CN100460506C - 一种ω-3脂肪酸去饱和酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ω-3脂肪酸去饱和酶及其编码基因与应用。ω-3脂肪酸去饱和酶的氨基酸残基如序列表中的序列2所示。本发明的ω-3脂肪酸去饱和酶基因，具备转录成mRNA和翻译成去饱和脂肪酸酶功能，并且能在转染细胞和动物体内合成ω-3 PUFAs，显著提高细胞和动物体内ω-3 PUFAs的水平。

Description

一种ω-3脂肪酸去饱和酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种ω-3脂肪酸去饱和酶及其编码基因与应用。

背景技术

脂肪酸是细胞的基本成分之一，在生物体中普遍存在并发挥着各种重要的生理作用。近年来，随着对脂肪酸功能的深入理解，一些脂肪酸特别是一些长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)已成为具有重要医疗价值和营养价值的物质并受到研究者的高度重视。LC-PUFAs是指十六碳以上并含有两个以上双键的脂肪酸，n-3 PUFAs和n-6 PUFAs是其中最重要的两种类型，前者的不饱和键起始于脂肪酸碳链甲基端的第三位碳，故称为n-3型或ω-3型；后者的不饱和键起始于脂肪酸碳链甲基端的第六位碳，故称为n-6型或ω-6型。这两类脂肪酸尤其是前者已成为目前研究与开发的热点与重点。

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAs)如EPA、DHA等是一类具有重要功能的脂肪酸。它们是细胞膜磷脂中必不可少的组分，使细胞膜结构保持适宜的柔性、流动性和选择通透性，并作为类花生酸如前列腺素、白细胞三烯和血栓烷的前体分子和与特定的细胞蛋白的伴随受体相结合，作为介导发热、发炎、血管扩张、血压及疼痛等细胞应答的信号分子(James G.Wallis，Jennifer L.Watts，John Browse.Polyunsaturated fatty acid synthesis:what will they think of next？.TRENDSin Biochemical Sciences，2002，27(9)：467～473)。更多情况，人们知道它们能作为功能性食品使用以维持身体的正常发育及健康。例如DHA被称为“脑黄金”而备受人们青睐，EPA则作为一种“血管清道夫”而受推崇(Kris-Etherton PM，Hecker KD，Binkoski AE.Polyunsaturated fatty acids and cardiovascularhealth.Nutr Rev.2004，62(11)：414～426)。因此，ω-3多不饱和脂肪酸作为功能性食品或药物的需求量也在不断增大。哺乳动物及人类自身都不能合成大多数的ω-3PUFAs、主要来源依靠食物获取。在当前，深海鱼油仍然是ω-3PUFAs的主要来源。但事实上该来源正在不断地下降，而且鱼油中的DHA和EPA的构成和含量随着鱼的种类、季节、地理位置等变化而变化。鱼油制剂还带有腥味，影响了产品的品质。此外，从鱼油中提取的DHA含胆固醇多，可能含有因环境污染所致的重金属等物质(D.R.Tocher，M.J.leaver，P.A.Hodgson.Recent advances in thebiochemi stry and molecular biology of fatty acyl desaturase.Prog.l ipidRes.1998，37：73～117)。因此通过其他途径来获取更大量ω-3 PUFAs以满足人们的需求已成研究的热点。海洋真菌和微藻等低等生物则具有合成EPA、DHA的能力，它们是EPA和DHA的原始生产者，而海洋鱼类等动物主要通过吞食藻类及浮游生物积累EPA、DHA等不饱和脂肪酸(Suzette L.Pereira，Yung-Sheng Huang，Emil G.Bobik，et al.A novel ω-3 fatty acid desaturase involved in the biosynthesisof eicosapentaenoic acid.Biochem.J.2004，378：665～671)。因此，各国先后开展了从海洋微藻和真菌中提取EPA、DHA的研究。虽然这些途径前景广阔，但目前还存在不少问题，离真正广泛的实际应用还有一定的距离。随着对脂肪酸代谢在基因水平的不断深入的认识和研究，通过基因工程及转基因技术使人类千百年来食用的作物或畜禽能自行产生EPA、DHA等不饱和脂肪酸已经逐渐成为现实。

α-亚麻酸(α-linolenic acid，α LA)、廿碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、廿二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)、廿二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)均属于n-3PUFAs；而亚油酸(linoleic acid，LA)、γ-亚麻酸(γ-lenolenic acid，γ-LA)、花生四烯酸(arochidonic acid，AA)等属于n-6 PUFAs。在哺乳动物中n-3和n-6 PUFAs在代谢上和功能上有着明显的区分。n-6 PUFAs如花生四烯酸的过量会引起前凝血反应(prothombotic)等生理效应，并导致炎症和心血管等疾病，相反n-3 PUFAs如EPA已经被证实能够预防和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病(Huang YS，Pereira SL，Leonard AE.Enzymesfor transgenic biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids.Biochimie.2004，86(11)：793～798；Kang JX.The importance of omega-6/omega-3fatty acid ratio in cell function.The gene transfer of omega-3 fatty aciddesaturase.World Rev Nutr Diet.2003，92：23～36)。

