ES2550639T3 - Anticuerpo anti-IL-3Ralfa para su utilización en el tratamiento de un tumor de la sangre - Google Patents

Anticuerpo anti-IL-3Ralfa para su utilización en el tratamiento de un tumor de la sangre Download PDF

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Abstract

Anticuerpo contra una cadena de IL-3Rα humana, que no inhibe la señalización de IL-3, y que se une al dominio B de la cadena de IL-3Rα humana pero no se une al dominio C de la cadena de IL-3Rα humana.

Description

Anticuerpo anti-IL-3Ra para su utilización en el tratamiento de un tumor de la sangre.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo contra la proteína IL-3Ra humana (por otro nombre: CD123 humana). También se describen en la presente memoria un agente terapéutico y un agente de diagnóstico para tumores malignos mielociticos, particularmente leucemia mieloide aguda (AML), que comprende como principio activo un anticuerpo anti-IL-3Ra humana.
Antecedentes de la invención
Con respecto a tumor ma ligno:
Un tumor maligno (cáncer) es la primera causa principal de muerte en Japón, y el número de pacientes crece cada año, y se desea vivamente el desarrollo de un fármaco y un método terapéutico que tenga eficacia y seguridad elevadas. Como la causa que forma un tumor maligno, están una mutación del ADN por radiación, rayos ultravioletas y diversas sustancias carcinogénicas. Los estudios sobre tumores malignos se han centrado en la identificación biológica molecular de estos cambios genéticos. Como resultado, se considera que la transformación tumOfigénica es inducida por la acumulación de un gran número de mutaciooes, y similares. Se ha demostrado mediante un modelo de estirpe celular y similar que algunas mutaciones decisivas están conectadas directamente con la transformación tumorigénica. Con respecto a la leucemia como una de las enfermedades diana de la invención, se han identificado y clasificado muchas anormalidades cromosómicas. En muchos de los casos, se encuentra translocación del cromosoma, y en las principales translocaciones cromosómicas ya se han identificado algunos genes asociados con la translocación cromosómica. Analizando las funciones de los genes relacionados con la translocación, se ha encontrado que estos genes están implicados en el inicio de la leucemia.
Con respecto a las células troncales cancerosas:
Por otro lado, desde hace tiempo, desde el punto de vista de la biología celular, se ha propuesto la denominada hipótesis de células troncales cancerosas, que señala que la célula troncal es el origen de un tumor maligno similar al tejido normal. La célula troncal se define como una célula que tiene capacidad de replicación autónoma y pluripotencia, y generalmente se divide aproximadamente en célula troncal totipotente y célula troncal tisular. Las células troncales tisulares se originan a partir de tejidos y órganos específicos tales como el sistema sanguíneo, hígado, sistema nervioso, y similar, y presentan una frecuencia extremadamente baja. Entre ellas, se ha estudiado muy frecuentemente la célula troncal hematopoyética. Se ha dado a conocer que un sistema hematopoyético se puede reconstruir durante un período de tiempo prolongado transplantando una célula troncal hematopoyética en un ratón en el que se destruyó el sistema hematopoyético mediante una dosis letal de irradiación (documento 1 no de patente). A diferencia de la célula troncal normal, los estudios sobre células troncales cancerosas se han retrasado durante un período de tiempo prolongado puesto que no se pudo encontrar su naturaleza exacta. Sin embargo, se ha identificado por primera vez una célula troncal cancerosa en leucemia mieloide aguda, en 1997 por Dick el al. Después, se ha dado a conocer la presencia de células troncales cancerosas en diversos tumores malignos Resumiendo, las células troncales cancerosas están presentes a una frecuencia de varios % o menos de todas las células troncales tanto tumorales y raras como normales. Se considera que las células restantes que forman el tumor SOfl células precursoras tumorales en las que la capacidad de proliferación está limitada, o células tumorales
Mediante estos informes, se mostró que existe una jerarquía incluso en el tumor similar al tejido normal, y la célula troncal cancerosa que reside en este pico (origen) tiene una fuerte capacidad formadora de tumores
Características y problemas terapéuticos de célu las tronca les cancerosas:
Resumiendo muchos informes, se considera que las células troncales cancerosas mantienen diversas características que poseen las células troncales normales. Los ejemplos de similitudes incluyen la rareza de las células, un microentorno (nicho) en el que existe la célula, la expresión de un gen de multirresistencia, la detención del ciclo celular, y similares.
Particularmente, las características de que expresan un grupo de genes de multirresistencia y de que están en la interfase del ciclo celular similar a células troncales normales podría convertirse en un problema terapéuticamente enorme. Un gen de multirresistencia BCRP es una bomba que afecta a la eficacia del fármaco al eliminar diversos agentes antitumorales fuera de las células, y se ha dado a conocer un método para recoger células troncales haciendo uso de la actividad (documento 2 no de patente). Además, su presencia en la interfase del ciclo celular
bajo el estado de ~detención" (documento 3 no de patente) provoca una reducción de la sensibilidad a muchos agentes antitumorales y radiaciooes que atacan el crecimiento celular rápido del cáncer (documentos 4 y 5 no de patente).
Basándose en las características anteriores, se considera que la célula troncal cancerosa que presenta resistencia a la terapia es una causa de regeneración tumoral
Con respecto al fármaco diana molecular
Las tres vías principales de tratamiento de un tumor maligno incluyen la terapia con agentes antitumorales, la terapia de radiación y la extirpación quirúrgica. El tumor de la sangre está limitado a la terapia con agentes antitumorales y a la terapia de radiación, y como se describe en lo anterior, la célula troncal cancerosa puede tener una resistencia a estos tratamientos. Otro problema es que los efectos secundarios son grandes, puesto que estos dos tratamientos afectan a todo el cuerpo. Como medio para resolver este problema, es de esperar un fármaco diana molecular Tienen la posibilidad de reducir los efectos secundarios al presentar su eficacia farmacéutica solamente en la célula que expresa la molécula diana.
Los ejemplos de fármacos típicos del fármaco diana molecular en el campo de enfermedades sanguíneas incluyen imatinib y rituximab. Imatinib se dirige contra un factor que provoca la leucemia, denominado Bcr-Abl, producido por una anormalidad cromosómica (cromosoma de Filadelfia), que se obselVa en el 95% de los pacientes con CML Este es un fármaco de bajo peso molecular que induce el suicidio de células leucémicas al inhibir la función de BcrAbL Rituximab es un anticuerpo terapéutico que reconoce CD20 como una molécula de la superficie en una célula B, y tiene un efecto antitumoral sobre un tumor maligno de célula B (Iinfoma no de Hodgkin y similar). Por otro lado, los fármacos diana moleculares para AML son pocos, y solamente hay un agente gemtuzumabozogamicina (Mylotarg) en el que un antibiótico, calicheamicina, está enlazado a un anticuerpo monoclonal para CD33, conocido como un antígeno de la superficie celular de AML. Sin embargo, actualmente el uso de Mylotarg está limitado debido a su fuerte toxicidad, que se considera derivada de la calicheamicina, además del problema de que el intelValo terapéutico es estrecho. Basándose en lo expuesto anteriormente, se puede afirmar que el descubrimiento de un nuevo gen diana y el desarrollo de un agente terapéutico para éste soo invenciones importantes que conducen directamente a la posibilidad de terapia y expansión de las elecciones de la terapia
Como la realización de fármacos diana moleculares, se han estudiado y desarrollado diversas sustancias tales como un anticuerpo terapéutico y un fármaco de bajo peso molecular, así como un fármaco peptídico, una preparación proteica biológica tal como citocina, un ARNpi, aptámero, y similar. Cuando se usa un anticuerpo como agente terapéutico, debido a su especificidad, es útil en el tratamiento de patologías en las que la célula trastornada expresa un antígeno específico. El anticuerpo se une a una proteína que se expresa sobre la superficie celular como su antígeno, y actúa eficazmente al unirse a la célula. El anticuerpo tiene una característica de una semivida prolongada en la sangre y una elevada especificidad por su antígeno, y también es notablemente útil como agente antitumoraL Por ejemplo, cuando un anticuerpo se dirige a un antígeno específico de tumor, se puede esperar que el anticuerpo administrado se acumule en el tumor y ataque de ese modo a la célula tumoral vía la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Además, al unir una sustancia radioactiva, una sustancia citotóxica y similar a un anticuerpo, es posible transferir eficientemente un agente a la parte tumoral y permitir de ese modo que actúe sobre ella. Al mismo tiempo, puede disminuir la cantidad del agente dirigido a otros tejidos no específicos, y también se puede esperar una reducción de efectos secundarios Se puede esperar la inhibición del crecimiento tumoral o la regresión del tumor al administrar un anticuerpo que tiene actividad agonista cuando un antígeno específico de tumor tiene una actividad para inducir la muerte celular, o al administrar un anticuerpo que tiene actividad de neutralización cuando un antígeno específico de tumor está relacionado con el crecimiento y supelVivencia de las células. Debido a las características anteriores, se considera que los anticuerpos son adecuados en la aplicación como agentes antitumorales
Con respecto a los anticuemos terapéuticos·
En la preparación de anticuerpo original, se usó un ratón como el animal a inmunizar. Sin embargo, el uso de anticuerpos de ratón como fármacos está limitado debido a un gran número de razones. Un anticuerpo de ratón puede ser reconocido como una sustancia extraña en el cuerpo humano, induciendo la denominada respuesta de ~anticuerpo anti-ratón humano·, a saber, ~HAMA· (documento 6 no de patente). Además, la región Fc del anticuerpo de ratón no es eficaz para el ataque sobre células enfermas vía el complemento humano o células inmunitarias humanas.
Como uno de los enfoques para evitar tales problemas, se ha desarrollado un anticuerpo quimérico (documentos 1 y 2 de patente). El anticuerpo quimérico contiene partes de anticuerpos derivadas de dos o más especies (región variable de anticuerpo de ratón, región constante de anticuerpo humano, y similar). Un punto ventajoso de tal anticuerpo quimérico es que mantiene las características del anticuerpo de ratón pero puede activar el complemento humano o células inmunitarias humanas, ya que tiene Fc humana. Sin embargo, es conocido que tal anticuerpo quimérico todavía induce la respuesta de ~anticuerpo humano anti-quimérico·, a saber, ~HACA· (documento 7 no de patente).
Además, se ha desarrollado un anticuerpo recombinante en el que solamente se sustituyeron las regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") de una parte de un anticuerpo (documentos 3 y 4 de patente).
Mediante el uso de una técnica de injerto de CDR, se obtiene un anticuerpo que comprende una CDR de ratón y una
región estructural variable humana y una región constante humana, el denominado ~anticuerpo humanizado· (documento 8 no de patente). Además, mediante el uso de un ratón productor de anticuerpo humano, o mediante la identificación usando una biblioteca de anticuerpos humanos, se han proporcionado técnicas ampliamente utilizadas también relacionadas con la preparación de anticuerpos humanos completos (documentos 9 y 10 no de patente)
Con respecto a IL-3Ra·
La IL-3Ra es la cadena a del receptor de IL-3, pertenece a una familia de receptores de citocinas, y muestra una afinidad débil por IL-3 como su ligando. Al formar un heterorreceptof con su cadena ~ (CD131 , en lo sucesivo denominado también como IL-3R~), un receptor de IL-3 tiene una fuerte afinidad y transfiere una señal, tal como crecimiento, diferenciación y similar, a una célula a través de la región intracelular de la cadena ~. La cadena a del receptor de IL-5 Y la cadena a del receptor de GM-CSF comparten en común la cadena 13
La IL-3Ra es una proteína membránica de tipo I de transmembrana de un solo paso, y se sabe, en base a la secuencia, que en la región extramembránica están presentes un sitio de unión a IL-3 y un sitio de fibronectina tipo
111. Se sabe que no hay ninguna estructura que pueda transferir una señal en la región intramembránica. Aunque la estructura tridimensional de IL·3Ra no se ha analizado todavía, se puede suponer que las estructuras de receptores de citocinas son similares entre familias, puesto que la posición del resto de cisteina que forma el enlace S-S estructuralmente importante está conservada en la mayoría de los casos_Entre los mismos receptores de citocinas, se han analizado las estructuras cristalinas de la cadena a del receptor de IL·13, de la cadena a del receptor de IL·4, y de la cadena a del receptor de GM·CSF. Basándose en la información de estas fami lias de receptores de citocinas, se puede suponer que la región extramembránica de IL-3Ra está aproximadamente dividida en 3 dominios (dominios A-B-C). Se sabe que un anticuerpo 7G3 que reconoce el dominio A de IL·3Ra humana bloquea la señalización de IL·3 (documento 11 no de patente). Además, se ha dado a conocer la expresión de una molécula de IL·3Ra deficiente en el dominio A (documento 12 no de patente), y como cuestión de rutina, un anticuerpo que reconoce el dominio A no puede reconocer IL·3Ra deficiente en el dominio A. Además, se considera que el dominio C es la raíz de la molécula de IL·3Ra, y tiene una elevada posibilidad de inhibir tridimensionalmente la asociación de IL·3RI3 con IL·3Ra .
La IL·3 es el único ligando que se conoce como ligando de IL·3Ra. IL·3 es un factor hematopoyético que se sabe que acelera la formación de colonias de los siguientes: eritrocito, megacariocito, neutrófilo, eosinófilo, basófilo, mastocito y célula del sistema monocítico. Se sabe que IL·3 también estimula una célula precursora que tiene pluripotencia, pero se afirma bastante que IL·3 acelera una diferenciación no de una célula troncal inmadura que tiene capacidad de replicación autónoma sino de una célula precursora comprometida con la diferenciación
Es conocido que IL·3Ra está relacionada con el crecimiento y diferenciación de células mieloides al formar un heterodímero con la cadena 13 y transferir de ese modo la señalización de IL-3 a la célula vía la ruta de fosforilación de serinaltreonina. Se sabe que IL-3Ra está expresada en células progenitoras de granulocitos-macrófagos (GMP) o células progenitoras mieloides comunes (CMP) entre las células precursoras hematopoyéticas, e induce crecimiento y diferenciación en sistemas de neutrófilos y macrófagos vía la señalización de IL·3. Por otro lado, se ha dado a conocer que el progenitor megacariocitico-eritroide (MEP) que se presenta aguas abajo de CMP no expresa IL-3Ra, a diferencia del GMP, que también está presente aguas abajo.
Con respecto a células troncales de AML, Bonnet y Oick han dado a conocer que la célula troncal de AML está
presente en la fracción CD34 positiva C038 negativa (referencia 13 no de patente). Además, comparando la misma fracción (CD34 positiva C038 negativa) de la célula troncal normal, Jordan et al. han encontrado que IL·3Ra está muy expresada en la célula troncal de AML (referencia 14 no de patente). En la pluralidad de informes posteriores (referencias 15 y 16 no de patente) también se ha dado a conocer un elevado potencial de IL·3Ra como marcador de no solo la célula troncal de AML sino también de célula troncal de leucemia. En el tratamiento de cánceres que incluyen leucemia, es importante que se eliminen solamente las células cancerosas sin lesionar tanto como sea posible células normales, y se considera que esta diferencia en la expresión de IL-3Ra entre la célula troncal normal y la célula troncal leucémica es útil en el tratamiento dirigido a la célula troncalleucémica
Con respecto a IL.3RI3 que forma un heterodimero con IL·3Ra, no hay ningún informe que afirme que IL-3RI3 está muy expresada en células troncales de leucemia, y también en el caso de una micromatriz en la que se compara de hecho la expresión de ARNm en célula troncal de leucemia y célula troncal normal, IL·3RI3 no está identificada como una molécula en la que su expresión está incrementada en célula troncal de leucemia (referencia 17 no de patente)
Con respecto a IL·3RI3 que forma un heterodímero con IL·3Ra , no hay ningún informe que afirme que IL·3RI3 está muy expresada en célula troncal de leucemia, y también en el caso de una micromatriz en la que se compara de hecho la expresión de ARNm en célula troncal de leucemia y célula troncal normal, IL·3RI3 no se identifica como una molécula cuya expresión está incrementada en célula troncal de leucemia (referencia 18 no de patente).
La presencia de una célula leucémica que depende de IL-3 es conocida desde hace tiempo, y los estudios antiguos son estudios enfocados en un blastocito, que ocupa la mayoría de las células leucémicas. Según los estudios recientes sobre célula troncal leucémica, se afirma que la célula troncal leucémica adquiere resistencia a agentes antitumorales al suprimir exhaustivamente su crecimiento. Además, se coosidera que un blastocito reactivo con IL-3 tiene una capacidad de proliferación elevada, de manera que se supone que tal célula es eficaz en el tratamiento general usando un agente antitumoral
Como candidato del agente dirigido a un receptor de IL-3R, la propia IL-3 se administró durante mucho tiempo a pacientes con insuficiencia hematopoyética, pero no dio resultado como fármaco. Está en desarrollo un ensayo clínico para una proteina de fusión en la que se añade la toxina diftérica a IL-3, apuntando a la leucemia como una diana de la enfermedad. Con respecto a la IL-3 y la fusión de toxina diftérica-IL-3, éstas no son adecuadas como los agentes dirigidos contra células en las que la expresión de IL-3Ro: está incrementada especificamente, puesto que IL-3 se une fuertemente no a una proteína de IL-3Ro: sola sino también a una heteroproteína de IL-3Ro: y 13, debido a las propiedades de IL-3. Por otro lado, como candidato de un agente dirigido contra IL-3Ra, se ha dado a conocer un resultado de primera fase de un anticuerpo quimérico 7G3 de ratón y humano anti-IL-3Ro: (documento 19 no de patente). Puesto que el anticuerpo quimérico 7G3 se usa con el objeto de bloquear la señalización de IL-3 como mecanismo de terapia contra AML, éste no es un agente dirigido a eliminar células positivas para IL-3Ru. También, aunque se conocen algunos otros anticuerpos anti-IL-3Ro: (9F5 (Becton Dickinson), 6H6 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) Y AC 145 (Miltenyi-Biotech)), éstos no tienen la capacidad para eliminar las células que expresan de forma elevada IL-3Ru.
El documento 20 no de patente describe el anticuerpo monoclonal 7G3, que se une específicamente a la cadena de IL-3Rcc El documento 5 de patente describe un anticuerpo monoclonal anti-cadena de IL-3Ra producido mediante la estirpe celular de hibridoma designada 7G3. El documento 21 no de patente da a cooocer un estudio de fase I que usa CSL360, un mAb IgG1 quimérico recombinante derivado de 7G3.
Listado de citas
Documento de patente Documento 1 de patente · Solicitud de Patente Publicada EP 120694 Documento 2 de patente: Solicitud de Palente Publicada nO 125023 Documento 3 de patente · Solicitud de Patente GB nO GB2188638A Documento 4 de patente · patente US nO 5.585.089 Documento 5 de patente · WO 97/24373 Documento no de patente Documento 1 no de patente· Osawa M et al., Science. 273:242-5 (1996) Documento 2 no de patente: Goadell MA et al. , J Exp Med. 183: 1797-806 (1996) Documento 3 no de patente Yamazaki S et al., EMBO J. 25: 3515-23 (2006) Documento 4 no de patente· Ishikawa F et al., Nat Biotechnol. 25:1315-21 (2007) Documento 5 no de patente: Bao S et al., Nature. 444: 756-60 (2006) Documento 6 no de patente: Schiff et al., Canco Res., 45, 879-885 (1985) Documento 7 no de patente· Bruggemann et al., J. Exp. Med., 170:2153-2157 (1989) Documento 8 no de patente: Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988) Documento 9 no de patente Ishida I et al., Clooing Stem Cells. 4:91-102 (2002) Documento 10 no de patente: Wu et al., J Mol Biol. 19:151-62 (1999) Documento 11 no de patente· Sun et al., Bload, 87:83 (1996) Documento 12 no de patente: Chen el al., J Biol Chem, 284: 5763(2009)
Documento 13 no de patente· Bonnetet al., Na! Med, 1997; 3: 730
Documento 14 no de patente: Jordan el al., Leukemia, 2000; 14: 1777
Documento 15 no de patente· Haematologica, 2001; 86:1261
Documento 16 node patente LeukLymphoma, 2006; 47:207
Documento 17 node patente· Majeti et al., Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:3396
Documento 18 node patente: Majeti et al., Proc Natl Acad Sci USA. 106:3396(2009)
Documento 19 no de patente· Blood, 2008 112 (11 ): Abstrae! 2956
Documento 20 no de patente· Sun et al (1996) Blood 87:83-92
Documento 21 no de patente· Roberts el al (2008) Blood 112:1015-1016
Sumario de la invenció n
Problemas técnicos
Un objetivo de la invención es proporcionar un agente terapéutico que puede eliminar células troncales leucémicas solas y que también apenas presente efectos adversos sobre células normales (muestra muy pocos efectos secundarios). Específicamente, la presente invención proporciona un anticuerpo contra la cadena de IL~3Ra humana, que no inhibe la señalización de IL-3, y que se une al dominio B de la cadena de IL-3Ra humana pero no se une al dominio C. También se describe en la presente memoria una composición que comprende el anticuerpo, y un método terapéutico o método de detección que comprende el anticuerpo
Solución de problemas
La invención se refiere a los siguientes (1) a (9)
(1 ) Un anticuerpo contra una cadena de IL-3Ro. humana, que no inhibe la señalizaciÓfl de IL-3 que se une al dominio B de la cadena de IL·3Ra humana pero no se une al dominio C de la cadena de IL+3Ra humana.
(2)
El anticuerpo descrito en el (1) mencionado anteriormente, que tiene además citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) elevada.
(3)
El anticuerpo descrito en el (1) o (2) mencionado anteriormente, en el que la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) elevada muestra una tasa de lisis específica de 10% a una concentración de anticuerpo de 0,01 ).Iglml, mediante un método de ensayo de ADCC sobre células Colon-261hCD123 que usa PBMC cultivadas con IL-2.
(4)
El anticuerpo descrito en uno cualquiera de los (1) a (3) mencionados anteriormente, que comprende secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y CDR de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes (a) a (e):
(a)
CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 113 a 115, respectivamente, y CDR 1 a 3 de la cadena ligera soo las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 131 a 133, respectivamente,
(b)
CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 116 a 118, respectivamente, y CDR 1 a 3 de la cadena ligera soo las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 134 a 136, respectivamente,
(c)
CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 119 a 121 , respectivamente, y CDR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 137 a 139, respectivamente,
(d)
CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs 122 a 124, respectivamente, y CDR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 140 a 142, respectivamente,
(e)
CoR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 125 a 127, respectivamente, y CoR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 143 a 145, respectivamente
(5)
El anticuerpo descrito en uno cualquiera de los (1) a (4) mencionados anteriormente, que comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes (a) a (e)·
(a)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (a ) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 53, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de valina (V) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 55;
(b)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (a) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 57, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de valina (V) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 59;
(c)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (Q) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 61 , Y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de ácido aspártico (O) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 63;
(d)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (a) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 65, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de ácido aspártico
(O) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 67; y
(e ) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (O) en la posición 20 a serina (S) en la posición 138 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 69, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de ácido aspártico (O) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 71
(6)
Una composición para uso en un método para prevenir o tratar un tumor de la sangre en el que una célula que expresa IL-3Ru se encuentra en la médula ósea o sangre periférica de un sujeto, que comprende el anticuerpo anti-IL-3Ru descrito en uno cualquiera de (1 ) a (5) como principio activo.
(7)
El anticuerpo anti-IL-3Ra descrito en uno cualquiera de (1) a (5) para uso en un método para tratar un tumor de la sangre en el que una célula que expresa IL-3Ro. se encuentra en médula ósea o sangre periférica
(8)
Uso del anticuerpo anti-IL-3Ru descrito en uno cualquiera de (1) a (5) para detectar un tumor de la sangre en el que una célula que expresa IL-3Ra se encuentra en médula ósea o sangre periférica de una muestra biológica procedente de un sujeto
(9)
La composición para uso como se describe en (6) o el anticuerpo anti-IL-3Ra para uso como se describe en
(7) o el uso como se describe en (8), en el que el tumor de la sangre es leucemia mieloide aguda (AML).
Efecto ventajoso de la invención
La invención se refiere a un anticuerpo contra la cadena de IL-3Ra humana, que no inhibe la señalización de IL-3 y que se une al dominio B de la cadena de IL-3Ra humana pero que no se une al dominio C; a una composición que comprende dicho anticuerpo; y a un método terapéutico o método de detección que usa dicho anticuerpo.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] Y {figura 2] Las figuras 1 y 2 son resultados de un análisis de citomelria de flujo de una célula que expresa una proteina quimérica IL-3RalGM-CSFRa usando un anticuerpo marcado anti-IL-3Ra.
[Figura 3] La figura 3 es un resultado de un análisis de cilometría de flujo de una célula que expresa una proteína quimérica IL-3RalGM-CSFRa usando un anticuerpo marcado anti-IL-3Ra.
[Figura 4] La figura 4 es una gráfica en la que, entre las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de los dominios A Y B de la molécula de IL-3Ra humana, se muestran mediante líneas discontinuas partes de regiones en las que las regiones 1 a 7 dispuestas en el exterior de la molécula están sustituidas por la secuencia de GM-CSFRa mostrada
[Figura 5] La figura 5 es un resultado de un ensayo de crecimiento celular para examinar la actividad de bloqueo de la señalización de IL-3. La ordenada representa el porcentaje de inhibición de crecimiento celular (%) y la abscisa representa diversos nombres de anticuerpos anti-IL-3Ra
[Figura 61 La figura 6 es un resultado de un ensayo de colonias para examinar la actividad de bloqueo de la señalización de IL-3. GM, E, Y GEMM muestran resultados usando el sistema de granulocitos/macrófagos, colonia del sistema de eritroides, y colonias mixtas, respectivamente
[Figura 7] La figura 7 es un resultado de examinar los efectos antitumorales de diversos anticuerpos humanos en un modelo que posee tumor. La ordenada representa el número de células MOLM13, y la abscisa representa los diversos nombres de anticuerpos anti-IL-3Ru.
[Figura 8] Y [figura 9] Las figuras 8 y 9 soo resultados del ensayo de ADCC para estirpes celulares que expresan IL3Ra usando anticuerpo anti-IL-3Ra En la figura 8 se usó PBMC no cultivada con IL-2, yen la figura 9 se usó PBMC cultivada con IL-2.
[Figura 10] La figura 10 es un resultado del análisis de citometría de flujo de células que expresan una IL-3Ru de Macaca fascicularis mediante el anticuerpo anti-IL-3Ra y un anticuerpo secundario anti-lgG humana marcado con PE. La columna superior muestra las células que expresan IL-3Ra de Macaca fascicularis , y la columna inferior muestra las células que expresan IL-3Ro: humana
Modo de poner en práctica la invención
(Descripción detallada de las formas de realización deseables especificadas)
Los encabezamientos de las secciones a usar en esta memoria descriptiva son solamente con el fin de organización, y no se deberían de interpretar como lim itación para el objeto principal a describir.
(Resumen)
Esta invención se refiere a un anticuerpo contra la cadena de IL-3Ra humana, que no inhibe la señalización de IL-3, y que se une al domino B de la cadena de IL-3Ra humana (en adelante denominada IL-3Ra) pero que no se une al dominio C
Los receptores de IL-3 (en adelante denominados IL-3R), particularmente IL-3Ra, son expresados en la superficie celular de una célula troncalleucémica. En general, la cadena 13 del receptor de IL-3 (en adelante denominada IL3RI3) transfiere la señalización de IL-3 a la célula, y por lo tanto induce crecimiento y diferenciación
En consecuencia, existe la posibilidad de que una inhibición de la señalización de IL-3 provoque efectos secundarios tales como la inhibición de la acción hematopoyética normal por una célula troncal normal. De este modo, como nuevo método terapéutico dirigido a la célula troncalleucémica, es preferible que el método se dirija contra IL-3Ro: y que no inhiba la señalización de IL-3
(IL-3Ra)
El gen de IL-3Ru es una proteína transmembránica de tipo I que pertenece a una familia de receptores de citocinas. En células normales, la molécula de IL-3Ra es expresada sobre una parte de células precursoras hematopoyéticas, basófilos, una parte de células dendriticas, y similares. En el caso de tumOfes, se sabe que es expresada en un cáncer y leucemia en el sistema hematapoyético. Como ejemplos de tumores que expresan IL-3Ra, se sabe que IL3Ra es expresada en blastocitos de AML y CML en la fase de crisis blástica, yen el caso de una fracción negativa para marcadores de diferenciación positiva para CD34 negativa para CD38 considerada como una célula troncal leucémica, en AML, CML, MDS, ALL Y SM. En la sangre, IL-3, que es un ligando conocido de IL-3Ra, es expresada sobre una célula T activada, una célula asesina natural, un mastocito y una parte de células del sistema megacariocítico. Además, la IL-3Ra también se denomina CD123. La IL-3Ra incluye una IL-3Ra de tipo mamífero (por ejemplo, los primates y humallOs). La secuencia de IL-3Ra incluye variantes polimórficas. Los ejemplos especificos de la IL-3Ra humana de longitud completa incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos
MVLLWLTLLLlALPCLLQTKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKD
ADYSMPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENSGKPWAGAENL
TCWJHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRlG
CRFDDISRLSSGSQSSHILVRGRSAAFGIPCTDKfVVFSQIEILTPPNMTAKCNKTHS
FMHWKMRSHFNRlKfRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQLLNPGTYTV QJRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGANTRAWRTSLLlALGTLLALVCVFVIC
RRYLVMQRLFPRlPHMKDPIGDSFQNDKLVVWEAGKAGLEECLVTEVQVVQKT
(SEC ID NO: 1)
Los ejemplos específicos de secuencia de aminoácidos de la región extracelular de IL-3Ru humana incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos
MVLLWLTLLLIALPCLLQTKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVK
DADYSMPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWlLFPENSGKPWAGAE
NLTCWJHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQG
TRlGCRFDDISRLSSGSQSSHILVRGRSAAFGJPCTDKFVVFSQIEILTPPNMTAKC
NKTHSFMJlWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQLLNPGTYTV
QJRARERVYEFLSA WSTPQRFECDQEEGANTRA WRTSL (SEQ ID NO:2)
Además, la región extracelular de IL-3Ra está dividida en tres dominios de A a C.
Un dominio comprende una región desde glutamina (O) en la posición 18 hasta serina (S) en la posiciÓfl 100 en los aminoácidos de SEC ID NO: 2, y el dominio B comprende desde la glicina (G) en la posición 101 hasta serina (S) en la posición 203 en los aminoácidos de SEC ID NO: 2, y el dominio e , aquella desde la glutamina (Q) en la posición 204 a leucina (L) en la posición 308 en los aminoácidos de SEC ID NO: 2.
Además, en el dominio A y en el dominio B, las siguientes 7 regiones están dispuestas en el exterior de la molécula.
La región 1 es desde el ácido aspártico (O) en la posición 55 hasta prolina (P) en la posición 61 en los aminoácidos de la SEC ID NO: 2, la región 2 es desde la valina (V) en la posición 63 hasta fenilalanina (F) en la posición 70 en los aminoácidos de la SEC ID NO:2, la región 3 es desde la serina (S) en la posición 91 hasta ácido glutámico (E) en la posición 98 en los aminoácidos de la SEC ID NO: 2, la región 4 es desde la prolina (P) en la posición 97 hasta triptófano (W) en la posición 104 en los aminoácidos de la SEC ID NO:2, la región 5 es desde la cisteína (C) en la posición 122 hasta prolina (P) en la posición 128 en los aminoácidos de la SEC ID NO:2, la región 6 es desde la isoleucina (1 ) en la posición 182 hasta serina (S) en la posición 188 en los aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y la región 7 es desde la glicina (G) en la posición 192 hasta lisina (K) en la posición 198 en los aminoácidos de la SEC ID NO:2
En consecuencia, los ejemplos del anticuerpo de la invención incluyen un anticuerpo que se une a una secuencia de aminoácidos de las posiciones 101 a 203 en los aminoácidos de SEC ID NO: 2 que es la región extracelular de IL3Ru, pero que no se une a una secuencia de aminoácidos de posiciones 204 a 308, y un anticuerpo que se une además a secuencias de aminoácidos de posiciones 182 a 188 y posiciones 192 a 198 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.
El anticuerpo de la invención se une a las regiones específicas mencionadas anteriormente de la región extracelular de IL-3Ra, y no inhibe la seña lización de IL-3
La expresión "no inhibe la sena lización de IL-3", como se usa en la invención, significa que no inhibe la senal
intracelular a través de IL-3R mediante IL-3, e incluye un caso en el que la asociación de IL-3 con IL-3R no está inhibida y la unión de la cadena de IL-3Ru y la cadena pno está inhibida. Específicamente, significa que la relación de inhibición del crecimiento celular mostrada por figura 5 según el análisis en el ejemplo 8 es 40% o más, preferiblemente 60% o más, más preferiblemente 80% o más, cuando la concentraciÓfl de anticuerpo se ajusta a 10 Ilg/mL Según esta memoria descriptiva, las expresiones "bloquear la señalización de IL-3" e "inhibir la señalizaciÓfl de IL-3~ se usan con el mismo significado y no son discriminantes, y la actividad de bloqueo de la seña lización de IL3 significa la capacidad para inhibir la señalización de IL-3
También, el anticuerpo de la invenciÓf'l tiene una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) elevada, además de las propiedades mencionadas anteriormente
El anticuerpo anti-IL-3Ra que tiene actividad de AOCC significa un anticuerpo que se une a una célula que expresa IL-3Ra para exterminar a la célula que expresa IL-3Ra vía una célula efectora que tiene citotoxicidad, tal como célu la NK y similar
La actividad de AOCC elevada significa que el porcentaje de lisis específico es 10% o más a una concentración de anticuerpo de 0,01 f.lg/ml o menos cuando se mide mediante un ensayo de AOCC sobre células Colon-261hC0123 que usa PBMC cultivada con IL-2
El porcentaje de lisis específica significa un valor obtenido midiendo el porcentaje de lisis de una célula diana por un anticuerpo, y se puede calcular específicamente según el siguiente ejemplo 11.
Los ejemplos de la célula que expresan IL-3Ra incluyen células cancerosas de la sangre (células de leucemia mieloide aguda (AML), células de leucemia mieloide crónica (CML), células de síndromes mielodisplásicos (MOS), células de leucemia linfoide aguda (ALL), células de leucemia linfoide crónica (CLL), células de mieloma múltiple (mieloma múltiple: MM), células de mastocitoma sistémico (SM), etc.), células T reguladoras (tales como células C04-positivas C025-positivas), células presentadoras de antígeno (tales como células dendríticas, monocitos, macrófagos y células similares a ellas (células estrelladas hepáticas, osteoclastos, microgliocitos, las células fagocíticas epidérmicas principales, células del polvo (macrófagos alveolares), etc.», basófilos, y similares.
Además, la célula de AML, la célula de CML, la célula de ALL, la célula de CLL, la célula de MOS, la célula de SM, la célula de MM, diversas células de linfoma incluyen sus células troncales cancerosas.
La célula troncal cancerosa es uno de los grupos celulares que constituye el tumor. Por ejemplo, en leucemia mieloide aguda (AML) está representada por la célula mieloide linaje(-)C034(+)C038(-). En consecuencia, pueslo que el anticuerpo de la invención tiene actividad de AOCC elevada, induce reducción o eliminación de células que expresan IL-3Ra
También, el anticuerpo anti-IL-3Ra de la invención incluye un anticuerpo anti-IL-3Ra que tiene COR de cadena pesada y COR de cadena ligera selecciooadas del grupo que consiste en los siguientes (a) a (e):
(a)
COR 1 a 3 de cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs· 113 a 115, respectivamente, y COR 1 a 3 de cadena ligera SOfl las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 131 a 133, respectivamenle,
(b)
COR 1 a 3 de cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 116 a 118, respectivamente, y COR 1 a 3 de cadena ligera SOfl las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 134 a 136, respectivamente,
(c)
COR 1 a 3 de cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs· 119 a 121, respectivamente, y COR 1 a 3 de cadena ligera SOfl las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 137 a 139, respectivamenle,
(d)
COR 1 a 3 de cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 122 a 124, respectivamente, y COR 1 a 3 de cadena ligera SOfl las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 140 a 142, respectivamente , y
(e)
COR 1 a 3 de cadena pesada son las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs:125 a 127, respectivamente, y COR 1 a 3 de cadena ligera SOfl las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 143 a 145, respectivamente .
Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo anti-IL-3Ra que comprende la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes (a) a
(f) (se muestran entre paréntesis los nombres de los anticuerpos que se describen en los siguientes ejemplos a partir de los cuales se obtiene cada una de las regiones variables):
(a)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos desde glutamina (O) en la posición 20 hasta serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 53, y una regiÓfl variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos desde valina (V) en la posición 23 hasta lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO:55 (nombre del anticuerpo: Old4)
(b)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos desde glutamina (O) en la posición 20 hasta serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 57 , y una regiÓfl variable de cadena ligera que comprende una secuencia de am inoácidos desde valina (V) en la posición 23 hasta lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos representada
por SEC ID NO: 59 (nombre del anticuerpo: Old5)
(c)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos desde glutamina (Q) en la posición 20 hasta serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 61 , y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos desde ácido aspártico (O) en la posición 23 hasta lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 63 (nombre del anticuerpo: Old17)
(d)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos desde glutamina (Q) en la posición 20 hasta serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 65, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos desde ácido aspártico (O) en la posición 23 hasta lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 67 (nombre del anticuerpo: Old19), y
(e)
una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos desde glutamina (Q) en la posición 20 hasta serina (S) en la posición 138 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 69, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos desde ácido aspártico (O) en la posición 23 hasta lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 71 (nombre del anticuerpo: Newl02).
También se describen aquí anticuerpos anti-IL-3Ra que comprenden una región variable de cadena pesada ylo una región variable de cadena ligera, que comprenden secuencias de aminoácidos en las que 1 a 3 restos de aminoácidos están suprimidos, sustituidos, añadidos o insertados en la región variable de cadena pesada ylo en la región variable de cadena ligera mostradas mediante (a) a (e).
(Anticuerpo)
El anticuerpo se usa en un sentido muy amplio, e incluye un anticuerpo monoclooal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multivalente, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y también fragmentos de anticuerpo en tanto que éstos presenten la actividad biológica deseada.
El anticuerpo contiene una secuencia de región variable de cadena pesada o de cadena ligera madura. Además, el anticuerpo también incluye una forma modificada y forma variante tal como sustituciones en o fuera de una región constante, una región determinante de la complementariedad (CoR) o un anticuerpo de región estructural (FR) de una secuencia de región variable de cadena pesada o ligera madura del anticuerpo, y similar. En una realización especifica, la sustitución incluye una sustitución de aminoácidos conservativa incluida en la sustitución
Además, el anticuerpo tambiérJ incluye una subsecuencia de la secuencia de la región variable de cadena pesada o de cadena ligera madura. En una realización especifica, la subsecuencia se selecciona de Fab, Fab', F(ab'b, Fv, Fd, Fv monocatenario (scFv), Fv de enlace de disulfuro (sdFv) y VL o VH
Además, el anticuerpo lambiérJ incluye un dominio heterogérJeo. En una forma de rea lización específica, el dominio heterogéneo incluye una etiqueta, un marcador detectable o un agente citotóxico.
Los ejemplos del anticuerpo incluyen un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal, y cualquier isotipo o subclase de los mismos. En una realización especifica, el anticuerpo mencionado anterionnente es un isotipo de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA, IgM, IgE o IgO. El anticuerpo ~monoclonal" significa un anticuerpo que se basa en, se obtiene de un único clon que incluye un clon eucariota, un clon proca riota o un clon fágico, o que deriva de un único clon que incluye un clon eucariota, un clon procariota o un clon fágico, se basa en un único clon que incluye un clan eucariota, un clon procariota o un clon fágico. En consecuencia, el anticuerpo "moooclonal" es una sustancia estructuralmente definida, y no un método mediante el cual se produce
El anticuerpo contra IL-3Ra, anti-IL-3Ra y anticuerpo anti-IL-3Ra significan un anticuerpo que se une específicamente a IL-3Ra. La unión específica significa que es selectiva para el epítopo que presenta una IL-3Ra. La unión especifica se puede distinguir de la unión no especifica usando un ensayo conocido en el campo técnico (por ejemplo, inmunoprecipitación, ELlSA, citometría de flujo, transferencia Westem).
Cuando todos o una parte de los epítopos del antígeno a los que se une específicamente un anticuerpo anti-IL-3Ra están presentes en diferentes proteinas, existe la posibilidad de que este anticuerpo se pueda unir a las diferentes proteínas. Por lo tanto, existe la posibilidad de que el anticuerpo anti-IL-3Ra se una específicamente a otra proteína que tiene homología estructural o de secuencia elevada con el epítopo de IL-3Ra, dependiendo de la homología estructural o de secuencia con el epítopo de IL-3Ru. En consecuencia, existe la posibilidad de que el anticuerpo antiIL-3Ra se una a una proteina diferente cuando un epítopo que tiene suficiente homologia de secuencia o estructural está presente en la proteína diferente
El anticuerpo anti-IL-3Ra incluye anticuerpos aislados y purificados. El anticuerpo de la invención, incluyendo un anticuerpo anti-IL-3Ra aislado o purificado, incluye un anticuerpo humano.
La expresión "(estar) aislada", que se debe utilizar como un modificador de una composición, significa que la composición se prepara por la mano del hombre o se separa de uno o más componentes adicionales en un entomo in vivo que se presenta en la naturaleza generalmente mediante una o más etapas o procedimientos de manipulación. En general, una composición separada de esta manera no contiene sustancialmente uno o más materiales con los que se asocian normalmente en la naturaleza, tal como una o más proteínas, ácidos nucleicos, lipidos, hidratos de carbono y membranas celulares. Debido a esto, la composición aislada se separa de otros componentes biológicos en las células del organismo en las que aparece de forma natural en la composición, o del medio artificial en el que se produce (por ejemplo, mediante síntesis o cultivo celular). Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-3Ra aislado se puede obtener de un animal en el que se produce el anticuerpo (por ejemplo, mamíferos no transgénicos o mamíferos transgénicos (roedores (ratón) o los ungulados (ganado) y se separa de otros polipéptidos y ácidos nucleicos. En consecuencia, se considera que el suero que contiene un anticuerpo obtenido de tal animal está aislado. la expresión a(estar) aislado" no excluye fonnas físicas alternativas, y por ejemplo, un anticuerpo aislado podrla incluir subsecuencias y quimeras, multímeros o formas derivatizadas del anticuerpo
La expresión "(estar) purificada", a usar como un modificador de una composición, se refiere a una composición que está libre de la mayoría de o de sustancialmente todos los materiales con los que está asociada en la naturaleza. En general, un anticuerpo purificado se obtiene a partir de los componentes que se presentan generalmente en el entomo del anticuerpo. Debido a esto, se considera que un sobrenadante de anticuerpo que se separa de una mezcla de cultivo celular de un hibridoma productor de anticuerpo está purificado. En consecuencia, el "(estar) purificado" no requiere pureza absoluta, y es específico del contexto. Además, la composición "(estar) purificada" se puede com binar con una o más moléculas adicionales. Debido a esto, la expresión ~(estar) purificada" no excluye la combinación de composición. la pureza se puede determinar mediante un método apropiado opcional tal como espectrometría de UV, cromatografía (por ejemplo, HPLC, fase gaseosa), eleclroforesis en gel (por ejemplo, tinción con plata o Coomassie), análisis de secuencia (péptido y ácido nucleico) y similares.
La proteína y el ácido nucleico ·purificados" incluyen una proteína y un ácido nucleico que se obtienen mediante un método de purificación estándaf. También, una proteína y un ácido nucleico obtenidos mediante expresión recombinante en una célula hospedante y síntesis química también están incluidos en este término. Además, el ~(estar) purificado" también se puede referir a una composición en la que el nivel de contaminantes es menor que el nivel que es aceptable por una agencia normativa para la administración a animales humanos o no humanos, tales como la Food and Drug Administration (FDA)
El anticuerpo anti-IL-3Ra incluye un anticuerpo que se une a IL-3Ra y modula la función o actividad de IL-3Ra in vivo o in vitro (por ejemplo, en un sujeto). En la memoria descriptiva, "modular" y sus variaciones gramaticales, cuando se usa en relación con la actividad o función de IL-3Ra, significan que la actividad o función de IL-3Ra está afectada, modificada o alterada de forma detectable, pero no incluye la inhibición de la señalización de IL-3. En consecuencia, el anticuerpo anti -IL-3Ra que modula la actividad o función de IL-3Ra es un anticuerpo que proporciona influencia, modificación o alteración de manera que una o más de la actividad o función de IL-3Ra se puede detectar sin inhibir la seña lización de IL-3, y tal actividad o función de IL-3Rn puede incluir, por ejemplo, la unión de IL-3Ra con un ligando de IL-3Ra (por ejemplo, IL-3), una transferencia de señal mediada por IL-3Ra, o una respuesta celular mediada por IL-3Ra o una respuesta celular que puede ser modulada por IL-3Ra, o la actividad o función de otra IL-3Ra descrita en la memoria descriptiva, o en cualquier otra parte, es conocida normalmente o se puede conocer
Los ejemplos de diversas actividades y funciones de IL-3Ra no limitadas que se pueden modular incluyen la transducción de señales mediada por IL-3Ra o la respuesta celular mediada por IL-3Ra, la respuesta celular que se puede modular vía IL-3Ra, la proliferación celular o expansión celular (por ejemplo, célula de AML, célula de CML,
célula de AlL, célula de ClL, célula de MOS, célula de MM, célula de SM, diversas células de linfoma, monodtos, macrófagos, mastocitos, basófilos, células T cooperadoras, células T reguladoras, células asesinas naturales, células progenitoras mieloides y células progenitoras linfoides), supervivencia o apoptosis celular (por ejemplo, célula de AML, célula de CML, célula de AlL, célula de ClL, célula de MDS, célula de MM, célula de SM, diversas células de linfoma, monocitos, macrófagos, mastocitos, basófilos, células T cooperadoras, células T reguladoras, células asesinas naturales, células progenitoras mieloides y células progenitoras linfoides), expresión o producción de dtocinas (por ejemplo, citocinas Th1 , Th2 Y no Th1fTh2) e interierones, expresión o producción de proteína antiapoptótica o proteína proapoptótica, tratamiento, supresión o mejora de trastorno, enfermedad, estado fisiológico, estado patológico y síntoma. Las citodnas específicas a modular no están limitadas, y los ejemplos incluyen IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, TNF-a, e interierón y (in vitro o in vivo) Las proteínas antiapoptóticas y las proteínas proapoptóticas específicas no están limitadas, y los ejemplos incluyen Scl-xL, BcI-2, Sad, Bim, y Mcl-1
Por lo tanto, los ejemplos de anticuerpo anti -IL-3Ra descritos en la presente memoria descriptiva incluyen un anticuerpo que modula la transducción de señales mediada por IL-3Ra o la respuesta celular mediada por IL-3Ra, la
respuesta celular que puede ser modulada vía IL-3Ru, la proliferación celular o crecimiento celular (por ejemplo, célula de AML, célula de CML, célula de ALL, célula de CLL, célula de MDS, célula de MM, célula de SM, diversas células de linfoma, monocitos, macrófagos, mastocitos, basófilos, células T cooperadoras, células T reguladoras, células asesinas naturales, células progenitoras mieloides y células progenitoras linfoides), supervivencia o apoptosis celular (por ejemplo, célula de AML, célula de CML, célula de ALL, célula de CLL, célula de MOS, célula de MM, célula de SM, diversas células de linfoma, mooocitos, macrófagos, mastocitos, basófilos, células T cooperadoras, células T reguladoras, células asesinas naturales, células progenitoras mieloides y células progenitoras linfoides), expresión o producción de citocinas (por ejemplo, citocinas Th1 , Th2 Y no Th1fTh2) e interterones, expresión o producción de proteína antiapoptótica o proteína proapoptótica, tratamiento, supresión o mejora de trastomo, enfermedad, estado fisiológico, estado patológico y síntoma. En las formas de realización específicas, el anticuerpo anti-IL-3Ru de la presente invención puede modular la expansión o supervivencia de célula de AML, el número de otra célula cancerosa de la sangre (por ejemplo, célula de CML, célula de ALL, célula de MDS, célula de MM, célula de SM, diversas células de linfoma), el crecimiento o supervivencia de células sanguíneas no cancerosas tales como monocitos, macrófagos, mastocitos, basófilos, células T cooperadoras, células T reguladoras, células asesinas naturales, células progenitoras mieloides y células progenitoras linfoides, y reduce, hace desaparecer o agota célula de AML, célula de CML, célula de ALL, célula de CLL, célula de MDS, célula de MM, célula de SM, o diversas células de linfoma
El anticuerpo anti-IL-3Ru incluye una forma modificada tal como un producto de sustitución (por ejemplo, un producto de sustitución de aminoácidos), que también se denomina como "variante", un producto de adición, un producto de supresión (por ejemplo, una subsecuencia o fragmento), y similar. Tales formas y variantes modificadas del anticuerpo retienen la función o actividad al menos parcial del anticuerpo anti-IL-3Ra mostrada por la invenciÓf'l, tal como la unión con IL-3Ra, o la modulación de la actividad o función (por ejemplo, transferencia de señales de IL3Ru) de IL-3Ra. En consecuencia, el anticuerpo anti-IL-3Ra modificado puede retener la capacidad para modular, por ejemplo, la unión al menos parcial de IL-3Ra y una o más de las funciones o actividades de IL-3Ra (por ejemplo, transferencia de señales, respuesta de señal, y similares)
Según esta memoria descriptiva, el término ~alterar" ("modificar") y sus versiooes gramaticales significan que la composición deriva de una composición de referencia. Las proteínas, ácidos nucleicos y otras composiciones modificadas pueden tener mayores o menores actividades que una proteína, ácido nucleico u otra composición no modificada de referencia, o pueden tener una función diferente de una proteína, ácido nucleico u otra composiciórJ no modificada de referencia.
Tal anticuerpo que contiene una sustitución de aminoácidos puede ser codificado por un ácido nucleico. En consecuencia, la presente invención también proporciona una secuencia nucleotidica que codifica un anticuerpo que contiene una sustitución de aminoácidos.
El término "identidad" o aidénticas" significa que las dos o más sustancias citadas son la misma En consecuencia, cuando dos secuencias proteicas (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-3Ra) son idénticas, tienen las mismas secuencias de aminoácidos al menos con las regiones o porción citadas. La expresión "región idéntica" significa una región idéntica de dos o más sustancias citadas. De este modo, cuando dos secuencias proteicas son idénticas a lo largo
de una o más regiones de las secuencias, tienen identidad en las regiones. "Sustancialmente idéntica-significa que una molécula está estructural o funcionalmente conservada de manera que la molécula tiene o se predice que tiene función o actividad al menos parcial de una o más de las funciones o actividades de la molécula de referencia, o región relevante/correspondiente o una porción de la molécula de referencia coo la que comparte identidad. De este modo, los polipéptidos que tienen identidad sustancial (por ejemplo, anticuerpos anti -IL-3Ra) tienen o se predice que tienen al menos una parte de la actividad o función como un polipéptido de referencia (por ejemplo, anticuerpo antiIL-3Ra). Por ejemplo, en una forma de realización específica, se considera que un anticuerpo anti-IL-3Ra. que tiene una o más modificaciones (por ejemplo, supresión, sustitución, adición o inserción de 1 a 3 restos de aminoácidos), que retiene actividad o función al menos parcial del anticuerpo anti-IL-3Ra sin modificar, tiene identidad sustancial con el anticuerpo anti-IL-3Ra de referencia
Debido a variaciones entre la proteína estructuralmente relacionada y la proteína funcionalmente relacionada, la cantidad de identidad de secuencia requerida para retener funciones o actividad en la proteína, región y funciÓn o actividad de la región. En el caso de proteína, una actividad o función puede ser retenida por la presencia de apenas 30% de identidad de secuencia de aminoácidos, pero en general, está presente una mayor identidad de 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98%, con la secuencia de referencia. El grado de identidad entre dos secuencias se puede verificar usando un programa de ordenador o algoritmo matemático conocido convencionalmente en el campo técnico. En tal algoritmo que calcula la relaciÓn de identidad de secuencia (homología), en general, se cuentan espacios y mal apareamientos de secuencias a lo largo de una región de comparación. Por ejemplo, el algoritmo de recuperación BLAST (por ejemplo, BLAST 2.0) (por ejemplo, véase Altschul et al., J. Mol. Biol., 215· 403 (1990), públicamente disponible mediante NCBI) tiene los siguientes parámetros de recuperación ilustrativos· mal apareamiento -2; comienzo del espacio 5; alargamiento del espacio 2. En la comparación de secuencias polipeptídicas, el algoritmo BLASTP se usa típicamente en combinación con una matriz de puntuación tal como PAM 100, PAM 250, BLOSUM 62, BLOSUM50.FASTA (por ejemplo, FASTA 2 y FASTA 3), y similares, y también se usa un programa de comparación de secuencias SSEARCH para determinar el grado de identidad (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988); Pearson, Methods Mol. Bio., 132: 185 (2000); Y Smith et al., J. Mol. Bio1., 147· 195 (1981» . También se ha desarrollado un programa para determinar la similitud estructural de proteínas usando cartografiado topológico basado en Delaunary (Bostick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 304: 320 (2003».
Una "sustitución conservativa" es una sustitución de un aminoácido por un resto biológica, quimica o estructuralmente similar. Similitud biológica significa que una actividad biológica, tal como la actividad de unión a IL· 3Ro., no es destruida por la sustitución. Similitud estructural significa que los aminoácidos tienen una cadena lateral con una longitud similar (por ejemplo, alanina, glicina y serina), o tienen un tamaño similar. La similitud quimica significa que los restos tienen la misma carga o son hidrófilos o hidrófobos. Los ejemplos específicos incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina, y metionina por otro resto, o la sustitución de un resto polar por otro resto, tal como la sustitución de arginina por lisina, la sustitución de ácido glutámico por ácido aspártico, o la sustitución de glutamina por asparagina, y la sustitución de serina por treonina
Además, los ejemplos del anticuerpo modificado incluyen miméticos peptídicos que tienen uno o más D-aminoácidos sustituidos por L-aminoácidos (y una mezcla de los mismos), análogos estructurales y funcionales tales como aminoácidos o análogos de aminoácidos sintetizados o no naturales, y formas derivatizadas de los mismos. Los ejemplos de modificación incluyen una estructura cíclica, tal como un enlace amídico de extremo a extremo entre el término amino y carboxi de la molécula, o un enlace de disulfuro intra-o intermolecular o un enlace de disulfuro intramolecular o intermolecular.
ejemplos especificos no limitantes adicionales de las modificaciones de aminoácidos incluyen la secuencia parcial (subsecuencia) y fragmento de IL-3Ra. La subsecuencia y fragmento ejemplares de IL-3Ra incluyen una parte de la secuencia de IL-3Ro. a la que se une el anticuerpo anti-IL-3Ra ejemplar de la invención. También, la subsecuencia y fragmento ejemplificativos de IL-3Ro. incluyen una región de inmunogenicidad, tal como una parte de la IL-3Ra, a la que se une el anticuerpo anti-IL-3Ra ejemplificativo de la invención
Según la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica una subsecuencia o fragmento del anticuerpo anti-IL-3Ra que retiene al menos una parte de la función o actividad del anticuerpo anti-IL-3Ro., y un anticuerpo anti-IL-3Ra no modificado o de referencia. En esta memoria descriptiva, el término "subsecuencia" o "fragmento" significa una porción de una molécula de longitud completa. La secuencia de aminoácidos que codifica la subsecuencia del anticuerpo anti-tL-3Ra es más corta que el anticuerpo anti-IL-3Ra de longitud completa en al menos un aminoácido (por ejemplo, supresión de uno o más aminoácidos intemos o terminales desde el término amino o término carboxi). La subsecuencia del anticuerpo anti-IL-3Ro. tiene aminoácidos más pequeños que aquellos del anticuerpo anti-IL3Ra de longitud completa en al menos uno. La subsecuencia de ácido nucleico tiene nucleótidos menOfes que aquellos de la secuencia de ácido nucleico comparativa de longitud completa en al menos uno. En consecuencia, la subsecuencia puede ser una longitud opcional dentro de la longitud completa de IL-3Ra nativa
La subsecuencia o fragmento del anticuerpo anti-IL-3Ra puede tener una afinidad de unión como el anticuerpo de longitud completa, y una especificidad de unión como el anticuerpo de longitud completa, o una o más actividades o funciones como el antiaJerpo de longitud completa, tal como la función o actividad de un anticuerpo antagonista o agonista anti-IL-3Ro.. Las expresiones "subsecuencia funcional" y ~fragmento funcional", en el caso de referirse al anticuerpo, significan una porción del anticuerpo que retiene una o más funciones o actividades como el anticuerpo de referencia de longitud completa, tal como al menos una parte de la función o actividad del anticuerpo anti -IL·3Ra Por ejemplo, una subsecuencia del anticuerpo que se une a IL·3Ra o a un fragmento de IL·3Ra es considerada una subsecuencia funcional.
La subsecuencia y fragmento del anticuerpo se pueden combinar. Por ejemplo, una subsecuencia de VL o VH se puede conectar mediante una secuencia enlazadora y de ese modo formar un anticuerpo quimérico VL-VH. Una combinación de subsecuencias de Fv monocatenario Fv(scFv) se pueden conectar mediante una secuencia enlazadora y de ese modo pueden formar un anticuerpo quimérico scFv-scFv. La subsecuencia y fragmento del anticuerpo anti-IL·3Ra incluyen un anticuerpo monocatenario o región variable, sola o en combinación con toda o una porción de otra sub secuencia del anticuerpo anti -IL-3Ra
La subsecuencia y fragmento del anticuerpo se pueden preparar mediante hidrólisis del anticuerpo mediante su proteolisis, por ejemplo mediante una digestión con pepsina o papaina de todo el anticuerpo. La subsecuencia y fragmento del anticuerpo obtenidos mediante escisión enzimática con pepsina proporciona un fragmento SS representado por F(ab'h. Este fragmento se puede escindir adicionalmente usando un agente reductor de tiol para formar un fragmento monovalente Fab' 3.5S. Altemativamente, una escisión enzimática que usa pepsina produce directamente dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc (véanse, por ejemplo, la patente US nO
4.036.945 y la patente US nO 4.331.647; y Edelman et al., Methods Enzymol., 1: 422 (1967». Se pueden usar otros métodos para escindir un anticuerpo, ta l como la separación de una cadena pesada para forma r un fragmento de cadena ligera-cadena pesada monovalente, la escisión adicional del fragmento u otro método enzimático o químico.
Una proteína y un anticuerpo, así como su subsecuencia y fragmento, se pueden preparar usando ingeniería genética. La tecnología incluye el gen total o parcial que codifica una proteína o un anticuerpo que se expresa en una célula hospedante tal como una célula COS y E. eoli. Una célula hospedante recombinante sintetiza la secuencia completa o una subsecuencia tal como scFv (tal como Whitlow et al, en: Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991), Bird et al, Science 242:423 (1988); Y patente US nO 4.946.778). Un Fv monocatenario y un anticuerpo se pueden preparar según el procedimiento como se describe en la patente US nO
4.946.778 y la patente US nO 5.258.498; Huston et al, Methods Enzymol 203:46 (1991); Shu et al, Proc Natl. Acad Sci. USA 90:7995 (1993); y 8kerra et al, Science 240:1038 (1988)
La forma modificada incluye una secuencia derivatizada, tal como aminoácidos en los que los grupos amino libre forman hidrocloruro de amina, grupo p-toluenosulfonilo y grupo carbobenzoquinona; los grupos carboxi libre que forman una sal o éster metílico y etilico; y los grupos hidroxilo libres forman un derivado O-acilico u O-alquílico, y derivados de aminoácidos que existen de forma natural tales como 4-hidroxiprolina (derivado de prolina), 5hidroxilisina (derivado de lisina), homoserina (derivado de serina), omitina (derivado de lisina), y similares. La modificación se puede llevar a cabo usando un método conocido convencionalmente en el campo técnico (por ejemplo, mutagénesis por supresión o inserción específica del sitio basado en PCR, modificación química y mutagénesis, reticulación y similar)
Los productos de adición y los productos de inserción están incluidos en las formas modificadas de las composiciones proteicas (por ejemplo, anticuerpo), de ácidos nucleicos y otras composiciones. Por ejemplo, la adición puede ser un enlace covalente o no covalente con cualquier tipo de moléculas de proteína (por ejemplo, anticuerpo), ácido nucleico u otras composiciones En general, la adición e inserción confieren función o actividad diferente.
Los polipéptidos o secuencias de ácidos nucleicos de fusión (quiméricos) están incluidos en el producto de adición y en el producto de inserción, y estas son secuencias que tienen una o más moléculas que generalmente no están presentes en la secuencia nativa (de tipo sa lvaje) de referencia unida covalentemente a la secuencia mencionada anteriormente. Un ejemplo específico es una secuencia de aminoácidos de otra proteína (por ejemplo, un anticuerpo) para producir una proteína multifuncional (por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico).
También, el anticuerpo de la invención incluye un producto quimérico o de fusión en el que uno o más dominios adicionales están enlazados covalentemente a aquél, a fin de conferir una función o actividad diferente o complementaria. Los ejemplos del anticuerpo incluyen un producto quimérico o de fusión que no está presente de forma natural, yen el que dos o más secuencias de aminoácidos están mutuamente enlazadas.
Según la invención, se proporciona un anticuerpo anti-IL-3Ro. que contiene un dominio heterólogo y un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-IL-3Ru. El dominio heterólogo puede ser un producto de adición o producto de inserción de aminoácidos, pero no está limitado a un resto de aminoácido. En consecuencia, el dominio heterólogo puede estar compuesto de uno cualquiera de diversos tipos diferentes de partes funcionales pequeñas o grandes. Tal parte incluye un ácido nucleico, un péptido, un hidrato de carbono, un lípido o un compuesto orgánico pequeño, tal como un fármaco, un metal (oro, plata) y similar.
Los ejemplos específicos no limitantes del dominio heterólogo incluyen una etiqueta, un marcador detectable y un agente citotóxico. Los ejemplos especificos de la etiqueta y del marcador detectable incluyen etiquetas T7, His, myc, HA y FLAG; enzimas (peroxidasa de rábano picante, ureasa, cata lasa, fosfatasa alcalina, ¡3-galactosidasa, cloranfenicol transferasa); sustratos enzimáticos; ligandos (por ejemplo, biotina); receptores (avidina); radionúclidos (por ejemplo, C14, 835, P32, P33, H3, 1125 e 1131); reactivos de densidad electrónica; moléculas de transferencia de energía; marcadores paramagnéticos; fluoróforo (fluoresceína, rodamina, ficoeritrina); cromóforo; agentes quimioluminiscentes (imidazol, luciferasa) y agentes bioluminiscentes. Los ejemplos específicos del agente citotóxico incluyen toxina de la difteria (difteria, toxina), toxina del cólera, y lisina
Se puede insertar una secuencia enlazadora entre la proteína (por ejemplo, un anticuerpo), ácido nucleico u otra composición y el producto de adición o producto de inserción (por ejemplo, un dominio heterólogo), de manera que los dos sustratos mantienen al menos una parte de función o actividad diferente. La secuencia enlazadora puede tener una o más propiedades que pueden acelerar cualquiera de los dominios, o puede portar reacción mutua con cualquiera de los dominios, y tales caracteristicas incluyen imposibilidad para formar una estructura flexible y una estructura secundaria ordenada, o propiedad hidrófoba o propiedad de carga. Los ejemplos de los aminoácidos que se encuentran generalmente en las regiones proteicas flexibles incluyen glicina, asparagina y serina. otros aminoácidos próximos a la neutralidad, tales como treonina y alanina, también se pueden usar en la secuencia enlazadora. La longitud de la secuencia enlazadora se puede variar (véase, por ejemplo, la patente US nO 6.087.329). El enlazador incluye además agentes de reticulación química y agentes de unión (agentes conjugantes) tales como un derivado sulfo-succinimidilico (sulfo-SMCC, sulfo-SMPB), disuccinimid il suberato (OSS), disuccinimidil glutarato (08G) y disuccinimidil tartrato (08T).
Otros ejemplos de la adición incluyen uno cualquiera de glucosilación, ácido graso, lípido, acetilación, fosforilación, amidación, form ilación, ubiquitinación y derivatización mediante un grupo protector o bloqueante, y un gran número de modificaciones quimicas Otras sustituciones y posibilidades pueden ser fácilmente entendidas por los expertos en la técnica, y se considera que están comprendidas dentro del alcance de la invención.
Tal secuencia modificada se puede preparar usando técnicas de ADN recombinante que median la expresión celular
o la traducción in vitro. Las secuencias de ácido nucleico y los polipéptidos también se pueden preparar mediante un método conocido convencionalmente en el campo técnico, tal como sintesis quimica usando un sintetizador de péptidos automatizado (véase, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City CA)
Los anticuerpos modificados y los anticuerpos variantes, tales como productos de sustitución, productos de adición de subsecuencias, y similares, pueden mantener actividad detectable del anticuerpo anti-IL-3Ra. En una realización, el anticuerpo modificado tiene la actividad para unirse a la molécula de IL-3Ra e induce reducción o eliminación de células que expresan IL-3Ra mediante un sistema inmune que se centra principalmente en una célula efectora. El anticuerpo modificado se refiere al control funcional de células que expresan IL-3Ra, e inducen supervivencia, crecimiento, detención, muerte celular, y similar, de las células. La muerte celular incluye apoptosis, necrosis, autofagia, y similar
(Método de identificación de IL-3Ral
También se describen en la presente memoria un método libre de células y un método a base de células (por ejemplo, in vivo o in vitral que criba, detecta e identifica IL-3Ra (por ejemplo, en una disolución o mediante una fase sólida). Estos métodos se pueden llevar a cabo en una disolución in vitro usando un biomaterial o muestra, e in vivo usando por ejemplo una muestra de una célula derivada de animal (por ejemplo, linfocito). El método puede comprender una etapa de puesta en contacto de un biomaterial o muestra con un anticuerpo unido a IL-3Ra bajo una condición que permita la unión del anticuerpo con tL-3Ra, y una etapa para evaluar el anticuerpo unido a IL3Ra. La presencia de IL-3Ra se detecta mediante la unión del anticuerpo que se une a IL-3Ra. IL-3Ro: puede estar presente en una célula o tejido El biomaterial o muestra mencionado anteriormente se puede obtener de un analito de mamífero.
La expresión «puesta en contacto", cuando se usa en relación con la composición, tal como una proteína (pOI" ejemplo, anticuerpo anti-IL-3Ra), un material, una muestra o tratamiento, significa una interacción directa o indirecta entre la composición (por ejemplo, anticuerpo anti-IL-3Ra) y otra sustancia de referencia. Los ejemplos específicos
de la interacción directa induyen el enlazamiento. Los ejemplos especificos de la interacción indirecta incluyen aquel caso en el que la composición actúa sobre una molécula intermedia, y esta molécula intermedia actúa entonces sobre la sustancia de referencia. En consecuencia, por ejemplo, la puesta en contacto de una célula (por ejemplo, linfocito) con el anticuerpo anti-IL-3Ra induye permitir que el anticuerpo se una a la célula (por ejemplo, a través de la unión a IL-3Ra), o permitir que el anticuerpo actúe sobre una sustancia intermedia, seguido de la acción de esta sustancia intermedia sobre la célula
Los términos "evaluar" y "medir", y sus versiones gramaticales, se usan de forma sinónima en la memoria descriptiva, y significan la medida cualitativa y la medida cuantitativa, o tanto la medida cualitativa como la medida cuantitativa. Cuando estos términos se usan en relación con la unión, incluyen cualquier medio para evaluar la cantidad relativa, la afinidad o especificidad de la unión, incluyendo diversos métodos que se describen en la memoria descriptiva y que se conocen convencionalmente en el campo técnico. Por ejemplo, la unión del anticuerpo anti-IL-3Ra con IL-3Ra se puede evaluar o medir mediante un ensayo de citometría de flujo.
¡Producción de anticueroo)
Se describe en la presente memoria un método para producir un anticuerpo anti-IL-3Ra humana que tiene citotoxicidad para células positivas para IL-3Ra. El método puede comprender administrar una región extracelular de IL-3Ra humana conjugada con una proteína recombinante IL-3Ra humana o un gen de IL-3Ra introduciendo células en animales capaces de expresar inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones transgénicos o ganado transgénico); identificar el animal para la expresión de un anticuerpo anti-IL-3Ra humana; seleccionar el animal que produce el anticuerpo anti-IL-3Ro: humana; y aislar el anticuerpo del animal seleccionado
La proteina IL-3Ra humana adecuada para la producción del anticuerpo se puede producir mediante una cualquiera de diversas técnicas de expresión recombinante y pu rificación de proteinas estándar. Por ejemplo, la secuencia de IL-3Ra se puede preparar mediante técnicas estándar de síntesis peptídica, tales como una síntesis en fase sólida A fin de facilitar la purificación de la proteina expresada o sintetizada, una porción de la proteina puede contener una secuencia de aminoácidos tal como una etiqueta FLAG, una etiqueta T7, una secuencia de polihistidina, o similar. La proteína se expresa en el interior de las células, y se puede purificar. La proteína se puede expresar mediante un método de recombinaciÓfl como parte de una proteina más grande (por ejemplo, un producto de fusión o quimérico) La IL-3Ra adecuada para generar la respuesta inmune induye subsecuencias de IL-3Ra. tales como un fragmento de inmunogenicidad. También se describe una célula que expresa IL-3Ra, una preparación o extracto celular o fracción que contiene IL-3Ra, y una IL-3Ra parcia lmente purificada El método para preparar anticuerpo policlonal y anticuerpo monoclonal es conocido convencionalmente en el campo técnico. Por ejemplo, IL-3Ra o su fragmento de inmunogenicidad se usa para inmunizar un animal conjugándolo opcionalmente con un portador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) u ovoalbúmina (por ejemplo, BSA),
o mezclándola con un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund Aislando una célula del bazo derivada de un animal inmunizado que responde a IL-3Ra, se puede fusionar con una célu la de mieloma usando técnicas de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales producidos mediante hibridomas se pueden identificar para determinar la reactividad con IL-3Ra o su fragmento de inmunogenicidad
El animal que se puede inmunizar incluye los primates, ratón, rata, conejo, cabra, oveja, ganado y cobaya. La inmunización inicial, y cualquier inmunización opcionalmente subsiguiente, puede ser mediante la via intravenosa, via intraperitoneal, via intramuscular o via subcutánea. Además, a fin de incrementar la respuesta inmune, el antigeno se puede conjugar con otra proteína, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), tiroglobulina y toxoide del tétano, o se puede mezclar con un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, y similar. La inmunización inicial, y cualquier inmunización opcionalmente subsiguiente, puede ser a través de la vía intraperitoneal, vía intramuscular, via intraocular o vía subcutánea. La inmunizaciÓfl puede ser a la misma concentración o concentración diferente de una preparación de IL-3Ra, o a intervalos regu lares o irregulares
El animal incluye aquellos que se modifican genéticamente para incluir loci de genes humanos, y se puede preparar un anticuerpo humano usando el mismo. Los ejemplos de los animales transgénicos con uno o más genes de inmunoglobulina humana se describen, por ejemplo, en la patente US nO 5.939.598, documentos WOO2l43478 y WOO2/092812. Usando una técnica de hibridoma convencional, se aíslan células del bazo de ratón inmunizado que tiene respuesta elevada al antígeno, y se fusionan con célula de mieloma. Se puede obtener un anticuerpo monoclonal que se une a IL·3Ra
El método para producir un anticuerpo policlonal humano y un anticuerpo monoclonal humano se describe adicionalmente (véase, tal como Kuroiwa et al., Na!. Biotechnol. 20:889 (2002); docs W098/24893; W092101047; W096134096; W096f33735; patente US nO 5.413.923; patente US nO 5.625.126; patente US nO 5.633.425; patente US nO 5.569.825; patente US nO 5.661 .016; patente US nO 5.545.806; patente US nO 5.814.318; patente US nO 5.885.793; patente US nO 5.916.771, Y patente US n05.939.598)
El término "humano", cuando se usa haciendo referencia a un anticuerpo, significa que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo es completamente la secuencia de aminoácidos humana, a saber, regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera humanas y región constante humana. En consecuencia, todos los aminoácidos son aminoácidos humanos, o están presentes en el anticuerpo humano. Un anticuerpo que es un anticuerpo no humano se puede obtener en un anticuerpo completamente humano sustituyendo los restos de aminoácidos no humanos por los restos de aminoácidos que están presentes en el anticuerpo humano. Los restos de aminoácidos que están presentes en el anticuerpo humano, el mapa de las regiones CDR y los restos de consenso del anticuerpo humano son bien conocidos en el campo técnico (véase, por ejemplo, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 48 edición, US Department of Health and Human Services, Public Health Service (1987); Chothia y Lesk (1987)). En Padlan, Mol. Immunol., 31. 169 (1994) Y Padlan, Mol. Immunol., 28: 489 (1991) se describen como objeto una secuencia de consenso del subgrupo 111 de VH humana basado en la investigación llevada a cabo usando 22 secuencias de VH 111 humana conocidas, y una secuencia de consenso de subgrupo' de cadena K de VL humana basado en la investigación llevada a cabo usando 30 secuencias de subgrupo I de cadena K humana conocidas. En consecuencia, el anticuerpo humano incluye un anticuerpo en el que uno o más restos de aminoácidos se han sustituido por uno o más aminoácidos existentes en un anticuerpo humano distinto opcional.
