ES2399806T3 - Miembro de la familia de desaturasa de ácido graso fad6 y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de a) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o uncomplemento de la misma; b) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidosde la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma; c) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 %idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde lamolécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa Δ6; d) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidosque es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, o un complementode la misma, en donde el polipéptido tiene una actividad desaturasa Δ6; e) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleicoaislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa Δ6; f) una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones exigentes al complemento de la secuencia denucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aisladacodifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa Δ6; y g) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ IDNO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa Δ6.

Description

Miembro de la familia de desaturasa de ácido graso fad6 y usos del mismo
Antecedentes de la Invención
Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos con grupos laterales de hidrocarburo de cadena larga y cumplen una función fundamental en muchos procesos biológicos. Los ácidos grasos son raramente libres en la naturaleza pero, en cambio, ocurren en forma esterificada como el componente principal de los lípidos. Los ácidos grasos/ lípidos son fuentes de energía (por ejemplo, oxidación b) y son una parte integral de las membranas de célula que son indispensables para procesar la información biológica o bioquímica.
Los ácidos grasos se pueden dividir en dos grupos: los ácidos grasos saturados y los ácidos grasos insaturados que contienen uno o más enlaces dobles de carbono en la configuración cis. Los ácidos grasos insaturados se producen por desaturasas terminales que pertenecen a la clase de enzimas sin hemo-hierro. Cada una de estas enzimas son parte de un sistema de transporte de electrones que contiene dos de otras proteínas, a saber citocromo b5 y NADHcitocromo b5 reductasa. Específicamente, dichas enzimas catalizan la formación de enlaces dobles entre los átomos de carbono de una molécula de ácido graso. El humano y otros mamíferos tienen un espectro limitado de estas desaturasas que se requieren para la formación de enlaces dobles particulares en los ácidos grasos insaturados. Sin embargo, los humanos toman algunos ácidos grasos, a través de su dieta. Dichos ácidos grasos esenciales, por ejemplo, son ácido linoleico (C18:2); ácido linolénico (C18:3), ácido araquidónico (C20:4). En contraste, los insectos y plantas son capaces de sintetizar una variedad mucho mayor de ácidos grasos insaturados y sus derivados.
Los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LCPUFA) tal como ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6(4,7,10,13,16,19)) son componentes esenciales de las membranas celulares de diversos tejidos y organelos en los mamíferos (células inmunes, nervio, retina y cerebro). Por ejemplo, más de 30 % de los ácidos grasos en fosfolípidos en el cerebro son 22:6 (n-3) y 20:4 (n-6). (Crawford, M.A., et al., (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1032S1041S). En la retina, el DHA cuenta más de 60 % de los ácidos grasos totales en el segmento externo de los bastones, la parte fotosensible de la célula fotorreceptora. (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315-391). Los estudios clínicos han mostrado que el DHA es esencial para el crecimiento y desarrollo del cerebro en los niños, y para el mantenimiento de la función cerebral normal en los adultos (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120:S129-S138). El DHA también tiene efectos significativos en la función fotorreceptora implicada en el proceso de transducción de señal, la activación de rodopsina, y el desarrollo de bastones y conos (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315-391). Adicionalmente, también se encuentran algunos efectos positivos del DHA en enfermedades tales como hipertensión, artritis, aterosclerosis, depresión, trombosis y cánceres (Horrocks, L.A. y Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215). Por lo tanto, el suministro dietario apropiado del ácido graso es importante para los humanos para permanecer saludables. Es particularmente importante para los niños, jóvenes y ciudadanos mayores absorber adecuadamente estos ácidos grasos de la dieta debido a que no se pueden sintetizar eficientemente en su cuerpo ni se pueden complementar por los alimentos (Spector, A.A. (1999) Lipids 34: S1-S3).
El DHA es un ácido graso de las serie n-3 de acuerdo con la ubicación del último enlace doble en el extremo metilo. Este se sintetiza por medio de etapas alternantes de desaturación y elongación. Partiendo de 18:3 (9,12,15), la biosíntesis de DHA implica la desaturación M6 a 18:4 (6,9,12,15), seguido por elongación a 20:4 (8,11,14,17) y desaturación M5 a 20:5 (5,8,11,14,17). Más allá de este punto, existen algunas controversias a cerca de la biosíntesis. La vista convencional es que 20:5 (5,8,11,14,17) se elonga a 22:5 (7,10,13,16,19) y luego se convierte a
22:6 (4,7,10,13,16,19) por la desaturación final M4 (Horrobin, D.F. (1992) Prog. Lipid Res. 31:163-194). Sin embargo, Sprecher et al. sugirió recientemente una ruta alternativa para la biosíntesis de DHA, que es independiente de la desaturasa M4, que implica dos elongaciones consecutivas, una desaturación M6 y un acortamiento de dos carbonos por medio de la oxidación � limitada en peroxisoma (Sprecher, H., et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477; Sprecher, H., et al. (1999) Lipids 34:5153-5156).
La producción de DHA es importante debido a su efecto beneficioso en la salud humana. Actualmente las fuentes principales de DHA son aceites de pescado y algas. El aceite de pescado es una fuente tradicional y principal para este ácido graso, sin embargo, se oxida usualmente por el tiempo en el que se vende. Adicionalmente, el suministro del aceite es altamente variable y su fuente está en peligro con la disminución de poblaciones de peces mientras que la fuente de algas es costosa debido a la baja producción y los altos costes de extracción.
El EPA y AA son ambos ácidos grasos esenciales M5. Estos forman una clase única de constituyentes de alimentos y comida para humanos y animales. El EPA que pertenece a la serie n-3 con cinco enlaces dobles en la cadena acilo, se encuentra en la comida marina, y es abundante en aceite de pescado en el Atlántico Norte. El AA pertenece a la serie n-6 con cuatro enlaces dobles. La carencia de un enlace doble en la posición w-3 confiere diferentes propiedades AA que aquellas encontradas en EPA. Los eicosanoides producidos de AA tienen propiedades agregadas a plaqueta y fuertemente inflamatorias, mientras que aquellos derivados de EPA tienen propiedades agregadas anti-plaqueta e anti-inflamatorias. Se puede obtener AA de algunos alimentos tal como carne, pescado, y huevos, pero la concentración es baja.
El ácido gama-linolénico (GLA) es otro ácido graso esencial encontrado en mamíferos. El GLA es el intermedio metabólico para ácidos grasos n-6 de cadena muy larga y para diversas moléculas activas. En los mamíferos, la
5 formación de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga se limita en índice por la desaturación M6. Muchas afecciones o condiciones patológicas y fisiológicas tal como envejecimiento, estrés, diabetes, eczema, y algunas infecciones han mostrado que reducen la etapa de desaturación M6. Adicionalmente, el GLA se cataboliza fácilmente de la oxidación y división celular rápida asociada con ciertos trastornos, por ejemplo, cáncer o inflamación. Por lo tanto, la complementación dietética con GLA puede reducir los riesgos de estos trastornos. Los estudios clínicos han mostrado que la complementación dietética con GLA es efectiva en tratar algunas afecciones patológicas tal como eczema atópico, síndrome premenstrual, diabetes, hipercolesterolemia, y trastornos cardiovasculares e inflamatorios.
Las fuentes predominantes de GLA son aceites de plantas tal como onagra (Oenothera biennis), borraja (Borago officinalis L.), grosella negra (Ribes nigrum), y de microorganismos tal como Mortierella sp., Mucor sp., y
15 Cyanobacteria. Sin embargo, estas fuentes GLA no son ideales para complementación dietaria debido a grandes fluctuaciones en la disponibilidad y costes asociados con los procesos de extracción.
Las enzimas desaturasa, en particular desaturasas M6, se describen por ejemplo en el documento WO 00/20602, en el documento WO 98/46764, en Sayanova et al., Proc. Natl .Acad. Sci. USA vol. 94, 1 Abril 1997, páginas 42114216, en Sakuradani et al., Gene vol. 238, no. 2, 1 Enero 1999, páginas 445-453 y en Huang et al., Lipids vol. 34, no. 7, 1 Julio 1999, páginas 649-659.
Resumen de la invención
La biosíntesis de ácidos grasos es una actividad principal de plantas y microorganismos. Sin embargo, los humanos tienen una capacidad limitada para sintetizar ácidos grasos esenciales, por ejemplo, ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LCPUFA). La biotecnología se ha considerado una forma eficiente para manipular el proceso para
25 producir ácidos grasos en plantas y microorganismos. Es efectiva en costes y renovable con pocos efectos colaterales. Sin embargo, ha surgido tremendo esfuerzo industrial dirigido a la producción de diversos compuestos que incluyen ácidos grasos y polipéptidos farmacéuticos de especialidades a través de la manipulación de células de planta, animal, y microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la biotecnología es una ruta atractiva para producir ácidos grasos insaturados, especialmente LCPUFA, en una forma segura, eficiente en costes con el fin de reunir valor terapéutico máximo de estos ácidos grasos.
La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de una familia de moléculas de ácido nucleico que codifica las desaturasas novedosas. En particular, los actuales inventores han identificado el Fad6 (desaturasa M6) que está implicada en la biosíntesis de los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga DHA (ácido docosahexaenoico, 22:6, n-3) y DPA (ácido docosapentaenoico, 22:5, n-6); más específicamente, las
35 desaturasas Fad6 18:2 (n-6) y 18:3(n-3) resultan en GLA (ácido gama- linolénico) y SDA (ácido estearidónico).
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:
a) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma;
b) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma;
c) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6;
45 d) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma, en donde el polipéptido tiene una actividad desaturasa M6;
e) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6;
f) una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones exigentes al complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad de desaturasa M6; y
g) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 5 NO: 8; en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa M6.
En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a un polipéptido aislado seleccionada del grupo que consiste de:
a) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8;
b) un polipéptido aislado codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;
c) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;
d) un polipéptido aislado que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de
15 nucleótidos que es por lo menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;
e) un polipéptido aislado que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa M6.
En una realización, la invención caracteriza una molécula aislada de ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:7. En otra realización, la invención caracteriza una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:8.
En todavía otras realizaciones, la invención caracteriza moléculas de ácido nucleico aisladas que incluyen secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, 70% idénticas) a la secuencia de nucleótidos establecida como SEQ ID NO: 7. La invención caracteriza adicionalmente moléculas de ácido nucleico 25 aisladas que incluye por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ SEQ ID NO: 7. En otra realización, la invención caracteriza moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, 50% idénticas) a la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 8. También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican variantes alélicas del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 8. Además de las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos de longitud completa, la presente invención también caracteriza moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, de los polipéptidos de longitud completa de la presente invención (por ejemplo, fragmentos que incluyen por lo menos 10 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8). En todavía otras realizaciones, la invención caracteriza moléculas de ácido nucleico que son 35 complementarias a, o hibridan bajo condiciones exigentes a las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aquí.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona vectores que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aquí (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican desaturasa). También se caracterizan células anfitrionas que incluyen dichos vectores (por ejemplo, células anfitrionas que incluyen vectores adecuados para producir moléculas de ácido nucleico de desaturasa y polipéptidos).
De acuerdo con el segundo aspecto, la invención caracteriza polipéptidos de desaturasa aislados y/o fragmentos de los mismos. Las realizaciones de ejemplo caracterizan un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 8, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 8, un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 %, por ejemplo,
45 por lo menos 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 7. También se caracterizan fragmentos de los polipéptidos de longitud completa descritos aquí (por ejemplo, fragmentos que incluyen por lo menos 10 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia establecida como la SEQ ID NO: 8).
En una realización, un polipéptido de desaturasa o fragmento del mismo tiene una actividad desaturasa. En otra realización, un polipéptido de desaturasa, o fragmento del mismo, tiene un motivo de unión hemo de terminal N, por ejemplo, un dominio similar a citocromo b5 encontrado en desaturasas de extremo frontal. En otra realización, un polipéptido de desaturasa, o fragmento del mismo, tiene por lo menos dos, preferiblemente aproximadamente tres, motivos de histidina conservadores encontrados en todas las desaturasas microsómicas y, opcionalmente, tiene una actividad desaturasa. En una realización preferida, el polipéptido de desaturasa, o fragmento del mismo, tiene aproximadamente tres motivos histidina.
Las construcciones que contienen los genes de desaturasa se pueden utilizar en cualquier sistema de expresión que incluye plantas, animales, y microorganismos para la producción de células capaces de producir LCPUFA tal como DHA, EPA, AA, SDA, y GLA. Ejemplos de las plantas utilizadas para expresar las desaturasas de la presente invención incluyen, entre otras, plantas y semillas de plantas de cultivos de oleaginosas, por ejemplo, lino (Linum sp.), semilla de colza (Brassica sp.), soja (Glycine y Soja sp.), girasol (Helianthus sp.), algodón (Gossypium sp.), maíz (Zea mays), oliva (Olea sp.), alazor (Carthamus sp.), cacao (Theobroma cacoa), y cacahuete (Arachis sp.).
En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona nuevos y mejorados métodos para producir ácidos grasos insaturados, por ejemplo, LCPUFA, y otros compuestos clave de la ruta biosintética de ácido graso insaturado utilizando células, por ejemplo, células de plantas; células de animal, y/o células microbianas en las que la ruta biosintética de ácido graso insaturado se ha manipulado de tal manera que se producen los LCPUFA u otros compuestos deseados de ácido graso insaturado.
Las nuevas y mejoradas metodologías de la presente invención incluyen métodos para producir ácidos grasos insaturados (por ejemplo, DHA) en células que tienen por lo menos una desaturasa de ácido graso de la ruta biosintética de ácido graso insaturado manipulada de tal manera que se producen los ácidos grasos insaturados (por ejemplo, producidos en un nivel aumentado). Por ejemplo, la invención caracteriza métodos para producir un ácido graso insaturado (por ejemplo, DHA) en células que comprenden por lo menos una molécula de ácido nucleico de desaturasa aislada, por ejemplo, Fad6, o una parte del mismo, como se describió anteriormente, de tal manera que se produce un ácido graso insaturado, por ejemplo, LCPUFA, por ejemplo, DHA. Dichos métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de recuperar el LCPUFA.
En otra realización, la presente invención proporciona métodos para producir ácidos grasos insaturados, por ejemplo, LCPUFA, por ejemplo, DHA, que comprende poner en contacto una composición que comprende por lo menos una molécula objetivo desaturasa, como se define aquí, con por lo menos un polipéptido de desaturasa aislado, por ejemplo, Fad6, o una parte del mismo, como se describió anteriormente, bajo condiciones de tal manera que se produce un ácido graso insaturado, por ejemplo, LCPUFA, por ejemplo, DHA. Dichos métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de recuperar el LCPUFA.
Los ácidos nucleicos, proteínas, y vectores descritos anteriormente son particularmente útiles en las metodologías de la presente invención. En particular, la invención caracteriza métodos para mejorar la producción de ácido graso insaturado (por ejemplo, producción de DHA) que incluye cultivar una planta recombinante, animal, y/o microorganismo que comprende un ácido nucleico de desaturasa, por ejemplo, Fad6, bajo condiciones de tal manera que se mejora la producción de ácido graso.