体外的和动物的模型研究表明(n-3)PUFAs在深海鱼中的高浓度存在抑制了癌细胞的分化和生长速度。但其机制有待深入研究。Aktas H等的研究发现，n-3 PUFAs的作用是通过钙信号实现的，既Ca²⁺损耗导致eIF2的α亚基的磷酸化，从而抑制了相关分子的转译起始。Denys A等在Jurkat T-细胞的实验中研究了EPA和DHA的作用机制，认为它们是通过蛋白激酶C-α和C-ε以及NF-β等信号通路调节IL-2基因的表达，从而最终调节T-细胞的活化(Mozaffarian D，Ascherio A，Hu FB，et al.Interplay Between Different Polyunsaturated Fatty Acids and Risk of CoronaryHeart Disease in Men.Circulation.2005 Jan 18；111(2)：157-64)。近年来的研究表明，n-6 PUFAs具有促进乳腺癌的发育，而长链的n-3 PUFAs则具有抑制效应。n-6/n-3 PUFAs的比率是控制癌症发生的一个重要因素。在人体细胞中该比率通常是很高的，因为n-6 PUFAs不能转化为n-3 PUFAs。Ge Y等通过腺病毒载体的方法把线虫n-3去饱和酶基因fat-1转入人的乳腺癌细胞，结果使细胞中n-3 PUFAs高水平表达，而n-6 PUFAs的含量大大下降(n-6/n-3 PUFAs的比率从12下降到0.8)，转基因引起癌细胞的大批死亡，有效地抑制了癌细胞的分裂(NicolaGaibazzi，Vigilio Ziacchi.Reversibility of stress-echo induced ST-segmentdepression by long-term oral n-3 PUFAs supplementation in subjects withchest pain syndrome，normal wall motion at stress-echo and normal coronaryangiogram.BMC Cardiovasc Disord.2004 Mar 23；4：1.)。Guermouche B等将富含EPA和DHA等PUFAs的制品EOAX-7010用于饲喂患糖尿病的怀孕小鼠及其所生的肥胖幼崽，结果发现在母鼠及其幼崽中Concavalin-A刺激的T-细胞增殖均显著下降，并观察到Ca²⁺的升高，这表明此制品有助于该小鼠模型的T-细胞畸形后的重塑(Napier JA，Beaudoin F，Michaelson LV，et al.The production of long chainpolyunsaturated fatty acids in transgenic plants by reverse-engineering.Biochimie.2004，86(11)：785～792)。

当然在适量的情况下，无论是n-3PUFAs还是n-6PUFAs都是哺乳动物和人体所必需的，例如，研究发现AA、DA以及DHA在中枢神经系统(CNS)的结构性脂(structural lipids)中高浓度地存在，故而这些PUFAs被认为是大脑、视网膜和神经系统发育所必需的，在婴幼儿营养中不可缺少(D.R.Tocher，M.J.leaver，P.A.Hodgson.Recent advances in the biochemistry and molecular biology offatty acyl desaturase.Prog.lipid Res.1998，37：73～117)。

然而，n-3 PUFAs和n-6 PUFAs在哺乳动物中的含量差异极大，即n-6 PUFAs含量较多，而n-3 PUFAs含量极少，二者比例在西方人体中高达16:1左右。根据相关的研究，n-6和n-3 PUFAs的比例应该在1:1为适宜，所以人体通常处于n-3 PUFAs供应不足的状态。因此，在西方国家的相关机构及专家推荐n-3 PUFAs的每日平均摄入量应该为0.2g。当然，近来的一些研究表明，此标准应根据不同的人群和地区进行适当的调整。实际上，即使在整个自然界，生物体内所能合成的n-6和n-3 PUFAs的量的比例也同样是极不均衡的，依然是后者稀缺，因此，n-3 PUFAs的重要性更为突出，对其相关研究和开发利用必将越来越受到重视。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种ω-3脂肪酸去饱和酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的ω-3脂肪酸去饱和酶，名称为sFat-1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的序列2；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有ω-3脂肪酸去饱和酶功能的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由399个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述ω-3脂肪酸去饱和酶编码基因也属于本发明的保护范围。

上述ω-3脂肪酸去饱和酶编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中序列1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的序列1由1226个脱氧核苷酸组成，自5′端第16位至1215位脱氧核苷酸为编码序列；自5′端第11位至20位脱氧核苷酸为有利于基因表达的Kozak序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因动物和植物、工程细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

