CN101845446A - 脂肪酸去饱和酶家族成员fad4、fad5、fad5-2和fad6及它们的应用 - Google Patents

脂肪酸去饱和酶家族成员fad4、fad5、fad5-2和fad6及它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码新型脂肪酸去饱和酶家族成员。本发明还提供包含去饱和酶核酸分子的重组表达载体、已经引入所述表达载体的宿主细胞以及大规模生产长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)如DHA的方法。

Description

脂肪酸去饱和酶家族成员FAD4、FAD5、FAD5-2和FAD6及它们的应用
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2001年9月28日；申请号：01819633.0(PCT/IB01/02346)；发明名称：同上。
相关申请
本申请要求2000年9月28日申请的美国临时申请序号60/236,303和2001年6月12日申请的美国临时申请序号60/297,562的优先权，所述临时申请的完整内容特此通过引用完整地结合到本文中。所述临时申请所引用的所有参考文献的完整内容也特此通过引用结合到本文中，成为本申请的一部分。
发明背景
脂肪酸是具有长链碳氢侧链基团的羧酸，在许多生物过程中起主要作用。脂肪酸在自然中很少是游离的，而是作为脂类的主要成分以酯化形式存在。脂类/脂肪酸是能量的来源(如b-氧化)，并且是加工生物学或生物化学信息不可缺少的细胞膜的组成部分。
脂肪酸可以分为两类：饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸在顺式构型内包含一个或多个碳双键。不包含脂肪酸由属于非血红素-铁酶家族的末端去饱和酶产生。每种这样的酶都是电子转运系统的一部分，而电子转运系统包含两种其它蛋白，即细胞色素b5和NADH-细胞色素b5还原酶。明确地说，所述酶催化脂肪酸分子中碳原子之间双键的形成。人和其它哺乳动物体内催化不饱和脂肪酸中特定双键形成所需的这些去饱和酶的种类有限。因此，人必须通过膳食摄取一些脂肪酸。所述必需脂肪酸有，例如，亚油酸(C18:2)；亚麻酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)。与此不同，昆虫和植物能够合成更多种类的不饱和脂肪酸及它们的衍生物。
长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)如二十二碳六烯酸(DHA，22:6(4，7，10，13，16，19))是哺乳动物体内各种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需成分。例如，脑磷脂中超过30％的脂肪酸是22:6(n-3)和20:4(n-6)。(Crawford，M.A.等(1997)Am.J.Clin.Nutr.66：1032S-1041S)。在视网膜中，DHA占感光细胞的感光部分杆外节段中总脂肪酸超过60％。(Giusto，N.M.等(2000)Prog.Lipid Res.39：315-391)。临床研究已经显示：DHA对于婴儿脑部的生长和发育以及维持成人正常脑功能是必需的(Martinetz，M.(1992)J.Pediatr.120：S129-S138)。DHA对于涉及信号传导过程、视紫红质激活以及视杆细胞和视锥发育的感光细胞功能也有显著影响(Giusto，N.M.等(2000)Prog.Lipid Res.39：315-391)。此外，在如高血压、关节炎、动脉粥状硬化、压抑、血栓形成和癌症等疾病的治疗中也发现DHA的一些积极效应(Horrocks，L.A.和Yeo，Y.K.(1999)Pharmacol.Res.40：211-215)。因此，通过膳食适当供应脂肪酸对于人维持健康是重要的。对于婴儿、年纪小的儿童和年长的公民来说，从膳食摄取足够这些脂肪酸尤其重要，因为他们在体内不能有效合成这些脂肪酸，必须通过食物补充(Spector，A.A.(1999)Lipids 34：S1-S3)。
根据甲基端最后一个双键的位置，DHA是n-3系列的脂肪酸。它通过去饱和以及延长的交替步骤合成。DHA的生物合成从18:3(9，12，15)开始，涉及Δ6去饱和形成18:4(6，9，12，15)，然后延长到20:4(8，11，14，17)，随后Δ5去饱和形成20:5(5，8，11，14，17)。此后，对于所述生物合成存在一些争议。传统观点是20:5(5，8，11，14，17)延长成为22:5(7，10，13，16，19)，然后通过最后的Δ4去饱和转化成为22:6(4，7，10，13，16，19)(Horrobin，D.F.(1992)Prog.Lipid Res.31：163-194)。然而，Sprecher等最近提出DHA生物合成另一个可能的途径，该途径不依赖于Δ4去饱和酶，涉及两次连续的延长、一次Δ6去饱和以及一次通过在过氧化物酶体中的限制性β-氧化缩短两个碳(Sprecher，H.等(1995)J.Lipid Res.36：2471-2477；Sprecher，H.等(1999)Lipids 34：S153-S156)。
由于DHA对人类健康的有益作用，因此DHA的生产是重要的。目前DHA的主要来源是鱼和藻类的油。鱼油是该脂肪酸的主要和传统来源，但是，到销售时，通常发生了氧化。另外油的供应极不稳定，并且由于鱼量缩减，其来源处于危险中，而藻类来源由于产量低和提取的高额费用而昂贵。
EPA和AA都是Δ5必需脂肪酸。它们形成人和动物的食物和饲料组成部分的一个独特种类。EPA属于n-3系列，在酰基链中有五个双键，EPA在海洋食物中发现，在来自北大西洋的富含脂肪的鱼中很丰富。AA属于n-6系列，带有四个双键。AA在ω-3位置缺少一个双键，这赋予它与EPA不同的特性。从AA生产的类二十烷酸有强烈的炎症和血小板凝集特性，而从EPA生产的类二十烷酸有抗炎和抗血小板凝集特性。也可以从一些食物如肉、鱼和蛋获得AA，但浓度较低。
γ-亚麻酸(GLA)是在哺乳动物中发现的另一种必需脂肪酸。GLA是超长链n-6脂肪酸和各种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物体内，长链多不饱和脂肪酸的形成受到Δ6去饱和的速度限制。已经显示：许多生理学和病理学状况如衰老、应激、糖尿病、湿疹和一些感染抑制Δ6去饱和步骤。此外，GLA容易受到来自与某些疾病如癌症或炎症的氧化和快速细胞分裂的催化。因此，在膳食中补充GLA能够降低这些疾病的风险。临床研究已经显示：在膳食中补充GLA有效治疗一些病理状况，如变应性湿疹、经前综合征、糖尿病、高胆固醇血症以及炎症和心血管疾病。
GLA的主要来源是植物油和微生物，植物如月见草(Oenotherabiennis)、琉璃苣(Borago officinalis L.)、红酯栗(Ribes nigrum)，微生物如被孢霉属菌(Mortierella sp.)、毛霉菌属菌(Mucor sp.)和蓝细菌(Cyanobacteria)。然而，由于这些GLA来源的可得性有巨大波动以及与提取过程有关的费用，因此这些GLA来源对于膳食补充不是理想的。
发明简述
脂肪酸的生物合成是植物和微生物的主要活动。然而，人合成必需脂肪酸如长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)的能力有限。长久以来，人们一直认为生物技术是在植物和微生物中操作生产脂肪酸的过程的有效方法。它节省成本、可再生并且副效应小。因此，已经进行大量的艰苦的努力，意图通过操作植物、动物和微生物细胞生产各种化合物，包括特殊脂肪酸和药用多肽。因此，生物技术是以安全成本-效益方式生产不饱和脂肪酸、尤其是LCPUFA的诱人途径，以从这些脂肪酸获取最大治疗价值。
本发明基于(至少部分基于)发现编码新型去饱和酶的核酸分子家族。尤其是本发明的发明人已经鉴定涉及长链多不饱和脂肪酸DHA(二十二碳六烯酸，22:6，n-3)和DPA(二十二碳五烯酸，22:5，n-6)生物合成的Fad4(Δ4去饱和酶)、Fad5和Fad5-2(Δ5去饱和酶)以及Fad6(Δ6去饱和酶)；更具体地说，Fad4使22:5(n-3)和22:4(n-6)去饱和，导致DHA和DPA；Fad5和Fad5-2使20:4(n-3)和20:3(n-6)去饱和，导致EPA和AA；以及Fad6去饱和酶18:2(n-6)和18:3(n-3)，导致GLA(γ-亚麻酸)和SDA(十八碳四烯酸)。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子包括在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7中陈述的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，该核酸分子编码一种多肽，该多肽包括SEQ ID NO：2、4、6或8中陈述的氨基酸序列。
在又一实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述核酸分子包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7陈述的核苷酸序列基本相同(如70％相同)的核苷酸序列。本发明还提供分离的核酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7陈述的核苷酸序列的至少30个连续核苷酸。在另一实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述核酸分子编码包括氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6或8陈述的氨基酸序列基本相同(如50％相同)。还提供核酸分子，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO：2、4、6或8陈述的氨基酸序列的多肽的等位基因变异体。除编码全长多肽的分离核酸分子外，本发明还提供编码本发明所述全长多肽的片段(如生物活性片段)(如包括SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸残基的片段)的核酸分子。在另外的其它实施方案中，本发明提供与本文所述的分离的核酸分子互补、或在严格条件下杂交的核酸分子。
在相关方面，本发明提供包括本文所述的分离的核酸分子(如编码去饱和酶的核酸分子)的载体。还提供包括这样的载体的宿主细胞(如包括适于生产去饱和酶核酸分子和多肽的载体的宿主细胞)。
在再一方面，本发明提供分离的去饱和酶多肽和/或其生物活性片段。示范性的实施方案提供包括SEQ ID NO：2、4、6或8陈述的氨基酸序列的多肽、包括与SEQ ID NO：2、4、6或8陈述的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列的多肽、由包括核苷酸序列的核酸分子编码的多肽，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7陈述的核苷酸序列至少70％相同。还提供本文所述全长多肽的片段(如包括SEQ ID NO：2、4、6或8陈述的序列的至少10个连续氨基酸残基的片段)以及具有SEQ ID NO：2、4、6或8陈述的氨基酸序列的多肽的等位基因变异体。
在一个实施方案中，去饱和酶多肽或其片段具有去饱和酶活性。在另一实施方案中，去饱和酶多肽或其片段具有N-末端血红素结合基序，如在前端(front-end)去饱和酶中发现的细胞色素b5样结构域。在另一实施方案中，去饱和酶多肽或其片段具有在所有微粒体去饱和酶中发现的至少两个、最好约三个连续的组氨酸残基，并且可选地具有去饱和酶活性。在一个优选实施方案中，所述去饱和酶多肽或其片段具有约三个组氨酸基序。
包含所述去饱和酶基因的构建物可以用于包含任何表达系统的植物、动物和微生物，以产生能够生产LCPUFA如DHA、EPA、AA、SDA和GLA的细胞。用于表达本发明的去饱和酶的植物的例子其中包括来自油料种子作物的植物和植物种子，例如亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine和Soja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(corron)(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、橄榄(Olea sp.)、红花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)和花生(Arachis sp.)。
在一个相关方面，本发明提供使用细胞(如植物细胞、动物细胞和/或微生物细胞)生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA)和不饱和脂肪酸生物合成途径中其它关键化合物的新型改良方法，在所述细胞中已经操作所述不饱和脂肪酸生物合成途径，以便生产LCPUFA或其它所需的不饱和脂肪酸化合物。
本发明所述新型改良方法包括在细胞中生产不饱和脂肪酸(如DHA)的方法，所述细胞中含有已经操作的不饱和脂肪酸生物合成途径的至少一种脂肪酸去饱和酶，以便生产不饱和脂肪酸(如以高水平生产)。例如，本发明提供在包含如上文所述的至少一种分离的去饱和酶核酸分子(如Fad4、Fad5、Fad5-2和/或Fad6)或其部分的细胞中生产不饱和脂肪酸(如DHA)的方法，以便生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))。所述方法可以另外包括回收所述LCPUFA的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))的方法，该方法包括在一定条件下，使包含至少一种上文定义的去饱和酶靶分子的组合物与至少一种如上文定义的分离的去饱和酶多肽(如Fad4、Fad5、Fad5-2和/或Fad6)或其部分接触，从而生产不饱和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))。所述方法还可以包括回收所述LCPUFA的步骤。
上文所述的核酸、蛋白和载体尤其可用于本发明的方法中。特别地，本发明提供增强不饱和脂肪酸生产(如DHA生产)的方法，所述方法包括在一定条件下培养包含去饱和酶核酸(如Fad4、Fad5、Fad5-2和/或Fad6)的重组植物、动物和/或微生物，从而增强脂肪酸生产。
在另一实施方案中，本发明提供产生能够生产不饱和脂肪酸的细胞的方法。所述方法包括将编码蛋白的分离的核酸分子引入细胞(如植物细胞)，所述蛋白具有催化脂肪酸分子中双键形成的活性。
在又一实施方案中，本发明提供调节脂肪酸生产的方法，所述方法包括培养包含分离的核酸分子的细胞，以便调节脂肪酸的生产，其中所述分离的核酸分子编码具有催化双键形成的活性的多肽。
在再一实施方案中，本发明包括组合物，所述组合物包含本文所述的不饱和脂肪酸核酸或多肽。本发明的组合物还可以包含能够生产如上文所述脂肪酸的细胞，并且可选地还包括药学上可接受的载体。
在另一实施方案中，本发明的组合物在如动物饲料中用作食品添加剂，或用作保健品(neutraceutical)。本发明的组合物也用于治疗患有疾病的患者，包括给予所述组合物以便治疗患者。所述方法包括的疾病包括，例如，应激、糖尿病、癌症、炎症和心血管疾病。
本发明的其它特征和益处将随后的详细描述和权利要求而变得显而易见。
附图简述
图1显示来自破囊壶菌属菌(Thraustochytrium sp.)的Fad4DNA序列和蛋白序列；(A)可读框的cDNA序列(SEQ ID NO：1)；和(B)翻译的蛋白序列(SEQ ID NO：2)。
图2显示来自破囊壶菌属菌的Fad5的DNA序列和蛋白序列；(A)可读框的cDNA序列(SEQ ID NO：3)；和(B)翻译的蛋白序列(SEQ IDNO：4)。
图3显示来自破囊壶菌属菌的Fad4和Fad5蛋白序列(分别是SEQID NO：2和4)的比较。垂直条指示氨基酸同一性。突出显示保守基序如细胞色素b5血红素结合基序和组氨酸丰富基序。两个箭头指示两个简并引物的结合位置。
图4显示来自畸雌腐霉(Pythium irregulare)的Fad5-2的DNA序列和蛋白序列；(A)可读框的cDNA序列(SEQ ID NO：5)；和(B)翻译的蛋白序列(SEQ ID NO：6)。
图5显示来自畸雌腐霉的Fad6的DNA序列和蛋白序列；(A)可读框的cDNA序列(SEQ ID NO：10)；和(B)翻译的蛋白序列(SEQ IDNO：11)。
图6显示来自畸雌腐霉的Fad5-2和Fad6蛋白序列(分别是SEQ IDNO：6和8)的比较。垂直条指示氨基酸同一性。突出显示保守基序如细胞色素b5血红素结合基序和组氨酸丰富基序。两个箭头指示两个简并引物的结合位置。
图7是来自表达Fad4的酵母菌株Invsc2的脂肪酸甲基酯(FAME)以及外源底物22:5(n-3)的气相色谱(GC)分析。
图8是图7中新峰的FAME的气相色谱/质谱(MS)分析；(A)Fad4产物；(B)DHA(22:6，n-3)标准。
图9是来自表达Fad4的酵母菌株Invsc2的FAME以及外源底物22:4(n-6)的GC分析。
图10是图9中新峰FAME的GC/MS分析；(A)Fad4产物；(B)DPA(22:5，n-6)标准。
图11是来自表达Fad5的酵母菌株Invsc2的FAME以及外源底物20:3(n-6)的GC分析。
图12是图11中新峰FAME的GC/MS分析；(A)Fad5产物；(B)AA(20:4-5，8，11，14)标准。
图13是来自表达Fad5-2的酵母菌株AMY2α的FAME分别与外源底物18:1-9(上部分)和18:1-11(下部分)的GC分析。
图14是来自表达Fad6的酵母菌株Invsc2的FAME与外源底物18:2(9，12)的GC分析。
图15是图14中新峰的衍生物的MS分析。显示所述新脂肪酸的二乙基酰胺的结构，其中m/z值代表包括酰胺部分的离子。在m/z156/168、196/208和236/248的三对离子分别鉴定为在Δ6、Δ9和Δ12位置的双键。
图16是来自在35S启动子控制下表达Fad4的芥菜(Brassicajuncea)的叶的FAME以及外源提供的底物22:5(n-3)的GC分析。
图17显示在35S启动子控制下表达Fad5-2的一个转基因T1系的营养组织(叶、茎和根)的脂肪酸组成。脂肪酸水平显示为芥菜总脂肪酸的重量百分比。
图18是表达Fad5-2的芥菜的根FAME以及外源底物高γ-亚麻酸(homo-γ-linolenic acid，HGLA，20:3-8，11，14)的GC分析。
图19是从在napin启动子控制下表达Fad5-2的芥菜的种子制备的FAME的GC分析。
图20是来自表达Fad6的芥菜的种子FAME的GC分析。三个新峰指出在转基因种子中有三种Δ6去饱和脂肪酸。
图21显示在芥菜的Fad6转基因种子中积累的GLA(γ-亚麻酸)和SDA(十八碳四烯酸)的重量百分比。
图22显示来自五个转基因系的种子脂类的脂肪酸组成，所述五个转基因系表达Fad6；SA＝硬脂酸；OA＝油酸；LA＝亚油酸；GLA＝γ-亚麻酸；ALA＝α-亚麻酸；SDA＝十八碳四烯酸。
图23是一个表，显示破囊壶菌属菌的脂肪酸分布。
表1.破囊壶菌属菌(Thraustochytrium sp.)的脂肪酸分布(w％)
图24是一个表，显示畸雌腐霉的脂肪酸分布。
表2.畸雌腐霉(Pythium irregulare)的脂肪酸分布(w％)
图25是一个表，显示外源脂肪酸在酵母AMY-2α/pFad5-2中的转化。
表3.在酵母AMY-2αpFad5-2中外源脂肪酸的转化
图26是一个表，显示在napin(Napin)和亚麻种子特异性(Cln)启动子控制下表达Fad5-2的转基因亚麻籽中Δ5-不饱和聚甲烯中断的脂肪酸(Δ5-UPIFA)的积累。脂肪酸水平显示为总脂肪酸的重量百分比。
表4：在napin(Napin)和亚麻种子特异性(Cnl)启动子控制下表述Fad5-2的转基因亚麻子中Δ5-UPIFA的积累。脂肪酸水平显示为占总脂肪酸的重量百分比。
图27是一个表，显示在napin启动子控制下表达Fad6的转基因亚麻籽(Solin和Normandy)中Δ6去饱和脂肪酸的积累。脂肪酸水平显示为总脂肪酸的重量百分比。
表5：在napin启动子控制下表达Fad6的转基因亚麻籽(Solin和Normandy)中Δ6不饱和脂肪酸的积累。脂肪酸水平显示为占总脂肪酸的重量百分比。
注：S，Solin型亚麻；N，Normandy-传统型亚麻
发明详述
本发明基于(至少部分基于)脂肪酸去饱和酶家族新成员的发现，所述新成员在本文中称为“去饱和酶”核酸和蛋白分子(如Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad-6)。这些新分子是脂肪酸去饱和酶家族的成员，在生产LCPUFA的生物中表达，所述生产LCPUFA的生物例如破囊壶菌属、畸雌腐霉、Schizichytrium和Crythecodinium。
本文所用术语“脂肪酸”是本领域内公知的，包括基于长碳氢链的羧酸。脂肪酸是许多脂类(包括甘油酯)的成分。最常见的天然脂肪酸是具有偶数碳原子(16或18)并且饱和或不饱和的单羧酸。“不饱和”脂肪酸在碳原子之间包含顺式双键。本发明包括的不饱和脂肪酸包括，例如，DHA、GLA和SDA。“多不饱和”脂肪酸包含多于一个双键，并且双键以一种亚甲基间断的系统(-CH＝CH-CH2-CH＝CH-)排列。
本文中通过一种编号系统描述脂肪酸，在该编号系统中，冒号前的数字指示所述脂肪酸中碳原子的数目，而冒号后的数字是存在双键的数目。在不饱和脂肪酸的情况下，随后是圆括号内的数字，指示双键的位置。圆括号内的每个数字是双键连接的两个碳原子中编号较低的碳原子。例如，油酸可以描述为18:1(9)，亚油酸可以描述为18:2(9，12)，这些编号指出有18个碳原子，一种在碳原子9有一个双键，另一种在碳原子9和12有两个双键。
生产不饱和脂肪酸(即不饱和脂肪酸生物合成途径)中的控制步骤由膜结合的脂肪酸去饱和酶(如Fad4、Fad5、Fad5-2和/或Fad6)催化。明确地说，所述酶催化脂肪酸分子碳原子间双键的形成。本文所用术语“不饱和脂肪酸生物合成途径”指在体内或体外导致不饱和脂肪酸合成的一系列化学反应。所述途径包括一系列去饱和以及延长步骤，产生不饱和脂肪酸，并最终产生长链多不饱和脂肪酸。所述不饱和脂肪酸可以包括：GLA 18:3(6，9，12)、SDA 18:4(6，9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA 20:5(5，8，11，14，17)和DPA 22:5(4，7，10，13，16)以及DHA 22:6(4，7，10，13，16，19)。
去饱和酶可以包括一个血红素结合基序和/或约三个保守组氨酸基序，不过可以存在其它结构域。脂肪酸去饱和酶家族的成员转化饱和脂肪酸成为不饱和脂肪酸，即长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)，长链多不饱和脂肪酸是哺乳动物体内各种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的组成成分。LCPUFA的例子其中包括二十二碳六烯酸(DHA，22:6(4，7，10，13，16，19))。临床研究已经显示：DHA对于婴儿脑部的生长和发育以及维持成人正常脑功能是必需的(Martinetz，M.(1992)J.Pediatr.120：S129-S138)。DHA对于涉及信号传导过程、视紫红质激活以及视杆细胞和视锥发育的感光细胞功能也有显著影响(Giusto，N.M.等(2000)Prog.Lipid Res.39：315-391)。此外，在如高血压、关节炎、动脉粥状硬化、抑郁、血栓形成和癌症等疾病的治疗中也发现DHA的一些积极效应(Horrocks，L.A.和Yeo，Y.K.(1999)Pharmacol.Res.40：211-215)。因此，去饱和酶分子可以用于生产在治疗疾病中应用的LCPUFA，所述疾病的特征在于异常调节性生长、增殖或分化。所述疾病包括癌症，如癌、肉瘤或白血病；肿瘤血管发生和转移；骨骼发育异常；肝病；脊髓发育不良综合征；以及造血疾病和/或骨髓增生疾病。其它与血管发生有关并因此与去饱和酶有关的疾病包括1型遗传性出血性毛细管扩张(hereditary hemorrhagictelangiectasia type 1)、进行性纤维发育不良骨化、特发性肺纤维变性和Klippel-Trenaunay-Weber综合征。
术语“家族”当指本发明的蛋白和核酸分子时，意味着具有共同结构域或基序并具有本文定义的足够氨基酸序列或核苷酸序列同源性的两种或多种蛋白或核酸分子。所述家族成员可以是天然的或非天然的，并且可以来自同一物种或不同物种。例如，一个家族可以包括人类来源的第一种蛋白和人类来源的其它不同蛋白，或者可以包括非人类来源的类似物(如大鼠或小鼠蛋白)。一个家族的成员也可以具有共同的功能特性。
例如，本发明的去饱和酶蛋白家族包括一个细胞色素b5血红素结合基序。本文所用术语“血红素结合基序”是在前端去饱和酶中存在的细胞色素b5样结构域的N末端延伸结构。
在另一实施方案中，蛋白的去饱和酶家族的成员在蛋白中包括“组氨酸基序”，最好包括约三个或四个组氨酸基序。本文所用术语“组氨酸基序”包括具有至少约两个组氨酸残基、最好约三个或四个组氨酸残基的蛋白结构域，并且一般在所有微粒体去饱和酶中作为第三个保守组氨酸基序出现。
细胞色素b5血红素结合基序和组氨酸基序的例子包括SEQ IDNO：2的氨基酸残基41-44、182-186、216-223和453-462，SEQ ID NO：4的氨基酸残基40-43、171-175、207-213和375-384，SEQ ID NO：6的氨基酸残基40-45、171-176、208-213和395-400，SEQ ID NO：8的氨基酸残基42-47、178-183、215-220和400-405，如图3和6所示。
本发明的分离的去饱和酶蛋白具有与SEQ ID NO：2、4、6和8的氨基酸序列足够同源的氨基酸序列，或者由与SEQ ID NO：1、3、5或7足够同源的核苷酸序列编码。本文所用术语“足够同源”指第一种氨基酸序列或核苷酸序列具有与第二种氨基酸序列或核苷酸序列足够或最小数目的相同或同等(如具有相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基或核苷酸，使得所述第一种和第二种氨基酸序列或核苷酸序列具有共同结构域或基序和/或共同功能活性。例如，本文定义下面这样的氨基酸或核苷酸序列是足够同源的：所述氨基酸序列或核苷酸序列具有共有结构域并包含至少一个、最好两个结构域或基序，其中所述序列的共有结构域在所述结构域的氨基酸序列上具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性或同一性。此外，本文定义下面这样的氨基酸或核苷酸序列是足够同源的：所述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性或同一性，并且具有共有功能活性。