En otra realización, la presente invención caracteriza métodos para producir una célula capaz de producir ácidos grasos insaturados. Dichos métodos incluyen introducir dentro una célula, por ejemplo, una célula de planta, una molécula aislada de ácido nucleico como se describió anteriormente que codifica una proteína que tiene una actividad de catalizar la formación de un enlace doble en una cadena grasa acilo.
En otra realización, la presente invención caracteriza métodos para modular la producción de ácidos grasos que comprende cultivar una célula que comprende una molécula aislada de ácido nucleico como se describió anteriormente que codifica un polipéptido que tiene una actividad de catalizar la formación de un enlace doble, de tal manera que ocurre la modulación de la producción de ácido graso.
En otra realización, la presente invención incluye composiciones que comprenden los ácidos nucleicos de ácidos grasos insaturados o polipéptidos descritos aquí. Las composiciones de la presente invención también pueden comprender células capaces de producir dichos ácidos grasos, como se describió anteriormente, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, las composiciones de la presente invención se utilizan como un complemento dietario, por ejemplo, en alimento para animal o como un nutracéutico. Las composiciones de la presente invención pueden permitir un método para tratar un paciente que tiene un trastorno, que comprende administrar la composición de tal manera que se trata el paciente. Los trastornos abarcados por dichos métodos incluyen, por ejemplo, estrés, diabetes, cáncer, trastornos inflamatorios, y trastornos cardiovasculares.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.
Breve Descripción de los Dibujos
La figura 1 muestra la secuencia de proteína y ADN de Fad5-2 de Pythium irregulare; (A) la secuencia de cADN del marco de lectura abierta (SEQ ID NO: 5); y (B) la secuencia de proteína traducida (SEQ ID NO: 6).
La figura 2 muestra la secuencia de proteína y ADN de Fad6 de Pythium irregulare; (A) la secuencia de cADN del marco de lectura abierta (SEQ ID NO: 7); y (B) la secuencia de proteína traducida (SEQ ID NO: 8).
La figura 3) muestra una comparación de las secuencias de proteína Fad5-2 y Fad6 de Pythium iregulare (SEQ ID NO: 6 y 8, respectivamente). La barra vertical indica la identidad de aminoácido. Los motivos conservados tal como los motivos de unión ricos en histidina y los motivos de unión hemo de citocromo b5 se destacan. Las dos flechas incidan las ubicaciones de unión de los dos cebadores degenerados.
La figura 4 es un análisis GC de los FAME de la cepa de levadura Invsc2 que expresa Fad6 con el sustrato exógeno
18:2 (9, 12).
La figura 5 es un análisis MS del derivado del nuevo pico de la figura 14. La estructura de la dietilamida del nuevo ácido graso se muestra con valores m/z para iones que incluyen la unidad estructural amida. Los tres pares de iones en m/z, 156/168, 196/208, y 236/248 son diagnósticos para enlaces dobles en la posición M6, M9, y M12, respectivamente.
La figura 6 es un análisis GC de los FAME de semilla de B. juncea que expresa Fad6. Tres picos nuevos indican tres ácidos grasos M6 desaturados en semillas transgénicas.
La figura 7 muestra el porcentaje en peso de GLA (ácido y- linolénico) y SDA (ácido estearidónico) acumulado en semillas transgénicas Fad6 de B. juncea.
La figura 8 muestra las composiciones de ácido graso de los lípidos de semilla de cinco estirpes transgénicas que expresan Fad6; SA= ácido esteárico; OA= ácido oleico; LA=ácido linoleico; GLA= ácido y- linolénico; ALA=ácido alinolénico; SDA=ácido estearidónico.
La figura 9 es una tabla que muestra el perfil de ácido graso de Pythium irregulare.
La figura 10 es una tabla que muestra la acumulación de ácidos grasos M6 desaturados en semillas de lino transgénicas (Solin y Normandy) que expresan Fad6 bajo el control del promotor napina. Los niveles de ácido graso se muestran como el porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de miembros novedosos de la familia de desaturasa de ácido graso, denominados intercambiablemente aquí como "desaturasas" o "desaturasa" de ácido nucleico y moléculas de proteínas (por ejemplo, Fad6). Estas moléculas novedosas son miembros de la familia de desaturasa de ácido graso y se expresan en los organismos que producen LCPUFA, por ejemplo, Thraustochytrium; Pythium irregulare, Schizichytrium, y Crythecodinium.
Como se utiliza aquí, el término "ácidos grasos" es reconocido en la técnica e incluye un ácido carboxílico basado en hidrocarburo de cadena larga. Los ácidos grasos son componentes de muchos lípidos que incluyen glicéridos. Los ácidos grasos que ocurren en forma natural más comunes son ácidos monocarboxílicos que tienen un número uniforme de átomos de carbono (16 o 18) y que pueden ser saturados o insaturados. Los ácidos grasos “insaturados” contienen enlaces dobles cis entre los átomos de carbono. Los ácidos grasos insaturados abarcados por la presente invención incluyen, por ejemplo, DHA, GLA, y SDA. Los ácidos grasos “poli-insaturados” contienen más de un enlace doble y los enlaces dobles se disponen en un sistema interrumpido por metileno (-CH=CHCH2-CH=CH-).
Los ácidos grasos se describen aquí por un sistema de numeración en el que el número antes de la coma indica el número de átomos de carbono en el ácido graso, mientras que el número después de la coma es el número de enlaces dobles que están presentes. En el caso de los ácidos grasos insaturados, esto se sigue por un número en paréntesis que indica la posición de los enlaces dobles. Cada número en paréntesis es el átomo de carbono enumerado menor de los dos conectados por el enlace doble. Por ejemplo, se puede describir el ácido oleico como 18:1(9) y se puede describir el ácido linoleico como 18:2(9,12) que indica 18 carbonos, un enlace doble en el carbono 9, dos enlaces dobles en los carbonos 9 y 12, respectivamente.
Las etapas de control en la producción de ácidos grasos insaturados, es decir, la ruta biosintética de ácido graso insaturado, se catalizando por desaturasas de ácido graso asociadas con membrana, por ejemplo, Fad6. Específicamente, dichas enzimas catalizan la formación de enlaces dobles entre los átomos de carbono de una molécula de ácido graso. Como se utiliza aquí, el término "ruta biosintética de ácido graso insaturado" se refiere a una serie de reacciones químicas que conducen a la síntesis de un ácido graso insaturado in vivo o in vitro. Dicha ruta incluye una serie de etapas de desaturación y elongación que generan ácidos grasos insaturados y finalmente, los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga. Dichos ácidos grasos insaturados pueden incluir, GLA 18:3 (6,9,12), SDA 18:4 (6,9,12,15), AA 20:4 (5,8,11,14), EPA 20:5 (5,8,11,14,17), y DPA 22:5 (4,7,10,13,16), y DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
Las desaturasas pueden contener un motivo de unión hemo y/o aproximadamente tres motivos de histidina conservadores, aunque pueden estar presentes dominios adicionales. Los miembros de la familia de desaturasa de ácido graso convierten los ácidos grasos saturados a ácidos grasos insaturados, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LCPUFA), que son componentes de las membranas celulares de diversos tejidos y organelos en mamíferos (células inmunes, nervio, retina, y cerebro). Ejemplos de LCPUFA incluyen, entre otros, ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6(4,7,10,13,16,19)). Los estudios clínicos han mostrado que el DHA es esencial para el crecimiento y desarrollo del cerebro en los niños, y para el mantenimiento de la función cerebral normal en los adultos (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120:S129-S138). El DHA también tiene efectos en la función fotorreceptora implicada en el proceso de transducción de señal, activación de rodopsina, y desarrollo de bastones y conos (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Adicionalmente, los efectos positivos del DHA también se encuentran en el tratamiento de enfermedades tales como hipertensión, artritis, aterosclerosis, depresión, trombosis y cánceres (Horrocks, L.A. y Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215). Sin embargo, se pueden utilizar moléculas de desaturasa para producir los LCPUFA útiles en tratar trastornos caracterizados por el crecimiento aberrantemente regulado, proliferación, o diferenciación. Dichos trastornos incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma; sarcoma, o leucemia; angiogenia de tumor y metástasis; displasia esquelética; trastornos hepáticos; síndromes mielodisplásicos; y trastornos hematoyéticos y/o mieloproliferativos. Otros trastornos relacionados con angiogenia y que son, por lo tanto, trastornos asociados con desaturasa incluyen telangiactasia hemorrágica hereditaria tipo 1, fibrodisplasia ossificans progresiva, fibrosis pulmonar idiopática, y síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber.
El término "familia" cuando se refiere a la proteína y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pretende significar dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio o motivo estructural común y tienen suficiente homología de secuencia de nucleótidos o aminoácidos como se define aquí. Dichos miembros de la familia pueden ocurrir en forma natural o no natural y pueden ser de la misma o de una especie diferente. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano así como también otras proteínas distintas de origen humano o alternativamente, puede contener homólogos de origen no humano, por ejemplo, proteínas de rata o ratón. Los miembros de la familia también pueden tener características funcionales comunes.
Por ejemplo, la familia de las proteínas desaturasa de la presente invención comprende un motivo de unión hemo de citocromo b5. Como se utiliza aquí, el término "motivo de unión hemo’ es una extensión de terminal N del dominio similar a citocromo b5 encontrado en desaturasas de extremo frontal.
En otra realización, los miembros de la familia de desaturasa de las proteínas incluyen "motivos de histidina" en la proteína, preferiblemente, aproximadamente tres o cuatro motivos de histidina. Como se utiliza aquí, el término "motivo de histidina" incluye un dominio de proteína que tiene por lo menos aproximadamente dos residuos de aminoácido histidina, preferiblemente aproximadamente tres o cuatro residuos de aminoácido de histidina, y se encuentra normalmente en todas las desaturasas microsómicas como el tercer motivo de histidina conservador.
Ejemplos de motivos de unión hemo de citocromo b5 y los motivo de histidina incluyen los residuos de aminoácido 42-47, 178-183, 215-220, y 400-405 de la SEQ ID NO: 8 como se muestra en la figura 3.
Las proteínas de desaturasa aisladas de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o se codifican por una secuencia de nucleótidos suficientemente homóloga a la SEQ ID NO: 7. Las proteínas de la invención se describen en la reivindicación 7. Como se utiliza aquí, el término "suficientemente homólogo" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número mínimo o suficiente de residuos de aminoácido idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar) o nucleótidos en una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de tal manera que la primera y segunda secuencias de nucleótidos o aminoácidos comparten dominios o motivos estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que comparten los dominios estructurales comunes tienen por lo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más homología o identidad a través de la secuencia de aminoácidos de los dominios y contienen por lo menos uno y preferiblemente dos dominios estructurales o motivos, se definen aquí como suficientemente homólogos. Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que comparten por lo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más homología o identidad y que comparten una identidad funcional común se definen aquí como suficientemente homólogos.
En una realización preferida, una proteína de desaturasa incluye por lo menos uno o más de los siguientes dominios
o motivos: un motivo de unión hemo y/o un motivo histidina y tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos
5 aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más homóloga o idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En todavía otra realización preferida, una proteína desaturasa incluye por lo menos uno o más de los siguientes dominios: un motivo de unión hemo y/o un motivo histidina, y se codifica por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación exigentes en un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. En otra realización preferida, una proteína desaturasa incluye por lo menos un motivo de unión hemo y/o por lo menos aproximadamente tres motivos de histidina, y tiene un actividad desaturasa.
Como se utiliza intercambiablemente aquí, una "actividad desaturasa," "actividad biológica de una desaturasa," o "actividad funcional de una desaturasa," incluye una actividad ejercida o mediada por una proteína desaturasa,
15 polipéptido o molécula de ácido nucleico sobre una célula que responde desaturasa o sobre un sustrato de desaturasa, como se determina in vivo o in vitro, de acuerdo con técnicas estándar. En una realización, una actividad desaturasa es una actividad directa tal como una asociación con una molécula objetivo de desaturasa. Como se utiliza aquí, una "molécula objetivo" o "compañero de unión" es una molécula por ejemplo, una molécula implicada en la síntesis de los ácidos grasos insaturados, por ejemplo, un ácido graso intermedio, con el cual una proteína desaturasa se une o interactúa en naturaleza de tal manera que se logra una función mediada por desaturasa. Una actividad de desaturasa directa también incluye la formación de un enlace doble entre los átomos de carbono de una molécula de ácido graso para formar una molécula de ácido graso insaturado.
La secuencia de nucleótidos de la desaturasa M5 Pythium irregulare, Fad5-2, cADN y la secuencia de aminoácidos predicha codificada por el cADN Fad5-2 se muestran en la figura 1 y en las SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente. El
25 gen Fad5-2 Pythium irregulare, que tiene aproximadamente 1371 nucleótidos de longitud, codifica una proteína que tiene aproximadamente 456 residuos de aminoácido de longitud.
La secuencia de nucleótidos de la desaturasa M6 Pythium irregulare, Fad6, cADN y la secuencia de aminoácidos predicha codificada por el cADN Fad6 se muestran en la figura 2 y en la SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente. El gen Fad6 Pythium irregulare, que tiene aproximadamente 1383 nucleótidos de longitud, codifica una proteína que tiene aproximadamente 460 residuos de aminoácido de longitud.
Se describen diversos aspectos de la invención en detalle adicional en las siguientes subsecciones:
I. Moléculas de Ácido Nucleico Aisladas
Un aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas desaturasa o fragmentos de los mismos, descritos aquí que son fragmentos de ácido nucleico suficientes para uso
35 como sondas de hibridación para identificar las moléculas de ácido nucleico que codifican desaturasa (por ejemplo, mARN de desaturasa) y fragmentos para uso como cebadores PCR para la amplificación y mutación de las moléculas de ácido nucleico de desaturasa. Como se utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, mARN) y análogos de ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser ADN de hebra doble o de hebra sencilla, pero preferiblemente es ADN de hebra doble.
El término "molécula de ácido nucleico aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que se separan de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que se separan del cromosoma con el cual el ADN genómico se asocia en forma natural. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es libre de las 45 secuencias que flanquean en forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de desaturasa aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean en forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Más aún, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cADN, puede estar sustancialmente libre de otro material celular,
o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o una parte del mismo, se puede aislar utilizando técnicas de biología 55 molecular estándar y la información de secuencia proporcionada aquí. Utilizando todo o una parte de la secuencia
de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 7, como sondas de hibridación, las moléculas de ácido nucleico de desaturasa se pueden aislar utilizando hibridación estándar y técnicas de clonación (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd; ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Más aún, una molécula de ácido nucleico abarca toda o una parte de la SEQ ID NO: 7, se puede aislar por la reacción de cadena polimerasa (PCR) utilizando cebadores sintéticos de oligonucleótido basados en la secuencia de la SEQ ID NO: 7.
Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar utilizando cADN, mARN o alternativamente, ADN genómico, como una plantilla y cebadores de oligonucleótido apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación PCR estrándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y se caracteriza por análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos que corresponden a las secuencias de nucleótidos de desaturasa se pueden preparar mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automático.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico consiste de la secuencia de nucleótidos establecida como la SEQ ID NO: 7.
En todavía otra realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, de tal manera que puede hibridar a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, formando por lo tanto un dúplex estable.
