DE69129897T2

DE69129897T2 - Methode des gentransfers mittels retrotransposons

Info

Publication number: DE69129897T2
Application number: DE69129897T
Authority: DE
Inventors: Clague Pitman Omaha Hodgson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-25
Filing date: 1991-10-25
Publication date: 1998-12-17
Anticipated expiration: 2011-10-26
Also published as: EP0506945B1; JPH05503636A; DK0506945T3; ES2121794T3; DE69129897D1; WO1992007950A1; EP0506945A4; US5354674A; US5879933A; EP0506945A1; CA2072581A1; ATE169061T1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und der Methode zur Veränderung des genetischen Materials einer Zelle oder eines Organismus. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Retrotransposons als Vektoren, die geeignet sind für die Expression, in verschiedenen Stadien, des genetischen Materials. Die vorliegende Erfindung weist eine breite Vielfalt von Anwendungen auf, beispielsweise bei der Tier- und Pflanzenzucht und beim Verständnis und der Behandlung verschiedener genetischer und viraler Erkrankungen.

Stand der Technik

In der Gentechnologie werden gegenwärtig verschiedene Methoden zur Ermöglichung des Transfers und der Expression von Genen in die Genome von Zellen und Organismen verwendet. Gene wurden durch Inkubieren von Zellen mit DNA, möglicherweise in Gegenwart von Chemikalien wie Polyanionen oder Calciumphosphat übertragen. Genetisches Material kann auch in den Kern oder das Cytoplasma von Zellen oder Zygoten injiziert werden. Weitere Methoden schließen Elektroporation, Liposomen-vermittelte Geninsertion, Asialoglycoprotein-Geninsertion, Partikelbeschleunigung und virale Transduktion ein.
Es wurde gezeigt, daß die Verwendung von Viren in der Transduktionsmethode sehr effizient ist, wenn Retroviren verwendet werden. Fremdgene werden entweder in ein replikationsunfähiges oder replikationskompetentes virales Vektorkonstrukt insertiert (üblicherweise als Plasmid), und in Zellen übertragen, die alle für das Verpacken und die Replikation des Virus notwendigen Gene enthalten. Spezielle Zellinien ("Helfer" oder virale Verpackungszellen) sind konstruiert worden, die die Verpackung der fehlerhaften (nichtreplikations-kompetenten) viralen Vektoren in infektiöse Partikel oder Virionen ermöglichen. Die Vektoren selbst enthalten die notwendigen Gene zur Replikation nicht, so daß bei Infektionen von Zellen durch die Vektoren die Vektoren unter Verwendung von Enzymen im viralen Partikel zu ihrer eigenen Insertion in das Gastgenom (Chromosomen) replizieren. Die Vektoren sind darüber hinaus unfähig zur weiteren Replikation, da die essentiellen viralen Gene (hoffentlich) in den "Helfer"-Zellen zurückgelassen wurden. Diese Technik wurde für die ersten Human-Gentherapie-Versuche verwendet und für geeignet befunden trotz der weiter andauernden Debatte bezüglich der Sicherheit solcher Verwendungen.
Die Transduktion durch RNA-Tumor-Viren (Retroviren) hat einen speziellen Reiz, da sie schnell, effizient sein kann und in einer stabilen Integration einer kleinen Anzahl von Kopien (üblicherweise 1 bis 2) genetischer Informationen resultiert. Anders als bei der Transformation findet die retrovirale Integration auf präzise Art statt, üblicherweise an einer exakten Position im viralen Genom, und die Insertion kann an vielen Stellen im Wirtszell- Genom stattfinden.
Unglücklicherweise werden Retroviren von nachteiligen pathogenen und onkogenen Wirkungen begleitet. Die Infektiosität von Retrovirus-Vektoren kann jedoch durch Verwendung genetisch behinderter Formen in Verbindung mit Helferzellen kontrolliert werden. Um wirksam als Vektor zu arbeiten, müssen die Anteile der notwendigen genetischen Information, die aus dem "behinderten" Vektor entfernt wurde, "in trans" vorgesehen werden (durch ein anderes Gen, das außerhalb des Vektors angesiedelt ist). Viele derartige Helfer-Zellinien, die für Verpackung, Replikation, Transport (delivery) und Reinsertion der replikationsunfähigen viralen Vektoren notwendig sind, wurden für einige üblicherweise verwendete Tumor-Virustypen angewendet. Diese nützlichen Viren schließen die Erkrahkungsorganismen ein, die murinen Leukämievirus (MLV), Milznekrosevirus (SNV), Vogelleukosevirus (ALV) und Reticuloendotheliosevirus (REV) verursachen, ein. Patente wurden für die Helfer-Zellinien für MLV und REV erteilt (Miller, US-Patent Nr. 4,861,719; Temin et al., US-Patent Nr. 4,650,764).
MLV-Viren sind die Vektoren der Wahl für das Tier-Gentechnologie von Zellen und Organismen geworden aufgrund ihrer Kompatibilität mit einer breiten Vielfalt von Tierzelltypen, einschließlich bestimmter Keimzellen genauso wie mit humanen Zellen. MLV wurde zur Insertion viraler Transgene in die Mauskeimbahn verwendet, wodurch eine transgene Maus erzeugt wurde (Jaenisch eta 1., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 73 : 1260 (1976) und Cell 24 : 519 (1981)). MLV-Vektorsysteme wurden für beschränkte Human- Gentherapie-Versuche gebilligt, trotz einiger der oben beschriebenen Probleme.
Während Retroviren wichtige Werkzeuge für den Transfer von Genen in Zellen werden, bestehen bedeutende Probleme, die mit den retroviralen Vektoren zusammenhängen. Ein solches Problem ist die Fähigkeit der "behinderten" viralen Vektorsequenz zur Rekombination mit entweder Helfervirus-Sequenzen oder Sequenzen im zellulären Genom, was infektiöse virale Partikel ergibt. Dieses Problem wurde gelöst durch Entfernen von mehr viralen Sequenzen aus Vektoren, genauso wie durch Einführung mutipler Mutationen und Umlagerungen in Helfer-Sequenzen. Zusammen erschweren diese Veränderungen die Rückkehr des Vektors zur Replikationskompetenz, können jedoch auch den Virustiter oder die Infektiosität senken. Rekombinationsereignisse sind jedoch in Retroviren üblich (Temin, H.M., Genome 31 : 17 - 22 (1989)), und daher bestehen Reversion und Rekombination als Probleme weiter fort.
Eine weitere mit RNA-Tumorviren zusammenhängende Schwierigkeit liegt darin, daß sie eine Tendenz zu Onkogenität zeigen. In dieser Klasse eingeschlossen sind die üblichen MLV-Vektoren, die Neoplasmen verschiedener Arten durch mindestens zwei Mechanismen verursachen: (1) durch Aktivieren der Transkription von benachbarten zellulären Onkogenen (Krebsgenen), was mindestens teilweise mit kraftvollen Enhancer-Promoter-Sequenzen in der viralen Transkriptions-Kontrollregion zusammenhängt, und (2) durch Rekombination mit zellulären Onkogenen, die dann ein Teil des viralen Genoms werden und schnelle Onkogenese verursachen, die mit dem Virus übertragen wird.
