PT1322752E - Fad4, fad5, fad5-2 e fad6, novos membros da família de dessaturases de ácidos gordos e susas utilizações - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO "FAD4, FAD5, FAD5-2 E FAD6, NOVOS MEMBROS DA FAMÍLIA DE DESSATURASES DE ÁCIDOS GORDOS E SUSAS UTILIZAÇÕES"
Antecedentes da Invenção
Os ácidos gordos são ácidos carboxílicos com grupos hidrocarboneto laterais de cadeia longa e desempenham um papel fundamental em muitos processos biológicos. Os ácidos gordos estão raramente livres na natureza mas, em vez disso, ocorrem na forma esterificada como a componente principal de lípidos. Os lípidos/ácidos gordos são fontes de energia (por exemplo, b-oxidação) e são uma parte intrínseca das membranas de células que são indispensáveis para processar a informação biológica ou bioquímica.
Os ácidos gordos podem ser divididos em dois grupos: os ácidos gordos saturados e os ácidos gordos insaturados os quais contêm uma ou mais ligações duplas de carbono na configuração cis. Os ácidos gordos insaturados são produzidos por dessaturases terminais que pertencem à classe de enzimas de ferro não-heme. Cada uma destas enzimas faz parte de um sistema de transporte de electrões que contém duas outras proteínas, nomeadamente citocromo bs e NADH-citocromo bs-redutase. Especificamente, tais enzimas catalisam a formação de ligações duplas entre os átomos de carbono de uma molécula de ácido gordo. Os humanos e outros mamíferos têm um espectro limitado destas dessaturases que são necessárias para a formação de ligações duplas particulares em ácidos gordos insaturados. Assim, os humanos têm de obter alguns ácidos gordos através do seu regime alimentar. Tais ácidos gordos essenciais são, por exemplo, os ácido linoleico (C18:2); ácido linolénico 2 (C18:3), ácido araquidónico (C20:4). Pelo contrário, os insectos e plantas são capazes de sintetizar uma variedade muito maior de ácidos gordos insaturados e seus derivados.
Os ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa (LCPUFAs) como o ácido docosa-hexaenóico (DHA, 22:6(4,7,10,13,16,19)) são componentes essenciais das membranas celulares de vários tecidos e organelos em mamíferos (tecidos nervosos, retina, cérebro e células imunitárias). Por exemplo, mais de 30% dos ácidos gordos nos fosfolipidos cerebrais são 22:6 (n-3) e 20:4 (n-6). (Crawford, M.A, et al., (1997) Am. J- Clin. Nutr. 66:1032S-1041S). Na retina, o DHA contribui para mais de 60% dos ácidos gordos totais no segmento exterior do bastonete, a parte fotossensivel das células fotorreceptoras (Giusto, N.M, et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Estudos clínicos demonstraram que o DHA é essencial para o crescimento e desenvolvimento do cérebro em crianças e para a manutenção de uma função cerebral normal nos adultos (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129-S138) . O DHA também tem efeitos significativos na função fotorreceptora envolvida no processo de transdução de sinal, na activação de rodopsina e no desenvolvimento de bastonetes e cones (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Além disso, também foram encontrados alguns efeitos positivos do DHA em doenças como hipertensão, artrite, aterosclerose, depressão, trombose e cancros (Horrocks, L.A. e Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215). Por conseguinte, o fornecimento alimentar adequado de ácidos gordos é importante para que os seres humanos permaneçam saudáveis. É particularmente importante que bebés, crianças e idosos ingiram adequadamente estes ácidos gordos da dieta alimentar uma vez que estes não podem ser eficazmente sintetizados no organismo daqueles e 3 têm de ser supridos pela alimentação (Spector, A.A. (1999) Lipids 34:S1-S3). 0 DHA é um ácido gordo da série n-3 de acordo com a localização da última ligação na extremidade metilo. E sintetizado via passos alternados de dessaturação e alongamento. Começando com o 18:3 (9,12,15), a biossintese de DHA envolve dessaturação Δ6 em 18:4 (6,9,12,15), seguida de alongamento para 20:4 (8,11,14,17) e dessaturação Δ5 em 20:5 (5,8,11,14,17). Para lá deste ponto, existem algumas controvérsias sobre a biossintese. O ponto de vista convencional é que o 20:5 (5,8,11,14,17) é alongado para 22:5 (7,10,13,16,19) e em seguida convertido em 22:6 (4,7,10,13,16,19) pela dessaturação Δ4 final (Horrobin, D.F. (1992) Prog. Lipid Res. 31:163-194). No entanto, Sprecher et al. sugeriram recentemente uma via alternativa para a biossintese de DHA, a qual é independente da dessaturase de Δ4, envolvendo dois alongamentos consecutivos, uma dessaturação Δ6 e um encurtamento de dois carbonos via β-oxidação limitada nos peroxissoma (Sprecher, H., et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477; Sprecher, H., et al. (1999) Lipids 34:S153-S156). A produção de DHA é importante devido ao seu efeito benéfico na saúde humana. Presentemente, as fontes principais de DHA são óleos de peixe e algas. O óleo de peixe é uma fonte tradicional e principal deste ácido gordo, contudo, está geralmente oxidado na altura em que é vendido. Além disso, o abastecimento de óleo é extremamente variável e a sua fonte está em risco com a diminuição das populações de peixes enquanto a fonte algal é dispendiosa devido ao baixo rendimento e aos custos elevados de extracção. 4
Os EPA e AA são ambos ácidos gordos Δ5 essenciais. Eles formam uma classe única de constituintes alimentares para humanos e animais. 0 EPA pertence à série n-3 com cinco ligações duplas na cadeia acilo, está presente em alimentos marinhos e é abundante no óleo de peixe do Atlântico Norte. 0 AA pertence à série n-6 com quatro ligações duplas. A ausência de uma ligação dupla na posição ω-3 confere ao AA propriedades diferentes daquelas encontradas em EPA. Os eicosanóides produzidos de AA têm propriedades inflamatórias e de agregação de plaquetas fortes, ao passo que aqueles derivados de EPA têm propriedades anti-inflamatórias e antiagregação de plaquetas. 0 AA pode ser obtido a partir de alguns alimentos como carne, peixe e ovos, mas a concentração é baixa. 0 ácido gama-linolénico (GLA) é um outro ácido gordo essencial presente em mamíferos. 0 GLA é o intermediário metabólico de ácidos gordos n-6 de cadeia muito longa e de várias moléculas activas. Em mamíferos, o passo determinante da velocidade de formação de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa é a dessaturação Δ6. Foi demonstrado que muitas condições fisiológicas e patológicas como envelhecimento, stress, diabetes, eczema e algumas infecções deprimem o passo de dessaturação Δ6. Além disso, o GLA é facilmente catabolizado da oxidação e divisão celular rápida associada a determinados distúrbios, por exemplo, cancro ou inflamação. Por conseguinte, a suplementação alimentar com GLA pode reduzir os riscos destes distúrbios. Estudos clínicos demonstraram que a suplementação alimentar com GLA é eficaz no tratamento de algumas condições patológicas como eczema atópico, síndrome 5 pré-menstrual, diabetes, hipercolesterolemia e distúrbios inflamatórios e cardiovasculares.
As fontes predominantes de GLA são os óleos de plantas como onagra (Oenothera biennis), borragem (Borago officinalis L.), groselha-negra (Ribes nigrum) e de microrganismos como Mortierella sp, Mucor sp. e Cyanobacteria. No entanto, estas fontes de GLA não são ideais para suplementação alimentar devido às grandes flutuações na disponibilidade e custos associados aos processos de extracção.
Sumário da Invenção A biossintese de ácidos gordos é uma actividade muito importante de vegetais e microrganismos. No entanto, os humanos têm uma capacidade limitada para sintetizar ácidos gordos essenciais, por exemplo ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa (LCPUFAs). A biotecnologia é considerada, desde há longa data, uma via eficaz para manipular o processo de produção de ácidos gordos em vegetais e microrganismos. É rentável e renovável com poucos efeitos secundários. Deste modo, surgiu um enorme esforço industrial dirigido para a produção de vários compostos incluindo ácidos gordos de especialidade e polipeptidos farmacêuticos através da manipulação de células vegetais, animais e de microrganismos. Por conseguinte, a biotecnologia é uma via atractiva de produção de ácidos gordos insaturados, especialmente LCPUFAs, de modo rentável e seguro, para conseguir o máximo valor terapêutico destes ácidos gordos. A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na revelação de uma família de moléculas de ácido nucleico que codificam novas dessaturases. Em particular, os actuais 6
inventores identificaram que a Fad 4 (dessaturase Δ4) e Fad5 (dessaturase Δ5), as quais estão envolvidas na biossintese de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa, DHA (ácido docosa-hexaenóico, 22:6, n-3) e DPA (ácido docosapentaenóico, 22:5, n-6); mais especificamente, desaturate Fad4 22:5 (n-3) e 22:4 (n-6) que origina DHA e DPA; desaturate Fad5 20:4 (n-3) e 20:3 (n-6) que origina EPA e AA.
Num primeiro aspecto, a presente invenção dirige-se para uma molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos explicitada na SEQ ID NO:l, ou SEQ ID NO:3 ou um seu complemento; (b) uma molécula de ácido nucleico a qual codifica um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou um seu complemento; e
Num segundo aspecto, a presente invenção dirige-se para uma molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma molécula de ácido nucleico a qual codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos cerca de 50% idêntica à sequência de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 2 ou 4, em que o polipéptido tem uma actividade dessaturase Δ4 (no caso de SEQ ID NO:2) ou Δ5 (no caso de SEQ ID NO:4), ou um seu complemento; (b) uma molécula de ácido nucleico a qual hibridiza em condições rigorosas num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de 7 SEQ ID NO: 1 ou 3, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipéptido possuindo uma actividade dessaturase Δ4 (no caso de SEQ ID NO: 1) ou Δ5 (no caso de SEQ ID N0:3), ou um seu complemento; e
Num terceiro aspecto, a presente invenção dirige-se para um polipéptido isolado seleccionado do grupo consistindo de: (a) um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos 50% idêntica à sequência de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 2 ou 4 e possuindo uma actividade dessaturase Δ4 no caso de SEQ ID NO:2 e possuindo uma actividade dessaturase Δ5 no caso de SEQ ID NO: 4 ; (b) um polipéptido o qual é codificado por uma molécula de ácido nucleico a qual hibridiza em condições rigorosas num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:l ou 3 e possuindo uma actividade dessaturase Δ4 no caso de SEQ ID NO:l e possuindo uma actividade dessaturase Δ5 no caso de SEQ ID NO:3; e (c) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou 4 e possuindo uma actividade dessaturase Δ4 no caso de SEQ ID NO: 2 e possuindo uma actividade dessaturase Δ5 no caso de SEQ ID NO:4.
Numa forma de realização, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que inclui a sequência de nucleótidos explicitada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipéptido incluindo a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:2 ou 4.
Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas incluindo sequências de nucleótidos que são substancialmente idênticas (por exemplo, 70% idênticas) à sequência de nucleótidos explicitada como SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO: 3. São aqui descritas moléculas de ácido nucleico isoladas incluindo pelo menos 30 nucleótidos contíguos da sequência de nucleótidos explicitada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:3. Noutra forma de realização, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas as quais codificam um polipéptido incluindo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica (por exemplo, 50% idêntica) à sequência de aminoácidos explicitada como SEQ ID NO:2 ou 4. Também são descritas moléculas de ácido nucleico as quais codificam variantes alélicas do polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos explicitada como SEQ ID NO:2 ou 4. Também são descritas moléculas de ácido nucleico as quais codificam fragmentos, por exemplo, fragmentos biologicamente activos, dos polipéptidos completos da presente invenção (por exemplo, fragmentos incluindo pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4). Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico que são complementares ou hibridizam em condições rigorosas nas moléculas de ácido nucleico isoladas aqui descritas. Num aspecto relacionado, a invenção proporciona vectores incluindo as moléculas de ácido nucleico isoladas aqui descritas (por exemplo, moléculas de ácido nucleico que codificam dessaturases). Também são caracterizadas células hospedeiras incluindo tais vectores (por exemplo, células hospedeiras incluindo vectores adequados para a produção de 9 moléculas de ácido nucleico e polipéptidos de dessaturases).
Como descrita acima, a invenção proporciona polipéptidos de dessaturase isolados. Formas de realização ilustrativas proporcionam um polipéptido incluindo a sequência de aminoácidos explicitada como SEQ ID NO: 2 ou 4, um polipéptido incluindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 50% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada como SEQ ID NO: 2 ou 4, um polipéptido codificado por uma molécula de ácido nucleico incluindo uma sequência de nucleótidos pelo menos 70% idêntica à sequência de nucleótidos explicitada como SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO: 3. Também são descritos fragmentos dos polipéptidos completos aqui descritos (por exemplo, fragmentos incluindo pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos da sequência explicitada como SEQ ID NO: 2 ou 4) bem como variantes alélicas do polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos explicitada como SEQ ID NO: 2 ou 4.
Numa forma de realização, um polipéptido de dessaturase tem uma actividade dessaturase. Noutra forma de realização, um polipéptido de dessaturase tem um motivo de ligação heme N-terminal, por exemplo, um domínio tipo citocromo b5 presente em dessaturases frontais. Noutra forma de realização, um polipéptido de dessaturase tem pelo menos dois, preferencialmente cerca de três, motivos conservadores de histidina presentes em todas as dessaturases microssomais e, opcionalmente, tem uma actividade dessaturase. Numa forma de realização preferida, o polipéptido de dessaturase tem cerca de três motivos de histidina. 10
Podem ser utilizadas construções contendo os genes de dessaturase em qualquer sistema de expressão incluindo plantas, animais e microrganismos para a produção de células capazes de produzir LCPUFAs como DHA, EPA, AA, SDA, e GLA. Exemplos de plantas utilizadas para expressar as dessaturases da presente invenção incluem, entre outras, plantas e sementes vegetais de culturas de oleaginosas, por exemplo, linho (Linum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glicina e Soja sp.), girassol (Helianthus sp.), algodão (Gosssypium sp.), milho (Zea mays), oliveira (Olea sp.), açafrão-bastardo (Carthamus sp.), cacau (Theobroma cacoa), e amendoim (Arachis sp.).
Num aspecto afim, a presente invenção proporciona métodos novos e melhorados de produção de ácidos gordos insaturados, por exemplo, LCPUFAs; e outros compostos chave da via biossintética de ácidos gordos insaturados utilizando células, por exemplo, células vegetais, células animais e/ou células microbianas nas quais a via biossintética de ácidos gordos insaturados foi manipulada para serem produzidos LCPUFAs ou outros compostos desejados de ácidos gordos insaturados.
As metodologias novas e melhoradas da presente invenção incluem métodos de produção de ácidos gordos insaturados (por exemplo, DHA) em células possuindo pelo menos uma dessaturase de ácidos gordos da via biossintética de ácidos gordos insaturados manipulada para serem produzidos ácidos gordos insaturados (por exemplo, produzidos num nivel aumentado). Por exemplo, a invenção proporciona métodos de produção de um ácido gordo insaturado (por exemplo, DHA) em células compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico de dessaturase isolada, por exemplo, Fad4 e/ou 11
Fad5, como descrita cima, pelo que é produzido um ácido gordo insaturado, por exemplo LCPUFA, por exemplo, DHA. Tais métodos podem compreender ainda o passo de recuperação do LCPUFA.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona métodos de produção de ácidos gordos insaturados, por exemplo, LCPUFAs, por exemplo, DHA, compreendendo pôr em contacto uma composição compreendendo pelo menos uma molécula alvo da dessaturase, como aqui definida, com pelo menos um polipéptido de dessaturase isolado, por exemplo, Fad4 e/ou Fad5, como descrito acima, em condições de modo a ser produzido um ácido gordo insaturado, por exemplo, LCPUFA, por exemplo, DHA. Tais métodos podem compreender ainda o passo de recuperação do LCPUFA.
Os ácidos nucleicos, proteínas e vectores descritos acima são particularmente úteis nas metodologias da presente invenção. Em particular, a invenção proporciona métodos de melhoramento da produção de ácidos gordos insaturados (por exemplo, produção de DHA) que incluem cultivar uma planta, animal e/ou microrganismo recombinante compreendendo um ácido nucleico de dessaturase, por exemplo, Fad4 e Fad5, em condições de modo a ser melhorada a produção de ácido gordo.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona métodos de produção de uma célula vegetal ou microbiana capaz de produzir ácidos gordos insaturados. Tais métodos incluem a introdução na referida célula, por exemplo, uma célula vegetal, de uma molécula de ácido nucleico isolada como descrito acima a qual codifica uma proteína possuindo 12 uma actividade de catalisação da formação de uma ligação dupla numa cadeia acilo gorda.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona métodos para modular a produção de ácidos gordos compreendendo cultivar uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada como descrito acima a qual codifica um polipéptido possuindo uma actividade de catalisação da formação de uma ligação dupla, pelo que ocorre a modulação da produção de ácido gordo.
Noutra forma de realização, a presente invenção inclui composições que compreendem os ácidos nucleicos ou polipéptidos de ácidos gordos insaturados aqui descritos. As composições da presente invenção também podem compreender as células capazes de produzir tais ácidos gordos, como descritas acima, e, opcionalmente, um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Noutra forma de realização, as composições da presente invenção são úteis como um suplemento alimentar, por exemplo, em alimentos compostos para animais ou como um neutracêutico. As composições da presente invenção podem possibilitar um método de tratamento de um doente possuindo um distúrbio. Os distúrbios abrangidos por tais métodos incluem, por exemplo, stress, diabetes, cancro, distúrbios inflamatórios e distúrbios cardiovasculares.
Outras caracteristicas e vantagens da invenção serão evidentes da descrição detalhada e reivindicações seguintes.
Breve Descrição dos Desenhos 13
Figura 1 mostra a sequência de ADN e da proteína de Fad4 de Thraustochytrium sp.; (A) a sequência de ADNc da grelha de leitura aberta (SEQ ID N0:1); e (B) a sequência de proteína traduzida (SEQ ID N0:2).
Figura 2 mostra a sequência de ADN e da proteína de Fad5 de Thraustochytrium sp.; (A) a sequência de ADNc da grelha de leitura aberta (SEQ ID N0:3); e (B) a sequência de proteína traduzida (SEQ ID N0:4).
Figura 3 mostra uma comparação das sequências de proteína de Fad4 e Fad5 de Thraustochytrium sp. (SEQ ID NO: 2 e 4, respectivamente). A barra vertical indica a identidade de aminoácido. Os motivos conservados como os motivos de ligação de heme citocromo b5 e rico em histidina estão realçados. As duas setas indicam as localizações de ligação dos dois iniciadores degenerados.
Figura 4 é uma análise por cromatografia em fase gasosa (GC) de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAMEs) da estirpe de levedura Invsc2 que expressa Fad4 com substrato exógeno 22:5 (n-3).
Figura 5 é uma análise por cromatograf ia em fase gasosa/espectroscopia de massa (MS) de FAMEs do pico novo na Figura 4; (A) o produto de Fad4; (B) o padrão de DHA (22:6, n-3) .
Figura 6 é uma análise por GC de FAMEs da estirpe de levedura Invsc2 que expressa Fad4 com substrato exógeno 22 : 4 (n-6) .
Figura 7 é uma análise por GC/MS de FAMEs do pico novo na Figura 9; (A) o produto de Fad4; (B) o padrão de DPA (22:5, n-6) .
