CN108026174B - 人cd3结合抗体 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及人CD3结合抗体,其包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,所述可变区包含以下氨基酸序列:QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFT‑FS SYGMH WVRQA PGKGL EWVAA IWYX1X2RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED TAVYY CTRGT GYNWF DPWGQ GTLVT VSS并具有0‑5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。本公开内容还涉及具有上文限定的重链的双特异性抗体。提供了产生所述抗体的方法、产生所述抗体的细胞以及所述抗体的(医学)用途。
Description
本发明涉及抗体领域,特别涉及治疗性抗体领域。抗体可用于治疗人。更特别地,本发明涉及用于治疗肿瘤的抗体,并且优选双特异性抗体。
结合人CD3的单克隆抗体是开发用于人中的治疗用途的第一类抗体。单克隆CD3结合抗体通常因其免疫抑制性质用于例如移植排斥中。对于T细胞上的CD3和癌细胞上的表面靶抗原具有双特异性的抗体能够将任何类型的T细胞连接到癌细胞,而不依赖于T细胞受体特异性、共刺激或肽抗原呈递。这种双特异性T细胞衔接抗体(T-cell engaging antibody)在治疗多种癌症和肿瘤生长中表现出很大前景。
WO2014/051433(通过引用并入本文)描述了CD3 mAb,其是用于产生充当T细胞衔接器分子(T-cell engager molecule)之双特异性抗体的结构单元的合适候选物。这些CD3mAb被命名为3056和3896;这些mAb的VH和VL序列公开在图22中。3056和3896CD3 mAb二者在功能活性方面具有良好性质。它们以显著低于公知的小鼠抗CD3抗体mOKT3之亲和力的亲和力(KD)与人T细胞系上的细胞表面表达CD3/TCR结合,从而导致CD3POS细胞上流式细胞术分析中更低的平均荧光强度。类似地,当固定在组织培养板上时,与mOKT3相比,它们诱导T细胞增殖的程度更小。
不受理论的约束,认为在双特异性T细胞衔接器形式中,显著低于mOKT3之亲和力的CD3亲和力是优选的。优选地,双特异性抗体以小于结合肿瘤抗原之亲和力的亲和力结合CD3。不受理论约束,认为这种亲和力的差异允许通过双特异性抗体优先调理肿瘤细胞,从而标记它们以通过附近存在的免疫效应细胞(包括NK细胞和/或T细胞)进行破坏。
发明人观察到利用3056抗体获得的结果表现出批次间的变化。这使发明人感到惊讶,因为与抗体3056具有相同VH序列但不同轻链的抗体15C3(描述在WO2005/118635中)没有这种变化性问题。
本发明的一个目的是提供具有改善特征的具有基本上相同的CD3结合性质(在种类上但未必在量上)之抗体3056的变体。
发明内容
本发明提供了结合人CD3的抗体,所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,所述可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A。
本发明还提供了编码以下氨基酸序列的核酸分子:
所述序列在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A。
如本文所述的抗体中的组合X1和X2优选为X1=N且X2=A。
本发明还提供了表达所述抗体和/或包含所述核酸分子的细胞。
除非另外明确地指出,否则本发明的抗体优选是双特异性抗体。所述双特异性抗体优选至少结合人CD3。另外,双特异性抗体优选至少结合人肿瘤细胞上优先表达的表面分子。在一个优选的实施方案中,双特异性抗体结合以下:BCMA、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CD44、CD123、CD138、CEA、CLEC12A、CS-1、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、DLL3、LGR5、MSLN、FOLR1、FOLR3、HER2、HM1.24、MCSP或PSMA。在一个更优选的实施方案中,双特异性抗体结合CLEC12A。
本发明还提供了包含根据本发明的抗体的药物组合物。
还提供了根据本发明的抗体,所述抗体还包含标记,优选用于体内成像的标记。
本发明还提供了用于治疗患有肿瘤或具有患肿瘤风险的对象的方法,其包括向所述对象施用根据本发明的双特异性抗体。还提供了根据本发明的双特异性抗体,其用于治疗患有肿瘤或具有肿瘤风险的对象。还提供了本发明的抗体在制备用于治疗患有肿瘤或具有肿瘤风险的对象的药物中的用途。在一个优选的实施方案中,所述肿瘤是CLEC12A阳性肿瘤。
发明详述
本发明的抗体优选是双特异性抗体。所述双特异性抗体优选至少结合人CD3。另外,双特异性抗体优选至少结合人肿瘤细胞上表达的表面分子。在一个优选的实施方案中,双特异性抗体与以下结合:BCMA、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CD44、CD123、CD138、CEA、CLEC12A、CS-1、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、DLL3、LGR5、MSLN、FOLR1、FOLR3、HER2、HM1.24、MCSP或PSMA。在一个更优选的实施方案中,双特异性抗体结合CLEC12A。
BCMA也被称为肿瘤坏死因子受体超家族,成员17(TNFRSF17);TNFRSF13A2;B细胞成熟抗原;BCM;B细胞成熟因子;B细胞成熟蛋白;CD269或CD269抗原。Id:HGNC:11913;Entrez Gene:608;Ensembl:ENSG00000048462;OMIM:109545;UniProtKB:Q02223。
CD19也被称为CD19分子;T细胞表面抗原Leu-12;CD19抗原;CVID3;分化抗原CD19;B4;B淋巴细胞表面抗原B4;B淋巴细胞抗原CD19。Id:HGNC:1633;Entrez Gene:930;Ensembl:ENSG00000177455;OMIM:107265;UniProtKB:P15391。
CD20也被称为跨膜4结构域,亚家族A,成员1(MS4A1);MS4A2;CD20;S7;白细胞表面抗原Leu-16;B淋巴细胞抗原CD20;Bp35;B淋巴细胞细胞表面抗原B1;CD20抗原;CD20受体;CVID5;B淋巴细胞表面抗原B1;B1;跨膜4结构域亚家族A成员1;LEU-16。Id:HGNC:7315;Entrez Gene:931;Ensembl:ENSG00000156738;OMIM:112210;UniProtKB:P11836。
CD30也被称为肿瘤坏死因子受体超家族,成员8(TNFRSF8);Ki-1抗原;CD30;Ki-1;D1S166E;细胞因子受体CD30;淋巴细胞活化抗原CD30;肿瘤坏死因子受体超家族成员8;CD30L受体;CD30抗原。Id:HGNC:11923;Entrez Gene:943;Ensembl:ENSG00000120949;OMIM:153243;UniProtKB:P28908。
