(OMEGA-3)に属する。DHAはヒトの身体の脳および網膜において主に見られ、神経系の発生の促進、網膜機能の向上、視力の向上、心血管疾患の予防、心血管疾患の処置、炎症への抵抗、およびアレルギー反応の抑制などの、重要な生理学的機能を有する。ヒトの身体自体は十分なDHAを合成できないため、DHAは、食品の摂取によって主に得られる。DHAは日々の食事では不十分であることが多いため、食品または粉ミルクにDHAを補充することまたはDHAを添加することは、ヒト、特に、乳児および高齢者にとって重要である。 DHA is the most important class of polyunsaturated fatty acids. In molecular structure, DHA is a linear fatty acid containing 22 carbon atoms and 6 double bonds. DHA belongs to the ω-3 series of fatty acids (OMEGA-3) because its first double bond is on the third carbon atom at the methyl end of the fatty acid chain. DHA is predominantly found in the brain and retina of the human body, promoting nervous system development, improving retinal function, improving visual acuity, preventing cardiovascular disease, treating cardiovascular disease, resistance to inflammation, and allergies. It has important physiological functions such as suppression of reaction. DHA is mainly obtained by ingesting food, as the human body itself cannot synthesize sufficient DHA. Supplementing or adding DHA to foods or infant formula is important for humans, especially infants and the elderly, as DHA is often inadequate in the daily diet.
現在のところ、DHAを生産するための2つの主な方法がある。1つは、海水魚(マス、サバ、サケ、およびイワシを主に含む)の組織から抽出される従来のDHAの供給源であるが、抽出によって得られる魚油の質は、魚の種、季節、および漁場の変化に影響され、また、魚油の質は、漁業資源が不足してきていることおよび環境汚染の影響も受ける。他方は、DHAの発酵生産に海洋微生物を使用する、新たに出現してきているDHA生産方法であり、この方法は、短期間である、客観的条件に影響されない、魚臭さがないなどの利点を有し、大きな将来性を有する。DHAの発酵生産に使用される海洋微生物は、主にSchizochytriumである。しかし、DHAの発酵生産に現在使用されているSchizochytriumは、それ自体の総脂肪酸含有量、DHA含有量、成長速度、および他の技術的指標に限りがあり、収量をさらに増大させることおよびコストを削減することができない。 Currently, there are two main methods for producing DHA. One is the source of traditional DHA extracted from the tissues of saltwater fish (mainly trout, mackerel, salmon, and sardines), but the quality of the fish oil obtained by the extraction is fish species, season, And affected by changes in fishing grounds, and the quality of fish oil is also affected by the lack of fish stocks and environmental pollution. The other is a newly emerging DHA production method that uses marine microorganisms for fermentative production of DHA, which has advantages such as short period, no influence on objective conditions, and no fishy odor. Has great potential. The marine microorganism used for the fermentative production of DHA is mainly Schizochytrium. However, the Schizochytrium currently used for fermentative production of DHA is limited in its own total fatty acid content, DHA content, growth rate, and other technical indicators, further increasing yield and cost. It cannot be reduced.
DHA生産株において、DHA生合成経路は、関連する同化作用経路における一連の酵素によって触媒される。DHA生合成経路に関連する遺伝子の穿孔、形質転換、および異種発現は、DHAの収量をさらに増大させるために好都合な条件をもたらす。したがって、DHA生合成経路における新規な鍵となる遺伝子を得ることは、DHA生産株の修飾およびプロセス最適化を容易にする。以下の2つのDHA合成経路が天然に存在する:(1)脂肪酸合成経路に基づき、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用によってDHAをさらに合成する伸長-不飽和化経路(E-D経路)、(2)主にポリケチドシンターゼの作用下でDHAを合成するための前駆体としてアセチルCoAおよびマロニルCoAを使用するポリケチドシンターゼ経路(PKS経路)。これらのうち、Schizochytriumでは、DHAの合成は主にPKS経路を採用している。現在、DPAおよびEPAの合成もまた、E-D経路およびPKS経路を有すると考えられている。 In DHA-producing strains, the DHA biosynthetic pathway is catalyzed by a series of enzymes in the associated anabolic pathway. Perforation, transformation, and heterologous expression of genes associated with the DHA biosynthetic pathway provide favorable conditions for further increasing the yield of DHA. Therefore, obtaining novel key genes in the DHA biosynthetic pathway facilitates modification and process optimization of DHA-producing strains. The following two DHA synthesis pathways are naturally present: (1) an extension-unsaturation pathway (ED pathway) that further synthesizes DHA by the action of elongase and desaturase based on the fatty acid synthesis pathway, (2) main Polyketide synthase pathway (PKS pathway) using acetyl-CoA and malonyl-CoA as precursors for synthesizing DHA under the action of polyketide synthase. Of these, in Schizochytrium, the PKS pathway is mainly adopted for the synthesis of DHA. Currently, DPA and EPA synthesis is also believed to have ED and PKS pathways.
本発明の目的は、DPAおよび/またはEPAを調製することである。
本発明は、第1に、以下の(X1)または(X2)または(X3)または(X4)であり得る、DPAおよび/またはEPAを調製するためのタンパク質の組み合わせを保護する:
(X1)タンパク質1、タンパク質2、タンパク質3、タンパク質4、タンパク質5、およびタンパク質6を含む、タンパク質の組み合わせ、
(X2)タンパク質1、タンパク質2、タンパク質3、タンパク質4、タンパク質5、およびタンパク質6からなる、タンパク質の組み合わせ、
(X3)タンパク質1、タンパク質2、タンパク質3、タンパク質4、タンパク質5、およびタンパク質6のいずれか2つ、いずれか3つ、いずれか4つ、またはいずれか5つからなる、タンパク質の組み合わせ、
(X4)タンパク質1、タンパク質2、タンパク質3、タンパク質4、タンパク質5、またはタンパク質6。
An object of the present invention is to prepare DPA and / or EPA.
The present invention first protects the combination of proteins for preparing DPA and / or EPA, which may be (X1) or (X2) or (X3) or (X4) below:
(X1) A combination of proteins, comprising protein 1,
(X2) A combination of proteins consisting of protein 1,
(X3) A combination of proteins consisting of any two, three, four, or five of protein 1,
(X4) Protein 1,
タンパク質1は、a1)またはa2)またはa3)またはa4)またはa5)であり得る:
a1)配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
a2)タグを配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
a3)配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
a4)Schizochytriumに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列と80%またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
a5)配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
Protein 1 can be a1) or a2) or a3) or a4) or a5):
a1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
a2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
a3) A protein obtained by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and having the same function.
a4) A protein derived from Schizochytrium and having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, which is related to the synthesis of polyunsaturated fatty acids.
a5) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
タンパク質2は、b1)またはb2)またはb3)またはb4)またはb5)であり得る:
b1)配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
b2)タグを配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
b3)配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
b4)Schizochytriumに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列と80%またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
b5)配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
b1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
b2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
b3) A protein obtained by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing and having the same function.
b4) A protein derived from Schizochytrium that has 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing, which is associated with the synthesis of polyunsaturated fatty acids.
b5) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
タンパク質3は、c1)またはc2)またはc3)またはc4)またはc5)であり得る:
c1)配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
c2)タグを配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
c3)配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
c4)Schizochytriumに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列と80%またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
c5)配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
Protein 3 can be c1) or c2) or c3) or c4) or c5):
c1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing,
c2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
c3) A protein obtained by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and having the same function.
c4) A protein derived from Schizochytrium that has 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing, which is associated with the synthesis of polyunsaturated fatty acids.
c5) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
タンパク質4は、d1)またはd2)またはd3)またはd4)またはd5)であり得る:
d1)配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
d2)タグを配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
d3)配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
d4)Schizochytriumに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列と80%またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
d5)配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
Protein 4 can be d1) or d2) or d3) or d4) or d5):
d1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing,
d2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing.
d3) A protein obtained by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing and having the same function.
d4) A protein derived from Schizochytrium that has 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 of the Sequence Listing, which is associated with the synthesis of polyunsaturated fatty acids.
d5) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
タンパク質5は、e1)またはe2)またはe3)またはe4)またはe5)であり得る:
e1)配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
e2)タグを配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
e3)配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
e4)Schizochytriumに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列と80%またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
e5)配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
Protein 5 can be e1) or e2) or e3) or e4) or e5):
e1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing,
e2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
e3) A protein obtained by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and having the same function.
e4) A protein derived from Schizochytrium that has 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 of the Sequence Listing, which is associated with the synthesis of polyunsaturated fatty acids.
e5) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
タンパク質6は、f1)またはf2)またはf3)またはf4)またはf5)であり得る:
f1)配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
f2)タグを配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
f3)配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加によって得られ、同一の機能を有するタンパク質、
f4)Schizochytriumに由来し、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関連する、配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列と80%またはそれを超える同一性を有するタンパク質、
f5)配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
Protein 6 can be f1) or f2) or f3) or f4) or f5):
f1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing,
f2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing.
f3) A protein obtained by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing and having the same function.
f4) A protein derived from Schizochytrium that has 80% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 of the Sequence Listing, which is associated with the synthesis of polyunsaturated fatty acids.
f5) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
ここで、配列表の配列番号9は669のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号10は1193のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号11は773のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号12は2189のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号13は1672のアミノ酸残基からなり、配列表の配列番号14は21のアミノ酸残基からなる。 Here, SEQ ID NO: 9 in the sequence listing consists of 669 amino acid residues, SEQ ID NO: 10 in the sequence listing consists of 1193 amino acid residues, and SEQ ID NO: 11 in the sequence listing consists of 773 amino acid residues. SEQ ID NO: 12 consists of 2189 amino acid residues, SEQ ID NO: 13 of the sequence listing consists of 1672 amino acid residues, and SEQ ID NO: 14 of the sequence listing consists of 21 amino acid residues.
a1)のタンパク質の精製を容易にするために、表1に示すタグを、配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。b1)のタンパク質の精製を容易にするために、表1に示すタグを、配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。c1)のタンパク質の精製を容易にするために、表1に示すタグを、配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。d1)のタンパク質の精製を容易にするために、表1に示すタグを、配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。e1)のタンパク質の精製を容易にするために、表1に示すタグを、配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。f1)のタンパク質の精製を容易にするために、表1に示すタグを、配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端にライゲーションすることができる。
上記のa3)のタンパク質1、上記のb3)のタンパク質2、上記のc3)のタンパク質3、上記のd3)のタンパク質4、上記のe3)のタンパク質5、および上記のf3)のタンパク質6に関して、1つまたは複数のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加は、10以下のアミノ酸残基の置換および/または欠失および/または付加である。
Regarding the above-mentioned a3) protein 1, the above-mentioned b3)
上記a3)のタンパク質1、上記のb3)のタンパク質2、上記のc3)のタンパク質3、上記のd3)のタンパク質4、上記のe3)のタンパク質5、および上記のf3)のタンパク質6は全て、人工的に合成することができるか、または、それらのコード遺伝子を合成し、次いで生物学的発現を行うことによって得ることができる。
The protein 1 of the above a3), the
上記のa3)のタンパク質1のコード遺伝子は、配列表の配列番号9で示されるDNA配列内の1つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに/または1つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに/または表1に示すタグのコード配列をその5’末端および/もしくは3’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。 The coding gene for protein 1 of a3) above is obtained by deleting the codons of one or more amino acid residues in the DNA sequence shown by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and / or one or more. It can be obtained by performing a base pair missense mutation and / or by ligating the coding sequence of the tag shown in Table 1 to its 5'end and / or 3'end.
上記のb3)のタンパク質2のコード遺伝子は、配列表の配列番号10で示されるDNA配列内の1つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに/または1つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに/または表1に示すタグのコード配列をその5’末端および/もしくは3’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。
The coding gene for
上記のc3)のタンパク質3のコード遺伝子は、配列表の配列番号11で示されるDNA配列内の1つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに/または1つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに/または表1に示すタグのコード配列をその5’末端および/もしくは3’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。 The coding gene for protein 3 of c3) above can be obtained by deleting the codons of one or more amino acid residues in the DNA sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, and / or one or more. It can be obtained by performing a base pair missense mutation and / or by ligating the coding sequence of the tag shown in Table 1 to its 5'end and / or 3'end.
上記のd3)のタンパク質4のコード遺伝子は、配列表の配列番号12で示されるDNA配列内の1つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに/または1つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに/または表1に示すタグのコード配列をその5’末端および/もしくは3’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。 The coding gene for protein 4 of d3) above is obtained by deleting the codons of one or more amino acid residues in the DNA sequence shown by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing, and / or one or more. It can be obtained by performing a base pair missense mutation and / or by ligating the coding sequence of the tag shown in Table 1 to its 5'end and / or 3'end.
上記のe3)のタンパク質5のコード遺伝子は、配列表の配列番号13で示されるDNA配列内の1つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに/または1つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに/または表1に示すタグのコード配列をその5’末端および/もしくは3’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。 The coding gene for protein 5 of e3) above is obtained by deleting the codons of one or more amino acid residues in the DNA sequence shown by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing, and / or one or more. It can be obtained by performing a base pair missense mutation and / or by ligating the coding sequence of the tag shown in Table 1 to its 5'end and / or 3'end.