Figura 8 é uma análise por GC de FAMEs da estirpe de levedura Invsc2 que expressa Fad5 com substrato exógeno 20:3 (n-6). 14
Figura 9 é uma análise por GC/MS de FAMEs do pico novo na Figura 11; (A) o produto de Fad5; (B) o padrão de AA (20:4-5,8,11,14) .
Figura 10 é uma análise por GC de FAMEs de folhas de Brassica juncea que expressam Fad4 sob o controlo do promotor 35S com substrato fornecido exogenamente 22:5 (n- 3) .
Figura 11 é um quadro que mostra o perfil de ácidos gordos de Thraustochytrium sp.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na revelação de novos membros da família de dessaturases de ácidos gordos, aqui referidas alternadamente como moléculas de ácido nucleico e proteína de "dessaturases" ou "dessaturase" (por exemplo, Fad4 e Fad5). Estas moléculas novas são membros da família de dessaturases de ácidos gordos e são expressadas em organismos produtores de LCPUFAs, por exemplo, Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizichytrium e Crythecodinium.
Como aqui utilizado, o termo "ácidos gordos" é reconhecido na técnica e inclui um ácido carboxílico com base em hidrocarboneto de cadeia longa. Os ácidos gordos são componentes de muitos lípidos incluindo glicéridos. Os ácidos gordos naturais mais comuns são ácidos monocarboxílicos os quais têm um número par de átomos de carbono (16 ou 18) e os quais podem ser saturados ou insaturados. Os ácidos gordos "insaturados" contêm ligações duplas cis entre os átomos de carbono. Os ácidos gordos insaturados abrangidos pela presente invenção incluem, por exemplo, DHA, GLA e SDA. Os ácidos gordos "poliinsaturados" contêm mais do que uma ligação dupla e as ligações duplas 15 estão arranjadas num sistema metileno interrompido (-CH=CH-CH2-CH=CH-).
Os ácidos gordos são aqui descritos por um sistema de numeração no qual o número antes dos dois pontos indica o número de átomos de carbono no ácido gordo, enquanto o número depois dos dois pontos é o número de ligações duplas que estão presentes. No caso de ácidos gordos insaturados, isto é seguido de um número entre parêntesis que indica a posição das ligações duplas. Cada número entre parêntesis é o átomo de carbono com o número mais baixo dos dois ligados pela ligação dupla. Por exemplo, o ácido oleico pode ser descrito como 18:1 (9) e o ácido linoleico pode ser descrito como 18:2 (9, 12) indicando 18 carbonos, uma ligação dupla no carbono 9, duas ligações duplas nos carbonos 9 e 12, respectivamente.
Os passos determinantes na produção de ácidos gordos insaturados, isto é, a via biossintética de ácidos gordos insaturados, são catalisados por dessaturases de ácidos gordos associadas à membrana, por exemplo, Fad4 ou Fad5. Especificamente, tais enzimas catalisam a formação de ligações duplas entre os átomos de carbono de uma molécula de ácido gordo. Como aqui utilizado, o termo "via biossintética de ácidos gordos insaturados" refere-se a uma série de reacções químicas que conduzem à síntese de um ácido gordo insaturado in vivo ou in vitro. Uma tal via inclui uma série de passos de dessaturação e alongamento os quais geram ácidos gordos insaturados e, por fim, ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa. Tais ácidos gordos insaturados podem incluir, GLA 18:3 (6,9,12), SDA 18:4 (6,9,12,15), AA 20:4 (5,8,11,14), EPA 20:5 (5,8,11,14,17), e DPA 22:5 (4,7,10,13,16) e DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19). 16
As dessaturases podem conter um motivo de ligação de heme e/ou cerca de três motivos conservadores de histidina, embora possam estar presentes mais domínios. Os membros da família das dessaturases de ácidos gordos convertem ácidos gordos saturados em ácidos gordos insaturados, por exemplo, ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa (LCPUFAs), os quais são componentes das membranas celulares de vários tecidos e organelos em mamíferos (tecido nervoso, retina, cérebro e células imunitárias). Exemplos de LCPUFA incluem, entre outros, o ácido docosa-hexaenóico (DHA, 22:6(4,7,10,13,16,19)). Estudos clínicos mostraram que o DHA é essencial para o crescimento e desenvolvimento do cérebro em bebés e para manutenção da função cerebral normal em adultos (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129-S138) . O DHA também tem efeitos na função foto-receptora envolvida no processo de transdução de sinal, na activação de rodopsina e no desenvolvimento do bastonete e cone (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39:315-391). Além disso, também foram encontrados efeitos positivos do DHA no tratamento de doenças como hipertensão, artrite, aterosclerose, depressão, trombose e cancros (Horrocks, L.A. e Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215) . Assim, as moléculas de dessaturase podem ser utilizadas para produzir os LCPUFAs úteis no tratamento de distúrbios caracterizados por crescimento, proliferação ou diferenciação regulado de forma aberrante. Tais distúrbios incluem cancro, por exemplo, carcinoma, sarcoma ou leucemia; angiogénese tumoral e metástase; displasia esquelética; distúrbios hepáticos; síndromes mielodisplásicas; e distúrbios hematopoiéticos e/ou mieloproliferativos. Outros distúrbios relacionados com angiogénese e os quais são, desse modo, distúrbios 17 associados a dessaturase incluem telangiectasia hemorrágica hereditária de tipo 1, fibrodisplasia ossificante progressiva, fibrose pulmonar idiopática e sindrome de Klippel-Trenaunay-Weber. 0 termo "família" quando se refere moléculas de proteína e ácido nucleico da presente invenção significa duas ou mais proteínas ou moléculas de ácido nucleico possuindo um domínio ou motivo estrutural comum e possuindo homologia de sequência de aminoácidos ou nucleótidos suficiente como aqui definida. Tais membros da família podem ser naturais ou não naturais e podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes. Por exemplo, a família pode conter uma primeira proteína de origem humana bem como outras proteínas distintas de origem humana ou alternativamente, podem conter homólogos de origem não humana, por exemplo, proteínas de ratazana ou rato. Os membros de uma família também podem ter características funcionais comuns.
Por exemplo, a família de proteínas dessaturase da presente invenção compreende um motivo de ligação de heme citocromo b5. Como aqui utilizado, o termo "motivo de ligação de heme" é um prolongamento N-terminal do domínio tipo citocromo b5 presente nas dessaturases frontais.
Noutra forma de realização, os membros da família de proteínas dessaturase incluem "motivos de histidina" na proteína, preferencialmente, cerca de três ou quatro motivos de histidina, Como aqui utilizado, o termo "motivo de histidina" inclui um domínio de proteína possuindo pelo menos cerca de dois resíduos de aminoácido histidina, preferencialmente cerca de três ou quatro resíduos de aminoácido histidina, e está tipicamente presente em todas 18 as dessaturases microssomais como o terceiro motivo conservador de histidina.
Exemplos de motivos de ligação de heme citocromo b5 e motivos de histidina incluem os resíduos de aminoácido 41-44, 182-186, 216-223 e 453-462 de SEQ ID N0:2, e os resíduos de aminoácido 40-43, 171-175, 207-213 e 375-384 de SEQ ID NO:4 como se mostra na Figura 3.
As proteínas dessaturase isoladas da presente invenção têm uma sequência de aminoácidos suficientemente homóloga à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4 ou são codificadas por uma sequência de nucleótidos suficientemente homóloga da SEQ ID NO:l ou 3. As proteínas da invenção são aquelas definidas na reivindicação 10. Como aqui utilizado, o termo "suficientemente homólogas" refere-se a uma primeira sequência de aminoácidos ou nucleótidos a qual contém um número mínimo ou suficiente de resíduos de aminoácido ou nucleótidos idênticos ou equivalentes (por exemplo, um resíduo de aminoácido o qual tem uma cadeia lateral semelhante) a uma segunda sequência de aminoácidos ou nucleótidos pelo que a primeira e segunda sequências de aminoácidos ou nucleótidos partilham domínios ou motivos estruturais comuns e/ou uma actividade funcional comum. Por exemplo, sequências de aminoácidos ou nucleótidos que partilham domínios estruturais comuns possuindo pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia ou identidade ao longo das sequências de aminoácidos dos domínios e contém pelo menos um e preferencialmente dois domínios ou motivos estruturais são aqui definidas como suficientemente homólogas. Além disso, sequências de aminoácidos ou nucleótidos que partilham pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 19 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia ou identidade e partilham uma actividade funcional comum são aqui definidas como suficientemente homólogas.
Numa forma de realização preferida, uma proteína dessaturase inclui pelo menos um ou mais dos seguintes domínios ou motivos: um motivo de ligação de heme e/ou um motivo de histidina e tem uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga ou idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou 4. Ainda noutra forma de realização preferida, uma proteína dessaturase inclui pelo menos um ou mais dos seguintes domínios: um motivo de ligação de heme e/ou um motivo de histidina, e é codificado por uma molécula de ácido nucleico possuindo uma sequência de nucleótidos que hibridiza em condições de hibridização rigorosas num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ou 3. Noutra forma de realização preferida, uma proteína dessaturase inclui pelo menos um motivo de ligação de heme e/ou pelo menos cerca de três motivos de histidina, e tem uma actividade dessaturase.
Como aqui utilizado alternadamente, uma "actividade dessaturase," "actividade biológica de uma dessaturase" ou "actividade funcional de uma dessaturase," inclui uma actividade exercida ou mediada por uma proteína, polipéptido ou molécula de ácido nucleico de dessaturase numa célula reactiva à dessaturase ou num substrato da dessaturase, como determinado in vivo ou in vitro, segundo técnicas correntes. Numa forma de realização, uma actividade dessaturase é uma actividade directa tal como 20 uma associação com uma molécula alvo da dessaturase. Como aqui utilizado, uma "molécula alvo" ou "parceiro de ligação" é uma molécula, por exemplo, uma molécula envolvida na síntese de ácidos gordos insaturados, por exemplo, um ácido gordo intermediário, com o qual uma proteína dessaturase se liga ou interage por natureza pelo que é obtida uma função mediada pela dessaturase. Uma actividade directa de dessaturase também inclui a formação de uma ligação dupla entre os átomos de carbono de uma molécula de ácido gordo para formar uma molécula de ácido gordo insaturado. A sequência de nucleótidos do ADNc da dessaturase Δ4, Fad4, de Thraustochytrium sp. isolado e a sequência prevista de aminoácidos codificada pelo ADNc de Fad4 são mostradas na Figura 1 e na SEQ ID NOs:l e 2, respectivamente. O gene de Fad4 de Thraustochytrium sp. (a grelha de leitura aberta), o qual tem um comprimento de aproximadamente 1560 nucleótidos, codifica uma proteína possuindo uma massa molecular de aproximadamente 59,1 kD e a qual tem um comprimento de aproximadamente 519 resíduos de aminoácido. A sequência de nucleótidos do ADNc da dessaturase Δ5, Fad5, de Thraustochytrium sp. e a sequência prevista de aminoácidos codificada pelo ADNc de Fad5 são mostradas na Figura 2 e na SEQ ID NOs:3 e 4, respectivamente. O gene de Fad5 de Thraustochytrium sp., o qual tem um comprimento de aproximadamente 1320 nucleótidos, codifica uma proteína possuindo uma massa molecular de aproximadamente 49,8 kD e a qual tem um comprimento de aproximadamente 439 resíduos de aminoácido. 21 Vários aspectos da invenção são descritos em mais pormenor nas subsecções que se seguem: I. Moléculas de Ácido Nucleico Isoladas
Um aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam proteínas dessaturase. São aqui descritos fragmentos de ácido nucleico suficientes para serem utilizados como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam dessaturases (por exemplo, ARNm de dessaturase) e fragmentos para serem utilizados como iniciadores de PCR para a amplificação ou mutação de moléculas de ácido nucleico de dessaturases. Como aqui utilizado, o termo "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN ("por exemplo, ADNc ou ADN genómico) e moléculas de ARN (por exemplo, ARNm) e análogos do ADN ou ARN gerados utilizando análogos de nucleótidos. A molécula de ácido nucleico pode ser monocatenária ou bicatenária, mas preferencialmente é ADN bicatenário. 0 termo "molécula de ácido nucleico isolada" inclui moléculas de ácido nucleico que são separadas de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural do ácido nucleico. Por exemplo, no que se refere ao ADN genómico, o termo "isolado" inclui moléculas de ácido nucleico que são separadas do cromossoma com o qual o ADN genómico está naturalmente associado. Preferencialmente, um ácido nucleico "isolado" está isento das sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no ADN genómico do organismo do qual o ácido nucleico é proveniente. Por exemplo, em várias formas de realização, a molécula de ácido nucleico de dessaturase 22 isolada pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleótidos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no ADN genómico da célula da qual o ácido nucleico é proveniente. Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", tal como uma molécula de ADNc, pode estar substancialmente isenta de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizado quimicamente.
Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico possuindo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ou 3 pode ser isolada utilizando técnicas correntes de biologia molecular e a informação sobre a sequência aqui proporcionada. Utilizando a totalidade ou uma parte da sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1 ou 3 como sondas de hibridização, pode isolar-se moléculas de ácido nucleico de dessaturases utilizando técnicas de hibridização e clonagem correntes (por exemplo, como descrito em Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
Além disso, uma molécula de ácido nucleico abrangendo a totalidade ou uma parte da SEQ ID N0:1 ou 3, pode ser isolada pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores oligonucleótidos sintéticos concebidos com base na sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3.
Um ácido nucleico da invenção pode ser amplificado utilizando ADNc, ARNm ou alternativamente, ADN genómico, 23 como uma cadeia molde e iniciadores oligonucleótidos apropriados segundo técnicas correntes de amplificação por PCR. 0 ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado num vector apropriado e caracterizado por análise de sequência de ADN. Além disso, os oligonucleótidos correspondentes a sequências de nucleótidos de dessaturase podem ser preparados por técnicas de síntese correntes, por exemplo, utilizando um sintetizador automático de ADN.
Noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico consiste da sequência de nucleótidos explicitada como SEQ ID NO: 1 ou 3.
Ainda noutra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção compreende uma molécula de ácido nucleico a qual é um complemento da sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3. A molécula de ácido nucleico que é complementar à sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID N0:1 ou 3 é uma que é suficientemente complementar à sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID N0:1 ou 3, pelo que pode hibridizar com a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3, formando desse modo uma forma dupla estável.
Ainda noutra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção compreende uma sequência de nucleótidos a qual é pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3.
As moléculas de ácido nucleico que compreendem apenas uma porção da sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1 ou 3, 24 por exemplo, um fragmento, podem ser utilizadas como uma sonda ou iniciador. A sequência de nucleótidos determinada da clonagem do gene da dessaturase permite gerar sondas e iniciadores concebidos para serem utilizados na identificação e/ou clonagem de outros membros da família das dessaturases, bem como homólogos das dessaturases de outras espécies. A sonda/iniciador (por exemplo, oligonucleótido) compreende tipicamente oligonucleótido consideravelmente purificado. 0 oligonucleótido compreende tipicamente uma região da sequência de nucleótidos que hibridiza em condições rigorosas em pelo menos cerca de 12 ou 15, preferencialmente cerca de 20 ou 25, mais preferencialmente cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 nucleótidos consecutivos de uma sequência mensageira de SEQ ID NO: 1 ou 3, de uma sequência antimensageira de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou de uma variante alélica natural ou mutante de SEQ ID NO: 1 ou 3.
As sondas ou iniciadores ilustrativos são pelo menos de (ou não são maiores do que) 12 ou 15, 20 ou 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou mais nucleótidos de comprimento e/ou compreende nucleótidos consecutivos de uma molécula de ácido nucleico isolada aqui descrita. Também são descritas sondas ou iniciadores compreendendo nucleótidos contíguos ou consecutivos de uma molécula de ácido nucleico isolada aqui descrita, excepto para a diferença de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 bases dentro da sequência da sonda ou iniciador. Sondas com base nas sequências de nucleótidos de dessaturases podem ser utilizadas para detectar (por exemplo, detectar especificamente) sequências transcritas ou genómicas que codificam as mesmas proteínas ou proteínas homólogas. A sonda pode compreender ainda um grupo etiqueta ligado à mesma, por exemplo, o grupo etiqueta por ser um 25 radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofactor enzimático. Também é descrito um conjunto de iniciadores, por exemplo, iniciadores adequados para serem utilizados num PCR, os quais podem ser utilizados para amplificar uma região seleccionada de uma sequência dessaturase, por exemplo, um dominio, região, sitio ou outra sequência aqui descrita. Os iniciadores deveriam ter pelo menos 5, 10 ou 50 pares de bases de comprimento e menos do que 100, ou menos do que 200, pares de bases de comprimento. Os iniciadores deveriam ser idênticos, ou diferir em não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 bases quando comparados com uma sequência aqui divulgada ou com a sequência de uma variante natural. Tais sondas podem ser utilizadas como uma parte de um estojo de ensaio para diagnóstico para identificar células ou tecidos que expressam erradamente uma proteína dessaturase, tal como medindo um nível de um ácido nucleico que codifica uma dessaturase numa amostra de células de um indivíduo, por exemplo, detectando níveis de ARNm de dessaturase ou determinando se um gene de dessaturase genómico foi mutado ou suprimido.
Um fragmento de ácido nucleico que codifica uma "porção biologicamente activa de uma proteína dessaturase" pode ser preparado isolando uma porção da sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ou 3, que codifica um polipéptido possuindo uma actividade biológica de dessaturase (as actividades biológicas das proteínas dessaturase são aqui descritas), expressando a porção codificada da proteína dessaturase (por exemplo, por expressão recombinante ín vitro) e avaliando a actividade da porção codificada da proteína dessaturase. Numa forma de realização ilustrativa, a molécula de ácido nucleico tem pelo menos 50-100, 100-250, 26 250-500, 500-700, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 ou mais nucleótidos de comprimento e codifica uma proteína possuindo uma actividade dessaturase (como aqui descrita). A invenção abrange ainda moléculas de ácido nucleico que diferem da sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3, devido à degeneração do código genético e codificam, desse modo, as mesmas proteínas dessaturase que as codificadas por uma sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3. Noutra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção tem uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos que difere em pelo menos 1, mas não mais do que 5, 10, 20, 50 ou 100 resíduos de aminoácido da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou 4. Ainda noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos da dessaturase humana. Se for necessário um alinhamento para esta comparação, as sequências deveriam ser alinhadas para homologia máxima.
As variantes de ácido nucleico podem ser naturais, como variantes alélicas (mesmo locus), homólogas (locus diferente) e ortólogas (organismo diferente) ou podem ser não naturais. As variantes não naturais podem ser preparadas por técnicas de mutagénese, incluindo as aplicadas a polinucleótidos, células ou organismos. As variantes podem conter substituições, supressões, inversões e inserções de nucleótidos. A variação pode ocorrer em qualquer uma ou em ambas as regiões de codificação e não codificação. As variações podem produzir substituições 27 conservadoras e não conservadoras de aminoácidos (como comparado no produto codificado).
As variantes alélicas resultam, por exemplo, de polimorfismos da sequência de ADN numa população (por exemplo, a população humana) que conduziram a modificações nas sequências de aminoácidos das proteínas dessaturase. Tais polimorfismos genéticos dos genes de dessaturase podem existir entre indivíduos de uma população devido a variação alélica natural.
Como aqui utilizado, os termos "genes" e "gene recombinante" referem-se a moléculas de ácido nucleico que incluem uma grelha de leitura aberta que codifica uma proteína dessaturase, por exemplo, proteína dessaturase de oleaginosa, e podem incluir ainda sequências reguladoras não codificadoras e intrões. São aqui descritas moléculas de ácido nucleico isoladas as quais codificam uma variante alélica natural de um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou 4, em que a molécula de ácido nucleico hibridiza num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou 3, por exemplo, em condições de hibridização rigorosas.