所述转基因动物和植物系具体可谓各种转基因动物如鱼类、禽类和哺乳类以及所有植物类；工程细胞系具体可为哺乳动物细胞系，如CHO细胞系；所述工程菌具体可为酵母。

本发明采用哺乳动物常用密码对ω-3脂肪酸去饱和酶的天然基因的密码子进行优化处理，使其更适合于在哺乳动物细胞和体内表达。转染CHO细胞和转基因小鼠实验表明，本发明的ω-3脂肪酸去饱和酶基因，具备转录成mRNA和翻译成去饱和脂肪酸酶功能，并且能在转染细胞和动物体内合成ω-3 PUFAs，显著提高细胞和动物体内ω-3 PUFAs的水平。本发明的基因，比天然基因更适于哺乳动物细胞和体内表达。可将本发明的ω-3脂肪酸去饱和酶基因导入动植物体内或离体的细胞系，提高动植物体内或细胞系中ω-3多不饱和脂肪酸的含量，或构建生产ω-3多不饱和脂肪酸的动植物生物反应器。

附图说明

图1为sFat-1基因人工合成示意图。

图2为sFat-1基因及其各小片段PCR拼接后电泳图。

图3为质粒pcDNA3.1-sFat1的质粒大小鉴定和酶切鉴定。

图4为质粒pcDNA3.1-sFat1-EGFP结构示意图和Sma I酶切鉴定电泳图。

图5为EGFP在转染的CHO细胞中表达。

图6为pcDNA3.1-sFat1-EGFP转染细胞的GC-MS分析。

图7为pEGFP-N1和pcDNA3.1-sFat1-EGFP转染CHO细胞的脂肪酸的相对比例。

图8为表达载体pBC1-sFat1的构建过程示意图。

图9为sFat-1基因在不同组织器官的转录表达情况。

图10为非转基因小鼠、pBC1-sFat1转基因2号、pcDNA3.1-sFat1-EGFP转基因小鼠4、5、6、16号的肌肉脂肪酸GC-MS分析。

图11为pcDNA3.1-sFat1-EGFP转基因小鼠16号的脂肪、心、肝、脾、脑、肺、肾等组织脂肪酸GC-MS分析。

图12为转基因小鼠乳汁脂肪酸GC-MS分析。

具体实施方式

下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、sFat-1及其编码基因的获得

在文献检索的基础上，发现线虫C.Briggsae的一段DNA具有类似fat-1基因的基因组序列，尽管内含子很短，其氨基酸编码较C.elegans的fat-1基因少两个氨基酸，但二者的核苷酸序列同源性为71.5％，氨基酸同源性为86.1％，没有对该序列编码蛋白功能研究的报道。该编码序列极可能具有fat-1基因功能，对该基因的密码子进行优化处理后，合成了24段核苷酸序列，共计1226bp。在该序列中有三个酶切位点AGATCT(BglII)；CATATG(NdeI)；CGATCG(PvuI)，可将其切割为四大段即FS1(231bp)；FS2(339bp)；FS3(368bp)；FS4(306bp)；各大段再设计为60～68bpD的小段进行人工合成。合成序列如下(带下划线处均为重叠区)：

FS1(231 bp)

FS1-1 CACCATGGTC GCTCATTCCT CTGACGGTCT GTCTGCCACC GCTCCTGTGA CTGGCGG TGA TGTG(64bp)

FS1-2 GTACGAGGAC CCTTCTCTTC AATAGAAACA CGAGCATCGA CCAGCACATC ACCGCCA GTC AC(62bp)

FS1-3 GAGAAGGGTC CTCGTACTTT GGAATCTACT CAAAACTCTA CTGAGGAAGA TCGCGTG CAA TTGC(64bp)

FS1-4 GGTCAGATCA CGTTCGAAAC AATGAGGTGG AATGGCACGG CGGAAAGCAT CCACAGT A GG CAATTGCACG CGATCTTCC(79bp)

FS2(339bp)

FS2-1 CTGAGATATC TTGTGCAAGA CTTTGCCGCT CTGGCTTTTC TCTACTTTGC TCTGCCTGTG TTCG(64bp)

FS2-2 CATAAGCACG TTCCAAGCCA GATAACCCAC CAGACCAAAG TATTCGAACA CAGGCAG AGC AAAG(64bp)

FS2-3 GGCTTGGAAC GTGCTTATGG GTGTCTTCGG ATTTGCTTTG TTCGTGGTCG GTCACGAT TG TCTG(64bp)

FS2-4 GACCAATAAT ATCGTTCAAG TTTTGGTTAT CTGAAAAAGA TCCATGCAGA CAATCGTGAC CGACC(65bp)

FS2-5 CTTGAACGAT ATTATTGGTC ATATCGCTTT CTCTCCTCTG TTCTCTCCCT ATTTTCCTTG GCAG(64bp)

FS2-6 GTCAATATGG TTGGTGAAAG CGTGATGCAG TTTGTGACTC TTCTGCCAAG GAAAATA GGG AG(62bp)

FS2-7 CTTTCACCAA CCATATTGAC AAAGATCATG GTCACGTGTG GATTCAAGAC AAAGATTATG AA(62bp)

FS3(368bp)

FS3-1 CCTACTTGGA AGAAGCTGTT CAACCCTATG CCCTTTTCTG GTTGGCTGAA ATGGTTCCCC GTGTAC(66bp)