在一个优选实施方案中，去饱和酶蛋白包括至少一种或多种下面结构域或基序：血红素结合基序和/或组氨酸基序，并且所述去饱和酶蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性或同一性。在又一优选实施方案中，去饱和酶蛋白包括至少一种或多种下面结构域：血红素结合基序和/或组氨酸基序，并且由具有以下核苷酸序列的核酸分子编码，所述核苷酸序列在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列的核酸分子互补物杂交。在再一实施方案中，去饱和酶蛋白包括至少一个血红素结合基序和/或至少约三个组氨酸基序，并且具有去饱和酶活性。
在本文中“去饱和酶活性”、“去饱和酶的生物活性”或“去饱和酶的功能活性”可以互换使用，这些术语包括根据标准技术在体内或体外测定，由去饱和酶蛋白、多肽或核酸分子在去饱和酶效应细胞或去饱和酶底物上施加或介导的活性。在一个实施方案中，去饱和酶活性是直接活性，例如与去饱和酶的靶分子结合。本文所用的“靶分子”或“结合配偶体”是一种分子，如涉及不饱和脂肪酸(如中间体脂肪酸)合成的分子，去饱和酶蛋白天然能够与所述分子结合或相互作用，完成去饱和酶介导的功能。去饱和酶的直接活性还包括在脂肪酸分子的碳原子之间形成双键，以形成不饱和脂肪酸分子。
分离的破囊壶菌属菌Δ4去饱和酶Fad4的核苷酸序列、cDNA以及由Fad4 cDNA编码的预期氨基酸序列分别显示于图1和SEQ IDNO：1和2。破囊壶菌属菌Fad4基因(可读框)约1560个核苷酸长，编码一种分子量约为59.1kD、长约519个氨基酸残基的蛋白。
破囊壶菌属菌Δ5去饱和酶Fad5的核苷酸序列、cDNA以及由Fad4 cDNA编码的预期氨基酸序列分别显示于图2和SEQ ID NO：3和4。破囊壶菌属菌Fad5基因约1320个核苷酸长，编码一种分子量约为49.8kD、长约456个氨基酸残基的蛋白。
畸雌腐霉Δ5去饱和酶Fad5-2的核苷酸序列、cDNA以及由Fad5-2cDNA编码的预期氨基酸序列分别显示于图4和SEQ ID NO：5和6。畸雌腐霉Fad5-2基因约1371个核苷酸长，编码一种长约456个氨基酸残基的蛋白。
畸雌腐霉Δ6去饱和酶Fad6的核苷酸序列、cDNA以及由Fad6cDNA编码的预期氨基酸序列分别显示于图5和SEQ ID NO：7和8。畸雌腐霉Fad6基因约1383个核苷酸长，编码一种长约460个氨基酸残基的蛋白。
本发明的各方面将在下面的小节中进一步详细描述：
I.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及编码去饱和酶蛋白或其生物活性部分的分离的核酸分子、足以用作鉴定编码去饱和酶的核酸分子(如去饱和酶mRNA)的杂交探针的核酸片段、以及用作PCR引物以扩增或突变去饱和酶核酸分子的片段。本文所用术语“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。所述核酸分子可以是单链或双链的，但最好是双链DNA。
术语“分离的核酸分子”包括这样的核酸分子：所述核酸分子与其天然来源中存在的其它核酸分子分离。例如，在基因组DNA的情况下，术语“分离的”包括这样的核酸分子：所述核酸分子与所述基因组DNA天然结合的染色体分离。“分离的”核酸最好不含获得所述核酸分子的生物的基因组DNA中所述核酸侧翼的序列(即在所述核酸5′和3′末端的序列)。例如，在不同实施方案中，所述分离的去饱和酶核酸可以包含获得所述核酸的细胞基因组DNA中天然出现在所述核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。此外，“分离的”核酸分子(如cDNA分子)可以基本不含其它细胞物质，或者在用重组技术生产的情况下不含培养基，或者在化学合成的情况下基本不含化学前体或其它化学物质。
可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子，所述核酸分子例如具有SEQ ID NO：1、3、5、7的核苷酸序列或其部分的核酸分子。用SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列的全部或部分作为杂交探针，可以使用标准杂交和克隆技术(如下面文献所述：Sambrook，J.等Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)分离去饱和酶核酸分子。
此外，使用根据SEQ ID NO：1、3、5或7的序列设计的合成寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)可以分离包含SEQ ID NO：1、3、5或7的全部或部分的核酸分子。
使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板以及合适的寡核苷酸引物，根据PCR扩增技术，可以扩增本发明的核酸。可以将如此扩增的核酸克隆进合适载体并通过DNA序列分析进行鉴定。此外，可以通过标准合成技术(如使用自动化DNA合成仪)制备对应于去饱和酶核苷酸序列的寡核苷酸。
在另一实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO：1、3、5或7陈述的核苷酸序列。
在又一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO：1、3、5或7所示核苷酸序列或者任何一种上述核苷酸序列的一部分的互补物。与SEQ ID NO：1、3、5或7所示核苷酸序列互补的核酸分子是与SEQ ID NO：1、3、5或7所示的核苷酸序列足够互补的核酸分子，以便它能够与SEQ ID NO：1、3、5或7所示的核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体。
在再一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与SEQ IDNO：1、3、5或7所示核苷酸序列(例如完整长度的所述核苷酸序列)或者任何一种上述核苷酸序列的一部分或互补物有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列长至少(或不多于)50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750或更多个核苷酸，并且在严格杂交条件下与SEQID NO：1、3、5或7的核酸分子的互补物杂交。
此外，本发明的核酸分子可以仅包含SEQ ID NO：1、3、5或7的部分核酸序列，例如可以用作探针或引物的片段或编码部分去饱和酶蛋白的片段，如去饱和酶蛋白的生物活性部分。根据克隆所述去饱和酶基因确定的核苷酸序列允许产生探针和引物，所述探针和引物设计用于鉴定和/或克隆其它去饱和酶家族成员以及其它物种的去饱和酶类似物。所述探针/引物(如寡核苷酸)一般包括基本纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包括在严格条件下与下面序列杂交的核苷酸序列区：SEQ ID NO：1、3、5或7的有义链或SEQ ID NO：1、3、5或7的反义链或SEQ ID NO：1、3、5或7的天然等位基因变异体或突变异体的至少约12或15、优选约20或25、更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个连续核苷酸。
示例性的探针或引物长至少(或不高于)为12或15、20或25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多核苷酸，和/或包含本文所述分离的核酸分子的连续核苷酸。本发明的范围内还包括下述探针和引物，所述探针或引物包含本文所述分离的核酸分子的连续核苷酸，但在所述探针或引物序列内有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的差异。基于所述去饱和酶核苷酸序列的探针可以用于检测(如特异性检测)编码同样或同源蛋白的转录物或基因组序列。在优选实施方案中，所述探针还包括与其连接的标记基团，如所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。在另一实施方案中，提供一组引物，如适于在PCR中应用的引物，所述引物可以用于扩增去饱和酶序列的选定区，所述区如本文所述的结构域、区、位点或其它序列。所述引物应该至少长5、10或50碱基对，并且少于100碱基对，或者少于200碱基对。所述引物在与本文所述序列或天然出现变异体的序列进行比较时，应该相同，或者差异不大于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。所述探针可以用作诊断测定试剂盒的一部分，以鉴定错误表达去饱和酶蛋白的细胞或组织，例如通过测量来自受试验者的细胞样品中编码去饱和酶的核酸，如检测去饱和酶mRNA水平或测定基因组去饱和酶基因是否已经突变或缺失。
可以如下制备编码“去饱和酶蛋白生物活性部分”的核酸片段：分离SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列部分，该部分编码具有去饱和酶生物活性的多肽(所述去饱和酶蛋白的生物活性如本文所述)，然后表达所编码的部分去饱和酶蛋白(如通过体外重组表达)，随后评价所编码的部分去饱和酶蛋白的活性。在一个示例性的实施方案中，所述核酸分子至少长50-100、100-250、250-500、500-700、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750或更多核苷酸，并且编码具有去饱和酶活性(如本文所述)的蛋白。
本发明还包括这样的核酸分子：所述核酸分子由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列不同，因此它们编码的去饱和酶蛋白与SEQ ID NO：1、3、5或7所示核苷酸序列编码的去饱和酶蛋白相同。在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6或8所示的氨基酸序列有至少1个、但不多于5个、10个、20个、50个或100个氨基酸残基不同。在又一实施方案中，所述核酸分子编码人去饱和酶的氨基酸序列。假如需要进行对比排列，则排列序列的最大同一性。
核酸变异体可以是天然的或非天然的，天然变异体例如等位基因变异体(相同座位)、同系物(不同座位)和直向同源物(orthologue)(不同生物)。可以通过诱变技术制造非天然出现的变异体，所述诱变技术包括那些应用于多核苷酸、细胞或生物的技术。所述变异体可以包括核苷酸置换、缺失、倒位和插入。变异可以出现在编码区或非编码区，或者同时出现在编码区和非编码区。所述变异可以产生保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代(所编码产物的比较)。
等位基因变异体源于，例如，群体(如人类群体)内的DNA序列多态性，所述DNA序列多态性导致所述去饱和酶蛋白的氨基酸序列的变化。去饱和酶基因内的所述遗传多态性可以由于天然等位基因变异而存在于群体的个体内。
本文所用的术语“基因”和“重组基因”指这样的核酸分子：所述核酸分子包括编码去饱和酶蛋白(如油籽去饱和酶蛋白)的可读框，并且可以还包括非编码的调节序列和内含子。
因此，在一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码多肽的天然出现的等位基因变异体，所述多肽包含SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列，其中所述核酸分子在例如严格杂交条件下与包含SEQ ID NO：1、3、5或7的核酸分子的互补物杂交。
去饱和酶的等位基因变异体(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)包括有功能的或无功能的去饱和酶蛋白。有功能的等位基因变异体是去饱和酶蛋白天然出现的氨基酸序列变异体，所述变异体保持下面能力，如：(i)与去饱和酶底物或靶分子(如脂肪酸如22:5(n-3))相互作用；和/或(ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子之间形成双键。由本发明的核酸和蛋白分子生产的脂肪酸也可用于治疗疾病如衰老、应激、糖尿病、癌症、炎症性疾病(如关节炎、湿疹)和心血管疾病。有功能的等位基因变异体一般将仅包含SEQ ID NO：2、4、6或8的一个或多个氨基酸的保守取代，或包含所述蛋白非关键区中非关键残基的取代、缺失或插入。
无功能的等位基因变异体是所述去饱和酶蛋白天然出现的氨基酸序列变异体(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)，所述变异体不具有下面能力，如：(i)与去饱和酶底物或靶分子(如中间体脂肪酸如22:5(n-3))相互作用；和/或(ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子之间形成双键。无功能的等位基因变异体一般将包含SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列中的非保守取代、缺失或插入，或者成熟前切短所述序列，或者包含在所述蛋白关键区或关键残基的取代、插入或缺失。
本发明还提供直向同源物(如所述去饱和酶蛋白的人直向同源物)。破囊壶菌属和畸雌腐霉去饱和酶蛋白的直向同源物是从其它生物分离的蛋白，并具有同样的去饱和酶底物或靶分子结合机制、双键形成机制、对婴儿脑部生长和发育的调节机制、对成人正常脑功能的维持机制、影响涉及信号转导过程的感光功能的能力、影响视紫红质激活的能力、视杆细胞和/或视锥的发育机制、和/或对非人去饱和酶蛋白的细胞生长和/或增殖的调节机制。破囊壶菌属和畸雌腐霉去饱和酶蛋白的直向同源物可以容易地鉴定为包含与SEQ ID NO：2、4、6或8基本同源的氨基酸序列。
此外，本发明的范围内包括编码其它去饱和酶家族成员、并因此与SEQ ID NO：1、3、5或7的去饱和酶序列不同的核苷酸序列的核酸分子。例如，可以根据Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6的核苷酸序列鉴定另一种去饱和酶cDNA。此外，本发明的范围内包括编码不同物种的去饱和酶、并因此与SEQ ID NO：1、3、5或7的去饱和酶序列不同的核苷酸序列的核酸分子。例如，可以根据Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6的核苷酸序列鉴定Schizochytrium或Crythecodinium的去饱和酶cDNA。
可以使用本文公开的cDNA或其部分作为杂交探针，依照标准杂交技术，在严格杂交条件下根据对应于本发明去饱和酶cDNA天然等位基因变异体和同系物的核酸分子与本文公开的去饱和酶核酸的同一性，分离所述变异体和同系物。
可以使用本领域内已知的方法(如在严格杂交条件下与本发明的分离的核酸分子杂交)，鉴定orhtologue、同系物和等位基因变异体。在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子至少长15、20、25、30或更多个核苷酸，并在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，所述核酸至少长50-100、100-250、250-500、500-700、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750或更多核苷酸。
本文所用术语“在严格条件下杂交”用于描述如下杂交和洗涤条件：在所述条件下相互之间显著相同或同源的核苷酸序列保持相互杂交。所述条件最好是这样的条件：在所述条件下，相互之间至少约70％相同、更优选至少约80％相同、甚至更优选至少约85％相同或90％相同的序列保持相互杂交。所述严格条件是本领域内技术人员已知的，可以在下面文献中找到：Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.(1995)，第2、4和6部分。其它严格条件可以在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，第7、9和11章中找到。严格杂交条件一个优选、非限制性的实施例包括在约65-70℃下在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交(或者在42-50℃下在4X SSC加50％甲酰胺中杂交)，然后在约65-70℃下在1X SSC中洗涤一次或多次。高度严格杂交条件一个优选非限制性的例子包括在约65-70℃下在1 X SSC中杂交(或者在42-50℃下在1 X SSC加50％甲酰胺中杂交)，然后在约65-70℃下在0.3X SSC中洗涤一次或多次。较低严格杂交条件一个优选非限制性的例子包括在约50-60℃下在4X SSC中杂交(或者在40-45℃下在6X SSC加50％甲酰胺中杂交)，然后在约50-60℃下在2X SSC中洗涤一次或多次。本发明也包括上述值的中间范围值(如在65-70℃或在42-50℃)。在杂交缓冲液和洗涤缓冲液中可以使用SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mMEDTA，pH 7.4)替代SSC(1X SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；完成杂交后每次洗涤进行15分钟。预期长度少于50个碱基对的杂交体的杂交温度应该比杂交体的熔解温度(Tm)低5-10℃，而Tm根据下面方程确定。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数量)+4(G+C碱基的数量)。对于长度在18到49个碱基对之间的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)一(600/N)，其中N是所述杂交体中碱基的数量，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1X SSC的[Na+]＝0.165M)。技术人员将理解：在杂交缓冲液和/或洗涤缓冲液中可以加入其它试剂，以降低核酸分子与膜(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)的非特异性结合，所述试剂包括但不限于封闭剂(如BSA或鲑鱼或鲱鱼精子载体DNA)、去污剂(如SDS)、鳌合剂(如EDTA)、Ficoll、PVP等。当使用尼龙膜时，特别地，严格杂交条件另一个优选非限制性的例子是在约65℃下在0.25-0.5MNaH2PO4，7％SDS中杂交，然后在65℃下在0.02M NaH2PO4，1％SDS中(见如Church和Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1991-1995)或0.2X SSC，1％SDS洗涤一次或多次。
在严格条件下与SEQ ID NO：1、3、5或7的序列杂交的本发明分离的核酸分子最好对应于天然存在核酸分子。本文所用的“天然出现的”核酸分子指具有天然出现的核苷酸序列(如编码天然蛋白)的RNA或DNA分子。
技术人员还将理解：除可能在群体中存在的所述去饱和酶序列的天然出现的等位基因变异体外，可以通过突变在SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列中引入变化，由此导致所编码的去饱和酶蛋白的氨基酸序列的变化，同时不改变所述去饱和酶蛋白的功能能力。例如，在SEQ ID NO：1、3、5或7的序列中可以制造导致在“非必需”氨基酸残基发生氨基酸取代的核苷酸置换。“非必需”氨基酸残基是Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6的野生型序列(如SEQ ID NO：2、5、8或11)可以变化但不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。例如，在本发明去饱和酶蛋白中保守的氨基酸残基(如在血红素结合基序或组氨酸基序中存在的那些氨基酸残基)预期将特别不能承受改变。此外，在本发明的去饱和酶蛋白和脂肪酸去饱和酶家族其它成员间保守的其它氨基酸残基不可能可以承受改变。
因此，本发明的另一方面涉及编码去饱和酶蛋白的核酸分子，所述去饱和酶蛋白对于活性并非必需的氨基酸残基中包含变化。所述去饱和酶蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6或8不同，但保持生物活性。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包括编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包括与SEQ ID NO：2、4、6或8(如SEQ IDNO：2、4、6或8的全长)有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
可以如下制造编码与SEQ ID NO：2、4、6或8的蛋白同源的去饱和酶蛋白的分离的核酸分子：在SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失，以便在所编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术将突变引入SEQ ID NO：1、3、5或7，所述标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变。最好在一个或多个预期非必需氨基酸残基上制造保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域内已经定义具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，最好用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代所述去饱和酶蛋白中预期非必需氨基酸残基。或者，在另一实施方案中，可以例如通过饱和诱变在去饱和酶编码序列的全部或部分内随机引入突变，然后可以筛选所得突变异体的去饱和酶活性，以鉴定保持活性的突变异体。对SEQ IDNO：1、3、5或7进行诱变后，可以重组表达所编码的蛋白，并测定所述蛋白的活性。
在一个优选实施方案中，可以测定突变去饱和酶蛋白的下列能力：(i)与去饱和酶底物或靶分子(如中间体脂肪酸)相互作用；和/或(ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子之间形成双键。
II.分离的去饱和酶蛋白
本发明的一方面涉及分离或重组的去饱和酶蛋白和多肽以及其生物活性部分。在一个实施方案中，可以使用标准蛋白纯化技术，通过合适的纯化方案从细胞或组织来源分离天然去饱和酶蛋白。在另一实施方案中，通过重组DNA技术产生去饱和酶蛋白。作为重组表达的替代方法，可以使用标准肽合成技术化学合成去饱和酶蛋白或多肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本不含来自获得所述去饱和酶蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白，或当使用化学合成时基本不含化学前体或其它化学试剂。语言“基本不含细胞物质”包括下述去饱和酶蛋白制品，其中所述蛋白与其由之分离或重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，语言“基本不含细胞物质”包括这样的去饱和酶蛋白制备物：所述去饱和酶蛋白制备物含有少于约80％、70％、60％、50％、40％或30％(干重)的非去饱和酶蛋白(本文也称为“污染蛋白”)、更优选少于约20％的非去饱和酶蛋白、更优选少于约10％的非去饱和酶蛋白、最优选少于约5％非去饱和酶蛋白。当重组产生所述去饱和酶蛋白或其生物活性部分时，它也最好基本不含培养基，即培养基占所述蛋白制备物量少于约20％、更优选少于约10％、最优选少于约5％。
语言“基本不含化学前体或其它化学试剂”包括这样的去饱和酶蛋白制备物：所述制备物中所述蛋白与涉及所述蛋白合成的化学前体或其它化学试剂分离。在一个实施方案中，语言“基本不含化学前体或其它化学试剂”包括这样的去饱和酶蛋白制备物：所述制备物具有少于约30％(干重)的化学前体或非去饱和酶化学试剂，更优选少于约20％化学前体或非去饱和酶化学试剂，甚至更优选少于约10％化学前体或非去饱和酶化学试剂，最优选少于约5％化学前体或非去饱和酶化学试剂。应当理解，本发明的蛋白也可以采取与它们对应天然蛋白不同的形式，和/或采取仍然与至少一些细胞成分结合的形式。例如，所述蛋白可以结合细胞膜。
本文所用的去饱和酶蛋白的“生物活性部分”包括去饱和酶蛋白的片段，所述片段参与去饱和酶分子和非去饱和酶分子(如去饱和酶底物如脂肪酸)间的相互作用。去饱和酶蛋白的生物活性部分包括这样的肽：所述肽包含与所述去饱和酶氨基酸序列足够同源或者来自所述去饱和酶氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸序列包括足够显示至少一种去饱和酶蛋白活性的氨基酸残基，所述去饱和酶氨基酸序列如在SEQ ID NO：2、4、6或8显示的氨基酸序列。一般地说，生物活性部分包括具有至少一种去饱和酶蛋白活性的结构域或基序；下面能力：(i)与去饱和酶底物或靶分子(如中间体脂肪酸)相互作用；和/或(ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子之间形成双键。去饱和酶蛋白的生物活性部分可以是多肽，所述多肽例如长10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或更多的氨基酸。
在一个实施方案中，去饱和酶蛋白的生物活性部分包含一个血红    素结合基序和/或至少一个组氨酸基序，最好约三个组氨酸基序。此外，可以通过重组技术制备其中缺失所述蛋白的其它区的生物活性部分，并评价所述生物活性部分的一种或多种天然去饱和酶蛋白功能活性。
