DE69131908T2

DE69131908T2 - Viruspartikel mit veraendertem wirtspektrum

Info

Publication number: DE69131908T2
Application number: DE69131908T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Emi; Theodore Friedman; J. Jolly; Jiing-Kuan Yee
Original assignee: University of California; Chiron Corp
Current assignee: Oxford Biomedica UK Ltd; University of California
Priority date: 1991-02-19
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2011-08-10
Also published as: AU663470B2; JP3547129B2; DE69131908T3; CA2104396C; WO1992014829A1; JPH06504905A; EP0572401A1; AU8430291A; ATE188740T1; CA2104396A1; DE69131908D1; EP0572401B1; EP0572401B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet von viralen Vektoren mit verändertem Wirtsbereich. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Vektorpartikel, die eine virale Hülle mit dem fremden Membran-assoziierten Protein VSV G enthalten und die Herstellung dieser Partikel von stabilen Zellinien.

Regierungsinteresse an der Erfindung

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter der Bewilligungsnummer HD20034 der National Institutes of Health entwickelt. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.

Hintergrund der Erfindung

Die Anordnung von umhüllten (komplexen) tierischen Viren ist gekennzeichnet durch selektiven Einschluß des viralen Genoms und akzessorischer viraler Proteine in einen knospenden viralen Partikel. Obwohl die Mechanismen für eine selektive Verkapselung oder Verpackung nicht gut charakterisiert sind, wird postuliert, daß das Erkennen von viralen Hüllproteinen innerhalb der Plasmamembran durch die viralen Nukleokapside einen möglichen Kontrollpunkt für die Verpackungsspezifität darstellt.
Unter Verwendung von internen Bild-anti-Ideotyp-Antikörpern haben Vaux et al. (Nature (London) 336: 36-42 (1988)) gezeigt, daß das Nukleokapsid von Semliki Forest Virus (SFV) einen spezifischen Rezeptor für den cytoplamatischen Schwanz des Virion E2 Spike-Glycoproteins enthält. Vaux et al. haben vorgeschlagen, daß eine spezifische Rezeptor/Liganden-artige Wechselwirkung zwischen den beiden wahrscheinlich kritisch ist bei der Organisation der Knospung von SFV und verwandten Viren aus infizierten Zellen.
In offensichtlichem Gegensatz zu dem hohen Maß an Spezifität von SFV für das E2 Protein, steht das bekannte Phänomen der "Pseudotyp"-Bildung, bei der eine gemischte Infektion einer Zelle durch ein Virus und Retroviren zur Erzeugung von Virionen-Nachkommen führt, wobei das Genom des einen Virus von dem Hüllprotein des anderen eingehüllt (encapsidated) ist. Diese phänotypisch gemischten Viren bil den Plaques auf entsprechenden Indikatorzellen und können neutralisiert werden durch Seren, die gegen das spezifische Hüllprotein gebildet worden sind. Ein Virus, von dem bekannt ist, daß es an der Pseudotyp-Bildung teilnimmt, ist das Virus der vesikulären Stomatitis (VSV), ein Glied der Rhabdovirus-Familie.
Der Mechanismus für den Einschluß des Hüllproteins von einem Virus in die Vironen eines nicht verwandten Virus ist unbestimmt. Ein Sequenzvergleich von VSV G Protein und Retrovirus-Hüllproteinen zeigt keine signifikante Sequenz-Ähnlichkeit zwischen diesen Proteinen. Bisher war es auch schwierig, zu bestimmen, ob das G- Protein allein in Abwesenheit von anderen VSV-codierten Proteinen an der Pseudotyp-Bildung teilnehmen kann. Pseudotypen bilden sich nicht zwischen VSV und Alphaviren, wie SFV, obwohl Pseudotypen zwischen zwei Alphaviren oder zwischen Alphaviren und verwandten Flaviviren, wie dem Virus der japanischen Encephalitis, gebildet werden können.
In einigen Fällen ist das phänotypische Mischen einseitig, wie im Falle von VSV mit Geflügel-Plaque-Virus (FPV) oder VSV mit Sindbis-Virus. Der Pseudoyp Viruspartikel VSV(FPV), der das VSV-Geno, eingehüllt durch das Hüllprotein von FPV enthält, und der Pseudotyp-Vektorpartikel VSV(Sindbis) gibt es, aber die umgekehrten Pseudotypen FPV(VSV) und Sindbis(VSV), die das FPV- oder Sindbis- Virusgenom, umhüllt von VSV G Protein enthalten, sind nicht nachgewiesen worden.
Eine gemischte Infektion von Zellen mit Retroviren und VSV führt üblicherweise zur Bildung von Pseudotypen mit wesentlich geringeren Titern als wenn von VSV von den gleichen Zellen gebildet wird. Es ist nicht klar, ob dies auf der Spezifität der Wechselwirkung zwischen dem Retroviren-Nukleokapsid und dem G-Protein oder auf anderen Faktoren beruht.
Retrovirale Vektoren wurden angewandt, um Gene durch Ausnutzen des viralen Infektionsprozesses wirksam zu übertragen. Fremde Gene, die in das retrovirale Genom kloniert sind, können wirksam an Zellen abgegeben werden, die für eine Infektion durch das Retrovirus empfänglich sind. Durch andere Genmanipulationen kann die Fortpflanzungsfähigkeit des retroviralen Genoms zerstört werden. Die Vektoren führen neues genetisches Material in eine Zelle ein, können sich jedoch nicht fortpflanzen. Ein Helfervirus oder ein Verpackungsmechanismus kann eingesetzt werden, um Aufbau und Austreten von Vektorpartikeln es zu ermöglichen. Wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "Vektorpartikel" virenartige Partikel, die in der Lage sind, Nukleinsäure über einen virenartigen Eintrittsmechanismus in eine Zelle einzuführen. Derartige Vektorpartikel können unter bestimmten Umständen den Transfer von Genen in die Zelle, die sie infizieren, vermitteln.
Es ist möglich, durch Einbau eines Hüllgens von einem anderen nahe verwandten Virus den Bereich von Zellen zu verändern, die diese Vektoren infizieren können. Miller et al. (Mol. Cell. Biol. 5: 431-437 (1985)) konstruierten einen von MoMLV stammenden Vektor, um einen selektierbaren Marker, Dihydrofolatreduktase, in empfängliche Zellen einzubauen, und bauten die Hüllregion von dem verwandten amphotropen Retrovirus 4070A ein, um den Wirtsbereich des Vektors zu verbreitern.
Wie oben angegeben, ist nicht klar, welche Signale erforderlich sind, um die funktionelle Anordnung der Vektorpartikel zu dirigieren, noch ist bekannt, welche Faktoren es ermöglichen, daß das Nukleokapsid und das Membran assoziierte Protein in Wechselwirkung treten und die Verpackung komplettieren. Daher wurden bisher Veränderungen des Wirtsbereichs nicht beeinflußt durch Einbau von heterologen Membran-assoziierten Proteinen innerhalb eines Vektorpartikels. Unter "heterologes Membran-assoziiertes Protein" ist ein Membran-assoziiertes Protein zu verstehen, dessen Ursprung mindestens in einer anderen Virenfamilie liegt, als der des Nukleokapsidproteins des Vektorpartikels. Wie er hier verwendet wird, sollte sich der Ausdruck virale "Familie" auf die taxonome Klasse einer Familie beziehen, wie durch das International Committee on Taxonomy of Viruses festgelegt.
Kurz gesagt, liefert die Erfindung eine Verpackungszellinie, die umhüllte Vektorpartikel mit einem vom Virus der vestikulären Stomatitis (VSV) abgeleiteten Wirtsbereich erzeugen kann, mit
einer ersten Nukleinsäuresequenz, die für die Produktion eines Nukleokapsidproteins mit Retrovirusursprung codiert;
einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die für die Produktion eines heterologen Membran-assoziierten Proteins codiert, das einen Wirtsbereich bestimmt, der von dem des Retrovirus, von dem die erste Nukleinsäuresequenz stammt,
verschieden ist, wobei das Membran assoziierte Protein mit einer äußeren rezeptorbindenden Domäne, einer Membran-assoziierten Domäne und einer zytoplasmischen Domäne VSV G-Protein ist, und die Zellen mit der ersten und zweiten Nukleinsäuresequenz stabil transfiziert sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine Säugetier-Verpackungszelle, mit codierenden Nukleotidsequenzen für gag, pol und ein heterologes chimäres Membran-assoziiertes Protein, das einen Wirtsbereich bestimmt, wobei das chimäre Membran assoziierte Protein aus einer äußeren rezeptorbindenden Domäne, einer Membran-assoziierten Domäne und einer zytoplasmischen Domäne besteht, wobei die Membran assoziierte Domäne die Membranassoziierten Domäne von VSV G und die zytoplasmische Domäne die zytoplasmische Domäne von VSV G ist und wobei die äußere rezeptorbindende Domäne aus irgendeinem Liganden/Rezeptor ausgewählt ist zur Bestimmung eines anderen Wirtsbereichs als dem des Virus von dem die für gag und pol codierende Nukleotidsequenz stammt.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektorpartikel, umfassend gag und pol retrovirale Proteine und eine Nukleinsäuresequenz, die mit dem Vektorpartikel assoziiert ist, und eine Hülle, umfassend ein heterologes chimäres Membran-assoziiertes Protein, das einen Wirtsbereich bestimmt, wobei das chimäre Membran assoziierte Protein eine äußere rezeptorbindende Domäne, eine Membran assoziierte Domäne und eine zytoplasmische Domäne umfaßt, wobei die Membran assoziierte Domäne die Membran-assoziierten Domäne von VSV G und die zytoplasmische Domäne die zytoplasmische Domäne von VSV G ist und wobei die äußere rezeptorbindende Domäne aus irgendeinem Liganden/Rezeptor ausgewählt ist zur Bestimmung eines anderen Wirtsbereichs als dem des Virus von dem gag und pol stammen.
Die funktionelle Nukleinsäuresequenz der Vektorpartikel nach der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise eine lange terminale Sequenzwiederholung von einem Retrovirus und codiert auch für ein Gen mit einem anderen Ursprung als von dem ersten Virus, wobei das Gen als ein Polypeptid, wie ein selektierbarer Marker, exprimiert wird. Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist ein Neomycin-Resistenz- Gen. Das für das Polypeptid codierende Gen kann von der langen terminalen Sequenzwiederholung, oder einem internen Promotor (promotes), der die Transcription dirigieren kann, und bei einer bevorzugten Ausführungsform von einem gewebespezifischen Promotor exprimiert werden.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines rekombinanten umhüllten Vektorpartikels aus einer Säugetier- Verpackungszelle, wobei das rekombinante Virion ein chimäres Membran-assoziiertes Protein umfaßt, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt: Einführen eines retroviralen Vektors in ein Säugetier-Verpackungszelle wobei die Zelle stabil gag und pol exprimiert, und Expression eines heterologen chimären Membran-assoziierten Proteins, das einen Wirtsbereich bestimmt, wobei das chimäre Membran assoziierte Protein eine äußere rezeptorbindende Domäne, eine Membran assoziierte Domäne und eine zytoplasmische Domäne umfaßt, wobei die Membran assoziierte Domäne die Membran assoziierte Domäne von VSV G ist und die zytoplasmische Domäne die zytoplasmische Domäne von VSV G ist und wobei die äußere rezeptobindende Domäne ausgewählt ist aus verschiedenen Liganden/Rezeptoren zur Bestimmung eines Wirtsbereichs, der von dem des Virus, von dem gag und pol stammen, verschieden ist; Kultivieren der Säugetier-Verpackungszelle und Isolieren eines von der Zelle produzierten rekombinanten verhüllten Vektorpartikels.
Noch ein anderes Verfahren betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines umhüllten Vektorpartikels von einer Säugetier-Verpackungszellinie, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt: Einführen eines retroviralen Vektors in eine stabile Säugetier- Verpackungszelle, enthaltend eine ersten Nukleotidsequenz, die für gag und pol codiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die für VSV G codiert, welche einen Wirtsbereich bestimmt, der von dem des Retrovirus, von dem die erste Nukleotidsequenzstammt, verschieden ist, wobei die zweite Nukleotidsequenz operabel mit einem induzierbaren Promotor verbunden ist; Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, zum Einleiten der Expression von VSV G von dem induzierten Promotor und Isolieren der von der Zelle erzeugten Vektorpartikel.
Die stabil transfizierte funktionelle Nukleinsäure codiert vorzugsweise für die Funktionen zur Produktion von Nukleokapsidprotein. Das Membran assoziierte Protein kann alternativ z. B. von einem induzierbaren Promotor exprimiert sein. Solche stabilen Zellinien ermöglichen die Produktion von Vektorpartikeln mit im wesentlichen jeder beliebigen erwünschten funktionellen Nukleinsäure. Die erwünschte funktionelle Nukleinsäure kann z. B. eingeführt werden durch Transfektion in diese stabilen Zellinien, die Nukleokapsid und ein Membran-assoziiertes Protein exprimieren und dadurch zur Verpackung der gewünschten funktionellen Nukleinsäure führen, mit gleichzeitiger Bildung von Vektorpartikeln.
Die vorliegende Erfindung kann angewandt werden bei einem Verfahren zum Einführen von fremder Nukleinsäure in eine Zelle, umfassend die Erzeugung eines Vektorpartikels mit einer funktionellen Nukleinsäuresequenz, einem Nukleokapsidprotein, das von einem ersten Virus stammt, und ein heterologes Membranassoziiertes Protein, wobei das Membran assoziierte Protein einen Wirtsbereich de finiert, der die Zelle umfaßt; und Infizieren der Zelle mit dem Vektorpartikel. Diese Erzeugungsstufe umfaßt vorzugsweise die Co-Transfektion mit einem Helfervirus oder einem funktionellen Teil eines Helefervirus-Genoms. In bestimmten Aspekten dieser Erfindung ist das Membran assoziierte Protein ein chimäres Protein, das eine äußere rezeptorbindende Domäne und eine Membran assoziierte Domäne umfaßt, und die äußere rezeptorbindende Domäne von einem anderen Ursprung stammt als die Membran assoziierte Domäne, die von VSV G Protein stammt. Das chimäre Protein hat vorzugsweise zwei Ursprünge, wobei nicht mehr als einer der beiden Ursprünge retroviral ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stammt die äußere rezeptorbindende Domäne von VSV G Protein und das erste Virus ist ein Retrovirus, wie MoMLV, mit einem Wirtsbereich, der weder menschliche Zellen noch eine Untergruppe von menschlichen Zellen umfaßt.
Die rekombinanten Vektorpartikel nach der vorliegenden Erfindung können verwendet werden bei einem Verfahren zum Einführen von Nukleinsäure in Zellen, die ein Teil eines lebenden Organismus sein können, umfassend das Infizieren der Zellen mit Vektorpartikeln, die die Nukleinsäure in einem Nukleokapsid und einer lipiden Hülle aufweisen, wobei das Nukleokapsid von einem ersten Virus stammt, die Hülle ein assoziiertes heterologes Membran-assoziiertes Protein aufweist, das einen Wirtsbereich bestimmt, der die Zellen umfaßt, und wobei die Nukleinsäure in weitere Nukleinsäure transcribiert werden kann. Bei bestimmten bevorzugten Formen des Verfahrens umfaßt das Verfahren auch das Transcribieren der Nukleinsäure in komplementäre Nukleinsäure. Bei einer bevorzugten Form des Verfahrens codiert die Nukleinsäure für ein Polypeptid und das Verfahren umfaßt das Exprimieren des Polypeptids durch Translation der komplementären Nukleinsäure.
Die bei diesem Verfahren verwendete Nukleinsäure kann für ein therapeutisches Mittel codieren. Bei einer Form kann das Verfahren angewandt werden, als Therapie für einen genetischen Defekt, bei dem ein Polypeptid nicht in ausreichender Menge in aktiver Form exprimiert wird, wobei das Polypeptid das durch die Nukleinsäure codiert wird, eine aktive Form des Polypeptids ist, das nicht in ausreichender Menge exprimiert wird und wobei die mit den Vektorpartikeln infizierten Zellen von dem Säugetier sind.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren das Identifizieren von Zielzellen in dem Organismus, in die die Nukleinsäure eingeführt werden soll, wobei das Membran assoziierte Protein einen Rezeptor auf den Zielzellen erkennt, und umfaßt auch das Integrieren der Nukleinsäure in das Genom der Zellen.
Weitere Ziele, Merkmale und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung im Zusammenhang mit den anliegenden Zeichnungen hervor.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine schematische, nicht maßstabsgetreue, Darstellung von retroviralen Vektoren und Verpackungsgebilden pLRNL, pLARNL, pLGRNL, pSVGP und pSAM zur Erzeugung von retroviralen Vektorpartikeln.
Fig. 2 zeigt eine Southern Blotting Analyse von mit LGRNL infizierten Zellen unter Verwendung eines Neomycin-Resistenz-Gens als Sonde.
Fig. 3 zeigt Immunopräzipitate, die durch SDS-PAGE abgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht worden sind. Die Bahnen 1 und 2 zeigen die polyclonale Zellinie, die mit anti-VSV G bzw. normalem Kaninchenserum immunologisch ausgefällt worden ist. Bahn 3 zeigt scheininfizierte MDCK Zellen, die mit anti-VSV G- Antikörper immunologisch ausgefällt worden sind.
Fig. 4 zeigt Immunopräzipitate von gepoolten ausgewählten Zellen, die eine Woche gewachsen und dann wieder durch FACS-Sortieren isoliert worden sind. Bahn 1 zeigt die Auszüge der zweimal sortierten Zellen, die immunologisch mit dem Anti-VSV G-Antikörper ausgefällt worden sind und Bahnen 2, 3 und 4 entsprechen den Bahnen 3, 2 bzw. 1 der Fig. 3.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es hat sich gezeigt, daß VSV G Membran-assoziiertes Protein in retrovirale Vektorpartikel eingebaut werden kann, um einen veränderten Wirtsbereich über ein breites Spektrum von Zellen zu ergeben.
Als Modellsystem wurde das VSV G Membran assoziierte Protein in Vektorpartikel auf Basis von Moloney Mäuse-Leukämievirus (MoMLV) eingebaut, um einen retroviralen Vektorpartikel mit einem von MLV abgeleiteten Nukleokapsid und dem Membran-assoziierten Protein VSV G in seiner Hülle zu erzeugen. Derartige Vektorpartikel sollen hier durch die Bezeichnung MLV[VSV G] angegeben werden. Diese Bezeichnung sollte hier allgemein verwendet werden, um Vektorpartikel mit einem Nukleokapsid von einem viralen Ursprung und einem Membran-assoziierten Protein von einem anderen Ursprung zu bezeichnen, wobei der nicht in Klammern stehende Teil der Bezeichnung sich auf den Kapsid-Ursprung bezieht und der in Klammern stehende Teil sich auf das Membran assoziierte Protein in der Hülle des Vektorpartikels bezieht.
Zur Produktion von Vektorpartikeln kann die Nukleinsäure der Vektorpartikel nach der Erfindung verwendet werden, um eine geeignete Zellinie zu transfizieren. Die Vektorpartikel werden in dem Überstand der transfizierten Zellen freigesetzt und verwendet, um einen gewünschten Zelltyp zu transfizieren. Die zur Transfektion verwendete Nukleinsäure kann entweder in isolierter Form vorliegen oder sie kann schon in Vektorpartikeln verpackt sein. In einigen Fällen ist ein Helfervirus erforderlich, um den Virion-Aufbau zu erleichtern. So können z. B. die Gene, die für gag und pol Gene codieren, in die Nukleinsäure eines Helfervirus eingebaut werden und funktionelle Sequenzen von einem anderen Virus können in die Nukleinsäure eingebaut werden, die in die Vektorpartikel verpackt ist.
Das für ein Membran-assoziiertes Hüllprotein codierende Gen kann in die Nukleinsäure entweder des Vektorpartikels oder des Helfervirus eingebaut sein. Alternativ könnte das Gen für dieses Hüllprotein von einem dritten Fragment von Nukleinsäure oder von dem Genom der Erzeugerzelle exprimiert werden. Bei einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure in dem Vektorpartikel in das zelluläre Genom der durch den Vektorpartikel infizierten Zelle eingebaut, wobei sich das Hüllgen auf einem anderen Fragment von Nukleinsäure befindet als derjenigen Nukleinsäure, die Vektorpartikel Genom ist. So wird bei dieser bevorzugten Ausführungsform das Membran assoziierte Protein nicht durch die mit Vektorpartikel infizierten Zellen erzeugt, die integrierte Nukleinsäure von dem Vektorpartikel enthalten.
Wie unten beschrieben, wurde festgestellt, daß das VSV G-Protein allein ausreichend ist, um bei der Bildung von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln mit dem Nukleokapsid von MoMLV in Wechselwirkung zu treten. Der Prozeß des Einbaus des VSV G Proteins in die Vektorpartikel ist effizient und führt zur Produktion von infektiösen Vektorpartikeln mit Titern, vergleichbar denjenigen von ganzen Retroviren. So wird angenommen, daß andere heterologe Membran assoziierte Proteine ebenfalls effizient in die Hüllen von umhüllten Viren eingebaut werden können.
MoMLV ist ein Mäuse-Retrovirus, das eine geringe Infektiosität außerhalb von Mäusezellen hat. Wenn dieses wirtsspezifische (ecotrope) Virus geeignet ist, retrovirale Vektorpartikel zu erzeugen, die z. B. das N2-Vektorgenom enthalten, wird dieser Vektor nur Mäusezellen mit annehmbarer Effizienz infizieren. Das verwandte am photrope N2 Virus wird Zellen von Mensch, Maus und anderen Organismen infizieren. Dieser Unterschied ist dem Ersatz des wirtsspezifischen Hüllproteins durch das amphotrope Hüllprotein zuzuschreiben. Beide Typen von viralen Vektorpartikeln haben im wesentlichen identische Nukleokapside, die von MoMLV abgeleitet sind. Weder das wirtsspezifische N2 noch das amphotrope N2 Virus infiziert jedoch Hamsterzellen. Wie in den unten angegebenen Beispielen gezeigt, wurde festgestellt, daß Hamsterzellen durch MLV[VSV G]-Vektorpartikel infiziert werden können und daß der Zusatz von Anti-VSV-Serum zu Zubereitungen von diesen viralen Partikeln ihre Infektiosität vollständig aufhob. So konnte gezeigt werden, daß das Vorhandensein von VSV G-Protein in den Vektorpartikeln zu Vektoren mit einem von VSV abgeleiteten Wirtsbereich führte, dem Ursprung des Membran-assoziierten Proteins, das in ihre Hülle eingebaut ist.
Um zu bestimmen, ob Vektorpartikel, die heterologes Membran-assoziiertes Protein enthalten, effizient zusammengefügt werden könnten, wurde untersucht, ob das VSV G Protein mit dem Nukleokapsid von MoMLV zusammengefügt werden konnte. Zunächst wurde das Neomycin-Phosphotransferase-Gen (Neo) das Neomycin-Resistenz verleiht, als selektierbarer Marker für die Vektorpartikel in die amphotrope Verpackungszellinie PA317 eingebaut. Die erhaltenen Vektorpartikel wurden zu Zellen zugegeben, die nicht imstande waren, eine amphotrope MLV Infektion zu fördern. Zellen von Babyhamsternieren (BHK) haben keine amphotropen Zelloberflächen-Rezeptoren und sind daher nicht empfänglich für eine Infektion mit amphotropen Retroviren auf MLV-Basis, wie in den Versuchen von Beispiel 1 unten gezeigt.
Bei Anfangsversuchen wurde bestätigt, daß diese Zellinie tatsächlich gegen eine Infektion durch amphotropen MLV-Retrovirus weitgehend immun (refractory)ist. Die nächste Reihe von Anfangsversuchen ist in Beispiel 1 gezeigt. Bei diesen Versuchen wurde bestätigt, daß das amphotrope N2 Virus, das das Neo-Gen enthält, in Ratten-208F-Fibroblasten wächst, aber nicht in BHK-Zellen.