En todavía otra realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %
o más idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, en la longitud completa de la secuencia de nucleótidos), o una parte o complemento de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. En una realización, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos (o no mayor de) 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 o más nucleótidos de longitud e hibrida bajo condiciones de hibridación exigentes aun complemento de una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7.
Más aún, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de una proteína desaturasa, por ejemplo, una parte biológicamente activa de una proteína desaturasa. La secuencia de nucleótidos determinada de la clonación del gen desaturasa permite la generación de sondas y cebadores designados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia desaturasa, así como también homólogos desaturasa de otras especies. La sonda/ cebador (por ejemplo, oligonucleótido) normalmente comprende oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido normalmente comprende una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones exigentes a por lo menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente aproximadamente 20 o 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia codificante de la SEQ ID NO: 7, de una secuencia anti-codificante de la SEQ ID NO: 7, o de una variante alélica que ocurre en forma natural o mutante de la SEQ ID NO: 7.
Las sondas o cebadores de ejemplo tienen por lo menos (o no más de) 12 o 15, 20 o 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más nucleótidos de longitud y/o comprenden nucleótidos consecutivos de una molécula aislada de ácido nucleico descrita aquí. También se describen sondas o cebadores que comprenden nucleótidos consecutivos o contiguos de una molécula aislada de ácido nucleico descrita aquí, pero por la diferencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases dentro de la secuencia de sonda o cebador. Las sondas con base en las secuencias de nucleótidos de desaturasa se pueden utilizar para detectar (por ejemplo, específicamente detectan) transcriptos o secuencias genómicas que codifican las mismas o proteínas homólogas. La sonda puede comprender adicionalmente un grupo marcado unido a esta, por ejemplo, el grupo marcado puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. También se proporciona un conjunto descrito de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para uso en un PCR, que se pueden utilizar para amplificar una región seleccionada de una secuencia de desaturasas, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita aquí. Los cebadores deben tener por lo menos 5, 10, o 50 pares base de longitud y menos de 100, o menos de 200, pares base de longitud. Los cebadores deben ser idénticos, o difieren por no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases cuando se compara con una secuencia descrita aquí o con la secuencia de una variante que ocurre en forma natural. Se pueden utilizar dichas sondas como una parte de un equipo de prueba diagnóstico para identificar células o tejido que expresa erróneamente una proteína de desaturasa, tal como al medir un nivel del ácido nucleico que codifica la desaturasa en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectarlos niveles de mARN de desaturasa o determinar si un gen de desaturasa genómico ha mutado o se ha eliminado.
Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "parte biológicamente activa de una proteína desaturasa" se puede preparar al aislar una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de desaturasa (las actividades biológicas de las proteínas desaturasa se describen aquí), expresando la parte codificada de la proteína desaturasa (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína desaturasa. En una realización de ejemplo, la molécula de ácido nucleico tiene por lo menos 50-100, 100-250, 250-500, 500-700, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 15001750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 o más nucleótidos de longitud y codifica una proteína que tiene una actividad desaturasa (como se describe aquí).
La invención abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en al SEQ ID NO: 7 debido a la degeneración del código genético y así codifica la misma proteína desaturasa como aquella codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en al SEQ ID NO: 7. En otra realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere mediante por lo menos 1, pero no más de 5, 10, 20, 50 o 100 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en al SEQ ID NO: 8. En todavía otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de la desaturasa humana. Si se necesita alineación para esta comparación, las secuencias se deben alinear para homología máxima.
Las variantes de ácido nucleico pueden ser de ocurrencia en forma natural, tal como variantes alélicas (mismos locus), homólogos (diferentes locus), y ortólogos (diferentes organismos) o pueden ocurrir en forma no natural. Las variantes que ocurren en forma no natural se pueden hacer mediante técnicas de mutagenia, que incluye aquellas aplicadas a los polinucleótidos, células, u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones de nucleótido, eliminaciones, inversiones e inserciones. La variación puede ocurrir en o las regiones codificantes y no codificantes. Las variaciones pueden producir las sustituciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras (cuando se compara en el producto codificado).
Las variantes alélicas resultan, por ejemplo, de polimorfismos de la secuencia de ADN dentro de una población (por ejemplo, la población humana) que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas desaturasa. Dichos polimorfismo genético en los genes de desaturasa pueden existir entre los individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural.
Como se utiliza aquí, el término "gen" y "gen recombinante" se refiere a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína desaturasa, por ejemplo, proteína desaturasa de oleaginosa, y adicionalmente puede incluir secuencia reguladoras no codificantes, e intrones.
También se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una variante alélica que ocurre en forma natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en donde la molécula de ácido nucleico hibrida a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, bajos condiciones de hibridación exigentes.
Las variantes alélicas de desaturasa, por ejemplo, Fad6, incluyen las proteínas desaturasa funcionales o no funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos que ocurren en forma natural de la proteína desaturasa que mantiene la capacidad de, por ejemplo, (i) interactuar con un sustrato de desaturasa o molécula objetivo (por ejemplo, un ácido graso, por ejemplo, DHA); y/o (ii) forma un enlace doble entre átomos de carbono en un sustrato de desaturasa o molécula objetivo. Los ácidos grasos producidos por el ácido nucleico y las moléculas de proteína de la presente invención también son útiles en el tratamiento de trastornos tal como envejecimiento, estrés, diabetes, cáncer, trastornos inflamatorios (por ejemplo, artritis, eczema), y trastornos cardiovasculares. Las variantes alélicas funcionales contendrán normalmente solo una sustitución conservadora de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o una sustitución, eliminación o inserción de los residuos no críticos en las regiones no críticas de la proteína.
Las variantes alélicas no funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos que ocurren en forma natural de la proteína desaturasa, por ejemplo, Fad6, que no tienen la capacidad de, por ejemplo, (i) interactuar con un sustrato de desaturasa o molécula objetivo (por ejemplo, un ácido graso intermedio, tal como 18:4 (6,9,12,15)); y/o (ii) forman un enlace doble entre átomos de carbono en un sustrato de desaturasa o molécula objetivo. Las variantes alélicas no funcionales contendrán normalmente una sustitución no conservadora, una eliminación, o inserción, o truncación prematura de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o una sustitución, inserción, o eliminación en los residuos críticos o las regiones críticas de la proteína.
La presente invención proporciona adicionalmente ortólogos (por ejemplo, ortólogos humanos de las proteínas desaturasa). Los ortólogos de las proteínas desaturasas Pythium irregulare son proteínas que se aíslan de otros organismos y poseen el mismo sustrato de desaturasa o mecanismos de unión de la molécula objetivo, mecanismos de formación de enlace doble, mecanismos de modulación de crecimiento y el desarrollo del cerebro en los niños, mecanismos de mantenimiento de la función cerebral normal en adultos, la capacidad de afectar la función fotorreceptora implicada en el proceso de transducción de señal, capacidad de afectar la activación de rodopsina, mecanismos de desarrollo de bastones y/o conos, y/o mecanismos de modulación del crecimiento celular y/o proliferación de las proteínas desaturasas no humanas. Los ortólogos de las proteínas desaturasas Pythium irregulare se pueden identificar fácilmente como que comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la SEQ ID NO: 8.
Se describen aquí moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia desaturasa y, sin embargo, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de desaturasas de la SEQ ID NO: 7 pretenden estar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, otro cADN de desaturasa se puede identificar con base en la secuencia de nucleótidos de Fad6. Se describen aquí, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas desaturasa de diferentes especies, y que, sin embargo, tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de desaturasas de la SEQ ID NO: 7 pretenden estar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, el cADN de desaturasa Schizochytrium o Crythecodinium se puede identificar con base en la secuencia de nucleótidos de un Fad6.
Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a las variantes alélicas naturales y los homólogos de los cADN de desaturasa de la invención se pueden aislar con base en su homología a los ácidos nucleicos de desaturasa descritos aquí utilizando los cADN descritos aquí, o una parte del mismo, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar bajo condiciones de hibridación exigentes.
Los ortólogos, homólogos y variantes alélicas se pueden identificar utilizando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, mediante hibridación a una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, bajo condiciones de hibridación exigentes). Se describe aquí una molécula aislada de ácido nucleico que tiene por lo menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud e hibrida bajo condiciones exigentes a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, o 7. En otra realización, el ácido nucleico tiene por lo menos 50-100, 100-250, 250-500, 500-700, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 o más nucleótidos de longitud.
Como se utiliza aquí, el término "hibrida bajo condiciones exigentes" pretende describir condiciones para hibridación y lavado bajo las que las secuencias de nucleótidos que son significativamente idénticas u homólogas entre sí permanecen hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias por lo menos aproximadamente 70 %, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80 %, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85 % o 90 % idénticas entre sí permanecen hibridadas entre sí. Dichas condiciones exigentes se conocen por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), secciones 2, 4, y 6. Las condiciones exigentes adicionales se pueden encontrar en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), capítulos 7, 9, y 11. Un ejemplo no limitante, preferido de condiciones de hibridación exigentes incluye hibridación de cloruro de sodio 4X /citrato de sodio (SSC), en aproximadamente 65-70° C (o alternativamente hibridación en 4X SSC más 50 % de formamida a aproximadamente 42-50° C) seguido por uno o más lavados en 1X SSC, a aproximadamente 65-70° C. Un ejemplo no limitante, preferido de condiciones de hibridación altamente exigentes incluye hibridación en 1X SSC, a aproximadamente 65-70° C (o alternativamente hibridación en 1X SSC más 50 % de formamida a aproximadamente 42-50° C) seguido por uno o más lavados en 0.3X SSC, a aproximadamente 65-70° C. Un ejemplo no limitante, preferido de condiciones de hibridación de exigencia reducida incluyen hibridación en 4X SSC, a aproximadamente 50-60° C (o alternativamente hibridación en 6X SSC más 50 % de formamida a aproximadamente 40-45° C) seguido por uno o más lavados en 2X SSC, a aproximadamente 50-60° C. El intermedio de rangos para los valores mencionados anteriormente, por ejemplo, a 65-70° C o a 42-50° C también se pretenden abarcar por la presente invención. El SSPE (1 x SSPE es 0.15M NaCl, 10mM NaH2PO4, y 1.25mM EDTA, pH 7.4) se puede sustituir por SSC (1X SSC es 0.15M NaCl y 15mM de citrato de sodio) en los reguladores de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después que se completa la hibridación. La temperatura de hibridación para los híbridos anticipados que tiene menos de 50 pares base de longitud debe ser 5-10° C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde el Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos de menos de 18 pares base de longitud, Tm(°C) = 2(# de bases A + T) + 4(# de bases G + C). Para los híbridos entre 18 y 49 pares base de longitud, Tm(°C) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N), en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el regulador de hibridación ([Na+] para 1X SSC = 0.165 M). También se reconocerá por el practicante experto que se pueden agregar reactivos adicionales para hibridación y/o reguladores de lavado para reducir la hibridación no específica de las moléculas de ácido nucleico a las membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o nylon, que incluye pero no se limita a agentes de bloqueo (por ejemplo, BSA
o esperma de arenque o salmón portador de ADN), detergentes (por ejemplo, SDS), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), Ficoll, PVP y similares. Cuando se utilizan membranas de nylon, en particular, un ejemplo no limitante, preferido adicional de condiciones de hibridación exigentes es hibridación en 0.25-0.5M NaH2PO4, 7 % de SDS a aproximadamente 65° C, seguido por uno o más lavados a 0.02M NaH2PO4, 1 % de SDS a 65° C (ver por ejemplo, Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995), o alternativamente 0.2 X SSC, 1 % de SDS.
Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que hibrida bajo condiciones exigentes a la secuencia de la SEQ ID NO: 7 corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre en forma natural. Como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico “que ocurre en forma natural” se refiere a una molécula de ADN o de ARN que tiene una secuencia de nucleótidos que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).
Además de las variantes alélicas que ocurren en forma natural de las secuencias de desaturasas que pueden existir en la población, el artesano experto apreciará adicionalmente que se pueden introducir cambios mediante mutación en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17, que conduce por lo tanto a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas desaturasa codificadas, sin alterar la capacidad funcional de las proteínas desaturasa. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótido que conducen a las sustituciones de aminoácido en los residuos de aminoácido “no esenciales” se pueden hacer en la secuencia de la SEQ ID NO: 7. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo natural de Fad6 (por ejemplo, la secuencia de la SEQ ID NO: 8) sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de aminoácido "esencial" para actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de aminoácido que se conservan entre las proteínas desaturasa de la presente invención, por ejemplo, aquellas presentes en un motivo de unión hemo o un motivo histidina, se predice que son particularmente no susceptibles a alteración. Adicionalmente, los residuos de aminoácido adicionales que se conservan entre las proteínas desaturasa de la presente invención y otros miembros de la familia de desaturasa de ácido no son probablemente susceptibles para alteración.
De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas desaturasa que contienen cambios en los residuos de aminoácido que no son esenciales para actividad. Dichas proteínas desaturasas difieren de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, aún retienen la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más homóloga a la SEQ ID NO: 8, por ejemplo, para la longitud completa de la SEQ ID NO: 8.
Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína desaturasa homóloga a la proteína de la SEQ ID NO: 8 se puede crear al introducir una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótido en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, de tal manera que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir en la SEQ ID NO: 7 mediante técnicas estándar, tal como mutagenia dirigida a sitio y mutagenia mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido conservadoras se hacen en uno o más residuos de aminoácido no esenciales predichos. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han identificado en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Sin embargo, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una proteína de desaturasa se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de todo o parte de una secuencia codificante de desaturasa, tal como mediante mutagenia de saturación, y los mutantes resultantes se pueden detectar para actividad biológica de desaturasa para identificar mutantes que retienen la actividad. Luego de mutagenia de la SEQ ID NO: 7, la proteína codificada se puede expresar recombinantemente y se puede determinar la actividad de la proteína.
Una proteína desaturasa mutante se puede evaluar por la capacidad de (i) interactuar con un sustrato de desaturasa
o molécula objetivo (por ejemplo, un ácido graso intermedio); y/o (ii) forma un enlace doble entre los átomos de carbono en un sustrato de desaturasa o molécula objetivo.
II. Proteínas de Desaturasa Aisladas
Un aspecto de la invención pertenece a las proteínas de desaturasa aisladas o recombinantes y polipéptidos, y fragmentos de las mismas. En una realización, las proteínas de desaturasa naturales se pueden aislar de células o fuentes de tejido mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteína estándar. En otra realización, las proteínas desaturasa se producen por técnicas de ADN recombinante. Alternativa a la expresión recombinante, una proteína desaturasa o polipéptido se puede sintetizar químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptido estándar.
Una proteína "aislada" o "purificada" o la porción biológicamente activa de la misma es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o la fuente de tejido de la que la proteína desaturasa se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. La frase "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de la proteína desaturasa en la que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce recombinantemente. En una realización, la frase "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de la proteína desaturasa que tiene menos de aproximadamente 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, o 30 % (por peso seco) de la proteína no desaturasa (también denominado aquí como una "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20 % de la proteína no desaturasa, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10 % de la proteína no desaturasa, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5 % de la proteína no desaturasa. Cuando la proteína desaturasa o la parte biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, también preferiblemente está sustancialmente libre del medio de cultico, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, más preferiblemente menos de aproximadamente 10 %, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5 % del volumen de la preparación de la proteína.