FS3-2 GATGAGTAAG GCCAGAAATG AGAACCATCG CAGAAACCAA ACAGAGTGTA CACGGGGA AC CATTTC(66bp)

FS3-3 CATTTCTGGC CTTACTCATC TCTGTTCGTG CGTGATTCTG AACGTGTCCA A TGCGTGATT TCTGCTAC(68bp)

FS3-4 GTAAGAACCG GCAATAGCCA GTGCCACATA AGCACAGGCC ACACAGCAAG TAGCAGA AAT CACGCATTG(69bp)

FS3-5 GGCTATTGCC GGTTCTTACT CAAACTGGTT CTGGTACTAT TGGGTGCCTC TGTCTTTCTT TGGTTG(66bp)

FS3-6 CCTCAGCCAC TTCATCAGCA TGTTGCAGAT AAGTGACAAT CACCAGCATA CAACCAA AGA AAGACAGAG(69bp)

FS3-7 GCTGATGAAG TGGCTGAGGT GTACGAAGCT GATGAGTGGA GTTTTGTGCG TGGTCAA ACCCAGACTAT(68bp)

FS4(306bp)

FS4-1 TTTCTATGGT TTTGGATTGG ATGAGACCAT GCACCATATT ACTGACGGTC ACGTGGCTCA TCAC(64bp)

FS4-2 CTTCAGTAGCTTCGATCAGATGGTAATGAGGAATCTTATTGAAAAAGTGATGAGCCACGT GACCG(65bp)

FS4-3 CTGATCGAAG CTACTGAAGG TGTGAAGAAA GTGTTGGAGC CTCTGTTCGA GACTCAGTAT GG(62bp)

FS4-4 CCACAGGAAA CGCACAAAGA AATCGTAGTT CACTTGATAC TTGTAACCAT ACTGAGTCTC GAAC(64bp)

FS4-5 CTTTGTGCGT TTCCTGTGGT TTAACCTGAA GCTGGATTAT CTGGTGCATA AGACTAAAGG TATC(64bp)

FS4-6 TTACTTGGCT TTAGCCTTCT CTTCCAGAGT TGTACGAAAT TGCAGGATAC CTTTAGTCTT ATGC(64bp)

此外，在起始密码子ATG的前面加入了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表达的Kozak序列。sFat-1基因人工合成和PCR拼接过程如图1所示。第一轮PCR扩增时，共用4个反应体系完成，第一个体系以上述FS1-1至FS1-4四个片段混合后作为模板，以PFS1F GTTGCGGCCG CCACCATGGTCGCTCATTCCTCTG和PFS1R AACAGATCTGGTCAGATCACGTTCGAAACAATG为引物，进行扩增；第二个体系以上述FS2-1至FS2-7片段混合后作为模板，以PFS2F TTGAGATCTCTGAGATATCTTGTGCAAGAC和PFS2R CCACATATGTTCATAATCTTTGTCTTGAATC为引物，进行扩增；第三个体系以上述FS3-1至FS3-7片段混合后作为模板，以PFS3F GGTCATATGCCTACTTGGAAGAAGCTGTTC和PFS3R TTACGATCGATAGTCTGGGTTTGACC ACGCAC为引物，进行扩增；第四个体系以上述FS4-1至FS4-6片段混合后作为模板，以PFS4FAATCGATCGTTTCTATGGTTTTGGATTGGATG和PFS4R CAAGGTACCTTACTTGGCTTTAGCCTTCTCTTC为引物，进行扩增；四个PCR的循环程序为94℃，30sec，72℃，45sec，30循环。将反应产物进行凝胶电泳，结果如图2中(a)所示，扩增产物为FS1片段(231bp，泳道1)、FS2片段(339bp，泳道2)、FS3片段(368bp，泳道3)和FS4片段(306bp，泳道4)。第二轮PCR用2个反应体系完成，即分别将上述PCR得到的FS1片段和FS2片段用Bgl II酶切后连接，将上述PCR得到的FS3片段和FS4片段用Pvu I酶切后连接，以FS1片段和FS2片段的连接产物为模板，以FS1-1和FS2-7为引物，进行PCR扩增，扩增得到570bp的片段，其中PCR的循环程序为94℃，30sec，72℃，60sec，30循环。以FS3片段和FS4片段的连接产物为模板，以FS3-1和FS4-6为引物，进行PCR扩增，扩增得到674bp的片段，其中，PCR的循环程序为94℃，30sec，72℃，60sec，30循环。然后将第二轮PCR扩增得到的两个片段分别用Nde I酶切，并将它们连接，以该连接产物为模板，以FS1-1和FS4-6为引物，PCR的循环程序为94℃，30sec，72℃，120sec，30循环，进行第三轮PCR反应，即获得1200bp的全长基因。第二轮和第三轮PCR扩增产物凝胶电泳如图2中(b)所示，其中泳道1、泳道2分别为第二轮PCR扩增得到的大小为570bp和674bp两个片段，泳道3为第三轮PCR扩增得到的1200bp的全长基因，合成的序列经序列分析，与设计的序列完全一致，将其命名为sFat-1。sFat-1具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列1具有1226个核苷酸，自5′端第16—1215位核苷酸序列为编码序列。