Beispiel 1

Wachstum von N2 Virus in Ratten 208F Fibroblasten

Amphotropes N2 Virus, das das Neo-Gen, eingefügt zwischen den langen terminalen Wiederholungen (LTRs) von MoMLV enthält, wurde von der Erzeugerzellinie PA317/N2 hergestellt und der Titer sowohl an BHK-Zellen als auch an Ratten- 208F-Fibroblasten, eine Zellinie, die für eine MoMLV-Infektion empfänglich ist, bestimmt. Es wurde eine 105-fache Abnahme an Neoresistenten (Neor) Kolonienbildenden Einheiten (CFU) in BHK-Zellen beobachtet, verglichen mit derjenigen in Ratten 208F Zellen; so unterstützte die verwendete BHK-Zelle die Infektion durch N2-Virus, enthaltend das amphotrope Retrovirus-Hüllprotein nicht.
Nach Abschluß der Anfangsuntersuchungen wurden umhüllte Vektorpartikel hergestellt, die heterologe Membran assoziierte Proteine enthielten. Als ein Beispiel für eine derartige Produktion ist Beispiel 2 angegeben, um die Produktion von amphotropen N2 MLV[VSV G]-Vektorpartikeln unter Verwendung eines retroviralen Vektors auf MLV-Basis zu zeigen, der für das VSV G Protein codiert. Es wurden die MLV[VSV G] Vektorpartikel auf BHK-Zellen untersucht, um festzustellen, ob der Wirtsbereich dieser Vektorpartikel gegenüber amphotropen MLV verändert war.

