CN104558179A - 用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Rα抗体 - Google Patents

用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Rα抗体 Download PDF

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Abstract

本申请涉及用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Rα抗体。具体而言，本申请提供了针对人类IL-3Rα链的抗体，其不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但是不结合人类IL-3Rα链的C结构域；用于预防或治疗血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在对象的骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述组合物的特征在于包含人类IL-3Rα抗体作为活性成分；以及用于治疗血液肿瘤的方法，在所述血液肿瘤中在骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述方法的特征在于包含向对象给药包含人类IL-3Rα抗体作为活性成分的组合物。

Description

用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Rα抗体
本申请是国际申请日2010年4月27日、国际申请号PCT/JP2010/057510于2011年12月20日进入中国国家阶段、申请号201080027383.1、发明名称“用于治疗血液肿瘤的抗IL-3RA抗体”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及针对人类IL-3Rα蛋白(另一个名称：人类CD123)的抗体。本发明还涉及用于髓细胞恶性肿瘤、特别是急性骨髓性白血病(AML)的治疗药剂和诊断药剂，其包含人类IL-3Rα抗体作为活性成分的发明。
发明背景
关于恶性肿瘤：
在日本，恶性肿瘤(癌症)是死亡的第一主导原因，患者的数量每年增加，极其需要开发具有高的效能和安全性的药物和治疗方法。作为形成恶性肿瘤的原因，存在着由辐射、紫外线和各种致癌物质引起的DNA突变。关于恶性肿瘤的研究集中于通过分子生物学鉴定这些遗传变化。结果，认为致瘤性转化由大量突变的积累等诱导。通过细胞系模型等已经显示，某些决定性突变与致瘤性转化直接相关。关于作为本发明的目标疾病之一的白血病，已经鉴定并分类了许多染色体畸变。在许多病例中发现了染色体易位，并且在主要的染色体易位中已经鉴定了与染色体易位相关的一些基因。通过分析易位相关基因的功能发现了一种情况，即这些基因与白血病的发生相关。
关于癌症干细胞：
另一方面，长时间以来，从细胞生物学观点提出了所谓的癌症干细胞假说，其主张与正常组织类似，恶性肿瘤同样起源于干细胞。干细胞被定义为具有自主复制能力和多能性的细胞，并粗略分成全能干细胞和组织干细胞。组织干细胞源自于特定组织和器官例如血液系统、肝脏、神经系统等，并以极低频率存在。其中，造血干细胞研究得最频繁。已报道，通过将一个造血干细胞移植到造血系统被致死剂量的辐射所破坏的小鼠中，可以在长时间内重建造血系统(非专利文献1)。与正常干细胞不同，关于癌症干细胞的研究已经延迟了很长时间，因为不能发现它们的真正本质。然而，在1997年由Dick等首次在急性骨髓性白血病中鉴定到癌症干细胞。此后，已经在各种恶性肿瘤中报道了癌症干细胞的存在。概括来说，癌症干细胞以全部肿瘤的百分之几或更低的频率存在，并且与正常干细胞同样稀少。据认为，形成肿瘤的其余细胞是增殖能力有限的肿瘤前体细胞或肿瘤细胞。
通过这些报告，显示了即使是在肿瘤中也存在与正常组织类似的层次结构，并且位于其顶点(源点)的癌症干细胞具有强的肿瘤形成能力。
癌症干细胞的特征和治疗问题：
总结许多报告，认为癌症干细胞维持了正常干细胞所具有的各种特征。相似性的实例包括细胞的稀少性、细胞存在于其中的微环境(生境)、多药物抗性基因的表达、细胞周期阻滞等。
具体来说，它们表达一组多药物抗性基因并且与正常干细胞类似处于细胞周期间期的特征，可能变成治疗上的极大问题。多药物抗性基因BCRP是通过将各种抗肿瘤药剂排除到细胞外部而损害药物效能的泵，并且已经报道了一种利用这种活性收集干细胞的方法(非专利文献2)。此外，它们在细胞周期间期在“冬眠”状态下存在(非专利文献3)，引起对靶向癌症细胞快速生长的许多抗肿瘤药剂以及辐照敏感性的降低(非专利文献4和5)。
根据上述特征，认为对治疗表现出抗性的癌症干细胞是肿瘤再生的原因。
关于分子定向药物
恶性肿瘤治疗的三个主要过程包括抗肿瘤药剂治疗、放射治疗和手术切除。血液肿瘤仅限于抗肿瘤药剂治疗和放射治疗，并且如上所述，癌症干细胞可能对这些治疗具有抗性。另一个问题是由于这两种治疗影响整个身体，因此副作用大。预期分子定向药物将作为这个问题的解决手段。它能够通过只在表达靶分子的细胞中表现出其药效来降低副作用。
在血液病领域中分子定向药物的典型药物实例包括伊马替尼和利妥昔单抗。伊马替尼靶向由在95％的CML患者中观察到的染色体畸变(费城染色体)所产生的被称为Bcr-Abl的引起白血病的因子。这是一种低分子量药物，其通过抑制Bcr-Abl的功能诱导白血病细胞自杀。利妥昔单抗是治疗性抗体，其识别B细胞上的表面分子CD20，并对B细胞的恶性肿瘤(非霍奇金淋巴瘤等)具有抗肿瘤效应。另一方面，用于AML的分子定向药物很少，只有药剂吉妥珠单抗-奥唑米星(Mylotarg)，其中将抗生素calicheamicin与针对已知AML细胞表面抗原CD33的单克隆抗体相连。然而，目前的形势是Mylotarg的使用受限，这是因为据认为源自于calicheamicin的强烈毒性，以及治疗范围狭窄的问题。基于上述，可以说发现新的靶基因并开发用于它的治疗药剂将是重要的发明，其直接导致治疗的可能性并扩展了治疗的选择范围。
作为分子定向药物的实施方案，已经研究并开发了各种物质，例如治疗性抗体和低分子量药物，以及肽类药物、生物蛋白制剂例如细胞因子、siRNA、适体(aptamer)等。当抗体被用作治疗药剂时，由于其特异性，它可用于治疗其中患病细胞表达特定抗原的病理状况。抗体与作为其抗原在细胞表面上表达的蛋白结合，并有效地作用于被结合细胞。抗体具有长的血液半衰期和对其抗原的高特异性的特征，并且也可显著用作抗肿瘤药剂。例如，当抗体靶向肿瘤特异性抗原时，可以预计给药的抗体积累在肿瘤中，从而通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)攻击肿瘤细胞。此外，通过将放射活性物质、细胞毒性物质等与抗体结合，有可能将药剂有效转移到肿瘤部分并因此允许在其上发挥作用。同时，它能够降低药剂到达其他非特异性组织的量，并且也可以预期副作用的降低。当肿瘤特异性抗原具有诱导细胞死亡的活性时通过给药具有激动活性的抗体，或者当肿瘤特异性抗原与细胞生长和存活有关时通过给药具有中和活性的抗体，预期可以抑制肿瘤生长或使肿瘤退行。由于上述特征，因此认为抗体适合用作抗肿瘤药剂。
关于治疗性抗体：
在原始抗体制备中，使用小鼠作为待免疫动物。然而，由于大量原因，使用小鼠抗体作为药物受到限制。在人体中可以被识别为外来物质的小鼠抗体，可以诱导所谓的“人类抗小鼠抗体”、即“HAMA”应答(非专利文献6)。此外，小鼠抗体的Fc区不能通过人类补体或人类免疫细胞有效攻击患病细胞。
作为用于避免这样的问题的方法之一，开发了嵌合抗体(专利文献1和2)。嵌合抗体含有源自于两种或更多物种的抗体部分(小鼠抗体可变区、人类抗体恒定区等)。这种嵌合抗体的优点在于它保持了小鼠抗体的特征，但是可以活化人类补体或人类免疫细胞，因为它具有人类Fc。然而，已知这样的嵌合抗体仍然诱导“人类抗嵌合抗体”、即“HACA”应答(非专利文献7)。
此外，已经开发了重组抗体，其中抗体唯一被取代的部分是互补性决定区(“CDR”)(专利文献3和4)。通过使用CDR嫁接技术，制备了包含小鼠CDR和人类可变区构架和人类恒定区的抗体，即所谓的“人源化抗体”(非专利文献8)。此外，通过使用产人类抗体的小鼠或通过使用人类抗体文库进行筛选，已经提供了可用于制备完全人类抗体的广泛应用的技术(非专利文献9和10)。
关于IL-3Rα：
IL-3Rα是IL-3受体的α链，属于细胞因子受体家族，并对作为其配体的IL-3显示出弱亲和性。通过与其β链(CD131，在后文中也称为IL-3Rβ)形成异源受体，IL-3受体具有强的结合性，并通过β链的细胞内区域将信号例如生长、分化等传递到细胞中。IL-5受体α链和GM-CSF受体α链享有共同的β链。
IL-3Rα是单次通过的跨膜I型膜蛋白，并且根据序列了解到在膜外区域中存在IL-3结合位点和III型纤连蛋白位点。已知不存在能够在膜内区域中传递信号的结构。尽管IL-3Rα的三维结构还没有被分析，但可以推测家族之间细胞因子受体的结构是相似的，因为在大多数情况下形成结构上重要的S-S键的半胱氨酸残基的位置得以保留。在同样的细胞因子受体中，IL-13受体α链、IL-4受体α链和GM-CSF受体α链的晶体结构已被分析。根据这些细胞因子受体家族的信息，可以推测IL-3Rα的膜外区域粗略分成3个结构域(A-B-C结构域)。已知识别人类IL-3Rα的A结构域的抗体7G3阻断IL-3信号传导(非专利文献11)。此外，已经报道了缺少A结构域的IL-3Rα分子的表达(非专利文献12)，并且当然识别A结构域的抗体不能识别缺少A结构域的IL-3Rα。此外，据认为C结构域是IL-3Rα分子的根，并具有在三维上抑制IL-3Rβ与IL-3Rα的结合的高度可能性。
IL-3是已知作为IL-3Rα配体的唯一配体。IL-3是一种造血因子，其已知加速下列细胞的集落形成：红细胞，巨核细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，肥大细胞和单核系统细胞。已知IL-3也刺激具有多能性的前体细胞，但是宁可将IL-3说成是加速具有自主复制能力的未成熟干细胞的分化，而是加速定向前体细胞的分化。
已知IL-3Rα通过与β链形成异源二聚体，从而通过丝氨酸/苏氨酸磷酸化途径将IL-3信号传导到细胞中，而与骨髓细胞的生长和分化有关。已知IL-3Rα表达在造血祖细胞中的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)或髓系共同祖细胞(CMP)中，并通过IL-3信号传导诱导生长和分化成中性粒细胞和巨噬细胞系统。另一方面，已报道存在于CMP下游中的巨核细胞-红细胞类祖细胞(MEP)与也存在于下游中的GMP不同，不表达IL-3Rα。
关于AML干细胞，Bonnet和Dick报道了AML干细胞存在于CD34阳性CD38阴性级分中(非专利参考文献13)。此外，通过与正常干细胞的相同级分(CD34阳性CD38阴性)进行比较，Jordan等已经发现IL-3Rα在AML干细胞中高表达(非专利参考文献14)。在随后的多篇报告中也已报道了IL-3Rα不仅作为AML干细胞而且作为白血病干细胞的标志物的高潜力(非专利参考文献15和16)。在癌症包括白血病的治疗中，重要的是尽可能多地只移除癌症细胞而不损伤正常细胞，并且据认为，IL-3Rα在正常干细胞与白血病干细胞之间的这种表达差异，可用于靶向白血病干细胞的治疗。
关于与IL-3Rα形成异源二聚体的IL-3Rβ，没有报告表明IL-3Rβ在白血病干细胞中高表达，并且在其中对白血病干细胞和正常干细胞中mRNA的表达进行比较的微阵列的情况下，事实上IL-3Rβ未被鉴定为在白血病干细胞中表达被增加的分子(非专利参考文献17)。
关于与IL-3Rα形成异源二聚体的IL-3Rβ，没有报告表明IL-3Rβ在白血病干细胞中高表达，并且在其中对白血病干细胞和正常干细胞中mRNA的表达进行比较的微阵列的情况下，事实上IL-3Rβ未被鉴定为在白血病干细胞中表达增加的分子(非专利参考文献18)。
长时间以来，已知道存在依赖于IL-3的白血病细胞，并且老的研究聚焦于占白血病细胞的大多数的母细胞。根据关于白血病干细胞的最新研究，据说白血病干细胞通过尽可能详尽地抑制其生长获得了抗肿瘤药剂抗性。此外，据认为IL-3反应性母细胞具有高增殖能力，因此推测这种细胞在使用抗肿瘤药剂的普通治疗中是有效的。
作为靶向IL-3R受体的药剂的候选物，长时间以来IL-3本身被给药于造血不足的患者，但是它没有因此变成药物。其中将白喉毒素添加到IL-3上的融合蛋白的临床试验正在进行之中，其目的在于将白血病作为靶疾病。对于IL-3和白喉毒素-IL-3融合物来说，它们不适合作为药剂靶向其中IL-3Rα的表达特异性增加的细胞，因为IL-3不是强烈地结合单独的IL-3Rα蛋白，而是强烈结合IL-3Rα和β的异源蛋白，这是由IL-3的性质而决定的。另一方面，作为靶向IL-3Rα的药剂的候选物，已经报道了IL-3Rα人类小鼠嵌合抗体7G3的一期结果(非专利文献19)。因为7G3嵌合抗体利用IL-3信号传导的阻断目的作为AML疗法的机制，它不是旨在除去IL-3Rα阳性细胞的药剂。此外，尽管已知一些其他的IL-3Rα抗体(9F5(Becton Dickinson)、6H6(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY)和AC145(Miltenyi-Biotech))，但它们不具有除去高表达IL-3Rα的细胞的能力。
引用文献名单
专利文献
专利文献1：EP公开的专利申请120694
专利文献2：EP公开的专利申请No.125023
专利文献3：GB专利申请No.GB2188638A
专利文献4：美国专利No.5,585,089
非专利文献
非专利文献1：Osawa M等，Science.273:242-5(1996)
非专利文献2：Goodell MA等，J Exp Med.183:1797-806(1996)
非专利文献3：Yamazaki S等，EMBOJ.25:3515-23(2006)
非专利文献4：Ishikawa F等，Nat Biotechnol.25:1315-21.(2007)
非专利文献5：Bao S等，Nature.444:756-60(2006)
非专利文献6：Schiff等，Cane.Res.,45,879-885(1985)
非专利文献7：Bruggemann等，J.Exp.Med.,170:2153-2157(1989)
非专利文献8：Riechmann等，Nature,332:323-327(1988)
非专利文献9：Ishida I等，Cloning Stem Cells.4:91-102(2002)
非专利文献10：Wu等，J Mol Biol 19:151-62(1999)
非专利文献11：Sun等，Blood,87:83(1996)
非专利文献12：Chen等，J Biol Chem,284:5763(2009)
非专利文献13：Bonnet等，Nat Med,1997；3:730
非专利文献14：Jordan等，Leukemia,2000；14:1777
非专利文献15：Haematologica,2001；86:1261
非专利文献16：LeukLymphoma,2006；47:207
非专利文献17：Majeti等，Proc Natl Acad Sci USA.2009；106:3396
非专利文献18：Majeti等，Proc Natl Acad Sci USA.106:3396(2009)
非专利文献19：Blood,2008112(11):摘要2956
发明概述
技术问题
本发明的目的是提供能够单独移除白血病干细胞并且也能几乎不表现出对正常细胞的副作用(显示出较少副作用)的治疗药剂。具体来说，本发明提供了针对人类IL-3Rα链的抗体，其不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但不与C结构域结合；包含抗体的组合物；以及包含抗体的治疗方法或检测方法。
解决问题的方案
本发明涉及下列(1)至(9)。
(1)一种针对人类IL-3Rα链的抗体，所述抗体不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但是与C结构域结合。
(2)上述(1)中描述的抗体，其进一步具有高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
(3)上述(1)或(2)中描述的抗体，其中通过使用用IL-2培养的PBMC的Colon-26/hCD123ADCC测定法，高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在0.01μg/ml的抗体浓度下显示出10％的特异的裂解率。
(4)上述(1)至(3)任一项中描述的抗体，其包含选自下列(a)至(e)的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列：
(a)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:113至115的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:131至133的氨基酸序列，
(b)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:116至118的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:134至136的氨基酸序列，
(c)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:119至121的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:137至139的氨基酸序列，
(d)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:122至124的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:140至142的氨基酸序列，以及
(e)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:125至127的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:143至145的氨基酸序列。
(5)上述(1)至(4)任一项中描述的抗体，其包含选自下列(a)至(f)的重链可变区和轻链可变区：
(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；以及
(f)重链可变区和/或轻链可变区，其包含在上述(a)至(e)所显示的重链可变区和/或轻链可变区中缺失、取代、添加或插入1至3个氨基酸残基的氨基酸序列。
(6)一种用于预防或治疗血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在对象的骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述组合物包含(1)至(5)任一项中描述的IL-3Rα抗体作为活性成分。
(7)一种用于治疗血液肿瘤的方法，在所述血液肿瘤中在骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述方法包含向对象给药包含(1)至(5)任一项中描述的IL-3Rα抗体作为活性成分的组合物。
(8)一种用于检测血液肿瘤的组合物，在所述血液肿瘤中在来自对象的生物样品的骨髓或外周血中发现了表达IL-3Rα的细胞，所述组合物包含(1)至(5)任一项中描述的IL-3Rα抗体。
(9)(1)至(5)任一项中描述的组合物或方法，其中上面提到的血液肿瘤是急性骨髓性白血病(AML)。
本发明的有益效果
本发明能够提供针对人类IL-3Rα链的抗体，其不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但不结合C结构域；包含所述抗体的组合物以及使用所述抗体的治疗方法或检测方法。
附图简述
[图1]和[图2]图1和2是使用标记的抗IL-3Rα抗体对表达IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白的细胞进行的流式细胞术分析结果。
[图3]图3是使用标记的抗IL-3Rα抗体对表达IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白的细胞进行的流式细胞术分析的结果。
[图4]图4是图表，其中在人类IL-3Rα分子的A和B结构域的核苷酸和氨基酸序列中，排列在分子外部的区域1至7被GM-CSFRα序列取代的区域部分用虚线显示。
[图5]图5是用于检测IL-3信号传导的阻断活性的细胞生长试验的结果。纵坐标表示细胞生长抑制率(％)，横坐标表示各种IL-3Rα抗体名称。
[图6]图6是用于检测IL-3信号传导的阻断活性的集落测定试验。GM、E和GEMM分别显示了使用粒细胞/巨噬细胞系统、红细胞类系统集落和混合集落的结果。
[图7]图7是在带肿瘤模型中检测各种人类抗体的抗肿瘤效果的结果。纵坐标表示MOLM13细胞的数量，横坐标表示各种IL-3Rα抗体名称。
[图8]和[图9]图8和9是使用抗IL-3Rα抗体对表达IL-3Rα的细胞系进行的ADCC试验的结果。在图8中使用了未用IL-2培养的PBMC，在图9中使用了用IL-2培养的PBMC。
[图10]图10是通过抗IL-3Rα抗体和PE-标记的抗人类IgG第二抗体检测的表达食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-3Rα的流式细胞术分析的结果。上排显示了表达食蟹猴IL-3Rα的细胞，下排显示了表达人类IL-3Rα的细胞。
实施本发明的方式
(特别理想的实施方案的详细描述)
在本说明书中使用的分段标题仅仅是出于组织的目的，不应被解释为对所描述的主题内容的限制。在本申请中引用的所有参考文献以任选目的在本说明书中明确引为参考。
(概要)
本发明涉及针对人类IL-3Rα链的抗体，其不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链(在后文中称为IL-3Rα)的B结构域结合，但不与C结构域结合。
IL-3受体(在后文中称为IL-3R)、特别是IL-3Rα表达在白血病干细胞的细胞表面上。一般来说，IL-3受体β链(在后文中称为IL-3Rβ)将IL-3信号传导传递到细胞中，并因此诱导生长和分化。
因此，存在着IL-3信号传导的抑制引起副作用、例如正常干细胞的正常造血功能的抑制的可能性。因此，作为靶向白血病干细胞的新治疗方法，优选情况下该方法靶向IL-3Rα，并且也不抑制IL-3信号传导。
(IL-3Rα)
由IL-3Rα基因编码的蛋白是I型跨膜蛋白，其属于细胞因子受体家族。在正常细胞中，IL-3Rα分子表达在一部分造血前体细胞、嗜碱性粒细胞、一部分树突状细胞等上。在肿瘤的情况下，已知它在造血系统癌症和白血病中表达。作为表达IL-3Rα的肿瘤的实例，已知IL-3Rα在急变期AML和CML的母细胞上，以及在AML、CML、MDS、ALL和SM中被认为是白血病干细胞的分化标志物阴性CD34阳性CD38阴性级分的情形中表达。在血液中，IL-3Rα的已知配体IL-3表达在活化的T细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和一部分巨核细胞上。此外，IL-3Rα也被称为CD123。IL-3Rα包括哺乳动物(例如灵长类和人类)类型的IL-3Rα。IL-3Rα序列包括多态性变体。全长人类IL-3Rα的具体实例包括下列氨基酸序列。
MVLLWLTLLLIALPCLLQTKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKDADYSMPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENSGKPWAGAENLTCWIHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGSQSSHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVFSQIEILTPPNMTAKCNKTHSFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQLLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGANTRAWRTSLLIALGTLLALVCVFVICRRYLVMQRLFPRIPHMKDPIGDSFQNDKLVVWEAGKAGLEECLVTEVQVVQKT(SEQ ID NO:1)
人类IL-3Rα的细胞外区域氨基酸序列的具体实例包括下列氨基酸序列。
MVLLWLTLLLIALPCLLQTKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKDADYSMPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENSGKPWAGAENLTCWIHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGSQSSHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVFSQIEILTPPNMTAKCNKTHSFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQLLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGANTRAWRTSL(SEQ ID NO:2)
此外，IL-3Rα的细胞外区域分成A至C三个结构域。
A结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸中从18位的谷氨酰胺(Q)到100位的丝氨酸(S)的区域，B结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸中从101位的甘氨酸(G)至203位的丝氨酸(S)的区域，C结构域是SEQ ID NO:2的氨基酸中从204位的谷氨酰胺(Q)到308位的亮氨酸(L)的区域。
此外，在A结构域和B结构域中，下列7个区域排列在分子外部。
区域1是SEQ ID NO:2的氨基酸中从55位的天冬氨酸(D)到61位的脯氨酸(P)，区域2是SEQ ID NO:2的氨基酸中从63位的缬氨酸(V)到70位的苯丙氨酸(F)，区域3是SEQ ID NO:2的氨基酸中从91位的丝氨酸(S)到98位的谷氨酸(E)，区域4是SEQ ID NO:2的氨基酸中从97位的脯氨酸(P)到104位的色氨酸(W)，区域5是SEQ ID NO:2的氨基酸中从122位的半胱氨酸(C)到128位的脯氨酸(P)，区域6是SEQ ID NO:2的氨基酸中从182位的异亮氨酸(I)到188位的丝氨酸(S)，区域7是SEQ ID NO:2的氨基酸中从192位的甘氨酸(G)到198位的赖氨酸(K)。
因此，本发明抗体的实例，包括与SEQ ID NO:2的氨基酸中作为IL-3Rα的细胞外区域的101至203位的氨基酸序列结合，但不与204至308位的氨基酸序列结合的抗体，以及进一步与SEQ ID NO:2的氨基酸序列中182至188位和192至198位的氨基酸序列结合的抗体。
本发明的抗体与IL-3Rα的细胞外区域的上述特定区域结合，并且不抑制IL-3信号传导。
当在本发明中使用时，术语“不抑制IL-3信号传导”是指它不由IL-3通过IL-3R抑制细胞内信号，并且它包括其中IL-3与IL-3R的结合不被抑制和IL-3Rα链与β链的结合不被抑制的情况。具体来说，它意味着按照实施例8中的分析，当抗体浓度被设定为10μg/ml时，如图5所示的细胞生长抑制率为40％以上，优选为60％以上，更优选为80％以上。根据本说明书，术语“IL-3信号传导的阻断”和“IL-3信号传导的抑制”以相同意义使用并且不可区分，并且IL-3信号传导的阻断活性是指抑制IL-3信号传导的能力。
此外，除了上面提到的性质之外，本发明的抗体具有高的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
具有ADCC活性的IL-3Rα抗体是指与表达IL-3Rα的细胞结合，通过具有细胞毒性的效应细胞例如NK细胞等杀死表达IL-3Rα的细胞的抗体。
高ADCC活性是指使用用IL-2培养的PBMC通过Colon-26/hCD123ADCC测定法测量时，在0.01μg/ml或以下的抗体浓度下特异的裂解率为10％以上。
特异的裂解率是指通过测量靶细胞被抗体的裂解率而获得的值，具体来说它可以按照下面的实施例11来计算。
表达IL-3Rα的细胞的实例包括血液癌细胞(急性骨髓性白血病(AML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、骨髓增生异常综合征(MDS)细胞、急性淋巴性白血病(ALL)细胞、慢性淋巴性白血病(CLL)细胞、多发性骨髓瘤(多发性骨髓瘤：MM)细胞、系统性肥大细胞瘤(SM)细胞等)、调节性T细胞(例如CD4阳性CD25阳性细胞)、抗原呈递细胞(例如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和与其类似的细胞(肝星状细胞、破骨细胞、小神经胶质细胞、主要表皮吞噬细胞、尘细胞(肺泡巨噬细胞)等))、嗜碱性粒细胞等。
此外，AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、SM细胞、MM细胞、各种淋巴瘤细胞包括它们的癌症干细胞。