上記のf3)のタンパク質6のコード遺伝子は、配列表の配列番号14で示されるDNA配列内の1つもしくは複数のアミノ酸残基のコドンを欠失させることによって、ならびに/または1つもしくは複数の塩基対のミスセンス変異を行うことによって、ならびに/または表1に示すタグのコード配列をその5’末端および/もしくは3’末端にライゲーションすることによって、得ることができる。 The coding gene for protein 6 of f3) above is obtained by deleting the codons of one or more amino acid residues in the DNA sequence shown by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, and / or one or more. It can be obtained by performing a base pair missense mutation and / or by ligating the coding sequence of the tag shown in Table 1 to its 5'end and / or 3'end.
上記で使用する場合、用語「同一性」は、ネイティブのアミノ酸配列に対する配列類似性を指す。「同一性」は、本発明によって提供されるタンパク質のアミノ酸配列と80%、または85%もしくはそれを超える、または90%もしくはそれを超える、または95%もしくはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む。 As used above, the term "identity" refers to sequence similarity to a native amino acid sequence. "Identity" refers to an amino acid sequence having 80%, or 85% or more, 90% or more, or 95% or more identity with the amino acid sequence of the protein provided by the present invention. include.
タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子もまた、本発明の範囲内である。 Nucleic acid molecules encoding protein combinations are also within the scope of the invention.
タンパク質1をコードする核酸分子は、以下のA1)またはA2)またはA3)またはA4)で示されるDNA分子であり得る:
A1)そのコード領域が配列表の配列番号3の5’末端から1044~3050位で示される、DNA分子、
A2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号3で示される、DNA分子、
A3)Schizochytriumに由来し、タンパク質1をコードする、A1)またはA2)によって規定されるヌクレオチド配列と75%またはそれを超える同一性を有するDNA分子、
A4)ストリンジェントな条件下でA1)またはA2)によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質1をコードするDNA分子。
The nucleic acid molecule encoding protein 1 can be the DNA molecule represented by A1) or A2) or A3) or A4) below:
A1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1044 to 3050 from the 5'end of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
A2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
A3) A DNA molecule derived from Schizochytrium that encodes protein 1 and has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by A1) or A2).
A4) A DNA molecule that hybridizes to the nucleotide sequence defined by A1) or A2) under stringent conditions and encodes protein 1.
タンパク質2をコードする核酸分子は、以下のB1)またはB2)またはB3)またはB4)で示されるDNA分子であり得る:
B1)そのコード領域が配列表の配列番号4の5’末端から1068~2737位および3254~5162位で示される、DNA分子、
B2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号4で示される、DNA分子、
B3)Schizochytriumに由来し、タンパク質2をコードする、B1)またはB2)によって規定されるヌクレオチド配列と75%またはそれを超える同一性を有するDNA分子、
B4)ストリンジェントな条件下でB1)またはB2)によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質2をコードするDNA分子。
The nucleic acid
B1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1068 to 2737 and 3254 to 5162 from the 5'end of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
B2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
B3) A DNA molecule derived from Schizochytrium that encodes
B4) A DNA molecule that hybridizes to the nucleotide sequence defined by B1) or B2) under stringent conditions and encodes
タンパク質3をコードする核酸分子は、以下のC1)またはC2)またはC3)またはC4)で示されるDNA分子であり得る:
C1)そのコード領域が配列表の配列番号5の5’末端から1094~3415位で示される、DNA分子、
C2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号5で示される、DNA分子、
C3)Schizochytriumに由来し、タンパク質3をコードする、C1)またはC2)によって規定されるヌクレオチド配列と75%またはそれを超える同一性を有するDNA分子、
C4)ストリンジェントな条件下でC1)またはC2)によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質3をコードするDNA分子。
The nucleic acid molecule encoding protein 3 can be the DNA molecule represented by C1) or C2) or C3) or C4) below:
C1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1094 to 3415 from the 5'end of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
C2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
C3) A DNA molecule derived from Schizochytrium that encodes protein 3 and has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by C1) or C2).
C4) A DNA molecule that hybridizes to the nucleotide sequence defined by C1) or C2) under stringent conditions and encodes protein 3.
タンパク質4をコードする核酸分子は、以下のD1)またはD2)またはD3)またはD4)で示されるDNA分子であり得る:
D1)そのコード領域が配列表の配列番号6の5’末端から1409~5044位、7004~7234位、および7700~10399位で示される、DNA分子、
D2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号6で示される、DNA分子、
D3)Schizochytriumに由来し、タンパク質4をコードする、D1)またはD2)によって規定されるヌクレオチド配列と75%またはそれを超える同一性を有するDNA分子、
D4)ストリンジェントな条件下でD1)またはD2)によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質4をコードするDNA分子。
The nucleic acid molecule encoding protein 4 can be the DNA molecule represented by D1) or D2) or D3) or D4) below:
D1) The DNA molecule whose coding region is shown at positions 1409-5044, 7004-7234, and 7700-10399 from the 5'end of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
D2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
D3) A DNA molecule derived from Schizochytrium that encodes protein 4 and has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by D1) or D2).
D4) A DNA molecule that hybridizes to the nucleotide sequence defined by D1) or D2) under stringent conditions and encodes protein 4.
タンパク質5をコードする核酸分子は、以下のE1)またはE2)またはE3)またはE4)で示されるDNA分子であり得る:
E1)そのコード領域が配列表の配列番号7の5’末端から1473~6488位で示される、DNA分子、
E2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号7で示される、DNA分子、
E3)Schizochytriumに由来し、タンパク質5をコードする、E1)またはE2)によって規定されるヌクレオチド配列と75%またはそれを超える同一性を有するDNA分子、
E4)ストリンジェントな条件下でE1)またはE2)によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質5をコードするDNA分子。
The nucleic acid molecule encoding protein 5 can be the DNA molecule represented by E1) or E2) or E3) or E4) below:
E1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1473 to 6488 from the 5'end of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
E2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
E3) A DNA molecule derived from Schizochytrium that encodes protein 5 and has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by E1) or E2).
E4) A DNA molecule that hybridizes to the nucleotide sequence defined by E1) or E2) under stringent conditions and encodes protein 5.
タンパク質6をコードする核酸分子は、以下のF1)またはF2)またはF3)またはF4)で示されるDNA分子であり得る:
F1)そのコード領域が配列表の配列番号8の5’末端から953~991位および1063~1090位で示される、DNA分子、
F2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号8で示される、DNA分子、
F3)Schizochytriumに由来し、タンパク質6をコードする、F1)またはF2)によって規定されるヌクレオチド配列と75%またはそれを超える同一性を有するDNA分子、
F4)ストリンジェントな条件下でF1)またはF2)によって規定されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、タンパク質6をコードするDNA分子。
The nucleic acid molecule encoding protein 6 can be the DNA molecule represented by F1) or F2) or F3) or F4) below:
F1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 953 to 991 and 1063 to 1090 from the 5'end of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
F2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
F3) A DNA molecule derived from Schizochytrium that encodes protein 6 and has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by F1) or F2).
F4) A DNA molecule that hybridizes to the nucleotide sequence defined by F1) or F2) under stringent conditions and encodes protein 6.
ここで、核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、または組換えDNAなどのDNAであり得、核酸分子はまた、mRNAまたはhnRNAなどのRNAでもあり得る。核酸分子は、タンパク質の組み合わせおよびその調節配列をコードする遺伝子によって形成される核酸分子であり得る。 Here, the nucleic acid molecule can be DNA such as cDNA, genomic DNA, or recombinant DNA, and the nucleic acid molecule can also be RNA such as mRNA or hnRNA. Nucleic acid molecules can be nucleic acid molecules formed by genes encoding protein combinations and their regulatory sequences.
ここで、配列表の配列番号3は4100のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号3で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号4は6200のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号4で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号5は4500のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号5で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号6は11100のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号6で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号7は7767のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号7で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列をコードする。配列表の配列番号8は7800のヌクレオチドからなり、配列表の配列番号8で示されるヌクレオチド配列は、配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列をコードする。 Here, SEQ ID NO: 3 in the sequence listing consists of 4100 nucleotides, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. SEQ ID NO: 4 of the sequence listing consists of 6200 nucleotides, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 of the sequence listing. SEQ ID NO: 5 in the sequence listing consists of 4500 nucleotides, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing. SEQ ID NO: 6 of the sequence listing consists of 11100 nucleotides, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 of the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 of the sequence listing. SEQ ID NO: 7 of the sequence listing consists of 7767 nucleotides, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 of the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 of the sequence listing. SEQ ID NO: 8 of the sequence listing consists of 7800 nucleotides, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 of the sequence listing encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 of the sequence listing.
当業者であれば、指向性進化法および点変異法などの公知の方法を使用して、本発明のタンパク質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を容易に変異させることができる。本発明のタンパク質の組み合わせのヌクレオチド配列に対して75%またはそれを超える相同性を有する、これらの人工的に修飾されたヌクレオチドは全て、それらがタンパク質の組み合わせをコードし、Schizochytriumに由来する限り、本発明のヌクレオチド配列に由来するものであり、本発明の配列に同一である。本明細書において使用する用語「同一性」は、ネイティブの核酸配列に対する配列類似性を指す。「同一性」は、本発明のタンパク質の組み合わせをコードするヌクレオチド配列と75%もしくはそれを超える、80%もしくはそれを超える、または85%もしくはそれを超える、または90%もしくはそれを超える、または95%もしくはそれを超える同一性を有するヌクレオチド配列を含む。 Those skilled in the art can readily mutate the nucleotide sequences encoding the protein combinations of the invention using known methods such as directional evolution and point mutations. All of these artificially modified nucleotides having 75% or more homology to the nucleotide sequence of the protein combination of the invention, as long as they encode the protein combination and are derived from Schizochytrium. It is derived from the nucleotide sequence of the present invention and is identical to the sequence of the present invention. As used herein, the term "identity" refers to sequence similarity to a native nucleic acid sequence. "Identity" is 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95 with the nucleotide sequence encoding the protein combination of the invention. Includes nucleotide sequences with% or greater identity.
核酸分子を含有する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物、またはトランスジェニック細胞系もまた、本発明の保護範囲内にある。 Expression cassettes, recombinant vectors, recombinant microorganisms, or transgenic cell lines containing nucleic acid molecules are also within the scope of the invention.
組換えベクターは、タンパク質1をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号3で示されるDNA分子)、タンパク質2をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号4で示されるDNA分子)、タンパク質3をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号5で示されるDNA分子)、タンパク質4をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号6で示されるDNA分子)、タンパク質5をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号7で示されるDNA分子)、およびタンパク質6をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号8で示されるDNA分子)を出発プラスミド内に挿入することによって得られる組換えプラスミドであり得る。 The recombinant vector is a nucleic acid molecule encoding protein 1 (that is, a DNA molecule represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) and a nucleic acid molecule encoding protein 2 (that is, a DNA molecule represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing). , The nucleic acid molecule encoding protein 3 (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing), the nucleic acid molecule encoding protein 4 (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing), protein 5. Insert the encoding nucleic acid molecule (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) and the nucleic acid molecule encoding protein 6 (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) into the starting plasmid. It can be a recombinant plasmid obtained by this.
組換え微生物は、組換えベクターを出発微生物内に導入することによって得ることができる。出発微生物は、酵母、細菌、藻類、または真菌であり得る。真菌は、Schizochytriumであり得る。Schizochytriumは、具体的には、株Schizochytrium limacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381であり得る。組換え微生物は、具体的には、実施例で言及されるGS-C06株であり得る。 Recombinant microorganisms can be obtained by introducing a recombinant vector into the starting microorganism. The starting microorganism can be yeast, bacteria, algae, or fungi. The fungus can be a Schizochytrium. The Schizochytrium can be specifically the strain Schizochytrium lilacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381. The recombinant microorganism can be specifically the GS-C06 strain referred to in the Examples.
DHAおよび/またはEPAの生産における、上記のうちのいずれか1つに従ったタンパク質の組み合わせ、または上記のうちのいずれか1つに従った核酸分子、または上記のうちのいずれか1つに従った核酸分子を含有する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物、もしくはトランスジェニック細胞系の使用もまた、本発明の保護範囲内である。 In the production of DHA and / or EPA, a combination of proteins according to any one of the above, or a nucleic acid molecule according to any one of the above, or according to any one of the above. The use of expression cassettes, recombinant vectors, recombinant microorganisms, or transgenic cell lines containing nucleic acid molecules is also within the scope of the invention.
本発明はまた、組換え株Bを保護し、その調製方法は、以下の通りであり得る:出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させて、組換え株、すなわち、組換え株Bを得ること。「出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させる」ステップは、タンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させる物質を出発株に導入することによって実現される。「タンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させる物質を出発株に導入する」ステップは、タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子を出発株に導入することによって実現される。出発株は、Schizochytriumであり得る。Schizochytriumは、具体的には、株Schizochytrium limacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381であり得る。 The invention also protects recombinant strain B and methods of its preparation may be as follows: Increased expression and / or activity of the protein combination in the starting strain, recombinant strain, ie, recombinant. Obtain stock B. The step of "increasing the expression and / or activity of a protein combination in a starting strain" is accomplished by introducing into the starting strain a substance that increases the expression and / or activity of the protein combination. The step of "introducing a substance that increases the expression and / or activity of a protein combination into the starting strain" is realized by introducing a nucleic acid molecule encoding the protein combination into the starting strain. The starting strain can be Schizochytrium. The Schizochytrium can be specifically the strain Schizochytrium lilacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381.
組換え株Bは、具体的には、実施例で言及されるGS-C06株であり得る。 The recombinant strain B can be specifically the GS-C06 strain referred to in the examples.