Ein weiteres Problem, das mit der Verwendung amphotroper Vektoren (breiter Wirt- Bereich), wie solchen, die gegenwärtig für die Human-Gentherapie vorgeschlagen werden, zusammenhängt, liegt darin, daß amphotrope Vektoren mit einem anderen Retrovirus im Human- oder Tierwirt rekombinieren könnten, was beispielsweise amphotropes Aids ergibt (Aids-Virus, der einen breiten Bereich humaner Wirte infizieren kann). Die Möglichkeit existiert theoretisch für einen amphotropen Aids-Virus (HIV) und entsteht durch Rekombination oder phänotypische Mischung mit amphotropem MLV und initiiert eine Epidemie durch starken Verbreiterung des Bereichs von Humanzellen, in denen der HIV- Virus replizieren kann.
Daher ist es wichtig, sicherzustellen, daß nicht-replikationskompetente MLV- Vektoren, die bei der Gentherapie verwendet werden, ein niedriges Potential zur Reversion oder für pathogene Effekte aufweisen. Idealerweise sollten trans-wirkende virale Gene vollständig aus den Vektoren isoliert werden, und die Vektoren sollten nicht aus MLV stammen, nicht pathogen, nicht onkogen sein und so wenig wie möglich Homologie zu MLVs wie möglich aufweisen, um produktive Rekombinationen zu beschränken, die replikationskompetente Viren ergeben wurde. Um zusätzlich für transgene Arbeit einsetzbar zu sein, sollten die Vektoren mit einer Langzeit-Verweildauer im Genom des Wirts- Organismus kompatibel sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung natürlicher, mobiler zellulärer Gene (Retrotransposons) als Kandidaten für Gentechnologie-Vektoren. Bis zur vorliegenden Erfindung wurden Retrotransposons nicht in praktischer Form für solche Verwendungen wie Tiergeninsertion oder Gentherapie angewendet. Im Gegensatz dazu konzentriert sich die Forschung auf andere Gebiete. Beispielsweise wurden ein Neomycin- Phosphotransferase-Gen genauso wie das Hefe-trpl-Gen in Hefe nach Einführung der Gene in ein Hefe-GALI-Ty-Fusionskonstrukt amplifiziert (Boeke et al., Science, 239 : 280 - 282, 1988). Dieses beinhaltete Transposition durch Ty-Element-vermittelte Transposition. Andere haben ein Mittel zur gezielten Einbringung (targeting) von Fusionsproteinen in Hefe-Ty- Retrotransposoren-Partikel entwickelt, die dann isoliert und vermutlich für die Produktion von Antikörpern, Impfstoffen, zur Proteinreinigung, für Diagnostika und ähniiches verwendet werden können. Vergleiche beispielsweise Adams et al., US-Patent Nr. 4,918,166. Nonretro- Transposons (P-elemente) wurden auch für die genetische Transposition in der Fliege Drosophila verwendet, vergleiche beispielsweise Rubin et al., US-Patent Nr. 4,670,388. Dies beinhaltet die Insertion von DNA-Material zwischen von Transposase erkannten definierten Sequenzen, Insertieren des Materials in eine Drosophila-Keimzelle und bestätigende (affirnative) Insertion des transponierbaren Elements in das Genom des Empfänger- Drosophila-Insekts, so daß es Teil des vererblichen Genoms des Insekts wird, in dem das Element und die Fremd-DNA arbeiten können. Säuger-Gentransfer und Transgene werden in Wagner et al., US-Patent Nr. 4,873,191, 1989 diskutiert. Dies beinhaltet die Einführung von exogenem genetischem Material in einen Pronukleus einer Säuger-Zygote durch Mikroinjektion. Die Zygote ist zur Entwicklung in einem Säuger fähig, und das genetische Material schließt mindestens ein Gen und eine damit operabel verbundene Kontrollsequenz ein. So wird eine genetisch transformierte Zygote erhalten. Der Embryo oder die Zygote wird in ein pseudo-schwangeres Weibchen transplantiert, und man läßt den Embryo sich bis zur Reife entwickeln, wobei die Gene integriert und exprimiert werden. Dieser Weg ist vollständig physikalisch und beinhaltet keine retrotransponierbaren Elemente (Retrotransposons erfordern keine Mikroinjektion). Die offensichtlich erste Anwendung von Retroviren zur Injektion der Keimbahn stammt von Jaenisch et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 73 : 1260 (1976) und Cell 24 : 519, (1981). Zusätzlich beschreibt Vande Woude et al., US-Patent Nr. 4,405,712 bestimmte Vektoren, die von murinen Leukämie-Sarkom-Viren stammen, und das Verfahren ihrer Transfektion in Zellen, der Auswahl des Phänotyps und dann der Superinfektion von Kulturen, um replikationskompetente Viren zu erhalten, wobei die Vektoren als Pseudotyp verpackt sind. Diese Vektoren und die beschriebenen Methoden sind nach heutigen Maßstäben ziemlich primitiv und beinhalten keine Retrotransposon- Vektoren.
Daher ist es klar vorteilhaft, eine neue, effiziente Methode zur Einführung von zellulären mobilen Elementen in die Genome zahlreicher Arten einzuführen. Die Verwendungen einer solchen Methode schließen beispielsweise Vektoren zur Untersuchung der Genexpression in kultivierten Zellen, Vektoren zur Produktion von transgenen Organismen und Vektoren für die Human-Gentherapie ein.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren oder einen Prozeß zur Verwendung von Retrotransposons als Vektoren in der Gentechnologie. Die Retrotransposons oder "springenden Gene" sind zelluläre bewegliche genetische Elemente. Die Retrotransposons sind nicht-replikationskompetenten zellulären Ursprungs und sind zur Übertragung eines Fremdgens fähig. Die Retrotransposons können als Parasiten von Retroviren wirken, wobei sie bestimmte klassische besondere Kennzeichen beibehalten, wie LTR (long terminal repeats), Bindungsstellen für retrovirale Primer und ähnliches. Die Retrotransposons enthalten jedoch üblicherweise keine funktionellen retroviralen Strukturgene, die normalerweise zur Rekombination unter Bildung replikationskompetenter Viren fähig wären. Solche Retrotransposons sind Beispiele für sogenannte "egoistische DNA", oder genetische Information, die für nichts außer der Fähigkeit zur Selbstreplikation kodiert. Die Retrotransposons wirken so durch Nutzung der gelegentlichen Anwesenheit eines Retrovirus oder einer reversen Transkriptase innerhalb der Wirtszelle, effiziente Verpackung innerhalb des viralen Partikels, der es in das neue Wirtsgenom transportiert, wo es erneut als RNA exprimiert wird. Jede innerhalb der RNA kodierte Information wird potentiell mit dem springenden Gen transportiert.