As variantes alélicas de dessaturase incluem, por exemplo, Fad4 ou Fad5, incluem proteínas dessaturases funcionais e não funcionais. As variantes alélicas funcionais são sequências de aminoácidos naturais variantes da proteína dessaturase que conservam a capacidade de, por exemplo, (i) interagir com um substrato de dessaturase ou molécula alvo (por exemplo, um ácido gordo, por exemplo, DRA); e/ou (ii) 28 formar uma ligação dupla entre átomos de carbono num substrato ou molécula alvo da dessaturase. Os ácidos gordos produzidos pelas moléculas de ácido nucleico e proteína da presente invenção também são úteis no tratamento de distúrbios como envelhecimento, stress, diabetes, cancro, distúrbios inflamatórios (por exemplo, artrite, eczema) e distúrbios cardiovasculares. As variantes alélicas funcionais conterão tipicamente apenas uma substituição conservadora de um ou mais aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou 4, ou uma substituição, supressão ou inserção de resíduos não críticos em regiões não críticas da proteína.
As variantes alélicas não funcionais são sequências de aminoácidos naturais variantes da proteína dessaturase, por exemplo, Fad4 ou Fad5, que não têm a capacidade de, por exemplo, (i) interagir com um substrato ou molécula alvo da dessaturase (por exemplo, um ácido gordo intermediário, como 18:4 (6,9,12,15)); e/ou (ii) formar uma ligação dupla entre átomos de carbono num substrato ou molécula alvo de dessaturase. As variantes alélicas não funcionais conterão tipicamente uma substituição, uma supressão ou inserção não conservadora, ou truncagem prematura da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4, ou uma substituição, inserção ou supressão em resíduos críticos ou regiões críticas da proteína. A presente invenção proporciona ainda ortólogos (por exemplo, ortólogos humanos das proteínas dessaturase). Os ortólogos das proteínas dessaturase de Thraustochytrium sp. são proteínas que são isoladas de outros organismos e possuem os mesmos mecanismos de ligação ao substrato ou molécula alvo da dessaturase, mecanismos de formação da ligação dupla, modulação dos mecanismos de crescimento e 29 desenvolvimento do cérebro em bebés, mecanismos de manutenção da função cerebral normal em adultos, capacidade de afectar a função fotorreceptora envolvida no processo de transdução de sinal, capacidade de afectar a activação de rodopsina, mecanismos de desenvolvimento de bastonetes e/ou cones, e/ou mecanismos de modulação do crescimento celular e/ou proliferação das proteínas dessaturase não humanas. Os ortólogos das proteínas dessaturase de Thraustochytrium sp. Podem ser facilmente identificados como compreendendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO:2 ou 4. São aqui descritas moléculas de ácido nucleico que codificam outros membros da família de dessaturases que têm uma sequência de nucleótidos que difere das sequências de dessaturase de SEQ ID NO: 1 ou 3. Por exemplo, pode identificar-se outro ADNc de dessaturase com base na sequência de nucleótidos de Fad4 ou Fad5. São aqui descritas moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas dessaturase de espécies diferentes que têm uma sequência de nucleótidos que difere das sequências de dessaturase de SEQ ID NO: 1 ou 3. Por exemplo, o ADNc de dessaturase de Schizochytrium ou Crythecodinium pode ser identificado com base na sequência de nucleótidos de uma Fad4 ou Fad5.
As moléculas de ácido nucleico correspondentes às variantes alélicas e homólogos naturais dos ADNc de dessaturase da invenção podem ser isoladas com base na sua homologia com os ácidos nucleicos de dessaturase aqui divulgados utilizando os ADNc aqui divulgados, ou uma porção destes, como uma sonda de hibridização segundo técnicas de 30 hibridização correntes em condições de hibridização rigorosas.
Os ortólogos, homólogos e variantes alélicas podem ser identificados utilizando métodos known na técnica (por exemplo, pró hibridização com uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção, por exemplo, em condições de hibridização rigorosas). É aqui descrita uma molécula de ácido nucleico isolada a qual tem pelo menos 15, 20, 25, 30 ou mais nucleótidos de comprimento e hibridiza em condições rigorosas com a molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ou 3. É também descrito um ácido nucleico o qual tem pelo menos 50-100, 100-250, 250-500, 500-700, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3250-3500, 3500-3750 ou mais nucleótidos de comprimento.
Como aqui utilizado, o termo "hibridiza em condições rigorosas" pretende descrever condições de hibridização e lavagem às quais as sequências de nucleótidos que são significativamente idênticas ou homólogas uma da outra permanecem hibridizadas uma com a outra. Preferencialmente, as condições são tais que as sequências pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 85% ou 90% idênticas uma à outra permanecem hibridizadas uma com a outra. Tais condições rigorosas são conhecidas dos especialistas na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), secções 2, 4 e 6. Outras condições rigorosas podem ser encontradas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring 31
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), capítulos 7, 9 e 11. Um exemplo preferido, não restritivo de condições de hibridização rigorosas inclui a hibridização em cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) 4X, a cerca de 65-70°C (ou alternativamente a hibridização em SSC 4X com 50% de formamida a cerca de 42-50 °C) seguida de uma ou mais lavagens em SSC IX, a cerca de 65-70°C. Um exemplo preferido, não restritivo de condições de hibridização extremamente rigorosas inclui hibridização em SSC IX, a cerca de 65-70°C (ou alternativamente hibridização em SSC IX com 50% de formamida a cerca de 42-50°C) seguida de uma ou mais lavagens em SSC 0,3X, a cerca de 65-70°C. Um exemplo preferido, não restritivo de condições de hibridização de rigor reduzido inclui hibridização em SSC 4X, a cerca de 50-60°C (ou alternativamente hibridização em SSC 6X com 50% de formamida a cerca de 40-45°C) seguida de uma ou mais lavagens em SSC 2X, a cerca de 50-60 °C. As gamas intermédias relativamente aos valores acima referidos, por exemplo, a 65-70°C ou a 42-50°C também estão abrangidas pela presente invenção. 0 SSPE (lxSSPE é NaCl 0,15M, NaH2P04 10mM e EDTA l,25mM, pH 7,4) pode ser substituído por SSC (SSC IX é NaCl 0,15M e citrato de sódio 15mM) nos tampões de hibridização e lavagem; as lavagens são realizadas durante 15 minutos cada, depois de a hibridização estar concluída. A temperatura de hibridização para híbridos que se prevê possuírem menos do que 50 pares de bases de comprimento deveria ser de 5-10°C inferior à temperatura de fusão (Tm) do híbrido, em que Tm é determinada de acordo com as equações seguintes. Para híbridos com menos de 18 pares de bases de comprimento, Tm(°C) = 2 (# de bases A + T) + 4 (# de bases G + C) . Para híbridos com entre 18 e 49 pares de bases de comprimento, Tm(°C) = 81,5 + 16,6 (logio [Na+] ) + 0,41 (%G+C) - (600/N), em 32 que N é o número de bases no híbrido e [Na+] é a concentração de iões sódio no tampão de hibridização ([Na+] para SSC IX = 0,165 M) . Também será reconhecido pelo especialista que podem ser adicionados mais reagentes aos tampões de hibridização e/ou lavagem para diminuir a hibridização não específica de moléculas de ácido nucleico com membranas, por exemplo, membranas de nitrocelulose ou nylon, incluindo mas não se limitando a agentes de bloqueio (por exemplo, BSA ou ADN portador de esperma de salmão ou arenque), detergentes (por exemplo, SDS), agentes quelantes (por exemplo, EDTA), Ficoll, PVP e semelhantes. Quando se utiliza membranas de nylon, em particular, um exemplo adicional preferido, não restritivo de condições de hibridização rigorosas é a hibridização em NaH2P04 0,25-0,5M, 7% de SDS a cerca de 65°C, seguida de uma ou mais lavagens com NaH2P04 0,02M, 1% de SDS a 65°C (ver por exemplo, Church e Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1991-1995), ou alternativamente SSC 0,2X, 1% de SDS.
Preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção que hibridiza em condições rigorosas com a sequência de SEQ ID NO:l ou 3, corresponde a uma molécula de ácido nucleico natural. Como aqui utilizada, uma molécula de ácido nucleico natural refere-se a uma molécula de ARN ou ADN possuindo uma sequência de nucleótidos que ocorre na natureza (por exemplo, codifica uma proteína natural).
Além das variantes alélicas naturais das sequências de dessaturase que possam existir na população, o especialista aperceber-se-á ainda que podem ser introduzidas modificações por mutação nas sequências de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ou 3, conduzindo desse modo a modificações na 33 sequência de aminoácidos das proteínas dessaturases codificadas, sem alterar a capacidade funcional das proteínas dessaturase. Por exemplo, podem ser feitas substituições de nucleótidos que conduzem a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácido "não essenciais" na sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado na sequência natural de Fad4 ou Fad5 (por exemplo, a sequência de SEQ ID N0:2) sem alterar a actividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para actividade biológica. Por exemplo, os resíduos de aminoácido que são conservados entre as proteínas dessaturase da presente invenção, por exemplo, aqueles presentes num motivo de ligação de heme ou num motivo de histidina, são antecipados como sendo particularmente inadequados para alteração. Além disso, outros resíduos de aminoácido que são conservados entre as proteínas dessaturase da presente invenção e outros membros da família de dessaturases de ácidos gordos não são provavelmente receptivos a alteração. 98% 99% ou mais
Por conseguinte, outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas dessaturase que contêm modificações nos resíduos de aminoácido que não são essenciais para a actividade. Tais proteínas dessaturase diferem na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou 4, retendo contudo a actividade biológica. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico isolada compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína, em que a proteína compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 76%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 34 homóloga à SEQ ID NO: 2 ou 4, por exemplo, à totalidade da SEQ IN NO: 2 ou 4.
Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína dessaturase homóloga à proteína de SEQ NO: 2 ou 4, pode ser gerada introduzindo uma ou mais substituições, adições ou supressões de nucleótidos na sequência de nucleótidos de SEQ ID N0:1 ou 3, pelo que são introduzidas uma ou mais substituições, adições ou supressões de aminoácidos na proteína codificada. Podem ser introduzidas mutações na SEQ ID N0:1 ou 3, por técnicas correntes, como por mutagénese específica de um locus e mutagénese mediada por PCR. Preferencialmente, são efectuadas substituições conservadoras de aminoácidos em um ou mais resíduos de aminoácido previsivelmente não essenciais. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido está substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácido possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina) , cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas na posição beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido previsivelmente não essencial numa proteína dessaturase está preferencialmente substituído por 35 outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou de uma parte da sequência de codificação da dessaturase, tal como por mutagénese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados quanto à actividade biológica dessaturase para identificar mutantes que retêm actividade. Após mutagénese de SEQ ID N0:1 ou 3 a proteina codificada pode ser expressada de modo recombinante e determinada a actividade da proteina.
Uma proteína dessaturase mutante pode ser avaliada quanto à sua capacidade para (i) interagir com um substrato ou molécula alvo de dessaturase (por exemplo, um ácido gordo intermediário); e/ou (ii) formar uma ligação dupla entre átomos de carbono num substrato ou molécula alvo de dessaturase. II. Proteínas Dessaturase Isoladas
Um aspecto da invenção refere-se a proteínas e polipéptidos de dessaturase isolados ou recombinantes, e a porções biologicamente activas daqueles. Numa forma de realização, proteínas dessaturase nativas podem ser isoladas de fontes celulares ou tecidulares por um esquema de purificação adequado utilizando técnicas correntes de purificação de proteínas. Noutra forma de realização, as proteínas dessaturase são produzidas por técnicas de ADN recombinante. Alternativamente à expressão recombinante, uma proteína ou polipéptido dessaturase pode ser sintetizado quimicamente utilizando técnicas correntes de síntese de péptidos. 36
Uma proteína ou sua porção biologicamente activa "isolada" ou "purificada" está substancialmente isenta de material celular ou de outras proteínas contaminantes da fonte celular ou tecidular da qual a proteína dessaturase é proveniente, ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizado quimicamente. A linguagem "substancialmente isenta de material celular" inclui preparações da proteína dessaturase na qual a proteína está separada de componentes celulares das células a partir das quais é isolada ou produzida de modo recombinante. Numa forma de realização, a linguagem "substancialmente isenta de material celular" inclui preparações de proteína dessaturase possuindo menos do que cerca de 80%, 70%, 60%, 50%, 40% ou 30% (em peso seco) de proteína não dessaturase (também aqui referida como uma "proteína contaminante"), mais preferencialmente menos do que cerca de 20% de proteína não dessaturase, ainda mais preferencialmente menos do que cerca de 10% de proteína não dessaturase e muito preferencialmente menos do que cerca de 5% de proteína não dessaturase. Quando a proteína dessaturase ou porção biologicamente activa desta é produzida de modo recombinante, ela também está preferencialmente isenta, de modo substancial, de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, mais preferencialmente menos do que cerca de 10% e muito preferencialmente menos do que cerca de 5% do volume da preparação de proteína. A linguagem "substancialmente isenta de precursores químicos ou outras substâncias químicas" inclui preparações de proteína dessaturase nas quais a proteína está separada de precursores químicos ou outras substâncias químicas que estão envolvidas na síntese da proteína. Numa forma de 37 realização, a linguagem "substancialmente isenta de precursores químicos ou outras substâncias químicas" inclui preparações de proteína dessaturase possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou substâncias químicas não dessaturase, mais preferencialmente menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou substâncias químicas não dessaturase, ainda mais preferencialmente menos do que cerca de 10% de precursores químicos ou substâncias químicas não dessaturase e muito preferencialmente menos do que cerca de 5% de precursores químicos ou substâncias químicas não dessaturase. Entender-se-á que as proteínas desta invenção também podem estar numa forma que é diferente das correspondentes proteínas naturais e/ou que está ainda associada a pelo menos alguns componentes celulares. Por exemplo, a proteína pode estar associada a uma membrana celular.
Como aqui utilizada, uma "porção biologicamente activa" de uma proteína dessaturase inclui um fragmento de uma proteína dessaturase o qual participa numa interacção entre uma molécula dessaturase e uma molécula não dessaturase (por exemplo, um substrato de dessaturase tal como um ácido gordo). As porções biologicamente activas de uma proteína dessaturase incluem péptidos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente homólogas ou derivadas das sequências de aminoácidos da dessaturase, por exemplo, as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO:2 ou 4 as quais incluem resíduos de aminoácido suficientes para exibir pelo menos uma actividade de uma proteína dessaturase. Tipicamente, as porções biologicamente activas compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma actividade da proteína dessaturase; a capacidade para (i) 38 interagir com um substrato ou molécula alvo de dessaturase (por exemplo, um ácido gordo intermediário); e/ou (ii) formar uma ligação dupla entre átomos de carbono num substrato ou molécula alvo de dessaturase. A porção biologicamente activa de uma proteína dessaturase pode ser um polipéptido o qual tem, por exemplo, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 ou mais aminoácidos de comprimento. A porção biologicamente activa de uma proteína dessaturase compreende um motivo de ligação de heme e/ou pelo menos um motivo de histidina, preferencialmente cerca de três motivos de histidina. Além disso, podem ser preparadas outras porções biologicamente activas, nas quais estão suprimidas outras regiões da proteína, por técnicas recombinantes e avaliadas em relação a uma ou mais das actividades funcionais de uma proteína dessaturase nativa.
Numa forma de realização preferida, uma proteína dessaturase tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou 4. Noutras formas de realização, a proteína dessaturase é substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 2 ou 4 e retém a actividade funcional da proteína de SEQ ID NO: 2 ou 4, diferindo contudo na sequência de aminoácidos devido a variação alélica natural ou mutagénese, como descrito em pormenor na subsecção I acima. Noutra forma de realização, a proteína dessaturase é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 99% ou mais 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, idêntica à SEQ ID NO: 2 ou 4. 39
Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína dessaturase a qual é codificada por uma molécula de ácido nucleico consistindo de uma sequência de nucleótidos pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou um seu complemento. Esta invenção proporciona ainda uma proteína dessaturase a qual é codificada por uma molécula de ácido nucleico consistindo de uma sequência de nucleótidos a qual hibridiza em condições de hibridização rigorosas num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID N0:1 ou 3, ou um seu complemento. A fim de determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas para efeitos de comparação óptima (por exemplo, podem ser introduzidas lacunas em uma ou em ambas de uma primeira e segunda sequências de aminoácidos ou ácido nucleico para alinhamento óptimo e as sequências não homólogas podem ser ignoradas para efeitos de comparação). O comprimento de uma sequência de referência alinhada para efeitos de comparação é pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 60% e ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, 80% ou 90% do comprimento da sequência de referência (por exemplo, quando se alinha uma segunda sequência com a sequência de aminoácidos de Fad4 de SEQ ID N0:2 possuindo 519 resíduos de aminoácido, pelo menos 156, preferencialmente pelo menos 208, mais preferencialmente pelo menos 260, ainda mais preferencialmente pelo menos 311 e ainda mais 40 preferencialmente pelo menos 363, 415 ou 467 resíduos de aminoácido estão alinhados; quando se alinha uma segunda sequência de aminoácidos de Fad5 de SEQ ID NO: 4 possuindo 439 resíduos de aminoácido, pelo menos 132, preferencialmente pelo menos 176, mais preferencialmente pelo menos 220, ainda mais preferencialmente pelo menos 263 e ainda mais preferencialmente pelo menos 307, 351 ou 395 resíduos de aminoácido estão alinhados. São então comparados os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos nas posições correspondentes de aminoácidos ou posições correspondentes de nucleótidos. Quando uma posição na primeira sequência está ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizada "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente a "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, as quais têm de ser introduzidas para alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser conseguida utilizando um algoritmo matemático. Numa forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) o qual foi incorporado no programa GAP do pacote de software GCG (disponível de http://www.gcg.com), utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e uma ponderação de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e uma 41 ponderação de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Ainda noutra forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos é determinada utilizando o programa GAWP do pacote de software GCG (disponível de http://www.qc.com) , utilizando uma matriz NWSgapdna CMP e uma ponderação de lacuna de 40, 50, 60, 7 0 ou 80 e uma ponderação de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um exemplo preferido, não restritivo de parâmetros a serem utilizados em conjunção com o programa GAP incluem uma matriz de classificação Blosum 62 com uma sanção de lacuna de 12, uma sanção prolongada de lacuna de 4 e uma sanção de deslocamento de lacuna de 5.
Noutra forma de realização, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos é determinada utilizando o algoritmo de Meyers e Miller (Comput. Appl. Biosci, r 4:11-17 (1988)) o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0 ou versão 2.0U), utilizando um quadro de massa de resíduo PAM120, uma sanção de comprimento de lacuna de 12 e uma sanção de lacuna de 4.