本発明は、以下のステップを順に含み得る、DHAおよび/またはEPAを生産する方法をさらに保護する:
(1)出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させて、組換え株Aを得るステップであって、DHAおよび/またはEPAを生産する組換え株Aの能力が、出発株と比較して向上する、ステップ、
(2)組換え株Aを発酵させて、DHAおよび/またはEPAを得るステップ。
The present invention further protects the method of producing DHA and / or EPA, which may include the following steps in sequence:
(1) In the step of increasing the expression and / or activity of the protein combination in the starting strain to obtain recombinant strain A, the ability of recombinant strain A to produce DHA and / or EPA is the same as that of the starting strain. Compare and improve, steps,
(2) A step of fermenting recombinant strain A to obtain DHA and / or EPA.
上記の方法において、組換え株Aは組換え株Bであり得る。 In the above method, recombinant strain A can be recombinant strain B.
上記の方法において、「出発株におけるタンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させて、組換え株Aを得る」ステップは、タンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させる物質を出発株に導入することによって実現される。 In the above method, the step of "increasing the expression and / or activity of the protein combination in the starting strain to obtain recombinant strain A" is to use a substance that increases the expression and / or activity of the protein combination as the starting strain. It will be realized by introducing it.
上記の方法において、「タンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させる物質を出発株に導入する」ステップは、タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子を出発株に導入することによって実現される。 In the above method, the step of "introducing a substance that increases the expression and / or activity of a protein combination into the starting strain" is realized by introducing a nucleic acid molecule encoding the protein combination into the starting strain.
上記の方法において、出発株は、Schizochytriumであり得る。Schizochytriumは、具体的には、株Schizochytrium limacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381であり得る。 In the above method, the starting strain can be Schizochytrium. The Schizochytrium can be specifically the strain Schizochytrium lilacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381.
上記の方法において、組換え株Aは、具体的には、実施例で言及されるGS-C06株であり得る。 In the above method, the recombinant strain A can be specifically the GS-C06 strain referred to in the examples.
上記において、「タンパク質の組み合わせをコードする核酸分子を出発株に導入する」ステップは、組換えベクターを出発株に導入することによって実現することができ、組換えベクターは、タンパク質1をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号3で示されるDNA分子)、タンパク質2をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号4で示されるDNA分子)、タンパク質3をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号5で示されるDNA分子)、タンパク質4をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号6で示されるDNA分子)、タンパク質5をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号7で示されるDNA分子)、およびタンパク質6をコードする核酸分子(すなわち、配列表の配列番号8で示されるDNA分子)を発現ベクター内に挿入することによって得られる組換えプラスミドであり得る。 In the above, the step of "introducing a nucleic acid molecule encoding a protein combination into a starting strain" can be realized by introducing a recombinant vector into the starting strain, wherein the recombinant vector is a nucleic acid encoding protein 1. A molecule (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), a nucleic acid molecule encoding protein 2 (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), a nucleic acid molecule encoding protein 3 (ie, the nucleic acid molecule). The DNA molecule represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, the nucleic acid molecule encoding protein 4 (ie, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing), and the nucleic acid molecule encoding protein 5 (ie, the sequence in the sequence listing). It can be a recombinant plasmid obtained by inserting the DNA molecule represented by No. 7) and the nucleic acid molecule encoding protein 6 (that is, the DNA molecule represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) into the expression vector.
本発明は、ドコサヘキサエン酸および/またはEPAを生産する細菌の株をさらに保護し、この株は、中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心での受託番号CGMCC第13746号を有するSchizoochytrium limacinum HS01である。 The present invention further protects strains of bacteria that produce docosahexaenoic acid and / or EPA, which strain is Schizoochytrium lilacinum HS01 with accession number CGMCC No. 13746 at the China Microbial Strain Conservation Management Commission Ordinary Microbial Center. ..
本発明は、Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号、または上記のうちのいずれか1つに従った組換え株Bを含む微生物剤をさらに提供する。 The present invention further provides a microbial agent comprising Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC No. 13746, or recombinant strain B according to any one of the above.
ドコサヘキサエン酸および/またはEPAの生産における、Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号、または上記のうちのいずれか1つに従った組換え株B、または微生物剤の使用もまた、本発明の保護範囲内である。 The use of Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC No. 13746, or recombinant strain B according to any one of the above, or microbial agent in the production of docosahexaenoic acid and / or EPA is also within the scope of the invention. be.
本発明は、Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号、または上記のうちのいずれか1つに従った組換え株Bを発酵させて、ドコサヘキサエン酸および/またはEPAを得るステップを含む、ドコサヘキサエン酸および/またはEPAを生産する方法をさらに保護する。 The present invention comprises the steps of fermenting schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC No. 13746, or recombinant strain B according to any one of the above to obtain docosahexaenoic acid and / or EPA, docosahexaenoic acid and / or. Further protect the way EPA is produced.
上記の方法において、発酵培養において使用される発酵培地溶質およびその溶解度は、グルコース20~120g/L(20~60g/L、60~120g/L、20g/L、60g/L、または120g/Lなど)、グルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム5~15g/L(5~10g/L、10~15g/L、5g/L、10g/L、または15g/Lなど)、コーンシロップ乾燥粉末3~15g/L(3~10g/L、10~15g/L、3g/L、10g/L、または15g/Lなど)、Na2SO4 5~24g/L(5~14g/L、14~24g/L、5g/L、14g/L、または24g/Lなど)、KCl 0.1~1.0g/L(0.1~0.5g/L、0.5~1.0g/L、0.1g/L、0.5g/L、または1.0g/Lなど)、MgSO4 1.0~3.0g/L(1.0~2.0g/L、2.0~3.0g/L、1.0g/L、2.0g/L、または3.0g/Lなど)、K2SO4 0.3~1.5g/L(0.3~1.0g/L、1.0~1.5g/L、0.3g/L、1.0g/L、または1.5g/Lなど)、KH2PO4 0.5~1.5g/L(0.5~1.0g/L、1.0~1.5g/L、0.5g/L、1.0g/L、または1.5g/Lなど)、(NH4)2SO4 0.5~1.5g/L(0.5~1.0g/L、1.0~1.5g/L、0.5g/L、1.0g/L、または1.5g/Lなど)、CaCl2 0.1~1.0g/L(0.1~0.5g/L、0.5~1.0g/L、0.1g/L、0.5g/L、または1.0g/Lなど)であり得、溶媒は水であり得、pHは、5.0~6.5(5.0、6.0、または6.5など)の範囲であり得る。発酵培地は、具体的には、60gのグルコース、10gのグルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム、10gのコーンシロップ乾燥粉末、14gのNa2SO4、0.5gのKCl、2.0gのMgSO4、1.0gのK2SO4、1.0gのKH2PO4、1.0gの(NH4)2SO4、および0.5gのCaCl2が1Lの蒸留水中に溶解され、pHが6.0に調整されているものであり得る。 In the above method, the fermentation medium solute and its solubility used in the fermentation culture are glucose 20-120 g / L (20-60 g / L, 60-120 g / L, 20 g / L, 60 g / L, or 120 g / L). , Etc.), glutamate or sodium glutamate 5-15 g / L (5-10 g / L, 10-15 g / L, 5 g / L, 10 g / L, or 15 g / L, etc.), corn syrup dry powder 3-15 g / L (etc.) 3-10g / L, 10-15g / L, 3g / L, 10g / L, or 15g / L, etc.), Na 2 SO 4 5-24g / L (5-14g / L, 14-24g / L, 5g, etc.) / L, 14 g / L, or 24 g / L, etc.), KCl 0.1-1.0 g / L (0.1-0.5 g / L, 0.5-1.0 g / L, 0.1 g / L, etc.) , 0.5 g / L, or 1.0 g / L, etc.), Л4 1.0 to 3.0 g / L (1.0 to 2.0 g / L, 2.0 to 3.0 g / L, 1. 0 g / L, 2.0 g / L, 3.0 g / L, etc.), K 2 SO 4 0.3 to 1.5 g / L (0.3 to 1.0 g / L, 1.0 to 1.5 g, etc.) / L, 0.3 g / L, 1.0 g / L, or 1.5 g / L, etc.), KH 2 PO 4 0.5 to 1.5 g / L (0.5 to 1.0 g / L, 1. 0-1.5 g / L, 0.5 g / L, 1.0 g / L, 1.5 g / L, etc.), (NH 4 ) 2 SO 4 0.5-1.5 g / L (0.5- 1.0 g / L, 1.0 to 1.5 g / L, 0.5 g / L, 1.0 g / L, 1.5 g / L, etc.), CaCl 2 0.1 to 1.0 g / L (0) .1 to 0.5 g / L, 0.5 to 1.0 g / L, 0.1 g / L, 0.5 g / L, 1.0 g / L, etc.), and the solvent can be water. The pH can range from 5.0 to 6.5 (such as 5.0, 6.0, or 6.5). The fermentation medium is specifically 60 g glucose, 10 g glutamic acid or sodium glutamate, 10 g corn syrup dry powder, 14 g Na 2 SO 4 , 0.5 g KCl, 2.0 g Л 4 , 1.0 g. K 2 SO 4 , 1.0 g KH 2 PO 4 , 1.0 g (NH 4 ) 2 SO 4 , and 0.5 g CaCl 2 are dissolved in 1 L of distilled water to adjust the pH to 6.0. It can be what has been done.
上記の方法において、発酵培養における最初のバイオマスは、1.0×108~2.5×108cfu/mL(1.0×108~1.5×108cfu/mL、1.5×108~2.5×108cfu/mL、1.0×108cfu/mL、1.5×108cfu/mL、または2.5×108cfu/mLなど)であり得る。 In the above method, the first biomass in the fermented culture is 1.0 x 10 8 to 2.5 x 10 8 cfu / mL (1.0 x 10 8 to 1.5 x 10 8 cfu / mL, 1.5). It can be × 10 8 to 2.5 × 10 8 cfu / mL, 1.0 × 10 8 cfu / mL, 1.5 × 10 8 cfu / mL, or 2.5 × 10 8 cfu / mL.
上記の方法において、発酵培養における最初のバイオマスは、5.0×108~3.0×109cfu/mL(5.0×108~1.0×109cfu/mL、1.0×109~3.0×109cfu/mL、5.0×108cfu/mL、1.0×109cfu/mL、または3.0×109cfu/mLなど)であり得る。 In the above method, the first biomass in the fermented culture is 5.0 × 10 8 to 3.0 × 10 9 cfu / mL (5.0 × 10 8 to 1.0 × 10 9 cfu / mL, 1.0. It can be × 10 9 to 3.0 × 10 9 cfu / mL, 5.0 × 10 8 cfu / mL, 1.0 × 10 9 cfu / mL, or 3.0 × 10 9 cfu / mL).
上記の方法において、発酵培養の接種材料は、3~10%(3~5%、5~10%、3%、5%、または10%など)であり得る。 In the above method, the inoculum of the fermented culture can be 3-10% (3-5%, 5-10%, 3%, 5%, or 10%, etc.).
上記の方法において、発酵培養の培養条件は、22~28℃(22~25℃、25~28℃、22℃、25℃、または28℃など)で72~120時間(72~100時間、100~120時間、72時間、100時間、または120時間など)であり得、溶存酸素濃度は、5~80%(5~50%、50~80%、5%、50%、または80%など)である。 In the above method, the culture conditions for fermentation culture are 22 to 28 ° C (22 to 25 ° C, 25 to 28 ° C, 22 ° C, 25 ° C, or 28 ° C, etc.) for 72 to 120 hours (72 to 100 hours, 100). It can be ~ 120 hours, 72 hours, 100 hours, or 120 hours, etc.), and the dissolved oxygen concentration is 5-80% (5-50%, 50-80%, 5%, 50%, or 80%, etc.). Is.
上記の方法において、「Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号、または上記のうちのいずれか1つに従った組換え株Bを発酵させること」は、一次シード培養ブロスを調製すること、および/または二次シードブロスを調製すること、および/または発酵した一次シードブロスを調製すること、および/または発酵した二次シードブロスを調製することをさらに含み得る。 In the above method, "fermenting recombinant strain B according to Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC No. 13746, or any one of the above" is to prepare a primary seed culture broth and / or two. Further comprising preparing a secondary seed broth and / or preparing a fermented primary seed broth and / or preparing a fermented secondary seed broth.
一次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る:Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号、または上記のうちのいずれか1つに従った組換え株Bを振とうフラスコ培養して、一次シードブロスを得ること;
二次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る:一次シードブロスを振とうフラスコ培養して、二次シードブロスを得ること;
発酵した一次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る:二次シードブロスを発酵させて、発酵した一次シードブロスを得ること;
発酵した二次シードブロスを調製するステップは、以下の通りであり得る:発酵した一次シードブロスを発酵させて、発酵した二次シードブロスを得ること。
The steps to prepare the primary seed broth may be as follows: Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC No. 13746, or recombinant strain B according to any one of the above is shaken flask culture and primary seed. Get broth;
The steps to prepare the secondary seed broth can be as follows: The primary seed broth is shaken in a flask and cultured to obtain the secondary seed broth;
The steps to prepare the fermented primary seed broth can be as follows: ferment the secondary seed broth to obtain the fermented primary seed broth;
The steps to prepare a fermented secondary seed broth can be as follows: Fermenting the fermented primary seed broth to obtain the fermented secondary seed broth.