Beispiel 2

Erzeugung von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln

Um MLV[VSV G]-Vektorpartikel zu produzieren, wurden retrovirale Vektoren auf MoMLV Basis verwendet, wie in Fig. 1 gezeigt, die nicht maßstabsgetreu ist. In pLRNL wurde das von dem Rous Sarcoma Virus (RSV) Promotor exprimierte Neor- Gen zwischen die LTRs von MoMLV eingefügt. Der retrovirale Vektor pLRNL auf MoMLV Basis enthält das Neo-Resistenz (Neo)-Gen unter der Kontrolle des Promotors von RSV. Dieser Vektor wird beschrieben von Li et al. in Virology 171: 331-341 (1989), auf dessen Inhalt hier verwiesen wird. Eine einzige BamH1-Stelle befindet sich unmittelbar stromaufwärts des RSV Promotors. In diese BamH1 Stelle wurde ein 1,7-Kilobasen-Paar (kb) BamHi-Fragment, das den vollständigen codierenden Bereich von VSV G-Gen enthält eingefügt, was zu dem Gebilde pLGRNL führte. Dieses VSV G-Gen wird beschrieben von Rose et al., Cell 30: 753-762 (1982) und Rose et al., J. Virol. 39: 519-528 (1981), auf deren Inhalt hier verwiesen wird. Das ebenfalls in Fig. 1 gezeigte Plasmid pSAM, das den gag-Bereich von MoMLV, einen hybriden pol- Bereich aus MoMLV und amphotropem Virus 4070A, und den env-Bereich von 4070A enthält wird von Miller et al., Science 225: 630-632 beschrieben, auf dessen Inhalt hier verwiesen wird.
HPRT-Mangel 208F-Zellen wurden von Fischer Rattenzellen durch Selektion in 6-Thioguanin abgeleitet, wie von Quade, K. in Virology 98: 461-465 (1979) beschrieben, auf dessen Inhalt hier verwiesen wird. Thymidinkinase-(Tk)-Mangel BHK- Zellen wurden von BHK21 Zellen durch Selektion mit 5-Bromdesoxyuridin abgeleitet, wie von Littlefield et al., Nature 211: 250-252 (1966) beschrieben auf dessen Inhalt hier verwiesen wird. Diese BHK-Zellen und 208F-Fibroblaste wurden in Dulbeccomodifiziertem Eagle-Medium (DME) mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10% Kalbsembryoserum (FCS) gezüchtet.
Um infektiöse Vektorpartikel zu erzeugen, wurde entweder pLGRNL oder pLRNL in BHK-Zellen transfiziert, zusammen mit dem Helfervektor pSAM, der MoMLV gag Protein, ein Polymerase-Gen und ein amphotropes Hüllprotein von dem frühen SV40 Promotor exprimiert. Die Überstände von transfizierten BHK-Zellen wurden 48 h nach der Transfektion gesammelt und verwendet, um empfängliche 208F-Zellen und resistente BHK-Zellen zu infizieren. Um den Titer des Virus zu bestimmen, wurden Zellen über Nacht mit filtrierten Überständen in Gegenwart von 4 mg/ml Polybrene infiziert. Infizierte Zellen wurden in einem Medium, enthaltend 400 mg/ml G418, selektiert und Kolonien etwa 14 Tage nach der Infektion ausgezählt. Die Ergebnisse des Versuchs dieses Beispiels sind in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß von pLRNL, ohne VSV G-Protein, abgeleitete Vektorpartikel in der Lage waren, 208F-Zellen wirksam zu infizieren, aber BHK Zellen nicht infizierten. Im Gegensatz dazu konnten von pLGRNL mit VSV G-Protein abgeleitete Vektorpartikel nicht nur 208F-Zellen sondern auch BHK-Zellen infizieren, wie durch das Auftreten von Neon-Kolonien gezeigt. So war der Wirtsbereich der MLV[VSV G]-Vektorpartikel, bezogen auf amphotropes MLV verändert. Folglich wird angenommen, daß das durch die pLGRNL-transfizierten BHK-Zellen produzierte VSV G-Protein des Beispiels 2 in mindestens einige der retroviralen Vektorpartikel eingebaut wurde, was zur Bildung von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln führte, die Hamsterzellen infizieren konnten. Da das einzige durch pLGRNL codierte VSV-Protein das VSV G-Protein ist, zeigen die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse des Beispiels 2 auch, daß G-Protein allein, ohne Beteiligung der anderen VSV- codierten Proteine, ausreicht zur Bildung von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln. Folglich zeigt Beispiel 2, daß infektiöse Vektorpartikel mit einem Nukleokapsid von einem Virus und einem homologen Membran-assoziierten Protein zusammengefügt werden konnten.
Wie oben bei dem Hintergrund der Erfindung angegeben, führte eine gemischte Infektion von VSV und Retroviren zu einem geringeren Titer an Vektorpartikeln als er durch eine VSV-Infektion allein erhalten wird. Das ist nicht das Ergebnis eines unzureichenden Einbaus in Virionen auf Grund einer geringen Spezifität zwischen dem G-Protein und dem retroviralen Nukleokapsid, sondern es wird angenommen, daß dieser geringere Titer auf der progressiven Hemmung der Zellprotein- Synthese, umfassend solche Proteine, die durch die Retroviren codiert werden, beruht, als Ergebnis der Toxizität von VSV G-Protein.
So wurden Versuche durchgeführt, NLV[VSV G]-Vektorpartikel ohne irgendein Hüllprotein, das von der gleichen Familie wie MLV stammt, zu bilden, um zu bestimmen, ob das Vorhandensein von Membran-assoziiertem Protein von der selben Virenfamilie wie der Ursprung des Nukleokapsids erforderlich ist zur Bildung von Vektorpartikeln. Ein Beispiel für einen solchen Versuch ist in Beispiel 3 angegeben.

Beispiel 3

Bildung von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln ohne Env-Gen-Produkt

Für diesen Versuch wurden zwei zusätzliche in Fig. 1 gezeigte Vektoren, pLARNL und pSVGP erzeugt. pLARNL wird von pLRNL erzeugt, ähnlich der Erzeugung von pLGRNL, wobei jedoch ein 2,7 kb Xbal-Fragment, enthaltend das Hüll- (env)-Gen von amphotropem Retrovirus 4070A in die BamH1-Stelle in pLRNL eingefügt wurde. pSVGP wurde aufgebaut durch Einfügen eines 5,8 kb HindIII-Scal- Fragments, enthaltend den frühen SV40-Promotor und die gag und pol Bereiche von pSAM, in den Säugetier-Expressionsvektor pcD, der von Okayama et al. in Mol. Cell. Biol. 3: 280-289 (1983) beschrieben ist, auf dessen Inhalt hier verwiesen wird. "PolA" in Fig. 1 zeigt das von SV40 stammende Polyadenylierungs-Signal.
In diesem Beispiel wurden pLRNL, pLARNL oder pLGRNL mit pSVGP in BHK- Zellen co-transfiziert. Um Vektorpartikel zu erzeugen, wurden 10 ug der Vektor-DNA zusammen mit 10 ug pSVGP in Zellen co-transfiziert, unter Anwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens nach Graham et al., Virology 52: 456-457, auf dessen Inhalt hier verwiesen wird. Das Kulturmedium wurde 36 h nach der Transfektion gesammelt und durch ein 0,45 mm Filter filtriert.
Das Gebilde pSVGP enthält gag und pol-Gene, exprimiert von dem frühen SV40-Promotor, aber das MoMLV-Env-Gen ist nicht vorhanden. Die Titer der den Neor-Marker exprimierenden Vektorpartikel (pLARNL oder pLGRNL) wurden getrennt auf 208F- und BHK-Zellen wie oben beschrieben bestimmt. Die erhaltenen Titer sind in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß keine infektiösen Vektorpartikel von pLRNL und pSVGP co-transfizierten Zellen nachgewiesen wurden, da das MoMLV-env-Gen in beiden Plasmiden nicht vorhanden war. 208F-Zellen, die mit pLARNL, enthaltend das amphotrope MLV-env-Gen, und pSVGP co-transfiziert waren, erzeugten einen Neon-Titer von 200-300 CFU/ml, aber diese Zubereitung infizierte BHK-Zellen nicht. Sowohl 208F- als auch BHK-Zellen wurden jedoch mit ähnlicher Effizienz infiziert durch von pLGRNL abgeleitete Vektorpartikel, enthaltend das VSV G-Gen, das mit pSVGP co-transfiziert. Da die LGRNL-Vektorpartikel in vollständiger Abwesenheit von MoMLV-env-Protein erzeugt wurden, führen die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse des Beispiels 3 zu dem Schluß, daß ein heterologes Membran-assoziiertes Protein in die Vektorpartikel eingebaut werden kann, ohne Beteiligung irgendeines Hüll proteins, das von der gleichen Virenfamilie stammt wie das Nukleokapsid. Da G- Protein auch das einzige durch VSV-codierte Protein ist, das in diesem Beispiel verwendet wird, bestätigt das, daß keine anderen VSV-Genprodukte als das G-Protein für die Bildung von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln erforderlich sind. So wird angenommen, daß allgemein keine zusätzlichen Genprodukte erforderlich sind zum Einführen von fremden Membran-assoziierten Proteinen in Vektorpartikel.
Es wurden ähnliche Titer an Neo-Resistenz erhalten wenn vorübergehend gebildete LGRNL- und LARNL-Vektorpartikel auf 208F-Zellen untersucht wurden. Da die Expression sowohl des Retrovirus-env-Gens als auch des VSV-G-Gens durch das gleiche MoMLV-LTR in diesen Gebilden gesteuert wird, wird angenommen, daß die Mengen an vorübergehend gebildeten Proteinen in den transfizierten BHK-Zellen ähnlich sind. Die Möglichkeit, daß die Stabilität der beiden Proteine verschieden ist, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. In jedem Falle wird angenommen, daß andere Membran-asoziierte Proteine ähnlich exprimiert werden können unter Verwendung dieser und ähnlicher Gebilde.
So wird angenommen, daß die Wechselwirkung zwischen Nukleokapsiden und dem heterologen Membran-assoziierten Protein mindestens so effizient sein kann wie oder effizienter als mit heterologem Membran-assoziiertem Protein. Im Falle von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln wurde eine höhere Infektions-Effizienz von 208F-Zellen durch MLV[VSV G]-Vektorpartikel bei geringeren Titern beobachtet als mit Vektorpartikeln, bei denen sowohl Nukleokapsid als auch Membran-assoziiertes Protein von MLV abgeleitet waren. Es hat sich gezeigt, daß die Rezeptoren für Mäuse-Retroviren, wie MLV, Zelloberflächen-Proteine sind, während eine gewisse Vermutung dafür spricht, daß ein Membran-Phospholipid der Rezeptor für VSV ist, der möglicherweise verantwortlich ist für den weiten Wirtsbereich von VSV. Daher wird angenommen, daß die hier beobachteten Neor-Titer von MLV[VSV G]- Vektorpartikeln die erhöhte Empfindlichkeit von Zellen für eine Infektion mit MLV[VSV G]-Vektorpartikeln gegenüber einer mit env enthaltenden MoMLV-Vektorpartikeln widerspiegelt.
Um sicherzustellen, daß die Infektionsspezifität mit Vektorpartikeln, wie MLV[VSV G], durch das Membran assoziierte Protein bestimmt wird, können die Vektorpartikel mit neutralisierendem Antiserum, spezifisch für das Membranassoziierte Protein, behandelt werden. Wenn die Spezifität durch das Membranassoziierte Protein bestimmt wird, würde ein solches neutralisierendes Antiserum eine Infektion durch die neutralisierten Partikel verhindern. So wurde der Versuch des Beispiels 4 durchgeführt, um zu bestimmen, ob Vektorpartikel mit einem heterologen Membran-assoziierten Protein eine Infektionsspezifität ergaben, die bestimmt ist durch das Membran assoziierte Protein. In Beispiel 4 wurde Anti-VSV-Serum verwendet, um in Infektiosität der MLV[VSV G]-Vektorpartikel zu neutralisieren.

Beispiel 4

Neutralisation von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln

Vektorpartikel, die vorübergehend gebildet wurden durch Co-Transfektion von pLARNL oder pLGRNL mit pSVGP, wurden 45 min. bei 37ºC entweder mit normalem Kaninchenserum oder mit verschiedenen Verdünnungen (1 : 500, 1 : 100 und 1 : 20) von Kaninchen-anti-VSV-Serum, das erhalten worden war von Lee Biomolecular Research Laboratories Inc., inkubiert. Die Überstände wurden 48 h nach Co-Transfektion von pSVGP mit pLARNL oder pLGRNL in BHK-Zellen gewonnen. Die Vektorpartikel wurden quantitativ bestimmt durch Untersuchung der Bildung von Neon-Kolonien auf 208F-Zellen und BHK-Zellen, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Aus den in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse ist ersichtlich, daß bei einer Verdünnung von 1 : 100 Anti-VSV-Serum die Infektiosität von LRGNL-Vektorpartikeln auf beiden Zellarten deutlich verringerte, während der Titer von LARNL auf 208F-Zellen dadurch nicht beeinflußt wurde, daß sie VSV-Antiserum ausgesetzt wurden. Diese Beobachtung stützt ferner die Annahme, daß VSV G-Protein in die Vektorpartikel von LGRNL eingebaut ist.
Wie aus den in Tabelle 2 im Detail gezeigten Ergebnissen des Beispiels 3 hervorgeht, war der Einbau von VSV G-Protein in Vektorpartikel effizient, da vorübergehend durch Co-Transfizieren von pLGRNL oder pLARNL mit pSVGP gebildete Vektorpartikel ähnliche Neon-Titer auf 208F-Zellen ergaben. Anschließend wurde bestimmt, ob das Verfahren des Einbaus von Membran-assoziierten Proteinen, wie VSV G-Protein, in Partikel-Hüllen in Gegenwart des nativen Partikel-Hüllproteins ebenso effizient ist. Diese Bestimmung wurde durchgeführt durch Co-Transfizieren von pLGRNL mit pSAM in BHK-Zellen und Analysieren der Anteile an reinen Vektorpartikeln und phänotypisch gemischten Partikeln durch Anti-VSV-Antikörper-gesteuerte Komplement-vermittelte Lyse. Diese Versuche sind in Beispiel 5 angegeben.