As sequências de ácido nucleico e proteína da presente invenção podem ser ainda utilizadas como uma "sequência testemunha" para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando o programa NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. A pesquisa de nucleótidos na BLAST pode ser realizada com o programa NBLAST, resultado = 100, comprimento = 12 para obter sequências de nucleótidos homólogas às moléculas de ácido nucleico de dessaturases da invenção. As pesquisas de proteínas na BLAST podem ser 42 realizadas com o programa XBLAST, resultado = 50, comprimento = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína dessaturases da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para efeitos de comparação, pode utilizar-se o Gapped BLAST como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utiliza os programas BLAST e Gapped BLAST, pode utilizar-se os parâmetros por defeito dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Ver http: //www ncbi . nlm, mh, qcv. III. Métodos de Produção de Ácidos Gordos Insaturados A presente invenção proporciona métodos novos e melhorados de produção de ácidos gordos insaturados, por exemplo, LCPUFAs, como, DHA (ácido docosa-hexaenóico, 22:6 (n-6)), DPA (ácido docosapentaenóico, 22:5 (n-6)), AA (Ácido araquidónico, 20:4 (n-6)) e EPA (ácido eicosapentaenóico, 20:5 (n-3)) . A. Células Recombinantes e Métodos de Cultura de Células A presente invenção proporciona ainda vectores recombinantes que incluem sequências de ácido nucleico que codificam os produtos genéticos como aqui descritos, preferencialmente os produtos genéticos Fad4 e Fad5. O termo vector recombinante inclui um vector (por exemplo, plasmídeo) que foi alterado, modificado ou manipulado de modo a conter mais, menos ou sequências de ácido nucleico diferentes daquelas incluídas no vector ou plasmídeo nativo. Numa forma de realização, um vector recombinante inclui a sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima dessaturase de ácidos gordos operacionalmente ligada a sequências reguladoras. A frase "operacionalmente ligada a sequência(s) reguladora(s)" 43 significa que a sequência de nucleótidos de interesse está ligada às sequência(s) reguladora(s) de um modo que permite a expressão (por exemplo, expressão melhorada, aumentada, constitutiva basal, atenuada, diminuída ou reprimida) de uma sequência de nucleótidos, preferencialmente a expressão de um produto genético codificado por uma sequência de nucleótidos (por exemplo, quando o vector recombinante é introduzido numa célula). Vectores ilustrativos são aqui descritos em mais pormenor bem como, por exemplo, em Frascotti et al., Patente U.S. No. 5,721,137. 0 termo "sequência reguladora" inclui sequências de ácido nucleico que afectam (por exemplo, modulam ou regulam) a expressão de outras sequências de ácido nucleico (não reguladoras) . Numa forma de realização, a sequência reguladora é incluída num vector recombinante numa posição e/ou orientação semelhante ou idêntica relativamente a um gene particular de interesse como é observado para a sequência reguladora e gene de interesse como surge na natureza, por exemplo, numa posição e/ou orientação nativa. Por exemplo, um gene de interesse (por exemplo, um gene Fad4 ou Fad5) pode ser incluído num vector recombinante ligado operacionalmente a uma sequência reguladora a qual acompanha ou está adjacente ao gene no organismo natural (por exemplo, operacionalmente ligado à sequência reguladora "nativa" de Fad4 ou Fad5 (por exemplo, ao promotor "nativo" de Fad4 ou Fad5). Alternativamente, um gene de interesse (por exemplo, um gene Fad4 ou Fad5) pode ser incluído num vector recombinante operacionalmente ligada a uma sequência reguladora que acompanha ou está adjacente a outro gene (por exemplo, um gene diferente) no organismo natural. Por exemplo, um gene de Fad4 ou Fad5 pode ser incluído num vector operacionalmente ligado a 44 sequências reguladoras não-Fad4 ou Fad5. Alternativamente, um gene de interesse (por exemplo, um gene de Fad4 ou Fad5) pode ser incluído num vector operacionalmente ligado a uma sequência reguladora de outro organismo. Por exemplo, sequências reguladoras de outros micróbios (por exemplo, outras sequências reguladoras bacterianas, sequência reguladora de bacteriófago e semelhantes) podem estar operacionalmente ligadas a um gene particular de interesse.
As sequências reguladoras preferidas incluem promotores, intensificadores, sinais de terminação e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sítios de ligação para proteínas reguladoras de transcrição e/ou tradução, por exemplo, no ARNm transcrito). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. As sequências reguladoras incluem aquelas que orientam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleótidos numa célula (por exemplo, promotores constitutivos e promotores constitutivos fortes) , aquelas que dirigem a expressão indutível de uma sequência de nucleótidos numa célula (por exemplo, promotores indutíveis, por exemplo, promotores indutíveis de xilose) e aqueles que atenuam ou reprimem a expressão de uma sequência de nucleótidos numa célula (por exemplo, sinais de atenuação ou sequências repressoras). Encontra-se também dentro do âmbito da presente invenção a regulação da expressão de um gene de interesse através da remoção ou supressão de sequências reguladoras. Por exemplo, as sequências envolvidas na regulação negativa da transcrição 45 podem ser removidas para que seja intensificada a expressão de um gene de interesse.
Numa forma de realização, um vector recombinante da presente invenção inclui sequências de ácido nucleico que codificam pelo menos um produto genético (por exemplo, Fad4 ou Fad5) operacionalmente ligadas a um promotor ou sequência promotora.
Ainda noutra forma de realização, um vector recombinante da presente invenção inclui uma sequência finalizadora ou sequências finalizadoras (por exemplo, sequências finalizadoras da transcrição). 0 termo "sequências finalizadoras" inclui sequências reguladoras que servem para terminar a transcrição de ARNm. As sequências finalizadoras (ou finalizadores de transcrição tandem) podem servir ainda para estabilizar o ARNm (por exemplo, adicionando estrutura ao ARNm), por exemplo, contra nucleases.
Ainda noutra forma de realização, um vector recombinante da presente invenção inclui sequências de resistência a antibióticos. 0 termo "sequências de resistência a antibióticos" inclui sequências que promovem ou conferem resistência a antibióticos no organismo do hospedeiro. Numa forma de realização, as sequências de resistência a antibióticos são seleccionadas do grupo consistindo de car (resistência ao cloranfenicol), sequências tet (resistência à tetraciclina), sequências erm (resistência à eritromicina), sequências neo (resistência à neomicina) e sequências spec (resistência à espeetinomicina). Os vectores recombinantes da presente invenção podem incluir ainda sequências de recombinação homólogas (por exemplo, 46 sequências concebidas para permitir a recombinação do gene de interesse no cromossoma do organismo hospedeiro). Por exemplo, as sequências amyE podem ser utilizadas como alvos de homologia para recombinação no cromossoma hospedeiro. 0 termo "célula manipulada" inclui uma célula que foi manipulada (por exemplo, manipulada geneticamente) ou modificada de modo a que a célula possua pelo menos uma dessaturase de ácidos gordos, por exemplo, Fad4 e/ou Fad5, pelo que é produzido um ácido gordo insaturado. A modificação ou manipulação de tais microrganismos pode ser efectuada segundo qualquer metodologia aqui descrita incluindo, mas não se limitando a, desregulação de uma via biossintética e/ou sobreexpressão de pelo menos uma enzima biossintética. Uma enzima "manipulada" (por exemplo, uma enzima biossintética "manipulada") inclui uma enzima, cuja expressão ou produção foi alterada ou modificada de modo a que pelo menos um precursor, substrato ou produto da enzima a montante ou a jusante é alterado ou modificado, por exemplo, em comparação com a enzima natural ou de tipo selvagem correspondente. 0 termo "sobreexpressado" ou "sobreexpressão" inclui a expressão de um produto genético (por exemplo, uma dessaturase de ácido gordo) a um nivel superior ao que era expressado antes da manipulação da célula ou numa célula comparável que não foi manipulada. Numa forma de realização, a célula pode ser geneticamente manipulada (por exemplo, geneticamente manipulada) para sobreexpressar um nível de produto genético maior do que o expressado antes da manipulação da célula ou numa célula comparável que não foi manipulada. A manipulação genética pode incluir, mas não se limita a alteração ou modificação de sequências 47 reguladoras ou sítios associados à expressão de um gene particular (por exemplo, adicionando promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou removendo sequências reguladoras para que a expressão seja constitutiva), modificação da localização cromossómica de um gene particular, alteração das sequências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular tal como um sitio de ligação de ribossoma ou finalizador de transcrição, aumento do número de cópias de um gene particular, modificação de proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressores, intensificadores, activadores transcricionais e semelhantes) envolvidas na transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto genético particular, ou quaisquer outros meios convencionais de desregulação da expressão de um gene particular, rotineiros na técnica (incluindo mas não se limitando à utilização de moléculas de ácido nucleico antimensageiro, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras).
Noutra forma de realização, a célula pode ser fisicamente ou ambientalmente manipulada para sobreexpressar um nível de produto genético maior do que aquele expressado antes da manipulação da célula ou numa célula comparável que não foi manipulada. Por exemplo, uma célula pode ser tratada ou cultivada na presença de um agente que se sabe ou suspeita que aumenta a transcrição de um gene particular e/ou a tradução de um produto genético particular pelo que a transcrição e/ou tradução são intensificadas ou aumentadas. Alternativamente, uma célula pode ser cultivada a uma temperatura seleccionada para aumentar a transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto genético particular pelo que a transcrição e/ou tradução são intensificadas ou aumentadas. 48 0 termo "desregulada" ou "desregulação" inclui a alteração ou modificação de pelo menos um gene numa célula que codifica uma enzima numa via biossintética, pelo que o nivel ou actividade da enzima biossintética na célula é alterada ou modificada. Preferencialmente, pelo menos um gene que codifica uma enzima numa via biossintética é alterado ou modificado pelo que o produto genético é intensificado ou aumentado. A frase "via desregulada" também pode incluir uma via biossintética na qual mais do que um gene que codifica uma enzima numa via biossintética é alterada ou modificada pelo que o nível ou actividade de mais do que uma enzima biossintética é alterada ou modificada. A capacidade para "desregular" uma via (por exemplo, para desregular simultaneamente mais do que um gene numa dada via biossintética) numa célula resulta do fenómeno particular de células nas quais mais do que uma enzima (por exemplo, duas ou três enzima biossintéticas) são codificadas por genes que ocorrem adjacentes um ao outro numa peça contígua de material genético designado por "operão". 0 termo "operão" inclui uma unidade coordenada de expressão genética que contém um promotor e possivelmente um elemento regulador associado a um ou mais, preferencialmente pelo menos dois, genes estruturais (por exemplo, genes que codificam enzimas, por exemplo, enzimas biossintéticas). A expressão dos genes estruturais pode ser coordenadamente regulada, por exemplo, por proteínas reguladoras que se ligam ao elemento regulador ou por anti-finalização da transcrição. Os genes estruturais podem ser transcritos para dar um ARNm simples que codifica todas as proteínas estruturais. Devido à coordenação regulada de genes 49 incluídos num operão, a alteração ou modificação do único elemento promotor e/ou regulador pode resultar na alteração ou modificação de cada produto genético codificado pelo operão. A alteração ou modificação do elemento regulador pode incluir, mas não se limita à remoção do(s) elemento(s) promotor(es) e/ou regulador(es) endógenos, adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou remoção de sequências reguladoras de modo a modificar a expressão dos produtos genéticos, modificação da localização cromossómica do operão, alteração de sequências de ácido nucleico adjacentes ao operão ou dentro do operão tal como um sítio de ligação de ribossoma, aumento do número de cópias do operão, modificação de proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressores, intensificadores, activadores transcricionais e semelhantes) envolvidas na transcrição do operão e/ou tradução dos produtos genéticos do operão, ou qualquer outro meio convencional de desregulação da expressão de genes, rotineiro na técnica (incluindo mas não se limitando à utilização de moléculas de ácido nucleico antimensageiras, por exemplo, para bloquear a expressão de proteína repressora). A desregulação também pode envolver a alteração da região de codificação de um ou mais genes para produzir, por exemplo, uma enzima que é resistente ao retorno ou tem uma actividade específica superior ou inferior.
Uma célula "recombinante" particularmente preferida da presente invenção foi geneticamente manipulada para sobreexpressar um gene ou produto genético derivado de vegetal ou um gene ou produto genético derivado de microrganismo. 0 termo "derivado de vegetal," "derivado de microrganismo" ou "derivado de" inclui, por exemplo, um 50 gene o qual está naturalmente presente num microrganismo ou numa planta, por exemplo, uma planta oleaginosa, ou um produto genético (por exemplo, Fad4 ou Fad5) ou o qual é codificado por um gene vegetal ou um gene de um microrganismo (por exemplo, codificado SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:3).
As metodologias da presente invenção proporcionam células recombinantes as quais sobreexpressam pelo menos uma dessaturase de ácidos gordos. Numa forma de realização, uma célula recombinante da presente invenção foi geneticamente manipulada para sobreexpressar uma dessaturase de ácidos gordos de Thrauschytrium sp. (por exemplo, foi manipulada para sobreexpressar pelo menos uma dessaturase Δ4 ou Δ5 (o produto genético Fad4 ou Fad5) (por exemplo, uma dessaturase de ácidos gordos possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4 ou codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ou 3) de
Thrauschytrium sp..
Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma célula (por exemplo, uma célula microbiana) que foi transformada com um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico de dessaturase de ácidos gordos (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de dessaturase de ácidos gordos como explicitada na SEQ ID NO: 1 ou 3).
Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de modulação da produção de ácidos gordos compreendendo cultivar células transformadas pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, uma dessaturase) de modo a que ocorra a modulação da produção de ácidos gordos (por exemplo, a produção de ácidos gordos 51 insaturados é melhorada). 0 método de cultura das células transformadas pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, Fad4 e Fad5) para modular a produção de ácidos gordos é aqui referido como "biotransformação." Os processos de biotransformação podem utilizar as células recombinantes e/ou dessaturases aqui descritas. 0 termo "processo de biotransformação," também aqui referido como "processos de bioconversão," incluem processos biológicos que resultam na produção (por exemplo, transformação ou conversão) de qualquer composto (por exemplo, substrato, intermediário ou produto) que está a montante de uma dessaturase de ácidos gordos num composto (por exemplo, substrato, intermediário, ou produto) que está a jusante de uma dessaturase de ácidos gordos, e particular, um ácido gordo insaturado. Numa forma de realização, a invenção proporciona um processo de biotransformação para a produção de um ácido gordo insaturado compreendendo pôr em contacto uma célula que sobreexpressa pelo menos uma dessaturase de ácidos gordos com pelo menos um substrato apropriado em condições de modo a produzir um ácido gordo insaturado e, opcionalmente, recuperar o ácido gordo. Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um processo de biotransformação para a produção de ácidos gordos insaturados compreendendo pôr em contacto uma célula que sobreexpressa Fad4 ou Fad5 com um substrato apropriado (por exemplo, um ácido gordo intermediário) em condições de modo a produzir um ácido gordo insaturado (por exemplo, DHA) e, opcionalmente, recuperar o ácido gordo insaturado. As condições sob as quais é produzido um ácido gordo insaturado podem incluir quaisquer condições que resultem na produção desejada de um ácido gordo insaturado. 52 A(s) célula (s) e/ou enzimas utilizadas nas reacções de biotransformação estão numa forma que permite que elas realizem a função pretendida (por exemplo, produção de um ácido gordo desejado) . As células podem ser células inteiras ou podem ser apenas aquelas partes das células necessárias para obter o resultado final desejado. As células podem ser suspensas (por exemplo, numa solução apropriada tal como soluções ou meios tamponados) , lavadas (por exemplo, lavadas para eliminar o meio de cultura das células), secas em acetona, imobilizadas (por exemplo, com gel de poliacrilamida ou k-carragenina ou em suportes sintéticos, por exemplo, esferas, matrizes e semelhantes), fixadas, reticuladas ou permeabilizadas (por exemplo, ter membranas e/ou paredes permeabilizadas para que os compostos , por exemplo, substratos, intermediários ou produtos possam passar mais facilmente através da referida membrana ou parede) . 0 tipo de célula pode ser qualquer célula capaz de ser utilizada nos métodos da invenção, por exemplo, células vegetais, animais ou microbianas.
Um aspecto importante da presente invenção envolve o crescimento da planta recombinante ou a cultura dos microrganismos recombinantes aqui descritos, de modo a que seja produzido um composto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado desejado). 0 termo "cultivar" inclui manter e/ou crescer um microrganismo vivo da presente invenção (por exemplo, manter e/ou crescer uma cultura ou estirpe). Numa forma de realização, um microrganismo da invenção é cultivado em meio liquido. Noutra forma de realização, um microrganismo da invenção é cultivado em meio sólido ou meio semi-sólido. Numa forma de realização preferida, um microrganismo da invenção é cultivado em meios (por exemplo, um meio liquido, estéril) compreendendo 53 nutrientes essenciais ou benéficos à manutenção e/ou crescimento do microrganismo (por exemplo, fontes de carbono ou substrato de carbono, por exemplo hidratos de carbono complexos como farinha de feijão ou cereal, amidos, açúcares, açúcar-álcoois, hidrocarbonetos, óleos, gorduras, ácidos gordos, ácidos orgânicos e álcoois; fonte de azoto, por exemplo, proteínas vegetais, peptonas, péptidos e aminoácidos derivados de cereais, feijões e tubérculos, proteínas, péptidos e aminoácidos derivados de fontes animais como carne, leite e produtos secundários animais como peptonas, extractos de carne e hidrolisados de caseína; fontes de azoto inorgânico como ureia, sulfato de amónio, cloreto de amónio, nitrato de amónio e fosfato de amónio; fontes de fósforo, por exemplo, ácido fosfórico, seus sais de sódio e potássio; oligoelementos, por exemplo, sais de magnésio, ferro, manganês, cálcio, cobre, zinco, boro, molibdénio e/ou cobalto; bem como factores de crescimento como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e semelhantes).
Preferencialmente, os microrganismos da presente invenção são cultivados sob pH controlado. 0 termo "pH controlado" inclui qualquer pH que resulte na produção do produto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado). Numa forma de realização, os microrganismos são cultivados a um pH de cerca de 7. Noutra forma de realização, os microrganismos são cultivados a um pH entre 6,0 e 8,5. O pH desejado pode ser mantido por qualquer de um número de métodos conhecidos dos especialistas na técnica.
Também preferencialmente, os microrganismos da presente invenção são cultivados sob arejamento controlado. O termo "arejamento controlado" inclui arejamento suficiente (por 54 exemplo, oxigénio) para resultar na produção do produto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado). Numa forma de realização, o arejamento é controlado regulando os níveis de oxigénio na cultura, por exemplo, regulando a quantidade de oxigénio dissolvido no meio de cultura. Preferencialmente, o arejamento da cultura é controlado agitando a cultura. A agitação pode ser proporcionada por uma hélice ou equipamento de agitação semelhante, rodando ou agitando o vaso de crescimento (por exemplo, fermentador) ou por vários equipamentos de bombagem. 0 arejamento pode ser ainda controlado pela passagem de ar ou oxigénio estéril através do meio (por exemplo, através da mistura de fermentação). Também preferencialmente, os microrganismos da presente invenção são cultivados sem formação excessiva de espuma (por exemplo, via adição de agentes antiespumantes).
Além disso, as plantas ou microrganismos da presente invenção podem ser cultivados sob temperaturas controladas. 0 termo "temperatura controlada" inclui qualquer temperatura que resulte na produção do produto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado). Numa forma de realização, as temperaturas controladas incluem temperaturas entre 15°C e 95°C. Noutra forma de realização, temperaturas controladas incluem temperaturas entre 15°C e 70°C. As temperaturas preferidas são entre 20°C e 55°C, mais preferencialmente entre 30°C e 45°C ou entre 30°C e 50 °C.
