DE69614527T2

DE69614527T2 - Retrovirale vektoren aus gefluegel-sarcom-leukoseviren ermoeglichen den transfer von genen in saeugetierzellen und ihre therapeutischen anwendungen

Info

Publication number: DE69614527T2
Application number: DE69614527T
Authority: DE
Inventors: Eugene Barsov; H. Hughes
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1995-05-22
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 2002-05-16
Anticipated expiration: 2016-05-23
Also published as: DE69614527D1; EP0827547A1; CA2221708A1; US6096534A; WO1996037625A1; US6794188B2; ES2161362T3; EP0827547B1; AU5924296A; AU695762B2; ATE204329T1; US20020110896A1

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilweiterbehandlung der US-Patentanmeldung Nr. 08/445,462, eingereicht am 22. Mai 1995.

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Gebiete der genetischen Veränderung und des Gentransfers. Insbesondere betrifft die Erfindung von Vogel-Sarkom-Leukoseviren (ASLV) abgeleitete rekombinante Retrovirus-Vektoren mit einem ausgedehnten Wirtsbereich. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinante ASLV-Retrovirus-Vektoren, worin das ASLV-env-Gen durch ein virales env-Gen, das von einem Virus abgeleitet ist, der zur Infektion von sowohl Säuger- als auch Vogelzellen fähig ist, ersetzt ist, was den Vektoren eine wirksame Infektion eines breiten Spektrums an Wirtszellen, einschließlich Säuger- und insbesondere menschliche Zellen, bei hohen Titern ermöglicht. Ferner umfasst die Erfindung therapeutische Anwendungen unter Einsatz dieser Vektoren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Retrovirale Vektoren, die interessierende Nukleinsäuresequenzen tragen und exprimieren, sind wertvolle Werkzeuge für den Transfer von Genen in ein breites Spektrum von Säugerzellen und in Tiere, einschließlich Menschen. Tatsächlich bieten Retroviren wesentliche Vorteile für eine Verwendung als Vektoren, die gewünschte Nukleinsäuresequenzen tragen und exprimieren, in kultivierten Zellen und ganzen Tieren (Weiss et al., RNA Tumor Viruses (1982)).
Erstens verleiht der retrovirale Lebenszyklus selbst einen wirksamen Transfer von Genen in Wirtszellen. Das infektiöse retrovirale Agens wird virales Partikel oder Virion genannt. Virionen bestehen aus einem Kapsid, das das virale Genom und alle inserierten Nukleinsäuresequenzen enthält, und einer Hülle (Envelope), die aus Glycoproteinen besteht. Die Glycoproteine der Hülle auf der Oberfläche des Virions erkennen Rezeptoren auf der Wirtszelle, die einen Eintritt des retroviralen RNA-Genoms in die Wirtszelle vermitteln. Innerhalb der Wirtszelle wird eine doppelsträngige DNA-Kopie des Virion-RNA-Genoms und aller interessierenden inserierten Nukleinsäuresequenzen durch ein virales Enzym, reverse Transkriptase, erstellt. Diese DNA-Kopie integriert in das Genom des Wirts an einer genauen Stelle auf dem viralen DNA-Molekül und an zufälligen oder nahezu zufälligen Stellen auf der chromosomalen DNA des Wirts. Die integrierte virale DNA-Kopie wird Provirus genannt. Da eine DNA- Kopie des viralen Genoms in das Genom des Wirts integriert, sind die Nachkommen einer einzelnen infizierten Wirtszelle alle infiziert und der Provirus liegt an der gleichen Stelle in dem Genom aller Nachkommen-Zellen.
Zweitens lysieren Retroviren gewöhnlich bei Vervollständigung ihres replikativen Prozesses nicht die Wirtszelle. Somit stellen Retroviren einen wirksamen Mechanismus für das Einbringen und die Expression in hohen Mengen von Genen in lebenden Wirtszellen dar.
Drittens sind retrovirale Genome klein, was eine Manipulation einer klonierten DNA-Kopie des Genoms relativ einfach macht. Außerdem sind die Viren effizient. In Kultur können im wesentlichen alle Zellen infiziert werden.
Die Fähigkeit der retroviralen Replikationsmaschinerie, genetische Information in das Genom der Zielzelle einzubringen, schuf die Idee für die Entwicklung rekombinanter Retrovirus- Vektoren, die eine interessierende Nukleinsäuresequenz enthalten, als Träger für den stabilen Transfer von Genen. Außerdem wurden rekombinante retrovirale Vektoren in einer Reihe von Anwendungen zusätzlich zu der Expression von interessierenden Genen eingesetzt, einschließlich Insertions-Mutagenese, Zellabstammungsuntersuchungen und die Schaffung von transgenen Tieren.
Eine gewünschte Eigenschaft, die für den retroviralen Vektor hilfreich ist, ist die Fähigkeit, in bestimmten, leicht manipulierten Wirtszellen (z. B. Vogelzellen) zu replizieren, was eine schnelle Replikation in diesen Zellen ohne Unterstützung einer Helfer- oder Verpackungszelllinie erlaubt. Dies erlaubt die Herstellung von Virus-Stammlösungen mit einem hohen Titer nur durch Passagierung transfizierter Zellen und durch ein Sichausbreitenlassen des Virus.
Eine weitere hilfreiche Eigenschaft für einen retroviralen Vektor ist die Fähigkeit, ein breites Spektrum von Wirtszellen, einschließlich Säuger- und insbesondere menschliche Zellen bei hohen Titern zu infizieren. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor nicht zur Replikation in Säugerzellen fähig. So wird der Vektor bei einem Eintritt in die Säuger-Wirtszelle ein stabiles Provirus, das in das Wirtszell-Genom integriert ist und nicht zu weiteren Infektionsrunden in der gegenwärtigen oder in nachfolgenden Generationen fähig ist.
Eine Reihe von retroviralen Vektorsystemen wurden beschrieben, einschließlich Systeme, die auf Säuger-Retroviren (Mäuse-Leukämievirus, Cepko et al. (1984), Cell 37: 1053-1062, Cone und Mulligan (1984), PNAS (U. S. A.) 81: 6349-6353; Maus-Mammatumorvirus, Salmons et al. (1984), Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 1191-1198; Gibbon-Leukämievirus, Miller et al. (1991), J. Virology 65: 2220-2224; menschliches Immunschwächevirus, Buchschacher und Panganiban (1992), J. Virology 66: 2731-2739, Page et al. (1990), J. Virology 64: 5270-5276, Shimada et al. (1991), J. Clin. Invest. 88: 1043-1047) und Vogel-Retroviren (Boerkoel et al. (1993), Virology 195: 669-679, Cosset et al. (1990), J. Virology 64: 1070-1078, Greenhouse et al. (1988), J. Virology 62: 4809-4812, Hughes et al. (1986), Poult. Sci. 65: 1459-1467, Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737, Valsessia et al. (1992), J. Virology 66: 5671-5676) basieren. Jedoch vereint keines dieser Vektorsysteme alle vorstehend genannten Merkmale. In der Tat leiden alle verfügbaren retroviralen Vektoren an bestimmten Nachteilen.
Zum Beispiel ist einer der am häufigsten verwendeten retroviralen Vektoren ein replikationsdefizientes Derivat des Moloney-Mäuse-Leukämievirus (MLV). Der hauptsächliche Vorteil von MLV ist, dass es ein breites Wirtsspektrum besitzt und Säuger-Wirtszellen, einschließlich menschlicher Zellen, infizieren kann. Jedoch sind die von diesem Virus abgeleiteten Vektoren replikationsdefizient. MLV-Vektoren enthalten alle cis-aktiven Elemente, die für eine virale Replikation notwendig sind, ihnen fehlen jedoch die Gene für die viralen Strukturproteine. Diese Proteine müssen in trans durch eine Helfer- oder Verpackungszelllinie bereitgestellt werden.
MLV- und andere replikationsdefiziente Vektoren besitzen zwei hauptsächliche Nachteile. Erstens sind die durch eine Helfer- oder Verpackungszelllinie produzierten Titer von rekombinanten Retroviren nicht immer für manche Anwendungen, z. B. für in vivo-Gentransfer- Experimente oder Gentherapie ausreichend (vgl. z. B. Hopkins (1993), PNAS (U. S. A.) 90: 8759-8760). Zweitens können Rekombinationsereignisse zwischen dem Genom der Helfer- oder Verpackungszelllinie und dem replikationsdefizienten Vektor auftreten und können zur Schaffung von Wildtyp-Virus führen (Ott et al. (1994), Hum. Gene Ther. 5: 567-575). Eine Kontaminierung der Stammlösung des rekombinanten retroviralen Vektors mit Replikationskompetentem MLV kann mit einem Gentransfer interferieren und zu möglicherweise ernsthaften Problemen führen, falls der Vektor für eine Gentherapie verwendet wird. Zum Beispiel wurden Leukämien und Lymphome bei Primaten induziert, die durch das Wildtyp-MLV infiziert wurden, das retrovirale Vektor-Stammlösungen kontaminierte (Donahue et al. (1992), J. Exp. Med. 176: 1125-1135; Vanin et al. (1994), J. Virology 68: 4241-4250). Darüber hinaus muss für eine Verwendung einer Helfer- oder Verpackungszelllinie ein selektierbarer Marker in den retroviralen Vektor eingebracht werden. Jedoch besteht bei einem Helfer-unabhängigen System kein Erfordernis für das Einbringen eines selektierbaren Markers in den Vektor, da jede in dem Vektor vorhandene Sequenz passiv während der Replikation mitgetragen wird.
Andere, häufig verwendete retrovirale Vektoren sind von Vogel-Sarkom-Leukoseviren (ASLV); insbesondere dem Rous-Sarkom-Virus (RSV) abgeleitet (Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99; Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012). RSV ist das einzige bekannte Replikations-kompetente Retrovirus mit einem zusätzlichen Gen, dem Onkogen vsrc, das für eine virale Replikation verzichtbar ist. Dieses Onkogen kann aus dem von RSV abgeleiteten Vektor entfernt und durch ein interessierendes Gen oder interessierende Gene ersetzt werden, ohne die Fähigkeit des Virus zur Replikation zu beeinträchtigen. Zum Beispiel wurden von RSV abgeleitete retrovirale Vektoren in jüngerer Zeit beschrieben, bei denen die v-src-Sequenzen, die in dem parentalen RSV auftreten, durch eine einzelne Restriktionsstelle, CIaI, ersetzt wurden, die für eine Insertion des interessierenden Gens oder der interessierenden Gene eingesetzt werden kann. Diese Vektoren werden als RCAS-Serien bezeichnet (Hughes et al. (1987), J Virology 61: 3004-3012). Die Stabilität dieser Vektoren wurde durch Entfernung der direkten Wiederholung stromaufwärts der src-Region verbessert (Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012). Die Herstellung und Vorteile dieser Vektoren sind in Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737, beschrieben (vgl. auch Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99). Retrovirus-Vektoren, die von Replikations-kompetentem endogenem Rous-assoziiertem Virustyp-O (RAV-O) abgeleitet sind, werden als RCOS bezeichnet (Greenhouse et al. (1988), J. Virology 62: 4809-4812). Vektoren ohne Splice- Akzeptoren werden als RCON und RCAN bezeichnet (Hughes et al., US-PS 4,997,763 (eingereicht am 31. Juli 1987, erteilt am 5. März 1991), Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012, Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737, Greenhouse et al. (1988), J Virology 62: 4809-4812).
Im Gegensatz zu den replikationsdefizienten Vektoren erfordern rekombinante Retrovirus- Vektoren, die auf RSV oder anderen Replikations-kompetenten ASLVs basieren, keine Verpackungs- oder Helferzelllinie. Somit können diese Vektoren in Vogelzellen ohne die Unterstützung von Helfer- oder Verpackungszelllinien replizieren. Entsprechend können Virus- Stammlösungen mit einem hohen Titer leicht durch Transfektion eines den Vektor enthaltenden Plasmids in kultivierte Hühnerembryo-Fibroblasten (CEFs) oder andere Vogelzellen und Passagierung der transfizierten Zellen und ein Sichausbreitenlassen des Virus hergestellt werden. Die Einfachheit der Herstellung der Virus-Stammlösung und die hohen Titer, die leicht mit den Replikations-kompetenten retroviralen Vektoren erreichbar sind, sind deutliche Vorteile. Zusätzlich besitzen diese Vektoren die gewünschte Eigenschaft, dass sie nicht zur Replikation in Säugerzellen fähig sind (Federspiel et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 11241- 11245). Von RSV abgeleitete RCAS-Vektoren wurden für die Expression einer Reihe von Genen und für die Herstellung transgener Hühner verwendet (Hughes et al. (1990), J. Reprod. Fertil. Suppl. 41: 39-49; Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737; Petropoulos et al. (1992), J. Virology 66: 3391-3397; Salter et al. (1986), Poult. Sci. 65: 1445-1458; Salter et al. (1987), Virology 157: 236-240).
Eine wichtige Beschränkung von RSV und anderen auf ASLV basierenden Vektoren ist ihr Wirtsbereich. Die vor der Erfindung beschriebenen, von ASLV abgeleiteten Vektoren konnten Säugerzellen nicht wirksam infizieren. Für die Infektion einer Wirtszelle muss das Glycoprotein der Hülle (env) eines Retrovirus spezifisch an einen passenden Rezeptor auf der Oberfläche der Wirtszelle binden. Somit wird das Wirtsspektrum durch die Bindefähigkeit des env- Glycoproteins definiert. Bei RSV und anderen ASLVs ist das env-Glycoprotein auf die Bindung an Vogelzell-Rezeptoren beschränkt. Somit können diese Viren Säugerzellen nicht wirksam infizieren.
Ein Verfahren zur Überwindung dieser Begrenzung ist die Herstellung transgener Mäuse, die den zellulären Rezeptor von Vogel-Leukose-Sarkom-Viren der Untergruppe A exprimieren (Federspiel et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 11241-11245). Von RSV abgeleitete Vektoren sind zu einem Transfer und zu einer stabilen Expression der Gene für alkalische Phosphatase und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) in der Muskulatur von Untergruppe A- Rezeptor-transgenen Mäusen fähig (Federspiel et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 11241-11245). Obwohl der Transfer von Genen effizient ist, replizieren die ASLVs nicht in Säugerzellen (es besteht ein Defekt bei dem Zusammenbau des Virions) und die von RSV abgeleiteten Vektoren sind konstitutiv replikationsdefizient in Säugerzellen. Darüber hinaus ist die Verwendung der von RSV abgeleiteten Vektoren auf die kleine Anzahl von Säuger-Wirtszellen begrenzt, die den Rezeptor des Vogel-Leukose-Virus der Untergruppe A tragen.
Bemühungen um eine Ausdehnung des Wirtsbereichs von retroviralen Vektoren auf eine Reihe verschiedener Zelltypen in einer Vielzahl von Säugerspezies nutzten die Fähigkeit von retroviralen Kapsiden, sich mit den Glycoproteinen der Hülle anderer viraler Spezies zusammenzufügen oder von diesen "verpackt" zu werden. Durch einen wenig verstandenen Mechanismus wird ein pseudotypisiertes Virus geschaffen, das ein gemischtes Hüll-Glycoprotein der zwei Viren trägt (Emi et al. (1991), J. Virology 65: 1201-1207). Das pseudotypisierte Virus besitzt den Wirtsbereich des Virus, das das Hüllprotein beisteuert (Burus et al. (1993), PNAS (U. S. A.) 90: 8033-8037).
Zum Beispiel beschreiben Emi et al. (1991), J. Virology 65: 1201-1207, und Burns et al. (1993), PNAS (U. S. A.) 90: 8033-8037, die Herstellung pseudotypisierter Viren durch Co- Infektion der gleichen Zellen mit MLV und dem vesikulären Stomatitis-Virus (VSV)-Helfer- /Verpackungsvirus. Die resultierenden pseudotypisierten Viren besitzen das vergrößerte Wirtszellspektrum von VSV (d. h. sie können Hamsterzellen infizieren, die MLV im allgemeinen nicht infizieren kann, jedoch bei einem niedrigen Titer).
Landau und Littman (1992), J. Virology 66: 5110-5113, beschreiben die Herstellung von replikationsdefizienten pseudotypisierten Viren, wobei das Virus-Partikel entweder das MLV- oder das RSV-Hüll-Glycoprotein trägt. Das Verpackungssystem wird durch transiente Expression der env-Gene in Zellen hergestellt, die mit replikationsdefizientem MLV infiziert wurden. Die resultierenden MLV-pseudotypisierten Viren besitzen ausgedehnte Wirtsspektren.