Beispiel 5

Komplement-vermittelte Lyse von MLV[VSV G]-Vektorpartikeln

Vektorpartikel, enthaltend Zell-Überstand in einem Endvolumen von 200 ul DMB-10% FCS, enthaltend unterschiedliche Mengen an spezifischen Antiseren, ergänzende oder gleiche Volumina Normalserum wurden 45 min. auf 37ºC erwärmt. Das Gemisch wurde dann in Gegenwart von 4 ug/ml Polybrene zu Kulturmedien zugegeben. Infizierte Zellen wurden, wie oben angegeben, in G418 enthaltendem Medium selektiert. Virale Überstände wurden 48 h nach der Co-Transfektion von pSAM mit pLARNL oder pLGRNL in BHK-Zellen gewonnen. Die Überstände wurden entweder mit 10 ul Kaninchenserum oder 10 ul Anti-VSV-Serum in einer Verdünnung von 1 : 20, mit oder ohne 10 ul Kaninchen-Komplement, behandelt. Alle Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 200 ul, 45 min. auf 37ºC erwärmt, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeben. Tabelle 4
Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, daß ohne irgendeine Behandlung vorübergehend gebildete LGRNL-Vektorpartikel einen Noeor-Titer von 380 CFU/ml auf 208F-Zellen und 260 CFU/ml auf BHK-Zellen ergaben. Der Zusatz von normalem Kaninchenserum zu der gleichen Zubereitung von Vektorpartikeln hatte keinen Einfluß auf den Titer. Im Gegensatz dazu fiel der Titer auf 270 CFU/ml auf 208F-Zellen und auf Hintergrundniveau auf BHK-Zellen, wenn die Vektorpartikel mit einer 1 : 20-Verdünnung des Anti-VSV-Antikörpers vorbehandelt worden waren. Dieses Ergebnis zeigt einen Titer an LGRNL-Vektorpartikeln, enthaltend nur VSV G-Protein, in dieser Zubereitung von etwa 110 CFU/ml auf 208F-Zellen an. Um den Anteil an Vektorpartikeln, die nur das retrovirale Hüllprotein enthalten, und den Anteil an Vektorpartikeln, die sowohl das retrovirale Hüllprotein als auch das VSV-G-Protein enthalten, in dieser Zubereitung zu bestimmen, wurde die Zubereitung der Vektorpartikel mit einer Kombination von Kaninchen-Komplement und dem Anti-VSV-Antikörper behandelt.
Die potenzierende Wirkung der Komplement-vermittelten Lyse, um MLV[VSV G]-Vektorpartikel wirksam zu eliminieren, wurde vorher von anderen gezeigt. Der Zusatz von Kaninchen-Komplement allein zu der Zubereitung von Vektorpartikeln verringerte den Neon-Titer leicht auf 320 CFU/ml auf 208F-Zellen und 230 CFU/ml auf BHK-Zellen (s. Tabelle 4), vermutlich auf Grund der unspezifischen Wechselwirkung von Kalbsembryoserum in den Medien mit Kaninchen-Komplement. Mit einer 1 : 20- Verdünnung des Anti-VSV-Antikörpers zusammen mit Kaninchen-Komplement vorbehandelte Vektorpartikel ergaben einen Neon-Titer von 90 CFU/ml auf 208F-Zellen. So wird angenommen, daß diese nicht neutralisierte Population von Neon-Vektorpartikeln nur das retrovirale Hüllprotein enthält. Diese Interpretation stimmt mit den in auch Tabelle 4 gezeigten Ergebnissen überein, bei denen ähnliche Behandlungen von LARNL-Vektorpartikeln, die nur retrovirales Hüllprotein enthalten, eine geringe Wirkung auf den Neon-Titer ausüben, wenn er auf 208F-Zellen gemessen wird. So ist es wahrscheinlich, daß VSV-G-Protein und andere Membran assoziierte Proteine selbst in Gegenwart von nativen Hüllproteinen wirksam in Vektorpartikel eingebaut werden können.
Retrovirale DNA wird in Wirts-Chromosomen in einer Art integriert, die die lineare Organisation des viralen Genoms in Sequenzen, die als provirale Sequenzen bezeichnet werden, aufrecht erhält. Um sicherzustellen, daß Zellklone, die durch Infektion mit umhüllten Vektorpartikeln mit einem heterologen Membran-assoziierten Protein entstanden sind, provirale Sequenzen enthielten, die die lineare Organisation der Vektorpartikel-Nukleinsäure aufrecht erhalten, wurde eine Southem Blotting- Analyse von LGRNL infizierten Klonen durchgeführt. Dies Versuche sind in Beispiel 6 angegeben.

Beispiel 6

Southern-Blotting-Analyse von LGRNL-infizierten Zellen

Genomische DNA wurde hergestellt, wie von Maniatis et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) beschrieben, auf dessen Inhalt hier verwiesen wird. DNA-Proben wurden mit entsprechenden Restriktionsenzymen abgebaut, der Elektrophorese auf 0,8% Agarosegelen unterworfen und auf Nylonmembranen übertragen. Eine ³²P-markierte DNA-Sonde, enthaltend das vollständige Neomycin-Phostphotransferse-Gen, hergestellt mit Desoxyhexanucleosiden als Primer mit Zufallsfrequenz (Amersham) wurde als Hybridisierungs-Sonde auf den Filtern verwendet. Filter wurden mit 0,1 · SSC - 0,5% SDS bei 53ºC mehrere Male gewaschen und einer Autoradiographie unterworfen.
Genomische DNA wurde von zwei unterschiedlichen Neon-Klonen (Bahnen B und C) und zwei unterschiedlichen Neon-BHK-Klonen (Bahnen D und E), die mit LGRNL-Vektorpartikeln infiziert waren, isoliert. DNA (10 ug) wurde mit SstI zerschnitten, auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, auf ein Filter vom Nylontyp übertragen und mit einer Neo-Gen-spezifischen Sonde untersucht. 5 ng pLGRNL-Plasmid- DNA, die mit SstI abgebaut worden war, wurden auf Bahn A aufgebracht, um als Marker zu dienen. Das erhaltene Southern Blotting ist in Fig. 2 gezeigt.
SstI spaltet jedes LTR von LGRNL nur einmal und es wird daher angenommen, daß ein 5 kb Fragment entsteht (s. Fig. 1). Wie aus den Bahnen B bis E der Fig. 2 ersichtlich, wurde ein Fragment von etwa 5 kb nachgewiesen, wenn die Chromosomen-DNA von den beiden BHK-Klonen und zwei 208F-Klonen mit Sst I gespalten wurde und zu einer Sonde, enthaltend das Neo-Gen hybridisiert wurde. Die Größe dieses Fragments war identisch mit derjenigen der mit Sst I gespaltenen pLGRNL-Plasmid-DNA, die in Bahn A zu sehen ist. So zeigen die Ergebnisse des Beispiels 6, daß die LGRNL provirale DNA eine nicht unterbrochene und nicht umorganisierte Anordnung in den infizierten Zellen aufzuweisen scheint. Dieses Ergebnis ist das gleiche wie das für die retrovirale Infektion mit dem Wildtyp erhaltene. So wird angenommen, daß andere rekombinante Vektorpartikel ähnlich nicht unterbrochene und nicht umorganisierte provirale DNA-Sequenzen bilden.
Um zu zeigen, daß derartige rekombinante Vektorpartikel den Wirtsbereich des in ihrer Hülle vorhandenen Membran-assoziierten Proteins erhalten, wurde eine Vielfalt von Zellinien mit Vektorpartikeln infiziert, die von pLGRNL und pLARNL abgeleitet waren. Diese Untersuchungen sind in Beispiel 7 angegeben.

Beispiel 7

Bestimmung des Wirsbereichs von MLV[VSV G]