癌症干细胞是构成肿瘤的细胞组之一。例如，在急性骨髓性白血病(AML)中，它用谱系(-)CD34(+)CD38(-)髓系细胞表示。因此，由于本发明的抗体具有高ADCC活性，它诱导表达IL-3Rα的细胞的减少或消除。
此外，本发明的IL-3Rα抗体包括具有选自下列(a)至(e)的重链CDR和轻链CDR的IL-3Rα抗体：
(a)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:113至115所显示的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:131至133所显示的氨基酸序列，
(b)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:116至118所显示的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:134至136所显示的氨基酸序列，
(c)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:119至121所显示的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:137至139所显示的氨基酸序列，
(d)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:122至124所显示的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:140至142所显示的氨基酸序列，以及
(e)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:125至127所显示的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:143至145所显示的氨基酸序列。
此外，本发明的抗体包括含有选自下列(a)至(f)的重链可变区和轻链可变区的IL-3Rα抗体(括号中显示的是下面实施例中描述的每个可变区所源自的抗体的名称)：
(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：Old4)
(b)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：Old5)
(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：Old17)
(d)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：Old19)
(e)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区(抗体名称：New102)；以及
(f)重链可变区和/或轻链可变区，其包含在上述(a)至(e)所显示的重链可变区和/或轻链可变区中缺失、取代、添加或插入了1至3个氨基酸残基的氨基酸序列。
(抗体)
抗体以最广义的意义使用，并包括单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们显示出所需生物活性即可。
抗体含有成熟的重链或轻链可变区序列。此外，抗体还包括修饰形式和变体形式，例如抗体的恒定区、成熟重链或轻链可变区序列的互补性决定区(CDR)或构架(FR)区内部或外部的取代等。在特定实施方案中，取代包括保守氨基酸取代。
此外，抗体还包括成熟重链或轻链可变区序列的子序列。在特定实施方案中，子序列选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键Fv(sdFv)和VL或VH。
此外，抗体还包括异源结构域。在特定实施方案中，异源结构域包括标签、可检测标记物或细胞毒性剂。
抗体的实例包括单克隆抗体和多克隆抗体及其任何同种型或亚类。在特定实施方案中，上面提到的抗体是IgG的同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD。“单克隆”抗体是指抗体基于、得自单一克隆包括真核细胞克隆、原核细胞克隆或噬菌体克隆，或源自于单一克隆包括真核细胞克隆、原核细胞克隆或噬菌体克隆，基于单一克隆包括真核细胞克隆、原核细胞克隆或噬菌体克隆，因此，“单克隆”抗体是结构确定的物质，而不是用于产生它的方法。
IL-3Rα抗体、抗IL-3Rα和抗IL-3Rα抗体是指特异性结合IL-3Rα的抗体。特异性结合是指它对于IL-3Rα中存在的表位具有选择性。特异性结合可以使用本技术领域中已知的测定方法(例如免疫沉淀、ELISA、流式细胞术、Western印迹)与非特异性结合区分开。
当IL-3Rα抗体所特异性结合的全部或部分抗原表位存在于不同蛋白中时，存在着该抗体能够与不同蛋白结合的可能性。因此，取决于IL-3Rα表位的序列或结构同源性，存在着IL-3Rα抗体特异性结合与IL-3Rα表位具有高的序列或结构同源性的其他蛋白的可能性。因此，当不同蛋白中存在具有足够序列或结构同源性的表位时，存在着IL-3Rα抗体与不同蛋白结合的可能性。
IL-3Rα抗体包括分离和纯化抗体。本发明的抗体包括从人类分离或纯化的IL-3Rα抗体。
术语“(被)分离的”当用作组合物的修饰语时，是指组合物通过人工制备，或一般通过一个或多个操作步骤或过程与天然存在的体内环境中的一种或多种其他组分分离开。一般来说，通过这种方式分离的组合物基本上不含在自然状态下一般与其相伴的一种或多种物质，例如一种或多种蛋白质、核酸、脂类、糖类和细胞膜。因此，分离的组合物与组合物天然存在于其中的生物体细胞中的其他生物组分、或组合物在其中生产(例如通过合成或细胞培养)的人造介质分离开。例如，分离的IL-3Rα抗体可以从产生抗体的动物(例如非转基因哺乳动物或转基因动物(鼠类(小鼠)或有蹄类动物(牛))获得，并与其他多肽和核酸分离开。因此，含有从这样的动物获得的抗体的血清被认为是分离的。术语“(被)分离的”不排除可选的物理形式，例如，分离的抗体可以包括抗体子序列和嵌合体、多聚体或衍生化形式。
术语“(被)纯化的”当用作组合物的修饰语时，是指组合物不含在自然状态下典型与其相伴的大部分或基本上所有的物质。一般来说，纯化的抗体从普遍存在于抗体环境中的组分获得。因此，从产抗体杂交瘤的细胞培养混合物分离的抗体上清液被认为是纯化的。因此，“(被)纯化的”不要求绝对纯度，并且取决于上下文。此外，“(被)纯化的”组合物可以与一种或多种其他分子组合。因此，术语“(被)纯化的”不排除组合物的组合。纯度可以通过任选的适合方法来确定，例如UV光谱测定法、色谱法(例如HPLC、气相)、凝胶电泳(例如银染色或考马斯亮蓝染色)、序列分析(肽和核酸)等。
“(被)纯化的”蛋白和核酸包括通过标准纯化方法获得的蛋白和核酸。通过在宿主细胞中重组表达和化学合成获得的蛋白和核酸也包括在该术语中。此外，“(被)纯化的”也可以是指组合物中污染物的水平低于用于人类或非人类动物给药的管理机构例如食品和药品管理局(FDA)所能接受的水平。
IL-3Rα抗体包括在体内或体外(例如在对象中)与IL-3Rα结合并调节IL-3Rα的功能或活性的抗体。在本说明书中，“调节”及其语法变化形式当与IL-3Rα的活性或功能关联使用时，是指IL-3Rα的活性或功能受到可检测的影响、修改或改变，但是不包括IL-3信号传导的抑制。因此，调节IL-3Rα的活性或功能的IL-3Rα抗体是提供影响、修改或改变，使得可以检测到一种或多种IL-3Rα活性或功能而不抑制IL-3信号传导的抗体，并且这样的IL-3Rα活性或功能可以包括例如IL-3Rα与IL-3Rα配体(例如IL-3)的结合，IL-3Rα介导的信号传递，或IL-3Rα介导的细胞应答或可以被IL-3Rα调节的细胞应答，或本说明书中描述的或公知的或可以了解到的其他IL-3Rα活性或功能。
可以被调节的各种非限制性的IL-3Rα活性和功能的实例包括IL-3Rα介导的信号转导或IL-3Rα介导的细胞应答，可以通过IL-3Rα调节的细胞应答，细胞增殖或细胞扩增(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞存活或凋亡(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞因子(例如Th、Th2和非Th1/Th2细胞因子)和干扰素表达或生产，抗凋亡蛋白或前凋亡蛋白的表达或生产，障碍、疾病、生理状况、病理状况和症状的治疗、抑制或改善。可以被调节的具体细胞因子不受限制，其实例包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-α和γ-干扰素(体外或体内)。具体的抗凋亡蛋白和前凋亡蛋白不受限制，其实例包括Bcl-xL、Bcl-2、Bad、Bim和Mcl-1。
因此，本说明书中描述的抗IL-3Rα抗体包括调节下列过程的抗体：IL-3Rα介导的信号转导或IL-3Rα介导的细胞应答，可以通过IL-3Rα调节的细胞应答，细胞增殖或细胞生长(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞存活或凋亡(例如AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞、各种淋巴瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞)，细胞因子(例如Th、Th2和非Th1/Th2细胞因子)和干扰素表达或生产，抗凋亡蛋白或前凋亡蛋白的表达或生产，障碍、疾病、生理状况、病理状况和症状的治疗、抑制或改善。在具体实施方案中，本发明的抗IL-3Rα抗体能够调节AML细胞的扩增或存活，其他血液癌细胞(例如CML细胞、ALL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞或各种淋巴瘤细胞)的数量，非癌血液细胞例如单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓系祖细胞和淋巴祖细胞的生长或存活，以及减少、消除或贫化AML细胞、CML细胞、ALL细胞、CLL细胞、MDS细胞、MM细胞、SM细胞或各种淋巴瘤细胞。
IL-3Rα抗体包括修饰的形式，例如也被称为变体的取代产物(例如氨基酸取代产物)、添加产物、缺失产物(例如子序列或片段)等。这样的修饰的抗体形式和变体保留了本发明显示的IL-3Rα抗体的至少部分功能或活性，例如与IL-3Rα的结合或IL-3Rα活性或功能(例如IL-3Rα信号传递)的调节。因此，修饰的IL-3Rα抗体可以保留调节例如至少一部分IL-3Rα结合或一种或多种IL-3Rα功能或活性(例如信号传递、细胞应答等)的能力。
根据本说明书，术语“改变”(“修饰”)及其语法变化形式是指组合物衍生自参比组合物。修饰的蛋白、核酸和其他组合物可以具有与参比的未修饰蛋白、核酸或其他组合物相比更高或更低的活性，或者可以具有与参比的未修饰蛋白、核酸或其他组合物不同的功能。
这样的含有氨基酸取代的抗体可以由核酸编码。因此，本发明还提供了编码含有氨基酸取代的抗体的核苷酸序列。
术语“同一性”或“同一的”是指两个或多个参比物质相同。因此，当两个蛋白序列(例如IL-3Rα抗体)同一时，它们至少在参比区域或部分中具有相同的氨基酸序列。术语“同一区”是指两个或多个参比物质的同一的区域。因此，当两个蛋白序列在一个或多个序列区域中同一时，它们在所述区域中具有同一性。“显著同一性”是指分子在结构或功能上保守，使得分子具有或预计具有一种或多种参比分子功能或活性的至少部分功能或活性，或具有与其享有同一性的参比分子的相关/相应区域或部分。因此，具有显著同一性的多肽(例如IL-3Rα抗体)具有或预计具有参比多肽(例如IL-3Rα抗体)的至少部分活性或功能。例如，在特定实施方案中，具有一个或多个修饰(例如1至3个氨基酸残基的缺失、取代、添加或插入)并保留了未修饰IL-3Rα抗体的至少部分活性或功能的IL-3Rα抗体，被认为与参比IL-3Rα抗体具有显著同一性。
由于结构相关蛋白和功能相关蛋白之间的变异，需要一定量的序列同一性才能保留蛋白、区域上的功能或活性以及区域的功能或活性。在蛋白的情况下，通过仅存在30％的氨基酸序列同一性就可能保留活性或功能，但一般来说，存在着与参比序列的50％、60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％或98％的较高同一性。两个序列之间的同一性程度可以使用本技术领域中公知的计算机程序或数学算法来确认。在这样的计算序列同一性(同源性)比例的算法中，一般来说考虑比较区域内的序列间隙和错配。例如，BLAST(例如BLAST 2.0)检索算法(例如参见Altschul等，J.Mol.Biol.,215:403(1990)，可通过NCBI公开使用)具有下列说明性的检索参数：错配-2；间隙开始5；间隙延长2。在多肽序列比较中，BLASTP算法典型地与计分矩阵例如PAM100、PAM 250、BLOSUM 62、BLOSUM50.FASTA(例如FASTA 2和FASTA 3)等组合使用，并且也可以使用SSEARCH序列比较程序来确定同一性程度(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444(1988)；Pearson,Methods Mol.Bio.,132:185(2000)；和Smith等，J.Mol.Biol.,147:195(1981))。也可以使用基于Delaunary类型的拓扑作图来开发用于确定蛋白结构相似性的程序(Bostick等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,304:320(2003))。
“保守取代”是将一个氨基酸用生物、化学或结构上类似的残基取代。生物相似性是指生物活性例如IL-3Rα结合活性不被取代所破坏。结构相似性是指氨基酸具有长度相似的侧链(例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)或具有相似尺寸。化学相似性是指残基具有相同电荷或是亲水或疏水的。具体实例包括将一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸用另一个残基取代，或将一个极性残基用另一个残基取代，例如用赖氨酸取代精氨酸、用天冬氨酸取代谷氨酸或用天冬酰胺取代谷氨酰胺，以及用苏氨酸取代丝氨酸。
此外，修饰的抗体的实例包括肽模拟物，其具有一个或多个用L-氨基酸(或其混合物)取代的D-氨基酸、结构和功能类似物例如合成或非天然氨基酸或氨基酸类似物及其衍生形式。修饰的实例包括环状结构，例如分子的氨基和羧基末端之间的端对端酰胺键或分子内或分子间二硫键或分子内或分子间二硫键。
氨基酸修饰的其他非限制性具体实例包括IL-3Rα的部分序列(子序列)和片段。IL-3Rα的示例性子序列和片段包括与本发明的示例性IL-3Rα抗体结合的IL-3Rα序列的部分。此外，IL-3Rα的示例性子序列和片段包括免疫原性区域，例如与本发明的示例性IL-3Rα抗体结合的IL-3Rα的部分。
根据本发明，提供了编码IL-3Rα抗体片段子序列的核酸，所述片段保留了IL-3Rα抗体和未修饰或参比IL-3Rα抗体的至少部分功能或活性。在本说明书中，术语“子序列”或“片段”是指全长分子的一部分。编码IL-3Rα抗体的子序列的氨基酸序列具有比全长IL-3Rα抗体少至少一个的氨基酸(例如缺失了一个或多个内部氨基酸或从氨基端或羧基端缺失一个或多个末端氨基酸)。IL-3Rα抗体的子序列具有比全长IL-3Rα抗体少至少一个的氨基酸。核酸子序列具有比全长对比核酸序列少至少一个的核苷酸。因此，子序列可以是全长天然IL-3Rα内的任选长度。
IL-3Rα抗体子序列和片段可以具有与全长抗体相同的结合亲和性、与全长抗体相同的结合特异性或与全长抗体相同的一种或多种活性或功能，例如IL-3Rα拮抗或激动抗体的功能或活性。在指称抗体时，术语“功能子序列”或“功能片段”是指保留了与全长参比抗体相同的一种或多种功能或活性，例如IL-3Rα抗体的至少一部分功能或活性的抗体部分。例如，与IL-3Rα或IL-3Rα片段结合的抗体子序列被认为是功能子序列。
抗体子序列和片段可以组合。例如，VL或VH子序列可以通过连接序列相连，并可以由此形成VL-VH嵌合体。单链Fv(scFv)子序列的组合可以通过连接序列相连，并可以由此形成scFv-scFv-嵌合体。IL-3Rα抗体子序列和片段包括单独或与所有或一部分其他IL-3Rα抗体子序列组合的单链抗体或可变区。
抗体子序列和片段可以通过抗体的蛋白水解作用、例如用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来制备。通过用胃蛋白酶进行酶切割获得的抗体子序列和片段，提供用F(ab’)2表示的5S片段。该片段可以用巯基还原剂进一步切割，形成3.5S的Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行的酶切割直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段(参见例如美国专利No.4,036,945和美国专利No.4,331,647；以及Edelman等，Methods Enzymol,1:422(1967))。也可以使用其他切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或其他酶或化学方法。
蛋白和抗体及其子序列和片段可以使用遗传工程来制备。技术包括将编码蛋白或抗体的全部或部分基因在宿主细胞例如COS细胞和大肠杆菌中表达。重组宿主细胞合成全长或子序列例如scFv(例如Whitlow等，In:Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:97(1991)；Bird等，Science 242:423(1988)；和美国专利No.4,946,778)。单链Fv和抗体可以按照下述文献中描述的步骤来制备：美国专利No.4,946,778和美国专利No.5,258,498；Huston等，Methods Enzymol 203:46(1991)；Shu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7995(1993)；和Skerra等，Science 240:1038(1988)。
修饰形式包括衍生化序列，例如在氨基酸中游离氨基形成胺的盐酸盐、对甲苯磺酸基团和羰基苯醌基团；游离羧基形成盐或甲基和乙基酯；游离羟基形成O-酰基或O-烷基衍生物，以及天然存在的氨基酸衍生物例如4-羟基脯氨酸(脯氨酸的衍生物)、5-羟基赖氨酸(赖氨酸的衍生物)、高丝氨酸(丝氨酸的衍生物)、鸟氨酸(赖氨酸的衍生物)等。修饰可以使用本技术领域通常已知的方法来进行(例如基于PCR的位点特异性缺失或插入突变、化学修饰和诱变、交联等)。
添加产物和插入产物包括在蛋白(抗体)、核酸和其他组合物的修饰形式中。例如，添加可以是与任何类型的蛋白(抗体)、核酸或其他组合物的分子的共价或非共价键合。一般来说，添加和插入产生不同功能或活性。
融合(嵌合)多肽或核酸序列包括在添加和插入产物中，它们是具有在参比的天然(野生型)序列中一般不存在的一个或多个分子共价连接于上述序列而形成的序列。具体实例是另一个蛋白(例如抗体)的序列，用于产生多功能蛋白(例如多特异性抗体)。
本发明的抗体还包括嵌合或融合产物，其中一个或多个附加结构域共价连接到其上，以赋予不同或互补的功能或活性。抗体的实例包括在自然界中天然不存在并且其中两个或多个氨基酸序列相互键合的嵌合和融合产物。
根据本发明，提供了含有异源结构域和编码IL-3Rα抗体的核酸的IL-3Rα抗体。异源结构域可以是氨基酸添加产物或插入产物，但是不限于氨基酸残基。因此，异源结构域可以由各种类型的小的或大的功能部分中的任一种构成。这样的部分包括核酸、肽、糖类、脂类或小的有机化合物例如药物、金属(金、银)等。
异源结构域的具体的非限制性实例包括标签、可检测标记物和细胞毒性药剂。标签和可检测标记物的具体实例包括T7-、His-、myc-、HA-和FLAG-标签，酶(辣根过氧化物酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素转移酶)，酶的底物，配体(例如生物素)，受体(亲和素)，放射性核素(例如C14、S35、P32、P33、H3、I125和I131)，电子密度试剂，能量转移分子，顺磁性标记物，荧光团(荧光素、罗丹明、藻红蛋白)，发色团，化学发光剂(咪唑、萤光素酶)和生物发光剂。细胞毒性药剂的具体实例包括白喉毒素(白喉，毒素)、霍乱毒素和赖氨酸。
连接序列可以插入到蛋白(例如抗体)、核酸或其他组合物与添加产物或插入产物(例如异源结构域)之间，使得两种物质维持至少一部分不同功能或活性。连接序列可以具有一种或多种性质，其能够加速任一结构域或能够执行与任一结构域的相互反应，并且这样的特征包括不能形成柔性结构和有序二级结构，或疏水性质或带电性质。在柔性蛋白区域中通常发现的氨基酸的实例包括甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。其他接近中性的氨基酸例如苏氨酸和丙氨酸也可用于连接序列中。连接序列的长度可以变化(例如参见美国专利No.6,087,329)。连接物还可以包括化学交联剂和结合试剂(偶联试剂)例如磺基-琥珀酰亚胺基衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)和二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)。
添加的其他实例包括下列任一种：糖基化，脂肪酸，脂类，乙酰化，磷酸化，酰胺化，甲酰化，泛素化和通过保护或阻断基团衍生化，以及大量化学修饰。本技术领域的专业人员可以容易地理解其他的替代方案和可能性，并且它们被认为属于本发明的范围内。
这样的修饰序列可以使用介导细胞表达或体外翻译的重组DNA技术来制备。多肽和核酸序列也可以通过本技术领域公知的方法来制备，例如使用自动化肽合成仪的化学合成(参见例如Applied Biosystems,Foster City CA)。
修饰的和变体抗体例如取代产物、子序列添加产物等，可以维持IL-3Rα抗体的可检测活性。在实施方案中，修饰抗体具有与IL-3Rα分子结合的活性，并通过免疫系统、主要以效应细胞为中心，诱导IL-3Rα表达细胞的减少或消除。修饰抗体涉及IL-3Rα表达细胞的功能控制，并诱导细胞的存活、生长、静息、细胞死亡等。细胞死亡包括凋亡、坏死、自噬等。
(IL-3Rα的筛选方法)
根据本发明，还提供了筛选、检测和鉴定IL-3Rα的无细胞方法和基于细胞的方法(例如体内或体外方法)(例如在溶液中或通过固相)。这些方法可以在体外在溶液中使用生物材料或样品来进行，以及使用例如动物来源细胞(例如淋巴细胞)的样品在体内进行。在实施方案中，方法包含将生物材料或样品与结合IL-3Rα的抗体在允许抗体与IL-3Rα结合的条件下进行接触的步骤，以及测定与IL-3Rα结合的抗体的步骤。IL-3Rα的存在通过抗体与IL-3Rα的结合来检测。在实施方案中，IL-3Rα存在于细胞或组织中。在另一个实施方案中，上面提到的生物材料或样品从哺乳动物被分析物获得。
当用于组合物例如蛋白(例如IL-3Rα抗体)、材料、样品或治疗时，术语“接触”是指组合物(例如IL-3Rα抗体)与其他所指称物质之间的直接或间接相互作用。直接相互作用的具体实例包括结合。间接相互作用的具体实例包括其中组合物作用于中间分子，然后将该中间分子作用于所指称物质的情况。因此，例如将细胞(例如淋巴细胞)与IL-3Rα抗体接触包括允许抗体与细胞结合(例如通过与IL-3Rα结合)或允许抗体作用于中间物质，然后将该中间物质作用于细胞。
术语“测定”和“测量”及其语法变化形式在本说明书中同义使用，并且是指定性测量和定量测量中的任一种或定性测量和定量测量两者。当这些术语用于指称结合时，它们包括评估结合的相对量、亲和性或特异性的任何手段，包括在说明书中描述的和本技术领域中公知的各种方法。例如，IL-3Rα抗体与IL-3Rα的结合可以通过流式细胞术测定法来测定或测量。
(抗体的生产)
本发明还提供了用于制备具有对IL-3Rα阳性细胞有毒性的人类IL-3Rα抗体的方法。在实施方案中，方法包含向能够表达人类免疫球蛋白的动物(例如转基因小鼠或转基因牛)给药与导入到细胞中的人类IL-3Rα重组蛋白或IL-3Rα基因偶联的人类IL-3Rα细胞外区域；筛选动物中人类IL-3Rα抗体的表达；选择产生人类IL-3Rα抗体的动物；以及从所选动物分离抗体。
适合用于抗体生产的IL-3Rα蛋白可以通过各种标准的蛋白纯化和重组表达技术中的任一种来生产。例如，IL-3Rα序列可以通过标准的肽合成技术例如固相合成来制备。为了便于表达或合成的蛋白的纯化，蛋白的一部分可以包含氨基酸序列例如FLAG标签、T7标签、聚组氨酸序列等。蛋白表达在细胞内，并可以被纯化。蛋白可以通过重组方法表达成另一个大的蛋白(例如融合或嵌合产物)的一部分。适合用于产生免疫应答的IL-3Rα的实施方案包括IL-3Rα子序列例如免疫原性片段。IL-3Rα的其他实施方案包括表达IL-3Rα的细胞、含有IL-3Rα的制备物或细胞提取液或级分，以及部分纯化的IL-3Rα。
用于制备多克隆抗体和单克隆抗体的方法在本技术领域中是公知的。例如，将IL-3Rα或其免疫原性片段通过任选与载体例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(例如BSA)偶联，或与佐剂例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，用于免疫动物。通过分离源自于对IL-3Rα有反应的被免疫动物的脾细胞，可以使用杂交瘤技术将其与骨髓瘤细胞融合。通过与IL-3Rα或其免疫原性片段的反应性，可以筛选由杂交瘤产生的单克隆抗体。
可以被免疫的动物包括灵长类、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛和豚鼠。最初和任选的任何后续免疫可以通过静脉内途径、腹膜内途径、肌肉内途径或皮下途径。此外，为了增加免疫应答，可以将抗原与其他蛋白例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白和破伤风类毒素偶联，或者可以与佐剂例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等混合。最初和任选的任何后续免疫可以通过腹膜内途径、肌肉内途径、眼内途径和皮下途径。免疫可以使用相同浓度或不同浓度的IL-3Rα制备物，或以规则或不规则的时间间隔进行。
动物包括经过遗传修饰以包含人类基因座的动物，并且可以使用其制备人类抗体。具有一个或多个人类免疫球蛋白基因的转基因动物的实例，描述在例如美国专利No.5,939,598、WO02/43478和WO02/092812中。使用常规的杂交瘤技术，从对抗原具有高响应性的被免疫小鼠分离脾细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合。由此可以获得与IL-3Rα结合的单克隆抗体。
用于生产人类多克隆抗体和人类单克隆抗体的方法被进一步描述(参见例如Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.20:889(2002)；WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；美国专利No.5,413,923；美国专利No.5,625,126；美国专利No.5,633,425；美国专利No.5,569,825；美国专利No.5,661,016；美国专利No.5,545,806；美国专利No.5,814,318；美国专利No.5,885,793；美国专利No.5,916,771和美国专利No.5,939,598)。
术语“人类”当用于指称抗体时，是指抗体的氨基酸序列完全是人类氨基酸序列，即是人类重链和人类轻链可变区和人类恒定区。因此，所有氨基酸都是人类的氨基酸或存在于人类抗体中。非人类抗体的抗体可以通过用人类抗体中存在的氨基酸残基取代非人类氨基酸残基，制造成完全人类抗体。人类抗体中存在的氨基酸残基、CDR区图谱和人类抗体共有残基在本技术领域中是众所周知的(参见例如Kabat，免疫重要的蛋白的序列(第四版)(Sequences of Proteins ofImmunological Interest,4th edition)，美国卫生与人类服务部公共卫生服务局(US Department of Health and Human Services,Public HealthService(1987)；Chothia和Lesk(1987))。根据使用22个已知人类VHIII序列作为对象所进行的调查获得的人类VH第III亚组的共有序列，以及根据使用30个已知人类κ链I序列作为对象所进行的调查获得的人类VLκ链第I亚组的共有序列，描述在Padlan,Mol.Immunol,31:169(1994)和Padlan,Mol.Immunol,28:489(1991)中。因此，人类抗体包括其中一个或多个氨基酸残基已被在任选的其他人类抗体中存在的一个或多个氨基酸取代的抗体
抗IL-3Rα抗体的实例包括使用本技术领域中的已知方法制备的抗体，所述方法例如CDR嫁接(EP 239,400；WO91/09967；美国专利No.5,225,539；美国专利No.5,530,101；和美国专利No.5,585,089)、表面镶饰、表面重塑(EP592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunol.28:489(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7:805(1994)；Roguska等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 91:969(1994))和链改组(美国专利No.5,565,332)。为了产生人源化抗体，人类共有序列(Padlan,Mol.Immunol 31:169(1994)；和Padlan,Mol.Immunol.28:489(1991))已被使用(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol 151:2623(1993))。