Die Transduktion exogener genetischer Information in Zellen oder Organismen wird erzielt, indem zunächst die exogenen Gene und/oder ihre Kontrollelemente in ein genetisches Retrotransposon-Element plaziert werden (zelluläres bewegliches genetisches Element mit LTR). Die LTR und die flankierende Region besteht aus einer genetischen Einheit (RNA oder DNA), die Signale enthält, welche notwendig sind zur Replikation, Verpackung, Insertion und Expression des genetischen Elements in einer Wirtszelle als Parasit der retroviralen Gentransduktion. Das rekombinante Retrotransposon wird dann transfiziert oder auf andere Weise in Zellen eingeführt, die retrovirale (oder Retrovirus-artige) replikative Funktionene bereitstellen, wie virusbildende Zellen oder andere sogenannte Helfer-Zellen. Die retroviralen Trans-Funktionen kombinieren mit RNA-Transkripten, die aus den DNA- Kopien der rekombinanten Retrotransposons gebildet werden, unter Bildung infektiöser Retrotransposon-Partikel oder Virionen. Diese Retrotransposon-Partikel, die in neue Wirtszellen transduziert wurden, werden in DNA revers umgeschrieben und stabil in das neue Wirtsgenom eingeführt, aus dem erneut RNA-Transkripte entweder aus der Retrotransposon-Transkriptionseinheit oder aus insertierten internen Transkriptionseinheiten erzeugt werden, die die Expression nützlicher Gene steuern. Die eingeführten Gene können in Abwesenheit von Helfer-Funktionen nicht weiter replizieren.
Die Erfindung kann für die Gentherapie, Geninsertion und Expressionsstudien in der Zellkultur, für die Erzeugung transgener Tiere und in weiteren Fällen verwendet werden, bei denen traditionelle RNA-Tumur-Virusvektoren als unsicher oder nicht wünschenswert angesehen werden können.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein schematisches Diagramm der Erfindung, das die Erzeugung von durch mobile VLPNF-Elemente transduzierten Zellen zeigt.
Figuren 2a und 2b sind Restriktionskarten, die die Genübertragung mit Retrotransposons VL30 in (a) ein Konstrukt pVLPNF; und (b) ein Konstrukt pVLPNR darstellen.
Figuren 3a und 3b sind Photographien, die darstellen: (a) Southern-Blot, der die DNA von Massehkulturen, Spur 1 und individuellen Klonen von in NIH3T3-Zellen transduzierten VLPN-Vektoren zeigt, verdaut mit Eco R 1 und mit 32P-radiomarkierten Neo-Sequenzen hybridisiert; (Spur 1 Massenkultur; 2 bis 7 Klone , VLPNF; 8 VLPNR-Massehkultur; Spur 9 VLPNR-Klon); und (b) Northern-Blot-Analyse von VLPN-transduzierten NIH3T3-Zellen zeigt, die vermutliche VL30- und PEPCK-Neo-RNA-Banden zeigen; (Spur 1-2, VLPNF- Massenkultur, Spuren 3-4, 5-6, 7-8, VLPNF-Klone (jeweils zwei Spuren); 9-10, VLPNR- Klone).
Figuren 4a und 4b sind Photographien, die mit VLPNF transduzierte PA317-Zellklone darstellen: (a) Southern-Blot von PA317-DNA, verdaut mit Xhol und hybridisiert mit 32P- radiomarkierten Neo-Sequenzen; und (b) Gesamt-RNA-Blots der Klone, hybridisiert mit Neo.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Die folgenden Definitionen biologischer und genetischer Begriffe sind beim Verständnis der Erfindung nützlich:
DNA: Deoxyribonucleinsäure, das genetische Material zellulärer Chromosomen.
RNA: Ribonucleinsäure, genetisches Material der RNA-Tumorviren und Retrotransposons während eines Teils des Lebenszyklus.
DNA-Sequenz: lineare Sequenz, die aus jeder beliebigen Kombination der vier DNA- Monomere besteht. Die DNA-Monomere, Nukleotide von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin, kodieren für genetische Information, einschließlich des Kodierens für eine Aminosäure, einen Promotor, eine Kontrolle oder ein Genprodukt. Eine spezifische DNA- Sequenz hat eine bekannte spezifische Funktion, kodiert beispielsweise für ein besonderes Polypeptid, einen speziellen genetischen Zug oder beeinflußt die Expression eines bestimmten pHänotyps.
Gen: die kleinste, unabhängige fünktionelle Einheit des genetischen Materials, die für ein Proteinprodukt kodiert oder die Transkription kontrolliert oder beeinflußt und mindestens eine DNA-Sequenz umfaßt.
Chimäre: ein Hybrid-Gen, das durch rekombinante DNA-Technologie produziert wird.
Genotyp: der genetische Aufbau einer Zelle oder eines Organismus.
Phänotyp: die Sammlung morphologischer, physiologischer und biochemischer Züge, die eine Zelle oder ein Organismus aufweist, die aus der Wechselwirkung von Genotyp und Umgebung resultieren.
Phänotypische Expression: die Expression des Codes einer DNA-Sequenz oder -Sequenzen, die in der Produktion eines Produktes resultiert, beispielsweise eines Polypeptids oder Proteins, oder die Expression des natürlichen Phänotyps der Zygote oder des Organismus verändert.
Chromosom: faser- oder fadenartige Struktur, die vollständig oder teilweise aus genetischer Nukleinsäure aufgebaut ist.
Retrovirus: Virus, der reverse Transkription von RNA in DNA an einem bestimmten Punkt während seines Lebenszyklus erfordert; genauer gesagt die Retroviridae oder RNA- Tumor-Viren. Diese Familie umfaßt alle Viren, die ein RNA-Genom und RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) enthalten.
Retrotransposon: ein zelluläres bewegliches genetisches Element, das von der reversen Transkription abhängt.
Vektor: üblicherweise ein Mittel, das eine Erkrankung oder eine natürliche genetische Information überträgt, hier auf ein genetisches Mittel beschränkt, das ein Fremdgen (DNA oder RNA)-Konstrukt überträgt, falls nicht anders angegeben.
Genom: ein Satz Chromosomen, haploid oder diploid, für ein Mittel oder einen Organismus.
Transduktion: hier auf die Übertragung viraler, Retrotransposon- oder exogener (zugefügte) Gene beschränkt (falls nicht mit Hilfe viraler Partikel oder viraler Funktionen anders angegeben).
Helfer-Zellinie: in diesem Zusammenhang eine Zellinie, die durch Gentechnologie hergestellt wurde oder auf natürliche Weise Gene enthält, die zur Erzeugung einiger oder aller notwenidigen retroviralen trans-wirkenden Funktionen oder Proteine fähig ist wie reverse Transkriptase, virale Kernproteine, Hüllen-Glycoproteine und/oder tRNA zum Primen der reversen Transkription und ähnliches. Beispiele für Helfer-Zellinien schließen psi2, PA317 ein.
Replikationskompetenter Retrovirus: ein Retrovirus, der alle für cis- und trans- Funktionen notwendigen Gene trägt; vollständig, zur Replikation ohne zusätzliche virale Funktionen fähig.
Nicht-replikationskompetenter (fehlerhafter) Retrovirus: Retrovirus, der zusätzliche Funktionen zur Replikation erfordert oder der zur Selbstreplikation unfähig ist. In diesem Zusammenhang erfordert er üblicherweise trans-wirkende Funktionen wie oben angegeben.
Transgen: ein Fremdgen, üblicherweise in einen Vektor insertiert.