CD33也被称为CD33分子;SIGLEC-3;CD33抗原(Gp67);骨髓细胞表面抗原CD33;唾液酸结合Ig样凝集素3;Siglec-3;SIGLEC3;CD33抗原和gp67。Id:HGNC:1659;Entrez Gene:945;Ensembl:ENSG00000105383;OMIM:159590;UniProtKB:P20138。
CD38也被称为CD38分子;T10;CD38抗原(P45);CADPr水解酶1;ADP-核糖基环化酶1;ADP-核糖基环化酶/环状ADP-核糖水解酶;NAD(+)核苷酶;EC 3.2.2.5;环状ADP-核糖水解酶1;CD38抗原。Id:HGNC:1667;Entrez Gene:952;Ensembl:ENSG00000004468;OMIM:107270;UniProtKB:P28907。
CD44也被称为CD44分子(印度血型);IN;MDU2;CD44抗原(归巢功能和印度血型系统);MDU3;CDW44;MIC4;CSPG8;硫酸软骨素蛋白聚糖8;HCELL;造血细胞E-和L-选择蛋白配体;MC56;细胞外基质受体III;Pgp1;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖;细胞表面糖蛋白CD44;透明质酸受体;epican;吞噬细胞糖蛋白1;归巢功能和印度血型系统;ECMR-III;CDw44;HUTCH-I;Epican;LHR;PGP-1;CD44抗原;PGP-I;CP90淋巴细胞归巢/粘附受体;吞噬细胞糖蛋白I;Hermes抗原。Id:HGNC:1681;Entrez Gene:960;Ensembl:ENSG00000026508;OMIM:107269;UniProtKB:P16070。
CD123也被称为细胞分裂周期123;细胞分裂周期123同源物;C10orf7;细胞分裂周期蛋白123同源物;D123;蛋白质D123;HT-1080;CCEP123;PZ32;CEP89;细胞分裂周期123同源物(酿酒酵母(S.Cerevisiae));FLJ14640;染色体10开放阅读框7。Id:HGNC:16827;Entrez Gene:8872;Ensembl:ENSG00000151465;OMIM:615470;UniProtKB:O75794。
CD138也被称为多配体聚糖1(Syndecan 1,SCD1);CD138;SDC;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖成纤维细胞生长因子受体;多配体聚糖蛋白聚糖1;多配体聚糖;SYND1;多配体聚糖-1;CD138抗原。Id:HGNC:10658;Entrez Gene:6382;Ensembl:ENSG00000115884;OMIM:186355;UniProtKB:P18827。
CEA也被称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5);胎粪抗原100(MeconiumAntigen 100);CD66e;癌胚抗原;CD66e抗原。Id:HGNC:1817;Entrez Gene:1048;Ensembl:ENSG00000105388;OMIM:114890;UniProtKB:P06731。
CLEC12A也被称为C型凝集素结构域家族12,成员A;C型凝集素蛋白CLL-1;MICL;树突细胞相关凝集素2;C型凝集素超家族;骨髓抑制性C型凝集素样受体;C型凝集素样分子-1;CLL-1;DCAL2;CLL1;C型凝集素样分子1;DCAL-2;杀伤细胞凝集素样受体亚家族L,成员1(KLRL1);CD371(Bakker A.等,Cancer Res.2004,64,第8843 50页;GenBankTM登录号:AY547296;Zhang W.等,GenBankTM登录号:AF247788;A.S.Marshall,等,J Biol Chem2004,279,第14792–802页;GenBankTM登录号:AY498550;Y.Han等,Blood 2004,104,第285866页;H.Floyd,等,GenBankTM登录号:AY426759;C.H.Chen,等,Blood 2006,107,p145967)。Id:HGNC:31713;Entrez Gene:160364;Ensembl:ENSG00000172322;OMIM:612088;UniProtKB:Q5QGZ9。CLEC12A是在急性髓性白血病(AML)中的白血病胚细胞和白血病干细胞上表达的抗原,包括CD34阴性或CD34低表达白血病干细胞(侧群,side population)(A.B.Bakker等,Cancer Res 2004,64,p8443 50;Van Rhenen等,2007 Blood 110:2659;Moshaver等,2008Stem Cells 26:3059)。另外认为CLEC12A的表达限于造血谱系,特别是外周血和骨髓中的骨髓细胞,即粒细胞、单核细胞和树突细胞前体。更重要的是,CLEC12A在造血干细胞上不存在。该表达谱使得CLEC12A成为AML中特别有利的靶标。CLEC12A的全长形式包含275个氨基酸残基,包括在大多数其他同工型中不存在的额外的一段10个氨基酸的细胞内序列,并表现出严格的骨髓表达谱(表面表达和mRNA水平)。术语“CLEC12A或其功能等同物”是指保持了严格骨髓表达谱(在表面表达水平和mRNA水平两者)的如上所述的所有(例如剪接和突变)变体及其同工型,如Bakker等,Cancer Res2004,64,第8443-50页和Marshall 2004-J Biol Chem 279(15),第14792–802页所述。本发明的CLEC12A结合抗体结合人CLEC12A。除非另外明确地指出,否则当本文提到CLEC12A时,是指人CLEC12A。
CD3(分化簇3)T细胞共受体是一种蛋白质复合物,其由四条不同的链构成。在哺乳动物中,复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。在T淋巴细胞中,这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链缔合以产生活化信号。TCRα、TCRβ、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3在T细胞上表达。结合CD3的抗体可结合CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链或者CD3δ/CD3ε或CD3γ/CD3ε的组合。本发明的CD3结合抗体结合CD3ε链。CD3ε以多种别名被人所知,其中一些是:“CD3e分子,ε(CD3-TCR复合物)”;
“CD3e抗原,ε多肽(TiT3复合物)”;T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链;T3E;T细胞抗原受体复合物,T3的ε亚基;CD3e抗原;CD3-ε3;IMD18;TCRE。CD3E基因的Id为:HGNC:1674;EntrezGene:916;Ensembl:ENSG00000198851;OMIM:186830和UniProtKB:P07766。已经表明靶向CD3ε链的双特异性CD3结合抗体在将T细胞募集至异常细胞方面是有效的。因此,根据本发明的(双特异性)抗体优选含有一个结合CD3ε的重链/轻链组合。本发明的CD3结合抗体结合人CD3。除非另外明确地指出,否则当本文提到CD3时,是指人CD3。