术语“人源化”当用于指称抗体时，是指抗体的氨基酸序列在受体的人类免疫球蛋白分子中具有与目标抗原特异性结合的互补决定区(CDR)的一个或多个非人类氨基酸残基(例如小鼠、大鼠、山羊、兔等)，以及Fv构架区(FR)中的一个或多个人类氨基酸残基(位于CDR两侧的氨基酸残基)。被称为“灵长类化”的抗体在“人源化”的意义范围之内，只是受体人类免疫球蛋白分子和构架区的氨基酸残基，除了任何人类残基之外，可以是任何灵长类的氨基酸残基(例如猴、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、恒河猴)。免疫球蛋白的人类FR残基可以用相应的非人类残基取代。因此，例如，为了改变、通常是提高抗原亲和性或特异性，CDR或人类构架区中的残基可以替换成相应的来自非人类CDR或构架区供体抗体的残基。人源化抗体可以包含不能在人类抗体和供体CDR或构架序列中发现的残基。例如，可以预计，在特定位置处不能在人类抗体和供体非人类抗体中发现的FR取代，可以提高人类抗体在该位点处的结合亲和性或特异性。基于分子模拟的抗体构架和CDR取代在本技术领域中是公知的，例如通过模拟CDR和架构残基的相互作用来鉴定对于抗原结合来说重要的构架残基，以及通过序列比较来鉴定特定位置处的不常见构架残基(参见例如美国专利No.5,585,089；和Riechmann等，Nature,332:323(1988))。
在IL-3Rα抗体中包括嵌合抗体。根据本说明书，术语“嵌合”及其语法变化形式当用于指称抗体时，是指抗体的氨基酸序列包含一个或多个部分，其源自于两种或多种不同物种，从两种或多种不同物种获得或分离，或基于两种或多种不同物种。例如，抗体的一部分可以是人类的(例如恒定区)，并且抗体的其他部分可以是非人类的(例如小鼠重链或小鼠轻链可变区)。因此，嵌合抗体的实例包括其中抗体的不同部分源自于不同物种的抗体。与人源化或灵长类化抗体不同，嵌合抗体可以在抗体的任意区域中具有不同物种的序列。
用于生产嵌合抗体的方法在本技术领域中是已知的(例如Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125:191(1989)；美国专利No.5,807,715；美国专利No.4,816,567；和美国专利No.4,816,397)。例如，在Munro,Nature 312:597(1984)；Neuberger等，Nature 312:604(1984)；Sharon等，Nature 309:364(1984)；Morrison等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 81:6851(1984)；Boulianne等，Nature 312:643(1984)；Capon等，Nature337:525(1989)；和Traunecker等，Nature 339:68(1989)中，嵌合抗体中源自于一个物种的抗体可变区被源自于另一个物种的抗体可变区代替。
此外，抗IL-3Rα抗体可以通过杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术及其组合来制备(参见美国专利No.4,902,614、美国专利No.4,543,439和美国专利No.4,411,993；也参见《单克隆抗体，杂交瘤：新维度生物分析》(Monoclonal Antibodies.Hybridomas:A NewDimensionin Biological Analyses)，Plenum Press,Kennett,McKearn和Bechtol等，1980，以及Harlow等，《抗体实验指南》(Antibodies:ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，1988)。
本发明的人类抗人类IL-3Rα抗体使用染色体转移小鼠(KM小鼠(注册商标))产生，所述小鼠用各种形式的可溶型重组人类IL-3Rα蛋白或表达IL-3Rα的细胞系来免疫(WO02/43478，WO02/092812和Ishida等，《IBC第11次抗体工程会议摘要》(IBC's 11thAntibodyEngineering Meeting,Abstract(2000))。因为人类抗人类IL-3Rα抗体可检测染色的不是未转化的亲代细胞系，而是人类IL-3Rα稳定转染的细胞系例如Jurkat-IL-3Rα细胞和L929-IL-3Rα细胞，因此特异性显示与人类IL-3Rα结合的抗体。
本发明的抗体可以具有κ轻链序列或λ轻链序列、如天然存在的抗体中所存在的它们任一种的全长、其混合物(即κ链序列与λ链序列的融合产物)及其子序列/片段。天然存在的抗体分子含有两个κ轻链或两个λ轻链。
本发明提供了用于制备与IL-3Rα特异性结合的抗体的方法。在特定实施方案中，制备IL-3Rα抗体的方法包含将人类IL-3Rα、其子序列或其片段(例如IL-3Rα细胞外区域)，如果需要与人类Fc重组蛋白偶联，给药于能够表达人类免疫球蛋白的动物(例如转基因小鼠或转基因牛)，筛选表达人类IL-3Rα抗体的动物，选择产生人类IL-3Rα抗体的动物，以及从所选动物分离抗体。在实施方案中，人类IL-3Rα抗体是否具有IL-3Rα拮抗或激动活性通过该方法判断。
效应细胞活性是指通过抗体的Fc区的抗体依赖性活性，已知的例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒性(CDC活性)、由吞噬细胞例如巨噬细胞和树突状细胞进行的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADP活性)等。
作为控制本发明的抗IL-3Rα单克隆抗体的效应细胞活性的方法，实例包括控制与抗体Fc区的297位天冬氨酸(Asn)结合的复合物类型的N-连接糖链的还原端中，通过α-1,6键与N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量的方法(WO2005/035586、WO2002/31140和WO00/61739)，通过修饰抗体Fc区的氨基酸残基进行控制的方法等。效应细胞活性可以通过向本发明的抗IL-3Rα单克隆抗体使用这些方法中的任一种来控制。
通过控制抗体Fc的复合物类型的N-连接糖链的核心岩藻糖含量，可以增加或降低抗体的效应细胞活性。作为降低与结合抗体Fc的复合物类型的N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以提到的是脱岩藻糖化作用(脱岩藻糖化或非岩藻糖化)。脱岩藻糖化作用是使用α-1,6-岩藻糖基转移酶基因被缺失的CHO细胞来表达抗体，并可以获得不与岩藻糖结合的抗体。不与岩藻糖结合的抗体具有高的ADCC活性。另一方面，作为增加与结合抗体Fc的复合物类型的N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以通过使用导入了α-1,6-岩藻糖基转移酶基因的宿主细胞表达抗体来获得与岩藻糖结合的抗体。与岩藻糖结合的抗体与不与岩藻糖结合的抗体相比，具有较低的ADCC活性。
此外，可以通过修饰抗体Fc区的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性和CDC活性。例如，可以使用在US 2007/0148165中描述的Fc区的氨基酸序列来增加抗体的CDC活性。此外，可以通过执行在US6,737,056、US 7,297,775和US 7,317,091中描述的氨基酸修饰来增加或降低ADCC活性或CDC活性。此外，可以通过在一个抗体中使用组合的上述方法，来获得其中抗体的效应细胞活性被控制的抗体。
根据本发明，进一步提供了本发明的例如载体等的核苷酸序列。在实施方案中，载体包含编码IL-3Rα抗体或其子序列或片段的核酸序列。
核酸可以具有各种不同长度。编码本发明的IL-3Rα抗体或其子序列的核酸的长度一般约为100至600个核苷酸，或涵盖在上述长度范围内的任何数值或范围；100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、400至450、450至500、500至550或550至600个核苷酸长，或在上述长度范围内或涵盖上述长度范围的任何数值或范围。编码本发明的IL-3Rα抗体或其子序列的核酸长度的实例一般包括10至20、20至30、30至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至400、400至500、500至600个核苷酸，以及在这些长度内或涵盖这些长度的任何数值或范围。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指通过磷酸酯键或等效的键相连的至少两个或多个核糖或脱氧核糖核酸碱基对(核苷酸)。核酸包括多核苷酸和多核苷。核酸包括单分子、双分子、三分子、环状分子或线性分子。核酸的实例包括RNA、DNA、cDNA、基因组核酸、天然存在的核酸和非天然核酸例如合成的核酸，但不限于此。短的核酸和多核苷酸(例如10至20、20至30、30至50、50至100个核苷酸)通常被称为单链或双链DNA的“寡核苷酸”或“探针”。
核酸可以使用各种标准克隆技术和化学合成技术来制备。技术的实例包括但不限于核酸扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其使用基因组DNA或cDNA靶，并使用可以与抗体编码序列退火的引物(例如简并引物混合物)。此外，核酸也可以通过化学合成(例如固相氨基磷酸酯合成)或从基因转录来制备。然后，在将制备的序列克隆到质粒中然后扩增，或体外翻译所述序列后，制备的序列可以被细胞(例如宿主细胞例如酵母、细菌或真核细胞(动物或哺乳动物细胞或在植物中))表达。
载体是可以通过插入或掺入核酸进行操作的媒介。载体的实例包括质粒载体、病毒载体、原核细胞(细菌)载体和真核细胞(植物、真菌、哺乳动物)载体。载体可用于核酸的体外或体内表达。这样的载体被称为“表达载体”，可用于转移包括编码IL-3Rα抗体或其子序列或片段的核酸的核酸，以及通过体外(例如在溶液中或在固相上)、通过细胞或通过在对象体内来表达被编码的蛋白。
此外，载体可用于核酸的操作。对于遗传操作来说，可以使用“克隆载体”在体外(例如在溶液中或在固相上)、在细胞中或在对象体内对插入的核酸进行转录和翻译。
一般来说，载体含有复制原点，用于在细胞中在体外或体内扩增。如果需要，可以包括控制元件例如载体中存在的表达控制元件，以便于转录和翻译。
载体可以包括选择标志物。“选择标志物”是允许对含有基因的细胞进行选择的基因。“正选择”是指通过正向选择来选择含有选择标志物的细胞的方法。药物抗性是正选择标志物的实例，含有标志物的细胞将在含有药物的培养基中存活，而不含标志物的细胞将死亡。选择标志物的实例包括药物抗性基因，例如提供对G418的抗药性的neo、提供对潮霉素的抗药性的hygr、提供对嘌呤霉素的抗药性的puro等。其他正选择标志物包括能够鉴定或筛选含有标志物的细胞的基因。这些基因的实例包括荧光蛋白(GFP和GFP样发色团、萤光素酶)基因、lacZ基因、碱性磷酸酶基因和表面标志物例如CD8。“负选择”是指通过暴露于适合的负向选择药剂杀死含有负选择标志物的细胞的方法。例如，含有单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因的细胞(Wigler等，Cell,11:223(1977))对药物更昔洛韦(GANC)敏感。类似地，gpt基因使细胞对6-硫代黄嘌呤敏感。
病毒载体包括基于下列病毒的载体：反转录病毒(不仅感染分裂中的细胞而且感染未分裂细胞的慢病毒)，泡沫病毒(美国专利No.5,624,820、美国专利No.5,693,508、美国专利No.5,665,577、美国专利No.6,013,516和美国专利No.5,674,703；WO 92/05266和WO92/14829)，腺病毒(美国专利No.5,700,470、美国专利No.5,731,172和美国专利No.5,928,944)，腺相关病毒(AAV)(美国专利No.5,604,090)，单纯性疱疹病毒载体(美国专利No.5,501,979)，细胞肥大病毒(CMV)系统载体(美国专利No.5,561,063)，呼肠孤病毒，轮状病毒基因组，猿猴病毒40(SV40)或乳头瘤病毒(Cone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6349(1984)；《真核病毒载体》(EukaryoticViral Vectors)，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman主编，1982；Sarver等，Mol.Cell.Biol,1:486(1981)；美国专利No.5,719,054)。腺病毒有效侵染缓慢复制的和/或终端分化细胞，并可用于靶向缓慢复制的细胞和/或终端分化细胞。可用于表达的病毒载体的其他实例包括细小病毒、诺沃克病毒、冠状病毒、副粘液病毒和杆状病毒、披膜病毒(例如辛德毕斯病毒和Semliki森林病毒)以及疱疹性口腔炎病毒(VSV)。
包含核苷酸的载体，当核酸与表达元件相连以发挥作用时，可以被表达。术语“相连以发挥作用”(可操作连接)是指所指称的元件之间的物理或功能关系允许它们以所打算的方式运作。因此，核酸与表达控制元件可操作连接是指控制元件调节核酸转录并在适合情况下调节转录产物的翻译。
“表达控制元件”或“表达控制序列”是影响可操作连接的核酸的表达的多核苷酸。启动子和增强子是表达控制元件和序列的非限制性的具体实例。“启动子”是顺式作用的DNA调控区，其能够起始下游(3’方向)核酸序列的转录。加速转录起始的核苷酸包含在启动子序列中。增强子也调控核酸的表达，但是在远离与其可操作连接的核酸的转录起始位点处起作用。当增强子存在于核酸的5’或3’末端以及核酸内部(例如内含子或编码序列)时，增强子也起作用。表达控制元件的其他实例包括前导序列和融合配偶体序列、用于制备多基因或多顺反子信使的内部核糖体进入位点(IRES)元件、用于维持基因的正确阅读框以使mRNA能够框内翻译的内含子拼接信号、为目标转录产物产生正确的多腺苷化的多腺苷化信号和终止密码子。
表达控制元件的实例包括“组成型”元件，其中可操作连接的核酸的转录不需要信号或刺激物的存在即可发生。对信号或刺激物做出响应而产生表达和增加或降低可操作连接的核酸的表达的表达控制元件是“可调节的”。对信号或刺激物做出响应而增加可操作连接的核酸的表达的可调节元件，被称为“诱导型元件”。对信号或刺激物做出响应而降低可操作连接的核酸的表达的可调节元件，被称为“阻遏型元件”(即信号降低表达；并且当信号被移除或不存在时表达增加)。
用于细菌表达的组成型启动子的实例包括例如λ噬菌体的T7和pL、plac、ptrp和ptac(ptrp-lac杂合启动子)等启动子。对于昆虫细胞系统来说，可以使用组成型或诱导型启动子(例如蜕皮激素启动子)。用于酵母的组成型启动子包括诱导的启动子例如ADH、LEU2、GAL等(例如参见Ausubel等，《分子生物学现代方法》(Current Protocolsin Molecular Biology)，Vol.2，第13章，Greene Publish.Assoc.&WileyInterscience edition,1988；Grant等，《酶学方法》(Methods inEnzymology)，153:516-544(1987)Wu&Grossman,1987,Acad.Press,N.Y.；Glover，《DNA克隆》(DNA Cloning)，Vol.11，第3章，IRLPress,Wash.,D.C.,1986；Bitter,《酶学方法》(Methods in Enzymology)，152:673-684(1987)，Berger&Kimmel主编，Acad.Press,N.Y.；以及Strathern等，《酵母菌的分子生物学》(The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces)，Cold Spring Harbor Press，Vol.1和Vol.11(1982))。
对于在哺乳动物中表达来说，可以使用源自于病毒或其他来源的组成型启动子。例如，可以使用源自于CMV、SV40或病毒长末端重复序列(LTR)，或哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白IIA启动子、热休克蛋白启动子、甾体/甲状腺激素/视黄酸响应元件)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、小鼠乳腺癌病毒LTR)的诱导型启动子。
表达控制元件的实例包括在特定组织或细胞类型中有活性的元件，这样的元件被称为“组织特异性表达控制元件”。一般来说，组织特异性表达控制元件在特定细胞或组织类型中与其他细胞或组织类型相比更有活性，这是因为该组织特异性表达控制元件，被在特定细胞或组织类型中有活性的转录激活蛋白或其他转录因子所识别。这样的表达控制元件的非限制性的具体实例是己糖激酶II、COX-2、α-胎蛋白、癌胚抗原、DE3/MUC1、前列腺特异抗原、C-erB2/neu、葡萄糖依赖性胰岛素分泌刺激性多肽(GIP)、端粒酶反转录酶和启动子例如缺氧响应性启动子。
根据本发明，提供了用本发明的IL-3Rα核酸或载体转化或转染的宿主细胞。宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞和真核细胞，例如细菌、真菌(酵母)和植物、昆虫和动物(例如哺乳动物例如灵长类、人类等)的细胞。被转化的细胞的非限制性实例包括用重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞；用重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞；以及用重组病毒表达载体(例如反转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞或被操作用于稳定表达的转化的动物细胞。CHO细胞是表达IL-3Rα抗体及其子序列和片段的哺乳动物宿主细胞的非限制性实例。宿主细胞可以是来自于原初细胞分离系的多个细胞或细胞群体、分离的次级细胞或传代培养细胞或建立的细胞系或永生化细胞培养物。
术语“被转化”或“被转染”当用于指称细胞(例如宿主细胞)或生物体时，是指在将外源分子例如蛋白或核酸(转入基因)引入到细胞中后，细胞中基因的改变。因此，“被转染”或“被转化”的细胞是其中通过人工通过例如重组DNA技术引入了外源分子的细胞或其后代。
核酸或蛋白可以被稳定或暂时转染或转化(表达)在细胞或其后代中。导入的蛋白可以通过生长细胞或转录核酸来表达。因为在复制期间有可能发生突变，因此存在着被转染或转化的细胞的后代与亲代细胞不同一的情况。
一般来说，在细胞转染或转化中使用载体。载体可以包含在病毒粒子或囊泡中，并可以任选地通过将蛋白包含在与靶细胞配体或受体结合的粒子或囊泡的表面上，根据需要定向到特定细胞类型。因此，通过制备用于体外、离体或体内转染或转化目的病毒粒子或囊泡本身或病毒表面蛋白，可以将细胞用作靶。因此，载体包括将病毒和非病毒载体体外、体内和离体递送到细胞、组织或器官中的技术。
此外，将核酸引入靶细胞(例如宿主细胞)，也可以通过本技术领域公知的方法来进行，例如渗透冲击(例如磷酸钙)、电穿孔、微注射、细胞融合等。核酸和多肽的体外、离体和体内导入也可以使用其他技术来进行。例如聚合物质例如聚酯、聚酰胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或乳酸交酯/乙醇酸交酯共聚物、聚乳酸交酯/乙醇酸交酯共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等。核酸可以通过凝聚技术或通过界面聚合，分别包封在羟甲基纤维素或明胶微胶囊或使用聚甲基丙烯酸甲酯制备的微胶囊或胶体系统中。胶体分散系统包括基于聚合物复合物、纳米粒子、微球、珠子或脂类(水包油类型的乳液、微胶粒、混合的微胶粒、脂质体等)的系统。
用于将各种组合物导入细胞的脂质体在本技术领域中是公知的，其中包括例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、lipofectin和DOTAP(例如美国专利No.4,844,904、美国专利No.5,000,959、美国专利No.4,863,740和美国专利No.4,975,282，以及GIBCO-BRL,Gaithersburg,Md.)。可用于基因治疗的基于哌嗪的两亲性阳离子脂类(参见例如美国专利No.5,861,397)也是已知的。阳离子脂类系统也是已知的(参见例如美国专利No.5,459,127)。在本说明书中，聚合物质、微胶囊和胶体分散系统(脂质体等)合称为“囊泡”。
此外，可使用在生产抗体的方法中的适合技术的实例是亲和纯化、非改性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、孔径排阻、通过蛋白A柱纯化以及这些技术的任选组合。可以使用ELISA测定法确定IL-3Rα抗体同种型，并且例如可以使用吸附抗人类Ig的小鼠Ig来鉴定人类Ig。
结合亲和性可以通过结合(Ka)和解离(Kd)速率来确定。平衡亲和常数KD是Ka/Kd的比率。结合(Ka)和解离(Kd)速率可以使用表面等离子共振(SPR)来测量(Rich和Myszka,Curr.Opin.Biotechnol.,11:54(2000):Englebienne,Analyst.,123:1599(1998))。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是公知的并可商购(BiaCore2000,Biacore AB,Upsala,Sweden；以及Malmqvist,Biochem.Soc.Trans.,27:335(1999))。KD值可以被定义为饱和IL-3Rα上的一半结合位点(50％)所需的IL-3Rα抗体浓度。
(在灵长类中的交叉性质)
目前，尽管在世界上正开发多达500种治疗性抗体，也就是说人类抗体有很大可能性能够避免免疫原性问题。但另一方面，在许多情况下人类抗体的药效完全不能在啮齿动物中表现出来。在这样的情况下，在许多情况下在毒性测试中不得不使用灵长动物，此外，只在黑猩猩中发现反应性，这在许多情况下并不罕见。当只能在黑猩猩中发现药理反应时，毒性测试受到更显著的限制。首先，能够进行黑猩猩试验的场所相当有限，在许多情况下个体感染HIV，并且还存在参与实验的工人的劳动卫生的问题。此外，对于黑猩猩来说，还存在着最终给药后的解剖试验不能进行以及生殖毒性试验也不可能进行等大量限制。因此，从对于开发药物来说必需的高级毒性试验的观点来看，在猴(食蟹猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatto))中验证药效的能力是有用的。
关于使用猴用来证实猴交叉反应性的方法，它可以通过公知的方法例如免疫化学组织染色方法、固相酶免疫测定法(在后文中称为“ELISA”)流式细胞术(FCM)等来证实。
(药物组合物)
抗体可以包含在药物组合物中。在实施方案中，抗体包含可药用载体、稳定剂或填充剂，并被制备成水溶液或作为冷冻干燥制剂的形式。典型情况下，使用适量可药用盐使药物制剂等渗。可接受的载体、稳定剂或填充剂的实例包括缓冲溶液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等；低分子量(残基数量少于10)多肽；蛋白例如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白等；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸等；单糖二糖和其他糖类，例如葡萄糖、甘露糖、糊精等；螯合剂例如EDTA等；甜味剂例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇等；成盐平衡离子例如钠等；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；防腐剂(十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯例如对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM、聚乙二醇(PEG)等。
(靶向IL-3Rα表达细胞的抗肿瘤物质的治疗应用)
对治疗应用进行检验的疾病的实例，包括但不限于被认为可以通过结合或靶向表达IL-3Rα的细胞来治疗的疾病，所述细胞例如血液肿瘤细胞(AML细胞、CML细胞、MDS细胞、ALL细胞、CLL细胞、多发性骨髓瘤细胞等)、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、辅助性T细胞(例如Th1细胞、Th17细胞)、调节性T细胞(例如CD4阳性CD25阳性细胞)、抗原呈递细胞(例如树突状细胞、单核细胞-巨噬细胞和相关细胞(肝星状细胞、破骨细胞、小神经胶质细胞、表皮内巨噬细胞、尘细胞(肺泡吞噬细胞)等))。
对治疗应用进行检验的疾病的实例，包括其中在骨髓或外周血中发现IL-3Rα表达的血液疾病。具体实例可以包括急性骨髓性白血病(AML)。根据能够确定从造血干细胞分化成各种血细胞的过程中细胞中的那个细胞阶段引起致瘤性转化的FAB分类标准(法国-美国-英国标准)，急性骨髓性白血病被分类成M0(微分化类型的成髓细胞性白血病)、M1(未分化的成髓细胞性白血病)、M2(已分化的成髓细胞性白血病)、M3(急性早幼粒细胞性白血病)、M4(髓单核细胞性白血病)、M5(单核细胞性白血病)、M6(红白血病)、M7(巨核细胞性白血病)疾病类型及其亚型。此外，疾病的其他实例包括急性淋巴细胞性白血病、非典型白血病、慢性淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、颗粒状淋巴细胞增生(LGL白血病)、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、高嗜酸性粒细胞综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大B-细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤和巨大淋巴结增生症。
本发明的包含给药或递送靶向表达IL-3Rα的细胞的IL-3Rα抗体和抗肿瘤物质的方法，可以通过任何可接受的方法来进行。在具体实施方案中，它们被局部、区域性或系统性给药于对象。
此外，对于IL-3Rα抗体来说，靶向表达IL-3Rα的细胞的用于治疗上面提到的疾病的抗肿瘤物质，也可以考虑与适合于同样疾病的其他治疗药剂(典型为化疗药剂)组合，或与放疗组合给药。适合的其他治疗药剂的实例包括化疗药剂例如阿糖胞苷(Ara-C)、蒽环系统抗肿瘤药剂(典型为柔红霉素(DNR)、伊达比星(IDA))等、分化诱导治疗药剂例如全反式视黄酸(ATRA)、亚砷酸、Am80(他米巴罗汀)、吉妥珠单抗-奥唑米星(奥唑米星-抗CD33抗体偶联物)、托泊替康、氟达拉滨、环孢霉素、米托蒽醌(MIT)、干扰素和伊马替尼，但不限于此，并且还包括与被认为在临床上有效的治疗方法的组合。
哺乳动物(例如人类)被包括在可以通过本发明治疗的对象中。在具体实施方案中，对象是血液肿瘤候选者或接受血液肿瘤治疗的对象，有可能引起IL-3Rα介导的细胞应答的对象或接受IL-3Rα介导的细胞应答的治疗的对象，作为髓细胞性恶性肿瘤候选者的对象或接受髓细胞性恶性肿瘤治疗的对象，或作为急性骨髓性白血病候选者的对象或接受急性骨髓性白血病治疗的对象。
更具本说明书，术语“治疗”及其语法变化形式是指对每个希望获得生理效应或在患者上获得良好结果的对象执行的方案、计划、过程或改善方法。因此，本发明的方法包括特别是对给定对象的障碍、疾病、病理、疾病状况或症状产生可测量的改进或有益效果的治疗和治疗方法。可测量的改进或有益效果是障碍、疾病、病理、疾病状况或症状中的任一种的客观或主观的、不适中的、暂时或长期的改进，或与障碍、疾病、生理条件、病理或状态相关或由其引起的不利症状的发作、严重性、持续时间或频率的减少。根据本发明的方法，有可能其效果不总是立即显现，而是随着时间的过去，在较晚些时候发现最终的改进或有益效果，由此在给定对象中将出现稳定或改善。
除非另有指明，否则在本说明书中使用的所有技术术语和科学术语，具有与本发明所涉及的技术领域中的专业人员所通常理解的相同的意义。与本说明书中所描述的类似或等效的方法和材料可用于本发明的操作或检验中，但是在本说明书中所描述的是适合的方法和材料。
实施例
实施例1人类、食蟹猴(Macaca fascicularis)或恒河猴(Macacamulatto)IL-3Rα表达细胞的制备
(IL-3RαcDNA的分子克隆和表达载体的制备)
使用ExTaq(TAKARA BIO INC.)，通过PCR从血细胞来源的DNA(CLONTECH Human MTC Panel)扩增了人类IL-3RαcDNA。作为PCR装置，使用了GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems，在后文中，在本说明书中PCR装置是相同的)。对于PCR来说，在94℃5分钟的变性步骤后，将94℃30秒—55℃30秒—72℃2分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99℃30秒的反应。使用的PCR引物如下：