Cis-wirkendes Element: genetisches Element, das auf demselben Stück Nucleinsäure lokalisiert sein muß, um zu wirken, wie Transkriptionspromotor oder Enhance-Elemente, Primer-Bindungsstellen und ähnliches.
Trans-wirkendes Element: genetisches Element, das nicht in cis-lokalisiert sein muß, d.h. das anderwo lokalisiert sein kann wie z.B. im zellulären Genom. Beispiele für Trans- Elemente sind Gene für das retrovirale Kernprotein, Polymerase und Hüllen-Glycoprotein.
Psi-Sequenzen: Sequenzen genetischer Information, die für die Verpackungsfunktionen kodieren, welche die Verpackung von Partikeln und Transmission von viraler oder Retrotransposon-RNA ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transfer und zur Expression eines beliebigen Gens in einer Zelle, eines Organismus oder einer Art unter Verwendung von Retrotransposons. Retrotransposons sind eine Klasse Retrovirus-artiger DNA-Elemente, die in den Genomen der meisten Säuger gefunden werden. Retrotransposons halten im allgemeinen eine strukturelle Ähnlichkeit mit Retroviren aufrecht, die wesentliche replikative Elemente innerhalb der DNA einschließt [wie LTR) long terminal repeats und Primer- Bindungsstellen]; die jedoch nicht die Fähigkeit zur Produktion von Proteinen oder Partikeln, einem beobachtbaren Phänytyp oder einer signifikanten Pathologie einschließt. Einige Retrotransposons kodieren für Proteine, die von Bedeutung für die Zelle sein können, oder für die Replikation der Retrotransposons. Retrotransposons replizieren und dispergieren sich selbst während einer retroviralen Infektion, oder bei Aktivierung endogener Retroviren oder retroviraler Gene im Wirt, oder der Wirts-Zellgene wie der zellulären reversen Transkriptase. Einige Retrotransposons sind daher ein Teil der sogenannten "egoistischen DNA", die einen bedeutenden Anteil der Genome von Menschen und der meisten Arten einnimmt. Es gibt jedoch ein breites Spektrum solcher Elemente, und einige können natürlicherweise zelluläre Gene oder mit Retrotransposon-Funktionen zusammenhängende Gene tragen. Während Retrotransposons typischerweise mit dem Wirt kompatibel sind, wurden bis zur vorliegenden Erfindung Retrotransposons nicht als wertvolle Werkzeuge zur Gen-Transduktion erkannt oder entwickelt.
Eine Klasse Retrotransposons ist Maus-VL30. Die VL30-Gene sind eine Familie disperser, mittelrepetitiver DNA-Sequenzen. Der Name VL30 stammt von der Tatsache, daß die VL30-Elemente "virusartige" Eigenschaften zeigen und eine 30 S RNA in einer Vielzahl von Mäusezellen produziert. Physikalisch ähnliche und genetisch verwandte Sequenzen sind im Ratten-Genom vorhanden.
Maus-VL30-Gene sind zelluläre genetische Elemente mit 5 Kilobasen, die mit 100 bis 200 Kopien in die Chromosomen von den meisten mus-Arten integriert gefünden werden. Die VL30-Gene verpacken sich und werden effizient durch murine und Primaten-Retroviren übertragen. VL30s und andere Retrotransposons behalten die strukturellen besonderen Kennzeichen von Retroviren wie LTR, tRNA-Primer-Bindungsstellen und umgekehrte tr (terminal repeats), die mit verschiedenen Aspekten der retroviralen Replikation zusammenhängen. Die VL30-Retrotransposons zeigen jedoch eine geringere Nukleotid- Homologie mit murinen Retroviren wie MLVs, und die zwei VL30s, die sequenziert wurden, scheinen keine langen offenen Leserahmen zu tragen. Es ist daher weniger wahrscheinlich, daß die charakterisierten VL30s produktiv mit für Protein kodierenden Regionen von MLVs rekombinieren würden. Es ist jedoch möglich, daß VL30-Verpackungssignale mit denen von MLVs rekombinieren könnten, da diese Signale offensichtlich wesentlich für die effiziente Verpackung der RNA in das virale Partikel sind, und in dieser Verpackungs- (oder psi)- Region des Genoms gemeinsam mit einigen Basenpaaren an den Grenzen der LTRS findet sich die stärkste Homologie zwischen VL30-Retrotransposons und MLVs. Es wurde vorgeschlagen, daß VL30-MLV-Rekombinationen eine Rolle bei der schnellen Reversion von Mutanten spielt, bei der nur die "psi" oder Verpackungsregion entfernt wurde.
Eine der ersten für MLV-Vektoren konstruierten Helfer-Zellinien, psi2, ist eine solche Rekombinations-anfällige Mutante, Mann et al., Cell 33 : 153159 (1983). Ein virales MLV-Genom (mit einer einzelnen 350 bp-Deletion in der Region, die Verpackungssequenzen trägt), wurde stabil in NIH3T3-Zellen transfiziert. Eine der drei isolierten Linien kehrte schnell zur Replikationskompetenz zurück. Eine weitere Helfer-Zellinie, psi 2, wurde trotz der Tendenz zur Rekombination eine nützliche Linie und wird heutzutage immer noch verwendet. Zusätzlich zur Reversion von "psi-minus"-Verpackungs-Mutanten-Linien zum "psi-plus-Phänotyp" wurde das virale Genom auch passiv durch die viralen Partikel übertragen, wenn auch mit einer viel geringeren Rate. Psi2 war der Prototyp für fortgeschrittene Verpackungs- oder Helfer-Zellinien wie PA317, das im Miller et al., US- Patent Nr. 4,861,719 diskutiert wird, welches zusätzliche Mutationen enthält, die die Rekombination der cis- und trans-wirkenden Anteile des viralen Genoms erschweren.
VL30 wird von psi2-Zellen natürlich verpackt und übertragen, genauso wie von anderen MLV- und retroviralen Primaten-Virionen. Das erfindungsgemäß verwendete VL30 enthält keine bekannten intakten Strukturgene, enthält jedoch psi-artige Sequenzen.
Es ist nicht bekannt, daß VL30 onkogen sind, trotz ihrer engen Verbindung mit den stark onkogenen MLVs. Experimentell haben MLVs zahlreiche Tumoren aktiviert und die Isolation verschiedener Onkogene ermöglicht, es gibt jedoch keine Beispiele, bei denen Maus-VL30-Gene direkt an der Onkogenese teilgenommen hätten. Es wurde auch gezeigt, daß ähnliche Ratten-VL30-Elemente mit MLV während der Entstehung von Harvey- und Kirsten-MSV-Retroviren rekombinieren (Ellis et al., Nature 292 : 506-511, 1981; Roop et al., Nature 323 : 822-824, 1986), die Mäuse-Epithel-Tumoren induzieren. Da Maus-VL30- Sequenzen sehr aktiv bei einer Vielzahl von Stimuli transkribiert werden, könnten sie ähnlich wie murine Retroviren durch Gen-Aktivierung als Insertionsmutagene wirken. Kürzlich wurde gezeigt, daß Ratten-VL30-Sequenzen in Harvey-Sarkom-Virus die Transkriptionsaktivität des begleitenden ras-Gens verstärken (Velu et al., J. Virology 63 : 1384-1392, 1989). Die Koexpression von ras aktiviert wiederum die Transkription von murinem VL30 (Owen et al., Mol. Cell Biol., 10 : 1-9, 1990). Trotz der engen Verbindung mit onkogenen MLV-Viren wurde VL30 nicht direkt mit einem onkogenen Aktivierungsereignis in Verbindung gebracht, anders als die umgebenden Beispiele wie die oben beschriebenen. Daher werden VL30s weniger wahrscheinlich in der Onkogenese involviert als MLV. Dies erklärt auch, warum eine große Anzahl von VL30s im Maus- Genom vorhanden ist, während Keimbahn-MLVs selten sind. In dem sie gutartig bleiben und den Wirts-Organismus nicht mit ungeeigneter reverser Transkription, Onkogenizität und Translationsbelastungen verkomplizieren, haben VL30s und andere Retrotransposons eine Niesche etabliert. Egoistische DNA-Parasiten scheinen vom Wirt toleriert zu werden.