Los ejemplos del anticuerpo anti·IL·3Ra. incluyen anticuerpos preparados usando un método conocido en el campo técnico, tal como injerto de CDR (documentos EP 239.400; W091109967; patente US nO 5.225.539; patente US nO
5.530.101 ; Y patente US nO 5.585.089), sustitución de restos interactivos de la superticie por aminoácidos de una secuencia de anticuerpo humano, modificación del patrón de los anticuerpos en la superticie (documento EP592_106; EP519.596; Padlan, Molecular Immunol. 28: 489 (1991); Studnicka el al., Protein Engineering 7: 805 (1994); Roguska et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91.969 (1994)) Y barajado de cadenas (patente US nO 5.565.332). A fin de producir un anticuerpo humanizado, se ha usado (Padlan, Mol. Immunol. 31:169 (1994); y Padlan, Mol ImmullOl. 28: 489 (1991)) la secuencia de consenso humana (Carter et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Y Presta el al, J. Immunol. 151: 2623 (1993».
El término "humanizado', cuando se usa en relación con un anticuerpo, significa que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo liene uno o más restos de aminoácidos no humanos (por ejemplo, ratón, rata, cabra, conejo, y similar) de la región determinante de la complementariedad (CDR) que se une específicamente a un antígeno deseado en una molécula inmunoglobulínica humana aceplora, y uno o más restos de aminoácidos humanos (restos de aminoácidos que están flanqueados con CDR) en la región estructural (FR) de Fv. El anticuerpo denominado ~primatizado' está dentro del alcance del significado de "humanizado' , excepto que los restos de aminoácidos de la molécula inmunoglobulínica humana aceptara y la región estructural pueden ser cualesquiera restos de aminoácidos de primate (por ejemplo, mono, gibón, gorila, chimpancé, orangután, macaco), además de restos humanos. Los restos de FR humanos de la inmunoglobulina se pueden sustituir por los restos no humanos correspondientes. En consecuencia, por ejemplo, a fin de alterar, generalmente mejorar, la afinidad o especificidad por el anticuerpo, los restos en la región CDR o en la región estructural humana se pueden sustituir por los restos correspondientes del anticuerpo donante de región CDR o estructural no humana. El anticuerpo humanizado puede cootener restos que no se pueden encontrar en el anticuerpo humano ni en la secuencia de CDR o estructural donante. Por ejemplo, se puede predecir que la sustitución en FR de una posición particular que no se puede encontrar en el anticuerpo humano o en el anticuerpo no humano donante puede mejorar la afinidad o especificidad de unión del anticuerpo humano en esta posición. Las sustituciones estructurales y de CDR del anticuerpo en base al modelado molecular son convencionalmente conocidas en el campo de la técnica, por ejemplo mediante el modelado de la interacciórJ de restos de CDR y estructurales para identificar restos estructurales importantes para la unión al antigeno y la comparaciórJ de secuencias para identificar restos estructurales inusuales en la posición especifica (véanse, por ejemplo, patente US nO 5.585.089; y Riechmann et al., Nature, 332:323 (1988)).
Los anticuerpos quiméricos están incluidos en el anticuerpo anti-IL-3Ru. Según la presente memoria, el término ~quimérico" y sus variaciones gramaticales, cuando se usa en relación con anticuerpos, significa que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo cootiene una o más porciones que derivan de dos o más especies diferentes, se obtiene
o aísla de dos o más especies diferentes, o se basa en dos o más especies diferentes. Por ejemplo, una porción del anticuerpo puede ser humana (por ejemplo, región constante) y otra porción del anticuerpo puede ser no humana (por ejemplo, una regiÓfl variable de cadena pesada de ratón o de cadena ligera de ratón). En consecuencia, un ejemplo del anticuerpo quimérico incluye un anticuerpo en el que la porción diferente del anticuerpo deriva de una especie diferente. A diferencia del anticuerpo humanizado o primatizado, el anticuerpo quimérico puede tener una secuencia de una especie diferente en una región arbitraria del anticuerpo
El método para producir un anticuerpo quimérico es conocido en el campo técnico (tal como MorrisOfl, Science 229: 1202 (1985); Di et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191 (1989); patente US nO 5.807.715; patente US nO 4.816.567; y patente US nO 4.816.397). Por ejemplo, en Munro, Nature 312: 597 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984); Sharon et al., Nature 309: 364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 81· 6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984); Capon et al, Nature 337: 525 (1989); Y Traunecker et al., Nature 339: 68 (1989), un anticuerpo quimérico en el que una región variable del anticuerpo derivada de una especie se sustituye por una regiórJ variable de anticuerpo derivada de otra especie.
Además, el anticuerpo anti-IL-3Ra se puede preparar mediante técnica de hibridoma, técnica recombinante, y técnica de presentación de fagos, y una combinación de las mismas (véanse patente US nO 4.902.614, patente US nO 4.543.439, y patente US nO 4,411 ,993; Y también véanse Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimensionin Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, y Bechtol et al, 1980, y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edición, 1988).
El anticuerpo humano anti-IL-3Ra humana de la invención se produjo usando ratones con cromosomas transferidos (ratones KM (marca registrada)) inmunizados con diversas formas de una forma soluble de proteínas IL-3Ra humanas recombinantes, o estirpes celulares que expresan IL-3Ra (documentos WOO2l43478, WOO2l092812, e Ishida et al., IBC's 11th Antibody Engineering Meeting, Abstract (2000)). Puesto que el anticuerpo humano anti-IL3Ra humana tiñe de forma detectable no una estirpe celular precursora no transformada sino una estirpe celular transfectante estable de IL-3Ra humana, tal como la célula Jurkat-IL-3Ra y la célula L929-IL-3Ra, se muestra que el anticuerpo se une específicamente a IL-3Ra humana.
El anticuerpo de la invención puede tener una secuencia de cadena ligera IC o una secuencia de cadena ligera A, una longitud completa de cualquiera de ellas como se presentan en el anticuerpo que existe de forma natural, o una mezcla de las mismas (principalmente un producto de fusión de la secuencia de cadena K y la secuencia de cadena Al, y sus subsecuenciaslfragmentos. Las moléculas de anticuerpo que se presentan de forma natural pueden contener dos cadenas ligeras IC o dos cadenas ligeras A.
Se describe en la presente memoria un método para preparar un anticuerpo que se une específicamente a IL-3Ra. El método para preparar un anticuerpo anti-IL-3RCl puede comprender administrar IL-3Ra humana, una subsecuencia de la misma °un fragmento de la misma (por ejemplo, región extracelular de IL-3Ru), conjugada, si es necesario, con una proteina recombinante Fc humana, a animales que pueden expresar inmunoglobu lina humana (por ejemplo, ratooes transgénicos o ganado transgénico), identificar los animales en busca de su expresión del anticuerpo anti-IL-3Ra humana, seleccionar un animal que produce anticuerpo anti-IL-3Ra humana, y aislar el anticuerpo del animal seleccionado. Mediante este método se puede juzgar si el anticuerpo anti-IL-3Ra humana tiene o no una actividad antagonista o agonista de IL-3Ra
La actividad efectora significa actividad dependiente del anticuerpo inducida vía una región Fc del anticuerpo, y como tal se conocen la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), cilotoxicidad dependiente del complemento (actividad de CDCl, fagocitosis dependiente del anticuerpo (actividad de ADP) mediante fagocitos tales como macrófagos y células dendríticas, y similares
Como método para controlar la actividad efectora del anticuerpo monoclooal anti-IL-3Ru de la invención, los ejemplos incluyen un método que controla la cantidad de la fucosa (también denominada fucosa central) que está unida a N-acetilglucosamina (GlcNAc) a través de un enlace 0.-1 ,6 en un extremo reductor de una cadena de azúcar enlazada mediante N de tipo complejo que está unida a asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos W02005/035586, W02002l31140, y WOOO/61739), un método en el que se controla modificando restos de aminoácidos de la región Fc del anticuerpo, y similar. La actividad efectora se puede controlar aplicando uno cualquiera de estos métodos al anticuerpo monoclonal anti -IL-3Ra de la invención
Controlando el contenido de la fucosa central de la cadena de azúcar enlazada mediante N de tipo complejo de Fc del anticuerpo, se puede aumentar o disminuir la actividad efectora del anticuerpo. Como método para reducir el contenido de la fucosa que se une a la cadena de azúcar enlazada mediante N de tipo complejo que está unida a Fc del anticuerpo, se puede mencionar la desfucosilación (desfucosilada o no fucosilada). La desfucosilación es expresar un anticuerpo usando célula CHO de la que se ha eliminado el gen de al ,6-fucosil-transferasa, y se puede obtener un anticuerpo al que no está unida la fucosa. El anticuerpo al que no está unida la fucosa tiene actividad de ADCC elevada. Por olro lado, como método para incrementar el contenido de la fucosa que se une a la cadena de azúcar enlazada mediante N de tipo complejo a la que está unido Fc del anticuerpo, el anticuerpo al que está unida la fucosa se puede obtener expresando el anticuerpo usando una célu la hospedante en la que se introduce el gen de al ,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que está unida la fucosa tiene actividad de ADCC menor que aquella del anticuerpo al que no está unida la fucosa.
Además, la actividad de ADCC y la actividad de CDC se pueden aumentar o disminuir modificando los restos de aminoácidos de la región Fc del anticuerpo. Por ejemplo, la actividad de CDC del anticuerpo se puede incrementar usando la secuencia de aminoácidos de la región Fc descrita en el documento US 200710148165. También, la actividad de ADCC o la actividad de CDC se puede aumentar o disminuir llevando a cabo la modificación de aminoácidos descrita en las patentes US nO 6.737.056, US nO 7.297.775 y US nO 7.317.091. Además, un anticuerpo en el que se conlrola la actividad efectora del anticuerpo se puede obtener usando los métodos mencionados anteriormente en combinación en un anticuerpo.
Se describe adicionalmente la secuencia nucleotidica de la invención, tal como de un vector y similar. El VectOf puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un antlcuerpo anti-IL-3Ru, o una subsecuencia o fragmento del mismo
El ácido nucleico puede tener diversas loogitudes La longitud del ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-1L3Ru de la presente invención o la subsecuencia del mismo es generalmente alrededor de 100 a 600 nucleótidos, o cualquier valor numérico o intervalo que comprende tales loogitudes del intervalo descrito anteriormente; 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 350, 350 a 400, 400 a 450, 450 a 500,500 a 550 o 550 a 600 nucleótidos de longitud, o cualquier valor numérico o intervalo o valor dentro de o que comprende tal longitud del intervalo descrito anteriormente. Los ejemplos de la loogitud del ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-IL-3Ra de la presente invención o la subsecuencia del mismo incluyen generalmente 10 a 20, 20 a 30, 30 aSO, 50 a lOO, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 400, 400 a 500, 500 a 600 nucleótidos, y cualquier valor numérico o intervalo dentro de o que engloba tal longitud.
Las expresiones ~ácido nucleico" y ~polinucleótido' significan al menos dos o más pares de bases de ácido ribo-o desoxirribonucleico (nucleótidos) que están enlazados a través de un enlace de fosfoéster o equivalente. El ácido nucleico incluye polinuc1eótido y polinucleósido. El ácido nucleico incluye una sola molécula, una molécula doble, una molécula triple, una molécula circular o una molécula lineal. Los ejemplos del ácido nucleico incluyen ARN, ADN, ADNc, un ácido nucleico gerlÓmico, un ácido nucleico de origen natural y un ácido nucleico no natural, tal como un ácido nuc1eico sintético, pero no está limitado. Los ácidos nucleicos y polinucleótidos cortos (por ejemplo, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 50, 50 a 100 nucleótidos) se denominan habitualmente "oligonucleótidos' o "sondas' de ADN monocatenario o bicatenario
El ácido nucleico se puede preparar usando diversas técnicas de clonación estándar y técnicas de síntesis química. Los ejemplos de las técnicas incluyen, pero no se limitan a, amplificación de ácidos nucleicos, tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con dianas de ADN genómico o ADNc usando cebadores (por ejemplo, una mezcla de cebadores degenerados) que se pueden hibridar con una secuencia codificante de anticuerpo. Además, el ácido nucleico también se puede preparar mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforoamidito en fase sólida) o transcripción a partir de un gen. Después, la secuencia preparada se puede expresar mediante una célula (por ejemplo, una célula hospedante tal como levadura, bacteria o euca riota (una célula de animal o de mamífero o en una planta», después la secuencia se clooa en un plásmido y después se amplifica, o la secuencia se traduce in
vitro.
Un vector es un vehículo que se puede manipular mediante inserción o incorporación de ácido nucleico. Los ejemplos del vector incluyen un vector plasmídico, un vector vírico, un vector pfOcariota (bacteria) y un vector eucariota (planta, hongos, mamiferos). El vector se puede usar para la expresión in vi/ro o in vivo de ácido nucleico. Tal vector se denomina "vector de expresión", y es útil para la transferencia de ácido nucleico, incluyendo un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anli-IL-3Ra o su subsecuencia o fragmento, y la expresión de una proteína codificada in vitro (por ejemplo, en una disolución o en fase sólida), mediante una célula o mediante in vivo en un sujeto.
Además, el vector también se puede usar para la manipulación de ácidos nucleicos. Para la manipulación genética, un ácido nucleico insertado se puede transcribir o traducir usando un "vector de clonación" in vitro (por ejemplo, en una disolución o en fase sólida) en una célula, o in vivo en un sujeto
En general, el vector contiene un origen de replicaciórJ para la amplificación en u na célula in vitro o in vivo. A fin de facilitar la transcripción y traducción, si es necesario, se pueden incluir elementos de control tales como un elemento de coot rol de expresión presente en el vector.
Un vector puede incluir un marcador de selección El "marcador de selección" es un gen que permite la selecciórJ de una célula que contiene el gen. ·Selección positiva" significa un proceso para seleccionar una célula que contiene el marcador de selección debido a una selección positiva. La resistencia a fármacos es un ejemplo del marcador de selección positiva, y una célula que contiene el marcador sobrevivirá en el medio de cultivo que contiene el fármaco, y una célula que no contiene el marcador morirá. Los ejemplos del marcador de selección incluyen genes de multirresistencia tales como neo, que proporciona resistencia a G418; hygr, que proporciona resistencia a higromicina; puro, que proporciona resistencia a puromicina, y similares. Otro marcador de selección positiva incluye genes que permiten la identificación o selecciórJ de una célula que contiene el marcadOf. Los ejemplos de estos genes incluyen un gen de proteína fluorescente (GFP y cromóforo similar a GFP, luciferasa), gen JacZ, gen de fosfatasa alcalina, y un marcador de superficie tal como C08. "Selección negativa" significa un proceso de exterminio de las células que contienen marcadores de selección negativa al exponerlas a un agente de selección negativa apropiado. Por ejemplo, una célula que contiene el gen de timidina cinasa del virus del herpes simple (HSVtk) (Wigler et al., Cell, 11' 223 (1977» es sensible al fármaco ganciclovir (GANC) De forma similar, el gen gpt hace a una célula sensible a 6-tioxantina.
El vector virico incluye aquellos que se basan en retrovirus (un lentivirus para infectar no solamente a células que se dividen sino también a células que no se dividen), virus espumoso (patente US nO 5.624.820, patente US nO 5.693.508, patente US nO 5.665.577, patente US nO 6.013.516 y patente US nO 5.674.703; documentos WO 92/05266 y WO 92114829 ), adenovirus (patente US nO 5.700.470, patente US nO 5.731 .172 y patente US nO 5.928.944), virus adenoasociado (AAV) (patente US nO 5.604.090), un vector vírico del herpes simple (patente US nO 5.501 .979), un vector del sistema de citomegalovirus (CMV) (patente US nO 5.561.063), reovirus, genoma de rotavirus, virus del simio 40 (SV40) o virus del papiloma (Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6349 (1984); Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, editado por Gluzman, 1982; Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1: 486 (1981); patente US nO 5.719.054). El adenovirus infecta de forma eficiente a una célula que se replica lentamente y/o terminalmente diferenciada, y se puede usar para dirigirlo a la célula que se replica lentamente y/o a la célula terminalmente diferenciada. ejemplos adicionales de vectores víricos útiles para la expresiórJ incluyen parvovirus, virus de Norwalk, coronavirus, paramixovirus y rabdovirus, virus de toga (por ejemplo, virus Sindobis y virus del bosque de Sem liki) y virus de la estomatitis vesicular (VSV)
Un vector que comprende un ácido nucleico se puede expresar cuando el ácido nucleioo está conectado a elementos de expresión para funcionar. La expresión "conectado para funcionar" (operablemente enlazado) significa que una relación física o funcional entre los elementos citados les permite operar en su manera pretendida. En consecuencia, el ácido nuc1eico "operablemente enlazado" a un elemento de control de expresión significa que el elemento de control modula la transcripción del ácido nucleico y, según sea apropiado, la Iraducción del producto de transcripción .
El "elemento de oonlrol de expresión" o Usecuencia de control de expresión" es un polinucleótido que influye sobre la expresión de un ácido nucleico operablemente enlazado. Los promotores y potenciadores son ejemplos específicos no limitantes de elementos y secuencias que controlan la expresión. El "promotor" es una región reguladora del AON que actúa en cis, que puede iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico hacia el extremo 3' (dirección 3'). Un nuc1eótido que acelera el inicio de la transcripción está incluido en la secuencia promotora. El potenciador
también regula la expresión del ácido nucleioo, pero actúa a una distancia desde el sitio de iniciación de la transcripción del ácido nucleico al que está operablemente enlazado. Cuando el potenciador está presente en el extremo 5' o en el extremo 3' del ácido nucleico, así como en el ácido nuc1eico (por ejemplo, secuencia codificante o inlrón), el potenciador funcional adicionalmente. ejemplos adicionales del elemento de control de expresión incluyen una secuencia líder y una secuencia de pareja de fusión, un elemento de sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) para preparar multigén, un mensaje policistrónico, una señal de ayuste de intrón, mantenimiento del marco de lectura correcto del gen para permitir la traducción de ARNm en el marco, señal de poliadenilación que produce una poliadenilación apropiada del producto de transcripción de interés, y codones de parada.
Los ejemplos del elemento de control de expresión incluyen un elemento "constitucional" en el que la transcripciórJ de un ácido nuc1eico operablemente enlazado se produce sin la presencia de señales o estímulo. El elemento de control de expresión que confiere expresión en respuesta a la señal o estímulo y aumenta o disminuye la expresión del ácido nucleico operablemente enlazado es "ajustable" El elemento ajustable que aumenta la expresión del ácido nucleico operablemente enlazado en respuesta a una señalo estímulo se denomina "elemento inducible". El elemento ajustable que disminuye la expresión del ácido nucleico operablemente enlazado en respuesta a una señal
o estímulo se denomina "elemento represor" (principalmente, la señal disminuye la expresión; y la expresión aumenta cuando se elimina o no está presente la señal ).
Los ejemplos del promotor constitucional para la expresión bacteriana incluyen un promotor inductor, tal como T7 y pL, plac, ptrp y ptac (promotor hibrido ptrp-Iac) o bacteri6fago l., y similar. Para un sistema de célula de insecto, se puede usar un promotor constitucional o un promotor inducible (por ejemplo, ecdisona). El promotor constitucional para levadura incluye un promotor inductor tal como ADH, LEU2, GAL y similar (por ejemplo, véanse Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Capítulo 13, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience edition, 1988; Grant et al., en: Methods in Enzymology, 153: 516 -544 (1987) Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y; Glover, DNA Cloning, Vol. 11, Capítulo 3, IRL Press, Wash., D.C., 1986; Sitler, en: Methods in Enzymology, 152: 673 -684 (1987), editado por Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; y Stralhern et al., The Molecular Biology of Ihe Veast Saccharomyces, editado por Cold Spring Harbar Press, Vol. 1 y Vol. 11 (1982)).
Para la expresión en mamíferos, se puede usar un promotor constitucional derivado de un virus o de otro origen. Por ejemplo, se pueden usar promotores inducibles derivados de CMV, SV40, o una secuencia de repetición terminal larga (L TR) viral, o genoma de célula de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina IIA; promotor de choque ténnico, elemento que responde a esteroidesfhonnona tiroidea/ácido retinoico) o virus de mamífero (por ejemplo, promotOf tardío de adenovirus; L TR de virus de cáncer de mama de ratón).
Los ejemplos del elemento de control de expresión incluyen un elemento que es activo en un tejido específico o tipos celulares, y tal elemento se denomina "elemento de control de expresión específico de tejidos". En general, el elemento de control de expresión específICo de tejidos es más activo en células específicas o tipos de tejidos, y esto es debido a que este elemento de control de expresión específico de tejidos es reconocido por una proteína activante de la transcripción que es activa en la célula específica o tipos de tejidos o por otro factor de transcripción, en comparación con otras células o tipos de tejidos. Los ejemplos especificos no limitantes de tal elemento de control de expresión son hexocinasa 11, COX-2, a-fetoproteína, antígeno carcinoembriónico, DE3fMUC1, antigeno especifico de la próstata, C-erB2fneu, polipéptido estimulante de la secreción de insulina dependiente de glucosa (GIP), transcriptasa inversa de telomerasa, y un promotor tal como un promotor sensible a hipoxia
Se describe en la presente memoria una célula hospedante transfonnada o transfectada con ácido nucleico de IL3Ra o vector de la invención. Los ejemplos de las células hospedantes incluyen, pero no se limitan a, célula procariota y célula eucariota, tal como células bacterianas, fúngicas (levadura), y células de plantas, insectos y animales (por ejemplo, mamíferos tales como primates, ser humano, y similar). Los ejemplos no limitantes de célula transformada incluyen una bacteria transfonnada con un ácido nucleico de bacteriófago recombinante, un vector de expresión de ácido nucleico plasmídico o vector de expresión de ácido nucleico cosmídico; una levadura transformada con un vector de expresión de levadura recombinante; una célula vegetal infectada con un vector de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o lransfonnada con un vector de expresión plasmídico recombinante (por ejemplo, plásmido Ti); una célula de insecto infectada con un vector de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus); y una célula animal infectada con un vector de expresión de virus recombinante (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus de la vacuna)
o una célula de animal transformada manipulada para la expresión estable. La célula CHO es un ejemplo no limitante de una célula hospedante de mamífero que expresa un anticuerpo anti-IL-3Ra y su subsecuencia y fragmento. La célula hospedante puede ser una plura lidad o población de células a partir de una línea separada de la célula primaria, una célula secundaria aislada o célula subcultivada, o una estirpe celular establecida o cultivo celu lar inmortalizado
La expresión "estar transformada" o "estar transfectada ", cuando se usa en referencia a una célula (por ejemplo, célula hospedante) o un organismo, significa un cambio de gen en una célula tras la incorporación de una molécula exógena, tal como una proteína o un ácido nucleico (por ejemplo, transgén), en la célula. En consecuencia, la célula "transfectada" o "transformada" es una célula en la que se introduce la molécula exógena manualmente por el hombre, por ejemplo, mediante técnicas de AON recombinante, o una progenie de la misma.
El ácido nucleico o proteína se puede transfectar o transformar (expresar) en la célula o una progenie de la misma de fOfma estable o temporalmente. La proteína introducida se puede expresar haciendo crecer la célula, o transcribiendo el ácido nucleico. Puesto que existe una posibilidad de que se produzca una mutación durante la replicación, existen casos en los que una progenie de la célula transfectada o transformada no es idéntica a la célula precursora
En general, en la transfección o transfonnación celulares se usa un vector. El vector puede incluirse en una partícula virica o vesícula, y puede ser dirigida opciooalmente hacia tipos celulares especificos incluyendo una proteína en la superficie de la partícula o vesícula que se une a un ligando o receptor de la célula diana. En consecuencia, una célula se puede usar como una diana preparando la propia particula vírica o vesícula o la protefna de la superficie vírica, con el fin de transfectar o transformar in vitro, ex vivo o in vivo. En consecuencia , el vector incluye técnicas de suministro in vitro, in vivo y ex vivo de vectores víricos y no víricos a una célula, tejido u órgano
Además, la introducción de un ácido nucleico en una célula diana (por ejemplo, una célula hospedante) también se puede llevar a cabo mediante un método conocido convencionalmente en el campo técnico, tal como choque osmótico (por ejemplo, fosfato de calcio), electroporación, microinyección, fusión celular, y similar. La introducción de ácido nucleico y polipéptido in vitro, ex vivo e in vivo también se puede llevar a cabo usando otras técnicas. Por ejemplo, una sustancia polimérica tal como poliéster, ácido poliámico, hidrogel, polivinilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina, o copolimero de lactida/glicolida, copolimero de polilactidalglicolida, o copolímero de etileno-acetato de vin ilo, y similar. El ácido nucleico se puede encerrar en una microcápsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina, o en una microcápsula preparada usando poli(metacrilato de metilo), o en un sistema coloidal, respectivamente, mediante una técnica de coacervación o mediante polimerización interiaciaL El sistema de dispersión coloidal incluye un sistema a base de un complejo polimérico, nanocápsula, microesfera, perlas y lípido (emulsiórJ de tipo aceite en agua, micela, micela mixta, liposoma, y similar).
El liposoma para introducir diversas composiciones en células es conocido convencionalmente en el campo técnico, y se incluyen en él, por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, lipofectina y DOTAP (por ejemplo, patente US nO 4.844.904, patente US nO 5.000.959, patente US nO 4.863.740 y patente US nO 4.975.282; y GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.). También se COflocen los lípidos catiónicos anfifílicos a base de piperazina, que son útiles en terapia gérlica (véase, por ejemplo, patente US nO 5.861.397). También se conoce un sistema lipidico catiónico (véase, por ejemplo, patente US nO 5.459.127). En esta memoria descriptiva, la sustancia polimérica, microcápsula y el sistema de dispersión coloidal (Iiposoma y similar) se denominan colectivamente como "vesicula"
Además, los ejemplos de las técnicas adecuadas que se pueden usar en el método para producir un anticuerpo sOfl purificación por afinidad, purificación en gel no modificado, HPLC o RP-HPLC, exclusión por tamaños, purificaciórJ mediante columna de proteína A, y una combinación opcional de estas técnicas. Un isotipo de anticuerpo anti-IL3Ra se puede determinar usando un ensayo EUSA, y, por ejemplo, se puede identificar una 19 humana usando anti· Ig humana absorbido sobre Ig de ratón.
La afinidad de unión se puede determinar mediante constantes de asociación (Ka) y de disociación (Kd). La constante de afinidad en el equilibrio KD es la relación de KafKd. Las constantes de asociación (Ka) y de disociaciórJ (Kd) se pueden medir usando resonancia plasmónica de superticie (SPR) (Rich y Myszka, Curr. Opino BiotechnoL, 11· 54 (2000): Englebienne, Analyst, 123: 1599 (1998». La instrumentación y los métodos para la detección y monitorización en tiempo real de la constante de asociación son conocidos convencionalmente y están comercialmente disponibles (BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Suecia; y Malmqvist, Biochem. Soco Trans., 27:335 (1999». El valor de KD se puede definir como la concentración de anticuerpo anti-IL-3Ra requerida para saturar la mitad del sitio de unión (50%) en IL·3Ra
(Propiedad de cruzamiento en primates)
Actualmente, aunque se están desarrollando en el mundo tantos como 500 anticuerpos terapéuticos, se afirma que los anticuerpos humanos tienen una posibilidad elevada de ser capaces de evitar problemas de inmunogenicidad Sin embargo, por otro lado, existen muchos casos en los que la eficacia farmacéutica de los anticuerpos humanos no es mostrada en absoluto en roedores. En ese caso, hay muchos casos en los que se han de usar primates en ensayos de toxicidad, y además en muchos casos no es rara la reactividad encontrada solamente en el chimpancé Cuando la reacción farmacológica se puede encontrar solamente en el chimpancé, el ensayo de toxicidad está adicionalmente cOflstreñido de forma significativa. En primer lugar, las instalaciones en las que se pueden llevar a cabo experimentos con chimpancés están limitadas cOflsiderablemente, los individuos están infectados con VIH en muchos casos, y también hay problemas de higiene laboral de trabajadores implicados en los experimentos. Además, con respecto al chimpancé, hay grandes limitaciones por cuanto no se puede llevar a cabo el ensayo anatómico tras la administración final del fármaco, y también es imposible llevar a cabo el ensayo de toxicidad reproductivo, y similares. En consecuencia, la capacidad para verificar la eficacia farmacéutica en mono (Macaca fascicularis y/o Macaca mulatta) es útil desde el punto de vista de avanzar ensayos de toxicidad que son esenciales para el desarrollo de sustancias farmacéuticas
Con respecto al método para confirmar la reactividad cruzada del mono con mono, se puede confirmar mediante un método convencionalmente conocido tal como el método de tinción tisular inmunoquímico, inmunoensayo enzimático en fase sólida (en lo sucesivo, "EUSA"), citometría de flujo (FCM), y similar.
(Composición farmacéutica)
Los anticuerpos se pueden incluir en una composición farmacéutica. Un anticuerpo puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable, un estabilizante o una carga, y se prepara en forma de una disolución acuosa o como una preparación liofilizada. Tipicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para la isotonicidad de la preparación farmacéutica. Los ejemplos del vehiculo aceptable, estabilizante o carga incluyen una disolución tampón tal como fosfato, citrato y otro ácido orgánico, y similar; un polipéptido de bajo peso molecular (menos de 10 en el número de restos); una proteína tal como seroalbúmina, gelatina, inmunoglobulina, y similar; un polimero hidrófilo tal como polivinilpirrolidona; un aminoácido tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, y similar; un monosacárido, disacárido y otros hidratos de carbono tales como glucosa, manosa, dextrina, y similar; un agente quelante tal como EDTA y similar; sacáridos tales como sacarosa, manit01, trehalosa, somitol, y similares; un contraión formador de sal tal como sodio y similar; un complejo metálico (por ejemplo, complejo de Zn-proteína); un antiséptico (cloruro de octadecil dimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico; alquilparabenos tales como metilo propilparabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); y/o un tensioactivo no iónico tal como lWEENTId, PLURONICS TId, polietilenglicol (PEG), y similar
(Uso terapéutico de sustancia antitumoral que selecciona como diana a células que expresan IL-3Ral
Los ejemplos de las enfermedades para las que se examina el uso terapéutico, pero no se limitan a ellas, incluyen
las enfermedades que se pueden considerar que se pueden tratar mediante la unión a o selección como diana de células tumorales de la sangre que expresan IL-3Ra (célula de AML, célula de CML, célula de MDS, célula de ALL, célula de CLL, célula de mieloma múltiple, y similar), mastocito, basófilo, célula T cooperadora (por ejemplo, célula Th1, célula Th17), célula T reguladora (por ejemplo, célula CD4 positiva CD25 positiva), célula presentadora de antígeno (por ejemplo, célula dendrítica, monocito·macrófago y células relacionadas (célula estrellada hepática, osteoclasto, microglía, macrófago intraepidérmico, célula del polvo (fagocito alveolar) y similares»
Los ejemplos de la enfermedad para la que se examina el uso terapéutico incluyen una enfermedad de la sangre en la que la expresión de IL-3Ra se encuentra en médula ósea o sangre periférica. El ejemplo especifico puede incluir leucemia mieloide aguda (AML). En base a la clasificación de FAB (criterios francés-americana-británico) que puede determinar qué etapa de la célula entre las células en el curso de la diferenciación en diversas células de la sangre a partir de la célula troncal hematopoyética provocó la transformación tumorigénica, la leucemia mieloide agua se clasifica en tipos de enfermedad de MO (leucemia mieloblástica de tipo de microdiferenciación), M1 (leucemia mieloblástica no diferenciada), M2 (leucemia mieloblástica diferenciada), M3 (leucemia promielocitica aguda), M4 (leucemia mielomonocítica), M5 (leucemia monocítica), M6 (eritroleucemia), M7 (leucemia megacariocítica) y sus subtipos. Además, otros ejemplos de enfermedades incluyen leucemia linfocítica aguda, leucemia atípica, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células T adultas, linfoma de células NKfT, linfocitosis granular (leucemia LGL), policitemia vera, trombocitemia esencial, síndrome hipereosinofílico, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma folicular, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, linfoma linfoblástico y enfermedad de Catsleman
El uso de la invención, que comprende la administración o suministro de un anticuerpo anti IL-3Ro: y una sustancia antitumoral dirigida contra una célula que expresa IL-3Ra, se puede llevar a cabo mediante cualquier método aceptable. En una rea lización específica, estos se administran a un sujeto, local, regional o sistémica mente
Además, con respecto al anticuerpo anti-IL-3Ro., la sustancia antitumoral dirigida contra la célula que expresa IL-3Ro. para tratar las enfermedades mencionadas anteriormente también se puede considerar que se combina con otro agente terapéutico adecuado para la misma enfermedad (típicamente un agente quimioterapéutico), o se puede administrar en combinación con radioterapia. Los ejemplos del otro agente terapéutico adecuado incluyen un agente quimioterapéutico tal como citarabina (Ara-C), un agente antitumoral del sistema de antraciclinas (típicamente, daunorrubicina (DNR), idarrubicina (IDA», y similares, un agente terapéutico que induce diferenciación, tal como ácido todo-trans-retinoico (ATRA), ácido arsenioso, AmBO (tamibaroteno), gemtuzumab-ozogamicina (anticuerpo anti-CD33 conjugado con ozogamicina), topotecán, nudarabina, ciclospOfina, mitoxantrona (MIT), interierón e imatinib, pero no se limitan a ellos, y también incluyen una combinación con un método terapéutico que se considera que es clín icamente eficaz
En el sujeto que puede ser tratado por la invención se incluyen mamíferos (por ejemplo, ser humano). En una forma de realización específica, es un sujeto que es un candidato a un tumor de la sangre, o un sujeto que recibió tratamiento del tumor de la sangre, un sujeto que tiene la posibilidad de provocar una respuesta celular mediada por IL-3Ra, o un sujeto que recibió tratamiento de la respuesta celular mediada por IL-3Ro:, un sujeto que es un candidato a un tumor maligno mielocitico, o un sujeto que recibió tratamiento del tumor maligno mielocltico, o un sujeto que es un candidato a leucemia mieloide aguda, o un sujeto que recibió tratamiento de la leucemia mieloide aguda.