IL-3Rα_Fw：5’-CGGCAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCAC-3’(SEQ ID NO:3)
IL-3Rα_Re：5’-ATTGCGGCCGCTCAAGTTTTCTGCACGACCT-3’(SEQ ID NO:4)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1.2kb的条带，并用JetSob(Genomed)提取。将提取到的DNA用MfeI和NotI消化，与用EcoRI和NotI消化过的pEGFP-N1载体(Clontech)或pEF6/Myc-His载体混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用LA Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)，通过直接菌落PCR进行pEGFP-N1载体的插入检查。对于PCR来说，在94℃5分钟的变性步骤后，将94℃30秒—55℃30秒—72℃2分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99℃30秒的反应。关于所用的引物，使用了IL-3Rα-Fw和IL-3Rα-Re。
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1.2kb扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。在测序样品的反应中，使用了BigDye(R)Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)(它们用于本说明书中所有的DNA序列分析中)。关于引物，使用了IL-3Rα-Fw、IL-3Rα-Re和下列引物。
IL-3Rα_seqF 1：5’-GTCTTCACTACAAAACGGAT-3’(SEQ ID NO：5)
使用ABI 3700XL DNA分析仪(Applied Biosystems)作为序列分析装置。选择与GenBank关联号NP-002174.1的编码区具有相同序列的克隆，并通过Miniprep方法提取质粒DNA。载体名分别是pEGFR-N1/hCD123和pEF6/Myc-His/hCD123。
插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。
CAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCGCCCTGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGAACCTAAGGATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACCGATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATGCCGGCAGTGAACAATAGCTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAGTACGAGTGTCTTCACTACAAAACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACATCTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGGAGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGATTGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCTTTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTTCAGATACAAAAGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGAACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCCGGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCCTGGTCTGTGTCTTCGTGATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGACTCTTTCCCCGCATCCCTCACATGAAAGACCCCATCGGTGACAGCTTCCAAAACGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGACTGAAGTACAGGTCGTGCAGAAAACTTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO：6)
通过PCR方法，使用LA Taq(TAKARA BIO INC)，从食蟹猴骨髓来源的cDNA或恒河猴骨髓来源的cDNA扩增了食蟹猴和恒河猴cDNA样品。使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)作为PCR装置。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒-56℃15秒-72℃70秒的三步反应执行40个循环，然后执行72℃2分钟的反应。根据hIL-3Rα cDNA序列，通过对恒河猴基因组的公共数据库(http：//www.hgsc.bnm.tmc.edu/blast.hgsc)进行BLAST检索获得了子序列，用于设计引物。所使用的引物序列如下。
Rhe123Fw1：CGGCAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTG(SEQ IDNO：7)
Rhe 123Rv1：TATATTGCGGCCGCTCAAGTTTTCTCCACCACCTGCAC(SEQ ID NO：8)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1.2kb的条带，并用凝胶提取试剂盒(QIAGEN)提取。将如此提取到的DNA与pGEM-T Easy载体(Promega)混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，通过直接菌落PCR进行pGEM-T Easy载体的插入检查。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒-56℃15秒-72℃1分钟的三步反应执行35个循环，然后执行72℃2分钟的反应。使用了下列引物：
T7：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO:9)
SP6：GATTTAGGTGACACTATAG(SEQ ID NO:10)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1.2kb扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。作为PCR引物，使用了T7和SP6。选择通过PCR显示出没有突变的菌落，并通过Miniprep方法提取其质粒DNA。将由此获得的DNA用MfeI和NotI消化，与用EcoRI和NotI消化过的pEGFP-N1载体(Clontech)混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，铺于LB平板(含卡那霉素)上。
使用La Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)，通过直接菌落PCR进行pEGFP-N1载体的插入检查。对于PCR来说，在94℃5分钟的变性步骤后，将94℃30秒—55℃30秒—72℃2分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99℃30秒的反应。关于所用的PCR引物，使用了Rhe123Fw1和Rhe123Rv1。
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1.2kb扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。在测序样品的反应中，使用了BigDye(R)Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)(它们用于本说明书中所有的DNA序列分析中)。关于引物，使用了Rhe123Fw1和Rhe123Rv1。载体分别命名为pEGFR-N1/cyCD123和pEGFR-N1/rhCD123。
食蟹猴IL-3Rα的插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。
CAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTGCTCCTGGTCGCCACGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAGGATCCAAATGCACCAATCAGGAATCTAAGGATGAAAGAAAAGGCTCAGCAGTTGATGTGGGACCTGAACAGAAACGTGACCGACGTGGAGTGTATCAAAGGCACCGACTATTCTATGCCGGCAATGAACAACAGCTATTGCCAGTTCGGAGCCATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAGTCCCCCGTTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGACGCCTCAGGCAGGCGCGGAGAATCTGACCTGCTGGGTTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGTGGCAGGCCCGGCGGCCCCCGCTGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACAATCCCAACAGCCACGAACAGTACAGGTGCCTTCACTACAAAACGGATGCTCGGGGAACACAGATCGGGTGTCGGTTCGATGACATCGCTCGACTCTCCCGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGAGGGGCAGGAGCGCAGCCGTCAGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCTTCTTTTCACAGATTGAGAGATTAACTCCACCCAACATGACTGGAGAGTGTAATGAGACACATTCCTTCATGCACTGGAAAATGAAAAGTCATTTCAATCGCAAATTCCGCTATGAGCTTCGGATCCAAAAGAGAATGCAGCCTGTAAGGACAGAACAGGTCAGAGACACAACCTCCTTCCAGCTACCCAATCCTGGAACGTACACAGTGCAAATAAGAGCCCGGGAAACAGTGTATGAATTCTTGAGTGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCGAGCTCGCGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCTTGCTCTGTGTGTTCCTCATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGGCTGTTTCCCCGCATCCCACACATGAAAGACCCCATCGGTGACACCTTCCAACAGGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGTCTGAAGTGCAGGTGGTGGAGAAAACTTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO：11)
恒河猴IL-3Rα的插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。
CAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTGCTCCTGGTCGCCACGCCCTGTCTCCTGCAAACCAAGGAGGATCCAAATGCACCAATCAGGAATCTAAGGATGAAAGAAAAGGCTCAGCAGTTGATGTGGGACCTGAACAGAAACGTGACCGACGTGGAGTGTATCAAAGGCACCGACTATTCTATGCCGGCAATGAACGACAGCTATTGCCAGTTCGGAGCCATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAGTCCTCCGTTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGACGCCTCGGGCAGGCGCGGAGAATTTGACCTGCTGGGTTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGTGGTAGGCCCGGCGGCCCCCGCTGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACAATCCCAACAGCCACGAACAGTACAGGTGCCTTCGCTACAAAACGGATGCTCGGGGAACACAGATCGGGTGTCGGTTCGATGACATCGCTCGACTCTCCCGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGAGGGGCAGGAGCGCAGCCGTCAGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCTTCTTTTCACAGATTGAGAGATTAACTCCACCCAACATGACTGGAGAGTGTAATGAGACACATTCCTTCATGCACTGGAAAATGAAAAGTCATTTCAATCGCAAATTCCACTATGAGCTTCGGATCCAAAAGAGAATGCAGCCTGTAAGGACAGAACAGGTCAGAGACACAACCTCCTTCCAGCTACCCAATCCTGGAACGTACACAGTGCAAATAAGAGCCCGGGAAACAGTGTATGAATTCTTGAGTGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCGAGCTCGCGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCTTGCTCTGTGTGTTCCTCATCTGCAGAAGGTATCTGGTGATGCAGAGGCTGTTTCCCCGCATCCCACACATGAAAGACCCCATCGGTGACACCTTCCAACAGGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCAAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGTCTGAAGTGCAGGTGGTGGAGAAAACTTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO：12)
(IL-3Rα强制表达细胞系的制备)
使用电穿孔(BTX)，用pEGFP-N1载体/hCD123或pEF6/Myc-His载体/hCD123感染L929细胞(由ATCC制造)和Colon-26细胞(由ATCC制造)。具体来说，将10至20μgDNA与10万个细胞混合，并使其在300V和950μF反应。关于细胞，对pEGFP-N1/hCD123来说使用新霉素(Calbiochem)或对于pEF6/Myc-His/hCD 123来说使用灭瘟素(Invitrogen)来筛选药物抗性细胞。对于由此选择到的细胞，使用流式细胞仪(FAC SVantage、FACSAria等，BD Biosciences)通过分拣进一步选择GFP阳性细胞或高表达IL-3Rα(CD 123)的细胞，并分别命名为L929/hCD123和Colon-26/hCD123。
对于食蟹猴IL-3Rα和恒河猴IL-3Rα强制表达细胞的制备来说，它们也以与人类IL-3Rα强制表达细胞的情况相同的方式，使用L929和Colon-26来制备，并命名为L929/cyCD123、Colon-26/cyCD123、L929/rhCD123和Colon-26/rhCD123。
实施例2制备IL-3Rα细胞外区域的可溶形式
(制备人类IL-3Rα细胞外区域表达载体的可溶形式)
通过PCR方法扩增编码人类IL-3Rα细胞外区域的cDNA，并将FLAG标签连接到它的下游。具体来说，使用pEF6/Myc-His/hCD123质粒DNA作为模板，使用Platinum Pfu聚合酶(Invitrogen)，通过PCR扩增编码人类IL-3Rα细胞外区域的cDNA。对于PCR来说，在96℃2分钟的变性步骤后，将96℃20秒—55℃30秒—68℃65秒的三步反应执行30个循环。所使用的引物是IL-3Rα-Fw和下列引物。
hIL-3Rαsol-FLAG-NotI：
5’-ATTGCGGCCGCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAGTCCCGCCAGGCACGTGTGTTTG-3’(SEQ ID NO:13)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。将DNA用JetSorb(Genomed)提取。将如此纯化的DNA用MfeI和NotI消化，并再次进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。切下约1.0kb的条带，并用JetSorb(Genomed)提取。将获得的DNA和已用与纯化DNA相同的切开的pTracer-CMV/Bsd载体混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，铺于LB平板(含氨苄青霉素)上。使用LA Taq(Takara ShuzoCo.,Ltd.)，通过直接菌落PCR进行插入检查。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒—56℃15秒—72℃40秒的三步反应执行35个循环，然后执行72℃2分钟的延伸反应。所用的PCR引物是IL-3Rα-Fw和IL-3Rαsol-FLAG-NotI。
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。通过Miniprep方法从其中获得了约1.0kb扩增产物的菌落提取质粒DNA。通过DNA序列分析发现纯化的质粒DNA具有与GenBank登记号NP-002174.1的相应区域同一的序列。
插入片段的序列(MfeI至NotI)如下。
CAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCGCCCTGCCCTGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGAACCTAAGGATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACCGATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATGCCGGCAGTGAACAATAGCTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCCGAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGGGAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAGTACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAGTACGAGTGTCTTCACTACAAAACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACATCTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGGAGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGATTGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCTTTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTTCAGATACAAAAGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGAACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCCGGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGGACTACAAGGATGACGACGATAAGTGAGCGGCCGC(SEQ ID NO：14)
(可溶形式的人类IL-3Rα蛋白的制备)
使用QIAGEN质粒大提试剂盒纯化含有可溶形式IL-3Rα序列的pTracer CMV表达载体的质粒DNA。使用CHOrasl细胞作为用于表达的宿主细胞。CHOrasl细胞使用SFMII培养基(Invitrogen)振摇培养(37℃，5％CO2)。
在基因导入中使用PEI方法。将MW 25，000的直链聚乙烯亚胺(Polysciences)称重并溶解在PBS中，同时用HCl调整到pH 7.0左右(1g/l)。将获得的溶液搅拌1小时，然后通过经孔径为0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(Millipore)过滤进行除菌。然后将1mg纯化的质粒DNA与20ml Opti-Pro SFM(Invitrogen)混合以获得溶液A。通过将2.5ml PEI溶液(1g/1)与20ml Opti-Pro SFM(Invitrogen)混合，制备了溶液B。在将溶液A和溶液B混合后，将其静置10分钟，并将获得的溶液加入到CHOras1细胞(每1ml 1,000,000个细胞)中。6天后，回收细胞上清液并用于蛋白纯化。
可溶形式人类IL-3Rα蛋白的纯化通过下列方法进行。在基因导入后6天通过离心回收含有可溶形式IL-3Rα蛋白的培养上清液，并通过滤器。将获得的溶液用Tris缓冲的盐水(TBS)稀释5倍，使用抗FLAGM2琼脂糖亲和凝胶(Sigma)制备抗FLAG柱，并使用HiLoad泵P-50(Pharmacia Biotech)向其施加溶液。使用FLAG肽(Sigma)并按照手册进行洗脱。将洗脱液分级成几个级分，将每个级分在还原条件下进行SDS-PAGE(MultiGel II Mini 10/20％梯度胶；Cosmo Bio Co.,Ltd.)，然后进行银染和Western印迹。银染使用银染试剂“Daiichi”(DaiichiPure Chemicals Co.,Ltd.)。将抗FLAG M2抗体(Sigma)和碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体用于Western印迹。将其中发现了目标蛋白的级分使用Amicon Ultra-410K(Millipore)浓缩，并使用Superdex 200gp(GE Healthcare)进行凝胶过滤层析。在分级后，将每个级分在还原条件下进行SDS-PAGE(MultiGel II Mini 10/20％梯度胶；Cosmo Bio Co.,Ltd.)，然后进行银染和Western印迹。银染使用银染试剂“Daiichi”(Daiichi Pure Chemicals Co.,Ltd.)。将抗FLAG M2抗体(Sigma)和碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体用于Western印迹。将其中发现了目标蛋白的级分使用Amicon Ultra-410K(Millipore)浓缩，并用PBS洗涤。通过使用孔径为0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(Millipore)过滤来进行除菌，获得了可溶形式的人类IL-3Rα蛋白。作为使用Limulus ES-II Kit Wako(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)进行Limulus试验的结果，没有检测到内毒素。对于可溶形式的人类IL-3Rα蛋白的浓度来说，测量280nm处的吸光度，并将1mg/ml计算为1.4OD。
实施例3使用产人类抗体的小鼠制备抗人类IL-3Rα人类抗体
(产人类抗体的小鼠)
在免疫接种中使用的小鼠具有内源Ig重链和κ轻链破坏两者的纯合的遗传背景，并且还同时保持含有人类Ig重链基因座(SC20)和人类Igκ链转入基因(KCo5)的第14号染色体片段。该小鼠通过将具有人类Ig重链基因座的株系A小鼠与具有人类Igκ链转入基因的株系B小鼠进行杂交来制备。株系A对内源Ig重链和κ轻链破坏两者是纯合的，是维持了可以传递给后代的第14号染色体片段(SC20)的小鼠株系，并描述在例如Tomizuka等的报道中[Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,Vol.97:722]。株系B也对内源Ig重链和κ轻链破坏两者是纯合的，是维持了人类Igκ链转基因(KCo5)的小鼠株系(转基因小鼠)，并描述在例如Fishwild等的报道中[Nat.Biotechnol(1996),114:845]。
在下面的免疫试验中使用了通过株系A雄性小鼠与株系B雌性小鼠的杂交或株系A雌性小鼠与株系B雄性小鼠的杂交获得的在血清中同时检测到人类Ig重链和κ轻链的个体[Ishida&Lonberg,IBC's11'Antibody Engineering,摘要2000]。就此而言，上面提到的产人类抗体的小鼠(被称为KM小鼠)，可以通过订立合同从Kyowa Hakko KirinCo.,Ltd.获得。
(针对人类IL-3Rα的人类单克隆抗体的制备)
对于本实施例中单克隆抗体的制备来说，它按照在《单克隆抗体实验操作指南》(A Guide to Monoclonal Antibody ExperimentalOperations)(用日文书写)(由Tamie Ando等主编，Kodansha出版，1991)等中描述的通用方法来制备。对于IL-3Rα来说，作为免疫原，使用了表达IL-3Rα的L929细胞(CCL-1,ATCC)、表达IL-3Rα的Colon-26细胞(Tohoku大学发育、衰老和癌症研究所生物医学研究细胞资源中心(Cell Resource Center for Biomedical Research Institute ofDevelopment,Aging and Cancer Tohoku University)或可溶形式的人类IL-3RαFc融合蛋白。作为待免疫的动物，使用了上面提到的KM小鼠。
为了制备针对人类IL-3Rα的人类单克隆抗体，将KM小鼠用实施例1中制备的表达IL-3Rα的L929细胞或表达IL-3Rα的Colon-26细胞，以每1周至2周每只动物1x107个细胞的剂量进行腹膜内免疫接种，总共接种4次。在如下所述提取脾脏前三天，通过尾静脉向每只小鼠个体给药20μg可溶形式的人类IL-3Rα蛋白。
在从被免疫小鼠通过手术获得脾脏后，将脾脏放入PBS中，并使用注射器活塞将其在筛网(细胞滤网，FALCON)上切碎。在将细胞悬液通过筛网并离心后，将获得的沉淀细胞重悬浮在红细胞裂解缓冲液(Sigma)中。在室温下温育5分钟后，向其加入含有350mg/ml碳酸氢钠、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的无血清DMEM培养基(Invitrogen)(在后文中称为“无血清DMEM培养基”)以沉淀细胞。通过再次悬浮在无血清DMEM培养基中，测量细胞数量。
另一方面，使用含有10％FCS(Invitrogen)、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM培养基(Invitrogen)(在后文中称为“含血清DMEM培养基”)，在37℃下，在5％二氧化碳存在下培养骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC No.CRL-1581)。将SP2/0细胞用无血清DMEM培养基清洗。采用同样方式，将细胞悬浮在无血清DMEM培养基中以测量细胞数量。在将回收的源自脾脏的细胞悬液与小鼠骨髓瘤悬液以5:1的细胞数量比例混合后，将混合的悬液离心，然后完全移除上清液。作为融合试剂，将50％(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer-Mannheim)缓慢加入到获得的细胞沉淀中，同时用移液器头搅拌沉淀，然后向其缓慢加入预先加热到37℃的无血清DMEM培养基。此外，向其缓慢加入适量的无血清DMEM培养基。然后将获得的溶液在5％二氧化碳存在下在37℃下静置5分钟。在离心后，除去上清液，并将由此获得的融合细胞悬浮在含有10％FCS(Invitrogen)、青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Sigma)、IL-6(5ng/ml)和2-巯基乙醇(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中(在后文中称为“含IL-6的DMEM培养基”)，并在5％二氧化碳存在下在37℃下培养。第二天，通过吸取回收细胞并通过离心进行沉淀。将获得的细胞沉淀重新悬浮在含有IL-6的DMEM培养基中。将悬浮的细胞在96孔板上进行有限稀释，并培养约7天至14天。将培养上清液用于下面的实施例中描述的杂交瘤筛选。