Miller et al.; US-PS Nr. 4,861,719 (eingereicht am 25. April 1986, erteilt am 29. August 1992) und Temin et al., US-PS Nr. 5,124,263 (eingereicht am 12. Januar 1989, erteilt am 23. Juni 1992) beschreiben Verpackungs-Helferzelllinien, die für die Veränderung des Wirtsspektrums replikationsdefizienter retroviraler Vektoren verwendet werden, mit denen sie cokultiviert werden. Beide Literaturstellen beschreiben unter anderem Helfer- /Verpackungszelllinien, die von amphotropem MLV abgeleitet sind.
Forscher versuchten, das ASLV-Genom in das Hüll-Glycoprotein eines Virus mit einem breiteren Wirtsspektrum zu "verpacken". Zum Beispiel beschreiben Weiss et al. (1977), Virology 77: 808-825, die Überinfektion von RSV produzierenden Zellen mit Temperatursensitiven Mutanten von VSV für eine Ausdehnung des Wirtsspektrums der auf RSV basierenden Vektoren. Dies ergab zwei Typen von pseudotypisierten Viren: VSV-Genome mit RSV-Hüll-Antigenen und RSV-Genome mit VSV-Hüll-Antigenen. Die RSV-Genome mit den VSV-Hüll- Antigenen besaßen das Wirtsspektrum des VSV-Virus und waren zur Infektion von Säugerzellen fähig, jedoch bei einem niedrigeren Titer als Hühnerzellen.
Weiss und Wong (1977), Virology 76: 826-834, beschreiben die gemischte Infektion kultivierter Vogelzellen durch RSV und MLV. Das Auftreten von für Säugerzellen infektiösen RSV-Partikeln wurde beobachtet. Jedoch scheint das MLV-env-Protein nicht wirksam mit RSV-env für die Bildung von pseudotypisiertem Virus zu kompetitieren. Weiterhin wurde gezeigt, dass die resultierenden RSV-pseudotypisierten Viren mit den xenotropen und ecotropen MLV-env-Antigenen Säugerzellen nur bei einem sehr niedrigen Titer infizierten (im Bereich von 10 /ml).
In jeder dieser Literaturstellen sind die pseudotypisierten Vogelviren mit einem erweiterten Wirtsspektrum von der Herstellung eines Hüllproteins durch ein Helfervirus oder eine Verpackungszelle abhängig. Somit sind diese Vektorsysteme für eine Rekombination zwischen den zwei viralen Genomen und für eine Instabilität und mögliche Kontamination mit Wildtyp- Virus-Rekombinationserzeugern empfänglich. Entsprechend sind sie für eine Gentherapie nicht geeignet.
Manche Forscher versuchten, das Wirtszellspektrum von auf Vogel-Leukosevirus-basierenden Vektoren durch Herstellung rekombinanter Vektoren auszudehnen, die chimäre Proteine mit einer erweiterten Wirtszell-Bindefähigkeit exprimieren. Zum Beispiel beschreiben Dong et al. (1992), J. Virology 66: 7374-7382, einen rekombinanten, auf RSV basierenden Vektor, der ein chimäres Influenzavirus-Hämagglutinin (HA) exprimiert. Plasmide mit chimären HA-Genen, die die kodierende Sequenz für das RSV-env-Signalpeptid in Fusion zu den Hämaglutinin (HA)-Strukturgenen oder eine Kombination von HA- und RSV-Strukturgenen umfassen, wurden für die Co-Infektion von Zellen mit Plasmiden verwendet, die gag pol-Sequenzen von RSV tragen. Virale Partikel, die HA enthielten, wurden gebildet und konnten für die Infektion von Säugerzellen verwendet werden. Jedoch wurde die Replikationsfähigkeit des Vektors in Vogelzellen nicht gezeigt und die Wirksamkeit der Infektion von Säugerzellen war niedrig, im Bereich von 102/ml.
Valsessia-Wittman et al. (1994), J Virology 68: 4609-4619, beschreiben den Austausch der möglichen Rezeptor-Bindedomäne des Hüllproteins gp85 von RSV der Untergruppe A (SU) durch das Peptid, das bekanntermaßen das Ziel für den zellulären Integrinrezeptor ist. Virale Partikel, die von der modifizierten Hülle umgeben waren, infizierten Säugerzellen, die resistent gegenüber einer Infektion durch ASLVs der Untergruppe A sind. Jedoch schien eine Infektiösität dieses Vektors bei Säugerzellen ziemlich niedrig zu sein, im Bereich von 10- 10²/ml.
Trotz unzähliger Versuche im Stand der Technik, Vektoren zu entwickeln, die zugleich 1) ein breites Spektrum an Zelltypen in einer Vielzahl von Vogel- und Säugerspezies, unabhängig von Helfer- oder Verpackungs-Viruszelllinien wirksam infizieren konnten, und 2) nicht innerhalb der Säuger-Wirtszelle replizieren konnten, war ein derartiger Vektor bis zu vorliegenden Erfindung ein Wunschdenken.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß werden allgemein rekombinante, von Vogel-Sarkom-Leukosevirus (ASLV) abgeleitete retrovirale Vektoren mit einem erweiterten Wirtsspektrum bereitgestellt, was eine Verwendung des Vektors für einen Gentransfer in einer Vielzahl von Spezies erlaubt. Insbesondere wird das Gen für die Hülle von ASLV durch eine env-Region ersetzt, die von Mäuse- Leukämievirus (MLV) abgeleitet ist, das zur Infektion von Säuger- und Vogelzellen fähig ist. Die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren können wirksam in Vogelzellen replizieren, was die Herstellung von Stammlösungen mit einem hohen Titer ermöglicht, und sie können sowohl Säuger- als auch Vogelzellen bei einem hohen Titer infizieren. Jedoch sind die von ASLV abgeleiteten erfindungsgemäßen Vektoren in Säugerzellen Replikations-defizient, wodurch retrovirale Vektoren bereitgestellt werden, die für eine Verwendung in der Gentherapie ziemlich sicher sind.
Eine allgemeine erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung rekombinanter retroviraler Vektoren, die eine oder mehrere interessierende Nukleinsäuresequenzen tragen und diese in einem breiten Spektrum von Säugerzellen exprimieren können.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Wirtszellen, insbesondere Vogel- oder Säugerzellen, die die rekombinanten retroviralen Vektoren tragen und eine oder mehrere interessierende Nukleinsäuresequenzen exprimieren können.
Ebenfalls eine erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren für eine Verwendung der rekombinanten retroviralen Vektoren für einen Transfer von interessierenden Nukleinsäuresequenzen in ein breites Spektrum von Wirtszelltypen, sowohl in vitro als auch in vivo, in eine Vielzahl von Spezies, einschließlich Vogel- und insbesondere Säugerspezies. Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Verwendung der rekombinanten retroviralen Vektoren für eine Herstellung transgener Tiere. Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung transgener Tiere, die die rekombinanten retroviralen Vektoren in wenigstens einer Zelle tragen.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren für die Behandlung oder Vermeidung von Erkrankungen, die einen Transfer einer gesamten oder eines Teils einer interessierenden Nukleinsäuresequenz durch rekombinante retrovirale Vektoren in einen Säuger, vorzugsweise einen Menschen, umfassen.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1A: Schematische Darstellung der Herstellung des Plasmids RSV gagpol.
Fig. 1B: Schematische Darstellung der Herstellung des rekombinanten retroviralen Vektors RCAS-M(4070A).
Fig. 2A: Schematisch dargestellte Struktur der Plasmide RSVgagpol und MLVenv. RSVgagpol enthält den gag-pol offenen Leserahmen, der von dem retroviralen Vektor RCASBP(A) abgeleitet ist (Petropoulos und Hughes (1991), J Virology 65: 3728-3737). MLVenv trägt eine Region, die für das Signalpeptid, das Oberflächen-Glycoprotein gp70 und das Transmembranprotein p15E eines amphotropen MLV, Klon 4070A, kodiert (Ott et al. (1990), J. Virology 64: 757-766, Ott et al. (1992), J. Virology 66: 4632-4638).
Fig. 2B: Immunoblotting-Analyse der viralen Partikel, die aus dem Komplementationstest mit RSVgagpol und MLVenv geerntet wurden. Antikörper gegen RSV p19 (MA) und MLV gp70 (SV) wurden verwendet. Die Spuren 1 und 2 zeigen MLVenv, das aus Überständen von Zellen gewonnen wurde, die mit dem MLVenv-Plasmid alleine transfiziert wurden. Die Spuren 3 und 4 zeigen RSVgagpol, das aus Überständen von Zellen gewonnen wurde, die mit dem RSVgagpol-Plasmid alleine transfiziert wurden, und die Spuren 5 und 6 zeigen Viruspartikel, die aus Überständen von Zellen gewonnen wurden, die mit beiden Plasmiden cotransfiziert wurden.
Fig. 3A: Schematische Darstellungen der Strukturen der retroviralen Vektoren RCAS- M(4070A) und RCASBP(A). RCAS-M(4070A) enthält ein chimäres env-Gen, das von einem amphotropen MLV abgeleitet ist, anstelle des env-Gens von RCASBP(A). Der retrovirale Vektor RCASBP(A) wurde durch Austausch des Stoppkodons des env-Gens durch eine einzelne NotI-Spaltstelle für die Herstellung von RCAS-M(4070A) modifiziert. Zusätzlich wurden env-kodierende Sequenzen von RSV entfernt und die für die chimäre Hülle-kodierende Region, einschließlich eines neuen Stoppkodons, inseriert, was den rekombinanten retroviralen Vektor RCAS-M(4070A) ergab.
Fig. 3B: SDS-PAGE-Gel. Spuren 1 und 2 enthalten virale Partikel, die aus der Transfektion von CEFs mit RCAS-M(4070A) gewonnen wurden. Die Spuren 3 und 4 sind Kontrollen und enthalten die viralen Partikel, die aus CEFs gewonnen wurden, die mit pR4070A, dem molekularen Klon des amphotropen MLV, von dem das MLV env-Gen abgeleitet war, infiziert worden waren.
Fig. 4A: Gefärbte Zellen, die gp70 aus RCAS-M(4070A) exprimieren. Für die Messung der Fähigkeit von RCAS-M(4070A) in CEFs zu replizieren, wurden Zellen mit RCAS- M(4070A)-DNA transfiziert und sechsmal passagiert, um eine Ausbreitung des Virus zu erlauben. Bei den Passagen 1, 4 und 6 wurde eine kleine Anzahl Zellen getrennt ausplattiert. Diejenigen, die Virus enthalten, wurden durch Färbung mit Antikörpern, die mit gp70 reagieren, identifiziert. Nur eine kleine Anzahl positiv gefärbter Zellen sind bei der Passage 1 zu erkennen. Diese Anzahl erhöht sich signifikant bei der Passage 4. Bei der Passage 6 sind scheinbar alle Zellen infiziert und exprimieren gp70.
Fig. 4B: Immunoblotting-Analyse der viralen Partikel, die aus dem geernteten Zellmedium von CEFs bei jeder Passage gewonnen wurden, mit Antikörpern gegen p19 und gp70. Die Menge von viralen Proteinen in dem Überstand erhöht sich bei der Passage 4 und erreicht einen hohen Wert bei der Passage 6.
Fig. 5: Puromycin-resistente Kolonien von D17 (dog)-Zellen, die durch Infektion von D17- Zellen mit seriellen Verdünnungen von RCAS-M(4070A)Puro hergestellt wurden.
Fig. 6A: Schematische Struktur von RCAS-M(4070A)NEO. Restriktionsendonuklease- Stellen sind markiert. "E" bedeutet EcoRI, "B" bedeutet BamHI.
Fig. 6B: Nachweis von RCAS-M(4070A)NEO-Provirus in der genomischen DNA von infizierten NIH 3T3-Zellen durch Southern-Blot-Hybridisierung. Die Spuren 1-19 zeigen Fragmente, die durch eine Spaltung der DNA von G418r-Klonen durch EcoRl und BamHI abgeleitet wurden. Die Spur C zeigt Fragmente, die durch Spaltung von Plasmid-RCAS- M(4070A)-DNA durch EcoRI und BamHI abgeleitet wurden.
Fig. 6C: Nachweis von RCAS-M(4070A)NEO-Provirus in der genomischen DNA infizierter HeLa-Zellen durch Southern-Blot-Hybridisierung. Die Spuren 1-15 zeigen Fragmente, die durch Spaltung der DNA von G418r-Klonen durch EcoRII und BamHI abgeleitet wurden. Die Spur C zeigt Fragmente, die durch Spaltung von Plasmid-RCAS-M(4070A)-DNA durch EcoRI und BamHI abgeleitet wurden.
Fig. 7: Immunoblotting-Analyse viraler Partikel, die aus der Kultur von mit RCAS- M(4070A) infizierten Zellen gewonnen wurden. Antikörper gegen p15E wurden verwendet. Die Spur 1 zeigt Wildtyp-MLV p15E-Proteine, Spur 2 zeigt p15E-Proteine von einem MLV- Stamm mit einem defekten Protease-Gen. Spur 3 zeigt RCAS-M(4070A)-p15E-Proteine.
Fig. 8: Schematische Darstellung von Mutationen in dem amphotropen env-Gen von RCAS- M(4070A)NEO. CEFs wurden nach drei Passagen des Virus mit RCAS-M(4070A)NEO infiziert. Vollständige Klone der viralen DNA wurden aus der Bibliothek einer niedrigmolekularen DNA abgeleitet, die von infizierten CEFs extrahiert wurde. env-Gene der Klone env1, 3, 6, 8 und 9 wurden sequenziert und sind dargestellt.
Fig. 9A: Replikation von RCAS-M2(4070A)Puro und RCAS-M2(4070A)Puro 1, 6, 8 und 9 in CEFs, gemessen durch einen RT-Assay. CEFs wurden mit Plasmid-DNA transfiziert und passagiert. 24 Stunden nach der Transfektion und bei jeder Passage wurden Viruspartikel aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation gewonnen und durch Bestimmung der RT-Aktivität quantifiziert. Die Kontrolle, nicht-infizierte Zellen, ist als "mock" bezeichnet. RCAS-. M2(4070A)Puro ist als "env (wt)" bezeichnet und RCAS-M2(4070A)Puro 1, 6, 8 und 9 sind als "env 1", "env 6", "env 8" bzw. "env 9" bezeichnet.
Fig. 9B: Titer von RCAS-M2(4070A)Puro 1, 6, 8 und 9 auf D17-Zellen. Zellen wurden mit den seriellen 10-fachen Verdünnungen der Virus-enthaltenden Kulturflüssigkeit infiziert, die bei jeder Passage geerntet wurde. Resistente Klone wurden in dem Puromycin-enthaltenden Medium selektiert. pacr-Kolonien wurden mit Giemsa-Färbung gefärbt und ausgezählt.
RCAS-M2(4070A)Puro 1, 6, 8 und 9 sind als "env 1 ", "env 6", "env 8" bzw. "env 9" bezeichnet. "Cfu" bedeutet Kolonie-bildende Einheiten.
Fig. 9C: Titer von RCAS-M2(4070A)Puro 8 (bezeichnet als "RCAS-M2(4070A)Puro") und RCAS-M2C(4070A)Puro auf D17-Zellen. Die gezeigten Werte sind der Durchschnitt von zwei unabhängigen Messungen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft rekombinante retrovirale Vektoren, die zur Infektion eines breiten Spektrums an Wirtszellen, insbesondere sowohl Säuger- als auch Vogelzellen, bei hohen Titern fähig sind. Im allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren wenigstens eine lange terminale Wiederholung (LTR), eine gag-Region, eine pol-Region und eine env-Region oder funktionelle Äquivalente davon. Insbesondere umfassen die rekombinanten retroviralen Vektoren LTR-, pol- und gag-Regionen, die aus Vogel-Sarkom-Leukoseviren (ASLV) abgeleitet sind und eine env-Region, die von Mäuse-Leukämievirus (MLV) abgeleitet ist, das zur Infektion von sowohl Vogel- wie auch Säugerzellen fähig ist. Die rekombinanten Vektoren sind fähig, eine oder mehrere interessierende Nukleinsäuresequenzen zu tragen und zu exprimieren, replizieren wirksam in Vogelzellen und sind zur wirksamen Infektion und zum Transfer von Genen in ein breites Spektrum von Säugerzellen fähig. Die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren sind replikationsdefizient in Säugerzellen, was ihre Sicherheit stark erhöht.
Gag ist das retrovirale Gen, das für die Strukturproteine kodiert, die den Kern des Virions bilden. Die gag-Region des Vektors ist von der gag-Region irgendeines Mitglieds der ASLV- Familie abgeleitet. Beispiele der Genome, von denen die gag-Sequenz abgeleitet sein kann, umfassen in nicht begrenzender Weise Rous-Sarkom-Virus (RSV), MC&sub2;&sub9;-assoziiertes Virus (MAV), Rous-assoziiertes Virus (RAV), RAV-O, Vogel-Erythroblastose-Virus (AEV), Vogel-Myoblastose-Virus (AMV), andere Mitglieder dieser Virusfamilie und ihre assoziierten Helferviren. Die gag-Region kann das gesamte oder Teile des gag-Gens umfassen. Für einen Replikations-kompetenten Vektor wird vorzugsweise eine Sequenz verwendet, die für die Kodierung eines funktionellen gag-Proteins ausreichend ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gag-Region von RSV abgeleitet.