Según la presente memoria, los términos "trata r", "tratando", "tratamiento" y sus variaciones gramaticales significan un protocolo, un plan, un procedimiento o un método mejorado que se lleva a cabo sobre cada sujeto del que es deseable obtener un efecto fisiológico o un buen resultado en el paciente. En consecuencia, la invención se refiere a un tratamiento y a un método de tratamiento que produce una mejora o efecto beneficioso medible, particularmente sobre un trastomo, una enfermedad, patología, un estado de una enfermedad o un síntoma de un sujeto dado. La mejora o efecto beneficioso medible es objetívo o subjetivo, desmesurado, transitorio o mejora a largo plazo de uno cualquiera de trastomos, enfermedades, patología, estados de una enfermedad o síntomas o una reducción en el comienzo, gravedad, duración o frecuencia de síntoma adverso relacionado con o provocado por trastomos, enfermedades, estados fisiológicos, patología o estado. Según la invención, existe la posibilidad de que su efecto no siempre se exhiba inmediatamente, sino que se encuentra una mejora o efecto beneficioso eventual un poco más
tarde con el transcurso del tiempo, de manera que se producirá la estabilización o mejoría en un sujeto dado.
Excepto que se señale de otro modo, todos los términos técnicos y términos científicos usados en esta memoria descriptiva tienen los mismos significados que aquellos que son generalmente evidentes para personas en el campo técnico al que se refiere la invención. En las operaciones o exámenes de la invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria descriptiva, pero aquellos que se describen en esta memoria descriptiva son métodos y materiales adecuados
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Preparación de célula de expresión de IL-3Ra humana, de Macaca fascicufaris o de Macaca mufatta
(Clonación molecular de AONc de IL-3Ra y preparación de vector de expresión)
El AONc de IL-3Ru humana se amplificó a partir de un AON derivado de célula sanguínea (CLONTECH Human MTC Panel) mediante PCR usando ExTaq (TAKARA BID INC.). Como dispositivo de PCR, se usó GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, en lo sucesivo, el dispositivo de PCR es el mismo en esta memoria descriptiva). Con respecto a la PCR, tras una etapa de desnaturalización a 94°C durante 5 minutos, se llevó a cabo una reacción en tres etapas a 94°C 30 segundos-SSoC 30 segundos-72°C 2 minutos, 40 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción a 99°C durante 30 segundos. Los cebadores de la PCR usados son como siguen.
IL-3Ru_Fw: 5'-CGGCAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCAC-3' (SEC ID NO:3)
IL-3Ru_ Re: 5'-ATTGCGGCCGCTCAAGTTTICTGCACGACCT-3' (SEC ID NO:4)
Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visua lizó mediante tinción coo bromuro de etidio. Se cortó una banda a alrededor de 1,2 kb Y se extrajo usando JetSob (Genomed). El AON extra ido se digirió con Mfel y Notl , se mezcló coo el vector pEGFP-N1 (Clontech) o con el vector pEF6/Myc-His que se había digerido con EcoRI y Notl, Y se ligó usando el kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, la muestra de ligación y una célula competente OH10B se mezdaron y se extendieron sobre placa de LB (que contiene kanamicina). La comprobación del inserto del vector pEGFP-N1 se llevó a cabo mediante PCR directa de la colonia usando LA Taq (Takara Shuzo Ca., Ud.). Con respecto a la PCR, tras una etapa de desnaturalización a 94°C durante 5 minutos, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 94°C 30 segundos-SSoC 30 segundos-72°C 2 minutos, 40 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción a 99°C durante 30 segundos. Con respecto a los cebadores usados, se usaron IL-3Ru-Fw e IL-3Ru-Re
Los productos de PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visualizó mediante tinción con bromuro de elidio. Usando una colonia a partir de la cual se obtuvo una amplificación a alrededor de 1,2 kb, se determinó una secuencia nudeotidica mediante un método de secuenciacián directo. En la reacción de muestras de secuencias, se usaron BigOye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) y GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) (éstos se usaron en todos los análisis de secuencias de AON en la presente memoria). Con respecto a los cebadores, se usaron IL-3Ra-Fw, IL-3Ra-Re y el siguiente cebador. IL-3Ru_seqF1 . 5'-GTCTTCACTACAAAACGGAT-3' (SEC ID NO:5).
Como el dispositivo de análisis de la secuencia, se usó el analizador de AON ABI 3700XL (Applied Biosystems). Se seleccionó un clan que tiene la misma secuencia de la región codificante del número de asociación de GenBank NP002174.1, Y se extrajo un AON plasmídico mediante un método Miniprep. Los nombres de los vectores fueron pEGFR-N1 fhC0123 y pEF6fMyc-HisfhCD123, respectivamente
La secuencia del inserto (Mfel a Notl ) fue como sigue.
CAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCGCCCTGCCC TGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGAACCTAAGG ATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACC GATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATGCCGGCAGTGAACAATAG CTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCC GAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGG
GAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGAT
TTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAG
TACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAG1ACGAGTGTCTTC
ACTACAAAACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACAT
CTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGG
AGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGAT
TGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCT
TTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTT
CAGATACAAAAGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGA
ACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCC GGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGA GTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGACGTCGCTGCT GATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCCTGGTCTGTGTCTTCGTGATCTGCAGA AGGTATCTGGTGATGCAGAGACTCTTTCCCCGCATCCCTCACATGAAAGACC CCATCGGTGACAGCTTCCAAAACGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGCA AAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGACTGAAGTACAGGTCGTGCAGAAAA CTTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO'6)
Las muestras de ADNc de Macaca fascicularis y Macaca mulaffa se amplificaron a partir de un ADNc derivado de médula ósea de Macaca fascicularis o ADNc derivado de médula ósea de Macaca mulatta, mediante un método de PCR usando LA Taq (TAKARA 810 INe). Como el dispositivo de peR, se usó el GeneAmp PCR Syslem 9700 (Applied Biosystems). Con respecto a la peR, después de una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se lIev6 a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos-S6OC 15 segundos-72°C 70 segundos, 40 cidos, y entonces se llevó a cabo una reacción a 720C durante 2 minutos. Las subsecuencias se obtuvieron a través de la recuperación mediante BLAST de la base de datos pública del genoma de Macaca mulaffa (http://w.vw.hgsc.bnm.tmc.edulblasthgsc), en base a la secuencia de ADNc de h1L-3Ra para diseñar los cebadores Las secuencias de cebadores usadas fueron las siguientes
Rhe123Fw1 :CGGCAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTG (SEC ID NO:7)
Rhe123Rv1 :T ATA TIGCGGCCGCTCAAGTTTTCTCCACCACCTGCAC (SEC ID NO:8)
Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron a eleclroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE), El ADN se visualizó mediante Unción COfl bromuro de etidio, Se cortó una banda a alrededor de 1,2 kb, Y el AON se extrajo usando Gel Extraction Kit (QIAGEN). El ADN así extraído se mezcló con el vector pGEM-T Easy (Promega) y se ligó usando kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, la muestra de ligación y una célula competente OH10B se mezclaron y se extendieron sobre placa de LB (que contiene ampicilina) La comprobación del inserto del vector pGEM-T Easy se llevó a cabo mediante PCR directa de colonias usando LA Taq (Takara Shuzo Ca., Ud.). Con respecto a la PCR, tras una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos-56°C 15 segundos-72°C 1 minuto, 35 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción a 72°C durante 2 minutos Como los cebadores, se usaron los siguientes
T7: TAATACGACTCACTATAGGG (SEC ID NO:9)
SP6: GATlTAGGTGACACTATAG (SEC ID NO: 10)
Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El ADN se visua lizó mediante tinción con bromuro de elidio. Usando una colonia a partir de la cual se obtuvo una amplificación a alrededor de 1,2 kb, la secuencia nucleotídica se determinó mediante un método de secuenciación directo. Como los cebadores de PCR, se usaron T7 y SP6. Se seleccionó un clan que no muestra mutación mediante PCR, y su AON plasmídico se extrajo mediante el método Miniprep. El AON así obtenido se digirió con Mtel y Not1 , se mezcló con el vector pEGFP-N1 (Clontech) que se habia escindido con EcoRI y Not1 y se ligó usando kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, la muestra de ligación y una célula competente DH10B se mezclaron y se extendieron sobre placa de LB (que contiene kanamicina)
La comprobación del inserto del vector pEGFP-N1 se llevó a cabo mediante una PCR directa de colonias usando LA Taq (Takara Shuzo Ca., Ud.). Con respecto a la PCR, tras una etapa de desnaturalización a 94°C durante 5 minutos, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 94°C 30 segundos-5SoC 30 segundos-72°C 2 minutos, 40 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción a ggoC durante 30 segundos. Con respecto a los cebadores de PCR usados, se usaron Rhe123Fw1 y Rhe123Rv1
Los productos de PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos,
5 lampón de TAE). El ADN se visualizó mediante linción con bromuro de etidio. Usando una colonia a partir de la cual se obtuvo una amplificación a alrededor de 1,2 kb, se determinó una secuencia nucleotidica mediante un método de secuenciación directo. En la reacción de muestras de secuencias, se usaron BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) y GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) (éstos se usaron en todos los análisis de secuencias de ADN en esta memoria descriptiva). Como los cebadores, se usaron Rhe123Fw1 y
10 Rhe123Rv1 Los vectores se denominaron pEGFR-N1 fcyCD123 y pEGFR-N1 frhCD123, respectivamente
La secuencia del inserto (Me" a NoN ) de IL-3Ra de Macaca fascicularis fue como sigue.
CAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTGCTCCTGGTCGCCACGCC CTGTCTCCTGCAAACGAAGGAGGATCCAAATGCACCAATCAGGAATCTAAGG ATGAAAGAAAAGGCTCAGCAGTTGATGTGGGACCTGAACAGAAACGTGACC GACGTGGAGTGTATCAAAGGCACCGACTATTCTATGCCGGCAATGAACAACA GCTATTGCCAGTTCGGAGCCATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTC CGAGTGGCCAGTCCCCCGTTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTG GGACGCCTCAGGCAGGCGCGGAGAATCTGACCTGCTGGGTTCATGACGTGG ATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGTGGCAGGCCCGGCGGCCCCCGCTGACGTCCA GTACGACCTGTACTTGAACAATCCCAACAGCCACGAACAGTACAGGTGCCTT CACTACAAAACGGATGCTCGGGGAACACAGATCGGGTGTCGGTTCGATGACA TCGCTCGACTCTCCCGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGAGGGGCAG GAGCGCAGCCGTCAGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCTTCTTTTCACAGA TTGAGAGATTAACTCCACCCAACATGACTGGAGAGTG1AATGAGACACATTC CTTCATGCACTGGAAAATGAAAAGTCATTTCAATCGCAAATTCCGCTATGAGC TTCGGATCCAAAAGAGAATGCAGCCTGTAAGGACAGAACAGGTCAGAGACA CAACCTCCTTCCAGCTACCCAATCCTGGAACGTACACAGTGCAAATAAGAGC CCGGGAAACAGTGTATGAATTCTTGAGTGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTC GAGTGCGACCAGGAGGAGGGCGCGAGCTCGCGTGCCTGGCGGACGTCGCTG CTGATCGCGCTGGGGACGCTGCTGGCCTTGCTCTGTGTGTTCCTCATCTGCAG AAGGTATCTGGTGATGCAGAGGCTGTTTCCCCGCATCCCACACATGAAAGAC CCCATCGGTGACACCTTCCAACAGGACAAGCTGGTGGTCTGGGAGGCGGGC AAAGCCGGCCTGGAGGAGTGTCTGGTGTCTGAAGTGCAGGTGGTGGAGAAA ACTTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO, 11)
La secuencia del inserto (Me" a NoN ) de IL-3Ra de Macaca mulatra fue como sigue
CAATTGCCACCATGACCCTCCTTTGGCTGACGCTGCTCCTGGTCGCCACGCC CTGTCTCCTGCAAACCAAGGAGGATCCAAATGCACCAATCAGGAATCTAAGG ATGAAAGAAAAGGCTCAGCAGTTGATGTGGGACCTGAACAGAAACGTGACC GACGTGGAGTGTATCAAAGGCACCGACTATTCTATGCCGGCAATGAACGACA GCTATTGCCAGTTCGGAGCCATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTC CGAGTGGCCAGTCCTCCGTTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTG GGACGCCTCGGGCAGGCGCGGAGAATTTGACCTGCTGGGTTCATGACGTGG ATTTCTTGAGCTGCAGCTGGGTGGTAGGCCCGGCGGCCCCCGCTGACGTCCA GTACGACCTGTACTTGAACAATCCCAACAGCCACGAACAGTACAGGTGCCTT CGCTACAAAACGGATGCTCGGGGAACACAGATCGGGTGTCGGTTCGATGACA TCGCTCGACTCTCCCGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGAGGGGCAG
(Preparación de estirpe celular de expresión forzada de IL-3Ra)
La célula L929 (fabricada por ATCC) y la célula Colon-26 (fabricada por ATCC) se infectaron con el vector pEGFPN1/hC0123 o el vector pEF6/Myc-HisIhCD123 usando electroporación (BTX). Específicamente, se mezclaron 10 a 20 l-\g de ADN con cien mil células, y se dejó reaccionar a 300 V Y 950 JlF. Con respecto a las células, se seleccionaron células multirresistentes usando neomicina (Calbiochem) para pEGFP-N1IhCD123 o blasticidina (Invitrogen) para pEF6/Myc-HisIhCD123. Con respecto a las células así seleccionadas, una célula positiva para GFP, o una célula que expresa en gran cantidad IL-3Ra (CD123), se seleccionó adicionalmente mediante clasificación usando citometria de flujo (FAC SVantage, FACSAria y similar, SD Biosciences), y se denominé como L929lhCD123 y Colon-26IhCD123, respectivamente
Con respecto a la preparación de células de expresión forzada de IL-3Ra de Macaca fascicularis y de Macaca mutarta, éstas también se prepararon usando L929 y Colon-26 de la misma manera como en el caso de la célula de expresión forzada de IL·3Ra humana, y se denominaron L929/cyC0123, Colon-26/cyCD123, L929lrhCD123 y Colon-26/rhCD123
Ejemplo 2 Preparación de forma soluble de región extracelular de IL·3Ra
(PreparaciÓfl de forma soluble de vector de expresión de región extracelular de IL·3Ra humana)
Un ADNc que codifica la región extracelular de IL·3Ra humana se amplificó mediante un método de peR, y se le conectó una etiqueta FLAG al mismo en dirección 3' Especificamente, el ADNc que codifica la región extracelular de IL·3Ra humana se amplificó mediante PCR usando el ADN plasmidico de pEF6/Myc-HisfhC0123 como molde, y usando Platinum Pfu polymerase (Invitrogen). Con respecto a la PCR, después de una etapa de desnaturalización a 960C durante 2 minutos, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 960C 20 segundos·55°C 30 segundos·68°C 65 segundos, 30 ciclos. Los cebadores usados fueron IL-3Ro.-Fw y el siguiente cebador
hIL·3Rasol·FLAG·Notl: 5'·
ATTOCGGCCGCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAGTCCCGCCAGGCACGTGT GTTTG-3' (SEQ ID NO:l3)
Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. El ADN se extrajo usando JetSorb (Genomed). El AON así purificado se digirió con Mfel y Not! , y nuevamente se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). Se cortó una banda de alrededor de 1,0 kb, Y el ADN se extrajo usando JetSorb (Genomed). El AON obtenido se mezcló con un vector pTracer·CMVfBsd, que se había escindido usando las mismas enzimas del ADN purificado, y se ligó usando kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, la muestra de ligación y una célula competente OH10B se mezclaron y se extendieron sobre placa de LB (que contiene ampicilina). La comprobación del inserto se llevó a cabo mediante PCR directa de colonias usando LA Taq (Takara Shuzo Ca., LId.). Con respecto a la PCR, después de una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos-56°C 15 segundos·72°C 40 segundos, 35 ciclos, y después se llevó a cabo una reacciórJ de alargamiento a 7'Z'C durante 2 minutos. Los cebadores de la PCR usados fueron IL·3Ra·Fw e IL·3Rasol-FLAG·Notl.
Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El ADN se visua lizó mediante tinción con bromuro de eUdio. Un ADN plasmídico se extrajo mediante el método Miniprep a partir de una colonia en la que se obtuvo una amplificación de aproximadamente 1,0 kb. Se encontró mediante un análisis de secuencia de AON que el AON plasmídico purificado tiene la secuencia idéntica a la región correspondiente que el número de acceso de GenBank Np·OO2174.1.
La secuencia del inserto (Mfel a Notl) fue como se expone a continuación
CAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCACGCTGCTCCTGATCOCCCTGCCC TGTCTCCTGCAAACGAAGGAAGATCCAAACCCACCAATCACGAACCTAAGG ATGAAAGCAAAGGCTCAGCAGTTGACCTGGGACCTTAACAGAAATGTGACC GATATCGAGTGTGTTAAAGACGCCGACTATTCTATOCCGGCAGTGAACAATAG CTATTGCCAGTTTGGAGCAATTTCCTTATGTGAAGTGACCAACTACACCGTCC GAGTGGCCAACCCACCATTCTCCACGTGGATCCTCTTCCCTGAGAACAGTGG GAAGCCTTGGGCAGGTGCGGAGAATCTGACCTGCTGGATTCATGACGTGGAT
TTCTTGAGCTGCAGCTGGGCGGTAGGCCCGGGGGCCCCCGCGGACGTCCAG
TACGACCTGTACTTGAACGTTGCCAACAGGCGTCAACAGTACGAGTGTCTTC
ACTACAPu\ACGGATGCTCAGGGAACACGTATCGGGTGTCGTTTCGATGACAT
CTCTCGACTCTCCAGCGGTTCTCAAAGTTCCCACATCCTGGTGCGGGGCAGG
AGCGCAGCCTTCGGTATCCCCTGCACAGATAAGTTTGTCGTCTTTTCACAGAr
TGAGATATTAACTCCACCCAACATGACTGCAAAGTGTAATAAGACACATTCCT
TTATGCACTGGAAAATGAGAAGTCATTTCAATCGCAAATTTCGCTATGAGCTT
CAGATACAPu\AGAGAATGCAGCCTGTAATCACAGAACAGGTCAGAGACAGA
ACCTCCTTCCAGCTACTCAATCCTGGAACGTACACAGTACAAATAAGAGCCC
GGGAAAGAGTGTATGAATTCTTGAGCGCCTGGAGCACCCCCCAGCGCTTCGA
GTGCGACCAGGAGGAGGGCGCAAACACACGTGCCTGGCGGGACTACAAGG
ATGACGACGATAAGTGAGCGGCCGC (SEQ ID NO,l")
(PreparaciÓfl de forma soluble de proteína IL-3Ra humana)
El AON plasmídico del vector de expresión de pTracer CMV que contiene la forma soluble de la secuencia de IL-3Ra se purificó usando QIAGEN Plasmid Maxi Kit. Como célula hospedante para la expresión, se usó una célula CHOras1 . La célula CHOras1 se cultivó con agitación usando medio SFM 11 (Invilrogen) (37°C, 5% de C02).
En la introducción génica se usó un método de PEI. Se pesó polietilenimina, lineal, WMI 25.000 (Polysciences) y se disolvió en PBS mientras se ajusta a pH de alrededor de 7,0 con Hel (1 gIl). La disolución obtenida se agitó durante 1 hora, y después se esterilizó filtrando a través de un filtro de membrana que tiene un tamaño de poros de 0,22 Jlm, MILLEX-GV (Millipore). Después, se mezcló 1 mg del ADN plasmídico purificado con 20 mi de Opti-Pro SFM (Invitrogen) para obtener la Disolución A. La Disolución B se preparó mezclando 2,5 mi de disolución de PEt (1 gil) con 20 mi de Opti-Pro SFM (Invitrogen). Después de que la Disolución A y la Disolución B se mezclaron, y después se dejó reposar durante 10 minutos, la disolución obtenida se añadió a células CHOras1 (1.000.000 células por 1 mi). Después de seis días, el sobrenadante celular se recuperó y se usó para la purificación de la proteína.
La purificación de la fonna soluble de la proteina IL-3Ra. humana se llevó a cabo mediante el siguiente método. Un sobrenadante de cultivo que contiene la forma soluble de la proteína IL-3Ru se recuperó mediante centrifugación 6 días después de la introducción del gen, y se hizo pasar a través de un filtro. La disolución obtenida se diluyó 5 veces con disolución salina tamponada con Tris (TBS), se preparó una columna Anti-FLAG usando anti-FLAG M2 Agarose Affinity Gel (Sigma), y se le aplicó la disolución usando HiLoad Pump P-50 (Phannacia Biotech). La elución se llevó a cabo usando el péptido FLAG (Sigma) y según el manual. El eluato se fraccionó en varias fracciones, cada fracción se sometió a SOS-PAGE (gel en gradiente MultiGel1l Mini 10/20% ; Cosmo Bio Ca., LId.) bajo una condición reductora, y entonces se llevó a cabo la tinción con plata y la transferencia Westem. Para la tinción con plata se usó un reactivo de tinción con plata ~Daiichi" (Daiichi Pure Chemicals Co., Ud.). Para la transferencia Western se usó anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma) y un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón de conejo marcado con fosfatasa alca lina. Una fracción en la que se encontró la proteína de interés se concentró usando Amicon Ultra-4 10K (Millipore), y se llevó a cabo la cromatografía pOf filtración en gel usando Superdex 200 gp (GE Healthcare) Después del fraccionamiento, cada fracción se sometió a SDS-PAGE (gel en gradiente MultiGel 11 Mini 10120%; Cosmo Bio Co., LId.) bajo coodición reductora, y entonces se llevó a cabo la tinción con plata y la transferencia
Westem. En la tinción con plata se usó un reactivo de tinción con plata ~Daiichi" (Daiichi Pure Chemicals Co., Ud.) En la transferencia Westem se usó anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma) y un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón de conejo marcado con fosfatasa alcalina. Una fracción en la que se encootró la proteína de interés se concentró usando Amicon U1tra4 10K (Millipore), y se lavó con PBS. Al llevar a cabo la esterilización mediante filtración usando un filtro de membrana MILLEX-GV (Millipore) que tiene un tamaño de poros de 0,22 Jlm, se obtuvo una forma soluble de la proteína IL-3Ra humana. Como resultado de la prueba de Limulus usando Limulus ES-U Kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, LId.), no se detectó endotoxina. Con respecto a la concentración de la fOfma soluble de la proteína IL-3Ra humana, se midió la absorbancia a 280 nm y se calculó 1 mg/ml como 1,4 OD.
Ejemplo J Preparación de anticuerpo humano anti-IL-3Ra. humana usando ratón productor de anticuerpo humano
(Ratón oroductor de anticuerpo humano)
El ratón usado en la inmunización tiene un antecedente genético de homocigoto tanto en las interrupciones de la cadena pesada de Ig como de la cadena ligera K endógenas, y también mantiene simultáneamente el fragmento cromosórnico 140 que contiene el locus de cadena pesada de Ig humana (SC20) y el transgén de cadena K de Ig humana (KC05). Este ratón se preparó cruzando un ratón de línea A que tiene el locus de cadena pesada de Ig
humana en un ratón de linea B que tiene el transgén de cadena K de Ig humana. La linea A es un homocigoto tanto en las interrupciones de cadena pesada de Ig como de cadena ligera K endógenas, es una línea de ratón que mantiene el fragmento cromosómico 14° (SC20) que se puede transmitir a la progenie, y se describe por ejemplo en un documento de Tomizuka et al. [Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97: 722]. También, la linea B es un homocigoto tanto en las interrupciones de cadena pesada de Ig como de cadena ligera K endógenas, es una linea de ratón (ratón transgénico) que mantiene un transgén de cadena K de Ig humana (KCo5), y se describe en un documento por Fishwild et al. [Na!. Biotechnol (1996), 114: 845].
En el siguiente ensayo inmune se usó un individuo en el que se detectaron simultáneamente cadena pesada de Ig humana y cadena ligera K en suero, obtenido cruzando un ratón macho de línea A en un ratón hembra de linea B, o cruzando un ratón hembra de línea A en un ratón macho de línea B [Ishida y Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 20001. A este respecto, el ratón productor de anticuerpo humano mencionado anteriormente (denominado ratón KM) se puede obtener de Kyowa Hakko Kirin Co., Ud. mediante un contrato
¡Preparacián de anticuemo monoclonal humano frente a IL-3Ra humana)
Con respecto a la preparación del anticuerpo monoclonal en este ejemplo, se preparó según un método general
descrito en A Guide a Monoclonal Antibody Experimental Operations (escrito en japonés) (editado por Tamie Ando et al. publicado por Kodansha, 1991) Y similar. Para la IL-3Ra como inmunógeno, se usó una célula L929 que expresa IL-3Ra (CCL-1, ATCC), una célula Colon-26 que expresa IL-3Ro: (Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Aging y Cancer Tohoku University), o una forma soluble de la proteína de fusión de IL-3Ro: humana con Fc. Como animal a inmunizar, se usó el ratón KM mencionado anteriormente.
Con el fin de preparar anticuerpo monoclonal humano frente a IL-3Ra humana, el ratán KM se inmunizó con la célula L929 que expresa IL-3Ra humana o con la célula Colon-26 que expresa IL-3Ra humana preparada en el ejemplo 1, intraperitonealmente a una dosis de 1 x 107 célulasfanimal cada 1 semana a 2 semanas durante un total de 4 veces. Tres días antes de la extracción del bazo que se describe más abajo, se administraron 20 ~gfratón de la forma soluble de la proteína soluble IL-3Ra humana a través de la vena caudal.
Después de que el bazo se obtuvo quirurgicamente del ratón inmunizado, el bazo se colocó en PBS y se troceó en una malla (cell strainer, FALCON) usando un émbolo de jeringuilla. Después de que la suspensión celular se hizo pasar a través de la malla y se centrifugó, las células precipitadas obtenidas se resuspendieron en Red Blood Cell Lysing Buffer (Sigma). Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se le añadió medio DMEM libre
de suero (Invitrogen) que contiene 350 mgfml de bicarbonato de sodio, 50 unidades/mi de penicilina y 50 ~gfml de estreptomicina (en adelante denominado ~medio DMEM libre de suero"), para precipitar las células. El número de células se midió suspendiéndolas nuevamente en el medio DMEM libre de suero.
Por otro lado, una célula de mieloma SP2/0 (ATCC No. CRL-1581) se cultivó a 370C en presencia de dióxido de carbono al 5% usando medio DMEM (Invitrogen) que contiene 10% de FCS (Invitrogen), 50 unidades/mi de penicilina y 5 f.lg/ml de estreptomicina (en lo sucesivo denominado ~medio DMEM que contiene suero"). Las células SP2IO se lavaron con medio DMEM libre de suero. De la misma manera, las células se suspendieron en medio DMEM libre de suero para medir el número de células. Después de que la suspensión de las células derivadas de bazo recuperadas y una suspensión del mieloma de ratón se mezclaron a una relación numérica de células de 5:1, la suspensión mixta se centrifugó, y después el sobrenadante se eliminó completamente. Como agente de fusión, se añadió lentamente polietilenglicol 1500 (Boehringer-Mannheim) al 50% (plv) al sedimento obtenido mientras se agitaba el sedimento con la punta de una pipeta, y después se le añadió lentamente medio DMEM libre de suero calentado previamente hasta 37°C. Además, se le añadió lentamente una cantidad apropiada de medio DMEM libre de suero. Después, la disolución obtenida se dejó reposar a 370C durante 5 minutos en presencia de dióxido de carbono al 5%. Tras centrifugar, el sobrenadante se eliminó, y las células fusionadas asi obtenidas se suspendieron en medio DMEM (Invitrogen) que contiene 10% de FCS (Invitrogen), penicilina-estreptomicina-glutamina (Sigma), IL6 (5 ngfml) y 2-mercaptoetanol (Invitrogen) (en adelante, denominado "medio DMEM que contiene IL-6"), y se cultivaron a 37°C en presencia de dióxido de carbono al 5%. Al dia siguiente, las células se recuperaron pipeteando, y se hicieron precipitar mediante centrifugación. El sedimento celular obtenido se resuspendió en medio DMEM que contiene IL-6. Las células suspendidas se sometieron a dilución limitante en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante alrededor de 7 días a 14 días. El sobrenadante de cultivo se usó en la identificación de hibridomas descrita en el siguiente ejemplo.
(Identificación de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano que se une a IL-3Ra humana)
La identificación del hibridoma se llevó a cabo usando el sobrenadante celular preparado en el ejemplo anterior. Brevemente, el método se llevó a cabo mediante citometría de flujo, en la que se usó una estirpe celular que expresa de forma estable IL-3Ra humana.
Específicamente, una combinación de célula L929 que expresa IL-3Ra humana y de la estirpe celular precursora de la célula L929, o una combinación de célula Colon-26 que expresa IL-3Ra humana y la célula Colon-26 de la estirpe celular precursora, se mezcló con el sobrenadante de hibridoma y se dejó reposar a 4°C durante 30 minutos. Después de lavar las células obtenidas dos veces con un medio de tinción (PBS de Dulbecco que contiene 2% de suero fetal de ternera, 2 mM de EDTA, 0,05% de NaN3), se le añadió Anti-lgG humana F(ab')z de cabra-PE (Southem Biotech) como anticuerpo secundario y se dejó reposar a 40C durante 30 minutos. Después de lavar dos veces con el medio de tinción, las células obtenidas se analizaron mediante FACSCalibur (BD Biosciences). Se recogió un hibridoma que reaccionó solamente con la célula L929 que expresa IL-3Ra humana.
El hibridoma seleccionado se sometió a dilución limitante, y la identificación se llevó a cabo usando su sobrenadante
de cultivo. Específicamente, cada una de la célula L929 que expresa IL-3Ra humana y la célula L929 de la estirpe celular precursora se mezcló con el sobrenadante de hibridoma y se dejó reposar a 40C durante 30 minutos Después de lavar dos veces con el medio de tinción, se le añadió anti-kappa humana F(ab'h de cabra-PE (Dako) como anticuerpo secundario, y se dejó reposar a 40C durante 30 minutos. Después de lavar dos veces con el medio de tinción, las células se analizaron mediante FACSCalibur (BD Biosciences). Se recogió un hibridoma que reaccionó solamente con la célula L929 que expresa IL-3Ra humana.
Ejemplo 4 Preparación de anticuerpo humano recombinante anti-IL-3Ra humana
(Obtención de un gen de anticuerpo humano anti-IL-3Ra. humana a partir del hibridoma y preparación de vector de expresión )
A partir del hibridoma obtenido en el ejemplo 3, los clones denominados Old4, OldS, Old7, Old19, New102 y Old6 se cultivaron usando medio eRDF (Kyokuto Pharmaceuticallndustrial Co., Ud.) que contiene 10 ng/ml de IL-6 (R & O Systems) y 10% de suero fetal bovino (SIGMA), y después las células se recogieron mediante centrifugación. A las células obtenidas, y entonces se añadió TRIZOL (GIBCO), y se extrajo ARN total segun las instrucciones. La clonación de la región variable del ADNc del anticuerpo se llevó a cabo usando el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech), según las instrucciones anejas al mismo
Además, la región variable se clonó a partir de un hibridoma ATCC, HB12009, que produce un anticuerpo de ratoo 7G3 anti-IL-3Ra humana, y se usó como control. Coneelando el ADNc así obtenido con un ADN que codifica la región constante de IgG1 humana, se preparó un vector de expresión de anticuerpo quimérico. Específicamente, las células se recogieron mediante centrifugación a partir del hibridoma crioconservado, y entonces se les añadió TRIZOL (GIBCO) para extraer ARN total según las instrucciones. La clonación de la región variable del ADNc del anticuerpo se llevó a cabo usando cebadores específicos del anticuerpo IgG de ratón, además del kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech), según las instrucciones adjuntas al mismo
Usando 5 ~g del ARN total como molde, se preparó el AONc de l a hebra.
1) Síntesis del ADNc de l a hebra
ARN total 5 ~gm/3 111
5'CDS 1 ~I
SMART oligo 1 ~J
Después de que la mezcla de reacción que comprende las composiciones anteriores se incubó a 720C durante 2 minutos, se añadieron
Sx tampón 2 ~I
DTT 1 ~I
Mezcla de DNTP 1 I-IL Y
Superscriptll 1 ~I
a la mezcla de reacción, y se incubó a 42°C durante 1,5 horas.
A la mezcla obtenida, se le añadieron adicionalmente 100 111 de tampón de Tricina, y se incubó a 72°C durante 7 minutos.
2) Amplificación del gen de cadena pesada y del gen de cadena ligera mediante PCR y construcdón del vector de expresión de anticuemo recombinante
Para la amplificación de AONc, se usó Z-Taq fabricado por Takara.
AoNc 2 pi
10x tampón de Z-Taq 5 pi
mezcla de dNTP 4 Itl
Z-Taq 1 pi
Cebador 1
Cebador 2
Una disolución de reacción que comprende la composición mencionada anteriormente se ajustó hasta un volumen final de 50 ,.tI COfl agua redesti lada , para ser sometida a PCR.
Para la amplificación de la cadena pesada, se usaron UPM (kit de amplificación de AONc SMART RACE; fabricado por Clontech) y el cebador hh-6 (5'-GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTT-3') (SEC ID NO:15), y un ciclo de reacciones de 980C 1 segundo y 680C 30 segundos se repitió 30 veces. Además, usando como molde 1 IlJ de la disolución de reacción obtenida, y usando como cebadores NUP (kit de amplificación de AONc SMART RACE; fabricado por Clontech) y el cebador hh-3 (5'-GTGCACGCCGCT GGT CAGGGCGCCTG-3') (SEC ID NO:16), un ciclo de reacciones a 98°C 1 segundo y 68°C 30 segundos se repitió 20 veces. Después, los productos de la PCR amplificados se purificaron usando el kit de purificación mediante PCR (QIAGEN ), y se determinaron las secuencias nucleotídicas usando como cebador hh-4 (5'-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3') (SEC ID NO: 17). Los siguientes cebadores específicos se sintetizaron en base a la información de secuencia, y las secuencias también se determinaron desde la dirección opuesta usando los siguientes cebadores.
Cebador Fw específico de la cadena pesada de Old4
(5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTICCTCTITG T -J')(SEQ ID NO:18)
Cebador Rv especifico de la cadena pesada de Old4 (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATIGTCCC-3') (SEC ID NO:19) Cebador Fw específico de la cadena pesada de Old5
(5' -AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTICCTCT TIG T
-J') (SEQ ID NO:20) Cebador Rv especifico de la cadena pesada de Old5 (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATIGTCCC-3') (SEC ID NO:21 ) Cebador Fw especifico de la cadena pesada de Old17
(S'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTICCTCTTIGT -J')(SEQ ID NO:22)
Cebador Rv específico de la cadena pesada de Old17 (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACAAGGGTTCCC-3') (SEC ID NO:23) Cebador Fw especifico de la cadena pesada de Old19
(5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTICCTCTTIGT -J') (SEQ ID NO:24)
Cebador Rv especifico de la cadena pesada de Old19
(5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTIC -3') (SEC ID NO:25)
Cebador Fw especifico de la cadena pesada de New102
(S'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGT
-
3') (SEQ ID NO:26)
Cebador Rv específico de la cadena pesada de New102
(5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTI-3') (SEC ID NO:27)
Cebador Fw especifico de la cadena pesada de Old6
(5'-AGAGAGAGAGGTCGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG-3') (SEC ID NO:28)
Cebador Rv especifico de la cadena pesada de Old6
(5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTIC-3') (SEC ID NO:29)
Para la amplificación de la cadena pesada del anticuerpo 7G3 de ratón, se usaron UPM (kit de amplificación de AoNc SMART RACE; fabricado por CJontech) y el cebador mH-Rv1 (5' -ATTTTG TCG ACC KYG GTS YTG CTG GCY GGGTG-3') (SEC ID NO:30), y un ciclo de reacciones a 98°C 1 segundo y 680C 30 segundos se repitió 30 veces. Además, usando como molde 1 ~¡J de esta disolución de reacción y usando NUP (kit de amplificación de AoNc SMART RACE; fabricado por Clontech) y el cebador mH-Rv2 (5'GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTICC-3') (SEC ID NO:31 ), un ciclo de reacciones a 98°C 1 segundo y 680C 30 segundos se repitió 20 veces. Después, los productos de la PCR amplificados se purificaron usando el kit
de purificación mediante PCR (QIAGEN), y la secuencia nucleolídica de la región variable de cadena pesada se determinó usando como cebador el cebador mH-Rv2 (SEC ID NO:31 ). Los siguientes cebadores específicos se sintetizaron en base a la información de secuencia, y las secuencias también se detenninaron desde el sentido opuesto usando los siguientes cebadores.
