JP2010505775A - Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体 - Google Patents
Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010505775A JP2010505775A JP2009530756A JP2009530756A JP2010505775A JP 2010505775 A JP2010505775 A JP 2010505775A JP 2009530756 A JP2009530756 A JP 2009530756A JP 2009530756 A JP2009530756 A JP 2009530756A JP 2010505775 A JP2010505775 A JP 2010505775A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- muc1
- stn
- cancer
- antibody
- glycopeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 205
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 title claims abstract description 204
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 71
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 66
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 195
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 195
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims abstract description 119
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 84
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 60
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 45
- 101100449758 Onchocerca volvulus GST1 gene Proteins 0.000 claims description 37
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 37
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 19
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 14
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 108010059574 C5a peptidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 claims description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 90
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 54
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 27
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 25
- 108010066816 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase Proteins 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 14
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 12
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 12
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 12
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 10
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 102100020950 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2 Human genes 0.000 description 8
- 102100039682 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 4 Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001473 O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-serine group Chemical group 0.000 description 6
- 101710189199 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 11 Proteins 0.000 description 6
- 102100023218 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 11 Human genes 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108010044850 MUC1 tandem repeat peptide Proteins 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 4
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 101710183133 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100031969 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000006402 Ductal Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000972286 Homo sapiens Mucin-4 Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 1,4-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=C(N)C=C1 CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001006370 Actinobacillus suis Hemolysin Proteins 0.000 description 2
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 208000037396 Intraductal Noninfiltrating Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102100022693 Mucin-4 Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.OC(O)=O HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 208000028715 ductal breast carcinoma in situ Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000002824 mRNA display Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026685 Acetylgalactosaminyl-O-glycosyl-glycoprotein beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007659 Fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102100039847 Globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000887519 Homo sapiens Globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100346929 Homo sapiens MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N Lactosamine Natural products OC1C(N)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000265 Lobular Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101150114927 MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100179119 Methanopyrus kandleri (strain AV19 / DSM 6324 / JCM 9639 / NBRC 100938) fni gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000703725 Mus musculus Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 description 1
- KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-threonine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1O[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N 0.000 description 1
- 108010075202 UDP-glucose 4-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 102100021436 UDP-glucose 4-epimerase Human genes 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000003149 breast fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N lactosamine Chemical compound O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N 0.000 description 1
- 101150082109 lldD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000009364 mariculture Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001483 monosaccharide substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N n-[(2r,3r,4s,5r)-4,5,6-trihydroxy-1-oxo-3-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6075—Viral proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
本発明は、免疫原性グリコペプチドを用いてＭＵＣ１に対する癌特異的な免疫反応を誘導する方法を提供する。本発明の他の態様は、免疫原性グリコペプチドを含む医薬組成物及び免疫原性グリコペプチドを含む癌ワクチンである。他の態様は、免疫原性グリコペプチドを使用して産生した抗体並びに治療及び診断における前記抗体の使用である。
Description
本発明は、免疫原性のグリコペプチドを用いてＭＵＣ１に対する高度に癌に関連するか又は癌特異的な免疫反応を誘導するための方法を提供する。本発明の他の態様は、免疫原性のグリコペプチドを含む医薬組成物並びに免疫原性グリコペプチドを含む癌ワクチンである。他の態様は、免疫原性グリコペプチドを用いて産生した抗体並びに治療及び診断における前記抗体の使用である。
ヒトムチンＭＵＣ１は、単層上皮及び腺上皮の先端表面上で発現する多形性膜貫通糖タンパク質である。ＭＵＣ１は、アデノカルシノーマにおいて過剰発現しており、異常にＯグリコシル化されている。ムチンの細胞外ドメインは、５箇所の潜在的なＯ−グリコシル化部位を有する２０アミノ酸残基のタンデムリピート（２５〜１２５）を様々な数において含有する。Ｏ−グリカンは、癌細胞において不完全に処理されて、癌に一般的な糖抗原Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、ＳＴｎ（ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、及びＴ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の発現をもたらす。乳癌細胞によって発現されるＭＵＣ１は、短い癌関連Ｔｎ、ＳＴｎ、及びＴ抗原並びに正常細胞によって広く認められるモノ及びジシアリルコア１構造（ＳＴ、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３［ＮｅｕＡｃα２−６］＋／−ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有する。対照的に、正常な胸の上皮細胞において発現されるＭＵＣ１は、一般的に、ラクトサミン伸長鎖を有する分枝コア２Ｏ−グリカン類（Ｇａｌβ１−３［ＧｌｃＮＡｃβ１−６］ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有する。細胞膜に結合したムチンは、長い間、免疫治療のための主要な標的であると解されている。乳癌患者における抗ＭＵＣ１抗体及びＭＵＣ１を含有する循環免疫複合体の存在は、予後の改善に関連しており、このことは、標的としてのＭＵＣ１を明らかに支持している。しかしながら、（細胞に基づく治療方法とは対照的に所定の免疫原を使用する）患者又はヒトＭＵＣ１遺伝子を発現するトランスジェニック動物における癌関連形態のＭＵＣ１に対する効果的な細胞性又は液性免疫反応の刺激は、成し遂げられていない。ペプチド／タンパク質免疫原に基づく、活性を有する特異的な免疫治療のための戦略は、これまで、各種の担体に接合されているか又はアジュバントと共に投与される、各種の長さの非グリコシル化ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドに限定されている。これらの戦略では、一般的には、ムチンが自己抗原として発現している宿主の癌細胞によって発現されるＭＵＣ１に対する効果的な免疫反応を生じさせることができない。
過去に、精製ＭＵＣ１並びにＭＵＣ１に由来する合成ペプチド及びグリコペプチドに対する多数のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が製造されている。これらのＭＡｂのエピトープは、伝統的には、短いオーバーラップペプチドのスキャンによって規定され、大半のＭＡｂは、重度にＯ−グリコシル化したムチンのタンデムリピートドメイン中にエピトープを規定する。ＭＡｂの１つの大きなグループは、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）に対して製造され、それはＨＭＦＧ１、１１５Ｄ８、及びＳＭ３を含み、その大半が野生型マウスにおける免疫優性ペプチドエピトープであると解されているムチンタンデムリピートのＰＤＴＲ領域にあるエピトープと反応する。ＰＤＴＲ領域外のタンデムリピートエピトープを規定するＭＡｂは少数のみが報告されている。乳癌組織抽出物に対して産生された１つであるＤＦ３は、１１５Ｄ８と共にＣＡ １５−３スクリーニングアッセイにおいて使用され、ＴＲＰＡＰＧＳというペプチドエピトープを規定する。非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドを用いた免疫は、ＧＳＴＡＰペプチドに反応性を有する、低いアフィニティーのモノクローナル抗体（ＢＣＰ９）を産生する。
大半のＭＵＣ１抗体は、ペプチド主鎖と反応するが、多くの場合、その結合は、グリカンの存在によって調節される。幾つかの場合において、Ｂ２７．２９、１１５Ｄ８、及びＶＵ−２−Ｇ７を用いて認められているように、特定のグリカンの存在が結合を促進し得る。他の例では、ＳＭ３及びＨＭＦＧ１を用いて認められているように、グリカンは結合を阻害し得る。ＳＭ３は、化学的に脱グリコシル化したＨＭＦＧに対して産生され、ＨＭＦＧに対して産生された他のＭＡｂとは対照的に、ＰＤＴＲ領域に結合する抗体は正常の胸の上皮において認められる大きな分枝Ｏ−グリカンによって選択的に阻害されるため、癌関連ＭＵＣ１に高い選択性を示す。
ＭＵＣ１糖型と特異的に反応する少数の抗体が報告されている。１つのＭＡｂであるＢＷ８３５は、癌細胞株ＭＣＦ−７及びＳＷ−６１３の注射を交互に行うことによって産生され、その特異性は、ＴｈｒがＴ抗原（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）で置換されているグリコペプチドエピトープであるＶＴＳＡに限定されることが報告されている（Ｈａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９５）。ＭＡｂであるＭＹ．１Ｅ１２（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）はＨＭＦＧに対して産生され、同じペプチド配列に対してエピトープをマッピングしているが、Ｔ構造のシアル化（ＳＴ）が反応性を促進する（Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００２）。
Burch ell, J. M., Mungul, A. & Taylor-Papadimitriou, J. (2001). O-linked glycosylation in the mammary gland: changes that occur during malignancy. J.Mammary.Gland.Biol.Neoplasia., 6, 355-364.Clausen,H., Stroud,M., Parker,J., Springer,G., & Hakomori,S. (1988) Monoclonal-Antibodies
Directed to the Blood Group-A Associated Structure, Galactosyl-A - Specificity and Relation to the Thomsen-Friedenreich Antigen. Molecular Immunology, 25, 199-204.
Hanisch, F. G., Stadie, T. & Bosslet, K. (1995). Monoclonal antibody BW835 defines a site-specific Thomsen-Friedenreich disaccharide linked to threonine within the VTSA motif of MUC1 tandem repeats. Cancer Res., 55, 4036-4040.
Kjeldsen,T., Clausen,H., Hirohashi,S., Ogawa,T., Iijima,H., & Hakomori,S. (1988) Preparation and Characterization of Monoclonal-Antibodies Directed to the Tumor-Associated O-Linked Sialosyl-2-]6 Alpha-N-Acetylgalactosaminyl (Sialosyl-Tn)Epitope. Cancer Research, 48, 2214-2220
Kjeldsen,T., Hakomori,S., Springer,G.F., Desai,P., Harris,T., & Clausen,H. (1989) Coexpression of Sialosyl-Tn (Neuac-Alpha-2-]6Galnac-Alpha-1-]O-Ser/Thr) and Tn (Galnac-Alpha-1-]O-Ser/Thr) Blood-Group Antigens on Tn Erythrocytes. Vox Sanguinis, 57, 81-87.
Mensdorff-Pouilly,S., Petrakou,E., Kenemans,P., van Uffelen,K., Verstraeten,A.A., Snijdewint,F.G.M., van Kamp,G.J., Schol,D.J., Reis,C.A., Price,M.R., Livingston,P.O., & Hilgers,J. (2000) Reactivity of natural and induced human antibodies to MUC1 mucin with MUC1 peptides and N-acetylgalactosamine (GalNAc) peptides. International Journal of Cancer, 86, 702-712.R
eis,C.A., Hassan,H., Bennett,E.P., & Clausen,H. (1998a) Characterization of a panel of monoclonal antibodies using GalNAc glycosylated peptides and recombinant MUC1. Tumor Biology, 19, 127-133.
Reis,C.A., Sorensen,T., Mandel,U., David,L., Mirgorodskaya,E., Roepstorff,P., Kihlberg,J., Hansen,J.E.S., & Clausen,H. (1998b) Development and characterization of an antibody directed to an alpha-N-acetyl-D-galactosamine glycosylated MUC2 peptide. Glycoconjugate Journal, 15, 51-62.
Sorensen, A. L., Reis, C. A., Tarp, M. A., Mandel, U., Ramachandran, K., Sankaranarayanan, V., Schwientek, T., Graham, R., Taylor-Papadimitriou, J., Hollingsworth, M. A., Burchell, J. & Clausen, H. (2006). Chemoenzymatically synthesized multimeric Tn/STn MUC1 glycopeptides elicit cancer-specific anti-MUC1 antibody responses and override tolerance. Glycobiology, 16, 96-107.
Springer,G.F. (1984) T and Tn, General Carcinoma Auto-Antigens. Science, 224, 1198-1206.
Takeuchi, H., Kato, K., da-Nagai, K., Hanisch, F. G., Clausen, H. & Irimura, T. (2002). The epitope recognized by the unique anti-MUC1 monoclonal antibody MY.1E12 involves sialyl alpha 2-3galactosyl beta 1-3N-acetylgalactosaminide linked to a distinct threonine residue in the MUC1 tandem repeat. J.Immunol.Methods, 270, 199-209.
Yamamoto, M., Bhavanandan, V. P., Nakamori, S. & Irimura, T. (1996). A novel monoclonal antibody specific for sialylated MUC1 mucin. Jpn.J.Cancer Res., 87, 488-496.
最近、本発明者は、長いＴｎ−又はＳＴｎ−ＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドを用いる免疫によって、ヒト化ＭＵＣ１トランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウスにおける免疫寛容を無効にし得ることを見出した（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６及び本明細書の実施例１）グリコペプチドワクチンを用いて誘導される液性免疫反応は、Ｔｎ／ＳＴｎ−ＭＵＣ１糖型及びヒト癌細胞によって発現されるＭＵＣ１に高度に特異的であった。更にこれらのグリコペプチドに対する免疫を特徴付けるため、本発明者は、ＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおいて生じたポリクローナル反応を摸倣したモノクローナル抗体を産生した。
本発明は、免疫原性のグリコペプチドを用いてＭＵＣ１に対する高度に癌に関連するか又は癌特異的な免疫反応を誘導するための方法を提供する。本発明の他の態様は、免疫原性のグリコペプチドを含む医薬組成物並びに免疫原性グリコペプチドを含む癌ワクチンである。他の態様は、免疫原性グリコペプチドを用いて産生した抗体並びに治療及び診断における前記抗体の使用である。
ＭＵＣ１に対する癌特異的な免疫反応を誘導する方法。