HeLa-Zellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten. LNSV-Zellen wurden abgeleitet von SV40-transformierten HPRT-Mangel Lesch- Nyhan-Zellen (angegeben von Jolly et al., Mol. Cell. Biol. 6: 1141-1147 (1986), auf dessen Inhalt hier verwiesen wird). Ratten-208F-Zellen und BHK-Zellen waren wie oben beschrieben. Überstände wurden 48 h nach der Co-Transfektion von pSVGP mit pLARNL oder pLGRNL in BHK-Zellen gewonnen. Gleiche Volumina jedes Überstands wurden dann auf die vier unterschiedlichen Zellarten aufgebracht und Neor- Titer wurden zwei Wochen nach G418-Selektion bestimmt. Der Versuch wurde dreimal wiederholt und die Ergebnisse eines solchen Versuchs sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5
Wie oben angegeben, stammt das in dieser Untersuchung verwendete env- Gen von LARNL von den env-Bereichen des amphtropen Virus 4070A. Das durch dieses Gen codierte Hüll-Glycoprotein kann an Zelloberflächen-Rezeptoren binden, die auf Zellen von einem weiten Bereich von Säugetierarten, einschließlich menschlichen Zellen, vorhanden sind. Verschiedene menschliche Linien waren jedoch relativ immun gegenüber einer amphotropen viralen Infektion, verglichen mit Mäusezellen. Wie in Tabelle 5 gezeigt, sind die Neon-Titer von LARNL in Human-Linien, wie HeLa- Zellen oder LNSV-Fibroblasten, etwa 20 mal niedriger als derjenige in Ratten 208F- Zellen. Wie ebenfalls in Tabelle 5 gezeigt, infizierten LGRNL-Vektorpartikel HeLa- Zellen mit einer etwas größeren Effizienz als LARNL-Vektorpartikel; sie infizierten LNSV-Fibroblaste jedoch wesentlich effizienter als es LARNL-Vektorpartikel taten.
Auf Grund der ausgezeichneten Infektionseffizienz der von pLGRNL auf LNSV-Zellen abgeleiteten MLV[VSV G]-Vektorpartikel wird angenommen, daß das Haupthindernis einer Infektion von LNSV-Zellen mit Retrovirus auf der unzureichenden Wechselwirkung von Zelloberflächen-Rezeptoren mit retroviralem Hüllprotein beruht. Der Einschluß von Membran-assoziierten Protein, von dem bekannt ist, daß es mit Zelloberflächen-Rezeptoren in Wechselwirkung tritt, in den Retrovirus scheint diese Blockierung zu überwinden. So wird angenommen, daß die Erfindung ein allgemeines Verfahren zur Veränderung des Wirtsbereichs von umhüllten Vektorpartikeln durch Einschluß eines heterologen Membran-assoziierten Proteins in die Hülle der davon abgeleiteten Vektorpartikel liefert.
Es wird nicht angenommen, daß die verhältnismäßig weniger effizienten Ergebnisse, die bei einer Infektion von HeLa-Zellen durch die MLV[VSV G]-Vektorpartikel von LGRNL auftreten, auf einer geringen Wechselwirkung mit HeLa-Zelloberflächen-Rezeptoren beruhen. Vielmehr wird angenommen, daß die oben beobachteten weniger effizienten Ergebnisse vermutlich auf Vorkommnissen nach dem Eindringen beruhen, da VSV HeLa-Zellen effizient infiziert.
Derzeit liefern retrovirale Vektoren die effizienteste Methode zum Einführen neuer genetischer Information in Säugetier-Zellen. Da Vektorpartikel, die amphotropes Hüllprotein enthalten, menschliche Zellen infizieren können, stellen sie ein potentiell nützliches Werkzeug zur Behandlung von genetischen Störungen beim Menschen dar. Wie Tabelle 5 gezeigt, können einige menschliche Zellen jedoch relativ resistent sein gegenüber einer Infektion durch amphotrope Retroviren. Das Vorhandensein von relativ wenigen amphotropen Retrovirus-Rezeptoren, eine nicht effiziente reverse Transcription in dem Zytoplasma oder ein beschleunigter Abbau von nicht integrierter viraler DNA in menschlichen Zellen können jeweils zu der nicht effizienten Infektion von menschlichen Zellen durch die retroviralen Vektoren beitragen.
Diese Feststellungen liefern ein Verfahren zur Erhöhung der Effizienz einer retroviralen Infektion von menschlichen und anderen Zellen über den begrenzten Bereich hinaus, der durch die von der gleichen Virusfamilie stammenden Membranassoziierten Proteine ermöglicht wird. Diese Feststellung ist, daß der Einbau von Membran-assoziierten Proteinen in das Retrovirus zumindest einen Teil dieser potentiellen Blockierungen einer Infektion überwinden kann, durch Veränderung des Wirtsbereichs der retroviralen Vektoren, so daß ein effizienterer Transfer von fremden Genen in diese Zellen erleichtert wird. Bei diesem System werden Helferviren verwendet, um eine infektiöse Einheit zu erzeugen. Diese Einheit enthält Elemente eines Retrovirus, die die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen, normalerweise Elemente zur Steuerung der Expression eines fremden Gens, einen selektierbaren Zellmarker und/oder andere fremde Gene. Diese Einheit wird so aufgebaut, daß sie auf eine vorgegebene Gruppe von Zellen zielt. Die Infektionsbreite ist definiert durch die Fähigkeit des manipulierten Proteins einen Bereich von Zellarten zu binden. Diese zusammengesetzten Gene können in die erhaltenen Vektoren auf irgendeine dem Fachmann bekannte Weise eingeführt werden.
Es wird in Betracht gezogen, daß andere Viren in diesem System verwendet werden können. Lange terminale Wiederholungen von anderen Retroviren könnten verwendet werden aus einer Gruppe, bestehend aus aber nicht beschränkt auf RSV, HIV, Geflügel-Leukämie-Virus und anderen Mäuse-Leukämie-Viren. Das Kapsidprotein könnte auch von diesen oder anderen Viren stammen.
Bei dem erfindungsgemäßen Modell wurde ein RSV-Promotor angewandt, um die Expression der Neomycin-Resistenz zu steuern. Andere Marker umfassen Hygromycin-Resistenz und Dihydrofolatreduktase (Methotrexat-Resistenz). Ähnliche andere Promotoren könnten verwendet werden, einschließlich aber nicht notwendiger Weise beschränkt auf den frühen Cytomegalovirus-Sofortpromotor, SV40. Promotoren könnten ausgewählt werden, um nach Wunsch möglicherweise eine Expression zu fördern oder eine verhältnismäßig schwache Expression zu erzeugen.
Außerdem können zu dem Vektor fremde Gene zur Expression in einer Ziel- Zellpopulation zugegeben werden, wie unten mehr im Detail beschrieben. Promotoren mit gegebenen Gewebespezifitäten könnten auch verwendet werden, um die Expression derartiger fremder Gene auf eine bestimmte Zellart zu beschränken. Z. B. ist ein Pankreaselastase-Promotor spezifisch für die Expression in Pankreasgewebe. Ein anders Beispiel wäre der interne Promotor des menschlichen Hepatits B Kerngens, der die Genexpression in einer leberspezifischen Weise reguliert. Andere gewebespezifische Promotoren existieren für das Gehirn und andere Gewebe.
Andere Membran assoziierte Proteine als VSV G-Protein, die gute Kandidaten darstellen, um einen veränderten Wirtsbereich zu ergeben, wenn sie erfindungsgemäß, wie in den Beispielen für VSV G Protein beschrieben, verwendet werden, umfassen solche Proteine von anderen umhüllten Viren die Wirtsrezeptoren binden und die Infektion erleichtern. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine selektive Entfernung von allem Membran-assoziierten Protein und die Verwendung dieses Proteins zur Erzeugung eines Nukleinsäure-Abgabesystems, das auf einen veränderten Zellbereich zielt. Als ein Beispiel könnte das gD-Gen von HSV (Herpes simplex Virus) verwendet werden, um einen Wirtsbereich zu erhalten, der die neutralen Ganglien von menschlichem Gewebe umfaßt. Eine große Anzahl derartiger viraler und nichtviraler Beispiele ist für den Fachmann leicht ersichtlich.
Nicht-virale Membran assoziierte Proteine könnten ebenfalls verwendet werden, um den Wirtsbereich von Vektorpartikeln zu verändern. Es wird angenommen, daß Proteine, die als Ligand zu einem vorgegebenen Zellrezeptor oder einer Zelloberflächen-Einheit wirken, Kandidaten sind, damit ein Vektorpartikel auf einen Wirtsbereich von Zellen mit einem vorgegebenen Zellrezeptor oder einer Zelloberflächen-Einheit zielt. Ein geeignetes Protein würde Bindungsbereiche enthalten, die dazu dienen würden, einen Wirtsbereich für den Vektorpartikel zu identifizieren. Abhängig von dem ubiquitären Auftreten des Rezeptors für das fragliche Protein, könnte man entweder den viralen Vektor auf einen sehr großen Bereich von menschlichen Zellen, auf eine Untergruppe von Zellen oder auf eine einzige Zellart richten. So könnte man z. B. alle menschlichen Zellen, alle weißen Blutkörperchen oder nur T-Helferzellen als Ziel vorsehen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung stammen solche Proteine von Viren, von denen bekannt ist, daß sie spezielle Zellarten infizieren. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung von aus Viren stammenden Proteinen beschränkt. Es wird in Betracht gezogen, daß irgendein Liganden/Rezeptoren-Paar in diesem System angewandt werden könnte. Die Erfordernisse für ein wirksames System sind die Identifizierung eines Liganden/Rezeptoren-Paars oder, zur Therapie, mindestens ein Verständnis der Breite von Zellarten, die mit dem Liganden in Wechselwirkung treten könnten. Die Eignung des Systems hängt ab von der Verfügbarkeit eines Rezeptors für einen Liganden und der Affinität eines gegebenen Rezeptors für den Liganden. So ist z. B. CD4, von dem bekannt ist, daß es mit HIV gp 120 auf der Oberfläche von mit HIV infizierten Zellen in Wechselwirkung tritt, ein Kandidat zur Verwendung in einem rekombinanten Vektorpartikel zur Abgabe eines fremden Gens an solche Zellen.
Beispiel 8 ist angegeben, um die Bildung eines Vektors zu erläutern, der auf Zellen gerichtet ist, die mit HIV infiziert sind. Das T-Helferzellen Membran assoziierte Oberflächenantigen, CD4 ist bekanntlich der Haupt-HIV-Zelloberflächen-Rezeptor. Das CD4-Antigen ergibt eine Liganden/Rezeptoren-Wechselwirkung mit dem durch HIV erzeugten Protein, gp 120. So sollten Vektorpartikel, bei denen CD4 mit ihrer viralen Hülle assoziiert ist, auf mit HIV infizierte Zellen zielen.

Beispiel 8

Vektorpartikel zur gezielten VIP-Therapie

Zunächst werden Sequenzen, die für CD4 codieren, von einer T-Zellinie erhalten. Kurz gesagt, werden Zellen in einer Kultur gezüchtet und lysiert. Die gesamte RNA von diesen Zellen wird unter Anwendung eines Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt. Die gesamte RNA wird gewaschen und ausgefällt und cDNA wird daraus synthetisiert unter Verwendung von Reverse-Transcriptase und Oligo-dT-Primern. Die erhaltenen CDNA/RNA-Hybride werden als Matrizen für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung entsprechender Primer-Paare für CD4, die zu den 5'- und 3'-Enden der CD4-Sequenz komplementär sind, und Schwänze enthalten, die für Bam H1-Restriktions-Endonuklese-Stellen codieren. Das PCR-Produkt wir über Agarosegel laufen gelassen und das Fragment der erwarteten Größe (etwa 1, 2 Kilobasen), wird herausgeschnitten und von dem Gel eluiert. Die eluierte DNA wird mit Bam H1 abgebaut und ein Promotor wird an das 5'-Ende dieser für CD4 codierenden Sequenz angefügt. Die erhaltene Sequenz wird in die Bam H1-Stelle in pLRNLkloniert.
So zeigt Beispiel 8 die Bildung eines Vektorpartikels mit einem Wirtsbereich, der definiert ist durch ein natürlich vorkommendes Membran-assoziiertes Protein. Wenn der in die virale Hülle einzufügende Ligand kein natürlich vorkommendes Membran-assoziiertes Protein ist, ist es erforderlich, den Liganden mit der Membran zu assoziieren. Um das zu erreichen, kann das für den Liganden codierende Gen mit Sequenzen kombiniert werden, die für eine Membran assoziierte Domäne codieren. Unter "natürlich vorkommendem Membran-assoziierten Protein" sind solche Proteine zu verstehen, die in ihrem nativen Zustand in vivo in Verbindung mit einer Lipid- Membran vorliegen, wie diejenigen, die sich assoziiert mit einer Zellmembran oder auf einer viralen Hülle finden.
Bei einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung kann dies erreicht werden durch Rekombinieren des Gens, das für den Liganden codiert, der am nächsten der Membran-bindenden Domäne für VSV G-Protein oder ein anderes von einem Virus stammendes Protein, das sich stabil mit einem vorgegebenen Kapsid- Protein verbindet. So liefern Proteine, wie Insulin, von denen bekannt ist, daß sie mit Rezeptoren auf Muskel- und Adipose-Zellen in Wechselwirkung treten, potentiell ein Vehikel, um Infektiosität von Zellen zu erreichen, die den entsprechenden Insulin- Rezeptor haben, durch Einbau des Insulin-Gens in die für seine Membran assoziierte Domäne codierende VSV G-Sequenz oder die Membran-assoziierten Sequenzen von einem anderen Membran-assoziierten Protein, das einen stabilen Vektorpartikel bildet.
Wie oben angegeben, wird angenommen, daß die Hauptblockierung für eine Infektion der Zellen mit umhüllten Vektorpartikeln auf einer unzureichenden Wechselwirkung von Zelloberflächen-Rezeptoren mit viralem Hüllprotein beruht. So könnte die äußere Domäne dieser Proteine an eine Membran- oder innere Domäne gebunden sein, um einen funktionellen Vektorpartikel zu bilden. Die Liganden/Rezeptoren- Wechselwirkung scheint nicht an der Wechselwirkung zwischen Protein und Nukleokapsid beteiligt zu sein.
Obwohl das Nukleokapsid von Semliki Forest Virus einen spezifischen Rezeptor für den zytoplasmischen Schwanz des viralen E2 Spike-Glycoproteins enthält, ist dieser Mechanismus nicht notwendigerweise unmittelbar anwendbar auf andere umhüllte Viren. So ist es für SFV und andere Alphaviren wahrscheinlich, daß E2 Spike-Glycoprotein oder ein ähnliches Protein für eine effektive Infektion erforderlich ist. Folglich ist es, wenn von SFV oder einem anderen Alphavirus abgeleitete Vektorpartikel im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, erforderlich, daß sie solche Anteile des E2 Spike-Glycoproteins umfassen, die für eine wirksame Wechselwirkung mit dem Nukleokapsid notwendig sind.
Retroviren, wie Rous Sarcoma Virus können Vektorpartikel bilden unter Verwendung von Mutantenformen des Hüllproteins, das keinen zytoplasmischen Schwanz umfaßt. So wird angenommen, daß, wenn eine Wechselwirkung zwischen dem Hüllprotein des Retrovirus und seinem Nukleokapsid erforderlich ist, um den Einbau des Glycoproteins in die Hülle von knospenden Viruspartikeln zu vermitteln, eine solche Wechselwirkung in oder nahe der Lipid-Doppelschicht erfolgt. Vermutlich tritt die Wechselwirkung innerhalb der hydrophoben Membran-assoziierten Domäne des Hüllproteins ein. So wird angenommen, daß bei vielen Systemen, wenn irgendein Teil des Membran-assoziierten Proteins für den Aufbau des Vektorpartikels erforderlich ist, dieser Teil in der Membran-assoziierten Domäne oder nahe dieser Domäne auftritt.
Folglich wird angenommen, daß es die Bildung von rekombinanten Proteinen mit Membran-assoziierten Domänen von Proteinen, die die Fähigkeit zu einer direkten Verpackung besitzen, wie das VSV G-Protein, und mindestens den rezeptorbindenden Anteilen von anderen Liganden, ob sie Membran-assoziiert sind oder nicht, ermöglicht, daß Vektorpartikel auf die gewünschten Zellarten zielen.
So liefert die Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein System vom Kassettentyp, bei dem der Anteil des für die Membran assoziierte Domäne des VSV G- Proteins oder ein anderes Membran-assoziiertes Protein codierenden Gens als konstanter Anteil des Kassettenvektors verbleibt. In diesen konstanten Bereich werden Teile von einem gewünschten Liganden eingefügt. Diese beiden Domänen bilden ein rekombinantes Protein, das mit dem Nukleokapsid in Wechselwirkung tritt unter Bildung eines strukturell intakten Vektorpartikels mit effizienten Zielfähigkeiten für eine gewünschte Zellart oder Zellarten. Es ist wichtig, das Leseraster zur Translation aufrechtzuerhalten, wenn Liganden in diese Kassette eingefügt werden, um eine bifunkionelle rekombinante Proteinchimäre voller Länge zu erhalten. Der Ausdruck "Proteinchimäre" wird verwendet, um ein Produkt zu beschreiben, das durch Rekombination erhalten worden ist durch genetisches Verbinden von Bereichen von Nukleinsäuresequenzen von zwei oder mehreren Proteinen, so daß das codierte Produkt, obwohl es ein kontinuierliches Produkt ist, Domänen-duplizierende Sequenzen von Aminosäuren dieser Proteine enthält. Folglich ist es nicht erforderlich, Hüllprotein oder nicht-Membran-gebundenes Protein voiler Länge zu verwenden, so lange ausreichend Liganden/Rezeptoren-Wechselwirkungen verbleiben.
So liefert die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren mit funktionellen Sequenzen von einem ersten Virus und auch Sequenzen, die für einen Liganden codieren, der den Wirtsbereich der Vektorpartikel, die die Nukleinsäure enthalten, identifiziert. Mit "funktionell" sind alle Sequenzen gemeint, die an irgendeiner typischen Wildtyp- Replikation oder Infektion durch diesen Virus beteiligt sind. Andere Sequenzen als solche, die mit einer typischen Wildtyp-Replikation oder Infektion verbunden sind, können auch von den hier angegebenen funktionellen Nukleinsäuren umfaßt sein.
Die Nukleinsäure kann die Bildung von Vektorpartikeln selbst dirigieren oder sie kann eine Co-Transfektion mit einem Helfervirus, wie oben im Zusammenhang mit der Verwendung von LGRNL mit pSVGP beschrieben, erfordern. Unter Verwendung dieser Nukleinsäuresequenzen können Vektorpartikel zusammengestellt werden, die diese, den Wirtsbereich verändernden Membran-assoziierten Proteine enthalten, statt hybride rekombinante Proteine oder als Expressionsprodukte eines Gens voller Länge um einen vorgegebenen Partikel auf eine vorgegebene Zelle zur Genfreisetzung zu richten.
Das Hüllprotein von einem typischen Retrovirus, wie MoMLV, enthält drei Domänen: eine äußere rezeptorbindende Domäne, eine Membran assoziierte Domäne und eine innere (zytoplasmische) Domäne. Bisher wurde angenommen, daß die zytoplasmische Domäne erforderlich wäre, um mit Nukleokappsid-Protein für eine effiziente Partikel-Verpackung in Wechselwirkung zu treten. Beispiel 9 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs, der bestätigt, daß keine der retroviralen Hüllprotein- Domänen erforderlich ist, um Vektorpartikel mit einem von einem Retrovirus stammenden Nukleokapsid effizient zu verpacken. Bei dem Versuch des Beispiels 9 wurden rekombinante chimäre Proteine mit verschiedenen retroviralen Domänen aufgebaut und die Verpackungseffizienz der erhaltenen Vektorpartikel bestimmt durch die Fähigkeit der Gebilde, VSV-Immunorektivität in COS-Zellen einzuführen.