Cebador Fw especifico de la cadena pesada de 7G3
(5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTICTC-3') (SEC ID NO:32)
Cebador Rv especifico de la cadena pesada de 7G3
(5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3') (SEC ID NO:33)
La PCR se llevó a cabo usando los cebadores específicos mencionados anteriormente (98OC 1 segundo, 600C 30 segundos, n oc 30 segundos), y el fragmento de AoNc procedente de la amplificación de la cadena pesada se digirió con Sall y Nhel y se insertó en el vector N5KG1 -Val Lar!< [un vector modificado de N5KG1 (documento US
6.001.358, Idec Pharmaceuticals)]. que se había escindido con las mismas enzimas. Determinando la secuencia usando como molde el vector, se encontró que la secuencia insertada es idéntica a la determinada mediante secuencia directa.
La cadena ligera se amplificó usando UPM (kit de amplificaciÓfl de AoNc SMART RACE; fabricado por Clontech) y el cebador hk-2 (5'-GTI GAAGCT CTI TGT GAC GGG CGA GC-3') (SEC ID NO:34) y repitiendo 30 veces un ciclo de reacciones a 980C 1 segundo y 68°C 30 segundos. Además, usando como molde 1 pi de esta disolución de reacción y usando NUP (kit de amplificación de ADNc SMART RACE; fabricado por Clontech) y hk-6 (5'TGGCGGGAAGATG AAG ACA GAT GGT G-3') (SEC ID NO:35), un ciclo de reacciones a 98°C 1 segundo y 680C 30 segundos se repitió 20 veces. Después, los productos de la PCR amplificados se purificaron usando el kit de purificación mediante PCR (QIAGEN), y la secuencia nucleotidica se determillÓ usando el cebador hk-6. Los siguientes cebadores especificas se sintetizaron en base a la información de secuencia, y las secuencias también se determinaron desde la dirección opuesta.
Cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old4
(5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC CCG CTC AGC-3') (SEC ID NO:36) Cebador Rv específico de la cadena ligera de Old4
(5'-AGAGAGAGAGCGTACGTITGATCTCCAGCTTGGTCC CCT G-3') (SEC ID NO:37) Cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old5 (5'-AGA GAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCG CTC AGC-3') (SEC ID NO:38) Cebador Rv específico de la cadena ligera de Old5 (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTITGATCTCCAGCTTGGTCC CCT G-3') (SEC ID NO:39) Cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old 17 (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTGC TGG GTG AG-3') (SEC ID N0:40) Cebador Rv específico de la cadena ligera de Old17 (5'-AGAGAGAGAGCGTAGGTITGATCTCGAGGTTGGTCC CGT G-3') (SEC ID N0:41) Cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old19 (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC TCG CTC AG-3') (SEC ID NO:42) Cebador Rv especifico de la cadena ligera de Old19 (5'-AGAGAGAGAGCGTAGGTTTGATTTCGAGCTTGGTCC GTT GGC-3') (SEG ID N0:43) Cebador Fw especifico de la cadena ligera de New102 (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC TCG CTC AG-3') (SEC ID NO:44) Cebador Rv específico de la cadena ligera de New102 (5'-AGAGAGAGAGCGTAGGTTTGATCTCGAGGTTGG TGC CGT G-3') (SEC ID N0:45) Cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old6 (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCAGCATGGACATGAGGGTGCGGGGTCAGC-3') (SEC ID N0:46) Cebador Rv específico de la cadena ligera de Old6 (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTITGATATCCACTITGGTCCCAGGGC-3') (SEC ID NO:47) La cadena ligera del anticuerpo 7G3 de ratón se amplificó usando UPM (kit de amplificación de ADNc SMART
RACE; fabricado por Clontech) y el cebador mK-Rv1 (5'-TT GAA GCT GTT GAC AAT GGG TGAAGT TGAT-3')
(SEC ID NO:48) y repitiendo 30 veces un ciclo de reacciones a 980C 1 segundo y 6B"C 30 segundos_ Además, usando como molde 1 ¡.tI de esta disolución de reacción y usando NUP (kit de amplificación de ADNc SMART RAGE; fabricado por Clontech) y mK-Rv2 (5'-GTAGGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAGT-3') (SEC ID NO:49), un ciclo de reacciones a 980C 1 segundo y 680C 30 segundos se repitió 20 veces. Después, los productos de la PCR amplificados se purificaron usando el kit de purificación mediante PCR (QIAGEN), y la secuencia nucleotidica se determinó usando el cebador mK-Rv2. Los siguientes cebadores específicos se sintetizaron en base a la información de secuencia, y las secuencias también se determinaron desde la dirección opuesta.
Cebador Fw especifico de la cadena ligera de 7G3 (5'-AGAGAGAGAGAGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTG-3') (SEC ID NO:50) Cebador Rv especifico de la cadena ligera de 7G3 (5'-AGAGAGAGAGCGTAGGTTTTATITCGAGCTTGGTCGCGGC-3') (SEC ID NO:51) La PCR se llevó a cabo usando los cebadores especificos mencionados anteriormente (98OC 1 segundo, 600C 30
segundos, 72°C 30 segundos), y el fragmento de ADNc de la amplificación de la cadena ligera se digirió con BglII y BsMlI y se insertó en un vector N5KG1-Val Lark que se había escindido con las mismas enzimas. Determinando la secuencia usando el vector como molde, se encontró que la secuencia insertada es idéntica a la determinada
mediante la secuencia directa.
A continuación se muestran cada una de las moléculas de ADN que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de OId4, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena 5 pesada y de la región variable de cadena ligera
< Región variable de cadena pesada de Old4>
GACCCGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAG CAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGCTACAGTCTGGGGCTGAGGT
10 GAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCATGCAAGGCTTCTGGAGGCAC CTTCAGCACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTT GAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTATAGTAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGTACAGCCTAC ATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGA
GAGGGGGGGGCTCGGGCCCAGATGTTCTTGATAT~GGGGCCAAGGGACAAT
GGTCACCGTCTCTTCaGCTAGCACCAA (SEQ ID NO:S2)
< Región variable de cadena pesada de Old4>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAI SWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIVNYAQKFQGRVI1TADESTSTAYMELSSLRSE
15 DTAVYYCARGGGSGPDVLDIWGQGTMVTVSSASTX (SEQ ID NO:S3)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 16 desde el terminal 5' de SEC ID NO:52, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 432 y guanina (G) en la posición 433 desde el 20 terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada llega hasta el resto de serina (S) en la posición 139 desde el N-terminal de SEC ID NO:53, y la región constante está en y después de alanina (A) en la posición 140. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta serina (8 ) en la posición 19 desde el N-terminal de SEC ID NO:53. El N-terminal de la forma madura se consideró que es glutamina (O) en la posiciórJ 20 de SEC ID
25 NO:53
<Región variable de cadena ligera de Old4>
CACAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCC TGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCA TCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGA GTCAGGGCATTAGOAGTTATTTAGCCTGGTATCAOCAAAAACCAOGOAAAGC CCCTGAGCTCCTOATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTOGGGTCCCATCAA GGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCT GCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTCCCGTA CACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGG (SEQ ID NO:S4)
<Región variable de cadena ligera de Old4>
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTODRVTISCRMSQOIRSY LAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGIDFTLTISSLQSEDFATYYC QQYYSFPYTFGQGTKLElKRTVX (SEQ ID NO:S5)
35 El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 16 desde el terminal 5' de SEC ID NO:54, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 402 y citosina (C) en la posición 403 desde el terminal 5' En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 129 desde el N-terminal de SEC ID NO:5S, y la región constante está en y después de arginina (R) en la posición 130. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se
5 estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta cisteina (C) en la posición 22 desde el N-terminal de SEC ID NO:SS. El N-terminal de la forma madura se consideró que es valina (V) en la posiciórl 23 de SEC ID NO:5S
A continuación se muestra cada una de las moléculas de ADN que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de OldS, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena 10 pesada y la región variable de cadena ligera
<Región variable de cadena pesada de OldS>
GTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCT ACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAG AAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCATGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCA GCACCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTG GATGGGAGGGCTCATCCCTATCTITGATATAGAAAACTACGCACAGAAGTTCC AGGGC.AGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGTCTATATGGA ACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGG GGGGGTTCGGGCCCTGATGTTCTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCA
CCGTCTCTTCaGCTAGC (SEQ ID NO,S6)
<Región variable de cadena pesada de OldS>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAI SWVRQAPGQGLEWMGGLIPIFDlENYAQKFQGRVTITADESTSTVYMELSSLRSE DTAMYYCARGGGSGPDVLDIWGQGTMVTVSSAS (SEQ ID NO,S7)
20 El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 16 desde el terminal 5' de SEC ID NO:S6, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 427 y guanina (G) en la posición 428 desde el lerminalS' En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada llega hasta el resto de serina (S) en la posición 139 desde el N-terminal de SEC ID NO:S7, y la región constante está en y después
25 de alanina (A) en la posición 140. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta serina (S) en la posición 19 desde el N-terminal de SEC ID ND:S7. El N-terminal de la forma madura se consideró que es glutamina (O) en la posiciÓfl 20 de SEC ID NO:S7
30 <Región variable de cadena ligera de Old5>
CACAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCC TGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCA TCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGA GTCAGGGCATTAGGAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGC CCCTGAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAA OGTTCAGTGOCAOTOOATCTOOOACAOATITCACTCTCACCATCAOCAGCCT GCAGTCTGAAGATTITGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTCCCGTA CACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAftCGTACG.GTGG (SEQ ID NO,S8)
<Región variable de cadena ligera de Old5>
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTODRVTISCRMSQGlRSY LAWYQQKPOKAPELLlYAASTLQSOVPSRFSGSOSOTDFTLTISSLQSEDFATYYC QQYYSFPYTFOQGTKLElKRTVX (SEQ ID NO:59)
5 El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 16 desde el terminal 5' de SEe ID NO:58, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 402 y citosina (e) en la posición 403 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 129 desde el N-terminal de SEe ID NO:59, y la región constante está en y después
10 de arginina (R) en la posición 130. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta cisteina (C) en la posición 22 desde el N-terminal de SEe ID NO:59. El N-terminal de la forma madura se consideró que es valina (V) en la posiciÓll 23 de SEe ID NO:59
A continuación se muestra cada una de las moléculas de ADN que cod ifican la región variable de cadena pesada y 15 la región variable de cadena ligera de Old17, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera
<Región variable de cadena pesada de Old17>
GACCCGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAG 20 CAOCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGO
TGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGAGGCA
CCTTCAGCAACTTTGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCT
TGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTTCAACAAACTACGCACAG
AAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTAACGCGGACOAATCCACGAGCACAGCC
TACATGGAGCTGAGCAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTG
CGGGTGGAGACAAATATGGTCCTTACTACTTTCACTACTGGGGCCAGGGAAC
CCTTGTCACCGTCTCCTC¡;GCTAGC (SEQ ID NO:60)
<Región variable de cadena pesada de Old17>
25 MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSYKYSCKTSGGTFSNFAl SWVRQAPGQGLEWMGOllPlFGSTNYAQKFQGRVTlNADESTSTAYMELSSLRSE DTAYYYCAGGDKYGPYYFHYWGQGTLVTVSSAS (SEQ ID NO:61)
El sitio de iniciaciÓll de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 16 desde el terminal 5' de SEe ID NO:60, y una frontera entre la región variable y la región
30 constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 432 y guanina (G) en la posición 433 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada llega hasta el resto de serina (S) en la posición 139 desde el N-terminal de SEe ID NO:61, y la región constante está en y después de alanina (A) en la posición 140. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta serina (S) en la posición 19 desde el N-terminal de
35 SEe ID NO:61 . El N-terminal de la forma madura se consideró que es glutamina (a) en la posición 20 de SEe ID NO:61
<Región variable de cadena ligera de Old17>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGC
TGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCC
TCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTC
AGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCC
TAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGT
TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCGTACA
Clll lGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAi\CGTACGGT (SEQ ID NO:62)
5 <Región variable de cadena ligera de Old17>
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDlQMTQSPSSLSASVGDRVTlTCRASQGlSSW LAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTlSSLQPEDFATYYC QQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTX (SEQ ID NO:63)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
10 (A) en la posición 19 desde el terminal 5' de SEC ID NO:62, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 399 y citosina (C) en la posición 400 desde el terminal 5' En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 129 desde el N-terminal de SEC ID NO:63, y la región constante está en y después de arginina (R) en la posición 130. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se
15 estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta cisteina (C) en la posición 22 desde el N-terminal de SEC ID NO:63. Se considera que el N-terminal de la forma madura es ácido aspártico (D) en la posición 23 de SEC ID NO:63.
A continuación se muestra cada una de las moléculas de ADN que cod ifican la región variable de cadena pesada y
20 la región variable de cadena ligera de Old19, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.
<Región variable de cadena pesada de Old19>
TCGACCCCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTAC AGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAA GCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGC AGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGG TGGGAGGGATCATCCCTATCTTrGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCA GGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGA GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGG ACACAAATATGGCCCCTACTACl<TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC
25 ACCGTCTCCTCt.GCTAGCACCAAG (SEQ ID NO:64)
<Región variable de cadena pesada de O ld19>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAl SWVRQAPGQGLEWVGGnPIFGTANYAQKFQGRVTlTADESTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCARGHKYGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO:65)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 9 desde el terminal 5' de SEC ID NO:64, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 425 y guanina (G) en la posición 426 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada llega hasta el
35 resto de serina (S) en la posición 139 desde el N-terminal de SEC ID NO:65, y la región constante está en y después de alanina (A) en la posición 140 Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta serina (S) en la posición 19 desde el N-terminal de SEC ID NO:65. Se considera que el N-terminal de la forma madura es la glutamina (O) en la posición 20 de SEC ID NO:65
5 <Región variable de cadena ligera de Old19>
AGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGC TGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCC TCACI'GTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTC AGGGTA1TAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCC TAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTcrCACCATCAGCAGCcrGCA GCCTGAAGATTTrGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTlACCCTCGGA
CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATC~CGTACGGTGGCT(SEQID
NO,66)
<Región variable de cadena ligera de Old19>
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSW LAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYNSYPRTFGQGTKVEIKRTVA (SEQ ID NO,67)
El sitio de iniciación de la traducción del AON de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 13 desde el terminal 5' de SEC ID NO:66, y una frontera entre la región variable y la región
15 constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 399 y citosina (C) en la posición 400 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 129 desde el N-terminal de SEC ID NO:67, y la región constante está en y después de arginina (R) en la posición 130. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta cisteina (e) en la posición 22 desde el N-terminal de
20 SEC ID NO:67. Se considera que el N-terminal de la forma madura es ácido aspártico (O) en la posición 23 de SEC ID NO:67.
A continuación se muestra cada una de las moléculas de AON que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de New102, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena
25 pesada y la región variable de cadena ligera.
<Región variable de cadena pesada de New102>
TCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCcrCTTTGTGGTGGCAGCAGCTA CAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGA
30 AGCCTGGATCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCATGGCTTCAGGAGGCACCGTCAG CAGCTACGCTATCAGcrGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTlGAGTG GATGGGAGAGATCATCCCTATCTTTGGTATAGTAAACTACGCACAGAAGTTCC AGGGCAGAGTCACGATlACCGCGGACGAATCCACGAACACAGCCTACATGG AGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGA GACAGCAGTGGCTGGTATlCTTGGTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTCTCCTCt,GCTAGCACCAAG (SEQ ID NO,68)
<Región variable de cadena pesada de New102>
MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCMASGGTVSSYA ISWVRQAPGQGLEWMGEIIPIFGIVNYAQKFQGRVTITADESTNTAYMELSSLRS
35 EDTAIYYCARETAVAGlLGYWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO,69)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 9 desde el terminal S' de SEC ID NO:68, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 423 y guanina (G) en la posición 424 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada llega hasta el
5 resto de serina (S) en la posición 138 desde el N-terminal de SEC ID NO:69, y la región constante está en y después de alanina (A) en la posición 139. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta serina (S) en la posición 19 desde el N-terminal de SEC ID NO:69. Se considera que el N-terminal de la forma madura es glutamina (O) en la posición 20 de SEC ID NO:69.
<Región variable de cadena ligera de New102>
AGATCTCTCACCATQGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGC
TGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCC
TCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTC
AGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCC
TAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGT
TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTACCCGTACA
CTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCA(SEQ
ID NO:70)
15 <Región variable de cadena ligera de New102>
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSW LAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYNSVPYTFGQGTKLEIKRTVAA (SEQ ID NO:7l)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
20 (A) en la posición 13 desde el terminal 5' de SEC ID NO:70, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 399 y citosina (C) en la posición 400 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 129 desde el N-terminal de SEC ID NO:71, y la región constante está en y después de arginina (R) en la posición 130. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se
25 estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta cisteína (C) en la posición 22 desde el N-terminal de SEC ID NO:71 El N-terminal de la forma madura se consideró que es ácido aspártico (O) en la posición 23 de SEC ID NO:71 .
A continuación se muestra cada una de las moléculas de ADN que codifican la región variable de cadena pesada y
30 la región variable de cadena ligera de Old6, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.
<Región variable de cadena pesada de Old6>
CGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA AGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAA GCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGT AGCCATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGG GTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATATTATGCAGACTCAGTGAAG GGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAA TGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG ACTGGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC
35 AGCTAGC (SEQ ID NO:72)
<Región variable de cadena pesada de Old6>
MELGLRWVFLVAlLEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSHNMN WVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYlYYADSVKGRFfISRDNAKNSLYLQMNSLRAE DTAVYYCAREDWGYFDYWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO:73)
El sitio de iniciaciórJ de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 10 desde el terminal 5' de SEC ID NO:72, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 417 y guanina (G) en la posición 418 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la regiórJ variable de cadena pesada llega hasta el resto de serina (S) en la posiciórJ 136 desde el N-terminal de SEC ID NO:73, y la región constante está en y después de alanina (A) en la posición 137. Mediante un software de estimaciórJ de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta cisteina (C) en la posición 19 desde el N-terminal de SEC ID NO:73. El N-terminal de la forma madura se consideró que es ácido glutámico (E) en la posición 20 de SEC ID NO:73.
<Región variable de cadena ligera de Old6>
AGATCTCTCACC6IQGACATGAGOGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGOCTTCTGC TGCTCTGGCTCCCAGGTOCCAGATGTOCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCC TCCCTGTCTGCATCTGTAOGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTC AGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCC TAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGOGTCCCATCAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCAC TTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCA,AACGTACGGT (SEQ ID NO:74)
<Región variable de cadena ligera de Old6>
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSDL AWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQFNSYPFTFGPGTKVDIKRTVAA (SEQ ID NO:75)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 13 desde el terminal 5' de SEC ID NO:74, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 399 y citosina (C) en la posición 400 desde el terminal 5' En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 129 desde el N-terminal de SEC ID NO:75, y la región constante está en y después de arginina (R) en la posición 130. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta cisteína (C) en la posición 23 desde el N-terminal de SEC ID NO:75. El N-terminal de la forma madura se consideró que es alanina (A) en la posición 24 de SEC ID NO:75
A continuación se muestra cada una de las moléculas de AON que cod ifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de 7G3, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.
<Región variable de cadena pesada de 7G3>
GTCGACCACCATGGGATGGAOCTGGATCTTTCTCTTTCTCGTGTCAGGAACT GGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTG AAGCCTGGGGCTTCAGTAAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCA
CTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGT GGATTGGAGATATTATTCCTAGCAATGGTGCCACTTTCTACAACCAGAAGTTC AAGGGCAAGGCCACTTTGACTGTGGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATGC ACCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTACAAGATCG CATTTACTGCGGGCCTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCA CTGTCTCTGC!l,GCTAGC (SEQ ID NO,76)
<Región variable de cadena pesada de 7G3>
MGWSWlFLFLVSGTGGVLS¡;;VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYY MKWVKQSHGKSLEWIGDIlPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRS SSTAYMHLNSLT
5 SEDSAYYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLYTYS!l,AS (SEQ IDNO,77)
El sitio de iniciación de la traducción del ADN de cadena pesada es un codón de ATG que comienza desde adenina (Al en la posición 16 desde el terminal 5' de SEC ID NO:76, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (Al en la posición 427 y guanina (G) en la posición 428 desde el 10 terminal 5' En la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada llega hasta el resto de alanina (Al en la posición 139 desde el N-terminal de SEC 10 NO:77, y la región conslante está en y después de alanina (Al en la posición 140. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena pesada llega hasta serina (S) en la posición 19 desde el N· terminal de SEC ID NO:77. El N-terminal de la forma madura se coosideró que es ácido glutámico (E) en la posición
15 20 de SEC ID NO:77
<Región variable de cadena ligera de 7G3>
AGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTCATGTCCCTGCTGTTCTGGG TATCTGGTACCTGTGGGGACTTTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACT GTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCTAGTCAGAGTCTG TTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTATCTGCAGAAACCAG GGCAGCCTCCTAAATTGTTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTC CCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGT TATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAA,ACGT (SEQ ID NO,78)
<Región variable de cadena ligera de 7G3>
MESQTQVLMSLLFWVSGTCGJ;1FVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSG NQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAE DLAYYYCQNDYSVPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:79)
25 El sitio de iniciación de la traducción del AON de cadena ligera es un codón de ATG que comienza desde adenina
(A) en la posición 11 desde el terminal 5' de SEC ID NO:78, y una frontera entre la región variable y la región constante del anticuerpo está situada entre adenina (A) en la posición 409 y citosina (C) en la posición 410 desde el terminal 5'. En la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, la región variable de cadena ligera llega hasta el resto de lisina (K) en la posición 133 desde el N-terminal de SEC ID NO:79, y la región constante está en y después
30 de arginina (R) en la posición 134. Mediante un software de estimación de la secuencia génica (Signal P ver. 2), se estimó que la secuencia señal de la cadena ligera llega hasta la glicina (G) en la posición 22 desde el N-terminal de SEC ID NO:79. El N-terminal de la forma madura se consideró que es ácido aspártico (O) en la posición 22 de SEC ID NO:79
35 (Preparación de anticuemos de tipo recombinantel
Las células que expresan un anticuerpo recombinante se prepararon introduciendo en una célula hospedante cada uno de los seis vectores de expresión de los anticuerpos recombinantes construidos. Como célula hospedante para la expresión, se usó HEK293F (Invitrogen)
S 10
Cada vector de expresión se introdujo en HEK293F usando 293Fectin (Invitrogen). La HEK293F se cu ltivó en condiciones de C02 al 5% y 37°C usando un agitador, y el sobrenadante de cultivo se reruperó alrededor de S dias después del cu ltivo. El sobrenadante de cultivo recuperado se sometió a purificación por afinidad usando rmp Protein A (Amersham-Pharmacia Biotech). PBS como un tampón de adsorción y 0,02 M de tampón de glicina (pH 3) como un lampón de elución, usando una columna de 0,8 x 40 cm (Bio-Rad Laboratories), y similar, dependiendo de la cantidad para la purificación. La fracción de elución se ajustó a alrededor de pH 7,2 añadiendo 1 M de Tris (pH 9,0). La disolución de anticuerpo asi preparada se sustituyó por PBS usando una membrana de diálisis (corte 10.000, Spectrum Laboratories), y se sometió a esterilización mediante filtración usando un filtro de membrana MILLEX-GV que tiene un tamaño de poros de 0,22 ~m (Mill ipore), obteniendo de ese modo un anticuerpo monoclonal humano anti-IL-3Ra purificado. La concentración del anticuerpo purificado se calculó midiendo la absorbancia a 280 nm y considerando 1 mglml como 1,4 OD.
1 S
En la Tabla 1 se muestra un resumen de las secuencias de aminoácidos y SEC ID nO de cada CDR (región determinante de la complementariedad) del anticuerpo humano
[labia 1]
Región va riable de CDR 1 cadena pesada CDR2
CDR1 CDR2 CDR3
0 ld4
TYAIS GIIPIFGIVNYAQKFQG GGGSGPDVLDI
0 ld5
TYAIS GLlPIFDIENYAQKFQG GGGSGPDVLDI
0 ld17
NFAIS GIIPIFGSTNYAQKFQG GDKYGPYYFHY
0 ld19
SYAIS GIIPIFGTANYAQKFQG GHKYGPYYFDY
New102
SYAIS EIIPIFGIVNYAQKFQG ETAVAGILGY
0 ld6
SHNMN SISSSSSYIYYADSVKG EDWGYFD
20 Ejemplo 5 Purificación de anticuerpo humano anti-IL-3Ra a partir de sobrenadante de cultivo de hibridoma
Se cultivó un hibridoma después de adaptarlo desde el medio DMEM que contiene IL-6 usado en el ejemplo 3 al medio E-RDF (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.). Se purificó un anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo. La purificación del anticuerpo se llevó a cabo según el ejemplo 4
25 Primeramente, un hibridoma que produce un anticuerpo monodonal humano anti-IL-3Rn. se adaptó a medio eROF (Kyokuto Pharmaceutical lndustrial Co., LId.) que contiene 10 nglml de IL-6 y 10% de suero fetal de ternera (FCS: SIGMA). A continuación, el hibridoma obtenido se adaptó a medio eRDF (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Lid.) que contiene insulina bovina (5 ~glml, GIBCO BRL), transferrina humana (5 ~glml, GIBCO BRL), etanolamina
30 (0,01 mM, SIGMA), selenito de sodio (2,5 x 10.5 mM, SIGMA) y 1% FCS bajo en IgG (HyClone). Este hibridoma adaptado se cultivó en un matraz, y se recuperó el sobrenadante de cultivo. El sobrenadante recuperado se sometió a filtros de 10 11m y 0,2 11m (Gelman Sciences Inc.) para eliminar articulos inútiles tales como un hibridoma y similar El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante asi recuperado mediante el mismo método como en el ejemplo 4
35 Ejemplo 6 Cálculo de constantes de asociación y de disociación usando el anticuerpo humano anti-IL-3Ra purificado
Las constantes de asociaciÓfl y de disociación del anticuerpo anti-IL-3Ru purificado se analizaron usando un analizador que se basa en el principio de resonancia de plasmones de superficie (Biacore, GE Healthcare, en lo sucesivo GE). De forma breve, se inmovilizó un anticuerpo anti-humano o anticuerpo anti-ratón sobre una punta de sensor CM5, después se le aplicó un anticuerpo humano o de ratón anti-IL-3Ro: para permitir la unión, después se le aplicó la forma soluble de la proteína IL-3Ra preparada en el ejemplo 2, y se observó la asociación y disociación usando Biacore 2000. A lo largo de todas las etapas del ensayo, se empleó básicamente el método de ensayo de GE Healthcare para el cálculo de las constantes de asociación y de disociaciÓfl
Específicamente, se usó CM5 (grado de investigación) para una punta de sensor (cada GE). En primer lugar, la punta CM5 se activó aplicando una mezcla equivalente de 400 mM de EDC (N-hidrocloruro de etil-N'-(3dimetilaminopropil)carbodiimida) y 100 mM de NHS (N -hidroxisuccinimida) a la punta de CM5. A continuación, un anticuerpo contra el anticuerpo humano unido al kit de captura de anticuerpo humano (GE) (en adelante denominado anticuerpo anti-anticuerpo humano) se diluyó con la disolución adjunta al kit y se aplicó a aquella, inmovilizando de ese mooo la cantidad requerida del anticuerpo anti-anticuerpo humano a la punta de CM5. Con respecto al anticuerpo de ratón a usar como control, un anticuerpo contra el anticuerpo de ratón unido al kit de captura de anticuerpo de ratón (GE) (en adelante denominado anticuerpo anti-anticuerpo de ratón) se diluyó con la disoluciÓfl adjunta al kit y se aplicó a aquella, inmovilizando de ese modo una cantidad necesaria del mismo a la punta de CM5. A continuación, la superficie de la punta activada se bloqueó y se inactivó aplicándole 1 M de dihodroc1oruro de etanolamina. Mediante las etapas anteriores hasta esta, se completó la preparación de una punta de sensor CM5 que puede medir la constante de disociación Ko.
A continuación, cada uno de los anticuerpos anti-1L-3Ro: se diluyó para proporciooar una concentración de 5 ).Iglml con tampón de HBS-FP (GE), una clase por celda de flujo, y se aplicó, permitiendo de ese modo que se unieran al anticuerpo anti-anticuerpo humano o al anticuerpo anti-anticuerpo de ratón inmovilizados. A continuación, se le aplicó la forma soluble de la proteína IL-3Ro.. A fin de disociar el anticuerpo anti-IL-3Ro. unido y la forma soluble de la proteína lL-3Ro:, se aplicó, en la cantidad adjunta al kit 3M de MgCl2 adjunto al kit de captura de anticuerpo humano,
o glicina-HCl de pH 1,7 adjunta al kit de captura de anticuerpo de ratón. Las etapas hasta ésta se consideraron como una etapa. Repitiendo las mismas etapas usando dos o más concentraciones de la forma soluble de la proteína lL3Ro., se obtuvieron datos para calcular las constantes de asociación y de disociación (sensograma)
La coocentración de la forma soluble de proteína lL-3Ro: humana aplicada a un sujeto se calculó como se describe en el ejemplo 2 midiendo la absorbancia a 280 nm y considerando 1 mg/ml como 1,4 OO. El peso molecular de la forma soluble de proteína IL-3Ra se calculó según lo siguiente. Con respecto al peso molecular de la proteína IL3Ra, se ha dado a conocer que comprende 360 restos de aminoácidos, tiene seis sitios de unión a la cadena de azúcar de tipo N, Y el peso molecular es 70 kDa (The Cytokine Facts Book segunda edición, Academic Press). En consecuencia, el peso molecular de la forma soluble de la proteina IL-3Ro: humana se calculó como alrededor de 63 kDa restando los pesos moleculares de los aminoácidos de la región transmembránica y de la región intracelular de 70 kDa conocido como información de referencia, y añadiendo, al valor resultante, el peso molecular de los aminoácidos de la secuencia FLAG
En el análisis, se usó el software Biaevaluation (GE), y se hizo referencia al Biaevaluation Software Handbook Específicamente, llevando a cabo el análisis simultaneo del análisis cinético, empleando básicamente el modelo de reacción de unión de Langmuir 1:1 y ajustando, se calcularon la constante de velocidad de asociaciÓfl (Ka) y la constante de velocidad de disociación (Kd), y el valor de la constante de disociación Ko se calculó mediante el cálcu lo de KdlKa.
Los resultados se muestran en la siguiente tabla 2
[Tabla 21 Ejemplo 7 Análisis del epítopo de anticuerpo humano anti·IL-3Ra humana
Nombre del anticue
Ka Kd K,
Anticue s humanos
Old4
388xl 0 5,15><10 1,33><10·
0 ld5
717xl0 4 72><10 658><10·
Old17
208xl 0 298>< 10 143>< 10·
01d19
1 54xl0 499><1 0 324>< 10·
New102
602x10 480><10 798><10·
0 ld6
171x10 215><10· 1 26><10·
Anticue uimérico
7G3
248xl0 466><1 0 1,88>< 10·
Anticue s de ratón
7G3
1 68xl0 952><10· 566>< 10·
9F5
71 3xl0 65xl0 911><10·
10702.08
416x1 0 203><10· 488><10·
AC145
766x10 426><1 0· 557><10·
(PreparaciÓf'l de célula de expresión de proteina quimérica IL~3RaJGM CSFRa)
A fin de llevar a cabo el análisis del epitopo del anticuerpo anti-IL-3Ra, se expresó en una célula una proteina quimérica en la que una porción de la región extramembránica de IL-3Ra se sustituyó por GM-CSFRa, y se ana lizó la actividad de uniÓf'l de cada anticuerpo anti-IL-3Ra frente a la célula. De forma breve, en primer lugar, la molécula de IL-3Ra y la molécula de GM-CSFRo. se dividieron en tres regiones (dominios A, B Y C desde el N-terminal mencionado anteriormente); en segundo lugar, se construyeron respectivamente vectores que expresan moléculas en las que cada uno de los dominios A, By C de la molécula de IL-3Ro. se sustituyó por el dominio correspondiente de la molécula de GM-CSFRa; en tercer lugar, aquellos se expresaron de forma forzada en célula HEK293F; yen cuarto lugar, se observó mediante citometria de flujo si cada anticuerpo anti-IL-3Ra marcado con un colorante fluorescente se une a ellos o no
¡PreparaciÓf'l de AoN plasmídico de GM-CSFRloEF6fMyc-HisC)
Se amplificó un AoNc de la cadena a del receptor GM-CSFR humano (GM-CSFRo., CD116) a partir de un AoNc derivado de bazo (CLONTECH Human MTC Panel), mediante un método de PCR usando KOo-Plus-Ver. 2 (Toyobo Co., Lid.). Como dispositivo de PGR, se usó GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Con respecto a la PGR, después de una etapa de desnaturalización a 94"C durante 2 minutos, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 9S"C 10 segundos-55°C 30 segundos-6SoC 75 segundos, 35 ciclos Los cebadores de la PCR usados fueroo los siguientes.
hC0116Fw-Mfel·
5'-GGGGAATTGGCAGCATGGTTGTGGTGGTGAGAAGCGT-3' (SEG ID NO:SO)
hC0116Rv-Notl:
5'·ATTGCGGCCGCTCAGGTAATTTCCTTCACGG-3' (SEC ID NO:S1)
Los productos de la PCR asi obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al O,S% (tampón de TAE) El AON se visualizó mediante tinción con bromuro de elidio. Se cortó una banda de aproximadamente 1,2 kb, yel AON se extrajo usando JETsorb Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, Alemania) y después se digirió con Noft y Mfel. Un ANO plasmídico de pEF6/Myc-HisC (Invitrogen) se digirió con EcoRI y Not1 . Cada AON se sometió a electroforesis en gel de agarosa al O,S%, y se cortaron bandas a alrededor de 1,2 kb Y alrededor de 6 kb, Y las moléculas de AON se extrajeron usando JETsorb Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, Alemania). Después, se mezdaron 0,5 IlJ de una disolución de ADN derivada de ADN plasmidico de pEF6fMyc-HisC y 4 IlJ de una disoluciÓf'l de ADN derivada del producto de la PCR, y se sometió a ligaciÓf'l usando el kitde ligación de TaKaRa (TAKARA BIO ING.). Con respecto a la transformación, se mezdaron una muestra de ligación y células competentes DH5 alfa y se extendieron sobre una placa de LB. La comprobación de la inserción se llevó a cabo mediante PCR directa de colonias usando LA Taq (TAKARA BIO JNC.). Coo respecto a la PCR, después de una etapa de desnaturalización a 940C durante 5 minutos, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 940C 30 segundos-55"C 30 segundos-72"C 2 minutos, 40 ciclos, y después se llevó a cabo un tratamiento a 9goC durante 30 minutos
Los cebadores de la PCR usados fueron los siguientes
hG0116Fw-Mfel:5'-GGGCAATTGCGAGCATGGTTGTGCTGGTGAGAAGCCT-3' (SEG ID NO:82)
hGo 116Rv-Notl:5'-ATTGGGGGGGGTGAGGTAATTTGCTTCACGG-3' (SEC ID NO:83)
Los productos de la PCR asi obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El ADN se visua lizó mediante tinción con bromuro de elidio. Usando una colooia a partir de la cual se obtuvo una amplificación de alrededor de 1,2 kb, se determinó una secuencia nucleolidica mediante un método de secuenciación directa. En la reacción de muestras de secuencia, se usaron BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) y GeneAmp PGR System 9700 (Applied Biosystems) (éstos se usaron en todos los análisis de secuencias de ADN en esta memoria descriptiva). Los cebadores de la PCR usados fueron los siguientes
hG0116Rv-Notl: 5'-ATTGGGGCGGGTGAGGTAATTTGCTTGAGGG-3' (SEG ID NO:85)
hGD116SeqFw1: 5'-TGAAGTGTACCTGGGGGAGG-3' (SEC ID NO:86) hC0116SeqFw2: 5'-CTGGCACGGAAMCCTACTG-3' (SEC ID NO:87)
hC0116SeqRv1 5'-CCTGAATTTGGATAAAGCAG-3' (SEC ID NO:88)
Como dispositivo analizador de las secuencias, se usó un analizador de AoN ABI 3700XL (Applied Biosystems) (éste se usó en todos los análisis de secuencias de AoN en esta memoria descriptiva). Seleccionando un clan en el cual no se encontró mutación en la secuencia de aminoácidos mediante PCR, se extrajo AoN plasmidico mediante el método Largeprep (QIAGEN)
¡Preparación de IL-3RA FLAG/pEGFP N1l
El AoNc de longitud completa de IL-3Ro: humana (C0123) amplificó mediante PCR, y se ligó una etiqueta FLAG en su dirección 3' (IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1)
El AoNc de IL-3RA se amplificó mediante un método de PCR usando como molde AoN plasmídico de hC0123/pEGFP-N1 y LA Taq (rAKARA BIO INC.). Con respecto a la PCR, después de una etapa de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos56"C 15 segundos-72°C 60 segundos, 10 ciclos, y después se llevaron a cabo 2 minutos de una reacción de alargamiento. Los cebadores de la PCR usados son los siguientes
T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEC ID NO:89)
hC0123-C-FLAG-R1 ·
5'-TCGTCATCGTCCTTGTAGTCAGTTTTCTGCACGACCTGTA-3' (SEC ID NO:90)
Usando como molde 2 111 del producto de la PCR, se llevó a cabo la amplificación mediante un método de PCR usando LA Taq (TAKARA BIO INC.). Con respecto a la PCR, tras una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos-56°C 15 segundos-72OC 60 segundos, 15 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción de alargamiento a 7'Z'C durante 2 minutos Los cebadores de la PCR usados son como siguen.