驚くべきことに、グリコシル化ＧＳＴＡモチーフを含む免疫原性グリコペプチドを用いた免疫が、ＭＵＣ１に対する癌特異的免疫反応を誘導することが示された。例えば、癌細胞に対する液性免疫が生じ得ることが示された。
本明細書において「免疫原性グリコペプチド」と称する際は、癌特異的免疫反応を誘導するために使用される免疫原性グリコペプチドの下記の実施態様の全てを意味する。
かくして、本発明の１つの態様は、ＧＳＴＡモチーフを含む免疫原性グリコペプチドを用いた哺乳動物の免疫を含むＭＵＣ１に対する癌特異的な免疫反応を誘導する方法であって、前記ＧＳＴＡモチーフが、少なくともＧＳＴＡモチーフのＴ残基又はＳ残基でＯ−グリコシル化されている、方法に関する。
好ましくは、前記哺乳動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、及びイヌからなる群から選択される。
好ましい実施態様では、前記ＭＵＣ１に対する免疫反応が、先天性免疫、液性免疫、細胞性免疫、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかである。
他の好ましい実施態様では、ＭＵＣ１は、癌細胞において異常にグリコシル化及び発現されており、すなわち、免疫反応が、好ましくは癌細胞において異常にグリコシル化及び発現されているＭＵＣ１に対するものであり、例えば分枝コア２に基づく構造などの正常なグリコシル化パターンを有するＭＵＣ１にはより低度に反応するものである
本明細書において示すように、ＧＳＴＡモチーフは４つのアミノ酸の伸長鎖であり、その文字は、アミノ酸の一文字表記によってアミノ酸の識別するものである。
本明細書で示すＯ−グリコシル化は、セリン又はスレオニンの側差のヒドロキシル基における糖鎖の存在を示す。
本明細書で示すＴｎグリコシル化は、（ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、すなわち、セリン又はスレオニンの側鎖であるヒドロキシルにおけるＧａｌＮＡｃα１置換として記載されてもよい。
本明細書で示すＳＴｎグリコシル化は、（ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、すなわち、セリン又はスレオニンの側差であるヒドロキシルにおけるＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１置換として記載されてもよい。ＳＴｎにおけるシアル酸は、任意の−ＯＨの位置においてＯアセチル化されてよい。
好ましくは、ＧＳＴＡモチーフのＯ−グリコシル化は、ＳＴｎグリカン又はＴｎグリカンのいずれかである。
好ましい実施態様では、ＧＳＴＡモチーフのＳ残基及びＴ残基は、同時にＯグリコシル化される。この実施態様では、Ｓ及びＴ残基は、同じＯ−グリコシル化を有するか又は異なるＯ−グリコシル化を有してよい。
かくして、好ましい実施態様では、Ｓ残基及びＴ残基のＯ−グリコシル化は、ＳＴｎグリカン又はＴｎグリカンのいずれかである。
他の好ましい実施態様では、ＧＳＴＡモチーフは２０アミノ酸残基のタンデムリピートに存在し、前記タンデムリピートは、５箇所の潜在的なＯ−グリコシル化部位を含む。
本明細書で示すように、タンデムリピートは、天然タンパク質において認められる反復配列である。好ましいタンデムリピートは、ＭＵＣ１のタンデムリピート配列である。
好ましい実施態様では、５箇所の潜在的なＯ−グリコシル化部位のうち少なくとも３箇所がグリコシル化され、Ｔｎ又はＳＴｎのいずれかを有する。
他の好ましい実施態様では、５箇所の潜在的なＯ−グリコシル化部位の全てがＴｎ又はＳＴｎのいずれかを有する。
本発明者は、ＭＵＣ１タンパク質に対する免疫反応を誘導する免疫原性グリコペプチドの能力が、免疫原性グリコペプチドのグリコシル化の程度に依存することを実証した。かくして、より高度のグリコシル化は、より強い免疫反応を誘導する。しかしながら、ある状況では、強力な免疫反応が、望ましくないか又は不必要である可能性があり、例えば、ＭＵＣ１タンパク質又は異常にグリコシル化したＭＵＣ１タンパク質に結合する抗体を生じるハイブリドーマ細胞産生のために、免疫反応が強力である必要はない。
好ましい実施態様では、ＧＳＴＡモチーフはタンデムリピート中に存在し、前記タンデムリピートの配列は、
a) VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG (配列番号１)
b) 配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する配列番号１の天然バリアント
c) １つ又は複数の保存的置換によって調製され、且つ、配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する、配列番号１の人工バリアント
d) １から３のアミノ酸が欠失した配列番号１の切断型断片
からなる群から選択される。
a) VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG (配列番号１)
b) 配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する配列番号１の天然バリアント
c) １つ又は複数の保存的置換によって調製され、且つ、配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する、配列番号１の人工バリアント
d) １から３のアミノ酸が欠失した配列番号１の切断型断片
からなる群から選択される。
配列番号１は、ヒトに存在するＭＵＣ１のタンデムリピート配列である。
配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する配列番号１の天然バリアントは、天然に存在する配列番号１のバリアントと解されるべきである。他の実施態様では、天然のバリアントが、８０％、８５％、９０％、及び９５％からなる群から選択される類似性の程度を有することが好ましい。
本明細書で示す配列番号１の人工バリアントは、例えば遺伝子工学又は化学的合成によって人工的に調製されたバリアントである。典型的には、人工バリアントは、１つ又は複数の保存的置換を用いて調製されるであろう。
配列番号１の切断型断片は、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端、又は双方の末端のいずれかにおいて切断されている。好ましい実施態様では、切断の長さ（欠失アミノ酸残基の数）は、１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、及び１０残基からなる群から選択される。切断型断片が双方の末端において切断される際は、ペプチドの最短の長さは、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、及び１６アミノ酸残基からなる群から選択されるであろう。
好ましい実施態様では、ＧＳＴＡモチーフは、配列番号１の切断型断片又は前記切断型断片に対して少なくとも７０％の類似性の程度を有するバリアントに存在する
本明細書で示す保存的置換は、類似の電荷、大きさ、又は疎水度の別のアミノ酸残基を用いた１つのアミノ酸残基の置換である。
好ましい保存的置換は、１つのアミノ酸残基が、以下に示すアミノ酸の群：
・極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＣｙｓ）
・非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、及びＭｅｔ）
・脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
・環状側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
・芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
・酸性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
・塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
・アミド側差を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
・ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
・硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
・中性の弱疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
・親水性の酸性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）及び
・疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）
の内の別のアミノ酸により置換されるものである。
・極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＣｙｓ）
・非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、及びＭｅｔ）
・脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
・環状側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
・芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
・酸性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
・塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
・アミド側差を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
・ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
・硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
・中性の弱疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
・親水性の酸性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）及び
・疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）
の内の別のアミノ酸により置換されるものである。
特に好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
２つのペプチドの間の類似性の程度又は類似性の割合を決定するための各種の方法が既知である。類似性の程度又は類似性の割合を本明細書で示す際は、以下の方法を使用する。
比較しようとするペプチドを、最適に整列させる。アラインメントプログラムは、最も良好なアラインメントを実施するのに役立つ。２つの配列を整列させる際は、２つのペプチドの間の類似性の程度を示すスコアが与えられる。同一のアミノ酸残基の位置が、１のスコアを与える。保存的置換を有する位置が、０．５のスコアを与える。アラインメントを最適化するために導入されるギャップは、０．２５のスコアを与える。非保存的置換は０のスコアを与える。比較のウィンドウの全ての位置についてスコアを得た後に、そのスコアをまとめ、比較のウィンドウの長さに対して正規化する。正規化した値が、本明細書で使用する類似性の割合又は類似性の程度である。例えば、配列番号１に対して１つの非保存的置換及び３つの保存的置換を有するタンデムリピートペプチドについて考えると、そのペプチドのスコアは、１６＋（３＊０．５）＝１７．５である。対応する類似性の割合は、１７．５／２０＝８７．５％である。
好ましい実施態様では、タンデムリピートのグリコシル化パターンが、
・VTTnSAPDTRPAPGSTTnAPPAHG
・VTTnSAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSTSTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
からなる群から選択される。
・VTTnSAPDTRPAPGSTTnAPPAHG
・VTTnSAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSTSTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、タンデムリピートのグリコシル化パターンは、
・VTTnSAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
からなる群から選択される。
・VTTnSAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
からなる群から選択される。
免疫についての有利な効果が、１を超えるタンデムリピートを組み合わせることによって報告されている。かくして、好ましい実施態様では、免疫原性グリコペプチドは、１を超えるタンデムリピートを含み、例えば、２を超えるタンデムリピートを含み、例えば、３を超えるタンデムリピートを含み、例えば、４を超えるタンデムリピートを含み、例えば、５を超えるタンデムリピートを含み、例えば、６を超えるタンデムリピートを含み、例えば、７を超えるタンデムリピートを含み、例えば、８を超えるタンデムリピートを含み、例えば、９を超えるタンデムリピートを含み、並びに、例えば、１０を超えるタンデムリピートを含む。
更に、好ましい実施態様では、免疫原性グリコペプチドは、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、オブアルブミン、インフルエンザヘマグルチニン、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇＩ９−２ｓ）、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌、コレラ毒素、毒性を低減させたコレラ毒素変異体、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素と交差反応するＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、化膿連鎖球菌ＯＲＦ１２２４、化膿連鎖球菌ＯＲＦ１６６４、化膿連鎖球菌ＯＲＦ２４５２、肺炎クラミジアＯＲＦ Ｔ３６７、肺炎クラミジアＯＲＦ Ｔ８５８、破傷風トキソイド、又はＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１からなる群から選択される適切な担体に結合する。
担体への結合は、免疫学的ペプチドの有効性を増大するために為される。
医薬組成物
免疫原性グリコペプチドは癌特異的な免疫反応を誘導し得るため、本発明の他の実施態様は、免疫原性グリコペプチドを含む医薬組成物である。
免疫原性グリコペプチドは癌特異的な免疫反応を誘導し得るため、本発明の他の実施態様は、免疫原性グリコペプチドを含む医薬組成物である。
好ましい実施態様では、前記医薬組成物は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、若しくは肺癌の治療又は予防のための癌ワクチンである。
癌の治療又は予防方法
本発明の他の態様は、免疫原性グリコペプチドを含む上述の医薬組成物を投与する工程を含む、癌の治療又は予防方法である。そうすることで、癌特異的免疫反応が生じるであろう。
本発明の他の態様は、免疫原性グリコペプチドを含む上述の医薬組成物を投与する工程を含む、癌の治療又は予防方法である。そうすることで、癌特異的免疫反応が生じるであろう。
抗体
本発明の他の態様は、免疫原性グリコペプチドを用いて調製した抗体、前記抗体の調製方法、並びに治療及び診断における前記抗体の使用である。
本発明の他の態様は、免疫原性グリコペプチドを用いて調製した抗体、前記抗体の調製方法、並びに治療及び診断における前記抗体の使用である。
かくして、本発明の他の態様は、
・適切な哺乳動物を免疫原性グリコペプチドで免疫する
・前記哺乳動物の抗体産生細胞を連続細胞株の細胞と融合する
・前記融合において得られたハイブリッド細胞をクローン化する
・所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する
を特徴とする、免疫原性グリコペプチドに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の調製のための方法である。
・適切な哺乳動物を免疫原性グリコペプチドで免疫する
・前記哺乳動物の抗体産生細胞を連続細胞株の細胞と融合する
・前記融合において得られたハイブリッド細胞をクローン化する
・所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する
を特徴とする、免疫原性グリコペプチドに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の調製のための方法である。
更なる他の態様は、
・上述の方法によって調製されたハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体
・免疫原性グリコペプチドに対するｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、及び共有結合ディスプレイ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ）などの分子ディスプレイ技術によって調製されるモノクローナル抗体
からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。
・上述の方法によって調製されたハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体
・免疫原性グリコペプチドに対するｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、及び共有結合ディスプレイ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ）などの分子ディスプレイ技術によって調製されるモノクローナル抗体
からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。
伝統的には、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製されている。しかしながら、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、及び共有結合ディスプレイなどの代替的な技術が現在では利用可能である。これらはすべて、ペプチドライブラリーが免疫原性グリコペプチドに対して選択される、ディスプレイ技術である。その様な技術は、例えば、ヒト化抗体又は完全なヒト抗体を同定するために使用されてよい。
好ましい実施態様では、モノクローナル抗体は、癌細胞上のＭＵＣ１に結合するが、非悪性細胞上のＭＵＣ１には結合しない。
他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体は、癌細胞で異常にグリコシル化及び発現されているＭＵＣ１に好適に結合する。
更なる他の実施態様では、モノクローナル抗体は、免疫原性グリコペプチドのＯ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフに直接的に結合するか又は少なくとも相互作用する。本発明者のデータは、Ｏ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフに結合する抗体が実際に癌特異的であり、癌に対する特異性が当該相互作用にあることを強力に示す。理論に結びつけることを意図しないが、本発明者は、Ｏ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフに結合又は相互作用する抗体は癌特異性を示すであろうと解している。それらがＳ残基及びＴ残基に同時にＯ−グリコシル化を有するＯ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフに結合又は相互作用する場合は、特にそうであろう。
好ましい実施態様では、前記免疫原性グリコペプチドを用いて調製される抗体は、ヒトにおける抗体の免疫原性を低減するために、ヒト化抗体又は完全なヒト抗体である。このことは、抗体が治療に使用される場合に、典型的には望ましい。
しかしながら、ある状況においては、急速なクリアランスが望ましく、その様な場合には、非ヒト化抗体が治療剤として興味を持たれる。１つのその様な状況は、毒素又は放射性同位体に結合した抗体を投与する際であってよい。その様な結合抗体は、その標的を即時に検出するか、又は一般的な毒性を有することを明らかにするはずである。本発明の一つの実施態様は結合抗体である。
本発明の他の実施態様は、ＳＴＨＭ１ ０６０９２１０２の受入番号で２００６年９月１９日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体である５Ｅ５である。
本発明の他の実施態様は、ＳＴＨＭ２ ０６０９２１０１の受入番号で２００６年９月１９日にＥＣＡＣＣに寄託したハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体である２Ｄ９である。
上述の寄託は、２００６年９月１９日にＭａｄｓ Ａｇｅｒｖｉｇ Ｔａｒｐによって為された。寄託によって、以下の参照番号：Ｑ６８４７が与えられた。
本発明の他の実施態様は、医薬としての免疫原性グリコペプチドを用いて調製したモノクローナル抗体の使用である。
好ましい実施態様では、前記医薬は、癌の治療又は予防のために使用される。
更なる他の態様は、免疫原性グリコペプチドを使用して調製したモノクローナル抗体の癌の治療又は予防のための医薬の調製のための使用である。
免疫原性グリコペプチドを使用して調製したモノクローナル抗体は癌特異性を示すため、本発明のさらなる態様は、免疫原性グリコペプチドを使用して調製したモノクローナル抗体を含む医薬組成物である。
好ましい実施態様では、医薬組成物の抗体は、毒素又は放射性同位体に接合されている。
本発明の他の実施態様は、
・個体からのサンプルを準備する工程
・免疫原性グリコペプチドを用いて調製した抗体を前記サンプルと接触させる工程
・前記サンプルと相互作用しない抗体を除去する工程
・前記サンプルと相互作用する抗体から、前記個体が癌を有しているか又は癌を発症するリスクがあるか否かを決定する工程
を含む、個体が癌を有するか又は癌を発症するリスクがあるか否かを決定する方法である。
・個体からのサンプルを準備する工程
・免疫原性グリコペプチドを用いて調製した抗体を前記サンプルと接触させる工程
・前記サンプルと相互作用しない抗体を除去する工程
・前記サンプルと相互作用する抗体から、前記個体が癌を有しているか又は癌を発症するリスクがあるか否かを決定する工程
を含む、個体が癌を有するか又は癌を発症するリスクがあるか否かを決定する方法である。
本発明のさらなる他の態様は、
・腫瘍患者からの自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を準備する工程
・前記腫瘍患者からの自己ＡＰＣを有効量の本発明の免疫原性グリコペプチドと接触させる工程であって、前記接触が、エンドサイトーシス、プロセシング、前記ＡＰＣによる前記グリコペプチド又は融合分子の断片のＭＨＣクラスＩＩ提示を可能にする条件下において実施される、工程
・患者における免疫治療用途のための前記ペプチド又は融合分子断片提示ＡＰＣを単離する工程
を含む、ＭＵＣ１に対する効果的な免疫反応を誘導し得る、自己ＡＰＣの集団を生じるｅｘ ｖｉｖｏ方法である。
・腫瘍患者からの自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を準備する工程
・前記腫瘍患者からの自己ＡＰＣを有効量の本発明の免疫原性グリコペプチドと接触させる工程であって、前記接触が、エンドサイトーシス、プロセシング、前記ＡＰＣによる前記グリコペプチド又は融合分子の断片のＭＨＣクラスＩＩ提示を可能にする条件下において実施される、工程
・患者における免疫治療用途のための前記ペプチド又は融合分子断片提示ＡＰＣを単離する工程
を含む、ＭＵＣ１に対する効果的な免疫反応を誘導し得る、自己ＡＰＣの集団を生じるｅｘ ｖｉｖｏ方法である。
本発明のさらなる他の態様は、
ａ．ヒト抗体を含むサンプルを準備する工程
ｂ．ペプチドインヒビター及びＯ−グリカン糖インヒビターと前記サンプルとを接触させる工程
ｃ．工程ｂのサンプルを前記グリコペプチドと更に接触させる工程
ｄ．前記グリコペプチドサンプルと相互作用する抗体の量を定量する工程
を含む、免疫原性グリコペプチドに結合する抗体の存在を決定するための方法である。
ａ．ヒト抗体を含むサンプルを準備する工程
ｂ．ペプチドインヒビター及びＯ−グリカン糖インヒビターと前記サンプルとを接触させる工程
ｃ．工程ｂのサンプルを前記グリコペプチドと更に接触させる工程
ｄ．前記グリコペプチドサンプルと相互作用する抗体の量を定量する工程
を含む、免疫原性グリコペプチドに結合する抗体の存在を決定するための方法である。
ヒトは、Ｔｎ、ＳＴｎ、及びＴ糖構造に対する天然抗体を有し、これらは、癌患者において増大しているようである。その様な抗体は、分析したモノクローナル抗体パネルである抗−Ｔｎ、−ＳＴｎ、及び−Ｔ抗体と同様に、対応するＭＵＣ１グリコペプチドと反応するであろう。ヒト血清中の新規ＭＵＣ１グリコペプチド抗体を同定するために、抗ペプチド又は抗糖抗体からの干渉を受けることなく、グリコペプチド特異的抗体を選択的に同定し得るアッセイを開発することが必要である。
理論に結び付けることを意図しないが、ペプチドインヒビター及びＯ−グリカン糖インヒビターを使用して、免疫原性グリコペプチドに特異的な抗体、すなわち、免疫原性グリコペプチドに結合するが、糖単独又は非グリコシル化ペプチドに結合しない抗体に影響を与えることなく、交差反応抗体を中和することが可能であると解されている。かくして、免疫原性グリコペプチドに特異的な抗体の存在は、検出及び定量さえ可能である。これらの抗体は癌特異的であることが示されているため、前記方法は、癌との関連において診断及び予後のために使用されてよい。
前記サンプルは、血清、血漿、乳などの体液、唾液、粘膜からの分泌物、糞、尿、及びそれらの任意の抗体調製物であってよい。
前記ペプチドインヒビターは、典型的には、免疫原性グリコペプチドと同じアミノ酸配列であるが、グリコシル化されていないペプチドである。他の実施態様では、前記ペプチドインヒビターは、正常細胞に典型的に存在する、完全にプロセシングされた分枝コア２Ｏ−グリカンを含む。
前記糖インヒビターは、典型的には、Ｔｎ、ＳＴｎ、又はＴであろう。上述の糖の多価ＰＡＡ接合体も好ましい。更なる他の実施態様では、前記糖インヒビターは、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、及びＮｅｕＡｃなどのモノサッカリドである。糖の他の組み合わせが同じ効果を有することも当業者には明らかであろう。