CS-1也被称为柠檬酸合酶;EC 2.3.3.1;线粒体柠檬酸合酶;EC 2.3.3。Id:HGNC:2422;Entrez Gene:1431Ensembl:ENSG00000062485;OMIM:118950;UniProtKB:O75390。
EGFR也被称为表皮生长因子受体;成红细胞白血病病毒(V-Erb-B)癌基因同源物(禽);ERBB1;PIG61;原癌基因C-ErbB-1;禽成红细胞白血病病毒(V-Erb-B)癌基因同源物;受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-1;细胞生长抑制蛋白40;细胞增殖诱导蛋白61;HER1;mENA;EC2.7.10.1;EC 2.7.10;表皮生长因子受体(禽成红细胞白血病病毒(V-Erb-B)癌基因同源物)。Id:HGNC:3236;Entrez Gene:1956;Ensembl:ENSG00000146648;OMIM:131550;UniProtKB:P00533。
EGFRvIII是EGFR的常见变体(Oncogene.2013年5月23日;32(21):2670-81.doi:10.1038/onc.2012.280.Epub 2012年7月16日)。
δ样3(DLL3)也被称为δ-样3;果蝇δ同源物3;δ3;δ(果蝇)-样3;SCDO1。DLL3的Id为:HGNC:2909;Entrez Gene:10683;Ensembl:ENSG00000090932;OMIM:602768和UniProtKB:Q9NYJ7。
LGR5是包含富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5,基因或蛋白的别名为包含富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5;含有富含亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5;G蛋白偶联受体HG38;G蛋白偶联受体49;G蛋白偶联受体67;GPR67;GPR49;孤儿G蛋白偶联受体HG38;G蛋白偶联受体49;GPR49;HG38和FEX。结合LGR5的本发明蛋白质或抗体结合人LGR5。由于人和其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性,本发明的LGR5结合蛋白或抗体也可以结合这样的直系同源物,但不一定如此。人LGR5蛋白和编码它的基因的数据库登录号是(NC_000012.12;NT_029419.13;NC_018923.2;NP_001264155.1;NP_001264156.1;NP_003658.1)。
MSLN或间皮蛋白(mesothelin)也被称为间皮素(Mesothelin);前原巨核细胞增强因子(Pre-Pro-Megakaryocyte-Potentiating Factor);CAK1抗原;MPF;可溶性MPF间皮素相关蛋白;巨核细胞增强因子和SMRP。MSLN的Id为:HGNC:7371;Entrez Gene:10232;Ensembl:ENSG00000102854;OMIM:601051;UniProtKB:Q13421。
叶酸受体1也被称为FOLR1;叶酸受体1叶酸受体1;卵巢肿瘤相关抗原MOv18;成年叶酸结合蛋白;成年叶酸受体;KB细胞FBP;FR-α;FOLR;FBP;叶酸结合蛋白;和叶酸受体1。FOLR1的Id为:HGNC:3791;Entrez Gene:2348;Ensembl:ENSG00000110195;OMIM:136430;UniProtKB:P15328。
叶酸受体3也被称为FOLR3;叶酸受体3(γ);FR-γ;叶酸受体3;γ-HFR;和FR-G。FOLR3的Id为:HGNC:3795;Entrez Gene:2352;Ensembl:ENSG00000110203;OMIM:602469;和UniProtKB:P41439。
EPCAM也被称为上皮细胞粘附分子;EGP40;M4S1;ESA;MIC18;KS1/4;肿瘤相关钙信号传感蛋白1;MK-1;TACSTD1;人上皮糖蛋白-2;TROP1;膜组分,染色体4,表面标志物(35kD糖蛋白);腺癌相关抗原;EGP;细胞表面糖蛋白Trop-1;EP-CAM;上皮糖蛋白314;GA733-2;主要胃肠肿瘤相关蛋白GA733-2;M1S2;EGP314;CD326抗原;KSA;上皮细胞表面抗原;DIAR5;上皮糖蛋白;HNPCC8;hEGP314;单克隆抗体AUA1鉴定的抗原;KS 1/4抗原;EGP-2;ACSTD1。Id:HGNC:11529;Entrez Gene:4072;Ensembl:ENSG00000119888;OMIM:185535;UniProtKB:P16422。
HER2也被称为V-Erb-B2禽成红细胞白血病病毒癌基因同源物2;ERBB2;CD340;NGL;HER-2;HER-2/neu2;NEU2;TKR1;神经/胶质母细胞瘤衍生癌基因同源物;C-Erb B2/Neu蛋白;转移性淋巴结基因19蛋白;herstatin;原癌基因C-ErbB-2;神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤衍生癌基因同源物;原癌基因Neu;受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-2;酪氨酸激酶型细胞表面受体HER2;V-Erb-B2成红血细胞白血病病毒癌基因同源物2,神经/胶质母细胞瘤衍生癌基因同源物;MLN 19;MLN19;p185erbB2;CD340抗原;EC 2.7.10.1;EC 2.7.10;V-Erb-B2禽成红细胞白血病病毒癌基因同源物2(神经/胶质母细胞瘤衍生癌基因同源物)。Id:HGNC:3430;Entrez Gene:2064;Ensembl:ENSG00000141736;OMIM:164870;UniProtKB:P04626。
HM1.24也被称为BST2;骨髓基质细胞抗原2;TETHERIN;BST-2;骨髓基质抗原2;HM1.24抗原;Tetherin;CD317;CD317抗原;NPC-A-7。Id:HGNC:1119;Entrez Gene:684;Ensembl:ENSG00000130303;OMIM:600534;UniProtKB:Q10589。
MCSP也被称为精子线粒体相关富含半胱氨酸蛋白(Sperm Mitochondria-Associated Cysteine-Rich Protein,SMCP);MCSP;MCS;线粒体荚膜硒蛋白(Mitochondrial Capsule Selenoprotein);HSMCSGEN1;精子线粒体相关富含半胱氨酸蛋白。Id:HGNC:6962;Entrez Gene:4184;Ensembl:ENSG00000163206;OMIM:601148;UniProtKB:P49901。
PSMA也被称为叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1;FOLH1;NAALAD1;FOLH;mGCP;谷氨酸羧肽酶II;N-乙酰化α连接的酸性二肽酶I;PSM;NAALAD酶I;PSMA;EC 3.4.17.21;谷氨酸羧化酶II;GCP2;细胞生长抑制基因27蛋白;NAALAd酶;叶酰聚-γ-谷氨酸羧肽酶;谷氨酸羧肽酶2;膜谷氨酸羧肽酶;N-乙酰化α连接的酸性二肽酶1;蝶酰聚-γ-谷氨酸羧肽酶;前列腺特异性膜抗原变体F;FGCP;叶酸水解酶1;GCPII;前列腺特异性膜抗原。Id:HGNC:3788;Entrez Gene:2346;Ensembl:ENSG00000086205;OMIM:600934;UniProtKB:Q04609。