5'-CGGCAATTGCCACCATGGTCCTCCTTTGGCTCAC-3' (SEC ID NO:91)
C-FLAG-NotR2:
5'-AAAAGCGGCCGCTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTC-3' (SEC ID NO:92)
Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AoN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Se cortó una banda a alrededor de 1 kb, Y el AoN se extrajo usando Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System. Toda la cantidad del AoN extraído se digirió con Mfel y NoN y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AoN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Se cortó una banda a alrededor de 1 kb, Y el AoN se extrajo usando Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System. Después, se mezclaron 5 111 del AoNc de IL-3RA-FLAG asi extraído y 1 111 del AoN plasmid ico de pEGFP-N1 que se habia escindido con EcoRI y Notl , y se ligaron usando el kit de ligación de TaKaRa (TAKARA BIO INC.). Con respecto a la transformación, se mezclaron una mezcla de ligación y células competentes OH10B, y se extendieron en una placa de LB (que contiene kanamicina). La comprobación de la inserción se llevó a cabo mediante PCR directa de colonias usando LA Taq (TAKARA BIO INC.). Con respecto a la PCR, después de una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos-56°C 15 segundos-72OC 60 segundos, 35 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción de alargamiento a 72°C durante 2 minutos. Los cebadores de la PCR usados son como siguen
pEGFP-N1-Fw: 5'-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3' (SEC ID NO:93)
pEGFP-N1-Re: S'-TTTATGTTTCAGGTTCAGG-3' (SEC ID NO:94)
Se extrajo un AoN plasmídico mediante un método Miniprep a partir de una colonia en la que se obtuvo una amplificación de alrededor de 0,8 kb.
Se descubrió mediante un análisis de secuencia de AoN que el AoN plasmídico de IL-3RA-FLAGlpEGFP-N1 purificado no tiene una mutación causada por la PCR, y que la etiqueta de FLAG está presente en él. Los cebadores usados en el análisis de secuencia de ADN son los siguientes.
pEGFP-N1-Fw: 5'-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3' (SEC ID NO:95)
pEGFP-N1-Re: 5'-TTIATGTTICAGGTTCAGG-3' (SEC ID NO:96)
(Cartografiado de los dominios de IL-3Ral
Como resultado de la búsqueda de BLASTP (base de datos· proteinas del Protein Data Bank (pdb», la cadena alfa del receptor de IL-13 (IL-13Ra.) tuvo la puntuación más alta (POB: 3BPNC; cadena C, estructura cristalina del complejo ternario 114-114r-1I13ra). Usando el archivo de PDB bajado del Protein Dala Bank, y un software de gráficos RasMol, se visualizó la estructura tridimensional de la proteína IL-13Ra., y se dividieron tres dominios que
constituyen la región extracelular (los dominios A, B Y C mencionados anteriormente). Usando el software de Alineamiento Múltiple MUSCLE, se comparó la secuencia de aminoácidos de IL-3Ra y la secuencia de aminoácidos de IL-13Ra., y la región extracelular de la región IL-3Ra también se dividió en tres dominios. Además, GM-CSFRa y IL-3Ra se compararon de la misma manera, y la región extracelular de GM-CSFRa también se divid ió en tres dominios.
Para asignar epilopos de anticuerpos humallOs IL-3Ra humana, se prepararon proteínas en las que cada uno de los tres dominios de IL-3Ra se sustituyó uno por uno por dichos dominios de GM-CSFRa, y se expresaron en la membrana celular, y se confirmó la presencia o ausencia de unión del antigeno
Usando como molde el AON plasmídico de IL-3RA-FLAGfpEGFP-N1, la amplificación se llevó a cabo mediante un método de PCR que usa PrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase «(TAKARA BIO INC.). Con respecto a la PCR, se llevó a cabo una reacción de dos etapas a 98°C 10 segundos-68°C 6 minutos, 25 ciclos Los cebadores de la PCR usados son los siguientes.
Deficiencia del dominio A;
CD123R11pEGFPN1 : AAAGGTACCGAATTCGAAGCTTGAGCTC (SEC ID NO:97)
C0123F11 : AAAGGTACCGGGAAGCCTTGGGCAGGT (SEC ID NO:98)
Deficiencia del dominio B;
C0123R12-2: AAAGGTACCACTGTTCTCAGGGAAGAGGAT (SEC ID NO:99)
C0123F12-2: AAAGGT ACCCAGA TTGAGATATTAACTCC (SEC ID NO: 1 00)
Deficiencia del dominio C;
C0123R13: AAAGGTACCTGAAAAGACGACAAACTT (SEC ID NO:101 )
C0123F13: AAAGGTACCTCGCTGCTGATCGCGCTG (SEC ID NO:102)
El producto de la PCR asi obtenido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El ADN se visua lizó mediante tinción con bromuro de etidio. Tras confirmar la amplificación, se purificó usando Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System. El ADN así obtenido se digirió con Kpnl y Dpnl , se purificó usando Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System, y se ligó usando el kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, se mezclaron una muestra de ligación y células competentes DH10B, y se extendieron sobre una placa de LB (que contiene kanamicina). La comprobación del inserto se llevó a cabo mediante PCR directa de colonias, usando LA Taq (TAKARA BID INC.). Con respecto a la PCR, tras una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 95°C 15 segundos-560(: 15 segundos-72°C 40 segundos, 38 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción de alargamiento a 720(: durante 2 minutos. Los cebadores de la PCR usados son como siguen.
pEGFP-N1 -Fw: 5'-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA -3' (SEC ID NO:103)
pEGFP-N1-Re: 5'-TTIATGTTICAGGTTCAGG -3' (SEC ID NO:104)
El producto de la PCR así obtenido se sometió a eleclroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Se extrajo un AON plasmídico mediante el método Miniprep a partir de una colonia en la que se obtuvo una amplificación a alrededor de 1 kb.
Usando como molde el AON plasmidico de GM-CSFRfpEF6/Myc-HisC, se llevó a cabo la amplificación mediante un método de PCR que usa PrimeSTAR(R) HS ONA Polymerase (TAKARA 810 INC.). Con respecto a la PCR, se llevó a cabo una reacción de dos etapas a 98°C 10 segundos-680(: 30 segundos, 25 ciclos. Los cebadores de la PCR usados son como se expone a continuación.
Inserción del dominio A;
GM-CSFRF11 · AAAGGTACCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACA (SEC ID NO· 105)
GM-CSFRR11: AAAGGTACCTGAATTTGGATAAAGCAG (SEC ID NO:1D6)
Inserción del dominio B;
GM-CSFRF12: AAAGGTACCGGAAGGGAGGGTACCGCT (SEC ID NO:107)
GM-CSFRR12: AAAGGTACCCTTTGTGTCCAAAAGTGA (SEC ID NO:1D8)
Inserción del dominio C;
GM-CSFRF13: AAAGGTACCAAAATAGAACGATTCAAC (SEC ID NO:109)
GM-CSFRR13: AAAGGTACCAATGTACACAGAGCCGAG (SEC ID NO: 110)
El producto de la PCR así obtenido se somelió a eleclroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Tras confirmar la amplificación, se purificó usando Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System.
El AON así obtenido se digirió con Kpnl y después se purificó usando el kit de extracción en gel OIAquick (OIAGEN), se mezcló con AON plasmídico de IL-3RA-FLAGfpEGFP-N1 en el que se suprimió el dominio correspondiente (ya escindido con Kpnl y purificado), y se ligó usando kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, se mezclaron una muestra de ligación y células competentes DH10B y se extendieron sobre una placa de LB (que contiene kanamicina). La comprobación del inserto se llevó a cabo mediante PCR directa de colonias usando LA Taq (TAKARA BIO INC.). Con respecto a la PCR, Iras una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, se llevó a cabo una reacción de tres etapas a 9SOC 15 segundos-S6OC 15 segundos-72°C 40 segundos, 38 ciclos, y después se llevó a cabo una reacción de alargamiento a 720C durante 2 minutos. Los cebadores de la PCR usados son como siguen.
pEGFP-N1-Fw: 5'-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3' (SEC ID NO:111)
pEGFP-N1 -Re : 5'-TTTATGTTTCAGGTTCAGG -3' (SEC ID NO:112)
El producto de la PCR así obtenido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visualizó mediante linción con bromuro de etidio. Se extrajo un AON plasmídico mediante el método Miniprep a partir de una colonia en la que se obtuvo una amplificación a alrededor de 1 kb.
(Marcaje del anticuerpo humano anli-IL-3Ro: con colorante fluorescente)
A fin de determinar la actividad de unión de anticuerpos humanos anti-IL-3Ro: humana, cada anticuerpo humano se marcó con un colorante fluorescente AlexaFlour488 (Molecular Probe, Invitrogen). Con respecto al método de marcaje, se llevó a cabo según el manual proporcionado por Invitrogen; y con respecto a la detección, la fluorescencia se detectó mediante FL 1 de una citometría de flujo (FACS Calibur, BO Biosciences)
Especificamente, se añadió 1110 volúmenes de Na2C03 1 M a una disolución de anticuerpo disuelta en PBS. A continuación, se añadió una cantidad predetenninada de la disolución de anticuerpo descrita en el manual a un recipiente que contiene polvo de AlexaFlour488 al que se había añadido tetrafluorofenilo (TFP), y se dejó reaccionar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora mientras se agitaba. A continuación, después de que una columna de filtración en gel (NAP-10 y similar, GE Healthcare) se sustituyó suficientemente con PBS, se le añadió la disolución de anticuerpo que se hizo reaccionar con AtexaFlour488, mientras que el tampón de la disolución del anticuerpo se sustituyó por PBS. Se obtuvo una fracción de anticuerpo que mostró un color amari llo verdoso. Con respecto al anticuerpo anti-IL-3Ra humana marcado con AlexaFlour488 obtenido de la manera anterior, las absorbancias a longitudes de onda de 280 nm y 494 nm (A280 y A494, respectivamente) se midieron usando un espectr6metro, y la concentración de anticuerpo se calculó mediante la siguiente fórmula de cálculo.
Concentración de anticuerpo (mg/ml) =(A280 -A494 x 0,11 )11,4
(Análisis mediante citometría de flujo de la célula que expresa la proteína quimérica lL-3RalGM-CSFRo: usando anticuerpo anli-IL-3Ra marcado)
Para la preparación de la célula de expresión de la proteína quimérica IL-3Ra/GM-CSFRa, se usó la célula HEK293T (ATCC CRL 1268). Usando 293Fectin (Invitrogen), el AON plasmídico obtenido en lo anterior se introdujo como un vector de expresión en la HEK293T. La HEK293T a la que se le introdujo el vector de expresiÓfl se cultivó usando un agitador en condiciones de C02 al 5% y 370C después de 2 días de la introducción, y la proteína obtenida se usó para el análisis de citometría de flujo.
Se dejaron reaccionar durante 30 minutos en hielo de 100.000 a 1.000.000 células de la célula de expresión de la proteína quimérica, a una concentración de 1 Ilg/ml, con un anticuerpo humano marcado con AlexaFlour488 o un anticuerpo de ratón anti-IL-3Ra marcado con FITC comercialmente disponible (7G3 o 9F5: ambos de Bo Biosciences, 6H6: Acris Antibodies, AC145: Milteny Biotech, 10702.08: Oendritics). Para la dilución de los
anticuerpos y las células, se usó un medio de tinción (PBS de oulbecco suplementado con 2% de suero fetal bovino, 2 mM de EoTA y 0,05% de NaN3). A continuación, las células que reaccionaban con los anticuerpos se lavaron tres veces con el med io de tinción , y se confirmó med iante citometría de flujo si el anticuerpo marcado se unió o no a la célu la.
Los resultados se representan en las figuras 1 y 2. Las reacciones de los anticuerpos 7G3, 9F5, 6H6 Y AC145 desaparecieron solamente en las células que expresan una proteína en la que un dominio A se sustituyó por GMCSFRa. Por otro lado, las reacciones de los anticuerpos Old4, Old5, Old19 Y New102 desaparecieron en las células que expresan una proteína en la que el dominio B se sustituyó por GM-CSFRa. Con respecto a Old19, su reacción con las células que expresan una proteína en la que el dominio A se sustituyó por GM-CSFRa también desapareció Con respecto a Old6 y 10702.08, desapareció su reacciÓfl con células que expresan la proteína sustituida con el dominio B y el dominio C
Basándose en lo expuesto anteriormente, se mostró la posibilidad de que 7G3, 9F5, 6H6 Y AC145 reconocieron el dominio A, y Old4, Old5 Y New102 reconocieron el dominio B, Old19 reconoció el dominio A y el dominio B, y Old6 Y 10702.08 reconocieron el dominio B y el dominio C. En consecuencia, la reactividad de los diversos anticuerpos anti-IL-3Ra frente a los dominios A a C de IL-3Ra fue como en la siguiente Tabla 3
[Tabla 31
7G3
9F5 6H6 AC14S 10702.08 Old19 New102 Old4 OldS Old6 Old28
Sin sustitución
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Sustitución del dominio A
- - - - ++ - ++ ++ ++ ++ +
Sustitución del dominio B
++ ++ ++ + - - - - - - -
Sustitución del dominio e
++ ++ ++ ++ - ++ ++ ++ ++ - ++
Ejemplo 8 Análisis de la actividad bloqueadora de la señalización de IL-3 de los anticuerpos anti-IL-3Ra.
Para examinar si los anticuerpos anti-IL-3Ra así obtenidos inhiben la señalización de IL-3, se usó una estirpe celular TF-1 (oMSZ n° ACC344) que crece dependientemente de IL-3 o de GM-CSF. Específicamente, la célula TF-1 se diluyó con medio RPMI 1640 que contiene 1 nglml de IL-3 y 10% de suero fetal de temera (medio TF-1 ), y se dispensó en una placa de 96 pocillos. Además, diversos anticuerpos anti-IL-3Ra y una IgG derivada de suero humano como anticuerpo de control negativo se diluyeron con el medio TF-1, se transfirieron a la placa de 96 pocillos, y se añadieron de tal manera que la concentraciÓfl final de cada anticuerpo dio una concentración final de 10 0100 Ilg/ml. Como control, se preparó un pocillo de medio solo libre de células y un pocillo al que se añadió la célula TF-1. Después de 3 días de cultivo en un entorno de 37°C y 5% de C02, se le añadió CelltiterGlo (Promega) en una cantidad equivalente al medio. Después de 30 minutos de dejar reposar, la emisión se determinó usando un lector de placas (ARBO, Perkin Elmer).
Para la relación de inhibición del crecimiento, se llevó a cabo el siguiente cálculo
(emisión de muestra -pocillo sin células )f(pocillo al que se añadió célula TF-1 sola -pocillo sin células) x 100 (%)
Con respecto a los anticuerpos comercialmente disponibles 9F5, 6H6 Y 10702.08, se usó una columna NAP-5 con el fin de sustituir el tampón por PBS. Específicamente, se añadieron 0,5 mi de una disolución de anticuerpo a la columna NAP-5 suficientemente sustituida con PBS. Después, añadiendo 1,0 mi de PBS, se recuperó la disolución descargada de la columna. Al llevar a cabo la esterilización mediante filtración usando un filtro de membrana MILLEX-GV (Mi llipore) que tiene un tamaño de poros de 0,22 11m, se obtuvo un anticuerpo disuelto en PBS como disolvente.
Los resultados se muestran en la figura 5 Se encontró que el anticuerpo Old4, el anticuerpo Old5, el anticuerpo Old17, el anticuerpo Old19, el anticuerpo New102, el anticuerpo 9F5 y el anticuerpo 6H6 no inhiben la señalizaciórJ de IL-3, y por otro lado se encontró que el anticuerpo 7G3, el anticuerpo Old6 y el anticuerpo 10702.08 inhibieron la señalización de IL·3
Ejemplo 9 Examen de la influencia sobre la capacidad formadora de colonias usando el anticuerpo humano anti-IL-3Ra
Se llevó a cabo un ensayo de colonias para encontrar si diversos anticuerpos anti-IL-3Ra tienen efectos sobre la capacidad formadora de colonias por células precursoras hematopoyéticas.
De forma breve, se añadieron 400 células/mi de células CD34 positivas derivadas de sangre de cordón (AIICells) a un medio Methocult (Stem Cell Technologie) suplementado con eritropoyetina, IL-3, G-CSF y factor de células troncales, y se midió el número de colonias 14 días a 16 después. Las colonias se contaron dividiéndolas en una colonia del sistema de granulocitos/macrófagos (CFU-GM), una colonia del sistema eritroide (BFU-E), y colonias mixtas (CFU-Mix o CFU-GEMM). Con respecto al método de clasificación de los tipos de colonias, se usó como referencia un manual proporcionado por Stem Cell Technologie o por diversos libros de texto en hematología.
Como los anticuerpos, se usó cada uno del anticuerpo quimérico 7G3 como anticuerpo en el que se descubrió actividad bloqueadora de la señalización de IL-3 en el ejemplo 8, y el anticuerpo New102 como un anticuerpo en el que no se encontró la actividad bloqueadora.
Los resultados se muestran en la figura 6. En el ensayo de colonias en el que se añadieron eritropoyetina, IL-3, GCSF y factor de células troncales, se encontró una disminuciórJ en el número de colonias y una disminución en el tamaño de las colonias por la adición del anticuerpo 7G3 que tuvo la actividad bloqueadora de la señalización de IL
3. Por otro lado, no se encontró cambio en el número de colonias por la adiciórJ del anticuerpo New102. Basándose en este resultado, se considera que la inHuencia sobre la función hematopoyética normal es pequeña, y los efectos secundarios son pocos cuando la señalización de IL-3 no se inhibe o no se bloquea
Ejemplo 10 Efecto antitumoral en un modelo de ratón portador de tumor usando anticuerpo humano anti-IL
3Ra
El anticuerpo anti-IL-3Ra asi obtenido se administró a un modelo de ratón portador de tumor, y se examinó su efecto antitumoral. De forma breve, se transfirió una célula de leucemia a un ratórJ a través de su vena caudal, se le administró el anticuerpo al día siguiente, y alrededor de 3 semanas después, se contó el número de células leucémicas en células de médula ósea recogidas de un hueso de ratón
Específicamente, se diluyeron 0,01 mi equivalentes de antisuero anti-asialoGM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ud.) con disolución salina fisiológica, y se administró a ratón SCID (CLEA Japan Inc.) (Día -1). Al día siguiente, se transplantaron 500.000 células de la estirpe celular de leucemia mieloide aguda, MOLM13 (ATCC), a través de la vena cauda l (Día O) . Posteriormente al día siguiente (Día 1), se administraron intraperitonealmente 10 l1g del anticuerpo anti-IL-3Ru. El ratón se sacrificó en el Día 21, se recogió la médula ósea de fémures y tibias, y las células de médula ósea se tiñeron con anticuerpo anti-CD45 humano marcado con FITC y con anti-IL-3Ru marcado con PE (ambos de BO Biosciences). Específicamente, el anticuerpo se añadió a aproximadamente 1.000.000 células de la célula de médula ósea, para proporcionar una concentración final de 1 ~gfml para cada uno, y se dejó reposar en hielo durante 30 minutos a la sombra. Después, las células teñidas con el anticuerpo se lavaron 3 veces usando medio de tinción (una disolución preparada añadiendo 2% de suero fetal bovino, 0,05% de azida sódica y 2 mM de EDTA a PBS (GIBCO)), y se detectó una célula positiva para CD45 humana y positiva para IL-3Ra humana mediante una citometría de Hujo (FACSCalibur, BO Biosciences). También, en el momento de recoger la médula ósea de ratón, se contó el número de células de médula ósea usando disolución de TURK. Además, el número absoluto de las células MOLM13 contenidas en un fémur se contó añadiendo simultáneamente perlas fluorescentes cuantificadas (Flow-Count, Beckman Coulter) en el momento de la tinciÓn con anticuerpo mencionado anteriormente
Los resultados se muestran en la figura 7. Se descubrió que el número de células MOLM13 en la médula ósea de fémur en cada grupo al que se le administró anticuerpo está notablemente reducido en comparación con el grupo de vehículo al que no se le administró el anticuerpo. Este resultado muestra que el anticuerpo anti-IL-3Ra tiene posibilidades como agente terapéutico para la leucemia
Ejemplo 11 Ensayo de toxicidad de la célula que expresa IL-3Ra mediante anticuerpo anti-IL-3Ra
Para medir la citotoxicidad mediada por el anticuerpo (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, en lo sucesivo denominada ADCC), ésta se llevó a cabo en presencia de anticuerpo usando células mononucleares de sangre periférica humana (células mononucleares de sangre periférica, en lo sucesivo PBMC) como un efector
La sangre periférica se recogió de un voluntario sano, y se añadió un anticoagulante. La sangre se colocó estáticamente en Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare) de manera que no se perturbó la interfaz, y se centrifugó a
2.000 rpm durante 20 minutos usando una centrífuga grande (CF9RX, Hitachi, Ud.). La capa intermedia que contiene las células se recogió y se lavó con PBS, se eliminaron las plaquetas mediante centrifugación a 900 rpm durante 20 minutos, y las células mononucleares derivadas de sangre periférica (PBMC) se usaron como un efector
Además, tambiérJ se usó como un efector del ensayo de ADCC PBMC cultivadas toda la noche en coodiciones de 370C y 5% de C02 usando medio RPMI 1640 que cootiene 10% de suero fetal bovino al que se añadió IL-2 humana (Peprotech) hasta una concentración final de 4 ngfml (40 UI/ml o más)
En el método, de forma simple, una célula diana se culliva en presencia de un anticuerpo y PBMC, y se mide el porcentaje de lisis de la célula diana especifica mediante el anticuerpo.
Para la medida del porcentaje de lisis, se usó el siguiente ~método de ensayo de ADCC de Colon-26JhCD123". Especificamente, una célula diana se marcó con 51 Cr cultivando como célula diana la célula Colon-26 que expresa forzada mente IL-3Ra, a 37°C durante 1 hora en presencia de 5% de C02, junto con cromato de sodio marcado con un radioisótopo 51Cr (Na251Cr04, Perkin Elmer, NEZ030S). La célula diana marcada se lavó 3 veces para eliminar SlCr en exceso, y después se suspendió en el medio y se transfirió a una placa de 96 poci llos a la que se habian añadido previamente anticuerpos a diversas concentraciones. Se suspendió PBMC en el med io y se transfirió a la placa a la que se habían añadido la célula diana y los anticuerpos (relación efectorldiana = 100). Como los anticuerpos, se usó el anticuerpo anti-IL-3Ra purificado en el ejemplo 4, y como control negativo, IgG derivada de suero humano (SIGMA). Como diversos controles, se preparó un pocillo del medio y célula diana solos, un pocillo de PBMC y célula diana solas, y un poci llo suplementado con Triton-X La placa de 96 pocillos llena de disoluciones mixtas se cultivó a 37°C durante 4 horas en presencia de 5% de C02.
Tras centrifugar la placa, se transfirieron 50 ¡.tI de cada sobrenadante a una placa de 96 pocillos que contiene líquido de centelleo (Lumaplate-TM, Perkin Elmer), y se secó a 56°C durante 2 hOfas. La placa se cerró herméticamente (TopSeal-A, Packard) y se midió usando un lector de microplacas (TopCount, Perkin Elmer).
Con respecto al porcentaje de lisis de la célula diana, se midió la cantidad de S1Cr en el cromato de sodio liberada al medio debido a la lisis de las células. Esto es, el ~porcentaje de lisis específica" se calculó dividiendo un valor obtenido restando el valor de un poci llo al que no se había añadido el anticuerpo del valor de cada pocillo, entre un valor obtenido restando el valor de un pocillo al que no se había añadido el anticuerpo del valor de un pocillo al que se añadió Triton-X (el porcentaje de lisis específica se ajusta a 100%)
Los resultados se muestran en las figura 8 y figura 9. En cada uno de los anticuerpos anti-IL-3Ra, se encontró que la actividad de ADCC para la célula diana depende de la concentración. También, estos anticuerpos mostraron una mayOf actividad de ADCC que el anticuerpo quimérico 7G3 como control. Esto muestra que el anticuerpo anti-IL-3Ra presenta actividad de ADCC elevada para células que expresan IL-3Ra, y tiene una posibilidad de un tratamiento en el que la eficacia farmacéutica es la eliminación de las células positivas a IL-3Ra
Ejemplo 12 Ensayo de afinidad de ant icuerpo anti-IL-3Ra frente a proteína IL-3Ra de mono
Con respecto a la presencia o ausencia de unión del anticuerpo anti-IL-3Ra humana así obtenido frente a IL-3Ra de mono, se analizó, usando citometría de flujo, si el anticuerpo anti-IL-3Ra humana preparado en el ejemplo 7 se une
o no a la célula que expresa forzadamente IL-3Ra de Macaca fascicularis preparada en el ejemplo 1
Específicamente, 2 x 105 células de la célula L929 que expresa de forma forzada IL-3Ra de mono se dejaron reaccionar con 100 ¡.tI de manera que una concentración final de 10 ¡.tg/ml, del anticuerpo anti-IL-3Ra humana a 4°C durante 30 minutos. Los anticuerpos usados son anticuerpo IgG1 humano anti-dinitrofenol (DNP) (fabricado por esta firma) como control negativo, y los anticuerpos OId4, Old5, Old17, Old19, New102 y el anticuerpo quimérico 7G3 Después, se lavó 3 veces usando un medio de tinción (PBS de Dulbecco suplementado con 2% de suero fetal bovino, 2 mM de EDTA y 0,05% de NaN 3). A continuación, se dejó que un anticuerpo específico de la cadena A antianticuerpo humano marcado con PE (Southem Bio) reaccionara en el medio de tinción a una concentración final de 1 ¡.tg/ml, y se lavó 3 veces con el medio de tinción de la misma manera. Finalmente, las células se mezclaron con el medio de tinción, y se analizó mediante citometría de flujo la presencia o ausencia de PE positivo.
Los resultados se muestran en la figura 10. Se encontró que los anticuerpos humanos anti-IL-3Ra humana, Old4, Old5, Old17, Old19, New102 y anticuerpos quiméricos 7G3, reaccionan con la IL-3Ra de Macaca fascicularis
Ejemplo 13 Análisis detallado del epíto po de anticuerpos humanos anti-IL-3Ra. humana
(Preparación de célula que expresa la proteína quimérica IL-3RalGM-CSFRal A fin de llevar a cabo un análisis detallado adicional del epítopo de anticuerpos anti-IL-3Ra, se expresó en una célula una proteína quimérica en la que una región más pequeña que el dominio de región extramembránica de IL-3Ru se sustituyó por GM-CSFRu, y se analizó la afinidad de cada anticuerpo anti -IL-3Ro. por la célula. De forma breve, en primer lugar, se determinó una región que se consideró que estaba situada en el exterior en base a una predicción de la estructura tridimensional de la molécula de IL-3Ra; en segundo lugar, se construyeron respectivamente los vectores que expresan moléculas de IL-3Ra en las que la región pequeña se sustituyó por GM-CSFRa; en tercer lugar, se expresaron de forma forzada en la célu la HEK293F; yen cuarto lugar, se observó mediante citometría de flujo si cada anticuerpo anti-IL-3Ra marcado con colorante fluorescente se une o no a aquella
(Cartografiado de los dominios de IL-3Ral
Entre los 3 dominios divididos según el ejemplo 7, se selecciooaron y se analizaron con detalle los dominios A y S que fueron reconocidos por los anticuerpos obtenidos Old19 y New102. En base a la estructura tridimensional de la cadena alfa del receptor de IL-4 (IL-4Ra, C0124) (POS: 3SPNC; cadena C, estructura cristalina del complejo ternario 114-114r-1I3ra), la estructura tridimensional de IL-3Ra se sometió a modelado de homologia usando SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.orgIfSWISS-MOOEL.html). La estructura predicha de la proteína tL-3Ru se visualizó usando un software gráfico RasMoI (hllp:ffrasmol.org/), y se determinaron 7 regiones que se coosideró que estaban situadas en la región de aminoácidos extracelular de la molécula de IL-3Ru (figura 4).
A fin de especificar el epítopo del anticuerpo humano anti-IL-3Ra humana, se preparó y se expresó en la membrana celular una proteína en la que las regiones correspondientes de GM-CSFRa sustituyeroo a las 6 regiones de IL-3Ra divididas como se describe en lo anterior, y se determinó la presencia o ausencia de la unión de los anticuerpos.
Usando como molde el ANO plasmídico de IL-3RA-Flag/pEGFP-N1 , se llevó a cabo la amplificación mediante un método de PCR que usa PrimeSTAR(R) HS DNA polymerase (TAKARASIO INC.). Con respecto a la PCR, se llevó a cabo una reacción de dos etapas a 98°C 10 segundos-68OC 5 minutos, 25 ciclos Los cebadores de la PCR usados son los siguientes.
