CN111629749A - 用于选择性蛋白质降解的组合物和方法 - Google Patents

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A·戈隆索夫
C·P·古尔德
C·P·P·吉马拉斯
M·H·P·希尔德
G·莫茨
N·T·罗斯
J·M·所罗门
R·E·J·贝克威思
S·卡尔博诺
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Abstract

本发明提供了包含融合多肽的组合物以及用于制备包含COF1/CRBN结合多肽、COF2/CRBN结合多肽、或COF3/CRBN结合多肽和目的异源多肽的融合多肽的方法。

Description

用于选择性蛋白质降解的组合物和方法
相关申请的交叉引用
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序列表
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背景技术
许多治疗性蛋白质已经发展为用于预防或治疗疾病的重要药物。副作用(从药物功效的丧失到严重毒性)可以在治疗期间或之后发生。期望开发调节治疗性蛋白质的表达水平的策略，例如，调节治疗性蛋白质的水平以增加功效和/或减少副作用。
发明内容
本披露至少部分提供了包含具有式(I)的化合物(COF1)/CRBN结合多肽、具有式(II)的化合物(COF2)/CRBN结合多肽、或具有式(III)的化合物(COF3)/CRBN结合多肽的融合多肽，用于靶向蛋白质失活。在一些实施例中，所述融合多肽包含一种或多种COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和一种或多种异源多肽，例如，目的多肽。所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽可以例如，经由接头可操作地连接至所述异源多肽。在一些实施例中，在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺))的存在下，或在COF3(例如，表29中披露的化合物)的存在下，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽改变融合多肽的水平和/或活性；例如，增加所述融合多肽的降解，如蛋白酶体降解。在一些实施例中，所述融合多肽的降解是泛素依赖性的。
不希望受理论的束缚,在一些实施例中，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽提供了氨基酸序列和/或结构基序，所述氨基酸序列和/或结构基序在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺))的存在下，或在COF3(例如，表29中披露的化合物)的存在下，导致所述融合多肽的翻译后修饰(例如，泛素化)，产生经修饰的例如泛素化的融合多肽。例如，在COF1、COF2或COF3的存在下，所述融合多肽中的一个或多个氨基酸(例如，赖氨酸或甲硫酸)可以被泛素化。在一些实施例中，所述泛素化融合多肽被选择性地降解。在一些实施例中，所述融合多肽的翻译后修饰增加了融合多肽的降解(例如，增加的降解水平和/或降解速率)。在一些实施例中，所述降解水平和/或降解速率相对于参考多肽(例如，在不存在COF1、COF2或COF3的情况下的融合多肽；异源多肽；或者不具有COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽或具有除COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽之外的部分的异源多肽的融合多肽)的降解水平和/或降解速率增加至少1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，。
在一个方面，本文提供了包含具有式(I)的化合物(COF1)/CRBN结合多肽和异源多肽的融合多肽，其中所述具有式(I)的化合物是：
Figure BDA0002541415150000021
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，所述异源多肽是异源的哺乳动物多肽。在一些实施例中，所述异源多肽是异源的细菌多肽。在一些实施例中，所述异源多肽是异源的病毒多肽。在一些实施例中，所述异源多肽包含来自或衍生自哺乳动物多肽、细菌多肽、病毒多肽、植物多肽、酵母多肽、真菌多肽、古细菌多肽、鱼(例如，斑马鱼)多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，所述异源多肽包含表2中的多肽，例如，细胞质多肽和/或细胞核多肽，或如在表2中描述的跨膜多肽。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽融合。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽通过肽键连接。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽通过除肽键之外的键连接。在一些实施例中，所述异源多肽与所述COF1/CRBN结合多肽直接连接。在一些实施例中，所述异源多肽与所述COF1/CRBN结合多肽间接连接。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽经由接头可操作地连接，所述接头是例如，甘氨酸-丝氨酸接头，例如包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的接头。在一些实施例中，所述接头包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ IDNO:28、37、38、39和99。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽的C-末端连接。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽的N-末端连接。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽在所述异源多肽的中部。
在一些实施例中，在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与小脑蛋白(cereblon)(CRBN)的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下，COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。在一些实施例中，在不存在COF1的情况下，所述COF1/CRBN结合多肽不与CRBN结合。在一些实施例中，在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。在一些实施例中，在不存在COF1的情况下，所述融合多肽不与CRBN结合。在一些实施例中，所述缔合或结合是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。在一些实施例中，在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。在一些实施例中，在COF1的存在下，所述异源多肽或所述融合多肽在一个或多个赖氨酸或甲硫氨酸残基处被泛素化。在一些实施例中，所述泛素化是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。在一些实施例中，在COF1的存在下，所述融合多肽的降解由泛素化介导。在一些实施例中，所述融合多肽的降解由溶酶体介导。在一些实施例中，所述降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述融合多肽是细胞表面多肽。在一些实施例中，在不存在COF1的情况下所述融合多肽从细胞表面到细胞内区室的再循环率不超过在COF1存在(例如过量的COF1)下所述融合多肽从细胞表面到细胞内区室的再循环率的例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如，如本文所述的测定所测量。在一些实施例中，所述再循环是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽的长度在10和95个氨基酸残基之间、在15和90个氨基酸残基之间、在20和85个氨基酸残基之间、在25和80个氨基酸残基之间、在30和75个氨基酸残基之间、在35和70个氨基酸残基之间、在40和65个氨基酸残基之间、在45和65个氨基酸残基之间、在50和65个氨基酸残基之间或在55和65个氨基酸残基之间。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含β转角。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的β转角。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含β发夹。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的β发夹。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含β链。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的β链。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含α螺旋。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的α螺旋。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。在一些实施例中，所述β发夹和所述第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自天然存在的多肽的COF1/CRBN结合序列或其COF1/CRBN结合变体。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF多肽的COF1/CRBN结合序列或其COF1/CRBN结合变体。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4或IKZF5的COF1/CRBN结合序列，或其COF1/CRBN结合变体。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合序列包含来自天然存在的多肽(例如，天然存在的IKZF多肽，如天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4或IKZF5)的两个或更多个不连续序列。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF多肽或其结构基序。
在一些实施例中，所述IKZF多肽是IKZF1多肽、IKZF3多肽、具有H141Q取代(根据SEQ ID NO:21编号)的IKZF2多肽、或具有H188Q取代(根据SEQ ID NO:22编号)的IKZF4多肽。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF(例如，IKZF1或IKZF3)的足够的氨基酸序列和/或结构基序使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸取代的序列)。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸取代的序列)。
在一些实施例中，以下氨基酸残基中的一个、两个、三个或全部保持不变：根据SEQID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺、在位置148处的半胱氨酸、在位置150处的谷氨酰胺、在位置152处的甘氨酸、在位置161处的亮氨酸或在位置162处的亮氨酸。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺保持不变。在一些实施例中，根据SEQID NO:19编号，在位置148处的半胱氨酸保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置150处的谷氨酰胺保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置152处的甘氨酸保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置161处的亮氨酸保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置162处的亮氨酸保持不变。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-139(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249具有不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸取代的序列)。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQID NO:19的氨基酸残基136-180和236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列(例如，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一序列)，或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列)；和包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的第二序列(例如，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的第二序列)，或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列)。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:85的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:86的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含比相应的天然序列少至少一个赖氨酸。在一些实施例中，在相应的天然序列中的一个或多个赖氨酸残基被不同氨基酸(例如，精氨酸)置换。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含少于1、2、3、4或5个赖氨酸残基。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽不包含赖氨酸残基。在一些实施例中，例如，在COF1的存在下，所述COF1/CRBN结合多肽未被泛素化，例如，如本文所述的测定所测量，任选地其中泛素化是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中所测量的。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含选自下组的任何氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:4、41、42和43。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF1是免疫调节性酰亚胺药(IMiD)或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF1具有式(I-a)的结构：
Figure BDA0002541415150000161
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在，是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
在式(I-a)的一些实施例中，X是O。在一些实施例中，M不存在。在一些实施例中，环A是杂环基(例如，含氮杂环基，例如，2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮)。在一些实施例中，R4是氧代或ORB(例如，-OCH3或-OCH2CH3)，并且o是0、1或2。在一些实施例中，每个R2a和R2b独立地是氢，或R2a和R2b连同它们所附接的碳原子一起形成羰基基团。在一些实施例中，R3a是杂烷基(例如，-CH2NHC(O)CH2)、-N(RC)(RD)(例如，-NH2)或-N(RC)C(O)RA(例如，-NHC(O)CH3)。在一些实施例中，n是0。
在一些实施例中，所述COF1是沙利度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
在一些实施例中，COF1选自下组，该组由以下组成：来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF1选自下组，该组由以下组成：
Figure BDA0002541415150000181
Figure BDA0002541415150000182
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF1是来那度胺或类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF1是来那度胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述融合多肽进一步包含降解结构域，其中所述降解结构域通过异源蛋白酶切割位点与所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。
在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含：
i)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF1/CRBN结合多肽；
ii)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽；
iii)所述COF1/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域；或
iv)所述异源多肽、和所述COF1/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF1/CRBN结合多肽。
在一些实施例中，所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在稳定化合物的存在下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍。
在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述表达水平和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在所述稳定化合物的存在下：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；或
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割。
在一些实施例中，所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。
在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:46或48至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQID NO:46的氨基酸序列，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:50至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施例中，所述稳定化合物是盾护物-1(Shield-1)或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:51至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，所述稳定化合物是甲氧苄啶或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞内蛋白酶切割。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被选自下组的蛋白酶切割，该组由以下组成：弗林蛋白酶(furin)、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶(genenase)、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含具有选自下组的切割基序的序列，该组由以下组成：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)、RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:53)、RRX共有基序(SEQ ID NO:54)、I-E-P-D-X共有基序(SEQ ID NO:55)、Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:63)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶切割。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的弗林蛋白酶切割位点，该组由以下组成：RTKR(SEQ ID NO:123)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:129)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:131)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:133)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:135)；CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:137)；和SARNRQKR(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点不包含SARNRQKR(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)的弗林蛋白酶切割位点。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞外蛋白酶切割。在一些实施例中，哺乳动物细胞外蛋白酶选自下组，该组由以下组成：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ IDNO:63)。
在一个方面，本文提供了融合多肽，所述融合多肽包含由异源蛋白酶切割位点分开的第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含降解结构域，并且所述第二结构域包含具有式(II)的化合物(COF2)/CRBN结合多肽和异源多肽，例如，异源的哺乳动物多肽、细菌多肽或病毒多肽，其中所述具有式(II)的化合物是：
Figure BDA0002541415150000211
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、互变异构体或前药，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同它们所附接的碳原子一起形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R10独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE或L-标签；其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R11取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、C(O)RA、-C(O)ORB或B、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R11独立地是C1-C6烷基、卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA；
每个L独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、-C(O)RA1、-C(O)ORB1、-ORB1、-N(RC1)(RD1)、-C(O)N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RA1、-S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)或-N(RC1)S(O)xRE1，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个标签是能够与靶蛋白结合的靶向部分；
每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个R12独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、碳环基或杂环基；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在稳定化合物的存在下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍。
在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述表达水平和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在所述稳定化合物的存在下：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；或
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割。
在一些实施例中，所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。
在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:46或48至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQID NO:46的氨基酸序列，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:50至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施例中，所述稳定化合物是盾护物-1(Shield-1)或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:51至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，所述稳定化合物是甲氧苄啶或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞内蛋白酶切割。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被选自下组的蛋白酶切割，该组由以下组成：弗林蛋白酶(furin)、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶(genenase)、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含具有选自下组的切割基序的序列，该组由以下组成：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)、RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:53)、RRX共有基序(SEQ ID NO:54)、I-E-P-D-X共有基序(SEQ ID NO:55)、Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:63)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶切割。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的弗林蛋白酶切割位点，该组由以下组成：RTKR(SEQ ID NO:123)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:129)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:131)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:133)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:135)；CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:137)；和SARNRQKR(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点不包含SARNRQKR(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)的弗林蛋白酶切割位点。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞外蛋白酶切割。在一些实施例中，哺乳动物细胞外蛋白酶选自下组，该组由以下组成：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ IDNO:63)。
在一些实施例中，所述降解结构域与所述异源蛋白酶切割位点融合，所述异源蛋白酶切割位点进一步与所述第二结构域融合。
在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含：
i)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF2/CRBN结合多肽；
ii)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述COF2/CRBN结合多肽和所述异源多肽；
iii)所述COF2/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域；或
iv)所述异源多肽、和所述COF2/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF2/CRBN结合多肽。在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含降解结构域、异源蛋白酶切割位点、COF2/CRBN结合多肽和异源多肽。在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含所述COF2/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含所述异源多肽、和所述COF2/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
在一些实施例中，在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与小脑蛋白(cereblon)(CRBN)的缔合不超过在COF2的存在(例如过量的COF2)下，COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。在一些实施例中，在不存在COF2的情况下，所述COF2/CRBN结合多肽不与CRBN结合。在一些实施例中，在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。在一些实施例中，在不存在COF2的情况下，所述融合多肽不与CRBN结合。在一些实施例中，所述缔合和/或结合是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。在一些实施例中，在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。在一些实施例中，在COF2的存在下，所述异源多肽或所述融合多肽在一个或多个赖氨酸或甲硫氨酸残基处被泛素化。在一些实施例中，所述泛素化是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。在一些实施例中，在COF2的存在下，所述融合多肽的降解由泛素化介导。在一些实施例中，所述降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽的长度在10和95个氨基酸残基之间、在15和90个氨基酸残基之间、在20和85个氨基酸残基之间、在25和80个氨基酸残基之间、在30和75个氨基酸残基之间、在35和70个氨基酸残基之间、在40和65个氨基酸残基之间、在45和65个氨基酸残基之间、在50和65个氨基酸残基之间或在55和65个氨基酸残基之间。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含β转角。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的β转角。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含β发夹。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的β发夹。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含β链。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的β链。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含α螺旋。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的α螺旋。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(例如，人IKZF1或IKZF3)的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。在一些实施例中，所述β发夹和所述第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自天然存在的多肽的COF2/CRBN结合序列或其COF2/CRBN结合变体。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF多肽的COF2/CRBN结合序列或其COF2/CRBN结合变体。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4或IKZF5的COF2/CRBN结合序列，或其COF2/CRBN结合变体。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合序列包含来自天然存在的多肽(例如，天然存在的IKZF多肽，如天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4或IKZF5)的两个或更多个不连续序列。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF多肽或其结构基序。
在一些实施例中，所述IKZF多肽是IKZF1多肽、IKZF3多肽、具有H141Q取代(根据SEQ ID NO:21编号)的IKZF2多肽、或具有H188Q取代(根据SEQ ID NO:22编号)的IKZF4多肽。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF(例如，IKZF1或IKZF3)的足够的氨基酸序列和/或结构基序使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸取代的序列)。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸取代的序列)。
在一些实施例中，以下氨基酸残基中的一个、两个、三个或全部保持不变：根据SEQID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺、在位置148处的半胱氨酸、在位置150处的谷氨酰胺、在位置152处的甘氨酸、在位置161处的亮氨酸或在位置162处的亮氨酸。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺保持不变。在一些实施例中，根据SEQID NO:19编号，在位置148处的半胱氨酸保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置150处的谷氨酰胺保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置152处的甘氨酸保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置161处的亮氨酸保持不变。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:19编号，在位置162处的亮氨酸保持不变。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-139(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249具有不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸取代的序列)。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQID NO:19的氨基酸残基136-180和236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列(例如，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一序列)，或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列)；和包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的第二序列(例如，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的第二序列)，或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列)。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:85的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:86的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含比相应的天然序列少至少一个赖氨酸。在一些实施例中，在相应的天然序列中的一个或多个赖氨酸残基被不同氨基酸(例如，精氨酸)置换。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含少于1、2、3、4或5个赖氨酸残基。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽不包含赖氨酸残基。在一些实施例中，例如，在COF2的存在下，所述COF2/CRBN结合多肽未被泛素化，例如，如本文所述的测定所测量，任选地其中泛素化是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中所测量的。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含选自下组的任何氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:4、41、42和43。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述COF2是免疫调节性酰亚胺药(IMiD)或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2具有式(I)的结构：
Figure BDA0002541415150000371
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，所述COF2具有式(I-a)的结构：
Figure BDA0002541415150000381
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在，是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，所述COF2是沙利度胺或其类似物或药学上可接受的盐。在一些实施例中，COF2选自下组，该组由以下组成：来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2选自下组，该组由以下组成：
Figure BDA0002541415150000401
Figure BDA0002541415150000402
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF2是来那度胺或类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF2是来那度胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2包含具有式(I)的结构：
Figure BDA0002541415150000403
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，所述COF2包含具有式(I-a)的结构：
Figure BDA0002541415150000411
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在，是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，所述COF2包含免疫调节性酰亚胺药(IMiD)或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF2包含沙利度胺或其类似物或药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF2包含来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、和2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2包含选自下组的化合物，该组由以下组成：
Figure BDA0002541415150000431
Figure BDA0002541415150000432
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2包含来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF2包含来那度胺或类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF2包含来那度胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述COF2进一步包含配体(例如，其中式(II)中的R10是L-标签)。在一些实施例中，式(II)中的R10是L-标签，L是接头，所述接头选自在国际专利公开号WO2017/024318(例如，图28-31)中披露的接头，并且标签选自在国际专利公开号WO 2017/024318(例如，表T，第119-129页)中披露的dTAG靶向配体。在一些实施例中，所述COF2包含IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和配体，其中所述IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)例如经由接头与配体连接。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽与所述配体结合，并且其中在不存在配体的情况下，所述COF2/CRBN结合多肽与IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)之间的结合不超过所述COF2/CRBN结合多肽与所述配体之间的结合的0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％或10％，例如，所述COF2/CRBN结合多肽不与IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)结合，任选地其中所述COF2/CRBN结合多肽选自国际专利公开号WO 2017/024318(例如，第36-65页)中披露的dTAG。
在一个方面，本文提供了包含具有式(III)的化合物(COF3)/CRBN结合多肽和异源多肽的融合多肽，其中所述具有式(III)的化合物是：
Figure BDA0002541415150000441
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0002541415150000442
任选地是双键；
每个R1独立地是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟基烷基或卤代，或
两个R1连同它们所附接的碳原子一起形成5元或6元杂环基环，或
当在相邻原子上时，两个R1连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基环；
R2是氢、C1-C6烷基、-C(O)C1-C6烷基、-C(O)(CH2)0-3-C6-C10芳基、-C(O)O(CH2)0-3-C6-C10芳基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R5取代，或
当在相邻原子上时，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环基环；
R3是氢，或当
Figure BDA0002541415150000451
是双键时，R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6、-C(O)NR6R6'、-NR6C(O)R6'、卤代、-OH、-NH2、氰基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至4个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2、氰基、C3-C7碳环基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是氢、C1-C6烷基或C6-C10芳基；
每个R7独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-C(O)R8、-(CH2)0-3C(O)OR8、-C(O)NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9、-S(O)pNR8R9、-S(O)pR12、(C1-C6)羟基烷基、卤代、-OH、-O(CH2)1-3CN、-NH2、氰基、-O(CH2)0-3-C6-C10芳基、金刚烷基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的-O(CH2)0-3-5元或6元杂芳基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的单环或二环5元至10元杂芳基、C3-C7碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R11取代，并且所述芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基和C1-C6烷氧基或
两个R7与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)，或
当在相邻原子上时，两个R7连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R10独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基或
两个R10与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)；
每个R11独立地选自氰基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中每个芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基；
R12是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基；
Rx是氢或氘；
p是0、1或2；
n是0、1、或2；
y是1或2，其中n+y≤3；和
q是0、1、2、3或4。
在一个实施例中，具有式(III)的化合物是具有式(III-b)的化合物：
Figure BDA0002541415150000471
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中X1、R1、R2、n、q及其亚变量是如以上针对式(III)的描述所定义。
在一个实施例中，具有式(III)的化合物是具有式(III-d)的化合物：
Figure BDA0002541415150000472
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中R1、R2、q及其亚变量是如以上针对式(III)的描述所定义。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽融合。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽通过肽键连接。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽通过除肽键之外的键连接。在一个实施例中，所述异源多肽与所述COF3/CRBN结合多肽直接连接。在一个实施例中，所述异源多肽与所述COF3/CRBN结合多肽间接连接。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽经由接头可操作地连接，所述接头是例如，甘氨酸-丝氨酸接头，例如，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的接头。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽的C-末端连接。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽的N-末端连接。
在一个实施例中，在不存在COF3的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF3的存在(例如过量的COF3)下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。在一个实施例中，在不存在COF3的情况下，所述融合多肽不与CRBN结合。在一个实施例中，在不存在COF3的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF3的存在(例如过量的COF3)下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。在一个实施例中，在COF3的存在下，所述融合多肽在一个或多个赖氨酸或甲硫氨酸残基处被泛素化。在一个实施例中，在不存在COF3的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF3的存在(例如过量的COF3)下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。在一个实施例中，在COF3的存在下，所述融合多肽的降解由泛素化介导。在一个实施例中，所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽的长度在10和95个氨基酸残基之间、在15和90个氨基酸残基之间、在20和85个氨基酸残基之间、在25和80个氨基酸残基之间、在30和75个氨基酸残基之间、在35和70个氨基酸残基之间、在40和65个氨基酸残基之间、在45和65个氨基酸残基之间、在50和65个氨基酸残基之间或在55和65个氨基酸残基之间。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽的长度是59个氨基酸残基。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含β转角。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含β发夹。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含β链。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含α螺旋。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。在一个实施例中，所述β发夹和所述第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含来自天然存在的多肽的COF3/CRBN结合序列或其COF3/CRBN结合变体。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF多肽的COF3/CRBN结合序列或其COF3/CRBN结合变体。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF2的COF3/CRBN结合序列或其COF3/CRBN结合变体。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF多肽(例如，天然存在的IKZF2)的两个或更多个不连续序列。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基130-174(根据SEQ ID NO:21编号)。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含与IKZF2的氨基酸残基130-174(根据SEQ ID NO:21编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸残基130-174差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含从SEQ ID NO:21的氨基酸残基130-174具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸取代的序列。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基230-243(根据SEQ ID NO:21编号)。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含与IKZF2的氨基酸残基230-243(根据SEQ ID NO:21编号)差异不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸残基230-243差异不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含从SEQ ID NO:21的氨基酸残基230-243具有不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸取代的序列。
在一个实施例中，根据SEQ ID NO:21编号，在位置141处的组氨酸保持不变。
在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基130-174(根据SEQ ID NO:21编号)。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基230-243(根据SEQ ID NO:21编号)。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一个实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施例中，所述融合多肽进一步包含降解结构域，其中所述降解结构域与所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽被异源蛋白酶切割位点分开。
在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含：
i)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF3/CRBN结合多肽；
ii)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽；
iii)所述COF3/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域；或
iv)所述异源多肽、和所述COF3/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
在一些实施例中，所述融合多肽从N-末端至C-末端包含所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF3/CRBN结合多肽。
在一些实施例中，所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在稳定化合物的存在下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍。
在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述表达水平和/或降解是如在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中测量的。
在一些实施例中，在所述稳定化合物的存在下：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；或
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割。
在一些实施例中，所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。
在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:46或48至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQID NO:46的氨基酸序列，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:50至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施例中，所述稳定化合物是盾护物-1(Shield-1)或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:51至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，所述稳定化合物是甲氧苄啶或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞内蛋白酶切割。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被选自下组的蛋白酶切割，该组由以下组成：弗林蛋白酶(furin)、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶(genenase)、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含具有选自下组的切割基序的序列，该组由以下组成：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)、RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:53)、RRX共有基序(SEQ ID NO:54)、I-E-P-D-X共有基序(SEQ ID NO:55)、Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:63)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶切割。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的弗林蛋白酶切割位点，该组由以下组成：RTKR(SEQ ID NO:123)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:129)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:131)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:133)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:135)；CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:137)；和SARNRQKR(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点不包含SARNRQKR(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)的弗林蛋白酶切割位点。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞外蛋白酶切割。在一些实施例中，哺乳动物细胞外蛋白酶选自下组，该组由以下组成：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ IDNO:63)。
在前述方面的某些实施例中，所述异源多肽选自细胞质多肽和/或细胞核多肽或跨膜多肽，例如，在表2中的异源多肽。在一些实施例中，所述细胞质多肽和/或细胞核多肽选自下组，该组由以下组成：细胞凋亡途径的组分(例如，半胱天冬酶9)、CRISPR/Cas系统的组分(例如，Cas9)、转录因子(例如，MITF、c-Myc、STAT3、STAT5、NF-κB、β-连环蛋白、Notch、GLI或c-JUN)、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)、FKBP和Tau。在一些实施例中，所述跨膜多肽选自下组，该组由以下组成：CD62L、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CCR10、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CTLA4、PD1、BTLA、VISTA、CD137L、CD80、CD86、TIGIT、CD3、CD8、CD19、CD22、CD20、BCMA和嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述异源多肽选自下组，该组由以下组成：嵌合抗原受体(CAR)、CRISPR/Cas系统的组分(例如，Cas9)、CD8、CD19和CD22。
在一些实施例中，所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，所述细胞内信号传导结构域包含一个或多个初级信号传导结构域。在一些实施例中，所述细胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，所述一个或多个初级信号传导结构域中的一个包含CD3-ζ刺激结构域。在一些实施例中，所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个是细胞内结构域，所述细胞内结构域来自选自下组的共刺激蛋白，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施例中，所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施例中，所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个包含CD28共刺激结构域。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是scFv。
在一些实施例中，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原，该组由以下组成：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和阿贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因多肽(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑色素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；天冬酰胺内肽酶(legumain)；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。在一些实施例中，所述抗原选自CD19、CD22、BCMA、CD20、CD123、EGFRvIII或间皮素。在一些实施例中，所述抗原是CD19。在一些实施例中，所述抗原是CD22。在一些实施例中，所述抗原是BCMA。在一些实施例中，所述抗原是CD20。在一些实施例中，所述抗原是CD123。在一些实施例中，所述抗原是EGFRvIII。
在一个方面，本文提供了编码本文披露的融合多肽的核酸分子。在另一方面，本文提供了包含所述核酸分子的载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述载体是慢病毒载体。在另一方面，本文提供了包含所述载体的病毒颗粒。
在另一方面，本文提供了细胞(例如宿主细胞)，所述细胞包含本文披露的融合多肽、本文披露的核酸分子或本文披露的载体。在一些实施例中，所述细胞(例如宿主细胞)是哺乳动物细胞，例如人细胞，如人效应细胞，如人T细胞或人NK细胞。
在一些实施例中，所述细胞(例如宿主细胞)是表达CAR的细胞，例如CAR-T细胞。在一些实施例中，所述细胞(例如宿主细胞)包含CRISPR/Cas系统的组分。在一些实施例中，所述细胞(例如宿主细胞)是人癌症细胞，例如人肿瘤细胞。
在一些实施例中，所述细胞(例如，宿主细胞)包含泛素连接酶复合物(例如E3泛素连接酶复合物)，其中所述泛素连接酶复合物包含CRBN。
在一些实施例中，所述细胞包含本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN结合多肽和异源多肽的融合多肽)，其中当所述细胞与COF1(例如过量的COF1)接触时：
i)所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞不与COF1接触时所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)所述融合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)所述异源多肽的泛素化与当所述细胞不与COF1接触时所述异源多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)所述融合多肽的泛素化与当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
v)所述融合多肽的降解与当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽的降解相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
vi)所述融合多肽的表达水平不超过当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽的表达水平的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述细胞进一步包含COF1，例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述细胞包含本文披露的融合多肽(例如，包含COF3/CRBN结合多肽和异源多肽的融合多肽)，其中当所述细胞与COF3(例如过量的COF3)接触时：
i)所述COF3/CRBN结合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞不与COF3接触时所述COF3/CRBN结合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)所述融合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞不与COF3接触时所述融合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)所述异源多肽的泛素化与当所述细胞不与COF3接触时所述异源多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)所述融合多肽的泛素化与当所述细胞不与COF3接触时所述融合多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
v)所述融合多肽的降解与当所述细胞不与COF3接触时所述融合多肽的降解相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
vi)所述融合多肽的表达水平不超过当所述细胞不与COF3接触时所述融合多肽的表达水平的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述细胞进一步包含COF3，例如，在表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述细胞包含本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的融合多肽，异源多肽和降解结构域)，其中在不存在稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述融合多肽进一步包含异源蛋白酶切割位点。在一些实施例中，所述细胞进一步包含能够切割异源蛋白酶切割位点的蛋白酶。
在一些实施例中，所述细胞包含本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，异源多肽和降解结构域的融合多肽)，其中当所述细胞与稳定化合物(例如过量的稳定化合物)接触时：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
iii)所述融合多肽的表达水平与当所述细胞不与所述稳定化合物接触时所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述细胞进一步包含稳定化合物。在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述细胞包含本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，异源多肽和降解结构域的融合多肽)，其中当所述细胞与稳定化合物(例如，过量的稳定化合物)和COF1、COF2或COF3(例如过量的COF1、COF2或COF3)接触时：
i)所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1、COF2或COF3接触时所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽与CRBN的缔合相比增加至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)所述融合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1、COF2或COF3接触时所述融合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)所述异源多肽的泛素化与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1、COF2或COF3接触时所述异源多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)所述融合多肽的泛素化与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1、COF2或COF3接触时所述融合多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
v)所述融合多肽的降解与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1、COF2或COF3接触时所述融合多肽的降解相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
vi)所述融合多肽的表达水平不超过当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1、COF2或COF3接触时所述融合多肽的表达水平的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述细胞进一步包含COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)、COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)或COF3(在表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐)。
在一些实施例中，所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
在一个方面，本文披露了药物组合物，所述药物组合物包含本文披露的融合多肽或本文披露的细胞，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。
在一个方面，本文披露了制备本文披露的细胞的方法。
在一个方面，本文披露了降解本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽)的融合多肽)的方法，所述方法包括使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)接触。在一些实施例中，在COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。在一些实施例中，使所述融合多肽或所述细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)离体接触。在一些实施例中，使所述融合多肽或所述细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)在体内接触。
在一个方面，本文披露了调节本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽、异源多肽(例如，CAR多肽)和降解结构域的融合多肽)表达的方法，所述方法包括：
i)使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与稳定化合物接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下：
a)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
b)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
c)所述融合多肽的表达水平与在不存在所述稳定化合物的情况下的所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述方法进一步包括，在步骤i)之后：
ii)使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)或COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)接触，任选地其中在COF1或COF2的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在一些实施例中，使所述融合多肽或所述细胞与COF1或COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和/或所述稳定化合物离体接触。在一些实施例中，使所述融合多肽或所述细胞与COF1或COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和/或所述稳定化合物在体内接触。
在一些实施例中，所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
在一个方面，本文披露了制备细胞的方法，所述方法包括：
i)提供包含编码融合多肽的核酸分子的细胞，所述融合多肽包含具有式1的化合物(COF1)/CRBN结合多肽和嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域；和
ii)使所述细胞与COF1离体接触，任选地其中：
在COF1的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF1的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，其中所述具有式(I)的化合物是：
Figure BDA0002541415150000631
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，在所述细胞与COF1离体接触后，所述细胞的增殖相对于在与COF1接触之前所述细胞的增殖增加了至少例如1.2、1.5、2、5或10倍。在一些实施例中，COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)使本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF1/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽))与COF1离体接触，任选地其中：
在COF1的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF1离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，并且
ii)向所述受试者施用有效量的所述细胞，任选地其中所述方法进一步包括在步骤i)之后且在步骤ii)之前：
减少与所述细胞接触的，例如所述细胞内和/或所述细胞周围的COF1的量，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)向所述受试者施用有效量的COF1，任选地其中COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF1的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF1的施用减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)中止COF1的施用，任选地其中中止COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤iii)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF1的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤ii)之后且在步骤iii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF1施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF1施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤iii)和/或iv)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。在一些实施例中，COF1是来那度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中将来那度胺或其药学上可接受的盐按例如2.5mg、5mg、10mg、15mg或25mg/天施用。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF1/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽))，任选地其中在施用之前使所述细胞与COF1离体接触，任选地其中：
在COF1的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF1离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中在所述细胞与COF1离体接触之后且在向受试者施用所述细胞之前，减少与所述细胞接触的，例如在所述细胞内和/或在所述细胞周围的COF1的量，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，在施用之前，所述细胞不与COF1离体接触。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)向所述受试者施用有效量的COF1，任选地其中COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF1的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF1的施用减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)中止COF1的施用，任选地其中中止COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF1的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤i)之后且在步骤ii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF1施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF1施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)重复步骤ii)和/或iii)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。在一些实施例中，COF1是来那度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中将来那度胺或其药学上可接受的盐按例如2.5mg、5mg、10mg、15mg或25mg/天施用。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向受试者施用有效量的COF1，其中所述受试者包含本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF1/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽))，任选地其中相对于在施用COF1之前所述融合多肽的表达水平，施用COF1降低了所述融合多肽的表达水平的例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF1的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF1的施用减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止COF1的施用，任选地其中中止COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF1的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在COF1的施用之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF1施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF1施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)重复步骤i)和/或ii)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。在一些实施例中，COF1是来那度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中将来那度胺或其药学上可接受的盐按例如2.5mg、5mg、10mg、15mg或25mg/天施用。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用：
(1)稳定化合物，和
(2)有效量的本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽、异源多肽(例如，CAR多肽)和降解结构域)，任选地其中：
在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者应答步骤i)的治疗(例如，所述受试者对所述步骤i)的治疗具有完全响应，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)，和/或
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者对步骤i)的治疗的应答(例如，所述受试者对步骤i)的治疗具有完全应答，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述稳定化合物的施用的中止减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
iv)中止所述稳定化合物的施用并且向所述受试者施用有效量的COF1或COF2，任选地其中步骤iv)将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)步骤iv)响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)步骤iv)减少或预防副作用。在一些实施例中，所述副作用是急性毒性。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)例如，在表面上表达所述融合多肽的细胞的量小于预定值持续例如，1天、5天、10天或15天之后，中止COF1或COF2的施用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后：
vi)施用有效量的稳定化合物，任选地其中所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后且在步骤vi)之前的所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述稳定化合物的施用响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述稳定化合物的施用治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤vi)之后：
vii)重复步骤iii)、iv)、v)或vi)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之前：
viii)使所述细胞与稳定化合物离体接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平。
在一些实施例中，在施用之前，所述细胞不与所述稳定化合物离体接触。在一些实施例中，在施用之前，所述细胞不与稳定化合物、COF1或COF2中的任一者离体接触。
在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐，并且任选地其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在一些实施例中，COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
在一些实施例中，COF2是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF2/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
在一些实施例中，COF1或COF2是来那度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中将来那度胺或其药学上可接受的盐按例如2.5mg、5mg、10mg、15mg或25mg/天施用。
在一个方面，本文披露了降解本文披露的融合多肽(例如，包含COF3/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽)的融合多肽)的方法，所述方法包括使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF3(例如，表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐)接触。在一个实施例中，在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF3的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。在一个实施例中，所述融合多肽或所述细胞与COF3离体接触。在一个实施例中，所述融合多肽或所述细胞与COF3在体内接触。
在一个方面，本文披露了调节本文披露的融合多肽(例如，包含COF3/CRBN结合多肽、异源多肽(例如，CAR多肽)和降解结构域的融合多肽)表达的方法，所述方法包括：
i)使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与稳定化合物接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下：
a)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
b)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
c)所述融合多肽的表达水平与在不存在所述稳定化合物的情况下的所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述方法进一步包括，在步骤i)之后：
ii)使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF3(例如，表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐)接触，任选地其中在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一些实施例中，所述融合多肽或所述细胞与COF3离体接触。在一些实施例中，所述融合多肽或所述细胞与COF3在体内接触。在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在一个方面，本文披露了制备细胞的方法，所述方法包括：
i)提供包含编码融合多肽的核酸分子的细胞，所述融合多肽包含COF3/CRBN结合多肽和嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域；和
ii)使所述细胞与COF3离体接触，任选地其中：
在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF3的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)使本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF3/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽))与COF3离体接触，任选地其中：
在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF3离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，并且
ii)向所述受试者施用有效量的所述细胞，任选地其中所述方法进一步包括在步骤i)之后且在步骤ii)之前：
减少与所述细胞接触的，例如所述细胞内和/或所述细胞周围的COF3的量，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)向所述受试者施用有效量的COF3，任选地其中COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF3的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF3的施用减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)中止COF3的施用，任选地其中中止COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤iii)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF3的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤ii)之后且在步骤iii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF3施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF3施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤iii)和/或iv)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，COF3是在表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF3/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽))，任选地其中在施用之前使所述细胞与COF3离体接触，任选地其中：
在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF3离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中在所述细胞与COF3离体接触之后且在向受试者施用所述细胞之前，减少与所述细胞接触的，例如在所述细胞内和/或在所述细胞周围的COF3的量，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，在施用之前，所述细胞不与COF3离体接触。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)向所述受试者施用有效量的COF3，任选地其中COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF3的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF3的施用减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)中止COF3的施用，任选地其中中止COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF3的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤i)之后且在步骤ii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF3施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF3施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)重复步骤ii)和/或iii)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，COF3是在表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向受试者施用有效量的COF3，其中所述受试者包含本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF3/CRBN结合多肽和异源多肽(例如，CAR多肽))，任选地其中相对于在施用COF3之前所述融合多肽的表达水平，施用COF3降低了所述融合多肽的表达水平的例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF3的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF3的施用减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止COF3的施用，任选地其中中止COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF3的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在COF3的施用之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF3施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF3施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)重复步骤i)和/或ii)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，COF3是在表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用：
(1)稳定化合物，和
(2)有效量的本文披露的细胞(例如，包含融合多肽的细胞，所述融合多肽包含COF3/CRBN结合多肽、异源多肽(例如，CAR多肽)和降解结构域)，任选地其中：
在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者应答步骤i)的治疗(例如，所述受试者对所述步骤i)的治疗具有完全响应，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)，和/或