Pol ist das retrovirale Gen, das für die reverse Transkriptase und Integrase kodiert. Die pol- Region kann von der pol-Region irgendeines Mitglieds der ASLV-Familie abgeleitet sein. Beispiele der Genome, von denen die pol-Sequenzen abgeleitet sein können, umfassen in nicht begrenzender Weise RSV, MAV, RAV, RAV-O, AEV, AMV, andere Mitglieder dieser Virusfamilie und ihre assoziierten Helferviren. Die pol-Region kann das gesamte oder einen Teil des pol-Gens umfassen. Für ein Replikations-kompetentes Virus wird vorzugsweise eine Sequenz verwendet, die für die Kodierung eines funktionellen pol-Proteins ausreichend ist. Zum Beispiel kann eine pol-Region, die von dem Bryan-RSV-Stamm mit einem hohen Titer abgeleitet ist, verwendet werden (Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737). Env ist das retrovirale Gen, das für die Antigene der Hülle kodiert, die die Antigene und Untergruppenspezifität des Virus bestimmen. Die env-Sequenz ist vorzugsweise von der Envelope-Region eines Virus abgeleitet, das zur Infektion von sowohl Säuger- als auch Vogelzellen fähig ist. Das Genom, von dem die env-Sequenzen abgeleitet sind, ist die env- Sequenz des amphotropen Moloney-Mäuse-Leukämievirus (MLV) (Weiss et al. (1982), RNA Tumor Viruses; Weiss (1985), Ergänzung zu RNA Tumor Viruses). Die env-Sequenz kann das gesamte oder Teile des env-Gens umfassen. Für ein Replikations-kompetentes Virus wird vorzugsweise eine Sequenz verwendet, die für die Kodierung eines funktionellen Hüllproteins ausreichend ist. Zum Beispiel kann eine Sequenz, die für die vollständige env-Region des amphotropen MLV kodiert, für den erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektor verwendet werden.
Die kodierende Sequenz eines Virus, das zur Infektion von sowohl Säuger- als auch Vogelzellen fähig ist, wie amphotropes MLV, ist durch eine oder mehrere Mutationen der DNA der env-kodierenden Sequenz, d. h. die Substitution des Prolins an Position 242 durch ein Isoleucin, "adaptiert", um anfängliche Replikationsgeschwindigkeiten zu erlauben, die ähnlich zu denjenigen sind, die bei Wildtyp-RSV beobachtet werden. Wie vollständiger in den Beispielen beschrieben, kann die "adaptierte" env-Sequenz durch Passagierung des Virus und Selektion für schnell replizierende Klone hergestellt werden. Zusätzlich wird der Fachmann erkennen, dass die env-Sequenz durch eine Reihe von anderen Verfahren "adapiert" werden kann, einschließlich in nicht begrenzender Weise die Verwendung von Stellen-gerichteter Mutagenese für die Herstellung der gewünschten Mutation(en).
Alternativ kann eine chimäre Envelope-Sequenz für die Herstellung des erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektors verwendet werden, umfassend die kodierende Region einer "adaptierten" env-Gensequenz eines Virus, das zur Infektion von Säuger- und Vogelzellen fähig ist, und die N-terminale Peptidsequenz eines ASLV.
Lange terminale Wiederholungen (LTRs) erleichtern die Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom und enthalten Promotoren für eine Transkription des viralen Genoms. Die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren besitzen wenigstens ein, vorzugsweise zwei LTRs. Ein von einem Mitglied der ASLV-Familie abgeleitetes LTR kann verwendet werden. Diese umfassen in nicht begrenzender Weise RSV, MAV, RAV, RAV-O, AEV, AMV und andere Mitglieder dieser Familie und ihre assoziierten Helferviren (Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99, Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3005-3102). Für ein Replikations-kompetentes Virus wird vorzugsweise das gesamte LTR verwendet. Alternativ kann in einer anderen Ausführungsform ein retroviraler Vektor mit einem einzelnen LTR verwendet werden. Falls ein zirkuläres Plasmid mit einem einzelnen LTR verwendet wird, kann eine provirale Form mit zwei LTRs einfach durch Spaltung an einer geeigneten Restriktionsstelle und Ligation abgeleitet werden (Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99).
Der von RSV abgeleitete Vektor, als RCAS bezeichnet, kann für die Herstellung des erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektors durch Bereitstellung der LTR-, pol- und gag-Sequenzen verwendet werden (Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012; Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99, hier durch einen Verweis einbezogen). Zusätzlich werden in einer anderen Ausführungsform die RCASBP-Vektoren verwendet (Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737). Bei der Herstellung von RCAS wurde das Genom einer zirkulären DNA-Form des Schmidt-Rappin A (SR-A)-Stamms von RSV in einer proviralen DNA-Form mit dem E. coli-Replikon zwischen die LTRs des Provirus rückkloniert. Die v-src-kodierende Region wurde entfernt und durch die Spaltstelle für die Restriktionsendonuklease ClaI ersetzt. Eine Kopie der direkten Wiederholungen, die v-src in SR-A flankieren, wurde entfernt. Für die Herstellung von RCASBP wurde der RCAS-Vektor verwendet und das pol-Gen des SR-A-Stamms durch das pol-Gen des Bryan-Hochtiter-Stamms von RSV ersetzt.
Herkömmliche Verfahren können für den Austausch der von RSV abgeleiteten env-Sequenz in dem RCAS- oder RCASBP-Vektor durch die env-Sequenz des amphotropen MLV-Retrovirus verwendet werden (vgl. Beispiel 2). Die vollständige MLV env-kodierende Sequenz kann verwendet werden oder eine chimäre env-Sequenz, die die MLV env-kodierende Sequenz mit dem RSV-Signalpeptid anstelle des MLV-Signalpeptids umfasst, kann hergestellt und in den Vektor kloniert werden. Das resultierende Retrovirus, als RCAS-M(4070A) bezeichnet, ist in Fig. 3 gezeigt. Die funktionellen Äquivalente des in Fig. 3 gezeigten rekombinanten Retrovirus sollen auch erfindungsgemäß umfasst sein.
Das RCAS-M(4070A) ist für eine schnelle anfängliche Replikation durch Mutation der env- Sequenz, um für ein Isoleucin an Position 242 zu kodieren, "adaptiert". Das resultierende Retrovirus wird als RCAS-M2(4070A) bezeichnet. Die funktionellen Äquivalente des RCAS- M2(4070A)-rekombinanten Retrovirus sollen auch erfindungsgemäß umfasst sein. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Envelope-Region der erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren von einem Virus abgeleitet, das Säuger-, jedoch nicht Vogelzell-Rezeptoren erkennt. Damit ein Vektor, der eine derartige Envelope-Sequenz enthält, Vogel-Wirtszellen infiziert, können die Vogelzellen verändert werden, so dass sie einen Rezeptor exprimieren, der durch die ausgewählte Envelope-Region erkannt wird.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren können für die Expression von interessierenden Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. In dieser Ausführungsform umfasst der Vektor ferner eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für ein interessierendes Protein kodieren. Der Fachmann wird erkennen, dass scheinbar alle Nukleotidsequenzen von scheinbar allen Genomen verwendet werden können. Insbesondere können Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die für ein therapeutisches oder immunogenes Protein kodieren. Alternativ können Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die für den Antisense-Strang für ein oder mehrere Proteine kodieren, um die Expression der Proteine zu hemmen. Die Nukleinsäuresequenzen können in den erfindungsgemäßen retroviralen Vektor mit Hilfe herkömmlicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, inseriert werden. Beispiele umfassen in nicht begrenzender Weise die Spaltung durch eine spezifische Restriktionsendonuklease und die Ligation oder homologe Rekombination.
Herkömmliche Verfahren, die in nicht begrenzender Weise Stellen-gerichtete Mutagenese umfassen, können für das Einbringen einer oder mehrerer Restriktionsendonuklease-Stellen in die erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden (Sambrook et al. (Hrsg.) (1989), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York und Ausubel et al. (Hrsg.) (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York). Um die Fähigkeit der Vektoren, in Vogelzellen zu replizieren, aufrecht zu erhalten, ist es wichtig, dass keine der gag-, pol- oder env-Sequenzen deletiert werden, die für eine Virus-Replikation notwendig sind. Irgendeine Restriktionsendonuklease- Stelle kann geschaffen werden, vorzugsweise eine Endonuklease-Stelle, die einzeln in dem retroviralen Expressionsvektor vorkommt, oder eine Endonuklease-Stelle, die nicht häufig in dem Vektor auftritt. Dem Fachmann ist bekannt, wie die geeigneten Restriktionsendonuklease-Stellen ausgewählt und geschaffen werden.
In einer Ausführungsform wird RSV für die Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren verwendet und die interessierenden Nukleinsäuresequenzen können anstelle des RSV-v-src-Onkogens mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen und Ligation inseriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die interessierenden Nukleinsäuresequenzen in die ClaI-Stelle der von RSV abgeleiteten RCAS- oder RCASBP- Vektoren inseriert und wenigstens eine Kopie der die v-src-Stelle flankierenden direkten Wiederholungen wird entfernt, um die Stabilität des Vektors zu erhöhen (vgl. Beispiel 2). Die gewünschten, in den erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor inserierten Nukleinsäuresequenzen können unter der Steuerung des LTR-Promotors transkribiert werden. Zum Beispiel können die von RSV abgeleiteten RCAS- oder RCASBP-Vektoren für die Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren verwendet werden, falls der LTR die Expression der interessierenden Nukleinsäuresequenz steuern wird (Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99, Hughes et al. (1987), J Virology 61: 3004-3012).
Alternativ kann die Expression der gewünschten Nukleinsäuresequenzen unter der Steuerung eines internen Promotors in dem erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektor erfolgen. Zum Beispiel können gewebespezifische Promotoren wie α-sk-Aktin (Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737), induzierbare Promotoren wie ein Metallothionein-Promotor (Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 65: 3728-3737), Zellzyklus- oder Stufen-spezifische Promotoren für die Steuerung der Expression der gewünschten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Der Fachmann wird wissen, welcher Promotor verwendet werden sollte, basierend auf der beabsichtigten Verwendung des Genprodukts. Zum Beispiel können die von RSV abgeleiteten RCAN-Vektoren (Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99; Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012) für die Herstellung der erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren verwendet werden, falls ein interner Promotor verwendet werden wird. Herkömmliche Verfahren können für einen Einbau dieser Promotoren in die rekombinanten retroviralen Vektoren verwendet werden.
Weiterhin wird der Fachmann erkennen, dass ein Splice-Akzeptor oder ein IRES-Element (interne Ribosomen-Eintrittsstelle) in den retroviralen Vektor eingebracht werden können, um die Expression eines inserierten Gens zu erlauben.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren können ferner zusätzliche Expressionskontrollelemente umfassen, einschließlich in nicht begrenzender Weise Enhancer-Sequenzen. Herkömmliche Verfahren können für den Einbau dieser zusätzlichen Expressionskontrollelemente in den Vektor verwendet werden (Sambrook et al. (Hrsg.) (1989), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview; New York und in Ausubel et al. (Hrsg.) (1987), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York).
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Verwendung der rekombinanten retroviralen Vektoren für einen Transfer einer oder mehrerer interessierender Nukleinsäuresequenzen in ein breites Spektrum von Wirtszellen aus einer Vielzahl von Spezies, insbesondere Säugerspezies. Die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren können eine oder mehrere interessierende Nukleinsäuresequenzen tragen. Die Virionen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen einkapseln, sind zur Infektion eines breiten Spektrums von Säugerzelltypen fähig. Innerhalb der Zelle erstellen die rekombinanten retroviralen Vektoren eine DNA-Kopie des retroviralen Genoms und der interessierenden Nukleinsäuresequenzen, die stabil in das Wirtsgenom inseriert wird und durch die Wirtszelle exprimiert werden kann.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren können direkt in eine Wirtszelle eingebracht werden oder in ein Plasmid oder ein anderes Konstrukt inseriert werden, das sodann in eine Wirtszelle inseriert wird. Zum Beispiel können für die Herstellung großer Mengen der erfindungsgemäßen retroviralen Vektor-DNA die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren in ein Plasmid für eine Vermehrung der DNA in geeigneten Zellen kloniert werden. Beispiele von verwendbaren Zellen umfassen in nicht begrenzender Weise E coli. Die Herstellung des Plasmids mit der retroviralen Vektor-DNA kann in herkömmlicher Weise erfolgen.
Zum Beispiel kann das pBR322-Plasmid oder ein Derivat davon für die Vermehrung der Vektor-DNA verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der erfindungsgemäße retrovirale Vektor in das E. coli-Replikon pPH, das von pBR322 abgeleitet ist, inseriert (Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012).
Der Fachmann wird erkennen, dass das Plasmid mit der rekombinanten retroviralen DNA weitere Elemente enthalten sollte, die für einen Transfer und eine darauffolgende Replikation des Konstrukts in dem Wirtssystem, das für die Vermehrung der DNA verwendet wird, notwendig sind. Beispiele solcher Elemente umfassen in nicht begrenzender Weise Replikationsursprünge und Selektionsmarker. Der Fachmann wird die erforderlichen Elemente erkennen. Die Mittel, durch die die rekombinanten retroviralen Vektoren in die Wirtszelle eingebracht werden können, umfassen in nicht begrenzender Weise Mikroinjektion, Elektroporation, Transduktion oder Transfektion mit Hilfe von DEAE-Dextran, Lipofektion, Calciumphosphat oder andere bekannte Verfahren (Sambrook et al. (1989), in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York).
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Bereitstellung von Wirtszellen, in die der rekombinante retrovirale Vektor mit der gesamten oder einem Teil der interessierenden Nukleinsäuresequenzen inseriert wurde. Die Wirtszellen, die den erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektor enthalten, umfassen Eukaryonten wie Vogelspezies, einschließlich Enten, Hühner, Truthähne und Wachteln und Säugerspezies, einschließlich Mäuse, Hunde, Menschen. Bevorzugte Wirtszellen umfassen in nicht begrenzender Weise CEF-Zellen, NIH 3T3-Zellen, D17-Zellen und HeLa-Zellen.