Os microrganismos podem ser cultivados (por exemplo, mantidos e/ou multiplicados) em meio líquido e preferencialmente são cultivados, continua ou intermitentemente, por métodos de cultura convencionais 55 como cultura em repouso, cultura em tubo de ensaio, cultura em agitação (por exemplo, cultura em agitação rotativa, cultura em balão de agitação, etc.), cultura em placa de arejamento ou fermentação. Numa forma de realização preferida, os microrganismos são cultivados em balões de agitação. Numa forma de realização mais preferida, os microrganismos são cultivados num fermentador (por exemplo, um processo de fermentação). Os processos de fermentação da presente invenção incluem, mas não se limitam a métodos de fermentação por lotes, alimentados por lotes e contínuos métodos. A frase "processo por lotes" ou "fermentação por lotes" refere-se a um sistema fechado no qual a composição do meio, nutrientes, aditivos suplementares e semelhantes é estabelecida no início da fermentação e não sujeita a alteração durante a fermentação, contudo, podem ser feitas tentativas para controlar factores como pH e concentração de oxigénio para prevenir acidificação excessiva do meio e/ou morte do microrganismo. A frase "processo alimentado por lotes" ou fermentação "alimentada por lotes" refere-se a uma fermentação por lotes com a excepção de que são adicionados um ou mais substratos ou suplementos (por exemplo, adicionados em incrementos ou continuamente) à medida que a fermentação progride. A frase "processo contínuo" ou "fermentação contínua" refere-se a um sistema no qual um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um fermentador e uma quantidade igual de meio utilizado ou "condicionado" é simultaneamente retirado, preferencialmente para recuperação do produto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado). Foi desenvolvida uma variedade de tais processos e são bem conhecidos na técnica. 56 A frase "cultivar em condições de modo a que seja produzido um composto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado, por exemplo, DHA)" inclui manter e/ou multiplicar plantas ou microrganismos em condições (por exemplo, temperatura, pressão, pH, duração, etc.) apropriadas ou suficientes para obter a produção do composto desejado ou para obter rendimentos desejados do composto particular a ser produzido. Por exemplo, a cultura é prosseguida durante um periodo de tempo suficiente para produzir a quantidade desejada de um ácido gordo insaturado (por exemplo, DHA) . Preferencialmente, a cultura é prosseguida durante um periodo de tempo suficiente para atingir substancialmente uma produção máxima do ácido gordo insaturado. Numa forma de realização, a cultura é prosseguida durante cerca de 12 até 24 horas. Noutra forma de realização, a cultura é prosseguida durante cerca de 24 até 36 horas, 36 até 48 horas, 48 até 72 horas, 72 até 96 horas, 96 até 120 horas, 120 até 144 horas, ou superiores a 144 horas. Noutra forma de realização, a cultura é prosseguida durante um periodo de tempo suficiente para atingir rendimentos de produção de ácidos gordos insaturados, por exemplo, as células são cultivadas de modo a que sejam produzidos pelo menos cerca de 15 até 20 g/L de ácidos gordos insaturados, sejam produzidos pelo menos cerca de 20 até 25 g/L de ácidos gordos insaturados, sejam produzidos pelo menos cerca de 25 até 30 g/L de ácidos gordos insaturados, sejam produzidos pelo menos cerca de 30 até 35 g/L de ácidos gordos insaturados, sejam produzidos pelo menos cerca de 35 até 40 g/L de ácidos gordos insaturados (por exemplo, pelo menos cerca de 37 g/L de ácidos gordos insaturados) ou sejam produzidos pelo menos cerca de 40 até 50 g/L de ácidos gordos insaturados. Ainda noutra forma de realização, os microrganismos são 57 cultivados em condições de modo a que seja produzido um rendimento preferido de ácidos gordos insaturados, por exemplo, um rendimento na gama explicitada acima, em cerca de 24 horas, em cerca de 36 horas, em cerca de 48 horas, em cerca de 72 horas ou em cerca de 96 horas.
Ao produzir ácidos gordos insaturados, pode ser ainda desejável cultivar células da presente invenção na presença de substratos biossintéticos de ácido gordo suplementares. 0 termo "substrato biossintético de ácido gordo suplementar" inclui um agente ou composto o qual, quando colocado em contacto com uma célula ou incluído no meio de cultura de uma célula, serve para melhorar ou aumentar a biossíntese de ácido gordo insaturado. Os substratos biossintéticos de ácido gordo suplementares podem ser adicionados na forma de uma solução ou suspensão concentrada (por exemplo, num solvente adequado como água ou tampão) ou na forma de um sólido (por exemplo, na forma de um pó) . Além disso, os substratos biossintéticos de ácido gordo suplementares da presente invenção podem ser adicionados como uma alíquota única, continuamente ou intermitentemente ao longo de um dado período de tempo. etc.) A metodologia da presente invenção pode incluir ainda um passo de recuperação de um composto desejado (por exemplo, um ácido gordo insaturado). 0 termo "recuperação" de um composto desejado inclui extrair, colher, isolar ou purificar o composto do meio de cultura. A recuperação do composto pode ser realizada segundo qualquer metodologia de isolamento ou purificação convencional conhecida na técnica incluindo, mas não se limitando a, tratamento com uma resina convencional (por exemplo, resina de troca aniónica ou catiónica, resina de adsorção não iónica, 58 tratamento com um adsorvente convencional (por exemplo, carvão activado, ácido silicico, sílica gel, celulose, alumina, etc.), alteração de pH, extracção com solvente (por exemplo, com um solvente convencional como um álcool, acetato de etilo, hexano e semelhantes), diálise, filtração, concentração, cristalização, recristalização, ajuste de pH, liofilização e semelhantes. Por exemplo, um composto pode ser recuperado do meio de cultura removendo em primeiro lugar os microrganismos da cultura. 0 meio é então feito passar através ou sobre uma resina de troca catiónica para remover catiões indesejados e em seguida através ou sobre uma resina de troca aniónica para remover aniões inorgânicos e ácidos orgânicos indesejados possuindo uma acidez superior ao ácido gordo insaturado de interesse (por exemplo, DHA).
Preferencialmente, um composto desejado é "extraído," "isolado" ou "purificado" de modo a que a preparação resultante esteja substancialmente isenta de outros componentes (por exemplo, isenta de componentes do meio e/ou produtos secundários de fermentação). A linguagem "substancialmente isenta de outros componentes" inclui preparações de composto desejado nas quais o composto está separado (por exemplo, purificado ou parcialmente purificado) de componentes do meio ou de produtos secundários de fermentação da cultura a partir da qual é produzido. Numa forma de realização, a preparação tem mais do que cerca de 80% (em peso seco) do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 20% de outros componentes do meio ou produtos secundários de fermentação), mais preferencialmente mais do que cerca de 90% do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 10% de outros componentes do meio ou produtos 59 secundários de fermentação), ainda mais preferencialmente mais do que cerca de 95% do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 5% de outros componentes do meio ou produtos secundários de fermentação) e muito preferencialmente mais do que cerca de 98-99% do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 1-2% de outros componentes do meio ou produtos secundários de fermentação). Quando o composto desejado é um ácido gordo insaturado que foi derivatizado num sal, o composto está ainda preferencialmente isento (por exemplo, substancialmente isento) de contaminantes quimicos associados à formação do sal. Quando o composto desejado é um ácido gordo insaturado que foi derivatizado num álcool, o composto está ainda preferencialmente isento (por exemplo, substancialmente isento) de contaminantes químicos associados à formação do álcool.
Numa forma de realização alternativa, o ácido gordo insaturado desejado não é purificado da planta ou microrganismo, por exemplo, quando a planta ou microrganismo é biologicamente não perigoso (por exemplo, seguro) . Por exemplo, a planta ou cultura inteira (ou sobrenadante da cultura) pode ser utilizado como uma fonte de produto (por exemplo , produto em bruto). Numa forma de realização, a planta ou cultura (ou sobrenadante da cultura) é utilizado sem modificação. Noutra forma de realização, a planta ou cultura (ou sobrenadante da cultura) é concentrada. Ainda noutra forma de realização, a planta ou cultura (sobrenadante da cultura) é pulverizado, seco ou liofilizado. B. Metodologias de Produção de Alto Rendimento 60
Uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção é um método de produção de alto rendimento para produzir ácidos gordos insaturados, por exemplo, DHA, compreendendo cultivar uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido o ácido gordo insaturado com um rendimento significativamente alto. A frase "método de produção de alto rendimento," por exemplo, um método de produção de alto rendimento para produzir um composto desejado (por exemplo, para produzir um ácido gordo insaturado) inclui um método que resulta na produção do composto desejado a um nivel que é alto ou acima do que é habitual para métodos de produção comparáveis. Preferencialmente, um método de produção de alto rendimento resulta na produção do composto desejado com um rendimento significativamente alto. A frase "rendimento significativamente alto" inclui um nivel de produção ou rendimento o qual é suficientemente alto ou acima do que é habitual para métodos de produção comparáveis, por exemplo, o qual é aumentado até um nivel suficiente para produção comercial do produto desejado (por exemplo, produção do produto a um custo comercialmente exequível). Numa forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nível superior a 2 g/L. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nível superior a 10 g/L. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de 61 alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nivel superior a 20 g/L. Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nivel superior a 30 g/L. Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nivel superior a 40 g/L. A invenção proporciona ainda um método de produção de alto rendimento para produzir um composto desejado (por exemplo, para produzir um ácido gordo insaturado) que envolve a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um nivel suficientemente elevado de composto num periodo de tempo comercialmente desejável. Numa forma de realização ilustrativa, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nivel superior a 15-20 g/L em 36 horas. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que sejam produzidos ácidos gordos insaturados a um 62 nível superior a 25-30 g/L em 48 horas. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que sejam produzidos ácidos gordos insaturados a um nível superior a 35-40 g/L em 72 horas, por exemplo, superior a 37 g/L em 72 horas. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de alto rendimento de produção de ácidos gordos insaturados que inclui a cultura de uma planta ou microrganismo manipulado em condições de modo a que seja produzido um ácido gordo insaturado a um nível superior a 30-40 g/L em 60 horas; por exemplo, superior a 30, 35 ou 40 g/L em 60 horas. Os valores e gamas incluídos e/ou intermédios dentro das gamas aqui explicitadas também estão dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, a produção de ácido gordo insaturado a niveis de pelo menos 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 e 39 g/L em 60 horas estão incluídos dentro da gama de 30-40 g/L em 60 horas. Noutro exemplo, as gamas de 30-35 g/L ou 35-40 g/L estão incluídos dentro da gama de 30-40 g/L em 60 horas. Além disso, o especialista compreenderá que a cultura de um microrganismo manipulado para atingir um nível de produção, por exemplo, de "30-40 g/L em 60 horas" inclui a cultura do microrganismo durante períodos de tempo adicionais (por exemplo, períodos de tempo mais longos do que 60 horas), resultando opcionalmente em rendimentos ainda mais elevados de um ácido gordo insaturado a ser produzido. IV. Composições
As moléculas de ácido nucleico de dessaturases e proteínas da invenção podem ser utilizadas para produzir ácidos gordos insaturados os quais podem ser incorporados em 63 63 por exemplo, compostos para neutracêuticos e composições composições. As composições incluem, composições para utilização como alimentos animais, composições para utilização como (por exemplo, suplementos alimentares) farmacêuticas adequadas para administração.
Tais composições farmacêuticas compreendem tipicamente um ácido gordo insaturado e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizada, a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluir qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto activo, é contemplada a sua utilização nas composições. Nas composições também podem ser incorporados compostos activos adicionais.
Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem a administração parentérica, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica), transmucosal e rectal. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como água para preparação injectável, soro fisiológico, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes como ácido 64 ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.
As composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções (quando solúvel em água) ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany; NJ) ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição tem de ser estéril e deveria ser fluida até ao ponto em que existe uma administração fácil com seringa. Deverá ser estável nas condições de fabrico e armazenagem e tem de ser conservada contra a acção contaminante de microrganismos como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento como uma lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, 65 timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrase a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto activo (por exemplo, um LCPUFA, ou um seu fragmento, produzido pelas moléculas de ácido nucleico e proteína da presente invenção) na quantidade necessária de um solvente apropriado com um ou uma associação de ingredientes enumerados acima, consoante necessário, seguido de esterilização por filtração. Dum modo geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto activo num veículo estéril o qual contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são a secagem por vácuo e a liofilização as quais produzem um pó do ingrediente activo com qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução daqueles previamente esterilizada por filtração.
As composições orais incluem duma maneira geral um diluente inerte ou um veículo comestível. Elas podem ser fechadas em cápsulas de gelatina ou prensadas em comprimidos. Para o efeito de administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e utilizados na forma de comprimidos, trociscos ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas utilizando um veiculo fluido para utilização como um colutório, em que o composto no 66 veículo fluido é aplicado por via oral e bochechado e expectorado ou engolido. Podem ser incluídos aglutinantes e/ou adjuvantes farmaceuticamente compatíveis como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de natureza semelhante: um aglutinante como celulose microcristalina, goma de tragacanta ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um desintegrante como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um edulcorante como sacarose ou sacarina; ou um aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja.
Para administração por inalação, os compostos são administrados na forma de uma formulação para pulverização de aerossol a partir de um recipiente ou distribuidor pressurizado o qual contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás como dióxido de carbono ou um nebulizador. A administração sistémica também pode ser por meio transmucosal ou transdérmico. Para administração transmucosal ou transdérmica, na formulação são utilizados penetrantes apropriados à barreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. A administração transmucosal pode ser conseguida através da utilização de pulverizadores nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos activos são formulados em pomadas, unguentos, geles ou cremes como é geralmente conhecido na técnica. 67
Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases convencionais para supositório como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou enemas de retenção para administração rectal.
Os compostos activos podem ser preparados com veiculos que protegerão o composto contra eliminação rápida do organismo, como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, poli(ácido glicólico) , colagénio, poliortoestéres e poli(ácido láctico). Os métodos de preparação de tais formulações serão evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Também podem ser utilizadas suspensões lipossomais (incluindo lipossomas orientados para células infectadas com anticorpos monoclonais contra antigénios virais) como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados segundo métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No. 4,522,811. É especialmente vantajoso formular composições orais ou parentéricas em formas unitárias de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. Forma unitária de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de composto activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as 68 formas unitárias de dosagem são ditadas e directamente dependentes das caracteristicas únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido, e das limitações inerentes na técnica de formulação de um tal composto activo para o tratamento de indivíduos. A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos correntes em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) . A razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser exprimido como a razão LD50/ED50. São preferidos os compostos que exibem índices terapêuticos grandes. Embora possam ser utilizados compostos que exibem efeitos secundários tóxicos, deverá ter-se cuidado para conceber um sistema de administração que direccione esses compostos para o sítio de tecido afectado para minimizar a lesão potencial de células não infectadas e reduzir, desse modo, os efeitos secundários.
Os dados obtidos dos ensaios com culturas de células e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente numa gama de concentrações em circulação que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir dos ensaios em culturas de células. Pode formular-se uma dose em modelos animais 69 para atingir uma gama de concentração no plasma em circulação que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de ensaio que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas) como determinada em culturas de células. Esta informação pode ser utilizada para determinar com mais exactidão doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
Como aqui definida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína ou polipéptido (isto é, uma dosagem eficaz) varia de cerca de 0,001 até 30 mg/kg de massa corporal, preferencialmente cerca de 0,01 até 25 mg/kg de massa corporal, mais preferencialmente cerca de 0,1 até 20 mg/kg de massa corporal, e ainda mais preferencialmente cerca de 1 até 10 mg/kg, 2 até 9 mg/kg, 3 até 8 mg/kg, 4 até 7 mg/kg ou 5 até 6 mg/kg de massa corporal. O especialista compreenderá que determinados factores podem influenciar a dosagem necessária para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, do estado físico geral e/ou idade do indivíduo e de outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína, polipéptido ou anticorpo pode incluir um único tratamento ou, preferencialmente, pode incluir uma série de tratamentos.
Num exemplo preferido, um indivíduo é tratado com um LCPUFA na gama entre cerca de 0,1 até 20 mg/kg de massa corporal, uma vez por semana durante entre cerca de 1 até 10 semanas, preferencialmente, entre 2 até 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 até 7 semanas e ainda mais preferencialmente durante cerca de 4, 5 ou 6 semanas. 70
Entender-se-á também que a dosagem eficaz de anticorpo, proteína ou polipéptido utilizado para tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um tratamento particular. As alterações na dosagem podem resultar e tornar-se evidentes dos resultados de ensaios de diagnóstico como aqui descritos.
As composições farmacêuticas podem ser incluídas num recipiente, embalagem ou distribuidor conjuntamente com instruções para administração.
Esta invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes, os quais não deverão ser interpretados como restritivos.
EXEMPLOS
Materiais: Thraustochytrium s.p ATCC 21685 foi adquirido de American type culture collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 EUA) e multiplicado num meio (Weete, J.D., et al. (1997) Lipids 32:839-845) a 24°C durante 7 dias. Depois disso, colheu-se a biomassa por centrifugação e utilizou-se para isolamento de ARN. EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO E RASTREIO DA BIBLIOTECA DE ADNc
Isolou-se o ARN total dos materiais acima segundo Qiu e Erickson (Qiu, X. e Eriekson, L. (1994) Plant Mol. Biol. Repr. 12:209-214). Construiu-se a biblioteca de ADNc a partir do ARN total. Sintetizou-se a primeira cadeia de ADNc por transcriptase inversa superscript II de Gibco-BRL. Sintetizou-se a segunda cadeia de ADNc por ADN polimerase I de Stratagene. Depois do fraccionamento do tamanho, as inserções de ADNc maiores do que 1 kb foram ligadas ao vector λ Uni-Zap XR (Stratagerie). Os ADNs recombinantes foram depois empacotados com extracto de empacotamento 71
Gigapack III Gold (Stratagene) e aplicados em placas NZY. A biblioteca resultante representou mais do que 5 * 10 6 clones independentes. O rastreio da biblioteca de ADNc foi realizado segundo métodos correntes (Sambrook, J, Fritseh, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning - A laboratory manual. (Cold Spring Harbor, New York, EUA.)
EXEMPLO 2: RT-PCR 0 ADNc monocatenário foi sintetizado por transcriptase inversa superscript II (Gibco-BRL) a partir de ARN total e foi então utilizado como uma cadeia molde para reacção de PCR com dois iniciadores degenerados (0 iniciador directo: GCXCA/GAXGAXCAC/TCCXGGXGG e o iniciador inverso: ATXTG/TXGGA/GAAXAG/AG/ATGG/ATG). A amplificação por PCR consistiu de 35 ciclos com 1 min a 94° C, 1,5 min a 55 °C e 2 min a 72 °C, seguidos de um passo de alongamento a 72 °C durante 10 min. Os produtos amplificados de 800 pb até 1000 pb foram isolados de gel de agarose e purificados por um estojo (purificação por gel Qiaex II, Qiagen), e subsequentemente clonados no vector de clonagem TA pCR®2.1. (Invitrogen). As inserções clonadas foram depois sequenciadas pelo Sistema de Sequenciação PRISM DyeDeoxy Terminator Cycle (Perkin Elmer/Applied Biosystems).
EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DE FAD4 E FAD5 EM LEVEDURA
As grelhas de leitura aberta de Fad4 e Fad5 foram amplificadas por PCR utilizando a enzima Precision Plus (Stratagene) e clonadas num vector de clonagem TA (pCR®2.1, Invitrogen). Uma vez confirmado que os produtos de PCR eram idênticos aos ADNcs originais por sequenciação, os fragmentos foram depois libertados por uma digestão dupla com BamHI-EcoRI e inseridos no vector de expressão de 72 levedura pYES2 (Invitrogen) sob o controlo do promotor indutível GAL1. A estirpe de levedura InvSc2 (Invitrogen) foi transformada com as construções de expressão utilizando o método de acetato de litio e foram seleccionados transformantes em placas com meio mínimo sem uracilo (Gietz, D., et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1425; Covello, P.S. e Reed, D.W. (1996) Plant Physiol. 111:223-226). OS transformantes foram primeiramente multiplicados em meio mínimo sem uracilo e contendo glucose a 28°C. Após cultura dum dia para o outro, as células foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas em água destilada. Meio mínimo contendo 2% de galactose, com ou sem 0,3 mM de substrato de ácidos gordos na presença de 0,1 % de tergitol foi inoculado com a suspensão da célula transformante de levedura e incubada a 20 °C durante três dias e depois a 15 °C durante mais três dias.