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者对步骤i)的治疗的应答(例如，所述受试者对步骤i)的治疗具有完全应答，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述稳定化合物的施用的中止减少或预防副作用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
iv)中止所述稳定化合物的施用并且向所述受试者施用有效量的COF3，任选地其中步骤iv)将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)步骤iv)响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)步骤iv)减少或预防副作用。在一些实施例中，所述副作用是急性毒性。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)例如，在表面上表达所述融合多肽的细胞的量小于预定值持续例如，1天、5天、10天或15天之后，中止COF3的施用。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后：
vi)施用有效量的稳定化合物，任选地其中所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后且在步骤vi)之前的所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述稳定化合物的施用响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述稳定化合物的施用治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤vi)之后：
vii)重复步骤iii)、iv)、v)或vi)，
从而治疗所述疾病。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤i)之前：
viii)使所述细胞与稳定化合物离体接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平。
在一些实施例中，在施用之前，所述细胞不与所述稳定化合物离体接触。
在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐，并且任选地其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在一些实施例中，COF3是在表29中披露的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述融合多肽的异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
在一个方面，本发明还提供了本文披露的用作药物的融合多肽、核酸分子、载体、病毒颗粒、细胞或药物组合物。在一个方面，本发明还提供了本文披露的用于在治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者中使用的融合多肽、核酸分子、载体、病毒颗粒、细胞或药物组合物。
在前述方法的某些实施例中，所述与肿瘤抗原表达相关的疾病是癌症。
在一些实施例中，所述癌症是间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)，例如在对至少一种先前标准疗法已经进展的受试者中；肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌)；胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌或转移性胰腺导管腺癌(PDA)，例如在对至少一种先前标准疗法已经进展的受试者中)；食管腺癌、卵巢癌(例如，浆液性上皮性卵巢癌，例如在至少一种先前标准疗法方案后已经进展的受试者中)、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌，或其任何组合。
在一些实施例中，所述与肿瘤抗原表达相关的疾病是血液学癌症，例如，选自白血病或淋巴瘤的血液学癌症。
在一些实施例中，所述癌症选自：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
在一些实施例中，所述癌症选自MCL、CLL、ALL、霍奇金淋巴瘤、AML或多发性骨髓瘤。
在前述方法的某些实施例中，所述细胞对所述受试者是自体的。在前述方法的某些实施例中，所述细胞对所述受试者是同种异体的。在一些实施例中，所述细胞是表达CAR的细胞，例如CART细胞。
在一些实施例中，在施用COF1、COF2或COF3之前，所述受试者被施用表达至少一种本文披露的融合多肽的细胞。
在一个方面，本文披露的是鉴定与具体生物学表型相关的遗传元件，例如与癌症的发展和/或进展相关的遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过将所述细胞暴露于COF1或COF3(例如，来那度胺或其药学上可接受的盐)，调节本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽的融合多肽)在细胞中的表达，
(ii)选择具有目的表型，例如与癌症的发展和/或进展相关的表型的细胞，和
(iii)鉴定诱导所述目的表型的所述融合多肽，
其中所述细胞暴露于COF1或COF3(例如来那度胺或其药学上可接受的盐)将所述融合多肽的表达水平相对于在暴露于COF1或COF3(例如来那度胺或其药学上可接受的盐)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一个方面，本文披露的是鉴定与具体生物学表型相关的遗传元件，例如与癌症的发展和/或进展相关的遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过将所述细胞暴露于稳定化合物(例如，巴多昔芬或其药学上可接受的盐)，并然后暴露于COF1、COF2或COF3(例如，来那度胺或其药学上可接受的盐)，调节本文披露的融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，异源多肽和降解结构域的融合多肽)在细胞中的表达，
(ii)选择具有目的表型，例如与癌症的发展和/或进展相关的表型的细胞，和
(iii)鉴定诱导所述目的表型的所述融合多肽，
其中所述细胞暴露于所述稳定化合物(例如，巴多昔芬或其药学上可接受的盐)将所述融合多肽的表达水平相对于在暴露于所述稳定化合物(例如，巴多昔芬或其药学上可接受的盐)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，并且其中所述细胞暴露于COF1、COF2或COF3(例如，来那度胺或其药学上可接受的盐)将所述融合多肽的表达水平相对于在暴露于所述稳定化合物之后且在暴露于COF1或COF2(例如沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺))或COF3(例如，在表29中披露的化合物)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在前述方面的某些实施例中，所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)多肽。在一些实施例中，所述CAR多肽包含本文披露的氨基酸序列，例如在表3中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗CD19CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如在表5、表6、表7和表30中任一个中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗CD123 CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如在表8、表9、表10、表11、表12、表13和表14中任一个中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗BCMA CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如在表15、表16、表17、表18和表31中任一个中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗CD22 CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如在表19和表20中任一个中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗CD20 CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如在表32中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗EGFRvIII CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如在表33中披露的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR多肽是抗间皮素CAR多肽，并且包含本文披露的氨基酸序列，例如，在表34中披露的氨基酸序列。
在前述方面的某些实施例中，所述融合多肽包含本文披露的氨基酸序列，例如在表4或表28中披露的氨基酸序列。
在前述方面的某些实施例中，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽包含本文披露的氨基酸序列，例如表1中披露的氨基酸序列。
在前述方面的某些实施例中，所述降解结构域包含本文披露的氨基酸序列，例如在表22中披露的氨基酸序列。
在前述方面的某些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包含本文披露的氨基酸序列，例如，在表23中披露的氨基酸序列。
附图说明
图1A是经由16甘氨酸-丝氨酸接头与纳米萤光素酶融合的HilD-标签IKZF3 136-180和236-249降解决定子的示意图。图1B是显示从HEK293T细胞测量的发光水平的图，所述HEK293T细胞用50ng编码与IKZF3 136-180和236-249连接的纳米萤光素酶的pNL1.1CMV构建体反转染。如与仅用DMSO处理的细胞相比，IKZF3 136-180和236-249促进在用1μM、10μM或100μM来那度胺处理6小时的细胞中发光的减少。MG132处理阻断纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解。
图2是蛋白质印迹，显示在用编码带IKZF3 136-180和236-249标签的纳米萤光素酶的pNL1.1CMV构建体转染的HEK293GT细胞中，IKZF3 136-180和236-249促进的纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解(IC50＝10nM)。在类似转染的HEK293GT小脑蛋白(CRBN)KO细胞中未观察到来那度胺依赖性降解。用蛋白酶体抑制剂MG132处理阻断IKZF3 136-180和236-249促进来那度胺依赖性降解的能力。
图3A是描绘包含侧翼于发夹的两个β片和α螺旋的IKZF3 136-180以及被预测为另外的α螺旋的IKZF3 236-249的示意图。示意图下面是IKZF3 136-180降解决定子的缩短版本(消除在N-末端和C-末端上的氨基酸(按出现顺序，分别是SEQ ID NO:3、5和7-10))的图表。图3B是显示来自如下研究结果的蛋白质印迹，所述研究测试与不同的基于IKZF3的降解标签融合的纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解。所述基于IKZF3的降解标签与纳米萤光素酶的N-末端融合，克隆进pNL1.1CMV载体中，并转染到HEK293T细胞中。在通过蛋白质印迹分析之前，将所述经转染的细胞用DMSO或10μM来那度胺处理4小时。针对纳米萤光素酶(“Nanoluc”)显示了两次曝光(长时间和短时间曝光)。IKZF3 136-180和236-249、IKZF3136-180和236-249K245R、IKZF3 136-180和236-249K245S、IKZF3 136-180MALEK以及IKZF3136-170MALEK全部促进来那度胺诱导的降解，然而IKZF3 140-170MALEK、IKZF3 141-163MALEK和IKZF3 145-155MALEK不介导来那度胺诱导的降解。
图4A和4B是蛋白质印迹图，显示在HEK293T细胞中带IKZF3136-180标签的纳米萤光素酶(图4A)或带IKZF3 136-170MALEK标签的纳米萤光素酶(图4B)的来那度胺依赖性降解，其中在两种情况下用来那度胺处理2小时的IC50为大约100nM。使用pNL1.1CMV构建体表达带标签的纳米萤光素酶融合物。图4C是蛋白质印迹，显示在HEK293T细胞中带IKZF3 136-180标签的纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解的时间过程，其中显示早在1小时降解并且到4小时几乎完全降解。使用pNL1.1CMV构建体表达带标签的纳米萤光素酶融合物。
图5A是蛋白质印迹，显示带IKZF3 136-180和236-249标签的黑素原生成相关的转录因子(MITF)(左图)以及带IKZF3 136-180标签的MITF(右图)的来那度胺依赖性降解。使用pNL1.1CMV构建体，将所述带标签的MITF融合物转染到HEK293T中。带IKZF3 136-180和236-249标签的MITF的降解显示IC50为约100nM。该降解依赖于蛋白酶体的活性，因为降解被MG132处理阻断。IKZF3 136-180还介导来那度胺依赖性降解，尽管比IKZF3 136-180和236-249的程度更低。图5B是蛋白质印迹，显示带IKZF3 136-180和236-249标签的MITF(左图)以及带IKZF3 136-180标签的MITF(右图)的在将表达这些融合蛋白质的细胞用10μM来那度胺处理不同时间后的来那度胺依赖性降解。在经测试的时间点中，4小时处理显示最大量的降解。
图6A和6B是显示用IKZF3 136-180和236-249(图6A)或IKZF3 136-180和236-249加标签的MITF的来那度胺依赖性降解的蛋白质印迹图，其中在所述标签中的每个赖氨酸残基突变为精氨酸(“不含赖氨酸的IKZF3 136-180和236-249”)(图6B)。将使用pNL1.1CMV构建体表达带标签的MITF融合物的HEK293T细胞用不同浓度的来那度胺处理24小时。对于带IKZF3 136-180和236-249标签的MITF(图6A)，IC50为大约10nM，并且对于带不含赖氨酸的IKZF3 136-180和236-249标签的MITF(图6B)，IC50低于100nM。在两种情况下，来那度胺依赖性降解依赖于蛋白酶体，因为降解可以通过蛋白酶体抑制剂MG132被阻断。该数据表明MITF，而不是IKZF3降解决定子标签被泛素化。图6C是蛋白质印迹，显示带不含赖氨酸的IKZF3 136-180和236-249标签的MITF的来那度胺依赖性降解。将使用pNL1.1CMV构建体表达带标签的MITF融合物的HEK293T细胞用10μM来那度胺处理2小时、4小时、8小时或24小时。图6D是带IKZF3 136-180和236-249标签的MITF(左图)以及带不含赖氨酸的IKZF3 136-180和236-249标签的MITF(右图)的蛋白质印迹。在所述细胞经历蛋白质印迹分析之前，将使用pNL1.1CMV构建体表达带标签的MITF融合物的HEK293T细胞用10μM来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、可以与CRBN结合但不与IKZF1或IKZF3结合的阴性对照IMiD、或DMSO中的任一者处理24小时。泊马度胺比来那度胺介导带标签的MITF的略微更大程度的降解，然而沙利度胺在介导这种降解方面效力要低得多。
图7是显示蛋白质印迹，显示带IKZF3 136-180Q147H标签的MITF的来那度胺依赖性降解。将用编码带标签的MITF融合物的pNL1.1CMV构建体转染的HEK293T细胞用不同剂量的来那度胺处理24小时。在来那度胺的存在下，带IKZF3 136-180Q147H标签的MITF不显示降解。
图8是蛋白质印迹，显示带IKZF3 136-180和236-249标签的禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因(MYC)同系物的来那度胺依赖性降解，其中IC50为大约10nM。将使用pNL1.1CMV构建体表达带标签的MYC融合物的HEK293T细胞用不同剂量的来那度胺处理4小时。
图9A是蛋白质印迹，显示C-末端带降解决定子标签的单通膜蛋白CD3ζ、CD8/CD3ζ嵌合体、CD8、CD19和CD22的4小时来那度胺依赖性降解。将Jurkat细胞用pNGX_LV_V002-CDx-IKZF3 136-180和236-249构建体病毒感染，用G418选择，并用10μM来那度胺或DMSO处理。在图9A中显示的是使用抗V5抗体(显示了长时间的1min暴露和短时间的1秒暴露)和抗β-肌动蛋白抗体进行染色。所有构建体表达并在10μM来那度胺处理情况下降解。图9A中的表显示针对每种蛋白质的蛋白质分子量(MW)、胞质氨基酸残基(“胞质AA”)的数目和胞质赖氨酸的数目。有趣地，降解与胞质氨基酸(“AA”)总数的相关性比与胞质赖氨酸残基的数目的相关性更好。图9B、9C和9D是蛋白质印迹图，显示C-末端带标签的CD19(图9B)、C-末端带标签的CD3ζ(图9C)和C-末端带标签的CD8/CD3ζ(图9D)的来那度胺依赖性降解。将表达带IKZF3 136-180和236-249标签的CD19、CD3ζ或CD8/CD3ζ的细胞用10μM来那度胺处理6小时或用不同剂量的来那度胺处理24小时。在图9B中，带IKZF3 136-180和236-249标签的CD19的降解显示IC50为大约100nM，并且强降解在6小时处检测到。在图9C中显示的带IKZF3136-180和236-249标签的CD3ζ的降解比带IKZF3 136-180和236-249标签的CD19的降解更弱。在细胞用10μM来那度胺处理24小时后，带标签的CD3ζ的降解明显。在图9D中显示的带IKZF3 136-180和236-249标签的CD8/CD3ζ的降解比带IKZF3 136-180和236-249标签的CD3ζ的降解更强。
图10A、10B、10C和10D是一系列流式细胞术直方图，比较在用1μM或10μM来那度胺处理1小时(图10A)、6小时(图10B)、16小时(图10C)或24小时(图10D)的Jurkat细胞上的带IKZF3 136-180和236-249标签的CD19的细胞表面表达。在用10μM来那度胺处理之前，将一些细胞用10μM MG132预处理。DMSO充当媒介物对照。IKZF3136-180和236-249与CD19的C-末端融合。图10E和10F是柱状图，显示跨越经测试的全部来那度胺剂量和时间点的CD19阳性细胞％(图10E)或CD19阳性细胞的平均荧光强度(MFI)(图10F)。在1小时处降解最小，并且在6小时处轻微降解。在1μM和10μM处理组中，降解在16和24小时处降解更明显，并且这种降解可以通过蛋白酶体抑制剂MG132被部分阻断。在1μM和10μM处理组中，在16小时处，CD19阳性细胞减少大约50％(图10E)，并且这种减少与MFI的减少相对应(图10F)。
图11是示意图，显示示例性融合蛋白，所述示例性融合蛋白包含降解结构域(降解决定子)、蛋白酶切割位点、和第二蛋白结构域(CAR)，以及在药物(例如稳定化合物)的存在下融合蛋白的降解的变化。
图12A、12B和12C是显示与FurON(图12A)、HilD(图12B)或FurON和HilD二者(图12C)融合的CAR分子的调节的示意图。如图12A中所示，与FurON融合的CAR可以通过施用稳定化合物(例如，与降解结构域结合并使之稳定的小分子配体，例如，巴多昔芬(BZA))来启动或通过取出所述稳定化合物来关闭。如在图12B中所示，与HilD标签融合的CAR可以通过施用IMiD化合物(例如，l来那度胺或泊马度胺)来关闭并且通过停止施用IMiD化合物来再次启动。如在图12C中所示，与FurON和HilD标签二者融合的CAR可以通过施用所述稳定化合物来启动，通过中止所述稳定化合物并施用IMiD化合物来关闭，并且通过中止IMiD化合物并施用所述稳定化合物来再次启动。组合FurON开关和HilD开关为CAR分子的表达和活性增加另外的调节层。
图13A、13B和13C是显示CAR分子的来那度胺依赖性降解的蛋白质印迹图。在蛋白质印迹分析之间，将表达构建体765(FurON_CAR19)(图13A)、构建体766(FurON_CAR19_16GS_HilD标签_V5)(图13B)或构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)(图13C)的JNL细胞在10μM来那度胺(“+”)或DMSO(“-”)的存在下孵育24小时。使全部的样品接受1μM巴多昔芬。“A”代表用275μL病毒上清液转导的细胞。“B”代表用700μL病毒上清液转导的细胞。
图14A、14B、14C和14D是显示CAR分子的来那度胺依赖性降解的蛋白质印迹图。在蛋白质印迹分析之前，将表达构建体771(CAR19_HilD标签_V5)(图14A)、构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)(图14B)、构建体768(CAR19_16GS_HilD标签_V5)(图14C)或构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)的JNL细胞在10μM来那度胺(“+”)或DMSO(“-”)的存在下孵育24小时。“A”代表用275μL病毒上清液转导的细胞。“B”代表用700μL病毒上清液转导的细胞。
图15A和15B是显示CAR分子的来那度胺依赖性降解的蛋白质印迹图。在蛋白质印迹分析之前，将表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞用10μM来那度胺或DMSO孵育2、4、8、16或24小时(图15A)或用不同剂量的来那度胺或DMSO孵育24小时(图15B)。图15A显示10μM来那度胺处理的时间过程。图15B显示来那度胺在24小时的剂量应答。
图16A、16B、16C、16D、16E、16F和16G是一组流式细胞术直方图，显示在来那度胺存在或不存在的情况下表面CAR表达。测试的构建体包括：构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)(图16A)、构建体771(CAR19_HilD标签_V5)(图16B)、构建体6761(CAR19_16KGS_HilD标签_V5)(图16C)、构建体768(CAR19_16GS_HilD标签_V5)(图16D)、构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)(图16E)、构建体773(HilD标签_CAR19_经修饰的信号肽)(图16F)和构建体774(HilD标签_CAR19)(图16G)。将表达指定构建体的JNL细胞与或不与10μM来那度胺孵育24小时，并然后经历流式细胞术分析。
图17A、17B和17C是一组流式细胞术直方图，显示通过来那度胺和/或巴多昔芬(BZA)调节的表面CAR表达。测试的构建体包括：构建体765(FurON_CAR19)(图17A)、构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)(图17B)和构建体766(FurON_CAR19_16GS_HilD标签_V5)(图17C)。在流式细胞术分析之前，将表达指定构建体的JNL细胞在存在或不存在来那度胺和/或巴多昔芬(BZA)的情况下孵育24小时。
图18A、18B、18C和18D是一组流式细胞术直方图，显示在存在或不存在不同浓度的来那度胺的情况下的表面CAR表达。测试的构建体包括：构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)(图18A和18C)和构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)(图18B和18D)。在流式细胞术分析之前，将表达指定构建体的JNL细胞在存在或不存在来那度胺的情况下孵育4小时(图18A和18B)或20小时(图18C和18D)。图18E和18F是条形图，显示针对测试的每个细胞系和每个来那度胺浓度的CAR表达％(图18E)或平均荧光强度(图18F)。
图19A和19B是一系列条形图，显示在JNL靶细胞系处理条件、靶细胞系处理的时间长度、来那度胺处理的时间和细胞数量之间的来那度胺应答比较。图19A是显示来自如下研究的发光信号的一组图，在所述研究中将表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞(9000或12000个细胞/孔)用10μM来那度胺处理4小时或24小时，并然后与Nalm6细胞、表达CD19的K562细胞(“K562+CD19”)、K562细胞或培养基(无细胞)孵育4小时、8小时或20小时。图19B是一组图，显示来自图19A所述的研究的数据子集：将表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞(9000个细胞/孔)用10μM来那度胺处理4小时，并然后与Nalm6细胞、表达CD19的K562细胞(“K562+CD19”)、K562细胞或培养基(无细胞)孵育20小时。图19B中的y轴显示减去背景信号(来自培养基样品的信号)之后的发光信号。在图19A和19B二者中，每个图中的两个条分别代表用DMSO(“DMSO”)处理的样品和用来那度胺(“来那度胺(10μM)”)处理的样品。
图20A和20B是一系列条形图，显示在JNL靶细胞处理条件、靶细胞处理的时间长度、来那度胺处理的时间和细胞数量之间的来那度胺应答比较。图20A是显示来自如下研究的发光信号的一组图，在所述研究中将表达构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞(9000或12000个细胞/孔)用10μM来那度胺处理4小时或24小时，并然后与Nalm6细胞、表达CD19的K562细胞(“K562+CD19”)、K562细胞或培养基(无细胞)孵育4小时、8小时或20小时。图20B是一组图，显示来自图20A所述的研究的数据子集：将表达构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞(9000个细胞/孔)用10μM来那度胺处理4小时，并然后与Nalm6细胞、表达CD19的K562细胞(“K562+CD19”)、K562细胞或培养基(无细胞)孵育20小时。图20B中的y轴显示减去背景信号(来自培养基样品的信号)之后的发光信号。在图20A和20B中，每个图中的四个条分别代表既不用来那度胺也不用巴多昔芬(“DMSO>>DMSO”)处理的样品；用巴多昔芬处理但不用来那度胺(“DMSO>>BZA(1μM)”)处理的样品；用来那度胺处理但不用巴多昔芬(“来那度胺(10μM)>>DMSO”)处理的样品；以及用来那度胺和巴多昔芬二者(“来那度胺(10μM)>>BZA(1μM)”)处理的样品。
图21A、21B、21C和21D是显示来那度胺在三个处理时间点上对NFAT萤光素酶报道子的剂量-应答作用的图。将表达构建体765(FurON_CAR19)(图21A)、构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)(图21B)、构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)(图21C)或构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)(图21D)的JNL细胞与K562靶细胞(“K562”)或表达CD19的K562靶细胞(“K562+CD19”)一起孵育。将来那度胺在添加靶细胞之前20小时(44小时来那度胺处理，“靶细胞前20hr”)、在添加靶细胞之前4小时(28小时来那度胺处理，“靶细胞前4hr”)，或在添加靶细胞之后16小时(8小时来那度胺处理，“靶细胞后16hr”)添加。还将表达构建体765(FurON_CAR19)(图21A)或构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)(图21B)的JNL细胞用巴多昔芬处理。在每个图中，将原始发光针对指定的来那度胺浓度做图。
图22A、22B、22C和22D是显示来自图21A、21B、21C和21D中所述研究的数据的图，其中将JNL细胞在K562+CD19靶细胞处理之前5小时用MG132处理，并且在K562+CD19靶细胞处理之前4小时用来那度胺处理。测试的细胞包括：表达构建体765(FurON_CAR19)(图22A)、构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)(图22B)、构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)(图22C)或构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)(图22D)的JNL细胞。每个图中的四个条分别代表用巴多昔芬(BZA)、MG132和来那度胺(“BZA、MG132、来那度胺”)处理的样品；用巴多昔芬(BZA)和来那度胺(“BZA，来那度胺”)处理的样品；用巴多昔芬(BZA)(“BZA”)处理的样品；以及仅用DMSO(“DMSO”)处理的样品。每个图中的y轴显示原始发光。
图23是一组显示HilD-Tau融合构建体的示意图。使用0N4R Tau同种型，其包括C-末端的重复结构域外显子，但不包括N-末端的外显子。使用慢病毒构建体，尽管所有构建体通过lipofectamine转染或核转染引入。Tau融合产物在CAG或CMV启动子的下游表达。
图24A和24B是显示设计和结果的图，所述设计和结果来自检测E3连接酶CRBN至HilD-Tau融合蛋白质的募集的研究。图24A：实验的图解.来那度胺将E3连接酶小脑蛋白(CRBN)募集至IKZF3β发夹，导致相关蛋白质的泛素化和降解。为测试这种募集发生在HilD-Tau融合物中，生成了HilD-Tau-生物素连接酶融合物。在生物素的存在下，生物素连接酶产生与附近的蛋白质共价结合的反应性生物素种类。如果添加来那度胺，则CRBN应该募集至HilD-Tau融合体，并且应在生物素连接酶介导的生物素化的范围内。图24B：将HEK293T细胞用带FLAG标签的CRBN和HilD-Tau-生物素连接酶或Tau-生物素连接酶融合物转染。转染后48小时，将细胞用50μM生物素以及DMSO或1μM来那度胺处理21小时。随后将细胞在PBS中洗涤，并然后在冰冷的M-PER缓冲液和蛋白酶抑制剂中裂解。估计大约有1百万个细胞被裂解，体积为300μL。在靠下的印迹中显示了细胞裂解物的蛋白质印迹分析，用抗Tau(HT7)或抗GAPDH抗体探测。在室温下，通过将20％的细胞裂解物与50μL的链霉亲和素磁珠(DynabeadsM-280)孵育30分钟，将生物素化的蛋白质进行免疫沉淀。通过煮沸从珠上洗脱生物素化的蛋白质，并然后通过蛋白质印迹进行分析。在FLAG-CRBN上探测FLAG信号，仅在来自用来那度胺处理并含有HilD标签的HEK293T细胞的免疫沉淀材料中观察到强条带，但未在用DMSO处理的细胞中或在用来那度胺处理但用不含有HilD标签的Tau构建体转染的细胞中观察到强条带。
图25A、25B和25C是显示通过E3连接酶CRBN的诱导募集减少毒性Tau蛋白的图。将HEK293T细胞用HilD-Tau(P301S)-YFP融合构建体转染。Tau(P301S)是Tau的易于聚集的形式，在患有家族性神经退行性疾病患者中鉴定出。在用来那度胺过夜处理后，如在YFP萤光的成像中所见，通过来那度胺，YFP萤光以剂量依赖性方式减少(图25A)。显示每个条件九个视野。图25B：在不同剂量的来那度胺处理后，对YFP萤光强度进行定量。图25C：注意到由于易于聚集的Tau的过表达而产生的毒性，通过细胞数量对毒性进行定量，通过Hoecht染料荧光的分段进行鉴定。通过来那度胺处理和Tau水平的降低消除了细胞死亡，这表明来那度胺诱导型降解可以揭示毒性蛋白的靶向蛋白降解的细胞保护作用。
图26A、26B、26C和26D是显示对通过CRBN的诱导型募集而产生的在HEK293T细胞中的Tau蛋白减少和Tau的特定形式的减少进行定量的图。图26A：将HEK293T细胞用HilD-Tau(野生型)融合构建体转染，并用不同剂量的来那度胺或DMSO处理。顶部和底部蛋白质印迹是一式三份重复的实验的代表。通过归一化为抗肌动蛋白条带强度，对来自多克隆抗Tau抗体(Dako)或针对Tau磷酸化形式的抗体(AT8)的Tau条带的强度进行定量。在此实验中，转染减少量的DNA产生Tau磷酸化形式的更大减少(1X DNA:0.625微克DNA在50μL Optimem培养基中用1.5μL lipofectamine 2000转染；0.1X DNA＝0.0625微克；转染进24孔板的HEK细胞)。这表明该系统可以测量E3连接酶介导的Tau降解的能力。在所显示的实验中，将来那度胺在转染后4小时(对于较高DNA浓度转染)或在转染后24小时(对于较低DNA浓度转染)给予。图26B：左图，通过来那度胺处理没有减少不具有HilD标签的Tau。右图，通过来那度胺处理，在敲除小脑蛋白(CRBN)的HEK293T细胞中不存在Tau水平降低。图26C：在小脑蛋白(CRBN)敲除(KO)细胞中，相比野生型(WT)细胞(与如图26B中所示的针对野生型细胞的相同数据)，对来那度胺处理对YFP强度的剂量应答的定量。图26D：与类泛素化抑制剂MLN4924(1μM)的共处理(包括与MLN4924进行的1小时预处理)还预防Tau的降解。总之，该数据表明CRBN的E3连接酶功能对于来那度胺诱导的HilD-Tau融合降解是必需的。
图27是显示对啮齿动物皮层神经元中表达的HilD-Tau(P301S)-YFP融合物的聚集倾向进行评估的一组图。将啮齿动物皮层神经元用HilD-Tau(P301S)-YFP融合物核转染，并然后用内部产生的、从Tau转基因小鼠分离的不溶性Tau级分进行随后地孵育。使用InCell6000分析仪对实时YFP萤光成像。中间图和底部图显示在顶部图中鉴定的神经元放大。如通过强烈的、点状YFP萤光显示的Tau聚集体是显而易见的。
图28是显示在大鼠神经元中表达的HilD-Tau(P301S)YFP的来那度胺介导的降解的一组图。将啮齿动物皮层神经元用HilD-Tau(P301S)YFP融合物或Tau(P301S)YFP融合物进行核转染。还检测了带FLAG标签的CRBN(顶行)。在体外9天开始，用指定剂量的来那度胺处理神经元。以指定的时间间隔，针对YFP萤光对神经元进行实时成像。相对于用DMSO处理的表达HilD-Tau(P301S)-YFP的神经元或用来那度胺处理的表达Tau(P301S)-YFP的神经元，来那度胺处理随时间降低YFP强度。在与人CRBN共转染或不与人CRBN共转染情况下发生的降解表明HilD-Tau融合物可以通过来那度胺由啮齿动物或人CRBN降解。
图29是显示在大鼠神经元中表达的HilD-Tau(P301S)YFP的来那度胺介导的降解的一组图。将在体外解离63天、衍生自胚胎干细胞的老人神经球的单细胞悬浮液用HilD-Tau(P301S)-YFP进行核转染。神经球包含神经元和神经元祖细胞二者。在培养物中10天后，将神经元用来那度胺处理(在体外总年龄为73天)。图像显示在按指定剂量的来那度胺处理20小时后的YFP萤光。来那度胺以剂量依赖性方式大幅降低YFP萤光强度。
图30A和30B是显示CAR19-16GS-HilD标签的来那度胺介导的降解的一组图。图30A是用单一剂量的来那度胺处理的CAR19-HilD标签-转导的Jurkat细胞随时间的一组蛋白质印迹图。测试了来自化合物处理后或洗脱后阶段的样品。图30B是一组流式细胞术直方图，分析了在蛋白质印迹分析中使用的相同样品。将抗CD3ζ抗体用于蛋白质印迹分析，并且将CD19-PE缀合物用于流式细胞术分析。
图31A、31B和31C是不同条件下分析CAR表达的一组流式细胞术直方图。图31A是显示原代T细胞中的CAR表达的一组流式细胞术直方图。将来那度胺在24小时对CAR19表达的作用显示在图31B中。将来那度胺在24或48小时对CAR19-HilD表达的作用显示在图31C中。
图32A、32B和32C是显示由CART细胞介导的杀伤％的一组图。图32A是显示针对CD19阴性细胞的杀伤百分比的图。图32B和32C是显示在存在或不存在1μM来那度胺的情况下，CAR19T细胞(图32B)或CAR19-HilD T细胞(图32C)针对CD19阳性细胞的杀伤％的图。
图33A和33B是分别显示来自表达CAR19或CAR19-HilD的T细胞的分泌性IFNγ和IL2在存在或不存在1μM来那度胺的情况下的水平的图。在x轴上，将来那度胺的浓度以μM显示。
图34是显示来那度胺消除CART19.HilD在体内控制肿瘤生长的能力的图。将ROI的总流量针对Nalm6植入后的天数做图。
图35是显示在来那度胺处理后CAR19-HilD表达丧失的一组流式细胞术图。
图36是显示在不同处理组中肿瘤控制水平的图。将ROI的总流量针对Nalm6植入后的天数做图。早期注射来那度胺有效地消除在用CART-HilD处理的小鼠中的CART表达，导致在该组中不存在肿瘤控制。来那度胺的后期处理(CART注射后第5天)也降低了CART的功能，如通过在该小鼠组中肿瘤控制的损失所示。
图37A、37B、37C、37D和37E是分析在来自脾细胞的CD3+细胞中CAR表达的图。图37A是显示来自用CART-HilD处理的小鼠的脾细胞的CD3+细胞中CAR表达的图(第1组)。图37B、37C和37D是显示在来自用CART-HilD和来那度胺处理的小鼠的脾细胞的CD3+细胞中CAR表达的图(分别是第2组、第3组合第4组)。图37A-37D中的峰代表针对个体小鼠的CD3表达水平。第1组.CART19.HilD(5x106)。第2组.CART19-HilD(5x106)+来那度胺qd。第3组.CART19-HilD(5x106)+来那度胺bid。第4组.CART19.HilD(5x106)+来那度胺+5天。图37E是总结数据的图。
图38A、38B和38C是显示化合物I-112对CAR19-CARB标签的表达和活性的影响的图。图38A是将表达CAR19-CARB标签的Jurkat NFAT萤光素酶(JNL)细胞用不同剂量的化合物I-112或DMSO处理24小时的蛋白质印迹，显示CAR19-CARB标签的剂量应答性降解。图38B是一组直方图，显示在用10μM化合物I-112处理后，与未带标签的CAR19细胞相比，在JNLCAR19-CARB标签细胞中的CAR19表面表达的流式细胞术分析。图38C是显示表达CAR19-CARB标签的JNL萤光素酶细胞(用剂量应答的化合物I-112处理15小时，随后与具有萤光素酶活性读出的K562(CD19-)或Nalm6(CD19+)细胞共处理)的JNL测定结果的图。
图39是用CARB标签-MITF-FLAG瞬时转染，并用10μM、1μM、0.1μM或0.01μM的化合物I-112或来那度胺，或DMSO处理的HEK293T细胞的蛋白质印迹，显示带CARB标签的MITF的I-112特异性降解。
图40A和40B是分析来那度胺对BCMACAR-HilD标签的表达和活性的影响的图。图40A是显示用BCMACAR HilD-标签感染的JNL细胞(用剂量应答的来那度胺处理24小时)的流式细胞术分析结果的一组直方图，显示BCMACAR的来那度胺剂量依赖性降解。图40B的图显示表达BCMA-HilD标签的Jurkat NFAT萤光素酶细胞(用剂量应答的来那度胺处理15小时，随后与具有萤光素酶活性读出的KMS11细胞共处理)的JNL测定结果。
具体实施方式
本披露至少部分提供了包含具有式(I)的化合物(COF1)/CRBN结合多肽、具有式(II)的化合物(COF2)/CRBN结合多肽、或具有式(III)的化合物(COF3)/CRBN结合多肽的融合多肽，用于靶向蛋白质失活。在一些实施例中，所述融合多肽包括一种或多种COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，和一种或多种异源多肽(例如，异源的哺乳动物多肽、细菌多肽或病毒多肽，如一种或多种目的多肽)。所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽可以例如，经由接头可操作地连接至所述异源多肽。在一些实施例中，在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺))的存在下，或在COF3(例如，在表29中披露的化合物)的存在下，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽增加所述融合多肽的降解，例如所述融合多肽的泛素化介导的降解；和/或改变所述融合多肽的水平和/或活性。在一些实施例中，所述融合多肽的降解是泛素依赖性的。
不希望受理论的束缚,在一些实施例中，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽提供了氨基酸序列和/或结构基序，所述氨基酸序列和/或结构基序在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺))的存在下，或在COF3(例如，表29中披露的化合物)的存在下，导致所述融合多肽的翻译后修饰(例如，泛素化)，产生经修饰的例如泛素化的融合多肽。例如，在COF1、COF2或COF3的存在下，所述融合多肽中的一个或多个氨基酸(例如，赖氨酸或甲硫酸)可以被泛素化。在一些实施例中，所述泛素化融合多肽被选择性地降解。在一些实施例中，所述融合多肽的翻译后修饰增加了所述融合多肽(例如，所述异源多肽的全部或部分)的降解(例如，增加的降解水平和/或降解速率)。在一些实施例中，降解水平和/或降解速率比参考蛋白(例如，在不存在COF1、COF2或COF3的情况下的融合多肽；异源多肽；不具有COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的异源多肽的融合多肽；或具有除COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽之外的部分的异源多肽的融合多肽)的降解水平和/或降解速率增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、10倍、100倍、1,000倍或更高倍。
不希望受理论的束缚，所述融合多肽的降解可以包括以下步骤中的一个、两个或全部：(1)将COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺))或COF3(例如，在表29中披露的化合物)与泛素连接酶复合物(例如，E3泛素连接酶复合物)的一个或多个亚基结合，例如，与CUL4、RBX1、DDBI和/或CRBN(还被称为CRL4(CRBN)，典型地DDB1-CRBN复合物)结合，从而形成COF1连接酶或COF2连接酶复合物；
(2)所述COF1连接酶、COF2连接酶或COF3连接酶复合物与所述融合多肽中的一个或多个氨基酸(例如，赖氨酸或甲硫氨酸)结合并增加所述一个或多个氨基酸的泛素化，从而形成泛素化的融合多肽(例如，单或多泛素化的融合多肽)；和
(3)所述泛素化的融合多肽被靶向用于降解，例如，所述融合多肽被选择性靶向至例如蛋白酶体用于降解。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1(例如，SEQ IDNO:20)或IKZF3(例如，SEQ ID NO:19)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基或约55至约65个氨基酸残基。
在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2(例如，SEQ ID NO:21)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基或约55至约65个氨基酸残基。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含β转角(例如，IKZF3的β转角)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含β转角(例如，IKZF3的β转角)和α螺旋(例如，IKZF3的α螺旋)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136至170或136至180和/或236-249(根据SEQ ID NO:19编号)或与其基本上相同(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100或与其基本上相同(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含β转角(例如，IKZF2的β转角)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含β转角(例如，IKZF2的β转角)和α螺旋(例如，IKZF2的α螺旋)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基130-174和/或230-243(根据SEQ ID NO:21编号)或与其基本上相同(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:109、113和114或与其基本上相同(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含β转角(例如，IKZF1的β转角)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含β转角(例如，IKZF1的β转角)和α螺旋(例如，IKZF1的α螺旋)。
在一些实施例中，在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物，如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)的存在下，或在COF3(例如，在表29中披露的化合物)的存在下，所述融合多肽的异源多肽易于进行翻译后修饰(例如，在一个或多个残基处泛素化)以及降解。
任选地，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽可以例如经由接头，例如，甘氨酸-丝氨酸接头(例如，SEQ ID NO:28、37、38、39或99)可操作地连接。例如，所述融合多肽可以包括三个元件：COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，例如，降解氨基酸序列(例如，降解决定子)的部分、待降解的目的异源多肽、以及将两者分开的接头。所述异源多肽可以是胞质蛋白、核蛋白、跨膜蛋白(例如，包括一个或多个跨膜结构域)或分泌性蛋白。例如，目的异源多肽可以包括例如，嵌合抗原受体(CAR)、CRISPR相关蛋白、CD8、CD19、CD22、转录因子(例如，STAT3、STAT5、NF-κB、β-连环蛋白、Notch、GLI或c-JUN)，例如，如本文所述。
在一些实施例中，本发明的融合多肽进一步包含降解结构域。在一些实施例中，所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在稳定化合物的存在下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍。在一些实施例中，所述降解结构域通过异源切割位点与所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。在一些实施例中，所述降解结构域通过异源切割位点与所述COF2/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。在一些实施例中，所述降解结构域通过异源切割位点与所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。
在一些实施例中，所述融合多肽包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含降解结构域，并且所述第二结构域包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽。在一些实施例中，所述第一结构域和所述第二结构域通过异源切割位点分开。不希望受理论的束缚，所述融合多肽的表达水平可以通过稳定化合物和COF1、COF2或COF3调节。在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述降解结构域不能获得适当的构象，并且通过细胞内降解途径连同融合多肽的其余部分被靶向用于降解。在一些实施例中，在所述稳定化合物的存在下，所述降解结构域呈现适当的构象，并且不易通过细胞内降解途径降解。在一些实施例中，在所述稳定化合物的存在下，所述降解结构域的适当折叠暴露了所述异源切割位点，导致所述异源切割位点的切割并从融合多肽的其余部分去除所述降解结构域。所述融合多肽的水平可以通过如上所述的COF1、COF2或COF3进一步调节。
在一些实施例中，所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，例如，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:46或48至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，例如，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，并且所述稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)。在一些实施例中，所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域，例如，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:50至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，例如，所述降解结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域，并且所述稳定化合物是盾护物-1。在一些实施例中，所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域，例如，所述降解结构域包含与SEQ ID NO:51至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，例如，所述降解结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域，并且所述稳定化合物是甲氧苄啶。
因此，本文披露了融合多肽，所述融合多肽包括异源多肽，COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，和/或降解结构域(例如，用于选择性蛋白质降解的目的多肽)；以及披露了编码所述融合多肽的核酸分子、载体和细胞(例如包括前述融合多肽的宿主细胞)。可以将本文披露的融合多肽和相关组合物用于活化或失活例如，降解多种靶蛋白用于调节疗法，例如，分泌疗法、细胞疗法或跨膜疗法(例如，CAR疗法)，调节基因表达(例如，经由调节CRISPR/CAS系统的组分的表达和/或活性)，验证靶标以及筛选文库。用于选择性调节(例如，降解)所述融合多肽用于例如治疗受试者的方法是另外披露的。
与本领域已知的调节系统相比，本文披露的组合物和方法提供了新颖和创造性特征，包括如下事实：COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽在蛋白质水平(相比于mRNA)上起作用，并导致细胞中现有和新生成的蛋白质的活性降解(相比于阻断初生蛋白质的产生)。另外，COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽可具有短的长度，并且COF1、COF2和COF3通常具有低分子量。
不希望受理论的束缚，如实例16中所述，COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺))不导致或基本上不导致融合多肽的降解，所述融合多肽包含本文所述的COF3/CRBN结合多肽(例如，包含本文所述的CARB标签的融合多肽，例如，包含CARB标签的融合多肽，所述标签包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:109、113和114)。在一些实施例中，在COF1或COF2的存在下包含本文所述的COF3/CRBN结合多肽的融合多肽的降解不超过在相同的条件下在COF3的存在下所述融合多肽的降解的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。
类似地，COF3(例如，在表29中披露的化合物)不导致或基本上不导致包含本文所述的COF1/CRBN结合多肽或COF2/CRBN结合多肽的融合多肽(例如，包含本文所述的HilD标签的融合多肽，如包含HilD标签的融合多肽，所述标签包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100)的降解。在一些实施例中，在COF3的存在下包含本文所述的COF1/CRBN结合多肽或COF2/CRBN结合多肽的融合多肽的降解不超过在COF1或COF2的存在下在相同的条件下所述融合多肽的降解的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。
结果，可以使用COF1或COF2和COF3独立地调节两个靶多肽，一个带有COF1/CRBN结合多肽或COF2/CRBN结合多肽标签(例如，本文所述的HilD标签)，另一个带有COF3/CRBN结合多肽标签(例如，本文所述的CARB标签)。例如，可以对表达带HilD标签的蛋白质和带CARB标签的蛋白质的细胞进行操作以仅表达带HilD标签的蛋白质(例如，通过使细胞与COF3接触)，仅表达带CARB标签的蛋白质(例如，通过使细胞与COF1或COF2接触)，或均不表达两种蛋白质(例如，通过使细胞与COF1或COF2和COF3接触)。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所使用的，术语“具有式(I)的化合物(COF1)/CRBN结合多肽”是指与COF1结合的多肽，与COF1和CRBN的复合物结合的多肽，或在COF1的存在下与CRBN结合的多肽。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与COF1结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与COF1和CRBN的复合物结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，在COF1的存在下，所述COF1/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与CRBN结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，当所述COF1/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))中时，可以导致所述融合多肽的泛素化的增加。在一些实施例中，当所述COF1/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))时，可以导致所述融合多肽的降解的增加。在一些实施例中，当所述COF1/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))时，可以导致所述融合多肽的失活的增加。在一些实施例中，泛素化、降解和/或失活的增加在COF1和泛素化连接酶复合物(例如，CRBN)的一种或多种组分的存在下发生。在一些实施例中，泛素化、降解和/或失活的增加是参考多肽(例如，在不存在COF1的情况下具有COF1/CRBN结合多肽的参考融合多肽，或不具有COF1/CRBN结合多肽的参考多肽)的泛素化、降解和/或失活的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、10倍、100倍、1,000倍或更多倍。在一些实施例中，所述含有COF1/CRBN结合多肽的融合多肽的降解是泛素依赖性的。例如，在COF1的存在下，在具有COF1/CRBN结合多肽的融合多肽中一个或多个氨基酸(例如，赖氨酸或甲硫氨酸)被泛素化。
如本文所使用的，术语“具有式(II)的化合物(COF2)/CRBN结合多肽”是指与COF2结合的多肽，与COF2和CRBN的复合物结合的多肽，或在COF2的存在下与CRBN结合的多肽。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与COF2结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，所述COF2/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与COF2和CRBN的复合物结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，在COF2的存在下，所述COF2/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与CRBN结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，当所述COF2/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))中时，可以导致所述融合多肽的泛素化的增加。在一些实施例中，当所述COF2/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))时，可以导致所述融合多肽的降解的增加。在一些实施例中，当所述COF2/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))时，可以导致所述融合多肽的失活的增加。在一些实施例中，泛素化、降解和/或失活的增加在COF2和泛素化连接酶复合物(例如，CRBN)的一种或多种组分的存在下发生。在一些实施例中，泛素化、降解和/或失活的增加是参考多肽(例如，在不存在COF2的情况下具有COF2/CRBN结合多肽的参考融合多肽，或不具有COF2/CRBN结合多肽的参考多肽)的泛素化、降解和/或失活的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、10倍、100倍、1,000倍或更多倍。在一些实施例中，所述含有COF2/CRBN结合多肽的融合多肽的降解是泛素依赖性的。例如，在COF2的存在下，在具有COF2/CRBN结合多肽的融合多肽中一个或多个氨基酸(例如，赖氨酸或甲硫氨酸)被泛素化。
如本文所使用的，术语“具有式(III)的化合物(COF3)/CRBN结合多肽”是指与COF3结合的多肽，与COF3和CRBN的复合物结合的多肽，或在COF3的存在下与CRBN结合的多肽。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与COF3结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与COF3和CRBN的复合物结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，在COF3的存在下，所述COF3/CRBN结合多肽以低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的亲和力(KD)与CRBN结合，例如，如通过本领域识别的方法所测量的，例如生物分子相互作用分析仪(Biacore)。在一些实施例中，当所述COF3/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))中时，可以导致所述融合多肽的泛素化的增加。在一些实施例中，当所述COF3/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))时，可以导致所述融合多肽的降解的增加。在一些实施例中，当所述COF3/CRBN结合多肽存在于融合多肽(例如，可操作地连接至异源多肽(例如，如本文所述的融合多肽))时，可以导致所述融合多肽的失活的增加。在一些实施例中，泛素化、降解和/或失活的增加在COF3和泛素化连接酶复合物(例如，CRBN)的一种或多种组分的存在下发生。在一些实施例中，泛素化、降解和/或失活的增加是参考多肽(例如，在不存在COF3的情况下具有COF3/CRBN结合多肽的参考融合多肽，或不具有COF3/CRBN结合多肽的参考多肽)的泛素化、降解和/或失活的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、10倍、100倍、1,000倍或更多倍。在一些实施例中，所述含有COF3/CRBN结合多肽的融合多肽的降解是泛素依赖性的。例如，在COF3的存在下，在具有COF3/CRBN结合多肽的融合多肽中一个或多个氨基酸(例如，赖氨酸或甲硫氨酸)被泛素化。
如本文所使用的，“泛素化”是指添加泛素分子，例如，单一泛素(单泛素化)或多于一个泛素(例如，泛素分子的链，或多泛素化)。泛素化可以通过酶机制来进行，所述酶机制包括泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)和泛素连接酶(E3)中的一种或多种。
如本文所使用的，术语“CRBN”是指在人中由CRBN基因编码的蛋白质，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。Swiss-Prot登录号Q96SW2提供了示例性人CRBN氨基酸序列。
如本文所使用的，“IKZF多肽”是指IKZF，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所使用的，术语“IKZF3”是指在人中由IKZF3基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9UKT9提供了示例性人IKZF3氨基酸序列。示例性人IKZF3氨基酸序列提供在SEQ ID NO:19中。术语“IKZF3多肽”是指IKZF3，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所使用的，术语“IKZF1”是指在人中由IKZF1基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q13422提供了示例性人IKZF1氨基酸序列。示例性人IKZF1氨基酸序列提供在SEQ ID NO:20中。术语“IKZF1多肽”是指IKZF1，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所使用的，术语“IKZF2”是指在人中由IKZF2基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9UKS7提供了示例性人IKZF2氨基酸序列。示例性人IKZF2氨基酸序列提供在SEQ ID NO:21中。术语“IKZF2多肽”是指IKZF2，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所使用的，术语“IKZF4”是指在人中由IKZF4基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9H2S9提供了示例性人IKZF4氨基酸序列。示例性人IKZF4氨基酸序列提供在SEQ ID NO:22中。术语“IKZF4多肽”是指IKZF4，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所使用的，术语“IKZF5”是指在人中由IKZF5基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9H5V7提供了示例性人IKZF5氨基酸序列。示例性人IKZF5氨基酸序列提供在SEQ ID NO:23中。术语“IKZF5多肽”是指IKZF5，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所使用的，“融合多肽”或“嵌合多肽”是指在单个、连续多肽中包括两个或更多个异源氨基酸序列和/或蛋白质结构域的多肽。在一些实施例中，所述两个或更多个异源蛋白结构域直接或间接地(例如，经由接头)共价连接。
如本文所使用的，术语“雌激素受体(ER)”是指在人中由ESR1基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P03372提供了示例性人雌激素受体(ER)氨基酸序列。“雌激素受体(ER)结构域”是指雌激素受体，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。示例性雌激素受体(ER)结构域氨基酸序列提供在SEQ ID NO:44、46和48中。示例性雌激素受体(ER)结构域核苷酸序列提供在SEQ ID NO:45、47和49中。
如本文所使用的，“FKB蛋白(FKBP)结构域”是指FKBP或其片段或变体。示例性FKB蛋白(FKBP)结构域氨基酸序列提供在SEQ ID NO:50中。
如本文所使用的，术语“二氢叶酸还原酶(DHFR)”是指在人中由DHFR基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P00374提供了示例性人二氢叶酸还原酶(DHFR)氨基酸序列。“二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域”是指DHFR或其片段或变体。示例性二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域氨基酸序列提供在SEQ ID NO:51中。
如本文所使用的，术语“降解结构域”是指当在稳定化合物的存在下表达时呈现稳定构象的融合多肽的结构域。当在目的细胞中表达时不存在稳定构象，大部分降解结构域(并且通常是与它们融合的任何蛋白质)将通过内源性细胞机制降解。值得注意地，降解结构域不是蛋白质的天然存在的结构域，而是被工程改造成在不与稳定化合物接触的情况下是不稳定的。因此，可以通过以下特征来鉴定降解结构域：(1)它不是天然存在的；(2)通过增加或降低降解速率来共翻译地或翻译后地调节其表达；(3)在稳定化合物的存在下，降解率实质性降低。在一些实施例中，不存在稳定化合物情况下，所述融合多肽的降解结构域或其他结构域在细胞中或在细胞上是基本上不可检测的。在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述降解结构域处于不稳定状态。在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述降解结构域不自缔合，例如，不同源二聚化。在一些实施例中，所述降解结构域与异源蛋白酶切割位点融合，其中在稳定化合物的存在下，所述异源蛋白酶切割位点的切割比在不存在稳定化合物的情况下更有效。
所述降解结构域不是如PCT申请号PCT/US 2017/027778中定义的聚集结构域。
“稳定化合物”或“稳定性化合物”是指如下化合物，当添加至表达降解结构域的细胞时，稳定降解结构域和与其融合的任何蛋白质，并降低其随后降解的速率。稳定化合物或稳定性化合物可以是天然存在的或合成的。
术语“异源多肽”表示与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽不同(例如，差异至少一个氨基酸)，并且不是活性萤光素酶结构域或具有萤光素酶序列的氨基酸序列(例如，蛋白质结构域)。在一些实施例中，所述异源多肽不是报告多肽，例如，萤光素酶、绿色荧光蛋白或b-半乳糖苷酶。在一些实施例中，所述异源多肽包含来自或衍生自哺乳动物多肽、细菌多肽、病毒多肽、植物多肽、酵母多肽、真菌多肽、古细菌多肽或鱼(例如，斑马鱼)多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，所述异源多肽包含在表2中的多肽，例如，如在表2中所述的细胞质多肽和/或细胞核多肽、分泌性多肽或跨膜多肽。
此外，“异源蛋白酶切割位点”表示相比与其融合的一个或多个蛋白质结构域具有不同起源的蛋白酶切割位点(例如，不与其他参考的结构域中的至少一个天然融合)。
“蛋白酶”表示基于待切割的蛋白质中切割位点的存在而切割另一种蛋白质的蛋白质。
“细胞内蛋白酶”表示在目的细胞内天然表达的蛋白酶。
“细胞外蛋白酶”是指在生物体(例如，哺乳动物)中天然表达并且分泌或暴露于细胞外部(例如，在血液中或皮肤表面)的蛋白酶。
如本文所使用的，术语“切割”是指共价键的断裂(例如在核酸分子的主链中共价键的断裂)或肽键的水解。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的。双链切割可以作为两个不同的单链切割事件的结果。
另外的术语描述在下文中。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，所述部分保留与抗原表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽例如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“抗原”、“Ag”或“抗原分子”是指引起免疫应答的分子。免疫反应可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。在一些实施例中，抗原是任何大分子，包括全部的蛋白质或肽。在其他实施例中，抗原衍生自重组或基因组DNA。包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。
抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。在实施例中，抗原包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫反应的多肽。在一个实施例中，抗原根本不需要由“基因”编码。在一个实施例中，抗原可以合成产生或可以衍生自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。在实施例中，抗原包括例如，碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖和多糖)。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，所述免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
术语“嵌合抗原受体”或替代性地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施例中典型地是两种多肽，当在免疫效应细胞中时，它为该细胞提供针对靶细胞(典型地针对癌细胞)的特异性，并且提供细胞内信号生成。在一些实施例中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该细胞质信号传导结构域包含衍生自如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，所述组的多肽组在同一多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施例中，所述组的多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，所述组的多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，所述组的多肽包括二聚化开关，所述二聚化开关在存在二聚化分子时可以将融合多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个方面，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，所述CAR的共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如，4-1BB(即CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一个方面，CAR在细胞外抗原结合结构域的N-末端进一步包含前导序列，其中该前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜的过程中从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
取决于上下文，“CAR分子”是指CAR(例如，CAR多肽)，编码CAR的核酸，或二者。
包含靶向特定肿瘤抗原X的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR(如本文描述的那些)也被称为XCAR。例如，包含靶向CD19或BCMA的抗原结合结构域的CAR被分别称为CD19CAR或BCMACAR。
如本文所用的，所述术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原。BCMA(也称为TNFRSF17，BCM或CD269)是肿瘤坏死受体(TNFR)家族的成员，并且主要在终末分化的B细胞(例如记忆B细胞)和浆细胞上表达。其配体称为TNF家族(BAFF)的B细胞激活物和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的基因在16号染色体上编码，产生长度为994个核苷酸的初级mRNA转录物(NCBI登录号NM_001192.2)，其编码184个氨基酸的蛋白质(NP_001183.2)。已经描述了衍生自BCMA基因座的第二反义转录物，其可以在调节BCMA表达中起作用。(Laabi Y.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],1994,22:1147-1154)。已经描述了具有未知显著性的另外的转录物变体(Smirnova AS等人Mol Immunol.[分子免疫学],2008,45(4):1179-1183)。已经鉴定出第二同种型，也称为TV4(Uniprot标识Q02223-2)。如本文所用，“BCMA”包括含有突变例如点突变的蛋白质，全长野生型BCMA的片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“CD19”是指分化簇19蛋白，它是在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以登录号NM_001178098找到。如本文所用，“CD19”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
CD19在大多数B谱系癌症上表达，这些B谱系癌症包括例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。具有表达CD19的其他细胞在下文“与CD19表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的早期标记物。参见例如，Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)。在一个方面，CART的抗原结合部分识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一个方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用，术语“CD20”是指已知在B细胞上可检测的抗原决定簇。人CD20也称为跨膜4结构域亚家族A成员1(MS4A1)。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD20的氨基酸序列可以登录号NP_690605.1和NP_068769.2找到，并且编码人CD20的转录物变体1和3的核苷酸序列可分别以登录号NM_152866.2和NM_021950.3找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD20蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一个方面，CD20蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD20”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型CD20的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“CD22”是指已知在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，同种型1-5人CD22的氨基酸序列可分别以登录号NP 001762.2、NP 001172028.1、NP001172029.1、NP001172030.1和NP 001265346.1找到，并且编码人CD22的变体1-5的核苷酸序列可分别以登录号NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1、和NM 001278417.1找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD22蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一个方面，CD22蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD22”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型CD22的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“CD123”是指已知在一些恶性血液学癌症细胞，例如白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库在找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD123的氨基酸序列可以在登录号NP_002174.1(同种型1前体)；NP_001254642.1(同种型2前体)中找到，并且编码所述氨基酸序列的mRNA序列可以在登录号NM_002183.3(变体1)；NM_001267713.1(变体2)中找到。在一个方面，所述CAR的抗原结合部分识别并结合CD123蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一个方面，CD123蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD123”包括含有突变例如全长野生型CD123的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。
包含抗体或其抗体片段的所述CAR部分可以按多种形式存在，其中所述抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，所述连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999:Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
术语“同源抗原分子”是指本文所述的任何抗原。在一个实施例中，它是指由CAR分子(例如，本文所述的任何CAR)识别(例如，靶向)的抗原。在另一个实施例中，它是指本文所述的与癌症相关的抗原。在一个实施例中，所述同源抗原分子是重组分子。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下项的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本文所述的目的多肽(例如，CAR)内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的功能测定测试改变的目的多肽(例如，CAR)。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
“衍生自”(当该术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
短语“与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病”包括但不限于与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的病症，包括例如增生性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个实施例中，与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一个实施例中，与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的增生性疾病。与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(过敏症和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或曾在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，所述表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与表达CD19(例如，野生型或突变型CD19)的细胞相关的疾病或与表达或曾在任何时间表达CD19(例如，野生型或突变型CD19)的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病，如癌症或恶性肿瘤或癌前病症，如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与CD19表达相关的疾病可以包括与目前不表达CD19(例如，因为例如由于用靶向CD19的分子例如CD19CAR进行治疗导致CD19表达已被下调)但曾经表达CD19的细胞相关的病症。在一个方面，与CD19表达相关的癌症是血液学癌症。在一个方面，血液学癌症症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如，急性髓性白血病(AML)、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与CD19表达相关的其他癌症或血液学病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓增殖性肿瘤；组织细胞障碍(例如，肥大细胞障碍或母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤)；肥大细胞障碍，例如，系统性肥大细胞增生症或肥大细胞白血病；B-细胞幼淋巴细胞白血病、浆细胞性骨髓瘤、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液学病症的多样化集合)等。
与CD19表达相关的其他疾病包括但不限于，例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病状或与CD19表达相关的增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如，狼疮)、炎性障碍(过敏和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达CD19的细胞表达或在曾在任何时间表达CD19mRNA。在一个实施例中，表达CD19的细胞产生CD19蛋白(例如，野生型或突变型)，并且CD19蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达CD19的细胞在一个时间点产生可检测水平的CD19蛋白，并且随后基本上不产生可检测的CD19蛋白。
在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或曾在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。在其他实施例中，所述疾病是CD19阴性癌症，例如，CD19阴性复发癌症。在一些实施例中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞表达或曾在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞在某一点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“4-1BB”是指具有作为GenBank登录号AAA62478.2，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ IDNO:158或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的序列。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在所述位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数的直接函数；例如，如果两个序列中这些位置的一半(例如，长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果这些位置的90％(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
本发明的组合物和方法涵盖具有指定序列，或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％、95％相同或更高地相同的序列的多肽和核酸。在氨基酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指这样的第一氨基酸：它含有i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同的，或ii)为第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基的保守置换的足够或最小数量的氨基酸残基，以使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同结构域和/或共同功能活性。例如，含有与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构域的氨基酸序列。
在核苷酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指这样的第一核酸序列：它含有与第二核酸序列中比对的核苷酸相同的足够或最小数量的核苷酸，以使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽域或具有共同功能多肽活性。例如与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
术语“变体”是指具有与天然存在的序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，变体是功能性变体。
术语“功能性变体”是指与天然存在的序列具有基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有天然存在的序列的一种或多种活性的多肽。
术语序列X的“COF1/CRBN结合变体”是指如下多肽，所述多肽：(1)具有与序列X基本上相同的氨基酸序列，并且(2)与COF1结合、与COF1和CRBN的复合物结合，或在COF1的存在下与CRBN结合。
术语序列X的“COF2/CRBN结合变体”是指如下多肽，所述多肽：(1)具有与序列X基本上相同的氨基酸序列，并且(2)与COF2结合、与COF2和CRBN的复合物结合，或在COF2的存在下与CRBN结合。
术语序列X的“COF3/CRBN结合变体”是指如下多肽，所述多肽：(1)具有与序列X基本上相同的氨基酸序列，并且(2)与COF3结合、与COF3和CRBN的复合物结合，或在COF3的存在下与CRBN结合。
当所述术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或反应的实例。
术语“抑制”或“抑制剂”包括给定分子，例如，CD19、CD20、CD10、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、间皮素或CD79a的某些参数例如活性的降低。例如，该术语包括对活性，例如，CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、间皮素或CD79a的活性至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的抑制。因此，抑制不必为100％。可以如本文所述或通过本领域已知的测定来测定抑制剂的活性。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可产生信号，所述信号促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。在实施例中，所述细胞内信号传导结构域是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能的部分。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含衍生自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含衍生自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。
如本文所用，术语“间皮素”是指40-kDa蛋白质间皮素，其通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接和氨基末端31-kDa脱落片段(称为巨核细胞增强因子(MPF))锚定在细胞膜上。两个片段均含有N-糖基化位点。该术语还指40-kDa羧基末端片段(也称为“可溶性间皮素/MPF相关的”)的可溶性剪接变体。优选地，该术语是指GenBank登录号AAH03512.1的人间皮素及其天然切割部分，例如在细胞膜如癌细胞膜上表达的。如本文所使用的，“间皮素”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型间皮素的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码所述蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其DNA或RNA的组合，及其聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一个实施例中，所述核酸分子是合成的(例如，化学合成的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res[核酸研究].19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志].260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中所述轻链可变区和重链可变区例如通过合成接头(例如短柔性多肽接头)是连续连接的并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了它所来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于融合多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，所述scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体)的一部分(Harlow等人,1999,于：Using Antibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],NY[纽约]；Harlow等人,1989,于：Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold SpringHarbor[冷泉港],New York[纽约]；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个实施例中，所述CAR包含含有scFv的抗体片段。如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(例如，抗原分子)的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于，通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一个方面，信号是初级信号，该初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞反应，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、共FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:163的序列，或来自非人物种的等同残基，例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ IDNO:166的序列，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“ζ”或可替代的“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBank登录号BAG36664.1、或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的蛋白质，并且“ζ刺激结构域”或可替代的“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链足以在功能上传输T细胞活化所必需的初始信号的细胞质结构域的氨基酸残基。在一个方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一个方面，所述“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:163(突变型CD3ζ)的序列。在一个方面，所述“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:166(野生型人CD3ζ)的序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”、“肿瘤抗原”、“过度增殖性障碍抗原”、和“与过度增殖性障碍相关的抗原”可互换地指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在一些实施例中，这些术语是指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志，例如谱系标志，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在某些方面，本发明的过度增殖性障碍抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、卵巢癌、胰腺癌等等)或者浆细胞增殖性障碍，例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther[基因治疗]2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学·转化医学]20135(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]201219(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
如使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指包含单独使用或组合使用的氨基酸(例如，甘氨酸和/或丝氨酸残基)或由其组成的以将两个多肽(例如，COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽，或可变重链区和可变轻链区)连接在一起的肽接头。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:173)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:141)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:142)。在另一个实施例中，所述接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:143)的多个重复。WO 2012/138475中描述的接头也被包括在本发明的范围内，将该文献通过引用并入本文。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。在实施例中，CAR分子在细胞(例如，宿主细胞)中瞬时表达持续有限的时间段或细胞复制次数，例如，少于50天(例如，少于40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或更少的天数)。在一个实施例中，使用体外转录的RNA实现瞬时表达。
如本文所使用的，“稳定”是指转基因的表达比瞬时表达持续更长的时间。在实施例中，转基因被整合到细胞(例如，宿主细胞)的基因组中，或包含在细胞中的稳定质粒复制子中。在一个实施例中，使用基因递送载体(例如，逆转录病毒载体，例如，慢病毒载体)将转基因整合到细胞基因组中。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性障碍的一种或多种症状(例如，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂，如本披露的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增生性障碍的进展。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。治疗不需要是100％，并且在一些实施例中疾病或障碍的至少一种症状的减少或延迟至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％足以被考虑在这些术语范围内。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物，如人)。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。
术语“特异性结合”是指识别样品中存在的同族结合配偶体蛋白并与其结合的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
范围：贯穿本公开内容，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
以下更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据元素周期表,CAS版本,Handbook of Chemistry and Physics[物理化学手册],第75版,内封面进行鉴定，并且具体官能团通常如其中所述被定义。另外，有机化学的一般原理以及特定功能性部分和反应性描述在Thomas Sorrell,Organic Chemistry[有机化学],University ScienceBooks[大学科学书籍出版社],索萨利托,1999；Smith和March,March’s Advanced OrganicChemistry,5th Edition[马奇氏高级有机化学，第5版],John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子出版社],纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[有机官能团转换],VCH Publishers,Inc.[VCH出版社有限公司],纽约,1989；以及Carruthers,SomeModern Methods of Organic Synthesis,3rd Edition[有机合成的一些现代方法],Cambridge University Press[剑桥大学出版社],剑桥,1987中。
如本文所使用的，术语“烷基”是指单价饱和的直链-或支链-烃，例如，1-12、1-10或1-6个碳原子的直链或支链基团，在本文中被分别称为C1-C12烷基、C1-C10烷基和C1-C6烷基。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异-丁基、仲-丁基、仲-戊基、异-戊基、叔-丁基、正-戊基、新戊基、正-己基、仲-己基等。