Beispiel 9

Verpackungseffizienz von Vektorpartikeln mit retroviralem /VSV G Retrovirus Membran-assoziiertem Protein

Es wurden zwei chimäre Membran assoziierte Protein-Gen-Gebilde hergestellt. Das M2-Gebilde enthielt eine äußere VSV G rezeptorbindende Domäne, die verschmolzen war mit den Membran-assoziierten und zytoplasmischen Domänen von MLV-Hüllprotein. Das M9-Gebilde enthielt die äußere rezeptorbindende Domäne und Membran assoziierte Domäne von VSV G-Protein, verschmolzen mit Sequenzen, die für die zytoplasmische Domäne von MLV-Hüllprotein codieren.
Die M2- und M9-Gebilde wurden in jeden von zwei Expressionsvektoren eingeführt. Der erste Vektor, pSVL, enthielt einen späten SV40-Promotor und spätes Protein-Polyadenylierungs-Signal. Der zweite Vektor, pFR400, enthielt einen frühen SV40-Promotor und ein HBV-Polyadenylierungs-Signal. So wurden vier Expressionsgebilde erzeugt: pSVLM2, pSVLM9, pFR4M2 und pFR4M9. Diese Expressionsvektoren wurden in COS-Zellen eingeführt. Plasmide, die VSV G Membran-assozi iertes Protein voller Länge (pJM) und MLV-Hüllprotein voller Länge (pSVLENV) enthielten, wurden ebenfalls eingeführt. Es wurde eine indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung von Kaninchen-anti-VSV G-Protein angewandt, um die Erzeugung von VSV G-Protein Immunoreaktivität in diesen Zellen zu analysieren. Tabelle 6 gibt die Ergebnisse dieser Versuche an. Tabelle 6
VSV G-Proteine voller Länge von pJM waren sowohl innerhalb der Zelle als auch auf der Zelloberfläche sichtbar. Hybride M9-Proteine waren nur in perinuklearen Bereichen sichtbar. Durch Fluoreszenzaktiviertes Sortieren von Zellen (FACS) wurde bestimmt, daß nur 10% dieser Zellen hybrides M9-Protein auf ihrer Zelloberfläche exprimierten. Das Molekulargewicht der hybriden Proteine wurde bestätigt durch Immunopräziptation unter Verwendung von Kaninchen-anti-VSV G. Die Beweglichkeiten stimmten mit der aus den Nukleotid-Sequenzen vorhergesagten Proteingröße überein.
Die Ergebnisse der Versuche des Beispiels 9 zeigen, daß die wirksamste Verpackung durch VSV G-Protein voller Länge erhalten wurde, wobei jedes der hybriden Proteine mit MLV zytoplasmischen Domänen weniger effizient auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Wie oben angegeben war diese Feststellung überraschend, auf Grund der vorherrschenden Annahme, daß eine retrovirale zytoplasmische Domäne erforderlich wäre zur effizienten Vektorpartikel-Verpackung von Vektorpartikeln mit von Retroviren stammendem Nukleokapsid. So bestätigt Beispiel 9 die überraschende Feststellung, daß umhüllte Vektorpartikel mit von einem speziellen Virus abgeleiteten Nukleokapsiden effizient verpackt werden können mit heterologen Membranassoziierten Proteinen.
Beispiel 9 zeigt auch, daß die zytoplasmischen und Membran-Domänen von VSV G wirksam sind, um Protein auf die Zelloberfläche zu dirigieren. So wird ange nommen, daß hybrides Protein erzeugt werden könnte auf eine Weise, ähnlich wie in Beispiel 9, wobei die zytoplasmischen und Membran-Domänen von VSV G-Protein kombiniert werden, um eine Kassette, die auf für Vektorpartikel zielt, zu bilden, wobei die äußeren Rezeptor-Domänen von einer Vielfalt von nicht verwandten Proteinen mit der Kassette verwendet werden könnte.
Wie oben angegeben, wird angenommen, daß die Bereiche von Membranassoziierten Proteinen, die an der Bildung von Vektorpartikeln beteiligt sind, hauptsächlich in den Membran-assoziierten Domänen des Proteins liegen. So enthalten rekombinante chimäre Membran assoziierte Proteine, die in ven Vektorpartikeln nach der vorliegenden Erfindung geeignet sind, die Membran assoziierte Domäne eines Membran-assoziierten Proteins, von dem gezeigt wurde, daß es wirksam in Vektorpartikel verpackt wird. Die äußeren Rezeptor-Domänen dieser chimären Proteine können ausgewählt werden aus irgendeinem Liganden/Rezeptor, um einen Wirtsbereich zu bestimmen, wie oben angegeben. Beispiel 10 ist als ein Beispiel für die Bildung von Vektorpartikeln mit einem rekombinanten chimären Membran-assoziierten Protein angegeben.

Beispiel 10

Kassette zur Erzeugung von Vektorpartikeln mit chimärem Membran-assoziiertem Protein

Das hybride Membran assoziierte Glycoprotein wird nach den in Beispiel 9 angegebenen Leitlinien aufgebaut. Als ein Modell für dieses Beispiel werden das zytoplasmische VSV G und Membran-Domänen genetisch mit dem für Erythropoietin (EPO) codierenden Gen kombiniert. Diese rekombinante Chimäre wird in den Expressionsvektor pSLV von Beispiel 9 eingefügt. Außerdem werden Vektor pLRNL und Vektor pSVGP in Erzeugerzellen transfiziert. Der erhalten Überstand wird gesammelt und die Vektorpartikel werden verwendet, um B6SutA-Zellen zu infizieren. B6SutA-Zellen enthalten den EPO-Rezeptor, und unter Neomycin-Selektion überleben nur solche Zellen, die Vektorpartikel, enthaltend EPO hybrides Protein und pLRNL-Vektorpartikel-Genom erhalten.
Die in Beispiel 10 beschriebene Verfahrensweise kann angewandt werden, um ein Kassettensystem zu erzeugen, bei dem Gene für irgendeine gewünschte rezeptorbindende Domäne rekombiniert werden können mit der Membran-assoziierten Domäne von VSV G-Protein oder einer anderen Membran-assoziierten Domäne. So liefert Beispiel 10 Methoden zum schnellen Erzeugen von einer Vielzahl von Vektor partikeln mit einem Wirtsbereich, der durch die in die Kassette eingefügte rezeptorbindende Domäne definiert ist.
Vektorpartikel mit nicht-nativen Membran-assoziierten Liganden, wie hier beschrieben, haben vorteilhafter Weise einen Wirtsbereich, der bestimmt wird durch die Liganden/Rezeptoren-Wechselwirkung des Membran-assoziierten Proteins. Wenn z. B. das Membran assoziierte Protein von einem umhüllten Virus stammt, das menschliche Zellen infizieren kann, sind die Vektoren imstande, fremde Gene mit stark erhöhter Effizienz in menschliche Zellen einzuführen. Das in den vorigen Beispielen verwendete Neomycin-Gen, könnte durch ein therapeutisches Gen ersetzt werden, das auch durch den RSV-Promotor gesteuert würde. Ähnlich könnte das therapeutische Gen zusätzlich zu dem Neomycin-Gen eingeführt werden. Wie erwähnt gibt es eine Anzahl von Promotoren und Markergenen, die in diesem System verwendet werden könnten. Therapeutische Gene könnten die Form von Nukleinsäuresequenzen annehmen, die für Protein oder Nukleinsäuresequenzen mit inhärentem regulatorischem Wert codieren.
Therapeutische Gene, die für Protein codieren, könnten die Form von Polypeptid annehmen, um einen gegebenen Proteindefekt auszugleichen, um eine Immunfunktion zu verbessern oder zu verändern oder eine, die ein spezifisches Protein oder eine Gruppe von Proteinen inaktiv machen würde. Das therapeutische Protein könnte potentiell regulatorische Aktivität besitzen, um ein Protein oder eine Gruppe von Proteinen zu stimulieren oder zu hemmen. Das therapeutische Protein könnte auch eine gegebene Zellfunktion stimulieren oder hemmen. In anderen Worten könnte das therapeutische Gen für ein Polypeptid mit einem Bereich von Aktivitäten, die nicht notwendigerweise auf die hier diskutierten beschränkt sind, aber vom Fachmann ausgewählt werden können, codieren.
Die Nukleinsäure könnte auch für ein Produkt mit einer Aktivität als Nukleinsäure codieren. Z. B. könnte diese Nukleinsäure Antisinn-Aktivität aufweisen, um die Translation eines gegebenen Proteins zu verhindern, oder sie könnte DNA-Bindungsfähigkeit besitzen, die die Expression von Protein oder einer Gruppe von Proteinen oder eine gegebene Zellfunktion fördern oder verhindern könnte. Wieder ist die gewählte Sequenz für einen Fachmann offensichtlich.
So kann für eine gezielte Gentherapie ein Vektorpartikel mit einem veränderten Wirtsbereich hergestellt werden unter Anwendung der erfindungsgemäßen Methoden. Der Ligand wird so ausgewählt, daß er einen Wirtsbereich ergibt, der den Ziel-Zelltyp umfaßt. So wird, um eine Therapie für einen genetischen Defekt, bei dem ein Polypeptid nicht in ausreichender Menge oder ausreichender Menge an der aktiven Form exprimiert wird, zu entwickeln, der Ligand so ausgewählt, daß er auf die Zellen zielt, die normalerweise das Polypeptid bilden. Das Cen für das Polypeptid sollte auch unter der Kontrolle eines entsprechenden viralen Promotors eingeführt werden.
Wahlweise kann die Therapie auch darin bestehen, daß die Expression eines unerwünschten Polypeptids gehemmt wird, z. B. durch Bildung eines Antisinn-Oligonukleids, das die Translation von mRNA, die für die unerwünschten Polypeptide codiert gehemmt wird. Beispiel 11 ist angegeben, um die Herstellung eines gezielten Vektorpartikels, der ein therapeutisches Oligonukleotid für eine HIV-Infektion liefert, zu erläutern.