在一个优选实施方案中，去饱和酶蛋白具有SEQ ID NO：2、4、6或8所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述去饱和酶蛋白与SEQID NO：2、4、6或8基本相同，并且保持SEQ ID NO：2、4、6或8的蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同，如上文小节I详细描述。在另一实施方案中，所述去饱和酶蛋白包含与SEQ ID NO：2、4、6或8至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供由一种核酸分子编码的去饱和酶蛋白，所述核酸分子包括与SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列或其互补物至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。本发明还提供由一种核苷酸分子编码的去饱和酶蛋白，所述核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列或其互补物的核酸分子的互补物杂交。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可以为最佳比较的目的排列所述序列(如，可以在第一个和第二个氨基酸序列或核酸序列的一个或两个中引入缺口以获得最佳排列，并且为比较目的可以不考虑不同源的序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的进行排列的参考序列的长度至少是所述参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、80或90％(如，当将第二个序列与具有519个氨基酸残基的SEQID NO：2的Fad4氨基酸序列进行排列时，排列至少156个氨基酸残基、优选至少208个氨基酸残基、更优选至少260个氨基酸残基、甚至更优选至少311个氨基酸残基、甚至更优选至少363、415或467个氨基酸残基；当将第二个序列与具有439个氨基酸残基的SEQ ID NO：4的Fad5氨基酸序列进行排列时，排列至少132个氨基酸残基、优选至少176个氨基酸残基、更优选至少220个氨基酸残基、甚至更优选至少263个氨基酸残基、甚至更优选至少307、351或395个氨基酸残基；当将第二个序列与具有456个氨基酸残基的SEQ ID NO：6的Fad5-2氨基酸序列进行排列时，排列至少137个氨基酸残基、优选至少182个氨基酸残基、更优选至少228个氨基酸残基、甚至更优选至少273个氨基酸残基、甚至更优选至少319、365或419个氨基酸残基；当将第二个序列与具有460个氨基酸残基的SEQ ID NO：8的Fad6氨基酸序列进行排列时，排列至少138个氨基酸残基、优选至少184个氨基酸残基、更优选至少230个氨基酸残基、甚至更优选至少276个氨基酸残基、甚至更优选至少322、368或414个氨基酸残基)。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的一个位置与第二个序列的对应位置同一氨基酸残基占据，则所述分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的函数，其中还要考虑为进行所述两个序列的最佳比较而引入的缺口数量以及每个缺口的长度。
可以使用数学算法完成两个序列间的序列比较以及确定同一性百分比。在一个优选实施方案中，两个氨基酸序列间的同一性百分比使用Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法确定，其中使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口加权16、14、12、10、8、6或4以及长度加权1、2、3、4、5或6，该算法已经加入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序。在又一优选实施方案中，使用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序确定两个核苷酸序列间的同一性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口加权40、50、60、70或80以及长度加权1、2、3、4、5或6。与GAP程序一起使用的参数的优选非限制性的例子包括：Blosum 62计分矩阵，缺口罚分12，缺口延长罚分4，移码缺口罚分5。
在另一实施方案中，使用Meyers和Miller算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))确定两个氨基酸序列或核苷酸序列间的同一性百分比，其中使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，该算法已经加入ALIGN程序(版本2.0或版本2.0U中)。
本发明的核酸序列和蛋白序列可以进一步用作“查询序列”，对公众数据库进行搜索以例如鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行所述搜索。可以使用NBLAST程序、分数＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的去饱和酶核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、分数＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的去饱和酶蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的带缺口的比较，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述使用缺口型BLAST。当使用BLAST和缺口型BLAST程序时，可以使用各个程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
III.生产不饱和脂肪酸的方法
本发明提供生产不饱和脂肪酸的新型改良方法，所述不饱和脂肪酸例如LCPUFA，如DHA(二十二碳六烯酸，22:6(n-6))、DPA(二十二碳五烯酸，22:5(n-6))、AA(花生四烯酸，20:4(n-6))和EPA(二十碳五烯酸，20:5(n-3))。
A.用于培养细胞的重组细胞和方法
本发明还提供包括核酸序列的重组载体，所述核酸序列编码如本文所述的基因产物，最好是Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6基因产物。术语重组载体包括这样的载体(如质粒)：所述载体已经受到改变、修饰或工程化，以便其包含与天然载体或质粒中包括的那些核酸序列相比更长、更短或不同的核酸序列。在一个实施方案中，重组载体包括有效连接调节序列的编码至少一种脂肪酸去饱和酶的核酸序列。短语“有效连接调节序列”指目标核苷酸序列以一定方式连接所述调节序列，所述方式允许表达所述核苷酸序列(如增强表达、增加表达、组成型表达、基础表达、减弱表达、降低表达或抑制表达)、最好表达由所述核苷酸序列编码的基因产物(如当将所述重组载体引入细胞时)。示例性的载体在本文中更详细地描述，并在例如Frascotti等，美国专利第5,721,137号中有描述，该文献的内容通过引用结合到本文中。
术语“调节序列”包括影响(如调整或调节)其它(非调节)核酸序列表达的核酸序列。在一个实施方案中，重组载体内调节序列相对于特定目的基因的位置和/或取向与所述调节序列和所述目的基因的天然状态(如天然位置和/或取向)相似或相同。例如，在重组载体中目的基因(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因)可以有效连接调节序列，所述调节序列在天然生物中伴随或邻接所述基因(如有效连接“天然”Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6调节序列(如有效连接“天然”Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6启动子))。或者，在重组载体中目的基因(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因)可以有效连接调节序列，所述调节序列在天然生物中伴随或邻接另一个(如不同的)基因。例如，在载体中可以包括有效连接非Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6调节序列的Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因。或者，在载体中目的基因(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因)可以有效连接来自另一种生物的调节序列。例如来自其它微生物的调节序列(如其它细菌调节序列、噬菌体调节序列等)可以有效连接特定目的基因。
优选的调节序列包括启动子、增强子、终止信号和其它表达控制元件(如转录的mRNA中转录和/或翻译调节蛋白的结合位点)。所述调节序列在例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中有介绍。调节序列包括那些指导细胞内核苷酸序列组成型表达的序列(如组成型启动子和强组成型启动子)、那些指导细胞内核苷酸序列诱导型表达的序列(例如诱导型启动子如木糖诱导型启动子)以及那些减弱和抑制细胞内核苷酸表达的序列(如减弱信号或阻遏序列)。本发明还包括通过缺失调节序列而调节目的基因的表达。例如，可以去除涉及转录负调节的序列，以便增强目的基因的表达。
在一个实施方案中，本发明的重组载体包括编码至少一种基因产物(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)的有效连接启动子或启动子序列的核酸序列。
在又一实施方案中，本发明的重组载体包括一个终止子序列或多个终止子序列(如转录终止序列)。术语“终止子序列”包括用于终止mRNA转录的调节序列。终止子序列(或串联转录终止子)还可用于使mRNA稳定(如通过在mRNA中添加结构)，例如抵抗核酸酶。
在再一实施方案中，本发明的重组载体包括抗生素抗性序列。术语“抗生素抗性序列”包括促进宿主生物的抗生素抗性或赋予宿主生物抗生素抗性的序列。在一个实施方案中，所述抗生素抗性选自以下：cat(氯霉素抗性)序列、tet(四环素抗性)序列、erm(红霉素抗性)序列、neo(新霉素抗性)序列和spec(壮观霉素抗性)序列。本发明的重组载体还可以包括同源重组序列(例如设计用于将目的基因重组进宿主生物染色体的序列)。例如，amyE序列可以用作重组进宿主染色体的同源性靶。
术语“操作的细胞”包括已经受到工程化(如遗传工程化)或修饰的细胞，以便所述细胞具有至少一种脂肪酸去饱和酶(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)以生产不饱和脂肪酸。可以根据本文描述的任何方法进行所述微生物的修饰或工程化，所述方法包括但不限于去调节生物合成途径和/或过量表达至少一种生物合成酶。“操作的”酶(如“操作的”生物合成酶)包括这样的酶：所述酶的表达或生产已经受到改变或修饰，以便与对应野生型或天然酶相比，所述酶的至少一种上游或下游前体、底物或产物已经受到改变或修饰。
术语“过量表达的”或“过量表达”包括以一定水平表达基因产物(如脂肪酸去饱和酶)，所述水平高于操作所述细胞前或未受到操作的对比细胞中的表达水平。在一个实施方案中，可以遗传操作(如遗传工程化)所述细胞，以一定水平过量表达基因产物，该水平高于操作所述细胞前或未受到操作的对比细胞中的表达水平。遗传操作可以包括但不限于：改变或修饰与特定基因的表达有关的调节序列或位点(如通过添加强启动子、诱导型启动子或多启动子，或通过去除调节序列以便使表达成为组成型表达)、修饰特定基因的染色体位置、改变邻接特定基因的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止序列、增加特定基因的拷贝数、修饰涉及特定基因的转录和/或翻译特定基因产物的蛋白(如调节蛋白、抑制物、增强物、转录激活物等)、或本领域内常规的去调节特定基因表达的任何其它常规方法(包括但不限于使用反义核酸分子例如以阻断阻遏蛋白的表达)。
在另一实施方案中，可以通过物理操作或环境操作使所述细胞过量表达基因产物，所述基因产物的表达水平高于操作所述细胞前或未受到操作的对比细胞中的表达水平。例如，可以用已知或怀疑增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的试剂处理细胞，或在所述试剂存在下培养所述细胞，以便增强或增加转录和/或翻译。或者，可以在选定的增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的温度下培养细胞，以便增强或增加转录和/或翻译。
术语“去调节的”或“去调节”包括改变或修饰细胞内编码生物合成途径酶的至少一种基因，以便改变或改进细胞内所述生物合成酶的水平或活性。最好改变或修饰编码生物合成途径酶的至少一种基因，以便增强或增加所述基因产物。词组“去调节的途径”也包括这样的生物合成途径：其中已经改变或修饰编码生物合成途径酶的至少一种基因，以便改变或修饰多于一种生物合成酶的水平或活性。在细胞中“去调节”一个途径的能力(如刺激性去调节给定生物合成途径中的多于一种基因)来自于细胞内的特定现象，其中超过一种酶(如两种或三种生物合成酶)是由连续遗传材料上相互邻接存在的基因(称为“操纵子”)编码。
术语“操纵子”包括基因表达的协同单位，该协同单位包含一个启动子，可能有与一个或多个、最好至少两个结构基因(如编码酶如生物合成酶的基因)连接的调节元件。所述结构基因的表达可以受到协同调节，例如受到结合所述调节元件的调节蛋白的调节或受到转录的反终止的调节。可以转录所述结构基因，获得编码所有结构蛋白的单一mRNA。由于包括在一个操纵子内的基因的协同调节，对单个启动子和/或调节元件的改变或修饰可导致所述操纵子编码的每个基因产物的改变或修饰。对所述调节元件的改变或修饰可包括但不限于：去除内源启动子和/或调节元件、添加强启动子、诱导型启动子或多启动子、或去除调节序列，使得改变所述基因产物的表达、改变所述操纵子的染色体位置、改变与所述操纵子邻接或在所述操纵子内的核酸序列如核糖体结合位点、增加所述操纵子的拷贝数、修饰涉及所述操纵子的转录和/或所述操纵子的基因产物的翻译的蛋白(如调节蛋白、抑制物、增强物、转录激活物等)、或本领域内常规的去调节基因表达的任何其它常规方法(包括但不限于使用反义核酸分子例如以阻断阻遏蛋白的表达)。去调节还可涉及改变一个或多个基因的编码区，以产生例如抗反馈或具有更高或更低比活的酶。
本发明尤其优选的“重组的”细胞已经受到遗传工程化，以过量表达来自植物的基因或基因产物或来自微生物的基因或基因产物。术语“来自植物的”、“来自微生物的”或“来自”，例如，包括在微生物或植物(如油籽植物)中天然存在的基因、或由植物基因或来自微生物的基因(如编码的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7)编码的基因产物(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)。
本发明的方法提供过量表达至少一种脂肪酸去饱和酶的重组细胞。在一个实施方案中，本发明的重组细胞已经受到遗传工程化，过量表达破囊壶菌属菌脂肪酸去饱和酶(如已经受到工程化以过量表达至少一种破囊壶菌属菌Δ4或Δ5去饱和酶(Fad4或Fad5基因产物)(如具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1或3的核酸序列编码的脂肪酸去饱和酶)。
在另一实施方案中，本发明的重组细胞已经受到遗传工程化，过量表达畸雌腐霉Δ5或Δ6去饱和酶(Fad5-2或Fad6基因产物)(如具有SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列或由具有SEQ ID NO：5或7的核酸序列的核酸分子编码的脂肪酸去饱和酶)。
在另一实施方案中，本发明提供已经用一种载体转化的细胞(如微生物细胞)，所述载体包含一种脂肪酸去饱和酶核酸序列(如在SEQID NO：1、3、5或7中陈述的脂肪酸去饱和酶核酸序列)。
本发明的另一方面提供调整脂肪酸生产的方法，所述方法包括培养用本发明的核酸分子(如去饱和酶)转化的细胞，以便调节脂肪酸生产(如增强不饱和脂肪酸的生产)。所述培养用本发明核酸分子(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)转化的细胞以调整脂肪酸生产的方法在本文中称为“生物转化”。所述生物转化过程可以利用本文描述的重组细胞和/或去饱和酶。术语“生物转化过程”在本文中也称为“生物转换过程”，包括脂肪酸去饱和酶上游的任何化合物(如底物、中间体或产物)产生(如转化或转换)为在脂肪酸去饱和酶下游的化合物(如底物、中间体或产物)的生物过程，所述下游化合物尤其是不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，本发明提供产生不饱和脂肪酸的生物转化过程，所述过程包括使过量表达至少一种脂肪酸去饱和酶的细胞与至少一种合适底物在一定条件下接触，以便生产一种不饱和脂肪酸，并可选地回收所述脂肪酸。在一个优选实施方案中，本发明提供生产不饱和脂肪酸的生物转化过程，所述过程包括使过量表达Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6的细胞与一种合适底物(如一种中间体脂肪酸)在一定条件下接触，以便生产一种不饱和脂肪酸(如DHA、SDA或GLA)，并可选地回收所述不饱和脂肪酸。其中生产不饱和脂肪酸的条件可以包括任何导致所需的不饱和脂肪酸生产的条件。
在所述生物转化反应中使用的细胞和/或酶采取允许它们行使预定功能(如生产所需脂肪酸)的形式。所述细胞可以是整个细胞，或者可以仅是获得所需最终结果所需的细胞部分。所述细胞可以是悬浮的(例如在合适的溶液例如缓冲液或培养基中)、受到洗涤(如洗涤以不含培养所述细胞的培养基)、用丙酮干燥、固定化(例如用聚丙烯酰胺凝胶或k-角叉藻聚糖固定化，或在合成支持物如珠、基质等上固定化)、固定、交联或接受透化处理(如已经透化膜和/或壁以便化合物例如底物、中间体或产物可以更容易地穿过所述膜或壁)。所述细胞类型可以是能够在本发明的方法内使用的任何细胞，如植物细胞、动物细胞或微生物细胞。
本发明的一个重要方面涉及培养本文所述的重组植物或培养本文所述的重组微生物，以便生产所需化合物(如所需的不饱和脂肪酸)。术语“培养”包括维持和/或培养本发明的活微生物(如维持和/或培养一种培养物或菌株)。在一个实施方案中，在液体培养基中培养本发明的微生物。在另一实施方案中，在固体或半固体培养基中培养本发明的微生物。在一个优选实施方案中，在培养基(如无菌液体培养基)中培养本发明的微生物，所述培养基包含对维持和/或培养所述微生物必需或有利的营养物(如碳源或碳底物，如复合糖如豆类粗粉或谷粉、淀粉、糖、糖醇、碳氢化合物、油、脂肪、脂肪酸、有机酸和醇；氮源，例如从谷物、大豆和块茎作用获得的植物蛋白、蛋白胨、肽和氨基酸、从动物来源如肉、奶和动物副产品(如蛋白胨、肉提取物和酪蛋白水解物)获得的蛋白、肽和氨基酸；无机氮源如尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源如磷酸、磷酸钠和磷酸钾；微量元素如镁、铁、锰、钙、铜、锌、硼、钼和/或钴盐；以及生长因子如氨基酸、维生素、促生长剂等)。
本发明的微生物最好在受控的pH下培养。术语“受控的pH”包括任何导致生产所需产物(如不饱和脂肪酸)的pH。在一个实施方案中，在约为7的pH下培养微生物。在另一个实施方案中，在6.0到8.5之间的pH培养微生物。可以通过本领域内技术人员已知的任何方法维持所需pH。
此外，最好在受控的通气下培养本发明的微生物。术语“受控的通气”包括导致生产所需产物(如不饱和脂肪酸)的足够通气(如氧气)。在一个实施方案中，通过调节培养物中的氧水平控制通气，例如通过调节培养基中的溶氧量。最好通过搅拌所述培养物来控制所述培养物的通气。可以用以下方法搅拌：通过螺旋桨或类似的机械搅拌设备、通过旋转或振荡培养容器(如发酵罐)或通过各种泵送设备。还可以通过在培养基中通过无菌空气或氧(例如通过发酵混合物)而控制通气。此外，最好在不产生过多泡沫的情况下培养本发明的微生物(例如通过加入消泡剂)。
此外，可以在受控的温度下培养本发明的微生物。术语“受控的温度”包括任何导致生产所需产物(如不饱和脂肪酸)的温度。在一个实施方案中，受控的温度包括15℃到95℃之间的温度。在另一个实施方案中，受控的温度包括15℃到70℃之间的温度。优选的温度在20℃到55℃之间、更优选30℃到45℃之间或30℃到50℃之间。
可以在液体培养基中培养(如维持和/或培养)微生物，最好通过常规培养方法连续培养或间歇培养，所述常规培养方法例如静置培养(standing culture)、试管培养、振荡培养(如旋转振荡培养、摇瓶培养等)、通气旋动培养或发酵。在一个优选实施方案中，在摇瓶中培养所述微生物。在一个更优选的实施方案中，在发酵罐中培养所述微生物(如一个发酵过程)。本发明的发酵过程包括但不限于分批发酵方法、补料分批发酵方法和连续发酵方法。短语“分批工艺”或“分批发酵”指这样的封闭系统：该系统中培养基组成、营养物、添加剂等在发酵开始时就已设定，并且发酵过程中不改变，然而，可以尝试控制例如pH和氧浓度等因子，以防止培养基过度酸化和/或微生物死亡。短语“补料分批培养”或“补料分批”发酵指一种分批发酵，只是随着发酵的进行而加入一种或多种底物或添加剂(如增量加入或连续加入)。短语“连续工艺”或“连续发酵”指这样的系统：在发酵罐中连续加入定量发酵培养基，同时取出等量使用过或“条件化”培养基，最好所取出的培养基用于回收所需产物(如不饱和脂肪酸)。已经发展多种所述方法，并且所述方法是本领域内众所周知的。
短语“在一定条件下培养以便生产所需化合物(如不饱和脂肪酸如DHA)”包括在适于或足以生产所需化合物或达到所生产的特定化合物的所需产量的条件(如温度、压力、pH、时间等)下，维持和/或培养植物或微生物。例如，在足以生产所需量的不饱和脂肪酸(如DHA)的时间内持续培养。培养最好持续足以充分达到所述不饱和脂肪酸最大产量的时间。在一个实施方案中，培养持续约12到24小时。在另一实施方案中，培养持续24到36小时、36到48小时、48到72小时、72到96小时、96到120小时、120到144小时或超过144小时。在另一实施方案中，培养持续足以达到不饱和脂肪酸产量的时间，例如，培养细胞以便生产至少约15到20g/L不饱和脂肪酸、生产至少约20到25g/L不饱和脂肪酸、生产至少约25到30g/L不饱和脂肪酸、生产至少约30到35g/L不饱和脂肪酸、生产至少约35到40g/L不饱和脂肪酸(如至少约37g/L不饱和脂肪酸)或生产至少约40到50g/L不饱和脂肪酸。在又一实施方案中，在一定条件下培养微生物，以便在约24小时内、约36小时内、约48小时内、约72小时内或约96小时内生产优选产量的不饱和脂肪酸，所述产量例如上文陈述范围内的产量。
在生产不饱和脂肪酸时，可能还希望在添加的脂肪酸生物合成底物的存在下培养本发明的细胞。术语“添加的脂肪酸生物合成底物”包括这样的试剂或化合物：当将所述试剂或化合物与细胞接触或包括在细胞的培养基后，它增强或增加不饱和脂肪酸的生物合成。本发明的添加的脂肪酸生物合成底物可以采用浓缩溶液或悬浮液的形式(如在合适的溶剂如水或缓冲液中)或以固体形式添加(如用粉末的形式)。此外，本发明的添加的脂肪酸生物合成底物可以作为单一等分量添加、连续添加或在给定时间内间歇添加。
本发明的方法还可以包括回收所需化合物(如不饱和脂肪酸)的步骤。术语“回收”所需化合物包括从培养基中提取、收获、分离或纯化所述化合物。可以根据本领域内已知的任何常规分离或纯化方法回收所述化合物，所述常规分离和纯化方法包括但不限于：用常规树脂(如阴离子交换树脂或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等)处理、用常规吸附剂(如活性碳、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等)处理、改变pH、溶剂萃取(如用常规溶剂如乙醇、乙酸乙酯、己烷等)、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、调节pH、冻干等。例如，可以如下从培养基回收化合物：首先从所述培养物中除去微生物。然后使培养基通过或流过一种阳离子交换树脂，除去不希望有的阳离子，然后通过或流过一种阴离子交换树脂，除去不希望有的无机阴离子和比目的不饱和脂肪酸(如DHA)有更强酸性的有机酸。
本发明所需的化合物最好是“提取的”、“分离的”或“纯化的”，以便所得的制备物基本不含其它成分(如不含培养基成分和/或发酵副产物)。语言“基本不含其它成分”包括这样的所需化合物制备物：在所述制备物中所述化合物与生产它的培养物中的培养基成分或发酵副产物分离(如纯化或部分纯化)。在一个实施方案中，所述制备物含超过约80％(干重)所需化合物(如少于约20％其它培养基成分或发酵副产物)、更优选超过约90％所需化合物(如少于约10％其它培养基成分或发酵副产物)、甚至更优选超过约95％所需化合物(如少于约5％其它培养基成分或发酵副产物)、最优选超过约98-99％所需化合物(如少于约1-2％其它培养基成分或发酵副产物)。当所需化合物是一种已经衍生成盐的不饱和脂肪酸时，所述化合物最好还不含(如基本不含)与形成所述盐有关的化学污染物。当所需化合物是一种已经衍生成醇的不饱和脂肪酸时，所述化合物最好还不含(如基本不含)与形成所述醇有关的化学污染物。
在另一可替代的方案中，所需不饱和脂肪酸不从植物或微生物中纯化，例如当所述植物或微生物是生物学上无害的(如安全的)。例如，可以使用整个植物或培养物(或培养物上清)作为产物来源(如粗产物)。在一个实施方案中，不加改变地使用所述植物或培养物(或培养物上清)。在另一实施方案中，浓缩所述植物或培养物(或培养物上清)。在又一实施方案中，磨碎、干燥或冻干所述植物或培养物(或培养物上清)。
B.高产量生产方法