实施例2、sFat-1的表达

1、哺乳动物细胞系表达载体的构建

将基因sFat-1用Not1和Kpn1双酶切，克隆到表达载体pcDNA3.1(-)(Invitrogen Inc.)的Not1和Kpn1酶识别位点之间。连接产物经过转化大肠杆菌DH5α、涂LB平板、挑选克隆、摇菌、提取质粒和酶切初步鉴定后再测序鉴定而获得正确插入了目的基因的克隆，结果如图3所示，图3中(a)为质粒大小鉴定，所有质粒大小均为6627bp，随机选择其中4个用Xho I和HindIII进行双酶切，即从载体两端再切下来的1200bp的sFat-1基因，证明它们确实连入了目的片段(见图3中(b))。最后测序检测，将测序表明含有sFat-1基因pcDNA3.1(-)重组载体命名为pcDNA3.1-sFat1。其中，图3中(a)中泳道1-6为pcDNA3.1-sFat1载体的电泳图，图3中(b)泳道1-4为Xho I和HindIII进行双酶切的pcDNA3.1-sFat1，泳道M为分子量标准。

为了使验证实验更为方便，在测序获得的正确克隆既质粒pcDNA3.1-sFat1上加上EGFP标签，得到用于哺乳动物细胞系表达质粒pcDNA3.1-sFat1-EGFP。具体步骤为：用AseI和Af1II从载体pEGFP-N1(Clontech Com)酶切下来EGFP片段，该片段还包括其前端的CMV启动子和后端的SV40 PolyA，将其补平，插入到pcDNA3.1-sFat1的Bst11071I酶切后补平的位点处，这样，该表达质粒中目的基因sFat-1和标记基因EGFP各自带有一套完整的启动子和PolyA，形成两个各自独立的表达单元。连接产物转化大肠杆菌DH5 α后最终获得克隆。提取质粒电泳鉴定表明，一部分为EGFP目的片段连入载体，一部分则为pcDNA3.1-sFat1载体本身自连接，一部分则为两个pcDNA3.1-sFat1载体之间的相连接。将属于第一种情况的克隆用Sma I酶切鉴定，结果见图4中b，其中一些为正连接(如图4中b的泳道3和泳道4)，切下来的6403bp和1810bp大小的两个片段，一些为反连接(如图4中b的泳道1)，较小片段大于1810bp，还有连入了2个EGFP片段的情况(如图4中b的泳道2)，将经过酶切和测序鉴定表明含有一个正连接的EGFP的pcDNA3.1-sFat1载体命名为pcDNA3.1-sFat1-EGFP。pcDNA3.1-sFat1-EGFP的结构简图如图4中a所示。

2、细胞培养及转染CHO细胞系

将CHO细胞用添加有10％胎牛血清、20mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和和100U/ml链霉素的DMEM培养基(生长培养基)，培养于37℃、5％CO₂及饱和湿度下。待瓶中细胞单层长满后进行消化传代。

采用阳离子脂质体法转染CHO细胞。转染前用Sca I酶切表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP，琼脂糖电泳，回收待用。哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP线形化后用脂质体转染CHO细胞系，同时用空载体pEGFP-N1转染的CHO细胞作为对照，一部分未转染的CHO细胞作空白对照。转染操作按转染试剂提供的方法进行，简述如下：(1)在转染的前一天，将上述培养的CHO细胞分散至三个6孔板中，待其生长至70％～90％汇合时使用；(2)向1.5ml Eppendorf管中分别加入500μl DMEM培养基，再加入6μl脂质体Lipofectamine TM2000，混合均匀，记做A液；(3)向1.5ml Eppendorf管中加入500μl DMEM，再加入1～2μg上述线性化的pcDNA3.1-sFat1-EGFP或用ApaI线性化的空载体pEGFP-N1(对照)，或者加入等体积的水(空白对照)，混合均匀，记做B液；(4)A液与3个B液在室温下放置5min，分别集中到一个Eppendorf管中，记做C液，室温静置20min；(5)吸弃CHO细胞的培养基，用新鲜的DMEM洗涤两遍，加入新鲜的DMEM500μl，将C液分散加到上述装有CHO细胞的6孔板的每个孔中，轻轻混匀；(6)置于37℃的CO₂培养箱中，3h后，每半小时观察一次细胞，待细胞形状由梭形变为稍圆形时，吸弃孔中的液体，换上含10％ FBS的DMEM培养基(生长培养基)，继续培养6～8h，然后用0.25％胰蛋白酶消化每个孔的细胞，分别转至90mm培养皿中，用含800g/ml Geneticin(G-418)的DMEM生长培养基进行培养，筛选抗性细胞。待抗性细胞长满后进行传代和冻存。