La frase "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de la proteína desaturasa en la que la proteína se separa de los precursores químicos u otros químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la frase "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos," incluye preparaciones de la proteína desaturasa que tiene menos de aproximadamente 30 % (por peso seco) de los precursores químicos o los químicos no desaturasa, más preferiblemente menos de aproximadamente 20 % de precursores químicos o químicos no desaturasa, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10 % de precursores químicos o químicos no desaturasa, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5 % de precursores químicos o químicos no desaturasa. Cabe entender que las proteínas o esta invención también pueden ser una forma que es diferente de sus proteínas que ocurren en forma natural correspondientes y/o que están aún en asociación con por lo menos algunos componentes celulares. Por ejemplo, la proteína se puede asociar con una membrana celular.
Como se utiliza aquí, una "parte biológicamente activa" de una proteína desaturasa incluye un fragmento de una proteína desaturasa que participa en una interacción entre una molécula de desaturasa y una molécula de no desaturasa (por ejemplo, un sustrato de desaturasa tal como ácido graso). Las porciones biológicamente activas de una proteína desaturasa incluyen secuencias de aminoácidos que comprenden péptidos suficientemente homólogas a o que se derivan de las secuencias de aminoácido de desaturasa, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en al SEQ ID NO: 8 que incluye suficientes residuos de aminoácido para exhibir por lo menos una actividad de una proteína desaturasa. Normalmente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con por lo menos una actividad de la proteína desaturasa; la capacidad de (i) interactuar con un sustrato de desaturasa o molécula objetivo (por ejemplo, un ácido graso intermedio); y/o (ii) formar un enlace doble entre átomos de carbono en un sustrato de desaturasa o molécula objetivo. Una parte biológicamente activa de una proteína desaturasa puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,’550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150,1200 o más aminoácidos de longitud.
En una realización, una parte biológicamente activa de una proteína desaturasa comprende un motivo de unión hemo y/o por lo menos un motivo de histidina, preferiblemente aproximadamente tres motivos de histidina. Más aún, otras porciones biológicamente activas, en las que otras regiones de la proteína se eliminan, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y se evalúan para una o más de las actividades funcionales de una proteína desaturasa natural.
En una realización preferida, una proteína desaturasa tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en al SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones, la proteína desaturasa es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 8 y retiene la actividad funcional de la proteína de la SEQ ID NO: 8, aún difiere en la secuencia de aminoácidos debido a la variación alélica natural o mutagenia, como se describe en detalle en la subsección I anterior. En otra realización, la proteína desaturasa es una proteína comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la SEQ ID NO: 8.
En otra realización, la invención caracteriza una proteína desaturasa que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos por lo menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma. Esta invención caracteriza adicionalmente una proteína de desaturasa que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación exigentes a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma.
Para determinar el porcentaje de identidad de las dos secuencias de aminoácido o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir
espacios en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para alineación óptima y las secuencias no homólogas se pueden tener en cuenta para propósitos de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es por lo menos 30 %, preferiblemente por lo menos 40 %, más preferiblemente por lo menos 50 %, incluso más 5 preferiblemente por lo menos 60 %, e incluso más preferiblemente por lo menos 70 %, 80 %, o 90 % de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia a la secuencia de aminoácidos Fad6 de la SEQ ID NO: 8 que tiene 460 residuos de aminoácido, por lo menos 138, se alinean preferiblemente por lo menos 184, más preferiblemente por lo menos 230, incluso más preferiblemente por lo menos 276, e incluso más preferiblemente por lo menos 322, 368, o 414 residuos de aminoácido). Los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido correspondientes o las posiciones de nucleótido luego se comparan. Cuando se ocupa una posición en la primera secuencia por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (como se utiliza aquí la “identidad” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas
15 por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesitan ser introducidos para la alineación óptima de las dos secuencias.
La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En todavía otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacio de 25 40, 50, 60, 70, o 80 y una longitud de espacio de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Un ejemplo no limitante, preferido de los parámetros que se van a utilizar en conjunto con el programa GAP incluyen una matriz de clasificación Blosum 62 con una penalidad gap de 12, una penalidad gap extendida de de 4, y una penalidad gap de cambio de estructura de
5.
En otra realización, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Meyers and Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0 o versión 2.0U), utilizando una tabla de residuo en peso PAM120, una penalidad de longitud gap de 12 y una penalidad gap de 4.
Las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra la base de datos pública para, por ejemplo,
35 identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Se pueden realizar las búsquedas de nucléotido BLAST con el programa NBLAST, clasificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de desaturasa de la invención. Se pueden realizar búsquedas de la proteína BLAST con el programa XBLAST, clasificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener las secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de la proteína desaturasa de la invención. Para obtener las alineaciones gap para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
45 III. Métodos para Producir Ácidos Grasos Insaturados
La presente invención proporciona nuevos y métodos mejorados para producir ácidos grasos insaturados, por ejemplo, LCPUFA, tal como, DHA (ácido docosahexaenoico, 22:6 (n-6)), DPA (ácido docosapentaenoico, 22:5 (n-6)), AA (ácido araquidónico, 20: 4 (n-6)) y EPA (ácido eicosapentaenioco, 20:5(n-3)).
A. Células Recombinantes y Métodos para Cultivar Células
La presente invención caracteriza adicionalmente vectores recombinantes que incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican los productos de gen como se describe aquí, preferiblemente los productos de gen Fad4, Fad5, Fad5-2, y Fad6. El término vector recombinante incluye un vector (por ejemplo, plásmido) que se ha alterado, modificado o construido por ingeniería de tal manera que contiene secuencias de ácidos nucleicos mayores, menores o diferentes que aquellas incluidas en el vector natural o plásmido. En una realización, un vector 55 recombinante incluye la secuencia de ácido nucleico que codifican por lo menos una enzima de desaturasa de ácido graso ligada operablemente a las secuencias reguladoras. La frase "ligado operablemente a las secuencias reguladoras" significa que la secuencia de nucleótidos de interés se une a las secuencias reguladoras en una forma que permite la expresión (por ejemplo, expresión mejorada, aumentada, constitutiva, basal, atenuada, reducida o
reprimida) de la secuencia de nucleótidos, preferiblemente la expresión de un producto de gen codificado por la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, cuando se introduce el vector recombinante en una célula). Los vectores de ejemplo se describen en detalla adicional aquí así como también en, por ejemplo, Frascotti et al., Patente Estadounidense No. 5,721,137.
El término "secuencia reguladora" incluye secuencias de ácidos nucleicos que afectan (por ejemplo, modulan o regulan) la expresión de otras secuencias de ácidos nucleicos (no reguladoras). En una realización, una secuencia reguladora se incluye en un vector recombinante en una posición similar o idéntica y/o orientación con relación con un gen particular de interés como se observa para la secuencia reguladora y el gen de interés cuando aparece en la naturaleza, por ejemplo, en una posición y/o orientación natural. Por ejemplo, un gen de interés (por ejemplo, un gen Fad6) se puede incluir en un vector recombinante unido operablemente a una secuencia reguladora que acompaña
o es adyacente al gen en el organismo natural (por ejemplo, ligado operablemente a la secuencia reguladora Fad6 “natural” (por ejemplo, al promotor Fad6 “natural”). Alternativamente, se puede incluir un gen de interés (por ejemplo, un gen Fad6) en un vector recombinante ligado operablemente a una secuencia reguladora que acompaña o es adyacente a otro gen (por ejemplo, uno diferente) en el organismo natural. Por ejemplo, se puede incluir un gen Fad6 en un vector ligado operablemente a las secuencias reguladoras no Fad4, Fad5, Fad5-2, o Fad6. Alternativamente, se puede incluir un gene de interés (por ejemplo, un gen Fad6) en un vector ligado operablemente a una secuencia reguladora de otro organismo. Por ejemplo, las secuencias reguladoras de otros microbios (por ejemplo, otras secuencias reguladoras bacterianas, secuencias reguladoras de bacteriófago y similares) se pueden unir operablemente a un gene de interés particular.
Las secuencias reguladoras preferidas incluyen promotores, mejoradores, señales de terminación y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, los sitios de unión para las proteínas reguladoras transcripcionales y/o de traducción, por ejemplo, en el mARN transcrito). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Las secuencias reguladoras incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en una célula (por ejemplo, promotores constitutivos y promotores constitutivos fuertes), aquellos que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en una célula (por ejemplo, promotores inducibles, por ejemplo, promotores inducibles de xilosa) y aquellos que atenúan o reprimen la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula (por ejemplo, señales de atenuación o secuencias represoras). También está dentro del alcance de la presente invención regular la expresión de un gene de interés al retirar o eliminar las secuencias reguladoras. Por ejemplo, las secuencias implicadas en la regulación negativa de transcripción se pueden retirar de tal manera que se mejora la expresión de un gen de interés.
En una realización, un vector recombinante de la presente invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican por lo menos un producto de gen (por ejemplo, Fad6) ligado operablemente a un promotor o secuencia promotora.
En todavía otra realización, un vector recombinante de la presente invención incluye una secuencia terminadora o secuencias terminadoras (por ejemplo, secuencias terminadoras de transcripción). El término "secuencias terminadoras" incluye secuencias reguladoras que sirven para terminar la transcripción del mARN. Las secuencias terminadoras (o terminadores de transcripción tándem) pueden servir adicionalmente para estabilizar el mARN (por ejemplo, al agregar estructura al mRNA), por ejemplo, contra las nucleasas.
En todavía otra realización, un vector recombinante de la presente invención incluye secuencias de resistencia a antibióticos. El término "secuencias de resistencia a antibióticos" incluye secuencias que promueven o confieren resistencia a los antibióticos en el organismo anfitrión. En una realización, las secuencias de resistencia a antibióticos se seleccionan del grupo que consiste de secuencias cat (resistencia a cloramfenicol), tet (resistencia a tetraciclina), secuencias erm (resistencia a eritromicina), secuencias neo (resistencia a neomicina) y secuencias spec (resistencia a espectinomicina). Los vectores recombinantes de la presente invención pueden incluir adicionalmente secuencias de recombinación homólogas (por ejemplo, secuencias designadas para permitir la recombinación del gen de interés en el cromosoma del organismo anfitrión). Por ejemplo, se pueden utilizar las secuencias amyE como objetivos de homología para recombinación en el cromosoma anfitrión.
El término "célula manipulada" incluye una célula que se ha construido por ingeniería (por ejemplo, construido genéticamente por ingeniería) o modificado de tal manera que la célula tiene por lo menos una desaturasa de ácido graso, por ejemplo, Fad6, de tal manera que se produce un ácido graso insaturado. La modificación o construcción por ingeniería de dichos microorganismos pueden estar de acuerdo con cualquier metodología descrita aquí que incluye, pero no se limita a, desregulación de una ruta biosintética y/o la sobreexpresión de por lo menos una enzima biosintética. Una enzima "manipulada" (por ejemplo, una enzima biosintética "manipulada") incluye enzimas, es decir la expresión o producción la cual se ha alterado o modificado de tal manera que por lo menos un precursor en la dirección 5’ o en la dirección 3’, sustrato o producto de la enzima se altera o modifica, por ejemplo, cuando se compara con una enzima que ocurre en forma natural o tipo natural correspondiente.
El término "sobreexpresado" o "sobreexpresión" incluye la expresión de un producto de gen (por ejemplo, una desaturasa de ácido graso) en un nivel mayor que se expresa antes de la manipulación de la célula o en una célula comparable que no se ha manipulado. En una realización, la célula se puede manipular genéticamente (por ejemplo, construir genéticamente por ingeniería) para sobreexpresar un nivel del producto de gen mayor que aquel expresado antes de la manipulación de la célula o en una célula comparable que no se ha manipulado. La manipulación genética puede incluir, pero no se limita a, alterar o modificar las secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen particular (por ejemplo, al agregar promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o al retirar secuencias reguladoras de tal manera que la expresión es constitutiva), modificar la ubicación cromosómica de un gen particular, alterar las secuencias de ácidos nucleicos adyacentes a un gen particular tal como un sitio de unión a ribosoma o terminador de transcripción, aumentar el número de copia de un gen particular, modificar las proteínas (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, mejoradores, activadores transcripcionales y similares) implicadas en la transcripción de un gen particular y/o traducción de un producto de gen particular, o cualesquier otros medios convencionales para desregular la expresión de una rutina de gen particular en la técnica (que incluye pero no se limita al uso de moléculas de ácido nucleico anticodificantes, por ejemplo, para bloquear la expresión de las proteínas represoras).
En otra realización, la célula se puede manipular físicamente o ambientalmente para sobreexpresar un nivel de producto de gen mayor que el expresado antes de la manipulación de la célula o en una célula comparable que no se ha manipulado. Por ejemplo, una célula se puede tratar con o cultivar en la presencia de un agente conocido o se sospecha aumenta la transcripción de un gen particular y/o traducción de un producto de gen particular de tal manera que se mejoran o aumentan la transcripción y/o traducción. Alternativamente, una célula se puede cultivar a una temperatura seleccionada para aumentar la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto de gen particular de tal manera que se mejoran o aumentan la transcripción y/o traducción.
El término "desregulado" o "desregulación" incluye la alteración o modificación de por lo menos un gen en una célula que codifica una enzima en una ruta biosintética, de tal manera que se altera o modifica el nivel o actividad de la enzima biosintética en la célula. Preferiblemente, por lo menos un gen que codifica una enzima en una ruta biosintética se altera o modifica de tal manera que mejora o aumenta el producto de gen. La frase "ruta desregulada" también puede incluir una ruta biosintética en la que más de un gen que codifica una enzima en la ruta biosintética se altera o modifica de tal manera que el nivel o actividad de más de una enzima biosintética se altera o modifica. La capacidad de "desregular" una ruta (por ejemplo, para desregular simultáneamente más de un gen un una ruta biosintética dada) en una célula surge de un fenómeno particular de células en las que más de una enzima (por ejemplo, dos o tres enzimas biosintéticas) se codifican por genes que ocurren adyacentes entre sí en una pieza contigua de material genético denominado como un "operón".
El término "operón" incluye una unidad coordinada de expresión de gen que contiene un promotor y posiblemente un elemento regulador asociado con uno o más, preferiblemente por lo menos dos, genes estructurales (por ejemplo, genes que codifican enzimas, por ejemplo, enzimas biosintéticas). La expresión de los genes estructurales se puede regular coordinadamente, por ejemplo, mediante proteínas reguladoras que se unen al elemento regulador o mediante anti-terminación de transcripción. Los genes estructurales se pueden transcribir para dar un mARN único que codifica todas las proteínas estructurales. Debido a la regulación coordinada de los genes incluidos en un operón, la alteración o modificación del promotor único y/o el elemento regulador puede resultar en alteración o modificación de cada producto de gen codificado por el operón. La alteración o modificación del elemento regulador puede incluir, pero no se limita a retirar el promotor endógeno y/o los elementos reguladores, agregar promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o retirar secuencias reguladoras de tal manera que se modifica la expresión del producto de gen, modificar la ubicación cromosómica del operón, alterar las secuencias de ácidos nucleicos adyacentes al operón o dentro del operón tal como un sitio de unión a ribosoma, aumentar el número de copia del operón, modificar las proteínas (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, mejoradores, activadores transcripciones y similares) implicados en la transcripción del operón y/o la traducción de los productos de gen del operón, o cualesquier otros medios convencionales para desregular la expresión de genes de rutina en la técnica (que incluye pero no se limita al uso de moléculas de ácido nucleico anticodificantes, por ejemplo, para bloquear la expresión de las proteínas represoras). La desregulación también puede implicar alterar la región codificante de uno o más genes para producir, por ejemplo, una enzima que es resistente a la retroalimentación o tiene una actividad específica mayor o menor.