本发明一个特别优选的实施方案是生产不饱和脂肪酸(如DHA)的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便以显著高产量生产不饱和脂肪酸。短语“高产量生产方法”，例如，用于生产所需化合物的高产量生产方法(如用于生产不饱和脂肪酸)包括导致以一定水平生产所需化合物的方法，该水平比类似生产方法通常获得的水平提高或升高。高产量生产方法最好导致以显著高产量生产所需化合物。短语“显著高产量”包括比类似生产方法通常获得的水平足够提高或升高的生产或产量水平，例如所述水平提高到足以商业化生产所需化合物的水平(如以在商业上可行的成本生产所述产物)。在一个实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便以高于2g/L的水平生产不饱和脂肪酸。在另一实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便以高于10g/L的水平生产不饱和脂肪酸。在另一实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便以高于20g/L的水平生产不饱和脂肪酸。在又一实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便以高于30g/L的水平生产不饱和脂肪酸。在再一实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便以高于40g/L的水平生产不饱和脂肪酸。
本发明还提供生产所需化合物的高产量生产方法(如用于生产一种不饱和脂肪酸)，该方法涉及在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便在商业化所需的时间内生产足够提高的水平的化合物。在一个示例性的实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便在36小时内以高于15-20g/L的水平生产一种不饱和脂肪酸。在另一的实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便在48小时内以高于25-30g/L的水平生产一种不饱和脂肪酸。在另一实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便在72小时内以高于15-20g/L的水平(如在72小时内以高于37g/L的水平)生产一种不饱和脂肪酸。在另一实施方案中，本发明提供一种生产不饱和脂肪酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养受到操作的植物或微生物，以便在60小时内以高于30-40g/L的水平(如在60小时内以高于30、35或40g/L的水平)生产一种不饱和脂肪酸。在本文陈述的范围内所包括的值和范围和/或中间值也在本发明的范围内。例如，在60小时内以至少31、32、33、34、35、36、37、38和39g/L的水平生产不饱和脂肪酸将包括在60小时内30-40g/L的范围内。另一实例是，30-35g/L或35-40g/L将包括在60小时内30-40g/L的范围内。此外，技术人员将理解：培养受到操作的微生物以达到例如“60小时内30-40g/L”的生产水平包括培养所述微生物达到更长的时间(例如长于60小时的时间)，这可选地导致所生产的不饱和脂肪酸的甚至更高的产量。
IV.组合物
本发明的去饱和酶核酸分子、蛋白和其片段可以用于生产可加入组合物的不饱和脂肪酸。本发明的组合物包括例如用作动物饲料的组合物、用作保健品(如食品添加剂)的组合物以及适于给药的药用组合物。
所述药用组合物一般包含不饱和脂肪酸和药学上可接受的载体。本文所用语言“药学上可接受的载体”包括与药物给药方法匹配的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药用活性物质的所述介质和试剂的使用是本领域内众所周知的。除任何常规介质或试剂与所述活性化合物不可配伍的情况外，设想所述介质在所述组合物中的应用。所述组合物中也可以加入附加的活性化合物。
本发明的药用组合物配制成与其既定给药途径的匹配形式。给药途径的例子包括胃肠外给药，如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、口服给药(如吸入)、经皮给药(局部给药)、经粘膜给药和直肠给药。用于胃肠外应用、经粘膜应用和皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下面成分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；鳌合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。所述胃肠外制备物可以封装在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多剂量小管内。
适于注射应用的药用组合物包括无菌水溶液(当水溶时)或分散体，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。为静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、制菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的，并且应该足够液体化以便容易注射。它应该在生产和贮存条件下稳定，并且在对抗微生物如细菌和真菌污染作用的情况下保存。所述载体可以是一种溶剂或分散体介质，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们合适的混合物。可以使用如下方法维持合适的流动性：例如，通过应用一种涂层如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂预防微生物的作用，所述抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在所述组合物中优选包括等渗剂如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。可以通过在所述组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，实现所述可注射组合物的延长吸收。
可以如下制备无菌可注射溶液：在一种合适的溶剂中以所需量加入所述活性化合物(如由本发明的核酸分子和蛋白分子产生的LCPUFA或其片段)，并根据需要加入一种上文列举成分或其组合，随后过滤除菌。一般地说，如下制备分散体：将所述活性化合物加入无菌媒介物，该媒介物含有一种基础分散介质和所需要上文列举的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冻干，该方法产生粉末，所述粉末包含所述活性成分和事先无菌过滤的溶液的任何附加的所需成分。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以封装在明胶胶囊内或压缩成片剂。为口服治疗给药的目的，所述活性化合物可以与赋形剂混合，并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。也可以用液体载体制备口服组合物以用作漱口药，其中所述液体载体中的所述化合物口服应用并哗哗漱口，然后吐出或吞下。可以包括药学上可配伍的粘合剂和/或辅助材料作为所述组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含下面成分中的任何一种或相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或风味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙风味剂(orange flavoring)。
为通过吸入给予，可以用压力容器或分配器(dispenser)提供的气溶胶喷雾形式传递所述化合物，所述压力容器或分配器包含合适的推进剂如一种气体(如二氧化碳)或一种雾化剂。
也可以通过经粘膜或经皮方式进行系统性给药。为进行经粘膜或经皮给药，在所述制剂中使用适用于所要穿透的屏障的渗透剂。所述渗透剂是本领域内众所周知的，用于经粘膜给药时包括例如去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可以通过应用鼻喷雾剂或栓剂实现经粘膜给药。为进行经皮给药，将所述活性化合物配制成本领域内众所周知的软膏剂、油膏、凝胶或乳油。
所述化合物也可以配制成栓剂(如使用常规栓剂基质如可可油和其它甘油酯)或保留灌肠剂以进行直肠给药。
在一个实施方案中，所述活性化合物用保护所述化合物对抗机体快速清除的载体制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化传递系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述制剂的方法对于本领域内的技术人员将是明显的。所述材料也可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商业性获得。脂质体悬浮液(包括靶向感染细胞的脂质体，所述脂质体携带针对病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作药学上可接受的载体。可以根据本领域内技术人员已知的方法制备它们，如美国专利第4,522,811号所述。
为了便利于给药和剂量均匀性，特别优选配制成剂量单位形式的口服或胃肠外组合物。本文所用的剂量单位形式指适合给予治疗对象的单位剂量的物理上分离的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算所述量化合物结合所需药学载体一起产生所需治疗效应。本发明所述剂量单位形式的规格由下面因素决定并直接取决于下面因素：所述活性化合物的独特特性和需要达到的特定治疗效果，以及配制领域内固有的限制例如用于治疗个体的活性化合物。
可以通过在细胞培养物或试验动物中的标准药学程序确定所述化合物的毒性和治疗功效，例如确定LD50(使50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体有效治疗的剂量)。毒性效应和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50。优选较大治疗指数的化合物。虽然可以使用表现毒性副作用的化合物，但应当注意设计一种将所述化合物靶向受累组织位点的传递系统，以最小化对未感染细胞的可能损害，由此降低副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定在人体应用的剂量范围。所述化合物的剂量最好在下面循环浓度范围内：该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。根据所使用的剂型和所利用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。对于在本发明方法中使用的任何化合物，开始可以根据细胞培养测定估计治疗有效剂量。在动物模型中制定一个剂量，以达到包括细胞培养所测定的IC50(即达到对症状最大抑制的一半的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用所述信息更精确地确定在人体内的有效剂量。可以通过例如高效液相色谱测定血浆中的水平。
本文所定义的蛋白或多肽的治疗有效量(即有效剂量)范围从约0.001到30mg/kg体重，优选约0.01到25mg/kg体重，更优选约0.1到20mg/kg体重，甚至更优选约1到10mg/kg体重、2到9mg/kg、3到8mg/kg、4到7mg/kg或5到6mg/kg体重。技术人员将认识到：某些因素可以影响有效治疗患者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重性、以前的治疗、总体健康状况和/或对象的年龄以及同时存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的蛋白、多肽或抗体对患者的治疗可以包括单一治疗，或者最好可包括一系列治疗。
在一个优选实施例中，用约0.1到20mg/kg体重范围内的LCPUFA治疗患者，每周一次治疗，连续约1到10周，优选2到8周，更优选约3到7周，甚至更优选约4、5或6周。人们也将理解：用于治疗的抗体、蛋白或多肽有效剂量可以在特定治疗的疗程中升高或降低。剂量上的变化可能源于如本文所述诊断测定的结果，并由所述结果而变得明显。
所述药用组合物可以包装在容器、包装器材或分配器内，同时附有使用说明。
本发明将通过下面的实施例进一步举例说明，不应当认为下面的实施例是限制性的。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图通过引用结合到本文中。
实施例
材料：破囊壶菌属菌ATCC 21685和畸雌腐霉购子美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852USA)，在24℃下在培养基(Weete，JD.等(1997)Lipids 32：839-845)中培养7天。然后通过离心收获生物量，用于RNA分离。
实施例1：构建和筛选cDNA文库
根据Qiu和Erickson(Qiu，X.和Eriekson，L.(1994)Plant Mol.Biol.Repr.12：209-214)所述，从上述材料分离总RNA。从所述总RNA构建cDNA文库。使用得自Gibco-BRL的上标II反转录酶合成第一条cDNA链。用Stratagene的DNA聚合酶I合成第二条cDNA链。经大小分级分离后，将大于1kb的cDNA插入片段连接进λUni-Zap XR载体(Stratagene)。然后将所述重组～DNA用Gigapack III Gold包装提取物包装，随后接种在NZY平板上。得到的文库代表超过5x106个独立集落。根据标准方法(Sambrook，J，Fritseh，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning-A laboratory manual.(Cold Spring Harbor，NewYork，USA))进行所述cDNA文库的筛选。
实施例2：RT-PCR
使用上标II反转录酶(Gibco-BRL)从总RNA合成单链cDNA，然后用作模板，与两个简并引物(正向引物：GCXCA/GAXGAXCAC/TCCXGGXGG和反向引物：ATXTG/TXGGA/GAAXAG/AG/ATGG/ATG)进行PCR反应。所述PCR扩增包括35个循环，每个循环在94℃下1分钟、在55℃下1.5分钟、在72℃下2分钟，然后在72℃下延伸10分钟。从琼脂糖凝胶上分离从800bp到1000bp的扩增产物，用试剂盒(Qiaex II凝胶纯化，Qiagen)纯化，然后克隆进TA克隆载体
Figure G2009102098253D00441
2.1(Invitrogen)。然后通过PEISMDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing System(Perkin Elmer/AppliedBiosystems)测序克隆的插入片段。
实施例3：在酵母中表达Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6
使用Precision Plus酶(Stratagene)通过PCR扩增Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6的可读框，然后克隆进TA克隆载体(
Figure G2009102098253D00442
2.1，Invitrogen)。通过测序确认所述PCR产物与原始cDNA相同后，通过BarnHI-EcoRI双消化释放所述片段，并插入酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，置于诱导型启动子GAL1的控制之下。
使用乙酸锂方法，用所述表达构建物转化酵母菌株InvSc2(Invitrogen)，在缺乏尿嘧啶的基本培养基上筛选转化子(Gietz，D.等(1992)Nucleic Acids Res.20：1425；Covello，P.S.和Reed，D.W.(1996)Plant Physiol.111：223-226)。
转化子首先在28℃下在缺乏尿嘧啶、含葡萄糖的基本培养基上培养。过夜培养后，离心沉淀细胞，洗涤并重悬浮于蒸馏水中。用所述酵母转化子细胞悬浮液接种基本培养基并在20℃下培养三天，然后在15℃下培养三天，所述基本培养基含2％半乳糖、0.1％表面活性剂、含或不含0.3mM底物脂肪酸。
实施例4：脂肪酸分析
收获破囊壶菌、畸雌腐霉和酵母细胞，用蒸馏水洗涤两次。在所述材料中加入2mL甲醇化KOH(在95％甲醇中7.5％w/v KOH)，将封装在12ml玻璃培养管内的混合物在80℃加热2小时。加入0.5mL水，所述样品用2mL己烷萃取两次，除去非皂化的脂类。加入1mL6N HCl，酸化剩余的水相，并用2mL己烷萃取两次。合并己烷相，在氮气流下干燥。加入2mL 3N甲醇化HCl(SUPELCO，Supelco Park，Bellefonte，PA 16823-0048)，所述混合物在80℃加热2小时。冷却到室温后，加入1mL 0.9％NaCl，用2x 2mL己烷萃取所述混合物两次。在氮气下蒸发合并的己烷。根据Covello&Reed(Covello，P.S.和Reed，D.W.(1996)Plant Physiol.111：223-226)，通过GC和GC-MS分析所得的脂肪酸甲基酯(FAME)。
使用偶联GC 8000系列气相色谱的在Masslynx版本2.0软件控制下的Fisons VG TRIO 2000质谱仪(VG Analytical，UK)，在标准EI模式下进行GC/MS分析。使用DB-23柱(30Mx0.25mm内径，0.25Ilm膜厚度，J&W Scientific，Folsom，CA)进行FAME分析，该柱的温度程序设置为180℃下1小时，然后以4℃/分钟加热到240℃，在该温度下保持15分钟。
实施例5：转化芥菜和亚麻(Linum usitatissimum)以及外源脂肪酸处理
使用芥菜和亚麻的5-6天幼苗的下胚轴作为外植体，在上面接种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，所述根癌农杆菌携带双载体，该双载体包含在不同启动子控制下的所述全长cDNA。使用20天的转基因幼苗进行外源脂肪酸处理。将所述幼苗分为三部分：叶、茎和根。每一部分切成小块，置于24孔滴定板上。在所有孔中加入2mL 0.05％底物的钠盐(NuCheck Prep Inc.，Elysian，MN)。在温和搅拌下，将所述板在24℃下温育4小时。温育后，用水洗涤所述植物组织三次，然后用于脂肪酸分析。
实施例6：破囊壶菌属菌的脂肪酸分布
由于破囊壶菌和畸雌腐霉生产LCPUFA如DHA、AA、EPA和DPA的能力，它们最近吸引科学界的注意。图23和24分别显示从破囊壶菌和畸雌腐霉的7天培养物分离的脂类的脂肪酸组成。如表中所示，所述微生物含有广泛范围的多不饱和脂肪酸，包括n-3和n-6家族，从18碳A6脂肪酸(γ-亚麻酸和steardonic acid)到22碳Δ4脂肪酸(DHA和DPA)。所述生物(尤其是破囊壶菌属菌)看起来包含DHA和DPA生物合成所需的全套去饱和酶和延长酶。该株缺乏24碳多不饱和脂肪酸，即Precher途径中DHA和DPA合成假定的前体(Voss，A.等(1991)J.Biol.Chem.266：19995-20000；Mohammed，B.S.等(1997)Biochem.J.326：425-430)。在破囊壶菌属菌中所述24碳脂肪酸可能不涉及22碳Δ4脂肪酸如DHA和DPA的体内合成。
实施例7：鉴定编码“前端”去饱和酶的cDNA
为鉴定涉及破囊壶菌属菌和畸雌腐霉内LCPUFA生物合成的去饱和酶的编码基因，应用一种基于PCR的克隆策略。设计两种简并引物，分别靶向前端去饱和酶内cyt b5样结构域N端延伸部分的血红素结合基序以及所有微粒体去饱和酶内的第三个保守组氨酸基序。这种设计的合理性在于：在破囊壶菌属菌和畸雌腐霉内涉及EPA和DHA生物合成的去饱和酶应该与其它前端去饱和酶具有类似的主要结构，即去饱和酶中cyt b5样结构域的N端延伸部分。鉴定四个cDNA片段来自破囊壶菌属菌和畸雌腐霉，它们编码在N末端包含cyt b5样结构域的融合蛋白。
为分离全长cDNA克隆，将所述四个插入片段用作探针，筛选破囊壶菌属菌和畸雌腐霉的cDNA文库，导致在每一组中鉴定几个cDNA克隆。测序所有那些克隆鉴定为四个全长cDNA的克隆，将它们命名为Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6。Fad4的可读框长1560bp，编码分子量为59.1kDa的519个氨基酸(图1)。Fad5长1230bp，编码分子量为49.8kDa的439个氨基酸(图2)。对这两个来自破囊壶菌属菌钟的序列的序列比较显示：在推导的蛋白之间仅有16％的氨基酸同一性。更详细的分析揭示：Fad4比Fad5长80个氨基酸，这80个氨基酸出现在第二个和第三个保守组氨酸基序之间(图3)。来自畸雌腐霉的Fad5-2的可读框长1371bp，编码456个氨基酸(图4)。来自畸雌腐霉的Fad6的可读框长1383bp，编码460个氨基酸(图5)。对这两个来自畸雌腐霉的序列的序列比较显示：在推导的蛋白之间有超过39％相似性(图6)。
BLASTPTM对蛋白数据库的搜索揭示所述四种蛋白Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6每一种的下面匹配数(hits)：
Fad4(519个氨基酸残基)
Blastp nr
  保藏号   生物   描述   长度   ％同一性
  AF067654   高山被孢霉  (Mortierella alpina)  Δ5脂肪酸去饱和酶   509   29
  AF054824   高山被孢霉  Δ5微粒体去饱和酶   509   28
  AB022097   盘基网柄菌  (Dictyostelium  discoideum)  Δ5脂肪酸去饱和酶   507   27
  AB029311   盘基网柄菌  脂肪酸去饱和酶   519   26
[0192]
  L11421  D90914   集胞藻属  (Synechocystis sp.)  Δ6去饱和酶   410   25
Fad5(439个氨基酸残基)
Blastp nr
  保藏号   生物   描述   长度   ％同一性
  AF139720   纤细裸藻(Euglena  gracilis)  Δ8脂肪酸去饱和酶   404   29
  AF007561   琉璃苣(Borago  officinalis)  Δ6去饱和酶   421   27
  U79010   琉璃苣  Δ6去饱和酶   421   27
  AF309556   Danio rerio  Δ6脂肪酸去饱和酶   422   26
  AF110510   高山被孢霉  Δ6脂肪酸去饱和酶   463   25
[0196]Fad5-2(456个氨基酸残基)
Blastp nr
  保藏号   生物   描述   长度   ％同一性
  AB029311   盘基网柄菌  脂肪酸去饱和酶   443   41
  AB022097   盘基网柄菌  Δ5脂肪酸去饱和酶   445   39
  AF067654   高山被孢霉  Δ5脂肪酸去饱和酶   441   38
  AF054824   高山被孢霉  Δ5微粒体去饱和酶   441   38
  L11421  D90914   集胞藻属  Δ6去饱和酶   361   28
Fad4(459个氨基酸残基)
Blastp nr
  保藏号   生物  描述   长度   ％同一性
  AF110510   高山被孢霉  Δ6脂肪酸去饱和酶   437   38
  AB020032   高山被孢霉  Δ6脂肪酸去饱和酶   437   38
  AF306634   深黄被孢霉  (Mortierella  isabellina)  Δ6脂肪酸去饱和酶   437   38
  AF307940   高山被孢霉  Δ6脂肪酸去饱和酶   438   38
  AJ250735   角齿藓(Ceratodon  purpureus)  Δ6脂肪酸去饱和酶   438   36
实施例8：在酵母中表达Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6
为确认Fad4的功能，将所述全长cDNA置于诱导型启动子控制下在酵母菌株InvSc2中表达。图7显示：在补充22:5(7，10，13，16，19)的培养基上，包含Fad4 cDNA的酵母细胞与载体对照相比产生额外的脂肪酸。该峰的保留时间与DHA标准相同。游离脂肪酸的LC/MS分析显示：它在负离子电喷射中产生与DHA标准相同的去质子的分子离子(m/z＝279)。此外，FAME的GC/MS分析证实：该峰的图谱与DHA标准的图谱相同(图8)。这些结果指出：Fad4是一种Δ4脂肪酸去饱和酶，能够在22:5(7，10，13，16，19)底物的位置4引入一个双键，导致一种Δ4不饱和脂肪酸，即DHA(22:6-4，7，10，13，16，19)。
为进一步研究Fad4的底物特异性，分别为酵母转化子提供包括18:2(9，12)、18:3(9，12，15)、20:3(8，11，14)和22:4(7，10，13，16)在内的多种底物。结果指出：Fad4也可以使用22:4(7，10，13，16)作为底物(图9)生产另一种Δ4不饱和脂肪酸，即DPA(22:5-4，7，10，13，16)(图10)。检查的其它脂肪酸不是有效底物。
为证实Fad5和Fad5-2的功能，用质粒转化啤酒酵母(S.cerevisiae)Invsc2，该质粒分别包含在半乳糖诱导型启动子控制下的Fad5和Fad5-2的可读框。当在含高γ-亚麻酸(HGLA，20:3-8，11，14)的培养基内用半乳糖诱导所述酵母转化子时，在FAME色谱上出现一个额外的峰，与对照相比，该峰在所述转化子中积累(图11)。该色谱与标准图谱的比较揭示：所述脂肪酸具有与花生四烯酸标准(AA，20:4-5，8，11，14)相同的保留时间。为进一步证实所述产物的区域化学，通过GC/MS分析FAME。图12指出：该新脂肪酸的质谱与AA标准的质谱是相同的。这些结果证明Fad5和Fad5-2在酵母中将HGLA(20:3-8，11，13)转化成AA(20:4-5，8，11，14)。为进一步研究Fad5-2的底物特异性，将包含Fad5-2的质粒转移进另一酵母菌株AMY-2α，其中破坏Δ9去饱和酶基因ole1。所述菌株不能在未添加单不饱和脂肪酸的基本培养基中生长。在本试验中，该菌株在补充17:1(10Z)(不是Fad5-2的底物)的基本培养基中培养，这使得能够研究该酶对各种底物(尤其是单不饱和化合物)的特异性。测试多种可能的底物，包括16:1(9Z)、18:1(9Z)、18:1(11Z)、18:1(11E)、18:1(12E)、18:1(15Z)、18:2(9Z，12Z)、18:3(9Z，12Z，15Z)、20:2(11Z，14Z)和20:3(11Z，14Z，17Z)。结果指出：Fad5-2能够使带有Δ9烯双键和Δ11烯双键的不饱和脂肪酸去饱和，以及使带有Δ8烯双键的脂肪酸(20:3-8，11，14)去饱和。如图13所示，Fad5-2有效转化18:1(9Z)和18:1(11Z)底物成为它们对应的Δ5不饱和脂肪酸，即分别是18:2-5，9(保留时间10.34分钟)和18:1-5，11(保留时间10.44分钟)。Fad5-2也使反式脂肪酸如18:1(11E)和18:1(12E)去饱和。