Die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren sind in Vogelzellen Replikations-kompetent. Vogelzellen, einschließlich in nicht begrenzender Weise Zellen von Huhn, Truthahn, Wachtel und Ente, können für die Herstellung einer Virus-Stammlösung verwendet werden. Die Virus- Stammlösung kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Der in ein Plasmid klonierte rekombinante retrovirale Vektor kann in die Vogelzellen in an sich bekannter Weise eingebracht werden und die Zellen können passagiert werden, um eine Verteilung des Virus in der Kultur zu erlauben. Darauffolgende Generationen des Virus können für die Infektion anderer Zellen verwendet werden. Alternativ kann ein Virus, das den rekombinanten retroviralen Vektor trägt, für die Infektion der Vogelzellen verwendet werden. Die hergestellte Virus-Stammlösung kann für die Infektion anderer Wirtszellen verwendet werden. Beispiele von infzierbaren Zellen umfassen in nicht begrenzender Weise Enten-, Hühner-, Truthahnzellen oder Säugerzellen. Beispiele von Säugerzellen umfassen in nicht begrenzender Weise hämatopoetische Stammzellen, Inselzellen oder T-Zellen.
Wirtszellen, die einen erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektor enthalten, können in vitro für die Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden. Die rekombinanten Proteine können isoliert und in herkömmlicher Weise gereinigt werden (Sambrook et al. (Hrsg.) (1989), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, und in Ausubel et al. (Hrsg.) (1987), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York). Zusätzlich können Wirtszellen in vivo verwendet werden, um rekombinante Proteine bereitzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren für einen Transfer von Nukleinsäuresequenzen, die für ein oder mehrere therapeutische Proteine kodieren, in einen Säuger, vorzugsweise einen Menschen, der einer Gentherapie bedarf, transferiert werden. Der retrovirale Vektor, der die interessierende Nukleinsäuresequenz trägt, kann an ein Lebewesen, das einer derartigen Therapie bedarf, in einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden. Retrovirale Überstände von Vogel-Wirtszellen, die mit dem Virus transfiziert wurden und diesen produzieren, können an das Lebewesen, das einer Gentherapie bedarf, verabreicht werden. Zusätzlich kann eine im wesentlichen aufgereinigte Form des Virus an einen Säuger, der einer derartigen Behandlung bedarf, alleine oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden.
Alternativ kann die Gentherapie durch Insertion der Nukleinsäuresequenzen, die für das/die therapeutische(n) Protein(e) kodieren, in den erfindungsgemäßen rekombinanten Retrovirus- Vektor und seine Einbringung in eine Wirtszelle erfolgen. Die Wirtszelle, die den rekombinanten retroviralen Vektor enthält und das gewünschte therapeutische Protein exprimiert, wird sodann an das Lebewesen, das einer Gentherapie bedarf, verabreicht oder in dieses implantiert. Die Zellen exprimieren sodann rekombinant das therapeutische Protein in dem Säuger.
Die Wirtszellen können scheinbar aus jeder Spezies stammen. In einer Ausführungsform werden die Wirtszellen dem Lebewesen entnommen, das der Gentherapie bedarf. Beispiele derartiger Wirtszellen umfassen in nicht begrenzender Weise hämatopoetische Stammzellen oder T-Zellen. In einer weiteren Ausführungsform stammen die Wirtszellen nicht von dem Lebewesen, das die Therapie erhält, sondern aus einer anderen Spezies. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform, die einen Nutzen aus der Fähigkeit der erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren zieht, in Vogel-, jedoch nicht in Säugerzellen zu replizieren und Virus zu produzieren, Vogel-Wirtszellen mit dem retroviralen Vektor an einen Säuger verabreicht, der einer Therapie bedarf.
Mittel zur Verabreichung der Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren enthalten, die rekombinant die interessierenden Proteine exprimieren, umfassen in nicht begrenzender Weise intravenöse, intramuskuläre, interläsionale, subkutane oder intraperitoneale Injektion oder Implantation. Alternativ können die Zellen, die die rekombinanten retroviralen Vektoren enthalten, lokal durch topische Auftragung, direkte Injektion in einen betroffenen Bereich oder Implantation einer porösen Vorrichtung, die Zellen von dem Wirt oder anderen Spezies enthält, in die die rekombinanten retroviralen Vektoren inseriert werden und die die interessierenden Proteine exprimieren, verabreicht werden.
Beispiele von Erkrankungen, die für die Gentherapie geeignet sein könnten, umfassen in nicht begrenzender Weise neurodegenerative Erkrankungen oder Störungen, Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie, Epilepsie, Neoplasmen, Krebs und AIDS.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt können die rekombinanten retroviralen Vektoren für die Herstellung transgener Tiere verwendet werden, die den rekombinanten Vektor in wenigstens einer Zelle tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der rekombinante retrovirale Vektor, der eine oder mehrere interessierende Nukleinsäuresequenzen trägt, in ein Tier oder einen Vorfahren des Tiers in einem embryonalen Stadium eingebracht. Das transgene Tier kann durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Einbringung des rekombinanten retroviralen Vektors, der die interessierenden Nukleinsäuresequenzen trägt, in das embryonale Tier durch Infektion oder Injektion. Zusätzlich kann der rekombinante retrovirale Vektor in Wirtszellen inseriert werden, die sodann in den sich entwickelnden Embryo eingebracht werden. Zum Beispiel können Hühnerzellen, die den rekombinanten retroviralen Vektor enthalten und das interessierende Gen tragen, in das Blastozysten-Stadium eines Säugerembryos implantiert werden.
Beispiele von Tieren, in die der rekombinante retrovirale Vektor eingebracht werden kann, umfassen in nicht begrenzender Weise nicht-menschliche Primaten, Kühe, Schafe, Hunde, Mäuse, Ratten oder andere Nager. Derartige transgene Tiere können als biologische Modelle für die Untersuchung von Erkrankungen und für die Bewertung diagnostischer oder therapeutischer Verfahren für eine Erkrankung hilfreich sein.
Der Fachmann wird erkennen, dass die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren für die Herstellung transgener Tiere ohne zusätzliche Nukleinsäuresequenzen (z. B. Insertions-Mutagenese) eingesetzt werden können. Alternativ können interessierende Nukleinsäuresequenzen in die erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektoren inseriert werden, so dass das transgene Tier das (die) gewünschte(n) Gen(e) exprimiert.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung der rekombinanten retroviralen Vektoren für die Verabreichung einer prophylaktischen oder therapeutischen Vaccine für ein breites Spektrum von Säuger-Erkrankungen, insbesondere menschlichen Erkrankungen.
Eine prophylaktische Vaccine wird vor irgendwelchen Krankheitssymptomen verabreicht und dient der Vermeidung oder Attenuierung der Erkrankung bei einem Säuger. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Säuger, insbesondere Menschen, die ein hohes Risiko für die interessierende Erkrankung tragen, prophylaktisch mit den erfindungsgemäßen Vaccinen behandelt.
Bei einer therapeutischen Verabreichung wird die Vaccine bei oder kurz nach Einsetzen der interessierenden Erkrankung (oder der Krankheitssymptome) verabreicht, um die Immunreaktion eines Patienten (ein Säuger, insbesondere ein Mensch) gegen die interessierende Erkrankung zu verstärken und die Erkrankung zu attenuieren.
Die Vaccine, die als immunogen wirkt, kann in Form einer Zelle vorliegen, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten retroviralen Vektor transfiziert wurde, der die Nukleinsäuresequenzen trägt, die für das gesamte oder einen Teil eines oder mehrerer immunogener Peptide kodieren, die mit der interessierenden Erkrankung assoziiert sind. Die Vaccine kann auch in Form eines Kulturüberstands aus Zellen vorliegen, die virale Partikel produzieren oder in Form einer Präparation von viralen Partikeln, die die interessierenden retroviralen Vektoren mit den interessierenden inserierten Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Bei Verwendung der Vaccine in Form einer Wirtszelle kann der erfindungsgemäße rekombinante retrovirale Vektor in scheinbar alle Säugerzellen eingebracht werden. Mittel, durch die der Vektor, der das Gen trägt, in eine Zelle eingebracht werden kann, umfassen in nicht begrenzender Weise Infektion oder andere an sich bekannte Verfahren (Sambrook et al. (Hrsg.) (1989), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York). Säugerzellen, die mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Retrovirus- Vektoren infiziert wurden und die das immunogene Protein exprimieren, können an Säuger verabreicht werden und dienen als Vaccine. Zellen, die das interessierende immunogene Protein exprimieren, können intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intraläsional oder subkutan verabreicht werden.
Weiterhin kann die Vaccine als eine Präparation von viralen Partikeln verabreicht werden. Virale Partikel, die die rekombinanten retroviralen Vektoren enthalten, können direkt an den Säuger über mehrere Wege verabreicht werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Exposition von Zellen gegenüber Virus ex vivo oder Injektion des Retrovirus in das betroffene Gewebe oder intravenöse Injektion. Alternativ können virale Partikel, die die vollständigen oder einen Teil der interessierenden Nukleinsäuresequenzen tragen, lokal durch direkte Injektion in einen betroffenen Bereich oder durch topische Aufbringung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden.
Beispiele von Säugern, an die das Vaccin verabreicht werden kann, umfassen in nicht begrenzender Weise Mäuse, Ratten, Hunde, nicht-menschliche Primaten und Menschen mit einer Familiengeschichte der interessierenden Erkrankung. Verwendungen in der Veterinärmedizin sind erfindungsgemäß umfasst.
Eine Vaccinierung kann in herkömmlicher Weise erfolgen. Die rekombinanten viralen Vektoren mit den Nukleinsäuresequenzen, die für das immunogene Protein kodieren, können auf einmal oder in periodischen Intervallen verabreicht werden, bis ein signifikanter Titer von Antikörper oder Immunzellen gegen das interessierende Immunogen-Protein produziert wird. Der Fachmann kennt die richtigen Immunoassays und andere Verfahren für einen Nachweis und eine Messung des Auftretens von Immunzellen gegen das interessierende Protein.
Der rekombinante retrovirale Vektor, der das Immunogen exprimiert, kann in einer reinen oder im wesentlichen reinen Form verabreicht werden. Weiterhin ist eine Verabreichung als pharmazeutische Zusammensetzung, Formulierung oder Präparation möglich.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, Formulierungen oder Präparationen für die Veterinärmedizin oder für eine Verwendung am Menschen können ein Immunogen wie vorstehend beschrieben zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen umfassen. Der (die) Träger müssen "verträglich" sein, in dem Sinne, dass sie mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sind und beim Empfänger keine schädliche Wirkung haben. Die Formulierungen können einfach in einer Einheit-Dosis-Form bereitgestellt werden und können durch alle bekannten Verfahren hergestellt werden.
Alle Verfahren umfassen den Schritt des Zusammenbringens des aktiven Bestandteils mit dem Träger, der einen oder mehrere akzessorische Bestandteile darstellt. Im allgemeinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, dass der aktive Bestandteil mit Flüssigträgern oder fein verteilten Festträgern oder beiden gleichmäßig und innig in Kontakt gebracht wird und sodann das Produkt, falls notwendig, in die gewünschte Formulierung gebracht wird.
Formulierungen, die für eine intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung geeignet sind, umfassen geeigneterweise sterile wässrige Lösungen des aktiven Bestandteils mit Lösungen, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch sind. Derartige Formulierungen können einfach durch Lösen von festen aktiven Bestandteilen in Wasser mit physiologisch verträglichen Substanzen wie Natriumchlorid (z. B. 0,1-2,0 M), Glycin und ähnlichem und einem gepufferten ph, der mit physiologischen Zuständen kompatibel ist, für die Herstellung einer wässrigen Lösung und Sterilisieren dieser Lösung hergestellt werden. Diese können in Einheits- oder Vielfachdosis-Behältnissen, z. B. verschlossenen Ampullen oder Gefäßen, vorliegen.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können einen Stabilisator enthalten. Beispielhafte Stabilisatoren sind Polyethylenglykol, Proteine, Saccharide, Aminosäuren, anorganische Säuren und organische Säuren, die alleine oder im Gemisch verwendet werden können. Diese Stabilisatoren werden vorzugsweise in einer Menge von 0,11-10 000 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil des Immunogens eingebaut. Falls zwei oder mehr Stabilisatoren verwendet werden sollen, liegt ihre Gesamtmenge vorzugsweise in dem vorstehend genannten Bereich. Diese Stabilisatoren werden in wässrigen Lösungen bei einer geeigneten Konzentration und einem geeigneten ph-Wert eingesetzt. Der spezifische osmotische Druck derartiger wässriger Lösungen beträgt im allgemeinen 0,1-3,0 Osmole, vorzugsweise 0,8-1,2. Der ph-Wert der wässrigen Lösung wird auf einen Bereich von 5,0-9,0 eingestellt, vorzugsweise auf einen Bereich von 6-8. Bei der Formulierung des erfindungsgemäßen Immunogens kann ein Anti- Adsorptionsmittel verwendet werden.
Nach einer Immunisierung kann die Wirksamkeit der Vaccine durch Herstellung von Antikörpern oder Immunzellen bewertet werden, die das Antigen erkennen, wie bewertet durch bekannte Verfahren. Falls der zu immunisierende Säuger bereits an der interessierenden Erkrankung erkrankt ist, kann die Vaccine in Verbindung mit anderen therapeutischen Behandlungen verabreicht werden.
Der Fachmann kennt die Parameter für die Bestimmung des richtigen Titers von zu verabreichenden Partikeln. Die Menge des zu verabreichenden rekombinanten retroviralen Vektors oder des Virus mit der gesamten oder einem Teil der Nukleinsäuresequenz, die für das interessierende immunogene Protein kodiert, das verabreicht werden soll, kann auf dem Titer von Viruspartikeln basieren. Die Menge an zu verabreichendem Virus ist keineswegs auf eine bestimmte Konzentration begrenzt und kann in Abhängigkeit von dem zu heilenden Lebewesen variieren. Basierend auf den klinischen Parametern wird der behandelnde Arzt die therapeutisch wirksame Menge des Virus, das das interessierende Gen enthält, für eine Verabreichung an ein bestimmtes Lebewesen bestimmen. Eine derartige Therapie kann so oft wie nötig und für einen Zeitraum verabreicht werden, der von dem behandelnden Arzt als notwendig erachtet wurde. Die hier beschriebenen therapeutischen Verfahren können alleine oder in Verbindung mit weiteren bekannten Therapien für die Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines Zustands bei einem Säuger eingesetzt werden.
Alle Bücher, Artikel oder Patente, die hier zitiert sind, sind durch ein Zitat einbezogen. Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen verschiedene erfindungsgemäße Aspekte, sind jedoch nicht begrenzend zu verstehen.