一次シードブロスの調製および二次シードブロスの調製において、振とうフラスコ培養において使用される振とうフラスコ培地溶質およびその溶解度は、グルコース10~90g/L(10~50g/L、50~90g/L、10g/L、50g/L、または90g/Lなど)、酵母粉末5~25g/L(5~15g/L、15~25g/L、5g/L、15g/L、または25g/Lなど)であり得、溶媒は水であり得、pHは自然のものであり得る。「振とうフラスコ培養」の培養条件は、22~28℃(22~25℃、25~28℃、22℃、25℃、または28℃など)で、150~250rpm/分(150~200rpm/分、200~250rpm/分、150rpm/分、200rpm/分、または250rpm/分など)で24~48時間(24~36時間、36~48時間、24時間、36時間、または48時間など)、培養することである。振とうフラスコ培養の接種材料の量は、3~10%(3~5%、5~10%、3%、5%、または10%など)である。振とうフラスコ培地は、具体的には、50gのグルコースおよび15gの酵母粉末が1Lの蒸留水に溶解され、pHが自然のものであり得る。 In the preparation of the primary seed broth and the preparation of the secondary seed broth, the shaking flask medium solute used in the shaking flask culture and its solubility are glucose 10 to 90 g / L (10 to 50 g / L, 50 to 90 g / L). 10 g / L, 50 g / L, 90 g / L, etc.), yeast powder 5-25 g / L (5-15 g / L, 15-25 g / L, 5 g / L, 15 g / L, or 25 g / L, etc.) The solvent can be water and the pH can be natural. The culture conditions for "shaking flask culture" are 22 to 28 ° C (22 to 25 ° C, 25 to 28 ° C, 22 ° C, 25 ° C, or 28 ° C, etc.) and 150 to 250 rpm / min (150 to 200 rpm / min). , 200-250 rpm / min, 150 rpm / min, 200 rpm / min, or 250 rpm / min, etc.) for 24-48 hours (24-36 hours, 36-48 hours, 24 hours, 36 hours, or 48 hours, etc.), culture It is to be. The amount of inoculum for the shaking flask culture is 3-10% (3-5%, 5-10%, 3%, 5%, or 10%, etc.). In the shaking flask medium, specifically, 50 g of glucose and 15 g of yeast powder are dissolved in 1 L of distilled water, and the pH can be natural.
発酵した一次シードブロスの調製および発酵した二次シードブロスの調製において、発酵培養で使用されるシード培地溶質およびその溶解度は、グルコース20~100g/L(20~60g/L、60~120g/L、20g/L、60g/L、または120g/Lなど)、酵母粉末5~15g/L(5~10g/L、10~15g/L、5g/L、10g/L、または15g/Lなど)、Na2SO4 5~24g/L(5~10g/L、10~24g/L、5g/L、10g/L、または24g/Lなど)、KCl 0.1~1.0g/L(0.1~0.5g/L、0.5~1.0g/L、0.1g/L、0.5g/L、または1.0g/Lなど)、MgSO4 1.0~3.0g/L(1.0~2.0g/L、2.0~3.0g/L、1.0g/L、2.0g/L、または3.0g/Lなど)、K2SO4 0.3~1.5g/L(0.3~1.0g/L、1.0~1.5g/L、0.3g/L、1.0g/L、または1.5g/Lなど)、KH2PO4 0.5~1.5g/L(0.5~1.0g/L、1.0~1.5g/L、0.5g/L、1.0g/L、または1.5g/Lなど)、(NH4)2SO4 0.5~1.5g/L(0.5~1.0g/L、1.0~1.5g/L、0.5g/L、1.0g/L、または1.5g/Lなど)、CaCl2 0.1~1.0g/L(0.1~0.5g/L、0.5~1.0g/L、0.1g/L、0.5g/L、または1.0g/Lなど)であり得、溶媒は水であり得、pHは5.0~6.5(5.0、6.0、または6.5など)であり得る。「発酵培養」の培養条件は、22~28℃(22~25℃、25~28℃、22℃、25℃、または28℃など)で24~48時間(24~36時間、36~48時間、24時間、36時間、または48時間など)培養することであり、溶存酸素濃度は、10~80%(10~50%、50~80%、10%、50%、または80%など)である。発酵培養の接種材料の量は、3~10%(3~5%、5~10%、3%、5%、または10%など)である。シード培地は、具体的には、60gのグルコース、10gの酵母粉末、10gのNa2SO4、0.5gのKCl、2.0gのMgSO4、1.0gのK2SO4、1.0gのKH2PO4、1.0gの(NH4)2SO4、および0.5gのCaCl2を1Lの蒸留水に溶解し、pHが6.0に調整されているものであり得る。 In the preparation of fermented primary seed broth and the preparation of fermented secondary seed broth, the seed medium solute used in the fermentation culture and its solubility are glucose 20-100 g / L (20-60 g / L, 60-120 g / L). , 20 g / L, 60 g / L, or 120 g / L, etc.), yeast powder 5 to 15 g / L (5 to 10 g / L, 10 to 15 g / L, 5 g / L, 10 g / L, or 15 g / L, etc.) , Na 2 SO 4 5 to 24 g / L (5 to 10 g / L, 10 to 24 g / L, 5 g / L, 10 g / L, or 24 g / L, etc.), KCl 0.1 to 1.0 g / L (0) .1 to 0.5 g / L, 0.5 to 1.0 g / L, 0.1 g / L, 0.5 g / L, 1.0 g / L, etc.), Л4 1.0 to 3.0 g / L (1.0 to 2.0 g / L, 2.0 to 3.0 g / L, 1.0 g / L, 2.0 g / L, 3.0 g / L, etc.), K 2 SO 4 0.3 ~ 1.5 g / L (0.3 ~ 1.0 g / L, 1.0 ~ 1.5 g / L, 0.3 g / L, 1.0 g / L, 1.5 g / L, etc.), KH 2 PO 4 0.5-1.5 g / L (0.5-1.0 g / L, 1.0-1.5 g / L, 0.5 g / L, 1.0 g / L, or 1.5 g / L Etc.), (NH 4 ) 2 SO 4 0.5-1.5 g / L (0.5-1.0 g / L, 1.0-1.5 g / L, 0.5 g / L, 1.0 g / L) L, or 1.5 g / L, etc.), CaCl 2 0.1-1.0 g / L (0.1-0.5 g / L, 0.5-1.0 g / L, 0.1 g / L, 0) It can be .5 g / L, or 1.0 g / L, etc.), the solvent can be water, and the pH can be 5.0-6.5 (5.0, 6.0, or 6.5, etc.). obtain. The culture conditions of "fermentation culture" are 22 to 28 ° C (22 to 25 ° C, 25 to 28 ° C, 22 ° C, 25 ° C, or 28 ° C, etc.) for 24 to 48 hours (24 to 36 hours, 36 to 48 hours). , 24 hours, 36 hours, or 48 hours, etc.), and the dissolved oxygen concentration is 10 to 80% (10 to 50%, 50 to 80%, 10%, 50%, or 80%, etc.). be. The amount of inoculum in the fermented culture is 3-10% (3-5%, 5-10%, 3%, 5%, or 10%, etc.). Specifically, the seed medium was 60 g of glucose, 10 g of yeast powder, 10 g of Na 2 SO 4 , 0.5 g of KCl, 2.0 g of distillation 4 , 1.0 g of K 2 SO 4 , 1.0 g. KH 2 PO 4 , 1.0 g (NH 4 ) 2 SO 4 , and 0.5 g CaCl 2 can be dissolved in 1 L of distilled water and adjusted to 6.0 pH.
発酵ブロスは、上記のうちのいずれか1つに従ったSchizoochytrium limacinum HS01または組換え細菌Bを発酵させることによって得られる。結果は、DHAが発酵ブロス中の油脂の45.0%~60.0%を占め、EPAが油脂の0.2%~1.0%を占めることを示す。 Fermentation broth is obtained by fermenting Schizoochytrium limacinum HS01 or recombinant bacterium B according to any one of the above. The results show that DHA accounts for 45.0% to 60.0% of fats and oils in the fermented broth and EPA accounts for 0.2% to 1.0% of fats and oils.
したがって、本発明によって提供されるSchizoochytrium limacinum HS01の使用は、DHAおよび/またはEPAを生産し得、重要な応用価値を有する。本発明によって提供される、DHAおよびEPA合成に関連する遺伝子断片のセットは、遺伝子断片1から遺伝子断片6からなり、それらのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号3から配列番号8で順に示される。実験は、遺伝子断片1から遺伝子断片6がSchizoochytrium limacinum MYA-1381に導入されて、組換え株が得られ、DHAおよびEPAを生産する組換え株の能力が大きく増強されていることを示している。したがって、本発明によって提供される6つの遺伝子断片、これらの6つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質、およびこれらの6つの遺伝子断片を含有するベクター、細胞、または生物は、DHAおよびEPAの生産において重要な応用価値を有する。 Therefore, the use of Schizoochytrium limacinum HS01 provided by the present invention can produce DHA and / or EPA and has significant application value. The set of gene fragments associated with DHA and EPA synthesis provided by the present invention consists of gene fragment 1 to gene fragment 6, and their nucleotide sequences are shown in sequence from SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8. .. Experiments have shown that gene fragment 1 to gene fragment 6 are introduced into Schizoochytrium limacinum MYA-1381 to give recombinant strains and greatly enhance the ability of recombinant strains to produce DHA and EPA. .. Therefore, the six gene fragments provided by the present invention, the proteins encoded by these six gene fragments, and the vectors, cells, or organisms containing these six gene fragments are important in the production of DHA and EPA. Has great application value.
寄託の説明
株の名称:Schizoochytrium limacinum
学名:Schizoochytrium limacinum
株番号:HS01
寄託機関:中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心
寄託機関の略記:CGMCC
住所:北京市朝陽区北辰西路1号院3号
寄託日:2017年3月10日
保蔵中心における受託番号:CGMCC第13746号
Description of the deposit Name of the strain: Schizoochytrium lilacinum
Scientific name: Schizoochytrium lilacinum
Stock number: HS01
Depositary organization: China Microbial Strain Storage Management Committee Abbreviation of depositary organization centered on ordinary microorganisms: CGMCC
Address: No. 1 Hospital, North Tatsu West Road, Chaoyang District, Beijing No. 3 Deposit date: March 10, 2017 Deposit number at the storage center: CGMCC No. 13746
本発明の詳細な説明
本発明を、具体的な実施形態を参照して、さらに以下に詳細に記載する。実施例は、本発明を説明するためのみに提供されており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
Detailed Description of the Invention The present invention will be described in more detail below with reference to specific embodiments. The examples are provided solely for illustration purposes and are not intended to limit the scope of the invention.
以下の実施例における実験方法は、別段の特定がない限り、従来の方法である。 The experimental methods in the following examples are conventional methods unless otherwise specified.
以下の実施例において使用される材料、試薬などは、別段の特定がない限り、市販されている。 Unless otherwise specified, the materials, reagents, etc. used in the following examples are commercially available.
以下の実施例における全ての定量的試験で、3回の反復実験を設定し、結果を平均した。 For all quantitative tests in the following examples, 3 repeat experiments were set up and the results were averaged.
以下の実施例において使用する培地は、以下の通りである。 The medium used in the following examples is as follows.
麦汁寒天培地:150gの麦芽抽出粉末を1Lの混合溶液(1容量部の天然海水および1容量部の蒸留水を混合することによって形成される)中に溶解し、pHは自然のものであり、次いで、寒天粉末を100mL当たり15gの濃度まで添加して、培地を得た。 Wheat agar medium: 150 g of malt extract powder is dissolved in 1 L of mixed solution (formed by mixing 1 volume of natural seawater and 1 volume of distilled water) and the pH is natural. Then, agar powder was added to a concentration of 15 g per 100 mL to obtain a medium.
スクリーニング用液体培地:50gのグルコースおよび15gの酵母粉末を1Lの混合物(1容量部の天然海水および1容量部の蒸留水を混合することによって形成される)中に溶解し、pHは自然のものである。 Liquid medium for screening: 50 g glucose and 15 g yeast powder are dissolved in 1 L mixture (formed by mixing 1 volume of natural seawater and 1 volume of distilled water) and the pH is natural. Is.
スクリーニング用固体培地:寒天粉末をスクリーニング用液体培地に100mL当たり15gの濃度まで添加して、培地を得た。 Solid medium for screening: Agar powder was added to the liquid medium for screening to a concentration of 15 g per 100 mL to obtain a medium.
スクリーニング用プレート:固体プレートを、約55℃のスクリーニング用固体培地を培養皿に注ぎ、冷却することによって調製した。 Screening Plate: A solid plate was prepared by pouring a screening solid medium at about 55 ° C. into a culture dish and cooling.
振とうフラスコ培地:50gのグルコースおよび15gの酵母粉末を1Lの蒸留水に溶解し、pHは自然のものであった。 Shaking flask medium: 50 g glucose and 15 g yeast powder were dissolved in 1 L distilled water and the pH was natural.
シード培地:グルコース60g、酵母粉末10g、Na2SO4 10g、KCl 0.5g、MgSO4 2.0g、K2SO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、(NH4)2SO4 1.0g、およびCaCl2 0.5gを1Lの蒸留水に溶解し、pHを6.0に調整した。 Seed medium: Glucose 60 g, yeast powder 10 g, Na 2 SO 4 10 g, KCl 0.5 g, distillation 4 2.0 g, K 2 SO 4 1.0 g, KH 2 PO 4 1.0 g, (NH 4 ) 2 SO 4 1.0 g and 0.5 g of CaCl were dissolved in 1 L of distilled water to adjust the pH to 6.0.