图25是在酵母菌株AMY-2α中测试的Fad5-2对脂肪酸底物的底物偏好的比较。底物与所积累的产物的相对比例是所述酶的底物偏好的有用指标。如图25所示，Fad5-2偏好使用有20碳的脂肪酸作为底物，如20:3(8Z，11Z，14Z)、20:3(11Z，14Z，17Z)和20:2(11Z，14Z)。然而，更短链脂肪酸是该酶在酵母中相对较弱的底物。
为证实Fad6的功能，用质粒转化啤酒酵母宿主菌株Invsc2，该质粒包含在半乳糖诱导型启动子GAL1控制下的Fad6的可读框。当在含亚油酸的培养基内用半乳糖诱导所述酵母转化子时，在FAME色谱上出现一个额外的峰，与对照相比，该峰在所述转化子中积累(图14)。该色谱与标准图谱的比较揭示：所述脂肪酸具有与γ-亚麻酸(GLA，18:3-6，9，12)相同的保留时间。为进一步证实所述产物的区域选择性，通过GC/MS分析从所述表达菌株获得的脂肪酸的二乙胺衍生物。图15显示新峰确实是在Δ6、Δ9和Δ12位置具有3个双键的GLA。12D不同的n和n十1碳的主要片段是在n+1和n+2碳间存在一个双键的特征。因此，156和168的片段、196和208的片段以及236和248的片段分别指出在Δ6、Δ9和Δ12位置有双键。这些结果证明：Fad6是一种在酵母中将亚油酸(18:2)转化为GLA的Δ6去饱和酶。
实施例9：Fad4在芥菜中的表达
为确定破囊壶菌属Fad4是否在油籽作物中是否有功能，用构建物转化芥菜，所述构建物包含在组成型启动子控制下的Fad4。获得8株独立的转基因植株。在芥菜中不能获得Δ4脂肪酸去饱和酶底物。因此，为测定所述转基因酶在植物中的活性，必须外源提供22:5(n-3)底物。在本试验中，为野生型植株和转基因植株提供二十二碳五烯酸钠的水溶液。发现外源提供的底物能够容易地被野生型和转基因植株的根、茎和叶吸收，但仅在转基因植株中被转化为DHA。叶中的DHA生产水平比根和茎中都高。在叶中，所述外源底物加入达到总脂肪酸10-20％的水平，而生产的Δ4不饱和脂肪酸(22:6，n-3)占总脂肪酸的3-6％(图16)。这些结果指出：来自破囊壶菌属的Δ4脂肪酸去饱和酶在油籽作物中是有功能的。
实施例10：Fad5-2在芥菜中的表达
为确定Fad5-2在油籽作物中是否有功能，以及它的表达对应他们生长和发育是否有任何影响，用双载体转化芥菜，所述双载体包含在组成型启动子(串联花椰菜花叶病毒35S启动子)之后的Fad5-2cDNA。获得六株独立的初级转基因植株，测定不同组织的脂类的脂肪酸分布。图17显示来自一株T1系的三周龄幼苗植株的脂肪酸组成。与野生型相比，所有转基因植物组织具有改变的脂肪酸分布，其中含四个额外的峰，这四个峰鉴定为四种不同的Δ5非去饱和的聚亚甲基间断的脂肪酸(Δ5-UPIFA)，具体地说是taxoleic acid(18:2-5，9)、ephedrenicacid(18:2-5，11)、pinolenic acid(18:3-5，9，12)和coniferonic acid(18:4-5，9，12，15)。因此，B.juncea象酵母一样，能够有功能地表达畸雌腐霉Δ5去饱和酶，该酶将内源底物18:1-9、18:1-11、18:2-9，12和18:3-9，12，15转化成对应的Δ5不饱和脂肪酸。根产生最大量的Δ5-UPIFA，占总脂肪酸的超过20％，其次是茎6％和叶5％(图17)。
在芥菜中没有有效的高γ-亚麻酸(20:3-8，11，14)底物。因此，为检查所述转基因植株是否能够产生AA，外源提供底物20:3(8，11，14)。在本试验中，为野生型植株和转基因植株提供高γ-亚麻酸钠的水溶液。发现外源提供的底物能够容易地被转基因植株的根、茎和叶吸收，并在植株中被转化为AA(图18)。
虽然Δ5-UPIFA在植株的所有部分积累，但对于转基因芥菜的生长和发育没有能够观察到的表型效应。植物组织如叶、茎和根的生长和分化与对应野生型没有区别。
为在种子中生产Δ5去饱和脂肪酸，用构建物转化芥菜，所述构建物包含在异源种子特异性启动子(欧洲油菜(B.napus)napin启动子)之后的Fad5-2cDNA。对转基因种子的脂肪酸分析显示：与野生型对照相比，在转基因植物的气相色谱中出现两种新的脂肪酸(图19)。它们鉴定为taxoleic acid(18:2-5，9)和pinolenic acid(18:3-5，9，12)。总的来说，这些脂肪酸占所述种子脂肪酸的9.4％。与未转化的对照相比，Δ5-UPIFA的积累对于油酸含量没有显著影响。
实施例11：Fad5-2在亚麻中的表达
为在亚麻种子中生产Δ5不饱和脂肪酸，用在两个种子特异性启动子控制下的Fad5-2转化亚麻，所述两个种子特异性启动子是异源甘蓝型油菜napin启动子和亚麻内源启动子。如图26所示，包含napin启动子的转基因植株在种子中产生一种Δ5不饱和脂肪酸，即taxoleicacid，其水平占总脂肪酸的少于1％。但是，包含亚麻种子特异性启动子的转基因植株生产三种Δ5不饱和脂肪酸：taxoleic acid、pinolenic acid和coniferonic acid。其中taxoleic(18:2-5，9)是最丰富的，在一个原种系(FN-10-1)中占总脂肪酸的超过9％，其次是coniferonic acid和pinolenicacid。惊人的是，Δ5不饱和脂肪酸在转基因种子中的积累对于其它脂肪酸的组成没有显著影响，尤其是对于油酸水平没有显著影响。在不同启动子控制下表达Fad5-2去饱和酶的两种转基因植株中，Δ5-UPIFA的积累伴随着油酸的大量增加。在具有napin和亚麻种子特异性启动子的转基因植株中，油酸的含量平均分别达到总脂肪酸的44.7％和24.3％，而未转化对照的含量是17.4％。
实施例12：Fad6在亚麻中的表达
为在亚麻种子中生产Δ6不饱和脂肪酸，用构建物转化两种亚麻，所述构建物包含在异源种子特异性启动子(甘蓝型油菜napin启动子)控制下的Fad6cDNA。I型亚麻(Normandy)是传统的工业化油籽作物，而II型(Solin)是由对I型的化学诱变而获得的可食用油籽作物。产生总共12株转基因植株。大部分转基因植株含有两种新脂肪酸，这两种脂肪酸的保留时间对应于GLA和SDA，它们占总脂肪酸的0.1到4.3％(图27)。GLA在转基因Solin型中的水平高于SDA的水平，而GLA在转基因Normandy中的水平低于SDA的水平。这是可以理解的，因为亚油酸是Solin型亚麻子中的主要脂肪酸，而α-亚麻酸是Normandy种子中的主要脂肪酸。
实施例13：Fad6在芥菜中的表达
为在芥菜的种子中生产Δ6不饱和脂肪酸，用在转化亚麻时使用的相同构建物转化芥菜，所述构建物即在甘蓝型油菜napin启动子控制下的Fad6。获得十五株独立的转基因植株。对所述转基因种子的脂肪酸分析显示：与野生型对照相比，在大多数转基因植株的气相色谱中出现三种新脂肪酸(图20)。所述三种脂肪酸鉴定为18:2(6，9)和18:3(6，9，12)以及18:4(6，9，12，15)。芥菜象亚麻一样，也能够有功能地表达来自畸雌腐霉的Fad6，该酶在内源底物18:1(9)、18:2(9，12)和18:3(6，9，12)的位置6引入双键，导致在转基因种子中生产三种对应的Δ6脂肪酸。在这三种在转基因种子中生产的新脂肪酸中，GLA是最丰富的一种，其水平达到转基因种子中总脂肪酸的30％到38％。第二最丰富的成分是SDA，在几个转基因系中占总脂肪酸的3-10％(图21)。
转基因种子的脂肪酸组成显示于图22。清楚的是：高水平生产Δ6不饱和脂肪酸需要消耗两种主要的脂肪酸，即亚油酸和亚麻酸。在转基因种子中油酸和硬脂酸的生产稍稍降低，但与野生型对照相比并不显著。所述转基因种子中的亚油酸含量显著降低。在未转化的野生型中，亚油酸占种子中总脂肪酸的超过40％。在转基因种子中，该水平降到低于10％。与亚油酸在转基因种子中的降低相比，亚麻酸在转基因种子中的降低没有那么大，但仍是显著的。在未转化的野生型中，亚麻酸占种子中超过10％的总脂肪酸，而在转基因种子中该水平降低到低于5％。在转基因种子中所述两种大幅减少的脂肪酸是Δ6去饱和酶的底物，所述降低是用于生产两种对应的Δ6不饱和脂肪酸。
等同实施方案
本领域内技术人员将认识到或能够确定仅使用常规实验就可获得的本文所述本发明的特定实施方案的许多等同实施方案。所述等同实施方案将包括在下面权利要求的范围内。
序列表
<110>Bioriginal Food&Science Corporation
<120>新型脂肪酸去饱和酶家族成员FAD4、FAD5、FAD5-2和FAD6及它们的应用
<130>PAT 642W-90
<140>PCT/IB01/02346
<141>2001-09-28
<150>60/236,303
<151>2000-09-28
<150>60/297,562
<151>2001-06-12
<160>8
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1560
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1560)
<220>
<221>变异体
<222>462
<223>Xaa＝Gly
<400>1
atg acg gtc ggc tac gac gag gag atc ccg ttc gag cag gtc cgc gcg    48
Met Thr Val Gly Tyr Asp Glu Glu Ile Pro Phe Glu Gln Val Arg Ala
  1               5                  10                  15
cac aac aag ccg gat gac gcc tgg tgc gcg atc cac ggg cac gtg tac     96
His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala Ile His Gly His Val Tyr
             20                  25                  30
gat gtg acc aag ttc gcg agc gtg cac ccg ggc ggc gac att atc ctg    144
Asp Val Thr Lys Phe Ala Ser Val His Pro Gly Gly Asp Ile Ile Leu
         35                  40                  45
ctg gcc gca ggc aag gag gcc acc gtg ctg tac gag act tac cat gtg    192
Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Val Leu Tyr Glu Thr Tyr His Val
     50                  55                  60
cgg ggc gtc tcg gac gcg gtg ctg cgc aag tac cgc atc ggc aag ctg    240
Arg Gly Val Ser Asp Ala Val Leu Arg Lys Tyr Arg Ile Gly Lys Leu
 65                  70                  75                  80
ccg gac ggc caa ggc ggc gcg aac gag aag gaa aag cgg acg ctc tcg    288
Pro Asp Gly Gln Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser
                 85                  90                  95
ggc ctc tcg tcg gcc tcg tac tac acg tgg aac agc gac ttt tac agg    336
Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg
            100                 105                 110
gta atg cgc gag cgc gtc gtg gct cgg ctc aag gag cgc ggc aag gcc    384
Val Met Arg Glu Arg Val Val Ala Arg Leu Lys Glu Arg Gly Lys Ala
        115                 120                 125
cgc cgc gga ggc tac gag ctc tgg atc aag gcg ttc ctg ctg ctc gtc    432
Arg Arg Gly Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Ala Phe Leu Leu Leu Val
    130                 135                 140
ggc ttc tgg agc tcg ctg tac tgg atg tgc acg ctg gac ccc tcg ttc    480
Gly Phe Trp Ser Ser Leu Tyr Trp Met Cys Thr Leu Asp Pro Ser Phe
145                 150                 155                 160
ggg gcc atc ctg gcc gcc atg tcg ctg ggc gtc ttt gcc gcc ttt gtg    528
Gly Ala Ile Leu Ala Ala Met Ser Leu Gly Val Phe Ala Ala Phe Val
                165                 170                 175
ggc acg tgc atc cag cac gac ggc aac cac ggc gcc ttt gcc cag tcg    576
Gly Thr Cys Ile Gln His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ala Gln Ser
            180                 185                 190
cga tgg gtc aac aag gtt gcc ggg tgg acg ctc gac atg atc ggc gcc    624
Arg Trp Val Asn Lys Val Ala Gly Trp Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala
        195                 200                 205
agc ggc atg acg tgg gag ttc cag cac gtc ctg ggc cac cat ccg tac    672
Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gln His Val Leu Gly His His Pro Tyr
    210                 215                 220
acg aac ctg atc gag gag gag aac ggc ctg caa aag gtg agc ggc aag    720
Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gln Lys Val Ser Gly Lys
225                 230                 235                 240
aag atg gac acc aag ctg gcc gac cag gag agc gat ccg gac gtc ttt    768
Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gln Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe
                245                 250                 255
tcc acg tac ccg atg atg cgc ctg cac ccg tgg cac cag aag cgc tgg    816
Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gln Lys Arg Trp
            260                 265                 270
tac cac cgt ttc cag cac att tac ggc ccc ttc atc ttt ggc ttc atg    864
Tyr His Arg Phe Gln His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met
        275                 280                 285
acc atc aac aag gtg gtc acg cag gac gtc ggt gtg gtg ctc cgc aag    912
Thr Ile Asn Lys Val Val Thr Gln Asp Val Gly Val Val Leu Arg Lys
    290                 295                 300
cgg ctc ttc cag att gac gcc gag tgc cgg tac gcg agc cca atg tac     960
Arg Leu Phe Gln Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr
305                 310                 315                 320
gtg gcg cgt ttc tgg atc atg aag gcg ctc acg gtg ctc tac atg gtg    1008
Val Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val
                325                 330                 335
gcc ctg ccg tgc tac atg cag ggc ccg tgg cac ggc ctc aag ctg ttc    1056
Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gln Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe
            340                 345                 350
gcg atc gcg cac ttt acg tgc ggc gag gtg ctc gca acc atg ttc att    1104
Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Val Leu Ala Thr Met Phe Ile
        355                 360                 365
gtg aac cac atc atc gag ggc gtc tcg tac gct tcc aag gac gcg gtc    1152
Val Asn His Ile Ile Glu Gly Val Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Val
    370                 375                 380
aag ggc acg atg gcg ccg ccg aag acg atg cac ggc gtg acg ccc atg    1200
Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Val Thr Pro Met
385                 390                 395                 400
aac aac acg cgc aag gag gtg gag gcg gag gcg tcc aag tct ggc gcc    1248
Asn Asn Thr Arg Lys Glu Val Glu Ala Glu Ala Ser Lys Ser Gly Ala
                405                 410                 415
gtg gtc aag tca gtc ccg ctc gac gac tgg gcc gtc gtc cag tgc cag    1296
Val Val Lys Ser Val Pro Leu Asp Asp Trp Ala Val Val Gln Cys Gln
            420                 425                 430
acc tcg gtg aac tgg agc gtc ggc tcg tgg ttc tgg aat cac ttt tcc    1344
Thr Ser Val Asn Trp Ser Val Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser
        435                 440                 445
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Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Xaa Leu Ser
    450                 455                 460
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His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gln Asp Val Phe Gln Ser Thr Cys Ala
465                 470                 475                 480
gag tac ggc gtc ccg tac cag cac gag cct tcg ctc tgg acc gcg tac  1488
Glu Tyr Gly Val Pro Tyr Gln His Glu Pro Ser Leu Trp Thr Ala Tyr
                485                 490                 495
tgg aag atg ctc gag cac ctc cgt cag ctc ggc aat gag gag acc cac  1536
Trp Lys Met Leu Glu His Leu Arg Gln Leu Gly Asn Glu Glu Thr His
            500                 505                 510
gag tcc tgg cag cgc gct gcc tga                                  1560
Glu Ser Trp Gln Arg Ala Ala
        515
<210>2
<211>519
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌
<220>
<221>变异体
<222>462
<223>Xaa＝Gly
<400>2
Met Thr Val Gly Tyr Asp Glu Glu Ile Pro Phe Glu Gln Val Arg Ala
  1               5                  10                  15
His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala Ile His Gly His Val Tyr
             20                  25                  30
Asp Val Thr Lys Phe Ala Ser Val His Pro Gly Gly Asp Ile Ile Leu
         35                  40                  45
Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Val Leu Tyr Glu Thr Tyr His Val
     50                  55                  60
Arg Gly Val Ser Asp Ala Val Leu Arg Lys Tyr Arg Ile Gly Lys Leu
 65                  70                  75                  80