(筛选产生与人类IL-3Rα结合的人类单克隆抗体的杂交瘤)
杂交瘤的筛选使用在上述实施例中制备的细胞上清液来进行。简而言之，方法通过流式细胞术来进行，其中使用了稳定表达人类IL-3Rα的细胞。
具体来说，将表达人类IL-3Rα的L929细胞与亲代细胞系L929细胞的组合或表达人类IL-3Rα的Colon-26细胞与亲代细胞系Colon-26细胞的组合，与杂交瘤的上清液混合，并将其在4℃下静置30分钟。在将获得的细胞用染色培养基(Dulbecco的PBS，含有2％胎牛血清、2mM EDTA、0.05％NaN3)清洗两次后，向其加入作为第二抗体的山羊F(ab’)2抗人类IgG-PE(Southern Biotech)，并将其在4℃下静置30分钟。在用染色培养基清洗两次后，将获得的细胞通过FACSCalibur(BD Biosciences)进行分析。收集只与表达人类IL-3Rα的L929细胞反应的杂交瘤。
将所选的杂交瘤进行有限稀释，并使用其培养上清液进行筛选。具体来说，将每个表达人类IL-3Rα的L929细胞和亲代细胞系L929细胞与杂交瘤的上清液混合，并将其在4℃下静置30分钟。在用染色培养基清洗两次后，向其加入作为第二抗体的山羊F(ab’)2抗人类κ-PE(Dako)，并将其在4℃下静置30分钟。在用染色培养基清洗两次后，将细胞通过FACSCalibur(BD Biosciences)进行分析。收集只与表达人类IL-3Rα的L929细胞反应的杂交瘤。
实施例4重组抗人类IL-3Rα人类抗体的制备
(从杂交瘤获得抗人类IL-3Rα人类抗体基因和表达载体的制备)
从实施例3中获得的杂交瘤，使用含10ng/ml IL-6(R&DSystems)和10％胎牛血清(SIGMA)的eRDF培养基(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.,Ltd.)，对克隆名Old4、Old5、Old17、Old19、New102和Old6进行培养，然后通过离心收集细胞。然后向获得的细胞加入TRIZOL(GIBCO)，并按照说明书提取总RNA。抗体可变区cDNA的克隆，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)按照其随附的说明书来进行。
此外，从产生抗人类IL-3Rα小鼠抗体7G3的杂交瘤ATCC,HB12009克隆可变区，并用作对照。通过将如此获得的cDNA与编码人类IgG1恒定区的DNA相连，制备了嵌合抗体表达载体。具体来说，从低温保存的杂交瘤通过离心收集细胞，然后向其加入TRIZOL(GIBCO)，按照说明书提取总RNA。抗体可变区cDNA的克隆使用小鼠IgG抗体特异性引物以及SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，按照其随附的说明书来进行。
使用5μg总RNA作为模板，制备了第一链cDNA。
1)第一链cDNA的合成
总RNA 5μgm/3μL
5’CDS 1μL
SMART寡聚物1μL
在将包含上述组分的反应混合物在72℃下温育2分钟后，向反应混合物加入
5x缓冲液2μL
DTT 1μL
DNTP混合物1μL和
SuperscriptII 1μL
并在42℃下温育1.5小时。
向获得的混合物进一步加入100μl Tricine缓冲液，并在72℃下温育7分钟。
2)通过PCR扩增重链基因和轻链基因并构建重组抗体表达载体
为了扩增cDNA，使用了由Takara公司制造的Z-Taq。
cDNA 2μL
10xZ-Taq缓冲液5μL
dNTP混合物4μL
Z-Taq 1μL
引物1
引物2
使用重蒸水将包含上面提到的组分的反应溶液调整到50μl的终体积，以进行PCR。
为了扩增重链，使用UPM(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clonetech公司制造)和hh-6引物(5’-GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTT-3’)(SEQ ID NO:15)，并将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复30次。此外，使用1μl获得的反应溶液作为模板，并使用NUP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clonetech制造)和hh-3引物(5’-GTGCACGCCGCTGGT CAGGGCGCCTG-3’)(SEQ ID NO:16)作为引物，将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用hh-4(5’-GGT GCC AGGGGG AAG ACC GAT GG-3’)(SEQ ID NO:17)作为引物测定核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也使用下列引物从相反方向测定了序列。
Old4重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGT-3’)(SEQ ID NO:18)
Old4重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3’)(SEQ ID NO:19)
Old5重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTGT-3’)(SEQIDNO:20)
Old5重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3’)(SEQ ID NO:21)
Old17重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTGT-3’)(SEQ ID NO:22)
Old17重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACAAGGGTTCCC-3’)(SEQ ID NO:23)
Old19重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTGT-3’)(SEQ ID NO:24)
Old19重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’)(SEQ ID NO:25)
New102重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGT-3’)(SEQ ID NO:26)
New102重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’)(SEQ ID NO:27)
Old6重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG-3’)(SEQ ID NO:28)
Old6重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’)(SEQ ID NO:29)
为了扩增小鼠抗体7G3的重链，使用UPM(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech公司制造)和mH-Rv1引物(5’-ATTTTG TCGACC KYG GTS YTG CTG GCY GGGTG-3’)(SEQ ID NO:30)，并将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复30次。此外，使用1μl获得的反应溶液作为模板，并使用NUP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech制造)和mH-Rv2引物(5’-GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)(SEQ IDNO:31)，将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用mH-Rv2引物(SEQ ID NO:31)作为引物的定重链可变区的核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也使用下列引物从相反方向测定了序列。
7G3重链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTC-3’)(SEQ ID NO:32)
7G3重链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’)(SEQ ID NO:33)
使用上面提到的特异性引物进行PCR(98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒)，并将重链扩增cDNA片段用SalI和NheI消化，插入到已用相同酶切开的N5KG1-Val Lark载体[N5KG1的修饰的载体(US6,001,358，Idec Pharmaceuticals)]中。通过使用载体作为模板测定序列，发现插入的序列与通过直接测序测定的序列同一。
轻链的扩增使用UPM(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech公司制造)和hk-2引物(5’-GTT GAAGCT CTT TGT GAC GGGCGA GC-3’)(SEQ ID NO:34)，并将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复30次。此外，使用1μl该溶液作为模板，并使用NUP(SMARTRACE cDNA扩增试剂盒；由Clonetech制造)和hk-6(5’-TGGCGGGAAGATG AAG ACA GAT GGT G-3’)(SEQ IDNO:35)，将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用hk-6引物测定核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也从相反方向测定了序列。
Old4轻链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC-3’)(SEQ ID NO:36)
Old4轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTG-3’)(SEQ ID NO:37)
Old5轻链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCG CTC AGC-3’)(SEQIDNO:38)
Old5轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTG-3’)(SEQ ID NO:39)
Old17轻链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCG CTC AG-3’)(SEQ ID NO:40)
Old17轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCT G-3’)(SEQ ID NO:41)
Old19轻链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCG CTC AG-3’)(SEQ ID NO:42)
Old19轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTT GGC-3’)(SEQ ID NO:43)
New102轻链特异性引物Fw
(5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCG CTC AG-3’)(SEQIDNO:44)
New102轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGG TCCCCT G-3’)(SEQ ID NO:45)
Old6轻链特异性引物Fw
(5‘-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC-3’)(SEQ ID NO:46)
Old6轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC-3’)(SEQ ID NO:47)
小鼠抗体7G3的轻链使用UPM(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech公司制造)和mK-Rv1引物mK_Rv1(5’-TT GAA GCTCTT GAC AAT GGG TGA AGT TGAT-3’)(SEQ ID NO:48)扩增，并将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复30次。此外，使用1μl该反应溶液作为模板，并使用NUP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；由Clontech制造)和mK-Rv2(5’-GTAGGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAGT-3’)(SEQ IDNO:49)，将98℃1秒和68℃30秒的反应循环重复20次。然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增的PCR产物，并使用mK-Rv2引物测定核苷酸序列。根据序列信息合成了下列特异性引物，并也从相反方向测定了序列。
7G3轻链特异性引物Fw
(5‘-AGAGAGAGAGAGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTC-3’)(SEQ ID NO：50)
7G3轻链特异性引物Rv
(5’-AGAGAGAGAGCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3’)(SEQ ID NO：51)
使用上面提到的特异性引物进行PCR(98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒)，并将轻链扩增cDNA片段用BglII和BsiWI消化，插入到已用相同酶切开的N5KG1-Val Lark载体中。通过使用载体作为模板测定序列，发现插入的序列与通过直接测序测定的序列同一。
下面显示了每个编码Old4的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<Old4重链可变区>
GACCCGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGCTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCATGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTATAGTAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGTACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGGGGGGGGCTCGGGCCCAGATGTTCTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGCACCAA(SEQ ID NO：52)
<Old4重链可变区>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAlSWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGSGPDVLDIWGQGTMVTVSSASTX(SEQ ID NO：53)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：52的5’端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第432位的腺嘌呤(A)与第433位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：53的N-端起第139位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第140位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：53的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：53的第20位的谷氨酰胺(Q)。
<Old4轻链可变区>
CACAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGGAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGG(SEQ IDNO：54)
<Old4轻链可变区>
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGIRSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCQQYYSFPYTFGQGTKLEIKRTVX(SEQ ID NO：55)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：54的5’端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第402位的腺嘌呤(A)与第403位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：55的N-端起第129位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：55的N-端起第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：55的第23位的缬氨酸(V)。
下面显示了每个编码Old5的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<Old5重链可变区>
GTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCATGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGCTCATCCCTATCTTTGATATAGAAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGTCTATATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGGGGGGGTTCGGGCCCTGATGTTCTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGC(SEQ ID NO：56)
<Old5重链可变区>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGLIPIFDIENYAQKFQGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAMYYCARGGGSGPDVLDIWGQGTMVTVSSAS(SEQ ID NO：57)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：56的5’端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第427位的腺嘌呤(A)与第428位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：57的N-端起第139位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第140位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：57的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：57的第20位的谷氨酰胺(Q)。
<Old5轻链可变区>
CACAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGGAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGG(SEQ IDNO：58)
<Old5轻链可变区>
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGIRSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCQQYYSFPYTFGQGTKLEIKRTVX(SEQ ID NO：59)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：58的5’端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第402位的腺嘌呤(A)与第403位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：59的N-端起第129位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：59的N-端起第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：59的第23位的缬氨酸(V)。
下面显示了每个编码Old17的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<Old17重链可变区>
GACCCGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTTTGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTTCAACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTAACGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGTGGAGACAAATATGGTCCTTACTACTTTCACTACTGGGGCCAGGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC(SEQ ID NO：60)
<Old17重链可变区>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGGTFSNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGSTNYAQKFQGRVTINADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGGDKYGPYYFHYWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO：61)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：60的5’端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第432位的腺嘌呤(A)与第433位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：61的N-端起第139位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第140位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：61的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：61的第20位的谷氨酰胺(Q)。
<Old17轻链可变区>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGT(SEQ ID NO：62)
<Old17轻链可变区>
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTX(SEQ ID NO：63)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：62的5’端起第19位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A)与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：63的N-端起第129位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：63的N-端起第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：63的第23位的天冬氨酸(D)。
下面显示了每个编码Old19的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<Old19重链可变区>
TCGACCCCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGACACAAATATGGCCCCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG(SEQ ID NO：64)
<Old19重链可变区>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWVGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGHKYGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO：65)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：64的5’端起第9位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第425位的腺嘌呤(A)与第426位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：65的N-端起第139位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第140位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：65的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：65的第20位的谷氨酰胺(Q)。
<Old19轻链可变区>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCT(SEQ IDNO：66)
<Old19轻链可变区>
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPRTFGQGTKVEIKRTVA(SEQ ID NO：67)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：66的5’端起第13位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A)与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：67的N-端起第129位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：67的N-端起第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：67的第23位的天冬氨酸(D)。
下面显示了每个编码New102的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<New102重链可变区>
TCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGATCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCATGGCTTCAGGAGGCACCGTCAGCAGCTACGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGAGATCATCCCTATCTTTGGTATAGTAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGAGACAGCAGTGGCTGGTATTCTTGGTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG(SEQ ID NO：68)
<New102重链可变区>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCMASGGTVSSYAISWVRQAPGQGLEWMGEIIPIFGIVNYAQKFQGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAIYYCARETAVAGILGYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO：69)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：68的5’端起第9位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第423位的腺嘌呤(A)与第424位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：69的N-端起第138位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第139位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：69的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：69的第20位的谷氨酰胺(Q)。
<New102轻链可变区>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCA(SEQID NO：70)
<New102轻链可变区>
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAA(SEQ ID NO：71)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：70的5’端起第13位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A)与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：71的N-端起第129位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：71的N-端起第22位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：71的第23位的天冬氨酸(D)。
下面显示了每个编码Old6的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<Old6重链可变区>
CGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCCATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATATTATGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGACTGGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC(SEQ ID NO：72)
<Old6重链可变区>
MELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSHNMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDWGYFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO：73)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：72的5’端起第10位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第417位的腺嘌呤(A)与第418位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：73的N-端起第136位的丝氨酸(S)残基，恒定区从第137位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：73的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：73的第20位的谷氨酸(E)。
<Old6轻链可变区>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGT(SEQ ID NO：74)
<Old6轻链可变区>
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSDLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIKRTVAA(SEQ ID NO：75)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：74的5’端起第13位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第399位的腺嘌呤(A)与第400位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：75的N-端起第129位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第130位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：75的N-端起第23位的半胱氨酸(C)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：75的第24位的丙氨酸(A)。
下面显示了每个编码7G3的重链可变区和轻链可变区的DNA分子以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
<7G3重链可变区>
GTCGACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCGTGTCAGGAACTGGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTAAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTATTCCTAGCAATGGTGCCACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTGACTGTGGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGATCGCATTTACTGCGGGCCTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGC(SEQ ID NO：76)
<7G3重链可变区>
MGWSWIFLFLVSGTGGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSAAS(SEQ ID NO：77)
重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：76的5’端起第16位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第427位的腺嘌呤(A)与第428位的鸟嘌呤(G)之间。在重链氨基酸序列中，重链可变区直到从SEQ ID NO：77的N-端起第139位的丙氨酸(A)残基，恒定区从第140位的丙氨酸(A)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计重链的信号序列直到从SEQ ID NO：77的N-端起第19位的丝氨酸(S)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：77的第20位的谷氨酸(E)。
<7G3轻链可变区>
AGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTCATGTCCCTGCTGTTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACTTTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCTAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTATCTGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAATTGTTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGT(SEQ IDNO：78)
<7G3轻链可变区>
MESQTQVLMSLLFWVSGTCGDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：79)
轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，其从SEQ ID NO：78的5’端起第11位的腺嘌呤(A)开始，并且抗体可变区与恒定区之间的边界位于5’端起第409位的腺嘌呤(A)与第410位的胞嘧啶(C)之间。在轻链氨基酸序列中，轻链可变区直到从SEQ ID NO：79的N-端起第133位的赖氨酸(K)残基，恒定区从第134位的精氨酸(R)开始并往后。通过基因序列估算软件(Signal P ver.2)，估计轻链的信号序列直到从SEQ ID NO：79的N-端起第22位的甘氨酸(G)。成熟形式的N-端被认为是SEQ ID NO：79的第23位的天冬氨酸(D)。
(重组类型抗体的制备)
通过将每个构建的6个重组抗体表达载体导入宿主细胞，制备了表达重组抗体的细胞。HEK293F(Invitrogen)被用作用于表达的宿主细胞。
使用293Fectin(Invitrogen)将每个表达载体导入HEK293F。将HEK293F在5％CO2和37℃的条件下使用摇床进行培养，并在培养后约5天回收培养上清液。将回收的培养上清液使用rpm蛋白A(Amersham-Pharmacia Biotech)进行亲和纯化。使用PBS作为吸附缓冲液，0.02M甘氨酸缓冲液(pH 3)作为洗脱缓冲液，根据用于纯化的量使用0.8x40cm柱子(Bio-Rad Laboratories)等。通过加入1M Tris(pH 9.0)将洗脱级分调整到约pH 7.2。使用透析膜(截留分子量10,000，Spectrum Laboratories)将如此制备的抗体溶液更换成PBS，并使用孔径为0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(Millipore)通过过滤进行除菌，由此获得纯化的人类抗IL-3Rα单克隆抗体。通过在280nm处测量吸光值并将1mg/ml视为1.4OD来计算纯化抗体的浓度。
每个人类抗体CDR(互补性决定区)的氨基酸序列和SEQ ID NOs的概述显示在表1中。
实施例5从杂交瘤培养上清液纯化抗IL-3Rα人类抗体
在从实施例3中使用的含IL-6的DMEM培养基改变成E-RDF培养基(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.,Ltd.)后，培养杂交瘤。从培养上清液纯化抗体。抗体的纯化按照实施例4的描述进行。
首先，使产生人类抗IL-3Rα单克隆抗体的杂交瘤适应于含有10ng/ml IL-6和10％胎牛血清(FCS；SIGMA)的eRDF培养基(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.,Ltd.)。接下来，使获得的杂交瘤适应于含有牛胰岛素(5μg/ml，GIBCO BRL)、人类转铁蛋白(5μg/ml，GIBCOBRL)、乙醇胺(0.01mM，SIGMA)、亚硒酸钠(2.5x10-5mM，SIGMA)和1％低IgG的FCS(HyClone)的eRDF培养基(Kyokuto PharmaceuticalIndustrial Co.,Ltd.)。将该适应的杂交瘤在摇瓶中培养，并回收培养上清液。将回收的上清液通过10μm和0.2μm滤膜(Gelman Sciences Inc.)，以除去无用的物质例如杂交瘤等。通过与实施例4相同的方法从如此回收的上清液纯化抗体。
实施例6使用纯化的抗IL-3Rα人类抗体计算结合和解离常数
使用基于表面等离子共振原理的分析仪(Biacore,GE Healthcare,hereinafter GE)，分析纯化的抗IL-3Rα抗体的结合和解离常数。简单来说，将抗人类抗体或抗小鼠抗体固定化在CM5传感器尖部上，然后向其施加抗IL-3Rα人类或小鼠抗体以使其结合，然后向其施加在实施例2中制备的可溶形式的IL-3Rα蛋白，并使用Biacore 2000观察结合和解离。在整个试验步骤中，基本上使用GE Healthcare的用于计算结合和解离常数的试验方法。
具体来说，CM5(研究级)用于传感器尖部(均来自GE)。首先，通过向CM5尖部施加400mM EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)与100mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的等量混合物，使CM5尖部活化。接下来，将人类抗体捕获试剂盒(GE)随附的针对人类抗体的抗体(在后文中称为抗人类抗体的抗体)用试剂盒随附的溶液稀释并施加于CM5尖部，从而将所需量的抗人类抗体的抗体固定到CM5尖部上。对于用作对照的小鼠抗体来说，将小鼠抗体捕获试剂盒(GE)随附的针对小鼠抗体的抗体(在后文中称为抗小鼠抗体的抗体)用试剂盒随附的溶液稀释并施加于CM5尖部，从而将所需量的该抗体固定到CM5尖部上。接下来，通过向其施加1M乙醇胺二盐酸盐将活化的尖部表面阻断并失活。通过到此为止的上述步骤，完成了能够测量解离常数KD的CM5传感器尖部的制备。
接下来，将每种抗IL-3Rα抗体用HBS-FP缓冲液(GE)稀释以给出5μg/ml的浓度，每个流动池施加一种抗体，从而允许其与固定化的抗人类抗体的抗体或抗小鼠抗体的抗体结合。接下来，向其施加可溶形式的IL-3Rα蛋白。为了使结合的抗IL-3Rα抗体与可溶形式的IL-3Rα蛋白解离，将人类抗体捕获试剂盒随附的3M MgCl2或小鼠抗体捕获试剂盒随附的pH 1.7的甘氨酸-HCl，以试剂盒随附的量施加。到此为止的步骤被当做一个步骤。通过使用两种或多种浓度的可溶形式的IL-3Rα蛋白重复同样的步骤，获得了用于计算结合和解离常数的数据(传感器谱)。
施加到对象的可溶形式的人类IL-3Rα蛋白浓度，按照实施例2中的描述通过测量280nm处的吸光值并将1mg/ml视为1.4OD来计算。可溶形式的人类IL-3Rα蛋白的分子量如下计算。对于人类IL-3Rα蛋白的分子量来说，已报道它包含360个氨基酸残基，具有6个N-型糖链结合位点，并且分子量为70KDa(《细胞因子实况手册》(The CytokineFacts Book)第二版，Academic Press)。因此，可溶性人类IL-3Rα蛋白的分子量，通过从作为参考信息而知的70KDa中减除跨膜区和膜内区氨基酸的分子量，并将得到的值加上Flag序列的氨基酸的分子量，计算为约63KDa。
在分析中，使用Biaevaluation软件(GE)并参考Biaevaluation软件手册。具体来说，通过基本上使用1:1Langmuir结合反应模型和拟合执行动力学分析的同时分析，计算了结合速率常数(Ka)和解离速率常数(Kd)，并通过计算Kd/Ka来计算解离常数KD的值。
结果显示在下面的表2中。
[表2]
抗体名称 Ka Kd KD
人类抗体
Old4 3.88x105 5.15x10-4 1.33x10-9
Old5 7.17x105 4.72x10-4 6.58x10-10
Old17 2.08x105 2.98x10-4 1.43x10-9
Old19 1.54x105 4.99x10-4 3.24x10-9
New102 6.02x105 4.80x10-4 7.98x10-10
Old6 1.71x106 2.15x10-5 1.26x10-9
嵌合抗体
7G3 2.48x105 4.66x10-4 1.88x10-9
小鼠抗体
7G3 1.68x105 9.52x10-5 5.66x10-10
9F5 7.13x104 6.5x10-5 9.11x10-10
107D2.08 4.16x105 2.03x10-5 4.88x10-8
AC145 7.66x104 4.26x10-5 5.57x10-8
L-16 8.13x105 4.16x10-5 5.12x10-9
实施例7抗人类IL-3Rα人类抗体的表位分析
(IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白表达细胞的制备)
为了执行IL-3Rα抗体的表位分析，将其中IL-3Rα的一部分膜外区域被GM-CSFRα替换的嵌合蛋白表达在细胞中，并分析每种抗IL-3Rα抗体与细胞的结合活性。简单来说，首先将IL-3Rα分子和GM-CSFRα分子分成三个区域(从上面提到的N-端起A、B和C结构域)，其次构建能够表达其中IL-3Rα分子的每个A、B和C结构域分别被GM-CSFRα分子的相应结构域取代的分子的载体，第三将它们强制表达在HEK293F细胞中，第四，通过流式细胞术观察每种用荧光染料标记的抗IL-3Rα抗体是否与其结合。
(GM-CSFR/pEF6/Myc-HisC质粒DNA的制备)
通过PCR方法，使用KOD-Plus-Ver.2(Toyobo Co.,Ltd.)从源自于脾脏的cDNA(CLONTECH Human MTC Panel)扩增了人类GM-CSFR受体α链(GM-CSFRα，CD116)的cDNA。使用GeneAmpPCR系统9700(Applied Biosystems)作为PCR装置。对于PCR来说，在94℃2分钟的变性步骤后，将98℃10秒—55℃30秒—68℃75秒的三步反应执行35个循环。所使用的PCR引物如下。
hCD116Fw-MfeI：
5’-CGGCAATTGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCT-3’(SEQ ID NO:80)
hCD116Rv-NotI：
5’-ATTGCGGCCGCTCAGGTAATTTCCTTCACGG-3’(SEQ IDNO:81)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1.2kb的条带，并用JETsorb试剂盒(Genomed,Bad Oeynhausen，德国)提取，然后用NotI和MfeI消化。将pEF6/Myc-HisC质粒DNA(Invitrogen)用EcoRI和NotI消化。将每个DNA进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并切下约1.2kb和约6kb的条带，并使用JETsorb试剂盒(Genomed,Bad Oeynhausen，德国)提取DNA分子。然后，将0.5μl源自pEF6/Myc-HisC质粒DNA的DNA溶液与4μl源自PCR产物的DNA溶液混合，并使用TaKaRa连接试剂盒(TAKARA BIO INC.)进行连接。对于转化来说，将连接样品和DH5α感受态细胞混合并铺在LB平板上。使用LA Taq(TAKARA BIO INC.)，通过直接菌落PCR进行插入检查。对于PCR来说，在94℃5分钟的变性步骤后，将94℃30秒—55℃30秒—72℃2分钟的三步反应执行40个循环，然后执行99℃30分钟的处理。
使用的PCR引物如下。
hCD 116Fw-MfeI：
5’-CGGCAATTGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCT-3’(SEQ ID NO:82)
hCD116Rv-NotI：
5’-ATTGCGGCCGCTCAGGTAATTTCCTTCACGG-3’(SEQ IDNO:83)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。使用可以从其获得约1.2kb扩增产物的菌落，通过直接测序方法测定核苷酸序列。在序列样品的反应中，使用了BigDye(R)Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)(它们用于本说明书中的所有DNA序列分析中)。使用的PCR引物如下。
hCD116Rv-NotI：5’-ATTGCGGCCGCTCAGGTAATTTCCTTCACGG-3’(SEQ ID NO:85)
hCD116SeqFw1：5’-TGAACTGTACCTGGGCGAGG-3’(SEQ ID NO:86)
hCD116SeqFw2：5’-CTGGCACGGAAAACCTACTG-3’(SEQ ID NO:87)
hCD116SeqRv1：5’-CCTGAATTTGGATAAAGCAG-3’(SEQ ID NO:88)
ABI 3700XL DNA分析仪(Applied Biosystems)被用作序列分析装置(其使用在本说明书中的所有DNA序列分析中)。通过选择经PCR没有发现氨基酸序列突变的菌落，并通过Largeprep方法(QIAGEN)提取质粒DNA。
(IL-3RΑ-FLAG/pEGFP-N1的制备)
通过PCR扩增人类IL-3Rα(CD123)的全长cDNA，并将FLAG标签连接到其下游(IL-3RΑ-FLAG/pEGFP-N1)。
使用hCD123/pEGFP-N1质粒DNA作为模板并使用LA Taq(TAKARA BIO INC.)，通过PCR方法扩增了人类IL-3RΑcDNA。对于PCR来说，在95℃30秒的变性步骤后，将95℃15秒—56℃15秒—72℃60秒的三步反应执行10个循环，然后执行2分钟的延伸反应。使用的PCR引物如下。
T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO:89)hCD123-C-FLAG-R1：
5’-TCGTCATCGTCCTTGTAGTCAGTTTTCTGCACGACCTGTA-3’(SEQ ID NO:90)
使用2μl PCR产物作为模板，使用LA Taq(TAKARA BIO INC.)通过PCR方法进行扩增。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒—56℃15秒—72℃60秒的三步反应执行15个循环，然后执行72℃2分钟的延伸反应。使用的PCR引物如下。
IL-3Rα_Fw：
5’-CGGCAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCAC-3’(SEQID NO:91)
C-FLAG-NotR2：
5’-AAAAGCGGCCGCTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTC-3’(SEQ ID NO:92)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1kb的条带，并将DNA用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统提取。将提取到的全部量的DNA用MfeI和NotI消化，并进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。切下约1kb的条带，并将DNA用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统提取。然后，将5μl由此提取的IL-3RΑ-FLAG cDNA与1μl已用EcoRI和NotI切开的pEGFP-N1质粒DNA混合，并使用TaKaRa连接试剂盒(TAKARA BIO INC.)进行连接。对于转化来说，将连接样品和DH10B感受态细胞混合并铺在LB平板(含卡那霉素)上。使用LATaq(TAKARA BIO INC.)，通过直接菌落PCR进行插入检查。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒—56℃15秒—72℃60秒的三步反应执行35个循环，然后执行72℃2分钟的延伸反应。使用的PCR引物如下。
pEGFP-N1-Fw：5’-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3’(SEQ ID NO:93)
pEGFP-N1-Re：5’-TTTATGTTTCAGGTTCAGG-3’(SEQ ID NO:94)
通过Miniprep方法从获得约0.8kb扩增产物的菌落提取质粒DNA。
通过DNA序列分析发现，纯化的IL-3RΑ-FLAG/pEGFP-N1质粒DNA不具有由PCR引起的突变，并且其中存在FLAG标签。在DNA序列分析中使用的引物如下。
pEGFP-N1-Fw：5’-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3’(SEQ ID NO:95)
pEGFP-N1-Re：5’-TTTATGTTTCAGGTTCAGG-3’(SEQ ID NO:96)(IL-3Rα的结构域作图)
作为BLASTP搜索(数据库：Protein Data Bank蛋白(pdb))的结果，IL-13受体α链(IL-13Rα)以最高分值命中(PDB：3BPNC；IL4-IL4r-IL13ra三元复合物C链的晶体结构)。使用从蛋白数据库(Protein Data Bank)下载的PDB文件和图形软件RasMol，将IL-13Rα蛋白的三维结构可视化，并分开构成细胞外区域的三个结构域(上面提到的A、B和C结构域)。使用多序列比对软件MUSCLE对IL-3Rα的氨基酸序列和IL-13Rα的氨基酸序列进行比较，并且也将IL-3Rα细胞外区域分成三个结构域。此外，以同样方式对GM-CSFRα和IL-3Rα进行比较，并将GM-CSFRα细胞外区域也分成三个结构域。
为了指派抗人类IL-3Rα人类抗体的表位，制备了其中IL-3Rα的三个结构域中的每个逐一被GM-CSFRα的所述结构域取代的蛋白并在细胞膜上表达，并验证了抗体结合是否存在。
使用IL-3RΑ-FLAG/pEGFP-N1质粒DNA作为模板，使用HS DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)通过PCR方法进行了扩增。对于PCR来说，将98℃10秒—68℃6分钟的两步反应执行25个循环。所使用的PCR引物如下。
A结构域缺陷型：
CD123R11pEGFPN1：AAAGGTACCGAATTCGAAGCTTGAGCTC(SEQ ID NO:97)
CD123F11：AAAGGTACCGGGAAGCCTTGGGCAGGT(SEQ IDNO:98)
B结构域缺陷型：
CD123R12-2：AAAGGTACCACTGTTCTCAGGGAAGAGGAT(SEQ ID NO:99)
CD123F12-2：AAAGGTACCCAGATTGAGATATTAACTCC(SEQID NO:100)
C结构域缺陷型：
CD123R13：AAAGGTACCTGAAAAGACGACAAACTT(SEQ IDNO:101)
CD123F13：AAAGGTACCTCGCTGCTGATCGCGCTG(SEQ IDNO:102)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。在证实了扩增之后，使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统对其进行纯化。将由此获得的DNA用KpnI和DpnI消化，使用Wizard SV凝胶和PCRClean-Up系统进行纯化，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，并铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用LA Taq(TAKARA BIO INC.)，通过直接菌落PCR进行插入检查。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒—56℃15秒—72℃40秒的三步反应执行38个循环，然后执行72℃2分钟的延伸反应。使用的PCR引物如下。
pEGFP-N1-Fw：5’-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3’(SEQ IDNO:103)
pEGFP-N1-Re：5’-TTTATGTTTCAGGTTCAGG-3’(SEQ IDNO:104)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。通过Miniprep方法从获得约1kb扩增产物的菌落提取质粒DNA。