PSMA不应与蛋白酶体(Proteasome)(前体(Prosome),Macropain)亚基α型1混淆,后者别名为PSMA1。
登录号主要用于提供另外的鉴定靶标的方法,蛋白质结合的实际序列可以变化,例如由于编码基因中的突变,如在一些癌症等中发生的突变。抗原结合位点结合抗原及其多种变体,如由某些抗原阳性免疫或肿瘤细胞表达的变体。
当在本文中提及基因、蛋白质时,优选是指人形式的基因或蛋白质。当在本文中提及基因或蛋白质时,是指天然基因或蛋白质,以及可以在肿瘤、癌症等中检测的,优选可以在人肿瘤、癌症等中检测的基因或蛋白质的变体形式。
本发明的双特异性抗体优选结合人BCMA、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CD44、CD123、CD138、CEA、CLEC12A、CS-1、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、DLL3、LGR5、MSLN、FOLR1、FOLR3、HER2、HM1.24、MCSP、PSMA蛋白、或其变体。当然,结合抗原的重链/轻链组合优选结合抗原的胞外部分。根据本发明的双特异性抗体优选结合人CLEC12A或其变体。根据本发明的一个优选双特异性抗体结合人CD3和人CLEC12A或其变体。
HGNC代表HUGO基因命名委员会。缩写后面的数字是可用其从HGNC数据库中检索基因和由基因编码的蛋白质的信息的登录号。Entrez Gene提供了可用其从NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)数据库检索基因或由基因编码的蛋白质的信息的登录号或基因ID。Ensemble提供了可用其从Ensemble数据库获得基因或由基因编码的蛋白质的信息的登录号。Ensembl是EMBL-EBI和Wellcome Trust Sanger Institute的联合项目,以开发在所选真核基因组上产生和维持自动注释的软件系统。
本发明提供了结合人CD3的抗体,所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,所述可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A。
在一个优选的实施方案中,轻链包含轻链可变区,所述轻链可变区包含如图23A所示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的氨基酸序列,并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。短语“O12轻链”将在整个说明书中用作以下的简称:“包含轻链可变区的轻链,所述轻链可变区包含如图23A所示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的氨基酸序列,并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合”。IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的简称。该基因也被称为免疫球蛋白κ可变1-39;IGKV139;IGKV1-39;O12a或O12。该基因的外部Id为:HGNC:5740;Entrez Gene:28930;Ensembl:ENSG00000242371。IgVκ1-39的一个优选氨基酸序列在图23A中示出。其列出了V区的序列。V区可以与五个J区之一组合。图23B和23C描述了与J区组合的IgVκ1-39的两个优选序列。联合的序列表示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5;别名为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名法)。
优选地,包含轻链可变区的O12/IgVκ1-39*01是种系序列。进一步优选地,包含轻链可变区的IGJκ1*01或/IGJκ5*01是种系序列。在一个优选的实施方案中,IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5轻链可变区是种系序列。
在一个优选的实施方案中,轻链可变区包含种系O12/IgVκ1-39*01。在一个优选的实施方案中,轻链可变区包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一个优选的实施方案中,IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。轻链可变区优选包含种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ5*01,优选种系IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。
产生具有O12轻链的抗体的成熟B细胞通常产生相对于种系序列(即生物体的非淋巴细胞中的正常序列)已经历一个或更多个突变的轻链。负责这些突变的过程通常被称为体细胞(超)突变。产生的轻链被称为亲和力成熟的轻链。当衍生自O12种系序列时,这样的轻链是O12衍生轻链。在本说明书中,短语“O12轻链”包括O12衍生轻链。通过体细胞超突变引入的突变当然也可以在实验室中人为引入。在实验室中也可以引入其他突变而不影响轻链的特性(在种类上但未必在量上)。如果轻链包含如图23A、图23B或图23C所示序列并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合,则轻链至少是O12轻链。在一个优选的实施方案中,O12轻链是包含如图23A、图23B或图23C所示序列并具有0-9个、0-8个、0-7个、0-6个、0-5个、0-4个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合的轻链。在一个优选的实施方案中,O12轻链是包含如图23A、图23B或图23C所示序列并具有0-5个,优选0-4个,更优选0-3个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合的轻链。在一个优选的实施方案中,O12轻链是包含如图23A、图23B或图23C所示序列并具有0-2个,更优选0-1个,最优选0个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合的轻链。在一个优选的实施方案中,O12轻链是包含如图23A或图23B所示序列并具有所述氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合的轻链。在一个优选的实施方案中,轻链包含图23B的序列。