Pro Asp Gly Gln Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser
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Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg
            100                 105                 110
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Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gln His Val Leu Gly His His Pro Tyr
    210                 215                 220
Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gln Lys Val Ser Gly Lys
225                 230                 235                 240
Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gln Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe
                245                 250                 255
Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gln Lys Arg Trp
            260                 265                 270
Tyr His Arg Phe Gln His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met
        275                 280                 285
Thr Ile Asn Lys Val Val Thr Gln Asp Val Gly Val Val Leu Arg Lys
    290                 295                 300
Arg Leu Phe Gln Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr
305                 310                 315                 320
Val Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val
                325                 330                 335
Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gln Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe
            340                 345                 350
Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Val Leu Ala Thr Met Phe Ile
        355                 360                 365
Val Asn His Ile Ile Glu Gly Val Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Val
    370                 375                 380
Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Val Thr Pro Met
385                 390                 395                 400
Asn Asn Thr Arg Lys Glu Val Glu Ala Glu Ala Ser Lys Ser Gly Ala
                405                 410                 415
Val Val Lys Ser Val Pro Leu Asp Asp Trp Ala Val Val Gln Cys Gln
            420                 425                 430
Thr Ser Val Asn Trp Ser Val Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser
        435                 440                 445
Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Xaa Leu Ser
    450                 455                 460
His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gln Asp Val Phe Gln Ser Thr Cys Ala
465                 470                 475                 480
Glu Tyr Gly Val Pro Tyr Gln His Glu Pro Ser Leu Trp Thr Ala Tyr
                485                 490                 495
Trp Lys Met Leu Glu His Leu Arg Gln Leu Gly Asn Glu Glu Thr His
            500                 505                 510
Glu Ser Trp Gln Arg Ala Ala
        515
<210>3
<211>1320
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1320)
<400>3
atg ggc aag ggc agc gag ggc cgc agc gcg gcg cgc gag atg acg gcc   48
Met Gly Lys Gly Ser Glu Gly Arg Ser Ala Ala Arg Glu Met Thr Ala
  1               5                  10                  15
gag gcg aac ggc gac aag cgg aaa acg att ctg atc gag ggc gtc ctg     96
Glu Ala Asn Gly Asp Lys Arg Lys Thr Ile Leu Ile Glu Gly Val Leu
             20                  25                  30
tac gac gcg acg aac ttt aag cac ccg ggc ggt tcg atc atc aac ttc    144
Tyr Asp Ala Thr Asn Phe Lys His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Asn Phe
         35                  40                  45
ttg acc gag ggc gag gcc ggc gtg gac gcg acg cag gcg tac cgc gag    192
Leu Thr Glu Gly Glu Ala Gly Val Asp Ala Thr Gln Ala Tyr Arg Glu
     50                  55                  60
ttt cat cag cgg tcc ggc aag gcc gac aag tac ctc aag tcg ctg ccg    240
Phe His Gln Arg Ser Gly Lys Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro
 65                  70                  75                  80
aag ctg gat gcg tcc aag gtg gag tcg cgg ttc tcg gcc aaa gag cag    288
Lys Leu Asp Ala Ser Lys Val Glu Ser Arg Phe Ser Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
gcg cgg cgc gac gcc atg acg cgc gac tac gcg gcc ttt cgc gag gag    336
Ala Arg Arg Asp Ala Met Thr Arg Asp Tyr Ala Ala Phe Arg Glu Glu
            100                 105                 110
ctc gtc gcc gag ggg tac ttt gac ccg tcg atc ccg cac atg att tac    384
Leu Val Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Pro His Met Ile Tyr
        115                 120                 125
cgc gtc gtg gag atc gtg gcg ctc ttc gcg ctc tcg ttc tgg ctc atg    432
Arg Val Val Glu Ile Val Ala Leu Phe Ala Leu Ser Phe Trp Leu Met
    130                 135                 140
tcc aag gcc tcg ccc acc tcg ctc gtg ctg ggc gtg gtg atg aac ggc    480
Ser Lys Ala Ser Pro Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Val Met Asn Gly
145                 150                 155                 160
att gcg cag ggc cgc tgc ggc tgg gtc atg cac gag atg ggc cac ggg    528
Ile Ala Gln Gly Arg Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly
                165                 170                 175
tcg ttc acg ggc gtc atc tgg ctc gac gac cgg atg tgc gag ttc ttc    576
Ser Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Met Cys Glu Phe Phe
            180                 185                 190
tac ggc gtc ggc tgc ggc atg agc ggg cac tac tgg aag aac cag cac    624
Tyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln His
        195                 200                 205
agc aag cac cac gcc gcg ccc aac cgc ctc gag cac gat gtc gat ctc    672
Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val Asp Leu
    210                 215                 220
aac acg ctg ccc ctg gtc gcc ttt aac gag cgc gtc gtg cgc aag gtc    720
Asn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val Arg Lys Val
225                 230                 235                 240
aag ccg gga tcg ctg ctg gcg ctc tgg ctg cgc gtg cag gcg tac ctc    768
Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ala Leu Trp Leu Arg Val Gln Ala Tyr Leu
                245                 250                 255
ttt gcg ccc gtc tcg tgc ctg ctc atc ggc ctt ggc tgg acg ctc tac    816
Phe Ala Pro Val Ser Cys Leu Leu Ile Gly Leu Gly Trp Thr Leu Tyr
            260                 265                 270
ctg cac ccg cgc tac atg ctg cgc acc aag cgg cac atg gag ttc gtc    864
Leu His Pro Arg Tyr Met Leu Arg Thr Lys Arg His Met Glu Phe Val
        275                 280                 285
tgg atc ttc gcg cgc tac att ggc tgg ttc tcg ctc atg ggc gct ctc    912
Trp Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Gly Trp Phe Ser Leu Met Gly Ala Leu
    290                 295                 300
ggc tac tcg ccg ggc acc tcg gtc ggg atg tac ctg tgc tcg ttc ggc    960
Gly Tyr Ser Pro Gly Thr Ser Val Gly Met Tyr Leu Cys Ser Phe Gly
305                 310                 315                 320
ctc ggc tgc att tac att ttc ctg cag ttc gcc gtc agc cac acg cac  1008
Leu Gly Cys Ile Tyr Ile Phe Leu Gln Phe Ala Val Ser His Thr His
                325                 330                 335
ctg ccg gtg acc aac ccg gag gac cag ctg cac tgg ctc gag tac gcg  1056
Leu Pro Val Thr Asn Pro Glu Asp Gln Leu His Trp Leu Glu Tyr Ala
            340                 345                 350
gcc gac cac acg gtg aac att agc acc aag tcc tgg ctc gtc acg tgg  1104
Ala Asp His Thr Val Asn Ile Ser Thr Lys Ser Trp Leu Val Thr Trp
        355                 360                 365
tgg atg tcg aac ctg aac ttt cag atc gag cac cac ctc ttc ccc acg  1152
Trp Met Ser Asn Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr
    370                 375                 380
gcg ccg cag ttc cgc ttc aag gaa atc agt cct cgc gtc gag gcc ctc  1200
Ala Pro Gln Phe Arg Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu
385                 390                 395                 400
ttc aag cgc cac aac ctc ccg tac tac gac ctg ccc tac acg agc gcg  1248
Phe Lys Arg His Asn Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Ala
                405                 410                 415
gtc tcg acc acc ttt gcc aat ctt tat tcc gtc ggc cac tcg gtc ggc  1296
Val Ser Thr Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly
            420                 425                 430
gcc gac acc aag aag cag gac tga    1320
Ala Asp Thr Lys Lys Gln Asp
        435
<210>4
<211>439
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌
<400>4
Met Gly Lys Gly Ser Glu Gly Arg Ser Ala Ala Arg Glu Met Thr Ala
  1               5                  10                  15
Glu Ala Asn Gly Asp Lys Arg Lys Thr Ile Leu Ile Glu Gly Val Leu
             20                  25                  30
Tyr Asp Ala Thr Asn Phe Lys His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Asn Phe
         35                  40                  45
Leu Thr Glu Gly Glu Ala Gly Val Asp Ala Thr Gln Ala Tyr Arg Glu
     50                  55                  60
Phe His Gln Arg Ser Gly Lys Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro
 65                  70                  75                  80
Lys Leu Asp Ala Ser Lys Val Glu Ser Arg Phe Ser Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Ala Met Thr Arg Asp Tyr Ala Ala Phe Arg Glu Glu
            100                 105                 110
Leu Val Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Pro His Met Ile Tyr
        115                 120                 125
Arg Val Val Glu Ile Val Ala Leu Phe Ala Leu Ser Phe Trp Leu Met
    130                 135                 140
Ser Lys Ala Ser Pro Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Val Met Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ile Ala Gln Gly Arg Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly
                165                 170                 175
Ser Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Met Cys Glu Phe Phe
            180                 185                 190
Tyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln His
        195                 200                 205
Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val Asp Leu
    210                 215                 220
Asn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val Arg Lys Val
225                 230                 235                 240
Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ala Leu Trp Leu Arg Val Gln Ala Tyr Leu
                245                 250                 255
Phe Ala Pro Val Ser Cys Leu Leu Ile Gly Leu Gly Trp Thr Leu Tyr
            260                 265                 270
Leu His Pro Arg Tyr Met Leu Arg Thr Lys Arg His Met Glu Phe Val
    275                     280                 285
Trp Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Gly Trp Phe Ser Leu Met Gly Ala Leu
    290                 295                 300
Gly Tyr Ser Pro Gly Thr Ser Val Gly Met Tyr Leu Cys Ser Phe Gly
305                 310                 315                 320
Leu Gly Cys Ile Tyr Ile Phe Leu Gln Phe Ala Val Ser His Thr His
                325                 330                 335
Leu Pro Val Thr Asn Pro Glu Asp Gln Leu His Trp Leu Glu Tyr Ala
            340                 345                 350
Ala Asp His Thr Val Asn Ile Ser Thr Lys Ser Trp Leu Val Thr Trp
        355                 360                 365
Trp Met Ser Asn Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr
    370                 375                 380
Ala Pro Gln Phe Arg Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu
385                 390                 395                 400
Phe Lys Arg His Asn Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Ala