Una célula "recombinante" particularmente preferida de la presente invención se ha construido genéticamente por ingeniería para sobreexpresar un gen derivado de planta o producto de gen o un gen derivado microorgánicamente. El término "derivado de planta," "derivado microorgánicamente," o "derivado de," por ejemplo, incluye un gen que se encuentra en forma natural en un microorganismo o una planta, por ejemplo, una planta de oleaginosa, o un producto de gen (por ejemplo, Fad6) o que se codifica por un gen de planta o un gen de un microorganismo (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 codificada).
Las metodologías de la presente invención caracterizan células recombinantes que sobreexpresan por lo menos una desaturasa de ácido graso.
En otra realización, una célula recombinante de la presente invención se ha construido por ingeniería genéticamente para sobreexpresar una desaturasa Pythium irregulare M6 (el producto de gen Fad6) (por ejemplo, una desaturasa de ácido graso que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o se codifica por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7).
En otra realización, la invención caracteriza una célula (por ejemplo, una célula microbiana) que se ha transformado con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de desaturasa de ácido graso (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de desaturasa de ácido graso como se establece en la SEQ ID NO: 7).
Otro aspecto de la presente invención caracteriza un método para modular la producción de ácidos grasos que comprende células cultivadas transformadas por la molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, una desaturasa) de tal manera que ocurre la modulación de la producción de ácido graso (por ejemplo, se mejora la producción de ácidos grasos insaturados). El método para cultivar células transformadas por la molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, Fad6) para modular la producción de ácidos grasos se denomina aquí como ’’biotransformación." Los procesos de biotransformación pueden utilizar células recombinantes y/o desaturasas como se describe aquí. El término "proceso de biotransformación," también denominados aquí como "procesos de bioconversión," incluye procesos biológicos que resultan en la producción (por ejemplo, transformación
o conversión) de cualquier compuesto (por ejemplo, sustrato, intermedio, o producto) que está en la dirección 5’ de una desaturasa de ácido graso a un compuesto (por ejemplo, sustrato, intermedio, o producto) que está en la dirección 3’ de una desaturasa de ácido graso, en particular, un ácido graso insaturado. En una realización, la invención caracteriza un proceso de biotransformación para la producción de un ácido graso insaturado que comprende poner en contacto una célula que sobreexpresa por lo menos una desaturasa de ácido graso con por lo menos un sustrato apropiado bajo condiciones de tal manera que se produce un ácido graso insaturado y, opcionalmente, recupera el ácido graso. En una realización preferida, la invención caracteriza un proceso de biotransformación para la producción de ácidos grasos insaturados que comprende poner en contacto una célula que sobreexpresa el Fad6 con un sustrato apropiado (por ejemplo, un ácido graso intermedio) bajo condiciones de tal manera que se produce un ácido graso insaturado (por ejemplo, DHA, SDA, o GLA) y, opcionalmente, recuperar el ácido graso insaturado. Las condiciones bajo las cuales un ácido graso insaturado se produce pueden incluir cualesquier condiciones que resultan en la producción deseada de un ácido graso insaturado.
Las célula y/o enzimas utilizadas en las reacciones de biotransformación están en una forma que les permite realizar su función pretendida (por ejemplo, producir ácidos grasos deseados). Las células pueden ser células completas, o pueden ser solo aquellas porciones de las células necesarias para obtener el resultado final deseado. Las células se pueden suspender (por ejemplo, en una solución apropiada tal como soluciones o medios regulados), enjuagar (por ejemplo, enjuagar libres de medio para cultivar la célula), secar en acetona, inmovilizar (por ejemplo, con gel de poliacrilamida o k-carragenano o en soportes sintéticos, por ejemplo, glóbulos, matrices y similares), fijar, entrecruzados o permeablizados (por ejemplo, tienen membranas permeabilizadas y/o paredes de tal manera que los compuestos, por ejemplo, sustratos, intermedios o productos pueden pasar más fácilmente a través de dicha membrana o pared). El tipo de célula puede ser cualquier célula capaz de ser utilizada dentro de los métodos de la invención, por ejemplo, células de planta, animal, o microbianas.
Un aspecto importante de la presente invención implica cultivar la planta recombinante o cultivar los microorganismos recombinantes descritos aquí, de tal manera que se produce un compuesto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado deseado). El término "cultivar" incluye mantener y/o cultivar un microorganismo vivo de la presente invención (por ejemplo, mantener y/o cultivar un cultivo o cepa). En una realización, se cultiva un microorganismo en medio líquido. En otra realización, se cultiva un microorganismo en medio sólido o medio semisólido. En una realización preferida, se cultiva un microorganismo en el medio (por ejemplo, un medio líquido, estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o el cultivo del microorganismos (por ejemplo, fuentes de carbono o sustrato de carbono, por ejemplo carbohidratos complejos tal como granos o harina de granos, almidones, azúcares, alcoholes de azúcar, hidrocarburos, aceites, grasas, ácidos grasos, ácidos orgánicos y alcoholes; fuentes de nitrógeno, por ejemplo, proteínas vegetales, peptonas, péptidos y aminoácidos derivados de granos, oleaginosas y tubérculos, proteínas, péptidos y aminoácidos derivados de fuentes animales tal como carne, leche y subproductos de animales tal como peptonas, extractos de carne y hidrolizados de caseína; fuentes de nitrógeno inorgánicas tal como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, ácido fosfórico, sales de sodio y potasio de los mismos; elementos traza, por ejemplo, magnesio, hierro, manganeso, calcio, cobre, zinc, boro, molibdeno, y/o sales de cobalto; así como también factores de cultivo tal como aminoácidos, vitaminas, promotores de crecimiento y similares).
Preferiblemente, se cultivan microorganismos bajo pH controlado. El término "pH controlado" incluye cualquier pH que resulta en la producción del producto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado). En una realización, los microorganismos se cultivan a un pH de aproximadamente 7. En otra realización, los microorganismos se cultivan a un pH de entre 6.0 y 8.5. El pH deseado se puede mantener mediante cualquier número de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica.
También preferiblemente, se cultivan microorganismos bajo aireación controlada. El término "aireación controlada" incluye suficiente aireación (por ejemplo, oxígeno) para resultar en la producción del producto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado). En una realización, la aireación se controla al regular los niveles de oxígeno en el cultivo, por ejemplo, al regular la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de cultivo. Preferiblemente, la aireación del cultivo se controla al agitar el cultivo. La agitación se puede proporcionar por un propulsor o equipo de agitación mecánica similar, al revolver o agitar el recipiente de cultivo (por ejemplo, fermentador) o mediante diversos equipos de bombeo. La aireación se puede controlar adicionalmente por el pasaje de aire estéril o oxígeno a través del medio (por ejemplo, a través de la mezcla de fermentación). También preferiblemente, los microorganismos de la presente invención se cultivan sin exceso de espuma (por ejemplo, por medio de la adición de agentes antiespumantes).
Más aún, se pueden cultivar plantas o microorganismos bajo temperaturas controladas. El término "temperatura controlada" incluye cualquier temperatura que resulta en la producción del producto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado). En una realización, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15° C y 95° C. En otra realización, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15° C y 70° C. Las temperaturas preferidas están entre 20° C y 55° C, más preferiblemente entre 30° C y 45° C o entre 30° C y 50° C.
Los microorganismos se pueden cultivar (por ejemplo, mantener y/o cultivar) en medio líquido y preferiblemente se cultivan, continuamente o intermitentemente, mediante métodos de cultivo convencionales tal como cultivo en pie, cultivo de tubo de ensayo, cultivo de agitación (por ejemplo, cultivo de agitación rotatorio, cultivo de matraz de agitación, etc.), cultivo de centrífuga de aireación, o fermentación. En una realización preferida, los microorganismos se cultivan en matraces de agitación. En una realización más preferida, los microorganismos se cultivan en un fermentador (por ejemplo, un proceso de fermentación). Los procesos de fermentación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, métodos de fermentación continuos, de tanda de carga y de tanda. La frase "proceso de tanda" o "fermentación en tanda" se refiere a un sistema cerrado en el que la composición de medio, nutrientes, aditivos complementarios y similares se establece al inicio de la fermentación y no se somete a alteración durante la fermentación, sin embargo, se pueden hacer intentos para controlar dichos factores como pH y concentración de oxígeno para evitar la acidificación del medio en exceso y/o la muerte del microorganismo. La frase fermentación de "proceso de tanda de carga" o "tanda de carga" se refiere a una fermentación de tanda con la excepción que se agregan uno o más sustratos o complementos (por ejemplo, agregar en aumentos o continuamente) cuando progresa la fermentación. La frase "proceso continuo" o "fermentación continua" se refiere a un sistema en el que se agrega un medio de fermentación definido continuamente a un fermentador y una cantidad igual de medio utilizado o "acondicionado" se retira simultáneamente, preferiblemente para la recuperación del producto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado). Se ha desarrollado una variedad de dichos procesos y se conocen bien en la técnica.
La frase "cultivar bajo condiciones tales que se produce un compuesto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado, por ejemplo, DHA) " incluye mantener y/o cultivar plantas o microorganismos bajo condiciones (por ejemplo, temperatura, presión, pH, duración, etc.) apropiadas o suficientes para obtener la producción del compuesto deseado o para obtener los rendimientos deseados del compuesto particular que se va a producir. Por ejemplo, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para producir la cantidad deseada de un ácido graso insaturado (por ejemplo, DHA). Preferiblemente, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para lograr sustancialmente la producción máxima del ácido graso insaturado. En una realización, el cultivo se continúa durante aproximadamente 12 a 24 horas. En otra realización, el cultivo se continúa durante aproximadamente 24 a 36 horas, 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, 120 a 144 horas, o más de 144 horas. En otra realización, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para lograr los rendimientos de producción de los ácidos grasos insaturados, por ejemplo, las células se cultivan de tal manera que se producen por lo menos aproximadamente 15 a 20 g/L de ácidos grasos insaturados, por lo menos se producen aproximadamente 20 a 25 g/L ácidos grasos insaturados, por lo menos se producen aproximadamente 25 a 30 g/L ácidos grasos insaturados, por lo menos se producen aproximadamente 30 a 35 g/L ácidos grasos insaturados, por lo menos se producen aproximadamente 35 a 40 g/L ácidos grasos insaturados (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 37 g/L ácidos grasos insaturados) o por lo menos se producen aproximadamente 40 a 50 g/L ácidos grasos insaturados. En todavía otra realización, los microorganismos se cultivan bajo condiciones tales que el rendimiento preferido de ácidos grasos insaturados, por ejemplo, un rendimiento en el rango establecido anteriormente, se produce en aproximadamente 24 horas, en aproximadamente 36 horas, en aproximadamente 48 horas, en aproximadamente 72 horas, o en aproximadamente 96 horas.
En la producción de ácidos grasos insaturados, puede ser deseable adicionalmente cultivar células de la presente invención en la presencia de sustratos biosintéticos de ácido graso complementarios. El término "sustrato biosintético de ácido graso complementario" incluye un agente o compuesto que, cuando se pone en contacto con una célula o se incluye en el medio de cultivo de una célula, sirve para mejorar o aumentar la biosíntesis del ácido graso insaturado. Los sustratos biosintéticos de ácidos grasos complementarios se pueden agregar en la forma de una solución o suspensión concentrada (por ejemplo, en un solvente adecuado tal como agua o regulador) o en la forma de un sólido (por ejemplo, en la forma de un polvo). Más aún, los sustratos biosintéticos de ácidos grasos complementarios de la presente invención se pueden agregar como una alícuota única, continuamente o intermitentemente durante un periodo dado.
La metodología de la presente invención puede incluir adicionalmente una etapa para recuperar un compuesto deseado (por ejemplo, un ácido graso insaturado). El término "recuperar" un compuesto deseado incluye extraer, cosechar, aislar o purificar el compuesto del medio de cultivo. La recuperación del compuesto se puede realizar de acuerdo con cualquier metodología de purificación o aislamiento convencional conocida en la técnica que incluye, pero no se limita a, tratamiento con una resina convencional (por ejemplo, resina de intercambio de anión o catión, resina de adsorción no iónica, etc.), tratamiento con un adsorbente convencional (por ejemplo, carbono activado, ácido silícico, gel de sílice, celulosa, alúmina, etc.), alteración del pH, extracción de solvente (por ejemplo, con un solvente convencional tal como un alcohol, acetato de etilo, hexano y similares), diálisis, filtración, concentración, cristalización, recristalización, ajuste de pH, liofilización y similares. Por ejemplo, se puede recuperar un compuesto del medio de cultivo al retirar primero los microorganismos del cultivo. El medio luego se pasa a través o alrededor de una resina de intercambio de catión para retirar cationes indeseados y luego a través o alrededor de una resina de intercambio de anión para retirar los aniones inorgánicos indeseados o ácidos orgánicos que tienen acidificaciones más fuertes que el ácido graso insaturado de interés (por ejemplo, DHA).
Preferiblemente, un compuesto deseado de la presente invención se "extrae," "aísla" o "purifica" de tal manera que la preparación resultante es sustancialmente libre de otros componentes (por ejemplo, libre de componentes de medio y/o subproductos de fermentación). La frase "sustancialmente libre de otros componentes" incluye preparaciones del compuesto deseado en el que el compuesto se separa (por ejemplo, se purifica o se purifica parcialmente) de los componentes del medio o los subproductos de fermentación del cultivo del, que se produce. En una realización, la preparación tiene más de aproximadamente 80 % (en peso seco) del compuesto deseado (por ejemplo, menos de aproximadamente 20 % de otros componentes del medio o subproductos de fermentación), más preferiblemente más de aproximadamente 90 % del compuesto deseado (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 % de otros componentes del medio o subproductos de fermentación), aún más preferiblemente más de aproximadamente 95 % del compuesto deseado (por ejemplo, menos de aproximadamente 5 % de otros componentes del medio o subproductos de fermentación), y más preferiblemente más de aproximadamente 98-99 % del compuesto deseado (por ejemplo, menos de aproximadamente 1-2 % de otros componentes del medio o subproductos de fermentación). Cuando el compuesto deseado es un ácido graso insaturado que se ha derivado a una sal, el compuesto es preferiblemente adicionalmente libre (por ejemplo, sustancialmente libre) de los contaminantes químicos asociados con la formación de la sal. Cuando el compuesto deseado es un ácido graso insaturado que se ha derivado a un alcohol, el compuesto es preferiblemente adicionalmente libre (por ejemplo, sustancialmente libre) de los contaminantes químicos asociados con la formación del alcohol.