Beispiel 11

Freisetzungs-Vehikel für ein therapeutisches Anti-HIV-Mittel

Der Vektorpartikel von Beispiel 8 wird verändert durch Ersatz des Neogens durch eine Sequenz, die für ein Antisinn-Oligonukleotid für einen komplementären Bereich zu der mRNA der Haupt-HIV-Protease codiert. Die erhaltenen Vektorpartikel enthalten CD4 als Membran-assoziiertes Protein und richten die Transkription von Antisinn-mRMA, die mit HIV-mRNA ein Hybrid bildet, auf eine Beschränkung der VIV-Replikation.
So zeigt Beispiel 10 ein Verfahren, bei dem ein Vektorpartikel-Genom modifiziert wird, um eine spezielle Therapie auf bestimmte Zellarten zu richten. Es wird auch in Betracht gezogen, daß die vorliegende Erfindung das Zielen auf Progenitor- Zellen umfaßt. Z. B. findet sich eine Anzahl von Progenitor-Zellarten im Knochenmark, die sich zu Blutzellen differenzieren. Viele Blutzellen haben verhältnismäßig kurze Lebenszeiten und daher teilen und differenzieren sich Progenitor-Zellen kontinuierlich, um die verlorenen Zellen zu ersetzen. Therapien, die auf Blutzellen gerichtet sind, wären am wirksamsten, wenn sie auf die Progenitor-Zelle zielen würden. Diese Zellen haben bekanntlich einzigartige zelluläre Determinanten, die eine histologische Identifizierung erlauben und könnten als Zellrezeptoren für die Membranassoziierten Proteine der erfindungsgemäßen Vektorpartikel verwendet werden. Die Vektorpartikel könnten so aufgebaut sein, daß sie auf diese Zellarten zur Genfreisetzung zielen indem sie ein exprimierbares Gen, das für ein Membran-assoziiertes Protein codiert, das eine einzigartige Determinante solcher Progenitor-Zellarten bin det, enthalten. Beispiele für solche Progenitor-Zellarten, auf die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Vektorpartikeln gezielt werden kann, umfassen pluripotente Stammzellen, Erythroblaste, Lymphoblaste, Myeloblaste und Megakaryozyten.
Es wird ferner in Betracht gezogen, daß die Therapie nach der vorliegenden Erfindung entweder in vivo oder in vitro durchgeführt wird. Für die in vitro Therapie eines Organismus könnten Zellen entfernt und in vitro mit dem Vektorpartikel infiziert werden. Für Vektorpartikel mit Membran-assoziierten Proteinen, die den entsprechenden Wirtsbereich bestimmen, wäre es nicht erforderlich, die in vitro als Ziel dienenden Zellen zu reinigen, da der virale Vektor spezifisch die entsprechenden Zellen infizieren würde. So könnten Knochenmarkproben von einem Patienten entnommen und die gewünschte Zellart transfiziert werden. Diese transfizierten Zellen könnten dann wieder an den Organismus, von dem die Zellen stammen, oder, wenn die Abstoßung der Zellen nicht als Problem angesehen wird, an einen anderen Organismus zurückgeführt werden. Die Probe könnte in vitro, entweder vor oder nach der Transfektion, mit Wachstumsfaktoren behandelt werden, um die Anzahl an Zellen zu erhöhen, die entweder markiert oder an den Organismus des Patienten zurückgeführt werden.
Um das Ziel der Veränderung des Wirtsbereichs dieser erfindungsgemäßen viralen Vektoren zu unterstützen, wurde festgestellt, daß die Entwicklung von stabilen Verpackungszellinien, die konstitutiv Membran assoziierte Proteine exprimieren, die Bildung von retroviralen Vektoren mit einem weiteren Wirtsbereich und mit einer erhöhten Infektionseffizienz in menschlichen und anderen Zellen sogar noch weiter erleichtern würde. Viele dieser Membran-assoziierten Proteine, einschließlich dem VSV G-Hüllprotein, sind für Zellen toxisch. Das führt zu Stabilitätsproblemen in der Erzeuger-Zellinie, da Expressorzellen schnell sterben, was zu Schwierigkeiten bei der Bildung einer mehr als nur vorübergehenden Produktion führt. Obwohl einige Zellarten (z. B. Human 293, das Derivat 2-3, das gag und pol Proteine aus MLV bildet, oder Hamster BHK-Zellen) nach der Transduktion mit Vektorpartikel LGRNL und Neo-Selektion wachsen, hält dieses Wachstum nur vier Wochen an und dann sterben die Zellen. Andere Zellarten sterben sogar noch schneller. So ist die Entwicklung von stabilen Verpackungszellinien höchst erwünscht.
Ein Verfahren zur Produktion von stabilen Verpackungszellinien besteht darin, ein Verpackungsgebilde zu entwickeln, bei dem das Hüllprotein einem induzierbaren Promotor ausgesetzt wird, in dem die Expression des Hüllproteins durch das Vor handensein oder die Abwesenheit einer speziellen Verbindung oder durch eine Veränderung der Bedingungen, wie der Temperatur, an- oder abgestellt werden kann. Ein Beispiel für einen derartigen induzierbaren Promotor ist der Maus-Mammary- Tumor-Virus (MMTV) Promotor. Der MMTV-Promotor ist stark induzierbar durch Corticosteroid und deren Analoge in Zellen, die Glucocorticoid-Rezeptor-Proteine in ausreichenden Mengen bilden.
Eine Zellinie, die die Fähigkeit besitzt, Vektorpartikel-Gene von einem induzierbaren Promotor, wie dem MMTV-Promotor, zu exprimieren, bildet keine Vektorpartikel ohne Induktion durch entsprechende induzierende Bedingungen, z. B. das Vorhandensein von Corticosteroid für den MMTV-Promotor. Folglich kann eine Zellinie, die die Fähigkeit besitzt, Vektorpartikel zu bilden, stabil gehalten werden, ohne daß sie Vektorpartikel erzeugt. Eine Subpopulation von der Zellinie könnte dann, wenn dies erwünscht ist, durch die entsprechenden Bedingungen induziert werden, um Vektorpartikel zu erzeugen. Ein Beispiel für die Bildung einer stabilen Verpackungszellinie, die die Fähigkeit besitzt, Vektorpartikel-Gene unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors zu exprimieren, ist in Beispiel 12 gezeigt.

Beispiel 12

Erzeugung eines stabilen Verpackungs-Gebildes mit induzierbarem Promotor

Um eine Zellinie zu identifizieren, die Glucocorticoid-Rezeptor-Proteine in ausreichenden Mengen zur Induktion des MMTV-Promotors in Gegenwart von Corticosteroid bildet, wird ein Gebilde mit dem MMTV-Promotor erzeugt, das die Transkription eines Marker-Gens, wie des Chloramphenicolacetyl-Übertragungs (CAT) Gens, dirigiert. Dieses Gebilde wird in verschiedene Zellinien mit oder ohne Dexamethason- Behandlung eingeführt.
Solche Zellinien, die ein Verhältnis von CAT-Aktivität in den mit Dexamthason behandelten Zellen zu derjenigen in den unbehandelten Zellen von mehr als 25 : 1 aufweisen, sind bevorzugt zur Verwendung als stabile Verpackungszellinien unter der Kontrolle des induzierbaren MMTV-Promotors. Eine Zellinie, die ein solches Verhältnis aufweist, ist die BHK-Zellinie.
Um eine stabile Verpackungszellinie für MLV[VSV G] herzustellen, werden BHK-Zellen permanent mit einem Verpackungsgebilde, pSVGP, transfiziert und anschließend mit einem Gebilde, das den MMTV-Promotor mit dem VSV G-Gen und mit RSV LTR verbindet, das das Hygromycin-Resistenz-Gen als selektierbaren Marker steuert. Hygromycin-resistente Zellen werden ausgewählt und auf die gag und pol-Bildung durch Western-Blotting unter Verwendung von anti-MLV 30 als Sonde untersucht. Diese Zellen werden auch auf das Vorhandensein des MTV-VSV G-Gens durch Southern-Blotting untersucht.
Zellen, die weiter wachsen (und daher keine letalen Gehalte an VSV G bilden) werden untersucht durch vorübergehende Transfektion mit einem Vektor wie LRNL, mit Dexamethason behandelt oder nicht behandelt und der Anteil der Neoresistenten Kolonienbildenden Einheiten bestimmt. Die Zellklone mit der besten Wirksamkeit werden permanent mit MLV[VSV G]-Vektorpartikel-bildender Nukleinsäure transfiziert. Die Bildung von infektiösen Partikeln wird für kurze Zeiten (1-3 Tage) eingeleitet durch Behandlung mit Dexamethason.
So zeigt Beispiel 12 ein Beispiel für die Produktion eines stabilen Verpackungsgebildes unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Ähnliche Verfahren können angewandt werden zur Erzeugung einer Vielfalt von Vektorpartikeln nach der vorliegenden Erfindung unter der Kontrolle von MMTV-Promotor oder anderen induzierbaren Promotoren.
Ein anderes Beispiel für die Erzeugung eines stabilen Verpackungsgebildes umfaßt die Entwicklung von Zellen, die die Bildung des Membran-assoziierten Proteins tolerieren können. Von einer Zellinie, MDCK, (ATCC Nr. CCL³&sup4;) wird berichtet, daß sie gegenüber den toxischen Wirkungen von VSV resistent ist und in der Lage ist, die Langzeit-Bildung von VSV G aufrechtzuerhalten. Es wird angenommen, daß andere derartige Zellinien existieren. Jedoch ist nicht jedes VSV G-Protein, das von solchen Zellinien gebildet wird, funktionell. Folglich müssen Klone, die funktionelles Protein erzeugen, ausgewählt werden. Ein Beispiel für die Produktion einer stabilen Verpackungszellinie, die funktionelles Membran-assoziiertes Protein bildet, ist in Beispiel 13 angegeben.