発酵培地:グルコース60g、グルタミン酸またはグルタミン酸ナトリウム10g、コーンシロップ乾燥粉末10g、Na2SO4 14g、KCl 0.5g、MgSO4 2.0g、K2SO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、(NH4)2SO4 1.0g、およびCaCl2 0.5gを1Lの蒸留水に溶解し、pHを6.0に調整した。 Fermentation medium: Glucose 60 g, Glutamic acid or Sodium glutamate 10 g, Corn syrup dry powder 10 g, Na 2 SO 4 14 g, KCl 0.5 g, Distilled 4 2.0 g, K 2 SO 4 1.0 g, KH 2 PO 4 1.0 g , (NH 4 ) 2 SO 4 1.0 g, and CaCl 2 0.5 g were dissolved in 1 L of distilled water to adjust the pH to 6.0.
コーンシロップ乾燥粉末は、Solarbio LIFE SCIENCESの製品であり、カタログ番号はFA0010である。酵母粉末は、Angel Yeast Co.,Ltd.の製品であり、カタログ番号はLMO2である。酵母ゲノム抽出キットは、TIANGEN BIOTECH CO.,LTD.の製品であり、カタログ番号はDP307である。高忠実度TransStart FastPfu DNAポリメラーゼは、TransGen Biotechの製品であり、カタログ番号はAP221である。アガロースゲルDNA回収キットは、TIANGEN BIOTECH CO.,LTD.の製品であり、カタログ番号はDP210である。pEASY-Bluntベクターは、TransGen Biotechの製品であり、カタログ番号はCB301-01である。 The corn syrup dry powder is a product of Solarbio LIFE SCIENCES and has a catalog number of FA0010. Yeast powder is available from Angel Yesst Co., Ltd. , Ltd. The catalog number is LMO2. The yeast genome extraction kit is available from TIANGEN BIOTECH CO. , LTD. The catalog number is DP307. The High Fidelity TransStart FastPfu DNA Polymerase is a product of TransGen Biotech and has a catalog number of AP221. The agarose gel DNA recovery kit is available from TIANGEN BIOTECH CO. , LTD. The catalog number is DP210. The pEASY-Blunt vector is a product of TransGen Biotech and has a catalog number of CB301-01.
株Schizochytrium limacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381は、American Type Culture Collection(ATCC、住所:American Type Culture Collection(ATCC)10801 University Boulevard Manassas、VA 20110 USA)に寄託されており、一般人は、この株をAmerican Type Culture Collectionから入手することができる。株Schizochytrium limacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381は、以下、簡単に、MYA-1381と呼ぶ。 Stocks Schizochytrium Honda et Yokochi ATCC MYA-1381, American Type Culture Collection (ATCC, Address: American Type Culture It can be obtained from Type Culture Collection. The strain Schizochytrium lilacinum Honda et Yokochi ATCC MYA-1381 is hereinafter simply referred to as MYA-1381.
(実施例1:Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号の単離、同定、および寄託)
I. Schizoochytrium limacinum HS01の単離
1.本出願発明者らは、Schizochytriumを、福建省ショウ州市雲霄県のマングローブ内の複数の場所から集め、Schizochytriumを混合して混合溶液を得た。0.5mLの混合溶液を5mLのスクリーニング用液体培地に接種し、次いで、25℃、200rpm/分で2日間培養した後、培養ブロスを得た。
(Example 1: Isolation, identification, and deposit of Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC No. 13746)
I. Isolation of Schizoochytrium limacinum HS01 1. The inventors of the present application collected Schizochytrium from multiple locations in the mangrove in Yunxiao County, Zhangzhou City, Fujian Province, and mixed Schizochytrium to obtain a mixed solution. A 0.5 mL mixed solution was inoculated into 5 mL of a liquid medium for screening, and then cultured at 25 ° C. and 200 rpm / min for 2 days to obtain a culture broth.
2.ステップ1で得た培養ブロスをスクリーニング用プレート上に均一に広げ、25℃で2日間、静止培養して、単一コロニーを得た。 2. 2. The culture broth obtained in step 1 was spread uniformly on a screening plate and statically cultured at 25 ° C. for 2 days to obtain a single colony.
3.ステップ2が完了した後、単一コロニーをつまみ取り、5mLの発酵培地に接種し、次いで、25℃、200rpm/分で2日間培養して、培養ブロスを得た。
3. 3. After
4.ステップ3で得た培養ブロスを4℃、2000rpmで5分間、遠心分離し、細胞を回収した。 4. The culture broth obtained in step 3 was centrifuged at 4 ° C. and 2000 rpm for 5 minutes, and the cells were collected.
5. 1.0~2.0gの細胞を、プラグを有するメスシリンダー(仕様:100mL)に入れ、8.3mol/LのHCl水溶液15mLをまず添加し、蓋を覆い、メスシリンダーを70~80℃の水浴中に置き、50~60分加水分解した(この間、プラグを有するメスシリンダーを10分間に1回、ボルテックスミキサーで振とうする)。室温に冷却した後、10mLの95%(v/v)エタノール水溶液をまず添加し、十分に一様に振とうした後、20mLの無水エーテルをさらに添加して、1~2分間、十分な振とうおよび抽出を行い、最後に、20mLの石油エーテルを添加した。混合物を、1~2分間、十分な振とうおよび抽出を行い、静置して層状化させた。上方の有機相をガラス製の秤量皿(これは乾燥しており、空の重量を秤量している)に置いた。ガラス製の秤量皿を、沸騰している水浴中の換気フードの中に置いて、有機相を完全に蒸発させ(完全に蒸発させなくてはならない)、液相は油脂であった。 5. Place 1.0-2.0 g of cells in a graduated cylinder with a plug (specification: 100 mL), first add 15 mL of an 8.3 mol / L HCl aqueous solution, cover the lid, and place the graduated cylinder at 70-80 ° C. It was placed in a water bath and hydrolyzed for 50 to 60 minutes (during this time, the graduated cylinder with the plug was shaken once every 10 minutes with a vortex mixer). After cooling to room temperature, 10 mL of 95% (v / v) aqueous ethanol solution is first added, and the mixture is shaken sufficiently uniformly, then 20 mL of anhydrous ether is further added, and the mixture is sufficiently shaken for 1 to 2 minutes. Finally and extraction was performed and finally 20 mL of petroleum ether was added. The mixture was shaken and extracted thoroughly for 1-2 minutes and allowed to stand for layering. The upper organic phase was placed on a glass weighing pan, which is dry and weighs empty. A glass weighing pan was placed in a ventilation hood in a boiling water bath to completely evaporate the organic phase (must be completely evaporated) and the liquid phase was fat.
6.ステップ5で抽出した油脂を取り、GB26400-2011食品安全国家基準に従ってDHA含有量を試験し、AOAC996.06の方法に従って脂肪酸の組成および含有量を試験した。 6. The fats and oils extracted in step 5 were taken and tested for DHA content according to GB26400-2011 National Food Safety Standards and for fatty acid composition and content according to the method of AOAC996.06.
DHA含有量がより高い株を選択し、24回繰り返し精製した。スクリーニングしたSchizochytrium株の1つを、Schizoochytrium limacinum HS01と名付けた。 Strains with higher DHA content were selected and purified 24 times repeatedly. One of the screened Schizochytrium strains was named Schizoochytrium limacinum HS01.
Schizoochytrium limacinum HS01単クローンを発酵培地に接種し、12回連続して継代し、DHA含有量を上記のステップに従って測定した。結果は、Schizoochytrium limacinum HS01によって生産されたDHAの安定性が良好であることを示した。 The Schizoochytrium limacinum HS01 single clone was inoculated into the fermentation medium and passaged 12 times in a row and the DHA content was measured according to the above steps. The results showed that the DHA produced by Schizoochytrium limacinum HS01 had good stability.
II. Schizoochytrium limacinum HS01の同定
1.形態学的同定
Schizoochytrium limacinum HS01を麦汁寒天培地に接種し、25℃の暗所で培養した。5日後、コロニーの形態学を観察し、株の形態学的特徴を分析し、高解像度の透過型電子顕微鏡法によって観察した。
II. Identification of Schizoochytrium lilacinum HS01 1. Morphological identification Schizoochytrium limacinum HS01 was inoculated on a wort agar medium and cultured in a dark place at 25 ° C. Five days later, colony morphology was observed, strain morphological characteristics were analyzed, and observed by high resolution transmission electron microscopy.
実験結果を図1および2に示す。結果は、Schizoochytrium limacinum HS01のコロニー直径が2~4.3mmであり、白色(その後のステージでは明るいオレンジ色)であり、縁の形が整っていないことを示した。分裂によって増殖した株では、細胞壁は薄く、球状で、無色または明るいオレンジ色で、透明であり、サイズは4.5~15.5μmであり、遊走子および外部原形質ネットは見られなかった。 The experimental results are shown in FIGS. 1 and 2. The results showed that the colony diameter of Schizoochytrium lilacinum HS01 was 2-3.3 mm, white (bright orange on subsequent stages), and the edges were not well-shaped. In the strains grown by division, the cell wall was thin, spherical, colorless or bright orange, transparent, 4.5-15.5 μm in size, and no zoospores and external protoplasmic nets were found.
2. 18s rDNAの配列相同性分析
Schizoochytrium limacinum HS01の18s rDNAの部分配列を、配列表の配列番号1に示す。
2. 2. Sequence homology analysis of 18s rDNA The partial sequence of 18s rDNA of Schizoochytrium limacinum HS01 is shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing.
Schizoochytrium limacinum HS01の18s rDNAの部分配列を、配列表の配列番号2に示す。 The partial sequence of 18s rDNA of Schizoochytrium limacinum HS01 is shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
上記の同定の結果に基づくと、Schizoochytrium limacinum HS01は、Schizoochytrium limacinumである。 Based on the results of the above identification, Schizoochytrium limacinum HS01 is Schizoochytrium limacinum.
III.Schizoochytrium limacinum HS01の寄託
Schizoochytrium limacinum HS01は、2017年3月10日に、中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心(略記:CGMCC、住所:北京市朝陽区北辰西路1号院3号)に寄託されており、受託番号はCGMCC第13746号である。Schizoochytrium limacinum HS01のフルネームは、Schizoochytrium limacinum HS01 CGMCC第13746号であり、Schizoochytrium limacinum HS01と省略される。
III. Deposit of Schizoochytrium lilacinum HS01 On March 10, 2017, the China Microbial Strain Storage Management Committee Ordinary Microbial Center (abbreviation: CGMCC, address: No. 1 Hokushin West Road, Chaoyang District, Beijing) The contract number is CGMCC No. 13746. The full name of the Schizoochytrium lilacinum HS01 is Schizoochytrium lilacinum HS01 CGMCC No. 13746, abbreviated as Schizoochytrium lilacinum HS01.
(実施例2:Schizoochytrium limacinum HS01の発酵によるDHAの生産)
I. Schizoochytrium limacinum HS01の発酵によるDHAの生産
1. Schizoochytrium limacinum HS01の単クローンを、2mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(仕様:10mL)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、一次シードブロスを得た。
(Example 2: Production of DHA by fermentation of Schizoochytrium limacinum HS01)
I. Production of DHA by fermentation of Schizoochytrium limacinum HS01 1. A single clone of Schizoochytrium limacinum HS01 is inoculated into a shaking flask (specification: 10 mL) containing 2 mL of shaking flask medium, cultured at 22 to 28 ° C. and 150 to 250 rpm / min for 24-48 hours, and then used as a primary seed. Got a flask.
2.一次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で250mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(1Lの振とうフラスコ仕様を伴う)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、二次シードブロスを得た。 2. 2. Take the primary seed broth and inoculate into a shaking flask (with 1L shaking flask specification) containing 250mL shaking flask medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) and inoculate at 22-28 ° C. , 150-250 rpm / min for 24-48 hours to obtain secondary seed broth.
3.二次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で3Lのシード培地を含有する発酵槽(5Lの発酵槽仕様を伴う)に接種し、22~28℃で24~48時間培養して(溶存酸素は10~80%であった)、発酵した一次シードブロスを得た。 3. 3. Take the secondary seed broth and inoculate into a fermenter (with 5 L fermenter specification) containing 3 L of seed medium with a 3-10% (v / v) inoculation material amount and 24-at 22-28 ° C. After culturing for 48 hours (dissolved oxygen was 10-80%), fermented primary seed broth was obtained.
4.発酵した一次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で50Lの発酵培地を含有する発酵槽に接種し(発酵槽の仕様は100Lであり、接種後の最初のバイオマスは1.0×108~2.5×108cfu/mLであった)、22~28℃で72~120時間培養して(溶存酸素は5~80%であった)、発酵ブロスを得た。発酵ブロスはDHAを含有していた。 4. Take the fermented primary seed broth and inoculate it into a fermenter containing 50 L of fermentation medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) (the fermenter specification is 100 L, the first biomass after inoculation). Was 1.0 × 10 8 to 2.5 × 10 8 cfu / mL), cultured at 22 to 28 ° C. for 72 to 120 hours (dissolved oxygen was 5 to 80%), and fermented broth. Obtained. The fermented broth contained DHA.