Erfindungsgemäß wird die Transduktion von Fremdgen-Sequenzen in Zellen oder Organismen durch Insertion der Fremgensequenz in ein Retrotransposons-Genom, und durch Transfektion des rekombinanten, transkriptionsaktiven Retrotransposon-Genoms in Zellen ermöglicht, die zur Übertragung von Retrotransposon-RNA oder -DNA, bevorzugt RNA in der Lage sind (Helfer-Zellen). Die Wachstumsmedien solcher Zellen enthalten infektiose Retrotransposon-Partikel, deren Wirtsbereich (Bereich der Infektiosität) durch Helfer-Zellen bestimmt wird, und deren Infektiosität üblicherweise auf eine Replikationsrunde beschränkt ist. Wenn die so erzeugten Retrotransposon-Partikel oder Virionen einmal in die Empfängerzellen eingedrungen sind, wird die Transposon-RNA in DNA umgeschrieben und in das Genom der Emfängerzelle insertiert. Ein Präparat von Empfängerzellen, die das Retrotransposon in hoher und verwendbarer Ausbeute enthalten, wird durch Infektionen zusätzlicher Empfängerzellen mit zusätzlichen infektiösen Virionenpartikeln erhalten.
Das integrierte Retrotransposon kann entweder die LTR-Promoter- Transkriptionseinheit und/oder eine interne Transkriptionseinheit exprimieren, falls es so ausgerüstet ist, als RNA und bevorzugt als Protein, was in einem nützlichen Phänotyp resultiert. Die Fremdgene können von jedem dieser Promotoren oder potentiell von einem dritter Promoter transkribiert werden. Darüber hinaus können die Retrotransposons ohne Expression auf diese Weise zur Markierung einer Zelle, Art oder eines Stammes verwendet werden, um einen einmaligen identifizierenden "Fingerabdruck" bereitzustellen. Das Retrotransposon kann zusätzlich genetisches Material umfassen, das für mindestens einen dominanten selektierbaren Marker kodiert. Nützliche selektierbare Marker schließen beispielsweise Aminoglycosidphospotransferase (nea, G418, APEI), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-phosphotransferase (HPEI), Thymidinkinase (TK), Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase (XGPRT, gpt), Chlorampenicol-Acetyltransferase (CAT), Luciferase und ähnliches ein. Das Retrotransposon kann auch zusätzlich genetisches Material umfassen, das für ein Peptid, einen Antikörper, ein Antigen, ein Hormon oder einen Wirkstoff kodiert, der üblicherweise nicht in der Zellinie, dem Organismus oder der Art in biologisch signifikanten Spiegeln exprimiert wird.
Die Hauptvorteile von Retrotransposonen liegen darin, daß sie relativ nicht onkogen und nicht pathogen sind. Abgesehen von Insertionsmutagenese weist der spezifische Vektor VL30 keine bekannte Krankheits-Ethiologie oder Geschichte der Onkogenese auf, wobei er in der Keimbalm von Mäusen während Millionen von Jahren vorhanden war. Eine solche lange Verweildauer stellt gemeinsam mit den Hinweisen auf kürzliche Insertion eines VL30- Elements in das Balbic-Mausgenom (Courtney et al., J. Virol. 43 : 511-518, 1982) einen Beweis dafür dar, daß VL30 auch ein Keimbalin-Vektor für die Transgenese ist, der potentiell während langer Zeiten stabil ist. Fremdgene tragende VL30 werden effizient übertragen, und bis zu 100 Kopien eines Gens können in eine Zelle insertiert werden.
Die vorliegende Erfindung ist potentiell nützlich bei der Human-Gentherapie, wo onkogene Aktivierungsereignisse und Rekombinationen aufgrund von MLV-Vektorsequenzen durch Substitution von Retrotransposon-Vektoren vermieden werden können.
Die Quelle des in einem solchen Retrotransposon-Vektor übertragenen genetischen Materials kann von anderen Organismen, Klonen, Plasmiden und ähnlichem stammen oder synthetisch sein. Die Erfindung kann zur Modifikation einer Art oder zur Erzeugung einer neuen Art verwendet werden. Es wird hier gezeigt, daß bis zu 50 oder mehr Kopien in das Genom insertiert werden können, was die Möglichkeit zur Einführung zahlreicher Gene zum Zweck der Multi-Zug-Einführung (multi-trait introduction) oder möglicherweise Überexprimierung ermöglicht. Tandem-Integration kann ebenfalls stattfinden, und große RNA-Transkripte dieser Multimere können natürlich hergestellt werden. So können multiple zelluläre genetische Elemente eingefülrrt und im Tandem in RNA oder als separate Transkriptionseinheiten innerhalb einer einzelnen Zelle oder eines Organismus exprimiert werden.
Es existieren stumme VL30-Transkriptionseinheiten, die zum Abschalten von VL30s nach gerade einer Replikationsrunde verwendet werden können aufgrund des Kopierens der letzten LTR-Region während der reversen Transkription. Eine Vielzahl von VL30 LTRS sind verfügbar, die Kontrollelemente enthalten, die auf spezifische Stimuh reagieren, einschließlich: zelluläre Transformation, Glucocorticoide, Aktivatoren von Proteinkinase C, Serum (Epidermis-Wachstumsfaktor)-Stirnulation und ähnliches. Diese können so zugeschnitten werden, daß sie die Expressionsnotwendigkeiten individueller Anwendungen erfüllen. Da keine essentiellen Strukturgene vorhanden zu sein scheinen, wird hier gezeigt, daß es möglich ist, bestimmte Regionen mit Fremdgen-Konstrukten zu unterbrechen, ohne daß die Fähigkeit zur effektiven Transposition unterbrochen wird. Zusätzlich sind viele Werkzeuge und Methoden der Expression und Vektorologie mit Retrotransposons möglich, die mit retroviralen Vektoren verwendet werden (wie Deletion, Doppelexpression, Selbst- Inaktivierung, Keimbahn-Insertion und ähnliches), da ihr Transmissionsmodus und die Expression ähnlich sind. Existierende Zellinien wie psi2 und PA317 können zur Propagation von VL30 fast auf dieselbe Art wie für retrovirale Vektoren verwendet werden, wobei der Hauptunterschied die Verwendung von zellulären "springenden Genen" als Retrotransposons anstelle der Tumorviren ist, die in solchen Systemen bis heute verwendet wurden. Dartiber hinaus bietet die Verwendung verschiedener anderer Typen von Retrotransposons spezialisierte Attribute für hochspezialisierte Gentechnologie.