抗体优选是双特异性抗体。双特异性抗体优选具有结合CD3的一个重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合和结合CD3上抗原以外的抗原的第二VH/VL组合。在一个优选的实施方案中,所述抗原是肿瘤抗原。在一个优选的实施方案中,所述第一VH/VL组合中的VL与所述第二VH/VL组合中的VL相似。在一个更优选的实施方案中,第一VH/VL组合和第二VH/VL组合中的VL相同。在一个优选的实施方案中,双特异性抗体是全长抗体,其具有结合CD3的一个重链/轻链(H/L)组合和结合另一抗原(优选肿瘤抗原)的一个H/L链组合。在一个优选的实施方案中,所述第一H/L链组合中的轻链与所述第二H/L链组合中的轻链相似。在一个更优选的实施方案中,第一H/L链组合和第二H/L链组合中的轻链相同,即相似或相同的人轻链是所谓的“共同轻链(common light chain)”,其是可与不同的重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域的抗体的轻链。在一个优选的实施方案中,所述第一H/L链组合中的轻链包含与所述第二H/L链组合中的轻链可变区相似的轻链可变区。在一个更优选的实施方案中,第一H/L链组合和第二H/L链组合中的轻链可变区相同,即相似或相同的人轻链可变区是所谓的“共同轻链可变区”,其是可与不同重链可变区组合以形成具有功能性抗原结合结构域的抗体的轻链可变区。包含共同轻链可变区的轻链优选是共同轻链。如在本文别处进一步限定的,轻链优选包含轻链可变区,所述轻链可变区包含如图23A所示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的氨基酸序列并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。优选地,共同轻链具有种系序列。一个优选的种系序列是人类库(human repertoire)中经常使用的轻链可变区,并具有良好的热力学稳定性、产量和溶解性。一个优选的种系轻链是如上所述的O12。O12/IgVκ1-39的一个优选序列在图23A中给出。其列出了V区的序列。图23B和23C描述了与J区组合的IgVκ1-39的两个优选序列。联合的序列表示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5;别名为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。
优选地,O12/IgVκ1-39*01轻链可变区是种系序列。优选地,包含轻链可变区的O12/IgVκ1-39*01是种系序列。进一步优选地,包含轻链可变区的IGJκ1*01或/IGJκ5*01是种系序列。在一个优选的实施方案中,IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5轻链可变区是种系序列。双特异性抗体的O12轻链优选是如上所述的O12轻链。
肿瘤抗原由其表达模式定义。肿瘤特异性抗原通常仅存在于肿瘤细胞上,而不存在于出生后,优选成年人体内的任何其他细胞上。肿瘤相关抗原通常存在于肿瘤细胞上,并且也存在于出生后,优选成年人体内的一些正常细胞上。本文使用的肿瘤抗原通常是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。肿瘤抗原可参与或不参与致癌过程。其可与健康个体中的“正常”蛋白质不同或相同。值得注意的是,多种肿瘤特异性抗原后来表明也在一些其他非致瘤细胞上表达。优选的肿瘤抗原是在细胞表面上表达并具有胞外部分的肿瘤抗原。抗体通常结合抗原的胞外部分。
如本文所用,术语“抗体”是指属于蛋白质的免疫球蛋白类别的蛋白质分子,其包含结合抗原上的表位的一个或更多个结构域,其中这样的结构域来源于抗体的可变区或与其具有序列同源性。抗体通常由基本结构单元构成,每个结构单元具有两条重链和两条轻链。用于治疗用途的抗体优选尽可能接近待治疗对象的天然抗体(例如用于人对象的人抗体)。抗体结合可以用特异性和亲和力来表示。特异性决定了哪个抗原或其表位被结合结构域特异性结合。亲和力是结合特定抗原或表位的强度的量度。结合或“特异性识别”定义为以至少1×10e-6M、1×10e-7M、1×10e-8M或至少1×10e-9M的亲和力(KD)结合。用于治疗应用的抗体可具有1×10e-10M或甚至更高的亲和力。本发明的抗体通常是双特异性抗体并且是人IgG亚类。优选地,本发明的抗体是人IgG1亚类。最优选地,本发明的抗体是全长IgG分子。本发明还提供了本发明抗体的衍生物和/或类似物。这样的衍生物和/或类似物具有本发明抗体的VH/VL结构域,优选包含如本文别处定义的共同轻链可变区。合适的衍生物是单链Fv片段、单体(monobody)、VHH和Fab片段。衍生物可以与抗体重链的CH2和CH3结构域融合。衍生物优选还包含抗体重链的CH1结构域和抗体轻链的CL结构域。衍生物还可以是多价形式,优选双特异性形式,其中抗体的一个VH/VL结构域包含结合本发明CD3的重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合,并且抗体的至少一个其他VH/VL结构域结合不是CD3抗原的抗原。抗体的所述至少一个其他VH/VL结构域优选结合肿瘤抗原,优选CLEC12A。例如通过以下方式容易地产生多价形式:产生作为在VH/VL结构域之间具有或不具有合适的和/或常规的肽接头或间隔区之融合蛋白的衍生物。
“双特异性抗体”是如上文所述的抗体,其包含结合CD3的一个重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合和结合CD3以外的抗原、优选肿瘤抗原的第二VH/VL组合。在一个优选的实施方案中,所述第一VH/VL组合中的VL与所述第二VH/VL组合中的VL相似。在一个更优选的实施方案中,第一VH/VL组合和第二VH/VL组合中的VL相同。在一个优选的实施方案中,双特异性抗体是全长抗体,其包含结合CD3的一个重链/轻链组合和结合另一抗原、优选肿瘤抗原的一个重链/轻链组合。
重链/轻链组合与抗原的结合通过重链/轻链组合的可变区中的抗原结合位点实现。
本发明还提供了替代的双特异性形式,例如Spiess,C.等,(Alternativemolecular formats and therapeutic applications for bispecificantibodies.Mol.Immunol.(2015)http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)中所述的那些。不是具有两个H/L组合的经典抗体的双特异性抗体形式至少具有包含本发明的重链可变区和轻链可变区的可变结构域。该可变结构域可以连接至提供第二结合活性的单链Fv片段、单体、VHH和Fab片段。
术语双特异性抗体可用更宽泛的术语“双特异性结合蛋白”代替,所述双特异性结合蛋白包含具有本发明的重链可变区和轻链可变区的结合CD3的免疫球蛋白可变结构域;和结合另一抗原的抗原结合(多)肽。在该实施方案中,所述结合(多)肽优选为如Spiess等(同上)中所述的(多)肽。
在本发明的双特异性抗体中,CD3结合H/L链组合中的轻链优选与可结合CD3以外的抗原、优选肿瘤抗原的H/L链组合中的轻链相似。在一个更优选的实施方案中,这两个H/L链组合中的轻链相同,即所述人轻链是所谓的“共同轻链”,其是可与不同重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域的抗体的轻链。优选地,共同轻链具有种系序列。一个优选的种系序列是人类库中经常使用的轻链可变区,并具有良好的热力学稳定性、产量和溶解性。一个优选的种系轻链是O12,优选重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能等同物(即相同的IgVκ1-39基因片段,但不同的IGJκ基因片段)(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名法)。