En una realización alternativa, el ácido graso insaturado deseado no se purifica de la planta o microorganismo, por ejemplo, cuando la planta o microorganismo es biológicamente no perjudicial (por ejemplo, segura). Por ejemplo, la planta o cultivo completo (o sobrenadante de cultivo) se puede utilizar como una fuente de producto (por ejemplo, producto crudo). En una realización, la planta o sobrenadante de cultivo (o sobrenadante de cultivo) se utiliza sin modificación. En otra realización, la planta o cultivo (o sobrenadante de cultivo) se concentra. En todavía otra realización, la planta o cultivo (o sobrenadante de cultivo) se pulveriza, se seca, o liofiliza.
B. Metodologías de Producción de Alto Rendimiento
Una realización particularmente preferida de la presente invención es un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados, por ejemplo, ADN, que comprende cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones tales que se produce el ácido graso insaturado en un rendimiento significativamente alto. La frase "método de producción de alto rendimiento," por ejemplo, un método de producción de alto rendimiento para producir un compuesto deseado (por ejemplo, para producir un ácido graso insaturado) incluye un método que resulta en la producción del compuesto deseado en un nivel que es elevado o por encima del usual para métodos de producción comparables. Preferiblemente, un método de producción de alto rendimiento resulta en la producción del compuesto deseado en un rendimiento significativamente alto. La frase "rendimiento significativamente alto" incluye un nivel de producción o rendimiento que es suficientemente elevado o por encima del usual para métodos de producción comparables, por ejemplo, que es elevado a un nivel suficiente para la producción comercial del producto deseado (por ejemplo, la producción del producto en un coste comercialmente factible). En una realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta u microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce en un nivel de más de 2 g/L. En otra realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce a un nivel más de 10 g/L. En otra realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce a un nivel de más de 20 g/L. En todavía otra realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce a un nivel más de 30 gIL. En todavía otra realización, la invención caracteriza a método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce a un nivel más de 40 g/L.
La invención caracteriza adicionalmente un método de producción de alto rendimiento para producir un compuesto deseado (por ejemplo, para producir un ácido graso insaturado) que implica cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que se produce un nivel suficientemente elevado del compuesto dentro de un periodo comercialmente deseable. En una realización de ejemplo, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce a un nivel más de 15-20 g/L en 36 horas. En otra realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturados se produce a un nivel de más de 25-30 g/L en 48 horas. En otra realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturados se produce a un nivel más de 35-40 g/L en 72 horas, por ejemplo, mayor de 37 g/L en 72 horas. En otra realización, la invención caracteriza un método de producción de alto rendimiento para producir ácidos grasos insaturados que incluye cultivar una planta o microorganismo manipulado bajo condiciones de tal manera que un ácido graso insaturado se produce a un nivel más de 30-40 g/L en 60 horas, por ejemplo, más de 30, 35 o 40 g/L en 60 horas. Los valores y rangos incluidos y/o intermedios dentro de los rangos establecidos aquí también pretenden estar dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, la producción de ácido graso insaturado en niveles de por lo menos 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39 g/L en 60 horas pretende estar incluida dentro del rango de 30-40 g/L en 60 horas. En otro ejemplo, los rangos de 30-35 g/L o 35-40 g/L pretenden estar incluidos dentro del rango de 30-40 g/L en 60 horas. Más aún, el artesano experto apreciará que cultivar un microorganismo manipulado para lograr un nivel de producción de, por ejemplo, "30-40 g/L en 60 horas" incluye cultivar el microorganismo durante periodos adicionales (por ejemplo, periodos mayores de 60 horas), que resulta opcionalmente en rendimientos incluso mayores de un ácido graso insaturado que se produce.
IV. Composiciones
Las moléculas de ácido nucleico de desaturasa, proteínas, y fragmentos de las mismas, de la invención se pueden utilizar para producir ácidos grasos insaturados que se pueden incorporar en composiciones. Las composiciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, composiciones para uso como alimentos para animal, composiciones para uso como nutracéuticos (por ejemplo, complementos dietarios), y composiciones farmacéuticas adecuadas para administración.
Dichas composiciones farmacéuticas comprenden normalmente un ácido graso insaturado y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aquí la frase "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antifúngicos y antibacterianos, agentes de retraso de absorción e isotónicos, y similares, compatibles con administración farmacéutica. El uso de dicho medio y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto como cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta pretendida de administración. Ejemplos de las rutas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa, y rectal. Las soluciones
o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietileglicoles, glicerina, propileglicol o otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilenidiaminatetraacético; reguladores tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o recipientes de dosis múltiple hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o inyectables estériles o dispersión. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany; NJ) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición puede ser estéril y debe ser fluida al grado que existe fácil inyectabilidad. Esta puede ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuados de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, un LCPUFA, o un fragmento del mismo, producido por el ácido nucleico y las moléculas de proteína de la presente invención) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. De manera general, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado por vacío y secado por congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo.
Las composiciones orales incluyen de manera general un diluyente inerte o un portador comestible. Estas se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en tabletas. Para el propósito administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y se utiliza en la forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas, las composiciones orales también se pueden preparar utilizando un portador fluido para uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y se agita y expectora o ingiere. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o se pueden incluir materiales de adyuvante como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un ligante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un aglutinante tal como dióxido de sílice coloidal; un agente endulzante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o sabor a naranja.
Para la administración mediante inhalación, los compuestos se suministran en la forma de un rociado por aerosol del contenedor o dispensador presionado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser mediante medios transmucosa o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, los penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear se utilizan en la formulación. Dichos penetrantes se conocen de manera general en la técnica, e incluyen por ejemplo, administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede llevar a cabo a través del uso de rociadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, salvas, geles, o cremas como se conocen de manera general en la técnica.
Los compuestos también se pueden preparar en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencional tal como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidas a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos víricos) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Esta especificación para las formas de dosificación unitaria se dicta mediante y directamente dependiente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Se puede determinar la toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal a 50 % de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación de LD50/ED50. Se prefieren compuestos que exhiben índices terapéuticos grandes. Aunque se pueden utilizar compuestos que exhiben efectos colaterales tóxicos, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de suministro que dirige dichos compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por lo que, se reducen efectos colaterales.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y los estudios de animales se pueden utilizar en la formulación de un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de dichos compuestos se basa preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o sin toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en los modelos de animal para lograr un rango de concentración de plasma circulante que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición máxima media de síntomas) como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar más exactamente dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño.
Como se define aquí, una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína o polipéptido (es decir, una dosificación efectiva) varía de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente aproximadamente 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, e incluso más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg, o 5 a 6 mg/kg de peso corporal. El artesano experto apreciará que ciertos factores pueden influenciar la dosificación requerida para tratar efectivamente un sujeto, que incluye pero no se limita a la severidad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Más aún, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína, polipéptido, o anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.
En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con un LCPUFA en el rango de entre aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana entre aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 a 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5, o 6 semanas. También se apreciará que la dosificación efectiva del anticuerpo, proteína, o polipéptido utilizado para el tratamiento se puede aumentar o reducir durante el curso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar y serán evidentes a partir de los resultados de los ensayos diagnósticos como se describe aquí.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, empaque, o dispensador junto con instrucciones para administración.
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se deben constituir como limitantes.
EJEMPLOS
Materiales: Se compra Pythium irregulare del American type culture collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 USA) y se cultiva en un medio (Weete, J.D., et al. (1997) Lipids 32:839-845) a 24° C durante 7 días. Después se cosechan biomasas mediante centrifugación y se utilizan para aislamiento de ARN.
EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y DETECCIÓN DE LA COLECCIÓN DE cADN
El ARN total se aísla de los materiales anteriores de acuerdo con Qiu y Erickson (Qiu, X. and Eriekson, L. (1994) Plant Mol. Biol. Repr. 12:209-214). La colección de cADN se construye del ARN total. La primera hebra de cADN se sintetiza mediante transcriptasa inversa superíndice II de Gibco-BRL. La segunda hebra de cADN se sintetiza mediante polimerasa I de ADN de Stratagene. Después de fraccionamiento de tamaño, los insertos de cADN mayores de 1 kb se ligan en el vector A Uni-Zap XR (Stratagene). Los ADN recombinantes luego se empacan con extracto de empaque Gigapack III Gold (Stratagene) y se colocan en placas en placas NZY. La colección resultante representa más de 5 x 106 clones independientes. La detección de la colección de cADN se realiza de acuerdo con métodos estándar (Sambrook, J, Fritseh, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning - A laboratory manual. (Cold Spring Harbor, New York, USA.)
EJEMPLO 2: RT-PCR
El cADN de hebra sencilla se sintetiza mediante transcriptasa inversa superscript II (Gibco-BRL) de ARB total y luego se utiliza como la plantilla para la reacción PCR con dos cebadores degenerados (El cebador delantero: GCXCA/GAXGAXCAC/ TCCXGGXGG y el cebador inverso: ATXTG/TXGGA/GA.AXAG/AG/ATGG/ATG). La amplificación PCR consiste de 35 ciclos con 1 min a 94° C, 1.5 min a 55 °C y 2 min a 72 °C seguido por una etapa de extensión a 72 °C durante 10 min. Los productos amplificados de 800 bp a 1000 bp se aíslan de gel de agarosa y se purifican mediante un equipo (purificación del gel Qiaex II, Qiagen), y se clonan posteriormente en el vector de clonación ta pCR®2.1 (Invitrogen). Los insertos clonados luego se secuencian mediante PRISM DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing System (Perkin Elmer/Applied Biosystems).
EJEMPLO 3: EXPRESIÓN DE FAD6 EN LEVADURA
Los marcos de lectura abiertos de Fad6 se amplifican mediante PCR utilizando la enzima Precision Plus (Stratagene) y se clonan en un vector de clonación ta (pCR®2.1, Invitrogen). Se ha confirmado que los productos PCR son idénticos a los cADN originales mediante secuenciamiento, los fragmentos luego se liberan mediante una digestión doble BarnHI-EcoRI y se insertan en el vector de expresión de levadura pYES2 (Invitrogen) bajo el control del promotor inducible GAL1.
Las cepas de levadura InvSc2 (Invitrogen) se transforman con las construcciones de expresión utilizando el método de acetato de aluminio y los transformantes se seleccionan en placas de medio mínimo que carecen de uracilo (Gietz, D., et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1425; Covello, P.S. y Reed, D.W. (1996) Plant Physiol. 111:223-226).
Los transformantes primero se cultivan en medio mínimo que carece de uracilo y que contiene glucosa a 28° C. Después de cultivo durante la noche, las células se centrifugan, se lavan y se resuspenden en agua destilada. El medio mínimo que contiene 2 % de galactosa, con o sin 0.3 mM ácidos grasos de sustrato en la presencia de 0.1 % de tergitol, se inocula con la suspensión celular de transformante de levadura y se incuba a 20° C durante tres días, y luego 15 °C durante otros tres días.
EJEMPLO 4: ANÁLISIS DE ÁCIDO GRASO
Se cosechan Pythium irregulare y células de levadura y se lavan dos veces con agua destilada. Luego se agrega 2 mL de KOH metanólico (7.5 % w/v de KOH en 95 % de metanol) a los materiales y la mezcla que se sella en un tubo de cultivo de vidrio de 12 ml se calienta a 80° C durante 2 horas. Se agrega 0.5 mL de agua y la muestra se extrae dos veces con 2 mL de hexano para retirar los lípidos no saponificables. La fase acuosa restante luego se acidifica al agregar 1 mL de 6 N HCl y se extrae dos veces con 2 mL de hexano. Las fases de hexano se combinan y se secan bajo una corriente de nitrógeno. Se agrega 2 mL de 3 N HCl metanólico (SUPELCO, Supelco Park, Bellefonte, PA 16823-0048) y la mezcla se calienta a 80° C durante 2 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agrega 1 mL de 0.9 % de NaCI y la mezcla se extrae dos veces con 2 x 2 mL de hexano. El hexano combinado se evapora bajo nitrógeno. Los metil ésteres de ácido graso resultantes (FAME) se analizan mediante GC y GC-MS de acuerdo con Covello & Reed (Covello, P.S. y Reed, D.W. (1996) Plant Physiol. 111: 223-226).
Se realiza análisis GC/MS en modo EI estándar utilizando un espectrómetro de masa Fisons VG TRIO 2000 (VG Analytical, UK) controlado por el software Masslynx versión 2.0, acoplado con un cromatógrafo de gas Serie GC 8000. Una columna DB- 23 (30M x 0.25 mm i.d., 0.25 Ilm de espesor de película, J&W Scientific, Folsom, CA) que se programa en temperatura a 180 °C durante 1 min, luego 4 C /min a 240 °C y se mantiene durante 15 minutos, se utiliza para análisis FAME.
EJEMPLO 5: TRANSFORMACIÓN DE BRASSICA JUNCEA Y LINO (LINUM USITATISSIMUM) Y TRATAMIENTOEXÓGENO DE ÁCIDO GRASO
Las hipocotiledóneas de plántulas de 5-6 días de B. juncea y lino se utilizan como explantes para inoculación con el Agrobacterium tumefaciens que aloja vectores binarios con los cADN de longitud completa bajo el control de los diferentes promotores. Se utilizan plántulas transgénicas de 20 días para el tratamiento exógeno de ácido graso. La plántula se divide en tres partes: hojas, tallos y raíces. Cada una se corta en piezas pequeñas y se pone en una placa de título de 24 pozos. A cada pozo, se agrega 2 mL de 0.05 % de sal de sodio de sustratos (NuCheck Prep Inc., Elysian, MN). La placa luego se incuba a 24° C durante 4 h con agitación gentil. Después de incubación, los tejidos de planta se lavan tres veces con agua y luego se utilizan para análisis de ácido graso.
EJEMPLO 6: PERFIL DE ÁCIDO GRASO DEL THRAUSCHYTRIUM SP.
El Thraustochytrium y Pythium irregulare ha llamado recientemente la atención de los científicos debido a su capacidad en la producción de LCPUFA tal como DHA, AA, EPA y DPA. La figura 8 muestra la composición de ácido graso de los lípidos aislados de cultivos de 7 días de Pythium irregulare. Como se muestra en las tablas, el microorganismo contiene un amplio rango de ácidos grasos poli-insaturados, de las familias n-3 y n-6, de ácidos grasos A6 de 18 carbonos (ácido gama- linolénico y ácido esteardónico). El organismo, especialmente Thraustochytrium sp., parece contener un conjunto completo de enzimas de desaturación y elongación requeridas para la biosíntesis de DHA y DPA. La cepa carece de ácidos grasos poli-insaturados de 24 carbonos, los
5 precursores propuestos para la síntesis de DHA y DPA en la ruta de Precher (Voss, A., et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:19995-20000; Mohammed, B.S., et al. (1997) Biochem. J. 326: 425-430). El ácido graso de 24 carbonos no puede estar implicado en la síntesis in vivo de ácidos grasos M4 de 22 carbonos tal como DHA y DPA en Thraustochytrium sp.