如本文所使用的，术语“烯基”和“烷基”指的是相对于上述烷基在长度与相似且可能被取代的不饱和脂族基团，但分别含有至少一个双键或三键。示例性烯基基团包括但不限于-CH＝CH2和-CH2CH＝CH2。
如本文所使用的，术语“烷氧基”是指含有1-12个碳原子的直链或支链饱和的烃，其在链中含有末端“O”，例如-O(烷基)。烷氧基基团的实例包括而不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、或戊氧基基团。
如本文所使用的，术语“芳基”是指单环、二环或多环烃环系统，其中至少一个环是芳香族的。代表性芳基基团包括完全芳香族环系统，例如苯基(例如，(C6)芳基)、萘基(例如，(C10)芳基)和蒽基(例如，(C14)芳基)，以及其中芳香族碳环与一个或多个非-芳香族碳环稠合的环系统，例如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基或四氢萘基等。
如本文所使用的，术语“碳环基”是指含有3-18个碳原子的单环或稠合、螺-稠合和/或桥连的二环或多环烃环系统，其中每个环是完全饱和的或包含一个或多个不饱和的单元，但没有环是芳香族的。代表性的碳环基基团包括环烷基基团(例如，环戊基、环丁基、环戊基、环己基等)和环烯基基团(例如，环戊烯基、环己烯基、环戊二烯基等)。
如本文所使用的，术语“羰基”是指-C＝O。
如本文所使用的，术语“氰基”是指-CN。
如本文所使用的，术语“卤代”或“卤素”是指氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)或碘(碘代，-I)。
如本文所使用的，术语“卤代烷基”是指单价饱和的直链或支链烷基链，其中所述链中的至少一个碳原子被一个或多个卤素原子取代。在一些实施例中，卤代烷基基团可以包含例如，1-12、1-10或1-6个碳原子，在本文中被称为C1-C12卤代烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C6卤代烷基。卤代烷基基团的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
术语“卤代烷氧基”是指含有1-12个碳原子、在链中含有末端“O”的直链或支链饱和烃，其中链中的至少一个碳原子被一个或多个卤素取代。卤代烷氧基基团的实例包括但不限于三氟甲氧基、二氟甲氧基、五氟乙氧基、三氯甲氧基等。
如本文所使用的术语“杂烷基”是指单价饱和直链或支链烷基链，其中链中的至少一个碳原子被杂原子(例如，O、S或N)置换，条件是在取代后，所述链包含至少一个碳原子。在一些实施例中，杂烷基基团可以包含，例如，1-12、1-10或1-6个碳原子，在本文中被称为C1-C12杂烷基、C1-C10杂烷基和C1-C6杂烷基。在某些实例中，杂烷基基团包含1、2、3或4个独立选择的杂原子代替烷基链中1、2、3或4个单独的碳原子。代表性杂烷基基团包括-CH2NHC(O)CH3、-CH2CH2OCH3、-CH2CH2NHCH3、-CH2CH2N(CH3)CH3等。
如本文所使用的，术语“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”和“杂亚烷基”分别指烷基、烯基、炔基或杂烷基基团的二价基团。通过从烷基、烯基、炔基或杂烷基基团中提取第二氢原子，单价烷基、烯基、炔基或杂烷基基团中的任一者可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基或杂亚烷基。
如本文所使用的，术语“杂芳基”是指单环、二环或多环的环系统，其中至少一个环是芳香族环且包含杂原子；且其中没有其他环是杂环基(如下定义)。代表性的杂芳基基团包括环系统，其中(i)每个环包含杂原子，并且是芳香族的，例如，咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和喋啶基；(ii)每个环是芳香族的或是碳环基，至少一个芳香族环包含杂原子，并且至少一个其他的环是烃环或例如，吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮、噻唑并-[4,5-c]-吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶基、5,6-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡咯基、4,5,6,7,8-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基；和(iii)每个环是芳香族的或碳环基，并且至少一个芳香族的环与另一个芳香族环共享桥头杂原子，例如，4H-喹嗪基。在某些实施例中，所述杂芳基是单环或二环的环，其中每个所述的环包含5或6个环原子，其中所述环原子中的1、2、3或4个是独立地选自N、O和S的杂原子。
如本文所使用的，术语“杂环基”是指单环的或稠合的、螺-稠合的和/或桥连的二环和多环的环系统，其中至少一个环是饱和的或部分不饱和的(但不是芳香族的)，并且包含杂原子。杂环基可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处附接至其侧基，并且任何环原子可以任选地被取代。代表性杂环基包括环系统，其中(i)每个环是非-芳香族的，并且至少一个环包含杂原子，例如，四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂卓基(diazepinyl)、氧氮杂卓基(oxazepinyl)、硫氮杂卓基(thiazepinyl)、吗啉基和奎宁环基(quinuclidinyl)；(ii)至少一个环是非-芳香族的，并且包含杂原子，并且至少一个其他的环是芳香族的碳环，例如，1,2,3,4-四氢喹啉基；和(iii)至少一个环是非-芳香族的，并且包含杂原子，并且至少一个其他的环是芳香族的并且包含杂原子，例如，3,4-二氢-1H-吡喃并[4,3-c]吡啶基，和1,2,3,4-四氢-2,6-萘啶基。在某些实施例中，所述杂环基是单环的或二环的环，其中每个所述的环包含3-7个环原子，其中所述环原子中的1、2、3或4个是独立地选自N、O和S的杂原子。
如本文所述，本发明的这些化合物可以包含“任选地取代的”部分。通常，术语“取代的”，无论术语“任选地”是否在其之前，表示指定部分的一个或多个氢被合适的取代基置换。除非另有说明，否则“任选地取代的”基团可以在所述基团的每个可取代的位置处具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的一个以上位置可被选自指定基团的一个以上取代基取代时，所述取代基在每个位置处可以是相同或不同的。在本发明中设想的取代基的组合优选是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。如本文所用，术语“稳定”是指如下化合物，在出于本文所披露的一个或多个目的而经历其制备、检测以及在某些实施例中经历其回收、纯化和使用的条件时，它们基本上不发生改变。
如本文所使用的，术语“氧代”是指＝O。
如本文所使用的，术语“硫代羰基”是指C＝S。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人或低级动物的组织接触，而没有不适当的毒性、刺激、过敏应答等，并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19(通过引用并入本文)中详细地描述了药学上可接受的盐。本发明的这些化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机酸和有机酸以及碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是用无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的具有氨基基团的盐，或通过使用本领域已知的其他方法(例如，离子交换)形成的具有氨基基团的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。衍生自适合的碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4 -盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。另外的药学上可接受的盐在适当时包括无毒性铵、季铵以及使用抗衡离子(例如，卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的胺阳离子。
术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合的化合物的形式。此物理缔合可以包括氢键合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚等。具有式(I)、式(I-a)和/或式(II)的化合物可以例如以结晶形式制备并且可以被溶剂化。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非-化学计量的溶剂化物。在某些情况下，溶剂化物能够分离(例如当一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时)。“溶剂化物”涵盖溶液-相和可分离的溶剂化物两者。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。
术语“水合物”是指与水缔合的化合物。通常，化合物的水合物中包含的水分子的数目与水合物中化合物分子的数目具有确定的比率。因此，化合物的水合物可以由例如通式R·x H2O代表，其中R是化合物，并且其中x是大于0的数字。给定的化合物可以形成多于一种类型的水合物，包括例如，一水合物(x是1)、低级水合物(x是大于0且小于1的数字，例如，半水合物(R·0.5H2O))和多水合物(x是大于1的数字，例如，二水合物(R·2H2O)和六水合物(R·6H2O))。
应当理解，具有相同的分子式，但在它们原子的键合性质或顺序或它们的原子在空间中的排列方面不同的化合物被称为“异构体”。在它们的原子在空间中的排列方面不同的异构体被称为“立体异构体”。
彼此不成镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，而彼此是不可重叠镜像的立体异构体被称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心时，例如，它会与四个不同的基团键合，并且可能有一对对映异构体。对映异构体的特征在于其不对称中心的绝对构型，并通过Cahn和Prelog的R-和S-顺序规则进行描述，或由分子旋转偏振光平面的方式来描述，并指定为右旋或左旋(即，分别被指定为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单独的对映异构体或作为其混合物存在。包含等比例对映异构体的混合物被称为“外消旋混合物”。
术语“互变异构体”是指具有可互换形式的特定化合物结构并且在氢原子和电子移位方面变化的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为通过用酸或碱的处理它们快速地相互转化。互变异构的另一个实例是苯基硝基甲烷的酸-和硝基-形式，它们同样是通过用酸或碱处理而形成的。
互变异构形式可以与获得目的化合物的最优化学反应性和生物活性相关。
除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括所述结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构和几何(或构象))形式；例如，每个非对称中心的R和S构型，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体，非对映异构体和几何(或构象)混合物都在本发明的范围内。除非另有说明，否则本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。另外，除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括仅在一个或多个同位素富集的原子存在下不同的化合物。例如，具有本发明结构的化合物，包括用氘或氚替换氢，或用富含13C-或14C-的碳替换碳，都在本发明的范围内。在一个实施例中，存在于本文披露的任何一种化合物(例如，具有式(I)的化合物)中的氢原子在同位素方面富集氘。这样的化合物例如可用作分析工具，用作生物学测定中的探针或用作根据本发明的治疗剂。
在特定对映体是优选的情况下，在一些实施例中，它可以基本上不含相应的对映体，并且也可以称为“光学富集的”提供。如本文所用，“光学-富集的”意指化合物由显著更大比例的一种对映异构体组成。在某些实施例中，化合物由按重量计至少约90％的优选的对映异构体组成。在其他实施例中，化合物由按重量计至少约95％、98％或99％的优选的对映异构体组成。优选的对映异构体可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶)从外消旋混合物中分离，或通过不对称合成制备。参见，例如Jacques等人.,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映异构体、外消旋体和分辨率](Wiley Interscience[威利国际科学出版社],纽约,1981)；Wilen,等人.,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of CarbonCompounds[碳化合物的立体化学](McGraw-Hill[麦格劳希尔出版社],NY,1962)；Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions[分辨剂和光学分辨率的表]第268页(E.L.Eliel,编辑,Univ.of Notre Dame Press[圣母大学出版社],巴黎圣母院(Notre Dame),IN 1972)。
在具体实施方式、附图、实例和权利要求书中更详细地描述了这些和其他示例性取代基。本发明不旨在以任何方式受限于上述示例性取代基列表。
COF1/CRBN结合多肽、COF2/CRBN结合多肽或COF3/CRBN结合多肽
本文尤其披露了融合多肽，所述融合多肽包括具有式(I)的化合物(COF1)/CRBN结合多肽、具有式(II)的化合物(COF2)/CRBN结合多肽或具有式(III)的化合物(COF3)/CRBN结合多肽。在实施例中，在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物，如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)的存在下或在COF3(例如，在表29中披露的化合物)的存在下，所述融合多肽中的COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽增加了所述融合多肽的翻译后修饰和/或降解。在一些实施例中，翻译后修饰可以包括在融合多肽(例如以下中的一种或全部：异源多肽和/或COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的全部或部分)中一个或多个氨基酸残基(例如，赖氨酸或甲硫氨酸中的一个或多个)的泛素化(例如，单或多泛素化)。
在某些实施例中，所述融合多肽的(例如，异源多肽和/或COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的全部或部分)的一个或多个赖氨酸残基被泛素化。在一些实施例中，所述融合多肽(例如，异源多肽和/或COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的全部或部分)的一个或多个甲硫氨酸残基被泛素化(例如，单或多泛素化)。
不希望受理论的束缚,在一些实施例中，本文所述的融合多肽的失活(例如，降解)可以包括以下步骤的一个、两个、三个或全部，例如，在细胞或反应混合物中：
(1)在COF1或COF2(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺))的存在下或在COF3(例如，在表29中披露的化合物)的存在下，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的融合多肽与泛素连接酶复合物(例如，E3泛素连接酶复合物)的一个或多个亚基(例如，CRBN)缔合；
(2)所述融合多肽的泛素化(例如，在异源多肽和/或COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽上的泛素化)，从而提供泛素化的融合多肽；和
(3)所述泛素化的融合多肽的降解。
在一些实施例中，例如，相对于在不存在COF1、COF2或COF3的情况下的修饰和/或降解，本文所述的任何COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽在COF1、COF2或COF3的存在下增加了融合多肽的翻译后修饰和/或降解。在一个实施例中，例如，相对于在不存在COF1、COF2或COF3的情况下的泛素化，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽在COF1、COF2或COF3的存在下增加了所述融合多肽的选择性泛素化。
在一些实施例中，COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽衍生自在COF1、COF2或COF3的存在下与泛素连接酶复合物(例如，所述E3泛素连接酶复合物)的一种或多种组分结合的氨基酸序列和/或结构基序(例如，结构域)。在一些实施例中，例如，如本文所述，COF1或COF2是沙利度胺类化合物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)。在一些实施例中，COF3是在表29中披露的化合物。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽包含锌指结构域(例如，锌指2结构域)或其部分。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽包含β转角。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含Ikaros家族的转录因子(例如，IKZF1或IKZF3)的β转角，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含Ikaros家族的转录因子(例如，IKZF1或IKZF3)的β发夹，或与其基本上相同的序列(例如，与IKZF1或IKZF3的β发夹至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，例如，如在Kronke,J.等人.(2014)Science[科学]343(6168):301-5中所述)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的β转角，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的β发夹，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
在一些实施例中，所述COF1/CRBN或COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1(例如，SEQ IDNO:20)或IKZF3(例如，SEQ ID NO:19)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基或约55至约65个氨基酸残基或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN或COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1(例如，SEQ ID NO:20)或IKZF3(例如，SEQ ID NO:19)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸或至少95个氨基酸或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-或COF2/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100。
在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2(例如，SEQ ID NO:21)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基或约55至约65个氨基酸残基或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2(例如，SEQ ID NO:21)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸或至少95个氨基酸，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。在一些实施例中，所述COF3/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:109、113和114。
在一些实施例中，将IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4和IKZF5的示例性全长序列或其片段提供在表1中。
表1.示例性IKZF序列、变体或片段
Figure BDA0002541415150001431
Figure BDA0002541415150001441
Figure BDA0002541415150001451
Figure BDA0002541415150001461
Figure BDA0002541415150001471
Figure BDA0002541415150001481
降解化合物
本文尤其披露了可以例如增加包括降解标签的融合蛋白质的泛素化和/或降解的降解化合物。
在一些实施例中，所述降解化合物包含沙利度胺类化合物的成员。在一些实施例中，沙利度胺类化合物的成员包括但不限于l来那度胺(CC-5013)、泊马度胺(CC-4047或ACTIMID)、沙利度胺及其盐或衍生物。在一些实施例中，所述降解化合物可以是沙利度胺类化合物的一、二、三或更多个成员的混合物。沙利度胺类似物和沙利度胺类似物的免疫调节剂特性描述于Bodera和Stankiewicz,Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov.[内分泌最新专利代谢免疫药物发现]2011年9月；5(3):192-6，将其通过引用以其整体特此并入。沙利度胺类似物和E3泛素的结构复合物描述于Gandhi等人,Br J Haematol.[英国血液病杂志]2014年3月；164(6):811-21,将其通过引用以其整体特此并入。通过利度胺类似物调节E3泛素连接酶描述于Fischer等人,Nature.[自然]2014年8月7日；512(7512):49-53,将其通过引用以其整体特此并入。
在一些实施例中，所述降解化合物包含具有式(I)的化合物：
Figure BDA0002541415150001482
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，X是O。
在一些实施例中，R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地并任选地被1-12个R4(例如，1个R4、2个R4、3个R4、4个R4、5个R4、6个R4、7个R4、8个R4、9个R4、10个R4、11个R4或12个R4)取代。在一些实施例中，R1是杂环基。在一些实施例中，R1是6元杂环基、或5元杂环基。在一些实施例中，R1是6元杂环基或5元杂环基，其各自独立地并任选地被1-6个R4(例如，1个R4、2个R4、3个R4、4个R4、5个R4或6个R4)取代。在一些实施例中，R1是含氮杂环基。在一些实施例中，R1是哌啶基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。
在一些实施例中，每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被1-12个R6(例如，1个R6、2个R6、3个R6、4个R6、5个R6、6个R6、7个R6、8个R6、9个R6、10个R6、11个R6或12个R6)取代。在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基、-N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA。在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)、-N(RC)(RD)(例如，NH2)或-N(RC)C(O)RA(例如，NHC(O)CH3)。在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基，其任选地被1-6个R6(例如，1个R6、2个R6、3个R6、4个R6、5个R6或6个R6)取代的。
在一些实施例中，每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被1-12个R7(例如，1个R7、2个R7、3个R7、4个R7、5个R7、6个R7、7个R7、8个R7、9个R7、10个R7、11个R7或12个R7)取代。
在一些实施例中，每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被1-6个R8(例如，1个R8、2个R8、3个R8、4个R8、5个R8或6个R8)取代。
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在实施例中，n是1。在一个实施例中，R3是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在一个实施例中，所述降解化合物包含来那度胺，例如，3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是来那度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0002541415150001511
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶基-2,6-二酮基)。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。在实施例中，n是1。在一个实施例中，R3是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在一个实施例中，所述降解化合物包含泊马度胺，例如4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮，或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是泊马度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0002541415150001512
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶基-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。在实施例中，n是0。在一个实施例中，所述降解化合物包含沙利度胺，例如2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮，或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解产物是沙利度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0002541415150001513
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在实施例中，n是1。在一个实施例中，R3是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)。在一个实施例中，R3是被1个R6(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)取代的C1-C6杂烷基。在一个实施例中，所述降解化合物包含2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物具有如在以下式中所示的结构：
Figure BDA0002541415150001521
在一些实施例中，所述降解化合物是具有式(I-a)的化合物：
Figure BDA0002541415150001522
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在，是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，X是O。
在一些实施例中，M是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被1-6个R4(例如，1个R4、2个R4、3个R4、4个R4、5个R4或6个R4)取代。在一些实施例中，M不存在。
在一些实施例中，环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被1-6个R4(例如，1个R4、2个R4、3个R4、4个R4、5个R4或6个R4)取代。在一些实施例中，环A是杂环基。在一些实施例中，环A是杂环基，例如，6元杂环基或5元杂环基。在一些实施例中，环A是含氮杂环基。在一些实施例中，环A是哌啶基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，M不存在且环A是杂环基(例如，哌啶基，例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。
在一些实施例中，R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被1-12个R6(例如，1个R6、2个R6、3个R6、4个R6、5个R6、6个R6、7个R6、8个R6、9个R6、10个R6、11个R6或12个R6)取代。在一些实施例中，R3a是氢、-N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA。在一些实施例中，R3a是氢。在一些实施例中，R3a是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在一些实施例中，R3a是-N(RC)C(O)RA(例如，NHC(O)CH3)。
在一些实施例中，每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被1-12个R6(例如，1个R6、2个R6、3个R6、4个R6、5个R6、6个R6、7个R6、8个R6、9个R6、10个R6、11个R6或12个R6)取代。在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)。
在一些实施例中，每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被1-12个R7(例如，1个R7、2个R7、3个R7、4个R7、5个R7、6个R7、7个R7、8个R7、9个R7、10个R7、11个R7或12个R7)取代。
在一些实施例中，每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被1-6个R8(例如，1个R8、2个R8、3个R8、4个R8、5个R8或6个R8)取代。
在一些实施例中，n是0或1。在一些实施例中，n是0。在一些实施例中，n是1。
在一些实施例中，所述降解化合物是具有式(III)的化合物：
Figure BDA0002541415150001551
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0002541415150001552
任选地是双键；
每个R1独立地是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟基烷基或卤代，或
两个R1连同它们所附接的碳原子一起形成5元或6元杂环基环，或
当在相邻原子上时，两个R1连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基环；
R2是氢、C1-C6烷基、-C(O)C1-C6烷基、-C(O)(CH2)0-3-C6-C10芳基、-C(O)O(CH2)0-3-C6-C10芳基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R5取代，或
当在相邻原子上时，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环基环；
R3是氢，或当
Figure BDA0002541415150001553
是双键时，R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6、-C(O)NR6R6'、-NR6C(O)R6'、卤代、-OH、-NH2、氰基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至4个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2、氰基、C3-C7碳环基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是氢、C1-C6烷基或C6-C10芳基；
每个R7独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-C(O)R8、-(CH2)0-3C(O)OR8、-C(O)NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9、-S(O)pNR8R9、-S(O)pR12、(C1-C6)羟基烷基、卤代、-OH、-O(CH2)1-3CN、-NH2、氰基、-O(CH2)0-3-C6-C10芳基、金刚烷基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的-O(CH2)0-3-5元或6元杂芳基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的单环或二环5元至10元杂芳基、C3-C7碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R11取代，并且所述芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基和C1-C6烷氧基或
两个R7与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)，或
当在相邻原子上时，两个R7连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R10独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基或
两个R10与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)；
每个R11独立地选自氰基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中每个芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基；
R12是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基；
Rx是氢或氘；
p是0、1或2；
n是0、1、或2；
y是1或2，其中n+y≤3；和
q是0、1、2、3或4。
在一些实施例中，所述具有式(III)的降解化合物是具有式(III-a)的化合物：
Figure BDA0002541415150001571
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0002541415150001581
任选地是双键；
每个R1独立地是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟基烷基或卤代；
R2是氢、C1-C6烷基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R5取代；
R3是氢，或当
Figure BDA0002541415150001582
是双键时，R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6、-C(O)NR6R6'、-NR6C(O)R6'、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至4个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基、和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2、氰基、C3-C7碳环基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6’各自独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R7独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-C(O)R8、-C(O)NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9、(C1-C6)羟基烷基、卤代、-OH、-NH2、氰基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C7碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，或
当在相邻原子上时，两个R7连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R10独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基；
Rx是氢或氘；
n是1或2；和
q是0、1、2、3或4。
在一个实施例中，所述具有式(III)的化合物是具有式(III-b)的化合物：
Figure BDA0002541415150001591
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中X1、R1、R2、n、q及其亚变量是如针对式(III)的描述所定义。
在一个实施例中，所述具有式(III)的化合物是具有式(III-c)的化合物：
Figure BDA0002541415150001601
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中R1、R2、n、q及其亚变量是如针对式(III)的描述所定义。
在一个实施例中，所述具有式(III)的化合物是具有式(III-d)的化合物：
Figure BDA0002541415150001602
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中R1、R2、q及其亚变量是如针对式(III)的描述所定义。
在一个实施例中，所述具有式(III)的化合物是具有式(III-e)的化合物：
Figure BDA0002541415150001603
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中R1、R2、q及其亚变量是如针对式(III)的描述所定义。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，并且n是1。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，并且q是0。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，并且q是0或1。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，并且R1是C1-C6烷基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基。
在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基。
在以上式的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自-C(O)OR6、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自-C(O)OR6、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、碳环基和杂环基任选地被一至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C6-C10芳基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是包含1个至3个选自N、O、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C3-C8碳环基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一至三个R5取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、碳环基和杂环基任选地被一至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C6-C10芳基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是包含1个至3个选自N、O、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C3-C8碳环基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一至三个R5取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基。在另一个实施例中，X1是CH，n是1，q是0，并且R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自-C(O)OR6、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自-C(O)OR6、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在上式的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自卤代、-OH、苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中所述苯基和杂芳基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基和杂芳基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中所述苯基和杂芳基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是1，n1是1，q是0，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自苯基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述苯基和杂芳基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH、n是1、q是0、R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4是任选地被一至三个R7取代的苯基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH、n是1、q是0、R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4是任选地被一至三个R7取代的苯基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH、n是1、n1是1、q是0、R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4是任选地被一至三个R7取代的苯基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH、n是1、n1是1、q是0、R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4是任选地被一至三个R7取代的苯基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，并且n是2。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，并且q是0。在又另一个实施例中，X1是CH，n是2，并且q是0或1。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，并且R1是C1-C6烷基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自-C(O)OR6、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自-C(O)OR6、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，R2是任选地被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基、R2是被一至三个R4取代的C1-C6烷基，并且每个R4独立地选自C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基基团任选地被一至三个R7取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、碳环基和杂环基任选地被一至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C6-C10芳基。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是包含1个至3个选自N、O、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C3-C8碳环基。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一至三个R5取代。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、碳环基和杂环基任选地被一至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是C6-C10芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基。
在式(III)的一些实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C6-C10芳基。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0，并且R2是包含1个至3个选自N、O、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个至三个R5取代。在又另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是任选地被一至三个R5取代的C3-C8碳环基。在另一个实施例中，X1是CH，n是2，q是0或1，R1是C1-C6烷基，并且R2是包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一至三个R5取代。
在式(III)的一些实施例中，
Figure BDA0002541415150001691
是
Figure BDA0002541415150001692
Figure BDA0002541415150001693
Figure BDA0002541415150001701
在式(III)的一些实施例中，
Figure BDA0002541415150001702
是
Figure BDA0002541415150001703
Figure BDA0002541415150001704
Figure BDA0002541415150001711
在式(III)的一些实施例中，
Figure BDA0002541415150001712
是
Figure BDA0002541415150001713
Figure BDA0002541415150001714
降解化合物可以包含一个或多个手性中心或作为一种或多种立体异构体存在。在一些实施例中，所述降解化合物包含单一手性中心且是立体异构体(例如，R立体异构体和S立体异构体)的混合物。在一些实施例中，所述混合物包含一定比率的R立体异构体与S立体异构体，例如，R立体异构体与S立体异构体的比率为约1:1(即，外消旋混合物)。在一些实施例中，所述混合物包含比率为约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5或约99:1的R立体异构体与S立体异构体。在一些实施例中，所述混合物包含比率为约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5或约99:1的S立体异构体与R立体异构体。在一些实施例中，所述降解化合物是具有式(I)或式(I-a)的单一立体异构体，例如，单一R立体异构体或单一S立体异构体。
在一些实施例中，所述降解化合物(例如，具有式(I)、(I-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)或(III-e)的化合物)不与接头或附接基团附接。在一些实施例中，所述降解化合物(例如，具有式(I)、(I-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)或(III-e)的化合物)不包含另一个部分(例如，配体、靶向剂或能够二聚化的部分)。
在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(I-a)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(III)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(III-a)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(III-b)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(III-c)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(III-d)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是具有式(III-e)的化合物或其药学上可接受的盐。
本披露的示例性降解化合物(例如，具有式(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)或(III-e)的化合物或其药学上可接受的盐)包括在表29中的那些化合物。
表29.示例性降解化合物
Figure BDA0002541415150001721
Figure BDA0002541415150001731
Figure BDA0002541415150001741
Figure BDA0002541415150001751
Figure BDA0002541415150001761
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在另一方面，所述降解化合物是具有式(II)的化合物：
Figure BDA0002541415150002362
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、互变异构体或前药，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同它们所附接的碳原子一起形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R10独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE或L-标签；其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R11取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、C(O)RA、-C(O)ORB或B、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R11独立地是C1-C6烷基、卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA；
每个L独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、-C(O)RA1、-C(O)ORB1、-ORB1、-N(RC1)(RD1)、-C(O)N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RA1、-S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)或-N(RC1)S(O)xRE1，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个标签是能够与靶蛋白结合的靶向部分；
每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个R12独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、碳环基或杂环基；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
在一些实施例中，X是O。
在一些实施例中，R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地并任选地被1-12个R4(例如，1个R4、2个R4、3个R4、4个R4、5个R4、6个R4、7个R4、8个R4、9个R4、10个R4、11个R4或12个R4)取代。在一些实施例中，R1是C1-C6烷基或杂环基。在一些实施例中，R1是被R4取代的C1-C6烷基(例如，甲基或乙基)。在一些实施例中，R1是被1-6个R4取代的C1-C6烷基(例如，甲基或乙基)。在一些实施例中，R1是杂环基。在一些实施例中，R1是6元杂环基、或5元杂环基。在一些实施例中，R1是任选地被1-6个R4(例如，1个R4、2个R4、3个R4、4个R4、5个R4或6个R4)取代的6元杂环基或5元杂环基。在一些实施例中，R1是含氮杂环基。在一些实施例中，R1是哌啶基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。
在一些实施例中，每个R10独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE或L-标签；其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被1-12个R11(例如，1个R11、2个R11、3个R11、4个R11、5个R11、6个R11、7个R11、8个R11、9个R11、10个R11、11个R11或12个R11)取代。在一些实施例中，R10是C1-C6杂烷基、-N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA。在一些实施例中，R10是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2)、-N(RC)(RD)(例如，NH2)或-N(RC)C(O)RA(例如，NHC(O)CH3)。
在一些实施例中，每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、C(O)RA、-C(O)ORB或B、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被1-12个R7(例如，1个R7、2个R7、3个R7、4个R7、5个R7、6个R7、7个R7、8个R7、9个R7、10个R7、11个R7或12个R7)取代。
在一些实施例中，每个R11独立地是C1-C6烷基、卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被1-6个R8(例如，1个R8、2个R8、3个R8、4个R8、5个R8或6个R8)取代。
在一些实施例中，每个L独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、-C(O)RA1、-C(O)ORB1、-ORB1、-N(RC1)(RD1)、-C(O)N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RA1、-S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)或-N(RC1)S(O)xRE1，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被1-12个R12(例如，1个R12、2个R12、3个R12、4个R12、5个R12、6个R12、7个R12、8个R12、9个R12、10个R12、11个R12或12个R12)取代。
在一些实施例中，每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被1-12个R12(例如，1个R12、2个R12、3个R12、4个R12、5个R12、6个R12、7个R12、8个R12、9个R12、10个R12、11个R12或12个R12)取代。
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在实施例中，n是1。在一个实施例中，R10是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在一个实施例中，所述降解化合物包含来那度胺，例如，3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是来那度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0002541415150002391
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶基-2,6-二酮基)。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。在实施例中，n是1。在一个实施例中，R10是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在一个实施例中，所述降解化合物包含泊马度胺，例如4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮，或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物是泊马度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0002541415150002401
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶基-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。在实施例中，n是0。在一个实施例中，所述降解化合物包含沙利度胺，例如2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮，或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解产物是沙利度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0002541415150002402
在一个实施例中，X是O。在一个实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在实施例中，n是1。在一个实施例中，R10是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)。在一个实施例中，所述降解化合物包含2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，所述降解化合物具有如在以下式中所示的结构：
Figure BDA0002541415150002403
在一些实施例中，所述降解化合物(例如，具有式(II)的化合物)不与接头或附接基团附接。在一些实施例中，所述降解化合物(例如，具有式(II)的化合物)不包含另一个部分(例如，配体、靶向剂或能够二聚化的部分)。在一些实施例中，R10不是L-标签。
在一些实施例中，所述降解化合物(例如，具有式(II)的化合物)与接头或附接基团附接(例如，至少一个R10是L-标签)。在一些实施例中，所述降解化合物(例如，具有式(II)的化合物)包含另一个部分(例如，配体、靶向剂或能够二聚化的部分)。在一些实施例中，R10是L-标签，并且L是烷基或杂烷基(例如，PEG链)。在一些实施例中，L是接头，其选自在国际专利公开号WO 2017/024318(例如，图28-31)中披露的接头。
在一些实施例中，R10是L-标签，并且标签是能够与靶蛋白结合或被靶蛋白结合的靶向部分。标签可以包含小分子化合物或氨基酸序列(例如，肽或多肽)。在一些实施例中，所述标签是激酶抑制剂、含BET布罗莫结构域的蛋白质抑制剂、细胞溶质信号传导蛋白FKBP12配体、HDAC抑制剂、赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫遏制性化合物或芳基烃受体(AHR)抑制剂。
在某些实施例中，所述标签是SERM(选择性雌激素受体调节剂)或SERD(选择性雌激素受体降解剂)。SERM和SERD的非限制性实例提供在国际专利公开号WO 2014/191726、WO2013/090921、WO 2014/203129、WO 2014/205136、WO 2014/205138和WO 2014/203132；美国专利公开号US 2013/0178445和US 2015/0005286；以及美国专利号9,078,871、8,853,423和8,703,810中。
另外的标签包括例如与内源蛋白结合的任何部分(与靶蛋白结合)。示例性标签包括Hsp90抑制剂、激酶抑制剂、HDM2和MDM2抑制剂、靶向含人BET布罗莫结构域的蛋白质的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞核激素受体化合物、免疫遏制性化合物，和靶向芳基烃受体(AHR)的化合物等。此类小分子标签还包括这些组合物的药学上可接受的盐、对映异构体、溶剂化物和多晶型物，以及可以与目的靶蛋白结合的其他小分子。
在一个实施例中，所述标签是Ubc9SUMO E2连接酶5F6D靶向配体，例如，如在Hewitt,W.M.,等人.(2016)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[德国应用化学国际版]55:5703-5707中所述。
在一个实施例中，所述标签是Tank1靶向配体，例如，如在Kirby,C.A.等人,(2012)Acta Crystallogr.Sect.F[晶体学报F部分]68:115-118；和Shultz,M.D.,等人.(2013)J.Med.Chem.[药物化学杂志]56:7049-7059中所述。
在一个实施例中，所述标签是pp60Src靶向配体的SH2结构域，例如，如在GudrunLange,等人.,(2003)J.Med.Chem.[药物化学杂志]46,5184-5195中所述。
在一个实施例中，所述标签是Sec7结构域靶向配体，例如，如在Huta,B.P.,等人.,(2016)Chemmedchem[化学药物化学]11:277中所述。
在一个实施例中，所述标签是Saposin-B靶向配体，例如，如在I.Nemcovicova和D.M.Zajonc Acta Cryst.[晶体学报](2014).D70,851-862中所述。
在一个实施例中，所述标签是蛋白质S100-A7 2OWS靶向配体，例如，如在Leon,R.,Murray,等人.,(2009)Biochemistry[生物化学]48:10591-10600中所述。
在一个实施例中，所述标签是磷脂酶A2靶向配体，例如，如在Schevitz,R.W.,等人.,(1995)Nat.Struct.Biol.[自然结构与分子生物学]2,458-465中所述。
在一个实施例中，所述标签是PHIP靶向配体，例如，如在Krojer,T.；等人.Chem.Sci.[化学科学]2016,7,2322-2330中所述。
在一个实施例中，所述标签是PDZ靶向配体，例如，如在Mangesh Joshi,等人.Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版](2006)45,3790-3795中所述。
在一个实施例中，所述标签是PARP15靶向配体，例如，如在Karlberg,T.,等人.,(2015)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]290:7336-7344中所述。
在一个实施例中，所述标签是PARP14靶向配体，例如，如在Andersson,C.D.,等人.,(2012)J.Med.Chem.[药物化学杂志]55:7706-7718.；Wahlberg,E.,等人.(2012)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]30:283-288.；Andersson,C.D.,等人.(2012)J.Med.Chem.[药物化学杂志]55:7706-7718中所述。
在一个实施例中，所述标签是MTH1靶向配体，例如，如在Helge Gad,等人.Nature[自然],(2014)508,215-221中所述。
在一个实施例中，所述标签是mPGES-1靶向配体，例如，如在Luz,J.G.,等人.,(2015)J.Med.Chem.[药物化学杂志]58:4727-4737中所述。
在一个实施例中，所述标签是FLAP-5-脂氧合酶-活化蛋白靶向配体，例如，如在Ferguson,A.D.,等人(2007)Science[科学]317:510-512中所述。
在一个实施例中，所述标签是FA结合蛋白靶向配体，例如，如在Kuhn,B.；等人.J.Med.Chem.[药物化学杂志](2016)59,4087-4102中所述。
在一个实施例中，所述标签是BCL2靶向配体，例如，如在Souers,A.J.,等人.(2013)Nat Med[自然医学]19:202-208中所述。
在一个实施例中，所述标签是任何小分子或蛋白质，所述任何小分子或蛋白质可以与靶蛋白(被泛素连接酶起作用或由泛素连接酶降解的靶蛋白)结合。在一些实施例中，所述标签是在国际专利公开号WO 2017/024318(例如，表T，第119-129页)中披露的dTAG靶向配体。
当R10是L-标签，标签能够与靶蛋白结合或被靶蛋白结合。示例性靶蛋白包括FK506结合蛋白-12(FKBP12)、含布罗莫结构域的蛋白4(BRD4)、CREB结合蛋白(CREBBP)或转录活化剂BRG1(SMARCA4)。在一些实施例中，所述靶蛋白包含激素受体，例如，雌激素-受体蛋白、雄激素受体蛋白、类视黄醇x受体(RXR)蛋白、或二氢叶酸还原酶(DHFR)(包括细菌性DHFR)。在一些实施例中，所述靶蛋白包含衍生自细菌性脱卤素酶的氨基酸序列。在其他实施例中，所述靶蛋白包含衍生自以下项的氨基酸序列：7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤三磷酸酶、AFAD、花生四烯酸5-脂氧合酶活化蛋白、载脂蛋白、ASH1L、ATAD2、含杆状病毒IAP重复的蛋白质2、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、BAZ2B、Bcl-2、Bcl-xL、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD5、BRD6、BRD7、BRD8、BRD9、BRD10、BRDT、BRPF1、BRPF3、BRWD3、CD209、CECR2、CREBBP、E3连接酶XIAP、EP300、FALZ、来自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、GCN5L2、GTP酶k-RAS、HDAC6、造血前列腺素D合酶、KIAA1240、乳酰谷胱甘肽裂解酶、LOC93349、Mcl-1、MLL、PA2GA、PB1、PCAF、肽基-脯氨酰基顺-反异构酶NIMA相互作用蛋白1、PHIP、聚-ADP-核糖聚合酶14、聚-ADP-核糖聚合酶15、PRKCBP1、鞘脂激活蛋白原(prosaposin)、前列腺素E合酶、视杆视紫红质敏感性cGMP 3’,’5-环磷酸二酯酶亚基δ、S100-A7、SMARCA2、SMARCA4、SP100、SP110、SP140、Src、Sumo缀合酶UBC9、超氧化物歧化酶、TAF1、TAF1L、端锚聚合酶1、端锚聚合酶2、TIF1a、TRIM28、TRIM33、TRIM66、WDR9、ZMYND11或MLL4。在其他实施例中，所述靶蛋白包含衍生自MDM2的氨基酸序列。在一些实施例中，所述靶蛋白是在国际专利公开号WO 2017/024318(例如，第112-114页)中披露的dTAG。
在一个实施例中，所述靶蛋白衍生自BRD2、BRD3、BRD4或BRDT。在一个实施例中，所述靶蛋白是经修饰的或突变的BRD2、BRD3、BRD4或BRDT蛋白。在某些实施例中，所述BRD2的一个或多个突变包括在氨基酸位置97处色氨酸(W)的突变、在氨基酸位置103处缬氨酸(V)的突变、在氨基酸位置110处亮氨酸(L)的突变、在氨基酸位置370处W的突变、在氨基酸位置376处V的突变或在氨基酸位置381处L的突变。
在一个实施例中，所述靶蛋白衍生自胞质信号传导蛋白FKBP12。在某些实施例中，所述靶蛋白是经修饰的或突变的胞质信号传导蛋白FKBP12。在某些实施例中，所述经修饰的或突变的胞质信号传导蛋白FKBP12包含一个或多个突变，所述突变产生了对FKBP12配体的扩大的结合口袋。在某些实施例中，所述一个或多个突变包括在氨基酸位置36处的苯基丙氨酸(F)向缬氨酸(V)(F36V)的突变(在本文中可互换地称为FKBP12*或FKBP*)。
在一些实施例中，所述降解化合物是披露于美国专利号7,973,057；美国专利号8,546,430；美国专利号8,716,315；国际专利公开号WO 2017/059062；或国际专利公开号WO2017/024318中的化合物，将这些文献各自特此通过引用以其整体并入本文。
异源多肽
本文提供了包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和目的异源多肽的融合多肽。在一些实施例中，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽通过接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)分开。在一些实施例中，本文所述的融合多肽包含三个元件：COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽(例如，如本文所述的降解决定子的氨基酸序列的部分)；异源多肽；以及将COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽分开的接头。在其他实施例中，本文所述的融合多肽包含两个元件：直接与异源多肽连接的COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽(例如，例如如本文所述的降解决定子的氨基酸序列的部分)。可以安排这些元件，使得所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽(例如，降解决定子的氨基酸序列的部分，例如，如本文所述)位于所述目的异源多肽的N-末端、所述目的异源多肽的C-末端或在所述目的异源多肽的中间。在一个实施例中，所述异源多肽是胞质蛋白和/或核蛋白，并且所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽位于所述异源多肽的N-末端。在一个实施例中，所述异源多肽是跨膜蛋白，并且所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽位于所述异源多肽的C-末端。
在一些实施例中，所述融合多肽进一步包含降解结构域。在一些实施例中，所述降解结构域通过异源蛋白酶切割位点与所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。
本文披露的这些融合多肽可以包括任何目的异源多肽。在一些实施例中，所述异源多肽可以是跨膜蛋白(例如，跨膜受体)。在某些实施例中，所述目的异源多肽可以是例如离子通道连接的受体；酶连接的受体(例如，受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶和组氨酸激酶相关受体)；或G蛋白偶联受体。在一些实施例中，所述跨膜蛋白是例如，如本文所述的嵌合抗原受体。
在另一个实施例中，所述异源多肽是分泌性蛋白(例如，小分泌性蛋白)。在一些实施例中，所述异源多肽可以是例如在细胞制造中的抗体、纳米抗体或蛋白质结合分子。在一些实施例中，所述异源多肽可以是治疗性蛋白或临床性蛋白(例如，胰岛素、生长激素、促红细胞生成素或治疗性抗体)。在某些实施例中，蛋白质可对用于制造的细胞产生毒性(例如，细菌毒素和蛋白酶)。
表2包括用于在本文披露的融合多肽中使用的示例性异源多肽的列表。另外的目的异源多肽包括如下部分所述的嵌合抗原T细胞受体。
表2.目的异源多肽
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CAR抗原结合结构域
在一个方面，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域结合的本披露的CAR包含靶特异性结合元件，在其他情况下被称为抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含抗原结合结构域的部分包含靶向(例如特异性结合)抗原(例如本文所述的抗原(例如CD19))的抗原结合结构域。在一个实施例中，所述抗原结合结构域靶向(例如，特异性结合)人CD19。
在一些实施例中，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域连接的异源多肽包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述CAR包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域的细胞内信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域。与本披露有关的CAR核酸构建体、编码的蛋白质、含有载体、宿主细胞、药物组合物以及给予和治疗的方法在国际专利申请公开号WO 2015142675(将其通过引用以其整体并入)中详细地披露。
在一些实施例中，所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含结合至支持肿瘤的抗原(例如，如本文描述的支持肿瘤的抗原)的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)、跨膜结构域(例如，本文描述的跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如，本文描述的细胞内信号传导结构域)(例如，包含共刺激结构域(例如，本文描述的共刺激结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的初级信号传导结构域)的细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，所述支持肿瘤的抗原是存在于基质细胞或骨髓源性遏制细胞(MDSC)上的抗原。在其他方面，本发明的特征在于由此类核酸编码的多肽以及含有此类核酸和/或多肽的宿主细胞。
在一些实施例中，CAR分子包含选自以下中的至少一个细胞内信号传导结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、CD3ζ信号结构域，或其任何组合。在一些实施例中，CAR分子包含选自一个或多个共刺激分子的至少一个细胞内信号传导结构域，所述共刺激分子选自CD137(4-1BB)、CD28、CD27或ICOS。
在一些实施例中，多个免疫效应细胞，例如T调节性细胞耗减的细胞群体，包括编码CAR的核酸，所述CAR包含靶特异性结合元件，否则称为抗原结合结构域。结合元件的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标记物的配体。因此，可以作为本文所述的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
可以是本文所述CAR分子(例如，TA CAR或BCA CAR)的一部分的不同组分的非限制性实例的序列在表3中列出，其中“aa”代表氨基酸，并且“na”代表编码相应肽的核酸。
表3.CAR的不同组分的序列(aa-氨基酸序列，na-核酸序列)。
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表4.用降解标签和/或FurON修饰的CAR
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在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域)。
在一个方面，本发明的CAR(例如CD19CAR)包含至少一个选自下组的细胞内信号传导结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、及其任何组合。在一个方面，所述CAR包含来自选自以下中的一种或多种共刺激分子的至少一个细胞内信号传导结构域：CD137(4-1BB)、CD28、CD27、或ICOS。
CAR抗原结合结构域
在一个方面，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域结合的本披露的CAR包含靶特异性结合元件，在其他情况下被称为抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含抗原结合结构域的部分包含靶向(例如特异性结合)抗原(例如本文所述的抗原(例如CD19))的抗原结合结构域。在一个实施例中，所述抗原结合结构域靶向(例如，特异性结合)人CD19。
在一些实施例中，多个免疫效应细胞，例如T调节性细胞耗减的细胞群体，包括编码CAR的核酸，所述CAR包含靶特异性结合元件，否则称为抗原结合结构域。结合元件的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标记物的配体。因此，可以作为本文所述的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在一些实施例中，所述抗原结合结构域选自：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和阿贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑色素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；天冬酰胺内肽酶(legumain)；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一个实施例中，所述抗原结合结构域与CD19结合。在另一个实施例中，所述抗原结合结构域与CD123结合。在另一个实施例中，所述抗原结合结构域与BCMA结合。在另一个实施例中，所述抗原结合结构域与CD20结合。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的可替代支架(如重组纤连蛋白结构域等)、T细胞受体(TCR)或其片段(例如，单链TCR)等。在一些情况下，抗原结合结构域衍生自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。
抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼科动物衍生纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域(如重组纤连蛋白结构域)的可替代支架等。在一些情况下，抗原结合结构域衍生自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。因此，在一个方面，抗原结合结构域包括人抗体或抗体片段。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个或三个(例如，全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如，描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892A1、US 2014/0322275A1、或WO 2015/090230中的抗体)，和/或一个、两个或三个(例如，全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如，描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)。在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，抗原结合结构域是WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的抗原结合结构域。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4等，如例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO2016/014535、和WO 2016/025880中所述，这些文献各自通过引用以其整体并入本文。
多特异性CAR
在一些实施例中，所述CAR分子是多特异性(例如，双特异性)，所述CAR分子具有针对第一抗原(例如，B细胞表位)的第一结合特异性，和针对相同或不同抗原(例如，B细胞表位)的第二结合特异性。在一些实施例中，所述双特异性CAR分子具有针对CD19的第一结合特异性(例如，所述双特异性CAR分子包含在表5、6、7和30中披露的抗CD19CAR)和针对CD22的第二结合特异性(例如，所述双特异性CAR分子包含在表19和20中披露的抗CD22 CAR)。在一些实施例中，所述双特异性CAR分子具有针对CD19的第一结合特异性(例如，所述双特异性CAR分子包含在表5、6、7和30中披露的抗CD19CAR)和针对CD20的第二结合特异性(例如，所述双特异性CAR分子包含在表32中披露的抗CD20 CAR)。
在一个实施例中，第一结合特异性和第二结合特异性是抗体分子，例如抗体结合结构域(例如，scFv)。在双特异性CAR分子的每个抗体分子(例如，scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。
在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VH(VH1)在其VL(VL1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VL(VL2)在其VH(VH2)上游，使得整个双特异性CAR分子从N末端至C末端取向具有VH1-VL1-VL2-VH2的排列。
在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VL(VL1)在其VH(VH1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VH(VH2)在其VL(VL2)上游，使得整个双特异性CAR分子从N末端至C末端取向具有VL1-VH1-VH2-VL2的排列。
在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VL(VL1)在其VH(VH1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VL(VL2)在其VH(VH2)上游，使得整个双特异性CAR分子从N末端至C末端取向具有VL1-VH1-VL2-VH2的排列。
在又一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VH(VH1)在其VL(VL1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列为其VH(VH2)在其VL(VL2)上游，使得整个双特异性CAR分子从N末端至C末端取向具有VH1-VL1-VH2-VL2的排列。
在前述构型中的任一种中，任选地，在这两个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间布置接头，例如如果该构建体排列为VH1-VL1-VL2-VH2，则在VL1与VL2之间布置该接头；如果构建体排列为VL1-VH1-VH2-VL2，则在VH1与VH2之间布置接头；如果构建体排列为VL1-VH1-VL2-VH2，则在VH1与VL2之间布置接头；或者如果构建体排列为VH1-VL1-VH2-VL2，则在VL1与VH2之间布置接头。一般来说，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。接头可以是如本文所述的接头。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝1(SEQ ID NO:168)，例如，所述接头具有氨基酸序列Gly4-Ser(SEQ ID NO:168)。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝3(SEQ ID NO:142)。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝4(SEQ ID NO:141)。在一些实施例中，接头包含以下氨基酸序列，例如由以下氨基酸序列组成：LAEAAAK(SEQ ID NO:822)。
在前述构型中的任一种中，任选地，在第一scFv的VL与VH之间布置接头。任选地，接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文描述的布置中包含VL、VH、和任选一个或多个接头。
在一些实施例中，每个抗体分子，例如每个抗原结合结构域(例如，每个scFv)在VH区与VL区之间包含接头。在一些实施例中，在VH和VL区之间的接头是(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝1(SEQ ID NO:168)，例如，所述接头具有氨基酸序列Gly4-Ser(SEQ ID NO:168)。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝3(SEQ ID NO:142)。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝4(SEQ ID NO:141)。在一些实施例中，VH区和VL区在没有接头的情况下连接。
另外的示例性多特异性CAR分子披露在WO 2018/067992的第26-39页，通过引用并入本文。
CD19CAR
在其他实施例中，所述表达CAR的细胞可以特异性结合CD19，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/153270的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。
在实施例中，CAR分子包含特异性结合CD19的抗原结合结构域(CD19CAR)。在一个实施例中，抗原结合结构域靶向人CD19。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63scFv片段相同或相似的结合特异性。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。CD19抗体分子可以是例如描述于通过引用以其整体并入本文的WO 2014/153270中的抗体分子(例如人源化抗CD19抗体分子)。WO 2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。
在一个方面，亲本鼠scFv序列是PCT公开WO 2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体。在一个实施例中，所述抗CD19结合结构域是WO 2012/079000中所述的scFv。
在一个实施例中，所述CAR分子包含在PCT公开WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，并且提供在本文的表5中，其提供特异性结合至人CD19的鼠来源的scFv片段。该小鼠scFv的人源化可能是临床环境所希望的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(例如用由CAR19构建体转导的T细胞进行的治疗)的患者中诱导人-抗小鼠抗原(HAMA)响应。
在一个实施例中，CD19CAR包含在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。在实施例中，氨基酸序列是
(MALPVTALLLPLALLLHAARP)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:181)，或与其基本上同源的序列。信号肽的任选序列以大写字母和大括号示出。
在一个实施例中，氨基酸序列是：
Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:182)，或与其基本上同源的序列。
在一个实施例中，所述CD19CAR具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。在实施例中，CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，所述CTL019通过用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自身失活、复制缺陷型慢病毒(LV)载体的转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在其他实施例中，CD19CAR包含根据通过引用并入本文的WO2014/153270的表3的抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。
对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将所述文献通过引用以其整体并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。
在一些实施例中，CD19CAR构建体描述于PCT公开WO 2012/079000中(通过引用并入本文)，并且鼠CD19CAR和scFv构建体的氨基酸序列在下表5中示出，或者是与前述序列中的任一种基本上相同的序列(例如，与本文所述的任何序列是至少85％、90％、95％或更高地相同)。
表5.CD19CAR构建体
Figure BDA0002541415150002711
Figure BDA0002541415150002721
Figure BDA0002541415150002731
Figure BDA0002541415150002741
Figure BDA0002541415150002751
Figure BDA0002541415150002761
Figure BDA0002541415150002771
表30.另外的CD19CAR构建体
Figure BDA0002541415150002772
Figure BDA0002541415150002781
Figure BDA0002541415150002791
含有人源化抗CD19scFv结构域的CD19CAR构建体描述于PCT公开WO 2014/153270(通过引用并入本文)中。
抗CD19scFv结构域的鼠和人源化CDR序列的序列对于重链可变结构域示出在表6中并且对于轻链可变结构域示出在表7中。在一些实施例中，鼠或人源化CD19结合结构域的HCDR1是GVSLPDYGVS(SEQ ID NO:230)。
表6.CD19抗体的重链可变结构域CDR(卡巴特)SEQ ID NO
候选物 HCDR1 HCDR2 HCDR3
鼠_CART19 SEQ ID NO:221 SEQ ID NO:222 SEQ ID NO:223
人源化_CART19a SEQ ID NO:221 SEQ ID NO:227 SEQ ID NO:223
人源化_CART19b SEQ ID NO:221 SEQ ID NO:228 SEQ ID NO:223
人源化_CART19c SEQ ID NO:221 SEQ ID NO:229 SEQ ID NO:223
表7.CD19抗体的轻链可变结构域CDR(卡巴特)SEQ ID NO
候选物 LCDR1 LCDR2 LCDR3
鼠_CART19 SEQ ID NO:224 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:226
人源化_CART19a SEQ ID NO:224 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:226
人源化_CART19b SEQ ID NO:224 SEQ ID NO:225 SEQ ID NO:226
人源化_CART19c SEQ ID NO:224 SEQ IDNO:225 SEQ ID NO:226
可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19CAR，例如任何已知的CD19CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人.,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人.,Blood[血液],118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人.,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人.,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am SocGen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日，盐湖城)2013,文摘10。
示例性CD19CAR包括本文所述的CD19CAR，例如，在本文所述的一个或多个表中，或在Xu等人.Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人.Blood[血液]122.25(2013):4129-39；Cruz等人.Blood[血液]122.17(2013):2965-73；NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207中所述的抗CD19CAR，每个文献通过引用以其整体并入本文。
CD123 CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。在WO2014/130635中详细说明的编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列提供在表8-14中。将与表8-14中提供的前述序列相同和基本上相同的氨基酸序列和核苷酸序列明确地并入本说明书中。
根据卡巴特和乔西亚编号方案的组合，将针对CD123结合结构域的CDR提供在表8-14中。
表8.重链可变结构域CDR
Figure BDA0002541415150002811
表9.轻链可变结构域CDR
Figure BDA0002541415150002812
表10.重链可变结构域CDR
Figure BDA0002541415150002813
表11.轻链可变结构域CDR
Figure BDA0002541415150002814
表12：示例性CD123 CAR序列
名称 SEQ ID NO
CAR123-2NT SEQ ID NO:248
CAR123-2AA SEQ ID NO:249
CAR123-2scFv SEQ ID NO:250
CAR123-2VH SEQ ID NO:251
CAR123-2VL SEQ ID NO:252
CAR123-3NT SEQ ID NO:253
CAR123-3AA SEQ ID NO:254
CAR123-3scFv SEQ ID NO:255
CAR123-3VH SEQ ID NO:256
CAR123-3VL SEQ ID NO:257
CAR123-4NT SEQ ID NO:258
CAR123-4AA SEQ ID NO:259
CAR123-4scFv SEQ ID NO:260
CAR123-4VH SEQ ID NO:261
CAR123-4VL SEQ ID NO:262
CAR123-1NT SEQ ID NO:263
CAR123-1AA SEQ ID NO:264
CAR123-1scFv SEQ ID NO:265
CAR123-1VH SEQ ID NO:266
CAR123-1VL SEQ ID NO:267
表13：人源化CD123 CAR序列
Figure BDA0002541415150002821
Figure BDA0002541415150002831
Figure BDA0002541415150002841
Figure BDA0002541415150002851
Figure BDA0002541415150002861
Figure BDA0002541415150002871
在实施例中，本文所述的CAR分子包含特异性地结合CD123的scFv，并且不含有前导序列，例如氨基酸序列SEQ ID NO:64。下表14提供了不含有前导序列SEQ ID NO:64的CD123scFv序列的氨基酸序列和核苷酸序列。
表14.CD123 CAR scFv序列
Figure BDA0002541415150002872
Figure BDA0002541415150002881
在其他实施例中，所述表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/028896的表2、表6和表9的CAR分子(例如CAR123-1或CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一个)或抗原结合结构域。在WO 2016/028896中详细说明的编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列通过引用以其整体并入本文。
EGFRvIII CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130657的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。将编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的示例性氨基酸和核苷酸序列提供在WO 2014/130657中。示例性抗EGFRvIII CAR序列可以包含在表33中披露的序列的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列(或与其至少约85％、90％、95％、99％或更高地相同的序列，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入、缺失或修饰的序列)。
表33.EGFRvIII CAR序列.