本文使用的术语“共同轻链”是指双特异性抗体中的两条轻链(或其VL部分)。两条轻链(或其VL部分)可相同或具有一些氨基酸序列差异,而全长抗体的结合特异性不受影响。例如,在本文使用的共同轻链的定义的范围内,例如通过引入和测试保守氨基酸变化、在与重链配对时不导致或仅部分地导致结合特异性的区域中氨基酸的变化等来制备或找到不相同但在功能上仍等同的轻链。在添加或不添加术语“重排”的情况下,术语‘共同轻链’、‘共同VL’、‘单轻链’、‘单VL’在本文中均可互换使用。
优选地,共同轻链具有种系序列。优选的种系序列是人类库中经常使用的轻链可变区。一个优选的种系轻链是O12,优选重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能等同物(即相同的IgVκ1-39基因片段,但不同的IGJκ基因片段)(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名法)。术语重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39轻链或简写的huVκ1-39在整个申请中可互换使用。显然,本领域技术人员将认识到“共同”还指氨基酸序列不相同的轻链的功能等同物。存在所述轻链的许多变体,其中存在不实质上影响功能结合区形成的突变(缺失、替换、插入和/或添加)。本发明的轻链也可以是如上所述的轻链,并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。
本发明的抗体优选为IgG抗体,优选IgG1抗体。根据本发明的术语“全长IgG”被定义为包含基本上完整IgG,然而其不一定具有完整IgG的全部功能。为了避免疑惑,全长IgG包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定(C)和可变(V)区,其可分为被称为CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结构域。IgG抗体通过Fab部分中包含的可变区结构域与抗原结合,并且结合后可以通过恒定结构域(主要通过Fc部分)与免疫系统的分子和细胞相互作用。根据本发明的全长抗体包括IgG分子,其中可能存在提供期望特征的突变。全长IgG不应具有任何区域的实质部分的缺失。然而,其中一个或多个氨基酸残基缺失但基本上不改变所得IgG分子的结合特征的IgG分子包含在术语“全长IgG”内。例如,这样的IgG分子可以具有1至10个氨基酸残基(优选在非CDR区域中)的缺失,其中缺失的氨基酸对IgG的结合特异性不是必需的。
使用全长IgG抗体是因为它们有利的半衰期,以及由于免疫原性的原因希望保持接近完全自体(人)分子。基于在人中的长循环半衰期,IgG1是有利的。为了防止或避免在人中的免疫原性,优选地根据本发明的双特异性全长IgG抗体是人IgG1。术语“双特异性”是指抗体的一个重链和轻链组合(H/L组合)或臂结合第一抗原,而另一个H/L组合或另一个臂结合第二抗原,其中所述第一抗原和所述第二抗原不相同。抗原通常是作为抗体的靶标的分子。在本发明中,优选地抗原是个体细胞膜上表达的蛋白质。根据本发明,所述第一抗原和所述第二抗原在两个不同分子上,所述两个不同分子优选位于两种不同细胞类型上。术语“[抗体的]一个臂”优选意指包含全长IgG抗体的一个Fab部分的重链/轻链组合。通过募集和活化内源免疫细胞来介导细胞毒性的双特异性抗体是新兴类型的下一代抗体治疗剂。这可以通过在一个分子中组合靶细胞(即,肿瘤细胞)和效应细胞(即,T细胞、NK细胞和巨噬细胞)的抗原结合特异性来实现(Cui等,JBC 2012(287)28206 28214;Kontermann,MABS 2012(4)182 197;Chames和Baty,MABS 2009(1)539 547;Moore等,Blood 2011(117)4542 4551;Loffler等,2000Blood 95:2098;Zeidler等,1999 J.Immunol.163:1246)。根据本发明,提供了双特异性抗体,其中一个重链/轻链组合结合异常(肿瘤)细胞上的CLEC12A抗原,而第二重链/轻链组合结合免疫效应细胞上的CD3。
本发明提供了双特异性IgG抗体,其中一个重链/轻链组合特异性识别CLEC12A或其功能等同物,包括那些缺少上述额外的一段10个氨基酸的细胞内序列的功能性CLEC12A等同物。其中一个重链/轻链组合结合全长形式的CLEC12A的双特异性IgG抗体是优选的。当然,结合肿瘤抗原的重链/轻链组合结合肿瘤抗原的胞外部分。
术语“可变区结构域”、“可变区”、“可变结构域”、“VH/VL对”、“VH/VL”、“VH”、“VL”、“Fab部分”、“Fab臂”、“Fab”或“臂”在本文中可互换使用。
与抗体的随机、非特异性粘着(sticking)相反,抗原与抗体的结合通常通过抗体的互补区域以及抗原和可变结构域两者的特定三维结构来介导,从而允许这两个结构精确地(类似于锁和钥匙的相互作用)结合在一起。由于抗体通常识别抗原的表位,并且这些表位也可能存在于其他蛋白质中,所以如果这样的其他蛋白质包含相同表位,则根据本发明的结合CD3或CLEC12A的抗体也可以识别其他蛋白质。因此,术语“结合”不排除抗体与包含相同表位的其他蛋白质的结合。本发明抗体中结合CD3的重链/轻链组合不结合出生后、优选成年人细胞膜上的其他蛋白质。本发明结合CLEC12A的重链/轻链组合不结合出生后、优选成年人细胞膜上的其他蛋白质。
如下文更详细描述的,根据本发明的结合CD3和肿瘤抗原的双特异性抗体以至少1×10e-6M的结合亲和力与CD3(优选效应细胞上的CD3)结合。在一个优选的实施方案中,CD3结合亲和力为1×10e-6M至1×10e-10M,优选1×10e-7M至1×10e-9M。
根据本发明的结合CD3和肿瘤抗原的双特异性抗体优选以高于其结合CD3之亲和力的结合亲和力结合肿瘤抗原。在一个优选的实施方案中,与肿瘤细胞上的肿瘤抗原的结合亲和力比与CD3结合的亲和力高至少2倍、更优选4倍、更优选6倍或10倍。在一个优选的实施方案中,肿瘤抗原结合亲和力为1×10e-6M至1×10e-10M,优选1×10e-7M至1×10e-10M,更优选至少1×10e-8,优选至少1×10e-9。优选地,以比肿瘤抗原所指定的结合亲和力低至少2倍、更优选4倍、更优选6倍或10倍的CD3亲和力组合。在一个优选的实施方案中,肿瘤抗原结合亲和力为1×10e-8至1×10e-10。
本文使用的术语“异常细胞”包括肿瘤细胞,更具体地为血液来源的肿瘤细胞,包括白血病前细胞,如导致骨髓增生异常综合征(MDS)的细胞,以及白血病细胞,如急性髓性白血病(AML)肿瘤细胞或慢性骨髓性白血病(CML)细胞。
如本文所用,术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指哺乳动物免疫系统中天然细胞库内的细胞,其可被活化以影响靶细胞的生存力。免疫效应细胞包括淋巴谱系细胞如自然杀伤(NK)细胞、T细胞(包括细胞毒性T细胞)、或B细胞,但是骨髓谱系的细胞可视为免疫效应细胞,如单核细胞或巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞。因此,所述效应细胞优选是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞。根据本发明,将效应细胞募集至异常细胞意味着免疫效应细胞紧密靠近异常靶细胞,以使得效应细胞可以直接杀伤或间接启动杀伤它们被募集至的异常细胞。优选地,CD3结合抗体结合效应细胞表面上的CD3。