Beispiel 1

Das amphotrope MLV env-Protein fügt sich wirksam mit RSV-gag-Proteinen zusammen

Um direkt die Fähigkeit eines Zusammenbaus von RSV gag und MLV env zu untersuchen, wurde ein Komplementationstest entwickelt, bei dem gag-Proteine von RSV und die Hüll- Glycoproteine von MLV transient in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEFs), die von EVO-Hühnerembryonen abgeleitet waren, exprimiert wurden (Astrin et al. (1979), Nature 282: 339-341; vgl. auch Hughes und Kosik (1984), Virology 136: 89-99, Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012). Die in diesem Experiment und in den anderen Beispielen verwendeten CEFs wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, GIBCO BRL, MD), supplementiert mit 5% fötalem Rinderserum, 5% Serum von neugeborenen Kälbern, 10% Tryptose- Phosphat-Nährmedium (GIBCO BRL), 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin, gehalten.

Herstellung der Plasmide

Zwei Plasmide, RSVgagpol (das den gag-pol-offenen Leserahmen enthält, der von dem retroviralen Vektor RCASBP(A) abgeleitet ist (Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 69: 3728-3737)) und MLVenv (das eine Region trägt, die für das Signalpeptid, das Oberflächen-Glycoprotein gp70 und das Transmembtan-Protein p15E eines amphotropen MLV (Klon 4070A) kodiert) (Fig. 2A) wurden gemäß Standardverfahren hergestellt (vgl. Sambrook et al. (Hrsg.) (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York). Rekombinante Klone wurden in E. coli DH5α isoliert.
Das Plasmid RSVgagpol wurde wie folgt hergestellt: Plasmid-DNA RCASBP(A) (Petropoulos und Hughes (1991), J. Virology 69: 3728-3737) wurde durch die Restriktionsendonukleasen SacI und XbaI (Fig. 1 A) gespalten und das Fragment mit der vollständigen gag-Region und dem 3'-Ende von pol isoliert. In einer getrennten Reaktion wurde RCASBP(A) mit XhoI gespalten. Die XhoI-Enden wurden mit Hilfe von T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und die DNA sodann mit XbaI gespalten. Das XbaI-XhoI (stumpf)-Fragment mit dem 3'-Ende des offenen Leserahmens von pol wurde isoliert. Die SacI-XbaI- und XbaI-XhoI (stumpf)-Fragmente wurden in Gegenwart von pBluescript KS II-DNA ligiert, die mit SacI und EcoRV gespalten worden war. Das resultierende Plasmid, pT7gagpol, enthielt die gesamte gag pol- Region, flankiert von einzelnen SacI- und ClaI-Stellen. RCASBP(A) wurde mit SacI und ClaI gespalten, um die gag-pol-env-Region zu entfernen und das SacI-ClaI-Fragment aus pT7gagpol wurde inseriert.
Für die Herstellung des Plasmids MLVenv wurde die env-kodierende Region des amphotropen MLV aus dem Plasmid pR4070A (Ott et al. (1990), J. Virology 64: 757-766, Ott et al. (1992), J. Virology 66: 4632-4638) (freundlicherweise von Alan Rein, ABL-Basic Research Program bereitgestellt) mit dem Vorwärtsprimer AMPH-F (AAAAGAGCTCGGCCGACACCCAGAGTGGAC), der unmittelbar stromaufwärts des env- Inititiationskodons liegt, und dem reversen Primer AMPH-R (AAAAGAGCTCTCATGGCTCGTACTCTATGGGTT), der sich über das env-Terminationskodon erstreckt, PCR-amplifiziert. Die resultierenden SacI-Erkennungsstellen wurden in die 5'-Enden beider Primer eingebaut. Das PCR-Produkt wurde mit SacI gespalten und in den Vektor TFA-NEO (Federspiel et al. (1989), J. Virology 173: 167-177) inseriert, was MLVenv ergab. Dieses Konstrukt exprimiert das amphotrope env-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des RSV-LTR.

Transfektion von Zellen und Herstellung von Viruspartikeln

Die Plasmide RSVgagpol und MLVenv wurden in CEFs durch getrennte Transfektion und Transfektion in einem Gemisch eingebracht. Calciumphosphat-vermittelte Transfektion von Plasmid-DNA in CEFs erfolgte gemäß Standardverfahren (Graham und Van der Eb (1973), J. Virology 52: 456-467). Präzipitate mit 10 ug DNA pro 10 mm-Platte wurden mit sub-konfluenten CEF-Monolayern 6 Stunden bei 37ºC inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit dem Medium mit 15% Glycerin für 5 Minuten bei 37ºC. Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in Wachstumsmedium 24 Stunden inkubiert. Falls notwendig, wurden die transfizierten Zellen passagiert, um eine Verteilung des Virus in der Kultur zu erlauben.
Virus-enthaltende Kulturflüssigkeit wurde sodann geerntet. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Kulturmedium geerntet und virale Partikel durch Ultrazentrifugation gewonnen. Für die Herstellung von Viruspartikeln wurde Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt und das Virus in einem SW41-Rotor (Beckman) mit Hilfe eines 15%-Sucrose-Kissens bei 35 000 Upm 1 Stunde bei +4ºC gefällt. Der entstehende Niederschlag wurde in Protein-Probepuffer resuspendiert und 4 Minuten bei 100ºC vor Beladen eines Gels erhitzt.