好ましい実施態様では、本発明の方法は、ペプチドインヒビター及び／又はＯ−グリカン糖インヒビターと相互作用する抗体を除去する工程を更に含む。
更なる他の実施態様では、ペプチドインヒビター及びＯ−グリカンインヒビターが、ペプチドインヒビター及び／又はＯ−グリカン糖インヒビターと相互作用する抗体を除去するために使用される固体支持体上に固定化される。
更なる他の実施態様では、免疫原性グリコペプチドに結合する抗体が、免疫原性グリコペプチドのＯ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフに結合する。本明細書から明らかなように、その様な抗体は癌特異的であり、その存在は、個体が癌を有することを示し得る。
かくして、他の実施態様では、
ａ．癌を有する疑いがある個体からのサンプルを準備する
ｂ．グリコペプチドと相互作用する抗体の測定量を、対照群から決定される標準量と比較する
ｃ．標準量超の抗体の測定量は、個体における癌を示す
ｄ．標準量未満の抗体の測定量は、癌を有しない個体を示す。
ａ．癌を有する疑いがある個体からのサンプルを準備する
ｂ．グリコペプチドと相互作用する抗体の測定量を、対照群から決定される標準量と比較する
ｃ．標準量超の抗体の測定量は、個体における癌を示す
ｄ．標準量未満の抗体の測定量は、癌を有しない個体を示す。
免疫原性グリコペプチドに結合する抗体の存在を測定する上述の方法は、本発明の免疫原性グリコペプチドに必ずしも限定されないことに注意すべきである。前記方法は、他のグリコペプチドに特異的に結合する（ペプチド又は糖単独には結合しない）抗体の検出にも適用可能なはずである。
（実施例１）
原料及び方法
多量体Ｔｎ及びＳＴｎ ＭＵＣ１グリコペプチドの化学酵素合成
ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒ(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n=3ペプチドを、Ｆｏｎｔｅｎｏｔにより最初に報告されているように合成した。使用する対照ペプチドは、ＭＵＣ２(PTTTPISTTTMVTPTPTPTC)及びＭＵＣ４(CPLPVTDTSSASTGHATPLPV)のタンデムリピート由来であった。ペプチドは、精製組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化した。ＧａｌＮＡｃ置換ペプチドは、精製組換えマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを使用してシアル化した。ペプチドのＧａｌＮＡｃグリコシル化は、２５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び２ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを含有する反応混合物（１ｍｇペプチド／ｍｌ）において実施した。２ＧａｌＮＡｃをＴＲ毎に有する１ｍｇ ６０ｍｅｒペプチドのグリコシル化（ＭＵＣ１６０Ｔｎ６）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を用いて得られた。ＴＲ毎の３ＧａｌＮＡｃの包含（ＭＵＣ１６０Ｔｎ９）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を用いて得られた。ＭＵＣ１ ＴＲにおける全ての５つの推定上のＯ−グリコシル化部位の置換（ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４との反応においてＭＵＣ１６０Ｔｎ９を基質として用いて実施した。シアル化は、２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、及び２ｍＭ ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する反応混合物（１ｍｇペプチド／ｍｌ）中で実施した。グリコシル化は、ナノスケール逆相カラム（Ｐｏｒｏｓ Ｒ３、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器を用いてモニターした。グリコペプチドは、０．１％ ＴＦＡ及び０から８０％のアセトニトリルグラジエントを用いる１１００ Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ｓｙｓｔｅｍにおいてＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（９．４ｍｍ×２５ｃｍ）でＨＰＬＣによって精製した。グリコシル化反応の定量及び収量の見積もりは、標準物質として１０μｇに秤量したペプチドを用いたｕｖ ２１０吸収によるＨＰＬＣピークの比較によって行った。ペプチドのＧＡｌＮＡｃ−グリコシル化は、一般的に、８０から９０％の収率であったが、シアル化工程は、６０から８０％の間の収率でより変化していた。精製グリコペプチドは、ディレイド・エクストラクションを取り付けたＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ又はＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けられた。ＭＡＬＤＩマトリックスは、０．１％トリフルオロ酢酸の３０％アセトニトリル水溶液における２：１の混合物に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸 １０ｇ／Ｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）であった。約１ｐｍｏｌ／μｌの濃度にまで０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを、プローブチップ上に１μｌのサンプルを配置して、その後に１μｌのマトリックスを配置することによる分析のために調製した。全てのマススペクトルがリニアモードで得られた。データ処理は、ＧＲＡＭＳ／３８６ソフトウェアを用いて実施した。
原料及び方法
多量体Ｔｎ及びＳＴｎ ＭＵＣ１グリコペプチドの化学酵素合成
ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒ(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n=3ペプチドを、Ｆｏｎｔｅｎｏｔにより最初に報告されているように合成した。使用する対照ペプチドは、ＭＵＣ２(PTTTPISTTTMVTPTPTPTC)及びＭＵＣ４(CPLPVTDTSSASTGHATPLPV)のタンデムリピート由来であった。ペプチドは、精製組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化した。ＧａｌＮＡｃ置換ペプチドは、精製組換えマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを使用してシアル化した。ペプチドのＧａｌＮＡｃグリコシル化は、２５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び２ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを含有する反応混合物（１ｍｇペプチド／ｍｌ）において実施した。２ＧａｌＮＡｃをＴＲ毎に有する１ｍｇ ６０ｍｅｒペプチドのグリコシル化（ＭＵＣ１６０Ｔｎ６）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を用いて得られた。ＴＲ毎の３ＧａｌＮＡｃの包含（ＭＵＣ１６０Ｔｎ９）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を用いて得られた。ＭＵＣ１ ＴＲにおける全ての５つの推定上のＯ−グリコシル化部位の置換（ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４との反応においてＭＵＣ１６０Ｔｎ９を基質として用いて実施した。シアル化は、２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、及び２ｍＭ ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する反応混合物（１ｍｇペプチド／ｍｌ）中で実施した。グリコシル化は、ナノスケール逆相カラム（Ｐｏｒｏｓ Ｒ３、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器を用いてモニターした。グリコペプチドは、０．１％ ＴＦＡ及び０から８０％のアセトニトリルグラジエントを用いる１１００ Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ｓｙｓｔｅｍにおいてＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（９．４ｍｍ×２５ｃｍ）でＨＰＬＣによって精製した。グリコシル化反応の定量及び収量の見積もりは、標準物質として１０μｇに秤量したペプチドを用いたｕｖ ２１０吸収によるＨＰＬＣピークの比較によって行った。ペプチドのＧＡｌＮＡｃ−グリコシル化は、一般的に、８０から９０％の収率であったが、シアル化工程は、６０から８０％の間の収率でより変化していた。精製グリコペプチドは、ディレイド・エクストラクションを取り付けたＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ又はＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けられた。ＭＡＬＤＩマトリックスは、０．１％トリフルオロ酢酸の３０％アセトニトリル水溶液における２：１の混合物に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸 １０ｇ／Ｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）であった。約１ｐｍｏｌ／μｌの濃度にまで０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したサンプルを、プローブチップ上に１μｌのサンプルを配置して、その後に１μｌのマトリックスを配置することによる分析のために調製した。全てのマススペクトルがリニアモードで得られた。データ処理は、ＧＲＡＭＳ／３８６ソフトウェアを用いて実施した。
免疫プロトコール
グリコペプチドを、グルタルアルデヒドを用いて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に結合させた。接合効率は、抗ＭＵＣ１ ＥＬＩＳＡの画分を用いて、ＰＤ−１０カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによる反応を分析することによって評価した。本質的に、排除された画分について全て反応性を確認し、排除していない画分における顕著な反応性によってペプチドを含有することが期待された。更なる評価として、ＥＬＩＳＡにおける対応グリコペプチドとのＫＬＨ接合体の比較滴定分析を実施した。双方の分析は、前記接合体がほぼ完全であり、１：３００のＫＬＨに対するグリコペプチドの割合をもたらすはずである。トランス遺伝子発現についてホモ接合性のＭＵＣ１トランスジェニックマウス（ＭＵＣ１．Ｔｇ）を、Ｈ２−ｋバックグラウンドにおいて最初に開発した。その後、これらのマウスをＢａｌｂ／ｃ株に対して１５世代の間に亘って戻し交配して、純粋なＢａｌｂ／ｃ（Ｈ２−ｄ）バックグラウンドを得た（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，見公開のデータ）。メスのＢａｌｂ／ｃ野生型マウスとＭＵＣ１．Ｔｇマウスに、１０又は１５μｇの（グリコ）ペプチドを２００μｌの全容量（フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）との１：１混合物）で皮下に注射した。マウスは、１４日ごとに４回の免疫を受け、血液サンプルを、３回目と４回目の免疫の１週間後に尾又は眼から出血させて得た。
グリコペプチドを、グルタルアルデヒドを用いて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に結合させた。接合効率は、抗ＭＵＣ１ ＥＬＩＳＡの画分を用いて、ＰＤ−１０カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによる反応を分析することによって評価した。本質的に、排除された画分について全て反応性を確認し、排除していない画分における顕著な反応性によってペプチドを含有することが期待された。更なる評価として、ＥＬＩＳＡにおける対応グリコペプチドとのＫＬＨ接合体の比較滴定分析を実施した。双方の分析は、前記接合体がほぼ完全であり、１：３００のＫＬＨに対するグリコペプチドの割合をもたらすはずである。トランス遺伝子発現についてホモ接合性のＭＵＣ１トランスジェニックマウス（ＭＵＣ１．Ｔｇ）を、Ｈ２−ｋバックグラウンドにおいて最初に開発した。その後、これらのマウスをＢａｌｂ／ｃ株に対して１５世代の間に亘って戻し交配して、純粋なＢａｌｂ／ｃ（Ｈ２−ｄ）バックグラウンドを得た（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，見公開のデータ）。メスのＢａｌｂ／ｃ野生型マウスとＭＵＣ１．Ｔｇマウスに、１０又は１５μｇの（グリコ）ペプチドを２００μｌの全容量（フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）との１：１混合物）で皮下に注射した。マウスは、１４日ごとに４回の免疫を受け、血液サンプルを、３回目と４回目の免疫の１週間後に尾又は眼から出血させて得た。
マウスモノクローナル抗−ＭＵＣ１抗体である５Ｅ５の産生
モノクローナル抗体は、完全にＧａｌＮＡｃでグリコシル化され、ＫＬＨに結合させた６０ｍｅｒ ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫した野生型のＢａｌｂ／ｃマウスから過去に開示されているように生産した。スクリーニングは、グリコペプチドのＥＬＩＳＡアッセイ、その後の乳癌細胞株（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＴＳＶ１−７）を用いた免疫細胞学及び乳癌組織を用いた免疫組織学に基づくものであった。選択は、同じマウスの全血清に類似する反応性パターンに基づくものであった。
モノクローナル抗体は、完全にＧａｌＮＡｃでグリコシル化され、ＫＬＨに結合させた６０ｍｅｒ ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫した野生型のＢａｌｂ／ｃマウスから過去に開示されているように生産した。スクリーニングは、グリコペプチドのＥＬＩＳＡアッセイ、その後の乳癌細胞株（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＴＳＶ１−７）を用いた免疫細胞学及び乳癌組織を用いた免疫組織学に基づくものであった。選択は、同じマウスの全血清に類似する反応性パターンに基づくものであった。
ＥＬＩＳＡアッセイ
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。プレートは、重炭酸−炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌのグリコペプチドを用いて４度で一晩コーティングして、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロッキングし、血清（ＰＢＳで希釈）又はモノクローナル抗体を用いて２時間に亘って室温でインキュベートした。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）又はアイソタイプ特異的な抗体ペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ＵＳＡ）を用いて検出した。プレートは、Ｏ−フェニレンジアミンタブレット（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて発色させ、４９２ｎｍで読取った。対照抗体は、抗−ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ２及びＳＭ３並びに抗糖抗体である５Ｆ４（Ｔｎ）及び３Ｆ１（ＳＴｎ）を含んだ。対照血清は、ＫＬＨに結合させたＭＵＣ４ムチンペプチドで免疫したマウスを含んだ。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。プレートは、重炭酸−炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌのグリコペプチドを用いて４度で一晩コーティングして、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロッキングし、血清（ＰＢＳで希釈）又はモノクローナル抗体を用いて２時間に亘って室温でインキュベートした。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）又はアイソタイプ特異的な抗体ペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ＵＳＡ）を用いて検出した。プレートは、Ｏ−フェニレンジアミンタブレット（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて発色させ、４９２ｎｍで読取った。対照抗体は、抗−ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ２及びＳＭ３並びに抗糖抗体である５Ｆ４（Ｔｎ）及び３Ｆ１（ＳＴｎ）を含んだ。対照血清は、ＫＬＨに結合させたＭＵＣ４ムチンペプチドで免疫したマウスを含んだ。
細胞株
ヒト哺乳動物細胞株であるＭＣＦ７、ＭＴＳＶ１−７、及びＴ４７Ｄ、並びにネズミ膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ０２は、過去に開示されているように培養した。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞は、３２のタンデムリピートを含有する全長をコードするＭＵＣ１で安定にトランスフェクトし、所定のＧａｌ／ＧａｌＮＡｃを添加して又は添加せずに増殖させた。６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中のＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞のコンフルエントな培養物を、ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌの非存在下、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃの存在下、又は１ｍＭ ＧａｌＮＡｃ及び０．１ｍＭ Ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下において１０％ＦＣＳを含むＨＡＭ’Ｓ Ｆ１２において増殖させた。前記培地は、増殖の４８時間後に回収し、免疫アッセイに使用した。細胞はトリプシン処理して、洗浄し、免疫細胞学のためにカバースライド上で乾燥させた。
ヒト哺乳動物細胞株であるＭＣＦ７、ＭＴＳＶ１−７、及びＴ４７Ｄ、並びにネズミ膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ０２は、過去に開示されているように培養した。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞は、３２のタンデムリピートを含有する全長をコードするＭＵＣ１で安定にトランスフェクトし、所定のＧａｌ／ＧａｌＮＡｃを添加して又は添加せずに増殖させた。６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中のＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞のコンフルエントな培養物を、ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌの非存在下、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃの存在下、又は１ｍＭ ＧａｌＮＡｃ及び０．１ｍＭ Ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下において１０％ＦＣＳを含むＨＡＭ’Ｓ Ｆ１２において増殖させた。前記培地は、増殖の４８時間後に回収し、免疫アッセイに使用した。細胞はトリプシン処理して、洗浄し、免疫細胞学のためにカバースライド上で乾燥させた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットは、製造業者の説明書に従って実施した（４から１２％のグラジエントゲル、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。膜は、１５％のスキムミルク粉末（Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ）によってブロッキングして、ＭＡｂである５Ｅ５及びＨＭＦＧ２を用いて一晩に亘って４℃でインキュベートし、次いで、ビオチン化ヤギ抗−マウスＩｇＧ１（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）を用いて１時間に亘って室温でインキュベートした。膜を、アビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体（０．３６μｇ／ｍｌ）（Ｄａｋｏ）を用いて３０分に亘って室温でインキュベートし、次いで、０．０４％ ４−クロロ−１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ）及び０．０２５％ Ｈ２Ｏ２を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）とインキュベートした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットは、製造業者の説明書に従って実施した（４から１２％のグラジエントゲル、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。膜は、１５％のスキムミルク粉末（Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ）によってブロッキングして、ＭＡｂである５Ｅ５及びＨＭＦＧ２を用いて一晩に亘って４℃でインキュベートし、次いで、ビオチン化ヤギ抗−マウスＩｇＧ１（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）を用いて１時間に亘って室温でインキュベートした。膜を、アビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体（０．３６μｇ／ｍｌ）（Ｄａｋｏ）を用いて３０分に亘って室温でインキュベートし、次いで、０．０４％ ４−クロロ−１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ）及び０．０２５％ Ｈ２Ｏ２を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）とインキュベートした。
免疫細胞化学
細胞株は、氷冷アセトン又はメタノール:アセトン中で１０分間に亘って固定化した。固定化した細胞を、マウス血清（１：２００／１：４００／１：８００）又はモノクローナル抗体を用いて一晩に亘って５℃でインキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ接合ウサギ抗マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて４５分間に亘って室温でインキュベートした。スライドに、ｐ−フェニレンジアミンを含有するグリセロールをのせ、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡で試験した。
細胞株は、氷冷アセトン又はメタノール:アセトン中で１０分間に亘って固定化した。固定化した細胞を、マウス血清（１：２００／１：４００／１：８００）又はモノクローナル抗体を用いて一晩に亘って５℃でインキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ接合ウサギ抗マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて４５分間に亘って室温でインキュベートした。スライドに、ｐ−フェニレンジアミンを含有するグリセロールをのせ、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡で試験した。
免疫組織化学
凍結組織サンプルを、冷メタノール／アセトン（５０：５０）中で１０分間に亘って固定化した。ホルマリンで固定化し、パラフィンワックスに埋め込んだ乳癌組織が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｔｏ，Ｐｏｒｔｏｇａｌから得られた。全てのケースは、組織のタイプによって簡便に分類した。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体方法を免疫染色に使用した。パラフィン切片は、ワックスを除いて、再水和し、メタノール中の０．５％ Ｈ２Ｏ２で３０分間に亘って処理した。切片はＴＢＳですすいで、ラビット非免疫血清と２０分間に亘ってインキュベートした。切片をすすいで、一次抗体を用いて一晩に亘って５℃でインキュベートした。切片をすすいで、ＴＢＳ中に１：２００に希釈したビオチン標識ウサギ抗−マウス血清（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて３０分間に亘ってインキュベートし、ＴＢＳですすぎ、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて１時間に亘ってインキュベートした。切片をＴＢＳですすぎ、０．１％Ｈ２Ｏ２を含有する０．０５Ｍ ＴＢＳ中で新しく調製した０．０５％ ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを用いて発色させた。切片をヘマトキシリンで染色し、脱水して、標本にした。