本发明结合人CD3的抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A。
相对于指定的氨基酸序列,重链可变区可具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。相对于指定的序列的氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合当然仅在X1X2指示的位置以外的位置处。在X1X2指示的位置处,只允许指定的氨基酸。在一个优选的实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,重链可变区在X1X2指示的位置以外的位置处包含0-9个、0-8个、0-7个、0-6个、0-5个、0-4个,优选0-3个,优选0-2个,优选0-1个,优选0个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。如果比对序列不在超过10个位置,优选不超过5个位置处不同,则插入、添加、缺失或替换的组合是要求保护的组合。比对序列之一中的空位计数为与另一个序列中跳过的氨基酸一样多。
氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合优选不在重链可变区的CDR3区中,优选不在重链可变区的CDR1和/或CDR2区中。在一个优选的实施方案中,相对于指定的序列,重链可变区不包含缺失、添加或插入。在该实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,重链可变区可具有0-10个,优选0-5个氨基酸替换。氨基酸替换优选是保守氨基酸替换。
本发明的结合人CD3的抗体,其包含重链可变区,所述重链可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A,
所述抗体优选是包含含有通过图12、25和28中所示编号5192、5193、5196、5197、5351、5354、5356、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列的重链可变区的抗体。重链可变区优选包含通过图12和25中所示编号5196、5197、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列。抗体的重链可变区优选包含通过图12中所示编号5196标识的氨基酸序列。
本发明还提供了本发明的结合人CD3的双特异性抗体,其包含重链和轻链,其中所述重链的重链可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A。
轻链优选为本文其他地方定义的共同轻链。双特异性抗体还包含结合另一抗原、优选肿瘤抗原的重链和轻链组合。结合另一抗原的重链和轻链组合的轻链优选是本文其他地方定义的共同轻链。重链包含重链可变区,所述重链可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A,
所述重链优选是包含含有通过图12、25和28中所示编号5192、5193、5196、5197、5351、5354、5356、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列的重链可变区的重链。双特异性抗体的重链可变区优选包含通过图12和25中所示编号5196、5197、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列。双特异性抗体的重链可变区优选包含通过图12中所示编号5196标识的氨基酸序列。
本发明的双特异性抗体,其包含重链可变区,所述重链可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A,
所述抗体优选地还包含结合人CLEC12A的重链/轻链组合。在一个优选的实施方案中,结合人CLEC12A的重链/轻链组合的重链包含可变区,所述可变区包含以下氨基酸序列:
并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。
相对于指定的氨基酸序列,结合人CLEC12A的重链/轻链组合的重链可变区可具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。在一个优选的实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,重链可变区包含0-9个、0-8个、0-7个、0-6个、0-5个、0-4个,优选0-3个,优选0-2个,优选0-1个,优选0个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。如果比对序列不在超过5个位置处不同,则插入、缺失、添加、或替换的组合是要求保护的组合。比对序列之一中的空位计数为与另一个序列中跳过的氨基酸一样多。
本文所述的CD3重链可变区中的氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合优选地留下H35、A61、Y102、N103和W104以及CDR3 VH中的位置未改变。如果A50被修饰,则其优选被S、Y、M或Q替换。如果D59被修饰,则其优选被Y或E替换,然而D59被L、I、V、F、R、A、N、H、S、T替换也是可能的。如果A61被替换,则优选被N、I、H、Q、L、R、Y、E、S、T、D、K、V替换。如果F105被修饰,则其优选被Y或M替换。对于本发明的CD3 VH,H35、Y102、N103和W104残基被认为与CD3结合相关。A50、D59、A61和F105位置处的其他特定替换也是相关的,但不一定影响CD3结合。表2在第2列中列出了引入的氨基酸替换。在第3栏中提到了还被恢复的那些。引入但未恢复的氨基酸替换被认为影响抗体并且是不期望的。例如A50I突变是不期望的。在储存后,使用实施例5A中描述的方法连同CIEX-HPLC容易发现耐受的氨基酸替换。
氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合优选不在重链和轻链的结合界面中进行。
如果H/L链相互作用的界面中的氨基酸变化,则优选另一条链中相应的氨基酸变化以适应该变化。氨基酸的插入或添加优选不插入或添加脯氨酸。
原则上可认为氨基酸的添加与插入相同。将氨基酸添加到多肽链的一个末端有时不被视为插入,而被视为严格添加(延长)。对于本发明,链内或者向一个末端的两种添加都被认为是插入。
氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合优选不在重链可变区的CDR3区中,优选不在重链可变区的CDR1或CDR2区中。在一个优选的实施方案中,相对于指定的序列,重链可变区不包含缺失、添加或插入。在该实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,重链可变区可具有0-5个氨基酸替换。氨基酸替换优选是保守氨基酸替换。本发明的CD3结合VH的CDR1、CDR2和CDR3优选分别包含以下氨基酸序列:CDR1的GFTFSSYG(根据IMGT),CDR2的IWYNARKQ,和CDR3的GTGYNWFDP。本发明的CLEC12A结合VH的CDR1、CDR2和CDR3优选分别包含以下氨基酸序列:CDR1的GYTFTSYY,CDR2的INPSGGST,和CDR3的GTTGDWFDY。