Immunoblot-Analyse

Virale Proteine wurden durch Elektrophorese in einem 4-20% Gradienten-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran (BA85, Schleicher & Schuell, NH) elektro-geblottet. RSV- Matrixprotein wurde durch Inkubation mit Kaninchen-Antiserum gegen p 19 (MA) (freundlicherweise von Volker Vogt, Cornell University, bereitgestellt) nachgewiesen. MLV-Hüll-Glycoproteine wurden mit Ziegen-Antiserum gegen gp70 (SU) nachgewiesen. Proteinbanden wurden mit Hilfe des verstärkte Chemilumineszenz (ECL)-Nachweissystems (Amersham) dargestellt.
Die Immunoblotting-Analyse (Fig. 2B) zeigte, dass das MLVenv-Plasmid bei einem Einbringen in CEFs Oberflächen-Glycoproteine exprimiert, die auf einer Zellmembran verankert sind und durch Immunoblotting in einer Membran-Proteinfraktion (Daten nicht gezeigt) nachgewiesen werden können, jedoch nicht in das Medium sekretiert werden (Fig. 2B, Spuren 1 und 2). Eine Transfektion von RSVgagpol führt zu einer Synthese von Kapsid-Proteinen, die sich in Virusähnliche Partikel zusammenfügen, die durch Ultrazentrifugation gewonnen werden können (Fig. 2B, Spuren 3 und 4). Mehr als eine Bande wurde durch die anti-p19-Antikörper nachgewiesen. Da RSV-MA an mehreren Positionen phosphoryliert wird, stellen die zusätzlichen Banden, die gewöhnlich auf Immunoblots erkannt werden, offensichtlich Proteine mit einem verschiedenen Grad an Phosphorylierung dar (Burstein et al. (1992), J. Virology 66: 1781-1785).
Eine Co-Transfektion von RSVgagpol und MLVenv verursacht die Co-Expression von Kapsid- und Hüllproteinen in der gleichen Zelle. Eine Immunoblotting-Analyse zeigt, dass RSV gag und MLV env in den Partikeln auftreten, die bei einer Co-Transfektion produziert werden (Fig. 2B, Spuren 5 und 6), was nahe legt, dass pseudotypisierte Virionen gebildet werden.
Diese Daten zeigen, dass die Hülle des amphotropen MLV wirksam mit einem RSV-Virion assoziieren kann, falls eine kompetitierende RSV-Hülle nicht vorhanden ist.

Beispiel 2

Der rekombinante retrovirale Vektor RCAS-M(4070A)

Herstellung von RCAS-M(4070A)

Im Hinblick auf die scheinbare Wirksamkeit, mit der das MLV-Hüllprotein sich mit RSV-gag zusammenfügt, wurde ein rekombinantes RSV-Genom hergestellt, bei dem das Envelope-Gen in dem parentalen Virus durch das env-Gen eines amphotropen MLV ersetzt wurde. Um den wirksamen intrazellulären Transport des Envelope-Vorläufers und die Abspaltung des Signalpeptids in Vogelzellen sicherzustellen, wurde ein chimäres env-Gen hergestellt, bei dem eine für ein reifes MLV-gp70 kodierende Sequenz mit dem Envelope-Signalpeptid von RSV fusioniert wurde. Für RSV-env kodierende Sequenzen wurden entfernt und die für die chimäre Hülle kodierende Region, einschließlich eines neuen Stoppkodons, wurde inseriert, was den rekombinanten retroviralen Vektor RCAS-M(4070A) ergab.
Der rekombinante retrovirale Vektor RCAS-M(4070A) wurde wie folgt hergestellt. Zuerst wurde ein EcoRI-Fragment von RCASBP(A), das sich über das 3-Ende des RSV-env-Gens und das U3R-Segment des 3'-LTR erstreckt, in pUC19 subkloniert, wodurch pUCenvRI enstand (Fig. 1B). Das Terminationskodon für env wurde durch eine NotI-Stelle mit Hilfe von Stellen-gerichteter Mutagenese ersetzt. Klone mit mutanten Plasmiden mit der NotI-Stelle wurden in Escherichia coli BMH 71-18 mutS (Clontech) vermehrt und durch NotI-Spaltung selektiert. Das resultierende Konstrukt wurde pUCenvRINOT genannt (Fig. 1B).
Das env-Gen von RCASBP(A) wurde durch dasjenige mit der NotI-Stelle ersetzt. RCASBP(A) wurde mit KpnI und ClaI gespalten und das die env-Region enthaltende Fragment entfernt. Die env-Region mit der einzelnen NotI-Stelle wurde durch Ligation eines KpnI- EcoRI-Fragments von RCASBP(A) und dem EcoRI-ClaI-Fragment von pUCenvRINOT mit RCASBP(A), das mit KpnI und ClaI gespalten worden war, ligiert, was das Plasmid RCASBP(A)NOT ergab (Fig. 1B).
Überlappungsverlängerung, Horton et al. (1990), Biotechniques 8: 528-535, wurde für die Herstellung eines chimären amphotropen env-Gens verwendet, bei dem die für das N-terminale Signalpeptid von MLV kodierende Sequenz durch die entsprechende Sequenz aus dem RSVenv-Gen ersetzt war. Ein Fragment, das sich über die einzelne KpnI-Stelle, die env-Splice- Akzeptor-Stelle und das Signalpeptid erstreckt, wurde aus RCASBP(A) mit Hilfe der Primer RSV-FOR (GGACGAGGTTATGCCGCTGTG) und RSV-BACK (ACATTAAAGACCTGATGGGGGCTAACATCAGCTCTTACCCCCGTAA) durch PCR amplifiziert (Fig. 1B). Das Fragment, das mit dem Kodon für den ersten Serinrest des reifen gp70 startet und den gesamten offenen Leserahmen von env überspannt, gefolgt von der einzelnen NotI-Stelle, wurde aus pR4070A mit den Primern MLV-FOR (AGCCCCCATCAGGTCTTTAATGT) und MLV-BACK (AGCGGCCGCTCATGGCTCGTACTCTATGGGTT) (der Primer MLV-FOR überlappte mit RSV-BACK) amplifiziert. Diese beiden Fragmente wurden fusioniert und ein Produkt mit den Primern RSV-FOR und MLV-BACK durch PCR amplifiziert. Das resultierende PCR- Produkt, das ein chimäres env-Gen enthielt, wurde mit KpnI und NotI gespalten. Das env-Gen wurde aus RCASBP(A)NOT durch Spaltung mit KpnI und NotI entfernt und ein chimäres KpnI-NotI-Fragment inseriert, was das endgültige Plasmid RCAS-M(4070A) ergab. Die richtige Sequenz der Region, die die Verbindung zwischen RSV- und MLV env-Sequenzen enthält, wurde durch Sequenzierung mit Hilfe des Sequenase-Sequenzier-Kits (USB, OH) bestätigt. Die Struktur von RCAS-M(4070A) ist schematisch in Fig. 3A gezeigt.

Herstellung von rekombinanten viralen Partikeln durch RCAS-M(4070A)

Um die Expression eines chimären env-Gens in Verbindung mit einem RSV-Genom und die Fähigkeit des Vektors zu testen, Partikel zu produzieren, die die Oberflächen-Glycoproteine von MLV eingebaut hatten, wurden CEFs mit RCAS-M(4070A)-DNA, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert. CEFs, die mit dem pR4070A transfiziert worden waren, dem molekularen Klon des amphotropen MLV, von dem das MLV nv-Gen abgeleitet war, dienten als Positivkontrolle. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Zellkulturmedium geerntet und virale Partikel durch Ultrazentrifugation, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Wie in Fig. 3B zu erkennen, schaffen CEFs, die mit RCAS-M(4070A) transfiziert wurden, Partikel, die das MLV-Oberflächen-Glycoprotein enthalten (Spuren 1 und 2). Spuren 3 und 4 von Fig. 3B enthalten die viralen Kontrollpartikel aus den Zellen, die mit dem amphoteren MLV transfiziert worden waren. Der Einbau von gp70 in durch RCAS-M(4070A) produzierte Partikel erschien ungefähr so effizient wie der Einbau in MLV-Virionen (vgl. Spuren 1 und 2 mit den Spuren 3 und 4).

Replikation von RCAS-M(4070A) in CEFs

Nachdem gezeigt worden war, dass der rekombinante retrovirale Vektor RCAS-M(4070A) chimäre virale Partikel produzierte, wurde seine Fähigkeit zur Replikation in CEFs gemessen. CEF-Zellen wurden mit RCAS-M(4070A)-DNA wie in Beispiel 1 beschrieben transfiziert und passagiert, um eine Verteilung des Virus zu erlauben. Insgesamt erfolgten sechs Passagen. Bei den Passagen 1, 4 und 6 wurde eine kleine Anzahl von Zellen getrennt ausplattiert und die Fähigkeit des Virus für eine Ausbreitung durch Färbung von CEFs durch die Antikörper, die mit exprimiertem gp70 reagieren, gemessen.
Der indirekte Immunofluoreszenz-Mikroskopietest erfolgte wie folgt. Mit RCAS-M(4070A) infizierte CEFs wurden auf Glas-Objektträgern vermehrt. Zellen wurden mit Methanol fixiert, mit anti-gp70-Ziegenserum (1 : 200 in PBS-1% Rinderserumalbumin verdünnt) zur Reaktion gebracht, dreimal 5 Minuten mit PBS mit 0,1% Triton X-100 gewaschen und mit Fluorescein- Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem-Kaninchen-anti-Ziege-Sekundärantikörper inkubiert. Photomikroskopie mit Hilfe eines Nikon Microphot-FXA-Mikroskops (Nikon Inc., Melville, NY) wurde eingesetzt. Wie in Fig. 4A gezeigt, sind anfänglich nur eine kleine Anzahl positiv gefärbter Zellen zu erkennen (Passage 1). Diese Anzahl erhöht sich signifikant bei der Passage 4 und bei der Passage 6 sind scheinbar alle Zellen infiziert und exprimieren gp70.
Für eine Überwachung der Produktion von Viruspartikeln wurde Zellkulturmedium bei jeder Passage geerntet und Partikel durch Ultrazentrifugation, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die viralen Partikel wurden durch Immunoblotting mit den Antikörpern gegen p19 und gp70, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Menge an viralen Proteinen in dem Überstand erhöht sich bei der Passage 4 und erreicht eine große Menge bei der Passage 6 (vgl. Fig. 4B). Die Fähigkeit von RCAS-M(4070A), sich in der CEF-Kultur auszubreiten, ist mit den Ausbreitungsgeschwindigkeiten vergleichbar, die bei dem parentalen Vektor RCASBP(A) gemessen werden.
Die Daten zeigen, dass das chimäre Retrovirus in Vogelzellen bei Geschwindigkeiten repliziert, die vergleichbar mit dem ursprünglichen, auf RSV basierenden, retroviralen Vektor sind. Die Partikel von RCAS-M(4070A), die nach Transfektion in CEFs geschaffen werden, enthalten etwa die gleiche Menge des gp70 wie Partikel des amphotropen MLV und können Säugerzellen infizieren. Zusammenfassend legen diese Daten nahe, dass die anfängliche Assoziierung der RSV gag- und der env-Proteine des amphotropen MLV wirksam genug ist, um einen Zusammenbau der infektiösen Virionen zu ermöglichen. Tabelle 1. Titer von RCAS-M(4070A)Puro auf Säugerzellen

Gentransfer in Säugerzellen durch RCAS-M(4070A)

Um die Fähigkeit von RCAS-M(4070A)-viralen Partikeln zu zeigen, Säugerzellen zu infizieren und in diese Gene zu transferieren, wurde das Markergen pac, das eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Puromycin verleiht (de 1a Lung et al. (1988), Gene 62: 121-126, Vara et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14: 4617-4624), in die ClaI-Spaltstelle stromabwärts des env- Gens und des Splice-Akzeptors eingebracht, um den Vektor RCAS-MC(4070A)Puro herzustellen.
Um eine Klonierung in RCAS-M(4070A) zu erleichtern, wurde eine stille Pumktmutation für die Eliminierung der ClaI-Stelle in der amphotropen env-Region verwendet. Sie wurde durch Stellen-gerichtete Mutagenese eingebracht. Das KpnI-NotI-Fragment von RCAS-M(4070A) wurde zuerst in pBluescript KS II für eine Mutagenese subkloniert. Mutierte Klone, die durch ClaI-Spaltung selektiert wurden, wurden in Escherichia coli BMH 71-18 mutS vermehrt. Die env-Region in RCAS-M(4070A) wurde durch das mutierte KpnI-NotI-Fragment ersetzt, wodurch der Vektor RCAS-MC(4070A) entstand.
Für die Herstellung von RCAS-MC(4070A)Puro wurde das Puromycin-Resistenzgen (pac) durch PCR aus dem Plasmid pSVpac (de 1a Lung et al. (1988), Gene 62: 121-126; Vara et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14: 4617-4624) mit Primern, die NcoI- und Hindlil-Stellen an die 5'- bzw. 3'-Enden von pac anfügten, durch PCR amplifiziert. Das Produkt wurde sodann in das Adaptor-Plasmid Cla12Nco kloniert (Hughes et al. (1987), J. Virology 61: 3004-3012). Das pac-Gen wurde aus dem Adaptor-Konstrukt als ClaI-Fragment isoliert und in RCAS- MC(4070A) eingebracht.
CEFs wurden mit RCAS-MC(4070A)Puro, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert und sechsmal passagiert. Virus-enthaltende Kulturflüssigkeit wurde für die Infektion frischer Zellen verwendet, die zwei weitere Male passagiert wurden. Das resultierende Virus wurde auf Mäusezellen (NIH 3T3), menschlichen (HeLa) Zellen und D17-Hundenierenzellen titriert. Die Titration auf Säugerzellen erfolgte wie folgt. Virus-enthaltende Kulturflüssigkeit wurde geerntet und durch eine 0,45 um-Membran filtriert. Wirtszellen wurden auf 60 mm-Platten (5 · 10&sup5; Zellen pro Platte) ausplattiert und über Nacht vermehrt. Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen der retroviralen Vektor-Stammlösungen in Gegenwart von Polybren (10 ug/ml) 24 Stunden infiziert, trypsinisiert und auf Selektivmedium mit G418 (400 ug/ml, GIBCO BRL) oder Puromycin (2,5 ug/ml, Sigma) ausplattiert. 10 Tage später wurden Kolonien, die sich aus resistenten Zellen entwickelten, mit Methanol fixiert, mit Giemsa-Färbung gefärbt und gezählt. In manchen Experimenten wurden einzelne Kolonien isoliert und zu Zelilinien für eine weitere Analyse vermehrt.
Puromycin-resistente Kolonien von D 17-Zellen, die durch Infektion der Zellen mit den seriellen Verdünnungen von RCAS-MC(4070A)Puro hergestellt worden waren, sind in Fig. 5 gezeigt.
Tabelle 1 zeigt, dass RCAS-MC(4070A)Puro zu einer Infektion aller getesteter Säugerzellen bei hohen Titern fähig war. Der Titer von RCAS-MC(4070A)Puro auf D 17 (Hunde)-Zellen war etwa eine Größenordnung höher als der Titer auf NIH 3T3 (Maus)- oder HeLa (Mensch)- Zellen. Die veränderliche Wirksamkeit, mit der RCAS-MC(4070A)Puro diese Zellen infiziert, konnte den Unterschieden in der Dichte des amphotropen Rezeptors auf der Oberfläche von Säugerzellen von verschiedenen Geweben und Spezies zugerechnet werden.