凍結組織サンプルを、冷メタノール／アセトン（５０：５０）中で１０分間に亘って固定化した。ホルマリンで固定化し、パラフィンワックスに埋め込んだ乳癌組織が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｔｏ，Ｐｏｒｔｏｇａｌから得られた。全てのケースは、組織のタイプによって簡便に分類した。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体方法を免疫染色に使用した。パラフィン切片は、ワックスを除いて、再水和し、メタノール中の０．５％ Ｈ２Ｏ２で３０分間に亘って処理した。切片はＴＢＳですすいで、ラビット非免疫血清と２０分間に亘ってインキュベートした。切片をすすいで、一次抗体を用いて一晩に亘って５℃でインキュベートした。切片をすすいで、ＴＢＳ中に１：２００に希釈したビオチン標識ウサギ抗−マウス血清（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて３０分間に亘ってインキュベートし、ＴＢＳですすぎ、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて１時間に亘ってインキュベートした。切片をＴＢＳですすぎ、０．１％Ｈ２Ｏ２を含有する０．０５Ｍ ＴＢＳ中で新しく調製した０．０５％ ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを用いて発色させた。切片をヘマトキシリンで染色し、脱水して、標本にした。
結果
多量体ＴｎおよびＳＴｎ ＭＵＣ１グリコペプチドの化学酵素合成
合成６０ｍｅｒ ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドは、部位選択的組換えポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ（ＣａｌＮＡｃ−Ｔ２、−Ｔ４、及び−Ｔ１１）を用いてグリコシル化した。組換えＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化されたＭＵＣ１６０ｍｅｒタンデムリピートペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって示されるように、ＭＵＣ１タンデムリピート配列中のＧａｌＮＡｃ結合部位は厳密に制御されている。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を使用して２つのＧａｌＮＡｃ残基をタンデムリピート毎に添加し、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によって３残基を添加し、続いてＧａｌＮＡｃ−Ｔ２及び−Ｔ４を使用して全部で５つの残基を添加した（図１）結合部位は、過去に開示されているように質量分析によって確認した。５つのＧａｌＮＡｃ残基をリピート毎に与えるＧａｌＮＡｃ−Ｔ４を用いたグリコシル化は、ＮＨ２−末端が高度に切断されているペプチドの設計のために全部で１４のみを可能にする。ＳＴｎを形成するシアル酸を有するＧａｌＮＡｃ残基の更なるグリコシル化は、組換えネズミＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを用いて達成した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる結合したシアル酸残基の数の評価は、当該糖鎖結合の不安定な性質により過小評価される。シアル化は、抗ＳＴｎ（ポジティブ）及び抗Ｔｎ（ネガティブ）モノクローナル抗体を用いた免疫反応パターンによって評価されるものが完全であると解される。コア１構造は、組換えβ３Ｇａｌトランスフェラーゼを用いて生産した。形成したグリコペプチドは、図１の各々のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプロフィールの上端に示されている。
多量体ＴｎおよびＳＴｎ ＭＵＣ１グリコペプチドの化学酵素合成
合成６０ｍｅｒ ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドは、部位選択的組換えポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ（ＣａｌＮＡｃ−Ｔ２、−Ｔ４、及び−Ｔ１１）を用いてグリコシル化した。組換えＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化されたＭＵＣ１６０ｍｅｒタンデムリピートペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって示されるように、ＭＵＣ１タンデムリピート配列中のＧａｌＮＡｃ結合部位は厳密に制御されている。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を使用して２つのＧａｌＮＡｃ残基をタンデムリピート毎に添加し、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によって３残基を添加し、続いてＧａｌＮＡｃ−Ｔ２及び−Ｔ４を使用して全部で５つの残基を添加した（図１）結合部位は、過去に開示されているように質量分析によって確認した。５つのＧａｌＮＡｃ残基をリピート毎に与えるＧａｌＮＡｃ−Ｔ４を用いたグリコシル化は、ＮＨ２−末端が高度に切断されているペプチドの設計のために全部で１４のみを可能にする。ＳＴｎを形成するシアル酸を有するＧａｌＮＡｃ残基の更なるグリコシル化は、組換えネズミＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを用いて達成した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる結合したシアル酸残基の数の評価は、当該糖鎖結合の不安定な性質により過小評価される。シアル化は、抗ＳＴｎ（ポジティブ）及び抗Ｔｎ（ネガティブ）モノクローナル抗体を用いた免疫反応パターンによって評価されるものが完全であると解される。コア１構造は、組換えβ３Ｇａｌトランスフェラーゼを用いて生産した。形成したグリコペプチドは、図１の各々のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプロフィールの上端に示されている。
完全なＯ−グリカン結合を有するＭＵＣ１グリコペプチドは最も免疫原性であり、Ｔｎ及びＳＴｎグリコペプチドはＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおける強力な抗体反応を誘導する。
最初の試験では、２、３、及び５のＯ−グリカンをリピート毎に有するＭＵＣ１Ｔｎ糖型を免疫原として試験して、３及び５のＯ−グリカンを有するグリコペプチドが、ＥＬＩＳＡによる各免疫原に対する最も強力な免疫反応を生じ、より重要には、ＭＵＣ１を発現する癌細胞に対して反応性の抗体を誘導した（データは示さず）。更なる試験のために、完全なＯ−グリカンの占有を有するＭＵＣ１を選択し、図２に示すように、完全にＴｎグリコシル化されたＭＵＣ１（ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５）又は完全なＳＴｎグリコシル化ＭＵＣ１グリコペプチド（ＭＵＣ１６０ＳＴｎ１５）のいずれかで免疫した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス（図２ａｃ）及びＭＵＣ１．Ｔｇマウス（図２ｂｄ）由来の血清は、双方のマウスにおいて高い抗体力価を生じた。最も高い抗体力価は、免疫原として使用したＭＵＣ１糖型について認められたが、他のＭＵＣ１糖型をについても同様の反応性が認められた。低い反応性が、非グリコシル化ＭＵＣ１について、特にＴｎ免疫マウスにおいて認められた。非常に低いレベルの抗−Ｔｎ及びＳＴｎハプテン抗体が、ムチンＯＳＭ（主にＳＴｎ糖型を有するヒツジ顎下腺ムチン）及びＡ−ＯＳＭ（Ｔｎ糖型を有するアシアロムチン）を抗原として用いて検出された。非ＭＵＣ１ペプチド又はＴｎグリコシル化を有するグリコペプチドは、反応性が認められなかった。
最初の試験では、２、３、及び５のＯ−グリカンをリピート毎に有するＭＵＣ１Ｔｎ糖型を免疫原として試験して、３及び５のＯ−グリカンを有するグリコペプチドが、ＥＬＩＳＡによる各免疫原に対する最も強力な免疫反応を生じ、より重要には、ＭＵＣ１を発現する癌細胞に対して反応性の抗体を誘導した（データは示さず）。更なる試験のために、完全なＯ−グリカンの占有を有するＭＵＣ１を選択し、図２に示すように、完全にＴｎグリコシル化されたＭＵＣ１（ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５）又は完全なＳＴｎグリコシル化ＭＵＣ１グリコペプチド（ＭＵＣ１６０ＳＴｎ１５）のいずれかで免疫した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス（図２ａｃ）及びＭＵＣ１．Ｔｇマウス（図２ｂｄ）由来の血清は、双方のマウスにおいて高い抗体力価を生じた。最も高い抗体力価は、免疫原として使用したＭＵＣ１糖型について認められたが、他のＭＵＣ１糖型をについても同様の反応性が認められた。低い反応性が、非グリコシル化ＭＵＣ１について、特にＴｎ免疫マウスにおいて認められた。非常に低いレベルの抗−Ｔｎ及びＳＴｎハプテン抗体が、ムチンＯＳＭ（主にＳＴｎ糖型を有するヒツジ顎下腺ムチン）及びＡ−ＯＳＭ（Ｔｎ糖型を有するアシアロムチン）を抗原として用いて検出された。非ＭＵＣ１ペプチド又はＴｎグリコシル化を有するグリコペプチドは、反応性が認められなかった。
Ｔｎ ＭＵＣ１を用いて免疫したＭＵＣ１．Ｔｇマウス及び野生型マウスにおいて誘導される免疫反応を摸倣するモノクローナル抗体５Ｅ５の特徴づけ
グリコペプチドに対する免疫反応の特異性をさらに特徴づけ規定するために、本発明者は、検出したポリクローナル反応の特異性を本質的に反映した、完全なＴｎグリコシル化ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫したマウスからモノクローナル抗体（５Ｅ５と称する）を単離した（図３ａ）。抗体５Ｅ５は、ＭＵＣ１タンデムリピートの全てのＴｎ及びＳＴｎ糖型と反応し、非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドとは反応を示さず、非ＭＵＣ１ペプチド主鎖上に存在するＴｎハプテンとは非常に弱く反応性を示すのみであった。特異性に関与する広範なＯ−グリカン構造を評価するために、本発明者は、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞系を利用した。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞は、ＵＤＰ−Ｇａｌ／ＧａｌＮＡＣエピメラーゼを欠失しており、ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌの各々の外部からの添加がない条件下において、ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリコシル化及びガラクトシル化の不全が生じる。完全長をコードするＭＵＣ１遺伝子（ＣＨＯ ｌｄｌＤ／ＭＵＣ１）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞は、ＧａｌＮＡｃの存在下、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃの存在下、又は双方の不在下において増殖し、Ｔｎ、ＳＴ、又は非グリコシル化ＭＵＣ１糖型の各々を発現する細胞を生じさせる。図３ｂに示すように、ＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１細胞は、増殖培地に対する糖の添加にかかわらず、一般的な抗ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ２によって検出されるようにＭＵＣ１を発現する。ＧａｌＮＡｃ単独において増殖した細胞は、予測されたように、Ｔｎ抗原のみを発現し、Ｔ又はＳＴを発現しないが、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃにおいて増殖した細胞は、予測されたようにＳＴのみを発現する。興味深いことに、ＧａｌＮＡｃ単独において増殖した細胞は、ＳＴｎ構造を発現せず、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞が顕著な量のＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを発現しないことが示している。トランスフェクトしていないＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞が非常に弱い反応性を示すのみであったため（データ示さず）、抗糖抗体の染色は、ＭＵＣ１の発現に高度に依存した。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞によって生産されるＭＵＣ１糖型の更なる確認は、糖の存在下又は非存在下で増殖して分泌されたＭＵＣ１−ＩｇＧキメラ構築物の質量分析により達成された（結果は他の場所に示す）。５Ｅ５は、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現した組換えＭＵＣ１のＴｎ糖型に特異的に反応し、非グリコシル化又は更なるグリコシル化Ｔ及びＳＴ ＭＵＣ１糖型と反応しなかった（図３ｂｃ）。５Ｅ５は、大半の乳癌において強力に発現したＭＵＣ１の癌関連糖型を規定する（表１、図３ｄ）。５Ｅ５は、全ての腺管癌を染色し（ｎ＝１８）、２の小葉癌を染色した。ポジティブ細胞の割合は、２５％未満から７５％超の間で変化した。良性病変の６ケースを染色し、そのうち２ケース（１つが線維症及び１つが線維腺腫）のみが５Ｅ５でポジティブ染色を示し、これらの場合では２５％未満の細胞が染色された。この染色パターンは、モノクローナル抗体であるＨＭＦＧ２の癌における場合に密接に従うものであるが、５Ｅ５は、正常の胸及び良性病変においてより制限されていた。このことは、Ｔｎ及びＳＴｎ ＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドが原発ワクチン候補を表わすことを更に示すものである。
グリコペプチドに対する免疫反応の特異性をさらに特徴づけ規定するために、本発明者は、検出したポリクローナル反応の特異性を本質的に反映した、完全なＴｎグリコシル化ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫したマウスからモノクローナル抗体（５Ｅ５と称する）を単離した（図３ａ）。抗体５Ｅ５は、ＭＵＣ１タンデムリピートの全てのＴｎ及びＳＴｎ糖型と反応し、非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドとは反応を示さず、非ＭＵＣ１ペプチド主鎖上に存在するＴｎハプテンとは非常に弱く反応性を示すのみであった。特異性に関与する広範なＯ−グリカン構造を評価するために、本発明者は、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞系を利用した。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞は、ＵＤＰ−Ｇａｌ／ＧａｌＮＡＣエピメラーゼを欠失しており、ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌの各々の外部からの添加がない条件下において、ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリコシル化及びガラクトシル化の不全が生じる。完全長をコードするＭＵＣ１遺伝子（ＣＨＯ ｌｄｌＤ／ＭＵＣ１）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞は、ＧａｌＮＡｃの存在下、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃの存在下、又は双方の不在下において増殖し、Ｔｎ、ＳＴ、又は非グリコシル化ＭＵＣ１糖型の各々を発現する細胞を生じさせる。図３ｂに示すように、ＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１細胞は、増殖培地に対する糖の添加にかかわらず、一般的な抗ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ２によって検出されるようにＭＵＣ１を発現する。ＧａｌＮＡｃ単独において増殖した細胞は、予測されたように、Ｔｎ抗原のみを発現し、Ｔ又はＳＴを発現しないが、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃにおいて増殖した細胞は、予測されたようにＳＴのみを発現する。興味深いことに、ＧａｌＮＡｃ単独において増殖した細胞は、ＳＴｎ構造を発現せず、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞が顕著な量のＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを発現しないことが示している。トランスフェクトしていないＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞が非常に弱い反応性を示すのみであったため（データ示さず）、抗糖抗体の染色は、ＭＵＣ１の発現に高度に依存した。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞によって生産されるＭＵＣ１糖型の更なる確認は、糖の存在下又は非存在下で増殖して分泌されたＭＵＣ１−ＩｇＧキメラ構築物の質量分析により達成された（結果は他の場所に示す）。５Ｅ５は、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現した組換えＭＵＣ１のＴｎ糖型に特異的に反応し、非グリコシル化又は更なるグリコシル化Ｔ及びＳＴ ＭＵＣ１糖型と反応しなかった（図３ｂｃ）。５Ｅ５は、大半の乳癌において強力に発現したＭＵＣ１の癌関連糖型を規定する（表１、図３ｄ）。５Ｅ５は、全ての腺管癌を染色し（ｎ＝１８）、２の小葉癌を染色した。ポジティブ細胞の割合は、２５％未満から７５％超の間で変化した。良性病変の６ケースを染色し、そのうち２ケース（１つが線維症及び１つが線維腺腫）のみが５Ｅ５でポジティブ染色を示し、これらの場合では２５％未満の細胞が染色された。この染色パターンは、モノクローナル抗体であるＨＭＦＧ２の癌における場合に密接に従うものであるが、５Ｅ５は、正常の胸及び良性病変においてより制限されていた。このことは、Ｔｎ及びＳＴｎ ＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドが原発ワクチン候補を表わすことを更に示すものである。
ＴｎおよびＳＴｎ ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫したＭＵＣ１．Ｔｇマウスは、癌関連ＭＵＣ１グリコペプチドに限定的なＭＵＣ１グリコペプチド特異的反応を生じる。
ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドワクチンは、一般的に、ムチンが自己抗原として発現する際に、おそらくは免疫寛容により、癌関連ＭＵＣ１に対する液性反応の誘導において効果的ではない。しかしながら、図２において示すように、ＴｎとＳＴｎ６０ｍｅｒＭＵＣ１グリコペプチドの双方が、ＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおけるグリコペプチドに対する強力な抗体反応を誘導した。その抗体反応の特異性は、本質的に、野生型マウスにおいて認められるものと同一である。Ｔｇサブクラスの分布は、主にＩｇＧ１であるが、ＳＴｎ６０ｍｅｒＭＵＣ１に対する反応は、ＩｇＧ２Ａ及びＩｇＧ２Ｂサブクラスを含み、顕著な切り替えを示す（データ示さず）。誘導された抗体は、野生型血清（データ示さず）及びモノクローナル抗体５Ｅ５（図３ｂ）と同様に、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現した組換えＴｎ ＭＵＣ１と反応した（図４ａ）。さらに、Ｔｎ ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫したマウスに由来する血清は、主にＴｎを有するが、幾つかのＴ及びＳＴ Ｏ−グリカンを有する、ヒト乳ガン細胞株Ｔ４７Ｄと強力に反応した。ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５に対して作製した血清は、Ｔ４７Ｄ細胞の強力な染色を示した。２又は３のＴｎをタンデムリピート毎に有するＭＵＣ１６０ｍｅｒで免疫したマウス由来の血清は、腫瘍細胞株について中程度の反応性を示した。ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５で免疫したＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清は、Ｔ４７Ｄの中程度の染色を示した。他の乳癌細胞株であるＭＣＦ７は、部分的にコア２構造に基づくＯ−グリカンを有するＭＵＣ１の発現を示し、かくして、正常な上皮細胞において認められるパターンと非常に近似しているグリコシル化パターンを有することを示した。ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５で免疫したマウス由来の血清は、ＭＣＦ７について、Ｔ４７Ｄ細胞よりも低い反応性を示した。ＭＣＦ７は、ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５に対して作製した血清によって染色しなかった。全ての血清は、高レベルのＣ２ＧｎＴ１を発現し、コア２に基づくＯ−グリカンを有するＭＵＣ１を産生する非腫瘍形成性上皮細胞株であるＭＴＳＶ１−７について非常に低い反応性を示した。最後に、ＭＵＣ１６０ＳＴｎ１５で免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の抗血清は、ＭＵＣ１及びＳＴｎを発現する原発性乳癌と反応した（図４ｂ）。
ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドワクチンは、一般的に、ムチンが自己抗原として発現する際に、おそらくは免疫寛容により、癌関連ＭＵＣ１に対する液性反応の誘導において効果的ではない。しかしながら、図２において示すように、ＴｎとＳＴｎ６０ｍｅｒＭＵＣ１グリコペプチドの双方が、ＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおけるグリコペプチドに対する強力な抗体反応を誘導した。その抗体反応の特異性は、本質的に、野生型マウスにおいて認められるものと同一である。Ｔｇサブクラスの分布は、主にＩｇＧ１であるが、ＳＴｎ６０ｍｅｒＭＵＣ１に対する反応は、ＩｇＧ２Ａ及びＩｇＧ２Ｂサブクラスを含み、顕著な切り替えを示す（データ示さず）。誘導された抗体は、野生型血清（データ示さず）及びモノクローナル抗体５Ｅ５（図３ｂ）と同様に、ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現した組換えＴｎ ＭＵＣ１と反応した（図４ａ）。さらに、Ｔｎ ＭＵＣ１グリコペプチドで免疫したマウスに由来する血清は、主にＴｎを有するが、幾つかのＴ及びＳＴ Ｏ−グリカンを有する、ヒト乳ガン細胞株Ｔ４７Ｄと強力に反応した。ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５に対して作製した血清は、Ｔ４７Ｄ細胞の強力な染色を示した。２又は３のＴｎをタンデムリピート毎に有するＭＵＣ１６０ｍｅｒで免疫したマウス由来の血清は、腫瘍細胞株について中程度の反応性を示した。ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５で免疫したＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清は、Ｔ４７Ｄの中程度の染色を示した。他の乳癌細胞株であるＭＣＦ７は、部分的にコア２構造に基づくＯ−グリカンを有するＭＵＣ１の発現を示し、かくして、正常な上皮細胞において認められるパターンと非常に近似しているグリコシル化パターンを有することを示した。ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５で免疫したマウス由来の血清は、ＭＣＦ７について、Ｔ４７Ｄ細胞よりも低い反応性を示した。ＭＣＦ７は、ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５に対して作製した血清によって染色しなかった。全ての血清は、高レベルのＣ２ＧｎＴ１を発現し、コア２に基づくＯ−グリカンを有するＭＵＣ１を産生する非腫瘍形成性上皮細胞株であるＭＴＳＶ１−７について非常に低い反応性を示した。最後に、ＭＵＣ１６０ＳＴｎ１５で免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の抗血清は、ＭＵＣ１及びＳＴｎを発現する原発性乳癌と反応した（図４ｂ）。
（実施例２）
原料及び方法
グリコペプチドの化学酵素合成
３のタンデムリピートを示すＭＵＣ１ ６０ｍｅｒペプチド(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n=3を、最初に報告されたとおりに合成した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫによる）。マウスの免疫のために、ペプチドは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２及び−Ｔ４の共同の作用によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全にＴｎ−グリコシル化された。捕捉ＥＬＩＳＡのために、６０ｍｅｒペプチドのＮＨ２末端ビオチン化バリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化して、１１の異なる糖型を形成した（図５）。さらに、対照ペプチドとして、１．４タンデムリピートに相当するＭＵＣ２ ３３ｍｅｒペプチド(PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTPISTTC)（Ｄｒ．Ｐ．Ｏ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）は、２０の潜在的な受容部位のうち約１２を占有するものとしてＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によってＴｎグリコシル化された。２種のバリン置換ＮＨ２末端ビオチン化２５ｍｅｒ ＭＵＣ１ペプチドTAP25V9 (T1APPAHGVV9SAPDTRPAPGST21APPA)及びTAP25V21 (T1APPAHGVT9SAPDTRPAPGSV21APPA)を合成して、異なるポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼを用いたそれらのグリコシル化産物は過去に開示されているように特性決定した。これらのペプチドは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を用いることによって、Ｔｈｒ１及びＴｈｒ２１又はＴｈｒ１及びＴｈｒ９の各々において酵素でｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化された（図５）。さらに、AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAの配列に基づく単独のＴｎ−グリカン（Ｔｎ−Ａ１−Ｔｎ−Ａ４）又は単独のＴ−グリカン（Ｔ−Ａ１−Ｔ−Ａ４）のいずれかを有する、８の異なる２１ｍｅｒ ＭＵＣ１グリコペプチドを化学的に合成した（図５）。