Figure BDA0002541415150002891
Figure BDA0002541415150002901
Figure BDA0002541415150002911
CD33CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD33，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014576的表2或表9的CAR分子(例如CAR33-1至CAR-33-9中的任一个)或抗原结合结构域。将编码CD33CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的示例性氨基酸和核苷酸序列提供于WO 2016/014576中。
间皮素CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2015/090230的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的示例性氨基酸和核苷酸序列提供在WO 2015/090230中。示例性抗间皮素CAR序列可以包含在表34中披露的序列的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列(或与其至少约85％、90％、95％、99％或更高地相同的序列，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入、缺失或修饰的序列)。
表34.间皮素CAR序列.与间皮素结合的人scFv和CAR的氨基酸序列(加粗体下划线的是前导序列)。在scFv的情况下，剩余氨基酸是重链可变区和轻链可变区，其中每个HCCDR(HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3)和LC CDR(LC CDR1、LC CDR2、LCCDR3)是加下划线的。在CAR的情况下，另外剩余的氨基酸是CAR的剩余氨基酸。
Figure BDA0002541415150002921
Figure BDA0002541415150002931
Figure BDA0002541415150002941
Figure BDA0002541415150002951
Figure BDA0002541415150002961
Figure BDA0002541415150002971
Figure BDA0002541415150002981
Figure BDA0002541415150002991
Figure BDA0002541415150003001
Figure BDA0002541415150003011
BCMA CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合BCMA，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014565的表1或表16、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:273的CAR分子或抗原结合结构域。在WO2016/014565中详细说明的编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列提供在本文的表15-18中。
表15.根据卡巴特编号方案(Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版.Public HealthService[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)的重链可变结构域CDR
Figure BDA0002541415150003021
Figure BDA0002541415150003031
Figure BDA0002541415150003041
表16.根据卡巴特编号方案(Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版.Public HealthService[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)的轻链可变结构域CDR
Figure BDA0002541415150003042
Figure BDA0002541415150003051
Figure BDA0002541415150003061
Figure BDA0002541415150003071
表17.示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸和核酸序列。还提供了每个scFv的氨基酸序列可变重链和可变轻链序列。
Figure BDA0002541415150003072
Figure BDA0002541415150003081
Figure BDA0002541415150003091
表31.示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸和核酸序列。还提供了每个scFv的氨基酸序列可变重链和可变轻链序列。
Figure BDA0002541415150003092
Figure BDA0002541415150003101
Figure BDA0002541415150003111
Figure BDA0002541415150003121
Figure BDA0002541415150003131
Figure BDA0002541415150003141
Figure BDA0002541415150003151
Figure BDA0002541415150003161
表18.示例性BCMA结合结构域的氨基酸序列
Figure BDA0002541415150003162
Figure BDA0002541415150003171
可以用于抗BCMA CAR构建体的另外的示例性的靶向BCMA的序列披露于WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、US 2015/0232557中，通过引用以它们的全文并入本文中。
在实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。示例性BCMA CAR构建体和它们对应的DNA序列显示在表17中。
CD22 CAR
在其他实施例中，所述表达CAR的细胞可以特异性结合CD22，例如，可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/164731的CAR分子或抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
在实施例中，所述CAR分子包含特异性结合CD22的抗原结合结构域(CD22 CAR)。在一个实施例中，所述抗原结合结构域靶向人CD22。在一个实施例中，所述抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。
人CD22 CAR的序列在如下提供。在一些实施例中，人CD22 CAR是CAR22-65。
人CD22 CAR scFv序列(VH-(G4S)3-VL)
Figure BDA0002541415150003181
人CD22 CAR重链可变区
Figure BDA0002541415150003182
人CD22 CAR轻链可变区
Figure BDA0002541415150003183
表19.CD22 CAR的重链可变区CDR(CAR22-65)
Figure BDA0002541415150003184
表20.CD22 CAR的轻链可变区CDR(CAR22-65)。所述表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。
Figure BDA0002541415150003185
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表19中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表20中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表20中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表19中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据卡巴特编号方案、乔西亚编号方案、或其组合定义CDR。
另外的抗CD20scFv序列提供在以下；
人CD22 CAR scFv序列(VH-(G4S)-VL)
Figure BDA0002541415150003191
人CD22 CAR scFv序列(VL-(G4S)3-VH)
Figure BDA0002541415150003192
人CD22 CAR scFv序列(VL-(G4S)-VH)
Figure BDA0002541415150003193
VL和VH结构域在scFv中出现的顺序可以是变化的(即，VL-VH或VH-VL取向)，并且其中“G4S”(SEQ ID NO:168)亚基(其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:168)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:142)或(G4S)4(SEQ ID NO:141))的一个、两个、三个或四个拷贝中的任一种可连接可变结构域以创建整个scFv结构域。替代性地，CAR构建体可以包含例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:821)的接头。替代性地，所述CAR构建体可以包括例如包含序列LAEAAAK(SEQ ID NO:822)的接头。在一个实施例中，所述CAR构建体不包括在VL和VH结构域之间的接头。
这些克隆均含有源自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
在一些实施例中，本文所述的CAR分子是双特异性CAR分子。在一个实施例中，所述双特异性CAR分子包含针对CD19的第一结合特异性，例如，针对CD19的VL1-VH1结合特异性，和针对CD22的第二结合特异性，例如，针对CD22的VL2-VH2或VH2-VL1结合特异性。在一个实施例中，第一结合特异性和第二结合特异性在连续的多肽链，例如单链中。在一些实施例中，所述第一结合特异性和第二结合特异性任选地包含如本文所述的接头。在一些实施例中，所述双特异性CAR分子包含CD19结合结构域，所述结构域包含在表5和表30中披露的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述双特异性CAR分子包含针对CD22的第一结合特异性，例如，针对CD22的VL2-VH2或VH2-VL1结合特异性，和针对CD19的第二结合特异性，例如，针对CD19的VL1-VH1结合特异性。在一个实施例中，第一结合特异性和第二结合特异性在连续的多肽链，例如单链中。在一些实施例中，所述第一结合特异性和第二结合特异性任选地包含如本文所述的接头。
在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝1(SEQ ID NO:168)，例如，所述接头具有氨基酸序列Gly4-Ser(SEQ ID NO:168)。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝3(SEQ IDNO:142)。在一些实施例中，所述接头是(Gly4-Ser)n，其中n＝4(SEQ ID NO:141)。在一些实施例中，接头包含以下氨基酸序列，例如由以下氨基酸序列组成：LAEAAAK(SEQ ID NO:822)。
CD20 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD20 CAR的细胞(例如，表达与人CD20结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，所述表达CD20 CAR的细胞包含根据WO2016/164731和PCT/US 2017/055627(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD20结合序列或CD20 CAR序列披露于例如，PCT/US 2017/055627(通过引用并入本文)的表1-5中。在一些实施例中，所述CD20结合序列或CD20CAR包含在PCT/US 2017/055627或WO 2016/164731(通过引用并入本文)中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。示例性抗CD20 CAR序列可以包含在表32中披露的序列的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列(或与其至少约85％、90％、95％、99％或更高地相同的序列，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入、缺失或修饰的序列)。
表32.CD20 CAR序列。
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CLL-1CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CLL-1，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014535的表2的CAR分子或抗原结合结构域。将编码CLL-1CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的示例性氨基酸和核苷酸序列提供于WO 2016/014535中。
GFRα-4
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合GFR ALPHA-4，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/025880的表2的CAR分子或抗原结合结构域。将编码GFRα-4CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的示例性氨基酸和核苷酸序列提供于WO 2016/025880中。
在一个实施例中，本文所述的任何CAR分子(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个或三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个或三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个方面，所述抗肿瘤抗原结合结构域是一个片段，例如，单链可变片段(scFv)。在一个方面，如本文所述的抗a癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合如本文描述的癌症相关抗原蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生scFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448；美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公开号WO 2006/020258和WO2007/024715，所述文献通过引用并入本文中。
在另一个方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见，例如，Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369-1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]11:487-496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其整体并入本文)。例如，scTCR可以工程改造为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的癌症相关靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
另外的示例性抗原结合结构域和CAR
在一个实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是抗原结合部分，例如，在例如Mujoo等人.,Cancer Res.[癌症研究]47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人.,Cancer Res[癌症研究]45(6):2642-2649(1985)；Cheung等人.,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]5(9):1430-1440(1987)；Cheung等人.,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]16(9):3053-3060(1998)；Handgretinger等人.,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学与免疫治疗]35(3):199-204(1992)中所述的抗体的CDR。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分：mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1、和8H9，参见例如WO 2012033885、WO 2013040371、WO 2013192294、WO2013061273、WO 2013123061、WO 2013074916、和WO 201385552。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分，美国公开号：20100150910或PCT公开号：WO 2011160119。
在一个实施例中，针对Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽抗原或sTn-O-糖肽抗原的抗原结合结构域是描述于例如US 2014/0178365、US 8,440,798、EP 2083868 A2、Brooks等人,PNAS 107(22):10056-10061(2010)和Stone等人,OncoImmunology[肿瘤免疫学]1(6):863-873(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PSMA的抗原结合结构域是描述于例如Parker等人,ProteinExpr Purif[蛋白质表达和纯化]89(2):136-145(2013)；US 20110268656(J591ScFv)；Frigerio等人,European J Cancer[欧洲癌症杂志]49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO2006125481(mAb 3/A12、3/E7和3/F11)中的抗体以及单链抗体片段(scFv A5和D7)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CD97的抗原结合结构域是描述于例如US 6,846,911、deGroot等人,J Immunol[免疫学杂志]183(6):4127-4134(2009)中的抗体或来自R&D:MAB3734的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对TAG72的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：描述于例如Hombach等人,Gastroenterology[肠胃病学]113(4):1163-1170(1997)中的抗体；和Abcam ab691。
在一个实施例中，针对CD44v6的抗原结合结构域是描述于例如Casucci等人,Blood[血液]122(20):3461-3472(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CEA的抗原结合结构域是描述于例如Chmielewski等人,Gastoenterology[肠胃病学]143(4):1095-1107(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：MT110；EpCAM-CD3双特异性Ab(参见，例如，clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗(Edrecolomab)；3622W94；ING-1；和阿迪妥木单抗(adecatumumab)(MT201)。
在一个实施例中，针对KIT的抗原结合结构域是描述于例如US 7915391、US20120288506中的抗体和若干种商业目录抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是描述于例如WO 2008/146911、WO 2004087758中的抗体、若干种商业目录抗体和WO 2004087758中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CD171的抗原结合结构域是描述于例如Hong等人,JImmunother[免疫疗法杂志]37(2):93-104(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PSCA的抗原结合结构域是在以下中描述的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：例如Morgenroth等人,Prostate[前列腺]67(10):1121-1131(2007)(scFv7F5)；Nejatollahi等人,J of Oncology[肿瘤学杂志]2013(2013),文章ID 839831(scFvC5-II)；和美国专利公开号20090311181。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：PMID:2450952；US7635753。
在一个实施例中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 20120009181；US4851332；LK26：US5952484。
在一个实施例中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗、或帕妥珠单抗的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗、或马妥珠单抗的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对NCAM的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：抗体克隆2-2B：MAB5324(EMD密理博公司(EMD Millipore))
在一个实施例中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&D系统公司(R&D Systems)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对Fos相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(罗福斯生物制剂公司)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(Cell Signaling公司)或其他市售抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcam ab32570的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对ALK的抗原结合结构域是描述于例如Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]16(5):1561-1571(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对多唾液酸的抗原结合结构域是描述于例如Nagae等人,JBiol Chem[生物化学杂志]288(47):33784-33796(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对PLAC1的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：例如Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem[生物化学生物技术应用]2013doi:10.1002/bab.1177。
在一个实施例中，针对GloboH的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分：抗体VK9；或描述于例如Kudryashov V等人,Glycoconj J.[糖缀合物杂志]15(3):243-9(1998)，Lou等人.,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]111(7):2482-2487(2014)，MBr1:Bremer E-G等人.J Biol Chem[生物化学杂志]259:14773-14777(1984)中的抗体。
在一个实施例中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是描述于例如Jager等人,ApplImmunohistochem Mol Morphol[应用免疫组织化学分子形态学]15(1):77-83(2007)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对精子蛋白17的抗原结合结构域是描述于例如Song等人,Target Oncol[靶标肿瘤学]2013年8月14日(PMID:23943313)；Song等人,Med Oncol[医学肿瘤学]29(4):2923-2931(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对TRP-2的抗原结合结构域是描述于例如Wang等人,J ExpMed.[实验医学杂志]184(6):2207-16(1996)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是描述于例如Maecker等人,Blood[血液]102(9):3287-3294(2003)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是抗体MAB5328(EMD密理博公司)的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：抗体目录号：LS-B95-100(莱仕邦生物科技公司)
在一个实施例中，针对肠道羧基酯酶的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：抗体4F12：目录号：LS-B6190-50(莱仕邦生物科技公司))。
在一个实施例中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：抗体(莱仕邦生物科技：单克隆:目录号：LS-C133261-100(莱仕邦生物科技公司))。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：PMID:2450952；US7635753。
在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含来自以上列出的抗体的一个、两个或三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)和/或来自以上列出的抗体的一个、两个或三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，CAR的抗原结合结构域靶向肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是在骨髓肿瘤上表达的抗原(表面抗原或由MHC呈递)，并且包含这种CAR的细胞识别骨髓肿瘤抗原。
在一个实施例中，所述骨髓肿瘤抗原是在骨髓肿瘤细胞表面上优先或特异性表达的抗原。
在一个实施例中，可以选择CAR的抗原结合结构域，使得骨髓肿瘤群体被靶向。可替代地，当需要靶向多于一种类型的髓系肿瘤时，可以选择靶向由多于一种例如所有待靶向的髓系肿瘤表达的髓系肿瘤抗原的抗原结合结构域。
CAR可以靶向以下另外的肿瘤抗原：CD123、CD34、Flt3、CD33和CLL-1。在实施例中，所述肿瘤抗原选自CD123、CD33和CLL-1。在一些实施例中，所述肿瘤抗原是CD123。在一些实施例中，所述肿瘤抗原是CD33。在一些实施例中，所述肿瘤抗原是CD34。在一些实施例中，所述肿瘤抗原是Flt3。在实施例中，所述肿瘤抗原是CLL-1。在实施例中，所述抗原结合结构域靶向人抗原。
在一个方面，CAR的抗原结合结构域与CD123(例如，人CD123)结合。任何已知的CD123结合结构域均可用于本发明。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是描述于例如，PCT公开WO 2014/130635(通过引用并入本文)中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分(例如，CDR或VH和VL)。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是描述于例如，PCT公开WO/2016/028896(通过引用并入本文)中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分(例如，CDR或VH和VL)。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是描述于例如，PCT公开WO 1997/024373，WO 2008/127735(例如，26292、32701、37716或32703的CD123结合结构域)；WO 2014/138805(例如，CSL362的CD123结合结构域)；WO 2014/138819、WO2013/173820、WO 2014/144622、WO 2001/66139、WO 2010/126066(例如，Old4、Old5、Old17、Old19、New102或Old6中任一个的CD123结合结构域)；WO 2014/144622；WO 2016/028896或US 2009/0252742(通过引用并入本文)中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分(例如，CDR)。在实施例中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CD123结合结构域。在实施例中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段(例如scFv结构域)。在实施例中，抗原结合结构域是结合人CD123的人抗体或抗体片段。在实施例中，抗原结合结构域是scFv结构域，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH可以通过本文所述的接头(例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:142))附接，并且可以处于任何方向，例如VL-接头-VH或VH-接头-VL。
在一些实施例中，所述CAR的抗原结合结构域靶向B-细胞抗原。在实施例中，B细胞抗原是优先或特异性地表达在B细胞表面上的抗原。抗原可以在以下类型B细胞的任一种的表面上表达：祖细胞B细胞(例如前B细胞或祖B细胞)、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞(例如初试B细胞)、成熟B细胞、浆B细胞、浆母细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞或调节性B细胞(Breg)。
本披露提供了可以靶向以下抗原的CAR：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和阿贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑色素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；天冬酰胺内肽酶(legumain)；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)；TNF受体家族成员；Fms样酪氨酸激酶3(FL T3)；CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD37、CD38、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、ROR1、BCMA、CD86、和CD179b。可以被本文所述的CAR靶向的其他B细胞抗原包括：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD17、CD18、CD26、CD27、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD35、CD38、CD39、CD40、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49d、CD50、CD52、CD54、CD55、CD58、CD60a、CD62L、CD63、CD63、CD68CD69、CD70、CD85E、CD85I、CD85J、CD92、CD95、CD97、CD98、CD99、CD100、CD102、CD108、CD119、CD120a、CD120b、CD121b、CD122、CD124、CD125、CD126、CD130、CD132、CD137、CD138、CD139、CD147、CD148、CD150、CD152、CD162、CD164、CD166、CD167a、CD170、CD175、CD175s、CD180、CD184、CD185、CD192、CD196、CD197、CD200、CD205、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD224、CD225、CD226、CD227、CD229、CD230、CD232、CD252、CD253、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD274、CD275、CD277、CD279、CD283、CD289、CD290、CD295、CD298、CD300a、CD300c、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD314、CD315、CD316、CD317、CD319、CD321、CD327、CD328、CD329、CD338、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、和CD363。
在另一个实施例中，被CAR靶向的抗原选自CD19、BCMA、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1和CD138。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是CD19。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是CD20。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是CD22。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是BCMA。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是FcRn5。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是FcRn2。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是CS-1。在一个实施例中，被CAR靶向的抗原是CD138。
在一个实施例中，可以将CAR(例如，由本发明的细胞(例如，还表达CAR的细胞)表达的CAR)的抗原结合结构域选择为使得靶向优选的B细胞群体。例如，在需要靶向B调节性细胞的实施例中，选择靶向抗原的抗原结合结构域，所述抗原在调节性B细胞上而不是在其他B细胞群(例如浆B细胞和记忆B细胞)上表达。在调节性B细胞上表达的细胞表面标志物包括：CD19、CD24、CD25、CD38或CD86，或在He等人.,2014,J Immunology Research[免疫学研究杂志],文章ID215471中所述的标志物。当希望靶向多于一种类型的B细胞时，可以选择靶向由所有待靶向的B细胞表达的抗原的抗原结合结构域。
CAR跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以设计为包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜衍生的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如该细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白衍生的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如该细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域包含与所用的CAR的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在一个不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同CART中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如，KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C的一个或多个跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一个实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一个实施例中，所述铰链或间隔子包含SEQ IDNO:147的氨基酸序列(例如由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:155的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一个方面，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一个实施例中，所述铰链或间隔子包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:149)的铰链。在一些实施例中，所述铰链或间隔子包含由GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG的核苷酸序列(SEQ ID NO:150)编码的铰链。
在一个方面，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一个实施例中，所述铰链或间隔子包含氨基酸序列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ IDNO:151)的铰链。在一些实施例中，所述铰链或间隔子包含由AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:152)的核苷酸序列编码的铰链。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一个方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:153)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:154)的核苷酸序列编码。
在一个方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。
用于在本文所述CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞激活是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一个实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ(例如本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
共刺激信号传导结构域
CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本发明的CAR的背景中使用的任何其他所希望的细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。在一个实施例中，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除了抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，包含淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C以及PAG/Cbp。
所述CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一个实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:158的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:163的信号传导结构域。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，所述CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:161)的氨基酸序列。在一个方面，所述CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ IDNO:162)的核酸序列编码。
在一个方面，本文描述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包括不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标或不同的靶标(例如，除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标，例如，CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3，或叶酸受体β))的第二CAR。在一个实施例中，第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但包含将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，所述第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在另一个方面，本披露的特征是表达CAR的细胞(例如，CART细胞)的群体。在一些实施例中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施例中，CART细胞群体可包括表达CAR(所述CAR具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达具有不同抗原结合结构域(例如本文所述的不同癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如不同于由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域所结合的癌症相关抗原的本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域))的CAR的第二细胞。作为另一个实例，表达CAR的细胞群体可包括表达CAR(所述CAR包括本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达CAR(所述CAR包括除如本文所述的癌症相关抗原以外的靶标的抗原结合结构域)的第二细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞群体包括，例如表达包含初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包含次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。
在另一个方面，本披露的特征是一个细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR；和表达另一种药剂(例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂)的第二细胞。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD-1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3，和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)。在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一个实施例中，所述药剂包含例如，抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽包含本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27、OX40或CD28，例如，如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
目的调节性多肽
在一些实施例中，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域连接的目的异源多肽是调节性蛋白。本文提供了可用于遗传控制回路的调节性多肽和调节性多肽编码序列，细胞，以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如重组多肽或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法。通常，调节性多肽调节产物(例如，重组多肽或治疗性多肽)的表达。在一些实施例中，所述调节性多肽是基因编辑的多肽。在一些实施例中，所述调节性多肽编码序列在控制元件的转录控制下，所述控制元件依赖于一种或多种条件活化所述调节性多肽编码序列的转录。在一些实施例中，调节性多肽与所述控制元件(例如，启动子元件)结合，所述控制元件可操作地连接至重组多肽或治疗性多肽编码序列。在一些实施例中，所述调节性多肽与控制元件的结合抑制可操作地连接的重组多肽或治疗性多肽编码序列的转录。在一些实施例中，调节性多肽与编码重组多肽或治疗性多肽的转录物的非翻译区的序列结合。在一些实施例中，所述调节性多肽与重组多肽或治疗性多肽的转录物的非翻译区的结合抑制所述重组多肽或治疗性多肽编码序列的翻译。在一些实施例中，调节性多肽与所述重组多肽或治疗性多肽编码序列的编码序列结合。在一些实施例中，所述调节性多肽与所述重组多肽或治疗性多肽的编码序列的结合抑制所述重组多肽或治疗性多肽编码序列的转录、翻译或转录和翻译。
预期本披露对具体的调节性多肽不是特异性的。示例性调节性多肽包括但不限于：Cas9分子、TALE分子和锌指分子。在一些实施例中，所述调节性多肽是本领域已知的Cas相关蛋白。在一些实施例中，所述调节性多肽是来自I类、II类或III类CRISPR/Cas系统(例如，如描述在K.S.Makarova等人.,Nat.Rev.Microbiol.[自然微生物学综述]9,467(2011)；K.S.Makarova,N.V.Grishin,S.A.Shabalina,Y.I.Wolf,E.V.Koonin,Biol.Direct[生物学直通报告]1,7(2006)；or K.S.Makarova,L.Aravind,Y.I.Wolf,E.V.Koonin,Biol.Direct[生物学直通报告]6,38(2011)中)的蛋白质。
在一些实施例中，所述调节性多肽是Cas9分子。作为Cas9分子的调节性多肽需要一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)适合的gRNA来抑制重组多肽或治疗性多肽的表达。
在一些实施例中，所述调节性多肽是TALE分子。
在一些实施例中，所述调节性多肽是锌指分子。
在一些实施例中，所述调节性多肽是第一控制元件(例如，第一启动子元件)的内源调节剂。在一个实施例中，所述编码调节性多肽的内源基因是失活的，例如，已经被敲除或突变为产生功能丧失。
Cas9分子和CRISPR/CAS系统的其他组分
在一些实施例中，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域连接的所述目的异源多肽是Cas9分子、Cas12分子、Cas13分子，或CRISPR/CAS系统的另一种组分(例如，核糖核蛋白(RNP)分子)。对于使用CRISPR/CAS系统的基因疗法，一个重要的考虑是限制由Cas分子(例如，Cas9分子)的脱靶活性引起的副作用。将降解决定子(例如，本文所述的COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽，例如，本文所述的HilD标签或CARB标签)与所述CRISPR/CAS系统的组分(例如，Cas9分子或RNP分子)融合有助于产生基因疗法，其中所述CRISPR/CAS系统的活性可以通过本文所述的降解化合物进行调节(例如，在发生副作用的情况下)。
有待在本披露的遗传控制回路、细胞和方法中使用的Cas9分子可包含源自多个物种的多肽。另外，例如在融合蛋白中，可以将来自一个物种中的Cas9分子的一个或多个结构域与来自另一物种中的Cas9分子的一个或多个结构域组合。另外的包含Cas9多肽的物种包括：燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属物种(Actinomyces sp.)、反硝化赛利非氏菌(cycliphilus denitrificans)、寡食氨基酸单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、Blastopirellula marina、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、Candidatus Puniceispirillum、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)、Dinoroseobacter shibae、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、γ变形杆菌(γproteobacterium)、醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、生痰嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(Helicobacter canadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金格杆菌(Kingella kingae)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、李斯特氏菌科细菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌属物种(Methylocystis sp.)、甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟球菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、浅黄色奈瑟球菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟球菌属物种(Neisseria sp.)、瓦茨瓦尔西奈瑟球菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)、食淋洗物细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacteriumsuccinatutens)、Ralstonia syzygii、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属物种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)、葡萄芽孢乳杆(Sporolactobacillus vineae)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、肠道罕见小球菌属物种(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体属物种(Treponema sp.)或Verminephrobacter eiseniae。
Cas12分子(例如，Cas12a、Cas12b和Cas12c)已经在以下文献中披露，例如，Chen等人.,Science.[科学]2018年4月27日；360(6387):436-439和Shmakov等人.,Nat RevMicrobiol.[自然微生物学综述]2017年3月；15(3):169-182，将其通过引用以其全文并入本文。CRISPR-Cas12a(Cpf1)蛋白是与DNA结合并产生靶向的双链DNA断裂的RNA指导的酶。同CRISPR-Cas9一样，Cas12在基因组编辑中也是有用的工具。可用于基因编辑的另外的Cas分子包括但不限于Cas13(例如，Cas13a、Cas13b和Cas13c)，如披露在例如，WO 2017219027和Shmakov等人.,Nat Rev Microbiol.[自然微生物学综述]2017年3月；15(3):169-182中，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，所述目的异源多肽是Cas12。在一些实施例中，所述目的异源多肽是Cas13。
Cas9结构和活性
晶体结构对于天然存在的Cas9多肽(Jinek等人.,Science[科学],343(6176):1247997,2014)，并且对于具有指导RNA(例如，crRNA和tracrRNA的合成融合物)的酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(Nishimasu等人.,Cell[细胞],156:935-949,2014；和Anders等人.,Nature[自然],2014,doi:10.1038/nature13579)是可用的。
在一个实施例中，Cas9分子或Cas9多肽包含以下结构域中的一个或多个：RuvC样结构域和HNH样结构域。在一个实施例中，Cas9分子或Cas9多肽是dCas9分子或dCas9多肽，并且所述dCas9分子或dCas9多肽包含RuvC样结构域(例如，缺少核酸酶活性的RuvC样结构域)，和/或HNH样结构域(例如，缺少核酸酶活性的HNH样结构域)。
在一个实施例中，所述Cas9分子或Cas9多肽可用包括多于一个的RuvC样结构域(例如，一个、两个、三个或更多个RuvC样结构域)。在一个实施例中，RuvC样结构域包含改变其活性的一个或多个突变，使得所述RuvC结构域不切割DNA或具有减少的DNA切割活性。在一个实施例中，RuvC样结构域的长度在至少5、6、7、8个氨基酸，但不超过20、19、18、17、16或15个氨基酸。在一个实施例中，所述Cas9分子或Cas9多肽包含长度为约10至20个氨基酸(例如，约15个氨基酸)的N-末端的RuvC样结构域。
在一个实施例中，所述Cas9分子或Cas9多肽可以包括多于一个的HNH样结构域(例如，一个、两个、三个或更多个HNH样结构域)。在一个实施例中，HNH样结构域包含改变其活性的一个或多个突变，使得所述HNH样结构域不切割DNA或具有减少的DNA切割活性。在一个实施例中，HNH样结构域的长度为至少15、20、25个氨基酸，但不超过40、35或30个氨基酸(例如，长度为20至35个氨基酸，如25至30个氨基酸)。
在实施例中，Cas9分子或Cas9多肽具有与gRNA分子相互作用并且与gRNA分子定位至核心靶结构域的能力，但不能切割靶核酸，或者不能以有效速率切割。不具有或基本上不具有切割活性的Cas9分子在本文中被称为dCas9分子或dCas9多肽。例如，如通过本领域已知的测定或本文所述的测定所测量的，dCas9分子或dCas9多肽可以缺少切割活性或具有基本上小于参考Cas9分子或Cas9多肽的切割活性的例如，小于20％、10％、5％、1％或0.1％。
靶向和PAM
Cas9分子或Cas9多肽是可以与指导RNA(gRNA)分子相互作用并且与gRNA分子协同作用定位于包含靶结构域和PAM序列的位点的多肽。
在一个实施例中，Cas9分子或Cas9多肽与靶核酸相互作用的能力是PAM序列依赖性的。PAM序列是靶核酸中的序列。来自不同细菌物种的Cas9分子可以识别不同的序列基序(例如，PAM序列)。Cas9分子可以被工程改造以改变Cas9分子的PAM特异性。示例性天然存在的Cas9分子描述于Chylinski等人.,RNA Biology[RNA生物学]2013 10:5,727-737中。
Cas9结构的改变
在一些实施例中，一个或多个突变可以存在于Cas9分子或Cas9多肽的例如，一个或多个RuvC样结构域(例如，N-末端的RuvC样结构域)；HNH样结构域；RuvC样结构域和HNH样结构域外的区域中。在一些实施例中，一个或多个突变存在于RuvC样结构域(例如，N-末端的RuvC样结构域)中。在一些实施例中，一个或多个突变存在于HNH样结构域中。在一些实施例中,突变存在于RuvC样结构域(例如，N-末端的RuvC样结构域)和HNH样结构域二者中。
在一个实施例中，Cas9分子或Cas9多肽(例如，dCas9分子或dCas9多肽)包含如下氨基酸序列：
与以下序列具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列；
当与如下序列比较时，差异不超过2％、5％、10％、15％、20％、30％或40％的氨基酸残基的氨基酸序列；
与以下序列差异至少1、2、5、10或20个氨基酸，但不超过100、80、70、60、50、40或30个氨基酸的氨基酸序列；或
与以下序列相同的氨基酸序列：所述序列是本文所述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列(例如，来自本文所列物种的或描述于Chylinski等人.,RNA Biology[RNA生物学]2013 10:5,727-737；Hou等人.,PNAS Early Edition[美国国家科学院院刊早期版本]2013,1-6中的Cas9分子)；。在一个实施例中，Cas9分子或Cas9多肽包含以下活性中的一个或多个：解旋酶活性；或与gRNA分子一起定位至靶核酸的能力。在一个实施例中，所述Cas9分子或Cas9多肽不包含切口酶活性或双链切割活性(例如，内切核酸酶和/或外切核酸酶活性)。
关于酿脓链球菌序列，可以在RuvC结构域或HNH结构域中制备的示例性突变包括：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A。
示例性Cas9多肽和Cas9结构域序列可以在WO 2015/157070的表50-54中找到。
dCas9多肽
在一个实施例中，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域连接的目的异源多肽是dCas9分子(例如，如与参考Cas9分子相比，在RuvC结构域和/或在HNH结构域中包含一个或多个差异的dCas9多肽)，并且所述dCas9分子或dCas9多肽不切割核酸，或以比野生型显著减少的效率切割(例如，如本文所述的测定所测量，在切割测定中当与野生型相比时，例如，如本文所述，以低于参考Cas9分子的50％、25％、10％或1％的效率切割)。
使Cas9蛋白的两个DNA切割结构域中的关键残基发生突变(例如，D10A和H840A突变)会导致催化失活的Cas9(dCas9，也称为死Cas9)分子的产生。酶失活的Cas9(例如，dCas9)与gRNA复合，并定位到gRNA的靶向结构域指定的DNA序列；然而，它不切割靶DNA。当被募集到编码序列的早期区域时，酶失活的Cas9分子(例如，dCas9)可以阻断转录。通过将转录阻遏结构域(例如，KRAB、SID或ERD)与酶失活的Cas9(例如，dCas9)融合，并将其募集到靶序列(例如，起始密码子的序列3’的1000bp内或控制元件(例如，启动子元件，如基因起始密码子的5’)的500bp内)可以实现另外的阻遏。靶向启动子的DNA酶I超敏位点(DHS)(例如，通过使gRNA与DHS互补)可能是基因阻遏的另一种策略，例如，抑制重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列，因为这些区域更可能获得酶失活的Cas9(例如，dCas9)，并且还可能具有内源转录因子的位点。尽管不希望受理论的束缚，但本文中预期阻断内源转录因子或RNA聚合酶的结合位点将有助于下调基因表达，例如，重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列的表达。在一个实施例中，可以使用一个或多个酶失活的Cas9(例如，dCas9)分子来阻断一个或多个内源转录因子的结合。在另一个实施例中，可以将酶失活的Cas9(例如，dCas9)分子与效应结构域(例如，阻遏结构域、活化结构域、甲基化酶等)融合。酶失活的Cas9(例如，dCas9)与效应结构域的融合使得效应子募集与由gRNA指定的任何DNA位点。改变染色质状态可以导致靶基因表达的减少。可以使用与一个或多个修饰染色质的蛋白质融合的一个或多个酶失活的Cas9(例如，dCas9)分子来改变染色质状态。
在一个实施例中，可以使gRNA分子靶向控制元件(例如，启动子元件)，例如，所述控制元件可操作地连接至重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列。在一个实施例中，可以使gRNA分子靶向编码重组多肽或治疗性多肽的序列。
TALE分子
在一些实施例中，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域连接的目的异源多肽是转录活化剂样效应(TALE)分子或TALE多肽。如本文所用的术语，分子或TALE多肽是指包含多个TALE DNA结合重复结构域(TALE DBD)的分子或多肽，所述结合重复结构域可以归巢或定位于由TALE DBD指定的核酸位置。如本文所用的术语，TALE分子和TALE多肽是指天然存在的TALE分子以及与参考序列(例如，本领域已知的最相似的天然存在的TALE分子)差异例如至少一个氨基酸残基的经工程改造的、改变的或修饰的TALE分子或TALE多肽。
如本文所用的术语，TALE DBD是指33-35个氨基酸的基序，包括在基序的位置12和13处的两个高变残基(即，重复可变双残基，RVD)。TALE DNA结合结构域(DBD)的RVD指定对TALE DBD具有结合亲和力的一个或多个DNA碱基对。当TALE DBD在TALE分子或TALE多肽内以阵列组合时，TALE DBD(和它们的RVD)的顺序决定了对TALE分子或TALE多肽具有结合亲和力的DNA序列。天然存在的TALE多肽和TALE DBD由黄单胞菌属细菌产生。
如本文所用的术语，重复可变双残基(RVD)是指在TALE DBD的位置12和13处的两个高变氨基酸残基。所述RVD确定TALE DBD的DNA碱基对亲和力。RVD的所有可能的组合及其各自的碱基对亲和力是本领域已知的。参见，例如，Cong L.,等人.Nat Commun.[自然通讯]2012年7月24日；(3):968；Juillerat A.,等人.Sci Rep.[科学报告]2015年1月30；5():8150；Miller J.C.等人.Nat Methods[自然方法]12,465-471(2015)；Streubel J.,等人.Nat Biotechnol[自然生物技术]30,593-595(2012)；和Yang J.等人.Cell Res[细胞研究]24,628-631(2014),通过引用以其全文并入本文。考虑将所有可能的RVD与阻遏多肽(例如，本文所述的TALE分子)一起使用。
如本文所用的术语，TALE DBD阵列是指在TALE分子或TALE多肽内的TALE DBD(例如，每个TALE DBD的RVD)的特性和顺序。所述TALE DBD阵列确定了TALE分子或TALE多肽的序列特异性结合亲和力。
在一些实施例中，所述阻遏多肽是TALE分子或TALE多肽。可以将来自黄单胞菌属的任何物种的TALE DBD和TALE多肽用于遗传控制回路、细胞以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量产物(例如，本文所述的重组多肽或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法。在一些实施例中，所述阻遏多肽是天然存在的TALE分子或TALE多肽。在一些实施例中，所述阻遏多肽是工程改造的TALE分子或TALE多肽，即，与天然存在的TALE分子或TALE多肽差异一个或多个氨基酸或来自本领域已知的另一种工程改造的TALE分子或TALE多肽的TALE分子或TALE多肽。
在一些实施例中，经工程改造的TALE分子或TALE多肽包含如下氨基酸序列：
与以下序列具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列；
当与如下序列比较时，差异不超过2％、5％、10％、15％、20％、30％或40％的氨基酸残基的氨基酸序列；
与以下序列差异至少1、2、5、10或20个氨基酸，但不超过100、80、70、60、50、40或30个氨基酸的氨基酸序列；或
与以下序列相同的氨基酸序列，所述序列是本文所述的任何TALE分子序列或天然存在的TALE分子序列(例如，来自本文所列物种的或描述在本文引用的出版物中的TALE分子)。
在一些实施例中，TALE分子定位于由TALE分子的TALE DBD阵列指定的靶DNA序列。在一些实施例中，当募集到编码序列(例如，重组多肽或治疗性多肽的编码序列)中的早期区域时，TALE分子可以阻断转录。在一些实施例中，当募集到可操作地连接至重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列的控制元件(例如，启动子元件)时，TALE分子可以阻断转录。在一些实施例中，通过使转录型阻遏结构域(例如，KRAB、SID或ERD)与TALE分子融合，使得效应子募集到由TALE DBD阵列指定的任何DNA位点，可以实现另外的阻遏。
在一些实施例中，TALE分子包含两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个)TALE DBD。
在一些实施例中，阻遏多肽(例如，TALE分子)的TALE DBD阵列指定靶DNA序列。在一些实施例中，由TALE DBD阵列指定的靶序列包含在可操作地连接至重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列的控制元件(例如，启动子元件)中。在一些实施例中，由TALE DBD阵列指定的靶序列包含有重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列。
示例性天然存在的和工程改造的TALE多肽序列，和用于设计和测试用于与遗传控制回路、细胞一起使用的TALE多肽的方法，以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量产物(例如，本文所述的重组多肽或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法可以在本领域中找到(例如，在Zhang F,等人.Nat Biotechnol.[自然生物技术]2011；29:149-153；Geissler R,等人.PLoS One.[公共科学图书馆综合]2011；6：e19509；Garg A,等人.Nucleic AcidsRes.[核酸研究]2012；Bultmann S,等人.Nucleic Acids Res.[核酸研究]2012；40:5368-5377；Cermak T,等人.Efficient design and assembly of custom TALEN and otherTAL effector-based constructs for DNA targeting.[用于进行DNA靶向的定制TALEN和其他基于TAL效应子的构建体的高效设计和组装]Nucleic Acids Res.[核酸研究]2011；39：e82；Cong L,等人.Nat Commun.[自然通讯]2012；3:968；和Miller JC,等人.NatBiotechnol.[自然生物技术]2011；29:143-148中，将其通过引用以其全文并入本文。
锌指分子
在一些实施例中，与COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和/或降解结构域连接的目的异源多肽是锌指分子。如本文所用的术语，锌指分子是指包含多个锌指结构域(ZFD)的分子或多肽。锌指分子对特定DNA序列具有亲和力，所述特定DNA序列由锌指分子包含的ZFD的特性和顺序决定。
如本文所用的术语，锌指结构域(ZFD)是指以序列特异性方式结合DNA并且需要锌离子配体以结合DNA的多肽家族中的任何一个。已经对ZFD的许多家族进行了研究和表征(参见，例如，Krishna,SS.,等人.Nucl.Acids Res.[核酸研究](2003)31(2):532-550)。本披露考虑了锌指分子，其可以包含本领域技术人员已知的任何类型或来源的ZFD。不旨在限于任何特定类型的ZFD，本披露预期了包含Cys2His2ZFD的锌指分子，其是本领域中最流行和研究最充分的ZFD。Cys2His2ZFD包含形成反平行β片的两条β链和α螺旋。已知α螺旋的位置-1、1、2、3、5和6通过与DNA碱基对相互作用来指定DNA序列特异性结合。在一个实施例中，Cys2His2ZFD可以对3个碱基对的靶序列具有特异性结合亲和力。在一个实施例中，Cys2His2ZFD可以按上下文特异性的方式(即取决于锌指分子内相邻ZFD的存在和特性)与邻近于靶序列的另外的碱基对特异性相互作用。
如本文中所用的术语，锌指结构域阵列或ZFD阵列是指在锌指分子或锌指多肽内ZFD的特性和顺序。所述ZFD阵列确定了锌指分子或锌指多肽的序列特异性结合亲和力。
在一些实施例中，所述阻遏多肽是锌指分子或锌指多肽。可以将来自任何物种(例如，哺乳动物物种，如人)的ZFD和锌指多肽用于遗传控制回路、细胞以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量产物(例如，本文所述的重组多肽或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法。在一些实施例中，所述阻遏多肽是天然存在的锌指分子或锌指多肽。在一些实施例中，所述阻遏多肽是工程改造的锌指分子或锌指多肽(即，与天然存在的锌指分子或锌指多肽差异一个或多个氨基酸或来自本领域已知的另一种工程改造的锌指分子或锌指多肽的锌指分子或锌指多肽)。
在一些实施例中，工程改造的锌指分子或锌指多肽包含如下氨基酸序列：
与以下序列具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列；
当与如下序列比较时，差异不超过2％、5％、10％、15％、20％、30％或40％的氨基酸残基的氨基酸序列；
与以下序列差异至少1、2、5、10或20个氨基酸，但不超过100、80、70、60、50、40或30个氨基酸的氨基酸序列；或
与以下序列相同的氨基酸序列，所述序列是本文所述的任何锌指分子序列或天然存在的锌指分子序列(例如，来自本文所列物种的或描述在本文引用的出版物中的锌指分子)。
在一些实施例中，锌指分子定位于由锌指分子的ZFD阵列指定的靶DNA序列。在一些实施例中，当募集到编码序列(例如，重组多肽或治疗性多肽的编码序列)中的早期区域时，锌指分子可以阻断转录。在一些实施例中，当募集到可操作地连接至重组多肽或治疗性多肽编码序列的控制元件(例如，启动子元件)时，锌指分子可以阻断转录。在一些实施例中，通过使转录型阻遏结构域(例如，KRAB、SID或ERD)与锌指分子融合，使得效应子募集到由ZFD阵列指定的任何DNA位点，可以实现另外的阻遏。
在一些实施例中，锌指分子包含两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个)ZFD。在一些实施例中，可以从具有已知靶序列亲和力的ZFD构建ZFD阵列，以产生具有所希望的特定靶序列的锌指分子或锌指多肽。
在一些实施例中，阻遏多肽(例如，锌指分子)的ZFD阵列指定靶DNA序列。在一些实施例中，由ZFD阵列指定的靶序列包含在可操作地连接至重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列的控制元件(例如，启动子元件)中。在一些实施例中，由ZFD阵列指定的靶序列包含有重组多肽编码序列或治疗性多肽编码序列。
示例性天然存在的和工程改造的锌指多肽序列，和用于设计和测试用于与遗传控制回路、细胞一起使用的锌指多肽的方法，以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量产物(例如，本文所述的重组多肽或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法可以在本领域中找到(例如，在Wolfe SA,等人.Annu Rev Biophys Biomol Struct.[生物物理与生物分子结构的年评]2000；29:183-212；Pabo CO,等人.Annu Rev Biochem.[生物化学年评]2001；70:313-340；Greisman HA,Pabo CO.Science[科学].1997；275:657-661；Isalan M,等人.,Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]1997；94:5617-5621；Wolfe SA,等人.J Mol Biol.[分子生物学杂志]1999；285:1917-1934中，将其通过引用以其全文并入本文。
设计ZFD和ZFD阵列以结合特定靶DNA序列的方法可以在本领域中找到，例如，在Maeder ML,等人.Mol Cell.[分子细胞学]2008；31:294-301；Sander JD,等人.,NatMethods.[自然方法]2011；8:67-69；和Meng X,等人.Nat Biotechnol.[自然生物技术]2008；26:695-701中，将其通过引用以其全文并入本文。
降解结构域
在一些实施例中，本发明的融合多肽进一步包含降解结构域。在一些实施例中，所述降解结构域具有第一状态和第二状态，例如，稳定化/去稳定化的状态或折叠/错折叠的状态。所述第一状态按第一比率或水平与所述融合多肽的表达相关、引起或介导所述融合多肽的表达，并且所述第二状态按第二比率或水平与所述融合多肽的表达相关、引起或介导所述融合多肽的表达。在一些实施例中，所述第二状态具有比所述第一状态的比率或水平更高的(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30倍高)的水平或比率。在一些实施例中，所述第二状态与稳定化合物的存在相关、由稳定化合物的存在维持或引起。在一些实施例中，所述稳定化合物的存在可以与第一折叠状态向第二折叠状态的转换(例如在目的细胞中，例如，从错折叠至更适当的折叠状态，例如，易于降解的第一状态转换为相比所述第一状态不易于降解的第二状态；或从具有第一降解水平的第一折叠状态向具有第二、更少降解水平的第二折叠状态)相关、引起或介导所述第一折叠状态向第二折叠状态的转换。
在一个实施例中，将稳定化合物添加至多个细胞(例如，宿主细胞或包含本文所述的融合多肽的细胞)导致亚多个细胞从第一状态向第二状态的转换(例如，如本文所述稳定化/去稳定化的状态，或折叠/错折叠的状态)。在一个实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述多个细胞中少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的的细胞包含所述第二状态，并且多于或等于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的多个细胞包含所述第一状态。在一个实施例中，在所述稳定化合物的存在下，所述多个细胞中多于或等于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞包含所述第二状态，并且所述多个细胞中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞包含所述第一状态。可以使用整个说明书中描述的方法来确定多个细胞中包含某个状态的细胞的百分比。
在一个实施例中，所述降解结构域通过异源蛋白酶切割位点与融合多肽的其余部分分开。
不希望受理论的束缚，在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，所述降解结构域是不稳定的和/或不能折叠成稳定构象。该错折叠/解折叠的降解结构域可通过细胞内降解途径连同融合多肽的其余部分一起降解。在所述稳定化合物的存在下，所述降解结构域呈现适当的构象，并且不易受细胞间降解途径的影响。因此，所述融合多肽的表达水平可以通过稳定化合物的存在或不存在来调节。
在一些实施例中，所述降解结构域的适当折叠暴露了异源蛋白酶切割位点，导致所述异源蛋白酶切割位点的切割以及所述降解结构域从融合多肽的其余部分的去除。
产生在稳定化合物的存在下选择性稳定的降解结构域的方法在本领域中是熟知的，并在下面进一步讨论。迄今为止已经产生了若干种此类结构域-稳定化合物对，并且在本发明中进行表征。这些包括基于FKBP(例如，使用“盾护”稳定化合物)的降解结构域(如描述在“A Rapid,Reversible,and Tunable Method to Regulate Protein Function inLiving Cells Using Synthetic Small Molecules[使用合成小分子调节活细胞中蛋白质功能的快速、可逆和可调的方法]”Banaszynski,L.A.；Chen,L.-C.；Maynard-Smith,L.A.；Ooi,A.G.L.；Wandless,T.J.Cell[细胞],2006,126,995-1004中)；基于DHFR的结构域(例如，使用甲氧苄啶作为稳定化合物)(如描述在A general chemical method to regulateprotein stability in the mammalian central nervous system.[调节哺乳动物中枢神经系统中蛋白质稳定性的一般化学方法].Iwamoto,M.；
Figure BDA0002541415150003751
T.；Lundberg,C.；Kirik,D.；Wandless,T.J.Chemistry&Biology[化学与生物学],2010,17,981-988中)；以及基于雌激素受体α的结构域(例如，其中4OHT被用作稳定化合物)(如描述在Destabilizingdomains derived from the human estrogen receptor[衍生自人雌激素受体的去稳定化结构域]Y Miyazaki,H Imoto,L-c Chen,TJ Wandless J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2012,134,3942-3945中)。这些参考文献中的每一个通过引用以其整体并入。
本披露涵盖衍生自任何天然存在的蛋白质的降解结构域。优选地，本发明的融合多肽将包括降解结构域，对于所述降解结构域，在目的细胞区室中不存在天然表达的配体。例如，如果融合多肽被设计用于在T细胞中表达，则优选选择对于在T细胞中不存在天然存在的配体的降解结构域。因此，当所述降解结构域在目的细胞中表达时，所述降解结构域仅在外源添加的化合物存在下才稳定。值得注意地，该特性可以通过如下方法被工程改造：将所述降解结构域工程改造以使其不再结合天然表达的配体(在这种情况下，所述降解结构域将仅在合成化合物的存在下才是稳定的)或通过在其中天然表达的配体不存在的区室中表达所述降解结构域(例如，所述降解结构域可以衍生自除所述融合多肽将在其中表达的物种以外的物种)。
降解结构域-稳定化化合物对可以衍生自任何天然存在的或合成开发的蛋白质。稳定化合物可以是任何天然存在的合成的化合物。在某些实施例中，所述稳定化合物将是现有处方药或非处方药。可以被工程改造以具有降解结构域特性的蛋白质的实例连同相应的稳定化合物一起列于下表21中。
在一些实施例中，所述降解结构域衍生自在表21中列出的蛋白质。
在一些实施例中，所述降解结构域衍生自雌激素受体(ER)。在一些实施例中，所述降解结构域包含选自SEQ ID NO:46或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列、或SEQ ID NO:48或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:46或48的氨基酸序列。当所述降解结构域衍生自雌激素受体时，所述稳定化合物可以选自巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)。在一些实施例中，所述稳定化合物是巴多昔芬。他莫昔芬和巴多昔芬是FDA批准的药物，并因此在人中使用是安全的。
在一些实施例中，所述降解结构域衍生自FKB蛋白(FKBP)。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:50或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。当所述降解结构域衍生自FKBP时，所述稳定化合物可以是盾护物-1。
在一些实施例中，所述降解结构域衍生自二氢叶酸还原酶(DHFR)。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:51或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述降解结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。当所述降解结构域衍生自DHFR时，所述稳定化合物可以是甲氧苄啶。
在一些实施例中，所述降解结构域不是衍生自FKB蛋白、雌激素受体或DHFR。
表21.用于产生降解结构域的示例性蛋白质
Figure BDA0002541415150003771
Figure BDA0002541415150003781
Figure BDA0002541415150003791
Figure BDA0002541415150003801
Figure BDA0002541415150003811
Figure BDA0002541415150003821
Figure BDA0002541415150003831
Figure BDA0002541415150003841
Figure BDA0002541415150003851
表22.降解结构域的示例性序列
Figure BDA0002541415150003852
Figure BDA0002541415150003861
Figure BDA0002541415150003871
可以通过本领域已知的多种常规方法从已知的蛋白质(例如，表21中列出的那些蛋白质)工程改造降解结构域。通常，此类方法使用首先创建目的文库，所述文库包括衍生自例如天然存在的蛋白质的蛋白质。其次，将基于衍生的蛋白质的表达是否依赖于所希望的稳定化合物的存在来选择表达来自单个文库构建体的蛋白质的细胞或细胞群体。衍生和选择的过程可以按照鉴定合适候选物所需的尽可能多的循环重复进行。
例如，可以基于蛋白质结构域对所选化合物的不同结构和推定的亲和力进行采样，通过合理的蛋白质设计来创建文库。替代性地，可以通过靶蛋白的随机诱变来产生文库。在任一种情况下，例如，可以用由构建体产生的慢病毒文库转导Jurkat细胞。然后，可以使Jurkat细胞经历一轮FACS分选，以消除组成性地表达目的蛋白质的细胞。在下一阶段，将经分选的细胞与所选化合物孵育24小时，然后对阳性细胞进行FACS分选。这些通过单细胞克隆进行扩增。由此，将对各个转导的克隆以化合物依赖性方式诱导目的蛋白表达的能力进行评估。
在一些实施例中，本发明的融合多肽包含降解结构域、COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽。在一些实施例中，在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平与在不存在稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
切割位点
在一些实施例中，本发明的融合多肽包含通过异源切割位点分开的第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含降解结构域，并且所述第二结构域包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽。
所述切割位点可以是自切割位点和/或蛋白酶切割位点。可以将切割位点设计为被任何位点特异性蛋白酶切割，所述蛋白酶在目的细胞中按足以切割开所述降解结构域的水平表达(通过重组表达或内源表达)。在本发明的重要方面，选择蛋白酶切割位点以对应于天然(或借助于细胞工程改造)存在于与目的蛋白表达有关的细胞区室中的蛋白酶。蛋白酶的细胞内运输应与包含所用降解结构域的目的蛋白的细胞内运输重叠或部分重叠。例如，如果目的蛋白位于细胞表面上，则可以将切割它的酶外源添加至细胞。
如果目的蛋白质驻留在核内体/溶酶体系统中，则可以使用针对驻留在那些区室中的酶的蛋白酶切割位点。此类蛋白酶/共有基序包括，例如，
弗林蛋白酶：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)
PCSK1：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)
PCSK5：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)
PCSK6：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:52)
PCSK7：RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:53)
组织蛋白酶B：RRX(SEQ ID NO:54)
颗粒酶B：I-E-P-D-X(SEQ ID NO:55)
因子XA：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)
肠激酶：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)
普基酶(Genenase)：Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)
分选酶：LPXTG/A(SEQ ID NO:59)
切断前(PreScission)蛋白酶：Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)
凝血酶：Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)
TEV蛋白酶：E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:62)
弹性蛋白酶1：[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:63)
在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括弗林蛋白酶切割位点。在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括表23中列出的弗林蛋白酶切割位点中的任何一个。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括弗林蛋白酶切割位点，所述弗林蛋白酶切割位点选自RTKR(SEQ ID NO:123)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:129)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:131)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:133)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:135)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；或CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:137)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括弗林蛋白酶切割位点，所述弗林蛋白酶切割位点选自RTKR(SEQ ID NO:123)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:129)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:131)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:133)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:135)；或CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:137)。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括弗林蛋白酶切割位点，所述弗林蛋白酶切割位点选自GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列、或GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括选自GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ IDNO:125)或GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)的弗林蛋白酶切割位点。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽包括GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)的弗林蛋白酶切割位点。
表23.示例性弗林蛋白酶切割位点
Figure BDA0002541415150003901
信号肽
在某些实施例中，本发明的融合多肽一步包括信号肽。如果希望使蛋白质遵循分泌途径，则信号肽很有用。在一些实施例中，该信号肽将被工程改造以存在于融合多肽的正好N-末端。示例性信号肽如下列出：
CD8：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:64)
GMCSFR：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:65)
IL2：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:66)
IgK链：MAQVKLQESGTELAKPGAAVK(SEQ ID NO:67)
NPC2：MRFLAATFLLLALSTAAQA(SEQ ID NO:68)
LAMB1：MGLLQLLAFSFLALCRARVRA(SEQ ID NO:69)
P3IP1：MLLAWVQAFLVSNMLLAEAYG(SEQ ID NO:70)
DMKN:MKFQGPLACLLLALCLGSGEA(SEQ ID NO:71)
TPA:MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:72)
PCSK9：MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDED(SEQ ID NO:73)
KDEL(SEQ ID NO:74)或KKXX(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:75)，并且如果所述目的蛋白是ER驻留蛋白，则可以将所述目的蛋白的正好C-末端处的衍生物工程改造。这些序列必须与信号肽一起插入。
目的蛋白可以被工程改造以包括用于经由甘露糖-6-磷酸受体进行内在化并靶向核内体/溶酶体系统的糖基化模式。如果这是驻留在所述区室中的蛋白质，则这些应包括在目的蛋白本身中。用于N-糖基化的共有序列是Asn-X-Ser/Thr，其中X是除脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)之外的任何氨基酸(SEQ ID NO:76)。
在希望具有在过氧化物酶体处靶向的目的蛋白的实施例中，所述融合多肽可以被工程改造以包括C-末端过氧化物酶体靶向信号(例如，PTS1:-SKL)。
编码融合多肽的核酸和载体
在另一方面，本发明涉及编码本文所述的任何融合多肽的核酸，或包含这种核酸的载体。在一个实施例中，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施例中，所述载体是慢病毒载体。
本披露还提供了插入本披露的DNA的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复(LTR)、和目的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(例如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713，将其通过引用特此并入本文。
在另一个实施例中，包含编码本发明所希望的融合多肽的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，可以使用转座子(例如，睡美人(sleeping beauty))，使用基因编辑工具(例如，CRISPR(如CAS9))或使用锌指核酸酶来完成编码嵌合分子的核酸的表达。参见，例如，June等人.2009,Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，将其通过引用特此并入本文。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
编码融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的CAR)的核酸构建体
本披露还提供了编码一种或多种本文披露的融合多肽的核酸分子。
在一个实施例中，所述融合多肽包含靶向本文所述的肿瘤抗原和/或B细胞抗原的CAR构建体。在一个方面，核酸分子以信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子以DNA构建体提供。
因此，在一个方面，本发明涉及编码融合多肽的核酸分子，所述融合多肽包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽。在一些实施例中，所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含与本文所述的肿瘤抗原或本文所述的B细胞抗原结合的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的细胞内信号传导结构域)(包含刺激结构域，例如共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域，例如，本文所述的ζ链))。在一个实施例中，跨膜结构域是选自下组的蛋白质的跨膜结构域，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、和NKG2C的一个或多个跨膜区。