II.発酵ブロスにおける脂肪酸組成の分析
実施例1におけるステップIのステップ5の方法に従って、発酵ブロスの油脂を抽出し、次いで、DHA含有量をGB26400-2011食品安全国家基準に従って検出し、脂肪酸の組成および含有量をAOAC996.06の方法に従って検出した。
II. Analysis of fatty acid composition in fermented broth According to the method of step 5 of step I in Example 1, the fats and oils of the fermented broth are extracted, and then the DHA content is detected according to the GB26400-2011 National Food Safety Standard, and the composition and content of the fatty acid. The amount was detected according to the method of AOAC996.06.
実験結果を表2に示す。結果は、DHAが油脂の45.0%~60.0%を占めることを示した。
III.発酵ブロス中のDHAの分離および質の同定
1.ステップIで得た発酵ブロスを取り、Schizochytriumの細胞壁破壊およびDHA藻類油の粗油の抽出を逐次的に行った(Schizochytriumの細胞壁破壊およびDHA藻類油の粗油の抽出の方法は、中国特許第CN101817738Bにおいて記録されている)。
III. Separation of DHA in fermented broth and identification of quality 1. The fermented broth obtained in step I was taken, and the cell wall of Schizochytrium was destroyed and the crude oil of DHA algae oil was sequentially extracted. Recorded in CN10187738B).
2.ステップ1において抽出されたDHA藻類油の粗油を精錬した(精錬方法は、中国特許第CN103865642Bにおいて記録されている)。 2. 2. The crude oil of DHA algal oil extracted in step 1 was smelted (the smelting method is recorded in Chinese Patent No. CN103865642B).
精錬後のDHA藻類油の粗油の質の指標を表3に示す。
(実施例3:Schizoochytrium limacinum HS01によるDHAの大規模発酵)
1. Schizoochytrium limacinum HS01の単一コロニーを、20mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(250mLの振とうフラスコ仕様を伴う)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、一次シードブロスを得た。
(Example 3: Large-scale fermentation of DHA by Schizoochytrium limacinum HS01)
1. 1. A single colony of Schizoochytrium limacinum HS01 was inoculated into a shaking flask containing 20 mL of shaking flask medium (with 250 mL shaking flask specifications) at 22-28 ° C., 150-250 rpm / min for 24-48 hours. After culturing, a primary seed broth was obtained.
2.一次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で250mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(2Lの振とうフラスコ仕様を伴う)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、二次シードブロスを得た。 2. 2. Take the primary seed broth and inoculate into a shaking flask (with 2L shaking flask specification) containing 250mL shaking flask medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) and inoculate at 22-28 ° C. , 150-250 rpm / min for 24-48 hours to obtain secondary seed broth.
3.二次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で500Lのシード培地を含有する発酵槽(1000Lの発酵槽仕様を伴う)に接種し、22~28℃で24~48時間培養して(溶存酸素は10~80%であった)、バイオマスが15~30g/Lの発酵した一次シードブロスを得た。 3. 3. Take the secondary seed broth and inoculate into a fermenter (with 1000 L fermenter specification) containing 500 L of seed medium with a 3-10% (v / v) inoculation material amount and 24-at 22-28 ° C. After culturing for 48 hours (dissolved oxygen was 10-80%), fermented primary seed broth with a biomass of 15-30 g / L was obtained.
4.発酵した一次シードブロスを取り、5~15%(v/v)の接種材料量で5000Lのシード培地を含有する発酵槽(8000~10000Lの発酵槽仕様を伴う)に接種し、22~28℃で24~48時間培養して(溶存酸素は10~80%であった)、15~30g/Lのバイオマスを伴う発酵した二次シードブロスを得た。 4. Take the fermented primary seed broth and inoculate into a fermenter (with 8000-10000 L fermenter specifications) containing 5000 L of seed medium with a 5-15% (v / v) inoculation material amount and 22-28 ° C. Inoculation for 24-48 hours (dissolved oxygen was 10-80%) to give fermented secondary seed broth with 15-30 g / L biomass.
5.発酵した二次シードブロスを取り、5~15%(v/v)の接種材料量で30000Lの発酵培地を含有する発酵槽に接種し(発酵槽の仕様は75000Lであり、接種後の最初のバイオマスは、5.0×108~3.0×109cfu/mLであった)、22~28℃で72~120時間で培養して(溶存酸素は5~80%であった)、発酵ブロスを得た。発酵ブロスはDHAを含有していた。 5. Take the fermented secondary seed broth and inoculate it into a fermenter containing 30,000 L of fermentation medium with an inoculation material amount of 5 to 15% (v / v) (the specification of the fermenter is 75,000 L, the first after inoculation. Biomass was 5.0 × 10 8 to 3.0 × 10 9 cfu / mL), cultured at 22 to 28 ° C. for 72 to 120 hours (dissolved oxygen was 5 to 80%). Fermented broth was obtained. The fermented broth contained DHA.
発酵ブロス中の脂肪酸の組成を、実施例2におけるステップIIの方法に従って分析した。結果は、発酵ブロス中において、DHAが油脂の35.0~60.0%を占めたことを示した。 The composition of fatty acids in the fermented broth was analyzed according to the method of Step II in Example 2. The results showed that DHA accounted for 35.0-60.0% of fats and oils in the fermented broth.
(実施例4:DHAおよびEPA合成に関連する遺伝子断片の発見)
I. Schizoochytrium limacinum HS01によるポリ不飽和脂肪酸の発酵
1. Schizoochytrium limacinum HS01の単クローンを、2mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(仕様:10mL)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、一次シードブロスを得た。
(Example 4: Discovery of gene fragments related to DHA and EPA synthesis)
I. Fermentation of polyunsaturated fatty acids with Schizoochytrium limacinum HS01 1. A single clone of Schizoochytrium limacinum HS01 is inoculated into a shaking flask (specification: 10 mL) containing 2 mL of shaking flask medium, cultured at 22 to 28 ° C. and 150 to 250 rpm / min for 24-48 hours, and then used as a primary seed. Got a flask.
2.一次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で250mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(1Lの振とうフラスコ仕様を伴う)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、二次シードブロスを得た。 2. 2. Take the primary seed broth and inoculate into a shaking flask (with 1L shaking flask specification) containing 250mL shaking flask medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) and inoculate at 22-28 ° C. , 150-250 rpm / min for 24-48 hours to obtain secondary seed broth.
3.二次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で3Lのシード培地を含有する発酵槽(5Lの発酵槽仕様を伴う)に接種し、22~28℃で24~48時間培養して(溶存酸素は10~80%であった)、発酵した一次シードブロスを得た。 3. 3. Take the secondary seed broth and inoculate into a fermenter (with 5 L fermenter specification) containing 3 L of seed medium with a 3-10% (v / v) inoculation material amount and 24-at 22-28 ° C. After culturing for 48 hours (dissolved oxygen was 10-80%), fermented primary seed broth was obtained.
4.発酵した一次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で50Lの発酵培地を含有する発酵槽に接種し(発酵槽の仕様は100Lであり、接種後の最初のバイオマスは、1.0×108~2.5×108cfu/mLであった)、22~28℃で72~120時間培養して(溶存酸素は5~80%であった)、発酵ブロスを得た。 4. Take the fermented primary seed broth and inoculate it into a fermenter containing 50 L of fermentation medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) (the fermenter specification is 100 L, the first biomass after inoculation). Was 1.0 × 10 8 to 2.5 × 10 8 cfu / mL), cultured at 22 to 28 ° C. for 72 to 120 hours (dissolved oxygen was 5 to 80%), and fermented broth. Got
5.実施例1におけるステップIのステップ5の方法に従って、発酵ブロスの油脂を抽出し、次いで、DHA含有量をGB26400-2011食品安全国家基準に従って検出し、DPA含有量をGB28404-2012食品安全国家基準に従って検出し、EPA含有量をGB5009.168-2016食品安全国家基準に従って検出し、脂肪酸の組成および含有量をAOAC996.06の方法に従って検出した。 5. According to the method of step 5 of step I in Example 1, the fats and oils of the fermented broth are extracted, then the DHA content is detected according to the GB26400-2011 food safety national standard, and the DPA content is according to the GB28404-2012 food safety national standard. EPA content was detected according to GB5009.168-2016 National Food Safety Standards and fatty acid composition and content were detected according to the method of AOAC996.06.
実験結果を表4に示す。結果は、DHAが油脂の45.0%~60.0%を占め、DPAが油脂の9.0%~17.0%を占め、EPAが油脂の0.2%~1.0%を占めることを示した。
II. MYA-1381によるポリ不飽和脂肪酸の発酵
ステップIの方法に従って、「Schizoochytrium limacinum HS01」を「MYA-1381」で置き換え、他のステップは変えなかった。結果は、DHAが油脂の12%~23%を占め、DPAが油脂の20%~39%を占め、EPAが油脂の0.5%~3%を占めることを示した。
II. Fermentation of Polyunsaturated Fatty Acids with MYA-1381 According to the method of step I, "Schizoochytrium limacinum HS01" was replaced with "MYA-1381" and the other steps were unchanged. The results showed that DHA accounted for 12% to 23% of fats and oils, DPA accounted for 20% to 39% of fats and oils, and EPA accounted for 0.5% to 3% of fats and oils.
上記の結果に基づくと、Schizoochytrium limacinum HS01は、DHAおよびEPAの合成について高収量株であり、MYA-1381は、DHAおよびEPAの合成について低収量株である。 Based on the above results, Schizoochytrium limacinum HS01 is a high yield strain for the synthesis of DHA and EPA, and MYA-1381 is a low yield strain for the synthesis of DHA and EPA.
III. DHAおよびEPA合成に関連する遺伝子断片の発見
Schizoochytrium limacinum HS01およびMYA-1381のゲノムDNAを、酵母ゲノム抽出キットを使用してそれぞれ抽出し、次いで、全ゲノム配列決定を、PacBio RS IIおよびIllumina HiSeq 4000を使用して、Novogeneによって行った。
III. Discovery of gene fragments associated with DHA and EPA synthesis Genomic DNA of Schizoochytrium limacinum HS01 and MYA-1381 was extracted using a yeast genome extraction kit, respectively, followed by whole genome sequencing for PacBio RS II and Illumina HiSeq 4000. Was performed by Novogene.
結果は、MYA-1381と比較して、Schizoochytrium limacinum HS01が6つの固有の遺伝子断片を含有していたことを示し、この遺伝子断片を、遺伝子断片1、遺伝子断片2、遺伝子断片3、遺伝子断片4、遺伝子断片5、および遺伝子断片6とそれぞれ名付けた。それらのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号3~配列番号8で順に示される。
The results showed that the Schizoochytrium limacinum HS01 contained 6 unique gene fragments as compared to MYA-1381, and this gene fragment was referred to as gene fragment 1,
配列表の配列番号3の5’末端から1044~3050位のヌクレオチド配列は、タンパク質1をコードし、タンパク質1のアミノ酸配列は配列表の配列番号9で示される。配列表の配列番号4の5’末端から1068~2737位および3254~5162位のヌクレオチド配列は、タンパク質2をコードし、タンパク質2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号10で示される。配列表の配列番号5の5’末端から1094~3415位のヌクレオチド配列は、タンパク質3をコードし、タンパク質3のアミノ酸配列は配列表の配列番号11で示される。配列表の配列番号6の5’末端から1049~5044位、7004~7234位、および7700~10399位のヌクレオチド配列は、タンパク質4をコードし、タンパク質4のアミノ酸配列は配列表の配列番号12で示される。配列表の配列番号7の5’末端から1473~6488位のヌクレオチド配列は、タンパク質5をコードし、タンパク質5のアミノ酸配列は配列表の配列番号13で示される。配列表の配列番号8の5’末端から953~991位および1063~1090位のヌクレオチド配列は、タンパク質6をコードし、タンパク質6のアミノ酸配列は配列表の配列番号14で示される。
The nucleotide sequence at positions 1044 to 3050 from the 5'end of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing encodes protein 1, and the amino acid sequence of protein 1 is represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. The nucleotide sequences at positions 1068 to 2737 and 3254 to 5162 from the 5'end of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing encode
(実施例5:6つの遺伝子断片の増幅およびその対応するプライマーの合成)
1. Schizoochytrium limacinum HS01のゲノムDNAを、酵母ゲノム抽出キットを使用して抽出した。ゲノムDNAを鋳型として使用して、高忠実度TransStart FastPfu DNAポリメラーゼおよびプライマー対(プライマー対HS01-1、プライマー対HS01-2、プライマー対HS01-3、プライマー対HS01-4、プライマー対HS01-5、プライマー対HS01-6)を使用してPCR増幅を行って、PCR増幅産物を得た。
(Example 5: Amplification of 6 gene fragments and synthesis of corresponding primers)
1. 1. Genomic DNA of Schizoochytrium limacinum HS01 was extracted using a yeast genome extraction kit. Using genomic DNA as a template, high fidelity TransStart FastPfu DNA polymerase and primer pair (primer vs. HS01-1, primer vs. HS01-2, primer vs. HS01-3, primer vs. HS01-4, primer vs. HS01-5, PCR amplification was performed using primer vs. HS01-6) to obtain a PCR amplification product.
各プライマー対を構成する上流プライマーおよび下流プライマーのヌクレオチド配列を表5に示す。 Table 5 shows the nucleotide sequences of the upstream and downstream primers constituting each primer pair.
反応手順:98℃で2分間;98℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル;72℃で5分間。
2.ステップ1が完了した後、PCR増幅産物を、アガロースゲルDNA回収キットを使用して回収した。 2. 2. After step 1 was completed, the PCR amplification product was recovered using an agarose gel DNA recovery kit.