                405                 410                 415
Val Ser Thr Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly
            420                 425                 430
Ala Asp Thr Lys Lys Gln Asp
        435
<210>5
<211>1371
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1371)
<400>5
atg acc gag aag gcg agt gac gag ttc acg tgg cag gag gtc gcc aag    48
Met Thr Glu Lys Ala Ser Asp Glu Phe Thr Trp Gln Glu Val Ala Lys
  1               5                  10                  15
cac aac acg gcc aag agc gcg tgg gtg atc atc cgc ggc gag gtg tac    96
His Asn Thr Ala Lys Ser Ala Trp Val Ile Ile Arg Gly Glu Val Tyr
             20                  25                  30
gac gtg acc gag tgg gcg gac aag cac ccg ggc ggc agc gag ctc atc    144
Asp Val Thr Glu Trp Ala Asp Lys His Pro Gly Gly Ser Glu Leu Ile
         35                  40                  45
gtc ctg cac tcc ggt cgt gaa tgc acg gac acg ttc tac tcg tac cac    192
Val Leu His Ser Gly Arg Glu Cys Thr Asp Thr Phe Tyr Ser Tyr His
     50                  55                  60
ccg ttc tcg aac cgc gcc gac aag atc ttg gcc aag tac aag atc ggc    240
Pro Phe Ser Asn Arg Ala Asp Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Lys Ile Gly
 65                  70                  75                  80
aag ctc gtg ggc ggc tac gag ttc ccg gtg ttc aag ccg gac tcg ggc    288
Lys Leu Val Gly Gly Tyr Glu Phe Pro Val Phe Lys Pro Asp Ser Gly
                 85                  90                  95
ttc tac aag gaa tgc tcg gag cgc gtg gcc gag tac ttt aag acg aac    336
Phe Tyr Lys Glu Cys Ser Glu Arg Val Ala Glu Tyr Phe Lys Thr Asn
            100                 105                 110
aat ctg gac cca aag gcg gcg ttc gcg ggt ctc tgg cgc atg gtg ttc    384
Asn Leu Asp Pro Lys Ala Ala Phe Ala Gly Leu Trp Arg Met Val Phe
        115                 120                 125
gtg ttc gcg gtc gcc gcg ctc gcg tac atg ggc atg aat gag ctc atc    432
Val Phe Ala Val Ala Ala Leu Ala Tyr Met Gly Met Asn Glu Leu Ile
    130                 135                 140
cct gga aac gtg tac gcg cag tac gcg tgg ggc gtg gtg ttc ggt gtc    480
Pro Gly Asn Val Tyr Ala Gln Tyr Ala Trp Gly Val Val Phe Gly Val
145                 150                 155                 160
ttc cag gcg ctg cca ttg ctg cac gtg atg cac gac tcg tcg cac gcg    528
Phe Gln Ala Leu Pro Leu Leu His Val Met His Asp Ser Ser His Ala
                165                 170                 175
gca tgc tcg agc agc cca gcg atg tgg cag atc atc ggt cgt ggt gtg    576
Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Gln Ile Ile Gly Arg Gly Val
            180                 185                 190
atg gac tgg ttc gct ggc gcc agc atg gtg tcg tgg ttg aac cag cac    624
Met Asp Trp Phe Ala Gly Ala Ser Met Val Ser Trp Leu Asn Gln His
        195                 200                 205
gtt gtg ggc cac cac atc tac acg aac gtc gcg ggc gcg gac ccg gat    672
Val Val Gly His His Ile Tyr Thr Asn Val Ala Gly Ala Asp Pro Asp
    210                 215                 220
ctc ccg gtc gac ttt gag agc gac gtg cgc cgc atc gtg cac cgc cag    720
Leu Pro Val Asp Phe Glu Ser Asp Val Arg Arg Ile Val His Arg Gln
225                 230                 235                 240
gtg ctg ctg ccg atc tac aag ttc cag cac atc tac ctg cca ccg ctc    768
Val Leu Leu Pro Ile Tyr Lys Phe Gln His Ile Tyr Leu Pro Pro Leu
                245                 250                 255
tac ggc gtg ctg ggc ctc aag ttc cgc atc cag gac gtg ttc gag acg    816
Tyr Gly Val Leu Gly Leu Lys Phe Arg Ile Gln Asp Val Phe Glu Thr
            260                 265                 270
ttc gtg tcg ctc acg aac ggc ccg gtg cgt gtg aac ccg cac ccg gtg    864
Phe Val Ser Leu Thr Asn Gly Pro Val Arg Val Asn Pro His Pro Val
        275                 280                 285
tcg gac tgg gtg caa atg atc ttc gcc aag gcg ttc tgg acg ttc tac    912
Ser Asp Trp Val Gln Met Ile Phe Ala Lys Ala Phe Trp Thr Phe Tyr
    290                 295                 300
cgc atc tac atc ccg ttg gcg tgg ctc aag atc acg ccg tcg acg ttc    960
Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Ala Trp Leu Lys Ile Thr Pro Ser Thr Phe
305                 310                 315                 320
tgg ggc gtg ttt ttc ctc gcc gag ttc acc aca ggt tgg tac ctc gcg   1008
Trp Gly Val Phe Phe Leu Ala Glu Phe Thr Thr Gly Trp Tyr Leu Ala
                325                 330                 335
ttc aac ttc cag gtg agc cac gtc tcg acc gag tgc gag tac ccg tgc  1056
Phe Asn Phe Gln Val Ser His Val Ser Thr Glu Cys Glu Tyr Pro Cys
            340                 345                 350
ggt gat gcg ccg tcg gcc gag gtc ggt gac gag tgg gcg atc tcg cag  1104
Gly Asp Ala Pro Ser Ala Glu Val Gly Asp Glu Trp Ala Ile Ser Gln
        355                 360                 365
gtc aag tcg tcg gtg gac tac gcg cac ggc tcg ccg ctc gcg gcg ttc  1152
Val Lys Ser Ser Val Asp Tyr Ala His Gly Ser Pro Leu Ala Ala Phe
    370                 375                 380
ctc tgc ggc gcg ctc aac tac cag gtg acc cac cac ttg tac ccg ggc  1200
Leu Cys Gly Ala Leu Asn Tyr Gln Val Thr His His Leu Tyr Pro Gly
385                 390                 395                 400
atc tca cag tac cac tac cct gcg atc gcg ccg atc atc atc gac gtg  1248
Ile Ser Gln Tyr His Tyr Pro Ala Ile Ala Pro Ile Ile Ile Asp Val
                405                 410                 415
tgc aag aag tac aac atc aag tac acg gtg ctg ccg acg ttc acc gag  1296
Cys Lys Lys Tyr Asn Ile Lys Tyr Thr Val Leu Pro Thr Phe Thr Glu
            420                 425                 430
gcg ctg ctc gcg cac ttc aag cac ctg aag aac atg ggc gag ctc ggc  1344
Ala Leu Leu Ala His Phe Lys His Leu Lys Asn Met Gly Glu Leu Gly
        435                 440                 445
aag ccc gtg gag atc cac atg ggt taa    1371
Lys Pro Val Glu Ile His Met Gly
    450                 455
<210>6
<211>456
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌
<400>6
Met Thr Glu Lys Ala Ser Asp Glu Phe Thr Trp Gln Glu Val Ala Lys
  1               5                  10                  15
His Asn Thr Ala Lys Ser Ala Trp Val Ile Ile Arg Gly Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Asp Val Thr Glu Trp Ala Asp Lys His Pro Gly Gly Ser Glu Leu Ile
         35                  40                  45
Val Leu His Ser Gly Arg Glu Cys Thr Asp Thr Phe Tyr Ser Tyr His
     50                  55                  60
Pro Phe Ser Asn Arg Ala Asp Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Lys Ile Gly
 65                  70                  75                  80
Lys Leu Val Gly Gly Tyr Glu Phe Pro Val Phe Lys Pro Asp Ser Gly
                 85                  90                  95
Phe Tyr Lys Glu Cys Ser Glu Arg Val Ala Glu Tyr Phe Lys Thr Asn
            100                 105                 110
Asn Leu Asp Pro Lys Ala Ala Phe Ala Gly Leu Trp Arg Met Val Phe
        115                 120                 125
Val Phe Ala Val Ala Ala Leu Ala Tyr Met Gly Met Asn Glu Leu Ile
    130                 135                 140
Pro Gly Asn Val Tyr Ala Gln Tyr Ala Trp Gly Val Val Phe Gly Val
145                 150                 155                 160
Phe Gln Ala Leu Pro Leu Leu His Val Met His Asp Ser Ser His Ala
                165                 170                 175
Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Gln Ile Ile Gly Arg Gly Val
            180                 185                 190
Met Asp Trp Phe Ala Gly Ala Ser Met Val Ser Trp Leu Asn Gln His
        195                 200                 205
Val Val Gly His His Ile Tyr Thr Asn Val Ala Gly Ala Asp Pro Asp
    210                 215                 220
Leu Pro Val Asp Phe Glu Ser Asp Val Arg Arg Ile Val His Arg Gln
225                 230                 235                 240
Val Leu Leu Pro Ile Tyr Lys Phe Gln His Ile Tyr Leu Pro Pro Leu
                245                 250                 255
Tyr Gly Val Leu Gly Leu Lys Phe Arg Ile Gln Asp Val Phe Glu Thr
            260                 265                 270
Phe Val Ser Leu Thr Asn Gly Pro Val Arg Val Asn Pro His Pro Val
        275                 280                 285
Ser Asp Trp Val Gln Met Ile Phe Ala Lys Ala Phe Trp Thr Phe Tyr
    290                 295                 300
Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Ala Trp Leu Lys Ile Thr Pro Ser Thr Phe
305                 310                 315                 320
Trp Gly Val Phe Phe Leu Ala Glu Phe Thr Thr Gly Trp Tyr Leu Ala
                325                 330                 335
Phe Asn Phe Gln Val Ser His Val Ser Thr Glu Cys Glu Tyr Pro Cys
            340                 345                 350
Gly Asp Ala Pro Ser Ala Glu Val Gly Asp Glu Trp Ala Ile Ser Gln
        355                 360                 365
Val Lys Ser Ser Val Asp Tyr Ala His Gly Ser Pro Leu Ala Ala Phe
    370                 375                 380
Leu Cys Gly Ala Leu Asn Tyr Gln Val Thr His His Leu Tyr Pro Gly
385                 390                 395                 400
Ile Ser Gln Tyr His Tyr Pro Ala Ile Ala Pro Ile Ile Ile Asp Val
                405                 410                 415
Cys Lys Lys Tyr Asn Ile Lys Tyr Thr Val Leu Pro Thr Phe Thr Glu
            420                 425                 430
Ala Leu Leu Ala His Phe Lys His Leu Lys Asn Met Gly Glu Leu Gly
         435                 440                 445
Lys Pro Val Glu Ile His Met Gly
450                 455
<210>7
<211>1380
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1380)
<400>7
atg gtg gac ctc aag cct gga gtg aag cgc ctg gtg agc tgg aag gag   48
Met Val Asp Leu Lys Pro Gly Val Lys Arg Leu Val Ser Trp Lys Glu
  1               5                  10                  15
atc cgc gag cac gcg acg ccc gcg acc gcg tgg atc gtg att cac cac     96
Ile Arg Glu His Ala Thr Pro Ala Thr Ala Trp Ile Val Ile His His
             20                  25                  30
aag gtc tac gac atc tcc aag tgg gac tcg cac ccg ggt ggc tcc gtg    144
Lys Val Tyr Asp Ile Ser Lys Trp Asp Ser His Pro Gly Gly Ser Val
        35                   40                  45
atg ctc acg cag gcc ggc gag gac gcc acg gac gcc ttc gcg gtc ttc    192
Met Leu Thr Gln Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ala Val Phe
     50                  55                  60
cac ccg tcc tcg gcg ctc aag ctg ctc gag cag ttc tac gtc ggc gac    240
His Pro Ser Ser Ala Leu Lys Leu Leu Glu Gln Phe Tyr Val Gly Asp
 65                  70                  75                  80
gtg gac gaa acc tcc aag gcc gag atc gag ggg gag ccg gcg agc gac    288
Val Asp Glu Thr Ser Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Pro Ala Ser Asp
                 85                  90                  95
gag gag cgc gcg cgc cgc gag cgc atc aac gag ttc atc gcg tcc tac    336
Glu Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg Ile Asn Glu Phe Ile Ala Ser Tyr
            100                 105                 110
cgt cgt ctg cgc gtc aag gtc aag ggc atg ggg ctc tac gac gcc agc    384
Arg Arg Leu Arg Val Lys Val Lys Gly Met Gly Leu Tyr Asp Ala Ser
        115                 120                 125
gcg ctc tac tac gcg tgg aag ctc gtg agc acg ttc ggc atc gcg gtg    432
Ala Leu Tyr Tyr Ala Trp Lys Leu Val Ser Thr Phe Gly Ile Ala Val
    130                 135                 140
ctc tcg atg gcg atc tgc ttc ttc ttc aac agt ttc gcc atg tac atg    480
Leu Ser Met Ala Ile Cys Phe Phe Phe Asn Ser Phe Ala Met Tyr Met
145                 150                 155                 160
gtc gcc ggc gtg att atg ggg ctc ttc tac cag cag tcc gga tgg ctg    528
Val Ala Gly Val Ile Met Gly Leu Phe Tyr Gln Gln Ser Gly Trp Leu
                165                 170                 175