经过3周的抗性Genectin筛选后获得转染细胞系，载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP在CHO细胞中表达了绿色荧光蛋白(如图5所示)，荧光的强度在筛选的各个时期都低于空载体pEGFP-N1。未转染的CHO细胞不表达绿色荧光蛋白。显然是因为目的基因sFat-1也在同时表达的缘故。试验过程中也发现，转染sFat-1基因的CHO细胞系经过6～7次的传代后，GFP基因的表达并没有明显的减弱。

3、sFat-1基因的表达及其对CHO细胞的脂肪酸组成影响

提取上述pcDNA3.1-sFat1-EGFP转染细胞的总RNA，进行了RT-PCR，其结果也证实了在转染细胞中sFat-1基因的mRNA存在。显然，CHO细胞系中的转染sFat-1基因已经转录了mRNA。

为了确切证实sFat-1在CHO细胞的表达产物是否具有ω-3脂肪酸去饱和酶的正常功能，实验测定了细胞中脂肪酸的变化情况，结果如图6所示。GC-MS测定的脂肪酸百分含量如表1所示。GC-MS实验在对照组(转染pEGFP-N1空载体)、实验组(转染pcDNA3.1-sFat-1-EGFP)中均检测出来16种脂肪酸，包括3种饱和脂肪酸、3种单不饱和脂肪酸和10种多不饱和脂肪酸。在2个组别间，不饱和脂肪酸总含量以及多不饱和脂肪酸总含量差异均不显著，但是二者间ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸总含量存在显著的差异，即ω-6多不饱和脂肪酸在对照组最高(48.97)、在实验组最低(35.29)，而ω-3多不饱和脂肪酸则刚好相反，在转染对照载体pEGFP-N1的对照组最低(7.86)、在转染pcDNA3.1-sFat1-EGFP实验组最高(24.02)。具体到每一种脂肪酸，其含量在2个组别间的情况与此也基本一致。此外，ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值在2个组别间也明显存在差异，在对照组中高达6.23，而在实验组里已降低至1.47。ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸之间此消彼长的这种关系正是因为sFat-1基因的ω-3去饱和酶的作用，它是合成ω-3系列多不饱和脂肪酸时最后一个步骤的关键酶，在ω-3位置上发生去饱和作用而增加一个不饱和键(双键)，而该酶的底物主要就是ω-6系列多不饱和脂肪酸。这样使得ω-6系列多不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列多不饱和脂肪酸，既18:2n-6→18:3n-3，20:2n-6→20:3n-3，20:3n-6→20:4n-3，20:4n-6→20:5n-3(EPA)，22:4n-6→22:5n-3(DHA)(见图6，7和表1)，其中，图7中1～16分别表示14，16，18，16:1n-5，18:1n-9，18:2n-6，18:3n-3，18:3n-6，20:1n-9，20:2n-7，20:3n-7，20:4n-6，20:5n-3，22:4n-6，22:5n-3，22:6n-3脂肪酸；serials 1表示pEGFP-N1转染的CHO细胞，serials 2表示pcDNA3.1-sFat-1-EGFP转染CHO细胞。

                    表1.不同脂肪酸的百分含量

不同的小写字母上标表示差异显著

实施例3、用于动物生物反应器的表达研究

1、转基因质粒的构建

转基因表达载体使用转染细胞用的pcDNA3.1-sFat1-EGFP载体。同时构建了乳腺表达载体质粒pBC1-sFat1，其构建流程示意图如图8所示，具体步骤为：将乳腺表达载体pBC1(Invitrogen Inc.)用内切酶Xho I切开，并用Klenow补平，再以CIAP去磷酸化；用Xho I、HindIII双酶切pcDNA3.1-sFat1，回收1200bp片段，补平。两者进行连接过夜。获得转化克隆后用PCR方法和酶切方法鉴定正确连接的克隆，测序结果含有DNA序列的pBC1重组载体即为乳腺表达载体为pBC1-sFat1。

注射用pcDNA3.1-sFat1-EGFP载体片段和pBC1-sFat1载体片段的制备：凝胶电泳回收后的pcDNA3.1-sFat1-EGFP载体片段和pBC1-sFat1载体片段经紫外分光光度计定量后用注射用TE(pH 7.4的10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA)稀释到1～3μg/mL。分装为10μL/管。-20℃保存备用。

2、显微注射制备转基因小鼠

按转基因小鼠制备的常规方法制备供体母鼠和受体母鼠。使用显微注射法将上述制备的注射用的pcDNA3.1-sFat1-EGFP载体和pBC1-sFat1注射到受精卵的雄性原核内，所有卵注射完毕后，全部转移至M16培养液中并置二氧化碳孵箱中短暂培养后，再移植到受体鼠即假孕母鼠的输卵管。pcDNA3.1-sFat1-EGFP的注射卵共移植了189枚，出生小鼠33只；pBC1-sFat1的注射卵共移植了167枚，出生小鼠24只。