3.ステップ2が完了した後、回収したPCR増幅産物をpEASY-Bluntベクターにライゲーションして、組換えプラスミドを得た。
3. 3. After
4.ステップ3が完了した後、組換えプラスミドを配列決定した。 4. After step 3 was completed, the recombinant plasmid was sequenced.
配列決定の結果は、プライマー対HS01-1によって増幅されたPCR増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号3で示され(すなわち、遺伝子断片1)、プライマー対HS01-2によって増幅されたPCR増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号4で示され(すなわち、遺伝子断片2)、プライマー対HS01-3によって増幅されたPCR増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号5で示され(すなわち、遺伝子断片3)、プライマー対HS01-4によって増幅されたPCR増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号6で示され(すなわち、遺伝子断片4)、プライマー対HS01-5によって増幅されたPCR増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号7で示され(すなわち、遺伝子断片5)、プライマー対HS01-6によって増幅されたPCR増幅産物のヌクレオチド配列が、配列表の配列番号8で示される(すなわち、遺伝子断片6)ことを示した。したがって、6つの遺伝子断片は、表2のプライマーを使用して増幅することができる。 The result of sequencing is that the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified by Primer vs. HS01-1 is shown in SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing (ie, Gene Fragment 1) and PCR amplified by Primer vs. HS01-2. The nucleotide sequence of the amplification product is shown by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing (ie, gene fragment 2), and the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified by Primer vs. HS01-3 is shown by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. (Ie, gene fragment 3), the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified by primer vs. HS01-4 is shown by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (ie, gene fragment 4) and amplified by primer vs. HS01-5. The nucleotide sequence of the PCR amplification product is shown in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing (ie, gene fragment 5), and the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified by Primer vs. HS01-6 is shown in SEQ ID NO: 8 of the sequence listing. It was shown to be shown (ie, gene fragment 6). Therefore, the six gene fragments can be amplified using the primers in Table 2.
(実施例6:DHAおよびEPAの生産における6つの遺伝子断片の増幅)
この実施例において、関与するプライマーのヌクレオチド配列を表6に示す。
In this example, the nucleotide sequences of the primers involved are shown in Table 6.
A. GS-C06株の獲得
I.標的断片HS01-1-Zeoの調製
A. Acquisition of GS-C06 shares I. Preparation of target fragment HS01-1-Zeo
1.組換えプラスミドpUC57-LZは、GenScriptによって合成された。組換えプラスミドpUC57-LZは、配列表の配列番号15で示すヌクレオチド配列をpUC57ベクターとライゲーションすることによって得た。配列表の配列番号15において、5’末端から25~58位はLox66配列であり、626~997位はゼオシン耐性遺伝子であり、2293~2326位はLox71配列である。 1. 1. The recombinant plasmid pUC57-LZ was synthesized by GenScript. The recombinant plasmid pUC57-LZ was obtained by ligating the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing with the pUC57 vector. In SEQ ID NO: 15 of the sequence listing, positions 25 to 58 from the 5'end are Lox66 sequences, positions 626 to 997 are zeocin resistance genes, and positions 2293 to 2326 are Lox71 sequences.
2. Schizoochytrium limacinum HS01のゲノムDNAを、酵母ゲノム抽出キットを使用して抽出した。 2. 2. Genomic DNA of Schizoochytrium limacinum HS01 was extracted using a yeast genome extraction kit.
3. Schizoochytrium limacinum HS01のゲノムDNAを鋳型として使用し、HS01-1-UFおよびHS01-1-URをプライマーとして使用して、PCR増幅を行った。約3100bpのPCR増幅産物が得られ、このPCR増幅産物は、HS01-1の上流の相同断片AUであった。 3. 3. PCR amplification was performed using the genomic DNA of Schizoochytrium limacinum HS01 as a template and HS01-1-UF and HS01-1-UR as primers. A PCR amplification product of approximately 3100 bp was obtained, which was the homologous fragment AU upstream of HS01-1.
4. Schizoochytrium limacinum HS01のゲノムDNAを鋳型として使用し、HS01-1-DFおよびHS01-1-DRをプライマーとして使用して、PCR増幅を行った。約1000bpのPCR増幅産物が得られ、このPCR増幅産物は、HS01-1の下流の相同断片ADであった。 4. PCR amplification was performed using the genomic DNA of Schizoochytrium limacinum HS01 as a template and HS01-1-DF and HS01-1-DR as primers. A PCR amplification product of about 1000 bp was obtained, which was a homologous fragment AD downstream of HS01-1.
5.ステップ1で合成された組換えプラスミドpUC57-LZを鋳型として使用し、Zeo-FおよびZeo-Rをプライマーとして使用して、PCR増幅を行った。約2350bpのPCR増幅産物が得られ(ヌクレオチド配列を配列表の配列番号15で示す)、このPCR増幅産物はZeo断片であった。 5. PCR amplification was performed using the recombinant plasmid pUC57-LZ synthesized in step 1 as a template and Zeo-F and Zeo-R as primers. A PCR amplification product of approximately 2350 bp was obtained (the nucleotide sequence is indicated by SEQ ID NO: 15 in the sequence listing), and this PCR amplification product was a Zeo fragment.
6. HS01-1の上流の相同断片AU、HS01-1の下流の相同断片AD、およびZeo断片を鋳型として使用し、HS01-1-UFおよびHS01-1-DRをプライマーとして使用して、オーバーラップ増幅を行った。約6450bpのPCR増幅産物が得られた。PCR増幅産物を、アガロースゲルDNA回収キットを使用して回収して、標的断片HS01-1-Zeoを得た。 6. Overlap amplification using HS01-1 upstream homologous fragment AU, HS01-1 downstream homologous fragment AD, and Zeo fragment as templates and HS011-1-UF and HS01-1-DR as primers. Was done. A PCR amplification product of about 6450 bp was obtained. The PCR amplification product was recovered using an agarose gel DNA recovery kit to obtain the target fragment HS01-1-Zeo.
II.前処理したMYA-1381の獲得
1.無菌の事前冷却したポリプロピレン試験管(仕様:50mL)を取り、10mLのMYA-1381溶液(濃度:1×108cfu/mL)を添加し、4℃、5000r/分で10分間、遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を回収した。
II. Acquisition of preprocessed MYA-1381 1. Take a sterile pre-cooled polypropylene test tube (specification: 50 mL), add 10 mL of MYA-1381 solution (concentration: 1 × 10 8 cfu / mL), and centrifuge at 4 ° C. and 5000 r / min for 10 minutes. , The supernatant was discarded and the cells were collected.
2.ステップ1が完了した後、以下のステップを2回繰り返した:ポリプロピレン試験管を取り、10mLの事前冷却した滅菌水を添加して細胞を洗浄し、得られた混合物を4℃、4472gで10分間、遠心分離し、細胞を回収した。 2. 2. After step 1 was completed, the following steps were repeated twice: Take the polypropylene test tube, add 10 mL of pre-cooled sterile water to wash the cells, and wash the resulting mixture at 4 ° C., 4472 g for 10 minutes. , Centrifuged and collected cells.
3.ステップ2が完了した後、ポリプロピレン試験管を取り、10mLの事前冷却した1mol/Lのソルビトール水溶液を添加することによって再懸濁し、4℃、5000r/分で10分間、遠心分離し、細胞を回収した。
3. 3. After
4.ステップ3が完了した後、ポリプロピレン試験管を取り、10mLの事前冷却した1mol/Lのソルビトール水溶液を添加することによって再懸濁して、前処理したMYA-1381を得た。 4. After step 3 was completed, polypropylene test tubes were removed and resuspended by adding 10 mL of pre-cooled 1 mol / L sorbitol aqueous solution to give pretreated MYA-1381.
III.電気的形質転換
1. 30μLの前処理したMYA-1381を取り、1μgの標的断片HS01-1-Zeoをそれに添加した。得られた混合物を穏やかに混合して、氷浴中で5分間静置し、次いで、電気ショックのために、氷冷したgene pulserキュベットに移した(電気ショックのパラメータ:0.75KV、50μF)。
III. Electrical transformation 1. 30 μL of pretreated MYA-1381 was taken and 1 μg of the target fragment HS01-1-Zeo was added to it. The resulting mixture was gently mixed and allowed to stand in an ice bath for 5 minutes and then transferred to an ice-cooled gene pulper cuvette for electric shock (electric shock parameters: 0.75 KV, 50 μF). ..
2.ステップ1が完了した後、gene pulserキュベットを取り、1mLのシード培地をそれに添加した。得られた混合物を30℃、200r/分で1時間培養し、次いで、10℃、5000r/分で10分間、遠心分離した。細胞および少量の上清を混合し、耐性プレート上に均一に広げ、逆さまにした状態で、30℃で48時間培養して、疑似形質転換体を得た。 2. 2. After step 1 was completed, the gene pulser cuvette was taken and 1 mL of seed medium was added to it. The resulting mixture was cultured at 30 ° C. and 200 r / min for 1 hour and then centrifuged at 10 ° C. and 5000 r / min for 10 minutes. The cells and a small amount of supernatant were mixed, spread evenly on a resistance plate, and cultured upside down at 30 ° C. for 48 hours to obtain pseudotransformants.
耐性プレート:ゼオシンを、約55℃のスクリーニング用固体培地に、200μg/mLの濃度まで添加し、次いでペトリ皿に注ぎ、冷却した後に固体プレートを得た。 Tolerance plate: Zeosin was added to a solid medium for screening at about 55 ° C. to a concentration of 200 μg / mL, then poured into Petri dishes and cooled to give a solid plate.
IV.陽性の形質転換体の獲得および同定
疑似形質転換体のゲノムDNAを、酵母ゲノム抽出キットによって抽出した。ゲノムDNAを鋳型として使用し、HS01-1-FおよびHS01-1-Rをプライマーとして使用してPCR増幅を行って、PCR増幅産物を得た。
IV. Acquisition and Identification of Positive Transformants Genomic DNA of pseudotransformants was extracted with a yeast genome extraction kit. PCR amplification was performed using genomic DNA as a template and HS01-1-F and HS01-1-R as primers to obtain a PCR amplification product.
疑似形質転換体のPCR増幅産物のサイズが4100bpである場合(またはそのヌクレオチド配列が配列表の配列番号3で示される場合)、疑似形質転換体は陽性の形質転換体であった。 When the size of the PCR amplification product of the pseudotransformant was 4100 bp (or its nucleotide sequence is indicated by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), the pseudotransformant was a positive transformant.
V. GS-C01の獲得。
プラスミドpSH65(Biovector Inc.の製品;このプラスミドはCre酵素を含有する)を陽性の形質転換体に導入し、次いで、Zeo遺伝子をプラスミドpSH65の指示の手順に従って除去して、形質転換体GS-C01を得た。
V. Acquisition of GS-C01.
The plasmid pSH65 (a product of Biofector Inc.; this plasmid contains the Cre enzyme) was introduced into a positive transformant, then the Zeo gene was removed according to the instructions of the plasmid pSH65 and the transformant GS-C01. Got
上記のステップIからVに従って、「HS01-1-UF」を「HS01-2-UF」で置き換え、「HS01-1-UR」を「HS01-2-UR」で置き換え、「HS01-1-DF」を「HS01-2-DF」で置き換え、「HS01-1-DR」を「HS01-2-DR」で置き換え、「HS01-1-F」を「HS01-2-F」で置き換え、「HS01-1-R」を「HS01-2-R」で置き換え、「MYA-1381」を「形質転換体GS-C01」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体GS-C02を得た。 According to steps I to V above, "HS01-1-UF" is replaced with "HS01-2-UF", "HS01-1-UR" is replaced with "HS01-2-UR", and "HS01-1-DF" is replaced. Is replaced with "HS01-2-DF", "HS01-1-DR" is replaced with "HS01-2-DR", "HS01-1-F" is replaced with "HS01-2-F", and "HS01". "-1-R" was replaced with "HS01-2-R", "MYA-1381" was replaced with "transformant GS-C01", and the transformant GS-C02 was obtained without changing the other steps. ..
上記のステップIからVに従って、「HS01-1-UF」を「HS01-3-UF」で置き換え、「HS01-1-UR」を「HS01-3-UR」で置き換え、「HS01-1-DF」を「HS01-3-DF」で置き換え、「HS01-1-DR」を「HS01-3-DR」で置き換え、「HS01-1-F」を「HS01-3-F」で置き換え、「HS01-1-R」を「HS01-3-R」で置き換え、「MYA-1381」を「形質転換体GS-C02」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体GS-C03を得た。 According to steps I to V above, "HS01-1-UF" is replaced with "HS01-3-UF", "HS01-1-UR" is replaced with "HS01-3-UR", and "HS01-1-DF" is replaced. Is replaced with "HS01-3-DF", "HS01-1-DR" is replaced with "HS01-3-DR", "HS01-1-F" is replaced with "HS01-3-F", and "HS01". "-1-R" was replaced with "HS01-3-R", "MYA-1381" was replaced with "transformant GS-C02", and the transformant GS-C03 was obtained without changing the other steps. ..