原料及び方法
グリコペプチドの化学酵素合成
３のタンデムリピートを示すＭＵＣ１ ６０ｍｅｒペプチド(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n=3を、最初に報告されたとおりに合成した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫによる）。マウスの免疫のために、ペプチドは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２及び−Ｔ４の共同の作用によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全にＴｎ−グリコシル化された。捕捉ＥＬＩＳＡのために、６０ｍｅｒペプチドのＮＨ２末端ビオチン化バリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化して、１１の異なる糖型を形成した（図５）。さらに、対照ペプチドとして、１．４タンデムリピートに相当するＭＵＣ２ ３３ｍｅｒペプチド(PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTPISTTC)（Ｄｒ．Ｐ．Ｏ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）は、２０の潜在的な受容部位のうち約１２を占有するものとしてＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によってＴｎグリコシル化された。２種のバリン置換ＮＨ２末端ビオチン化２５ｍｅｒ ＭＵＣ１ペプチドTAP25V9 (T1APPAHGVV9SAPDTRPAPGST21APPA)及びTAP25V21 (T1APPAHGVT9SAPDTRPAPGSV21APPA)を合成して、異なるポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼを用いたそれらのグリコシル化産物は過去に開示されているように特性決定した。これらのペプチドは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を用いることによって、Ｔｈｒ１及びＴｈｒ２１又はＴｈｒ１及びＴｈｒ９の各々において酵素でｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化された（図５）。さらに、AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAの配列に基づく単独のＴｎ−グリカン（Ｔｎ−Ａ１−Ｔｎ−Ａ４）又は単独のＴ−グリカン（Ｔ−Ａ１−Ｔ−Ａ４）のいずれかを有する、８の異なる２１ｍｅｒ ＭＵＣ１グリコペプチドを化学的に合成した（図５）。
免疫のためのＭＵＣ１ ６０ｍｅｒグリコペプチド接合物
１５のＧａｌＮＡｃ残基を有する６０ｍｅｒＭＵＣ１ペプチドを、グリコペプチド：ｍｃＫＬＨが３００：１のモル比でグルタルアルデヒドを用いて、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標） Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅキーホールリンペットヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に接合した。過剰なグルタルアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）においてＰＢＳで溶出して除去した。２８０ｎｍ及び２１０ｎｍのＯＤの読み取りに基づいて、画分をプールした。未接合のペプチドの溶出時間に相当する画分は、２１０ｎｍにおけるＯＤの読み取りによれば、ペプチドを含有していなかった。さらに、ＥＬＩＳＡでは、接合の割合が、前記接合物及び未接合のグリコペプチドとグリコペプチド又はグリカン単独に対するモノクローナル抗体との反応性を比較することによって、ほぼ完全であることが推定された。
１５のＧａｌＮＡｃ残基を有する６０ｍｅｒＭＵＣ１ペプチドを、グリコペプチド：ｍｃＫＬＨが３００：１のモル比でグルタルアルデヒドを用いて、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標） Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅキーホールリンペットヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に接合した。過剰なグルタルアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）においてＰＢＳで溶出して除去した。２８０ｎｍ及び２１０ｎｍのＯＤの読み取りに基づいて、画分をプールした。未接合のペプチドの溶出時間に相当する画分は、２１０ｎｍにおけるＯＤの読み取りによれば、ペプチドを含有していなかった。さらに、ＥＬＩＳＡでは、接合の割合が、前記接合物及び未接合のグリコペプチドとグリコペプチド又はグリカン単独に対するモノクローナル抗体との反応性を比較することによって、ほぼ完全であることが推定された。
ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞における組換えＭＵＣ１の生産
１６のタンデムリピートを含有する可溶性ＭＵＣ１−ネズミＩｄＧ２ａ融合構築物で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞を、１０％ＦＣＳ及び６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ修飾Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地で培養した。これらの細胞中のＵＤＰ−Ｇａｌ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ ４−エピメラーゼの欠如を利用して、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃと共に培養して可溶性Ｔｎ−ＭＵＣ１を発現する細胞を産生し、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃ及び０．１ｍＭ Ｇａｌと共に培養して可溶性ＳＴ−ＭＵＣ１を発現する細胞を産生した。糖タンパク質（６×Ｈｉｓタグ付加した）をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。精製ＳＴ ＭＵＣ１は、ノイラミニダーゼ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、０．２Ｕ／ｍｌ）で処理して、Ｔ−ＭＵＣ１をＮｉ−ＮＴＡアガロースでノイラミニダーゼを除去するために再精製した。
１６のタンデムリピートを含有する可溶性ＭＵＣ１−ネズミＩｄＧ２ａ融合構築物で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞を、１０％ＦＣＳ及び６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ修飾Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地で培養した。これらの細胞中のＵＤＰ−Ｇａｌ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ ４−エピメラーゼの欠如を利用して、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃと共に培養して可溶性Ｔｎ−ＭＵＣ１を発現する細胞を産生し、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃ及び０．１ｍＭ Ｇａｌと共に培養して可溶性ＳＴ−ＭＵＣ１を発現する細胞を産生した。糖タンパク質（６×Ｈｉｓタグ付加した）をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。精製ＳＴ ＭＵＣ１は、ノイラミニダーゼ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、０．２Ｕ／ｍｌ）で処理して、Ｔ−ＭＵＣ１をＮｉ−ＮＴＡアガロースでノイラミニダーゼを除去するために再精製した。
ＭＡｂ ２Ｄ９の産生
ＭＡｂ ５Ｅ５と同様に、メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、ＫＬＨに接合した１５Ｔｎ−ＭＵ１ ６０ｍｅｒグリコペプチドで免疫した。３回目の免疫の７日後に尾から出血させて回収し、ネガティブ対照として役に立つＴｎ−ＭＵＣ２グリコペプチドを用いてＥＬＩＳＡによって、又はＴｎ−ＭＵＣ１、ＳＴ−ＭＵＣ１（ノイラミニダーゼ処理後のＴ−ＭＵＣ）、若しくは非グリコシル化ＭＵＣ１を発現するＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１Ｆ細胞、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳管癌）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）、及びＭＴＳＶ１−７（ヒトの胸）を用いて免疫細胞化学によって、血清を試験した。４回目の免疫の３日後に、一匹のマウスに由来する脾臓細胞をＮＳ１ミエローマ細胞と融合させた。興味ある抗原に特異的なハイブリドーマを、少なくとも３回の限界希釈法によってクローン化した。
ＭＡｂ ５Ｅ５と同様に、メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、ＫＬＨに接合した１５Ｔｎ−ＭＵ１ ６０ｍｅｒグリコペプチドで免疫した。３回目の免疫の７日後に尾から出血させて回収し、ネガティブ対照として役に立つＴｎ−ＭＵＣ２グリコペプチドを用いてＥＬＩＳＡによって、又はＴｎ−ＭＵＣ１、ＳＴ−ＭＵＣ１（ノイラミニダーゼ処理後のＴ−ＭＵＣ）、若しくは非グリコシル化ＭＵＣ１を発現するＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１Ｆ細胞、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳管癌）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）、及びＭＴＳＶ１−７（ヒトの胸）を用いて免疫細胞化学によって、血清を試験した。４回目の免疫の３日後に、一匹のマウスに由来する脾臓細胞をＮＳ１ミエローマ細胞と融合させた。興味ある抗原に特異的なハイブリドーマを、少なくとも３回の限界希釈法によってクローン化した。
他のモノクローナル抗体
２種の対照抗体を、ＧａｌＮＡｃ中で増殖させるか（ＭＡｂ ５Ｅ１０）又はＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ中で増殖させて、その後にノイラミニダーゼで処理（ＭＡｂ １Ｂ９）したＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞由来の精製した可溶性ＭＵＣ１に対してメスのＢａｌｂ／ｃマウスにおいて産生させた。免疫は、フロイント完全アジュバント中に乳化させた４０μｇ／１００μｌの免疫原の１回の皮下注射、その後のフロイント不完全アジュバントの２から３週間間隔における２回の注射、並びに最後のアジュバントなしの追加免疫によって実施した。異なる選択基準で上述のようにして、免疫細胞化学的に２種のクローンが選択された。Ｏ−グリコシル化からは独立して全ての試験したＭＵＣ１発現細胞株と反応し、そのためユニバーサルな抗ＭＵＣ１ＭＡｂとして役に立ち得るため、ＭＡｂ ５Ｅ１０が選択された。Ｔ抗原を提示するノイラミニダーゼで処理した細胞に対する特異性を示すため、ＭＡｂ １Ｂ９が選択された。
２種の対照抗体を、ＧａｌＮＡｃ中で増殖させるか（ＭＡｂ ５Ｅ１０）又はＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ中で増殖させて、その後にノイラミニダーゼで処理（ＭＡｂ １Ｂ９）したＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞由来の精製した可溶性ＭＵＣ１に対してメスのＢａｌｂ／ｃマウスにおいて産生させた。免疫は、フロイント完全アジュバント中に乳化させた４０μｇ／１００μｌの免疫原の１回の皮下注射、その後のフロイント不完全アジュバントの２から３週間間隔における２回の注射、並びに最後のアジュバントなしの追加免疫によって実施した。異なる選択基準で上述のようにして、免疫細胞化学的に２種のクローンが選択された。Ｏ−グリコシル化からは独立して全ての試験したＭＵＣ１発現細胞株と反応し、そのためユニバーサルな抗ＭＵＣ１ＭＡｂとして役に立ち得るため、ＭＡｂ ５Ｅ１０が選択された。Ｔ抗原を提示するノイラミニダーゼで処理した細胞に対する特異性を示すため、ＭＡｂ １Ｂ９が選択された。
ＥＬＩＳＡアッセイ
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、ＮｕｎｃＩｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ９６プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。非ビオチン化グリコペプチドは、２μｇ／ｍｌの最初の濃度から連続的に希釈し、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で１時間３７℃又は一晩４℃でコーティングした。捕捉ＥＬＩＳＡのために、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で１．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１時間３７℃又は一晩４℃でプレートをコーティングした。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で１時間室温においてブロッキングした。ストレプトアビジンコーティングプレートは、２μｇ／ｍｌの最初の濃度から連続的に希釈したビオチン化グリコペプチドを用いてインキュベートし、１時間３７℃又は一晩４℃でインキュベートした。その後、モノクローナル抗体を用いて２時間室温又は一晩４℃でプレートをインキュベートした。５Ｅ５、２Ｄ９、１Ｂ９、５Ｅ１０、及びＳＭ３は、非希釈の培養物上清として使用したが、ＭＹ．１Ｅ１２腹水は１：１０００で使用し、精製ＢＷ８３５は１μｇ／ｍｌで使用した。ＭＹ．１Ｅ１２は、Ｄｒ．Ｔ．Ｉｒｉｍｕｒａから提供されたものであり、ＢＷ８３５はＤｒｓ．Ｆ．−Ｇ．Ｈａｎｉｓｃｈ及びＴ．Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋによるものである。Ｔｎ−ＭＵＣ１で免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の血清は、１：１００又は１：２００の最初の希釈からＰＢＳ中の２％ＢＳＡで連続的に希釈した。結合した抗体は、ＨＲＰ接合ポリクローナルウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で検出した。ＴＭＢ＋ １段階基質システム（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いてプレートを発色させ、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍで読取った。
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、ＮｕｎｃＩｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ９６プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。非ビオチン化グリコペプチドは、２μｇ／ｍｌの最初の濃度から連続的に希釈し、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で１時間３７℃又は一晩４℃でコーティングした。捕捉ＥＬＩＳＡのために、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で１．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１時間３７℃又は一晩４℃でプレートをコーティングした。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で１時間室温においてブロッキングした。ストレプトアビジンコーティングプレートは、２μｇ／ｍｌの最初の濃度から連続的に希釈したビオチン化グリコペプチドを用いてインキュベートし、１時間３７℃又は一晩４℃でインキュベートした。その後、モノクローナル抗体を用いて２時間室温又は一晩４℃でプレートをインキュベートした。５Ｅ５、２Ｄ９、１Ｂ９、５Ｅ１０、及びＳＭ３は、非希釈の培養物上清として使用したが、ＭＹ．１Ｅ１２腹水は１：１０００で使用し、精製ＢＷ８３５は１μｇ／ｍｌで使用した。ＭＹ．１Ｅ１２は、Ｄｒ．Ｔ．Ｉｒｉｍｕｒａから提供されたものであり、ＢＷ８３５はＤｒｓ．Ｆ．−Ｇ．Ｈａｎｉｓｃｈ及びＴ．Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋによるものである。Ｔｎ−ＭＵＣ１で免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の血清は、１：１００又は１：２００の最初の希釈からＰＢＳ中の２％ＢＳＡで連続的に希釈した。結合した抗体は、ＨＲＰ接合ポリクローナルウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で検出した。ＴＭＢ＋ １段階基質システム（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いてプレートを発色させ、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍで読取った。
免疫細胞化学
細胞株を氷冷アセトン中で１０分に亘って固定化した。固定化した細胞は非希釈ＭＡｂ上清と一晩４℃でインキュベートし、その後に、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合ウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と４５分室温でインキュベートした。スライドにｐ−フェニレンジアミンを含有するグリセロールをのせ、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（ＦｌｕｏｒｅｓＳｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｌｌｂｅｒｇｍｏｏｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で試験した。
細胞株を氷冷アセトン中で１０分に亘って固定化した。固定化した細胞は非希釈ＭＡｂ上清と一晩４℃でインキュベートし、その後に、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合ウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と４５分室温でインキュベートした。スライドにｐ−フェニレンジアミンを含有するグリセロールをのせ、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（ＦｌｕｏｒｅｓＳｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｌｌｂｅｒｇｍｏｏｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で試験した。
結果
ＭＵＣ１モノクローナル抗体の産生
ＭＡｂ ５Ｅ５（ＩｇＧ１）は、過去に開示されているように（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、ＫＬＨに接合させた１５のＧａｌＮＡｃ残基を有する６０ｍｅｒ ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドに対して産生させた。この抗体は、タンデムリピートドメインにＴｎ又はＳＴｎを有するＭＵＣ１と特異的に反応し、各種の広範な乳癌と反応するが、正常な胸の上皮とは反応を示さないことが示された（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。本来、その反応性のパターンが本質的に完全なＴｎ−又はＳＴｎグリコシル化を有するＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドで免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の全血清のものを反映するため、５Ｅ５が選択された（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。本試験では、本発明者は、免疫及びスクリーニングプロトコルを再現し、本質的に同じ特異性を示す（図６）他のモノクローナル抗体である２Ｄ９（ＩｇＧ１）を単離し、その様な抗体が一般的なものであることを示した。
ＭＵＣ１モノクローナル抗体の産生
ＭＡｂ ５Ｅ５（ＩｇＧ１）は、過去に開示されているように（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、ＫＬＨに接合させた１５のＧａｌＮＡｃ残基を有する６０ｍｅｒ ＭＵＣ１タンデムリピートペプチドに対して産生させた。この抗体は、タンデムリピートドメインにＴｎ又はＳＴｎを有するＭＵＣ１と特異的に反応し、各種の広範な乳癌と反応するが、正常な胸の上皮とは反応を示さないことが示された（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。本来、その反応性のパターンが本質的に完全なＴｎ−又はＳＴｎグリコシル化を有するＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドで免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の全血清のものを反映するため、５Ｅ５が選択された（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。本試験では、本発明者は、免疫及びスクリーニングプロトコルを再現し、本質的に同じ特異性を示す（図６）他のモノクローナル抗体である２Ｄ９（ＩｇＧ１）を単離し、その様な抗体が一般的なものであることを示した。
２種の追加のＭＵＣ１抗体は、Ｔｎ糖型（５Ｅ１０）を産生するためにＧａｌＮＡｃにおいて増殖させた、又はＳＴ糖型を産生するためにＧａｌおよびＧａｌＮＡｃにおいて増殖させて、その後にノイラミニダーゼ処理によりＴ糖型（１Ｂ９）を低減させたＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現した精製組換え分泌ＭＵＣ１（ｒＭＵＣ１）に対して産生した。免疫細胞化学によって、ＭＡｂ ５Ｅ１０は、試験した全てのＭＵＣ１発現細胞株と反応し、そのため、潜在的にユニバーサルな抗ＭＵＣ１ ＭＡｂとして役に立ち得る。ＭＵＣ１のＴ糖型を提示するノイラミニダーゼ処理細胞に対して特異性を示すため、ＭＡｂ １Ｂ９が選択された。
Ｔｎ−ＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドに対して産生されたＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９のエピトープマッピング
前記抗体の特異性を、酵素化学法によって産生した６０ｍｅｒグリコペプチドのパネルを用いる直接結合ＥＬＩＳＡアッセイによって最初に測定した（図５）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９は、Ｔｎ及びＳｔｎ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドに対して高い選択性とともに同様の反応性パターンを示し、双方の抗体が、最も高いＯ−グリカン占有率を有するＴｎ−ＭＵＣ１糖型に好適であることを示したが、直接結合アッセイでは、２Ｄ９は、ＳＴｎ糖型と比較して、Ｔｎ糖型に顕著により良好な反応性を示した（データ示さず）。抗体の結合特異性を完全に評価し、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＭＵＣ１ペプチド及びグリコペプチドの吸着及び提示における差異に関する問題を排除するために、ストレプトアビジン−ビオチン捕捉ＥＬＩＳＡを、６０ｍｅｒのＭＵＣ１ビオチン化グリコペプチドの大きなパネルを用いて開発した（図５）。図６に示す結果は、２つのＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９が、グリカンがＴｎ又はＳＴｎであり、少なくとも２つのＯ−グリカン、好ましくは３又は５つのＯ−グリカンをＭＵＣ１リピート毎に有するグリコペプチドエピトープと反応することが明らかに確認される。これは、配列のＶＴＳＡ又はＧＳＴＶ領域のいずれかにおけるＯ−グリカンがエピトープには必要であることを示唆し得る（図５）。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞におけるＭＵＣ１の組換え発現は、ＭＵＣ１の異なる糖型の提示を可能にする（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９は、Ｔｎ−ＭＵＣ１と反応するが、Ｔ及びＳＴ−ＭＵＣ１グリコペプチドとの反応性の欠如により予測されるようにＴ−ＭＵＣ１糖型とは反応しなかった（図６、パネルＡ及びＤ）。興味深いことに、弱い反応性は、コア３−グリコシル化糖型（ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）について認められたが、３つのＯ−グリカンをタンデムリピート毎に有する場合に認められ、５つのＯ−グリカンをタンデムリピート毎に有する場合には認められなかった。これの有意性は現時点では明らかではなく、コア３Ｏ−グリカン構造を合成するβ３Ｇｎ−Ｔ６酵素の発現は胃、直腸、及び小腸に限定されている。