在一个实施例中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:155的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，抗原结合结构域通过铰链区(例如本文所述的铰链)与跨膜结构域连接。在一个实施例中，所述铰链区包含SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:149或SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，共刺激结构域是选自下组的蛋白质的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的另外的实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:158、161、176或180的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列，和SEQID NO:163或SEQ ID NO:166的序列，或与其具有95％-99％同一性的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在相同的读框中且作为单一的多肽链表达。
在另一方面，本发明涉及编码融合多肽(例如，如本文所述的融合多肽)的分离的核酸分子，所述融合多肽包含包括CAR构建体的结构域，所述CAR构建体包含SEQ ID NO:64的前导序列、如本文所述的scFv结构域、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:149或SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:153(或与其具有95％-99％同一性的序列)的铰链区、具有SEQ ID NO:155的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有SEQ ID NO:158的序列的4-1BB共刺激结构域、具有SEQ ID NO:161的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域、具有SEQ ID NO:176的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的ICOS共刺激结构域、或具有SEQ ID NO:180的序列的CD28共刺激结构域，以及具有SEQ IDNO:163或SEQ ID NO:166的序列(或与其具有95％-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域中已知的重组方法获得，诸如像通过从表达所述基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括所述基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从含有所述基因的细胞和组织分离。替代性地，目的基因可以合成产生，而不是克隆。
本披露还提供了插入本披露的核酸的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。
简言之，编码本发明融合多肽的重组核酸的表达典型地通过将编码融合多肽的核酸与启动子可操作地连接并将构建体掺入表达载体来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，本披露的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,399,346、5,580,859、5,589,466，这些专利通过援引以其全文并入本文。在另一个实施例中，本发明提供了一种基因治疗载体。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且封装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述启动子在特定的发育阶段被活化。在一些实施例中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，所述启动子是四环素诱导型启动子。在一些实施例中，所述启动子是金属硫蛋白启动子。在一些实施例中，所述启动子是HSV TK启动子。
在哺乳动物T细胞中能够表达融合多肽(例如，如本文所述，包含结构域，所述结构域包括编码CAR的核酸分子)的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，所述复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。所述EF1a启动子已经被广泛用于哺乳动物表达质粒中，并已经显示出可有效地从克隆到慢病毒载体中的核酸分子驱动融合多肽(例如，如本文所述，包含结构域的融合多肽，所述结构域包括CAR)的表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包含提供为SEQ ID NO:1的序列。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，所述分子开关能够当需要所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子
Figure BDA0002541415150003981
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
Figure BDA0002541415150003982
PGK200：
Figure BDA0002541415150003983
PGK300：
Figure BDA0002541415150003984
PGK400：
Figure BDA0002541415150003985
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志)。
为了评估例如，如本文所述的包含结构域(所述结构域包括CAR多肽或其部分)的融合多肽的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者都可以侧接适当的调控序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评估调控序列的功能。通常，报告基因是如下基因，所述基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。适合的报告基因可以包括编码萤光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因、或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施例中，包含编码本文所述的融合多肽(例如，包含本文所述的CAR分子的融合多肽)的核酸序列的载体可以进一步包含编码多肽(例如，增加融合多肽(例如，如本文所述，包含结构域，所述结构域包括CAR分子)的活性的药剂)的第二核酸序列。在一些实施例中，单个核酸分子或包含所述核酸分子的载体编码多个融合多肽(例如，如本文所述的，每个融合多肽包含结构域，所述结构域包括本文所述的CAR)。在一些实施例中，编码第一融合多肽的核酸与编码第二融合多肽(例如，通过本文所述的启动子控制)的核酸处于分开的调节性控制(例如，通过本文所述的启动子控制)。在其他实施例中，所述两个或更多个核酸序列由相同读框中的单个核酸分子编码，并呈单个多肽链。在这方面，所述两个或更多个融合多肽(例如，如本文所述，每个包含结构域，所述结构域包括CAR)可以例如通过一个或多个肽切割位点(例如自身切割位点或细胞内蛋白酶的底物)分开。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：
T2A：(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:828)
P2A：(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:829)
E2A：(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:830)
F2A：(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:831)
在一些实施例中，本披露提供了例如包含编码第一分子的第一核酸序列和编码第二分子的第二核酸序列的核酸分子。在一些实施例中，所述第一分子是第一融合多肽，包含第一COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和第一异源多肽(例如，第一CAR分子)；和/或所述第二分子是第二融合多肽，包含第二COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和第二异源多肽(例如，第二CAR分子)。在一些实施例中，所述第一和第二核酸序列布置在单个核酸分子上。在一些实施例中，所述第一和第二核酸序列布置在分开的核酸分子上。在一些实施例中，所述第一CAR分子与CD19结合(例如，所述第一CAR分子是表5、6、7和30中披露的抗CD19CAR)，并且所述第二CAR分子与CD22结合(例如，所述第二CAR分子是表19和20中披露的抗CD22 CAR)。在一些实施例中，所述第一CAR分子与CD19结合(例如，所述第一CAR分子是表5、6、7和30中披露的抗CD19CAR)，并且所述第二CAR分子与CD20结合(例如，所述第二CAR分子是表32中披露的抗CD20 CAR)。在实施例中，所述核酸分子包含RNA或DNA。在实施例中，所述第一和第二核酸序列以相同的定向定位，例如，所述第一和第二核酸序列以相同的方向进行转录。在实施例中，所述第一和第二核酸序列以不同的定向定位。在实施例中，单个启动子控制所述第一和第二核酸序列的表达。在实施例中，编码蛋白酶切割位点(例如，T2A、P2A、E2A或F2A切割位点)的核酸位于所述第一和第二核酸序列之间。在实施例中，以如下方式放置蛋白酶切割位点，所述方式使得细胞可以表达包含所述第一分子和所述第二分子的融合蛋白，所述蛋白随后通过蛋白水解切割而加工成两个肽。在一些实施例中，所述第一核酸序列在所述第二核酸序列的上游，或所述第二核酸序列在所述第一核酸序列的上游。在实施例中，第一启动子控制所述第一核酸序列的表达，并且第二启动子控制所述第二核酸序列的表达。在实施例中，所述核酸分子是质粒。在实施例中，所述核酸分子包含病毒包装元件。在一些方面，本披露提供了细胞(例如，免疫效应子细胞)，所述细胞包含本文所述的核酸分子，例如，包含以上所述的第一和第二核酸序列的核酸分子。所述细胞可以包含切割T2A、P2A、E2A或F2A切割位点的蛋白酶(例如，内源或外源)。
将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染或电穿孔。
用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring公司获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从阿万蒂极性脂质有限公司(亚拉巴马州伯明翰)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本披露的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。
本披露进一步提供了包含编码例如如本文所述的融合多肽(所述融合多肽包含包括CAR的结构域)的核酸分子的载体。在一个实施例中，载体包含编码CAR的核酸分子，例如如本文所述。在一个实施例中，所述载体包含编码两个CAR的核酸分子。在一个方面，可以将一个或多个CAR载体(例如，包含编码第一CAR的核酸分子的载体、和包含编码第二CAR的核酸分子的载体，或包含编码第一和第二CAR的核酸的载体)直接转导进细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)中表达CAR构建体。
在一个实施例中，其中例如如本文所述的一个或多个(例如，一个或两个)融合多肽(每个包含包括CAR的结构域)的稳定表达是所希望的，将包含编码一个或多个(例如，一个或两个)CAR的核酸分子的载体转导到免疫效应细胞中。可以使用慢病毒载体产生例如，具有例如如本文所述的两个融合多肽(每个包含包括CAR的结构域)的稳定表达的免疫效应细胞。在转导后，展现例如如本文所述的两个融合多肽(每个包含包括CAR的结构域)的稳定表达的细胞表达CAR持续至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、3个月、6个月、9个月或12个月。
在一个实施例中，其中例如如本文所述的一个或多个(例如，一个或两个)融合多肽(包含包括CAR的结构域)的瞬时表达是所希望的，将编码一个或多个(例如，一个或两个)融合多肽的核酸分子转染到免疫效应细胞中。编码例如如本文所述的一个或多个(例如，一个或两个)融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸分子可以是包含编码一个或多个(例如，一个或两个)CAR的核酸分子、或一个或多个(例如，一个或两个)CAR的体外转录的RNA的载体。下文进一步描述了体外转录的RNA CAR和用于转染到免疫效应细胞中的方法。在转染后，展现一个或多个(例如，一个或两个)CAR瞬时表达的细胞表达一个或多个(例如，一个或两个)CAR持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。
RNA转染
本文披露了用于产生编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的体外转录的RNA的方法。本披露还包括编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的RNA构建体，所述RNA构建体可以被直接转染到细胞中。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后加入多聚A，以产生通常长度为50-5000个碱基含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和多聚A尾的构建体(SEQ ID NO:174)。这样产生的RNA可以有效转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。
在一个方面，本披露的例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码本文所述的CAR的mRNA引入T细胞或NK细胞中。
在一个实施例中，可以将编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的体外转录的RNA按瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所希望的模板是例如如本文所述的融合多肽(包含包括本文所述的CAR的结构域)。例如，RNA CAR的模板可以包含含有对本文所述的抗原的抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域，例如CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包括细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施例中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合多肽的读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，所述mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(可读框)，包括5'和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一个实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选地具有5'和3’UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改良RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。
在一个实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，所述RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，所述RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的可读框上游。在一个优选的实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选的实施例中，mRNA具有5'端帽和3'聚腺苷酸尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，所述多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，所述mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超出模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003)。
将聚A/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有聚A/T 3'伸展段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的多聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有多聚T尾(如100T尾)(SEQ ID NO:832)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:833))的反向引物来产生，或在PCR之后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)来产生。聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施例中，聚腺苷酸尾在100个和5000个腺苷之间(SEQ ID NO:834)。
在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一个实施例中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:835)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施例中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。5’帽可以使用本领域已知和本文所述的技术提供(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生化科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯],330:958-966(2005))。
通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，所述序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞通透性和存活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些方面，可以使用非病毒方法将编码本文所述的嵌合分子或融合多肽的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程改造的大范围核酸酶重新工程改造的归巢内切核酸酶))的组合产生表达例如如本文所述的嵌合分子或融合多肽的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
细胞
本文还提供了细胞，例如，免疫效应细胞(例如，细胞群体，如免疫效应细胞群体)，所述细胞包含例如如本文所述的核酸分子、融合多肽分子或载体。在一些实施例中，所提供的细胞包含例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)、编码融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸分子，或包含所述核酸分子的载体。
在某些方面，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术(例如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位中获得。在一个优选的方面，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆部分并且任选地将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在本发明的一个实施例中，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤这些细胞。在替代性实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。
在不存在钙的情况下的初始激活步骤可以导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力-A(PlasmaLyte A)、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一个方面，通过裂解红细胞和耗减单核细胞(例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗)从外周血淋巴细胞分离T细胞。
本文所述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，所述亚群是调节性T细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节性耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体IL-2从所述群体除去调节性T细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段与如本文所述的底物缀合。
在一个实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减药剂从所述群体在去除调节性T细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施例中，细胞与CD25耗减药剂的比率是1e7个细胞至20uL、或1e7个细胞至15uL、或1e7个细胞至10uL、或1e7个细胞至5uL、或1e7个细胞至2.5uL、或1e7个细胞至1.25uL。在一个实施例中，例如对于调节性T细胞(例如CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另外的方面，使用6、7、8、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+T细胞。在其他方面，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x109至1x1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施例中，所得的群体T调节性耗减细胞具有2x109个调节性T细胞(例如，CD25+细胞)或更少(例如，1x109个、5x108个、1x108个、5x107个、1x107个或更少的CD25+细胞)。
在一个实施例中，使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从所述群体除去调节性T细胞(例如CD25+细胞)。在一个实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的负调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于，环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25-耗减、及其组合。
在一些实施例中，所述制造方法包括在制造表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞之前，减少(例如，耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样本(例如单采术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在一个实施例中，在收集用于制造表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞产物的细胞之前，用减少TREG细胞的一种或多种疗法对受试者进行预治疗，从而降低受试者对表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞治疗的复发的风险。在一个实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于，向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在一个实施例中，在收集用于制造表达CAR的细胞产物的细胞之前，用环磷酰胺对受试者进行预治疗，从而降低受试者对表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞治疗的复发的风险。在实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一个实施例中，有待除去的细胞群体既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志的细胞)。在一个实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行除去、或者在所述耗减之后、或以另一种顺序除去。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体中除去细胞，从而提供T调节性耗减的(例如，CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞的群体，所述细胞适于表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR(例如如本文所述CAR)的结构域)。在一个实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，调节性T细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，调节性T细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠(如
Figure BDA0002541415150004141
M-450CD3/CD28T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施例中，所述时间段是约30分钟。在另外的实施例中，所述时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中，所述时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个实施例中，所述时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在所述过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他所希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。
在一个实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。用于筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号：WO 2013/126712中。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、或50亿/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样本(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒(如珠))，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个方面，所使用的细胞的浓度是5x106/ml。在其他方面，所使用的浓度可以是从约1x105/ml至1x106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群体中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所描述进行解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法激活之前在室温静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便后续用于免疫效应细胞疗法中，以用于将受益于免疫效应细胞疗法的任意数目的疾病或病症，如本文所述的那些。在一个方面，血液样品或单采取自基本健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采取自基本健康的受试者，所述受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将感兴趣的细胞分离并冷冻供以后使用。在某些方面，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另外的方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本发明的另一个方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或经改进的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本披露的上下文中，预期在所述恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病症，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。
在一个实施例中，表达例如本文所述的融合多肽(包含包括CAR分子(例如如本文所述的CAR分子)的结构域)的免疫效应细胞获得自已经接受了低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获被工程改造以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。
在其他实施例中，已经被或将被工程改造为表达例如如本文所述的融合蛋白(包含包括CAR的结构域)的免疫效应细胞(例如，T细胞)的群体可以通过与一定量的mTOR抑制剂接触而进行离体处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞))的比率。
在一个实施例中，T细胞群体是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。可替代地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一个实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
另外的表达的药剂
在另一个实施例中，例如，表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的本文所述的免疫效应细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。抑制性分子的实例包括例如，如本文描述的PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文描述的细胞内信号传导结构域)相关联。在一个实施例中，所述药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，本文描述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个实施例中，表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的本文所述的免疫效应细胞可以进一步包含例如如本文所述的第二融合多肽，所述第二融合多肽包含包括CAR(例如，包括不同抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标(例如，以上所述的靶标)或不同的靶标)的第二CAR)的结构域。在一个实施例中，所述第二CAR包含针对在与第一CAR的靶标相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。
虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除由所述第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除由所述第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含本文描述的CAR(例如，针对上述靶标的CAR)和抑制性CAR。在一个实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如也表达所述靶标的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ的细胞内结构域。
在一个实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)包含第一CAR，所述第一CAR包含结合至如本文描述的肿瘤抗原的抗原结合结构域；和第二CAR，所述第二CAR包含PD1细胞外结构域或其片段。
在一个实施例中，所述细胞进一步包含如上所述的抑制性分子。
在一个实施例中，所述细胞中的第二CAR是抑制性CAR，其中所述抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。抑制性分子可以选自以下中的一个或多个：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、和CEACAM-5。在一个实施例中，第二CAR分子包含PD1的细胞外结构域或其片段。
在实施例中，所述细胞中的第二CAR分子进一步包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在其他实施例中，所述细胞中的细胞内信号传导结构域包含含有CD3ζ的功能性结构域的初级信号传导结构域和含有4-1BB的功能性结构域的共刺激信号传导结构域。
在某些实施例中，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，并且第二CAR分子的抗原结合结构域不包含scFv。例如，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，并且第二CAR分子的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法在公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中更详细地描述，将这些公开通过引用并入本文。简言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且所述细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当所述细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当所述细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被激活并开始细胞杀伤活性。因此，所述表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全激活。
多重CAR表达
在一个方面，表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的本文所述的细胞可以进一步包含例如如本文所述的第二融合多肽，所述第二融合多肽包含包括CAR的结构域，所述CAR是例如包括不同抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标或不同的靶标(例如，除本文所述的癌症相关抗原或本文所述的不同癌症相关抗原之外的靶标))的第二CAR。在一个实施例中，第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，所述第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，要求保护的本发明包括第一CAR和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域是scFv，而另一者不是scFv。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
同种异体细胞
在本文描述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，所述细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)或β2微球蛋白(B2M)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如被工程改造使得它在其表面上不表达任何功能性TCR，被工程改造使得它不表达包含功能性TCR(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3E、CD3G或CD3D)的一个或多个亚基，或被工程改造使得它在其表面上产生非常少的功能性TCR。替代性地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。
本文描述的T细胞可以例如被工程改造，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，可以工程改造本文所述的T细胞，使得其细胞表面HLA(例如，HLA 1类和/或HLA II类或亚基)表达或HLA表达的调节剂(例如，B2M)被下调。
本文描述的T细胞可以例如被工程改造，使得它在其表面上不表达功能性B2M。例如，本文所述的T细胞可以被工程改造，使得B2M的细胞表面表达被下调。
在一些实施例中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLAII类)。
缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文描述的任何方法不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，所述细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，所述抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如如本文描述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
siRNA和shRNA
在一些实施例中，可以使用靶向编码T细胞中的TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA来抑制TCR表达和/或HLA或B2M表达。
CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，所述系统可以用于使TCR和/或HLA或B2M基因沉默或突变。
可以使用本领域中已知的技术产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统，例如，描述于美国公开号20140068797和Cong(2013)Science[科学]339:819-823中的技术，将其通过引用以其全文并入本文。还可以产生本领域已知的其他人工CRISPR/Cas系统，其抑制TCR和/或HLA，例如描述于以下：Tsai(2014)Nature Biotechnol.[自然生物技术],32:6569-576,美国专利号：8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359，将其通过引用以其全文并入本文。
TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化因子样效应子核酸酶，一种可以用于编辑HLA或B2M和/或TCR基因的人工核酸酶。
通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割域进行融合来人工产生TALEN。可以工程改造转录活化因子样作用(TALE)以结合任何所希望的DNA序列，包括HLA或TCR基因的部分。通过将工程改造的TALE与DNA切割域组合，可以产生对任何所希望的DNA序列(包括HLA或TCR序列)特异的限制酶。然后可以将它们引入细胞中，在其中它们可以用于进行基因组编辑，如在Boch(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:135-6；Boch等人.(2009)Science[科学]326:1509-12；和Moscou等人.(2009)Science[科学]326:3501中所述，将其通过引用以其全文并入本文。
可以使用本领域已知的任何方法构建对HLA或TCR中的序列特异的TALEN，这些方法包括使用模块组分的各种方案，如在Zhang等人.(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:149-53；和Geibler等人.(2011)PLoS ONE[公共科学图书馆综合]6:e19509中所述，将其通过引用以其全文并入本文。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR或B2M基因的人工核酸酶。
可以使用本领域已知的任何方法构建对HLA和/或TCR中的序列特异的ZFN，如描述在Provasi(2011)Nature Med.[自然医学]18:807-815；Torikai(2013)Blood[血液]122:1341-1349；Cathomen等人.(2008)Mol.Ther.[分子疗法]16:1200-7；Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230中，将其通过引用以其全文并入本文。
端粒酶表达
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)，通过引用以其整体并入本文。因此，在一个实施例中，免疫效应细胞(例如T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本公开内容提供了产生表达CAR的细胞的方法，所述方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与所述核酸接触。
扩增和活化
免疫效应细胞(如T细胞)通常可以使用如描述于例如以下中的方法进行活化和扩增：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005，这些专利各自通过引用以其整体并入。
通常，免疫效应细胞(例如调节性T细胞耗减的细胞)群体可以通过与已附着有药剂和配体的表面接触而扩增，所述药剂刺激CD3/TCR复合物相关信号并且该配体刺激T细胞表面上的共刺激分子。具体地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化因子(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，
Figure BDA0002541415150004261
法国)，可以如本领域公知的其他方法来使用(Berg等人,Transplant Proc.[移植进展]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.ImmunolMeth.[免疫学方法杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一个方面，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些方面，两种药剂都可以在溶液中。在一个方面，这些试剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810(将其通过引用以其全文并入本文)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞预期用于活化和扩增本发明中的T细胞。
在一个方面，将两种药剂固定在珠上，或者在同一珠上，即“顺式”，或者在分离的珠上，即“反式”。通过举例，提供初级激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一个方面，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用如下比率的与珠结合的抗CD3:CD28抗体，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定方面，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定方面，使用与珠结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在另外的方面，使用与珠结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用与珠结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在又一个方面，使用与珠结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。
颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些方面范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在另外的方面包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个优选的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一个方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一个特定方面，优选的颗粒:细胞的比率为1:5。在另外的方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一个方面，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外颗粒在之后每天或每隔一天添加到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一个方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，各种其他比率可适用于本发明。具体地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一个方面，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。
在另外的方面，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将这些珠和这些细胞分离，并且然后培养细胞。在可替代方面，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在另一个方面，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28所附接的顺磁珠(3x28个珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的
Figure BDA0002541415150004291
M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子(如钙和镁))中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶标细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文内。在某些方面，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿个细胞/ml、60亿个细胞/ml、50亿个细胞/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞激活、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且在某些方面是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施例中，例如，通过本文所述的方法，将用编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR(例如，本文所述的CAR)的结构域)的核酸转导的细胞进行扩增。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞在抗原刺激后显示细胞倍增的至少一倍、两倍、三倍或四倍增加。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞显示促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)的至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍增加(pg/ml)。
还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，Minimal Essential Media或RPMI Media 1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，所述培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、优化剂，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
在一个实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当介质(例如本文描述的介质)中扩增，所述白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如通过本文描述的方法(如流式细胞术)测量。在一个实施例中，细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)的存在下扩增。
在实施例中，本文所述的方法(例如，表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞的制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从细胞群体除去调节性T细胞(例如CD25+T细胞)。本文描述了从细胞群体除去调节性T细胞(例如CD25+T细胞)的方法。在实施例中，这些方法(例如制造方法)进一步包括使细胞群体(例如其中调节性T细胞(如CD25+T细胞)已耗减的细胞群体；或先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群体(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的本文所述的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一个实施例中，在离体扩增期间，使表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一个实施例中，所述接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+T细胞)的存活和增殖。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群体(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群体，所述T细胞群体在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，所述T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性亚群，则将所述亚群扩增到更大程度可能是有益的。
此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标记之外，其他表型标记物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制激活的T细胞产物。
一旦构建了例如如本文所述的融合多肽(包含包括本文所述的CAR的结构域)，可以使用各种测定来评估分子的活性，例如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞、在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增、以及在适当的体外和动物模型中维持抗癌活性的能力。用于评估本披露的car的作用的测定进一步详细描述于下文。
可以将原代T细胞中的例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)表达的蛋白质印迹分析用于检测单体和二聚体的存在。参见例如，Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR的T细胞(CD4+和CD8+T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，然后在还原条件下进行裂解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR。相同的T细胞亚群用于在非还原条件下的SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。
可以通过流式细胞术测量例如如本文所述的融合多肽+(包含包括CAR的结构域)例如如CAR+T细胞在抗原刺激后的体外扩增。例如将CD4+和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28aAPC刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术，在培养的第6天在CD4+和/或CD8+T细胞亚群中评估GFP荧光。参见例如，Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。替代性地，在第0天将CD4+和CD8+T细胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天使用表达CAR连同eGFP(使用2A核糖体跳跃序列)的双顺反子慢病毒载体转导。在洗涤后在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在下，将培养基用如本文描述的癌症相关抗原+K562细胞(表达如本文描述的癌症相关抗原的K562)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激。每隔一天以100IU/ml向培养基中添加外源IL-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计算GFP+T细胞。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
还可以测量在不存在再刺激的情况下持久的例如如本文所述的融合多肽+(包含含有CAR的结构域)例如CAR+T细胞扩增。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、NexcelomCellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量CART活性。例如，可以使用异种移植模型，所述异种移植模型使用人本文描述的癌症相关抗原特异性CAR+T细胞来治疗免疫缺陷小鼠中的初级人前-BALL。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简言之，在建立ALL后，将小鼠随机分配至处理组。将不同数量的癌症相关抗原特异性CAR工程改造的T细胞以1:1的比率共注射到携带B-ALL的NOD-SCID-γ-/-小鼠中。在T细胞注射后的不同时间，评估来自小鼠的脾DNA中的癌症相关抗原特异性CAR载体的拷贝的数量。以每周间隔评估动物的白血病。外周血如本文描述的癌症相关抗原+B-ALL胚细胞计数在注射本文描述的癌症相关抗原-ζCAR+T细胞或模拟转导的T细胞的小鼠中测量。使用时序检验比较组的存活曲线。此外，还可以分析在NOD-SCID-γ-/-小鼠中T细胞注射后4周的绝对外周血CD4+和CD8+T细胞计数。给小鼠注射白血病细胞，并在3周后注射T细胞，这些T细胞经工程改造以通过编码与eGFP连接的CAR的双顺反子慢病毒载体表达CAR。通过在注射前与模拟转导的细胞混合将T细胞标准化为45％-50％输入的GFP+T细胞，并通过流式细胞术确认。在1周的间隔评估动物的白血病。使用时序检验比较CAR+T细胞组的存活曲线。
可以对剂量依赖性的例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)治疗应答进行评估。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21天用CAR T细胞、相同数量的模拟转导的T细胞、或无T细胞注射的小鼠中建立白血病之后35-70天获得外周血。将来自每组的小鼠随机放血以确定外周血如本文描述的癌症相关抗原+ALL胚细胞计数，并且然后在第35天和第49天处死。在第57天和第70天评估剩余的动物。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。简言之，通过将洗涤的T细胞与表达本文描述的癌症相关抗原(K19)或CD32和CD137(KT32-BBL)的K562细胞混合(最终T细胞:K562比率为2:1)，在微量滴定板中进行CAR介导的增殖的评估。在使用前用γ射线照射K562细胞。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至具有KT32-BBL细胞的培养基以用作用于刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+T细胞离体扩增。使用CountBrightTM荧光珠(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Carlsbad，CA))和流式细胞术(如由制造商描述的)在培养基中计数T细胞。使用用eGFP-2A连接的表达CAR的慢病毒载体进行工程改造的T细胞，通过GFP表达来鉴定CAR+T细胞。对于不表达GFP的CAR+T细胞，用生物素化的重组如本文描述的癌症相关抗原和次级抗生物素蛋白-PE缀合物检测CAR+T细胞。还用特异性单克隆抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。根据制造商说明书，使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD生物科学公司，圣地牙哥，加利福尼亚州)对再刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光，并根据制造商说明书分析数据。
可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如，Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简言之，在37℃将靶细胞(K562系和初级原B-ALL细胞)负载51Cr(如NaCrO4，新英格兰核公司(New England Nuclear)，波士顿，马萨诸塞州)2小时伴随频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤两次并铺板到微量滴定板中。将效应T细胞与完全RPMI的孔中的靶细胞以不同比率的效应细胞:靶细胞(E:T)混合。还制备了仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100洗涤剂溶液(总释放，TR)的另外的孔。在37℃孵育4小时后，收获来自每个孔的上清液。然后使用γ颗粒计数器(帕卡德仪器公司(PackardInstrument Co.)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)测量释放的51Cr。每种条件进行至少一式三份，并且使用下式计算裂解百分比：％裂解＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER代表每种实验条件释放的平均51Cr。
成像技术可用于评估荷肿瘤的动物模型中CAR的特定运输和增殖。例如，Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。简言之，NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠IV注射Nalm-6细胞，7天后在用CAR构建体电穿孔后4小时用T细胞注射。将T细胞用慢病毒构建体稳定转染以表达萤火虫萤光素酶，并将小鼠针对生物发光成像。可替代地，单次注射CAR+T细胞在Nalm-6异种移植模型中的治疗效果和特异性可以如下测量：向NSG小鼠注射转导的Nalm-6以稳定表达萤火虫萤光素酶，然后在7天后单次尾静脉注射用本披露的car电穿孔的T细胞。在注射后的不同时间点对动物成像。例如，可以产生在第5天(处理前2天)和第8天(CAR+PBL后24小时)的代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性白血病的光子密度热图。
其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评估本文描述的CAR。
制备表达CAR的细胞的方法
在另一方面，本发明涉及制备细胞(例如，免疫效应细胞或其群体)的方法，所述方法包括将载体引入(例如，转导)细胞(例如，本文所述的T细胞或NK细胞)，所述载体包含编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR(例如本文所述的CAR)的结构域)的核酸；或编码CAR分子(例如本文所述的CAR)的核酸。
这些方法中的细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞，或它们的组合)。在一些实施例中，这些方法中的细胞是甘油二酯激酶(DGK)和/或Ikaros缺陷型的。
在一些实施例中，引入编码CAR的核酸分子包括转导包含编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸分子的载体，或转染编码CAR的核酸分子(其中所述核酸分子是体外转录的RNA)。
在一些实施例中，所述方法还包括：
提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的群体；和
从所述群体中除去调节性T细胞，从而提供调节性T细胞耗减的细胞群体；
其中步骤a)和b)在将编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸引入所述群体中之前进行。
在这些方法的实施例中，调节性T细胞包含CD25+T细胞，并且使用抗CD25抗体或其片段从细胞群体中除去。抗CD25抗体或其片段可以与底物(例如珠)缀合。
在其他实施例中，从步骤(b)提供的调节性T细胞耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在又其他实施例中，所述方法进一步包括从表达不包含CD25的肿瘤抗原的群体中除去细胞，以提供T调节性细胞耗减的和肿瘤抗原耗减的细胞的群体，之后将编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸引入所述群体。肿瘤抗原可以选自CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b、或它们的组合。
在其他实施例中，所述方法进一步包括从表达检查点抑制剂的群体中除去细胞，以提供T调节性细胞耗减的和抑制性分子耗减的细胞的群体，之后将编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸引入所述群体。检查点抑制剂可以选自PD-1、LAG-3、TIM3、B7-H1、CD160、P1H、2B4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。
本文披露的其他实施例包括提供免疫效应细胞群体。可以基于CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO中的一种或多种的表达来选择所提供的免疫效应细胞群体。在某些实施例中，所提供的免疫效应细胞群体是CD3+和/或CD28+。
在所述方法的某些实施例中，所述方法进一步包括在引入编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的核酸分子后扩增所述细胞群体。
在实施例中，所述细胞群体扩增8天或更短的时间。
在某些实施例中，使细胞群体在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。
在其他实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，在培养物中扩增5天的细胞群体在抗原刺激后显示细胞倍增的至少一倍、两倍、三倍或四倍增加。
在又其他实施例中，使细胞群体在培养物中扩增5天，并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎性IFN-γ和/或GM-CSF水平。
在其他实施例中，通过在刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的配体存在下培养细胞来扩增细胞群体。所述药剂可以是与抗CD3抗体或其片段、和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。
在其他实施例中，使细胞群体在包含一种或多种白介素的适当介质中扩增，所述一种或多种白介素导致在14天扩增期内细胞增加至少200倍、250倍、300倍或350倍，如通过流式细胞术所测量的。
在其他实施例中，在IL-15和/或IL-7存在下扩增细胞群体。
在某些实施例中，所述方法进一步包括在适当的扩增期后冷冻保存细胞群体。
在又其他实施例中，本文披露的制备方法进一步包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。
本披露还提供了一种产生RNA工程改造的细胞，例如本文描述的细胞，例如瞬时表达外源RNA的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的群体的方法。所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞，其中所述RNA包含编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括本文所述的CAR分子的结构域)的核酸。
在另一方面，本发明涉及在受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR分子的结构域)的细胞，例如，表达本文所述的CAR分子的细胞。在一个实施例中，细胞是自体T细胞或NK细胞。在一个实施例中，细胞是同种异体T细胞或NK细胞。在一个实施例中，受试者是人。
在一个方面，本发明包括用包含编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括本文所述的CAR分子的结构域)的核酸分子的载体转染或转导的自体细胞的群体。在一个实施例中，所述载体是逆转录病毒载体。在一个实施例中，所述载体是如本文其他地方描述的自灭活慢病毒载体。在一个实施例中，将载体递送(例如，通过转染或电穿孔)至细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其中所述载体包含编码如本文描述的本披露的CAR的核酸分子，所述核酸分子被转录为mRNA分子，并且本披露的CAR从所述RNA分子翻译并在细胞的表面上表达。
在另一方面，本披露提供了表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的细胞的群体，例如，表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一些实施例中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的群体可以包括表达CAR的第一细胞，所述CAR具有结合至如本文描述的第一肿瘤抗原的抗原结合结构域；以及表达CAR的第二细胞，所述CAR具有结合至如本文描述的第二肿瘤抗原的不同抗原结合结构域。作为另一个实例，表达CAR的细胞群体可以包括表达CAR的第一细胞，所述CAR包含结合至如本文描述的肿瘤抗原的抗原结合结构域；以及表达CAR的第二细胞，所述CAR包含针对除如本文描述的肿瘤抗原以外的靶标的抗原结合结构域。在一个实施例中，表达CAR的细胞群体包括，例如表达包含初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包含次级信号传导结构域(例如共刺激信号传导结构域)的CAR的第二细胞。
在另一方面，本披露提供了细胞群体，其中所述群体中的至少一个细胞表达例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR(其具有结合至如本文描述的肿瘤抗原的抗原结合结构域)的结构域)，和表达另一种药剂(例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂)的第二细胞。例如，在一个实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂例如是本文描述的分子，例如包含第一多肽(例如抑制性分子)的药剂，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽例如本文描述的细胞内信号传导结构域相关联。在一个实施例中，所述药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、LAG-3、CTLA-4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、2B4和TIGIT、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，本文描述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个实施例中，编码例如如本文所述的融合多肽(包含包括本披露CAR的结构域)的例如如本文所述的核酸分子被表达为mRNA分子。在一个实施例中，表达本发明的遗传修饰的CAR的细胞，例如免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)可以通过将编码所希望的CAR的RNA分子(例如，没有载体序列)转染或电穿孔到细胞中来产生。在一个实施例中，本披露的CAR一旦被掺入并在重组细胞的表面上表达就从RNA分子翻译。
用于产生用于在转染中使用的mRNA的方法涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如，本文描述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文描述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文描述的IRES)、待表达的核酸和聚腺苷酸尾的构建体，典型地长度为50-5000个碱基(SEQ ID NO:174)。这样产生的RNA可以有效转染不同种类的细胞。在一个实施例中，所述模板包括用于例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)的序列。在一个实施例中，例如如本文所述的RNA融合多肽(包含包括CAR的结构域)，载体被通过电穿孔转导到细胞(例如，T细胞或NK细胞)中。
在一个实施例中，例如使用体外转录将例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)引入免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)中，并且受试者(例如人)接受本发明的例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)、免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的初始施用以及本发明的例如如本文所述的融合多肽(包含包括CAR的结构域)、免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用在前一次施用后少于15天(例如在14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天)施用。在一个实施例中，将本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的多于一次施用每周施用至受试者(例如人)，例如每周施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的2、3、或4次施用。在一个实施例中，受试者(例如人受试者)每周接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的多于一次施用(例如每周2、3或4次施用)(在本文中也称为周期)，随后一周未施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后将CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的一次或多次另外的施用(例如，每周CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的多于一次施用)施用至受试者。在另一个实施例中，受试者(例如人受试者)接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的多于一个周期，并且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施例中，每隔一天施用(每周3次施用)CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一个实施例中，施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)持续至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一个方面，使用慢病毒病毒载体(例如，慢病毒)产生表达CAR的细胞。以所述方式产生的细胞(例如，CART)将具有稳定的CAR表达。
在一个方面，使用病毒载体如γ逆转录病毒载体(例如本文描述的γ逆转录病毒载体)产生表达CAR的细胞，例如CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。
在一个方面，CART在转导后瞬时表达CAR载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR的瞬时表达可能受RNA CAR载体递送的影响。在一个方面，通过电穿孔将CAR RNA转导到T细胞中。
在使用瞬时表达CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)(特别是采用携带CART的鼠scFv时)治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受该理论的束缚，据信这种过敏反应可能是由患者发展体液抗CAR应答，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为当存在暴露于抗原的10至14天中断时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。如果患者在瞬时CAR疗法(如通过RNA转导产生的那些)过程中处于产生抗CAR抗体应答的高风险中，则CART输注中断时间不应持续超过10至14天。
药物组合物
本披露的药物组合物可以包含任何融合多肽，编码这种融合多肽的核酸，或包含如本文所述的融合多肽的细胞，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一个方面，本披露的组合物被配制用于静脉内施用。
本披露的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。
在一个方面，本发明包括被配制用于在如本文所述的方法中使用的药物组合物，所述组合物包含经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含编码自杀基因的核酸和编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含抗B细胞结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。
在另一方面，本发明包括被配制用于在如本文所述的方法中使用的药物组合物，所述组合物包含经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含编码二聚化结构域和嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含抗B细胞结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。
在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本披露组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物以104至109个细胞/kg体重、在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在某些方面，可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后随后重抽血液(或进行单采术)，根据本发明从其活化免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并用这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)回输患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。
能以任何常规方式施用主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文所述的组合物。在一个方面，通过皮内或皮下注射向患者施用本披露的细胞组合物。在一个方面，通过i.v.注射来施用本披露的细胞组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采法，其中离体收集、富集、或耗减白细胞以选择和/或分离目的细胞(例如T细胞)。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增并处理，使得可以引入本发明的一个或多个CAR构建体，从而产生本发明的CART细胞。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或与移植同时，受试者接受输注本发明的扩增的CAR T细胞。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
有待向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和所述治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来进行人类施用的剂量的缩放。
选择性调节所述融合多肽的表达的方法
本文还提供了选择性调节(例如，降解)融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和异源多肽的融合多肽，例如，CAR多肽)的方法。此类方法可以包括使细胞(包含本文所述的任何融合多肽或编码这种融合多肽的核酸)与COF1、COF2或COF3接触。在一些实施例中，例如，相对于在不存在COF1、COF2或COF3的情况下的修饰和/或降解，COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽在COF1、COF2或COF3的存在下增加了融合多肽的翻译后修饰和/或降解。在一个实施例中，例如，相对于在不存在COF1、COF2或COF3的情况下的泛素化，所述COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽在COF1、COF2或COF3的存在下增加了所述融合多肽的选择性泛素化。在一些实施例中，使所述细胞与COF1、COF2或COF3在体内接触。在一些实施例中，使所述细胞与COF1、COF2或COF3离体接触。
如本文所使用的，“选择性降解”融合多肽或靶多肽等是指相对于参考多肽(例如，不具有COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽的多肽)，增加所述融合多肽或靶多肽的降解(例如，增加的降解水平和/或降解速率，例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、10倍、100倍、1,000倍或更高)。
本文还提供了选择性调节(例如，降解)融合多肽(包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽)、异源多肽和降解结构域的方法。此类方法包括以下步骤中的一个或多个：
i)使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与稳定化合物接触，任选地其中在稳定化合物的存在下，所述融合多肽的表达水平与在不存在稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如，1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，并且
ii)使所述融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF1、COF2或COF3接触，任选地其中在COF1、COF2或COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
在另一方面，本披露提供了包括施用本发明的融合多肽作为疗法的方法。通常，这种向受试者的施用将处于表达本发明的融合多肽的细胞(例如自体或同种异体宿主细胞)形式。因此，通过施用COF1、COF2或COF3(在体内或离体)可以调节治疗性蛋白质(例如，异源蛋白质)的表达。因此，通过施用COF1、COF2或COF3(在体内或离体)可以调节治疗性蛋白质(例如，异源蛋白质)的表达。因此，可以调节已知的合成的治疗性蛋白质或跨膜受体(例如，融合多肽，例如如本文所述的融合多肽，例如，包含包括本文所述的CAR分子的结构域)的表达。在一个实施例中，受试者患有本文描述的病症，例如受试者患有癌症，例如受试者患有表达本文描述的靶抗原的癌症。在一个实施例中，受试者是人。
本文提供了对患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法是通过向所述受试者施用有效量的细胞(例如，宿主细胞)，所述细胞包含本文所述的任何融合多肽或编码这种融合多肽的核酸。在一些实施例中，所述融合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体在N-末端至C-末端的方向上包含特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，所述宿主细胞对所述受试者是自体的。在一些实施例中，所述宿主细胞对所述受试者是同种异体的。在一些实施例中，使所述宿主细胞与COF1、COF2或COF3接触。
在又另一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有与肿瘤抗原(例如，本文描述的抗原)的表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的包含融合多肽(其包含CAR分子)的细胞，例如免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，其中所述CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域结合至与所述疾病相关的肿瘤抗原，例如如本文描述的肿瘤抗原。
在相关方面，本发明的特征在于一种治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含含有CAR分子的融合多肽的细胞，例如免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)与增加所述免疫细胞的功效的药剂的组合，其中：
所述增加免疫细胞的功效的药剂选自以下中的一种或多种：
(i)蛋白磷酸酶抑制剂；
(ii)激酶抑制剂；
(iii)细胞因子；
(iv)免疫抑制性分子的抑制剂；或
(v)降低TREG细胞的水平或活性的药剂。
在另一方面，本发明的特征在于用于在治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病(例如，如本文所述障碍)的受试者中使用的组合物，所述组合物包含免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，所述免疫效应细胞包含含有CAR分子的融合多肽(例如，包含如本文所述的CAR分子的融合多肽)。
在任何前述方法或用途的某些实施例中，所述与肿瘤抗原(例如，本文描述的肿瘤抗原)相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤，或癌前病状如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在一个实施例中，所述疾病是本文描述的癌症，例如本文描述为与本文描述的靶标相关的癌症。在一个实施例中，所述疾病是血液癌症。
在一个实施例中，血液癌是白血病。在一个实施例中，所述癌症选自下组，该组由以下组成：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病症集合的“白血病前期”；以及与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病，包括但不限于表达如本文描述的肿瘤抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病；以及它们的任何组合。在另一个实施例中，与本文描述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。
在某些实施例中，这些方法或用途与增加免疫效应细胞的功效的药剂(例如，如本文描述的药剂)组合进行。
在任何前述方法或用途中，与肿瘤抗原的表达相关的疾病选自下组，该组由以下组成：增生性疾病、癌前病状、癌症以及与该肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。
癌症可以是血液癌症，例如选自以下中的一种或多种的癌症：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病状、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症或白血病前期。
癌症还可以选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、所述癌症的组合、以及所述癌症的转移性病灶。
在本文所述的方法或用途的某些实施例中，将细胞与增加细胞的功效的药剂(例如，蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制性分子的抑制剂中的一种或多种)；或降低TREG细胞的水平或活性的药剂组合施用。
在本文描述的方法或用途的某些实施例中，蛋白磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂和/或SHP-2抑制剂。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中，激酶抑制剂选自以下中的一种或多种：CDK4抑制剂、CDK4/6抑制剂(例如，帕博西尼)、BTK抑制剂(例如，依鲁替尼或RN-486)、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或依维莫司(RAD001))、MNK抑制剂或双重P13K/mTOR抑制剂。在一个实施例中，BTK抑制剂不会降低或抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中，抑制免疫抑制性分子的药剂包括抗体或抗体片段、抑制性核酸、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或对抑制性分子的表达进行抑制的锌指核酸内切酶(ZFN)。
在本文描述的方法或用途的其他实施例中，降低TREG细胞的水平或活性的药剂选自环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减或它们的组合。
在本文所述的方法或用途的某些实施例中，所述免疫抑制性分子选自下组，该组由以下组成：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5。
在其他实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含含有抑制性分子的第一多肽或其片段以及向细胞提供阳性信号的第二多肽，并且其中所述第一多肽和第二多肽在含有CAR的免疫细胞上表达，其中(i)所述第一多肽包含PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、以及CEACAM-5或其片段；和/或(ii)所述第二多肽包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性结构域；和/或共刺激信号传导结构域包含选自41BB、CD27和CD28的蛋白质的功能性结构域。
在其他实施例中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15、IL-18、或IL-21、或其组合。
在其他实施例中，包含融合多肽的免疫效应细胞和第二，例如本文披露的任何组合疗法(例如，增加免疫效应细胞的功效的药剂)基本上同时或顺序地施用。
在其他实施例中，将包含融合多肽的免疫细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子组合施用。在某些实施例中，靶向GITR和/或调节GITR功能的分子在表达CAR的细胞或细胞群体之前或在单采术之前给予。
在一个实施例中，淋巴细胞输注(例如同种异体淋巴细胞输注)用于治疗癌症，其中淋巴细胞输注包含至少一种本发明的表达CAR的细胞。在一个实施例中，自体淋巴细胞输注用于治疗癌症，其中自体淋巴细胞输注包含至少一种本文描述的表达CAR的细胞。
在一个实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞是甘油二酯激酶(DGK)缺陷的。在一个实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞是Ikaros缺陷的。在一个实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞是DGK和Ikaros两者缺陷的。
在一个实施例中，所述方法包括施用表达包含如本文所述CAR分子的融合多肽的细胞与增强表达CAR的细胞的活性的药剂的组合，其中所述药剂是细胞因子，例如IL-7、IL-15、IL-18、IL-21或它们的组合。可以与给予表达CAR的细胞组合，例如同时或在给予表达CAR的细胞之后不久递送细胞因子。可替代地，可以在给予表达CAR的细胞后延长的时间段后，例如，在评估受试者对表达CAR的细胞的应答之后递送细胞因子。在一个实施例中，将细胞因子与施用本文所述的细胞或细胞群体同时(例如，在同一天施用)或在施用所述细胞或细胞群体之后不久(例如，在施用所述细胞或细胞群体之后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用)施用至受试者。在其他实施例中，将细胞因子在施用本文所述的细胞或细胞群体之后或在评估受试者对细胞的应答之后延长的时间段(例如，例如，至少2周、3周、4周、6周、8周、10周或更长时间)后施用至受试者。
在其他实施例中，将表达包含CAR分子的融合多肽的细胞与改善与表达CAR分子的细胞的施用相关的一种或多种副作用的药剂组合施用。与表达CAR的细胞相关的副作用可以选自细胞因子释放综合征(CRS)或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。
在任何前述方法或用途的实施例中，表达CAR分子的细胞与治疗与肿瘤抗原的表达相关的疾病的药剂(例如本文披露的第二或第三疗法中的任一种)组合施用。
另外的示例性组合包括以下中的一种或多种。
在另一个实施例中，表达例如，如本文描述的CAR分子的细胞可以与另一种药剂(例如，本文描述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂)组合给予。在一个实施例中，表达CAR分子的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂。
例如，在一个实施例中，增强表达CAR的细胞的活性的药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂(例如，免疫抑制剂分子)。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。
在一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂是抑制性核酸，是dsRNA、siRNA或shRNA。在实施例中，所述抑制性核酸与编码CAR分子的组分的核酸连接。例如，抑制性分子可以在表达CAR的细胞上表达。
在另一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂是本文描述的分子，例如包含第一多肽(例如，抑制性分子)的药剂，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文描述的细胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施例中，所述药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段(例如，这些中的任一者的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施例中，所述药剂包含PD1或其片段(例如PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如本文描述的CD28信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个实施例中，将本发明的细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至已接受先前干细胞移植(例如自体干细胞移植)的受试者。
在一个实施例中，将本发明的细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至已接受先前剂量的美法仑的受试者。
在一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞与增加表达CAR分子的细胞的功效的药剂(例如本文描述的药剂)组合施用。
在一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞与低免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合施用。尽管不希望受理论束缚，但据信用低免疫增强剂量(例如不足以完全抑制免疫系统但足以改善免疫功能的剂量)进行治疗伴随PD-1阳性T细胞的减少或PD-1阴性细胞的增加。PD-1阳性T细胞、但非PD-1阴性T细胞可以通过与表达PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)的细胞接合而耗竭。