Industrielle Anwendbarkeit

Figur 1 ist ein schematisches Diagramm, das allgemein das Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigt, nachdem Zellen durch mobile Element VLPNF transduziert werden. Ein Plasmid-Klon von revers transkribiertem VL30 Element-NVL3 wurde mit der Restriktionsendonuklease Hpal verdaut, und ein stumpfendiges Fragment, das den cytosolischen Ratten-Phosphoenolpyruvat-carboxykinase [PEPCK]-Promoter und das bakterielle Neo-Gen trug, wurde in die Restriktionsstelle ligiert. Das Plasmid wurde in psi2- Zellen transfiziert, die retrovirale Helfer-Funktionen enthalten (Kemproteine, Polymerase- Integrase, und Hüllen-Glycoprotein). Die VLPNF-psi2-Zellen produzierten Partikel, die RNA-Kopien des chimären mobilen Element-VLPNF trugen, die Zellen mit hoher Effizienz infizieren können. Einmal innerhalb der Empfängerzelle wurde die RNA in DNA revers umgeschrieben und in Zell-DNA integriert, wo sie als RNA exprimiert wurde und als Protein, das den Neo-Phänotyp exprimierte. Eine Variation beinhaltet die Verwendung von replikationskompetentem Virus anstelle von Helfer-Zellen.
Entsprechend der erfindungsgemäßen Methode wurde ein Fremdgen-Promoter, PEPCK aus der Ratte, gemeinsam mit einem bakteriellen Neomycin-Resistenzgen (neo) in verschiedenen Orientierungen in ein VL30-Genom insertiert. Diese Konstrukte wurde in Helfer (psi2)-Zellen transfiziert. Es liegt im angestrebten Umfang der vorliegenden Erfindung, daß jeder andere replikationskompetente Virus oder Helfer-Zellinie anstelle der Donor-Helfer-Zellen verwendet werden kann. Von diesen Zellen übertrug VL30 effizient die Fremdgene auf NIH3T3-Zellen (Titer 10³&supmin;&sup4;). Es liegt innerhalb des angestrebten Umfangs der vorliegenden Erfindung, daß der Titer durch Methoden wie Zentrifugation, Konzentrationspatronen, Verwendung von Polybren und ähnliches erhöht werden kann. Es liegt ebenfalls innerhalb des angestrebten Umfangs der vorliegenden Erfindung, daß jede empfängliche Zelle oder Organismus als Empfängerzelle verwendet werden kann. Die VL30- Gene wurden sowohl als RNA als auch Protein exprimiert, was sie mit einem selektierbaren Phänotyp (G418-Resistenz) bei den Empfängerzellen versah. Es liegt auch innerhalb des angestrebten Umfangs der vorliegenden Erfindung, daß jeder geeignete dominante selektierbare Marker oder pHänotypische Selektionstechnik mit dem Retrotransposon kodiert werden kann.
Ein nicht permutierter Plasmidklon, der das Maus-VL30-Retrotransposon-Genom trug, wurde mit der Restriktions-Endonuklease Hpal verdaut und mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt ligiert, das aus dem Ratten-Kem-Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase [PEPCK]-Promoter, der Region von 355 Basenpaaren vor der Startstelle der Transkription bis zu 73 Basenpaaren nach der Startstelle, gefolgt von dem gesamten bakteriellen Neomycinphosphotransferase-Gen ohne Polyadenylierungs-Signal bestand. Zwei Klone wurden isoliert, die beiden (vorwärts und rückwärts) Orientierungen des heterozygoten DNA- Konstrukts entsprachen, die im folgenden jeweils VLPNF (vorwärts) und VLPNR (rückwärts) genannt werden. Die heterozygoten Retrotransposon-PEPCK-Neokonstrukte wurden im prokaryotischen Plasmid-Vektor PGEM3 nach Transfektion des DNA-Ligations- Gemisches in E. coli-kompetente Zellen gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und mit der Calciumphosphatmethode (Graham et al., Virol. 52 456-467 (1973)) in psi2-Helfer- Zellen transfiziert (Mann et al., supra., 1983). Nach einem Tag wurden 200 ug/ml des Wirkstoffs G418 zugegeben und das Wachtstum der psi2-Zellen auf den selektiven Medien während 10 weiterer Tage fortgesetzt. Massehkulturen von G418-überlebenden Zellen wurden in Medien ohne G418 gezüchtet, und gereinigte Medien von schnellwachsenden psi2- Zellen wurden zur Transduktion von VL30-Retrotransposon in solche Empfängerzellen wie NIH3T3-Zellen, PA317-Zellen und Hühner-Embryo-Fibroblasten verwendet. Ein Reverse- Transkriptase-Assay wurde verwendet, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Helfer- Virus in Donor- und Empfänger-Klonen sicherzustellen. DNA-Blotting (Southern-Blots) und RNA-Blotting (Northern-Blots) wurden zur Bestimmung der Identität und Expression der insertierten Sequenzen verwendet (beschrieben in Maniatis et al., 1984, "Molecular Kloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). SI-Nuclease-Analyse (Berk et al., Zitat benötigt) wurde zur Bestimmung der Startstelle der Transkription der internen Transkriptions-Kassette verwendet. Der Reverse-Transkriptase-Assay (Goff et al., J. Virol., 38 : 239-248, 1981) wurde verwendet, um zu bestimmen, ob Zellen infektiöse Viren produzierten, die zur reversen Transkription von RNA fähig waren.
Nach Inkubieren von NIH3T3-Zellen mit Medien aus psi2-Zellen, die nach Transfektion mit den VLPN-Vektoren Neo-Resistenz zeigten, wurden NIH3T3-Zellen selbst in G418 selektiert, um zu sehen, ob das selektierbare Neo-Gen durch die Partikel transduziert wurde.
Tabbellen IA und IB im folgenden zeigen Experimente, die zur Titration der Transduktionskraft der Partikel in den Medien durchgeführt wurden. In Tabelle IA wurden VLPNF- und VLPNR-Konstrukte in psi2-Zellen transfiziert, und die virale überstehende Flüssigkeit aus psi2-Klonen wurde auf NIH3T3-Zellen titriert und während 10 Tagen mit G418 selektiert. Tabelle IA Titer von VLPN-Retrotransposons
In Tabelle 113 wurden virale Filtrat-PA317-virale Helfer-Zellen, die mit VLPNF aus psi2- Zellen transduziert wurden, nach Selektion mit G418 kloniert, und Medien aus diesen Zellen wurden zur Transduktion von Hühner-Embryo-Fibroblasten (CEF) entweder unverdünnt oder 10000-fach verdünnt verwendet. Drei Klone von PA317 produzierten einen Titer von 10&sup4; infektiösen Einheiten pro ml oder mehr. Tabelle IB
Dieses Experiment zeigt, daß VLPNF Zellen bei einer 1000-fachen Verdünnung (≥ 10³ transduzierende Einheiten pro ml) transduzierte, während VLPNR bei 100-facher Verdünnung, jedoch nicht bei 1000-facher Verdünnung transformierte.
Klone aus Zellen aus den Verdünnungen wurden durch Präparation von Zellen aus den gebildeten Kolonien isoliert. RNA und DNA aus den Empfänger-Zellen wurde durch Elektrophorese und die oben beschriebenen Blotting-Methoden untersucht. Bei Hybridisierung mit dem bakteriellen Neo-Gen, isoliert aus einem Gel, waren zwei RNA Transkripte klar bei etwa 6 Kilobasen und 4 Kilobasen sichtbar, wobei die Größen aus der Karte der VLPN-Klone vorhergesagt sind, wie in Figuren 2a und 2b dargestellt. Das Transkript größerer Größe entspricht in der Größe dem genomischen VL30-RNA-Transkript in voller Länge, während das kleinere Transkript die Größe ist, die von der internen PEPCK- Neo-Transkriptionseinheit des Klons VLPNF erwartet wird. VLPNR-Massenkulturen und Klone ergaben nur einen leichten Schmier, was mögliche Heterogenität des internen Promoters nahelegt, wobei kein klares VL30-Transkript sichtbar ist. DNA-Blots von Zell- Klonen, die mit den zwei Konstrukten infiziert waren, ergaben EcoRI-Restriktions- Endonukleasefragmente der erwarteten Größen, wie in Figuren 2a und 2b dargestellt, mit der Ausnahme, daß die Massehkulturen und ein Klon aus VLPNF auch andere Fragmente trugen, was multiple und/oder umgelagerte Kopien der Neo-enthaltenden Sequenzen nahelegt. Da der VLPNR-Klon eine umgekehrte Transkriptionseinheit aufweist, die RNA im negativen Sinne relativ zur Retrotranspose-RNA herstellen können sollte, wird einige Transkriptions- Interferenz erwartet, die in Umlagerungen, Deletion und Veränderungen in der Transkription resultieren sollte (Hodgson et al., unveröffentlichte Ergebnisse unter Verwendung von Vogel- Leukose-Virus). Zusätzlich ist es nicht möglich anzugeben, wo das interne Neo-Transkript aufhört, da kein Polyadenylierungs-Signal in der reversen VLPNR-Heterozygote bekannt ist. Diese Selektierbarkeit der Sequenzen zeigt jedoch an, daß einige Transkription stattfindet. VLPNR dient als Kontrolle für Vorwärts-VLPNF-Experimente.