使用GM-CSFR/pEF6/Myc-HisC质粒DNA作为模板，使用HS DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)通过PCR方法进行了扩增。对于PCR来说，将98℃10秒—68℃30秒的两步反应执行25个循环。所使用的PCR引物如下。
A结构域插入：
GM-CSFRF11：AAAGGTACCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACA(SEQ ID NO:105)
GM-CSFRR11：AAAGGTACCTGAATTTGGATAAAGCAG(SEQ ID NO:106)
B结构域插入：
GM-CSFRF12：AAAGGTACCGGAAGGGAGGGTACCGCT(SEQ ID NO:107)
GM-CSFRR12：AAAGGTACCCTTTGTGTCCAAAAGTGA(SEQ IDNO:108)
C结构域插入：
GM-CSFRF13：AAAGGTACCAAAATAGAACGATTCAAC(SEQ IDNO:109)
GM-CSFRR13：AAAGGTACCAATGTACACAGAGCCGAG(SEQ IDNO:110)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。在证实了扩增之后，使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统对其进行纯化。
将由此获得的DNA用KpnI消化，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)进行纯化，与其中相应结构域被缺失(已经用KpnI切下并纯化)的IL-3RΑ-FLAG/pEGFP-N1质粒DNA混合，并使用TaKaRa连接试剂盒进行连接。对于转化来说，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，并铺于LB平板(含卡那霉素)上。使用LA Taq(TAKARA BIOINC.)，通过直接菌落PCR进行插入检查。对于PCR来说，在95℃1分钟的变性步骤后，将95℃15秒—56℃15秒—72℃40秒的三步反应执行38个循环，然后执行72℃2分钟的延伸反应。使用的PCR引物如下。
pEGFP-N1-Fw：5’-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3’(SEQ ID NO:111)
pEGFP-N1-Re：5’-TTTATGTTTCAGGTTCAGG-3’(SEQ IDNO:112)
对由此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴乙锭染色进行可视化。通过Miniprep方法从获得约1kb扩增产物的菌落提取质粒DNA。
(用荧光染料标记抗IL-3Rα人类抗体)
为了测定抗人类IL-3Rα人类抗体的结合活性，将每种人类抗体用荧光染料AlexaFlour488(Molecular Probe,Invitrogen)进行标记。对于标记方法来说，按照由Invitrogen提供的手册来进行，对于检测来说，荧光通过流式细胞术(FACS Calibur,BD Biosciences)的FL1来检测。
具体来说，向溶解在PBS中的抗体溶液加入1/10体积的1MNa2CO3。接下来，将手册中描述的预定量的抗体溶液加入容器，所述容器含有AlexaFlour488粉末并已向其中加入四氟苯基(TFP)，并允许在搅拌下、在室温下、在暗处反应1小时。接下来，在将凝胶过滤柱(NAP-10等，GE Healthcare)用PBS充分替换后，向其加入与AlexaFlour488反应的抗体溶液，同时将抗体溶液的缓冲液用PBS替换。获得显示出黄绿色的抗体级分。对于通过上述方式获得的AlexaFlour488标记的抗人类IL-3Rα抗体来说，使用分光光度计测量280nm和494nm波长处的吸光值(分别为A280和A494)，并通过下列计算公式计算抗体浓度。
抗体浓度(mg/ml)＝(A280-A494x 0.11)/1.4
(使用标记的抗IL-3Rα抗体对IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白表达细胞进行流式细胞术分析)
HEK293T细胞(ATCC CRL 1268)被用于制备IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白表达细胞。使用293Fectin(Invitrogen)，将上文中获得的质粒DNA作为表达载体导入HEK293T中。在导入两天后，使用摇床，在5％CO2和37℃条件下对向其导入表达载体的HEK293T进行培养，将获得的蛋白用于流式细胞术分析。
将嵌合蛋白表达细胞的100,000至1,000,000个细胞，与浓度为1μg/ml的AlexaFlour488标记的人类抗体或可商购的FITC-标记的抗IL-3Rα小鼠抗体(7G3或9F5：都来自BD Biosciences，6H6：AcrisAntibodies,AC145:Milteny Biotech,107D2.08:Dendritics)，在冰上反应30分钟。使用染色培养基(增补有2％胎牛血清、2mM EDTA和0.05％NaN3的Dulbecco’s PBS)稀释抗体和细胞。接下来，将与抗体反应的细胞用染色培养基洗涤三次，并通过流式细胞术证实标记的抗体是否与细胞结合。
结果显示在图1和2中。只有在表达其中A结构域被GM-CSFRα取代的蛋白的细胞中，7G3、9F5、6H6和AC145抗体的反应才消失。另一方面，在表达其中B结构域被GM-CSFRα取代的蛋白的细胞中，Old4、Old5、Old19和New102抗体的反应消失。对于Old19来说，它与表达其中A结构域被GM-CSFRα取代的蛋白的细胞的反应，也消失。对于Old6和107D2.08来说，它们与表达B结构域和C结构域被取代的蛋白的细胞的反应消失。
根据上述结果，显示出可能7G3、9F5、6H6和AC145识别A结构域，Old4、Old5和New102识别B结构域，Old19识别A结构域和B结构域，而Old6和107D2.08识别B结构域和C结构域。因此，各种抗IL-3Rα抗体与IL-3Rα的A至C结构域的反应性如下表3所示。
实施例8抗IL-3Rα抗体的IL-3信号传导阻断活性的分析
为了检查如此获得的IL-3Rα抗体是否抑制IL-3信号传导，使用依赖于IL-3或GM-CSF生长的细胞系TF-1(DMSZ no.ACC344)。具体来说，将TF-1细胞用含有1ng/ml IL-3和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(TF-1培养基)稀释，并分发在96孔板中。此外，将各种IL-3Rα抗体和作为阴性对照抗体的源自于人类血清的IgG用TF-1培养基稀释，转移到96孔板并添加，使得每种抗体的终浓度提供了10或100μg/ml的终浓度。作为对照，制备了无细胞的单独培养基的孔和加入了TF-1细胞的孔。在37℃和5％CO2环境下培养三天后，向其加入与培养基等量的CelltiterGlo(Promega)。静置30分钟后，使用读板器(ARBO,Perkin Elmer)测定发射。
对于生长抑制率来说，进行了下面的计算。
(样品的发射–无细胞的孔)/(只加入TF-1细胞的孔–无细胞的孔)x100(％)
对于可商购的抗体9F5、6H6和107D2.08来说，出于用PBS替换缓冲液的目的，使用了NAP-5柱。具体来说，将0.5ml抗体溶液加到用PBS充分替换的NAP-5柱上。接下来，通过加入1.0ml PBS，回收从柱中排出的溶液。通过使用孔径为0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(Millipore)进行过滤除菌，获得了溶解在作为溶剂的PBS中的抗体。
结果显示在图5中。发现抗体Old4、抗体Old5、抗体Old17、抗体Old19、抗体New102、抗体9F5和抗体6H6不抑制IL-3信号传导，另一方面，发现抗体7G3、抗体Old6和抗体107D2.08抑制IL-3信号传导。
实施例9检测使用抗IL-3Rα人类抗体对集落形成能力的影响
进行了集落测定以发现各种IL-3Rα抗体对造血前体细胞的集落形成能力是否具有影响。
简单来说，将400个细胞/ml的源自脐带血的CD34阳性细胞(AllCells)加入到增补有促红细胞生成素、IL-3、G-CSF和干细胞因子的Methocult培养基中(Stem Cell Technologie)，并在14天至16天后测量集落的数量。通过将集落分成粒细胞/巨噬细胞系统集落(CFU-GM)、红细胞类系统集落(BFU-E)和混合集落(CFU-Mix或CFU-GEMM)来对集落计数。对于集落类型的分类方法，使用由StemCell Technologie提供的手册或各种血液学教科书作为参考。
对于抗体来说，使用了每种嵌合7G3抗体作为在实施例8中其IL-3信号传导阻断活性被发现的抗体，New102抗体作为没有发现阻断活性的抗体。
结果显示在图6中。在其中添加了促红细胞生成素、IL-3、G-CSF和干细胞因子的集落测定中，通过添加具有IL-3信号传导阻断活性的7G3抗体，发现集落数量的减少和集落尺寸的减小。另一方面，通过添加New102抗体，没有发现集落数量的变化。根据该结果，认为当IL-3信号传导没有被抑制或阻断时，对正常造血功能的影响小，并且几乎没有副作用。
实施例10在带肿瘤小鼠模型中使用抗IL-3Rα人类抗体的抗肿瘤效果
将如此获得的抗IL-3Rα抗体给药于带肿瘤小鼠模型，并检测其抗肿瘤效果。简单来说，将白血病细胞通过尾静脉转移到小鼠中，在第二天向其给药抗体，并在约3周后，对从小鼠骨中收集到的骨髓细胞中的白血病细胞的数量进行计数。
具体来说，将0.01ml当量的抗asialoGM1抗血清(Wako PureChemical Industries,Ltd.)用生理盐水稀释并给药于SCID小鼠(CLEAJapan Inc.)(第-1日)。在第二天，将急性骨髓性白血病细胞系MOLM13(ATCC)的500,000个细胞通过尾静脉植入(第0日)。在第二天(第1日)，腹膜内给药10μg抗IL-3Rα抗体。在第21日处死小鼠，从大腿骨和胫骨收集骨髓，并用FITC-标记的人类CD45抗体和PE-标记的抗IL-3Rα抗体(二者都来自于BD Biosciences)对骨髓细胞进行染色。具体来说，向约1,000,000个骨髓细胞加入抗体以给出每种抗体1μg/ml的终浓度，并允许其在暗处在冰上静置30分钟。然后，将用抗体染色的细胞用染色培养基(通过向PBS(GIBCO)添加2％胎牛血清、0.05％叠氮化钠和2mM EDTA而制备的溶液)清洗三次，并通过流式细胞术(FACSCalibur,BD Biosciences)检测人类CD45阳性和人类IL-3Rα阳性细胞。此外，在收集小鼠骨髓时，使用TURK溶液对骨髓细胞的数量进行计数。此外，通过在上面提到的抗体染色时同时加入定量荧光珠(Flow-Count,Beckman Coulter)，对一根大腿骨中包含的MOLM13细胞的绝对数量进行计数。
结果显示在图7中。发现在给药每种抗体的组中，与没有给药抗体的介质组相比，大腿骨骨髓中MOLM13细胞的数量明显降低。该结果显示出抗IL-3Rα抗体有可能用作白血病的治疗药剂。
实施例11抗IL-3Rα抗体对IL-3Rα表达细胞的毒性试验
为了测量抗体介导的细胞毒性(抗体依赖性细胞毒性，在后文中称为ADCC)，在抗体存在下使用人类外周血单核细胞(外周血单核细胞，在后文中称为PBMC)作为效应细胞进行了试验。
从健康志愿者收集外周血，并向其加入抗凝剂。将血液静置于Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare)上，使得界面不被扰乱，并使用大型离心机(CF9RX,Hitachi,Ltd.)以2,000rpm离心20分钟。收集含有细胞的中间层，并用PBS清洗，通过以900rpm离心20分钟除去血小板，并使用源自外周血的单核细胞(PBMC)作为效应细胞。
此外，在37℃和5％CO2条件下使用含有10％胎牛血清并添加人类IL-2(Peprotech)至终浓度为4ng/ml(40IU/ml以上)的RPMI 1640培养基培养过夜的PBMC，也用作ADCC测定的效应细胞。
简单来说，在方法中，将靶细胞在抗体和PBMC存在下培养，并测量特定靶细胞被抗体的裂解率。
使用下面的“Colon-26/hCD123ADCC测定方法”测量裂解率。具体来说，通过将作为靶细胞的IL-3Rα强制表达Colon-26细胞在37℃下、在5％CO2存在下与用放射性同位素51Cr标记的铬酸钠(Na2 51CrO4，Perkin Elmer,NEZ030S)一起培养1小时，将靶细胞用51Cr标记。将标记的靶细胞清洗三次以除去过量的51Cr，然后悬浮在培养基中，并转移到事先已经添加有各种浓度的抗体的96孔板中。将PBMC悬浮在培养基中，并转移到已添加靶细胞和抗体的板中(效应细胞/靶细胞比率＝100)。作为抗体，使用了实施例4中纯化的抗IL-3Rα抗体，并使用源自人类血清的IgG(SIGMA)作为阴性对照。作为各种对照，制备了只有培养基和靶细胞的孔、只有PBMC和靶细胞的孔和增补有Triton-X的孔。将装填有混合溶液的96孔板在5％CO2存在下、在37℃下培养4小时。
在将板离心后，将50μl每种上清液转移到含有闪烁剂的96孔板中(Lumaplate-TM,Perkin Elmer)，并在56℃下干燥2小时。将板密封(TopSeal-A,Packard)，并使用微孔板读板器进行测量(TopCount,Perkin Elmer)。
对于靶细胞的裂解率来说，测量由于细胞裂解而释放到培养基中的铬酸钠中的51Cr的量。也就是说，通过从来自每个孔的值中减去未添加抗体的孔的值所获得的值，除以从添加Triton-X的孔(特异的裂解率被设定为100％)的值中减去未添加抗体的孔的值所获得的值，来计算“特异的裂解率”。
结果显示在图8和图9中。在每种IL-3Rα抗体中，发现对靶细胞的ADCC活性依赖于浓度。此外，这些抗体与作为对照的嵌合7G3抗体相比，显示出更高的ADCC活性。这显示IL-3Rα抗体对表达IL-3Rα的细胞表现出高ADCC活性，并在其中药效是除去IL-3Rα阳性细胞的治疗中具有应用可能性。
实施例12抗IL-3Rα抗体对猴IL-3Rα蛋白的亲和性试验
关于由此获得的抗人类IL-3Rα抗体与猴IL-3Rα的结合的存在与否，使用流式细胞术分析了在实施例7中制备的抗人类IL-3Rα抗体是否与实施例1中制备的食蟹猴IL-3Rα强制表达细胞结合。
具体来说，将猴IL-3Rα强制表达L929细胞的2x105个细胞与100μl、使得终浓度为10μg/ml的抗人类IL-3Rα抗体，在4℃下反应30分钟。使用的抗体是抗二硝基苯酚(DNP)人类IgG1抗体(由本公司制造)和Old4、Old5、Old17、Old19、New102和嵌合7G3抗体。然后，使用染色培养基(增补有2％胎牛血清、2mM EDTA和0.05％NaN3的Dulbecco’s PBS)将其清洗三次。接下来，将PE-标记的抗人类抗体λ链特异性抗体(Southern Bio)在染色培养基中，以1μg/ml的终浓度进行反应，并以相同方式用染色培养基清洗3次。最后，将细胞与染色培养基混合，并通过流式细胞术分析PE阳性是否存在。
结果显示在图10中。发现抗人类IL-3Rα人类抗体、Old4、Old5、Old17、Old19、New102和嵌合7G3抗体与食蟹猴IL-3Rα反应。
实施例13抗人类IL-3Rα人类抗体的详细表位分析
(IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白表达细胞的制备)
为了对IL-3Rα抗体进行进一步详细表位分析，将其中比IL-3Rα膜外区结构域更小的区域被GM-CSFRα替代的嵌合蛋白表达在细胞中，并分析每种抗IL-3Rα抗体对细胞的亲和性。简单来说，首先，根据IL-3Rα分子的三维结构预测来确定被认为位于外部的区域，其次，分别构建表达其中小的区域被GM-CSFRα替代的IL-3Rα分子的载体，第三，将它们在HEK293F细胞中强制表达，第四，通过流式细胞术观察用荧光染料标记的每种抗IL-3Rα抗体是否与其结合。
(IL-3Rα的结构域作图)
在根据实施例7分出的3个结构域中，选择了被获得的抗体Old19和New102所识别的A和B结构域，并对其进行详细分析。根据IL-4受体α链(IL-4Rα，CD124)的三维结构(PDB：3BPNC；链C，IL4-IL4r-IL3ra三元复合物的晶体结构)，使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)对IL-3Rα的三维结构进行同源性模拟。预测的IL-3Rα蛋白结构使用图形软件RasMol(http://rasmol.org/)进行可视化，并确定了被认为位于IL-3Rα分子外部氨基酸区域的7个区域(图4)。
为了指定抗人类IL-3Rα人类抗体的表位，制备了其中GM-CSFRα的相应区域被上述分出的IL-3Rα的6个区域替代的蛋白并将其表达在细胞膜上，并确定抗体的结合是否存在。
使用IL-3RΑ-Flag/pEGFP-N1质粒DNA作为模板，通过使用HS DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)的PCR方法进行扩增。对于PCR反应来说，将98℃10秒—68℃5分钟的两步反应执行25个循环。使用的PCR引物如下。
区域1缺陷：
CD123-Fw21：CGTGGAACCCGCAGTGAACAATAGCTATT(SEQID NO:149)
CD123-Re21：ACTCTGTTCTTTTTAACACACTCGATATCG(SEQID NO:150)
区域3缺陷：
CD123-Fw22：CTTTATCCAAATAACAGTGGGAAGCCTTG(SEQID NO:151)
CD123-Re22：CAGTTTCTGTTGGAATGGTGGGTTGGCCACT(SEQ ID NO:152)
区域4缺陷：
CD123-Fw23：AGGGAGGGTACCGGTGCGGAGAATCTGACCTGCT(SEQ IDNO:153)
CD123-Re23：TCCTGAATTTGGATAGAAGAGGATCCACGTGG(SEQ ID NO:154)
区域5缺陷：
CD123-Fw24：GGTCCGACGGCCCCCGCGGACGTCCAGTA(SEQID NO:155)
CD123-Re24：CCTCGCCCAGGTACAGCTCAAGAAATCCACGT(SEQ IDNO:156)
区域6缺陷：
CD123-Fw25：ACGGAACCAGCGCAGCCTTCGGTATCCCCT(SEQ ID NO:157)
CD123-Re25：TAACCAGAAAGTGGGAACTTTGAGAACC(SEQID NO:158)
区域7缺陷：
CD123-Fw26：TCTTTGATTCATTTGTCGTCTTTTCACA(SEQ IDNO:159)
CD123-Re26：ATTGGATGCCGAAGGCTGCGCTCCTGCCC(SEQID NO:160)
将如此获得的PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(135V，15分钟，TAE缓冲液)。DNA通过溴化乙锭染色进行可视化。在证实了扩增之后，使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统进行纯化。使用多核苷酸激酶(New England Biolabs)对如此获得的DNA进行磷酸化，并用乙醇沉淀，然后使用TaKaRa连接试剂盒将其一部分进行连接反应。关于转化，将连接样品与DH10B感受态细胞混合，并铺在LB平板(含卡那霉素)上。通过Miniprep方法从如此获得的菌落提取质粒DNA，用XhoI和NotI消化，并对插入片段进行验证。
(使用标记的抗IL-3Rα抗体对IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白表达细胞进行流式细胞术分析)
使用HEK293T细胞来制备IL-3Rα/GM-CSFRα嵌合蛋白表达细胞。将上述获得的质粒DNA作为表达载体导入HEK293T中。将导入有表达载体的HEK293T在5％CO2和37℃的环境下培养，并在导入后2天用于流式细胞术分析。
将浓度为1μg/ml的每种AlexaFlour488标记的人类抗体或可商购的FITC标记的抗IL-3Rα小鼠抗体(7G3和9F5：都从BD Biosciences获得，6H6：从Acris Antibodies获得)，与嵌合蛋白表达细胞的100,000至1,000,000个细胞在冰上反应30分钟。使用染色培养基(含有2％胎牛血清、2mM EDTA和0.05％NaN3的Dulbecco’s PBS)稀释抗体和细胞。接下来，将与每种抗体反应的细胞用染色培养基洗涤三次，并通过流式细胞术证实标记的抗体是否与细胞结合。
结果显示在图3中。只有在其中区域1被GM-CSFRα替换的蛋白表达细胞的情况下，抗体c7G3的反应才消失。在其中A结构域中的区域3和区域4以及B结构域中的区域6和区域7被GM-CSFRα替换的蛋白表达细胞的情况下，Old19的反应消失。在其中B结构域中的区域6和区域7被GM-CSFRα替换的蛋白表达细胞的情况下，New102的反应消失。
根据上述结果，显示了有可能抗体Old19识别A结构域的区域3和4和B结构域的区域6和7，抗体New102识别B结构域的区域6和7。上述结果概述为表4。
[表4]
区域(结构域) 替换序列 7G3 9F5 6H6 Old19 New102
区域1(A) 55-DADYSMP-61 - ++ ++ ++ ++
区域3(A) 91-STWILFPE-98 ++ ++ ++ - ++
区域4(A-B) 97-PENSGKPW-104 ++ ++ ++ - ++
区域5(B) 122-CSWAVGP-128 ++ ++ ++ ++ ++
区域6(B) 182-ILVRGRS-188 ++ ++ ++ - -
区域7(B) 192-GIPCTDK-198 ++ ++ ++ - -
工业实用性
根据本发明，提供了针对人类IL-3Rα蛋白(另一个名称：人类CD 123)的抗体，以及包含人类IL-3Rα抗体作为活性成分的用于髓细胞性恶性肿瘤、特别是急性骨髓性白血病(AML)的治疗药剂和诊断药剂。
序列公开文本名单
SEQ ID NO:3：IL-3Rα_Fw引物
SEQ ID NO:4：IL-3Rα_Re引物
SEQ ID NO:5：IL-3Rα_seqF1引物
SEQ ID NO:6：插入片段(MfeI至NotI)
SEQ ID NO:7：Rhe123Fw1引物
SEQ ID NO:8：Rhe123Rv1引物
SEQ ID NO:9：T7引物
SEQ ID NO:10：SP6引物
SEQ ID NO:11：食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-3Rα的插入片段(MfeI至NotI)
SEQ ID NO:12：恒河猴(Macaca mulatto)IL-3Rα的插入片段(MfeI至NotI)
SEQ ID NO:13：hIL-3Rαsol-FLAG-NotI引物
SEQ ID NO:14：插入片段(MfeI至NotI)
SEQ ID NO:15：hh-6引物
SEQ ID NO:16：hh-3引物
SEQ ID NO:17：hh-4引物
SEQ ID NO:18：Old4重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:19：Old4重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:20：Old5重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:21：Old5重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:22：Old17重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:23：Old17重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:24：Old19重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:25：Old19重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:26：New102重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:27：New102重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:28：Old6重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:29：Old6重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:30：mH_Rv1引物
SEQ ID NO:31：mH_Rv2引物
SEQ ID NO:32：7G3重链特异性引物Fw
SEQ ID NO:33：7G3重链特异性引物Rv
SEQ ID NO:34：hk-2引物
SEQ ID NO:35：hk-6引物
SEQ ID NO:36：Old4轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:37：Old4轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:38：Old5轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:39：Old5轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:40：Old17轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:41：Old17轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:42：Old 19轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:43：Oldl9轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:44：New102轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:45：New102轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:46：Old6轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:47：Old6轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:48：mK_Rv1引物
SEQ ID NO:49：mK_Rv2引物
SEQ ID NO:50：7G3轻链特异性引物Fw
SEQ ID NO:51：7G3轻链特异性引物Rv
SEQ ID NO:80：hCD116Fw-MfeI引物
SEQ ID NO:81：hCD116Rv-NotI引物
SEQ ID NO:82：hCD116Fw-MfeI引物
SEQ ID NO:83：hCD116Rv-NotI引物
SEQ ID NO:84：hCD116Fw-MfeI引物
SEQ ID NO:85：hCD116Rv-NotI引物
SEQ ID NO:86：hCD116SeqFw1引物
SEQ ID NO:87：hCD116SeqFw2引物
SEQ ID NO:88：hCD116SeqRv1引物
SEQ ID NO:89：T7引物
SEQ ID NO:90：hCD123-C-FLAG-R1引物
SEQ ID NO:91：IL-3Rα_Fw引物
SEQ ID NO:92：C-FLAG-NotR2引物
SEQ ID NO:93：pEGFP-N1-Fw引物
SEQ ID NO:94：pEGFP-N1-Re引物
SEQ ID NO:95：pEGFP-N1-Fw引物
SEQ ID NO:96：pEGFP-N1-Re引物
SEQ ID NO:97：CD123R11pEGFPN1引物
SEQ ID NO:98：CD123F11引物
SEQ ID NO:99：CD123R12-2引物
SEQ ID NO:100：CD123F12-2引物
SEQ ID NO:101：CD123R13引物
SEQ ID NO:102：CD123F13引物
SEQ ID NO:103：pEGFP-N1-Fw引物
SEQ ID NO:104：pEGFP-N1-Re引物
SEQ ID NO:105：GM-CSFRF11引物
SEQ ID NO:106：GM-CSFRR11引物
SEQ ID NO:107：GM-CSFRF12引物
SEQ ID NO:108：GM-CSFRR12引物
SEQ ID NO:109：GM-CSFRF13引物
SEQ ID NO:110：GM-CSFRR13引物
SEQ ID NO:111：pEGFP-N1-Fw引物
SEQ ID NO:112：pEGFP-N1-Re引物
SEQ ID NO:149：CD123-Fw21引物
SEQ ID NO:150：CD123-Re21引物
SEQ ID NO:151：CD123-Fw22引物
SEQ ID NO:152：CD123-Re22引物
SEQ ID NO:153：CD123-Fw23引物
SEQ ID NO:154：CD123-Re23引物