前記抗体の特異性を、酵素化学法によって産生した６０ｍｅｒグリコペプチドのパネルを用いる直接結合ＥＬＩＳＡアッセイによって最初に測定した（図５）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９は、Ｔｎ及びＳｔｎ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１タンデムリピートグリコペプチドに対して高い選択性とともに同様の反応性パターンを示し、双方の抗体が、最も高いＯ−グリカン占有率を有するＴｎ−ＭＵＣ１糖型に好適であることを示したが、直接結合アッセイでは、２Ｄ９は、ＳＴｎ糖型と比較して、Ｔｎ糖型に顕著により良好な反応性を示した（データ示さず）。抗体の結合特異性を完全に評価し、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＭＵＣ１ペプチド及びグリコペプチドの吸着及び提示における差異に関する問題を排除するために、ストレプトアビジン−ビオチン捕捉ＥＬＩＳＡを、６０ｍｅｒのＭＵＣ１ビオチン化グリコペプチドの大きなパネルを用いて開発した（図５）。図６に示す結果は、２つのＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９が、グリカンがＴｎ又はＳＴｎであり、少なくとも２つのＯ−グリカン、好ましくは３又は５つのＯ−グリカンをＭＵＣ１リピート毎に有するグリコペプチドエピトープと反応することが明らかに確認される。これは、配列のＶＴＳＡ又はＧＳＴＶ領域のいずれかにおけるＯ−グリカンがエピトープには必要であることを示唆し得る（図５）。ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞におけるＭＵＣ１の組換え発現は、ＭＵＣ１の異なる糖型の提示を可能にする（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＭＡｂ ５Ｅ５及び２Ｄ９は、Ｔｎ−ＭＵＣ１と反応するが、Ｔ及びＳＴ−ＭＵＣ１グリコペプチドとの反応性の欠如により予測されるようにＴ−ＭＵＣ１糖型とは反応しなかった（図６、パネルＡ及びＤ）。興味深いことに、弱い反応性は、コア３−グリコシル化糖型（ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）について認められたが、３つのＯ−グリカンをタンデムリピート毎に有する場合に認められ、５つのＯ−グリカンをタンデムリピート毎に有する場合には認められなかった。これの有意性は現時点では明らかではなく、コア３Ｏ−グリカン構造を合成するβ３Ｇｎ−Ｔ６酵素の発現は胃、直腸、及び小腸に限定されている。
更なるグリコペプチドのバリアントは、エピトープをより正確に規定するために必要であるが、現在の６０ｍｅｒ ＭＵＣ１ペプチドの酵素グリコシル化は、ポリペプチドＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの基質特異性に限定される。そのため、所定のスレオニン残基のバリン置換を有する２種の２５ｍｅｒペプチドを使用し、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１を利用して個々の部位にＴｎを有する糖型を化学酵素的に生じさせた。最初のＴｈｒのＴｎグリコシル化に加えて、２種のグリコペプチドは、ＶＴＳＡ領域のＴｈｒ（２Ｔｎ−ＴＡＰ２５Ｖ２１）又はＧＳＴＡ領域のＴｈｒ（２Ｔｎ−ＴＡＰ２５Ｖ９）においてＴｎグリコシル化された。ＧＳＴＡ領域におけるＳｅｒ及びＴｈｒの双方の酵素的なＴｎグリコシル化は、ビオチン化６０ｍｅｒペプチドとの反応性の増大が認められ、ＴＡＰ２５Ｖ９ペプチドとは不可能であった。図６に示すように（パネルＢ及びＥ）、５Ｅ５及び２Ｄ９は、ＶＴＳＡ領域のＴｈｒにＴｎグリコシル化を有する２Ｔｎ−ＴＡＰ２５Ｖ２１と反応しないが、強力な反応性が、ＧＳＴＡ領域のＴｈｒにＴｎグリコシル化を有する２Ｔｎ−ＴＡＰ２５Ｖ９グリコペプチドについて認められた。この反応性は、単独のＴｎ又はＴ Ｏ−グリカンを有する合成ＭＵＣ１グリコペプチドのパネルを用いた直接結合ＥＬＩＳＡにおいて確認された（図５）。５Ｅ５及び２Ｄ９は、ＧＳＴＡ領域のＴｈｒにＴｎを有するグリコペプチドに対して強力な反応性を示したが、Ｔグリカンが当該スレオニンにあるか又は他のＴｎ又はＴグリコシル化グリコペプチドについては反応性を示さなかった（図６、パネルＣ及びＦ）。要約すると、５Ｅ５及び２Ｄ９は、ＧＳＴＡのＴｈｒがＴｎ又はＳｔｎグリコシル化されている際にＭＵＣ１グリコペプチドと反応し、Ｓｅｒ及びＴｈｒの双方がグリコシル化されている際により強力であった。
Ｔｎ−ＭＵＣ１免疫ＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の全血清の特異性分析
ＫＬＨに接合させた１５Ｔｎ−ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒグリコペプチドで免疫したマウスの全血清は、高密度のＴｎ−及びＳＴｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドに好ましいことを示した（図７、パネルＡ）。より重要なことに、Ｔｎグリコシル化ＧＳＴＡ配列についての同じ特異性が、バリン置換グリコペプチドについて認められた（図７、パネルＢ）。上記のデータをまとめると、これらの結果は、明らかに、Ｔｎ及び／又はｓＴｎでグリコシル化されたＭＵＣ１タンデムリピートのＧＳＴＡ領域が、新規な免疫優性ＭＵＣ１グリコペプチドエピトープを示す。
ＫＬＨに接合させた１５Ｔｎ−ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒグリコペプチドで免疫したマウスの全血清は、高密度のＴｎ−及びＳＴｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドに好ましいことを示した（図７、パネルＡ）。より重要なことに、Ｔｎグリコシル化ＧＳＴＡ配列についての同じ特異性が、バリン置換グリコペプチドについて認められた（図７、パネルＢ）。上記のデータをまとめると、これらの結果は、明らかに、Ｔｎ及び／又はｓＴｎでグリコシル化されたＭＵＣ１タンデムリピートのＧＳＴＡ領域が、新規な免疫優性ＭＵＣ１グリコペプチドエピトープを示す。
ＭＡｂ １Ｂ９及び５Ｅ１０の特徴づけ
ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現させた組換えＭＵＣ１糖タンパク質に対して産生した前記２種のＭＡｂは、ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒビオチン化グリコペプチドのパネルを用いて捕捉ＥＬＩＳＡにより分析した。ＭＡｂ １Ｂ９は、３つのＴ Ｏ−グリカンをタンデムリピート毎に有するＭＵＣ１グリコペプチドについて強力な反応性を示したが、非常に弱い反応が、タンデムリピート毎５つのＴ Ｏ−グリカンで完全に置換されたグリコペプチドについて認められた（図８、パネルＡ）。中程度の反応性が、コア３及びＳＴで置換したペプチドについて認められたが、タンデムリピート毎に３つのグリカンを有するペプチドにのみであった（図８、パネルＡ）。単独のＴ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドを用いたＥＬＩＳＡによって、アミノ酸配列ＧＳＴＡのＴｈｒでＴ−グリコシル化されたペプチドについて反応性が示されただけでなく、より弱い反応性が、アミノ酸配列ＶＴＳＡのＴｈｒにＴ−グリコシル化を有するペプチドについて認められた（図８、パネルＢ）。単独のＴｎ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドについては反応性が認められなかった。更に、１Ｂ９は、ＧａｌＮＡｃ単独で増殖した際に、ＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１発現細胞と反応しなかったが、Ｇａｌを増殖培地に添加した際には、ＳＴ−ＭＵＣ１の発現が生じた。顕著に高められた反応性が、細胞のノイラミニダーゼ処理によりＴ−ＭＵＣ１を曝露した後に認められた（図８、パネルＣ）。これらのデータは、１Ｂ９のエピトープは、グリコペプチドエピトープではなく、むしろＰＤＴＲ領域ではなくＶＴＳＡ又はＧＳＴＡ領域のいずれかにβ１−３結合ジサッカリドを用いたグリコシル化を必要とする立体構造エピトープであることを示唆する。
ＣＨＯ ｌｄｌＤ細胞において発現させた組換えＭＵＣ１糖タンパク質に対して産生した前記２種のＭＡｂは、ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒビオチン化グリコペプチドのパネルを用いて捕捉ＥＬＩＳＡにより分析した。ＭＡｂ １Ｂ９は、３つのＴ Ｏ−グリカンをタンデムリピート毎に有するＭＵＣ１グリコペプチドについて強力な反応性を示したが、非常に弱い反応が、タンデムリピート毎５つのＴ Ｏ−グリカンで完全に置換されたグリコペプチドについて認められた（図８、パネルＡ）。中程度の反応性が、コア３及びＳＴで置換したペプチドについて認められたが、タンデムリピート毎に３つのグリカンを有するペプチドにのみであった（図８、パネルＡ）。単独のＴ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドを用いたＥＬＩＳＡによって、アミノ酸配列ＧＳＴＡのＴｈｒでＴ−グリコシル化されたペプチドについて反応性が示されただけでなく、より弱い反応性が、アミノ酸配列ＶＴＳＡのＴｈｒにＴ−グリコシル化を有するペプチドについて認められた（図８、パネルＢ）。単独のＴｎ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドについては反応性が認められなかった。更に、１Ｂ９は、ＧａｌＮＡｃ単独で増殖した際に、ＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１発現細胞と反応しなかったが、Ｇａｌを増殖培地に添加した際には、ＳＴ−ＭＵＣ１の発現が生じた。顕著に高められた反応性が、細胞のノイラミニダーゼ処理によりＴ−ＭＵＣ１を曝露した後に認められた（図８、パネルＣ）。これらのデータは、１Ｂ９のエピトープは、グリコペプチドエピトープではなく、むしろＰＤＴＲ領域ではなくＶＴＳＡ又はＧＳＴＡ領域のいずれかにβ１−３結合ジサッカリドを用いたグリコシル化を必要とする立体構造エピトープであることを示唆する。
ＭＡｂ ５Ｅ１０は、ビオチン化ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒペプチドについて最も高い反応性を示し、又は前記ペプチドが非グリコシル化又は２つのみのＴｎグリカンでタンデムリピート毎に置換されている際に最も高い反応性を示した。Ｔｎグリコシル化に対する反応性は、グリコシル化の密度が増大するにつれて低減した。反応性における更なる低減は、Ｔグリコシル化の導入、それに続くコア３グリコシル化の導入による低減と共に認められた。最も低い反応性は、シアル化の程度の増大と共に認められ、特にＮｅｕＡｃがＧａｌＮＡｃにα２−６結合（ＳＴｎ）している際に認められた。ＳＴｎで完全に置換されているペプチドについては、反応性が全く認められなかった。ビオチン化バリン置換ｉｎ ｖｉｔｒｏＴｎグリコシル化ＭＵＣ１ペプチドを用いたＥＬＩＳＡにおいて、グリコシル化に関係なく、４つの全てのペプチドについて同じ反応性が認められた（図９、パネルＢ）。単独のＴｎ又はＴ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドを用いたＥＬＩＳＡにおいて、アミノ酸配列ＧＳＴＡのＴｈｒでＴ−グリコシル化されたペプチドを除く、全てのペプチドで等しい反応性が認められた（図９、パネルＣ）。免疫細胞学において、５Ｅ１０は、ＧａｌＮＡｃと共培養、Ｇａｌと共培養、又は糖を含まずに培養することからは独立して、ＣＨＯ ｌｄｌＤ ＭＵＣ１発現細胞と反応した（データ示さず）。まとめると、５Ｅ１０は、完全なＳＴｎ占有を有するものを除き、試験した全てのＭＵＣ１糖型と反応した。
ＭＵＣ１糖型と反応することが過去に報告されている他のＭＡｂとの比較
ＭＡｂ ＳＭ３は、ＭＵＣ１タンデムリピートのＰＤＴＲ領域に結合し、ＴｈｒのＴｎ−グリコシル化はその結合を促進する。過去の報告と一致して、ＳＭ３は、非グリコシル化ペプチド及びタンデムリピート毎に５つのＯ−グリカンの完全なＯ−グリカン占有を有するグリコペプチドと好適に反応するが、２つ又は３つのＯ−グリカンを有するグリコペプチドとの反応性は低い（図９、パネルＤ）。これらの結果は、Ｔ、ＳＴ、及びコア３ Ｏ−グリカンが等しく良好に反応することを示した本発明者の試験を確認し拡張する。本試験について、本発明者は、コア２糖型を有していなかったが、細胞株を用いた試験によって、ＭＵＣ１のコア２グリコシル化がＳＭ３エピトープを阻害することが明示されている。弱い反応性が、非グリコシル化又はアミノ酸配列ＶＴＳＡ又はＧＳＴＡのＴｈｒでＴｎグリコシル化された、ビオチン化バリン置換ペプチドについて認められた（図９、パネルＥ）。単独のＴｎ又はＴ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドを用いたＥＬＩＳＡでは、高い反応性が、アミノ酸配列ＰＤＴＲのＴｈｒがＴ又はＴｎのいずれかで置換された際に認められた。より低い反応性が、残りのＴ−ＭＵＣ１グリコペプチドについて認められたが、残りのＴｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドについて反応性は認められなかった（図９、パネルＦ）。
ＭＡｂ ＳＭ３は、ＭＵＣ１タンデムリピートのＰＤＴＲ領域に結合し、ＴｈｒのＴｎ−グリコシル化はその結合を促進する。過去の報告と一致して、ＳＭ３は、非グリコシル化ペプチド及びタンデムリピート毎に５つのＯ−グリカンの完全なＯ−グリカン占有を有するグリコペプチドと好適に反応するが、２つ又は３つのＯ−グリカンを有するグリコペプチドとの反応性は低い（図９、パネルＤ）。これらの結果は、Ｔ、ＳＴ、及びコア３ Ｏ−グリカンが等しく良好に反応することを示した本発明者の試験を確認し拡張する。本試験について、本発明者は、コア２糖型を有していなかったが、細胞株を用いた試験によって、ＭＵＣ１のコア２グリコシル化がＳＭ３エピトープを阻害することが明示されている。弱い反応性が、非グリコシル化又はアミノ酸配列ＶＴＳＡ又はＧＳＴＡのＴｈｒでＴｎグリコシル化された、ビオチン化バリン置換ペプチドについて認められた（図９、パネルＥ）。単独のＴｎ又はＴ Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ１グリコペプチドを用いたＥＬＩＳＡでは、高い反応性が、アミノ酸配列ＰＤＴＲのＴｈｒがＴ又はＴｎのいずれかで置換された際に認められた。より低い反応性が、残りのＴ−ＭＵＣ１グリコペプチドについて認められたが、残りのＴｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドについて反応性は認められなかった（図９、パネルＦ）。
ＭＡｂ ＢＷ８３５は、ジサッカリドＴで完全にグリコシル化されたビオチン化ＭＵＣ１ ６０ｍｅｒグリコペプチドを用いた捕捉ＥＬＩＳＡにおいて反応した（図８、パネルＣ）。興味深いことに、ＢＷ８３５は、コア３ Ｏ−グリコシル化ペプチドと等しく良好に反応し、前記抗体はＴ糖型自体を必要としないことが示された。より低い反応性が、完全にＳＴ−グリコシル化されたペプチドについても認められた。弱い反応性が、３つのみＯ−グリカンを有するＴグリコペプチドについて認められ、類似の弱い反応性が完全にＴｎグリコシル化したグリコペプチドについて認められた。２つ又は３つのＴｎグリカンをＴＲ毎に有するグリコペプチド、ＳＴｎ−グリコシル化ペプチド、又は非グリコシル化ペプチドについては反応性が認められなかった。これらの結果は、エピトープの過去の特徴づけと一致し、これを拡張するものである。
先に公開されたデータに従って、ＭＹ．１Ｅ１２は、ビオチン化６０ｍｅｒグリコペプチドを用いて評価すると、ＭＵＣ１のＳＴ−糖型に厳格な特異性を示した（図８、パネルＤ）。ＢＷ８３５とは対照的に、ＭＹ．１Ｅ１２は、３つのＳＴ Ｏ−グリカンをタンデム配列ごとに有するペプチドに対して好ましいことを示し、エピトープが、ＶＴＳＡ領域のＴｈｒ及びＳｅｒの双方がグリコシル化される際に少なくとも部分的に破壊されることが示された。
（実施例３）
原料及び方法
３のタンデムリピートを示すＭＵＣ１ ６０ｍｅｒペプチド(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n=3は、実施例１及び２に記載のように、５モルのＴｎ、ＳＴｎ、及びＴを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化されている。対照グリコペプチドは、同じ糖型を有するＭＵＣ２ ３３ｍｅｒペプチド(PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTPISTTC)を含む。ネズミモノクローナル抗−ＭＵＣ１抗体、５Ｅ１０、５Ｅ５、及び１Ｂ９は、実施例２に開示している。ネズミモノクローナル抗体Ｔｎ（３Ｅ１、５Ｆ４）、Ｔ（３Ｆ１、ＴＫＨ２）、及びＴ（ＨＨ８、３Ｃ９）は、過去に開示されているように製造した（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｈｉｒｏｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．１９８５；Ｃｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８８）。モノサッカリドであるＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、及びＮｅｕＡｃはＳｉｇｍａから購入した。ＧａｌＮＡｃα−アガロース（ＧｌｙｃｏＳｏｒｂ−１）はＧｌｙｃｏＲｅｘから購入した。ＯＳＭ及びアシアロ−ＯＳＭは、過去に開示されているように製造した（Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ｂ；Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ａ）。ＢＳＭはＳｉｇｍａから購入し、アシアロ−ＢＳＭはノイラミニダーゼ処理によって過去に開示されているように調製した（Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ｂ；Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ａ）。Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃα１−）、ＳＴｎ（ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−）、及びＴ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−）多価ＰＡＡ接合体はＧｌｙｃｏＴｅｃｈから購入した。
原料及び方法
３のタンデムリピートを示すＭＵＣ１ ６０ｍｅｒペプチド(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n=3は、実施例１及び２に記載のように、５モルのＴｎ、ＳＴｎ、及びＴを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化されている。対照グリコペプチドは、同じ糖型を有するＭＵＣ２ ３３ｍｅｒペプチド(PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTPISTTC)を含む。ネズミモノクローナル抗−ＭＵＣ１抗体、５Ｅ１０、５Ｅ５、及び１Ｂ９は、実施例２に開示している。ネズミモノクローナル抗体Ｔｎ（３Ｅ１、５Ｆ４）、Ｔ（３Ｆ１、ＴＫＨ２）、及びＴ（ＨＨ８、３Ｃ９）は、過去に開示されているように製造した（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｈｉｒｏｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．１９８５；Ｃｌａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８８）。モノサッカリドであるＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、及びＮｅｕＡｃはＳｉｇｍａから購入した。ＧａｌＮＡｃα−アガロース（ＧｌｙｃｏＳｏｒｂ−１）はＧｌｙｃｏＲｅｘから購入した。ＯＳＭ及びアシアロ−ＯＳＭは、過去に開示されているように製造した（Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ｂ；Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ａ）。ＢＳＭはＳｉｇｍａから購入し、アシアロ−ＢＳＭはノイラミニダーゼ処理によって過去に開示されているように調製した（Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ｂ；Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８ａ）。Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃα１−）、ＳＴｎ（ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−）、及びＴ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−）多価ＰＡＡ接合体はＧｌｙｃｏＴｅｃｈから購入した。
ＥＬＩＳＡアッセイ
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ９６プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。ペプチド及びグリコペプチドは、１、０．２、及び０．０５μｇ／ｍｌの濃度で１時間３７℃又は一晩４℃で炭酸−重炭酸干渉液（ｐＨ９．６）中でコーティングする。プレートはＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で１時間室温においてブロッキングする。その後、プレートを、モノクローナル抗−ＭＵＣ１抗体 ５Ｅ５、１Ｂ９、及び５Ｅ１０並びに抗糖抗体３Ｅ１、５Ｆ４、３Ｆ１、ＴＫＨ２、ＨＨ８、及び３Ｃ９（非希釈の培養上清から出発する）の希釈物で２時間室温においてインキュベートする。その後の阻害実験では、固定した（グリコ）ペプチド及びモノクローナル抗体の濃度を使用し、コーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移す前に、モノクローナル抗体の適当な希釈物を連続的に希釈したインヒビターである糖及び糖接合体（０．５Ｍモノサッカリド、１０μｇ／ｍｌ （グリコ）ペプチド、１００μｇ／ｍｌＰＡＡ接合物、及び１０μｇのムチンから出発する）と事前に３０分室温でインキュベートする。結合した抗体は、ＨＲＰ−接合ポリクローナルウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で検出される。プレートは、ＴＭＢ＋ １段階基質システム（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で発色させ、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍで読取る。
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ９６プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。ペプチド及びグリコペプチドは、１、０．２、及び０．０５μｇ／ｍｌの濃度で１時間３７℃又は一晩４℃で炭酸−重炭酸干渉液（ｐＨ９．６）中でコーティングする。プレートはＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で１時間室温においてブロッキングする。その後、プレートを、モノクローナル抗−ＭＵＣ１抗体 ５Ｅ５、１Ｂ９、及び５Ｅ１０並びに抗糖抗体３Ｅ１、５Ｆ４、３Ｆ１、ＴＫＨ２、ＨＨ８、及び３Ｃ９（非希釈の培養上清から出発する）の希釈物で２時間室温においてインキュベートする。その後の阻害実験では、固定した（グリコ）ペプチド及びモノクローナル抗体の濃度を使用し、コーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移す前に、モノクローナル抗体の適当な希釈物を連続的に希釈したインヒビターである糖及び糖接合体（０．５Ｍモノサッカリド、１０μｇ／ｍｌ （グリコ）ペプチド、１００μｇ／ｍｌＰＡＡ接合物、及び１０μｇのムチンから出発する）と事前に３０分室温でインキュベートする。結合した抗体は、ＨＲＰ−接合ポリクローナルウサギ抗−マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で検出される。プレートは、ＴＭＢ＋ １段階基質システム（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で発色させ、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍで読取る。
結果
抗体の終点力価の測定
最初のＥＬＩＳＡアッセイを実施して、更なる阻害アッセイのための抗体の適当な希釈並びにペプチド及びグリコペプチドの適当なコーティング濃度を規定する。各抗体のために、適当な抗原及び抗体希釈物を終点力価の評価によって決定し、約１のＯＤ４５０読み取りを生じる条件を更なる試験に使用する。
抗体の終点力価の測定
最初のＥＬＩＳＡアッセイを実施して、更なる阻害アッセイのための抗体の適当な希釈並びにペプチド及びグリコペプチドの適当なコーティング濃度を規定する。各抗体のために、適当な抗原及び抗体希釈物を終点力価の評価によって決定し、約１のＯＤ４５０読み取りを生じる条件を更なる試験に使用する。
Ｔｎ、Ｓｔｎ、及びＴグリコシル化を有するグリコペプチドに結合する抗体の阻害
糖ハプテンに対する抗体 − グリコペプチドのペプチド主鎖にかかわらずＴｎ、ＳＴｎ、及びＴに対する抗体は、各々の糖型を有するＭＵＣ１及びＭＵＣ２の双方のグリコペプチドと反応する。
糖ハプテンに対する抗体 − グリコペプチドのペプチド主鎖にかかわらずＴｎ、ＳＴｎ、及びＴに対する抗体は、各々の糖型を有するＭＵＣ１及びＭＵＣ２の双方のグリコペプチドと反応する。
かくして、抗Ｔｎ抗体１Ｅ３及び５Ｆ４は、Ｔｎ−グリコペプチドとのみ反応し、抗ＳＴｎ抗体ＴＫＨ２及び３Ｆ１はＳＴｎ−グリコペプチドとのみ反応するが、抗Ｔ抗体はＴ−グリコペプチドと反応する。阻害ＥＬＩＳＡアッセイは、各々のグリコペプチドに対する結合が、対応するグリコペプチド、ムチン類（アシアロ−ＯＳＭを有するＴｎ抗体、ＯＳＭを有するＳＴｎ抗体、及びアシアロ−ＢＳＭを有するＴ抗体）、ＰＡＡ接合物、並びに高濃度のモノサッカリド（ＧａｌＮＡｃを有するＴｎ抗体、ＮｅｕＡｃを有するＳＴｎ抗体、及びＧａｌを有するＴ抗体）によって阻害され得ることを更に示す。さらに、ＧｌｙｃｏＳｏｒｂ−１ Ｔｎ吸着体はＴｎ抗体を阻害し得る。