Die Massenkulturen von VLPNF-psi2-Produktionszellen wurden zur Transduktion der amphotropen Produzenten-Zellinie PA317 verwendet, die eine weitere Helfer-Zellinie mit einem stark erweiterten Bereich von infizierbaren Wirtszellen darstellt, einschließlich humanen Zellen. Um festzustellen, ob multiple VL30 transduziert werden können, wurden PA317s multiplen Dosen Medien aus psi2-Zellen ausgesetzt, die wegen verschiedener Tropismen der beiden Zelltypen PA317 wiederholt infizieren können. Klone von PA317s wurden dann isoliert, und RNA und DNA aus diesen Linien wurde untersucht. DNA aus Massenkulturen und Klone der mit VLPNF transduzierten Zellen wurden mit Xhol verdaut (vergleiche Figur 2a), daß das interne Neo-enthaltende Fragment freisetzt. Aus dem Blot ist klar, daß alle Zellen mindestens einmal transduziert wurden, daß jedoch eine große Anzahl wiederholt transduziert wurde und daß multiple Arten von VL30 wiederholt von den psi2- Produzenten transduziert wurden. Aus visueller und digitalisierter densitometrischer Analyse der Filme wird geschätzt, daß die PA317-Zellen mit einer bis zu etwa 50 bis 100 Kopien während der wiederholten Bombardierung transduziert wurden. Einige Neo-enthaltende Transduktanten wurden isoliert, die fehlende, kleinere Inserte als erwartet trugen, was anzeigt, daß einiges Material sich umgelagert hatte. Dennoch exprimierten diese Zellen, die einzelne Kopien dieses Materials trugen, den Neo-pHänotyp (G418-Resistenz), was zeigt, daß ein funktionelles Neo-Gen verblieb. Aus den in Figuren 3a und 3b gezeigten Blots ist jedoch klar, daß die meisten der übertragenen VL30-Retrotransposons VLPN-DNA fast voller Länge enthielten. Daher ist eine Umlagerung ein mögliches, jedoch kein wahrscheinliches Ereignis. Die wiederholte Insertion von Varianten mit derselben ungefähren Größe legt nahe, daß Klone von psi2-Zellen in den Produzenten-Massehkulturen wiederholt die charakteristischen Umlagerungen produzierten, die beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu könnten einige derselben Klone wiederholt isoliert worden sein. Da die DNA in psi-Zellen transfiziert worden war, könnte die Umlagerung während des Transfektionsprozesses stattgefunden haben, und in die Transduktion mitgeschleppt worden sein.
Der Vergleich von DNA-Blots mit RNA-Blots zeigte, daß die Expression auch bestimmte Insertions-Typen charakterisiert, die in den DNA-Blots beobachtet werden. Zunächst markieren Banden von ungefähr 6 bis 7 kb auf den RNA-Blots die ungefähre Position, die für die genomischen VL30-Transkripte erwartet wird, während höhere Banden nicht charakteristisch sind und nicht erwartet werden. Gemessene Größen von ungefähr 13 und 19 kb für diese größeren Transkripte weisen ungefähr die Größen auf, die erwartet werden, wenn multimere Tandem-Insertionen von VL30 aufgetreten sind, die im Tandem transkribiert werden könnten. Falls dies der Fall wäre, sollten multimere Transkripte nur in den Proben beobachtet werden, in denen multiple Transduktionen aufgetreten sind. Da dies der Fall ist (vergleiche offensichtliche Einzelkopie-Sequenzen: 2k, 2l, 2m, 2n, 2o, 2t, 2v, 2y, 3a, 1a, 2d, 2e, die nur eigentümliche Genomgrößen von RNA tragen, us Klone mit multiplen Inserten, die offensichtlich multimere Transkripte tragen), wird spekuliert, daß Tandem-Integration stattfand, und daß RNA-Transkripte daraus hergestellt wurden, die größer waren als eine Genomlänge. Es wurde auch bestimmt, ob multiple Insertionen von VLPNF in erhöhten Expressionsspiegeln resultieren wurde, oder ob die Anwesenheit von zusätzlichen cis-wirkenden Kontrollregionen in der genomischen DNA dieser Zellen die verfügbare Zufuhr von Transkriptionsfaktoren verdünnen würde. Vermutlich hat jeder chromosomale Ort seine besonderen Wirkungen auf Genexpression, so daß eine Vielzahl von Ergebnissen erwartet wurde. Als jedoch die Transkriptionsspiegel auf der Basis der gemessenen Kopien verglichen wurde, wurde ein inverser Effekt beobachtet, was nahelegt, daß zusätzliche Kopien von VLPNF nicht notwendig in einer erhöhten Expression resultieren. Eine andere Interprätation ist, daß Klone ausgewählt wurden, bei denen die mit nur einer Kopie ebenfalls zum Überleben ausreichend exprimiert wurden gemeinsam mit denen mit mehreren Kopien, von denen einige stumm gewesen sein könnten, da Selektionsdruck angewendet wurde. Daher ist noch nicht klar, ob Überexpression von VL30 LTR durch Insertieren von multiplen Kopien mit einem gegebenen Insert möglich ist.
Aus einer Analyse der beobachteten Größen der DNA-Fragmente (wie in Figur 4a dargestellt) geht hervor, daß Mutanten derselben Größen in einer Anzahl von verschiedenen Zellinien vorhanden sind, was eine gemeinsame Elternschaft nahelegt. Dies impliziert, daß Mutationen vor der Erzeugung der RNA aufgetreten sein können, und nicht während der vorliegenden Infektion. Dies gemeinsam mit den Daten, die zeigen, daß die meisten Xhol- Fragmente (einschließlich allen internen VLPN-PEPCK-Neo-Materials) in den meisten Inserten mit VL30-Retrotransposon intakt war, was nahelegt, das VL30 ziemlich stabil ist und intaktes Material weitergeben kann. Einige Instabilität ist charakteristisch für alles revers transkribierte Material, und dies wurde ebenfalls beobachtet. Da Mäusezellen viele Kopien von VL30 enthalten, einschließlich einiger transkriptionell aktiver VL30, waren diese Vektoren unzweifelhaft nicht das einzige VL30-Material, das durch psi2-Zellen übertragen wurde (Hatzoglou et al., 1991, im Druck, Human Gene Therapy). Die in diesen Studien verwendete Hybridisierungssonde wurde nur aus dem heterozygoten Bakterienanteil des Inserts erhalten, das nicht in irgend einem natürlichen VL30 oder diesen Zellen vorkommt (vergleiche negative Kontrolle PA317).
Die hier mit VL30 gemeinsam mit nicht klar gezeigten Daten gezeigten Daten ergeben hohe Spiegel der Expression des LTR-Promoters, genauso wie selektierbare Expressionsspiegel des internen Promoters. Beide Promotoren können zur Expression der Fremdgen-Sequenzen verwendet werden.
So können VL30-Vektoren mit bereits entwickelten Helfer-Zellinien wie psi1 und PA317 verwendet werden. VL30 behält die Integrität der Fremdgene und kann einzelne oder große Anzahlen (> 50) von Kopien der Fremdgene liefern, die einfach im Labor manipuliert werden können.
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Selektion hinsichtlich hoher Expressionsspiegel in Betracht, die Konzentration von VL30-Partikeln zur Erzielung höherer Titer, multiple Inserte, Deletionsmutagenese zur Bestimmung, welche Sequenzen zur Modifikation oder zur Verbesserung des Systems zum Gentransfer verwendet werden können, und ähnliches. Es können auch Vektoren eingebaut werden, in denen die zweite Generation VL30-Transkriptionseinheiten transkriptionell stumm ist, was der inserten Transkriptionseinheit einen zentralen Platz (center-stage) ermöglicht, und die Möglichkeit reduziert, daß VL30 während einer sekundären Infektion des Wirts mit einem anderen Retrovirus übertragen wird.
Praktisch alle zur Verbesserung von Retroviren verwendeten Techniken können auch für VL30 angewendet werden. Die Größe von VL30 ermöglicht die Insertion von bis zu 5 kb genetischer Information ohne die Notwendigkeit zur Entfernung irgend einer VL30- Information (MLV-Partikel verpacken bis zu etwa 10 kb genetische Information als Duplikat). Zusätzlich können andere Typen von Retrotransposons auf gleiche Art wie VL30 verwendet werden. Es wird jedoch erkannt, daß einige Systeme andere Helfer-Mechanismen erfordern als die für die hier beschriebenen Elemente verwendeten.
Wie oben diskutiert, wird erwartet, daß viele Gentypen für die Verwendung mit einem Retrotransposon-Vektor geeignet sein werden. Darüber hinaus wird erwartet, daß andere Typen von Retrotransposons sich als geeignete Vektoren erweisen werden. Die Auswahl eines bevorzugten Wirts ist nicht als Beschrähkung gemeint, und viele andere Wirte können sich als geeignet herausstellen. Während die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit einer bevorzugten Ausführungsform und beschreibenden Beispielen beschrieben wurde, ist ein üblicher Fachmann nach dem Lesen der vorstehenden Beschreibung in der Lage, verschiedene Änderungen, Substitutionen oder Äquivalente einzuführen, sowie Veränderungen der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen und Methoden. Es ist daher beabsichtigt, daß der durch das hierauf erteilte Patent gewährte Schutz nur durch die in den beigefügten Ansprüchen enthaltenen Definitionen beschränkt ist.