SEQ ID NO:155：CD123-Fw24引物
SEQ ID NO:156：CD123-Re24引物
SEQ ID NO:157：CD123-Fw25引物
SEQ ID NO:158：CD123-Re25引物
SEQ ID NO:159：CD123-Fw26引物
SEQ ID NO:160：CD123-Re26引物

Claims (18)

1.一种用于制备针对人类IL-3Rα链的抗体的方法，所述方法包括将人类IL-3Rα、其子序列或其片段给药于能够表达人类免疫球蛋白的动物，筛选表达针对人类IL-3Rα链的抗体的动物，选择产生针对人类IL-3Rα链的抗体的动物，以及从所选动物分离所述抗体，其中所述抗体不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但是不结合人类IL-3Rα链的C结构域，所述抗体包含选自下列(a)至(e)的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列：
(a)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:113至115的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:131至133的氨基酸序列，
(b)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:116至118的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:134至136的氨基酸序列，
(c)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:119至121的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:137至139的氨基酸序列，
(d)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:122至124的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:140至142的氨基酸序列，以及
(e)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:125至127的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:143至145的氨基酸序列。
2.权利要求1的方法，其中人类IL-3Rα、其子序列或其片段是与人类Fc重组蛋白偶联的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述片段是IL-3Rα细胞外区域。
4.权利要求1或2的方法，其中所述动物包括灵长类、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛和豚鼠。
5.权利要求1或2的方法，其中所述动物包括经过遗传修饰以包含人类基因座的动物。
6.权利要求1或2的方法，其中所述动物是转基因小鼠或转基因牛。
7.权利要求1或2的方法，其中所述动物是染色体转移小鼠。
8.权利要求1或2的方法，其中所述抗体进一步具有高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
9.权利要求8的方法，其中通过使用用IL-2培养的PBMC的Colon-26/hCD123 ADCC测定法，高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在0.01μg/ml的抗体浓度下显示出10％的特异的裂解率。
10.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含选自下列(a)至(e)的重链可变区和轻链可变区：
(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区。
11.一种用于制备针对人类IL-3Rα链的抗体的方法，所述方法包括将表达IL-3Rα的细胞、含有IL-3Rα的制备物或细胞提取液或级分、或者部分纯化的IL-3Rα给药于能够表达人类免疫球蛋白的动物，筛选表达针对人类IL-3Rα链的抗体的动物，选择产生针对人类IL-3Rα链的抗体的动物，以及从所选动物分离所述抗体，其中所述抗体不抑制IL-3信号传导并与人类IL-3Rα链的B结构域结合，但是不结合人类IL-3Rα链的C结构域，所述抗体包含选自下列(a)至(e)的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列：
(a)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:113至115的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:131至133的氨基酸序列，
(b)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:116至118的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:134至136的氨基酸序列，
(c)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:119至121的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:137至139的氨基酸序列，
(d)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:122至124的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:140至142的氨基酸序列，以及
(e)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:125至127的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:143至145的氨基酸序列。
12.权利要求1或11的方法，其中通过静脉内途径、腹膜内途径、肌肉内途径或皮下途径对所述动物进行免疫。
13.一种用于生产针对人类IL-3Rα链的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：将编码所述抗体的氨基酸序列的核酸导入宿主细胞，在培养基中培养所述细胞，收集培养上清液，以及从所述上清液纯化所述抗体，其中所述抗体包含选自下列(a)至(e)的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR的氨基酸序列：
(a)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:113至115的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:131至133的氨基酸序列，
(b)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:116至118的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:134至136的氨基酸序列，
(c)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:119至121的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:137至139的氨基酸序列，
(d)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:122至124的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:140至142的氨基酸序列，以及
(e)重链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:125至127的氨基酸序列，轻链的CDR 1至3分别为SEQ ID NO:143至145的氨基酸序列。
14.权利要求13的方法，其中所述抗体进一步具有高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
15.权利要求14的方法，其中通过使用用IL-2培养的PBMC的Colon-26/hCD123 ADCC测定法，高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在0.01μg/ml的抗体浓度下显示出10％的特异的裂解率。
16.权利要求13的方法，其中所述抗体包含选自下列(a)至(e)的重链可变区和轻链可变区：
(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列中从23位缬氨酸(V)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至139位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列中从20位谷氨酰胺(Q)至138位丝氨酸(S)的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列中从23位天冬氨酸(D)至129位赖氨酸(K)的氨基酸序列的轻链可变区。
17.权利要求13的方法，其中所述抗体具有人类免疫球蛋白的Fc区。
18.权利要求13的方法，其中所述抗体是人类IgG1类抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107840889A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 上海吉倍生物技术有限公司 高亲和力的抗cd123抗体及其应用

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100209341A1 (en) 2009-02-18 2010-08-19 Csl Limited Treatment of chronic inflammatory conditions
KR101732201B1 (ko) * 2009-04-27 2017-05-02 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 혈액 종양 치료를 목적으로 하는 항ＩＬ－３Ｒα 항체
EP2470212A4 (en) * 2009-10-01 2013-12-04 Csl Ltd METHOD FOR TREATING POSITIVE PHILADELPHIA CHROMOSOME LEUKEMIA
WO2011108502A1 (ja) 2010-03-02 2011-09-09 協和発酵キリン株式会社 改変抗体組成物
AU2011253598B1 (en) * 2010-08-17 2012-01-19 Csl Limited Humanized anti-interleukin 3 receptor alpha chain antibodies
AU2012202125B2 (en) * 2010-08-17 2015-03-19 Csl Limited Humanized Anti-Interleukin 3 Receptor Alpha Chain Antibodies
NZ604510A (en) * 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
WO2013150043A1 (en) * 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
TW201446794A (zh) 2013-02-20 2014-12-16 Novartis Ag 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向
MA47849A (fr) 2014-05-28 2020-01-29 Agenus Inc Anticorps anti-gitr et leurs procédés d'utilisation
EP3158064A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-26 Cellectis Cd123 specific multi-chain chimeric antigen receptor
CN112410363A (zh) 2014-08-19 2021-02-26 诺华股份有限公司 抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗
EP2990416B1 (en) * 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
PT3189081T (pt) * 2014-09-05 2020-05-25 Janssen Pharmaceutica Nv Agentes de ligação a cd123 e seus usos
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
CN114230667A (zh) 2015-01-23 2022-03-25 赛诺菲 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
US10100118B2 (en) 2015-04-08 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD123
JP2018513856A (ja) * 2015-04-08 2018-05-31 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｃｄ１２３に結合する抗体治療剤
CN114671951A (zh) 2015-06-29 2022-06-28 伊缪诺金公司 抗cd123抗体以及其缀合物和衍生物
US20180271861A1 (en) * 2015-07-14 2018-09-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Therapeutic agent for a tumor comprising an ido inhibitor administered in combination with an antibody
WO2017082214A1 (ja) 2015-11-09 2017-05-18 国立大学法人京都工芸繊維大学 単鎖抗体のスクリーニング方法及び単鎖抗体
US11447557B2 (en) 2015-12-02 2022-09-20 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
CN114539414B (zh) 2016-01-22 2024-03-29 默沙东有限责任公司 抗凝血因子xi抗体
SG11201807489PA (en) 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
JP7251981B2 (ja) 2016-03-24 2023-04-04 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂基を有する細胞毒性活性剤のプロドラッグ
WO2017181119A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein expression
CA3172367A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-coagulation factor xi antibodies
EP3471776B1 (en) * 2016-06-15 2022-05-04 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
BR112019005333A2 (pt) * 2016-09-21 2019-06-11 Aptevo Research And Development Llc proteínas de ligação a cd123 e composições e métodos relacionados
US20190351066A1 (en) 2016-12-21 2019-11-21 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
JP7066714B2 (ja) 2016-12-21 2022-05-13 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
JP7030811B2 (ja) 2016-12-21 2022-03-07 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤を有する特異的抗体－薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
WO2019072824A1 (en) * 2017-10-09 2019-04-18 Cellectis IMPROVED ANTI-CD123 CAR IN UNIVERSAL MODIFIED IMMUNE T LYMPHOCYTES
CN111629749A (zh) 2017-10-18 2020-09-04 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质降解的组合物和方法
EP3746079A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Bayer Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with nampt inhibitors
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
CA3100724A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag B-cell maturation antigen protein (bcma) chimeric antigen receptors and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
KR20210129672A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
MX2021009763A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina -2,6-diona y usos de los mismos.
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
WO2021013693A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with nampt inhibitors
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
IL298473A (en) 2020-06-11 2023-01-01 Novartis Ag zbtb32 inhibitors and uses thereof
BR112022026202A2 (pt) 2020-06-23 2023-01-17 Novartis Ag Regime de dosagem compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
AU2021414400A1 (en) 2020-12-31 2023-08-17 Innate Pharma Multifunctional natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and cd123
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997024373A1 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Medvet Science Pty. Limited Monoclonal antibody antagonists to haemopoietic growth factors
WO2001066139A1 (en) * 2000-03-06 2001-09-13 University Of Kentucky Research Foundation Use of a compound that selectively binds to cd123 to impair hematologic cancer progenitor cell

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
FR2562421B1 (fr) 1984-04-09 1989-02-17 Sandoz Sa Perfectionnements a la therapie par l'interleukine
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4975282A (en) 1985-06-26 1990-12-04 The Liposome Company, Inc. Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies
DE3682257D1 (de) 1985-11-22 1991-12-05 Takeda Chemical Industries Ltd Liposomzusammensetzung.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP2666345B2 (ja) 1987-04-16 1997-10-22 武田薬品工業株式会社 リポソーム製剤およびその製造法
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5273876A (en) 1987-06-26 1993-12-28 Syntro Corporation Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH04503306A (ja) 1989-02-01 1992-06-18 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 単純ヘルペスウイルス１型発現ベクター
US5665577A (en) 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0549723A1 (en) 1990-09-21 1993-07-07 Chiron Corporation Packaging cells
ATE188740T1 (de) 1991-02-19 2000-01-15 Univ California Viruspartikel mit veraendertem wirtspektrum
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
EP0580751A1 (en) 1991-04-19 1994-02-02 Schering Corporation Subunit of the human interleukin-3 receptor
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU6014094A (en) 1992-12-02 1994-06-22 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
EP0728202A4 (en) 1993-11-12 1997-04-23 Univ Case Western Reserve EPISOMIC EXPRESSION VECTOR FOR HUMAN GENE THERAPY
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US5731172A (en) 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5604090A (en) 1994-06-06 1997-02-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for increasing transduction of cells by adeno-associated virus vectors
US5693508A (en) 1994-11-08 1997-12-02 Chang; Lung-Ji Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats
JP3770333B2 (ja) 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US5861397A (en) 1996-10-03 1999-01-19 Vical Incorporated Piperazine based cytofectins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
KR100583331B1 (ko) 2001-05-11 2006-05-26 기린 비루 가부시키가이샤 인간 항체 λ 경쇄 유전자를 포함하는 인간 인공 염색체 및 자손 전달 가능한 상기 인간 인공 염색체를 포함하는 비인간 동물
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
HUE026039T2 (en) * 2005-07-01 2016-05-30 Squibb & Sons Llc Human monoclonal antibodies programmed for death ligand 1 (PD-L1)
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
AU2008331436A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Csl Limited Method of inhibition of leukemic stem cells
KR101732201B1 (ko) * 2009-04-27 2017-05-02 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 혈액 종양 치료를 목적으로 하는 항ＩＬ－３Ｒα 항체
EP2470212A4 (en) 2009-10-01 2013-12-04 Csl Ltd METHOD FOR TREATING POSITIVE PHILADELPHIA CHROMOSOME LEUKEMIA
NZ604510A (en) 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997024373A1 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Medvet Science Pty. Limited Monoclonal antibody antagonists to haemopoietic growth factors
WO2001066139A1 (en) * 2000-03-06 2001-09-13 University Of Kentucky Research Foundation Use of a compound that selectively binds to cd123 to impair hematologic cancer progenitor cell

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUN Q等: "Monoclonal antibody 7G3 recognizes the N-terminal of the human interleukin-3(IL-3)receptor alpha-chain and function as a specific IL-3 receptor antagonist", 《BLOOD》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107840889A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 上海吉倍生物技术有限公司 高亲和力的抗cd123抗体及其应用

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