Deficiencia de la Región 1,
C0123-Fw21 · CGTGGAACCCGCAGTGAACAATAGCTATI (SEC ID NO:149) C0123-Re21 · ACTCTGTTCTTTTTAACACACTCGATATCG (SEC ID NO:150)
Deficiencia de la Región 3;
C0123-Fw22: CTTIATCCAAA T AACAGTGGGAAGCCTTG (SEC ID NO:151) C0123-Re22: CAGTTICTGTTGGAATGGTGGGTTGGCCACT (SEC ID NO:152)
Deficiencia de la Región 4;
C0123-Fw23: AGGGAGGGTACCGGTGCGGAGAATCTGACCTGCT (SEC ID NO:153)
C0123-Re23: TCCTGAATTIGGATAGAAGAGGATCCACGTGG (SEC ID NO:154)
Deficiencia de la Región 5;
C0123-Fw24: GGTCCGACGGCCCCCGCGGACGTCCAGTA (SEC ID NO: 155)
C0123-Re24 : CCTCGCCCAGGTACAGCTCMGAAATCCACGT (SEC ID NO:156)
Deficiencia de la Región 6;
C0123-Fw25: ACGGMCCAGCGCAGCCTICGGTATCCCCT (SEC ID NO:157)
C0123-Re25: TAACCAGAAAGTGGGAACTTIGAGAACC (SEC ID NO:158)
Deficiencia de la Región 7;
C0123-Fw26: TCTTIGATTCATTTGTCGTCTTTTCACA (SEC ID NO:159)
C0123-Re26: ATTGGATGCCGMGGCTGCGCTCCTGCCC (SEC ID NO:160)
El producto de la PCR asi obtenido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (135 V, 15 minutos, tampón de TAE). El AON se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Tras confirmar la amplificación, la purificación se llevó a cabo usando Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System. El ADN así obtenido se sometió a
fosforilación usando polinucleótido cinasa (New England Biolabs) y a precipitación con etanol, y después una parte del mismo se dejó reaccionar usando el kit de ligación de TaKaRa. Con respecto a la transformación, se mezclaron una muestra de ligación y célula competente DH10B, y se extendieron sobre una placa de LB (que contiene kanamicina). Se extrajo un AON plasmídico a partir de la colonia así obtenida mediante el método Miniprep y se digirió con Xhol y Notl , y se verificó el inserto
(Análisis mediante citometria de flujo de la célula que expresa la proteina quimérica IL·3RcúGM-CSFRa usando anticuerpo anti-IL-3Ra marcado)
En la preparación de la célula que expresa la proteína quimérica IL·3RalGM-CSFRa se usó la célula HEK293T. El AON plasmíd ico obten ido en lo anterior se introdujo en un vector de expresión en la HEK293T. La HEK293T con el vector de expresión introducido se cultivó en un entorno de 5% de C02 y 37OC, y se usó en el análisis de citometría de flujo 2 días después de la introducción
Cada uno de los anticuerpos humanos marcados con Alexa Flour488 o anticuerpos de ratón anti-IL-3Ra marcados con FITC comercialmente disponibles (7G3 y 9F5: ambos disponibles de BO Biosciences, 6H6: de Acris Antibodies), a una concentración de 1 f.lg/ml, se dejó reaccionar durante 30 minutos en hielo con 10.000 a 1.000.000 células de la célula que expresa la proteína quimérica. Para diluir los anticuerpos y las células, se usó un medio de tinción (PBS de Oulbecco que cootiene 2% de suero fetal de ternera, 2 mM de EOTA y 0,05% de NaN3). A continuación, las células que reaccionaron con cada anticuerpo se lavaron 3 veces con el medio de tinción, y se confirmó mediante citometría de flujo si el anticuerpo marcado se unió o no a las células
Los resu ltados se muestran en la figura 3. La reacción del anticuerpo c7G3 desapareció solamente en el caso de la célula que expresa la proteína en la que la región 1 se sustituyó por GM-CSFRa. La reacción del Old19 desapareció en el caso de la célula que expresa la proteína en la que la región 3 y la región 4 en el dominio A, y la región 6 y la región 7 en el dominio B, se sustituyeron por GM-CSFRa. La reacción del New102 desapareció en el caso de la célula que expresa la proteína en la que la región 6 y la región 7 del dominio B se sustituyó por GM-CSFRa
Basándose en lo expuesto anteriormente, se demostró la posibilidad de que el anticuerpo Old19 reconoció las regiones 3 y 4 del dominio A y las regiones 6 y 7 del dominio B, y que el anticuerpo New102 recoooció las regiooes 6 y 7 del dominio B Los resultados anteriores se resumen como la Tabla 4
[Tabla 41
Aplicabilidad industrial
Según la invención, se proporciona un anticuerpo contra la proteína IL-3Ra humana (otro nombre· C0123 humana) y un agente terapéutico y un agente de diagnóstico para tumores malignos mielocíticos, particularmente leucemia mieloide aguda (AML), que comprende un anticuerpo anti-IL-3Ra humana como principio activo
Texto libre de listado de secuencias
SEC ID NO . 3 . cebador IL-3Ra_Fw SEC ID NO . 4 . cebador IL-3Ra_Re SEC ID NO . 5 . cebador IL-3Ra_seqF1
SEC ID NO . 6 . Inserto (Mfel de No!l)
SEC ID NO · 7 · cebador Rhe123Fw1 SEC ID NO . 8 . cebador Rhe123Rv1 SEC ID NO . 9 . cebador T7
SEC ID NO . 10 . cebador SP6 SEC ID NO . 11 . Inserto (Me" a Notl) de IL-3Ra de Macaca fascicularis SEC ID NO . 12 . Inserto (Me" a Notl) de IL-3Ra de Macaca mulatta SEC ID NO 13 cebador hIL-3Rusol-FLAG-Notl SEC ID NO . 14: Inserto (Me" a Not1) SEC ID NO . 15 . cebador hh-6 SEC ID NO . 16 . cebador hh-3 SEC ID NO . 17 . cebador hh-4 SEC ID NO · 18 . cebador Fw específico de la cadena pesada de Old4 SEC ID NO · 19: cebador Rv específico de la cadena pesada de Old4 SEC ID NO 20 cebador Fw específico de la cadena pesada de Old5 SEC ID NO . 21 · cebador Rv específico de la cadena pesada de Old5 SEC ID NO · 22 · cebador Fw específico de la cadena pesada de Old 17 SEC ID NO · 23 · cebador Rv específico de la cadena pesada de Old 17 SEC ID NO · 24 · cebador Fw específico de la cadena pesada de Old 19 SEC ID NO 25 cebador Rv específico de la cadena pesada de Old 1 9 SEC ID NO . 26 · cebador Fw específico de la cadena pesada de New102 SEC ID NO · 27 · cebador Rv específico de la cadena pesada de New102 SEC ID NO · 28 · cebador Fw específico de la cadena pesada de Old6 SEC ID NO . 29 · cebador Rv específico de la cadena pesada de Old6 SEC ID NO : 30 : cebador mH_Rv1 SEC ID NO · 31 · cebador mH Rv2 SEC ID NO . 32 · cebador Fwespecífico de la cadena pesada de 7G3 SEC ID NO · 33 · cebador Rv específico de la cadena pesada de 7G3 SEC ID NO . 34 . cebador hk-2 SEC ID NO · 35 · cebador hk-6 SEC ID NO . 36 · cebador Fw específico de la cadena ligera de Old4 SEC ID NO · 37 · cebador Rv especifico de la cadena ligera de Old4 SEC ID NO · 38 · cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old5 SEC ID NO . 39 · cebador Rv específico de la cadena ligera de Old5 SEC ID NO : 40 : cebador Fw específico de la cadena ligera de Old 17 SEC ID NO . 41 · cebador Rv específico de la cadena ligera de Old17 SEC ID NO · 42 · cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old19 SEC ID NO · 43 · cebador Rv especifico de la cadena ligera de Old1 9 SEC ID NO . 44 · cebador Fw específico de la cadena ligera de New102 SEC ID NO . 45 · cebador Rv específico de la cadena ligera de New102 SEC ID NO · 46 · cebador Fw especifico de la cadena ligera de Old6 SEC ID NO . 47 · cebador Rv específico de la cadena ligera de Old6 SEC ID ND :48 : cebador mK_Rv1 SEC ID NO . 49 . cebador mK Rv2 SEC ID NO . 50 · cebador Fwespecífico de la cadena ligera de 7G3 SEC ID NO · 51 · cebador Rv especifico de la cadena ligera de 7G3 SEC ID NO 80 cebador hCD116Fw-Mfel SEC ID NO. 81 · cebador hCD116Rv-Notl SEC ID NO · 82 · cebador hCD116Fw-Mfel SEC ID NO · 83 · cebador hCD116Rv-Notl SEC ID NO . 84 · cebador hCD116Fw-Mfel SEC ID NO 85 cebador hCD116Rv-Notl SEC ID NO . 86 · cebador hCD116SeqFw1 SEC ID NO · 87 · cebador hCD116SeqFw2 SEC ID NO · 88 · cebador hCD116SeqRv1 SEC ID NO . 89 . cebadorT7 SEC ID NO · 90 · cebador hCD123-C-FLAG-R1 SEC ID NO . 91 . cebador IL-3Ra Fw SEC ID NO: 92 . cebador C-FLAG-NotR2 SEC ID NO . 93 · cebador pEGFP-N1-Fw SEC ID NO · 94 · cebador pEGFP-N1 -Re SEC ID NO : 95 : cebador pEGFP-N1-Fw SEC ID NO · 96 · cebador pEGFP-N1 -Re SEC ID NO . 97 . cebador CD123R11 pEGFPN1 SEC ID NO: 98 . cebador CD123F11 SEC ID NO · 99 · cebador CD123R12-2 SEC ID NO · 100 . cebador CD123F12-2 SEC ID NO . 101 . cebador CD123R13 SEC ID NO · 102 · cebador CD123F13
SEC ID NO · 103 · cebador pEGFP-N1-Fw SEC ID NO · 104 · cebador -N1 -Re SEC ID NO · 105 · cebador GM-CSFRF11 SEC ID NO: 106 . cebador GM-CSFRR11 SEC ID NO : 107 : cebador GM-CSFRF 12 SEC ID NO · 108 · cebador GM-CSFRR12 SEC ID NO . 109 · cebador GM-CSFRF13 SECIDNO . 110 · cebador GM-CSFRR13 SEC ID NO · 111 · cebador pEGFP-N1 -Fw
SEC ID NO . 112 . cebador pEGFP-N1-Re SEC ID NO · 149 · cebador CD 123-Fw21 SEC ID NO: 150 cebador CD123-Re21 SEC ID NO . 151 . cebador CD123-Fw22
5 SEC ID NO . 152 . cebador CD123-Re22 SEC ID NO· 153 · cebador CD123-Fw23 SEC ID NO· 154 · cebador CD123-Re23 SEC ID NO 155 cebador CD123-Fw24 SEC ID NO . 156 . cebador CD 123-Re24
10 SEC ID NO· 157 · cebador CD 123-Fw25 SEC ID NO . 158 . cebador CD123-Re25 SEC ID NO: 159 . cebador CD123-Fw26 SEC ID NO : 160 : cebador CD123-Re26
15 Listado de secuencias
<110> Kyowa Hakko Krin Co., LId
<120> Anticuerpo anti-IL-3R\203 para el tratamiento de tumores de la sangre
<130> 1001P12041
<150> US 611172923
<151> 2009-04-27
<160> 160
<170> Patentln version 3.3
30 <210> 1
<211> 378
<212> PRT
<213> Horno sapiens
35 <400> 1
Met val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu 1 5 10 15
Leu eln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arq Met 20 25 30
Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arq Asn Val Thr 35 40 45
Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala val Asn 50 55 60
Asn Se r Tyr Cys Gln Phe G1y Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn 65 70 75 80
Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Ph. Sel: Thr Trp Ile Leu Phe SS .0 95
Pro Glu A$n Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Al~. Glu un Lo. Thr Cys 100 105 llO
Trp Ila Bis Asp Val Aap Phe Leu Ser Cys Sel: Trp Ala Val Gly Pro llS 120 125
Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyl: Leu Alln Val Ala Asn 130 135 140
Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cya Leu His Tyr Lyll Thr Aap Ala Gln Gl, 145 150 l5!' 160
Thr Arg Ile Gly Cya Arg Phe Asp Asp Ile Sel: Arg Leu Ser Ser GIl' 165 170 175
Ser Gln Ser Ser H~s lle Leu Val Arg GIl' Ar~J Ser Al.a Al.a Phe GIl' 180 185 190
lle Pro Cya Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Sel~ Gln Ile Glu Ile Leu 195 200 205
Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys eys Asn Ly~. Thr Kis Ser Phe Met 210 215 220
Kis Trp Lys Met Arq Ser His Phe Asn Arq Ly!, Phe Arg Tyr Glu Leu 225 230 23!:¡ 240
Gln Ile Gln Lys Arg Het Gln Pro Val n. Thl~ Glu Gln Val Arg Asp 245 250 255
Arg Thr Ser Ph. Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr V.l Gln Ile 260 265 270
Glu Arg Val Tyr Glu ph. Leu SeJ~ Ala Trp 280 285
Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Al,l Asn Thr Al:g Ala T.tp 290 295 300
Arg Thr Ser Leu Leu lle Ala Leu GIl' Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys 305 310 315 320
Val Ph. Val 110 Cys Arg Arg Tyr Leu Vd He!: Gln Arg Leu Phe Pro 325 330 335
Al:g lle Pro His Het Lys Asp Pro 11e GIl' Asp Ser Phe Gln Asn Asp 340 345 350
Lys Leu Val Val Trp Glu Ala aly Lya Ala Gly Leu Glu Glu Cya LeU JS5 J60 365
Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lya Thr J70 375
<210> 2
<211> 308 5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 2 Met Val Leu Leu T~ Leu Thr Leu Leu Leu Ila A1a Lau Pro Cys Leu 1 5 10 15
Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Aan Leu Arg Met 20 25 30
LV. Ala Lyll! Al. Gln Gln Leu Th:r Trp A.p Leu Asn Arq Aan Val Thr 35 40 45
Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Va l Aan 50 55 60
Asn Se r Tyr Cya aln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Olu Val Thr Asn 6S 70 7S 80
Tyr Thr Val Arg val Al. Asn Pro Pro Ph. Ser Thr Trp Ila Leu Phe 85 90 95
Pro Glu As n Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys 100 lOS 110
Trp Ile Bis Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro 115 120 125
Gly Al. Pro Al. Asp Va l aln Ty:r: Asp Leu Ty.r:: Leu Asn val Ala Aan 130 135 140
Azg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu Hia Tyr Lya Thr Asp Ala aln aly 145 ISO 155 160
Thr Arg Il~ Gly eys Arg Ph~ Aap A3p Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly 165 170 175
Ser Gln Ser Ser Mili! Ile Leu Va l Arg a1y Arg Ser Ala Al. Phe Gly 180 18S 190
Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Va l Phe Se.r:: Gln Ile alu Ile Lau 19~ 200 20S
Thr pro pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met 210 215 220
His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu 225 230 23~ 240
Gln 11e Gln Lys Arq Met Gln PrQ Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp 245 250 255
Axg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile 260 265 270
Arg
~a Arg Glu Arq Val Tyr 275 Glu 280
Gln Arq Phe Glu Cys Asp Gln Glu 290 295
Arq Thr Ser Leu 305
5
<210>3 <211>34 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> cebador IL·3RA Fw
15 20
<400> 3 cggcaattgc caccalgglc clccttlggc Icac <210> 4 <211>31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> IL-3RA_Re
25
<400> 4 attgcggccg ctcaagtttt clgcacgacc I
30
<210> 5 <211>20 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador IL-3RA_seqF1
35
<400> 5 glcttcacla caaaacggal
40
<210>6 <211> 1156 <212> ADN <213> Artificial
45
<220> <223> secuencia de inserto
Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro 285
Glu Gly Ala Asn Thr Arq Ala Trp
<400> 6 caattgccac catggtcctc ctt tggc t c a
cqctgctcct gatcgccc tg ceetgtc tce .0
tgcaaae gaa ggaaga t e e a
aaeee.accaa teaeqaacct a.agq.atg.a.a.a geaaagge t e 120
agcagttgae etgqqacctt aacagaaatg tgaccgatat cqaqtgtgtt IIlIlIqacqccg
180
a etatt ctllt gccgqcllqtg aacaatagct .attgcc.agtt
tggllgcaatt tccttatqtq 240
aagtgaccaa etacaccgtc cgaqtggc ca
acccaccatt etee aegtgg atcetettcc 300
ctgagaacag tqggaagcet
tgggcagqtg cggagaatct gacc t qc t qg IIt tcatgaeq 360
t qqatttett gagctgcagc tgggcggtag gcceqqg99c
eecegeqqac qtccagtacg 420
acetgtaett gaacgttqcc aacaqgcqtc aacagtacga gtgtctteac
tacaaaaegq 480
atgctcaggq aacacgtatc qqgtgtcgtt tcqatqacat ctetcqaetc: tccaqcgqtt
540
cteaaaqttc ceacatcctg qtqcgqqqca ggagc9cll9c
cttcqgtatc ccctqcacaq .00
atllagtttgt cgtcttttca cagattgaga t attaac tcc
aeecaacatg IIctqcaaaqt 660
gtllat aagac acattccttt atqcactgqa aaatqa 9aaq
tcattt caat cqcaaatttc 720
qctatgaqct tcagatacaa aagaqaatgc aqcctgtaat cacagaacaq gtcaq.agaca
780
qaacctcctt ccaqctact c
aatcctqgaa cqtacacaqt acaaataaqa qcccgqqaaa 840
qaqtgtatga
attcttqage gcetggaqca ceccccagcq cttcqaqtqc qaccaggaqg .00
agqqcgcaaa cacacqtgcc tqgcggacqt cgctgctgat cgcgctgggg acgctgctqq
••0
ccctqgtctg tqtettcqtq atctgcagaa
ggtatctggt gatgcagaqa ctctt tcccc 1020
gcatccctca catgaallgae cccatcggtg acagettcca aaacgacaaq ctggtggtct
1080
qqgaqgcqqq caaagccggc ctggaggagt qtctggtgac tgaagtacaq gtcqtgcaga
1140
5 10
aaactt qaqc qgccqc <210>7 <211>38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador Rhe123 Fw1 :1156
15
<400> 7 cggcaattgc caccatgacc ctcctttggc tgacgctg 3B
20
<210> 8 <211>38 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rhe123Rv1
25
<400> 8 tatattgcgg ccgctcaagt ttLctccacc acctgcac 3B
30
<210> 9 <211>20 <212> ADN <213> Artificial
<220>
5B
<223> cebador T7
<400> 9 taatacgact cactataggg 20 5
<210> 10
<211> 19
<212> AON
<213> Artificia l
<220>
<223> cebador SP6
<400> 10 15 gatttaggtg acactatag 19
<210>11
<211> 1156
<212> AON 20 <213> Artificia l
<220>
<223> secuencia de inserto 25 <400> 11 caattgccac catgacc::ctc ctttqqctga cgctqctcct qqtcqccacg ccctqtctcc 60 tgcaaacgaa ggaggatcc:a aatqcaccaa tcagqaatct aaqqatgaaa gallaaggctc >20 agea!}ttgat gtgggacctg aac::agaaacg tgaccgacqt ggaqtqtatc aaaggeaceg 1SO actattctat gccqgcaatg aacaacagct attgccagtt cggagccatt tccttatgtg 240 aagtgaccaa ctacaccgtc cgagtggcca gtcccccgtt ctccacgtgq atcctcttcc 300 ctgagaacaq tqqqacgcct cagqcaqqcq cqgagaatct gacctqctgq gttcatgacg 360 tggatttett gagctgcagc tgqgtggcag gcccggcqgc ccccgctgac qtccaqtacg 420 acctqtactt gaacaatccc aaclI.gccacq II.lI.caqtaca q qtqccttcac t ll.caaaacqg 4" atgctcc¡qgq lI.acacagatc ggqtgtcggt tcqatqa cat eqctegactc tcccqcqqtt 540 ctcaaagttc ccaeatcctg gtga.qgqqca qqa.gcqcagc eqtcaqtatc ccctqcacaq '00 ataaqtttgt cttcttttca c:agattqaga. qa.ttaactcc acccaacatq aetqgaqaqt "O qtll.lI.tgagac acattccttc atgcactgga aaatgaaaaq tcatttcaat cgcaaattee 720 getatgaqct tcgqatceaa aagagaatge aqcctqtaaq gaeagaaeag gteagagaca 780 eaacctcett ccagctacee aatcctqqaa eqtaeacaqt gcaall.taaga geeeqqqaaa 840 caqtgtatga attcttgagt qcctggaqca eeeeeeagcq cttegaqtgc ga.cea.gga.qg '00 aggqcgcgag ctegcgtgc:c: tggc:gqacgt egctgetgat egcqctqqgq {!Iegetgetgg .60 ccttqetetq tqtqttcctc atctgclI.gaa qqtatctqqt qatgeagagg ctgtttcccc 1020 gcatcceaca catgaaagac eccatcggtg acaccttcca aca.qqacaaq ctqqtgqtct 1080
gqgll.gqcqgg caaagccggc ctggagqagt
aaacttqaqc ggccgc
<2 10> 12
<211> 1156
<212> AON
<213> Artificial
qtctqgt~c t911.agtqcaq gtqqtgqaga 1140 1156
<220>
<223> secuencia de inserto 5 <400> 12 c.aattgccac e.atgaeccte etttqqctga cqetgeteet gqtcgccacg cectqtctcc 60 t<¡caaaecaa qqaqqatcca aatqcaccoa tcaqqaatet aaqqatqaaa gaaaaggctc 120 aqcagttqat gtggqacctljJ aacaqaaacg tqaccgacgt ggagtgtatc aaaggcaccq 180 actattctat gecggcaatg aacqacagct .attgccagtt cqgagccatt tccttatqtg 240 aagtgaccaa ctacaccgtc cgagtqgcca gtcctccgtt c:tc:c:acgtqq atcct.cttcc 300 ctgaqaacag tgqqacqcct cqqqcaqqcq cgqaq.aattt ;acctqctgq qttcatqacq 360 tggatttctt qaqc:tgcagc tgggtggtag gcccqqcqqc c:cccqctqac gt.cc:agtac:q .20 ac:ctgtactt qaacaatccc aacac¡cc.acc¡ .aacagtacaq qtqccttcqc tac.aaaacqq 480 atqctcqqqg' aaCacag'atc g'qgtgtcqqt tcgatgacat cgctcgac:tc tcccqcggtt 540 ctcaaagttc cc:acatc:c:tq gtqaqgqqc:a ggaqc:gc.aqc c:gtc.agtatc ccctqc:acaq 600 ataaqtttgt cttcttttca cagattg.aga qatta.ac:tcc accc.aac.atg actqgag.aqt 660 gtaatgagac acattccttc atgcactgga aaatgaa.aaq tcatttcaat cgcaaattcc 720 actatgaqet tcqq.atccaa a.ag.a~aatgc aqcctgt.aag 9.aca9a.acag qtcagagaca 780 ca.acctcett c:cagetacc:c: a.atcctqqaa cqtac.ac.aqt gcaaataaqa gcccqqgaaa 840 eagtgtatg.a attcttgagt qcctqqaqca. CCCCCCllqCq cttcqa.qtqc gllcca.qgaqq 900 agqgcgCqag ctcqcqtqcc tqqcqgacgt cqetgctqat cqcqctgqgg aegetqetgg 960 ecttgctetg tqtgttcctc atctqcaqaa qgtatctqqt g.atqcaqaqg ctgtttcccc 1020 gcatcccacll catgaaaqac cccatcggtg acaccttcca. acaqqacaaq ctggtqqtct 1080 qqqaqgclNq caaaqccgqc ctqqaggaqt. gtetqgtgtc tqaagtqcaq gtqqtqqaga 1140 aa.aettqage <¡<¡cege 1156
<210> 13
<211> 58 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador hIL-3RAsol-FLAG-Noll
<400> 13 attgcggccg ctcacttatc gtcgtcatcc ttglaglccc gccaggcacg tglgtttg 58
<210> 14 20 <211> 961
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 25 <223> secuencia de inserto
<400> 14
cllllttqccllc clltqqtc:ctc ctttggctC:lI cgctgctcct glltcgccctg c:cctgtctcc
60
tqCll.lIlIcgll.lI. 9"gllllqlltCCll. lIlICCCllccall. tCll.cgll.lI.cct Illlggllt gllll.lI gCllll.lI.9gctc
120
ilqCll.qttgllC ctgggacctt ilacll.gaaatg tgaccgll.tat cgll.qtgtqtt lIlIa9acgccg
180
actattc tllt qccggcllgtg allcaatagct attqccagtt tqgagcaatt tccttlltqtg
2'0
aagtgacc:aa c:tac:ac:c:qtc: cgaqtggc:c:a acccacc:att
ctCC&cqtgg lItCCtCttcc JOO
ctgllqaacag tggqaagcct tgggcagqtg cggagalltct gacctqctgq attcatgllcg
3 60
tgqllt ttc:tt gllgc:tgc:agc tgqgc:gqtag gcccgggggc cc:cc:gc:ggac
gtccaqtacg .20
lICCtqtllCtt gallcqttqcc lIlIcllqqcqtc .... c.gt. cg. gtgtcttcac
tacilllllacqq 480
atgctcagqq aacacgtatc gggtgtcgtt tcqatgacat ctctcqll.ctc tccagcgqtt
540
ctca••qttc cc.catc:ctg qtgcg99gca
ggagc9ca9c cttcqqtatc c:cctgcacag 600
ataaqtttqt cgtcttttca cagattg. ga tattll.lI.ctcc
lI.ccc.acatg actgcaaaqt 660
qtaataaqac
a cattccttt atqcactgga aaatqaqaaq tcatttcaat cqcaaatttc 720
qctatgaqct tcaqatacall. aaqaqaatqc aqcctqtaat
cacaqaacag gtcagaqaca 7.0
qaacctcctt cCll.qctactc .atcctqqaa cqtll.cll.cagt
aCll.lI.ataa9a 9ccc99qaaa 840
gaqtqtatga attcttgagc lI.gqgcgcaaa cacacgtgcc e
<210> 15 5 <211>27
<212> AON
<213> Artificial
<220> 10 <223> cebador hh-6
<400> 15
gcctggaqca cccc cc.llqcg
cttcgaqtqc g accag9a9q .00
t gqcggqact acaagqatgll-cqacgatall.q tqll.qcgqccq
"O
'"
ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27
15 <210> 16 <211>26
<212> AON
<213> Artificia l
20 <220>
<223> cebador hh-3
<400> 16
glgcacgccg clgglcaggg cgcclg 26 25
<210> 17 <211>23
<212> AON
<213> Artificia l
<220>
<223> cebador hh-4
<400> 17 35 gglgccaggg ggaagaccga 199 23
<210> 18
<211>49 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de Old4
<400> 18 agagagagag gtcgaccacc atggactgga cctggaggtt cctctttgt
49
<210> 19 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de Old4
<400> 19 agagagagag gctagctgaa gagacggtga ccattgtccc
40
<210> 20 <211>49 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de Old5
<400> 20 agagagagag gtcgaccacc atggactgga cctggaggtt cctctttgt
49
<210> 21 <211>40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de Old5
<400> 21 agagagagag gctagctgaa gagacggtga ccattgtccc
40
<210> 22 <211 > 49 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de Old17
<400> 22 agagagagag gtcgaccacc atggactgga cctggaggtt cctctttgt
49
<210> 23 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de Old 17
<400> 23 agagagagag gctagctgag gagacggtga caagggttcc c
41
<210> 24
62
<211>49 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de Old19
<400> 24 agagagagag gtcgaccacc atggactgga cctggaggtt cctctttgt
49
<210> 25 <211>39 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de Old19
<400> 25 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggttc
39
<210> 26 <211>49 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de New102
<400> 26 agagagagag gtcgaccacc atggactgga cctggaggtt cctctttgt
49
<210> 27 <211> 38 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de New102
<400> 27 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggtt
38
<210>28 <211 > 41 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de Old6
<400> 28 agagagagag gtcgacccac catggaactg gggctccgct 9
41
<210> 29 <211>39 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de Old6
<400> 29 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggttc
39
<210> 30
63
<211>32 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador mH Rv1
<400> 30 attttgtcga cckyggtsyt gctggcyggg tg
32
<210> 31 <211>30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador mH_Rv2
<400> 31 gcacacyrct ggacagggat ccagagttcc
30
<210>32 <211>44 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena pesada de 7G3
<400> 32 agagagagag gtcgaccaec atgggatgga getggatett tete
44
<210> 33 <211>40 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena pesada de 7G3
<400> 33 agagagagag gctagctgca gagacagtga ccagagtccc
40
<210> 34 <211 > 26 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador hk-2
<400> 34 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc
26
<210> 35 <211>26 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador hk-6
<400> 35 tggcgggaag atgaagacag atggtg
26
<210> 36
<211>45 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena ligera de Old4
<400> 36 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtccccgc tcagc
45
<210> 37 <211>40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena ligera de Old4
<400> 37 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg
40
<210> 38 <211>45 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena ligera de Old5
<400> 38 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtccccgc tcagc
45
<210>39 <211>40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena ligera de Old5
<400> 39 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg
40
<210> 40 <211>44 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Fw específico para la cadena ligera de Old17
<400> 40 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtcctcgc tcag
44
<210> 41 <211>40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador Rv específico para la cadena ligera de Old17
<400> 41 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg
40
<210> 42
<211>44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador Fw específico para la cadena ligera de Old19
<400> 42 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtcctcgc tcag
<210> 43 <211>42
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador Rv específico para la cadena ligera de Oldl9
<400> 43 agagagagag cgtacgtttg attlccacct tggtcccttg gc
<210> 44 <211>44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador Fw específico para la cadena ligera de New102
<400> 44 agagagagag atctctcacc atggacatga gggtcctcgc tcag
<210> 45 <211>40
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador Rv específico para la cadena ligera de New102
<400> 45 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg
<210> 46
<211 > 44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador Fw específico para la cadena ligera de Old6
<400> 46 gagagagaga tctctcacca tggacatgag ggtccccgct cagc
<210> 47 <211>42
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador Rv específico para la cadena ligera de Old6
<400> 47 agagagagag cgtacgttlg atatccactt tggtcccagg gc
<210> 48
44
42
<211>30
<212> ADN
<213> Artificial 5 <220>
<223> cebador mK_Rv1
<400> 48 ttgaagclcl lgacaalggg Igaagllgal
<210> 49 <211>30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador mK_Rv2
<400> 49 20 glaggtgctg Ictllgclgt cctgatcagt
<210> 50
<211> 44
<212> ADN 25 <213> Artificia l
<220>
<223> cebador Fw específico para la cadena ligera de 7G3
30 <400> 50 agagagagag agatelcaec atggaatcae agacleaggt cele
<210> 51
<211>40 35 <212> ADN
<213> Artificia l
<220>
<223> cebador Rv específico para la cadena ligera de 7G3
<400> 51 agagagagag cgtacgtttt atllccagct tggtcccccc
<210>52 45 <211>443
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 52
qacccqtcqa ccaccatqqa ctqqacctgq aqqttcctct ttgtgqtqgc qqtqteeagt eeeaggteea getqetaeaq tetgqggetq agqtqaaqaa teqgtgaaqq tctcatqcaa qqcttctqqa qqcaecttca qcacctatqc gtgcgacaqq cccctqqacil ilqqqettgaq tgqatqgqaq qqateatccc atagtaaact acgcacagaa gttccaqggc agagtcacga ttaccgcqqa agtacagcct acatgqaact gagcagcctq aqatctqagq acacgqccqt qcqaqaqggg ggggetcggg eeeagatgtt cttqatatct qqqqccaagq accqtctctt cagctaqcac caa
<210> 53
<211> 143
30
30
44
40
aqcagctaca
"
geetggqtee
120
tatcagctgg
180
tatetttqqt
240
cgaatccacq
300
gta.tt.attgt
360
gacaatqqtc
420
443
<212> PRT <2 13> Horno sapiens
5
<220> <221> caracteristica diversa <222> (143)..(143) <223> xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<400> 53 Met Asp Trp Thr 1
Trp Arg Phe Leu Phe Val 5 10 Val Ala Ala A1a Thr Gl y 15
Val Gl n
Ser Gl n 20 val Ol n Leu Leu Gln 25 Ser Gl y Ala Glu Val 30 Lys Lys
Pro a l y
Ser Ser 35 Val Ly8 Val Ser CyS Lys Ala Ser Cly Cly 40 45 Thr Phe
Ser Thr Tyr Ala 50
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pr o 55 60 Gly Gl n Gl y LeU
Glu Trp Met Gly Gl y 65
Ile 11. Pro 70 I l e Phe Gly 15 I l e Val Asn Tyr Ala 80
Gln Lys
Phe Gln Gly Arg Val 85 Th r Ile Thr Ala Aap Glu Ser Thr 90 95 Ser
Thr Ala Tyr Met 100
Gl u Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Va l 105 110
Tyr Tyr eys Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gl y 115 120
Pro Asp Val Leu Asp 125 Ile
10
'l'rp Gly Cln Gly 130 Thr Met Val 135 Thr Val Ser Ser Al. Ser Thr 140 Xaa
15
<210> 54 <2 11> 41 2 <212> AON <2 13> Horno sapiens
<400> 54 eaeaqatete teaeeatqga eatgagqgte eeeqeteaqc teetqqgget
eetqetqete 60
tqqetceeaq gtgecaqatg tgteatetgq atgaeecagt
ctecateett a etetetgea 120
tetaeagqaq aeaqagteae eateagttgt eqqatqagtc aqqqeattaq g'agtta ttta
1SO
gcetggtatc age aaaaaee
agggaaaqce eetqagetec tqatetatqe tgcatccact 240
tt'ilcaaaqtg gggteec:atc aagqtteaqt ggeagtggat etgggaeaga tttcactcte
300
accatcagca gcetgc agtc: tqaaqatttt qc:aact tatt
aetgteaaea gtattatagt 360
t t cccqtaca cttttggcca 99993cc a a 9
ctq9a9atca aacgtaC99't 99 412
20
<210> 55 <211> 133 <212> PRT <213> Horno sapiens
25
<220>
<221> característica diversa <222> (133) __ (133) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
5
<:400> 55 Met Asp Met 1 Arq val Pro Ala Gln 5 Leu Leu G1y Leu Leu Leu 10 Lau 15 Trp
Lou Pro Gly Ala Arq Cya Val 20
Ile Trp Met 25 Thr Gln Ser Pro 30 S.r Leu
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr 35 40
lle Ser eys ALg Met 45 Ser
Gln Gly 11. Arq Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr G1n 50 55
eln Lys 60 Pro Gly Lys
Ala Pro Glu Leu Leu 65
lle Tyr Ala Ala 70 Ser Thr Leu Gln Ser G1y 75 ~al 80
Pro Ser ALg phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85 'O
Tbr A$p phe Thr Leu '5 Thr
l1e Ser Ser Leu G1n 100
Ser Glu Asp Phe Al.a 105 Thr Tyr Tyr eya e1n G1n 110
Tyr Tyr Ser phe Pro Tyr Thr Phe 115 120
Gly G1n G1y Thr Lys 125 Leu G1u 11a
Lys Arq Tbr Val Xaa 130
10
<210> 56 <211>433 <212> AON <213> Horno sapiens
<:400> 56 gtcgaccacc
atggactgga cctggaqqtt cctctttqtg gtggcagcag ctacaggtgt .0
ccagtcccag
qtccagctgg tgcagtctgg ggctgagqtq aagaagcetg ggtcctcggt 120
qaagqtctca
tgcaaggctt ctggagqcac cttcagcacc tatgctatca gctgggtgcg 180
acaggcccct
g9acaag9gc ttgaqt9gat g9Qaqgqcte atccctatct ttgatataga 240
aaactacgca
cagaagttcc agggcagagt cacgattace gcggacgaat ccacgagcac 300
agtctatatg
gaactgaqca gcetgagatc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcgaq 3.0
alJ9ggggggt
tcgggccctg atgttcttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt. 420
15 20
ctcttcaqct <210>57 <211> 141 <212> PRT ••c <213> Horno sapiens 433
<400> 57
Het Asp Trp Thr Trp Are¡ Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 S 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lya Lys 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45
Ser Thr Tyr Ala lle Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu SO 55 60
Glu Trp Het Gly Gly LeU lle Pro lle Phe Asp lle Glu Asn Tyr Ala 65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr lle Thr Ala Aap Glu Ser Thr Ser 85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Aap Thr Ala Met 100 lOS 110
Tyr Tyr Cy. Ala Arg Gly Gly Gly S. r Gly Pro A.p Val Leu Aap 11. 115 120 125
Trp G1y G1n Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140
<210> 58 s <211> 412
<2 12> AON
<213> Horno sapiens
<400> 58 eaeagatete teaccatgga clltgagggte eecgctcagc tcctgggget cetge tgete 60
tggctcccag qtgceagatg tqteatetg9 atgaeccaqt eteeateett aetetetgea 120
tetacaggag acagagteac eateagttgt eggatgagte agggeattag gagttattta 180
gectgqtate agcaaaaaee agggaaagee eetgagctee tqatetatgc tgeateeact 240
ttgeaaaqtg ggqteeeate aaggttcagt ggcagtggat ctgggaeaga tttcactctc 3 00
accat e&gca gcctqeagte tgaaqatttt qcaaettatt actgtcaaea qtattatagt 360
ttccegtaca ettttggcca qqqqaeeallq ctqqaqatea aaeqtaeqgt 9. 412
<210> 59
<211> 133
<212> PRT 15 <213> Horno sapiens
<220>
<221> caracteristica diversa
<222> (133) ..(133) 20 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<400> 59 Met Asp Met 1
Arg val Pro Ala S Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu la Leu Trp 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Val 20
tle Trp Met 25 Thr Gln Ser Pro Ser Leu 30
Leu
Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val 35 40 Thr tI. Ser eys Arg Met 45 Ser
Gln Gly 50
lle Arg Ser Tyr Leu Ala 55 Trp Tyr Gln Gln Ly8 Pro Gly Lys 60
Ala Pro Glu Leu Leu 65
Ile Tyr Ala Ala 10 Ser Thr Leu Gln 75 Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe
Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85 90 Thr Asp Phe Thr Leu Thr 95
Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala 100 lOS
Thr Tyr Tyr eys 110 Gln Gln
Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Ph. Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125
Lau Glu Il.