EXEMPLO 4: ANÁLISE DE ÁCIDOS GORDOS
As células de thraustochytrium e levedura foram colhidas e lavadas duas vezes com água destilada. Adicionou-se então 2 mL de KOH metanólico (7,5% m/v de KOH em metanol a 95%) aos materiais e aqueceu-se a mistura selada num tubo de cultura em vidro de 12 mL até 80 °C durante 2 horas. Adicionou-se 0,5 mL de água e extraiu-se a amostra duas vezes com 2 mL de hexano para eliminar os lípidos não saponifiçáveis. A fase aquosa remanescente foi então acidificada adicionando 1 mL de HC1 6 N e extraída duas vezes com 2 mL de hexano. As fases de hexano foram combinadas e secas sob uma corrente de azoto, foi adicionado 2 mL de HC1 metanólico 3 N (SUPELCO, Supelco 73
Park, Bellefonte, PA 16823-0048) e a mistura foi aquecida a 80°C durante 2 horas. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, adicionou-se 1 mL de NaCl a 0,9% e extraiu-se a mistura duas vezes com 2 χ 2 mL de hexano. Evaporou-se o hexano combinado sob azoto. Os ésteres metilicos de ácido gordo (FAMEs) resultantes foram analisados por GC e GC-MS segundo Covello & Reed (Covello, P.S. e Reed, D.W. (1996) Plant Physiol. 111:223-226). A análise por GC/MS foi realizada no modo de EI padrão utilizando um espectrómetro de massa Fisons VG TRIO 2000 (VG Analytical, UK) controlado pelo software Masslynx versão 2.0, acoplado a um cromatógrafo gasoso GC 8000 Series. Para a análise de FAME foi utilizada uma coluna DB-23 (30 m χ 0,25 mm i.d., 0,25 μιη de espessura de filme, J&W Scientific, Folsom, CA) cuja temperatura foi programada a 180 °C durante 1 min, depois a 4 °C /min até 240 °C e mantida durante 15 minutos.
EXEMPLO 5: TRANSFORMAÇÃO DE BRASSICA JUNCEA E LINHO (LINUM USITATISSIMUM) E TRATAMENTO COM ÁCIDO GORDO EXÓGENO
Utilizou-se hipocótilos de plantas com 5-6 dias de B. juncea e linho como explantes para inoculação com o Agrobacterium tumefaciens que hospeda vectores binários com os ADNcs completos sob o controlo de promotores diferentes. Utilizou-se plantas transgénicas com 20 dias para tratamento com ácido gordo exógeno. A planta foi dividida em três partes: folhas, caules e raízes. Cada uma foi cortada em pedaços pequenos e colocados numa placa de titulação de 24 poços. A cada poço, adicionou-se 2 mL de sal de sódio a 0,05% de substratos (NuCheck Prep Inc. , Elysian, MN). A placa foi então incubada a 24°C durante 4 h com agitação suave. Após incubação, os tecidos vegetais 74 foram lavados três vezes com água e depois usados para análise de ácido gordo. EXEMPLO 6: PERFIL DE ÁCIDO GORDO DE THRAUSCHYTRIUM SP. A thraustochytrium chamou recentemente a atenção cientifica devido à sua capacidade na produção de LCPUFAs como DHA, AA, EPA e DPA. A Figura 11 mostra a composição de ácido gordo dos lipidos isolados de culturas de 7 dias de Thraustochytrium sp.. Como se mostra nos quadros, os microrganismos contêm uma grande gama de ácidos gordos poliinsaturados, das familias n-3 e n-6, de ácidos gordos A6 de 18 carbonos (ácido gama-linolénico e ácido esteardónico) até ácidos gordos Δ4 de 22 carbonos (DHA e DPA). Os organismos, especialmente Thraustochytrium sp.r parecem conter um conjunto completo de enzimas de dessaturação e alongamento necessárias para a biossintese de DHA e DPA. A estirpe carece de ácidos gordos poliinsaturados de 26 carbonos, os precursores propostos para a síntese de DHA e DPA na via de Precher (Voss, A., et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:19995-20000; Mohammed, B.S., et al. (1997) Biochem. J. 326:425-430). O ácido gordo de 24 carbonos pode não estar envolvido na síntese in vivo de ácidos gordos Δ4 de 22 carbonos como os DHA e DPA em Thraustochytrium sp.
EXEMPLO 7: IDENTIFICAÇÃO DE ADNcs QUE CODIFICAM A DESSATURASE "FRONTAL"
Para identificar genes que codificam dessaturases envolvidas na biossintese de LCFUFAs em Thraustochytrium sp. Foi adoptada uma estratégia de clonagem baseada em PCR. São concebidos dois iniciadores degenerados para visar o motivo de ligação de heme da extensão N-terminal do domínio tipo cyt b5 em dessaturases frontais e o terceiro motivo 75 conversador de histidina em todas as dessaturases microssomais, respectivamente. A lógica por detrás da concepção é que as dessaturases envolvidas na biossintese de EPA e DHA em Thraustochytrium sp. deveriam ter estrutura primária semelhante às de outras dessaturases frontais, isto é extensão N-terminal do domínio tipo cyt b5 na dessaturase. Foram identificados quatro fragmentos de ADNc de Thraustochytrium sp. Que codificam proteínas de fusão contendo o domínio tipo cyt b5 na extremidade N.
Para isolar os clones de ADNc completo, utilizou-se as quatros inserções como sondas para rastrear bibliotecas de ADN de Thraustochytrium sp. o que resultou na identificação de vários clones de ADNc em cada grupo. A sequenciação de todos os clones identificou quatro ADNs completos que foram designados por Fad4, Fad5, Fad5-2 e Fad6. A grelha de leitura aberta de Fad4 tem 1560 pb e codifica 519 aminoácidos com massa molecular de 59,1 kDa (Figura 1). A Fad5 tem 1230 pb de comprimento e codifica 439 aminoácidos com massa molecular de 49,8 kDa (Figura 2). Uma comparação sequencial destas duas sequências de Thraustochytrium sp. mostrou apenas 16% de identidade de aminoácidos entre as proteínas deduzidas. Uma análise detalhada revelou que a Fad4 é 80 aminoácidos mais comprida do que a Fad5, ocorrendo entre o segundo e terceiro motivos conservadores de histidina (Figura 3).
Uma pesquisa BLASTP™ da base de dados de proteína revelou os seguintes acertos para cada uma das duas proteínas, Fad4 e Fad5:
Fad 4 (519 resíduos de aminoácido)
Blastp nr 76 N° Registo Organismo Descrição Comprimen to % Identidade AFO 67 654 Mortierella alpina dessaturase Δ5 de ácidos gordos 509 29 AF054824 Mortierella alpina dessaturase microssomal Δ5 509 28 A022097 Dictyostelium discoideum dessaturase Δ5 de ácidos gordos 507 27 AB029311 Dictyostelium discoideum dessaturase de ácidos gordos 519 26 L11421 D90914 Synechocystis sp. dessaturase Δ6 410 25
Fad 5 (439 resíduos de aminoácido) Blastp nr N° Registo Organismo Descrição Comprimen to % Identidade AF139720 Euglena gracilis dessaturase Δ8 de ácidos gordos 404 29 AF007561 Borago offícínalis dessaturase Δ6 421 27 U79010 Borago offícínalis dessaturase Δ6 421 27 A309556 Danío rerío dessaturase Δ6 de ácidos gordos 422 26 AF110510 Mortierella alpina dessaturase Δ6 de ácidos gordos 463 25
EXEMPLO 8: EXPRESSÃO DE FAD4 E FAD5 EM LEVEDURA
Para confirmar a função de Fad4, o ADNc completo foi expressado na estirpe de levedura InvSc2 sob o controlo do promotor indutível. A Figura 4 mostra que com a suplementação do meio com 22:5 (7,10,13,16,19), as células de levedura contendo ADNc de Fad4 tinham um ácido gordo extra em comparação com o controlo de vector. O pico tinha um tempo de retenção idêntico ao padrão de DHA. A análise por LC/MS do ácido gordo livre mostrou que produz iões moleculares desprotonados (m/z = 279) idênticos ao padrão de DHA em electropulverização de iões negativos. Além disso, a análise por GC/MS dos FAME confirmou que o espectro do pico é idêntico ao do padrão de DHA (Figura 8). 77
Estes resultados indicam que a Fad4 é uma dessaturase Δ4 de ácidos gordos que é capaz de introduzir uma ligação dupla na posição 4 do substrato 22:5(7,10,13,16,19), resultando num ácido gordo dessaturado Δ4, DHA (22:6-4,7,10,13,16,19).
Para estudar ainda a especificidade para o substrato da Fad4 foram fornecidos separadamente um número de substratos incluindo 18:2(9,12), 18:3(9,12,15), 20:3(8,11,14) e 22:4(7,10,13,16) aos transformantes de levedura. Os resultados indicaram que a Fad4 também poderia utilizar o 22:4 (7,10,13,16) como um substrato (Figura 6) para produzir outro ácido gordo dessaturado Δ4, DPA (22:5-4,7,10,13,16) (Figura 7). 0 resto dos ácidos gordos examinados não foram substratos efectivos.
Para confirmar a função de Fad5, a S. cerevisiae Invsc2 foi transformada com plasmideos, os quais contêm a grelha de leitura aberta da Fad5 sob o controlo do promotor indutivel com galactose. Quando os transformantes de levedura foram induzidos pela galactose num meio contendo ácido homo-gama-linolénico (HGLA, 20:3-8,11,14) foi observado um pico extra no cromatograma de FAMEs que se acumula nos transformantes por comparação com o controlo (Figura 8). Uma comparação do cromatograma com o dos padrões revelou que o ácido gordo tinha um tempo de retenção idêntico ao padrão de ácido araquidónico (AA, 20:4-5,8,11,14). Para confirmar melhor a regioquimica dos produtos, os FAMEs foram analisados por GC/MS. A Figura 9 indica que os espectros de massa do ácido gordo novo e do padrão de AA são idênticos. Estes resultados demonstram que a Fad5 converte o HGLA (20:3— 8,11,13) em AA (20:4-5,8,11,14) na levedura.
EXEMPLO 9: EXPRESSÃO DE FAD4 EM 3 JUNCEA 78
Para determinar se a Fad4 de Traustochytrium é funcional em culturas de oleaginosas, B. juncea foram transformadas com a construção contendo Fad4 sob o controlo de um promotor constitutivo. Foram obtidas oito plantas transgénicas independentes. Na B. juncea não existem nenhuns substratos disponíveis de dessaturase Δ4 de ácidos gordos. Assim, para examinar a actividade da enzima transgénica nas plantas, o substrato 22:5 (n-3) tem de ser fornecido exogenamente. Nesta experiência foram aplicadas de tipo selvagem e transgénicas com uma solução aquosa de docosapentaeneato de sódio. Constatou-se que os substratos aplicados exogenamente eram prontamente captados pelas raízes, caule e folhas de ambos os tipos de plantas, mas convertidos em DRA apenas nas transgénicas. As folhas têm um nível de produção de DHA superior às raízes e caules. Nas folhas, o substrato exógeno foi incorporado a um nível de 10-20% dos ácidos gordos totais e o ácido gordo dessaturado Δ4 (22:6, n-3) foi produzido numa gama de 3-6% dos ácidos gordos totais (Figura 16) . Estes resultados indicam que a dessaturase Δ4 de ácidos gordos de Traustochytrium é funcional em culturas de oleaginosas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Bioriginal Food & Science Corp.
<120> FAD4, FAD5, FAD5-2 e FAD6, NOVOS MEMBROS DA FAMÍLIA DE DESSATURASES DE ÁCIDOS GORDOS e SUAS UTILIZAÇÕES
<130> BNZ-001PC <150> 60/236,303 <151> 2000-09-28 <150> 60/297,562 79 <151> 2001-06-12 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Versão 4.0
<210> 1 <211> 1560 <212> ADN <213> Thraustochytrium sp. <220>
<221> CDS <222> (1)...(1560) <400> 1 atg acg gtc ggc tac gac gag gag ate ccg ttc gag cag gtc cgc gcg 48 Met Thr Vai Gly Tyr Asp Glu Glu Ile Pro Phe Glu Gin Vai Arg Ala 1 5 10 15 cac aac aag ccg gat gac gcc tgg tgc gcg ate cac ggg cac gtg tac 96 His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala Ile His Gly His Vai Tyr 20 25 30 gat gtg acc aag ttc gcg age gtg cac ccg ggc ggc gac att ate ctg 144 Asp Vai Thr Lys Phe Ala Ser Vai His Pro Gly Gly Asp Ile Ile Leu 35 40 45 ctg gcc gca ggc aag gag gcc acc gtg ctg tac gag act tac cat gtg 192 Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Vai Leu Tyr Glu Thr Tyr His Vai 50 55 60 cgg ggc gtc tcg gac gcg gtg ctg cgc aag tac cgc ate ggc aag ctg 240 Arg Gly Vai Ser Asp Ala Vai Leu Arg Lys Tyr Arg Ile Gly Lys Leu 65 70 75 80 ccg gac ggc caa ggc ggc gcg aac gag aag gaa aag cgg acg ctc tcg 288 Pr o Asp Gly Gin Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser 85 90 95 ggc ctc tcg tcg gcc tcg tac tac acg tgg aac age gac ttt tac agg 336 Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg 100 105 110 gta atg cgc gag cgc gtc gtg gct cgg ctc aag gag cgc ggc aag gcc 384 Vai Met Arg Glu Arg Vai Vai Ala Arg Leu Lys Glu Arg Gly Lys Ala 115 120 125 80 cgc cgc gga ggc tac gag etc tgg ate aag gcg ttc ctg ctg etc gtc 432 Arg Arg Gly Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Ala Phe Leu Leu Leu Val 130 135 140 ggc ttc tgg age teg ctg tac tgg atg tgc acg ctg gac CCC teg ttc 480 Gly Phe Trp Ser Ser Leu Tyr Trp Met Cys Thr Leu Asp Pro Ser Phe 145 150 155 160 ggg gee ate ctg gee gee atg teg ctg ggc gtc ttt gee gee ttt gtg 528 Gly Ala Ile Leu Ala Ala Met Ser Leu Gly vai Phe Ala Ala Phe Val 165 170 175 ggc acg tgc ate cag cac gac ggc aac cac ggc gee ttt gee cag teg 576 Gly Thr Cys Ile Gin His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ala Gin Ser 180 185 190 cg a tgg gtc aac aag gtt gee ggg tgg acg etc gac atg ate ggc gee 624 Arg Trp Vai Asn Lys Vai Ala Gly Trp Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala 195 200 205 age ggc atg acg tgg gag ttc cag cac gtc ctg ggc cac cat ccg tac 672 Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gin His Vai Leu Gly His His Pro Tyr 210 215 220 acg aac ctg ate gag gag gag aac ggc ctg caa aag gtg age ggc aag 720 Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gin Lys Val Ser Gly Lys 225 230 235 240 aag atg gac acc aag ctg gee gac cag gag age gat ccg gac gtc ttt 7 68 Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gin Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe 245 250 255 tCC acg tac ccg atg atg cgc ctg cac ccg tgg cac cag aag cgc tgg 816 Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gin Lys Arg Trp 260 265 270 tac cac cgt ttc cag cac att tac ggc ccc ttc ate ttt ggc ttc atg 864 Tyr His Arg Phe Gin His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met 275 280 285 acc ate aac aag gtg gtc acg cag gac gtc ggt gtg gtg etc cgc aag 912 Thr Ile Asn Lys Vai Vai Thr Gin Asp Vai Gly Val Val Leu Arg Lys 290 295 300 cgg etc ttc cag att gac gee gag tgc cgg tac gcg age cca atg tac 960 Arg Leu Phe Gin Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr 305 310 315 320 gtg gcg cgt ttc tgg ate atg aag gcg etc acg gtg etc tac atg gtg 1008 Vai Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val 325 330 335 gee ctg ccg tgc tac atg cag ggc ccg tgg cac ggc etc aag ctg ttc 1056 Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gin Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe 340 345 350 gcg ate gcg cac ttt acg tgc ggc gag gtg etc gea acc atg ttc att 1104 Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Val Leu Ala Thr Met Phe Ile 355 360 365 81 gtg aac cac ate ate gag ggc gtc tcg tac gct tcc aag gac gcg gtc 1152 Vai Asn His lie Ile Glu Gly Vai Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Vai 370 375 380 aag ggc acg atg gcg ccg ccg aag acg atg cac ggc gtg acg CCC atg 1200 Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Vai Thr Pro Met 385 390 395 400 aac aac acg ege aag gag gtg gag gcg gag gcg tcc aag tet ggc gee 1248 Asn Asn Thr Arg Lys GLu" Vai "Glu" Ala "Glu"· Alã Ser Lys Ser Gly Ala 405 410 415 gtg gtc aag tea gtc ccg ctc gac gac tgg gee gtc gtc cag tgc cag 1296 Vai Vai Lys Ser Vai Pro Leu Asp Asp Trp Ala Vai Vai Gin Cys Gin 420 425 430 acc tcg gtg aac tgg age gtc ggc tcg tgg ttc tgg aat cac ttt tcc 1344 Thr Ser Vai Asn Trp Ser Vai Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser 435 440 445 ggc ggc ctc aac cac cag att gag cac cac ctg ttc ccc ggr ctc age 1392 Gly Gly Leu Asn His Gin Ile Glu His His Leu Phe Pro Xaa Leu Ser 450 455 460 cac gag acg tac tac cac att cag gac gtc ttt cag tcc acc tgc gee 1440 His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gin Asp Vai Phe Gin Ser Thr Cys Ala 465 470 475 480 gag tac ggc gtc ccg tac cag cac gag cct tcg ctc tgg acc gcg tac 1488 Glu Tyr Gly Vai Pro Tyr Gin His Glu Pro Ser Leu Trp Thr Ala Tyr 485 490 495 tgg aag atg ctc gag cac ctc cgt cag ctc ggc aat gag gag acc cac 1536 Trp Lys Met Leu Glu His Leu Arg Gin Leu Gly Asn Glu Glu Thr His 500 505 510 gag tcc tgg cag ege gct gee tga 1560 Glu Ser Trp Gin Arg Ala Ala * 515