ＭＵＣ１に対する抗体
ＭＵＣ１ペプチドに対する抗体（５Ｅ１０）は、全てのＭＵＣ１ペプチド及びグリコペプチドによって阻害されるが、ＭＵＣ２ペプチド及びグリコペプチド並びに全ての他のグリカン及び糖接合体は阻害し得ない。これとはまさに対照的に、ＭＵＣ１ Ｔｎ／ＳＴｎ糖型特異的な抗体５Ｅ５及び２Ｄ９は、Ｔｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドによってのみ阻害され、より低い程度において、ＳＴｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドによって阻害される。同様に、ＭＵＣ１Ｔ糖型特異的抗体１Ｂ９は、Ｔ−ＭＵＣ１グリコペプチドによって阻害されるのみである。
ＭＵＣ１ペプチドに対する抗体（５Ｅ１０）は、全てのＭＵＣ１ペプチド及びグリコペプチドによって阻害されるが、ＭＵＣ２ペプチド及びグリコペプチド並びに全ての他のグリカン及び糖接合体は阻害し得ない。これとはまさに対照的に、ＭＵＣ１ Ｔｎ／ＳＴｎ糖型特異的な抗体５Ｅ５及び２Ｄ９は、Ｔｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドによってのみ阻害され、より低い程度において、ＳＴｎ−ＭＵＣ１グリコペプチドによって阻害される。同様に、ＭＵＣ１Ｔ糖型特異的抗体１Ｂ９は、Ｔ−ＭＵＣ１グリコペプチドによって阻害されるのみである。
Claims (36)
- ＧＳＴＡモチーフを含む免疫原性グリコペプチドで動物を免疫する工程を含む、ＭＵＣ１に対する癌特異的な免疫反応を誘導する方法であって、前記ＧＳＴＡモチーフが、ＧＳＴＡモチーフの少なくともＴ残基又はＳ残基でＯ−グリコシル化されている、方法。
- 前記ＭＵＣ１に対する免疫反応が、先天性免疫、液性免疫、細胞性免疫、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
- 前記ＭＵＣ１が、癌細胞で異常にグリコシル化及び発現されている、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記Ｏ−グリコシル化が、ＳＴｎグリカン及びＴｎグリカンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓ残基及びＴ残基の双方がＯ−グリコシル化されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｏ−グリコシル化が、ＳＴｎグリカン又はＴｎグリカンのいずれかである、請求項５に記載の方法。
- 前記ＧＳＴＡモチーフが２０アミノ酸残基のタンデムリピートに存在し、前記タンデムリピートが５つの潜在的なＯ−グリコシル化部位を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記５つの潜在的なＯ−グリコシル化部位のうちの少なくとも３つの部位が、グリコシル化されて、Ｔｎ又はＳＴｎのいずれかを有する、請求項６に記載の方法。
- 前記５つの潜在的なＯ−グリコシル化部位の全てが、Ｔｎ又はＳＴｎのいずれかを有する、請求項６に記載の方法。
- 前記タンデムリピートの配列が、
a) VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG (配列番号１)
b) 配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する配列番号１の天然バリアント
c) １つ又は複数の保存的置換によって調製され、且つ、配列番号１に対して少なくとも７５％の類似性を有する、配列番号１の人工バリアント
d) １から３のアミノ酸が欠失した配列番号１の切断型断片
からなる群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。 - 前記グリコシル化のパターンが、
・VTTnSAPDTRPAPGSTTnAPPAHG
・VTTnSAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTTnSTnAPDTTnRPAPGSTnTTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSTSTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
・VTSTnSSTnAPDTSTnRPAPGSSTnTSTnAPPAHG
からなる群から選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記免疫原性グリコペプチドが、１を超えるタンデムリピートを含み、例えば、２を超えるタンデムリピートを含み、例えば、３を超えるタンデムリピートを含み、例えば、４を超えるタンデムリピートを含み、例えば、５を超えるタンデムリピートを含み、例えば、６を超えるタンデムリピートを含み、例えば、７を超えるタンデムリピートを含み、例えば、８を超えるタンデムリピートを含み、例えば、９を超えるタンデムリピートを含み、並びに、例えば、１０を超えるタンデムリピートを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫原性グリコペプチドが、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、オブアルブミン、インフルエンザヘマグルチニン、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇＩ９−２ｓ）、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌、コレラ毒素、毒性を低減させたコレラ毒素変異体、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素と交差反応するＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、化膿連鎖球菌ＯＲＦ１２２４、化膿連鎖球菌ＯＲＦ１６６４、化膿連鎖球菌ＯＲＦ２４５２、肺炎クラミジアＯＲＦ Ｔ３６７、肺炎クラミジアＯＲＦ Ｔ８５８、破傷風トキソイド、又はＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１からなる群から選択される適切な担体に結合している、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１から１３のいずれか一項に規定の免疫原性グリコペプチドを含む医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、若しくは肺癌の治療又は予防のための癌ワクチンである、請求項１４に記載の医薬組成物。
- 請求項１４又は１５に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法。
- 請求項１から１３のいずれか一項に規定の免疫原性グリコペプチドに結合する抗体の調製のための方法。
- 請求項１から１３のいずれか一項に規定の免疫原性グリコペプチドで適切な哺乳動物を免疫し、
前記哺乳動物の抗体産生細胞を連続細胞株の細胞と融合させ、
前記融合において得られたハイブリドーマ細胞をクローン化し、及び
所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択すること
を特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に規定の免疫原性グリコペプチドに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の調製のための方法。 - 請求項１８に規定のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体、並びに
請求項１から１２のいずれか一項に規定の免疫原性グリコペプチドに対する分子ディスプレイ技術によって調製されるモノクローナル抗体
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。 - 前記抗体が癌細胞上のＭＵＣ１に結合するが、非悪性細胞上のＭＵＣ１には結合しない、請求項１９に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体がＯ−グリコシル化されたＧＳＴＡモチーフに結合する、請求項１９又は２０に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト化されているか又は完全なヒトの請求項１９から２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- ＳＴＨＭ１ ０６０９２１０２の受入番号で２００６年９月１９日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託したハイブリドーマによって分泌される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、５Ｅ５。
- ＳＴＨＭ２ ０６０９２１０１の受入番号で２００６年９月１９日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託したハイブリドーマによって分泌される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、２Ｄ９。
- 医薬として使用するための請求項１９から２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記医薬が癌の治療又は予防のために使用される、請求項２５に記載のモノクローナル抗体。
- 癌の治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項１９から２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 診断、モニタリング、又はイメージングのための、請求項１９から２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 請求項１９から２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
- ａ）個体からのサンプルを準備する工程
ｂ）請求項１９から２４のいずれか一項に記載の抗体を前記サンプルと接触させる工程
ｃ）前記サンプルと相互作用しない抗体を除去する工程
ｄ）前記サンプルと相互作用する抗体から、前記個体が癌を有するか又は癌を発症するリスクがあるか否かを決定する工程
を含む、個体が癌を有するか又は癌を発症するリスクがあるか否かを決定する方法。 - （ａ）腫瘍患者からの自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を準備する工程
（ｂ）前記腫瘍患者由来の自己ＡＰＣを、有効量の請求項１から１３のいずれか一項に規定の免疫原性グリコペプチドと接触させる工程であって、前記接触が、エンドサイトーシス、プロセシング、及び前記ＡＰＣによる前記ペプチド又は融合分子の断片のＭＨＣクラスＩＩ提示を可能にする条件下で実施される、工程
（ｃ）患者における免疫治療用途のために前記ペプチド又は融合分子断片提示ＡＰＣを単離する工程
を含む、ＭＵＣ１に対する効果的な免疫反応を誘導することが可能である、自己ＡＰＣの集団を産生させるｅｘ ｖｉｖｏ方法。 - ａ）ヒト抗体を含むサンプルを準備する工程
ｂ）ペプチドインヒビター及びＯ−グリカン糖インヒビターと前記サンプルとを接触させる工程
ｃ）工程ｂ）のサンプルを請求項１から１３のいずれか一項に規定のグリコペプチドとさらに接触させる工程
ｄ）前記グリコペプチドサンプルと相互作用する抗体の量を定量する工程
を含む、請求項１から１３のいずれか一項に規定のグリコペプチドに結合する抗体の存在を測定する方法。 - 前記ペプチドインヒビター及び／又はＯ−グリカン糖インヒビターと相互作用する抗体を除去する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記ペプチドインヒビター及びＯ−グリカン糖インヒビターが固体担体に固定化され、前記ペプチドインヒビター及び／又はＯ−グリカン糖インヒビターと相互作用する抗体を除去するために使用される、請求項３２又は３３に記載の方法。
- 前記抗体が、前記グリコペプチドのＯ−グリコシル化ＧＳＴＡモチーフに結合する、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、癌を有する疑いがある個体から提供され、
前記グリコペプチドと相互作用する抗体の測定量を、対照群から決定された標準量と比較し、
前記標準量を超える抗体の測定量が、個体における癌の指標であり、
前記標準量未満の抗体の測定量が、癌を有しない個体の指標である、
請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84899706P | 2006-10-04 | 2006-10-04 | |
| PCT/DK2007/050139 WO2008040362A2 (en) | 2006-10-04 | 2007-10-04 | Generation of a cancer-specific immune response toward muc1 and cancer specific muc1 antibodies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010505775A true JP2010505775A (ja) | 2010-02-25 |
Family
ID=38267564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009530756A Pending JP2010505775A (ja) | 2006-10-04 | 2007-10-04 | Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US8440798B2 (ja) |
| EP (1) | EP2083868A2 (ja) |
| JP (1) | JP2010505775A (ja) |
| AU (1) | AU2007304590A1 (ja) |
| CA (2) | CA2977261A1 (ja) |
| WO (1) | WO2008040362A2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013532120A (ja) * | 2010-04-19 | 2013-08-15 | エゾース サイエンシズ，インコーポレイテッド | 癌関連糖ペプチドエピトープ、抗体および使用方法 |
| JP2013544503A (ja) * | 2010-10-08 | 2013-12-19 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ノース・カロライナ・アット・シャーロット | 腫瘍特異的抗体及びその使用法 |
| WO2015166934A1 (ja) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | 医化学創薬株式会社 | 抗ｍｕｃ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途 |
| WO2018092885A1 (ja) * | 2016-11-18 | 2018-05-24 | アステラス製薬株式会社 | 新規な抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント |
| JP2021529524A (ja) * | 2018-06-29 | 2021-11-04 | ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド | 抗グリコｍｕｃ１抗体およびその使用 |
| US11667724B2 (en) | 2017-07-07 | 2023-06-06 | Astellas Pharma Inc. | Anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment |
Families Citing this family (69)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8440798B2 (en) | 2006-10-04 | 2013-05-14 | Københavns Universitet | Generation of a cancer-specific immune response toward MUC1 and cancer specific MUC1 antibodies |
| US20120039984A1 (en) | 2008-07-03 | 2012-02-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Glycopeptide and uses thereof |
| CN101838611B (zh) * | 2009-02-13 | 2013-06-19 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种表达外源基因的重组疟原虫及其应用 |
| US9588121B2 (en) | 2009-11-06 | 2017-03-07 | Go Therapeutics, Inc. | Method for early detection of cancer |
| EP2565268A4 (en) | 2010-04-28 | 2013-10-09 | Shionogi & Co | NEW MUC1 ANTIBODY |
| US9845362B2 (en) | 2010-10-08 | 2017-12-19 | The University Of North Carolina At Charlotte | Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same |
| WO2012155098A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-15 | Novarx Corporation | Predictors of response to immunotherapy |
| SG11201404180RA (en) * | 2012-01-20 | 2014-08-28 | Agency Science Tech & Res | Cho-gmt recombinant protein expression |
| WO2013151649A1 (en) | 2012-04-04 | 2013-10-10 | Sialix Inc | Glycan-interacting compounds |
| US9778263B2 (en) | 2013-11-13 | 2017-10-03 | General Electric Company | Quantitative in situ characterization of biological samples |
| WO2015120187A1 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | The University Of Chicago | Chimeric antigen receptors recognizing cancer-spevific tn glycopeptide variants |
| EP3102236A4 (en) * | 2014-02-05 | 2017-08-30 | The University of Chicago | Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific tn glycopeptide variants |
| CN103880956B (zh) * | 2014-03-10 | 2015-12-30 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗muc1单克隆抗体及其轻链和重链可变区 |
| EP3593812A3 (en) | 2014-03-15 | 2020-05-27 | Novartis AG | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor |
| GB201406767D0 (en) | 2014-04-15 | 2014-05-28 | Cancer Rec Tech Ltd | Humanized anti-Tn-MUC1 antibodies anf their conjugates |
| JP2017528433A (ja) | 2014-07-21 | 2017-09-28 | ノバルティス アーゲー | 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ |
| US11554181B2 (en) | 2014-09-05 | 2023-01-17 | The University Of North Carolina At Charlotte | Tumor specific antibody conjugates and uses therefor |
| JP6951973B2 (ja) | 2014-11-12 | 2021-10-20 | シージェン インコーポレイテッド | グリカン相互作用化合物及び使用方法 |
| US9879087B2 (en) | 2014-11-12 | 2018-01-30 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
| WO2016090034A2 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Novartis Ag | Methods for b cell preconditioning in car therapy |
| US11161907B2 (en) | 2015-02-02 | 2021-11-02 | Novartis Ag | Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof |
| WO2016172583A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
| EP3331913A1 (en) | 2015-08-07 | 2018-06-13 | Novartis AG | Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins |
| EP4014996A1 (en) | 2015-08-31 | 2022-06-22 | Helixmith Co., Ltd | Anti-sialyl tn chimeric antigen receptors |
| WO2017083582A1 (en) | 2015-11-12 | 2017-05-18 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
| JP7118887B2 (ja) | 2015-11-23 | 2022-08-16 | ノバルティス アーゲー | 最適化されたレンチウイルス移入ベクターおよびその使用 |
| ES2944597T3 (es) | 2015-12-30 | 2023-06-22 | Novartis Ag | Terapias con células efectoras inmunitarias de eficacia mejorada |
| WO2017149515A1 (en) | 2016-03-04 | 2017-09-08 | Novartis Ag | Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore |
| EP3432924A1 (en) | 2016-03-23 | 2019-01-30 | Novartis AG | Cell secreted minibodies and uses thereof |
| BR112018071096A2 (pt) | 2016-04-15 | 2019-02-26 | Novartis Ag | composições e métodos para a expressão da proteína seletiva |
| MX2019001469A (es) | 2016-08-01 | 2019-10-02 | Novartis Ag | Tratamiento del cáncer usando un receptor de antígeno quimérico en combinación con un inhibidor de una molécula de macrófago pro- m2. |
| WO2018094143A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
| WO2018111340A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Novartis Ag | Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells |
| WO2018140725A1 (en) | 2017-01-26 | 2018-08-02 | Novartis Ag | Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy |
| WO2018144535A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities |
| US20200048359A1 (en) | 2017-02-28 | 2020-02-13 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
| AU2018226824A1 (en) | 2017-03-03 | 2019-09-19 | Seagen Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
| WO2018229715A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof |
| ES2930276T3 (es) | 2017-06-21 | 2022-12-09 | Glykos Finland Oy | Enlazadores hidrofílicos y conjugados de los mismos |
| EP3697436A1 (en) | 2017-10-18 | 2020-08-26 | Novartis AG | Compositions and methods for selective protein degradation |