Replikation und Infektiösität von RCAS-M(4070A)NEO

Zusätzlich wurde das Markergen neo in RCAS-M(4070A) eingebracht. Der resultierende Vektor, RCAS-M(4070A)NEO (Fig. 6A) wurde für die Infektion und den Gentransfer in Säugerzellen verwendet. RCAS-M(4070A)NEO wurde wie folgt hergestellt: Das ClaI-Fragment mit dem neo-Gen wurde aus RCASBP(A)NEO isoliert und in die ClaI-Stelle von RCASBP(A)NOT kloniert. Das chimäre env-Gen wurde in dieses Plasmid als KpnI-NotI- Fragment eingebracht.
CEFs wurden mit RCAS-M(4070A)NEO, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert und virale Stammlösungen, die 24 Stunden nach Transfektion hergestellt wurden, wurden auf Mäuse-NIH 3T3- und menschlichen HeLa-Zellen, wie vorstehend beschrieben, titriert. Das durch die transiente Expression von RCAS-M(4070A)NEO in CEFs erhaltene Virus wies einen Titer von 2-3 · 10³ koloniebildenden Einheiten (cfu/ml) auf beiden Zeillinien auf. Aus den G418r-Klonen isolierte genomische DNA wurde durch Southern Blot-Hybridisierung analysiert. Zellen wurden mit RCAS-M(4070A)NEO infiziert und G418r-Klone wurden selektiert. Ihre genomische DNA wurde mit EcoRI und BamHI gespalten. Fragmente wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf geladene Nylonmembran gebracht und mit Digoxygenin-markierter EcoRI-gespaltener RCAS-M(4070A)NEO-DNA hybridisiert. Membranen wurden mit alkalische Phosphatase-konjugiertem anti-Digoxygenin-Antikörper inkubiert und banden mit Hilfe von Lumi-Phos 530-Reagenz nachgewiesen. Wie in den Fig. 6B und C gezeigt, enthielt die Mehrzahl der G418r-Klone, die von NIH 3T3- und HeLa-Zellen abgeleitet waren, Provirus, das von RCAS-M(4070A)NEO strukturell nicht unterscheidbar war.
Die transfizierten CEFs wurden passagiert und das produzierte Virus für die Infektion frischer CEFs und von Säugerzellen verwendet. Durch Immunoblotting-Analyse der viralen Partikel, die bei jeder Passage gesammelt wurden, wurde bestimmt, dass das Virus ziemlich wirksam in CEFs replizierte. Jedoch verringerte sich die Fähigkeit, neor in NIH 3T3-Zellen zu transferieren, relativ schnell (Tabelle 2) und war mehrere Größenordnungen niedriger als der Titer von RCAS-M(4070A)Puro bei einer ähnlichen Passage (vgl. Tabelle 1 und Tabelle 2). Die Sequenzierung der proviralen DNA, wie in Beispiel 5 beschrieben, zeigte, dass das neo-Gen etwas instabil im Verbund mit dem amphotropen env-Gen war und spezifisch, dass eine Reihe von Proviren an Deletionen litten, an denen die Splice-Akzeptor-Stelle, das Initiationskodon und das 5'-Ende des neo-Gens beteiligt war.
Es scheint, dass der Unterschied in der Stabilität zwischen den neo- und pac-Selektionsmarkern keine Funktion des Vektors, sondern vielmehr ein Maß der relativen Cytotoxizität dieser Marker auf die Wirtszelle ist. Es scheint unwahrscheinlich zu sein, dass das neo-Insert eine viel größere Tendenz für eine Umordnung besitzt, da dies implizieren würde, dass es bestimmte bevorzugte Stellen für eine Umordnung in dem neo-Insert gibt. Jedoch waren die neo-Deletionen, die analysiert wurden, alle unterschiedlich.

Tabelle 2. Titer von RCAS-M(4070A)NEO auf NIH 3T3-Zellen

Virus Titer, cfu/ml
24 Stunden nach Transfektion 2,6 · 10³
Virus-Passage 1 10¹
Virus-Passage 2 10¹
Virus-Passage 3 5 · 10²

Beispiel 3

Das Transmembran-Protein p15E wird in RCAS-M(4070A)-Partikeln richtig prozessiert

Bei den Mäuse-Leukämieviren wird der env-Vorläufer anfänglich durch eine zelluläre Protease in gp70 (SU) und prä-p15E (TM) gespalten. Nach dem Freisetzen des Viruspartikels aus der Zelle entfernt die virale Protease die 16 C-terminalen Reste aus der cytoplasmatischen Domäne von prä-p15E, was das reife p15E und p2E ergibt (Rein et al. (1994), J. Tlirology 68: 1773-1781). Diese Spaltung aktiviert die Membranfusionsfähigkeit des env-Proteins und ist für die virale Infektiösität essentiell.
Virionen, die von mit RCAS-M(4070A) infizierten Zellen produziert werden, enthalten keine MLV-Protease. Jedoch ist das chimäre Virus infektiös, was nahe legt, dass prä-p15E gespalten wird. Virale Partikel wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und die Proteine auf 16% SDS-PAGE fraktioniert und durch Immunoblotting mit Kaninchen-Antiserum gegen pl5E (Geschenk von Alan Rein) analysiert (Fig. 7). Die Daten zeigen, dass die durch RCAS- M(4070A) gebildeten chimären Viruspartikel das prozessierte p15E enthalten, obwohl die MLV-Protease nicht vorhanden ist. Das Transmembran-Protein, das in den RCAS-M(4070A)- Partikeln prozessiert, scheint genauso wirksam wie in den Wildtyp-MLV-Virionen zu sein (vgl. Spuren 1 "MLV" und 3 "RCAS-M(4070A)" von Fig. 7), was nahe legt, dass entweder die RSV-Protease oder die Protease der Vogelzellen wirksam prä-p15E prozessieren kann.

Beispiel 4

Viruspartikel werden nicht von mit RCAS-M(4070A) infizierten Säugerzellen produziert

Jüngere Untersuchungen zeigten die Entwicklung der Lymphome in nicht-menschlichen Primaten nach einem Gentransfer als Ergebnis einer Infektion und Ausbreitung des Replikationskompetenten Helfer-MLV, das in den retroviralen Vektor-Stammlösungen auftrat (Donahue et al. (1992), J. Exp. Med. 176: 1125-1135; Vanin et al. (1994), J. Virology 68: 4241-4250). Dies zeigt die wichtige Stellung der Sicherheit eines retroviralen Vektors. Einer der Vorteile bei der Verwendung von auf Vogel-Retrovirus basietenden Vektoren in einem Säugerzellsystem ist, dass die mit RSV transfizierten oder infizierten Säugerzellen keine infektiösen viralen Partikel produzieren (Federspiel et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 11241-11245) und daher kann der Vektor sich in dem Säugerwirt nicht ausbreiten. Die Unfähigkeit von RSV, eine vollständige genomische RNA zu synthetisieren oder in das Cytoplasma zu exportieren (Berberich et al. (1990), Virology 64: 4313-4320; Knight et al. (1993), J. Gen. Virology 74(P112): 2629-2636; Quintrell et al. (1980), J. Mol. Biol. 143: 363-393), sowie sein Unvermögen, gag-Vorläufer- Protein in Säugerzellen zu prozessieren (Vogt et al. (1982), J. Tlirology 44: 725-730), wurden für die möglichen Defekte gehalten, die die Synthese der strukturellen Proteine des Virus und die Produktion der Viruspartikel verhindern.
Für eine Bestimmung, ob die durch RCAS-M(4070A) infizierten Säugerzellen Viruspartikel herstellen, wurden frische NIH 3T3-Zellen mit den Überständen verschiedener NIH 3T3/RCAS-M(4070A)NEO-Klone, die nicht-umgeordnete Proviren tragen, infiziert. Die Zellen wurden sodann einer G418-Selektion unterzogen. Keine G418-resistenten Kolonien wurden nachgewiesen. Dieser sensitive Test zeigte, dass keine infektiösen viralen Partikel durch die Mäuse-NIH 3T3-Zellen produziert wurden, die nicht-umgeordnetes RCAS- M(4070A)NEO-Provirus enthalten. Zusätzlich wurde dieses Experiment unter Verwendung von RCAS-M2(4070A)Puro für eine Infektion von NIH 3T3-Zellen wiederholt. Wiederum wurden keine viralen Partikel nachgewiesen. Somit besitzt der auf RSV basierende Vektor RCAS-M(4070A), der inhärent in Säugerzellen replikationsdefizient ist, wesentlich verbesserte Sicherheitsmerkmale, die für empfindliche Anwendungen wie die menschliche Gentherapie erforderlich sind.

Beispiel 5

Herstellung von RCAS-M2(4070A), ein schnell replizierender und stabiler Vektor

Anfänglich repliziert das chimäre Virus RCAS-M(4070A) bei einer merklich geringeren Geschwindigkeit als der parentale Vektor RCASBP(A). Tatsächlich waren nach der Transfektion von RCAS-M(4070A) in CEFs 3-4 Zellpassagen erforderlich, bevor nachweisbare Mengen des Virus produziert wurden. Jedoch infiziert das chimäre Virus nach 5-6 Passagen auf CEFs diese Zellen wirksam und breitet sich rasch in der gesamten Kultur aus.
Für eine Untersuchung der Möglichkeit, dass genetische Veränderungen in dem viralen Genom während dieser Phase einer anfänglichen langsamen Replikation dem chimären Virus die Anpassung und das effizientere Wachstum erlaubten, wurden die env-Regionen von molekularen Klonen des RCAS-M(4070A)-Provirus mit dem neo-Markergen (RCAS- M(4070A)NEO) sequenziert.

Klonierung von RCAS-M(4070A)NEO-Provirus

RCAS-M(4070A)NEO-Provirus wurde wie folgt kloniert. DNA mit einem niedrigen Molekulargewicht wurde aus mit RCAS-M(4070A)NEO infizierten CEFs bei der Passage 3 durch das Extraktionsverfahren von Hirt isoliert (Hirt (1967), J. Mol. Bio. 26: 365-369). Die DNA mit einem niedrigen Molekulargewicht wurde mit der Restriktionsendonuklease SacI gespalten, mit dem SacI-gespaltenen Vektor λZAP Express (Stratagene, CA) ligiert und mit Hilfe des GigaPack II Gold-Verpackungsextrakts (Stratagene, CA) verpackt. Eine Bibliothek von 4,7 · 10&sup6; unabhängigen Klonen wurde durch Hybridisierung mit einer ³²P-markierten, für amphotropes env spezifischen Sonde (SaII/CIaI-Fragment, abgeleitet von pR4070A) gescreent. Positive Phagenklone wurden durch Co-Infektion mit ExAssist-Helferphage (Stratagene, CA) in Plasmide umgewandelt. Diese Klone wurden als enyl, env3, env6, env8 und env9 bezeichnet. RCAS-M(4070A)NEO-provirale DNA in den resultierenden Pläsmidklonen wurde durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen analysiert.