<210> 2 <211> 519 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <22 0> <221> VARIANTE <222> (1)...(519) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 2 82
Met Thr Vai Gly Tyr Asp Glu Glu Ile Pro Phe Glu Gin Vai Arg Ala 1 5 10 15 His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala Ile His Gly His Vai Tyr 20 25 30 Asp Vai Thr Lys Phe Ala Ser Vai His Pro i Sly Gly Asp Ile Ile Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Vai Leu ' Tyr Glu Thr Tyr His Vai 50 55 60 Arq Gly Vai Ser Asp Ala Vai Leu Arg Lys Tyr Arg Ile Gly Lys Leu 65 70 75 80 Pro Asp Gly Gin Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser 85 90 95 Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg 100 105 110 Vai Met Arg Glu Arg Vai Vai Ala Arg Leu Lys Glu Arg Gly Lys Ala 115 120 125 Arq Arq Gly Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Ala Phe Leu Leu Leu Val 130 135 140 Gly Phe Trp Ser Ser Leu Tyr Trp Met Cys Thr Leu Asp Pro Ser Phe 145 150 155 160 Gly Ala Ile Leu Ala Ala Met Ser Leu Gly val Phe Ala Ala Phe Val 165 170 175 Gly Thr Cys Ile Gin His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ala Gin Ser 180 185 190 Arg Trp Vai Asn Lys Vai Ala Gly Trp Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala 195 200 205 Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gin His Vai Leu Gly His His Pro Tyr 210 215 220 Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gin Lys Val Ser Gly Lys 225 230 235 240 Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gin Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe 245 250 255 Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gin Lys Arg Trp 260 265 270 Tyr His Arg Phe Gin His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met 275 280 285 Thr Ile Asn Lys Vai Vai Thr Gin Asp Vai Gly Val Val Leu Arg Lys 290 295 300 Arg Leu Phe Gin Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr 305 310 315 320 Vai Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val 325 330 335 Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gin Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe 340 345 350 Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Vai Leu Ala Thr Met Phe Ile 355 360 365 Vai Asn His Ile Ile Glu Gly Vai Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Val 370 375 380 83
Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Vai Thr Pro Met 385 390 395 400 Asn Asn Thr Arg Lys Glu Vai Glu Ala Glu Ala Ser Lys Ser Gly Ala 405 410 415 Vai Vai Lys Ser Vai Pro Leu Asp Asp Trp Ala Vai Vai Gin Cys Gin 420 425 430 Thr Ser Vai Asn Trp Ser Vai Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser 435 440 445 Gly Gly Leu Asn His Gin Ile Glu His His Leu Phe Pro Xaa Leu Ser 450 455 460 His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gin Asp Vai Phe Gin Ser Thr Cys Ala 4 65 470 475 480 Glu Tyr Gly Vai Pro Tyr Gin His Glu Pro Ser Leu Trp Thr Ala Tyr 485 490 495 Trp Lys Met Leu Glu His Leu Arg Gin Leu Gly Asn Glu Glu Thr His 500 505 510 Glu Ser Trp Gin Arg Ala Ala 515
<210> 3 <211> 1320 <212> ADN <213> Thraustochytrium sp. <220>
<221> CDS <222> (1)...(1320) <400> 3 atg ggc aag ggc age gag ggc ege age gcg gcg ege gag atg acg gee 48 Met Gly Lys Gly Ser Glu Gly Arg Ser Ala Ala Arg Glu Met Thr Ala 1 5 10 15 gag gcg aac ggc gac aag cgg aaa acg att ctg ate gag ggc gtc ctg 96 Glu Ala Asn Gly Asp Lys Arg Lys Thr Ile Leu Ile Glu Gly Vai Leu 20 25 30 tac gac gcg acg aac ttt aag cac ccg ggc ggt teg ate ate aac ttc 144 Tyr Asp Ala Thr Asn Phe Lys His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Asn Phe 35 40 45 ttg acc gag ggc gag gee ggc gtg gac gcg acg cag gcg tac ege gag 192 Leu Thr Glu Gly Glu Ala Gly Vai Asp Ala Thr Gin Ala Tyr Arg Glu 50 55 60 84 ttt cat cag cgg tcc ggc aag gcc gac aag tac ctc aag tcg ctg ccg 240 Phe His Gin Arg Ser Gly Lys Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro 65 70 75 80 aag ctg gat gcg tcc aag gtg gag tcg cgg ttc tcg gcc aaa gag cag 288 Lys Leu Asp Ala Ser Lys Vai Glu Ser Arg Phe Ser Ala Lys Glu Gin 85 90 95 gcg cgg cgc gac gcc atg acg cgc gac tac gcg gcc ttt cgc gag gag 336 Ala Arg Arg Asp Ala Met Thr Arg Asp Tyr Ala Ala Phe Arg Glu •Glu 100 105 110 ctc gtc gcc gag ggg tac ttt gac ccg tcg ate ccg cac atg att tac 384 Leu Vai Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Pro His Met Ile Tyr 115 120 125 cgc gtc gtg gag ate gtg gcg ctc ttc gcg ctc tcg ttc tgg ctc atg 432 Arg Vai Vai Glu Ile Vai Ala Leu Phe Ala Leu Ser Phe Trp Leu Met 130 135 140 tcc aag gcc tcg ccc acc tcg ctc gtg ctg ggc gtg gtg atg aac ggc 480 Ser Lys Ala Ser Pro Thr Ser Leu Vai Leu Gly Vai Vai Met Asn Gly 145 150 155 160 att gcg cag ggc cgc tgc ggc tgg gtc atg cac gag atg ggc cac ggg 528 Ile Ala Gin Gly Arg Cys Gly Trp Vai Met His Glu Met Gly His Gly 165 170 175 tcg ttc acg ggc gtc ate tgg ctc gac gac cgg atg tgc gag ttc ttc 576 Ser Phe Thr Gly Vai Ile Trp Leu Asp Asp Arg Met Cys Glu Phe Phe 180 185 190 tac ggc gtc ggc tgc ggc atg age ggg cac tac tgg aag aac cag cac 624 Tyr Gly Vai Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gin His 195 200 205 age aag cac cac gcc gcg CCC aac cgc ctc gag cac gat gtc gat ctc 672 Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val Asp Leu 210 215 220 aac acg ctg CCC ctg gtc gcc ttt aac gag cgc gtc gtg cgc aag gtc 720 Asn Thr Leu Pro Leu Vai Ala Phe Asn Glu Arg Vai Val Arg Lys Val 225 230 235 240 aag ccg gga tcg ctg ctg gcg ctc tgg ctg O O gtg cag gcg tac ctc 768 Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ala Leu Trp Leu Arg Val Gin Ala Tyr Leu 245 250 255 ttt gcg CCC gtc tcg tgc ctg ctc ate ggc ctt ggc tgg acg ctc tac 816 Phe Ala Pro Vai Ser Cys Leu Leu Ile Gly Leu Gly Trp Thr Leu Tyr 260 265 270 ctg cac ccg cgc tac atg ctg cgc acc aag cgg cac atg gag ttc gtc 864 Leu His Pro Arg Tyr Met Leu Arg Thr Lys Arg His Met Glu Phe Val 275 280 285 85 tgg ate ttc gcg ege tac att ggc tgg ttc teg etc atg ggc gct etc 912 Trp Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Gly Trp Phe Ser Leu Met Gly Ala Leu 290 295 300 ggc tac teg ccg ggc acc teg gtc ggg atg tac ctg tgc teg ttc ggc 960 Gly Tyr Ser Pro Gly Thr Ser Val Gly Met Tyr Leu Cys Ser Phe Gly 305 310 315 320 etc ggc tgc att tac att ttc ctg cag ttc gee gtc age cac acg cac 1008 T.Pn Gly TI p Tyr Tlp Phe» T»#=»n m n Php AI a Val His 325 330 335 ctg ccg gtg acc aac ccg gag gac cag ctg cac tgg etc gag tac gcg 1056 Leu Pro Val Thr Asn Pro Glu Asp Gin Leu His Trp Leu Glu Tyr Ala 340 345 350 gee gac cac acg gtg aac att age acc aag tcc tgg etc gtc acg tgg 1104 Ala Asp His Thr Val Asn Ile Ser Thr Lys Ser Trp Leu Val Thr Trp 355 360 365 tgg atg teg aac ctg aac ttt cag ate gag cac cac etc ttc ccc acg 1152 Trp Met Ser Asn Leu Asn Phe Gin Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr 370 375 380 gcg ccg cag ttc ege ttc aag gaa ate agt cct ege gtc gag gee etc 1200 Ala Pro Gin Phe Arg Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu 385 390 395 400 ttc aag ege cac aac etc ccg tac tac gac ctg ccc tac acg age gcg 1248 Phe Lys Arg His Asn Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Ala 405 410 415 gtc teg acc acc ttt gee aat ctt tat tcc gtc ggc cac teg gtc ggc 1296 Vai Ser Thr Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly 420 425 430 gee gac acc aag aag cag gac tga 1320 Ala Asp Thr Lys Lys Gin Asp * 435
<210> 4 <211> 439 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 4 86
Met Gly Lys Gly Ser Glu Gly Arg Ser Ala Ala Arg Glu Met Thr Ala 1 5 10 15 Glu Ala Asn Gly Asp Lys Arg Lys Thr Ile Leu Ile Glu Gly Val Leu 20 25 30 Tyr Asp Ala Thr Asn Phe Lys His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Asn Phe 35 40 45 Leu Thr Glu Gly Glu Ala Gly Val Asp Ala Thr Gin Ala Tyr Arg Glu 50 55 60 Phe His Gin Arg Ser Gly Lys Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro 65 70 75 80 —Lys- Leu- -Asp- Ala --Se-r lys- -V-a-1- Glu-Ser—Arg Phe- -Ser- -Ala- Ly s -Glu Gin- 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Ala Met Thr Arg Asp Tyr Ala Ala Phe Arg Glu Glu 100 105 110 Leu Vai AXíel Glu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Pro His Met Ile Tyr 115 120 125 Arg Vai Vai Glu Ile Val Ala Leu Phe Ala Leu Ser Phe Trp Leu Met 130 135 140 Ser Lys Ala Ser Pro Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Val Met Asn Gly 145 150 155 160 Ile Ala Gin Gly Arq Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly 1 CR 170 η n c 1 1 ϋ Ser Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Met Cys Glu Phe Phe 180 185 190 Tyr Gly Vai Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gin His 195 200 205 Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val Asp Leu 210 215 220 Asn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val Arg Lys Val 225 230 235 240 Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ala Leu Trp Leu Arg Val Gin Ala Tyr Leu 245 250 255 «r irp JjtíU. ^tyr— 260 265 270 Leu His Pro Arg Tyr Met Leu Arg Thr Lys Arg His Met Glu Phe Val 275 280 285 Trp Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Gly Trp Phe Ser Leu Met Gly Ala Leu 290 295 300 Gly Tyr Ser Pro Gly Thr Ser Val Gly Met Tyr Leu Cys Ser Phe Gly 305 310 315 320 Leu Gly Cys Ile Tyr Ile Phe Leu Gin Phe Ala Val Ser His Thr His 325 330 335 Leu Pro Vai Thr Asn Pro Glu Asp Gin Leu His Trp Leu Glu Tyr Ala 340 345 350 Ala Asp His Thr Val Asn Ile Ser Thr Lys Ser Trp Leu Val Thr Trp 355 360 365 Trp Met Ser Asn Leu Asn Phe Gin Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr 370 375 380 Ala Pro Gin Phe Arg Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu 385 390 395 400 Phe Lys Arg His Asn Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Ala 405 410 415 Vai Ser Thr Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly 420 425 430 Ala Asp Thr Lys Lys Gin Asp 435 87
<210> 5 <211> 1371 <212> ADN <213> Thraustochytrium sp. <220>
<221> CDS <222> (1)...(1380) <400> 5 atg acc gag aag gcg agt gac gag ttc acg tgg cag gag gtc gcc aag 48 Met Thr Glu Lys Ala Ser Asp Glu Phe Thr Trp Gin Glu Vai Ala Lys 1 5 10 15 cac aac acg gcc aag age gcg tgg gtg ate ate cgc ggc gag gtg tac 96 Hls Asn Thr Ala Lys Ser Ala Trp Vai Ile Ile Arg Gly Glu Vai Tyr 20 25 30 gac gtg acc gag tgg gcg gac aag cac ccg ggc ggc age gag ctc ate 144 Asp Vai Thr Glu Trp Ala Asp Lys His Pro Gly Gly Ser Glu Leu Ile 35 40 45 gtc ctg cac tcc ggt cgt gaa tgc acg gac acg ttc tac tcg tac cac 192 Vai Leu His Ser Gly Arg Glu Cys Thr Asp Thr Phe Tyr Ser Tyr His 50 55 60 ccg ttc tcg aac cgc gcc gac aag ate ttg gcc aag tac aag ate ggc 240 Pro Phe Ser Asn Arg Ala Asp Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Lys Ile Gly 65 70 75 80 aag otc gtg ggc ggc tac gag ttc ccg gtg ttc aag ccg gac tcg ggc 288 Lys Leu Vai Gly Gly Tyr Glu Phe Pro Vai Phe Lys Pro Asp Ser Gly 85 90 95 ttc tac aag gaa tgc tcg gag cgc gtg gcc gag tac ttt aag acg aac 336 Phe Tyr Lys Glu Cys Ser Glu Arg Vai Ala Glu Tyr Phe Lys Thr Asn 100 105 110 aat ctg gac cca aag gcg gcg ttc gcg ggt ctc tgg cgc atg gtg ttc 384 Asn Leu Asp Pro Lys Ala Ala Phe Ala Gly Leu Trp Arg Met Vai Phe 115 120 125 gtg ttc gcg gtc gcc gcg ctc gcg tac atg ggc atg aat gag ctc ate 432 Vai Phe Ala Vai Ala Ala Leu Ala Tyr Met Gly Met Asn Glu Leu Ile 130 135 140 cct gga aac gtg tac gcg cag tac gcg tgg ggc gtg gtg ttc ggt gtc 480 Pro Gly Asn Vai Tyr Ala Gin Tyr Ala Trp Gly Vai Vai Phe Gly Vai 145 150 155 160 88 ttc cag gcg ctg cca ttg ctg cac gtg atg cac gac tcg tcg cac gcg 528 Phe Gin Ala Leu Pro Leu Leu His Vai Met His Asp Ser Ser His Ala 165 170 175 gca tgc tcg age age cca gcg atg tgg cag ate ate ggt cgt ggt gtg 576 Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Gin Ile Ile Gly Arg Gly Val 180 185 190 atg gac tgg ttc gct ggc gee age atg gtg tcg tgg ttg aac cag cac 624 Met Asp Trp Phe Ala Gly Ala Ser Met Val Ser Trp Leu Asn Gin His 195 200 205 gtt gtg ggc cac cac ate tac acg aac gtc gcg ggc gcg gac ccg gat 672 Vai Vai Gly His His Ile Tyr Thr Asn Val Ala Gly Ala Asp Pro Asp 210 215 220 ctc ccg gtc gac ttt gag age gac gtg cgc cgc ate gtg cac cgc cag 720 Leu Pro Vai Asp Phe Glu Ser Asp Val Arg Arg Ile Val His Arg Gin 225 230 235 240 gtg ctg ctg ccg ate tac aag ttc cag cac ate tac ctg cca ccg ctc 768 Vai Leu Leu Pro Ile Tyr Lys Phe Gin His Ile Tyr Leu Pro Pro Leu 245 250 255 tac ggc gtg ctg ggc ctc aag ttc cgc ate cag gac gtg ttc gag acg 816 Tyr Gly Vai Leu Gly Leu Lys Phe Arg Ile Gin Asp Val Phe Glu Thr 260 265 270 ttc gtg tcg ctc acg aac ggc ccg gtg cgt gtg aac ccg cac ccg gtg 864 Phe Vai Ser Leu Thr Asn Gly Pro Val Arg Val Asn Pro His Pro Val 275 280 285 tcg gac tgg gtg caa atg ate ttc gee aag gcg ttc tgg acg ttc tac 912 Ser Asp Trp Vai Gin Met Ile Phe Ala Lys Ala Phe Trp Thr Phe Tyr 290 295 300 cgc ate tac ate ccg ttg gcg tgg ctc aag ate acg ccg tcg acg ttc 960 Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Ala Trp Leu Lys Ile Thr Pro Ser Thr Phe 305 310 315 320 tgg ggc gtg ttt ttc ctc gee gag ttc acc aca ggt tgg tac ctc gcg 1008 Trp Gly Vai Phe Phe Leu Ala Glu Phe Thr Thr Gly Trp Tyr Leu Ala 325 330 335 ttc aac ttc cag gtg age cac gtc tcg acc gag tgc gag tac ccg tgc 1056 Phe Asn Phe Gin Vai Ser His Vai Ser Thr Glu Cys Glu Tyr Pro Cys 340 345 350 ggt gat gcg ccg tcg gee gag gtc ggt gac gag tgg gcg ate tcg cag 1104 Gly Asp Ala Pro Ser Ala Glu Vai Gly Asp Glu Trp Ala Ile Ser Gin 355 360 365 gtc aag tcg tcg gtg gac tac gcg cac ggc tcg ccg ctc gcg gcg ttc 1152 Vai Lys Ser Ser Vai Asp Tyr Ala His Gly Ser Pro Leu Ala Ala Phe 370 375 380 89 ctc tgc ggc gcg ctc aac tac cag gtg acc cac cac ttg tac ccg ggc 1200 Leu Cys Gly Ala Leu Asn Tyr Gin Vai Thr His His Leu Tyr Pro Gly 385 390 395 400 ate tea cag tac cac tac cct gcg ate gcg ccg ate ate ate gac gtg 1248 Ile Ser Gin Tyr His Tyr Pro Ala Ile Ala Pro Ile Ile Ile Asp Vai 405 410 415 tgc aag aag tac aac ate aag tac acg gtg ctg ccg acg ttc acc gag 1296 Cys Lys Lys Tyr Asn Ile Lys Tyr Thr Vai Leu Pro Thr Phe Thr Glu 420 425 430 gcg ctg ctc gcg cac ttc aag cac ctg aag aac atg ggc gag ctc ggc 1344 Ala Leu Leu Ala His Phe Lys His Leu Lys Asn Met Gly Glu Leu Gly 435 440 445 aag ccc gtg gag ate cac atg ggt taa 1371 Lys Pro Vai Glu Ile His Met Gly * * ★ 450 455
<210 6 <211> 456 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 6
Met Thr Glu Lys Ala Ser Asp Glu Phe Thr Trp Gin Glu Vai Ala Lys 1 5 10 15 His Asn Thr Ala Lys Ser Ala Trp Vai Ile Ile Arg Gly Glu Vai Tyr 20 25 30 Asp Vai Thr Glu Trp Ala Asp Lys His Pro Gly Gly Ser Glu Leu Ile 35 40 45 Vai Leu His Ser Gly Arg Glu Cys Thr Asp Thr Phe Tyr Ser Tyr His 50 55 60 Pro Phe Ser Asn Arg Ala Asp Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Lys Ile Gly 65 70 75 80 Lys Leu Vai Gly Gly Tyr Glu Phe Pro Vai Phe Lys Pro Asp Ser Gly 85 90 95 Phe Tyr Lys Glu Cys Ser Glu Arg Vai Ala Glu Tyr Phe Lys Thr Asn 100 105 110 Asn Leu Asp Pro Lys Ala Ala Phe Ala Gly Leu Trp Arg Met Vai Phe 115 120 125 Vai Phe Ala Vai Ala Ala Leu Ala Tyr Met Gly Met Asn Glu Leu Ile 130 135 140 Pro Gly Asn Vai Tyr Ala Gin Tyr Ala Trp Gly Vai Vai Phe Gly Vai 145 150 155 160 Phe Gin Ala Leu Pro Leu Leu His Vai Met His Asp Ser Ser His Ala 165 170 175 90 90 Ala Cys Ser Ser 180 Ser Pro Ala Met Met Asp Trp 195 Phe Ala Gly Ala Ser 200 Vai Vai 210 Gly His His Ile Tyr 215 Thr Leu 225 Pro Vai Asp Phe Glu 230 Ser Asp Vai Leu Leu Pro Ile 245 Tyr Lys Phe Tyr Gly Vai Leu 260 Gly Leu Lys Phe Phe Vai Ser 275 Leu Thr Asn Gly Pro 280 Ser Asp 290 Trp Vai Gin Met Ile 295 Phe Arg 305 Ile Tyr Ile Pro Leu 310 Ala Trp Trp Gly Vai Phe Phe 325 Leu Ala Glu Phe Asn Phe Gin 340 Vai Ser His Vai Gly Asp Ala 355 Pro Ser Ala Glu Vai 360 Vai Lys 370 Ser Ser Vai Asp Tyr 375 Ala Leu 385 Cys Gly Ala Leu Asn 390 Tyr Gin Ile Ser Gin Tyr His 405 Tyr Pro Ala Cys Lys Lys Tyr 420 Asn Ile Lys Tyr Ala Leu Leu 435 Ala His Phe Lys His 440 Lys Pro 450 Vai Glu Ile His Met 455 Gly