Claims

1.Verfahren zur Übertragung und Expression eines Gens in Zellen, Organismen oder Spezies, mit Ausnahme der Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie, umfassend die Stufen:

a) Isolierung des Gens

b) Einführung des Gens in ein Retrotransposon zur Bildung eines Hybridgens

c) Einführung des Hybridgens in eine Donorzelle, die zur Verpackung und Transmission des Hybridgens in ein Virion in der Lage ist, welches einen Retrotransposon-Vektor darstellt

d) Übertragung des Virions in eine Empfängerzelle, in der das Hybridgen durch reverse Transkription repliziert und in das Genom der Empfängerzelle insertiert wird, und

e) Expression des Hybridgens und Screenen hinsichtlich des Phänotyps des Hybridgens.

2. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei dem ein Präparat von Empfängerzellen, die das Hybridgen in hohen und verwendbaren Ausbeuten enthalten, durch Infektion zusätzlicher Empfängerzellen mit den Virionen erhalten wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem multiple Hybridgene eingeführt und als RNA exprimiert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die multiplen Hybridgene in Tandem- Anordnung eingeführt und als RNA exprimiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die multiplen Hybridgene eingeführt und als separate Transkriptionseinheiten innerhalb einer einzelnen Zelle oder eines einzelnen Organismus exprimiert werden.

6. Retrotransposon-Vektor zur Expression einer Fremdgen-Sequenz in Zeilen oder Organismen, erhältlich durch:

- Insertion der Fremdgensequenz in ein Retrotransposon-Genom, und

- Transfektion des rekombinanten, in der Transription aktiven Retrotransposon-Genoms in eine Donorzelle, die die Retrotransposon-RNA oder -DNA in Form einer Partikel oder eines Virions übertragen kann, die die Retrotransposon-Vektoren darstellen.

7. Retrotransposon-Vektor nach Anspruch 6, wobei der Vektor aus einem murinen Retrostransposon VL 30 erhalten wird.

8. Retrotransposon-Vektor nach Anspruch 7, wobei der Vektor ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Vektoren besteht, bei denen die Fremdgensequenz in Vorwärts-Orientierung vorliegt (VLNPF), und aus Vektoren, bei denen die Fremdgensequenz in umgekehrter Orientierung vorliegt (VLPNR), relativ zu VL30.

9. Retrotransposon-Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Donorzelle ausgewählt wird aus der aus psi2 und PA317 bestehenden Gruppe.

10. Retrotransposon-Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Fremdgen durch einen zellulären beweglichen genetischen Element-LTR(long terminal repeat)-Promoter exprimiert wird.

11. Retrotransposon-Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Fremdgen durch interne Transkriptionseinheiten exprimiert wird, die in einem «heterazygoten» (chimeric) zellulären beweglichen genetischen Element enthalten sind.

12. Retrotransposon-Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei das Retrotransposon zusätzlich genetisches Material umfaßt, das für mindestens einen dominanten selektierbaren Marker codiert.

13. Retrotransposon-Vektor nach Anspruch 12, wobei der selektierbare Marker ausgewählt wird aus der Gruppe, die Aminoglykosid-Phosphotransferase (eno, G4 18, APH), Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Hygromycin-B- Phosphotransferase (HPH), Thymidinkinase (TK), Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase (XGPRT, gpt), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) und Luciferase umfaßt.

14. Retrotransposon-Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 13, wobei das Fremdgen genetisches Material umfaßt, welches für ein Peptid, einen Antikörper, ein Antigen, ein Hormon oder einen Arzneistoff codiert, die jeweils normalerweise nicht in biologisch signifikanten Mengen in der Zelle, dem Organismus oder der Spezies exprimiert werden.

15. Empfängerzellen, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhalten werden oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 14 enthalten.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Retrotransposon- Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 14 oder erhalten nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 5.

17. Verfahren zur Herstellung eines Virions, welches einen Retrotransposon- Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 14 umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) Isolierung eines interessierenden Gens,

b) Einführung des Gens in einen Vektor, der mindestens ein Retrotransposon umfaßt, welches ein zelluläres bewegliches genetisches Element mit LTR's umfaßt, zur Bildung eines Hybridgens,

c) Einführung des Hybridgens in eine Donorzelle, die zur Verpackung und Übertragung des genetischen Retrotransposon-Elements in ein Virion fähig ist.

18. Virion, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 17, umfassend einen Retrotransposon-Vektor, welcher ein Hybridgen mit einem Retrotransposon umfaßt, welches ein zelluläres bewegliches genetisches Element mit LTR's umfaßt.