Sequenzierung der env-Regionen der RCAS-M(4070A)NEO-Proviren

Die env-Gensequenzen der RCAS-M(4070A)NEO-Provirus-Klone und des parentalen Plasmids RCAS-M(4070A)NEO wurden durch Zyklus-Sequenzierung beider Stränge mit Hilfe des PRISMTM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA) bestimmt. Die Sequenzierreaktionen wurden mit Hilfe des automatischen 373A DNA-Sequenzierers (Applied Biosystems, CA) analysiert. Die vollständigen Sequenzen der env-Gene wurden mit Hilfe der Sequencher-Software (Gene Codes Corporation, M1) zusammengefügt.
Ein begrenztes Spektrum von Mutationen in der env-Region der einzelnen proviralen Klone wurde nachgewiesen. Die Mutationen lagen primär in der zentralen und der C-terminalen Region der gp70-kodierenden Sequenz (Fig. 8). In allen Klonen waren zwei benachbarte Cytosine in der für gp70 kodierenden Region zu A und T mutiert, was zu einer Substitution von Pro an der Position 242 gegen Ile führt. Die gleiche Region des env-Gens in dem parentalen Plasmid RCAS-M(4070A)NEO besaß ein Prolin-Kodon an der Position 242, was somit bestätigt, dass die Pro242I1e-Mutation während der Passage des Vektors auf CEF ausgewählt worden war und nicht im Laufe der Vektor-Konstruktion erfolgte. Zusätzlich zu dieser Mutation wurden andere Substitutionen aufgefunden, einschließlich Lys308G1n (Klone enyl und env9), Ala310Gly (Klone env3 und env6) und Met446Leu (Klone env6 und env9). Manche Klone besaßen weitere Aminosäure-Veränderungen, die nur bei diesem Klon beobachtet wurden. Zusätzlich war bei dem Klon env3 die für das C-terminale Ende von gp70 kodierende Sequenz und fast das gesamte p15E deletiert.
Die Pro242Ile-Mutation scheint für eine wirksame Replikation von entscheidender Wichtigkeit zu sein, da sie in allen Klonen auftritt, die von passagiertem RCAS-M(4070A)NEO-Virus abgeleitet waren. Weiterhin ist diese Mutation alleine für eine dramatische Erhöhung der Wirksamkeit der Virus-Replikation ausreichend, da sie die einzige Mutation in dem env-Gen des Klons env8 ist, das Virus, das am wirksamsten in CEFs repliziert und das die höchsten Titer auf Säugerzellen produziert.
Der Austausch von Pro242 durch den ungeladenen Isoleucinrest könnte eine wichtige strukturelle Veränderung in gp70 andeuten, da Prolinreste häufig an Punkten von β-Schleifen liegen. Diese Veränderung könnte die Anpassung widerspiegeln, die für eine Erkennung von Vogel- und Säugertypen des amphotropen Rezeptors durch gp70 notwendig ist oder könnte alternativ die Interaktion zwischen dem RSV-Kapsid und dem env-Protein aus dem amphotropen MLV verstärken. Es ist auch möglich, dass die Mutation die Struktur und/oder Funktion der viralen RNA beeinflusst.
Der zelluläre Rezeptor von Säugern für amphotropes MLV wurde vor kurzer Zeit kloniert und charakterisiert (Miller et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 78-82; von Zeijl et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 1168-1172). Jedoch wurde das Gen für den amphotropen Rezeptor aus Vögeln nicht eindeutig identifiziert (von Zeijl et al. (1994), PNAS (U. S. A.) 91: 1168-1172). Eine Passagierung von RCAS-M(4070A) durch CEFs könnte die viralen Varianten selektieren, die eine erhöhte Affinität für den amphotropen Rezeptor aus Vögeln besitzen. Keine Mutationen wurden in der N-terminalen Hälfte von gp70, der Region, die das Wirtsspektrum zu bestimmen scheint (Ott und Rein (1990), J Virol. 64: 757-766; Ott und Rein (1992), J Virol. 66: 4632- 4638) oder in der hypervariablen Prolin-reichen Region beobachtet. Falls die Veränderung in gp70 die Affinität des Proteins für den Vogelrezeptor erhöht, beeinträchtigt sie nicht die Fähigkeit des Virus zur Infektion von Säugerzellen.

Herstellung von RCAS-M2(4070A)

Für die Herstellung einer "adaptierten" Version von RCAS-M(4070A), die ihren Nutzen aus den genetischen Veränderungen zieht, die in dem viralen Genom während der Phase der anfänglichen langsamen Replikation auftraten, wurden die als RCAS-M2(4070A)Purol, 6, 8 und 9 bezeichneten Vektoren hergestellt. Diese Vektoren enthalten die (gag pol)RSV-envMLV- Regionen, die von den Klonen enyl, env6, env8 und env9 von RCAS-M(4070A)NEO abgeleitet sind, anstelle der (gag pol)RSV-envMLV-Region von RCAS-M(4070A)Puro.
Für die Herstellung von RCAS-M2(4070A)Puro wurden DNA-Fragmente mit der (gagp00RSV-envMLV-Region aus den Plasmid-Klonen durch Spaltung mit SacI und NotI abgeleitet und mit der LTR-Puro-LTR-Kassette ligiert, die durch SacI/NotI-Spaltung von RCAS- MC(4070A)Puro erhalten worden war.
Die resultierenden RCAS-M2(4070A)Purol, 6, 8 und 9-Vektoren wurden in CEFs transfiziert und die Zellen für die Herstellung von Virus passagiert. Bei jeder Passage wurde die Produktion von viralen Partikeln durch Bestimmen der Virion-assoziierten RT-Aktivität quantifiziert und die Anzahl an Viren, die zur Infektion von Säugerzellen fähig waren, wurde durch Titrierung von D17-Zellen, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt.
Bestimmung der Virion-assoziierten RT-Aktivität erfolgte wie in Whitcomb et al. (1995), J. Virol. 69 : 6228-6238, beschrieben. Zusammengefasst wurden Viruspartikel aus der Kulturflüssigkeit durch Zenrifugation bei 14 000 Upm für 30 Minuten bei 4ºC gewonnen. Niederschläge wurden in RT-Puffer (50 mM Tris, pH 8,3, 60 mM NaCl, 12 nd4 NgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreit, 0,1% NP-40) mit oligo(dO) (5 ugg/ml), poly(rC) (10 ug/ml), dGTP (10 uM) und 10 uCl [cJ2P]dGTP (800 Cl/mmol), Amersham, IL) resuspendiert. Reaktionsgemische wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nukleinsäuren wurden durch Zugabe von 1 ml 10% Trichloressigsäure (TCA) gefällt, auf GF/C-Glas-Mikrofaserfiltern (Whatman, OR) gesammelt und mit 10% TCA und 95% Ethanol gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und in einem TriCarb 1500-Flüssigscintillations-Analysegerät (Packard) ausgezählt.
Wie in Fig. 9A gezeigt, sind die anfänglichen Replikationsgeschwindigkeiten der "adaptierten" Vektoren viel höher als die des parentalen Vektors, RCAS-M(4070A)Puro. Virus-Produktion ist bei der Passage 1 nachweisbar und erreicht ein Maximum bei den Passagen 3-4, was zu den anfänglichen Geschwindigkeiten der Replikation von RCASBP(A) ähnlich ist. Bei diesem Experiment konnte die Produktion des parentalen Vektors, RCAS-M(4070A)Puro, als "ehv (wt)" bezeichnet, nicht bis zur Passage 6 nachgewiesen werden. Die "adaptierten" RCAS-M2(4070A)Puro-Vektoren sind für Säugerzellen infektiös und zeigen signifikante Titer auf D17-Zellen (Fig. 9B). Das am schnellsten replizierende Virus (Klon env8) errreicht den maximalen Titer auf D 17-Zellen bei der Passage 2 (vgl. Fig. 9A und B).

Herstellung von RCAS-M2C(4070A)

Für eine Erleichterung der Klonierung in RCAS-M2(4070A) wurde die ClaI-Stelle in dem env-Gen von RCAS-M2(4070A)Puro (abgeleitet von dem Klon env8) durch Einbringen einer stillen Punktmutation mit Hilfe von Stellen-gerichteter Mutagenese, wie bei der Herstellung von RCAS-MC(4070A) in Beispiel 2 beschrieben, beseitigt. Die DNA des resultierenden Vektors RCAS-M2C(4070A)Puro wurde in CEFs, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert und die Zellen wurden passagiert. Bei jeder Passage wurde die Anzahl an Viruspartikeln, die fähig zur Infektion von Säugerzellen waren, durch Titration auf D 17-Zellen, wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert. Wie in Fig. 9C zu erkennen, repliziert RCAS-M2C(4070A)Puro wirksam in CEFs und der Titer einer Virus-Stammlösung, die bei jeder Passage produziert wird, ist zu dem Titer des RCAS-M2(4070A)Puro-Virus, von dem es abgeleitet war, gleich. Bei klinischen Anwendungen eines retroviralen Gentransfers sind der Titer und die Sicherheit des Vektors von entscheidender Bedeutung. Der Titer des RCAS-M2C(4070A)Puro-Vektors übersteigt 106 cfu/ml. Dieser Titer kann durch 2-3 Zellpassagen nach Transfektion von CEFs erhalten werden. Der Vektor ist nicht nur einfach zu verwenden und der Titer hoch, sondern der Vektor sollte auch ziemlich sicher sein. RSV-infizierte Säugerzellen produzieren keine infektiösen viralen Partikel und der Vektor kann sich nicht in dem Säugerwirt ausbreiten. Das Unvermögen von RSV, wirksam eine vollständige genomische RNA in das Cytoplasma zu exportieren (Berberich et al. (1990), J. Virol. 64: 4313-4320; Knight et al. (1993), J Gen. Virol. 74 (Pt 12): 2629-2636; Nasioulas et al. (1995), PNAS (USA.), im Druck; Quintrell et al. (1980), J. Mol. Biol. 143: 363-393), sowie seine Unfähigkeit, das gag-Vorläuferprotein in Säugerzellen zusammenzufügen, zu exportieren und zu prozessieren (Nasioulas et al. (1995), PNAS (U. S. A.), im Druck; Vogt et al. (1988), J. Virol. 44: 725-730) scheinen die Produktion von infektiösen Viruspartikeln zu verhindern. Für die Bestimmung, ob die durch RCAS- M(4070A)NEO infizierten Säugerzellen infektiöse Viruspartikel schaffen, wurden frische NIH 3T3-Zellen mit den Überständen mehrerer NIH 3T3/RCAS-M(4070A)NEO-Klone, die nicht-umgeordnete Proviren tragen, wie in Beispiel 4 beschrieben, infiziert. Nach G418- Selektion wurden keine G418-resistenten Kolonien nachgewiesen, was zeigt, dass die mit RCAS-M(4070A) infizierten Säugerzellen keine infektiösen Partikel produzieren. Keine infektiösen viralen Partikel wurden in den Mäuse-NIH 3T3-Zellen mit nicht-umgeordnetem RCAS-M(4070A)NEO-Provirus mit Hilfe der G418-Selektion, wie in Beispiel 4 beschrieben, nachgewiesen. Ähnliche Experimente erfolgten mit Hilfe von RCAS-M2(4070A)Puro für eine Infektion der Säugerzellen und keine Viruspartikel wurden in den infizierten Mäuse-NIH 3T3- Zellen nachgewiesen. Aufgrund seiner inhärenten Defizienz in den Säugerzellen scheint der auf RSV basierende Vektor RCAS-M2C(4070A) die Sicherheitsmerkmale zu besitzen, die für empfindliche Anwendungen wie die menschliche Gentherapie erforderlich sind.
Für die Zwecke der Verständlichkeit wurde die vorliegende Erfindung detailliert durch Veranschaulichung und Beispiele beschrieben. Jedoch ist es für den Fachmann offensichtlich, dass bestimmte Modifikationen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche möglich sind.

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure, umfassend:

a. wenigstens eine lange terminale Wiederholung (LTR), die von einem Vogel- Sarkom-Leukose-Virus (ASLV) abgeleitet ist;

b. eine erste Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus einer von ASLV abgeleiteten gag-Region;

c. eine zweite Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus einer von einem ASLV abgeleiteten po/-Region; und

d. eine dritte Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus einer von Mäuse-Leukämievirus (MLV) abgeleiteten Envelope-Region, wobei die dritte Sequenz für eine erhöhte anfängliche Replikation durch Mutation der Envelope-Region für die Kodierung eines Isoleucins an der Position 242 angepasst ist, und ein Protein kodiert, das zur Bindung an sowohl Vogel- wie auch Säugerzellen fähig ist, wobei ein diese Nukleinsäure tragendes Viruspartikel sowohl Vogel- wie auch Säugerzellen bei Titern von wenigstens 104/ml infizieren kann, das replikationskompetent in Vogelzellen, jedoch replikationsdefizient in Säugerzellen ist.

2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, ferner umfassend wenigstens eine vierte Nukleinsäuresequenz.

3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, ferner umfassend eine Restriktionsendonuklease- Stelle, die die Insertion einer weiteren Nukleinsäuresequenz ermöglicht.

4. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die LTR-, gag- und po/-Sequenzen von Rous- Sarkom-Virus (RSV) abgeleitet sind.

5. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Envelope-Sequenz eine chimäre Envelope-Sequenz ist, umfassend eine für das N-terminale Signalpeptid einer ASLV-env-Region kodierende Sequenz und eine Sequenz, die aus der kodierenden Region einer env-Sequenz eines amphotropen MLV ausgewählt ist.

6. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure RCAS-M2 (4070A) Puro 8 oder eine äquivalente Nukleinsäure mit den funktionellen Eigenschaften und Merkmalen dieser Nukleinsäure umfasst.

7. Virales Partikel, umfassend die Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 6.

8. Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und, falls gewünscht, einen Träger.

9. Wirtszelle, enthaltend ein virales Partikel gemäß Anspruch 7 und, falls gewünscht, einen Träger.

10. Verfahren zur Insertion wenigstens einer interessierenden Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, umfassend das Einbringen der Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 oder 6 in die Wirtszelle.

11. Verfahren zur Insertion wenigstens einer interessierenden Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, umfassend die Infektion der Wirtszelle mit dem viralen Partikel gemäß Anspruch 7.

12. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 6 als Arzneimittel.

13. Virales Partikel gemäß Anspruch 7 als Arzneimittel.

14. Transgenes, nicht-menschliches Tier, wobei wenigstens eine Zelle die Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 6 enthält.

15. Verwendung der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 6 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die somatische Gentherapie.

16. Verwendung des viralen Partikels gemäß Anspruch 7 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die somatische Gentherapie.

17. Verwendung einer Wirtszelle gemäß Anspruch 8 oder 9 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die somatische Gentherapie.