Trp Gin Ile Ile Gly Arg Gly Vai 185 190 Met Vai Ser Trp Leu Asn Gin His 205 Asn Vai Ala Gly Ala Asp Pro Asp 220 Vai Arg Arg Ile Vai His Arg Gin 235 240 Gin His Ile Tyr Leu Pro Pro Leu 250 255 Arg Ile Gin Asp Vai Phe Glu Thr 265 270 Vai Arg Vai Asn Pro His Pro Vai 285 Ala Lys Ala Phe Trp Thr Phe Tyr 300 Leu Lys Ile Thr Pro Ser Thr Phe 315 320 Phe Thr Thr Gly Trp Tyr Leu Ala 330 335 Ser Thr Glu Cys Glu Tyr Pro Cys 345 350 Gly Asp Glu Trp Ala Ile Ser Gin 365 His Gly Ser Pro Leu Ala Ala Phe 380 Vai Thr His His Leu Tyr Pro Gly 395 400 Ile Ala Pro Ile Ile Ile Asp Vai 410 415 Thr Vai Leu Pro Thr Phe Thr Glu 425 430 Leu Lys Asn Met Gly Glu Leu Gly 445
<210> 7 <211> 1380 <212> ADN <213> Thraustochytrium sp. <220>
<221> CDS <222> (1)...(1380) <400> 7 91 atg gtg gac ctc aag cct gga gtg aag ege ctg gtg age tgg aag gag 48 Met Val Asp Leu Lys Pro Gly Val Lys Arg Leu Val Ser Trp Lys Glu 1 5 10 15 ate ege gag cac gcg acg ccc gcg acc gcg tgg ate gtg att cac cac 96 Ile Arg Glu His Ala Thr Pro Ala Thr Ala Trp Ile Val Ile His His 20 25 30 aag gtc tac gac ate tcc aag tgg gac teg cac ccg ggt ggc tcc gtg 144 Lys Val Tyr Asp Ile Ser Lys Trp Asp Ser His Pro Gly Gly Ser Val 35 40 45 atg ctc acg cag gee ggc gag gac gee acg gac gee ttc gcg gtc ttc 192 Met Leu Thr Gin Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ala Val Phe 50 55 60 cac ccg tcc teg gcg ctc aag ctg ctc gag cag ttc tac gtc ggc gac 240 His Pro Ser Ser Ala Leu Lys Leu Leu Glu Gin Phe Tyr Val Gly Asp 65 70 75 80 gtg gac gaa acc toe aag gee gag ate gag ggg gag ccg gcg age gac 288 Val Asp Glu Thr Ser Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Pro Ala Ser Asp 85 90 95 gag gag ege gcg ege ege gag ege ate aac gag ttc ate gcg tcc tac 336 Glu Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg Ile Asn Glu Phe Ile Ala Ser Tyr 100 105 110 cgt cgt ctg ege gtc aag gtc aag ggc atg ggg ctc tac gac gee age 384 Arg Arg Leu Arg Val Lys Val Lys Gly Met Gly Leu Tyr Asp Ala Ser 115 120 125 gcg ctc tac tac gcg tgg aag ctc gtg age acg ttc ggc ate gcg gtg 432 Ala Leu Tyr Tyr Ala Trp Lys Leu Val Ser Thr Phe Gly Ile Ala Val 130 135 140 ctc teg atg gcg ate tgc ttc ttc ttc aac agt ttc gee atg tac atg 480 Leu Ser Met Ala Ile Cys Phe Phe Phe Asn Ser Phe Ala Met Tyr Met 145 150 155 160 gtc gee ggc gtg att atg ggg ctc ttc tac cag cag tcc gga tgg ctg 528 Val Ala Gly Val Ile Met Gly Leu Phe Tyr Gin Gin Ser Gly Trp Leu 165 170 175 gcg cac gac ttc ttg cac aac cag gtg tgc gag aac O o acg ctc ggc 576 Ala His Asp Phe Leu His Asn Gin Val Cys Glu Asn Arg Thr Leu Gly 180 185 190 aac ctt ate ggc tgc ctc gtg ggc aac gee tgg cag ggc ttc age gtg 624 Asn Leu Ile Gly Cys Leu Val Gly Asn Ala Trp Gin Gly Phe Ser Val 195 200 205 caq tqq tgg aag aac aag cac aac ctg cac cac gcg gtg ccg aac ctg 672 Gin Trp Trp Lys Asn Lys His Asn Leu His His Ala Val Pro Asn Leu 210 215 220 92 cac age gee aag gac gag ggc ttc ate ggc gac ccg gac ate gac acc 720 His Ser Ala Lys Asp Glu Gly Phe Ile Gly Asp Pro Asp Ile Asp Thr 225 230 235 240 atg ccg ctg ctg gcg tgg tet aag gag atg gcg ege aag gcg ttc gag 7 68 Met Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu Met Ala Arg Lys Ala Phe Glu 245 250 255 tcg gcg cac ggc ccg ttc ttc ate cg c aac cag gcg ttc cta tac ttc 816 Ser Ala His Gly Pro Phe Phe Ile Aro Asn Gin Ala Phe Leu Tvr Phe 260 265 270 ccg ctg ctg ctg ctc gcg ege ctg age tgg ctc gcg cag tcg ttc ttc 864 Pro Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Gin Ser Phe Phe 275 280 285 tac gtg ttc acc gag ttc tcg ttc ggc ate ttc gac aag gtc gag ttc 912 Tyr Vai Phe Thr Glu Phe Ser Phe Gly Ile Phe Asp Lys Val Glu Phe 290 295 300 gac gga ccg gag aag gcg ggt ctg ate gtg cac tac ate tgg cag ctc 960 Asp Gly Pro Glu Lys Ala Gly Leu Ile Val His Tyr Ile Trp Gin Leu 305 310 315 320 gcg ate ccg tac ttc tgc aac atg age ctg ttt gag ggc gtg gea tac 1008 Ala Ile Pro Tyr Phe Cys Asn Met Ser Leu Phe Glu Gly Val Ala Tyr 325 330 335 ttc ctc atg ggc cag gcg tcc tgc ggc ttg ctc ctg gcg ctg gtg ttc 1056 Phe Leu Met Gly Gin Ala Ser Cys Gly Leu Leu Leu Ala Leu Val Phe 340 345 350 agt att ggc cac aac ggc atg tcg gtg tac gag ege gaa acc aag ccg 1104 Ser Ile Gly His Asn Gly Met Ser Vai Tyr Glu Arg Glu Thr Lys Pro 355 360 365 gac ttc tgg cag ctg cag gtg acc acg acg ege aac ate ege gcg tcg 1152 Asp Phe Trp Gin Leu Gin Vai Thr Thr Thr Arg Asn Ile Arg Ala Ser 370 375 380 gta ttc atg gac tgg ttc acc ggt ggc ttg aac tac cag ate gac cat 1200 Vai Phe Met Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gin Ile Asp His 385 390 395 400 cac ctg ttc ccg ctc gtg ccg ege cac aac ttg cca aag gtc aac gtg 1248 His Leu Phe Pro Leu Vai Pro Arg His Asn Leu Pro Lys Val Asn Val 405 410 415 ctc ate aag tcg cta tgc aag gag ttc gac ate ccg ttc cac gag acc 1296 Leu Ile Lys Ser Leu Cys Lys Glu Phe Asp Ile Pro Phe His Glu Thr 420 425 430 ggc ttc tgg gag ggc ate tac gag gtc gtg gac cac ctg gcg gac ate 1344 Gly Phe Trp Glu Gly Ile Tyr Glu Val Val Asp His Leu Ala Asp Ile 435 440 445 age aag gaa ttc ate acc gag ttc cca gcg atg taa 1380 Ser Lys Glu Phe Ile Thr Glu Phe Pro Ala Met * 450 455 <210> 8 93
<211> 459 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 8
Met Vai Asp Leu Lys Pro Gly Vai Lys Arg Leu Vai Ser Trp Lys Glu 1 5 10 15 Ile Arg Glu His Ala Thr Pro Ala Thr Ala Trp Ile Vai Ile His His 20 25 30 Lys Vai Tyr Asp Ile Ser Lys Trp Asp Ser His Pro Gly Gly Ser Vai 35 40 45 Met Leu Thr Gin Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ala Vai Phe 50 55 60 His Pro Ser Ser Ala Leu Lys Leu Leu Glu Gin Phe Tyr Vai Gly Asp 65 70 75 80 Vai Asp Glu Thr Ser Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Pro Ala Ser Asp O J yu -yo— Glu Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg Ile Asn Glu Phe Ile Ala Ser Tyr 100 105 110 Arg Arg Leu Arg Vai Lys Vai Lys Gly Met Gly Leu Tyr Asp Ala Ser 115 120 125 Ala Leu Tyr Tyr Ala Trp Lys Leu Vai Ser Thr Phe Gly Ile Ala Vai 130 135 140 Leu Ser Met Ala Ile Cys Phe Phe Phe Asn Ser Phe Ala Met Tyr Met 145 150 155 160 Vai Ala Gly Vai Ile Met Gly Leu Phe Tyr Gin Gin Ser Gly Trp Leu 165 170 175 Ala His Asp Phe Leu His Asn Gin Vai Cys Glu Asn Arg Thr Leu Gly 180 185 190 Asn Leu Ile Gly Cys Leu Vai Gly Asn Ala Trp Gin Gly Phe Ser Vai 195 200 205 Gin Trp Trp Lys Asn Lys His Asn Leu His His Ala Vai Pro Asn Leu 210 215 220 His Ser Ala Lys Asp Glu Gly Phe Ile Gly Asp Pro Asp Ile Asp Thr 225 230 235 240 Met Pro Leu Leu Ala Trp Ser Lys Glu Met Ala Arg Lys Ala Phe Glu 245 250 255 Ser Ala His Gly Pro Phe Phe Ile Arg Asn Gin Ala Phe Leu Tyr Phe 260 265 270 Pro Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Gin Ser Phe Phe 275 280 285 Tyr Vai Phe Thr Glu Phe Ser Phe Gly ile Phe Asp Lys Vai Glu Phe 290 295 300 Asp Gly Pro Glu Lys Ala Gly Leu Ile Vai His Tyr Ile Trp Gin Leu 305 310 315 320 Ala Ile Pro Tyr Phe Cys Asn Met Ser Leu Phe Glu Gly Vai Ala Tyr 325 330 335 94
Phe Leu Met Gly Gin Ala Ser Cys Gly Leu Leu Leu Ala Leu Vai Phe 340 345 350 Ser Ile Gly His Asn Gly Met Ser Vai Tyr Glu Arg Glu Thr Lys Pro 355 360 365 Asp Phe Trp Gin Leu Gin Vai Thr Thr Thr Arg Asn Ile Arg Ala Ser 370 375 380 Vai Phe Met Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gin Ile Asp His 385 390 395 4 (KL His Leu Phe Pro Leu Vai Pro Arg His Asn Leu Pro Lys Vai Asn Vai 405 410 415 Leu Ile Lys Ser Leu Cys Lys Glu Phe Asp Ile Pro Phe His Glu Thr 420 425 430 Gly Phe Trp Glu Gly Ile Tyr Glu Vai Vai Asp His Leu Ala Asp Ile 435 440 445 Ser Lys Glu Phe Ile Thr Glu Phe Pro Ala Met 450 455
Lisboa, 30 de Abril de 2010

Claims (38)

  1. REIVINDICAÇÕES Molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos explicitada na SEQ ID N0:1, ou SEQ ID N0:3, ou um seu complemento; e (b) a molécula de ácido nucleico a qual codifica um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou um seu complemento. Molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma molécula de ácido nucleico a qual codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos cerca de 50% idêntica à sequência de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 2 ou 4, em que o polipéptido tem uma actividade dessaturase Δ4 (no caso de SEQ ID NO:2) ou Δ5 (no caso de SEQ ID NO:4), ou um seu complemento; e (b) uma molécula de ácido nucleico a qual hibridiza em condições rigorosas num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:l ou 3, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipéptido possuindo uma actividade dessaturase Δ4 (no caso de SEQ ID NO:l) ou Δ5 (no caso de SEQ ID NO:3), ou um seu complemento. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1 ou 2. 2
  2. 4. Vector da reivindicação 3, o qual é um vector de expressão.
  3. 5. Célula hospedeira transfectada com o vector de expressão da reivindicação 4.
  4. 6. Célula hospedeira da reivindicação 5, em que a célula é seleccionada do grupo consistindo de uma célula vegetal, uma célula microbiana e uma célula animal.
  5. 7. Célula hospedeira da reivindicação 6, em que a célula vegetal é de uma planta oleaginosa seleccionada do grupo consistindo de linho (Línum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glycine e Soja sp.), girassol (Helianthus sp.), algodão (Gossypium sp.), milho (Zea mays), oliveira (Olea sp.), açafrão-bastardo (Carthamus sp.), cacau (Theobroma cacoa) e amendoim (Arachis sp.).
  6. 8. Célula hospedeira da reivindicação 6, em que a célula microbiana é seleccionada do grupo consistindo de Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizochytrium, e Crythecodinium.
  7. 9. Método de produção de um polipéptido compreendendo cultivar a célula hospedeira da reivindicação 5 para produzir o polipéptido.
  8. 10. Polipéptido isolado seleccionado do grupo consistindo de: (a) um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos 50% idêntica à 3 sequência de aminoácidos completa de SEQ ID NO:2 ou 4 e possuindo uma actividade dessaturase Δ4 no caso de SEQ ID NO:2 e possuindo uma actividade dessaturase Δ5 no caso de SEQ ID NO: 4; (b) um polipéptido o qual é codificado por uma molécula de ácido nucleico a qual hibridiza em condições rigorosas num complemento de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID N0:1 ou 3 e possuindo uma actividade dessaturase Δ4 no caso de SEQ ID N0:1 e possuindo uma actividade dessaturase Δ5 no caso de SEQ ID N0:3; e (c) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4 e possuindo uma actividade dessaturase Δ4 no caso de SEQ ID NO: 2 e possuindo uma actividade dessaturase Δ5 no caso de SEQ ID NO:4.
  9. 11. Polipéptido isolado da reivindicação 10 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4.
  10. 12. Método de transformação de um ácido gordo insaturado compreendendo transfectar ou transformar uma célula com a molécula de ácido nucleico isolada da reivindicação 1 ou 2 e cultivar ou desenvolver a célula em condições de modo a que seja produzido o ácido gordo insaturado.
  11. 13. Método da reivindicação 12, em que a célula é seleccionada do grupo consistindo de uma célula vegetal, uma célula animal e uma célula microbiana. 4
  12. 14. Método da reivindicação 13, em que a célula vegetal é seleccionada de uma planta oleaginosa.
  13. 15. Método da reivindicação 14, em que a planta oleaginosa é seleccionada do grupo consistindo de linho (Llnum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glycine e Soja sp.), girassol (Helianthus sp.), algodão (Gossypium sp.), milho (Zea mays), oliveira (Olea sp.), açafrão-bastardo (Carthamus sp.), cacau (Theobroma cacoa) e amendoim (Arachís sip.) .
  14. 16. Método da reivindicação 12, compreendendo ainda o passo de recuperação do ácido gordo insaturado.
  15. 17. Método da reivindicação 12, em que o ácido gordo insaturado é seleccionado do grupo consistindo de AA 20:4 (5,8,11,14), EPA 20:5 (5,8,11,14,17), DPA 22:5 (4,7,10,13,16) e DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
  16. 18. Método de produção de um ácido gordo insaturado compreendendo pôr em contacto uma composição compreendendo pelo menos uma molécula alvo da dessaturase com pelo menos um polipeptido isolado da reivindicação 10 ou 11 em condições de modo a que seja produzido o ácido gordo insaturado.
  17. 19. Método da reivindicação 18, compreendendo ainda o passo de recuperação do ácido gordo insaturado.
  18. 20. Método da reivindicação 18, em que o ácido gordo insaturado é seleccionado do grupo consistindo de AA 5 20:4 (5,8,11,14), ΕΡΑ 20:5 (5,8,11,14,17), DPA 22:5 (4.7.10.13.16) e DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
  19. 21. Método de produção de uma célula vegetal ou microbiana capaz de gerar um ácido gordo insaturado compreendendo introduzir na referida célula a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1 ou 2, em que a molécula de ácido nucleico codifica uma dessaturase possuindo uma actividade de catalisação da formação de uma ligação dupla numa cadeia acilo gorda.
  20. 22. Método da reivindicação 21, em que a célula é uma célula vegetal.
  21. 23. Método da reivindicação 22, em que a célula vegetal é de uma planta oleaginosa.
  22. 24. Método da reivindicação 23, em que a planta oleaginosa é linho (Linum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glycine e Soja sp.), girassol (Helianthus sp.), algodão (Gossypium sp.), milho (Zea mays) , oliveira (Olea sp.), açafrão-bastardo (Carthamus sp.), cacau (Theobroma cacoa) e amendoim (Arachis sp.).
  23. 25. Método da reivindicação 21, em que o ácido gordo insaturado é seleccionado do grupo consistindo de AA 20:4 (5,8,11,14), EPA 20:5 (5,8,11,14,17), DPA 22:5 (4.7.10.13.16) e DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
  24. 26. Método para modular a produção de um ácido gordo insaturado compreendendo cultivar uma célula da 6 reivindicação 5, de modo a que ocorra a modulação da produção de um ácido gordo insaturado.
  25. 27. Método da reivindicação 26, em que a produção do ácido gordo insaturado é melhorada.
  26. 28. Método da reivindicação 26, em que o ácido gordo insaturado é seleccionado do grupo consistindo de AA 20:4 (5,8,11,14), EPA 20:5 (5,8,11,14,17), DPA 22:5 (4.7.10.13.16) e DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
  27. 29. Método da reivindicação 26, compreendendo ainda recuperar o ácido gordo insaturado.
  28. 30. Método para produção em grande escala de um ácido gordo insaturado, compreendendo cultivar uma célula da reivindicação 5, de modo a que seja produzido o ácido gordo insaturado.
  29. 31. Método da reivindicação 30, em que a produção do ácido gordo insaturado é melhorada.
  30. 32. Método da reivindicação 30, em que o ácido gordo insaturado é seleccionado do grupo consistindo de AA 20:4 (5,8,11,14), EPA 20:5 (5,8,11,14,17), DPA 22:5 (4.7.10.13.16) e DHA 22:6 (4,7,10,13,16,19).
  31. 33. Método da reivindicação 28, compreendendo ainda recuperar o ácido gordo insaturado.
  32. 34. Composição compreendendo o polipéptido da reivindicação 10 ou 11. 7
  33. 35. Método para produzir um suplemento alimentar compreendendo o método da reivindicação 12, 18, 26 ou 30.
  34. 36. Composição compreendendo a célula produzida pelo método da reivindicação 21.
  35. 37. Composição da reivindicação 34, em que a composição é utilizada num alimento composto para animal.
  36. 38. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o suplemento alimentar é alimento composto para animal.
  37. 39. Suplemento alimentar compreendendo a composição da reivindicação 34.
  38. 40. Método para suplementar o regime alimentar de um humano ou animal, compreendendo a adição da composição da reivindicação 34. Lisboa, 30 de Abril de 2010
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