在一个实施例中，这种方法可以用于优化本文描述的CAR细胞在受试者中的性能。虽然不希望受理论束缚，但是据信，在一个实施例中，内源性、未修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的性能得到改善。尽管不希望受理论束缚，但据信，在一个实施例中，表达靶抗原CAR的细胞的性能得到改善。在其他实施例中，已经被或将被工程改造为表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以通过与一定量的mTOR抑制剂接触而离体进行处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率。
在一个实施例中，在给予本文所述的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)之前，开始给予低免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如变构抑制剂(例如，RAD001)，或催化性抑制剂。在一个实施例中，在足够的时间或足够剂量的mTOR抑制剂后施用CAR细胞，以使得PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少短暂地增加。
在一个实施例中，在足够的时间后、或在低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的足够给药后收获经工程改造以表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少是瞬时增加了。
在一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞与改善与表达CAR分子的细胞的施用相关的一种或多种副作用的药剂(例如，本文描述的药剂)组合施用。
在一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞与治疗与如本文描述的癌症相关抗原相关的疾病的药剂(例如，本文描述的药剂)组合施用。
在一个实施例中，将表达两种或更多种融合多肽(包含例如，如本文所述的CAR分子)的细胞施用至有需要的受试者以治疗癌症。在一个实施例中，将包括融合多肽的细胞(包含例如如本文所述表达CAR的细胞)的群体施用至有需要的受试者以治疗癌症。
在一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞以本文描述的剂量和/或给药时间表施用。
在一个实施例中，例如，使用体外转录将包含CAR分子的融合多肽引入免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且受试者(例如，人)接受包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的初始施用和一次或多次包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的后续施用，其中所述一次或多次后续施用在先前施用之后少于15天(例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)施用。在一个实施例中，每周向受试者(例如，人)施用包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的多于一次施用，例如，每周施用包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的2、3或4次施用。在一个实施例中，所述受试者(例如，人受试者)每周接受包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的多于一次的施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称为周期)，然后一周不施用包含含有CAR分子的融合多肽的细胞，然后向受试者施用包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的一次或多次另外的施用(例如，每周施用包含CAR分子的细胞的多于一次的施用)。在另一个实施例中，所述受试者(例如，人受试者)接受包含含有CAR分子的融合多肽的细胞的多于一个周期，并且每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施例中，每隔一天施用(每周3次施用)包含含有CAR分子的融合多肽的细胞。在一个实施例中，将包含含有CAR分子的融合多肽的细胞施用持续至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞作为疾病(例如癌症，例如本文描述的癌症)的一线治疗施用。在另一个实施例中，将表达包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的细胞作为疾病(例如癌症，例如本文描述的癌症)的二线、三线、四线治疗施用。
在一个实施例中，给予本文描述的细胞群体。
在另一方面，本发明涉及本文所述的表达包含CAR分子的融合多肽的细胞，所述细胞与如本文描述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂组合用作药物。在另一个方面，本发明涉及本文描述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂，所述激酶抑制剂和/或检查点抑制剂与本文描述的表达CAR分子的细胞组合用作药物。
在另一个方面，本发明涉及本文所述的表达包含CAR分子的融合多肽的细胞，所述细胞与细胞因子(例如，如本文描述的IL-7、IL-15和/或IL-21)组合用于治疗表达由所述CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。在另一个方面，本发明涉及本文描述的细胞因子，所述细胞因子与本文所述的表达包含CAR分子的融合多肽的细胞组合用于治疗表达由所述CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。
在另一个方面，本发明涉及本文所述的表达包含CAR分子的融合多肽的细胞，所述细胞与如本文描述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂组合用于治疗表达由所述CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。在另一个方面，本发明涉及本文描述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂，所述激酶抑制剂和/或检查点抑制剂与本文所述的表达包含CAR分子的融合多肽的细胞组合用于治疗表达由所述CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。
在另一方面，本披露提供了如下方法，所述方法包括施用包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽，或包含编码包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的融合多肽的核酸的细胞。在一个实施例中，受试者患有本文描述的病症，例如，受试者患有癌症，例如，受试者患有癌症并且具有表达本文描述的支持肿瘤的抗原的支持肿瘤的细胞。在一个实施例中，受试者是人。
在本文所述的方法或用途的一个实施例中，将所述包含CAR分子的融合多肽与另一种药剂组合施用。在一个实施例中，所述药剂可以是激酶抑制剂，例如CDK4/6抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、MNK抑制剂或双重PI3K/mTOR激酶抑制剂、以及它们的组合。在一个实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，例如CD4/6抑制剂，如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为帕博西尼(palbociclib)或PD0332991)。在一个实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如本文描述的BTK抑制剂，例如像依鲁替尼。在一个实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如本文描述的mTOR抑制剂，例如像雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。所述mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文描述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施例中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如本文描述的MNK抑制剂，例如像4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。所述MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。所述双重PI3K/mTOR抑制剂可以是例如PF-04695102。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色满酮；克唑替尼(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟基甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮，盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；英迪舒兰(E7070)；roscovitine(CYC202)；帕博西尼(PD0332991)；地那西利(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂环庚三烯-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如帕博西尼(PD0332991)，并且将帕博西尼以每天约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的剂量给予持续一段时间，例如每天给予28天周期的14-21天、或每天给予21天周期的7-12天。在一个实施例中，施用帕博西尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在本文所述的方法和用途的一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个实施例中，BTK抑制剂不会降低或抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂(例如，依鲁替尼(PCI-32765))，并且将依鲁替尼以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量给予持续一段时间，例如每天给予持续21天周期，或每天给予持续28天周期。在一个实施例中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是不会抑制ITK(例如RN-486)的激酶活性的BTK抑制剂，并且将RN-486以每天约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg(例如，150mg、200mg或250mg)的剂量给予一段时间，例如28天周期。在一个实施例中，给予RN-486的1、2、3、4、5、6、7或更多个周期。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：替西罗莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:836)，内盐(SF1126)；和XL765。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并且将雷帕霉素以每天约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量给予持续一段时间，例如每天给予持续21天周期、或每天给予持续28天周期。在一个实施例中，施用雷帕霉素的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一个实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司，并且将依维莫司以每天约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的剂量施用持续一段时间，例如每天施用持续28天周期。在一个实施例中，施用依维莫司的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在本文描述的方法或用途的一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在本文所述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是双重磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，其选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿托利司(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-(3H)-马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在本文所述的方法和用途的一个实施例中，将包含本文所述的融合多肽的细胞与蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如本文描述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用至受试者。在一个实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文描述的SHP-1抑制剂，例如像葡萄糖酸锑钠。在一个实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。
在本文所述的方法和用途的一个实施例中，将包含本文所述的融合多肽的细胞与另一种药剂组合施用，并且所述药剂是细胞因子。所述细胞因子可以是例如IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合。在另一个实施例中，将包含本文所述的融合多肽的细胞与检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)组合施用。例如、在一个实施例中，所述检查点抑制剂抑制选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ的抑制性分子。
在一个方面，本文所述的融合多肽可以用于根除表达如本文所述的肿瘤抗原的正常细胞，从而适用于在细胞移植之前用作细胞调理疗法。在一个方面，表达如本文描述的肿瘤抗原的正常细胞是正常干细胞，并且细胞移植是干细胞移植。
检查点抑制剂
在本文所述的方法和用途的其他实施例中，将包含本文所述的融合多肽的细胞与另一种药剂组合施用，并且所述药剂是检查点抑制剂的抑制剂，例如，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂。本文中在下文更详细地披露了示例性抑制剂。
PD-1抑制剂
在某些实施例中，所述检查点抑制剂的抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，所述PD-1抑制剂选自PDR001(诺华公司)、纳武单抗(百时美施贵宝公司)、兰洛利珠单抗(默克公司(Merck&Co))、匹地利珠单抗(CureTech公司)、MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司(Medimmune))、REGN2810(再生元公司(Regeneron))、TSR-042(Tesaro公司)、PF-06801591(辉瑞制药公司(Pfizer))、BGB-A317(百济神州公司(Beigene))、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司(Incyte))、或AMP-224(Amplimmune公司)。
示例性PD-1抑制剂
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子。在一个实施例中，所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子，如题为“PD-1的抗体分子及其用途”的2015年7月30日公布的US2015/0210769(将其通过引用以其整体并入)中所述的。本文所述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US 2015/0210769(将其通过引用以其整体并入)中所述的方法制得。
其他示例性PD-1抑制剂
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是纳武单抗(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))，也称为MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558、或
Figure BDA0002541415150004611
纳武单抗(克隆5C4)和其他抗PD-1抗体披露于US 8,008,449和WO 2006/121168(将其通过引用以其全文并入)中。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是派姆单抗(默克公司(Merck&Co))，也称为兰洛利珠单抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475、或
Figure BDA0002541415150004612
兰洛利珠单抗和其他抗PD-1抗体披露于Hamid,O.等人(2013)New England Journal ofMedicine[新英格兰医学杂志]369(2):134-44；US 8,354,509和WO 2009/114335中，将其通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是匹地利珠单抗(治疗科技公司(CureTech))，也称为CT-011。匹地利珠单抗和其他抗PD-1抗体披露于Rosenblatt,J.等人,(2011)JImmunotherapy[免疫疗法杂志]34(5):409-18，US 7,695,715，US 7,332,582和US 8,686,119(将其通过引用以其全文并入)中。
在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子是MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体披露于US 9,205,148和WO 2012/145493(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：MEDI0680的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是REGN2810(再生元公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：REGN2810的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是PF-06801591(辉瑞公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：PF-06801591的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是BGB-A317或BGB-108(百济神州公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：BGB-A317、或BGB-108的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是INCSHR1210(因赛特公司)，也称为INCSHR01210或SHR-1210。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：INCSHR1210的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是TSR-042(泰萨罗公司)，也称为ANB011。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：TSR-042的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗PD-1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/112800、WO2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731、和US 9,102,727，将其通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗PD-1抗体是与本文所述的抗PD-1抗体之一竞争与PD-1上的相同表位结合和/或结合PD-1上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是例如如US 8,907,053(将其通过引用以其整体并入)中所述的抑制PD-1信号传导途径的肽。在一个实施例中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一个实施例中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg(安普利公司(Amplimmun))，例如，披露于WO 2010/027827和WO 2011/066342(将其通过引用以其全文并入)中。
PD-L1抑制剂
在某些实施例中，所述检查点抑制剂的抑制剂是PD-L1抑制剂。在一些实施例中，所述PD-L1抑制剂选自FAZ053(诺华公司)；阿特利珠单抗(基因泰克公司/罗氏公司)；阿维鲁单抗(默克雪兰诺公司(Merck Serono)和辉瑞制药公司)；度伐鲁单抗(英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康公司)；或BMS-936559(百时美施贵宝)。
示例性PD-L1抑制剂
在一个实施例中，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子。在一个实施例中，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子，如题为“PD-L1的抗体分子及其用途”的2016年4月21日公开的US 2016/0108123(将其通过引用以其整体并入)中所披露的。本文所述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US 2016/0108123(将其通过引用以其整体并入)中所述的方法制得。
其他示例性PD-L1抑制剂
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是阿特利珠单抗(基因泰克公司/罗氏公司)，也称为MPDL3280A、RG7446、RO5541267、YW243.55.S70、或TECENTRIQTM。阿特利珠单抗和其他抗PD-L1抗体在US 8,217,149中披露，这些抗体通过引用以其整体并入。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是阿维鲁单抗(默克雪兰诺公司和辉瑞公司)，也称为MSB0010718C。阿维鲁单抗和其他抗PD-L1抗体披露于WO 2013/079174(将其通过引用以其整体并入)中。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是度伐鲁单抗(英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康公司)，也称为MEDI4736。度伐鲁单抗和其他抗PD-L1抗体披露于US 8,779,108(将其通过引用以其整体并入)中。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是BMS-936559(百时美施贵宝公司)，也称为MDX-1105或12A4。BMS-936559和其他抗PD-L1抗体披露于US 7,943,743和WO 2015/081158(将其通过引用以其全文并入)中。
其他已知的抗PD-L1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/181342、WO2014/100079、WO 2016/000619、WO 2014/022758、WO 2014/055897、WO 2015/061668、WO2013/079174、WO 2012/145493、WO 2015/112805、WO 2015/109124、WO 2015/195163、US 8,168,179、US 8,552,154、US 8,460,927和US 9,175,082，将其通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体是与本文所述的抗PD-L1抗体之一竞争与PD-L1上的相同表位结合和/或结合至PD-L1上的相同表位的抗体。
LAG-3抑制剂
在某些实施例中，所述检查点抑制剂的抑制剂是LAG-3抑制剂。在一些实施例中，所述LAG-3抑制剂选自LAG525(诺华公司)、BMS-986016(百时美施贵宝公司)、或TSR-033(Tesaro公司)。
示例性LAG-3抑制剂
在一个实施例中，所述LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子。在一个实施例中，所述LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子，如题为“LAG-3的抗体分子及其用途”的2015年9月17日公开的US 2015/0259420(将其通过引用以其整体并入)中所披露的。本文所述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US 2015/0259420(将其通过引用以其整体并入)中所述的方法制得。
其他示例性LAG-3抑制剂
在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子是BMS-986016(百时美施贵宝公司)，也称为BMS986016。BMS-986016和其他抗LAG-3抗体披露于WO 2015/116539和US 9,505,839(将其通过引用以其全文并入)中。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子是TSR-033(泰萨罗公司)。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下的一种或多种：TSR-033的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子是IMP731或GSK2831781(GSK公司和普瑞马生物医药公司)。IMP731和其他抗LAG-3抗体披露于WO 2008/132601和US 9,244,059(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含以下的一种或多种：IMP731的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：GSK2831781的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子是IMP761(普瑞马生物医药公司)。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下的一种或多种：IMP761的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗LAG-3抗体包括在例如WO 2008/132601、WO 2010/019570、WO 2014/140180、WO 2015/116539、WO 2015/200119、WO 2016/028672、US 9,244,059、US 9,505,839(将其通过引用以其全文并入)中描述的那些。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体是与本文所述的抗LAG-3抗体之一竞争与LAG-3上的相同表位结合和/或结合至LAG-3上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抑制剂是可溶性LAG-3蛋白，例如，IMP321(普瑞马生物医药公司)，例如，如WO 2009/044273(将其通过引用以其整体并入)中所披露的。
TIM-3抑制剂
在某些实施例中，所述检查点抑制剂的抑制剂是TIM-3抑制剂。在一些实施例中，所述TIM-3抑制剂是MGB453(诺华公司)或TSR-022(泰萨罗公司)。
示例性TIM-3抑制剂
在一个实施例中，所述TIM-3抑制剂是抗TIM-3抗体分子。在一个实施例中，所述TIM-3抑制剂是抗TIM-3抗体分子，如题为“TIM-3的抗体分子及其用途”的2015年8月6日公开的US 2015/0218274(将其通过引用以其整体并入)中所披露的。
本文所述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US 2015/0218274(将其通过引用以其整体并入)中所述的方法制得。
其他示例性TIM-3抑制剂
在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子是TSR-022(安奈普泰斯生物有限公司(AnaptysBio)/泰萨罗公司)。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：TSR-022的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含以下的一种或多种：APE5137或APE5121的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。APE5137、APE5121和其他抗TIM-3抗体披露于WO 2016/161270(将其通过引用以其整体并入)中。
在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子是抗体克隆F38-2E2。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：F38-2E2的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗TIM-3抗体包括例如在WO 2016/111947、WO 2016/071448、WO 2016/144803、US 8,552,156、US 8,841,418、和US 9,163,087(将其通过引用以其全文并入)中描述的那些。
在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体是与本文所述的抗TIM-3抗体之一竞争与TIM-3上的相同表位结合和/或结合至TIM-3上的相同表位的抗体。
GITR激动剂
在某些实施例中，将所述融合多肽与GITR激动剂组合施用。在一些实施例中，GITR激动剂是GWN323(诺华公司(NVS))、BMS-986156、MK-4166或MK-1248(默克公司(Merck))、TRX518(利普治疗公司(Leap Therapeutics))、INCAGN1876(因赛特公司(Incyte)/艾吉纳斯公司(Agenus))、AMG 228(美商安进公司(Amgen))或INBRX-110(印希彼公司(Inhibrx))。
示例性GITR激动剂
在一个实施例中，所述GITR激动剂是抗GITR抗体分子。在一个实施例中，所述GITR激动剂是抗GITR抗体分子，如题为“Compositions and Methods of Use for AugmentedImmune Response and Cancer Therapy[用于增强免疫反应和癌症治疗的组合物和方法]”的2016年4月14日公布的WO 2016/057846(将其通过引用以其整体并入)中所述的。
本文所述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在WO 2016/057846(将其通过引用以其整体并入)中描述的方法制得。
其他示例性GITR激动剂
在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子是BMS-986156(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))，也称为BMS 986156或BMS986156。BMS-986156和其他抗GITR抗体披露于例如US 9,228,016和WO 2016/196792(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：BMS-986156的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子是MK-4166或MK-1248(默克公司)。MK-4166、MK-1248、和其他抗GITR抗体披露于例如，US 8,709,424、WO 2011/028683、WO 2015/026684、和Mahne等人,Cancer Res.[癌症研究]2017；77(5):1108-1118(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：MK-4166或MK-1248的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子是TRX518(利普治疗公司)。TRX518和其他抗GITR抗体披露于例如US 7,812,135、US 8,388,967、US 9,028,823、WO 2006/105021，以及Ponte J等人,(2010)Clinical Immunology[临床免疫学]；135：S96(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：TRX518的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子是INCAGN1876(因赛特公司/艾吉纳斯公司)。INCAGN1876和其他抗GITR抗体披露于例如US 2015/0368349和WO 2015/184099(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：INCAGN1876的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子是AMG 228(美商安进公司)。AMG 228和其他抗GITR抗体披露于例如US 9,464,139和WO 2015/031667(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下的一种或多种：AMG 228的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子是INBRX-110(印希彼公司)。INBRX-110和其他抗GITR抗体披露于例如US 2017/0022284和WO 2017/015623(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，GITR激动剂包含以下中的一种或多种：INBRX-110的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述GITR激动剂(例如，融合多肽)是MEDI 1873(英商梅迪缪思有限公司(MedImmune))，也称为MEDI1873。MEDI1873和其他GITR激动剂披露于例如US2017/0073386、WO 2017/025610，以及Ross等人,Cancer Res[癌症研究]2016；76(14增刊):摘要nr 561(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，所述GITR激动剂包含MEDI1873的IgG Fc结构域、功能性多聚化结构域、和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域中的一种或多种。
另外的已知GITR激动剂(例如，抗GITR抗体)包括例如在WO 2016/054638(将其通过引用以其整体并入)中描述的那些。
在一个实施例中，所述抗GITR抗体是与本文所述的抗GITR抗体之一竞争与GITR上的相同表位结合和/或结合至GITR上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，所述GITR激动剂是活化GITR信号传导途径的肽。在一个实施例中，所述GITR激动剂是与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的免疫黏附素结合片段(例如，包含GITRL的细胞外或GITR的结合部分的免疫黏附素结合片段)。
IL15/IL-15Ra复合物
在某些实施例中，将所述融合多肽与IL-15/IL-15Ra复合物组合施用。在一些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物选自NIZ985(诺华公司)、ATL-803(亚拉斯托公司(Altor))或CYP0150(Cytune公司)。
示例性IL-15/IL-15Ra复合物
在一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含人IL-15与可溶形式的人IL-15Ra复合。所述复合物可以包含共价或非共价连接至IL-15Ra的可溶性形式的IL-15。在具体的实施例中，人IL-15非共价地与可溶形式的IL-15Ra结合。在具体是实施例中，组合物中的人IL-15包含如在WO 2014/066527(通过引用以其整体并入)中所述的氨基酸序列。本文所述的这些分子可以通过载体、宿主细胞、和在WO 2007/084342中描述的方法制得，该申请通过引用以其整体并入。
其他示例性IL-15/IL-15Ra复合物
在一个实施例中，所述IL-15/IL-15Ra复合物是ALT-803(IL-15/IL-15Ra Fc融合多肽(IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc可溶性复合物))。ALT-803披露在WO 2008/143794中，通过引用以其整体并入。
在一个实施例中，所述IL-15/IL-15Ra复合物包含与IL-15Ra的sushi结构域融合的IL-15(CYP0150，赛腾制药)。IL-15Ra的sushi结构域是指在IL-15Ra的信号肽之后的第一半胱氨酸残基处开始并且在所述信号肽之后的第四个半胱氨酸残基处结束的结构域。与IL-15Ra的sushi结构域融合的IL-15的复合物披露在WO 2007/04606和WO 2012/175222中，这些申请通过引用以其全文并入。
筛选方法
本发明包括鉴定与特定生物学表型相关的遗传元件，例如，与障碍(例如癌症)的发展和/或进展相关的遗传元件的方法。所述方法包括以下步骤：(i)通过将细胞暴露于COF1、COF2或COF3，调节融合多肽在所述细胞(例如，宿主细胞)中的表达；(ii)选择具有目的表型，例如与障碍(例如，癌症)的发展和/或进展相关的表型的细胞，和(iii)鉴定诱导目的表型的融合多肽，其中所述细胞暴露于COF1、COF2或COF3将所述融合多肽的表达相对于在暴露于COF1、COF2或COF3之前所述融合多肽的表达水平降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
治疗受试者的方法
在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，所述方法包括施用融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和目的异源多肽)或表达如本文所述制造的融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，任选地与一种或多种其他的疗法组合施用。在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，所述方法包括施用包含融合多肽或表达如本文所述的融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)的反应混合物，任选地与一种或多种其他的疗法组合施用。在一些方面，本披露提供了运送或接收反应混合物的方法，所述反应混合物包含融合多肽或表达如本文所述的融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)。
在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，所述方法包括接收融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和目的异源多肽)或表达如本文所述制造的融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，并且进一步包括向患者施用所述融合多肽或表达所述融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，任选地与一种或多种其他的疗法组合施用。在一些方面，本披露提供了治疗患者的方法，所述方法包括制造融合多肽或表达如本文所述的融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，并且进一步包括向所述患者施用融合多肽或表达所述融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，任选地与一种或多种其他的疗法组合施用。所述其他的疗法可以是例如癌症疗法(例如化疗)。
本文所述的这些方法可以进一步包括在药物组合物中配制所述融合多肽(例如，包含COF1/CRBN-、COF2/CRBN-或COF3/CRBN结合多肽和目的异源多肽)或表达所述融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)。药物组合物可以包含融合多肽或表达所述融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，例如如本文所述，多个融合多肽或表达所述融合多肽的细胞(例如，表达CAR的细胞)，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。可以配制组合物，例如，用于静脉内施用。
在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗癌症有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物以104至109个细胞/kg体重、在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括至少约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括高达约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括约1.1x106-1.8x107个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括至少约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，CD19CAR细胞)的剂量包括高达约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在某些方面，可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后随后重抽血液(或进行单采术)，从其活化免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并用这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)回输患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。
在实施例中，将表达CAR的细胞(例如，CD19表达CAR的细胞)以多个剂量(例如，第一剂量、第二剂量、和任选第三剂量)施用。在实施例中，所述方法包括治疗患有癌症(例如急性淋巴细胞白血病(ALL))的受试者(例如，成人受试者)，包括向受试者施用第一剂量、第二剂量、和任选地一个或多个另外的剂量，每个剂量包含表达CAR分子(例如CD19CAR分子)的免疫效应细胞。
在实施例中，所述方法包括施用剂量为2-5x106个活的表达CAR的细胞/kg，其中受试者具有小于50kg的体重；或施用剂量为1.0-2.5x108个活的表达CAR的细胞，其中受试者具有至少50kg的体重。
在实施例中，向受试者(例如儿科受试者)给予单剂量。
在实施例中，在顺序的天数给予这些剂量，例如在第1天给予第一剂量，在第2天给予第二剂量，并且在第3天给予任选的第三剂量(如果给予)。
在实施例中，给予第四、第五、或第六剂量、或更多剂量。
在实施例中，第一剂量占总剂量的约10％，第二剂量占总剂量的约30％，并且第三剂量占总剂量的约60％，其中上述百分比的总和为100％。在实施例中，第一剂量占总剂量的约9％-11％、8％-12％、7％-13％、或5％-15％。在实施例中，第二剂量占总剂量的约29％-31％、28％-32％、27％-33％、26％-34％、25％-35％、24％-36％、23％-37％、22％-38％、21％-39％、或20％-40％。在实施例中，第三剂量占总剂量的约55％-65％、50％-70％、45％-75％、或40％-80％。在实施例中，总剂量是指在1周、2周、3周、或4周的过程中给予的活表达CAR的细胞的总数量。在其中给予两个剂量的一些实施例中，总剂量是指在第一和第二剂量中向受试者给予的活表达CAR的细胞的数量总和。在其中给予三个剂量的一些实施例中，总剂量是指在第一、第二、和第三剂量中向受试者给予的活表达CAR的细胞的数量总和。
在实施例中，根据其中活表达CAR的细胞的数量测量剂量。可以例如通过使用结合CAR分子的抗体分子和可检测标记的流式细胞术测量CAR表达。可以例如通过Cellometer测量活力。
在实施例中，以递增剂量给予活表达CAR的细胞。在实施例中，第二剂量大于第一剂量，例如大于10％、20％、30％、或50％。在实施例中，第二剂量是第一剂量大小的两倍、三倍、四倍、或五倍。在实施例中，第三剂量大于第二剂量，例如大于10％、20％、30％、或50％。在实施例中，第三剂量是第二剂量大小的两倍、三倍、四倍、或五倍。
在某些实施例中，所述方法包括以下a)-h)中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部：
a)以第一剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于以第二剂量给予的表达CAR的活细胞数量的1/3；
b)以第一剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于给予的表达CAR的活细胞总数量的1/X，其中X是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50；
c)以第一剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于1x107、2x107、3x107、4x107,5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、或5x108个表达CAR的活细胞，并且第二剂量大于第一剂量；
d)以第二剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于以第三剂量给予的表达CAR的活细胞数量的1/2；
e)以第二剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于给予的表达CAR的活细胞总数量的1/Y，其中Y是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50；
f)以第二剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于1x107、2x107、3x107、4x107,5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、或5x108个表达CAR的活细胞，并且第三剂量大于第二剂量；
h)选择第一、第二、和任选第三剂量的给予剂量和时间段，使得受试者经历的CRS水平不大于4、3、2、或1。
在实施例中，总剂量是约5x108个表达CAR的活细胞。在实施例中，总剂量是约5x107-5x108个表达CAR的活细胞。在实施例中，第一剂量是约5x107个(例如±10％、20％、或30％)表达CAR的活细胞，第二剂量是约1.5x108个(例如±10％、20％、或30％)表达CAR的活细胞，并且第三剂量是约3x108个(例如±10％、20％、或30％)表达CAR的活细胞。
在实施例中，在接受一定剂量后，例如在接受第一剂量、第二剂量、和/或第三剂量后，评估受试者的CRS。
在实施例中，受试者接受CRS治疗，例如托珠单抗、皮质类固醇、依那西普、或siltuximab。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第一剂量之前或之后给予CRS治疗。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第二剂量之前或之后给予CRS治疗。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第三剂量之前或之后给予CRS治疗。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第一与第二剂量之间，和/或在包含CAR分子的细胞的第二与第三剂量之间给予CRS治疗。
可以按任何方便的方式进行受试者组合物的施用。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内(例如，通过皮内或皮下注射)施用本文描述的组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与减少TREG细胞群的分子组合施用至受试者。减少(例如，耗减)TREG细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25耗减、环磷酰胺施用、调节GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采术之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的TREG细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。
在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子(如GITR激动剂和/或耗减调节性T细胞(TREG)的GITR抗体)组合施用至受试者。在实施例中，将表达本文所述CAR的细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一个实施例中，在表达CAR的细胞施用之前，施用GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或消耗Treg的GITR抗体)。例如，在一个实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采术之前施用。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺施用于受试者。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采术之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用于受试者。在一个实施例中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液学癌症，如ALL或CLL)。在一个实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有ALL。在实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌。示例性GITR激动剂包括，例如，GITR融合多肽和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如描述于以下中的GITR融合多肽：美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、美国专利号：8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754，或描述于以下中的抗GITR抗体：例如美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO 2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO 2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO 99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公开号：WO 2011/051726中。
在一个实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)组合施用于受试者。在一个实施例中，在表达CAR的细胞之前施用GITR激动剂。例如，在一个实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采术之前施用。在一个实施例中，受试者患有CLL。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
实例1：通过萤光素酶测定对基于IKZF3的降解标签进行评估
在此实例中，测试基于IKZF3的降解标签促进靶蛋白的来那度胺依赖性降解的能力。基于IKZF3的降解标签包括人IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249，并且包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。该标签在本文中被称为“IKZF3 136-180和236-249”或“HilD-标签”。将IKZF3 136-180和236-249通过16GS接头GGGGSGGGGTGGGGSG(SEQ ID NO:28)与纳米萤光素酶的N-末端融合(图1A)。使用总共为0ng、5ng、50ng或250ng DNA(此处DNA值是基于384孔，25μl转染，然后按比例放大至6孔培养皿)，将编码带IKZF3 136-180和236-249标签的纳米萤光素酶的pNL1.1CMV载体反转染到HEK293T细胞中。
使经转染的细胞接受用128ng/mL环己酰胺、12.8ng/mL环己酰胺或10μM MG132的1小时预处理，然后用0μM、1μM、10μM或100μM来那度胺处理2、4或6小时。DMSO被包括作为媒介物对照。通过在
Figure BDA0002541415150004781
上用1秒和5秒曝光对每个384孔板读数来测量发光。将数据导入
Figure BDA0002541415150004782
并根据下式通过进行NC3归一化进行可视化：100*([发光]/[DMSO])。
包括IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249的降解标签可以促进靶蛋白的来那度胺依赖性降解(图1B)。IKZF3 136-180和236-249促进了在所有测试的DNA浓度下观察到的纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解。在用5ng的DNA转染的细胞中观察到最大降解(约60％)(图1B)。重要的是，来那度胺依赖性降解被MG132处理阻断，这表明靶蛋白的来那度胺依赖性降解是蛋白酶体依赖性的(图1B)。用环己酰胺处理未观察到来纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解的明显减少(数据未显示)。
实例2：通过蛋白质印迹对基于IKZF3的降解标签进行评估
通过蛋白质印迹评估IKZF3 136-180和236-249促进的纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解。将以上所述的编码带IKZF3 136-180和236-249标签的纳米萤光素酶的pNL1.1CMV载体转染到中293GT细胞和293GT小脑蛋白(CRBN)敲除(KO)细胞中。然后将经转染的细胞在37℃下，用100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM或0.001μM来那度胺，或DMSO处理一小时。在用100μM来那度胺处理之前，将预处理样品用在37℃下用10μM MG132处理一小时。将样品沉淀，溶解，在蛋白质凝胶上运行，转移到膜上，用抗体探测并用薄膜显影。
数据进一步表明，IKZF3 136-180和236-249可以随来那度胺浓度的增加而促进靶蛋白的来那度胺依赖性降解(IC50＝约10nM)(图2)。在经转染的293GT CRBN KO细胞或在用MG132预处理的细胞中，未观察到纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解(图2)。这些数据表明具有IKZF3 136-180和236-249标签的靶蛋白的来那度胺依赖性降解是CRBN和蛋白酶体依赖性的。
实例3：基于变体IKZF3的降解标签的设计和评估
为测定较短的基于IKZF3的降解标签是否可以促进靶蛋白的来那度胺依赖性降解，设计以下基于IKZF3的降解标签：“IKZF3 136-180”，其包括IKZF3的氨基酸残基136-180(包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的标签)；“IKZF3 145-170”，其包括IKZF3的氨基酸残基145-170(包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的标签)；和“IKZF3 140-169”，其包括IKZF3的氨基酸残基140-169(包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的标签)。
另外地，使用以下策略修饰基于IKZF3的降解标签：
(1)缺失N-末端的和/或C-末端的氨基酸残基；
(2)替换氨基酸残基236-249，其对应于具有MALEKMALEKMALE的氨基酸序列(SEQID NO:91)的IKZF3的α螺旋；和/或
(3)使在IKZF3的α螺旋中氨基酸位置245处的赖氨酸残基突变为精氨酸或丝氨酸(即，根据SEQ ID NO:19编号，通过掺入K245R或K245S突变)。
将基于这些变体IKZF3的降解标签与纳米萤光素酶的N-末端融合，并克隆到pNL1.1CMV载体中，所述载体具有CMV启动子。将5ng(对于不包括SEQ ID NO:19的残基236-249的全部标签)或50ng(对于包括SEQ ID NO:19的残基236-249的全部标签)的每个构建体转染到中HEK293T细胞中。在37℃下，将经转染的细胞用100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM或0.001μM来那度胺，或DMSO对照处理2-4小时。在用100μM来那度胺处理之前，将预处理样品用在37℃下用10μM MG132处理一小时。使用如在实例2中所述的蛋白质印迹测量蛋白质降解。
将来自两个研究的结果描述如下。
在第一个研究中，IKZF3 136-180和236-249(包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的标签)促进纳米萤光素酶的来那度胺依赖性降解(图3B)。将位置245处(根据SEQ ID NO:19编号)的赖氨酸残基突变为精氨酸(包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的标签)或丝氨酸(包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的标签)没有显著影响标签介导降解的能力(图3B)。类似地，IKZF3 136-180MALEK(包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的标签)和IKZF3 136-170MALEK(包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的标签)(其中残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)被螺旋MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)置换)也保持促进来那度胺依赖性降解的能力(图3B)。相反，IKZF3 140-170MALEK(包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的标签)、IKZF3 141-163MALEK(包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的标签)、和IKZF3 145-155MALEK(包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的标签)不介导来那度胺诱导的降解(图3B)，这表明对于降解需要至少前四个氨基酸HKRS(SEQ ID NO:40)(根据SEQ ID NO:19编号，位置136-139)。
在第二个研究中，将表达带IKZF3 136-180标签的纳米萤光素酶或带IKZF3 136-170MALEK标签的纳米萤光素酶的细胞用不同剂量的来那度胺处理2小时，并使用如上所述的蛋白质印迹进行分析。两个标签能够介导来那度胺依赖性降解(图4A和4B)。降解水平随着来那度胺浓度的增加而增加(图4A和4B)。此外，在蛋白质印迹分析之前，将表达带IKZF3136-180标签的纳米萤光素酶的细胞用10μM来那度胺处理加长的时间量。降解最早在1小时之前就很明显，到4小时接近完全(图4C)。
实例4：对结合至转录因子的基于IKZF3的降解标签进行评估
通过蛋白质印迹，对基于IKZF3的降解标签促进黑素原生成相关转录因子(MITF)或禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因(MYC)同系物的降解的能力进行评估。除了基于IKZF3的降解标签，还将MITF和MYC与FLAG标签融合以促进使用抗FLAG抗体对其进行检测。
在第一研究中，检测带IKZF3 136-180和236-249标签的MITF或带IKZF3 136-180标签的MITF对来那度胺依赖性降解的敏感性。将细胞使用编码带标签的MITF融合物的pNL1.1CMV构建体进行转染，并用不同浓度的来那度胺处理4小时，或用10μM来那度胺处理不同的时间，然后使细胞经历蛋白质印迹分析。在用100μM来那度胺处理之前，将一些细胞用MG132处理。DMSO被用作媒介物对照。如图5A和5B中所示，在介导MITF的来那度胺依赖性降解方面，IKZF3 136-180和236-249比IKZF3 136-180更有效。降解水平与来那度胺的浓度(图5A)和来那度胺处理的时间长度(图5B)相关，这表明可以通过给予来那度胺来微调残余靶蛋白水平的水平。
在第二研究中，对不含赖氨酸的IKZF3 136-180和236-249(IKZF3136-180和236-249的变体，其中标签中的每个赖氨酸残基突变为精氨酸)(包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的标签)测试其介导来那度胺依赖性降解的能力。不希望受理论的束缚，如果来那度胺依赖性降解主要经由靶蛋白(在该实例中是MITF)的泛素化介导，而不是基于IKZF的标签本身介导，用精氨酸置换标签中的全部赖氨酸残基对降解水平可能不具有显著影响。如图6A、6B、6C和6D所示，置换IKZF3 136-180和236-249降解标签中的全部赖氨酸残基没有显著性影响此标签介导MITF的来那度胺依赖性降解的能力，表明带标签的MITF的降解主要是通过MITF的泛素化，而不是标签本身。来那度胺和泊马度胺二者有效促进带标签的MITF的降解(图6D)。
在第三研究中，对IKZF3 136-180Q147H(IKZF3 136-180的变体，其中基于SEQ IDNO:19的编号，在位置147处的谷氨酰胺残基被组氨酸置换)(SEQ ID NO:27)进行测试。已经显示在位置147处的谷氨酰胺对于IMiD诱导的CRBN结合和IKZF1或IKZF3的降解是必需的(
Figure BDA0002541415150004811
等人.,Science.[科学]2014年1月17日；343(6168):301-5，通过引用以其整体并入本文)。如预期，Q147H取代阻断了IKZF3 136-180介导MITF的来那度胺依赖性降解的能力(图7)。
在第四研究中，对IKZF3 136-180和236-249介导另一个转录因子禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因(MYC)同系物的来那度胺依赖性降解的能力进行检测。将用融合分子转染的HEK293T细胞(其中将IKZF3 136-180和236-249与MYC的N-末端融合)用不同浓度的来那度胺处理4小时。通过蛋白质印迹，使用抗FLAG抗体，对也与FLAG标签融合的带标签的MYC的水平进行评估。如图8所示，IKZF3 136-180和236-249也介导带标签的MYC的来那度胺依赖性降解。降解的水平与来那度胺的浓度相关(图8)。
实例5：通过蛋白质印迹，对结合至跨膜蛋白质的基于IKZF3的降解标签进行评估
对基于IKZF3的降解标签促进单通膜细胞表面蛋白质CD3ζ、CD8、CD8/CD3ζ、CD19和CD22的来那度胺依赖性降解的能力进行评估。使用16GS接头GGGGSGGGGTGGGGSG(SEQ IDNO:28)，将IKZF3136-180和236-249标签(包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的标签)与单通膜蛋白的C-末端融合。从购自基维斯公司(Genewiz)的带IKZF3136-180和236-249标签的CD3ζ、CD8、CD8/CD3ζ、CD19和CD22大量制备物(maxi preps)产生病毒。在通过蛋白质印迹分析之前，将稳定的Jurkat细胞系用病毒转导，并用10μM来那度胺处理4小时。所有带标签的膜蛋白进一步包含V5标签以促进使用抗V5抗体对它们的检测。
如图9A、9B、9C和9D所示，所有经测试的构建体均对来那度胺依赖性降解敏感，尽管敏感性水平在所述构建体之间发生变化。有趣地，来那度胺依赖性降解的水平和靶蛋白中胞质氨基酸的数量之间似乎存在相关性(图9A)，因为胞质液中具有更多氨基酸的靶蛋白被更大程度地降解。
总之，这些数据表明在来那度胺的存在下，基于IKZF3的降解标签可能能够介导CD蛋白(并且通常是单通膜蛋白)的降解。
实例6：通过流式细胞术，对结合至跨膜蛋白的基于IKZF3的降解标签进行评估
通过流式细胞术，对来那度胺处理对于与基于IKZF3的降解标签融合的靶蛋白的剂量应答性作用进行评估。特别地，进行流式细胞术分析以确定在降解的靶蛋白的总量与在细胞表面上表达的靶蛋白的总量之间是否存在差异。
在用1μM或10μM来那度胺处理后0、1、6、16和24小时，通过流式细胞术对表达带IKZF3 136-180和236-249标签的CD19的Jurkat细胞进行分析。将CD19用抗人CD19抗体(BD制药公司(BD Pharmingen)555413)染色。
90％经转导的Jurkat细胞在表面上表达CD19，其中在亲本Jurkat细胞上没有可检测的CD19表达(图10E)。将细胞用来那度胺处理16小时或24小时后，观察到在平均荧光强度(MFI)和CD19表达百分比方面的降低，这可以通过MG132处理阻断(图10C、10D、10E和10F)。这与在实例5中所述的蛋白质印迹分析中看到的不同，后者显示10μM来那度胺处理6小时后，在CD19水平方面的大幅降低。
这些数据表明，可以将基于IKZF3的降解标签用于选择性降解单通跨膜蛋白。
实例7：通过蛋白质印迹，对与HilD标签和/或FurON融合的嵌合抗原受体(CAR)进 行评估
在该实例中，将抗CD19嵌合抗原受体CAR19用HilD标签和/或弗林蛋白酶降解决定子(FurON)修饰。当与CAR分子融合时，FurON可以充当开关。FurON包含两种组分：(1)降解决定子或降解结构域，所述降解决定子或降解结构域是在不存在小分子配体(例如，巴多昔芬)的情况下不能获得适当构象的突变的蛋白质结构域，和(2)弗林蛋白酶切割位点(图11)。不希望受理论的束缚，在不存在小分子配体(例如，巴多昔芬)的情况下，错折叠/解折叠的降解结构域可通过细胞内降解途径与融合至所述降解结构域的CAR分子一起被降解(图11)。在小分子配体(例如，巴多昔芬)的存在下，所述降解结构域呈现适当的构象，导致弗林蛋白酶切割位点的暴露以及降解结构域的去除(图11)。在一些实施例中，FurON开关可以与HilD开关组合(图12C)。在毒性的存在下，将这两个开关组合可以提高关闭CAR表达和活性的速度(图12C)。
将编码带HilD标签的CAR19的多核苷酸序列克隆到pNGx-LV_v002慢病毒表达载体中。根据IDT安排gBlock。表24提供了有关这些gBlock的信息。构建体765从N-末端至C-末端包含信号肽、FurOn和CAR19。构建体766从N-末端至C-末端包含信号肽、FurON、CAR19、16GS接头、HilD标签和V5。构建体767从N-末端至C-末端包含信号肽、FurON、CAR19、16GS接头和HilD标签。构建体768从N-末端至C-末端包含信号肽、CAR19、16GS接头、HilD标签和V5。构建体769从N-末端至C-末端包含信号肽、CAR19、16GS接头和HilD标签。构建体770从N-末端至C-末端包含信号肽、CAR19、16GS接头和不含赖氨酸的HilD标签。在不含赖氨酸的HilD标签(表24中显示为“HilD标签_NoK”)中，标签中的每个赖氨酸残基已经被精氨酸置换。构建体771从N-末端至C-末端包含信号肽、CAR19、HilD标签和V5。构建体6761从N-末端至C-末端包含信号肽、CAR19、16KGS接头、HilD标签和V5。构建体773从N-末端至C-末端包含经修饰的信号肽、HilD标签、弗林蛋白酶切割位点和CAR19。构建体774从N-末端至C-末端包含信号肽、HilD标签、弗林蛋白酶切割位点和CAR19。简言之，将gBlock消化，使用Qiagen MinElutePCR纯化试剂盒(目录号28004)纯化，并连接到pNGx-LV_v002慢病毒表达载体中。通过测序确认所得克隆。
表24.gBlock的组分
Figure BDA0002541415150004841
Figure BDA0002541415150004851
从大量制备物(maxi preps)制备病毒，并用于转导JNL细胞。将275μL病毒上清液或700μL病毒上清液用于转导。JNL细胞是用在NFAT启动子的控制下的萤光素酶基因工程改造的Jurkat细胞。在存在或不存在来那度胺处理的情况下，使用蛋白质印迹检测经转导的JNL细胞的CAR表达。
简言之，将细胞在6孔培养皿中稀释为3mL中总共0.5x106。将每个细胞系铺板到两个孔(一个针对DMSO，一个针对10μM来那度胺处理)。将巴多昔芬按终浓度为1μM添加至每个孔，所述孔包含表达含有FurON的融合物的细胞系。对于所有细胞系，添加10μM终浓度来那度胺或DMSO。将细胞在37℃下和5％CO2下孵育过夜。
化合物处理后24小时，将细胞沉淀，用PBS洗涤，并用含有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)04693124001)的50μL RIPA缓冲液(波士顿生物产品公司(Boston Bioproducts)BP-115D)裂解。将裂解物离心，将上清液转移至新试管中，并通过劳利测定法(LowryAssay)(伯乐公司(BioRad)5000111)读取蛋白量。用4X样品缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)NP0007)和10X还原剂(赛默飞世尔科技公司NP0009)，将每个样品标准化为在20μL体积中的30μg总蛋白。使用按1:1000稀释的小鼠抗V5抗体(赛默飞世尔科技公司MA5-15253)、按1:10000稀释的小鼠抗肌动蛋白抗体(西格玛奥德里奇公司A5441)，和/或按1:1000稀释的小鼠抗CD3z抗体(BD 551034)，使样品经历蛋白质印迹分析。
如预期，来那度胺对没有HilD标签的FurON-CAR19没有任何影响(图13A)。在HilD标签的存在下，无论是否存在V5标签，用10μM来那度胺处理几乎完全降解FurON-CAR19(图13B和13C)。无论是否存在16GS接头或V5标签，10μM来那度胺处理还几乎完全降解全部的CAR19-HilD构建体(图14A-14C)。包含不含赖氨酸的HilD标签(HilD标签中的每个赖氨酸残基被精氨酸置换)的构建体770的来那度胺依赖性降解(图14D)表明CAR19的降解主要通过CAR19本身的泛素化介导而不是HilD标签介导。
接下来，通过蛋白质印迹检测CAR19降解的动力学以及用于降低CAR19表达的有效来那度胺剂量。将表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞在6孔培养皿中稀释为3mL中总共0.5x106。将每个细胞系铺板到针对来那度胺处理/时间点的多个孔中。将细胞铺板后，用不同剂量(10μM、1μM、0.1μM、0.01μM或0.001μM)的来那度胺或DMSO将样品处理不同的时间。收获细胞并使用按1:10000稀释的小鼠抗肌动蛋白抗体(西格玛奥德里奇公司A5441)或按1:1000稀释的小鼠抗CD3ζ抗体(BD 551034)如上所述使所述细胞经历蛋白质印迹。
10μM来那度胺以时间依赖性方式降解CAR19-16GS-HilD-标签融合蛋白(图15A)。降解早在4小时就很明显，并且似乎在8小时达到最大降解(图15A)。降解水平在8-24小时是稳定的，其中没有蛋白表达的明显反弹(图15A)。
如图15B所示，来那度胺在低至100nM的浓度降解CAR19-16GS-HilD-标签融合蛋白。在高于100nM的每个化合物剂量下CAR19降解是明显的(图15B)，表明不存在化合物钩挂效应(hook-effect)。在较低来那度胺浓度处观察到的蛋白质降解的滴定表明所述降解是可调节的，并且可以通过调整来那度胺的剂量来调节精确的CAR19水平。
实例8：通过流式细胞术，对与HilD标签和/或FurON融合的嵌合抗原受体(CAR)进 行评估
接下来，通过流式细胞术检测CAR19在稳定转导的JNL细胞上的表面表达。在第1天，将转导的JNL细胞在不具有来那度胺或具有10μM来那度胺的情况下铺板24小时。在存在或不存在巴多昔芬的情况下，将表达FurON-CAR19构建体的细胞与或不与来那度胺进行培养。在第2天，将细胞收获，使用生物素化的蛋白L(金斯瑞公司(Genscript)，M00097)染色，然后用PE缀合的链霉亲和素(杰克逊实验室(Jackson Lab)，016-110-084)染色，并使用Fortessa仪器经历流式细胞术分析。
对于其中HilD标签与CAR19的C-末端融合的分子(构建体769、771、6761、768和770)，经转导的细胞在超过60％的细胞中均显示出CAR表达(图16A、16B、16C、16D和16E)。在亲本JNL细胞上未检测到CAR表达(图16A、16B、16C、16D和16E)。用10μM来那度胺处理24小时显著降低了表面CAR表达(图16A、16B、16C、16D和16E)。值得注意地，不含赖氨酸的HilD标签也介导表面CAR表达的来那度胺依赖性降低(图16E)。
对于其中HilD标签与弗林蛋白酶切割位点融合，并然后与CAR19的N-末端融合的分子(构建体773和774)，经转导的细胞显示CAR表达(图16F和16G)。与10μM来那度胺孵育24小时不影响表面CAR表达(图16F和16G)。
此外，在巴多昔芬和/或来那度胺的调节下，检测具有或不具有HilD标签的FurON-CAR19构建体的表面表达。如图17A、17B和17C所示，仅在巴多昔芬的存在下，检测到表面CAR表达，并且仅当CAR19与HilD标签融合时，观察到表面CAR水平的来那度胺依赖性降低。
表25提供了在图16A、16B、16C、16D、16E、16F、16G、17A、17B和17C中所示的流式细胞术数据的总结。
表25.对流式细胞术数据的总结
Figure BDA0002541415150004871
Figure BDA0002541415150004881
接下来，在来那度胺的剂量滴定的存在下，通过流式细胞术检测表面CAR表达。简言之，将用构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)或构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)稳定转导的JNL细胞与8个不同浓度的来那度胺(以2μM开始持续4小时处理或以1μM开始持续20小时处理)一起孵育，以确定剂量应答作用。如上所述，然后使用生物素化的蛋白质L(金斯瑞公司，(Genscript)M00097)，随后使用PE缀合的链霉亲和素(杰克逊实验室(JacksonLab)，016-110-084)，将这些细胞通过流式细胞术进行分析。
针对4小时处理组的结果显示在图18A和18B以及表26中。针对20小时处理组的结果显示在图18C、18D、18E和18F以及表27中。在4小时来那度胺处理后，检测到MFI降低，其中CAR表达％(表达CAR的细胞％)略有降低(表26)。在20小时处理后，来那度胺以剂量依赖性方式更显著地降低了CAR表达％和MFI(表27，图18E和18F)。在来自构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的结果与来自构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)的结果之间不存在显著差异，这表明泛素化可能主要经由靶蛋白中的赖氨酸残基发生，而不是在HilD标签本身中发生。
表26.4小时处理后来那度胺的作用
Figure BDA0002541415150004882
Figure BDA0002541415150004891
表27.20小时处理后来那度胺的作用
Figure BDA0002541415150004892
实例9：使用功能性读出，对与HilD标签和/或FurON融合的嵌合抗原受体(CAR)进 行评估
在该实例中，进行了许多研究来测定当用HilD加标签时CAR19和FurON-CAR19是否具有功能，并且由来那度胺诱导的降解是否足以消除在Jurkat细胞中CAR19的功能。
该研究使用了以上所述的JNL细胞系，所述细胞系是用NFAT萤光素酶报告子修饰的Jurkat细胞系。表达CAR19的JNL细胞和表达CD19的B细胞的共培养活化NFAT信号传导，导致萤光素酶表达。
在第一研究中，将表达构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)或构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞铺板。将表达构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞用1μM巴多昔芬孵育。将所有的JNL细胞用10μM来那度胺处理4小时或24小时。将来那度胺处理的JNL细胞与Nalm6细胞、K562细胞或表达CD19的K562细胞孵育4小时、8小时或20小时。按照制造商的方案，将样品用Brightglo(普洛麦格公司(Promega)E2620)处理，并且在铂金埃尔默公司(Perkin Elmer)Viewlux中用5秒或40秒的曝光读取发光。
如预期，仅在当表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞与CD19+靶细胞(Nalm6细胞和表达CD19的K562细胞)共培养时观察到发光信号(图19A)。在每种情况下，除了4小时来那度胺/4小时靶细胞处理之外，来那度胺处理将发光信号降低至背景水平(图19A)。一个可能的解释是为了在此NFAT萤光素酶报告子测定中降低发光信号，必须将表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞用来那度胺处理超过8小时。在减去背景信号(来自培养基样品的信号)后，来那度胺处理在与表达CD19的K562细胞共培养的表达CAR的JNL细胞中将发光信号降低了约95％，并且在与Nalm6细胞共培养的表达CAR的JNL细胞中将发光信号降低了约88％。该数据表明，在来那度胺的存在下，HilD-标签足以显著降低CAR19功能。
类似地，在巴多昔芬的存在下，仅在当表达构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞与CD19+细胞(Nalm6细胞和表达CD19的K562细胞)共培养时观察到发光信号(图20A)。在巴多昔芬共处理的样品中，来那度胺处理将发光信号降低至背景(图20A)。在减去背景信号(来自培养基样品的信号)后，来那度胺处理在与表达CD19的K562细胞共培养的表达CAR的JNL细胞中将发光信号降低了约90％，并且在与Nalm6细胞共培养的表达CAR的JNL细胞中将发光信号降低了约83％(图20B)。该数据表明，对于通过FurON和HilD标签修饰的CAR19构建体，所述CAR19的功能可以通过巴多昔芬处理增强，并然后通过来那度胺处理降低。
进行第二研究以测定带HilD标签的CAR19或FurON-CAR19对来那度胺依赖性降解的敏感性。将表达构建体765(FurON_CAR19)、构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)、构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)或构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)的JNL细胞铺板。将表达构建体765(FurON_CAR19)或构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞用1μM巴多昔芬孵育。存在三个处理组：“靶细胞前20hr”(总共44小时来那度胺处理)、“靶细胞前4hr”(总共28小时来那度胺处理)和“靶细胞后16hr”(总共8小时来那度胺处理)。对于“20hr前靶细胞”组，在添加巴多昔芬后三小时，将MG132(10μM终浓度)添加至转导的JNL细胞；在添加MG132后一小时，添加来那度胺；并且在添加来那度胺后20小时，添加K562细胞或表达CD19的K562靶细胞。对于“4hr前靶细胞”组，在添加巴多昔芬后19小时，将MG132(10μM终浓度)添加至转导的JNL细胞；在添加MG132后一小时，添加来那度胺；并且在添加来那度胺后4小时，添加K562细胞或表达CD19的K562靶细胞。对于“靶细胞后16hr”组，在添加巴多昔芬后24小时，将K562细胞或表达CD19的K562靶细胞添加至转导的JNL细胞；在添加靶细胞后15小时，添加MG132(10μM终浓度)；并且在添加MG132后1小时，添加来那度胺。对于靶细胞共培养物，将K562细胞或表达CD19的K562细胞添加至含有JNL细胞的每个孔中，并且在37℃和5％CO2下的培养箱中在GNF系统超高通量筛选系统上进行培养。在添加K562细胞或表达CD19的K562细胞后24小时，按照制造商的方案，将样品用Brightglo(普洛麦格公司(Promega)E2620)处理，并且在铂金埃尔默公司(Perkin Elmer)Viewlux中用5秒曝光读取发光。
如预期，转导的JNL细胞仅对表达CD19的K562细胞产生应答，而不对K562细胞产生应答(图21A、21B、21C和21D)。在没有HilD标签的情况下，来那度胺处理对报告子应答没有影响(图21A)。在巴多昔芬的存在下，表达构建体767(FurON_CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞在与表达CD19的K562细胞共培养后显示报告子活化，并且这种报告子活化由来那度胺以剂量依赖性方式抑制(图21B)。IC50的范围在从约5μM至0.1μM。来那度胺的IC50随时间转变为降低的效力，其中最高IC50是在8小时处理时(“靶细胞后16hr”，在图21B中)，并且最低IC50是在44小时处理时(“靶细胞前20hr”，在图21B中)。在44小时处理组(“靶细胞前20hr”，在图21B中)和28小时处理组(“b-细胞前4hr”，在图21B中)中，最高剂量的来那度胺将发光信号降低了100％，并且在8小时处理组(“靶细胞后16hr”，在图21B中)中降低了90％。来那度胺还在表达构建体769(CAR19_16GS_HilD标签)的JNL细胞中以剂量依赖性方式抑制NFAT-萤光素酶报告子活化(图21C)。IC50的范围在从1μM至0.05μM，其中所述IC50随着增加的来那度胺处理时间而降低。最高2-3个剂量的来那度胺(10μM、3.16μM和1μM)将发光信号降低了几乎100％(图21C)。类似地，来那度胺在表达构建体770(CAR19_16GS_HilD标签_NoK)的JNL细胞中剂量依赖性地抑制报告子活化(图21D)。IC50的范围在从1μM至0.05μM，其中所述IC50随着增加的来那度胺处理时间而降低。最高2-3个剂量的来那度胺(10μM、3.16μM和1μM)将信号降低了几乎100％(图21D)。对于与不含赖氨酸的HilD标签融合的CAR19观察到的该应答与对于与野生型HilD标签融合的CAR19观察到的应答类似，这表明CAR19的降解主要是由于在CAR19上的赖氨酸残基的泛素化，而不是在HilD标签上的赖氨酸残基的泛素化。
28小时、10μM来那度胺处理导致在所有表达带HilD标签的CAR分子的细胞系中CAR19表达的降低，并且这种降低可以被蛋白酶体抑制剂MG132部分挽救(数据未显示)。不能直接比较表达不同构建体的JNL细胞，因为它们具有不同水平的CAR表达，导致对CD19+细胞的不同应答水平。替代地，在相同的细胞系中的处理之间进行比较(图22A、22B、22C和22D)。对于包含FurON的构建体，在CD19+细胞的存在下，需要巴多昔芬处理以活化NFAT-萤光素酶报告子(图22A和22B)。在不存在HilD标签的情况下，来那度胺处理不影响发光信号，并且MG132可以增加信号(图22A)。在HilD标签的存在下，来那度胺处理将CD19诱导的报告子活化几乎降低至背景水平(约80％)，并且这种降低可以被蛋白酶体抑制剂MG132大部分挽救(图22B)。不包含FurON的构建体不需要巴多昔芬用于报告子活化(图22C和22D)。表达带HilD标签的CAR19或带不含赖氨酸的HilD标签的CAR19的JNL细胞共享对来那度胺的类似应答：CD19诱导的NFAT报告子信号被来那度胺显著降低，并且这种降低可以被MG132部分挽救(图22C和22D)。
实例10：对带HilD标签的Tau蛋白进行评估
方法
构建体
通过合成基因块(IDT)并通过吉布森(Gibson)组装将其引入内部质粒来生成构建体。表28列出了在该实例中使用的构建体的序列。
表28.Tau构建体的序列。
Figure BDA0002541415150004931
Figure BDA0002541415150004941
Figure BDA0002541415150004951
Figure BDA0002541415150004961
Figure BDA0002541415150004971
生物素连接酶转染和生物素免疫沉淀
在终体积为200μL的Optimem培养基中，使用6μL的lipofectamine2000，将生长在6孔组织培养皿中的HEK293T细胞用3微克带FLAG标签的CRBN和2.1微克指定的Tau融合构建体转染。转染后48小时，将细胞用50μM生物素(从DMSO中制备的100mM储备液稀释)和DMSO(1至10,000)或1微摩尔的来那度胺处理。将细胞孵育21小时，然后在冰冷的PBS中洗涤后用含有1X Halt蛋白酶抑制剂(赛默飞世尔公司目录号1861281)的300μL冰冷的M-PER缓冲液(赛默飞世尔公司目录号78501)使细胞裂解。使细胞裂解物澄清并通过BCA反应定量蛋白质，并在M-PER缓冲液中将蛋白质浓度标准化。将20％的细胞裂解物(60μL)在IP-裂解缓冲液(15mM Tris pH7.5、120mM NaCl、25mM KCl、2mM EGTA、2mM EDTA、0.5％Triton X-100、1XHalt蛋白酶抑制剂)中稀释4倍，并在室温下用50μL链霉亲和素M-280磁性Dynabeads(赛默飞世尔公司目录号11205D)孵育30分钟。随后将珠用IP裂解缓冲液洗涤三次，然后最终溶解在20μL含蛋白酶抑制剂的M-PER缓冲液中。在该免疫沉淀材料中，添加4X NuPage LDS缓冲液至终浓度为1X，并类似地将细胞裂解物稀释。然后添加10X NuPage还原缓冲液至浓度为1X，并将样品加热至95℃持续5分钟。使细胞裂解物或免疫沉淀材料在10％Bis-TrisCriterion XT胶(伯乐公司(BioRad)3450111)上运行，印迹(TurboBlot)，并与如指定的一抗孵育。将LiCor RDye 800CW山羊抗兔(#925-32211)或680RD(#925-68070)二抗进行孵育，并且在Li-Cor Odyssey CLx成像站上测量信号。
对HEK293T细胞中的HilD-Tau-YFP融合物进行成像分析
在转染之前的一天，在96孔板中，按22.5K个细胞/孔接种野生型HEK 293T或CRBN敲除(KO)HEK293T细胞。然后用0.02微克的HilD-Tau(P301S)融合构建体转染细胞。转染后一天，用不同浓度的来那度胺处理孔。过夜处理后，将细胞在4％PFA和4％蔗糖的最终溶液中固定15分钟。将固定的细胞用PBS洗涤。然后将细胞用1:5000Hoechst和1:10000CellmaskHCS孵育十五分钟，洗涤，然后成像。
使用20X物镜捕获和DAPI、FITC和Cy5通道，在Incell分析仪6000上对板成像。然后使用cellprofiler对成像数据定量，其中将细胞核经由赫斯特(Hoechst)染色进行分段，并然后通过将细胞核对象扩展到经分段的细胞边缘(通过细胞掩模(Cell mask)染色进行鉴定)来鉴定细胞体。然后将该细胞对象用于测量FITC强度，对应于HilD-Tau(P301S)-YFP。
HEK293T转染和通过蛋白质印迹分析进行的HilD-Tau降解的定量
在转染前一天，将HEK293T细胞以150,000个/孔的密度接种在24孔板中。然后将这些细胞用0.175微克的HilD-Tau(野生型)转染。转染后4小时或24小时，用来那度胺的剂量应答处理孔。将细胞孵育过夜。然后将这些细胞用洗涤冰冷的PBS洗涤，并在补充Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂的85μL的N-PER缓冲液(赛默飞世尔公司目录号87792)中裂解。将板在冰上孵育(伴随偶尔摇动)15分钟。然后通过在4℃下以15000g离心15分钟来使裂解液澄清。将LDS缓冲液和还原剂添加至澄清的裂解物中，并然后将样品在95℃下加热8分钟。将样品在10％bis-tris凝胶上按150V运行70分钟。使用伯乐公司(Biorad)turboblot(混合分子量设定)转移印迹。用DAKO Tau(总tau)(达科公司(Dako)目录号A0024)、肌动蛋白(细胞信号传导计数公司(Cell signaling technologies)目录号3700S)和AT8(磷酸-Tau)(赛默飞世尔公司目录号MN1020)探测印迹。将这些印迹用Supersignal west femto化学发光底物(赛默飞世尔公司目录号34095)显影。
对蛋白质印迹条带的定量是根据Molecular Psychiatry[分子精神病学](2017)22,417-429。
大鼠神经元解剖和核转染
从第18.5天的大鼠胚胎中分离大鼠皮质。通过如下方法制备单细胞悬浮液：在37℃下，通过在3mL的Hibernate E(-Ca)溶液(布灵特公司(Brainbits)目录号HECA)中稀释的木瓜蛋白酶(布灵特公司(Brainbits)目录号PAP)中消化15分钟；接下来补充DNA酶(至浓度为0.5mg/mL)；磨碎；在37℃下孵育10分钟；磨碎；并最终通过40μm细胞过滤器过滤。使用P3溶液(龙沙(Lonza)核转染试剂盒目录号V4XP-1024)和2微克指定的质粒，将大约8百万个细胞进行核转染。使用在4D核转染器上的程序CU-133。然后将细胞在含有1％血清的神经基础培养基(生命技术公司(Life Technologies)目录号21103)中稀释，并按96孔Biocoat(康宁公司(Corning)目录号356640)板的80,000个细胞/孔的密度铺板。注意，在核转染后发生了大量细胞死亡，因此需要高初始铺板密度。在第二天，将培养基完全换成缺少血清的培养基。
每7天更换50％的培养基。在第9天，将化合物以指定的终浓度添加至培养基。使用经由赛默飞世尔科技公司Orbitor RS机器人与Liconic Instruments IC培养箱(目录号391180700)/板箱(plate hotel)联接的InCell6000系统(通用电气公司(GeneralElectric))，按指定的间隔，对YFP信号进行成像。
人神经元核转染
将人多能干细胞(hPSC)维持在玻连蛋白包被的组织培养板上的E8培养基(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))中。通过将培养基改变为Ph I，将hPSC的汇合的单层进行神经转化(参见下文培养基配方)。诱导后7天，将细胞用Accutase解离为单细胞悬浮液，在具有补充有2微摩尔Thiazovivin和10ng/mL FGF2(最终)的Ph II/III培养基的旋转瓶中，按1.5百万个细胞/毫升接种，并在37℃下，在微量搅拌板上以40rpm孵育4天。然后将培养基改变为Ph II/III，并将神经球在60rpm下进一步培养17天，每周两次更换50％的培养基。在第28天，将培养基改变为Ph IV，并将培养物再维持21天，其中每周两次更换50％的培养基。从第49天开始，将培养物改变为Ph V培养基进行维持，并用木瓜蛋白酶试剂盒(沃辛顿科学公司(Worthington Sciences))解离，以在层粘连蛋白、纤连蛋白和基质胶包被的板上进行神经元沉降。将单细胞悬浮液进行核转染2微克构建体(1千万个细胞/反应)。在96孔板的每个孔铺板80,000个细胞。将神经元在阶段5培养基+杀稻瘟素中孵育。每周两次更换介质(50％)。
阶段I培养基：基底：高级DMEM/F12；Glutamax(1X)(生命技术公司目录号35050)；Pen/Strep(1x)(生命技术公司目录号15140)；N-乙酰基-半胱氨酸(500微摩尔)；肝素(2微克/mL)；SB431542(10微摩尔)；LDN193189(100nM)；XAV939(2微摩尔)；N2补充物(0.5％v/v)。
阶段II/III培养基：基底：高级DMEM/F12；Glutamax(1X)；Pen/Strep(1X)；N-乙酰基-半胱氨酸(500微摩尔)；肝素(2微克/ml)；N2补充物(0.5％v/v)；B27补充物(1％v/v)(生命技术公司目录号17504)；FGF2(10ng/mL，前4天；2.5ng/mL，阶段II/III的其余时间)；LDN193189(100nM)；CHIR99021(20nM)；视黄酸(5nM)。
阶段IV培养基：基底：高级DMEM/F12；GlutaMax(1x)；Pen/Strep(1x)；肝素(2微克/mL)；N2补充物(0.5％v/v)；B27补充物(0.4％v/v)；毛喉素(10微摩尔)；氯化钙(600微摩尔)
阶段V培养基：基底：高级DMEM/F12；GlutaMax(1x)；Pen/Strep(1x)；肝素(2微克/mL)；N2补充物(0.5％v/v)；B27补充物(1％v/v)；毛喉素(10微摩尔)；氯化钙(600微摩尔)；BDNF(5ng/mL)；GDNF(5ng/mL)。
不溶性Tau级分的产生