| US11161911B2 (en) | 2017-10-23 | 2021-11-02 | Go Therapeutics, Inc. | Anti-glyco-MUC1 antibodies and their uses |
| SG11202003177RA (en) | 2017-10-25 | 2020-05-28 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
| WO2019081983A1 (en) | 2017-10-25 | 2019-05-02 | Novartis Ag | CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
| WO2019089798A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
| US20200392458A1 (en) | 2017-11-24 | 2020-12-17 | Onk Therapeutics Limited | Modified natural killer cells and natural killer cell lines targetting tumour cells |
| PT110526B (pt) | 2018-01-26 | 2021-02-04 | Univ Nova De Lisboa | Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais |
| EP3542814B1 (en) | 2018-03-21 | 2022-08-24 | Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Novel peptide-based compounds for use in the prevention, treatment and/or detection of cancer |
| EP3784351A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-03-03 | Novartis AG | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
| EP3788369A1 (en) | 2018-05-01 | 2021-03-10 | Novartis Ag | Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome |
| MX2020012351A (es) | 2018-05-17 | 2021-01-29 | Astellas Pharma Inc | Complejo que tiene fragmento fab de anticuerpo anti-muc1 de humano, enlazador peptido y/o ligando. |
| US20210213063A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-07-15 | Novartis Ag | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
| US20210123075A1 (en) | 2018-06-08 | 2021-04-29 | Novartis Ag | Compositions and methods for immunooncology |
| AR116109A1 (es) | 2018-07-10 | 2021-03-31 | Novartis Ag | Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos |
| KR20210106437A (ko) | 2018-12-20 | 2021-08-30 | 노파르티스 아게 | 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법 및 약학적 조합물 |
| JOP20210180A1 (ar) | 2019-01-07 | 2023-01-30 | Astellas Pharma Inc | مادة اقتران تشتمل على ربيطة، فاصل، رابط ببتيدي وجزيء حيوي |
| EP3924055B1 (en) | 2019-02-15 | 2024-04-03 | Novartis AG | Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| US20220144807A1 (en) | 2019-02-15 | 2022-05-12 | Novartis Ag | 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| US11090336B2 (en) | 2019-03-27 | 2021-08-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Tn-MUC1 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy |
| WO2020219742A1 (en) | 2019-04-24 | 2020-10-29 | Novartis Ag | Compositions and methods for selective protein degradation |
| WO2021123996A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Novartis Ag | Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases |
| AU2021288224A1 (en) | 2020-06-11 | 2023-01-05 | Novartis Ag | ZBTB32 inhibitors and uses thereof |
| CN115916199A (zh) | 2020-06-23 | 2023-04-04 | 诺华股份有限公司 | 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案 |
| US20230271940A1 (en) | 2020-08-03 | 2023-08-31 | Novartis Ag | Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof |
| TW202304979A (zh) | 2021-04-07 | 2023-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途 |
| TW202309294A (zh) | 2021-04-27 | 2023-03-01 | 瑞士商諾華公司 | 病毒載體生產系統 |
| WO2023121448A1 (en) * | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Merus N.V. | Binding domains against cancer-associated muc1 |
| WO2023214325A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Novartis Ag | Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors |
| WO2023240135A2 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Actinium Pharmaceuticals, Inc. | Bifunctional chelators and conjugates |
| WO2024089639A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Novartis Ag | Lentiviral formulations |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003089574A2 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | Biomira, Inc. | Synthetic glyco-lipo-peptides as vaccines |
| WO2004022590A2 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Cell Center Cologne Gmbh | Immunogenic muc1 glycopeptides |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5876716A (en) * | 1991-01-24 | 1999-03-02 | Bay Development Corporation Sa | Method of using an antibody to the TN antigen for the inhibition of HIV infection |
| DE19758400A1 (de) | 1997-12-30 | 1999-07-01 | Max Delbrueck Centrum | Tumorvakzine für MUC1-positive Karzinome |
| US6465220B1 (en) | 1998-12-21 | 2002-10-15 | Glycozym Aps | Glycosylation using GalNac-T4 transferase |
| ATE361375T1 (de) | 2000-05-11 | 2007-05-15 | Glycozym Aps | Methoden zur modelierung die funktion von polypeptid galnac transferasen und zurscreening substanzen dafür |
| MXPA04012656A (es) * | 2002-06-14 | 2005-08-15 | Immunomedics Inc | Anticuerpo hpam4 monoclonal humanizado. |
| EP1558728B1 (en) | 2002-11-08 | 2007-06-27 | Glycozym ApS | Methods to identify agents modulating functions of polypeptide galnac-transferases, pharmaceutical compositions comprising such agents and the use of such agents for preparing medicaments |
| US8440798B2 (en) * | 2006-10-04 | 2013-05-14 | Københavns Universitet | Generation of a cancer-specific immune response toward MUC1 and cancer specific MUC1 antibodies |
-
2007
- 2007-10-04 US US12/444,360 patent/US8440798B2/en active Active
- 2007-10-04 EP EP07817938A patent/EP2083868A2/en not_active Withdrawn
- 2007-10-04 JP JP2009530756A patent/JP2010505775A/ja active Pending
- 2007-10-04 WO PCT/DK2007/050139 patent/WO2008040362A2/en active Application Filing
- 2007-10-04 AU AU2007304590A patent/AU2007304590A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-04 CA CA2977261A patent/CA2977261A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-04 CA CA2665356A patent/CA2665356C/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-04-16 US US13/864,096 patent/US8912311B2/en active Active
-
2014
- 2014-11-12 US US14/539,916 patent/US9359436B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-10 US US15/040,375 patent/US10017576B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-12 US US16/006,119 patent/US10919973B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003089574A2 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | Biomira, Inc. | Synthetic glyco-lipo-peptides as vaccines |
| WO2004022590A2 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Cell Center Cologne Gmbh | Immunogenic muc1 glycopeptides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6013003299; Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００６ Ｆｅｂ， Ｖｏｌ．１６， Ｎｏ．２， ｐ．９６-１０７ * |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013532120A (ja) * | 2010-04-19 | 2013-08-15 | エゾース サイエンシズ，インコーポレイテッド | 癌関連糖ペプチドエピトープ、抗体および使用方法 |
| JP2016053581A (ja) * | 2010-10-08 | 2016-04-14 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ノース・カロライナ・アット・シャーロットＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ | 腫瘍特異的抗体及びその使用法 |
| JP2013544503A (ja) * | 2010-10-08 | 2013-12-19 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ノース・カロライナ・アット・シャーロット | 腫瘍特異的抗体及びその使用法 |
| KR102262720B1 (ko) | 2014-04-28 | 2021-06-08 | 이카가쿠 소우야쿠 가부시키가이샤 | 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도 |
| KR20170002500A (ko) | 2014-04-28 | 2017-01-06 | 이카가쿠 소우야쿠 가부시키가이샤 | 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도 |
| JPWO2015166934A1 (ja) * | 2014-04-28 | 2017-06-01 | 医化学創薬株式会社 | 抗ｍｕｃ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途 |
| WO2015166934A1 (ja) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | 医化学創薬株式会社 | 抗ｍｕｃ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途 |
| US10239950B2 (en) | 2014-04-28 | 2019-03-26 | Medicinal Chemistry Pharmaceuticals, Co., Ltd. | Anti-MUC1 antibody or antigen-binding fragment thereof and uses thereof |
| US10507251B2 (en) | 2016-11-18 | 2019-12-17 | Astellas Pharma Inc. | Anti-human MUC1 antibody fab fragment |
| JPWO2018092885A1 (ja) * | 2016-11-18 | 2019-10-17 | アステラス製薬株式会社 | 新規な抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント |
| KR20190078573A (ko) * | 2016-11-18 | 2019-07-04 | 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 | 신규 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 |
| US10517966B2 (en) | 2016-11-18 | 2019-12-31 | Astellas Pharma Inc. | Anti-human MUC1 antibody Fab fragment |
| WO2018092885A1 (ja) * | 2016-11-18 | 2018-05-24 | アステラス製薬株式会社 | 新規な抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント |
| KR102512833B1 (ko) | 2016-11-18 | 2023-03-23 | 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 | 신규 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 |
| US11679166B2 (en) | 2016-11-18 | 2023-06-20 | Astellas Pharma Inc. | Anti-human MUC1 antibody Fab fragment |
| US11667724B2 (en) | 2017-07-07 | 2023-06-06 | Astellas Pharma Inc. | Anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment |
| JP2021529524A (ja) * | 2018-06-29 | 2021-11-04 | ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド | 抗グリコｍｕｃ１抗体およびその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10919973B2 (en) | 2021-02-16 |
| US20160176975A1 (en) | 2016-06-23 |
| US8440798B2 (en) | 2013-05-14 |
| US20150065692A1 (en) | 2015-03-05 |
| CA2665356C (en) | 2017-10-31 |
| CA2977261A1 (en) | 2008-04-10 |
| US8912311B2 (en) | 2014-12-16 |
| EP2083868A2 (en) | 2009-08-05 |
| AU2007304590A8 (en) | 2009-06-11 |
| CA2665356A1 (en) | 2008-04-10 |
| US20100034825A1 (en) | 2010-02-11 |
| WO2008040362A3 (en) | 2009-03-12 |
| US20180334507A1 (en) | 2018-11-22 |
| US10017576B2 (en) | 2018-07-10 |
| US9359436B2 (en) | 2016-06-07 |
| AU2007304590A1 (en) | 2008-04-10 |
| WO2008040362A2 (en) | 2008-04-10 |
| US20140005366A1 (en) | 2014-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10919973B2 (en) | Generation of a cancer-specific immune response toward MUC1 and cancer specific MUC1 antibodies | |
| Tarp et al. | Identification of a novel cancer-specific immunodominant glycopeptide epitope in the MUC1 tandem repeat | |
| Sørensen et al. | Chemoenzymatically synthesized multimeric Tn/STn MUC1 glycopeptides elicit cancer-specific anti-MUC1 antibody responses and override tolerance | |
| JP5916017B2 (ja) | 新規なｍｕｃ１抗体 | |
| Reis et al. | Development and characterization of an antibody directed to an α-N-acetyl-D-galactosamine glycosylated MUC2 peptide | |
| US9657074B2 (en) | Enzymatic large-scale synthesis of mucin glyconjugates, and immunogenic applications thereof | |
| Mazal et al. | Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns on human cancer cells. Implications for effective immuno-targeting of cancer | |
| Danussi et al. | A newly generated functional antibody identifies Tn antigen as a novel determinant in the cancer cell–lymphatic endothelium interaction | |
| Naito et al. | Generation of novel anti-MUC1 monoclonal antibodies with designed carbohydrate specificities using MUC1 glycopeptide library | |
| Dobrochaeva et al. | Specificity of human natural antibodies referred to as anti-Tn | |
| Goletz et al. | Thomsen-Friedenreich antigen: the “hidden” tumor antigen | |
| JP5683948B2 (ja) | 糖を含有する全ての（ｐａｎ）癌のマーカー | |
| EP2032164B1 (en) | Method for the preparation of specific antibodies against saccharidic antigens | |
| Steentoft et al. | Characterization of an immunodominant cancer-specific O-glycopeptide epitope in murine podoplanin (OTS8) | |
| JP5978204B2 (ja) | 癌関連糖ペプチドエピトープ、抗体および使用方法 | |
| US20160084844A1 (en) | Methods of identifying glycopeptides recognized by disease-associated auto-antibodies | |
| US20130195873A1 (en) | Carbohydrate hapten-based anti-cancer vaccines and antibody drugs | |
| Irazoqui et al. | Immune response to Thomsen–Friedenreich disaccharide and glycan engineering | |
| Wandall et al. | Auto-antibody signatures to aberrant O-glycopeptide epitopes serve as undiscovered biomarkers of cancer | |
| Hernández et al. | 3’-Sialyllactose neoglycoconjugates are not able to provide an immunological response against N-acetyl GM3 ganglioside in mice and chickens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101004 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130129 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130410 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130417 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130729 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130729 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130917 |