gcg cac gac ttc ttg cac aac cag gtg tgc gag aac cgc acg ctc ggc    576
Ala His Asp Phe Leu His Asn Gln Val Cys Glu Asn Arg Thr Leu Gly
            180                 185                 190
aac ctt atc ggc tgc ctc gtg ggc aac gcc tgg cag ggc ttc agc gtg    624
Asn Leu Ile Gly Cys Leu Val Gly Asn Ala Trp Gln Gly Phe Ser Val
        195                 200                 205
cag tgg tgg aag aac aag cac aac ctg cac cac gcg gtg ccg aac ctg    672
Gln Trp Trp Lys Asn Lys His Asn Leu His His Ala Val Pro Asn Leu
    210                 215                 220
cac agc gcc aag gac gag ggc ttc atc ggc gac ccg gac atc gac acc    720
His Ser Ala Lys Asp Glu Gly Phe Ile Gly Asp Pro Asp Ile Asp Thr
225                 230                 235                 240
atg ccg ctg ctg gcg tgg tct aag gag atg gcg cgc aag gcg ttc gag    768
Met Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu Met Ala Arg Lys Ala Phe Glu
                245                 250                 255
tcg gcg cac ggc ccg ttc ttc atc cgc aac cag gcg ttc cta tac ttc    816
Ser Ala His Gly Pro Phe Phe Ile Arg Asn Gln Ala Phe Leu Tyr Phe
            260                 265                 270
ccg ctg ctg ctg ctc gcg cgc ctg agc tgg ctc gcg cag tcg ttc ttc    864
Pro Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Gln Ser Phe Phe
        275                 280                 285
tac gtg ttc acc gag ttc tcg ttc ggc atc ttc gac aag gtc gag ttc    912
Tyr Val Phe Thr Glu Phe Ser Phe Gly Ile Phe Asp Lys Val Glu Phe
    290                 295                 300
gac gga ccg gag aag gcg ggt ctg atc gtg cac tac atc tgg cag ctc    960
Asp Gly Pro Glu Lys Ala Gly Leu Ile Val His Tyr Ile Trp Gln Leu
305                 310                 315                 320
gcg atc ccg tac ttc tgc aac atg agc ctg ttt gag ggc gtg gca tac    1008
Ala Ile Pro Tyr Phe Cys Asn Met Ser Leu Phe Glu Gly Val Ala Tyr
                325                 330                 335
ttc ctc atg ggc cag gcg tcc tgc ggc ttg ctc ctg gcg ctg gtg ttc    1056
Phe Leu Met Gly Gln Ala Ser Cys Gly Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe
            340                 345                 350
agt att ggc cac aac ggc atg tcg gtg tac gag cgc gaa acc aag ccg    1104
Ser Ile Gly His Asn Gly Met Ser Val Tyr Glu Arg Glu Thr Lys Pro
        355                 360                 365
gac ttc tgg cag ctg cag gtg acc acg acg cgc aac atc cgc gcg tcg    1152
Asp Phe Trp Gln Leu Gln Val Thr Thr Thr Arg Asn Ile Arg Ala Ser
    370                 375                 380
gta ttc atg gac tgg ttc acc ggt ggc ttg aac tac cag atc gac cat    1200
Val Phe Met Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Asp His
385                 390                 395                 400
cac ctg ttc ccg ctc gtg ccg cgc cac aac ttg cca aag gtc aac gtg    1248
His Leu Phe Pro Leu Val Pro Arg His Asn Leu Pro Lys Val Asn Val
                405                 410                 415
ctc atc aag tcg cta tgc aag gag ttc gac atc ccg ttc cac gag acc    1296
Leu Ile Lys Ser Leu Cys Lys Glu Phe Asp Ile Pro Phe His Glu Thr
            420                 425                 430
ggc ttc tgg gag ggc atc tac gag gtc gtg gac cac ctg gcg gac atc    1344
Gly Phe Trp Glu Gly Ile Tyr Glu Val Val Asp His Leu Ala Asp Ile
        435                 440                 445
agc aag gaa ttc atc acc gag ttc cca gcg atg taa                    1380
Ser Lys Glu Phe Ile Thr Glu Phe Pro Ala Met
    450                 455
<210>8
<211>459
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌
<400>8
Met Val Asp Leu Lys Pro Gly Val Lys Arg Leu Val Ser Trp Lys Glu
  1               5                  10                  15
Ile Arg Glu His Ala Thr Pro Ala Thr Ala Trp Ile Val Ile His His
             20                  25                  30
Lys Val Tyr Asp Ile Ser Lys Trp Asp Ser His Pro Gly Gly Ser Val
         35                  40                  45
Met Leu Thr Gln Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ala Val Phe
     50                  55                  60
His Pro Ser Ser Ala Leu Lys Leu Leu Glu Gln Phe Tyr Val Gly Asp
 65                  70                  75                  80
Val Asp Glu Thr Ser Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Pro Ala Ser Asp
                 85                  90                  95
Glu Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg Ile Asn Glu Phe Ile Ala Ser Tyr
            100                 105                 110
Arg Arg Leu Arg Val Lys Val Lys Gly Met Gly Leu Tyr Asp Ala Ser
        115                 120                 125
Ala Leu Tyr Tyr Ala Trp Lys Leu Val Ser Thr Phe Gly Ile Ala Val
    130                 135                 140
Leu Ser Met Ala Ile Cys Phe Phe Phe Asn Ser Phe Ala Met Tyr Met
145                 150                 155                 160
Val Ala Gly Val Ile Met Gly Leu Phe Tyr Gln Gln Ser Gly Trp Leu
                165                 170                 175
Ala His Asp Phe Leu His Asn Gln Val Cys Glu Asn Arg Thr Leu Gly
            180                 185                 190
Asn Leu Ile Gly Cys Leu Val Gly Asn Ala Trp Gln Gly Phe Ser Val
        195                 200                 205
Gln Trp Trp Lys Asn Lys His Asn Leu His His Ala Val Pro Asn Leu
    210                 215                 220
His Ser Ala Lys Asp Glu Gly Phe Ile Gly Asp Pro Asp Ile Asp Thr
225                 230                 235                 240
Met Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu Met Ala Arg Lys Ala Phe Glu
                245                 250                 255
Ser Ala His Gly Pro Phe Phe Ile Arg Asn Gln Ala Phe Leu Tyr Phe
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Gln Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Tyr Val Phe Thr Glu Phe Ser Phe Gly Ile Phe Asp Lys Val Glu Phe
    290                 295                 300
Asp Gly Pro Glu Lys Ala Gly Leu Ile Val His Tyr Ile Trp Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ala Ile Pro Tyr Phe Cys Asn Met Ser Leu Phe Glu Gly Val Ala Tyr
                325                 330                 335
Phe Leu Met Gly Gln Ala Ser Cys Gly Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe
            340                 345                 350
Ser Ile Gly His Asn Gly Met Ser Val Tyr Glu Arg Glu Thr Lys Pro
        355                 360                 365
Asp Phe Trp Gln Leu Gln Val Thr Thr Thr Arg Asn Ile Arg Ala Ser
    370                 375                 380
Val Phe Met Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Asp His
385                 390                 395                 400
His Leu Phe Pro Leu Val Pro Arg His Asn Leu Pro Lys Val Asn Val
                405                 410                 415
Leu Ile Lys Ser Leu Cys Lys Glu Phe Asp Ile Pro Phe His Glu Thr
            420                 425                 430
Gly Phe Trp Glu Gly Ile Tyr Glu Val Val Asp His Leu Ala Asp Ile
        435                 440                 445
Ser Lys Glu Phe Ile Thr Glu Phe Pro Ala Met
    450                 455

Claims (43)

1.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：
(a)包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7核苷酸序列或其互补序列的核酸分子；
(b)编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列或其互补序列；
(c)编码下述多肽的天然等位基因变异体的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8氨基酸序列或其互补序列。
2.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：
(a)一种包含下述核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3、5、7的整个核苷酸序列或其互补序列至少70％相同；
(b)一种核酸分子，该核酸分子包含一种下述核酸的至少30个连续核苷酸的片段，所述核酸包含SEQ ID NO：3、5、7的核苷酸序列或其互补序列；
(c)一种编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ IDNO：4、6或8的整个氨基酸序列至少约50％相同的氨基酸序列；
(d)一种编码下述多肽的片段的核酸分子，所述多肽包含SEQID NO：4、6或8的氨基酸序列，其中所述片段包含SEQ ID NO：4、6或8的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸残基。
3.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在严格条件下与权利要求1或2核酸分子的互补序列杂交。
4.一种载体，所述载体包含权利要求1或2的核酸分子。
5.权利要求4的载体，所述载体是一种表达载体。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞是用权利要求5的表达载体转染的宿主细胞。
7.权利要求6的宿主细胞，其中所述细胞选自植物细胞、微生物细胞和动物细胞。
8.权利要求7的宿主细胞，其中所述植物细胞是从选自以下的油籽作物获得的细胞：亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine和Soja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、橄榄(Olea sp.)、红花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)和花生(Arachis sp.)。
9.权利要求8的宿主细胞，其中所述微生物细胞选自：破囊壶菌属(Thraustochytrium)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、Schizochytrium和Crythecodinium。
10.一种生产多肽的方法，该方法包括培养权利要求6的宿主细胞以生产所述多肽。
11.一种分离的多肽，所述多肽选自：
(a)一种多肽的片段，所述多肽包含SEQ ID NO：4、6或8的氨基酸序列，其中所述片段包含SEQ ID NO：4、6或8的至少10个连续氨基酸；
(b)一种多肽的天然等位基因变异体，所述多肽包含SEQ IDNO：4、6或8的氨基酸序列，其中所述多肽由一种下述核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与由SEQ ID NO：3、5或7组成的核酸分子的互补序列杂交；
(c)一种由下述核酸分子编码的多肽，所述核酸分子包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含SEQ ID NO：3、5或7的整个核苷酸序列的核酸至少70％相同；和
(d)一种包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQID NO：4、6或8的整个氨基酸序列至少60％相同。
12.权利要求11的分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：4、6或8的氨基酸序列。
13.一种生产不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括用权利要求1或2的分离核酸分子转染或转化细胞，然后在一定条件下培养所述细胞，从而生产所述不饱和脂肪酸。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞选自植物细胞、动物细胞和微生物细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述植物选自油籽作物。
16.权利要求15的方法，其中所述油籽作物选自以下：亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine和Soja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、橄榄(Oleasp.)、红花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)和花生(Arachissp.)。
17.权利要求13的方法，所述方法还包括回收所述不饱和脂肪酸的步骤。
18.权利要求13的方法，其中所述不饱和脂肪酸选自：GLA18:3(6，9，12)、SDA 18:4(6，9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA 20:5(5，8，11，14，17)、DPA 22:5(4，7，10，13，16)和DHA 22:6(4，7，10，13，16，19)。
19.一种生产不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括使包含至少一种去饱和酶靶分子的组合物在一定条件下与至少一种权利要求11或12的分离的多肽接触，从而生产所述不饱和脂肪酸。
20.权利要求19的方法，所述方法还包括回收所述不饱和脂肪酸的步骤。
21.权利要求19的方法，其中所述不饱和脂肪酸选自：GLA18:3(6，9，12)、SDA 18:4(6，9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA 20:5(5，8，11，14，17)、DPA 22:5(4，7，10，13，16)和DHA 22:6(4，7，10，13，16，19)。
22.一种体外生产细胞的方法，所述细胞能够产生不饱和脂肪酸，所述方法包括将权利要求1或2的核酸分子引入所述细胞，其中所述核酸分子编码去饱和酶，所述去饱和酶具有催化脂肪酰基链中双键形成的活性。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞选自植物细胞、动物细胞和微生物细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述植物细胞是一种油籽植物细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述油籽植物是：亚麻(Linumsp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine和Soja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、橄榄(Oleasp.)、红花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)和花生(Arachissp.)。
26.权利要求22的方法，其中所述不饱和脂肪酸选自：GLA18:3(6，9，12)、SDA 18:4(6，9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA 20:5(5，8，11，14，17)、DPA 22:5(4，7，10，13，16)和DHA 22:6(4，7，10，13，16，19)。
27.一种调节不饱和脂肪酸产生的方法，所述方法包括培养权利要求6的细胞，从而调节不饱和脂肪酸产生。
28.权利要求27的方法，其中增强不饱和脂肪酸的产生。
29.权利要求27的方法，其中所述不饱和脂肪酸选自：GLA18:3(6，9，12)、SDA 18:4(6，9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA 20:5(5，8，11，14，17)、DPA 22:5(4，7，10，13，16)和DHA 22:6(4，7，10，13，16，19)。
30.权利要求27的方法，所述方法还包括回收所产生的不饱和脂肪酸。
31.一种大规模生产不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括培养权利要求6的细胞，从而生产不饱和脂肪酸。
32.权利要求31的方法，其中增强不饱和脂肪酸的产生。
33.权利要求31的方法，其中所产生的不饱和脂肪酸选自：GLA 18:3(6，9，12)、SDA 18:4(6，9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA20:5(5，8，11，14，17)、DPA 22:5(4，7，10，13，16)和DHA 22:6(4，7，10，13，16，19)。
34.权利要求29的方法，所述方法还包括回收所产生的不饱和脂肪酸。
35.一种组合物，所述组合物包含权利要求11或12的多肽。
36.一种组合物，所述组合物包含通过权利要求13的方法生产的多肽。
37.一种组合物，所述组合物包含通过权利要求19的方法生产的多肽。
38.一种组合物，所述组合物包含通过权利要求22的方法生产的细胞。
39.权利要求35的组合物，其中所述组合物用于动物饲料中。
40.权利要求36的组合物，其中所述组合物用于动物饲料中。
41.权利要求36的组合物，其中所述组合物用作食品添加剂。
42.权利要求35的组合物在制备用于以下病症的人或动物的食品添加剂中的用途：应激、糖尿病、癌症、炎症性疾病及心血管疾病。
43.权利要求35的组合物在制备用于治疗以下病症的患者的药物中的用途：应激、糖尿病、癌症、炎症性疾病及心血管疾病。
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