在6个月龄的58/4(tg/tg)转基因小鼠(一种过表达具有P301S突变的tau全长人0N4R同种型的内部tau转基因小鼠模型)上进行月桂酰基肌氨酸钠(sarkosyl)不溶性分级。简言之，将从小鼠分离的脑组织在9:1(v/w)的高盐缓冲液(10mM Tris-HCL，pH 7.4，0.8Nacl，1mM EDTA和2mM二硫苏糖醇)中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂和0.1％月桂酰基肌氨酸钠进行均化。将匀浆在4℃下以10,000g离心10分钟，并收集上清液。使用相同的缓冲液条件将沉淀物再萃取两次，并将所有上清液合并。将另外的月桂酰基肌氨酸钠添加至上清液，以达到1％最终的月桂酰基肌氨酸钠浓度。在室温下回转1小时后，将样品以280,000g在4℃下离心1小时。最后，将所得沉淀物重悬浮于PBS(300ul/g组织)中，并使用手持式探头(QSonica)短暂超声处理(20％功率，持续10个10秒循环)。将该最终的级分储存在-80℃下直至使用，并被称为月桂酰基肌氨酸钠不溶性tau级分。
结果
产生HilD-Tau融合物(包括易聚集的Tau突变)以构建工具来监测易于聚集的、毒性形式的Tau蛋白的降解(图23)。
在第一实验中，测试了HilD标签与Tau的融合是否可以经由用免疫调节性药物(来那度胺)的处理来诱导E3连接酶小脑蛋白(CRBN)的募集。产生了HilD-Tau-生物素连接酶融合物(图24A)。生物素连接酶在暴露于生物素后会产生反应性生物素种类，这些生物素种类与数十纳米半径内的邻近蛋白质共价结合。在用来那度胺处理(但未在对照条件下)后，HilD-Tau-生物素连接酶在HEK293T细胞中引起与HilD-Tau-生物素连接酶构建体共转染的带FLAG标签的CRBN构建体的稳健的生物素化(图24B)。这证实了HIlD标签可以经由来那度胺三元复合物形成将CRBN募集到Tau。
接下来，在异源细胞中对Tau是否可以通过CRBN募集而降解进行检测。将HEK293T细胞用Tau的毒性的易聚集的形式0N4R Tau P301S(与N-末端HilD标签和C-末端YFP(黄色荧光蛋白)报告子融合)转染。该构建体的表达导致细胞随时间的毒性。用来那度胺处理降低了YFP表达(图25A和25B)，并改善了HEK细胞的生存力(图25C)。这表明，可以将HilD-Tau融合蛋白用于揭示如在神经退行性疾病中发现的毒性Tau蛋白的降解的细胞保护作用。
此外，还测试了缺少YFP标签的Tau在HEK293T细胞中是否会降解。如通过蛋白质印迹分析与肌动蛋白负载对照相比，来那度胺处理降低了Tau水平(图26A)。有趣地，通过降低转染的DNA的量减少Tau表达的量增加了降解效率，特别是Tau的磷酸化形式的降解效率(图26A，底部图)。这表明可以将该系统用于探索E3连接酶和蛋白酶体系统降解不同水平的Tau蛋白的能力，此外还可以将该系统用于探索毒性蛋白的特定形式对诱导型降解的选择性脆弱性。磷酸化Tau的增强的减少表明，Tau的特定亚型更易于降解，或者包含该表位的Tau片段比Tau的其他同种型更大程度地降解。
在为了进一步验证经由CRBN E3连接酶募集介导的Tau的降解的一系列对照实验中，在缺少CRBN的HEK293T细胞中测试HilD-Tau或HilD-Tau(P301S)-YFP的降解，并且证实没有发生降解(图26B和26C)。此外，降解对类泛素化抑制剂MLN4924敏感(图26D)。类泛素化对E3连接酶CRBN的活性至关重要，表明CRBN的泛素化活性对于Tau靶向的降解是必需的。
接下来，探讨了如下内容：Tau是否可以在神经元中被降解，所述神经元是针对Tau介导的神经退行性疾病的疾病相关细胞类型；并且这种使Tau泛素化的降解过程是否会产生作为副产物的任何聚集的Tau。首先，通过对用该构建体进行核转染的神经元用从过表达突变型Tau的转基因小鼠中分离的啮齿动物脑的不溶性级分进行处理，建立了胜任聚集的HilD-Tau(P301S)-YFP融合物。HilD-Tau(P301S)-YFP的聚集是清晰可见的，如神经元的细胞体和树突内强烈的点状YFP荧光所示(图27)。
此外，测试了HilD-Tau(P301S)-YFP在从胚胎组织制备的大鼠原代皮层神经元中以及在从衍生自人胚胎干细胞的神经球转染的神经元和神经元祖细胞中的降解敏感性(图28和29)。在原代神经元中，单独地和当与带FLAG标签的人小脑蛋白共转染时，对HilD-Tau(P301S)-YFP针对来那度胺诱导的降解进行了测试。尽管报道所谓的免疫调节性药物(例如，沙利度胺和来那度胺)在啮齿动物中展现出与人不同的作用(例如，致畸性)，但在此系统中甚至当不与人CRBN共转染时，来那度胺诱导HilD-Tau-YFP的降解(图28)。这表明该系统可以在啮齿动物系统中起作用，例如通过将HilD Tau敲入转基因小鼠中，以评估在神经退行性疾病动物模型中降解Tau的影响。HilD-Tau-YFP构建体在神经元中表现出亚细胞分布，与Tau在整个细胞体和整个过程中的生理定位一致。来那度胺降解显示出整个神经元细胞体内Tau水平的普遍降低，表明所述系统可用于验证E3连接酶CRBN可能跨神经元细胞体的各区室分布。该系统中YFP标签的使用还可以使用跨时间的重复活细胞成像来直接确定降解动力学。在啮齿动物和人类神经元中降解是稳健的(图29)，这充当神经元中的Tau靶向蛋白降解的原理证明。在这两种情况下，都没有任何可见的证据表明通过来那度胺介导的CRBN的募集会形成聚集的Tau。
因为可以诱导HilD-Tau系统聚集，所以可以预见它可以用于评估如下情况，其中聚集的Tau能够或不能够被泛素化并被蛋白酶体降解。
实例11：在Jurket细胞中对CAR19-HilD进行评估
这项研究检测了在Jurkat细胞中来那度胺对CAR19-HilD的动力学，以及在将来那度胺从细胞洗脱后，CAR19的表达是否可以恢复。
方法
细胞处理：将CAR19-16GS-HilD标签-转导的Jurkat细胞稀释并接种在两个烧瓶中。一旦接种细胞后，将一个烧瓶用DMSO处理，并且将另一个烧瓶用10μM来那度胺处理一定的时间收获。在化合物处理后1、2、4、6、8、12和24小时，收获来自每个烧瓶的3ml细胞用于进行流式细胞术和蛋白质印迹。将来那度胺处理的烧瓶中的细胞在24小时的时间点被分至两个烧瓶中。一个被标记为“洗脱”，并且另一个被标记为“处理”。通过在300g下离心将来那度胺从“洗脱”细胞洗脱，并重悬于新鲜培养基中三次，另一半与来自先前的培养基中存在的残留来那度胺分开(10μM来那度胺处理仅进行一次)。在洗脱后1、2、4、6小时以及在化合物处理后36、48、60和72小时收集细胞。
蛋白质印迹：将细胞沉淀，用PBS洗涤，并且将沉淀物用含有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)04693124001)的50μl RIPA缓冲液(波士顿生物产品公司(Boston Bioproducts)BP-115D)裂解。将裂解物离心，将上清液转移至新试管中，并通过劳利测定法(LowryAssay)(伯乐公司(BioRad)5000111)读取蛋白量。用4X样品缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)NP0007)和10X还原剂(赛默飞世尔科技公司NP0009)，将每个样品标准化为在20μl体积中的30μg总蛋白。将样品在4％-12％Bis-Tris丙烯酰胺凝胶(赛默飞世尔科技公司WG1402BOX)上运行。将凝胶一式两份运行，一种针对肌动蛋白探测，并且另一种针对V5或CD3Z探测。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并且将膜在3％奶(在TBS-0.1％Tween-20中)中与以下抗体中的一种孵育过夜：按1:10000稀释的小鼠抗肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司A5441)和按1:1000稀释的小鼠抗CD3z(BD 551034)。第二天，将印迹在TBS-0.1％Tween-20中洗涤，在室温下置于在具有1:10000绵羊-抗小鼠HRP二抗(通用电气医疗集团(GE Healthcare)NA931)的3％奶(在TBS-0.1％Tween-20中)中1小时，然后洗涤印迹并用ECL(赛默飞世尔科技公司34076)显影。
流式细胞术：在u底板中收获细胞，并使用1X PBS洗涤。将经洗涤的细胞用100μL生物素化的蛋白质L(金斯瑞公司(Genscript)M00097)(按1:1000X稀释，以1μg/ml)进行染色。将一抗在4℃下孵育45min。孵育后，用PBS洗涤细胞。将细胞与PE缀合的链霉亲和素(杰克逊实验室(Jackson Lab)016-110-084)按1:300X稀释在4℃下孵育30min。细胞用PBS洗涤两次，并在室温下悬浮于100μL固定缓冲液(PBS中2％多聚甲醛)中10min。将固定的细胞用PBS洗涤，并悬浮在150μL PBS中。然后使用BD LSRF Fortessa细胞分析仪，获得这些细胞。使用FSC和SSC图，基于大小排除死细胞。分析活细胞的PE CAR表达。使用未染色的JNL亲本细胞系对FACS结果进行门控，并记录每个样品的10k事件。
结果
如图30A中使用蛋白质印迹所示，10μM来那度胺以时间依赖性方式降解CAR19-HilD，并且在洗脱来那度胺后，CAR19-HilD表达恢复。使用流式细胞术分析证实了该观察结果。来那度胺随时间持续降解CAR19-HilD，并且洗脱来那度胺增加了CAR19-HilD表面表达(图30B)。实例12：在原代T细胞中对CAR19-HilD进行评估
这项研究分析来那度胺对原代T细胞中CAR表达和功能的剂量应答作用。
首先，检测用或不用来那度胺处理24和48小时的CAR19-HILD CART细胞中CAR的表面表达。其次，在表达CD19的细胞的存在下，分析了来那度胺对CAR T杀伤和细胞因子产生的影响。
方法
pELPS载体病毒产生：在37℃和5％CO2下，将LentiX-293T细胞(克泰科公司(Clonetech)632180)在具有10％FBS的DMEM中培养。将细胞在25ml的DMEM、10％FBS中按14x10^6个细胞/板接种在五个15cm组织培养板(BD生物科学公司(BD Biosciences)356451)上，并孵育过夜。在第二天，在每个15cm板中，将15μg的pELP载体与慢病毒包装混合物(18μg pRSV.REV、18μg pMDLg/p.RRE和7μg pVSV-G)、90μl的Lipofectamine 2000(英杰公司11668-019)和3ml的OptiMEM(英杰公司11058021)组合，并添加至铺板的细胞中。在第二天，除去培养基，并用15ml的新鲜培养基置换。将细胞孵育30小时，然后收集病毒，以500g离心10min，并通过0.45μM醋酸纤维素过滤器(康宁公司(Corning)430314)过滤。使用Lenti-X浓缩器(克泰科公司(Clonetech)611232)将病毒上清液在4℃下浓缩过夜，以1500g在4℃下沉淀45min，然后按初始体积的1/100将上清液抽吸并重悬于DMEM，10％FBS中。将病毒等分并储存在-80℃。
SUPT1滴度：将100μL SUPT1细胞按2E5个细胞/ml铺板在平底96孔板中。将50μL稀释的病毒添加至细胞。将板在37℃在CO2下孵育过夜。将100μL RPMI培养基添加至每个孔中，并将板放回培养箱中。在转导的第4天，收获细胞并针对蛋白L进行染色，并使用Flow Jo分析CAR表达。
10天CART扩增：CART细胞是从健康供体的单采术产物开始产生的，所述健康供体天然T细胞是通过对T细胞CD3淋巴细胞进行阴性选择而获得的。将T细胞以24孔板每孔1mL培养基中0.5×106个T细胞培养。通过在T细胞培养基中，按1:3(T细胞与珠)的比率添加CD3/CD28珠(
Figure BDA0002541415150005061
人T扩增子CD3/CD28(
Figure BDA0002541415150005062
Human T-Expander CD3/CD28))，将这些细胞活化。
24小时后，对于CART19或CART19-HilD，T细胞不被转导(UTD)或以感染复数(MOI)为4进行转导。通过测量每mL的细胞计数来对T细胞生长进行监测，并且每两天将T细胞稀释在新鲜培养基中。在第7天，将1百万个细胞转移至24孔板中以评估三种不同浓度(1μM、0.1μM和0.01μM)的来那度胺持续24小时或48小时的作用。通过在FACS Fortessa(BD)上进行流式细胞术分析来确定转导的细胞(在细胞表面上表达CD19特异性CAR的细胞)的百分比。
FACS染色：
将细胞收获并用PBS洗涤。然后将细胞与100μL生物素化的蛋白质L在4℃下孵育45min。然后使用PBS将细胞洗涤，并在4℃下与PE缀合的链霉亲和素(按1:300X稀释)和BV421CD3抗体(按1:200稀释)孵育30min。然后将细胞用PBS洗涤两次，并在室温下悬浮于100μL固定缓冲液2％多聚甲醛中10min。将固定的细胞用PBS洗涤，并悬浮在150μL PBS中。然后在Fortessa仪器中采集这些细胞，并使用Flow Jo软件分析结果。
将冷冻的CART细胞在T细胞培养基中解冻，并与都表达萤光素酶的CD19阴性(K562细胞)或CD19阳性靶细胞(Nalm6细胞)共培养。样品之间的CART细胞的数量和T细胞的总数都被标准化；后者是通过添加UTD细胞实现的。进行CART细胞的滴定，保持靶细胞数恒定在25,000个细胞。探索的最高效应子:T细胞比率(E:T)为20:1，并使用8点稀释曲线。按1μM终浓度添加来那度胺。在透明底黑色板中，以最终体积为200μL进行共培养实验。在20小时孵育后，除去100μL的上清液，并测量细胞因子水平。向其余部分中添加100μL Bright-Glo萤光素酶测定试剂(底物+酶)，并在室温下孵育10分钟。使用下式测量杀伤％：特异性裂解(％)＝(1-(样品发光/平均最大发光))*100。
结果
如图31A所示，CAR19和CAR19-HilD的转导效率是相当的。用CAR19或CAR19-HilD转导的原代T细胞的扩增倍数也相当的。来那度胺处理不影响CAR19的表达(图31B)。相反，在来那度胺处理下，表达CAR19-HilD的细胞显示CAR表达的剂量依赖性降低(图31C)。在48小时处对CAR表达的影响更加明显(图31C)。
跨各样品观察到针对CD19阴性细胞的低背景杀伤，而与来那度胺的添加无关(图32A)。在不存在来那度胺的情况下，CART19和CART19-HilD杀伤CD19阳性细胞的能力是相当的(图32B和32C)。添加来那度胺后，CART19-HilD的杀伤曲线略有变化(图32C)。
应答于在不存在来那度胺的情况下的CD19阳性细胞，CART19和CART19HilD分泌相当水平的IFNγ(图33A)和IL2(图33B)。在来那度胺的存在下，由CART19HilD细胞分泌的IFNγ和IL2的水平降低(图33A和33B)。CART19分泌细胞因子的能力对于来那度胺的添加是不受影响的(图33A和33B)。
总之，这项研究表明，将HilD标签附加到CAR19结构上不会影响这些CART在培养基中扩增的能力。来那度胺以剂量依赖性方式导致在表达CAR19-HilD的T细胞中的表面CAR表达的降低。
在不存在来那度胺的情况下，CART19HilD的活性与CART19相当。通过CART19.HilD细胞的杀伤和细胞因子分泌是靶细胞特异性的。
在本文进行的杀伤测定中，来那度胺略微损害了CART19-HilD杀伤靶细胞的能力。在本文使用的实验条件下，一旦共同添加CART，靶细胞就会开始死亡。图32C中细胞杀伤的轻微变化可能是由于以下事实：细胞杀伤的动力学可能比CAR19-HilD降解的动力学更快。
来那度胺干扰CART19.HilD(而非CART19)分泌细胞因子的能力。
实例13：CAR19-HilD的体内评估
该研究测试了表达CAR19-HilD的T细胞的体内活性和通过来那度胺对其的调节。
方法
异种移植小鼠模型
雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(NSG)小鼠(6-8周龄)购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)。动物研究是在由NIBR机构的动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的协议下进行的。对NSG小鼠用1.0x106萤光素化的Nalm-6进行静脉内接种。数天后，将CAR-T细胞静脉输注到荷瘤小鼠中；除非另有说明，否则来那度胺是同时口服的。通过IVIS测量肿瘤负荷，并量化为目的区域(ROI)中的辐射度，所述区域通常是一只小鼠的面积。当体重减轻超过20％或发展为后肢瘫痪时，对小鼠实施安乐死。在指定的动物中，移植物抗宿主病被定义为非归因于Nalm-6萤光素酶信号的毛发脱落、行为改变和健康状况的明显下降。
脾细胞的CAR表达分析
在研究结束时，从上述用于体内功效研究的小鼠中收获脾。将收获的脾均化为单细胞悬浮液(脾或脾来源的细胞不池化)。将细胞用RPMI培养基洗涤，并在1mL冷冻培养基中冷冻。在染色的当天，将细胞在含10％血清的RPMI培养基中解冻。为了阻断CD16/CD32受体，将细胞与小鼠Fc阻断剂(1:100稀释)在室温下孵育14min。将细胞洗涤，并在4℃下与100μL生物素化蛋白(终浓度为1μg/mL)一起孵育45min。PBS洗涤后，将细胞与PE缀合的链霉亲和素(以1:300稀释)在4℃下孵育30min。然后将细胞用PBS洗涤两次，并在室温下悬浮于100μL的2％多聚甲醛固定缓冲液中10min。将固定的细胞用PBS洗涤，并悬浮在150μL PBS中。然后在Fortessa仪器中采集这些细胞，并使用Flow Jo软件分析结果。
以下是从中收获脾的小鼠组。每个组中有三只小鼠：
第1组.-CART19.HilD(5x106)
第2组.-CART19-HilD(5x106)+来那度胺qd
第3组.-CART19-HilD(5x106)+来那度胺bid
第4组.-CART19.HilD(5x106)+来那度胺+5天
结果
来那度胺对Nalm6体内生长影响不大(数据未显示)。
为测定CART19.HilD在体内的治疗性功效，将荷瘤小鼠用5.0x106、2.5x106或1.0x106CART19.HilD处理。尽管5.0x106CART19.HilD产生的肿瘤消退率与2.5x106CART19相当，但2.5x106CART19.HilD可以仅部分地控制肿瘤生长(图34)。1.0x106CART19.HilD未显示功效(图34)。除了持续超过>40d的剂量依赖性活性外，按30mg/kg bid的来那度胺处理可以完全消除CART19.HilD控制体内肿瘤生长的能力(图34)。此类结果与图32C所示的肿瘤细胞溶解测定中体外获得的结果形成对比。在来那度胺处理后外周血中CART细胞的损失也通过流式细胞术证实(图35)。
体内过继转移T细胞功能的控制对于预防或克服与CART疗法相关的潜在毒性很重要。因此，进一步研究了在CART19.HilD控制了肿瘤后是否可以消除CART19.HilD活性。在Nalm6荷瘤NSG模型中进行来那度胺剂量的时间过程研究。在CART19.HilD转移后立即用来那度胺给药的小鼠丧失了体内控制肿瘤生长的能力(图36)。在CART19HilD细胞过继转移后第5天，用来那度胺给药的小鼠在来那度胺给药后数天显示肿瘤复发(图36)。CART19.HilD的活性与在不存在来那度胺的情况下的CART19相当(图36)。
分析了衍生自小鼠脾细胞的CD3+细胞中的CAR表达。衍生自用表达CAR19或CAR19-HilD的T细胞处理的小鼠的CD3细胞中的CAR表达是相当的(图37E)。用CAR19-HilD和来那度胺处理的所有小鼠显示出衍生自脾的CD3阳性细胞中的明显降低的CAR表达(图37B-37E)。
实例14：CARB-标签设计
CARB标签是基于IKZF2衍生的发夹序列，所述序列可与表29中披露的化合物I-112一起用作降解决定子标签。
IMiD化合物(例如，来那度胺)可诱导IKZF1和IKZF3降解，但不诱导IKZF2降解。已鉴定化合物I-112可特异性降解IKZF2，但不能降解IKZF1或IKZF3。由于HilD标签基于IKZF1/IKZF3发夹，因此它仅通过IMiD降解。这项研究探索了用化合物I-112是否可以降解基于IKZF2的发夹(CARB标签)。
方法
设计：初始CARB标签序列来自IKZF2CDS(NM_016260)。所述标签的N-末端部分来自H130-S174，并且C-末端的部分来自A230-D243。
完整的氨基酸序列是：
HKRSHTGERPFHCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCPFCSAGQVMSHHVPPMED(SEQ IDNO:109)
以上加下划线的区域是C-末端部分。同HilD标签一样，将CARB标签用16GS接头(GGGGSGGGGTGGGGSG(SEQ ID NO:28))附加到目的蛋白上。设计两侧均带有限制性酶切位点的16GS-CARB标签DNA，并通过整合的DNA技术合成为gBlock。DNA序列如下所示：
Figure BDA0002541415150005111
还针对具有上述CARB标签序列的整个CAR19(CTL119)设计并合成了gBlock。DNA序列如下所示：
ccatttcaggtgtcgtgagcggccgctctagagccGAattCGgatccatggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctcAgagactacttactaccaatcatccctcaagtcTcgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggggtggtggcgggagcggaggtggaggcacgggcggtggaggttcggggcataaaaggagtcacactggtgaacgccccttccactgtaaccagtgtggagcttcttttactcagaagggcaaccttctgagacacataaagttacactctggagagaagccgttcaaatgtcctttctgtagcgctgggcaggtcatgagtcaccatgtacctcctatggaagatTAAgtcgacgcgtAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTTGATATCCAGCACAGTGGCGGCGCGCCATTCCGCCCCTCTCCCTC(SEQ ID NO:111)。将CAR19-16GS-CARB标签的未成熟氨基酸序列披露为SEQ ID NO:112。
克隆：将gBlock用限制性内切酶消化，同样消化具有CMV启动子的哺乳动物表达载体，所述启动子驱动具有FLAG标签的MITF(NM_000248)或具有V5标签的CD19(NM_001770)，由此产生这些最终的构建体：CD19-16GS-HilD-V5(在实例5中所述的构建体)和CARB标签-16GS-MITF-FLAG。
还将CTL119-16GS-CARB标签gBlock用限制性内切酶消化，但被克隆到包含EF1a启动子的慢病毒哺乳动物表达载体中。
实例15：CARB-标签化合物I-112剂量应答蛋白质印迹、流式细胞术和JNL CAR19功 能性测定
这项研究旨在测定给药化合物I-112后，CARB标签对降解CAR19的功效。
方法
pNGX_LV_V002载体病毒产生：在37℃和5％CO2下，将HEK293T细胞(ATCC CRL-3216)在DMEM(具有10％FBS)中培养。将细胞按0.75x10^6个细胞/孔，在2ml的DMEM，10％FBS中接种在胶原蛋白包被的6孔板中，并孵育过夜。第二天，在55.1μl OptiMEM(英杰公司11058021)中，将pNGX_LV_V002载体(0.23μg)和慢病毒包装混合物DNA(0.28μg)(西来塔公司(Cellecta)CPC-K2A)与1.5μl TransIT转染试剂(米卢斯公司(Mirus)MIR2700)混合，并添加至铺板的细胞，将所述细胞孵育过夜。第二天，将培养基从细胞除去，并添加1ml新鲜培养基。将细胞孵育72小时。从细胞收集病毒上清液，并通过0.45μM醋酸纤维素过滤器(康宁公司(Corning)430516)过滤，并且等分并储存在-80℃下。
病毒滴度：使用RPMI和10％FCS，在1:3倍开始制备八倍稀释的病毒。将100μLSUPT1细胞按2E5个细胞/ml铺板在平底96孔板中。将50μL稀释的病毒一式两份添加至细胞。将板在37℃在CO2下孵育过夜。将100μL RPMI培养基添加至每个孔中，并将板放回培养箱中。在转导的第4天，收获细胞并针对蛋白L进行染色，并使用Flow Jo分析CAR表达。
细胞处理：将包含NFAT萤光素酶报告子的Jurkat细胞用CAR19或CAR19-CARB标签以感染复数(MOI)为4感染。在使用前将细胞扩增一周。将细胞在6孔培养皿中稀释为3ml中总共0.5x10^6。一旦细胞铺板，立即用10μM、1μM、0.1μM、0.01μM和0.001μM化合物I-112和DMSO处理样品。在初始化合物处理后24小时，收获所有细胞，用于蛋白质印迹和流式细胞术分析。
蛋白质印迹：将细胞沉淀，用PBS洗涤，并且将沉淀物用含有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)04693124001)的50μl RIPA缓冲液(波士顿生物产品公司(Boston Bioproducts)BP-115D)裂解。将裂解物离心，将上清液转移至新试管中，并通过劳利测定法(LowryAssay)(伯乐公司(BioRad)5000111)读取蛋白量。用4X样品缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)NP0007)和10X还原剂(赛默飞世尔科技公司NP0009)，将每个样品标准化为在20μl体积中的30μg总蛋白。将样品在4％-12％Bis-Tris丙烯酰胺凝胶(赛默飞世尔科技公司WG1402BOX)上运行。将凝胶一式两份运行，一份针对肌动蛋白，并且另一份针对V5或CD3Z。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并且将膜在3％奶(在TBS-0.1％Tween-20中)中与以下抗体中的一种孵育过夜：按1:10000稀释的小鼠抗肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司A5441)；和按1:1000稀释的小鼠抗CD3z(BD 551034)。第二天，将印迹在TBS-0.1％Tween-20中洗涤，在室温下置于在具有1:10000绵羊-抗小鼠HRP二抗(通用电气医疗集团(GEHealthcare)NA931)的3％奶(在TBS-0.1％Tween-20中)中1小时，然后洗涤印迹并用ECL(赛默飞世尔科技公司34076)显影。
流式细胞术：在u底板中收获细胞，并使用1X PBS洗涤。将经洗涤的细胞用100μL生物素化的蛋白质L(金斯瑞公司(Genscript)M00097)(按1:1000X稀释，以1μg/ml)进行染色。将一抗在4℃下孵育45min。孵育后，用PBS洗涤细胞。将细胞与PE缀合的链霉亲和素(杰克逊实验室(Jackson Lab)016-110-084)按1:300X稀释在4℃下孵育30min。细胞用PBS洗涤两次，并在室温下悬浮于100μL固定缓冲液(PBS中2％多聚甲醛)中10min。将固定的细胞用PBS洗涤，并悬浮在150μL PBS中。然后使用BD LSRF Fortessa细胞分析仪，获得这些细胞。使用FSC和SSC图，基于大小排除死细胞。分析活细胞的PE CAR表达。使用未染色的JNL亲本细胞系对流式细胞术结果进行门控，并记录每个样品的10k事件。
Jurkat NFAT萤光素酶(JNL)CAR功能性测定：将CAR19-CARB-标签细胞在20mlRPMI 1640培养基(赛默飞世尔科技公司11875-085)10％FBS 1X pen/strep中稀释为0.5x10^6。将20μl(0.5x10^6个细胞)的此细胞系铺板于白色实心底384孔板(格雷钠公司(Greiner)789163-G)中。使用Labcyte ECHO声分发器，将化合物I-112按8点1/2-对数稀释(具有10μM最终的最高浓度)添加至384孔板。将板在37℃，5％CO2下孵育15小时。将K562和Nalm6细胞以0.5x10^6个细胞/ml重悬浮。经8点化合物I-112处理的细胞中的一半接受20μl的K562，并且另一半接受20μl的Nalm6细胞。将细胞在37℃，5％CO2下的培养箱中储存八小时。然后将样品用40μl(1:1)Bright Glo(普洛麦格公司(Promega)E2620)处理，并使用铂金埃尔默公司(Perkin Elmer)Viewlux用20秒曝光读取发光。
结果
在化合物I-112处理24小时后，CAR19-CARB标签的蛋白质水平显示出剂量依赖性的降低(图38A)。类似地，化合物I-112处理还降低了JNL CAR19-CARB标签细胞中的CAR表面表达(图38B)。如上文所述在JNL CAR功能性测定中所示，CAR19-CARB标签细胞仅对CD19+细胞Nalm6产生应答，并且该应答以剂量依赖性方式随着化合物处理量的增加而降低(图38C)。
实例16：使用CARB-标签和HilD标签作为正交系统用于蛋白质降解
这项研究旨在确定在化合物I-112处理后，带CARB标签的蛋白质是否可以在细胞中降解。还检测了在带HilD标签的蛋白质和带CARB标签的蛋白质是否共同表达时，是否每种蛋白的表达都可以独立地用来那度胺处理(对于带HilD标签的蛋白质)或化合物I-112处理(对于带CARB标签的蛋白质)来调节。
方法
细胞基因表达和处理：在37℃和5％CO2下，将HEK293T(ATCC CRL-3216)细胞在DMEM(具有10％FBS和pen/strep)中培养。使用FuGene HD(普洛麦格公司(Promega)E2311)，使用3:1的FuGene HD与DNA的比率，将细胞用CARB标签-16GS-MITF-FLAG或CARB标签-16GS-MITF-FLAG和CD19-16GS-HilD-V5进行转染。将转染的细胞孵育24小时，然后用来那度胺或化合物I-112(以4点对数稀释(在10μM的终浓度开始))处理。将细胞用指定的化合物处理24小时，并然后准备用于蛋白质印迹。
蛋白质印迹：化合物处理后24小时，将细胞沉淀，用PBS洗涤，并且将沉淀物用含有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)04693124001)的50μl RIPA缓冲液(波士顿生物产品公司(Boston Bioproducts)BP-115D)裂解。将裂解物离心，将上清液转移至新试管中，并通过劳利测定法(Lowry Assay)(伯乐公司(BioRad)5000111)读取蛋白量。用4X样品缓冲液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)NP0007)和10X还原剂(赛默飞世尔科技公司NP0009)，将每个样品标准化为在20μl体积中的30μg总蛋白。将样品在4％-12％Bis-Tris丙烯酰胺凝胶(赛默飞世尔科技公司WG1402BOX)上运行。将凝胶一式三份(对于每个抗体一份)运行。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并且将膜在3％奶(在TBS-0.1％Tween-20中)中与以下三种抗体中的一种孵育过夜：按1:1000稀释的小鼠抗V5(赛默飞世尔科技公司MA5-15253)；按1:10000稀释的小鼠抗肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司A5441)；和按1:1000稀释的小鼠抗FLAG M2(西格玛公司F3165)。第二天，将印迹在TBS-0.1％Tween-20中洗涤，然后在室温下置于在具有1:10000绵羊-抗小鼠HRP二抗(通用电气医疗集团(GE Healthcare)NA931)的3％奶(在TBS-0.1％Tween-20中)中一小时，并且然后洗涤印迹并用ECL(赛默飞世尔科技公司34076)显影。
结果
带CARB标签的MITF可被化合物I-112而不是来那度胺有效降解(图39)。相反，在不同剂量的化合物I-112处理下，CD19-HilD标签的表达保持恒定(数据未显示)。
实例17：对BCMA CAR HilD-标签融合构建体的表征
这项研究旨在确定HilD-标签是否可用于降解其他CAR(例如，BCMA CAR)。如下显示BCMA CAR-16GS接头-HilD标签序列。HilD标签是加单下划线的。16GS接头是加双下划线的。信号肽以斜体显示。
Figure BDA0002541415150005161
方法
pELPS载体病毒产生：在37℃和5％CO2下，将LentiX-293T细胞(克泰科公司(Clonetech)632180)在具有10％FBS的DMEM中培养。将细胞在25ml的DMEM、10％FBS中按14x10^6/板接种在五个15cm组织培养板(BD生物科学公司(BD Biosciences)356451)上，并孵育过夜。第二天，在每个15cm板中，将15μg的pELP载体与慢病毒包装混合物(18μgpRSV.REV、18μg pMDLg/p.RRE和7μg pVSV-G)、90μl的Lipofectamine 2000(英杰公司11668-019)和3ml的OptiMEM(英杰公司11058021)组合，并添加至铺板的细胞中。第二天，除去培养基，并用15ml的新鲜培养基置换。将细胞孵育30小时，然后收集病毒，以500g离心10min，并通过0.45μM醋酸纤维素过滤器(康宁公司(Corning)430314)过滤。使用Lenti-X浓缩器(克泰科公司(Clonetech)611232)将病毒上清液在4℃下浓缩过夜，以1500g在4℃下沉淀45min，然后按初始体积的1/100将上清液抽吸并重悬于DMEM，10％FBS中。将病毒等分并储存在-80℃。
病毒滴度：使用RPMI和10％FCS，在1:3倍开始制备八倍稀释的病毒。将100μLSUPT1细胞按2E5个细胞/ml铺板在平底96孔板中。将50μL稀释的病毒一式两份添加至细胞。将板在37℃在CO2下孵育过夜。将100μL RPMI培养基添加至每个孔中，并将板放回培养箱中。在转导的第4天，收获细胞，并针对CAR表达进行染色，并使用Flow Jo进行分析。
细胞处理：将包含NFAT萤光素酶报告子的Jurkat细胞用BCMACAR-HilD标签以感染复数(MOI)为4感染。在使用前将细胞扩增一周。将BCMACAR HilD-标签JNL细胞在6孔培养皿中稀释为3ml中总共0.5x10^6。一旦细胞铺板，立即用10μM、1μM、0.1μM、0.01μM和0.001μM来那度胺或DMSO处理样品。在初始来那度胺处理后24小时，收获所有细胞，用于流式细胞术分析。
流式细胞术：在u底板中收获细胞，并使用1X PBS洗涤。将洗涤的细胞用抗BCMACARAlexa flour 647缀合的抗体(生物传奇公司(BioLegend)#94581)(按1:300X稀释)染色。将一抗在4℃下孵育45min。孵育后，将细胞用PBS洗涤两次，并在室温下悬浮于100μL固定缓冲液2％多聚甲醛中10min。将固定的细胞用PBS洗涤，并悬浮在150μL PBS中。然后使用Fortessa仪器，获得这些细胞。使用FSC和SSC图，基于大小排除死细胞。分析活细胞的APCCAR表达。使用未染色的JNL亲本细胞系对流式细胞术结果进行门控，并记录每个样品的10k事件。
Jurkat NFAT萤光素酶(JNL)CAR功能性测定：将BCMACARHilD-标签细胞系在20mlRPMI 1640培养基(赛默飞世尔科技公司11875-085)10％FBS 1X pen/strep中稀释为0.5x10^6。将20μl(0.5x10^6个细胞)的此细胞系铺板于白色实心底384孔板(格雷钠公司(Greiner)789163-G)中。使用Labcyte ECHO声分发器，将来那度胺按8点1/2-对数稀释(具有10μM最终的最高浓度)添加至384孔板。将板在37℃，5％CO2下孵育15小时。将KMS11细胞以0.5x10^6个细胞/ml重悬浮。将20μl的KMS11细胞添加至JNL细胞，并在37℃，5％CO2的培养箱中储存八小时。然后将样品用40μl(1:1)Bright Glo(普洛麦格公司(Promega)E2620)处理，并使用铂金埃尔默公司(Perkin Elmer)Viewlux用20秒曝光读取发光。
结果
如图40A所示，用来那度胺的处理导致BCMACAR HilD-标签的表面表达的剂量依赖性降低。表达BCMACAR HilD-标签的Jurkat NFAT萤光素酶细胞应答于表达BCMA的KMS11细胞，这通过萤光素酶活性的增加来证明，萤光素酶活性可以剂量依赖性方式被增加量的来那度胺处理抑制(图40B)。
实例18：例示性化合物的合成
本披露的化合物能以有机合成领域技术人员熟知的多种方式制备。举例来说，本披露的化合物可以使用下文所述的方法、以及合成有机化学领域中已知的合成方法或本领域技术人员所理解的其变体来合成。优选的方法包括但不限于下文所述的那些方法。
可以通过遵循在方案I中概述的步骤来合成本披露的化合物，所述方案包括组装中间体A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-5a、A-6a、A-6b和A-7的不同顺序。起始材料是可商购的或通过报道文献中或如说明的已知程序制备的。方案1旨在提供与制备本发明化合物的选择有关的一般指导。本领域的技术人员将理解，可以使用有机化学的常识来修改或优化方案中所示的步骤，以制备本发明的各种化合物。
方案1：
Figure BDA0002541415150005191
其中P是胺保护基团(例如，叔丁氧基羰基(Boc))，并且X1、R1、R2、Rx、n和y是如上在式(III)中的定义。
使用中间体A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-5a、A-6a、A-6b和A-7制备具有式(III)的化合物(其中
Figure BDA0002541415150005192
是双键，并且R3不存在，并且其中
Figure BDA0002541415150005193
是单键，并且R3是氢)的一般方法概述在方案1中。可以如美国专利申请US 2009/0142297中所报道来制备A-1。如步骤1所示，在弱碱(例如，碳酸钾(K2CO3)、碳酸铯(Cs2CO3)等)的存在下，在溶剂(例如，二甲基甲酰胺(DMF))中，并且任选地在升高的温度下，A-1和3-氨基哌啶-2,6-二酮-HCl(A-2)的环化提供A-3。使用催化剂(例如，Pd(dppf)Cl2·DCM)和碱(例如，碳酸铯(Cs2CO3))，在溶剂(例如，N,N-二甲基甲酰胺(DMF))中，在升高的温度下，A-3与硼酸酯A-4的偶联产生A-5。使用强酸(例如，三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl))，在溶剂(例如，四氢呋喃(THF)、1,2,-二氯乙烷、二噁烷或二氯甲烷(DCM))中，任选地在升高的温度下，将A-5脱保护以提供A-6a。在醛或酮A-7情况下A-6a的还原胺化提供了具有式(III)的化合物(其中
Figure BDA0002541415150005194
是双键，并且R3不存在)。可替代地，通过在碱(例如，NEt3、Cs2CO3等)的存在下，在溶剂(例如，DCM、DMF等)中，并且任选地在升高的温度下，在烷基卤化物A-7情况下A-6a的烷基化来获得具有式(III)的化合物(其中
Figure BDA0002541415150005195
是双键，并且R3不存在)。
在合适的催化剂(例如，Pd/C或PtO2)的存在下，在溶剂(例如，DMF)中并且在氢气气氛下，将A-5进行氢化，提供A-5a。使用强酸(例如，三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl))，在溶剂(例如，四氢呋喃(THF)、1,2,-二氯乙烷、二噁烷或二氯甲烷(DCM))中，任选地在升高的温度下，将A-5a脱保护以提供A-6b。在醛或酮A-7情况下A-6b的还原胺化提供了具有式(III)的化合物(其中
Figure BDA0002541415150005201
是单键，并且R3是氢)。可替代地，通过在碱(例如，NEt3、Cs2CO3等)的存在下，在溶剂(例如，DCM、DMF等)中，并且任选地在升高的温度下，在烷基卤化物A-7情况下A-6b的烷基化来获得具有式(III)的化合物(其中
Figure BDA0002541415150005202
是单键，并且R3是氢)。
由上文所述的方法得到的对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体的混合物可以通过手性盐技术，使用正常相、反相或手性柱的色谱法分离成它们的单一组分，这取决于分离的性质。
可以通过已知方法将任何所得的本披露的化合物或中间体的外消旋体拆分成旋光对映体，例如通过将用光学活性酸或碱得到的其非对映异构体盐进行分离，并释放出光学活性的酸性或碱性化合物。特别地，因此可以采用碱性部分将本披露的化合物拆分成它们的旋光对映体，例如通过用光学活性酸(例如酒石酸、联苯甲酰酒石酸、二乙酰酒石酸、二-O,O'-对甲苯甲酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸)形成的盐的分步结晶。本披露的外消旋化合物或外消旋中间体还可以通过手性色谱法(例如，使用手性吸附剂的高压液相色谱法(HPLC))拆分。
可以基于组分的物理化学差异，例如通过色谱法和/或分级结晶法将任何所得的立体异构体混合物分离成纯的或基本上纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体。
应当理解，在上面所示的描述和公式中，除非另外指明，各基团X1、R1、R2、Rx、n和y和其他变量如上文所定义。此外，出于合成目的，方案1的化合物仅仅是具有选择的基团的代表，以说明如本文所定义的具有式(III)的化合物的通用合成方法。
分析方法、材料和仪器
除非另有说明，否则使用从商业供应商处收到的试剂和溶剂。除非另有说明，否则在Bruker Avance光谱仪或Varian Oxford 400MHz光谱仪上获得质子核磁共振(NMR)光谱。光谱以ppm(δ)给出，并且以赫兹报告耦合常数J。将四甲基硅烷(TMS)用作内标。相对于二甲亚砜(δ2.50)、甲醇(δ3.31)、氯仿(δ7.26)或如NMR光谱数据中所指示的其他溶剂，以ppm报告化学位移。将少量干燥样品(2-5mg)溶于适当的氘代溶剂(1mL)中。化学名称使用来自剑桥软件(CambridgeSoft)的ChemBioDraw Ultra v12生成。
使用沃特世(Waters)系统(Acquity UPLC和Micromass ZQ质谱仪)或安捷伦(Agilent)-1260Infinity(6120四极杆)收集质谱(ESI-MS)；除非另外记录，否则报告的所有质量均为质子化母体离子的m/z。将样品溶解于合适的溶剂(如MeCN、DMSO、或MeOH)中，并且使用自动样品处理器将其直接注入柱中。如下进行分析：在沃特世Acquity UPLC系统上(柱：沃特世Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，2.1x30mm；流速：1mL/min；55℃(柱温)；溶剂A：水中的0.05％甲酸，溶剂B：MeOH中的0.04％甲酸；从0至0.10min梯度95％溶剂A；从0.10至0.50min 95％溶剂A至20％溶剂A；从0.50至0.60min 20％溶剂A至5％溶剂A；从0.6至0.8min保持在5％溶剂A；从0.80至0.90min 5％溶剂A至95％溶剂A；以及从0.90至1.15min保持在95％溶剂A。
以下实例和本文其他地方使用的缩写词是：
Figure BDA0002541415150005211
Figure BDA0002541415150005221
实例18-1：3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-155)
Figure BDA0002541415150005222
向4-溴-2-(溴甲基)苯甲酸甲酯(A-1，15g，48.7mmol)于DMF(150mL)中的搅拌溶液中添加3-氨基哌啶-2,6-二酮-HCl(A-2，6.9g，53.6mmol)和K2CO3(20.2g，146.1mmol)。在70℃下，将所得混合物加热16h，在此之后将反应混合物冷却至室温，并且然后浓缩至干燥。然后添加水，并将混合物在室温下搅拌30min。将所得固体过滤，并用醚和乙酸乙酯洗涤，并在真空过滤下干燥，以得到A-10(10.6g，32.9mmol，67％产率)。MS[M+H]+＝323.0。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.99(s,1H),7.91-7.88(m,1H),7.72(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),5.11(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.47(d,J＝17.7Hz,1H),4.34(d,J＝17.7Hz,1H),2.98-2.83(m,1H),2.65-2.55(m,1H),2.45-2.29(m,1H),2.01(dtd,J＝12.7,5.3,2.3Hz,1H)。
步骤2.4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(A-12)
将在密封管中的A-10(1.8g，5.6mmol)于DMF(10mL)中的溶液用氩气吹扫5min，之后添加3,6-二氢-2H-吡啶-1-叔丁氧基羰基-4-硼酸频哪醇酯(A-11，2.2g，7.2mmol)、K3PO4(1.42g，6.7mmol)和Pd(dppf)Cl2·DCM(227mg，0.28mmol)。将反应混合物再用氩气吹扫5min，并且然后在90℃下加热16h。此后，将所述反应混合物冷却至室温，并且然后在减压下浓缩。将水添加到残余物中，然后将其用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且然后在减压下浓缩。将粗化合物通过硅胶色谱法(用在己烷中的70％-80％EtOAc洗脱)纯化，以得到呈固体的A-12(1.0g，2.4mmol，42％产率)。MS[M+H]+＝426.3。
步骤3.4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(A-13)
向A-12(1.0g，2.35mmol)于DMF(20mL)中的搅拌溶液中添加10％Pd/C(150mg)，并且在氢气气氛(气囊)下，在室温下，将混合物搅拌6h。然后将反应混合物通过
Figure BDA0002541415150005231
助滤剂床过滤。将滤液在减压下浓缩，得到呈固体的A-12(0.85g，1.97mmol，84％产率)。MS[M-tBu]+＝372.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(s,1H),7.81(d,J＝7.9Hz,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.29(s,1H),5.22(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.46(d,J＝16.0Hz,1H),4.31(d,J＝16.1Hz,1H),4.27(d,J＝16.2Hz,2H),2.97-2.67(m,5H),2.41-2.26(m,1H),2.23-2.13(m,1H),1.83(d,J＝12.6Hz,2H),1.71-1.55(m,2H),1.48(s,9H)。
步骤4.3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮盐酸盐(I-155)：
向A-12(0.85g，2.0mmol)于二噁烷(10mL)中的搅拌溶液中添加在二噁烷(5.0mL)中的4N HCl。然后将反应混合物在室温下搅拌2h。将反应物料在减压下浓缩，以得到呈固体的所希望的化合物I-155的HCl盐(0.65g，1.8mmol，90％产率，盐酸盐)。MS[M+H]+＝328.3。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.99(s,1H),9.28(s,1H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.39(d,J＝8.0Hz,1H),5.74(s,1H),5.11(dd,J＝13.3,5.2Hz,1H),4.46(d,J＝17.3Hz,1H),4.32(d,J＝17.3Hz,1H),3.36(d,J＝11.5Hz,2H),3.10-2.86(m,4H),2.61(d,J＝14.8Hz,1H),2.39(qd,J＝13.2,4.3Hz,1H),2.14-1.79(m,5H)。
实例18-2：3-(1-氧代-5-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-171)
Figure BDA0002541415150005241
步骤1：3-(1-氧代-5-(2,2,6,6-四甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)异吲哚啉-2-基)-哌啶-2,6-二酮(A-15)
将在密封管中的A-10(150mg，0.46mmol)于DMF(5mL)中的搅拌溶液用氩气吹扫5min，之后添加2,2,6,6-四甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)哌啶(A-14，185mg，0.69mmol)、Cs2CO3(300mg，0.92mmol)、和Pd(dppf)Cl2·DCM(19mg，0.02mmol)，并且将所得混合物再用氩气吹扫5min。然后将反应混合物在90℃下加热5h，在此之后将所述反应混合物冷却至室温，添加水，并且将混合物用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且然后在减压下浓缩。将粗材料通过硅胶色谱法(用15％MeOH/DCM洗脱)纯化，以得到呈固体的A-15(35mg，0.092mmol，20％产率)。MS[M+H]+＝382.3。
步骤2.3-(1-氧代-5-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-171)
向3-(1-氧代-5-(2,2,6,6-四甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(A-15，25mg，0.07mmol)于DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加Pd/C(5mg)。在氢气气氛(气囊)下，在室温下，将所得混合物搅拌5h。然后将反应混合物通过
Figure BDA0002541415150005252
助滤剂垫过滤，并且将滤液浓缩至干燥。将粗材料通过反相HPLC(含0.05％甲酸的MeCN/H2O)纯化，以得到呈固体的I-171(11mg，0.03mmol，44％产率)。MS[M+H]+＝384.4。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ11.0(s,1H),8.33-8.32(m,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.5(s,1H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),5.12(dd,J＝13.2,4.8Hz,1H),4.36(d,J＝17.4Hz,1H),4.31(d,J＝17.4Hz,1H),2.95-2.90(m,1H),2.43-2.39(m,2H),2.00-1.99(m,2H),1.54-1.50(m,2H),1.52-1.50(m,2H),1.26(s,6H),1.23(s,6H)。
根据方案1和以上提供的实例所示的一般方案，制备了以下化合物：
Figure BDA0002541415150005251
Figure BDA0002541415150005261
Figure BDA0002541415150005271
实例18-3：3-(5-(8-苄基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮HC(O)OH盐(I-265)
Figure BDA0002541415150005272
步骤1.3-(甲苯磺酰氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(A-17)
向3-羟基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸酯(A-16，570mg，2.51mmol)、Et3N(0.52mL，3.8mmol)、和DMAP(61mg，0.50mmol)于DCM(5mL)中的搅拌溶液中添加TsCl(574mg，3.01mmol)，并且将所得混合物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物用饱和水性NaHCO3淬灭，并用DCM萃取(3x)。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，并将粗材料通过硅胶色谱法(用在庚烷中的0％至40％EtOAc洗脱)纯化，以得到呈固体的A-17(91mg，0.22mmol，9％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.36(d,J＝8.5Hz,2H),4.83(t,J＝5.0Hz,1H),4.16(s,2H),2.47(s,3H),2.12-2.02(m,4H),2.00-1.90(m,2H),1.84(d,J＝15.3Hz,2H),1.45(s,9H)。
步骤2.3-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)-8-氮杂双环[3.2.1]-辛烷-8-甲酸叔丁酯(A-20)
在氮气气氛下，向A-18(56mg，0.15mmol)、56b(69mg，0.18mmol)、NiBr2(DME)(4.7mg，0.015mmol)、4,4’-二-叔丁基-2,2’-二吡啶基(4.1mg，0.015mmol)、KI(25mg，0.15mmol)和锰粉(17mg，0.30mmol)于DMA(0.7mL)中的搅拌悬浮液中添加4-乙基吡啶(0.017mL，0.15mmol)，并将所得混合物在80℃下剧烈搅拌4小时。然后将反应混合物用MeCN稀释，并且通过
Figure BDA0002541415150005281
助滤剂垫过滤，用MeCN洗脱。通过与庚烷共沸将滤液浓缩至干燥。将粗材料通过硅胶色谱法(用DCM中的0％至5％MeOH洗脱)纯化，得到呈固体的A-20(38.4mg，0.085mmol，56％产率)。MS[M+H]+＝454.5。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.58(s,1H),7.80(dd,J＝7.9,0.6Hz,1H),7.32(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.29(s,1H),5.23(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.46(d,J＝16.0Hz,1H),4.39-4.24(m,3H),3.20(tt,J＝11.8,5.2Hz,1H),2.94-2.74(m,2H),2.34(qd,J＝12.8,5.6Hz,1H),2.23-2.13(m,1H),2.09-2.02(m,2H),1.90(t,J＝12.9Hz,2H),1.80(q,J＝8.0,6.6,6.2Hz,2H),1.76-1.69(m,2H),1.51(s,9H)。
步骤3.3-(5-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮盐酸盐(I-188)
向A-20(38mg，0.084mmol)于THF(1mL)中的搅拌溶液中添加在二噁烷(0.7mL，2.8mmol)中的4M HCl，并且在60℃下，将所得混合物搅拌3小时。观察到形成白色沉淀物。然后将所述反应混合物用Et2O稀释，并且过滤。将沉淀物用Et2O洗涤，并然后干燥，以得到呈固体的I-188的盐酸盐(31.9mg，0.082mmol，98％)。MS[M+H]+＝354.3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.98(s,1H),9.18(s,1H),7.69(dd,J＝7.8,2.3Hz,1H),7.56(s,1H),7.50(d,J＝7.9Hz,1H),5.10(ddd,J＝13.2,5.2,2.1Hz,1H),4.45(d,J＝18.1Hz,1H),4.30(dd,J＝17.3,2.2Hz,1H),4.03(s,2H),3.26-3.21(m,1H),2.92(tt,J＝14.0,5.2Hz,1H),2.67-2.54(m,1H),2.45-2.31(m,1H),2.17(t,J＝13.1Hz,2H),2.09-1.92(m,5H),1.89-1.73(m,2H)。
步骤4.3-(5-(8-苄基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮HC(O)OH盐(I-265)
向I-188(20mg，0.051mmol)和苯甲醛(0.016mL，0.154mmol)于DMF(1mL)中的搅拌溶液中一次性添加三乙酰氧基硼氢化钠(33mg，0.15mmol)，并且在室温下，将所得混合物剧烈搅拌过夜。然后添加一滴HCOOH，并且将反应混合物在减压下浓缩。将粗材料通过反相HPLC(用含0.1％甲酸的MeCN/H2O洗脱)纯化，并将产物冻干，以得到呈固体的I-265的甲酸盐(15.0mg，0.031mmol，60％产率)。MS[M+H]+＝444.3。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.98(s,1H),8.25(s,1H),7.64(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,3H),7.35-7.31(m,2H),7.24(t,J＝7.3Hz,1H),5.10(dd,J＝13.0,5.0Hz,1H),4.42(d,J＝17.2Hz,1H),4.29(d,J＝17.1Hz,1H),3.61(s,2H),3.25(s,2H),3.13-3.01(m,1H),2.91(ddd,J＝17.9,13.2,5.3Hz,1H),2.59(d,J＝17.0Hz,1H),2.46-2.31(m,1H),2.14-1.94(m,3H),1.85(t,J＝12.4Hz,2H),1.76(d,J＝7.8Hz,2H),1.63(d,J＝12.7Hz,2H)。
根据实例18-3中所述的路径合成化合物I-260(MS[M+H]+＝404.2)。
实例18-4：3-(5-(1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-190)和(I-273)的非对映异构体
Figure BDA0002541415150005301
步骤1：3-(1-氧代-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(A-22a)
向在密封管中的A-10(3.0g，9.28mmol)于DMF(20mL)中的搅拌溶液中添加双(频哪醇)二硼(A-21，2.6g，10.2mmol)、KOAc(2.37g，27.9mmol)、和PdCl2(dppf)2(0.22g，0.28mmol)。将反应混合物用氩气吹扫5min，密封，并且然后在100℃下加热16h。将水添加至反应混合物中，并且在室温下搅拌15min。将固体沉淀，过滤，并且在真空下干燥，以得到呈固体的A-22a(2.3g，6.2mmol，66％产率)。MS[M+H]+＝371.0。
步骤2：5-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)-2,3,4,7-四氢-1H-氮杂卓-1-甲酸叔丁酯(A-23)
如PCT申请公开号2007/111904中所报道来制备5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2,3,4,7-四氢-1H-氮杂卓-1-甲酸叔丁酯A-22b。
向在密封管中的A-22a(1.0g，2.70mmol)于DMF(10.0mL)中的搅拌溶液中添加5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2,3,4,7-四氢-1H-氮杂卓-1-甲酸叔丁酯(A-22b，1.19g，3.24mmol)、Pd(PPh3)4(0.16g，0.13mmol)、和Na2CO3(0.85g，8.10mmol)。将混合物用氩气吹扫5min，并且然后密封，并且在100℃下加热3h。此后，将反应冷却并且添加水，之后用EtOAc萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩，并且通过硅胶色谱法(用60％-70％EtOAc/己烷洗脱)纯化，以得到呈固体的A-23(350 mg，0.796 mmol，29％产率)。MS[M+H]+＝440.0。
步骤3：4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(A-24)。
向A-23(0.35 g，0.80 mmol)于THF(10 mL)中的搅拌溶液中添加PtO2(100 mg)。将混合物在氢气囊下搅拌5 h。然后将反应混合物在
Figure BDA0002541415150005311
助滤剂床上过滤，并且然后在减压下浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(用40％-50％EtOAc/己烷洗脱)纯化，以得到呈固体的A-24(0.31 g，0.70 mmol，88％产率)，其由非对映异构体的混合物组成。MS[M+H]+＝442.0。
步骤4a：4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯(A-24)的手性分离
如下进行A-24(350 mg)的手性分离：使用Kinetex(150 mm X 21mm)，5.0μ柱，使用洗脱液(由流动相A＝在水中的0.05％TFA；流动相B＝乙腈组成)，以及流速20 mL/min，在25℃下，其中经20 min20％-70％流动相B:流动相A。在这些条件下，将两种化合物分离(A-24(峰1)Rt＝11.64 min和A-24(峰2)Rt＝17.41 min)。将对应于峰1和峰2的级分收集，并且在减压下浓缩，然后用水性饱和NaHCO3溶液中和，之后用DCM萃取。将有机层合并，经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩至干燥，得到呈白色固体状的峰1(50 mg)和峰2(45 mg)。MS[M+H]+＝442.0。
步骤4b：3-(5-(氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-166&I-167)
在0℃下，向A-24(峰1)(50 mg，0.113 mmol)于二噁烷(2.0 mL)中的搅拌溶液中添加在二噁烷(0.5 mL)中的4 M HCl。然后将反应搅拌，并且经2 h升温至室温。然后将反应混合物在减压下浓缩，得到非对映异构体A(40 mg，0.106 mmol，94％，盐酸盐)。MS[M+H]+＝342.3。1H NMR(CD3OD,300MHz):δ7.74(d,J＝8.1Hz,1H),7.49(1H,s),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),5.14(dd,J＝13.5,5.1Hz,1H),4.48-4.46(m,2H),3.74-3.71(m,1H),3.68-3.63(m,2H),3.59-3.55(m,1H),3.44-3.37(m,2H),3.02(m,1H),2.90-2.78(m,2H),2.51-2.47(m,1H),2.16-2.08(m,5H),2.00-1.80(m,2H)。
在0℃下，向A-24(峰2)(40mg，0.091mmol)于二噁烷(2.0mL)中的搅拌溶液中添加在二噁烷(0.5mL)中的4M HCl。然后将反应搅拌，并且经2h升温至室温。然后将反应混合物在减压下浓缩，以得到非对映异构体B(30mg，0.079mmol，87％，盐酸盐)。MS[M+H]+＝342.4。1H NMR(CD3OD,300MHz):δ7.74(d,J＝7.5Hz,1H),7.49(s,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),5.15(dd,J＝13.5,5.1Hz,1H),4.47-4.45(d,2H),3.74-3.71(m,1H),3.67-3.62(m,3H),3.58-3.55(m,1H),3.43-3.38(m,2H),3.02(m,1H),2.90-2.78(m,2H),2.51-2.48(m,1H),2.17-2.08(m,5H),2.09-1.87(m,1H)。
步骤5.3-(5-(1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-190和I-273)的非对映异构体
通过还原胺化，由I-166(80mg，0.21mmol)和苯甲醛(27mg，0.25mmol)来制备化合物I-190。在起始材料完全消耗后，将粗反应混合物在减压下浓缩，并且添加饱和水性NaHCO3。将所得混合物用DCM萃取，并且将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩至干燥。将所得固体用醚(5mL)和EtOAc(0.1mL)洗涤，得到呈固体的I-190(55mg，0.13mmol，60％产率)。绝对立体化学是未知的，并且是任意分配的。MS[M+H]+＝439.1。1H NMR(CD3OD,600MHz):δ7.69(d,J＝5.2Hz,1H),7.44(s,1H),7.39-7.36(m,3H),7.32-7.30(m,2H),7.26-7.24(m,1H),5.12(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H),4.47(d,J＝11.6Hz,1H),4.41(d,J＝11.2Hz,1H),3.71(2H,s),2.98-2.97(m,1H),2.92-2.86(m,2H),2.80-2.74(m,4H),2.47-2.45(m,1H),2.16-2.14(m,1H),1.94-1.84(m,1H),1.80(m,1H)。
以与以上关于I-190所述类似的方式，由I-167(80mg，0.21mmol)和苯甲醛(27mg，0.25mmol)来制备化合物I-273。将I-273分离，其为固体(55mg，0.13mmol，60％产率)。绝对立体化学是未知的，并且是任意分配的。MS[M+H]+＝439.1。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.0(1H,s),7.62(d,J＝5.2Hz,1H),7.46(s,1H),7.38-7.32(m,5H),7.24-7.23(m,1H),5.09(dd,J＝8.8,3.6Hz,1H),4.31(d,J＝11.6Hz,1H),4.28(d,J＝11.6Hz,1H),3.65(d,J＝9.1Hz,1H),3.63(d,J＝9.2Hz,1H),2.96-2.88(m,2H),2.76-2.69(m,1H),2.67-2.62(m,3H),2.61-2.50(m,2H),2.46-2.36(m,3H),1.99(m,2H),1.82(m,2H)。
实例18-5：3-(5-(1-苄基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)-哌啶-2,6-二酮(I-192)
Figure BDA0002541415150005331
向A-22a(500mg，1.35mmol)、A-25(428mg，1.62mmol)、和K2CO3于DMF(5mL)中的搅拌悬浮液中添加PdCl2(dppf)·DCM(55mg，0.07mmol)，并且将所得混合物用氩气吹扫10min，并且然后在130℃下搅拌90min。在起始材料完全消耗后，将反应混合物用冰冷的水淬灭，并且用EtOAc(3x50mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。将粗材料通过硅胶色谱法(用在DCM中的5％MeOH洗脱)纯化，以得到呈固体的I-192(20mg，0.46mmol，35％产率)。MS[M+H]+＝427.8。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.98(s,1H),7.94(s,1H),7.90(d,J＝7.6Hz,1H),7.80-7.76(m,2H),7.33-7.25(m,5H),6.76(d,J＝2.0Hz,1H),6.64(dd,J＝7.2,2.0Hz,1H),5.12(s,2H),5.12-5.08(m,1H),4.48(d,J＝17.2Hz,1H),4.36(d,J＝17.2Hz,1H),2.80-2.75(m,1H),2.60-2.53(m,1H),2.45-2.38(m,1H),2.02-1.97(m,1H)。
根据实例18-5中所述的方案合成以下化合物：
I-184：MS[M+H]+＝356.1。
I-186：MS[M+H]+＝342.1。
I-192：MS[M+H]+＝427.8。
实例18-6：3-(1-氧代-5-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-196)
Figure BDA0002541415150005341
步骤1：3-(1-氧代-5-乙烯基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(A-26)
向A-10(1.5g，4.66mmol)和三丁基(乙烯基)锡烷(2.04mL，6.95mmol)于二噁烷(15mL)中的溶液中添加PdCl2(PPh3)2(162mg，0.23mmol)，并且将所得混合物用氩气吹扫10min，并且然后在微波中在110℃下搅拌1h。在起始材料完全消耗后，将反应混合物用水淬灭，并且用EtOAc(2x50mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。将获得的粗材料通过硅胶色谱法(用己烷中的90％EtOAc洗脱)纯化。将纯级分收集，并且在减压下蒸发，以得到呈固体的A-26(500mg，1.85mmol，40％产率)。MS[M+H]+＝271.2。
步骤2：3-(1-氧代-5-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(I-196)
向A-26(200g，0.74mmol)和(叠氮甲基)苯(118mg，0.89mmol)于DCM(4mL)中的溶液中添加三氟甲磺酸(0.08mL，0.89mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌2h。在起始材料完全消耗后，将反应混合物用水淬灭，并且用EtOAc(2x50mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。将获得的粗材料通过反相HPLC(用在MeCN中的0.01％NH4OAc洗脱)纯化，以得到呈固体的I-196(15mg，0.04mmol，6％产率)。MS[M+H]+＝376.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.96(s,1H),7.66(d,J＝8.0Hz,1H),7.32-7.23(m,2H),6.92(t,J＝7.6Hz,1H),6.59-6.55(m,2H),6.41(t,J＝7.2Hz,1H),5.08(dd,J＝13.2,5.2Hz,1H),4.44-4.23(m,3H),3.24-3.18(m,1H),3.10-3.05(m,1H),2.95-2.86(m,1H),2.66-2.50(m,2H),2.42-2.31(m,1H),2.10-1.98(m,3H)。
将化合物I-197按以上在实例18-6中所述相同的方式合成。I-197：MS[M+H]+＝466.2。
等同物
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Claims (353)

1.一种融合多肽，所述融合多肽包含具有式(I)的化合物(COF1)/CRBN(小脑蛋白)结合多肽和异源多肽，例如，异源的哺乳动物多肽、细菌多肽或病毒多肽，其中所述具有式(I)的化合物是：
Figure FDA0002541415140000011
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
2.如权利要求1所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽融合。
3.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽通过肽键连接。
4.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽通过除肽键之外的键连接。
5.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其中所述异源多肽与所述COF1/CRBN结合多肽直接连接。
6.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽，其中所述异源多肽与所述COF1/CRBN结合多肽间接连接。
7.如权利要求1-6中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽经由接头可操作地连接，所述接头是例如，甘氨酸-丝氨酸接头，例如，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的接头。
8.如权利要求1-7中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽与所述异源多肽的C-末端或N-末端连接。
9.如权利要求1-8中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与小脑蛋白(CRBN)的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。
10.如权利要求1-9中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下，所述COF1/CRBN结合多肽不与CRBN结合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。
12.如权利要求1-11中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下，所述融合多肽不与CRBN结合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。
14.如权利要求1-13中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。
15.如权利要求13或14所述的融合多肽，其中在COF1的存在下，所述异源多肽或所述融合多肽在一个或多个赖氨酸或甲硫氨酸残基处被泛素化。
16.如权利要求1-15中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
17.如权利要求16所述的融合多肽，其中在COF1的存在下，所述融合多肽的降解由泛素化介导。
18.如权利要求9-17中任一项所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
19.如权利要求1-18中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽的长度在10和95个氨基酸残基之间、在15和90个氨基酸残基之间、在20和85个氨基酸残基之间、在25和80个氨基酸残基之间、在30和75个氨基酸残基之间、在35和70个氨基酸残基之间、在40和65个氨基酸残基之间、在45和65个氨基酸残基之间、在50和65个氨基酸残基之间或在55和65个氨基酸残基之间。
20.如权利要求1-19中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含β转角。
21.如权利要求1-20中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含β发夹。
22.如权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含β链。
23.如权利要求1-22中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含α螺旋。
24.如权利要求1-23中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。
25.如权利要求1-24中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。
26.如权利要求25所述的融合多肽，其中所述β发夹和所述第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
27.如权利要求1-26中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含来自以下的COF1/CRBN结合序列：天然存在的多肽或其COF1/CRBN结合变体，例如天然存在的IKZF多肽或其COF1/CRBN结合变体，例如天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4、IKZF5或其COF1/CRBN结合变体。
28.如权利要求27所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合序列包含来自以下的两个或更多个不连续序列：天然存在的多肽，例如天然存在的IKZF多肽，例如天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4或IKZF5。
29.如权利要求1-28中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF多肽或其结构基序。
30.如权利要求29所述的融合多肽，其中所述IKZF多肽是IKZF1多肽、IKZF3多肽、具有H141Q取代(根据SEQ ID NO:21编号)的IKZF2多肽、或具有H188Q取代(根据SEQ ID NO:22编号)的IKZF4多肽。
31.如权利要求1-30中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF(例如，IKZF1或IKZF3)的足够的氨基酸序列和/或结构基序使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
32.如权利要求31所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
33.如权利要求1-32中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基。
34.如权利要求1-33中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
35.如权利要求34所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
36.如权利要求1-35中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸取代的序列)。
37.如权利要求1-33中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
38.如权利要求37所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
39.如权利要求1-33、37或38中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸取代的序列)。
40.如权利要求36-39中任一项所述的融合多肽，其中以下氨基酸残基中的一个、两个、三个或全部保持不变：根据SEQ ID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺、在位置148处的半胱氨酸、在位置150处的谷氨酰胺、在位置152处的甘氨酸、在位置161处的亮氨酸或在位置162处的亮氨酸。
41.如权利要求40所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺保持不变。
42.如权利要求40所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:19编号，在位置148处的半胱氨酸保持不变。
43.如权利要求40所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:19编号，在位置152处的甘氨酸保持不变。
44.如权利要求1-43中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-139(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
45.如权利要求1-44中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5或77的氨基酸序列，或由其组成。
46.如权利要求1-44中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6或78的氨基酸序列，或由其组成。
47.如权利要求1-46中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
48.如权利要求47所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
49.如权利要求1-48中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249具有不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸取代的序列)。
50.如权利要求1-49中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
51.如权利要求1-49中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列。
52.如权利要求1-51中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180和236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF1的情况下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF1的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF1的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF1的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF1例如过量的COF1的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
53.如权利要求52所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
54.如权利要求1-53中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列(例如，包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的第一序列)，或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列(例如，与SEQID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列)；和包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的第二序列(例如，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的第二序列)，或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列)。
55.如权利要求1-54中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列，或由其组成。
56.如权利要求1-55中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQID NO:1或3的氨基酸序列，或由其组成。
57.如权利要求1-56中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:14或85的氨基酸序列，或由其组成。
58.如权利要求1-56中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列，例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:15或86的氨基酸序列，或由其组成。
59.如权利要求1-58中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含比相应的天然序列少至少一个赖氨酸。
60.如权利要求59所述的融合多肽，其中在相应的天然序列中的一个或多个赖氨酸残基被不同氨基酸，例如精氨酸置换。
61.如权利要求59或60所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含少于1、2、3、4或5个赖氨酸残基。
62.如权利要求61所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽不包含赖氨酸残基。
63.如权利要求1-62中任一项所述的融合多肽，其中例如，在COF1的存在下，所述COF1/CRBN结合多肽未被泛素化，例如，如本文所述的测定所测量，任选地其中泛素化是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中所测量。
64.如权利要求1-63中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:4、41、42和43。
65.如权利要求1-63中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQID NO:2或4的氨基酸序列，或由其组成。
66.如权利要求1-65中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1是免疫调节性酰亚胺药(IMiD)或其药学上可接受的盐。
67.如权利要求1-65中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1具有式(I-a)的结构：
Figure FDA0002541415140000141
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在，是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
68.如权利要求67所述的融合多肽，其中X是O。
69.如权利要求67或68所述的融合多肽，其中M不存在。
70.如权利要求67-69中任一项所述的融合多肽，其中环A是杂环基(例如，含氮杂环基，例如，2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮)。
71.如权利要求67-70中任一项所述的融合多肽，其中R4是氧代或ORB(例如，-OCH3或-OCH2CH3)，并且o是0、1或2。
72.如权利要求67-71中任一项所述的融合多肽，其中每个R2a和R2b独立地是氢，或R2a和R2b连同它们所附接的碳原子一起形成羰基基团。
73.如权利要求67-72中任一项所述的融合多肽，其中R3a是杂烷基(例如，-CH2NHC(O)CH2)、-N(RC)(RD)(例如，-NH2)或-N(RC)C(O)RA(例如，-NHC(O)CH3)。
74.如权利要求67-73中任一项所述的融合多肽，其中n是0。
75.如权利要求1-74中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1是沙利度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
76.如权利要求1-74中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1选自下组，该组由以下组成：来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。
77.如权利要求1-74中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1选自下组，该组由以下组成：
Figure FDA0002541415140000161
Figure FDA0002541415140000162
或其药学上可接受的盐。
78.如权利要求1-74中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。
79.如权利要求1-74中任一项所述的融合多肽，其中所述COF1是来那度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
80.如权利要求1-79中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽进一步包含降解结构域，其中所述降解结构域通过异源蛋白酶切割位点与所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。
81.如权利要求80所述的融合多肽，其中所述融合多肽从N-末端至C-末端包含：
i)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF1/CRBN结合多肽；
ii)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述COF1/CRBN结合多肽和所述异源多肽；
iii)所述COF1/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域；或
iv)所述异源多肽、和所述COF1/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
82.如权利要求80所述的融合多肽，其中所述融合多肽从N-末端至C-末端包含所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF1/CRBN结合多肽。
83.一种融合多肽，所述融合多肽包含由异源蛋白酶切割位点分开的第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包含降解结构域，并且所述第二结构域包含具有式(II)的化合物(COF2)/CRBN(小脑蛋白)结合多肽和异源多肽，例如，异源的哺乳动物多肽、细菌多肽或病毒多肽，其中所述具有式(II)的化合物是：
Figure FDA0002541415140000171
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、互变异构体或前药，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同它们所附接的碳原子一起形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R10独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE或L-标签；其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R11取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、C(O)RA、-C(O)ORB或B、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R11独立地是C1-C6烷基、卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA；
每个L独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、-C(O)RA1、-C(O)ORB1、-ORB1、-N(RC1)(RD1)、-C(O)N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RA1、-S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)或-N(RC1)S(O)xRE1，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个标签是能够与靶蛋白结合的靶向部分；
每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个R12独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、碳环基或杂环基；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
84.如权利要求80-83中任一项所述的融合多肽，其中所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在稳定化合物的存在下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍。
85.如权利要求84所述的融合多肽，其中在不存在所述稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
86.如权利要求84或85所述的融合多肽，其中所述表达水平和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
87.如权利要求84-86中任一项所述的融合多肽，其中在所述稳定化合物的存在下：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；或
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割。
88.如权利要求80-87中任一项所述的融合多肽，其中所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。
89.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域。
90.如权利要求89所述的融合多肽，其中所述降解结构域包含与SEQ ID NO:46或48至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
91.如权利要求90所述的融合多肽，其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
92.如权利要求89-91中任一项所述的融合多肽，其中所述稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或其药学上可接受的盐。
93.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域。
94.如权利要求93所述的融合多肽，其中所述降解结构域包含与SEQ ID NO:50至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
95.如权利要求93或94所述的融合多肽，其中所述稳定化合物是盾护物-1或其药学上可接受的盐。
96.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。
97.如权利要求96所述的融合多肽，其中所述降解结构域包含与SEQ ID NO:51至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
98.如权利要求96或97所述的融合多肽，其中所述稳定化合物是甲氧苄啶或其药学上可接受的盐。
99.如权利要求80-98中任一项所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞内蛋白酶切割。
100.如权利要求99所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点被选自下组的蛋白酶切割，该组由以下组成：弗林蛋白酶、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。
101.如权利要求99或100所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点包含具有选自下组的切割基序的序列，该组由以下组成：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQID NO:52)、RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:53)、RRX共有基序(SEQID NO:54)、I-E-P-D-X共有基序(SEQ ID NO:55)、Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ ID NO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:63)。
102.如权利要求99所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶切割。