EJEMPLO 7: IDENTIFICACIÓN DE cADN QUE CODIFICAN LA DESATURASA DE "EXTREMO FRONTAL"
10 Para identificar los genes que codifican las desaturasas implicadas en la biosíntesis de LCFUFA en Pythium irregulare, se adopta una estrategia de clonación basada en PCR. Se diseñan dos cebadores degenerados para dirigir el motivo de unión hemo de la extensión de terminal N del dominio similar a cyt b5 en las desaturasas de extremo frontal y el tercer motivo de histidina conservador en todas las desaturasas microsómicas, respectivamente. La parte racional entre el diseño es que las desaturasas implicadas en la biosíntesis EPA y DHA en Pythium
15 irregulare, deben tener estructura primaria similar como otras desaturasas de extremo frontal, es decir extensión de terminal N del dominio similar a cyt b5 en la desaturasa. Se identifican cuatro fragmentos de cADN de Pythium irregulare que codifican las proteínas de fusión que contienen el dominio similar a cyt b5 en el terminal N.
Para aislar los clones de cADN de longitud completa, se utilizan cuatro insertos como sondas para detectar colecciones de cADN de Pythium irregulare, que resulta en la identificación de diversos clones de cADN en cada
20 grupo. El secuenciamiento de todos aquellos clones identifica cuatro cADN de longitud completa que se denominan como Fad4, Fad5, Fad5-2 y Fad6. El marco de lectura abierto de Fad5-2 de Pythium irregulare es 1371 bp y los códigos para 456 aminoácidos (Figura 1). El Fad6 de Pythium irregulare tiene 1383 bp de longitud y codifica 460 aminoácidos (Figura 2). La comparación de secuencia de las dos secuencias de Pythium irregulare muestran cerca de 39 % de similitud entre las proteínas deducidas (Figura 3).
25 Una búsqueda BLASTP™ de la base de datos de proteínas revela los siguientes hits para Fad6:
Fad 6 (459 residuos de aminoácido)
Blastp nr
No. de Acceso
Organismo Descripción Longitud % de Identidad
AF110510
Mortierella alpina Desaturasa de ácido graso M6 437 38
AB020032
Mortierella alpina Desaturasa de ácido graso M6 437 38
AF306634
Mortierella isabellina Desaturasa de ácido graso M6 437 38
AF307940
Mortierella alpina Desaturasa de ácido graso M6 438 38
AJ250735
Ceratodon purpureus Desaturasa de ácido graso M6 438 36
EJEMPLO 8: EXPRESIÓN DE FAD6 EN LEVADURA
30 Para confirmar la función de Fad6, la cepa anfitriona S. cerevisiae Invsc2 se transforma con un plásmido que contiene el marco de lectura abierto de Fad6 bajo el control del promotor inducible de galactosa, GAL1. Cuando el transformante de levadura se induce mediante galactosa en un medio que contiene ácido linoleico, se observa un pico extra en el cromatograma del FAME acumulado en los transformantes comparados con el control (Figura 4). Una comparación del cromatográma con aquellos estándares revelados que el pico tiene un tiempo de retención
35 idéntico al ácido gama- linolénico estándar (GLA, 18: 3-6,9,12). Para confirmar la regioselectividad de los productos, los derivados de dietilamina de los ácidos grasos de la cepa expresada se analizan mediante GC-MS. La figura 15 24
muestra que el nuevo pico es de hecho GLA con tres enlaces dobles en las posiciones M6, M9, y M12. Los fragmentos principales de los carbonos n y n+1 que difieren por 12 D son diagnósticos de un enlace doble entre el carbono n+1 y n+2. Sin embargo, los fragmentos a 156 y 168, 196 y 208, y 236 y 248, indican enlaces dobles en las posiciones M6, M9, y M12, respectivamente. Estos resultados demuestran que el Fad6 es una desaturasa M6 que se convierte de ácido linoleico (18:2) a GLA en levadura.
EJEMPLO 9: EXPRESIÓN DE FAD6 EN LINO
Para producir ácidos grasos M6 desaturados en semillas de lino, se transforman dos tipos de lino con la construcción que contiene cADN Fad6 bajo el control de un promotor específico de semilla heterólogo (promotor napina B. napus). (Normandy) es un cultivo de oleaginosa industrial tradicional, mientras que el Tipo II (Solin) es un cultivo de oleaginosa derivado de mutagenia química del Tipo I. Se produce un total de veinte plantas transgénicas. La mayoría de transgénicos exhiben dos ácidos grasos novedosos cuyos tiempos de retención corresponden a GLA y SDA y constituyen 0.1 a 4.3 % de los ácidos grasos totales (Figura 10). El nivel de GLA en el tipo Solin transgénico es mayor que aquel del SDA, mientras que el GLA en Normandy transgénico es menor de SDA. Es compresible debido a que el ácido linoleico es un ácido graso principal en semilla de lino Solin mientras que el ácido a-linolenico es un ácido graso principal en semillas Normandy.
EJEMPLO 10: EXPRESIÓN DE FAD6 EN B. JUNCEA
Para producir ácidos grasos M6 desaturados en semillas de B. juncea, B. juncea se transforman con la misma construcción utilizada en transformación de lino, es decir, Fad6 bajo el control del promotor napina B. napus. Se obtienen quince plantas transgénicas independientes. El análisis de ácido graso de las semillas transgénicas muestra que existen tres nuevos ácidos grasos en el cromatograma de gas de la mayor parte de transgénicos comparado con el control tipo natural (Figura 6). Se identifican tres ácidos grasos como 18:2(6,9) y 18:3(6,9,12), y 18:4(6,9,12,15). B. juncea, como lino, que también pueden expresar funcionalmente Fad6 de P. irregulare, introducir un enlace doble en la posición 6 del sustrato endógeno 18:1 (9), 18:2(9,12), y 18:3(6,9,12) que resulta en la producción de los ácidos grasos M6 correspondientes en las semillas transgénicas. Entre los tres nuevos ácidos grasos producidos en semillas transgénicas, el GLA es el más abundante uno, con un nivel en semillas transgénicas de 30 % a 38 % de los ácidos grasos totales. El siguiente componente más abundante es SDA, que cuenta para 310 % de los ácidos grasos totales en diversas estirpes transgénicas (Figura 7).
Las composiciones de ácido graso de las semillas transgénicas se muestran en la figura 8. Es claro que el alto nivel de producción de ácidos grasos M6 desaturados está en el coste de los dos ácidos grasos principales, ácido linoleico y ácidos linolénicos. Las proporciones de los ácidos oleicos y esteáricos en los transgénicos se reducen ligeramente, pero no se compara significativamente con aquellas en el control tipo natural. El contenido de ácido linoleico en los transgénicos se reduce dramáticamente. En el tipo natural no transformado, el ácido linoleico cuenta más de 40 % de los ácidos grasos totales en las semillas. En los transgénicos, el nivel se reduce a menos de 10 %. Como se compara con la reducción del ácido linoleico en los transgénicos, la reducción del ácido linolénico en los transgénicos es menos dramática, pero aún significativa. En el tipo natural no transformado, el ácido linolénico cuenta para más de 10 % de los ácidos grasos totales en las semillas mientras que en los transgénicos el nivel se reduce a menos de 5 %. Los dos ácidos grasos dramáticamente reducidos en semillas transgénicas son los sustratos de la desaturasa M6, y la reducción es el coste para producir dos ácidos grasos M6 desaturados correspondientes.
Equivalentes
Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas aquí.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Bioriginal Food & Science Corp. et al.
<120> FAD4, FAD5, FAD5-2, y FAD6, MIEMBROS NOVEDOSOS DE LA FAMILIA DE DESATURASA DE ÁCIDO GRASO Y USOS DE LOS MISMOS
<130> BNZ-001PC
<140> PCT/IB01/02346
<141> 2001-09-28
<150> 60/236,303
<151> 2000-09-28
<150> 60/297,562
<151> 2001-06-12 5 <160> 10
<170> FastSEQ para Versión windows 4.0
<210> 1
<211> 1560
<212> ADN 10 <213> Thraustochytrium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1560)
<221> variante 15 <222> 462
<223> Xaa = Gly
<400> 1
<210> 2
<211> 519
<212> PRT 5 <213> Thraustochytrium sp.
<220>
<221> VARIANTE
<222> 462
<223> Xaa = Gly 10 <400> 2
<210> 3
<211> 1320
<212> ADN
<213> Thraustochytrium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1320)
<400> 3
<210> 4
<211> 439
<212> PRT
<213> Thraustochytrium sp.
<400> 4
<210> 5
<211> 1371
<212> ADN
<213> Thraustochytrium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1368)
<400> 5
<210> 6
<211> 456
<212> PRT
<213> Thraustochytrium sp.
<400> 6
<210> 7
<211> 1380
<212> ADN
<213> Thraustochytrium sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1380)
<400> 7
<210> 8
<211> 459
<212> PRT
<213> Thraustochytrium sp.
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<221> misc_feature
<222> 3, 8, 11, 18, 21
<223> n = A, T, C o G 5 <400> 9 gcncaganga ncactccngg ngg 23
<210> 10
<211> 25
<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<221> misc_feature
<222> 3, 7, 14 15 <223> n = A, T, C o G
<400> 10 atntgtngga gaanagagat ggatg 25

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de
    a) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma;
    b) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma;
    c) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6;
    d) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma, en donde el polipéptido tiene una actividad desaturasa M6;
    e) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6;
    f) una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones exigentes al complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6; y
    g) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa M6.
  2. 2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el polipéptido o fragmento que tiene una actividad desaturasa M6 codificada por la molécula de ácido nucleico comprende por lo menos un motivo representado por los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de los residuos 42-47 de la SEQ ID NO: 8, los residuos 178-183 de la SEQ ID NO: 8, los residuos 215-220 de la SEQ ID NO: 8 y los residuos 400-405 de la SEQ ID NO: 8; o en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende por lo menos uno de un motivo de unión hemo o un motivo histidina que tiene por lo menos dos residuos de aminoácido histidina;
    o en donde la molécula de ácido nucleico codifica una molécula de desaturasa de ácido graso M6 capaz de convertir ácido linoleico (18:2) a ácido gama linoleico (GLA) (18:3(6,9,12)) o ácido a-linolenico (ALA) (18:3) a ácido estearidónico (SDA) (18:4(6,9,12,15)).
  3. 3.
    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el vector es opcionalmente un vector de expresión.
  4. 4.
    Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 3, en donde la célula se selecciona opcionalmente del grupo que consiste de una célula de planta, una célula microbiana, y una célula de animal.
  5. 5.
    La célula anfitriona de la reivindicación 4, en donde la célula de planta es una célula obtenida de un cultivo de oleaginosa seleccionado del grupo que consiste de lino (Linum sp.), Brassica napus, Brassica juncea, semilla de colza (Brassica sp.), soja (Glycine y Soja sp.), girasol (Helianthus sp.), algodón (Gossypium sp.), maíz (Zea mays), oliva (Olea sp.), alazor (Carthamus sp.), cacao (Theobroma cocoa), y cacahuete (Arachis sp.), o en donde la célula microbiana se selecciona del grupo que consiste de Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium, y Crythecodinium.
  6. 6.
    Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de
    a) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8;
    b) un polipéptido aislado codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;
    c) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;
    d) un polipéptido aislado que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6; y
    e) un polipéptido aislado que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa M6.
  7. 7.
    Un método para producir el polipéptido aislado de la reivindicación 6, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 4 para producir dicho polipéptido.
  8. 8.
    El polipéptido aislado de la reivindicación 6, en donde el polipéptido comprende por lo menos un motivo representado por los residuos de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de los residuos 42-47 de la SEQ ID NO: 8, los residuos 178-183 de la SEQ ID NO: 8, los residuos 215-220 de la SEQ ID NO: 8 y los residuos 400-405 de la SEQ ID NO: 8; o en donde el polipéptido comprende por lo menos uno de un motivo de unión hemo o un motivo histidina que tiene por lo menos dos residuos de aminoácido histidina; o en donde el polipéptido es una molécula de desaturasa de ácido graso M6 capaz de convertir ácido linoleico (18:2) a ácido gama linoleico (GLA) (18:3(6,9,12)) o ácido a-linolenico (ALA) (18:3) a ácido estearidónico (SDA) (18:4(6,9,12,15)).
  9. 9.
    Un método para producir un ácido graso insaturado que comprende (i) cultivar o cosechar la célula anfitriona de la reivindicación 4 bajo condiciones de tal manera que se produce el ácido graso insaturado, o (ii) poner en contacto una composición que comprende por lo menos una molécula objetivo desaturasa con por lo menos un polipéptido aislado de la reivindicación 6 bajo condiciones de tal manera que se produce el ácido graso insaturado, o
    (iii) transfectar o transformar una célula con la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 y cultivar o cosechar la célula bajo condiciones de tal manera que se produce el ácido graso insaturado.
  10. 10.
    Un método para mejorar la producción de un ácido graso insaturado que comprende cultivar o cosechar la célula anfitriona de la reivindicación 4, de tal manera que se mejora la producción de un ácido graso insaturado.
  11. 11.
    Un método para producir una célula capaz de generar un ácido graso insaturado que comprende introducir dentro de dicha célula la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una desaturasa que tiene una actividad de catalizar la formación de un enlace doble en una cadena grasa acilo.
  12. 12.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el ácido graso insaturado se selecciona del grupo que consiste de GLA (18:3(6,9,12)), SDA (18:4(6,9,12,15)), AA (20:4(5,8,11,14)) y EPA (20:5(5,8,11,14,17)).
  13. 13.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende adicionalmente recuperar el ácido graso insaturado.
  14. 14.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9, parte (i) o (ii), o 10-11, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula de planta, por ejemplo, una planta de oleaginosa, una célula de animal y una célula microbiana.
  15. 15.
    El método de la reivindicación 14, en donde la planta de oleaginosa se selecciona del grupo que consiste de lino (Linum sp.), semilla de colza (Brassica sp.), soja (Glycine y Soja sp.), girasol (Helianthus sp.), algodón (Gossypium sp.), maíz (Zea mays), oliva (Olea sp.), alazor (Carthamus sp.), cocao (Theobroma cocoa), y cacahuete (Arachis sp.).
  16. 16.
    Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 6.
  17. 17.
    Una composición que comprende la célula producida por el método de la reivindicación 11.
  18. 18.
    La composición de la reivindicación 16 para uso como un complemento dietario o para uso como alimento para animal.
  19. 19.
    La composición de la reivindicación 16 para uso en el tratamiento de un paciente que tiene un trastorno, en donde el trastorno se selecciona opcionalmente del grupo que consiste de estrés, diabetes, cáncer, trastornos inflamatorios, y trastornos cardiovasculares.