3、转基因小鼠的鉴定

剪下出生后10～14d小鼠尾尖约0.5cm，提取DNA。以DTF1 5′TGTGCGTGGTCAA ACCCAGACTATC 3′和DTR15′GTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAG 3′为引物，提取的pcDNA3.1-sFat1-EGFP注射小鼠的DNA为模板，PCR程序为：先94℃预变性4min；再94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 20s，35个循环；最后72℃ 10min；4℃保存。结果表明pcDNA3.1-sFat1-EGFP的注射卵共移植后出生的33只小鼠中有5只PCR阳性(3号，4号，5号，6号，16号)，再用Soutrernblot鉴定，获得4只为阳性转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠(4号，5号，6号，16号)。以55：5′-GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3和56：5′-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3′为引物，以提取的pBC1-sFat1注射小鼠的DNA为模板，PCR条件同转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠PCR鉴定，结果表明，pBC1-sFat1的注射卵共移植后出生的24只小鼠中有5只PCR阳性(2号，3号，9号，10号，11号)，再用Soutrern blot鉴定，仍有5只为阳性(具体结果见表2)表明获得5只转pBC1-sFat1小鼠(2号，3号，9号，10号，11号)。

   表2 显微注射制备转基因小鼠的结果

 

转基因载体	移植卵数	出生小鼠数	转基因小鼠数	阳性率(％)
					pcDNA3.1-sFat1-EGFP	189	33	4	12.12
pBC1-sFat1	167	24	5	20.83

4、首建者转基因小鼠的传代

将上述PCR鉴定正确的转pBC1-sFat1首建者小鼠(2号，3号，9号，10号，11号)和转pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠(3号，4号，5号，6号，16号)分别在4周龄左右与非转基因小鼠交配，获得F₁代小鼠，结果如表3所示。对出生的后代小鼠进行PCR(方法同步骤3中转pBC1-sFat1小鼠或转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠的PCR鉴定)检测，根据阳性转基因小鼠的数量计算遗传率。结果表明，转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠中3号不能将导入的外源基因遗传给后代，其余的4，5，6，16号F₀小鼠都能遗传给后代，其中4号遗传概率较高。转pBC1-sFat1小鼠中，10号不能将导入的外源基因遗传给后代，其余的转pBC1-sFat1F₀小鼠都能遗传给后代。但除3号遗传概率较高外，其余的遗传概率较低。

                表3 转基因小鼠的传代

5、RT-PCR检测sFat-1在转基因小鼠不同组织器官的表达情况

分别将上述传代保种后的转pBC1-sFat1首建者小鼠或转pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠引颈法处死后取肌肉、心脏、大脑、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、脂肪等组织，实验提取总RNA，按照TaKaLa公司的RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0的说明书进行RT-PCR，结果表明，在转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠中，上述各组织都转录表达了目的基因，而转pBC1-sFat1小鼠中则没有转录表达，部分结果如图9所示，图9种所示为转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠(16号鼠)和转pBC1-sFat1小鼠(2号鼠)的转录表达情况。在转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠中，RT-PCR产物的浓度反应了在肝脏、心脏、肌肉、大脑和肾脏中转录表达的mRNA较丰富，而脂肪、肺脏和脾脏中则很稀少。

5、转基因小鼠中sfat-1基因表达即脂肪酸组成变化的鉴定

首先用气相色谱质谱联用法(GC-MS)测定分析了4只转pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠(4号、5号、6号和16号，因为3号小鼠未能将导入基因遗传给后代，故不作分析)的肌肉组织的脂肪酸组成(包括每只首建者小鼠的一只转基因后代)，转pBC1-sFat1小鼠肌肉组织中的脂肪酸组成，以非转基因小鼠作为对照。结果如图10所示，图10为色谱图，纵坐标为百分含量，横坐标为各种脂肪酸出现的保留时间(Retention time)，结果表明，每一种脂肪酸出现的保留时间在同样的实验条件下几乎是恒定的，不同的脂肪酸出现的时间不一样，由此可以将各种脂肪酸在色谱图中区分开，在通过质谱分析和搜库对比就可以准确判定各个色谱峰所代表的不同脂肪酸的具体种类。各个色谱峰的高低则表明此脂肪酸的含量，按照其峰面积计算出它含量。这样GC-MS分析后所有脂肪酸种类和百分含量得以确定，结果如表4所示。结果表明，这4只小鼠肌肉组织的脂肪酸中ω-3多不饱和脂肪酸都显著提高。表明该基因在4只小鼠体内发挥了其酶活性，将ω-6多不饱和脂肪酸催化生成了ω-3多不饱和脂肪酸。与非转基因小鼠相比较，其中ω-6多不饱和脂肪酸总含量从对照组35％左右降到试验组(转基因组)的27％左右，而ω-3多不饱和脂肪酸总含量则从6％左右升高到23％左右。转pBC1-sFat1小鼠肌肉组织中的脂肪酸组成，分析结果表明，这种小鼠在脂肪酸组成上并没有发现ω-3多不饱和脂肪酸的增加(图10，表4)，这说明外源基因在转pBC1-sFat1小鼠的肌肉等组织中很可能都没有表达。因此，不再分析转pBC1-sFat1小鼠其他组织的脂肪酸组成。图10中(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)分别表示非转基因小鼠、转pBC1-sFat1小鼠2号、转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠4、5、6、16号的肌肉脂肪酸GC-MS分析。