Beispiel 13

Produktion eines stabilen Verpackungsgebildes in einer toleranten Zellinie

MDCK-Zellen wurden auf ihre Toleranz gegenüber der stabilen Expression von VSV G Membran-assoziiertem Protein und auf ihre Fähigkeit, Vektorpartikel zu produzieren, untersucht. Die VSV G-Toleranz wurde untersucht durch Infizieren von MDCK-Zellen mit MLV[VSV G]-Vektorpartikeln und Selektieren auf G41B-resistente Klone. Die Vektorpartikel wurden gebildet durch die vorübergehende Transfektion von pLGRNL in Human 293 Zellen, die die retroviralen gag und pol Proteine stabil exprimierten. Der Vektorpartikel enthaltende Überstand dieser transfizierten Zellen wurde verwendet, um MDCK-Zellen zu infizieren. Diese Vektorpartikel enthalten pLGRNL als ihr Vektorgenom und VSV G als ihr Membran-assoziiertes Protein.
MDCK-Zellen wurden infiziert und 24 h vor der Selektion in G418 kultiviert. 24 h nach der Infektion wurden die Zellen mit 400 ug/ml des Neomycin-Analogen G418 behandelt. Etwa 7-10 Tage nach der Selektion begannen Kolonien aufzutreten, die gegenüber G418 resistent waren. Wenn die Kolonien deutlich sichtbar waren, und von den nicht-resistenten Zellen abgetrennt worden waren, wurden sie zusammengegeben und Subkulturen in Gegenwart von G418 für die Analyse gebildet.
Die oben beschriebene polyklonale Zellinie wurde auf die Expression von VSV G von dem pLGRNL-Vektorgenom untersucht. Kurz gesagt wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 60-70% gezüchtet und in Methionin-freiem Medium ohne Kalbsembryoserum (Met&supmin; DME) 30 min. bei 37ºC inkubiert. Das Medium wurde durch 2 ml Met&supmin; DME, enthaltend 300 uCl ³&sup5;S-Methionin ersetzt und weitere 4 h inkubiert. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und 1 ml RIPA-Lysepuffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Desoxycholat, 0,19% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0), enthaltend 10 ul des Proteaseinhibitors PMSF in einer Konzentration von 1 mM, wurde zu jeder Platte zugegeben. Die Platten wurden 15-30 min. auf Eis inkubiert und anschließend 10 min. zentrifugiert nach dem Überführen des lysierten Zellmaterials in das Röhrchen einer Mikrozentrifuge. Der Überstand wurde entfernt und entweder bei -70ºC aufbewahrt oder direkt zur Immunopräzipitation verwendet. Diese Lysate wurden hergestellt für Immunopräzipitationen indem sie zunächst mit nicht-immunem Kaninchenserum behandelt wurden, um nicht-spezifische Bindungsaktivität vorher zu entfernen.
Immunopräzipitationen wurden durchgeführt durch Inkubieren eines Volumens, enthaltend 1 · 10&sup7; Zählungen von vorgereinigtem Lysat mit 5 ul Kaninchen-anti- VSV G-Antikörper über Nacht bei 4ºC. Dann wurde Protein A-Sepahrose (100 ul einer 10%igen Lösung in RIPA-Puffer) zugegeben und anschließend 1-2 h bei 4ºC inkubiert. Die Konjugate wurden dreimal in RIPA-Puffer gewaschen und die erhaltenen Perlen wurden wieder in 30 ul Laemmli Probenpuffer suspendiert. Immunopräzipitate wurden abgetrennt durch SDS-PAGE und sichtbar gemacht durch Fluorographie. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Bahnen 1 und 2 zeigen die polyklonale Zellinie, die mit Anti-VSV G bzw. normalem Kaninchenserum immunopräzipitiert ist Bahn 3 sind scheininfizierte MDCK-Zellen, die mit Anti-VSV G-Antikörper immunopräzipitiert sind. Die Bande, die bei Mr von etwa 68 kD läuft, entspricht dem VSV G-Protein und do kumentiert, daß diese MDCK-Zellen die Langzeit-Expression von VSV G unterstützen.
Die polyklonale MDCK/VSV G Zellinie wurde ebenfalls auf ihre Fähigkeit untersucht, VSV G enthaltende Vektorpartikel zu bilden. Um dies zu tun, wurden die Zellen mit ptkhygro als markierbarem Marker und pSVPG zur Lieferung der gag/pol- Funktionen transfiziert.
Das Polykation Polybrene (Aldrich, Milwaukee, WI) wurde für die Co-Transfektion von MDCK/VSV G-Zellen verwendet. Kurz gesagt, wurden exponentiell wachsende Zellen durch Trypsin-Behandlung gewonnen und wieder mit 5 · 10&sup5; Zellen pro 100 mm Schale in 10 ml Medium, enthaltend 10% FCS, plattiert. Die Kulturen wurden 18-20 h bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 10% CO&sub2; inkubiert. Transfektions- DNA (2 ug ptkhygro und 18 ug pSVGp) wurde mit 3 ml Serum enthaltendem Medium vermischt und anschließend 30 ug Polybrene zugegeben. Diese Transfektionslösung wurde nach Entfernen des Mediums auf die Zellen aufgebracht. Die Zellen wurden 10 h inkubiert. Das DNA/Medium-Gemisch wurde angesaugt und mit 2 ml einer DMSO-Lösung (3 Teile DMSO: 1 Teil Medium) vermischt. Die Zellen wurden 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Medium wurden die Zellen weitere 48 h in vollständigem Medium inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen in selektivem Medium, enthaltend Hygromycin (400 ug/ml) und G418 inkubiert und zur Selektion von doppel-resistenten Zellen stehen gelassen. Hygromycinresistente und G418-resisitente Kolonien wurden zusammengegeben, wie oben beschrieben, und der Titer der Bildung von VSV G enthaltenden Vektorpartikeln wurde auf BHK-Zellen bestimmt.
Die Infektion von BHK-Zellen mit Vektorpartikeln, die von den resistenten Zellen abgeleitet waren, ergab etwa 100-200 G418-resisitente Kolonien pro 10 ml Medium. Dieses Ergebnis zeigte, daß die polyklonale MDCK-Zellnie funktionelle Vektorpartikel bilden konnte, die das VSV G-Hüllglycoprotein und das pLGRNL-Vektorgenom enthielten.
Eine stabile Verpackungszellinie, die kein verpackungskompetentes Vektorpartikelgenom enthält, aber VSV G gag und pol stabil exprimiert, wurde dann in einem zweistufigen Transfektionsverfahren aufgebaut. In der ersten Stufe wurden pTKhygro und pSVG (VSV G unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors) unter Verwendung von Polybrene in MDCK-Zellen co-transfiziert und wie oben beschrieben nach der Hydromycinresistenz selektiert. Die resistenten Zellen wurden zusam mengegeben und die Zellen, die VSV G co-exprimierten, wurden durch Fluoreszenzaktiviertes Sortieren von Zellen (FACS) isoliert. Kurz gesagt wurden subkonfluente Platten einmal mit PBS gewaschen und dann 15 min. bei 37ºC mit 10 mM EDTA behandelt, um Zellen aus der Schale zu entfernen. Die Zellen wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt, durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit eine Perle gebildet, erneut in DME plus 2% FCS suspendiert und wieder zentrifugiert. Das Medium wurde entfernt und die Perle wurde wieder in 0,5 ml einer 1 : 200 Verdünnung von normalem Kaninchenserum oder einer 1 : 200 Verdünnung von Kaninchen-anti- VSV G-Antikörper suspendiert. Die Zellen wurden mit dem Antikörper 30 min. auf Eis inkubiert und dann mit 5,0 ml DME plus 2% FCS verdünnt und anschließend mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Die erhaltenen Perlen wurden weitere zwei Mal mit 5 ml DME plus 2% FCS gewaschen. Die Zellperle wurde erneut in einer 500 ul PBS-Lösung, enthaltend den sekundären Antikörper, suspendiert und 30 min. auf Eis inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen wie oben beschrieben gewaschen und die erhaltene Perle wieder in 0,5 ml DME plus 2% FCS mit Pen/Strep und Fungazone suspendiert und in den Zellsorter injiziert. Selektierte Zellen wurden zusammengegeben, 1 Woche gezüchtet und dann wieder durch Sortieren mit FACS isoliert. Diese zweimal sortierten Zellen wurden, wie oben beschrieben, durch Immunopräzipitation mit Anti-VSV G-Antikörper auf die VSV G-Expression analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 angegeben, wo Bahn 1 die Auszüge der mit dem Anti-VSV G-Antikörper immunopräzipitierten zweimal sortierten Zellen zeigt und die Bahnen 2, 3 und 4 entsprechen den Bahnen 2, 3 bzw. 4 der Fig. 3. Diese Ergebnisse zeigen, daß die pSVG transfizierten Zellen wesentliche Gehalte an VSV G stabil exprimieren.
Die zweite Stufe der Herstellung der stabilen Verpackungslinie bestand darin, pSVGP und ein Plasmid, das Dihydrofolatreduktase (DHFR) exprimiert, zu co-transfizieren, um die stabile Expression der gag- und pol-Gene zu erreichen. DHFR wurde zur Selektion von stabilen Transfektionsprodukten verwendet, wenn sie in Gegenwart von Methotrexat (MTX) wuchsen. Die Plasmide wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung von Polybrene co-transfiziert und 48 h nach der Transfektion in Gegenwart von 5 uM MTX wieder plattiert. MTX-resistente Kolonien wurden zusammengegeben und durch vorübergehende Transfektion dieser Zellen mit einem Verpackungs-kompetenten Vektorgenom auf die Bildung von Vektorpartikeln untersucht. Die Überstände wurden nach 48 h gesammelt und der Titer der Bildung von infektiösem Vektor wurde, wie oben beschrieben, auf Ziel-BHK-Zellen bestimmt.
So zeigt Beispiel 13 die Produktion einer permanenten VSV G-Verpackungszellinie durch selektives Untersuchen auf die Bildung von funktionellem VSV G Protein in Zellinien, die gegenüber der toxischen Wirkung von VSV G Protein resistent sind. Wie für den Fachmann leicht ersichtlich, können ähnliche Verfahren angewandt werden, um Zellinien zu erzeugen, die funktionelles Membran-assoziiertes Protein von einer Vielfalt von Quellen bilden.

Claims

1. Verpackungszellinie, welche verpackte Vektorpartikel mit einem vom Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) abgeleiteten Wirtsbereich erzeugen kann, mit:

einer ersten Nukleinsäuresequenz, welche für die Produktion eines Nukleokapsidproteins mit Retrovirusursprung codiert;

einer zweiten Nukleinsäuresequenz, welche für die Produktion eines heterologen Membran-assoziierten Proteins codiert, welches einen Wirtsbereich bestimmt, der dem des Retrovirus, von dem die erste Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, verschieden ist, wobei das Membran assoziierte Protein eine äußere rezeptorbindende Domäne, eine Membran assoziierte Domäne und eine zytoplasmische Domäne aufweist und worin das Membran assoziierte Protein VSV-G-Protein ist, wobei die Zellen mit der ersten und der zweiten Nukleinsäuresequenz stabil transfiziert sind.

2. Zellinie nach Anspruch 1, welche mit einer dritten Nukleinsäuresequenz transfiziert ist, wobei die dritte Nukleinsäuresequenz von der ersten oder zweiten Nukleinsäuresequenz verschieden ist.

3. Säugetier-Verpackungszelle, welche für gag, pol und ein heterologes chimäres Membran-assoziiertes Protein, das einen Wirtsbereich bestimmt, codierende Nukleotidsequenzen enthält, wobei das chimäre Membran assoziierte Protein eine äußere rezeptorbindende Domäne, eine Membran assoziierte Domäne und eine zytoplasmische Domäne aufweist, wovon die Membran assoziierte Domäne die Membran assoziierte Domäne von VSV G ist und die zytoplasmische Domäne die zytoplasmische Domäne von VSV G ist und die äußere rezeptorbindende Domäne aus beliebigen Liganden/Rezeptoren zur Bestimmung eines Wirtsbereichs ausgewählt ist, welcher verschieden von dem des Virus ist, von dem die für gag und pol codierende Nukleotidsequenz abgeleitet ist.

4. Zelle nach Anspruch 3, worin die äußere rezeptorbindende Domäne eine rezeptorbindende Domäne eines nicht-viralen Proteins ist.

5. Zelle nach Anspruch 4, worin das nicht-virale Protein CD4 ist.

6. Zelle nach Anspruch 4, worin das nicht-virale Protein Erythropoietin ist.

7. Rekombinanter Vektorpartikel mit:

retroviralen gag- und pol-Proteinen;

einer mit dem Vektorpartikel assoziierte Nukleinsäuresequenz; und

einer Hülle, welche ein heterologes chimäres Membran-assoziiertes Protein enthält, welches einen Wirtsbereich bestimmt, wobei das chimäre Membran assoziierte Protein eine äußere rezeptorbindende Domäne, eine Membran assoziierte Domäne und eine zytoplasmische Domäne aufweist, wovon die Membran assoziierte Domäne die Membran assoziierte Domäne von VSV G ist und die zytoplasmische Domäne die zytoplasmische Domäne von VSV G ist, und worin die äußere rezeptorbindende Domäne aus beliebigen Liganden/Rezeptoren zur Bestimmung eines Wirtsbereichs, welcher von dem des Virus, von dem das retrovirale gag- und pol-Protein abgeleitet ist, verschieden ist, ausgewählt ist.

8. Rekombinanter Vektorpartikel nach Anspruch 7, worin die äußere rezeptorbindende Domäne eine rezeptorbindende Domäne eines nicht-viralen Proteins ist.

9. Rekombinanter Vektorpartikel nach Anspruch 8, worin das nichtvirale Protein CD4 ist.

10. Rekombinanter Vektorpartikel nach Anspruch 8, worin das nichtvirale Protein Erythropoietin ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten verpackten Vektorpartikels aus einer Säugetier-Verpackungszelle, wobei das rekombinante Virion ein heterologes chimäres Membran-assoziiertes Protein enthält, welches Verfahren als Schritte aufweist:

Einführen eines retroviralen Vektors in, eine Säugetier-Verpackungszelle, wobei die Zelle stabil gag und pol exprimiert, und Exprimieren eines heterologen chimären Membran-assoziierten Proteins, welches einen Wirtsbereich bestimmt, welches chimäre Membran assoziierte Protein eine äußere rezeptorbindende Domän, eine Membran assoziierte Domäne und eine zytoplasmische Domäne aufweist, wovon die Membran assoziierte Domäne die Membran assoziierte Domäne von VSV G ist und die zytoplasmische Domäne die zytoplasmische Domäne von VSV G, und wovon die äußere rezeptorbindende Domäne aus verschiedenen Liganden/Rezeptoren zur Bestimmung eines Wirtsbereichs, der von dem des Virus, von dem sich gag und pol herleiten, verschieden ist, ausgewählt ist;

Kultivieren der Säugetier-Verpackungszelle; und

Isolieren eines von der Zelle produzierten rekombinanten verpackten Vektorpartikels.

12. Stabile Säugetier-Verpackungszelle, welche stabil eine für retrovirales gag und pol codierende erste Nukleotidsequenz exprimiert und induzierbar eine für VSV G codierende zweite heterologe Nukleotidsequenz exprimiert, welche einen Wirtsbereich bestimmt, der von dem des Retrovirus, von dem die erste Nukleotidsequenz herstammt, verschieden ist, wobei die zweite Nukleotidsequenz operabel mit einem induzierbaren Promotor verbunden ist.

13. Verpackungszelle nach Anspruch 12, worin der induzierbare Promotor ein MMTV-Promotor ist.

14. Verpackungszelle nach Anspruch 12, worin die Zelle eine BHK- Zelle ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines verpackten Vektorpartikels aus einer Säugetier-Verpackungszellinie, welches Verfahren als Schritte aufweist:

Einführen eines retroviralen Vektors in eine stabile Säugetier- Verpackungszelle mit einer ersten Nukleotidsequenz, welche für gag und pol codiert, und einer zweiten Nukleotidsequenz, welche für VSV G codiert, welche einen Wirtsbereich bestimmt, welche von dem des Retrovirus, von dem sich die erste Nukleotidsequenz herleitet, verschieden ist, wobei die zweite Nukleotidsequenz operabel mit einem induzierbaren Promotor verbunden ist;

Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Expression von VSV G von dem induzierbaren Promotor induzieren; und

Isolieren der von der Zelle erzeugten Vektorpartikel.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Expression durch den induzierbaren Promotor temperaturabhängig ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Expression durch den induzierbaren Promotor von der Anwesenheit wenigstens einer Verbindung abhängig ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin der induzierbare Promotor MMTV ist und die Verbindung ein Corticosteroid ist.