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Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6566583B1 (en) * 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US20070244192A1 (en) * 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US7247461B2 (en) * 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7211418B2 (en) * 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7217856B2 (en) * 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
EP1392823B1 (en) * 2001-01-25 2011-11-30 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
TWI324181B (en) * 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7045683B2 (en) * 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
DE10137374A1 (de) * 2001-07-31 2003-02-27 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure in transgenen Organismen
CN1267174C (zh) 2001-12-12 2006-08-02 马泰克生物科学博尔德公司 从含油种子和微生物来源提取和冬化脂类的方法
BRPI0311324B1 (pt) 2002-05-22 2020-01-28 Monsanto Technology Llc polinucleotídeo, vetor, polipeptídeo com atividade dessasturase, métodos para produção de planta e óleo de milho contendo ácidos graxos de ômega-3, para aumentar o valor nutricional de um produto comestível, de fabricação de alimento ou alimentação, bem como composição comestível
US7485414B2 (en) * 2002-08-30 2009-02-03 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Modulators of angiogenesis
US8084074B2 (en) 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
CA2520396C (en) * 2003-03-26 2016-08-09 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
AU2004227075B8 (en) * 2003-04-08 2009-07-16 Basf Plant Science Gmbh Delta-4 Desaturases from Euglena gracilis, expressing plants, and oils containing PUFA
EP1654344B1 (de) 2003-08-01 2018-10-17 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
AU2004268196B2 (en) 2003-08-21 2010-03-04 Monsanto Technology Llc Fatty acid desaturases from primula
EP1685239B1 (en) 2003-11-12 2014-05-21 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast
CN1930277B (zh) 2004-02-27 2011-02-02 巴斯福植物科学有限公司 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法
ES2375363T3 (es) 2004-02-27 2012-02-29 Basf Plant Science Gmbh Método para la preparación de ácidos grasos omega-3 insaturados en organismos transgénicos.
JP2007533310A (ja) * 2004-04-16 2007-11-22 モンサント テクノロジー エルエルシー トウモロコシにおける脂肪酸デサチュラーゼの発現
CA3023314C (en) 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
JP4955540B2 (ja) 2004-06-04 2012-06-20 フラクスオーム サイエンセズ エイ／エス 多価不飽和脂肪酸生産のための代謝改変細胞
US7256033B2 (en) 2004-06-25 2007-08-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
DK1780275T3 (da) 2004-07-12 2011-02-21 Suntory Holdings Ltd Polypeptid med en delta5-fedtsyre-desaturationsaktivitet, polynukleotid kodende for polypeptidet og anvendelse deraf
US7138391B2 (en) * 2004-08-09 2006-11-21 Silverbrook Research Pty Ltd Hydrophilizable and hydrophilic cyanine dyes
CA2598792A1 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
ES2576986T3 (es) 2005-06-07 2016-07-12 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucariotas para la producción de lípidos y antioxidantes
DE102005038036A1 (de) * 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
CA2625855C (en) 2005-11-23 2016-04-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
MX2008011351A (es) * 2006-03-03 2008-09-15 Monsanto Technology Llc Medios para mejorar la salud cardiovascular.
AU2007226511A1 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Dsm Ip Assets B.V. Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
JP5531324B2 (ja) 2006-08-01 2014-06-25 ディーエスエム ニュートリショナル プロダクツ アーゲー 油生産微生物およびその改変方法
WO2008025068A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
WO2008029909A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Kaneka Corporation Composition comprising reduced coenzyme q10 and lysolecithin
JP5101894B2 (ja) * 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US8828690B2 (en) * 2007-04-03 2014-09-09 E I Du Pont De Nemours And Company Multizymes comprising delta-9 elongase and delta-8 desaturase and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7943365B2 (en) 2007-05-03 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2171049A4 (en) * 2007-07-13 2010-12-29 Ocean Nutrition Canada Ltd D4 DESATURASES AND D5 ELONGASES
CN101952452B (zh) * 2007-12-11 2014-07-09 合成基因组公司 通过光合微生物分泌脂肪酸
US8119784B2 (en) * 2008-04-02 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-4 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
DE112009001585T5 (de) 2008-07-01 2012-02-23 Basf Plant Science Gmbh Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression
US8148121B2 (en) * 2008-08-01 2012-04-03 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ6 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP3260544A1 (en) 2008-11-18 2017-12-27 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
CN104263729B (zh) * 2009-03-16 2020-09-15 帝斯曼知识产权资产有限公司 在网粘菌门微生物中产生蛋白质
EP2408797B1 (en) * 2009-03-19 2017-03-15 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
US20100272875A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Monsanto Technology Llc Omega-3 enriched cereal, granola, and snack bars
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
AU2010257729B2 (en) 2009-06-08 2016-03-24 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongation components and uses thereof
WO2011008565A1 (en) 2009-06-29 2011-01-20 Synthetic Genomics, Inc. Acyl-acp thioesterase genes and uses therefor
CA3037072C (en) 2009-07-17 2022-07-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
CN106222166B (zh) 2009-08-31 2020-09-08 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子
CN102725405B (zh) * 2009-09-24 2015-08-19 国立大学法人九州大学 原生藻菌的转化方法
WO2011064183A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongase and uses thereof
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
WO2011161093A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses therof in fatty acid production
WO2012052468A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses therof
JP2012096498A (ja) * 2010-11-05 2012-05-24 Tomoegawa Paper Co Ltd 両面印刷用熱転写受像シートおよびその製造方法
CN102559710B (zh) * 2011-06-27 2013-10-30 中国农业科学院油料作物研究所 等鞭金藻δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法
JP6242882B2 (ja) 2012-06-15 2017-12-06 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の産生
AU2013298113A1 (en) 2012-08-03 2015-01-29 Basf Plant Science Company Gmbh Novel enzymes, enzyme components and uses thereof
CN105189740B (zh) * 2013-03-13 2019-01-15 帝斯曼营养品股份公司 工程化微生物
EP3795686A3 (en) 2013-07-05 2021-06-23 Basf Plant Science Company GmbH Gene expression or activity enhancing elements
US10329541B2 (en) 2013-12-17 2019-06-25 Basf Plant Science Company Gmbh Methods for conversion of the substrate specificity of desaturases
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
US10760089B2 (en) 2014-11-14 2020-09-01 Basf Plant Science Company Gmbh Materials and methods for increasing the tocopherol content in seed oil
CN107236679A (zh) * 2017-04-27 2017-10-10 广州弘宝元生物科技有限公司 一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法
AU2019252523A1 (en) * 2018-04-13 2020-11-12 Basf Plant Science Company Gmbh Method of cultivating lc-pufa containing transgenic brassica plants
AU2020223182A1 (en) 2019-02-14 2021-09-09 Basf Plant Science Company Gmbh Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids
WO2022098631A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Cargill, Incorporated Harvest management
EP4312517A1 (en) 2021-03-25 2024-02-07 BASF Plant Science Company GmbH Fertilizer management

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8025A (en) * 1851-04-08 Apparatus eor boltiitg flouk
US4873191A (en) * 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
NL8200523A (nl) * 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4441972A (en) * 1983-04-08 1984-04-10 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4476004A (en) * 1983-04-08 1984-10-09 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4806476A (en) * 1983-09-08 1989-02-21 Lovelace Medical Foundation Efficient cell fusion process
US4608339A (en) * 1983-10-25 1986-08-26 Yoakum George H Protoplast fusion method for high-frequency DNA transfection in human cells
US4736866A (en) * 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
FR2569723B1 (fr) * 1984-08-31 1986-09-19 Centre Nat Rech Scient Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique
US4686186A (en) * 1984-09-26 1987-08-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant vector and eukaryotic host transformed thereby
US5223263A (en) * 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
US4970162A (en) * 1985-11-13 1990-11-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human-mouse hybrid cell line expressing monocyte-macrophage properties
US4935350A (en) * 1985-11-18 1990-06-19 Amgen Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability
US4784737A (en) * 1986-04-18 1988-11-15 The United States Department Of Energy Electromicroinjection of particles into living cells
US4923814A (en) * 1986-05-09 1990-05-08 Electropore, Inc. High speed, high power apparatus for vesicle prealignment, poration, loading and fusion in uniform electric fields and method therefor
US4906576A (en) * 1986-05-09 1990-03-06 Electropore, Inc. High speed, high power apparatus for vesicle prealignment, poration, loading and fusion in uniform electric fields and method therefor
US5215914A (en) * 1986-06-18 1993-06-01 American Registry Of Pathology Adherent and invasive mycoplasma
US5364761A (en) * 1986-07-24 1994-11-15 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Method for isolating a DNA encoding an autonomously replicating sequence
US4801540A (en) * 1986-10-17 1989-01-31 Calgene, Inc. PG gene and its use in plants
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4997764A (en) * 1987-04-23 1991-03-05 New York University Transformation of human B-lympocytes with Epstein Barr virus and c-myc containing vectors
US5063162A (en) * 1987-04-24 1991-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Process for isolating nucleic acids utilizing protease digestion
CA1297431C (en) * 1987-04-24 1992-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the isolation of nucleic acids
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
DE3730246A1 (de) * 1987-09-09 1989-06-01 Boehringer Mannheim Gmbh Expressionsvektor und verfahren zur expression von heterologen proteinen in saeugerzellen
JP2798459B2 (ja) * 1988-01-21 1998-09-17 マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー エレクトロポレーションを利用した診断装置及び分子の組織内移動装置
US4955378A (en) * 1988-05-02 1990-09-11 University Of South Florida Apparatus and methods for performing electrofusion at specific anatomical sites
US5162215A (en) * 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
GB8823068D0 (en) * 1988-09-30 1988-11-09 Ici Plc Recombinant dna
US5175384A (en) * 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5272262A (en) * 1989-06-21 1993-12-21 City Of Hope Method for the production of catalytic RNA in bacteria
US5144019A (en) * 1989-06-21 1992-09-01 City Of Hope Ribozyme cleavage of HIV-I RNA
US5501967A (en) * 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
GB8918226D0 (en) * 1989-08-09 1989-09-20 Wellcome Found Dna assays
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5434086A (en) * 1989-08-22 1995-07-18 The Regents Of The University Of Michigan Method of testing potential cystic fibrosis treating compounds using cells in culture
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5149796A (en) * 1989-08-31 1992-09-22 City Of Hope Chimeric DNA-RNA catalytic sequences
EP0497922B1 (en) * 1989-10-24 2002-01-30 Chiron Corporation Infective protein delivery system
WO1991007489A1 (en) * 1989-11-22 1991-05-30 Childrens Hospital Of Los Angeles Bcr/abl transgenic animals as models for philadelphia chromosome positive chronic myelogenous and acute lymphoblastic leukemia
US5292658A (en) * 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US5436392A (en) * 1990-01-12 1995-07-25 Arizona Technology Development Corporation Transgenic plants expressing M. sexta protease inhibitor
CA2042093C (en) * 1990-05-09 2002-12-24 Gyula Hadlaczky Cell line carrying an excess of mammalian centromeres
EP0647268B1 (en) * 1990-06-15 2004-03-03 Scios Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
DE69133557D1 (de) * 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5470730A (en) * 1990-09-28 1995-11-28 Immunex Method for producing TH -independent cytotoxic T lymphocytes
US5382524A (en) * 1990-10-24 1995-01-17 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-n-acetylgalactosaminidase
JPH05503636A (ja) * 1990-10-25 1993-06-17 ホジソン，クラーグ　ピトマン レトロトランスポゾンを用いた遺伝子導入法
US5300431A (en) * 1991-02-26 1994-04-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Positive selection vector for the bacteriophage P1 cloning system
US5461032A (en) * 1991-03-01 1995-10-24 Fmc Corporation Insecticidally effective peptides
US5482928A (en) * 1991-03-11 1996-01-09 Imperial Chemical Industries Plc Biocidal proteins
US5240840A (en) * 1991-04-05 1993-08-31 Regents Of The University Of Michigan Dna superfragment cloning
US5468634A (en) * 1991-06-24 1995-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Axl oncogene
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5288625A (en) * 1991-09-13 1994-02-22 Biologic Research Center Of The Hungarian Academy Of Sciences Mammalian artificial chromosomes
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
PH31293A (en) * 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
CA2098498A1 (en) * 1991-10-15 1993-04-16 Ning-Sun Yang Particle-mediated transformation of mammalian unattached cells
US5246842A (en) * 1991-10-30 1993-09-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of eicosapentaenoic acid from filamentous fungi utilizing lactose as a primary carbon source
US5260191A (en) * 1992-01-30 1993-11-09 Agracetus, Inc. Method for diagnosing tumors
US5266600A (en) * 1992-02-28 1993-11-30 Bristol-Myers Squibb Company BU-4641V, an antibacterial, antiviral and antitumor antibiotic
JP3314241B2 (ja) * 1992-04-06 2002-08-12 ヤマハ発動機株式会社 自動二輪車用エンジンの排気浄化装置
US5501662A (en) * 1992-05-22 1996-03-26 Genetronics, Inc. Implantable electroporation method and apparatus for drug and gene delivery
CA2100116C (en) * 1992-07-09 2001-09-18 Joseph M. Jilka Virus resistant plants
US5453357A (en) * 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5449604A (en) * 1992-10-21 1995-09-12 University Of Washington Chromosome 14 and familial Alzheimers disease genetic markers and assays
US5496731A (en) * 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
US5468615A (en) * 1993-07-01 1995-11-21 The Upjohn Company Binding assay employing a synthetic gene for D4 dopamine receptors
US5413914A (en) * 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
US5457182A (en) * 1994-02-15 1995-10-10 Merck & Co., Inc. FK-506 cytosolic binding protein, FKBP12.6
IT1274168B (it) 1994-04-15 1997-07-15 Eniricerche Spa Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe
US5625130A (en) * 1995-03-07 1997-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Oilseed Brassica bearing an endogenous oil wherein the levels of oleic, alpha-linolenic, and saturated fatty acids are simultaneously provided in an atypical highly beneficial distribution via genetic control
US5543319A (en) * 1995-03-31 1996-08-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Recombination-proficient avian/mammalian microcell hybrids
US5721118A (en) * 1995-10-31 1998-02-24 The Regents Of The University Of California, San Diego Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US6133503A (en) * 1995-10-31 2000-10-17 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US6077697A (en) * 1996-04-10 2000-06-20 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US6025155A (en) * 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
WO1998003671A1 (en) 1996-07-23 1998-01-29 Nagase Biochemicals, Ltd. Process for preparing docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid
US6051754A (en) 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
AU720677B2 (en) 1997-04-11 2000-06-08 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
CN1283230A (zh) * 1997-12-23 2001-02-07 布利斯脱大学 去饱和酶
DK1086236T3 (da) 1998-06-12 2007-12-03 Calgene Llc Polyumættede fedtsyrer i planter
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
AU1097900A (en) * 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
AU6503699A (en) * 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
WO2000021557A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Merck & Co., Inc. Delta 6 fatty acid desaturase
EP2292223A1 (en) 1998-10-15 2011-03-09 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid supplements
EP1147174B1 (en) 1998-12-07 2007-02-14 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
KR100423013B1 (ko) 1999-03-04 2004-03-12 산토리 가부시키가이샤 도코사펜타엔산 함유물질의 이용
IL146782A0 (en) 1999-06-07 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh 6-acetylenase and 6-desaturase from ceratodon purpureus
JP3520328B2 (ja) 2000-10-06 2004-04-19 奈良先端科学技術大学院大学長 コーヒー属植物のテオブロミン合成酵素ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする遺伝子
EP1392823B1 (en) * 2001-01-25 2011-11-30 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
DE10137374A1 (de) * 2001-07-31 2003-02-27 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure in transgenen Organismen
DE60335708D1 (de) 2002-03-16 2011-02-24 Univ York E exprimieren
AU2004227075B8 (en) 2003-04-08 2009-07-16 Basf Plant Science Gmbh Delta-4 Desaturases from Euglena gracilis, expressing plants, and oils containing PUFA

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