103.如权利要求102所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的弗林蛋白酶切割位点，该组由以下组成：RTKR(SEQ ID NO:123)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:127)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:129)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:131)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:133)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:135)；CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:137)；和SARNRQKR(SEQ IDNO:34)。
104.如权利要求102所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点包含GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:125)的弗林蛋白酶切割位点。
105.如权利要求80-98中任一项所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞外蛋白酶切割。
106.如权利要求105所述的融合多肽，其中所述哺乳动物细胞外蛋白酶选自下组，该组由以下组成：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。
107.如权利要求106所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ IDNO:56)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:57)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:58)、LPXTG/A共有基序(SEQID NO:59)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:60)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:61)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:62)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ IDNO:63)。
108.如权利要求83-107中任一项所述的融合多肽，其中所述降解结构域与所述异源蛋白酶切割位点融合，所述异源蛋白酶切割位点进一步与所述第二结构域融合。
109.如权利要求83-108中任一项所述的融合多肽，其包含，从N-末端至C-末端：
i)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF2/CRBN结合多肽；
ii)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述COF2/CRBN结合多肽和所述异源多肽；
iii)所述COF2/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域；或
iv)所述异源多肽、和所述COF2/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
110.如权利要求83-108中任一项所述的融合多肽，其包含，从N-末端至C-末端，所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF2/CRBN结合多肽。
111.如权利要求83-110中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与小脑蛋白(CRBN)的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。
112.如权利要求83-111中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下，所述COF2/CRBN结合多肽不与CRBN结合。
113.如权利要求83-112中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量。
114.如权利要求83-113中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下，所述融合多肽不与CRBN结合。
115.如权利要求83-114中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。
116.如权利要求83-115中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量。
117.如权利要求115或116所述的融合多肽，其中在COF2的存在下，所述异源多肽或所述融合多肽在一个或多个赖氨酸或甲硫氨酸残基处被泛素化。
118.如权利要求83-117中任一项所述的融合多肽，其中在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
119.如权利要求118所述的融合多肽，其中在COF2的存在下，所述融合多肽的降解由泛素化介导。
120.如权利要求111-119中任一项所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
121.如权利要求83-120中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽的长度在10和95个氨基酸残基之间、在15和90个氨基酸残基之间、在20和85个氨基酸残基之间、在25和80个氨基酸残基之间、在30和75个氨基酸残基之间、在35和70个氨基酸残基之间、在40和65个氨基酸残基之间、在45和65个氨基酸残基之间、在50和65个氨基酸残基之间或在55和65个氨基酸残基之间。
122.如权利要求83-121中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含β转角。
123.如权利要求83-122中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含β发夹。
124.如权利要求83-123中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含β链。
125.如权利要求83-124中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含α螺旋。
126.如权利要求83-125中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋。
127.如权利要求83-126中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋。
128.如权利要求127所述的融合多肽，其中所述β发夹和所述第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
129.如权利要求83-128中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含来自以下的COF2/CRBN结合序列：天然存在的多肽或其COF2/CRBN结合变体，例如天然存在的IKZF多肽或其COF2/CRBN结合变体，例如天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4、或IKZF5其COF2/CRBN结合变体。
130.如权利要求129所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合序列包含来自以下的两个或更多个不连续序列：天然存在的多肽，例如天然存在的IKZF多肽，例如天然存在的IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4或IKZF5。
131.如权利要求83-130中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF多肽或其结构基序。
132.如权利要求131所述的融合多肽，其中所述IKZF多肽是IKZF1多肽、IKZF3多肽、具有H141Q取代(根据SEQ ID NO:21编号)的IKZF2多肽、或具有H188Q取代(根据SEQ ID NO:22编号)的IKZF4多肽。
133.如权利要求83-132中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF(例如，IKZF1或IKZF3)的足够的氨基酸序列和/或结构基序使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
134.如权利要求133所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
135.如权利要求83-134中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF1或IKZF3的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基。
136.如权利要求83-135中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
137.如权利要求136所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
138.如权利要求83-137中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸取代的序列)。
139.如权利要求83-137中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
140.如权利要求139所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
141.如权利要求83-137、139或140中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-170具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸取代的序列)。
142.如权利要求138-141中任一项所述的融合多肽，其中以下氨基酸残基中的一个、两个、三个或全部保持不变：根据SEQ ID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺、在位置148处的半胱氨酸、在位置150处的谷氨酰胺、在位置152处的甘氨酸、在位置161处的亮氨酸或在位置162处的亮氨酸。
143.如权利要求142所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:19编号，在位置147处的谷氨酰胺保持不变。
144.如权利要求142所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:19编号，在位置148处的半胱氨酸保持不变。
145.如权利要求142所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:19编号，在位置152处的甘氨酸保持不变。
146.如权利要求83-145中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-139(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
147.如权利要求83-146中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:5或77的氨基酸序列，或由其组成。
148.如权利要求83-146中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:6或78的氨基酸序列，或由其组成。
149.如权利要求83-148中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
150.如权利要求149所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
151.如权利要求83-150中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)(例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列)或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249具有不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸取代的序列)。
152.如权利要求83-151中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
153.如权利要求83-152中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列。
154.如权利要求83-153中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含来自IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的足够的氨基酸序列和/或结构基序(例如，来自SEQ ID NO:19的氨基酸残基136-180和236-249的足够的氨基酸序列和/或结构基序)使得：
i)在不存在COF2的情况下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)在不存在COF2的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)在不存在COF2的情况下所述异源多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述异源多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量；或
v)在不存在COF2的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF2例如过量的COF2的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
155.如权利要求154所述的融合多肽，其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
156.如权利要求83-155中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列(例如，包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的第一序列)，或与IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列(例如，与SEQID NO:19的氨基酸残基136-180差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的第一序列)；和包含IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)的第二序列(例如，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的第二序列)，或与IKZF3的氨基酸残基236-249(根据SEQ ID NO:19编号)差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列(例如，与SEQ ID NO:19的氨基酸残基236-249差异不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的第二序列)。
157.如权利要求83-156中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249(根据SEQ ID NO:19编号)，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列，或由其组成。
158.如权利要求83-157中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列，或由其组成。
159.如权利要求83-158中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-180(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:14或85的氨基酸序列，或由其组成。
160.如权利要求83-159中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含：包含IKZF3的氨基酸残基136-170(根据SEQ ID NO:19编号)的第一序列和包含MALEKMALEKMALE(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列的第二序列，例如，所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:15或86的氨基酸序列，或由其组成。
161.如权利要求83-160中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含比相应的天然序列少至少一个赖氨酸。
162.如权利要求161所述的融合多肽，其中在相应的天然序列中的一个或多个赖氨酸残基被不同氨基酸，例如精氨酸置换。
163.如权利要求161或162所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含少于1、2、3、4或5个赖氨酸残基。
164.如权利要求163所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽不包含赖氨酸残基。
165.如权利要求83-164中任一项所述的融合多肽，其中例如，在COF2的存在下，所述COF2/CRBN结合多肽未被泛素化，例如，如本文所述的测定所测量，任选地其中泛素化是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中所测量。
166.如权利要求83-165中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:4、41、42和43。
167.如权利要求83-165中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列，或由其组成。
168.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2是免疫调节性酰亚胺药(IMiD)或其药学上可接受的盐。
169.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2具有式(I)的结构：
Figure FDA0002541415140000331
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
170.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2具有式(I-a)的结构：
Figure FDA0002541415140000341
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在，是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
171.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2是沙利度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
172.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2选自下组，该组由以下组成：来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。
173.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2选自下组，该组由以下组成：
Figure FDA0002541415140000361
Figure FDA0002541415140000362
或其药学上可接受的盐。
174.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。
175.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2是来那度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
176.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含具有式(I)的结构：
Figure FDA0002541415140000363
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
177.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含具有式(I-a)的结构：
Figure FDA0002541415140000371
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
M不存在、是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、或3；
o是0、1、2、3、4、或5；和
x是0、1、或2。
178.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含免疫调节性酰亚胺药(IMiD)或其药学上可接受的盐。
179.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含沙利度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
180.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含来那度胺、泊马度胺、沙利度胺和2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺或其药学上可接受的盐。
181.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含选自下组的化合物，该组由以下组成：
Figure FDA0002541415140000391
Figure FDA0002541415140000392
或其药学上可接受的盐。
182.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐。
183.如权利要求83-167中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含来那度胺或其类似物或药学上可接受的盐。
184.如权利要求176-183中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2进一步包含配体(例如，其中式(II)中的R10是L-标签)。
185.如权利要求176-184中任一项所述的融合多肽，其中式(II)中的R10是L-标签，L是接头，所述接头选自在国际专利公开号WO2017/024318(例如，图28-31)中披露的接头，并且标签选自在国际专利公开号WO 2017/024318(例如，表T，第119-129页)中披露的dTAG靶向配体。
186.如权利要求83-184中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2包含IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和配体，其中所述IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)例如经由接头与所述配体连接。
187.如权利要求184-186中任一项所述的融合多肽，其中所述COF2/CRBN结合多肽与所述配体结合，并且其中在不存在所述配体的情况下，所述COF2/CRBN结合多肽与IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)之间的结合不超过所述COF2/CRBN结合多肽与所述配体之间的结合的0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％或10％，例如，所述COF2/CRBN结合多肽不与IMiD(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)结合，任选地其中所述COF2/CRBN结合多肽选自国际专利公开号WO 2017/024318(例如，第36-65页)中披露的dTAG。
188.如权利要求1-187中任一项所述的融合多肽，其中所述异源多肽选自细胞质多肽和/或细胞核多肽或跨膜多肽，例如，在表2中的异源多肽。
189.如权利要求188所述的融合多肽，其中所述细胞质多肽和/或细胞核多肽选自下组，该组由以下组成：细胞凋亡途径的组分(例如，半胱天冬酶9)、CRISPR/Cas系统的组分(例如，Cas9)、转录因子(例如，MITF、c-Myc、STAT3、STAT5、NF-κB、β-连环蛋白、Notch、GLI或c-JUN)、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)、FKBP和Tau。
190.如权利要求188所述的融合多肽，其中所述跨膜多肽选自下组，该组由以下组成：CD62L、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CCR10、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CTLA4、PD1、BTLA、VISTA、CD137L、CD80、CD86、TIGIT、CD3、CD8、CD19、CD22、CD20、BCMA和嵌合抗原受体(CAR)。
191.如权利要求188所述的融合多肽，其中所述异源多肽选自下组，该组由以下组成：嵌合抗原受体(CAR)、CRISPR/Cas系统的组分(例如，Cas9)、CD8、CD19和CD22。
192.如权利要求191所述的融合多肽，其中所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
193.如权利要求192所述的融合多肽，其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
194.如权利要求193所述的融合多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包含一个或多个初级信号传导结构域。
195.如权利要求193或194所述的融合多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激信号传导结构域。
196.如权利要求194所述的融合多肽，其中所述一个或多个初级信号传导结构域中的一个包含CD3-ζ刺激结构域。
197.如权利要求195所述的融合多肽，其中所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个是细胞内结构域，所述细胞内结构域来自选自下组的共刺激蛋白，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
198.如权利要求197所述的融合多肽，其中所述共刺激信号传导结构域中的所述一个或多个包含4-1BB共刺激结构域。
199.如权利要求197或198所述的融合多肽，其中所述共刺激信号传导结构域中的所述一个或多个包含CD28共刺激结构域。
200.如权利要求193-199中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原结合结构域是scFv。
201.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合，该组由以下组成：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和阿贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因多肽(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑色素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；天冬酰胺内肽酶；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
202.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原选自CD19、CD22、BCMA、CD20、CD123、EGFRvIII或间皮素。
203.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原是CD19。
204.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原是CD22。
205.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原是BCMA。
206.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原是CD20。
207.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原是CD123。
208.如权利要求193-200中任一项所述的融合多肽，其中所述抗原是EGFRvIII。
209.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1-208中任一项所述的融合多肽。
210.一种载体，所述载体包含如权利要求209所述的核酸分子。
211.如权利要求210所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
212.如权利要求210所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
213.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含如权利要求210-212中任一项所述的载体。
214.一种细胞，例如宿主细胞，所述细胞包含如权利要求1-208中任一项所述的融合多肽、如权利要求209所述的核酸分子或如权利要求210-212中任一项所述的载体。
215.如权利要求214所述的细胞，其中所述细胞，例如宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞，例如人效应细胞，例如人T细胞或人NK细胞。
216.如权利要求214或215所述的细胞，其中所述细胞，例如宿主细胞是表达CAR的细胞，例如CAR-T细胞。
217.如权利要求214或215所述的细胞，其中所述细胞，例如宿主细胞包含CRISPR/Cas系统的组分。
218.如权利要求214-217中任一项所述的细胞，其中所述细胞，例如宿主细胞是人癌症细胞，例如人肿瘤细胞。
219.如权利要求214-218中任一项所述的细胞，其中所述细胞，例如宿主细胞包含泛素连接酶复合物，例如E3泛素连接酶复合物，其中所述泛素连接酶复合物包含CRBN。
220.如权利要求214-219中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽，或所述细胞包含编码如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽的核酸分子，其中当所述细胞与COF1，例如过量的COF1接触时：
i)所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞不与COF1接触时所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)所述融合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
iii)所述异源多肽的泛素化与当所述细胞不与COF1接触时所述异源多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)所述融合多肽的泛素化与当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
v)所述融合多肽的降解与当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽的降解相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
vi)所述融合多肽的表达水平不超过当所述细胞不与COF1接触时所述融合多肽的表达水平的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
221.如权利要求214-220所述的细胞，其中所述细胞进一步包含COF1，例如，来那度胺或泊马度胺，或其药学上可接受的盐。
222.如权利要求214-219中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含如权利要求80-82、84-107或188-208中任一项所述的融合多肽，或所述细胞包含编码如权利要求80-82、84-107或188-208中任一项所述的融合多肽的核酸分子，其中在不存在稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
223.如权利要求214-219中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽，或所述细胞包含编码如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽的核酸分子，其中在不存在稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
224.如权利要求222或223所述的细胞，其进一步包含能够切割所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶。
225.如权利要求222-224中任一项所述的细胞，当所述细胞与稳定化合物，例如过量的稳定化合物接触时：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
iii)所述融合多肽的表达水平与当所述细胞不与所述稳定化合物接触时所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
226.如权利要求222-225中任一项所述的细胞，其进一步包含稳定化合物。
227.如权利要求222-226中任一项所述的细胞，其中所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐，并且任选地其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
228.如权利要求222或224-227中任一项所述的细胞，其中当所述细胞与稳定化合物，例如过量的稳定化合物和COF1，例如过量的COF1二者接触时：
i)所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞仅与所述稳定化合物而不与COF1接触时所述COF1/CRBN结合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)所述融合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1接触时所述融合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定如免疫沉淀所测量；
iii)所述异源多肽的泛素化与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1接触时所述异源多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)所述融合多肽的泛素化与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1接触时所述融合多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
v)所述融合多肽的降解与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1接触时所述融合多肽的降解相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
vi)所述融合多肽的表达水平不超过当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF1接触时所述融合多肽的表达水平的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
229.如权利要求222或224-228中任一项所述的细胞，其进一步包含COF1，例如来那度胺或泊马度胺，或其药学上可接受的盐。
230.如权利要求223-229中任一项所述的细胞，其中当所述细胞与稳定化合物，例如过量的稳定化合物和COF2，例如过量的COF2二者接触时：
i)所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF2接触时所述COF2/CRBN结合多肽与CRBN的缔合相比，增加了至少例如，10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量；
ii)所述融合多肽与CRBN的缔合与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF2接触时所述融合多肽与CRBN的缔合相比增加了至少例如10、50、100、1000或10000倍，例如，如本文所述的测定如免疫沉淀所测量；
iii)所述异源多肽的泛素化与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF2接触时所述异源多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
iv)所述融合多肽的泛素化与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF2接触时所述融合多肽的泛素化相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定所测量；
v)所述融合多肽的降解与当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF2接触时所述融合多肽的降解相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
vi)所述融合多肽的表达水平不超过当所述细胞仅与所述稳定化合物接触但不与COF2接触时所述融合多肽的表达水平的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
231.如权利要求223-230中任一项所述的细胞，其进一步包含COF2，例如来那度胺或泊马度胺，或其药学上可接受的盐。
232.如权利要求214-231中任一项所述的细胞，其中所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
233.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-208中任一项所述的融合多肽或如权利要求214-232中任一项所述的细胞，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。
234.一种制备如权利要求214-232中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括向细胞，例如免疫效应细胞提供如权利要求209所述的核酸分子、如权利要求210-212中任一项所述的载体，或如权利要求213所述的病毒颗粒。
235.一种降解融合多肽的方法，所述方法包括使如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)接触，任选地其中在COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
236.如权利要求235所述的方法，其中，使所述融合多肽或所述细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)离体接触。
237.如权利要求235所述的方法，其中，使所述融合多肽或所述细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)在体内接触。
238.一种调节融合多肽表达的方法，所述方法包括：
i)使如权利要求80-82、84-107或188-208中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与稳定化合物接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下：
a)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
b)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
c)所述融合多肽的表达水平与在不存在所述稳定化合物的情况下的所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
239.如权利要求238所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)使如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)接触，任选地其中在COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后和步骤ii)之前的所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
240.如权利要求238或239所述的方法，其中所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐，并且任选地其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
241.如权利要求238-240中任一项所述的方法，其中使所述融合多肽或所述细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和/或所述稳定化合物离体接触。
242.如权利要求238-240中任一项所述的方法，其中使所述融合多肽或所述细胞与COF1(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和/或所述稳定化合物在体内接触。
243.一种调节融合多肽表达的方法，所述方法包括：
i)使如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与稳定化合物接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下：
a)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
b)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
c)所述融合多肽的表达水平与在不存在所述稳定化合物的情况下的所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
244.如权利要求243所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)使如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)接触，任选地其中在COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后和步骤ii)之前的所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
245.如权利要求243或244所述的方法，其中所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐，并且任选地其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
246.如权利要求243-245中任一项所述的方法，其中使所述融合多肽或所述细胞与COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和/或所述稳定化合物离体接触。
247.如权利要求243-245中任一项所述的方法，其中使所述融合多肽或所述细胞与COF2(例如，来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐)和/或所述稳定化合物在体内接触。
248.如权利要求234-247中任一项所述的方法，其中所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
249.一种制备细胞的方法，所述方法包括：
i)提供包含编码融合多肽的核酸分子的细胞，所述融合多肽包含具有式1的化合物(COF1)/CRBN结合多肽和嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域；和
ii)使所述细胞与COF1离体接触，任选地其中：
在COF1的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF1的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，其中所述具有式(I)的化合物是：
Figure FDA0002541415140000521
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；和
x是0、1、或2。
250.如权利要求249所述的方法，其中，在所述细胞与COF1离体接触后，所述细胞的增殖相对于在与COF1接触之前所述细胞的增殖增加了至少例如1.2、1.5、2、5或10倍。
251.如权利要求250所述的方法，其中，COF1是来那度胺或泊马度胺，或其药学上可接受的盐。
252.如权利要求249或250所述的方法，其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
253.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括
i)使包含如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽的细胞与COF1离体接触，任选地其中：
在COF1的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF1离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，并且
ii)向所述受试者施用有效量的所述细胞，任选地其中所述方法进一步包括在步骤i)之后且在步骤ii)之前：
减少与所述细胞接触的，例如所述细胞内和/或所述细胞周围的COF1的量，
从而治疗所述疾病。
254.如权利要求253所述的方法，其进一步包括在步骤ii)之后：
iii)向所述受试者施用有效量的COF1，任选地其中COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF1的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF1的施用减少或预防副作用。
255.如权利要求254所述的方法，其进一步包括在步骤iii)之后：
iv)中止COF1的施用，任选地其中中止COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤iii)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF1的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤ii)之后且在步骤iii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF1施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF1施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
256.如权利要求255所述的方法，其进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤iii)和/或iv)，
从而治疗所述疾病。
257.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的包含如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽的细胞，任选地其中在施用之前，使所述细胞与COF1离体接触，任选地其中：
在COF1的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF1离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中在所述细胞与COF1离体接触之后且在向受试者施用所述细胞之前，减少与所述细胞接触的，例如在所述细胞内和/或在所述细胞周围的COF1的量，
从而治疗所述疾病。
258.如权利要求257所述的方法，其中，在施用之前，所述细胞不与COF1离体接触。
259.如权利要求257或258所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)向所述受试者施用有效量的COF1，任选地其中COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF1的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF1的施用减少或预防副作用。
260.如权利要求259所述的方法，其进一步包括在步骤ii)之后：
iii)中止COF1的施用，任选地其中中止COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF1的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤i)之后且在步骤ii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF1施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF1施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
261.如权利要求260所述的方法，其进一步包括在步骤iii)之后：
iv)重复步骤ii)和/或iii)，
从而治疗所述疾病。
262.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的COF1，其中所述受试者包含含有如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽的细胞，任选地其中COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在COF1的施用之前的所述融合多肽的表达水平降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF1的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF1的施用减少或预防副作用。
263.如权利要求262所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止COF1的施用，任选地其中中止COF1的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF1的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在COF1的施用之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF1施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF1施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
264.如权利要求263所述的方法，其进一步包括在步骤ii)之后：
iii)重复步骤i)和/或ii)，
从而治疗所述疾病。
265.如权利要求253-264中任一项所述的方法，其中COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
266.如权利要求259-265中任一项所述的方法，其中COF1是来那度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中将来那度胺或其药学上可接受的盐按例如2.5mg、5mg、10mg、15mg或25mg/天施用。
267.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用：
(1)稳定化合物，和
(2)有效量的包含如权利要求80-82、84-107或188-208中任一项所述的融合多肽的细胞，或有效量的包含如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽的细胞，任选地其中：
在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平，
从而治疗所述疾病。
268.如权利要求267所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者应答步骤i)的治疗(例如，所述受试者对所述步骤i)的治疗具有完全应答，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)，和/或
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者对步骤i)的治疗的应答(例如，所述受试者对步骤i)的治疗具有完全应答，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)。
269.如权利要求267所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述稳定化合物的施用的中止减少或预防副作用。
270.如权利要求267所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
iv)中止所述稳定化合物的施用并且向所述受试者施用有效量的COF1或COF2，任选地其中步骤iv)将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)步骤iv)响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)步骤iv)减少或预防副作用。
271.如权利要求270所述的方法，其中，所述副作用是急性毒性。
272.如权利要求270或271所述的方法，其进一步包括在步骤iv)之后：
v)例如，在表面上表达所述融合多肽的细胞的量小于预定值持续例如，1天、5天、10天或15天之后，中止COF1或COF2的施用。
273.如权利要求268-272中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后：
vi)施用有效量的稳定化合物，任选地其中所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后且在步骤vi)之前的所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述稳定化合物的施用响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述稳定化合物的施用治疗或预防肿瘤复发。
274.如权利要求273所述的方法，其进一步包括在步骤vi)之后：
vii)重复步骤iii)、iv)、v)或vi)，
从而治疗所述疾病。
275.如权利要求267-274中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤i)之前：
viii)使所述细胞与稳定化合物离体接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平。
276.如权利要求267-274中任一项所述的方法，其中在施用之前，所述细胞不与所述稳定化合物离体接触。
277.如权利要求276所述的方法，其中，在施用之前，所述细胞不与所述稳定化合物、COF1或COF2中的任一者离体接触。
278.如权利要求267-277中任一项所述的方法，其中所述稳定化合物是巴多昔芬或其药学上可接受的盐，并且任选地其中所述降解结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
279.如权利要求270-278中任一项所述的方法，其中COF1是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF1/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
280.如权利要求270-278中任一项所述的方法，其中COF2是来那度胺或泊马度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中所述COF2/CRBN结合多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-6、11-15、40、41-43、77、78、84-86和100(例如，所述COF1/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成)。
281.如权利要求270-280中任一项所述的方法，其中COF1或COF2是来那度胺或其药学上可接受的盐，任选地其中来那度胺或其药学上可接受的盐按例如2.5mg、5mg、10mg、15mg或25mg/天施用。
282.如权利要求253-281中任一项所述的方法，其中所述融合多肽的异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
283.如权利要求1-233中任一项所述的融合多肽、核酸分子、载体、病毒颗粒、细胞或药物组合物，用作药物。
284.如权利要求1-233中任一项所述的融合多肽、核酸分子、载体、病毒颗粒、细胞或药物组合物，用于在对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者的治疗中使用，例如，用于在如权利要求253-282中任一项所述的方法中使用。
285.用于如权利要求253-284中任一项所述使用的方法或组合物，其中所述与肿瘤抗原表达相关的疾病是癌症。
286.用于如权利要求285所述使用的方法或组合物，其中所述癌症是间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)，例如在对至少一种先前标准疗法已经进展的受试者中；肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌)；胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌或转移性胰腺导管腺癌(PDA)，例如在对至少一种先前标准疗法已经进展的受试者中)；食管腺癌、卵巢癌(例如，浆液性上皮性卵巢癌，例如在至少一种先前标准疗法方案后已经进展的受试者中)、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌，或其任何组合。
287.用于如权利要求253-284中任一项所述使用的方法或组合物，其中所述与肿瘤抗原表达相关的疾病是血液学癌症，例如，选自白血病或淋巴瘤的血液学癌症。
288.用于如权利要求287所述使用的方法或组合物，其中所述癌症选自：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
289.用于如权利要求287所述使用的方法或组合物，其中所述癌症选自MCL、CLL、ALL、霍奇金淋巴瘤、AML或多发性骨髓瘤。
290.用于如权利要求253-289中任一项所述使用的方法或组合物，其中所述细胞对所述受试者是自体的。
291.用于如权利要求253-289中任一项所述使用的方法或组合物，其中所述细胞对所述受试者的同种异体的。
292.用于如权利要求253-291中任一项所述使用的方法或组合物，其中所述细胞是表达CAR的细胞，例如CART细胞。
293.用于如权利要求253-292中任一项所述使用的方法或组合物，其中在施用COF1或COF2之前，所述受试者被施用表达至少一种如权利要求1-208中任一项所述的融合多肽的细胞。
294.一种鉴定与具体生物学表型相关的遗传元件，例如与癌症的发展和/或进展相关的遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过将细胞暴露于COF1，例如来那度胺或其药学上可接受的盐，在所述细胞中调节如权利要求1-79或188-208中任一项所述的融合多肽的表达，
(ii)选择具有目的表型，例如与癌症的发展和/或进展相关的表型的细胞，和
(iii)鉴定诱导所述目的表型的所述融合多肽，
其中所述细胞暴露于COF1，例如来那度胺或其药学上可接受的盐将所述融合多肽的表达水平相对于在暴露于COF1，例如来那度胺或其药学上可接受的盐之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
295.一种鉴定与具体生物学表型相关的遗传元件，例如与癌症的发展和/或进展相关的遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过将细胞暴露于稳定化合物，例如巴多昔芬或其药学上可接受的盐并然后暴露于COF1或COF2，例如来那度胺或其药学上可接受的盐，在所述细胞中调节如权利要求80-82、84-107或188-208中任一项所述的融合多肽的表达或如权利要求83-208中任一项所述的融合多肽的表达，
(ii)选择具有目的表型，例如与癌症的发展和/或进展相关的表型的细胞，和
(iii)鉴定诱导所述目的表型的所述融合多肽，
其中所述细胞暴露于稳定化合物，例如巴多昔芬或其药学上可接受的盐将所述融合多肽的表达水平相对于在暴露于所述稳定化合物，例如巴多昔芬或其药学上可接受的盐之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，并且其中所述细胞暴露于COF1或COF2，例如来那度胺或其药学上可接受的盐将所述融合多肽的表达水平相对于在暴露于所述稳定化合物之后且在暴露于COF1或COF2，例如来那度胺或其药学上可接受的盐之前所述融合多肽的表达水平降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
296.一种融合多肽，所述融合多肽包含具有式(III)的化合物(COF3)/CRBN(小脑蛋白)结合多肽和异源多肽，例如，异源的哺乳动物多肽、细菌多肽或病毒多肽，其中所述具有式(III)的化合物是：
Figure FDA0002541415140000641
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure FDA0002541415140000642
任选地是双键；
每个R1独立地是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟基烷基或卤代，或
两个R1连同它们所附接的碳原子一起形成5元或6元杂环基环，或
当在相邻原子上时，两个R1连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基环；
R2是氢、C1-C6烷基、-C(O)C1-C6烷基、-C(O)(CH2)0-3-C6-C10芳基、-C(O)O(CH2)0-3-C6-C10芳基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R5取代，或
当在相邻原子上时，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环基环；
R3是氢，或当
Figure FDA0002541415140000651
是双键时，R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6、-C(O)NR6R6'、-NR6C(O)R6'、卤代、-OH、-NH2、氰基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至4个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2、氰基、C3-C7碳环基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是氢、C1-C6烷基或C6-C10芳基；
每个R7独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-C(O)R8、-(CH2)0-3C(O)OR8、-C(O)NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9、-S(O)pNR8R9、-S(O)pR12、(C1-C6)羟基烷基、卤代、-OH、-O(CH2)1-3CN、-NH2、氰基、-O(CH2)0-3-C6-C10芳基、金刚烷基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的-O(CH2)0-3-5元或6元杂芳基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的单环或二环5元至10元杂芳基、C3-C7碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R11取代，并且所述芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基和C1-C6烷氧基或
两个R7与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)，或
当在相邻原子上时，两个R7连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R10独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基或
两个R10与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)；
每个R11独立地选自氰基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中每个芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基；
R12是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基；
Rx是氢或氘；
p是0、1或2；
n是0、1、或2；
y是1或2，其中n+y≤3；和
q是0、1、2、3或4。
297.如权利要求296所述的融合多肽，其中所述具有式(III)的化合物是具有式(III-b)的化合物：
Figure FDA0002541415140000671
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中X1、R1、R2、n、q、及其亚变量是如在权利要求296中针对式(III)的描述所定义。
298.如权利要求296或297所述的融合多肽，其中所述具有式(III)的化合物是具有式(III-d)的化合物：
Figure FDA0002541415140000672
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中R1、R2、q及其亚变量是如在权利要求296中针对式(III)的描述所定义。
299.如权利要求296-298中任一项所述的融合多肽，其中：
(i)所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽融合，
(ii)所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽通过肽键连接，
(iii)所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽通过除肽键之外的键连接，
(iv)所述异源多肽与所述COF3/CRBN结合多肽直接连接，
(v)所述异源多肽与所述COF3/CRBN结合多肽间接连接，
(vi)所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽经由接头可操作地连接，例如，甘氨酸-丝氨酸接头，例如，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的接头，或
(vii)所述COF3/CRBN结合多肽与所述异源多肽的C-末端或N-末端连接。
300.如权利要求296-299中任一项所述的融合多肽，其中：
(i)在不存在COF3的情况下所述融合多肽与CRBN的缔合不超过在COF3例如过量的COF3的存在下所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％或20％，例如，如本文所述的测定例如免疫沉淀所测量，任选地其中在不存在COF3的情况下，所述融合多肽不与CRBN结合；
(ii)在不存在COF3的情况下所述融合多肽的泛素化不超过在COF3例如过量的COF3的存在下所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定所测量，任选地其中在COF3的存在下，所述融合多肽在一个或多个赖氨酸或甲硫氨酸残基处泛素化；或
(iii)在不存在COF3的情况下所述融合多肽的降解不超过在COF3例如过量的COF3的存在下所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，任选地其中在COF3的存在下，所述融合多肽的降解由泛素化介导；
任选地其中所述缔合、泛素化和/或降解是如在哺乳动物细胞中，例如人细胞中测量。
301.如权利要求296-300中任一项所述的融合多肽，其中所述COF3/CRBN结合多肽的长度在10和95个氨基酸残基之间、在15和90个氨基酸残基之间、在20和85个氨基酸残基之间、在25和80个氨基酸残基之间、在30和75个氨基酸残基之间、在35和70个氨基酸残基之间、在40和65个氨基酸残基之间、在45和65个氨基酸残基之间、在50和65个氨基酸残基之间或在55和65个氨基酸残基之间。
302.如权利要求296-301中任一项所述的融合多肽，其中所述COF3/CRBN结合多肽包含β转角、β发夹、β链或α螺旋，任选地其中所述COF3/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链和第一α螺旋，任选地其中所述COF3/CRBN结合多肽从N-末端至C-末端包含第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋和第二α螺旋，任选地其中所述β发夹和所述第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基被分开。
303.如权利要求296-302中任一项所述的融合多肽，其中所述COF3/CRBN结合多肽包含来自以下的COF3/CRBN结合序列：天然存在的多肽或其COF3/CRBN结合变体，例如天然存在的IKZF多肽或其COF3/CRBN结合变体，例如天然存在的IKZF2或其COF3/CRBN结合变体，任选地其中所述COF3/CRBN结合多肽包含来自天然存在的IKZF多肽，例如天然存在的IKZF2的两个或更多个不连续序列。
304.如权利要求296-303中任一项所述的融合多肽，其中所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基130-174(根据SEQ ID NO:21编号)(例如，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列)或与IKZF2的氨基酸残基130-174(根据SEQ ID NO:21编号)差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:21的氨基酸残基130-174差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:21的氨基酸残基130-174具有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸取代的序列)。
305.如权利要求296-304中任一项所述的融合多肽，其中所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基230-243(根据SEQ ID NO:21编号)(例如，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列)或与IKZF2的氨基酸残基230-243(根据SEQ ID NO:21编号)差异不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列(例如，与SEQ ID NO:21的氨基酸残基230-243差异不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列)(例如，从SEQ ID NO:21的氨基酸残基230-243具有不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸取代的序列)。
306.如权利要求304或305所述的融合多肽，其中根据SEQ ID NO:21编号，在位置141处的组氨酸保持不变。
307.如权利要求296-306中任一项所述的融合多肽，其中：
(i)所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基130-174(根据SEQ ID NO:21编号)，例如，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列；和/或
(ii)所述COF3/CRBN结合多肽包含IKZF2的氨基酸残基230-243(根据SEQ ID NO:21编号)，例如，所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
308.如权利要求296-307中任一项所述的融合多肽，其中所述COF3/CRBN结合多肽包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或由其组成。
309.如权利要求296-308中任一项所述的融合多肽，其中所述异源多肽选自细胞质多肽和/或细胞核多肽或跨膜多肽，例如，在表2中的异源多肽。
310.如权利要求309所述的融合多肽，其中所述细胞质多肽和/或细胞核多肽选自下组，该组由以下组成：细胞凋亡途径的组分(例如，半胱天冬酶9)、CRISPR/Cas系统的组分(例如，Cas9)、转录因子(例如，MITF、c-Myc、STAT3、STAT5、NF-κB、β-连环蛋白、Notch、GLI或c-JUN)、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)、FKBP和Tau。
311.如权利要求309所述的融合多肽，其中所述跨膜多肽选自下组，该组由以下组成：CD62L、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CCR10、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CTLA4、PD1、BTLA、VISTA、CD137L、CD80、CD86、TIGIT、CD3、CD8、CD19、CD22、CD20、BCMA和嵌合抗原受体(CAR)。
312.如权利要求309所述的融合多肽，其中所述异源多肽选自下组，该组由以下组成：嵌合抗原受体(CAR)、CRISPR/Cas系统的组分(例如，Cas9)、CD8、CD19和CD22，任选地其中所述异源多肽是嵌合抗原受体(CAR)。
313.如权利要求312所述的融合多肽，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，初级信号传导结构域或共刺激信号传导结构域)，任选地其中所述初级信号传导结构域包含CD3-ζ刺激结构域，和/或所述共刺激信号传导结构域包含来自选自下组的共刺激蛋白的细胞内结构域，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
314.如权利要求312所述的融合多肽，其中所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原，该组由以下组成：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和阿贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因多肽(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑色素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；天冬酰胺内肽酶；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)，任选地其中所述抗原结合结构域结合选自CD19、CD22、BCMA、CD20、CD123、EGFRvIII或间皮素的抗原。
315.如权利要求296-314中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽进一步包含降解结构域，其中所述降解结构域通过异源蛋白酶切割位点与所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽分开。
316.如权利要求315所述的融合多肽，其中所述融合多肽从N-末端至C-末端包含：
i)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述异源多肽和所述COF3/CRBN结合多肽；
ii)所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点、所述COF3/CRBN结合多肽和所述异源多肽；
iii)所述COF3/CRBN结合多肽、所述异源多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域；或
iv)所述异源多肽、和所述COF3/CRBN结合多肽、所述异源蛋白酶切割位点和所述降解结构域。
317.如权利要求315或316所述的融合多肽，其中所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在稳定化合物的存在下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍，任选地其中：
在不存在所述稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽被降解，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量；或
在所述稳定化合物的存在下：
i)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；或
ii)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割。
318.如权利要求315-317中任一项所述的融合多肽，其中所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域。
319.如权利要求315-318中任一项所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点被选自下组的哺乳动物细胞内蛋白酶切割，该组由以下组成：弗林蛋白酶、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。
320.如权利要求315-318中任一项所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点被选自下组的哺乳动物细胞外蛋白酶切割，该组由以下组成：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1。
321.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求296-320中任一项所述的融合多肽。
322.一种载体，所述载体包含如权利要求321所述的核酸分子，任选地其中所述载体是病毒载体，例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。
323.一种细胞，例如宿主细胞，所述细胞包含如权利要求296-320中任一项所述的融合多肽、如权利要求321所述的核酸分子或如权利要求322所述的载体，任选地其中所述细胞是T细胞、NK细胞或肿瘤细胞。
324.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求296-320中任一项所述的融合多肽、或如权利要求323所述的细胞，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。
325.一种制备如权利要求323所述的细胞的方法，所述方法包括向细胞，例如免疫效应细胞提供如权利要求321所述的核酸分子或如权利要求322所述的载体。
326.一种降解融合多肽的方法，所述方法包括使如权利要求296-320中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF3接触，任选地其中在COF3的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF3的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，任选地其中：
所述融合多肽或所述细胞与COF3离体接触，或
所述融合多肽或所述细胞与COF3在体内接触。
327.一种调节融合多肽表达的方法，所述方法包括：
i)使如权利要求315-320中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与稳定化合物接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下：
a)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；
b)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，所述融合多肽的构象在异源蛋白酶切割位点处更容易切割；或
c)所述融合多肽的表达水平与在不存在所述稳定化合物的情况下的所述融合多肽的表达水平相比增加了至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，
任选地其中使所述融合多肽或所述细胞与所述稳定化合物离体或在体内接触。
328.如权利要求327所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)使如权利要求315-320中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的细胞与COF3接触，任选地其中在COF3的存在下，所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量，
任选地其中使所述融合多肽或所述细胞与COF3离体或在体内接触。
329.一种制备细胞的方法，所述方法包括：
i)向细胞，例如免疫效应细胞提供编码如权利要求296-320中任一项所述的融合多肽的核酸分子；和
ii)使所述细胞与COF3离体接触，任选地其中：
在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在不存在COF3的情况下所述融合多肽的表达水平基本上降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，如本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析所测量。
330.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)使包含如权利要求296-314中任一项所述的融合多肽的细胞与COF3离体接触，任选地其中：
在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF3离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，并且
ii)向所述受试者施用有效量的所述细胞，任选地其中所述方法进一步包括在步骤i)之后且在步骤ii)之前：
减少与所述细胞接触的，例如所述细胞内和/或所述细胞周围的COF3的量，
从而治疗所述疾病。
331.如权利要求330所述的方法，其进一步包括在步骤ii)之后：
iii)向所述受试者施用有效量的COF3，任选地其中COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF3的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF3的施用减少或预防副作用。
332.如权利要求331所述的方法，其进一步包括在步骤iii)之后：
iv)中止COF3的施用，任选地其中中止COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤iii)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF3的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤ii)之后且在步骤iii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF3施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF3施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
333.如权利要求332所述的方法，其进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤iii)和/或iv)，
从而治疗所述疾病。
334.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的包含如权利要求296-314中任一项所述的融合多肽的细胞，任选地其中在施用之前，使所述细胞与COF3离体接触，任选地其中：
在COF3的存在下所述融合多肽的表达水平相对于在所述细胞与COF3离体接触之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中在所述细胞与COF3离体接触之后且在向受试者施用所述细胞之前，减少与所述细胞接触的，例如在所述细胞内和/或在所述细胞周围的COF3的量，
从而治疗所述疾病。
335.如权利要求334所述的方法，其中，在施用之前，所述细胞不与COF3离体接触。
336.如权利要求334或335所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)向所述受试者施用有效量的COF3，任选地其中COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF3的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF3的施用减少或预防副作用。
337.如权利要求336所述的方法，其进一步包括在步骤ii)之后：
iii)中止COF3的施用，任选地其中中止COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)之后且在步骤iii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF3的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在步骤i)之后且在步骤ii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF3施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF3施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
338.如权利要求337所述的方法，其进一步包括在步骤iii)之后：
iv)重复步骤ii)和/或iii)，
从而治疗所述疾病。
339.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的COF3，其中所述受试者包含含有如权利要求296-314中任一项所述的融合多肽的细胞，任选地其中COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在COF3的施用之前的所述融合多肽的表达水平降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述COF3的施用响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述COF3的施用减少或预防副作用。
340.如权利要求339所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止COF3的施用，任选地其中中止COF3的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止COF3的施用使所述融合多肽的表达水平恢复至在COF3的施用之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述COF3施用的中止响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述COF3施用的中止治疗或预防肿瘤复发。
341.如权利要求340所述的方法，其进一步包括在步骤ii)之后：
iii)重复步骤i)和/或ii)，
从而治疗所述疾病。
342.一种对患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用：
(1)稳定化合物，和
(2)有效量的包含如权利要求315-320中任一项所述的融合多肽的细胞，或有效量的包含如权利要求315-320中任一项所述的融合多肽的细胞，任选地其中：
在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平，
从而治疗所述疾病。
343.如权利要求342所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者应答步骤i)的治疗(例如，所述受试者对所述步骤i)的治疗具有完全响应，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)，和/或
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者对步骤i)的治疗的应答(例如，所述受试者对步骤i)的治疗具有完全应答，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)。
344.如权利要求342所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止所述稳定化合物的施用，任选地其中中止所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤ii)之前所述融合多肽的表达减少了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述稳定化合物的施用的中止减少或预防副作用。
345.如权利要求342所述的方法，其进一步包括在步骤i)之后：
iv)中止所述稳定化合物的施用并且向所述受试者施用有效量的COF3，任选地其中步骤iv)将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤i)之后且在步骤iv)之前所述融合多肽的表达水平降低了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)步骤iv)响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)步骤iv)减少或预防副作用，
任选地其中所述副作用是急性毒性。
346.如权利要求345所述的方法，其进一步包括在步骤iv)之后：
v)例如，在表面上表达所述融合多肽的细胞的量小于预定值持续例如，1天、5天、10天或15天之后，中止COF3的施用。
347.如权利要求343-346中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后：
vi)施用有效量的稳定化合物，任选地其中所述稳定化合物的施用将所述融合多肽的表达水平相对于在步骤ii)、iii)、iv)或v)之后且在步骤vi)之前的所述融合多肽的表达水平增加了例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述稳定化合物的施用响应于所述受试者中的肿瘤复发，或响应于所述受试者中的预期复发，和/或
c)所述稳定化合物的施用治疗或预防肿瘤复发。
348.如权利要求347所述的方法，其进一步包括在步骤vi)之后：
vii)重复步骤iii)、iv)、v)或vi)，
从而治疗所述疾病。
349.如权利要求342-348中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤i)之前：
viii)使所述细胞与稳定化合物离体接触，任选地其中在所述稳定化合物的存在下所述融合多肽的表达水平是例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍高于在不存在所述稳定化合物的情况下所述融合多肽的表达水平。
350.如权利要求342-348中任一项所述的方法，其中在施用之前，所述细胞不与所述稳定化合物离体接触。
351.如权利要求330-350中任一项所述的方法，其中所述与肿瘤抗原表达相关的疾病是癌症。
352.如权利要求351所述的方法，其中，所述癌症是间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)，例如在对至少一种先前标准疗法已经进展的受试者中；肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌)；胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌或转移性胰腺导管腺癌(PDA)，例如在对至少一种先前标准疗法已经进展的受试者中)；食管腺癌、卵巢癌(例如，浆液性上皮性卵巢癌，例如在至少一种先前标准疗法方案后已经进展的受试者中)、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌，或其任何组合。
353.如权利要求351所述的方法，其中，所述癌症是选自以下的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
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