表4 pBC1-sFat1和pcDNA3.1-sFat1-EGFP转基因小鼠肌肉中不同脂肪酸含量(％)

不同的小写字母上标表示差异显著

对在肌肉中表达最高的转pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠16号(ω-3多不饱和脂肪酸总含量高达25.41％)的其他体组织即脂肪、心、肝、脾、脑、肺、肾等进行GC-MS分析结果表明，外源基因sFat-1在这些组织均有表达，但表达程度(由ω-3多不饱和脂肪酸积累的总量表示)有很大的差异，结果如图11和表5所示。除了肌肉组织外，心、肝、脑和肾的ω-3多不饱和脂肪酸增加幅度都较大，而脂肪、脾和肺则增幅较小。这些数据说明，外源基因sFat-1在pcDNA3.1-sFat1-EGFP转基因小鼠中获得了非常高的和组织广泛的表达，其中，图11中为(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)和(g)分别表示转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠16号的脂肪、心、肝、脾、脑、肺、肾等组织脂肪酸GC-MS分析。

表5 pcDNA3.1-sFat1-EGFP转基因小鼠16号的多种组织不同脂肪酸含量(％)

对转pBC1-sFat1小鼠重点分析了乳汁中的脂肪酸组成成分，同时也分析了转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠和非转基因小鼠的乳汁脂肪酸，结果见图12和表6。结果表明，转pBC1-sFat1小鼠和转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠的ω-3多不饱和脂肪酸总量比非转基因小鼠都有所增加，然而增幅并不大。转pBC1-sFat1小鼠乳汁ω-3多不饱和脂肪酸总量仅比正常非转基因小鼠提高一倍。而转pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠增加更少(近0.5倍)。图12中(a)，(b)和(c)分别为非转基因，转pBC1-sFat1小鼠，和转pBC1-sFat1小鼠乳汁脂肪酸GC-MS分析。

上述所有的ω-3多不饱和脂肪酸增加几乎都有一个共同特点，即更长链的22碳ω-3多不饱和脂肪酸(包括22:6n-3和22:5n-3)增加的幅度非常大(主要是同此前发表的结果相比较)，而其他较短链的ω-3多不饱和脂肪酸(18:3n-3和20:5n-3)则增加较少。

        表6 转基因小鼠乳汁中不同脂肪酸含量(％)

 

脂肪酸类别	非转基因小鼠	pcDNA3.1-sFat1-EGFP转基因	pBC1-sFat1转基因
				14	17.02	15.55	20.90
16	20.49	19.10	20.57
				18	6.11	8.34	6.64
16:1n-5	0.35	0.35	0.37
				18:1n-9	16.41	15.17	13.94
18:2n-6	22.05	22.14	24.14
				18:3n-3	0.71<sup>b</sup>	0.98<sup>b</sup>	1.76<sup>a</sup>

 

18:3n-6	0.17	0.21	2.38
				20:1n-9	2.13	1.29	1.88
20:2n-7	2.46	2.30	3.25
				20:3n-7	0.76	0.73	0.58
20:4n-6	5.24	6.44	7.02
				20:5n-3	2.39	3.21	3.24
22:4n-6	1.19<sup>b</sup>	1.38<sup>b</sup>	2.62<sup>a</sup>
				22:5n-3	0.44<sup>b</sup>	0.86<sup>a</sup>	1.01<sup>a</sup>
22:6n-3	1.00<sup>b</sup>	1.47	2.06<sup>a</sup>
				ω-6PUFAs	28.65	30.17	36.16
ω-3PUFAs	4.54<sup>b</sup>	6.52	8.07<sup>a</sup>
				ω-6/ω-3PUFAs	6.31	4.63	4.48

不同的小写字母上标表示差异显著

序列表

<160>2

<210>1

<211>1226

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>399

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Claims (10)

1.一种ω-3脂肪酸去饱和酶，是氨基酸残基序列如序列表中的序列2所示。

2.权利要求1所述ω-3脂肪酸去饱和酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述ω-3脂肪酸去饱和酶的编码基因的编码序列为自序列1的5′端第16位至1215位脱氧核苷酸。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为酵母。

7.权利要求2或3所述的基因在提高植物体内ω-3多不饱和脂肪酸含量中的应用。

8.权利要求4所述的重组表达载体在生产ω-3多不饱和脂肪酸中的应用。

9.权利要求4所述的工程菌在生产ω-3多不饱和脂肪酸中的应用。

10.权利要求2或3所述的基因在制备生产ω-3多不饱和脂肪酸的离体动物生物反应器或植物生物反应器中的应用。

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