Lya Arg Thr Val Xaa 130
s
<210> 60 <2 11> 438 <2 12> AON <213> Horno sapiens
<400> 60 gac:c:c:t¡Jtcga ccaccatgqa qqtqtcc:aqt cc:c:aqqtc:c:a tc:gqtgaagg tc:tc:c:tgc:aa
ctgqac:c:tgq aqqttc:c:tc:t ttqtgqtggc: gc:tqqtgc:aq tc:tggqqc:tq aqqtgaagaa gac:ttc:tqga ggc:ac:c:ttc:a gc:aaetttge aqcagctac:a gc:etggqtee tateagetgg •• 12. 18.
qtgc:gaeagg ecectgqaea
aggqcttgaq tggatgqgag gqa tc:atc:c:c: tatc:tttgqt 24.
teaaeaaact
acgcacaqaa gttccaqggc aqaqteac:ga tta acgcgga eqaatecacg 30.
aqcac:agcct ac:atggagc:t
gagc:aqtc:tg agatctgagg acacqqcc:qt gtattac:tgt
gc:ggqtgga q
a c:aaat a tqq tc:c:ttacta c: tttc:actact qqggccaggg a acccttgtc 420
ac:cgtc t c:et
e age tage 438
15
<210> 61 <211> 141 <212> PRT <213> Horno sapiens
<400> 61
Het Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe val val A1a Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
Val Gln Ser Gln val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr phe 35 40 45
Ser Asn Phe Ala Ile Ser Trp Val ~g Gln Ala Pro aly al" aly LeU 50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly l1e l1a Pro 11e Phe G1y Ser Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly ~g Val Thr 1le Asn Ala Asp G1u Ser Thr Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser G1u Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Phe His Tyr
Trp Gly eln Gly Thr Leu Va l 130 135
<210> 62
<211> 407
<212> AON
<213> Horno sapiens
<400> 62
120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser 140
agatct c tca ceatggacat gagggtcctc gctcaqctec t qqqqctcct gctqc:tctgt .0 ttcccaggtg ceagatgtga catccagatg acccagtct c catcctcact qtctgcatct 120 qtaggagaca gagtcaccat cacttgtcgg gcgagtcag9 gtattagcag ctggttagcc 180 tggtatcagc agaaaccaga ga aagcccct aaqtccctga tctatgctgc atccagtttq 2'0 caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc aqtggatctg ggacagattt C&ctctcacc 300 at cagcagcc tgC&gcctga. aga.ttttgca &cttattact gccaacaqt& taatagttac
10 3" ccgtacaett tt99ceaq9g gaccaagctg gaqatcaaac gtacqgt 401
<210> 63 15 <211 > 132
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<220> 20 <221> característica diversa
<222> (132) ..(132)
<223> xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<400> 63 Met Asp Met Arg Va l Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cy& 1 5 10 15
Phe Pro Gly A1a Arg Cya Aap rle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser ~a Ser Val Oly Asp Arg Val Thr rl. Thr Cys Axg Ala Ser 35 40 45
Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys SO SS 60
Ala Fro Lys Ser Leu I1e Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80
Fro Ser Arq Fhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Fhe Thr Leu Thr 85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Fro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125
Lys Ar9 Thr Xaa 130
<210> 64 S <211> 437
<212> AON
<213> Horno sapiens
<400> 64 tcqACcccat ggactggacc tggaggttcc tctttgtqgt qqcaqcaqct acaqqtgtcc 60
aqtCCcagqt ccagctgqtg cagtctqggg ctgagqtgaa gaagcctggg tcctcggtga 120
aqgtctcctg caaggcttct qqaqqcacct tcaqcaqcta tqctatcaqc tqqgtqcqac 180
agqcccctqg acaagqqctt gagtgqqtqg gaqqqatcat ccctatcttt ggtacagcaa 240
actacgcaca qaaqttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacgaatcc acgagcacag 300
cctacatqqa gctqagcagc ctgagatctg aqgacacggc cgtgtattac tqtgcgagag 360
gacacaaata tggcccctac tactttgact actgqggcca gggaaccctg gtcaccqtct 420
cctcaqctag caccaaq 437
<210> 65 1S <211> 143
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 65 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe val va1 Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
Val Gln Se r
Gln Val Gln 20 Le~ Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 25 30 Lya Lya
Pro Gly Ser Ser Va l 35
Lys Val Se% Cys Lys Ala Ser Gly Gly 40 45 Thr Phe
Ser Ser Tyr Ala 118 Ser Trp val Arg Gln Ala 50 55
Pro Gly Gln Gly Leu 60
Glu Trp Val Gly Gly 11e 11e Pro 11e Phe Gly Thr Ala 65 70 75
Aan Tyr Ala 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arq Val Thr 11a 85
Thr Ala Asp Glu Ser 90 Thr Ser 95
Thr Ala Tyr Met 100
Glu Lea Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 105 Thr Ala Val 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly His Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Ph. Asp Tyr 115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 130 135
Ser Ser Ala Ser Thr Lys 140
S
<210> 66 <211>411 <212> AON <213> Horno sapiens
<400> 66 agatctctca cCatggacat gaqgqtcctc qctcaqctcc tqqqqctcct qctqctetgt
60
ttcccaggtg ccagatgtga catccagatg acccagtctc
catcctcact qtctgcatct 120
10
gtaqgagaca gagtcaccat cacttgtcgq qcqagtcaqq gtattaqcaq ctqqttaqcc 180
tqqtateaqe aqaaaecaga gaaagcccct aaqtccctga tctatqctgc atccagtttq
240
eaa&qtqqqq teceatcaaq qttcaqcqgc aqtqqatctq qqacaqattt cactetcacc
300
atcaqeaqec tqeaqcctga aqattttqca aettattact
qccaacaqta taataqttae 360
eeteqqacgt tcgqccaaqq qaeeaaqqtq gaaateaaae
gtaeqgtqgc t 411
1S
<210> 67 <211> 133 <212> PRT <213> Horno sapiens
<400> 67
Met Asp Het Arg val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys A$p Xl. Gln Het Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Alll Ser Val Gly ~p Arg Val Thr Xle Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gln Gly tle Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60
Ala Fro Lya Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80
Fro Ser Arg Phe Ser Gly Ser G1y Ser Gly Thr Aap Phe Thr Leu Thr 85 90 95
11e Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Pha Ala Thr Tyr Tyr Cya Gln Gln 100 lOS 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Xla 115 120 125
Lys Arg Thr val Ala 130
<210> 68 5 <211> 435
<212> AON
<213> Horno sapiens
<400> 68
tcgllceacca tggactggac ctggaggttc ctctttgtgq tggcaqcaqc tacaggtgtc 60
cagtcccagg tccagctgqt gcaqtctggg getgagqtga agaagcetgg atcctcggtg 120
aaggtctect gcatggettc aggaggcaec gtcagcagct lIcgctatcag etgqqtgcqa 180
cllggcccctg gacaagqgct tgagtggatg ggagagatca tccctatctt tggtatagts 240
aactacgcac agaaqttcca gggclIgaqtc acgattaccq cggacgaatc cacgaacaca 300
gcctacatgq aqctgagcag cctgllgatct gaqgacacgq ccatatatta ctqtqcqaqa 360
gllgacagcag tqgctgqtat tcttgqttllc tgqgqccagq gllaccctgqt caccqtctcc 420
tcagetaqca ceaaq 435
<210> 69 15 <211> 142
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 69 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe val va1 Ala Ala Al. Thr Gly 1 5 10 15
Val G1n
Ser G1n Val G1n 20 Leu Val G1n 25 Ser G1y Ala G1u Val 30 Lys Lys
Pro G1y
Ser Ser Val 3S Lys Val Ser Cys Met Al. Ser G1y G1y 40 45 Thr Val
Ser Ser Tyr Ala 11e Ser 50
T~ 55 va1 Arq Gln Al. Pro Gly Gln Gly Leu 60
G1u Trp Net ely G1u 65
Ile I1e Pro 10 I1e Phe G1y Ile Val Asn 75 Tyr Al. 80
eln Lys
Phe eln G1y Arq Val Thr 85 11. Thr Al. Aap 90 Glu Ser Thr Aan 95
Thr A1a
Tyr Net 100 elu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu AlIp 105 Thr Al. 1le 110
Tyr Tyr Cya 115
Ala Arg Glu Thr Ala Val Ala 120 Gly 11. Leu Gly 125 Tyr Trp
Gly Gln G1y 130
Thr Leu Val Thr Val 135 Ser Ser Al. Ser Thr Lys 140
s
<210> 70 <211> 414 <212> AON <213> Horno sapiens
<400> 70 agatctctca ccatggacat gagqqtcctc gctcll.gctcc tggggctcct qctgctctqt
ttcccaqqtg ccagatqt.ga catccagatg acccagtctc
catcctcact gtctgcatct 120
10
qtaggagaca gagtcaccat cacttgtcgg gcgaqtcagq gtattagcag ~tggttagc~ 180
tggtatcll.gc aqaaaccaga qaaaqcccct aaqtccctg& tctatgctgc atccaqtttg
2'0
eaall.gtgggg teeeateaag qtteagegge aqtggatetg ggaeagattt
eacteteaee 300
atcagcagcc tgcagcctga agattttgca acttattact gccaacagta taataqttac cc:gtacac:tt ttqgc:cag9g gaccaagctg 9agatcaaac gtac9qt99C: tgca
360 'H
15
<210> 71 <211> 134 <212> PRT <213> Horno sapiens
<400> 71 Mot Asp Met Arg val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu 1 5 10
Leu Cys 15
Phe
Pro Gly Ala Arg Cys 20 Asp tle Gln Met 25 Tbr Gln Ser Pro 30 Ser Ser
Leu
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arq Val 35 40 Thr tle 'l'hr Cys Arg Ala 45 Ser
Cln Gly tle Ser Ser Trp 50
Leu 55 Ala Trp Tyr Gln CIn Lys 60 Pro Glu Lys
Ala Pro Lys 65
Ser Leu tle Tyr Ala Ala 10 Ser Ser Leu Gln 1S Se r Gly Va l 80
Pro Ser Arq Phe
Ser Gly 85 Ser Gly Ser Gly 90 Tbr Asp Pbe Thr Leu 95 Thr
tIa Se r
Ser Leu Gln pro Glu Asp phe Ala lOO lOS Thr Tyr Tyr Cys 110 Gln Gln
'l'yr Asn
Ser 'l'yr Pro 'l'yr Thr Phe 115 120 Gly GIn Gly Thr Ly. 125 L_u Glu tI_
Lys
Arg 'l'hr val Ala Ala 130
S
<210> 72 <211> 423 <2 12> AON <213> Horno sapiens
<400> 72 cqacccacca tggaactggg gctccgctgg qttttccttg ttgcta t t t t
agaagqtgtc 60
eagtqtgsgg tgeagttggt ggsgtot999 99~ggeotgq teaageetqg gqggteeetq
120
10
agactctcct gtgcagcct c tqgattcacc ttcagtagce ataaeatgaa etggqtccgc 1SO
caggctecag 9gaagggget ggagtggqte tcatecatta gtagtaqtag tagttacata
240
tattatqeag aetcagtqaa qggccgattc aceatetcca
gagacaac gc caagaactca 300
c t gtatetgc aaatgaacag cctgagagcc gaqqac acgq
ctgtgtatta ctgtgcgaga 360
gaggactqgg getaetttga etactggggc cag9gaaeec tggteaecgt ctceteaget
420
aqe
423
1S
<210> 73 <211> 140 <212> PRT <213> Horno sapiens
<400> 73
Het Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala 11e Leu Glu Gly 1 5 10 15
Va l aln Cys alu Val a1n Leu Val G1u Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Bis Asn Het Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser S. r 1le Ser Ser Ser Se r Ser Tyr 11. Tyr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 11e Se r Arg Asp ~n Ala Lys Asn
8S
Ser Leu Tyr Leu Gln Het 100
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu 115
01y Thr Lau Val 'l'hr Val 130
<210> 74
<211> 407
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 74
90 95
~n Ser Leu Arq Ala Glu ~p Thr Ala Val 105 110
~p Trp Gly Tyr Ph. Asp Tyr Trp Gly Gln 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Ly. 135 140
4g4t~t~tC4 cc:atggac:at g<lgqgtc:c:cc: gc:tC:<lgctcc tggggc:ttc:t gc:tgctc:tgg
"
ctcccagqtg cCllgatqtgc cat ccaqttg acccaqtct c catcctccct gtctgcatct 120 qtaggagaca qaqtcacoat o.llcttgccgg goaaqtoagq ge.llttageag tqatttagec 180
10 tgqtatcagc aqaa.llccagg qaaagctcct aaqctcctqa. tctatqatqe ctccagtttq 240 qaaaqtgggg tcccatC.Ilaq qttC<lgcggc aqtggatctg 9'9acagattt cactctcacc 300 lltcllgeagcc tqcaqcc:tga agatttt gcll acttattaet-qtC.llllcaqtt taat.llqttac 360 ccattcllctt t cqqccctgg gaccaaagtq qat.lltcaaac qtacqqt 407
<210> 75 15 <211> 134
<212> PRT
<213> Horno sapiens <400> 75
Met Aap Het Arg Val Pro Al. Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro G1y ~a ~g Cys Al. rle Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Va l Thr lle Thr Cys A.rq Ala Ser 3S 40 45
Gln Gly 11. Se r Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lya Leu Leu Ile Tyr ASp Ala Ser Se~ Leu Glu Ser Gly val 65 70 7S 80
Pro Ser ALg Phe Ser Gly Ser Gly Se r Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr 85 90 95
rle Ser Ser Leu Gln Pro Glu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr Phe 115 120
Lys ALg Thr Val A1a Ala 130
<210> 76 S <211> 433
<212> AON
<213> Horno sapiens
<400> 76
105 110
Gly Pro Gly Thr Lys Val Aap rle 125
qtcqaccacc atggqatgga gctqgatctt tctctttctc qtqtc.gqa. ctqqagqtqt 60 cctctetgaq gtceaqetgc aacaqtetgg aectqagetg gtgaagcctg gggcttcaqt 120 aaaqatqtoo tqcaag90tt ctqgatacao ottoactgac taetaeatga agtgqqtqaa 180
10 aeaqaqoeat qqaaagaqoe ttgaqtggat tqqaqatatt atteotagoa atqqtgeoao 240 tttctacaac cagaaqttca aqggoaaqqo oaotttqaet qtggacaqat cct ccaqcac 300 aqootaeatq oacoteaaea qeetqacatc tqaqqact ct qcaqtctatt actqtacaaq 360 atcqcattta otqcqqgcct cctgqtttqc ttactqqqqc caaq9qactc tqqtcactgt 420 ctctgcagct agc 433
<210> 77 15 <211> 141
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 77 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu val Ser Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Va l 20
Gln Le~ Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 25 30 Val Lys
Pro Gly Ala Ser Va l 35
Lys Met Ser Cys Lys Al& Ser Gly Tyr Thr Phe 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Met 50
Lys Trp va1 Lys Gln Ser His Gly Lys 55 60 Ser Leu
Glu Trp Ile Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly A1a Thr Phe Tyr Asn 6S 70 7S 80
aln Lys Phe Lys aly Lys Ala Thr Leu Thr Val 85 90
~p Arq Ser Ser Ser 95
Thr Ala Tyr Met 100
His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser 115
His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Pha A1a Tyr 120 125
Trp Gly Gln aly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 140
Ser
s
<210> 78 <211>412 <212> AON <213> Horno sapiens
<400> 78 agatctcacc atqgaatcac agactcaggt cctcatgtcc ctgctgttct gggtatctqg
60
tacctqtqqq qactttgtqa tc¡acaeaqte teeatcetec etgaetgtga eageaggaqa
1 20
10
gaaggteaet atgagetgca agtctaqtca gaqtctqtta aaeaqtqgaa a t caaaagaa 180
ctaettgaec tggtatct ge
agaaaeeagg geagcctcct aaattgttga tctattgggc 2.0
atceactagg gaatctqgqg tccetgatcq etteaeaggc: agtggatetq gaaeaqattt
300
eactcteaee ateageagtg tgeaggetga aqaeetggca gtttattact gtcaqaatqa
360
ttataqttat ccgtacacqt tcggaggggg qaccaagctq gaaataaaae
gt 412
15
<210> 79 <211> 134 <212> PRT <213> Horno sapiens
S
<400> 79
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser 1 5 10 15
Gly Thr Cye Gly Asp Phe Val Het Thr aln S.r Pro Ser Ser Leu Thr 20 2S 30
Vel Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gl y Asn Gl n Lys Asn Tyr Lau Thr Trp Tyr Leu Gln 50 55 60
Lya Pro Gly Gln Pro Pro Ly. Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Ar9 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro As p Arg Phe Thr Gl y Ser Gly Se r Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Al a Glu Aap Leu Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cya Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125
Lya Leu Glu Ile Lya Arg 1 30
<210> 80
<211> 37
<212> AON
<213> Artificial
<220>
<223> cebador hC0116Fw-Mfel
<400> 80 cggcaattgc caccatgctt ctcctggtga caagcct 37
<210> 81 <211>31
<212> AON
<213> Artificia l
<220>
<223> cebador hC0116Rv-Notl
<400> 81 attgcggccg ctcaggtaat ttccttcacg 9 31
<210> 82
<211> 37
<212> AON
<213> Artificial
<220>
<223> cebador hC0116Fw-Mfel
<400> 82 cggcaattgc caccalgctl ctcclgglga caagcct 37
<210> 83 <211> 31 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0116Rv-Notl
<400> 83 attgcggccg ctcaggtaat ttccttcacg 9
31
<210> 84 <211>37 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0116Fw-Mfel
<400> 84 cggcaattgc caccatgctt ctcctggtga caagcct
37
<210> 85 <211>31 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0116Rv-Notl
<400> 85 attgcggccg ctcaggtaat ttccttcacg 9
31
<210> 86 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0116Seqfw1
<400> 86 tgaactgtac ctgggcgagg
20
<210> 87 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0116Seqfw2
<400> 87 clggcacgga aaacclaclg
20
<210> 88 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0116SeqRv1
<400> 88 cclgaatttg galaaagcag
20
82
<210>89 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador T7
<400> 89 taatacgact cactataggg
20
<210> 90 <211>40 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador hC0123-C-FLAG-R1
<400> 90 tcgtcatcgt ccttgtagtc agttttctgc acgacctgta
40
<210> 91 <211>34 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador IL·3RA Fw
<400> 91 cggcaattgc caccatggtc ctcctttggc tcac
34
<210> 92 <211>39 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador C-FLAG-NotR2
<400> 92 aaaagcggcc gctcacttgt cgtcatcgtc cttgtagtc
39
<210>93 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1-Fw
<400> 93 cgtgtacggt gggaggtcta
20
<210> 94 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1-Re
<400> 94 tttatgtttc aggttcagg
19
83
<210> 95 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1 .Fw
<400> 95 cgtgtacggt gggaggtcta
20
<210> 96 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1 .Re
<400> 96 tttatgtttc aggttcagg
9
<210> 97 <211>28 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123R11pEGFPN1
<400> 97 aaaggtaccg aattcgaagc ttgagctc
28
<210> 98 <211>27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123F11
<400> 98 aaaggtaccg ggaagccttg ggcaggt
27
<210> 99 <211 > 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123R12-2
<400> 99 aaaggtacca ctgttctcag ggaagaggat
30
<210> 100 <211>29 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123F12-2
<400> 100 aaaggtaccc agattgagat attaactcc
29
<210> 101 <211>27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador C0123R13
<400> 101 aaaggtacct gaaaagacga caaactt
27
<210> 102 <211>27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador C0123F13
<400> 102 aaaggtacct cgctgctgat cgcgctg
27
<210> 103 <211>20 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1 .Fw
<400> 103 cgtgtacggt gggaggtcta
20
<210> 104 <211 > 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1.Re
<400> 104 tttatgtttc aggttcagg
19
<210> 105 <211>33 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador GM-CSFRF11
<400> 105 aaaggtaccg ccaccatgct tctcctggtg aca
33
<210> 106 <211> 27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador GM-CSFRR11
<400> 106 aaaggtacct gaatttggat aaagcag
27
<210> 107 <211>27 <212> AON <213> Artificia l
<220> <223> cebador GM-CSFRF12
<400> 107 aaaggtaccg gaagggaggg taccgct
27
<210> 108 <211>27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador GM-CSFRR12
<400> 108 aaaggtaccc tttgtgtcca aaagtga
27
<210> 109 <211>27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador GM-CSFRF13
<400> 109 aaaggtacca aaatagaacg attcaac
27
<210> 110 <211 > 27 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador GM-CSFRR13
<400> 110 aaaggtacca atgtacacag agccgag
27
<210>111 <211>20 <212> AON <213> Artificia l
<220> <223> cebador pEGFP-N1-Fw
<400> 111 cgtgtacggt gggaggtcta
20
<210> 112 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador pEGFP-N1-Re
<400> 112 tttatgtttc aggttcagg
19
86
<210> 113 <211>5
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 113
'I'hr 'I'yr Ala Ile Ser 1 5
<210> 11 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 114
G1y Ile Ile Pro ". Phe Gly lle Val Asn Tyr Ala Gln Lys Ph. G1n 1 5 10 15
G1y
<210> 115 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 115
Gly Gly Gly Ser Gly PrO Asp Val Leu Asp U. 1 5 10
<210> 116 <211>5
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 116
'I'hr Tyr Ala Ile Sor 1 5
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 117
G1y Leu Ile Pro ". Phe Aap 118 Glu Aon Tyr Ala Gln Lys Ph. 01n 1 5 10 15
G1y
<210> 118 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 118
Gly Gly Gly Ser Gly Pro Asp Val Leu Asp !le
1 S 10
<210> 119 <211>5
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400>119
Asn Phe Ala ne Ser 1 5
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 120
.'y x18 11. Pro 11. Phe Gly Ser '1'hr Asn Tyr Ala Gln Lys ". .'n 1 5 10 15
Gl,
<210> 121 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 121
Gly Asp Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Phe His ryr
1 5 10
<210> 122 <211>5
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 122
Ser Tyr Ala n. Ser
1 5
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 123
ely tle tle Pro n . Phe Gly Thr Al", Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15
el,
<210> 124 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 124
Gly Ria Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr pha Asp ryr
1 5 la
<210> 125 <211>5
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 125
Ser Tyr Ala ne Ser
1 5
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 126
Glu Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val "n Tyr Ala Gln Lys Ph. Gln 1 5 10 15
Gl y 5
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 127
Glu Thr Ala Val Ala Gly Ile Leu Gly Tyr 1 5 la
<210> 128 15 <211>5
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 128
Ser Hi s Asn Met Asn 1 S
<210> 129
<211> 17
<212> PRT 25 <213> Horno sapiens
<400> 129
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr 11e Tyr Tyr Ala Aap Ser Val Ly. 1 5 10 15
Gly
<210> 130 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
35 <400> 130 Glu Asp Trp Gly Tyr Phe Asp 1 5
<210> 131 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 131 Arg Met Ser Gln Gly Ile Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 la 45
<210> 132 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 132
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5
<210> 133 <211>9
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 133
Gin Gin Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 134 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 134
Argo Met Ser Gin Gly Ila Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10
<210> 135 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 135
Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser
1 5
<210> 136 <211>9
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 136
Gln Gln Tyr. 'l'yr Sor Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 137 <211>11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 137
Arg Ala Ser Gln G1y 11e Ser Ser TrpLeu Ala
1 5 10
<210> 138 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 138
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser
1 5
<210> 139 <211>9
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<:400> 139
Gln. Gln Tyr Asn Ser fyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 140 Arq Ala Ser Gln Gly 11e Ser Ser Trp Leu Ala 1 S 10
<210> 141 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 141
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 S
<210> 142 <211>9
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 142
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 S
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 143
Arg Ala Ser Gln Gly Ila Sltr Sar Trp Leu Ala 1 S 10
<210> 144 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 144
Ala Ala Ser Ser Lou Gln Ser 1 S
<210> 145 <211>9
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 145
Gln Gln Tyr Asn So. Tyr Pro Tyr Thr 1 S
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 146
Arg Ala Ser Gln Gly 11e Ser Ser Asp Leu Ala 1 S 10
<210> 147 <211>7
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 147
Asp Ala Sltr Ser Lou Glu Sar 1 S
<210> 148 <211>9 <212> PRT <213> Horno sapiens
<400> 148 Gl n Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5
<210> 149 <211> 29 <212> AON <213> Artificia l
<220> <223> cebador C0123-Fw21
<400> 149 cglggaaccc gcaglgaaca alagclatt
29
<210> 150 <211> 30 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123-Re21
<400> 150 actctgttct tmaacaca ctcgatatcg
30
<210> 151 <211> 29 <212> AON <213> Artificia l
<220> <223> cebador CD123-Fw22
<400> 151 cttlalccaa alaacaglgg gaagccttg
29
<210> 152 <211> 31 <212> AON <213> Artificia l
<220> <223> cebador C0123-Re22
<400> 152 cagtttctgl Iggaalgglg ggttggccac I
31
<210> 153 <211> 34 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123-Fw23
<400> 153 ag99ag991a ccgglgcgga gaalclgacc Igcl
34
<210> 154
<211>32 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123-Re23
<400> 154 tcctgaattt ggatagaaga ggatccacgt gg
32
<210> 155 <211>29 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123-Fw24
<400> 155 ggtccgacgg cccccgcgga cgtccagta
29
<210> 156 <211>32 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador CD123-Re24
<400> 156 cctcgcccag gtacagclca agaaatccac 91
32
<210> 157 <211>30 <212> ADN <213> Artificia l
<220> <223> cebador CD123-Fw25
<400> 157 acggaaccag cgcagccttc ggtatcccct
30
<210> 158 <211>28 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123-Re25
<400> 158 taaccagaaa gtgggaactt tgagaacc
28
<210> 159 <211>28 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador CD123-Fw26
<400> 159 tctttgattc atttgtcgtc ttttcaca
28
<210> 160
<211>29 <212> ADN <213> Artificial
5
<220> <223> cebador CD123-Re26
10
<400> 160 attggatgcc gaaggctgcg ctcctgccc

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Anticuerpo contra una cadena de IL-3Ra humana, que no inhibe la seña lización de IL-3, y que se une al dominio B de la cadena de IL-3Ra humana pero no se une al dominio C de la cadena de IL-3Ra humana
  2. 2.
    Anticuerpo según la reivindicación 1, que presenta además una cilotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) elevada.
  3. 3.
    Anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, en el que la citoloxicidad celular dependiente de anticuerpos (AOCC)
    elevada muestra un porcentaje de lisis específica de 10% a una concentración de anticuerpo de 0,01 ,Ig/ml, medianle un mélodo de ensayo de AOCC de Colon-26fhC0123 que utiliza PBMC cultivadas con IL-2
  4. 4.
    Anlicuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende unas secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y CDR de cadena ligera seleccionadas de entre el grupo que consiste en los (a) a (e) siguientes:
    (a)
    CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 113 a 115, respectivamente, y COR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO. 131 a 133, respectivamente ,
    (b)
    CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 116 a 118, respectivamente, y COR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO. 134 a 136, respectivamente ,
    (c)
    CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 119 a 121 , respectivamente, y COR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 137 a 139, respectivamente ,
    (d)
    CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 122 a 124, respectivamente, y CDR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 140 a 142, respectivamente , y
    (e)
    CDR 1 a 3 de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO: 125 a 127, respectivamente, y COR 1 a 3 de la cadena ligera son las secuencias de aminoácidos de SEC ID nO. 143 a 145, respectivamente
  5. 5.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciooes 1 a 4, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera selecciooadas de entre el grupo que consiste en los (a) a (e) siguientes:
    (a)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (Q) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 53 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de valina (V) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO. 55;
    (b)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (O) en la
    posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO. 57 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de valina (V) en la posiciórJ 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 59;
    (c)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (Q) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 61 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de ácido aspártico (O) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 63;
    (d)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (O) en la posición 20 a serina (S) en la posición 139 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 65, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de ácido aspártico (O) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO. 67; y
    (e)
    una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de glutamina (O) en la posición 20 a serina (S) en la posición 138 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 69 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de ácido aspártico (O) en la posición 23 a lisina (K) en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO. 71
    6 Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de IL-3Ra según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su utilización en un método para prevenir o tratar un tumor de la sangre en el que una célula que expresa IL3Ru se encuentra en la médula ósea o la sangre periférica de un sujeto.
  6. 7. Anticuerpo de IL-3Ru según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su utilización en un método para tratar
    un tumor de la sangre en el que una célula que expresa IL-3Ru se encuentra en la médula ósea o la sangre 5 periférica
  7. 8. Utilización del anticuerpo de IL-3Ru según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para detectar en una muestra biológica de un sujeto un tumor de la sangre en el que una célula que expresa IL-3Ru se encuentra en la médula ósea o la sangre periférica.
  8. 9. Composición farmacéutica para su utilización según la reivindicación 6, anticuerpo de IL-3Ru para su utilización según la reivindicación 7, o utilización del anticuerpo de IL-3Ru según la reivindicación 8, en la/el que el tumor de la sangre es la leucemia mieloide aguda (AML).
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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100209341A1 (en) 2009-02-18 2010-08-19 Csl Limited Treatment of chronic inflammatory conditions
HUE025966T2 (en) * 2009-04-27 2016-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-IL-3RA antibody for use in the treatment of blood cancer
CA2775155A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Csl Limited Method of treatment of philadelphia chromosome positive leukemia
AU2011222012C1 (en) 2010-03-02 2015-02-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
AU2011253598B1 (en) * 2010-08-17 2012-01-19 Csl Limited Humanized anti-interleukin 3 receptor alpha chain antibodies
NZ604510A (en) * 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
AU2012202125B2 (en) * 2010-08-17 2015-03-19 Csl Limited Humanized Anti-Interleukin 3 Receptor Alpha Chain Antibodies
EA201401077A1 (ru) * 2012-04-05 2015-02-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела к человеческому tweak и человеческому il17 и их применения
UY35340A (es) 2013-02-20 2014-09-30 Novartis Ag Marcaje efectivo de leucemia humana usando células diseñadas con un receptor quimérico de antígeno anti-cd123
CN108064242B (zh) 2014-05-28 2022-10-21 阿吉纳斯公司 抗gitr抗体和其使用方法
US20180134795A1 (en) * 2014-06-17 2018-05-17 Cellectis Cd123 specific multi-chain chimeric antigen receptor
CA2955386A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
ES2791248T3 (es) 2014-08-19 2020-11-03 Novartis Ag Receptor antigénico quimérico (CAR) anti-CD123 para su uso en el tratamiento del cáncer
EP2990416B1 (en) * 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
LT3189081T (lt) * 2014-09-05 2020-05-11 Janssen Pharmaceutica Nv Cd123 surišantys agentai ir jų naudojimas
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
SG11201705925PA (en) 2015-01-23 2017-08-30 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
US10100118B2 (en) 2015-04-08 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD123
WO2016164658A1 (en) * 2015-04-08 2016-10-13 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd123
SG11201710639YA (en) 2015-06-22 2018-01-30 Bayer Pharma AG Antibody drug conjugates (adcs) and antibody prodrug conjugates (apdcs) with enzymatically cleavable groups
HUE053619T2 (hu) 2015-06-29 2021-07-28 Immunogen Inc Anti-CD123 antitestek és konjugátumok és ezek származékai
WO2017010106A1 (en) * 2015-07-14 2017-01-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A therapeutic agent for a tumor comprising an ido inhibitor administered in combination with an antibody
US11136609B2 (en) 2015-11-09 2021-10-05 National University Corporation Kyoto Institute Of Technology Separating agent for human serum-derived IgG polyclonal antibodies, and method for separating human serum-derived IgG polyclonal antibodies using same
KR20180083944A (ko) 2015-12-02 2018-07-23 아게누스 인코포레이티드 항체 및 이의 사용 방법
AU2016382512A1 (en) 2015-12-30 2018-07-12 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
RU2021129189A (ru) 2016-01-22 2021-11-15 Мерк Шарп И Доум Корп. Антитела против фактора свертывания xi
SG11201807489PA (en) 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
RU2018136778A (ru) 2016-03-24 2020-04-24 Байер Фарма Акциенгезельшафт Пролекарства цитотоксических лекарственных средств, содержащие ферментативно расщепляемые группы
BR112018071096A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Novartis Ag composições e métodos para a expressão da proteína seletiva
PE20190416A1 (es) 2016-06-14 2019-03-19 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos antifactor de la coagulacion xi
JP7022707B2 (ja) * 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
BR112019002035A2 (pt) 2016-08-01 2019-05-14 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor de antígeno quimérico em combinação com um inibidor de uma molécula pró-macrófago m2
CN107840889A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 上海吉倍生物技术有限公司 高亲和力的抗cd123抗体及其应用
MY194290A (en) * 2016-09-21 2022-11-26 Aptevo Res & Development Llc CD123 Binding Proteins and Related Compositions and Methods
US11433140B2 (en) 2016-12-21 2022-09-06 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (ADCs) having KSP inhibitors
RU2761390C2 (ru) 2016-12-21 2021-12-07 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты связующего и активного вещества (adc), имеющие ферментативно расщепляемые группы
US12059472B2 (en) 2016-12-21 2024-08-13 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
US11535662B2 (en) 2017-01-26 2022-12-27 Novartis Ag CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2019072824A1 (en) * 2017-10-09 2019-04-18 Cellectis IMPROVED ANTI-CD123 CAR IN UNIVERSAL MODIFIED IMMUNE T LYMPHOCYTES
KR20200086278A (ko) 2017-10-18 2020-07-16 노파르티스 아게 선택적 단백질 분해를 위한 조성물 및 방법
CN111556876B (zh) * 2017-10-27 2024-10-18 辉瑞公司 对cd123具有特异性的抗体和抗体-药物缀合物及其用途
EP3746079A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Bayer Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with nampt inhibitors
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
EP3806962A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Novartis AG Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
EP3897637A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Novartis AG Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
MX2021009763A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina -2,6-diona y usos de los mismos.
US20220144798A1 (en) 2019-02-15 2022-05-12 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
PH12021552916A1 (en) 2019-05-21 2022-04-04 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2021013693A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with nampt inhibitors
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
CA3185455A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
EP4168007A1 (en) 2020-06-23 2023-04-26 Novartis AG Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US20230271940A1 (en) 2020-08-03 2023-08-31 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
TW202241952A (zh) 2020-12-31 2022-11-01 法商英耐特醫藥公司 結合至ＮＫｐ４６及ＣＤ１２３之多功能自然殺手（ＮＫ）細胞接合體
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
CN119365495A (zh) 2022-05-27 2025-01-24 赛诺菲 与NKp46和BCMA变体结合的具有Fc工程化的自然杀伤（NK）细胞接合物
WO2024105206A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Vincerx Pharma Gmbh Antibody-drug-conjugates cleavable in a tumor microenvironment
WO2024243441A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Kumquat Biosciences Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
CH668554A5 (de) 1984-04-09 1989-01-13 Sandoz Ag Liposomen welche polypeptide mit interleukin-2-aktivitaet enthalten sowie verfahren zu ihrer herstellung.
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4975282A (en) 1985-06-26 1990-12-04 The Liposome Company, Inc. Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies
EP0225130B1 (en) 1985-11-22 1991-10-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Liposome composition
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP2666345B2 (ja) 1987-04-16 1997-10-22 武田薬品工業株式会社 リポソーム製剤およびその製造法
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5273876A (en) 1987-06-26 1993-12-28 Syntro Corporation Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH04503306A (ja) 1989-02-01 1992-06-18 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 単純ヘルペスウイルス１型発現ベクター
US5665577A (en) 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
HK1007330A1 (en) 1990-01-12 1999-04-09 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP1285967A3 (en) 1990-09-21 2005-03-02 Chiron Corporation Human retroviral packaging cell line
WO1992014829A1 (en) 1991-02-19 1992-09-03 The Regents Of The University Of California Viral particles having altered host range
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
JPH06506600A (ja) 1991-04-19 1994-07-28 シェリング・コーポレーション ヒトインターロイキン　３　レセプターのサブユニット
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
AU7353494A (en) 1993-11-12 1995-05-29 Case Western Reserve University Episomal expression vector for human gene therapy
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US5731172A (en) 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5604090A (en) 1994-06-06 1997-02-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for increasing transduction of cells by adeno-associated virus vectors
US5693508A (en) 1994-11-08 1997-12-02 Chang; Lung-Ji Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats
JP3770333B2 (ja) 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6177078B1 (en) 1995-12-29 2001-01-23 Medvet Science Pty Limited Monoclonal antibody antagonists to IL-3
US5861397A (en) 1996-10-03 1999-01-19 Vical Incorporated Piperazine based cytofectins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2616914C (en) 1996-12-03 2012-05-29 Abgenix, Inc. Egfr-binding antibody
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP3031917A1 (en) 1999-04-09 2016-06-15 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2895884C (en) * 2000-03-06 2019-04-23 University Of Kentucky Research Foundation A compound that selectively binds to cd123 and use thereof to kill hematologic cancer progenitor cells
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
EP1632571B1 (en) 2001-05-11 2012-11-28 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Human artificial chromosome containing human antibody Lambda light chain and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
RS54271B1 (en) * 2005-07-01 2016-02-29 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
WO2009070844A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Csl Limited Method of inhibition of leukemic stem cells
HUE025966T2 (en) * 2009-04-27 2016-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-IL-3RA antibody for use in the treatment of blood cancer
CA2775155A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 Csl Limited Method of treatment of philadelphia chromosome positive leukemia
NZ604510A (en) 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use

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