上記のステップIからVに従って、「HS01-1-UF」を「HS01-4-UF」で置き換え、「HS01-1-UR」を「HS01-4-UR」で置き換え、「HS01-1-DF」を「HS01-4-DF」で置き換え、「HS01-1-DR」を「HS01-4-DR」で置き換え、「HS01-1-F」を「HS01-4-F」で置き換え、「HS01-1-R」を「HS01-4-R」で置き換え、「MYA-1381」を「形質転換体GS-C03」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体GS-C04を得た。 According to steps I to V above, replace "HS01-1-UF" with "HS01-4-UF", replace "HS01-1-UR" with "HS01-4-UR", and replace "HS01-1-DF". Is replaced with "HS01-4-DF", "HS01-1-DR" is replaced with "HS01-4-DR", "HS01-1-F" is replaced with "HS01-4-F", and "HS01". "-1-R" was replaced with "HS01-4-R", "MYA-1381" was replaced with "transformant GS-C03", and the transformant GS-C04 was obtained without changing the other steps. ..
上記のステップIからVに従って、「HS01-1-UF」を「HS01-5-UF」で置き換え、「HS01-1-UR」を「HS01-5-UR」で置き換え、「HS01-1-DF」を「HS01-5-DF」で置き換え、「HS01-1-DR」を「HS01-5-DR」で置き換え、「HS01-1-F」を「HS01-5-F」で置き換え、「HS01-1-R」を「HS01-5-R」で置き換え、「MYA-1381」を「形質転換体GS-C04」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体GS-C05を得た。 According to steps I to V above, replace "HS01-1-UF" with "HS01-5-UF", replace "HS01-1-UR" with "HS01-5-UR", and replace "HS01-1-DF". Is replaced with "HS01-5-DF", "HS01-1-DR" is replaced with "HS01-5-DR", "HS01-1-F" is replaced with "HS01-5-F", and "HS01". "-1-R" was replaced with "HS01-5-R", "MYA-1381" was replaced with "transformant GS-C04", and the transformant GS-C05 was obtained without changing the other steps. ..
上記のステップIからVに従って、「HS01-1-UF」を「HS01-6-UF」で置き換え、「HS01-1-UR」を「HS01-6-UR」で置き換え、「HS01-1-DF」を「HS01-6-DF」で置き換え、「HS01-1-DR」を「HS01-6-DR」で置き換え、「HS01-1-F」を「HS01-6-F」で置き換え、「HS01-1-R」を「HS01-6-R」で置き換え、「MYA-1381」を「形質転換体GS-C05」で置き換え、他のステップは変えずに、形質転換体GS-C06を得た。 According to steps I to V above, "HS01-1-UF" is replaced with "HS01-6-UF", "HS01-1-UR" is replaced with "HS01-6-UR", and "HS01-1-DF" is replaced. Is replaced with "HS01-6-DF", "HS01-1-DR" is replaced with "HS01-6-DR", "HS01-1-F" is replaced with "HS01-6-F", and "HS01". "-1-R" was replaced with "HS01-6-R", "MYA-1381" was replaced with "transformant GS-C05", and the transformant GS-C06 was obtained without changing the other steps. ..
形質転換体GS-C06は、GS-C06株であった。 The transformant GS-C06 was a GS-C06 strain.
B. DHAおよびEPAの生産における6つの遺伝子断片の応用
試験対象の株は、Schizoochytrium limacinum HS01、MYA-1381、またはGS-C06株であった。
B. Application of 6 gene fragments in the production of DHA and EPA The strains under test were the Schizoochytrium limacinum HS01, MYA-1381, or GS-C06 strains.
1.試験対象の株の単クローンを、2mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(仕様:10mL)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、一次シードブロスを得た。 1. 1. A single clone of the strain under test is inoculated into a shaking flask (specification: 10 mL) containing 2 mL of shaking flask medium, and cultured at 22 to 28 ° C. and 150 to 250 rpm / min for 24-48 hours to perform primary. I got a seed broth.
2.一次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で50mLの振とうフラスコ培地を含有する振とうフラスコ(500mLの振とうフラスコ仕様を伴う)に接種し、22~28℃、150~250rpm/分で24~48時間培養して、二次シードブロスを得た。 2. 2. Take the primary seed broth and inoculate into a shaking flask (with a 500mL shaking flask specification) containing 50 mL of shaking flask medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) and inoculate at 22-28 ° C. , 150-250 rpm / min for 24-48 hours to obtain secondary seed broth.
3.二次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で500mLのシード培地を含有する発酵槽(発酵槽の仕様:1L)に接種し、22~28℃で24~48時間培養して(溶存酸素は10~80%であった)、三次シードブロスを得た。 3. 3. Take the secondary seed broth and inoculate into a fermenter (fermenter specification: 1 L) containing 500 mL of seed medium with a 3-10% (v / v) inoculation material amount and 24-48 at 22-28 ° C. After time culturing (dissolved oxygen was 10-80%), tertiary seed broth was obtained.
4.三次シードブロスを取り、3~10%(v/v)の接種材料量で5Lの発酵培地を含有する発酵槽(発酵槽の仕様は10Lであり、接種後の最初のバイオマスは、0.3×108~0.5×108cfu/mLであった)に接種し、22~28℃で72~120時間培養して(溶存酸素は5~80%であった)、発酵ブロスを得た。発酵ブロスはDHA、DPA、およびEPAを含有していた。 4. Take the tertiary seed broth and contain a fermenter containing 5 L of fermentation medium with an inoculation material amount of 3-10% (v / v) (fermenter specifications are 10 L, the first biomass after inoculation is 0.3. × 10 8 to 0.5 × 10 8 cfu / mL) was inoculated and cultured at 22 to 28 ° C. for 72 to 120 hours (dissolved oxygen was 5 to 80%) to obtain fermented broth. rice field. Fermented broth contained DHA, DPA, and EPA.
5.実施例1におけるステップIのステップ5の方法に従って、発酵ブロスの油脂を抽出し、次いで、DHA含有量をGB5009.168-2016食品安全国家基準に従って検出し、DPA含有量をGB28404-2012食品安全国家基準に従って検出し、EPA含有量をGB5009.168-2016食品安全国家基準に従って検出した。 5. The fats and oils of the fermented broth are extracted according to the method of step 5 of step I in Example 1, then the DHA content is detected according to GB5009.168-2016 food safety national standards and the DPA content is GB28404-2012 food safety national. Detected according to standards, EPA content was detected according to GB5009.168-2016 National Food Safety Standards.
実験結果を表7に示す。結果は、本発明によって得られた6つの遺伝子断片をMYA-1381に形質転換することによって、DHAおよびEPAの合成についての高収量株(すなわち、GS-C06株)を得ることができることを示した。したがって、本発明によって提供される6つの遺伝子断片、6つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質、およびこれらの6つの遺伝子断片を含有するベクター、細胞、または生物は、DHAおよびEPAの生産において重要な応用価値を有する。これらの6つの遺伝子セグメントによってコードされるタンパク質を出発株において作出することによって、DHAおよびEPAの高収量作出株を構築することができる。
本発明によって提供されるSchizoochytrium limacinum HS01は、DHAおよび/またはEPAの生産について高い生産値を有する。DHAおよび/またはEPAの合成についての高収量株は、本発明によって得られる6つの遺伝子断片を、DHAおよび/またはEPAの合成についての低収量株に形質転換することによって得ることができる。したがって、本発明によって提供される6つの遺伝子断片、これらの6つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質、およびこれらの6つの遺伝子断片を含有するベクター、細胞、または生物は、DHAおよび/またはEPAの生産において重要な応用価値を有する。これらの6つの遺伝子断片によってコードされるタンパク質を出発株において作出することによって、DHAおよび/またはEPAの高収量作出株を構築することができる。 The Schizoochytrium limacinum HS01 provided by the present invention has a high production value for the production of DHA and / or EPA. High-yielding strains for the synthesis of DHA and / or EPA can be obtained by transforming the six gene fragments obtained by the present invention into low-yielding strains for the synthesis of DHA and / or EPA. Thus, the six gene fragments provided by the present invention, the proteins encoded by these six gene fragments, and the vectors, cells, or organisms containing these six gene fragments produce DHA and / or EPA. Has important application value in. By producing the protein encoded by these six gene fragments in the starting strain, a high yield production strain of DHA and / or EPA can be constructed.
Claims (11)
前記タンパク質1が、a1)またはa2):
a1)配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
a2)タグを配列表の配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
であり、
前記タンパク質2が、b1)またはb2):
b1)配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
b2)タグを配列表の配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
であり、
前記タンパク質3が、c1)またはc2):
c1)配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
c2)タグを配列表の配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
であり、
前記タンパク質4が、d1)またはd2):
d1)配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
d2)タグを配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
であり、
前記タンパク質5が、e1)またはe2):
e1)配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
e2)タグを配列表の配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
であり、
前記タンパク質6が、f1)またはf2):
f1)配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
f2)タグを配列表の配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のN末端または/およびC末端にライゲーションすることによって得られる融合タンパク質、
である、タンパク質の組み合わせ。 A combination of proteins consisting of protein 1, protein 2, protein 3, protein 4, protein 5, and protein 6.
The protein 1 is a1) or a2) :.
a1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing,
a2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
And
The protein 2 is b1) or b2) :.
b1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing,
b2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
And
The protein 3 is c1) or c2) :.
c1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing,
c2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
And
The protein 4 is d1) or d2) :.
d1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing,
d2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing.
And
The protein 5 is e1) or e2) :.
e1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing,
e2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
And
The protein 6 is f1) or f2) :.
f1) A protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing,
f2) A fusion protein obtained by ligating a tag to the N-terminus or / and C-terminus of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing.
Is a combination of proteins.
A1)そのコード領域が配列表の配列番号3の5’末端から1044~3050位で示される、DNA分子、
A2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号3で示される、DNA分子、
で示されるDNA分子であり、
前記タンパク質2をコードする核酸分子が、以下のB1)またはB2):
B1)そのコード領域が配列表の配列番号4の5’末端から1068~2737位および3254~5162位で示される、DNA分子、
B2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号4で示される、DNA分子、
で示されるDNA分子であり、
前記タンパク質3をコードする核酸分子が、以下のC1)またはC2):
C1)そのコード領域が配列表の配列番号5の5’末端から1094~3415位で示される、DNA分子、
C2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号5で示される、DNA分子、
で示されるDNA分子であり、
前記タンパク質4をコードする核酸分子が、D1)またはD2):
D1)そのコード領域が配列表の配列番号6の5’末端から1409~5044位、7004~7234位、および7700~10399位で示される、DNA分子、
D2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号6で示される、DNA分子、
で示されるDNA分子であり、
前記タンパク質5をコードする核酸分子が、以下のE1)またはE2):
E1)そのコード領域が配列表の配列番号7の5’末端から1473~6488位で示される、DNA分子、
E2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号7で示される、DNA分子、
で示されるDNA分子であり、
前記タンパク質6をコードする核酸分子が、以下のF1)またはF2):
F1)そのコード領域が配列表の配列番号8の5’末端から953~991位および1063~1090位で示される、DNA分子、
F2)そのヌクレオチド配列が配列表の配列番号8で示される、DNA分子、
で示されるDNA分子である、
請求項2に記載の核酸分子の組み合わせ。 The nucleic acid molecule encoding the protein 1 is the following A1) or A2) :.
A1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1044 to 3050 from the 5'end of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
A2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
It is a DNA molecule indicated by
The nucleic acid molecule encoding the protein 2 is the following B1) or B2) :.
B1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1068 to 2737 and 3254 to 5162 from the 5'end of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
B2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
It is a DNA molecule indicated by
The nucleic acid molecule encoding the protein 3 is the following C1) or C2) :.
C1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1094 to 3415 from the 5'end of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
C2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing,
It is a DNA molecule indicated by
The nucleic acid molecule encoding the protein 4 is D1) or D2) :.
D1) The DNA molecule whose coding region is shown at positions 1409-5044, 7004-7234, and 7700-10399 from the 5'end of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
D2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing,
It is a DNA molecule indicated by
The nucleic acid molecule encoding the protein 5 is the following E1) or E2) :.
E1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 1473 to 6488 from the 5'end of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
E2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing,
It is a DNA molecule indicated by
The nucleic acid molecule encoding the protein 6 is the following F1) or F2) :.
F1) A DNA molecule whose coding region is indicated at positions 953 to 991 and 1063 to 1090 from the 5'end of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
F2) The DNA molecule whose nucleotide sequence is shown by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing,
Is a DNA molecule indicated by,
The combination of nucleic acid molecules according to claim 2.
発現カセット、組換えベクター、組換え微生物、またはトランスジェニック細胞系。 A combination of nucleic acid molecules according to claim 2 or 3.
Expression cassettes, recombinant vectors, recombinant microorganisms, or transgenic cell lines.
前記組換え株が、請求項2または3に記載の核酸分子の組み合わせを含む組換えSchizochytriumである、使用。 The use of recombinant strains in the production of DHA and / or EPA.
Use , wherein the recombinant strain is a recombinant Schizochytrium comprising the combination of nucleic acid molecules according to claim 2 or 3.
前記「出発株における請求項1に記載のタンパク質の組み合わせの発現および/または活性を増大させる」ステップが、請求項2または3に記載の、前記タンパク質の組み合わせをコードする前記核酸分子の組み合わせを、前記出発株に導入することによって実現され、
前記出発株がSchizochytriumである、組換え株。 A recombinant strain, which is a recombinant strain obtained by a preparation method for increasing the expression and / or activity of the protein combination according to claim 1 in the starting strain.
The step of "increasing the expression and / or activity of the protein combination according to claim 1 in the starting strain" is the combination of the nucleic acid molecules encoding the protein combination according to claim 2 or 3. Realized by introducing it into the starting stock
A recombinant strain in which the starting strain is Schizochytrium .
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