轻链可变区优选包含种系O12可变区V片段。在一个优选的实施方案中,轻链可变区包含κ轻链V片段IgVκ1-39*01。在一个特别优选的实施方案中,轻链可变区包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05。在一个最优选的实施方案中,轻链可变区包含种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01序列。
在本发明的双特异性抗体中,优选地,两个重链/轻链组合的轻链相同。这样的轻链也被称为“共同轻链”。根据本发明的术语“共同轻链”是指可相同或具有一些氨基酸序列差异同时保留抗体的结合特异性的轻链。例如,在本文使用的共同轻链的定义范围内,可例如通过引入并测试保守氨基酸变化、在与重链配对时不导致或仅部分地导致结合特异性的区域中氨基酸的变化等来制备或找到不相同但在功能上仍等同的轻链。在添加或不添加术语“重排”的情况下,术语“共同轻链”、“共同VL”、“单轻链”、“单VL”在本文中均可互换使用。本发明的一个方面是使用可与不同重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域之抗体的人轻链作为共同轻链(WO2004/009618,WO2009/157771,Merchant等,1998,Nissim等,1994)。优选地,共同轻链具有种系序列。一个优选的种系序列是人类库中经常使用的轻链可变区,其具有与许多不同的VH区配对的优异能力,并具有良好的热力学稳定性、产量和溶解性。
在一个优选的实施方案中,所述共同轻链包含含有种系O12/IgVκ1-39*01的轻链可变区。在一个优选的实施方案中,轻链可变区包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一个优选的实施方案中,IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。轻链可变区优选包含种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一个优选的实施方案中,种系IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。显然,本领域技术人员将认识到,“共同”还指氨基酸序列不相同的轻链的功能等同物。存在所述轻链的许多变体,其中存在不实质上影响功能性结合区形成的突变(缺失、替换、添加)。
在一个优选的实施方案中,轻链可变区包含以下氨基酸序列
并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。在一个优选的实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,轻链可变区包含0-9个、0-8个、0-7个、0-6个、0-5个、0-4个,优选0-3个,优选0-2个,优选0-1个,优选0个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。如果比对序列不在超过5个位置处不同,则插入、缺失、添加或替换的组合是要求保护的组合。比对序列之一中的空位计数为与另一个序列中跳过的氨基酸一样多。在一个优选的实施方案中,轻链可变区包含以下氨基酸序列
在另一个优选的实施方案中,轻链可变区包含以下氨基酸序列
氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合优选不在轻链可变区的CDR3区中,优选不在重链可变区的CDR1或CDR2区中。在一个优选的实施方案中,相对于指定的序列,重链可变区不包含缺失、添加或插入。在该实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,重链可变区可具有0-5个氨基酸替换。氨基酸替换优选是保守氨基酸替换。本发明抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3优选分别包含氨基酸序列CDR1–QSISSY、CDR2–AAS、CDR3–QQSYSTPPT,即IGKV1-39的CDR(根据IMGT)。
如上所述,优选地本发明的抗体是双特异性抗体。在一个优选的实施方案中,双特异性抗体包含本文所示的CD3结合重链/轻链组合以及结合肿瘤抗原的重链/轻链组合。在一个优选的实施方案中,结合肿瘤抗原的重链/轻链组合结合CLEC12A。
本发明的(双特异性)抗体的恒定区优选为人恒定区。相对于天然存在的人抗体,所述恒定区可包含一个或更多个,优选不超过10个,优选不超过5个氨基酸差异。本文产生的抗体的多种可变结构域来源于人抗体可变结构域文库。因此这些可变结构域是人的。独特的CDR区可以来源于人,可以是合成的,或来源于其他生物体。本发明的抗体或双特异性抗体优选是人抗体或人源化抗体。
在本领域中存在多种产生抗体的方法。抗体通常由表达编码抗体之核酸的细胞产生。用于抗体产生的合适细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞或PER-C6细胞。在一个特别优选的实施方案中,所述细胞是CHO细胞。
多个机构和公司已经开发了用于大规模生产抗体的细胞系,例如用于临床使用。此类细胞系的非限制性实例是CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。这些细胞也用于其他目的,例如生产蛋白质。开发的用于工业规模生产蛋白质和抗体的细胞系在本文中进一步称为工业细胞系。在一个优选的实施方案中,本发明提供了产生本发明抗体的工业细胞系。
在一个实施方案中,本发明提供了包含根据本发明的抗体和/或根据本发明的核酸的细胞。所述细胞优选是动物细胞,更优选哺乳动物细胞,更优选灵长类动物细胞,最优选人细胞。为了本发明的目的,合适的细胞是能够包含并优选产生根据本发明的抗体和/或根据本发明的核酸的任何细胞。
本发明还提供了包含根据本发明的抗体的细胞。优选地,所述细胞(通常是体外、分离的或重组的细胞)产生所述抗体。在一个优选的实施方案中,所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。在一个特别优选的实施方案中,所述细胞是CHO细胞。还提供了包含根据本发明的细胞的细胞培养物。多个机构和公司已经开发了用于大规模生产抗体的细胞系,例如用于临床使用。此类细胞系的非限制性实例是CHO细胞,NS0细胞或PER.C6细胞。这些细胞也用于其他目的,例如生产蛋白质。开发的用于工业规模生产蛋白质和抗体的细胞系在本文中进一步称为工业细胞系。因此,在一个优选的实施方案中,本发明提供了开发用于大规模生产抗体的细胞系用于生产本发明抗体的用途。本发明还提供了用于产生抗体的细胞,其包含编码要求保护的抗体的VH、VL和/或重链和轻链的核酸分子。优选地,所述核酸分子编码通过图12的编号5196标识的VH,核酸分子编码通过图24的编号4327标识的VH,或其组合。
本发明还提供了产生抗体的方法,其包括培养本发明的细胞并从所述培养物中收获所述抗体。优选地,所述细胞在无血清培养基中培养。优选地,所述细胞适于悬浮生长。还提供了通过根据本发明用于产生抗体的方法可获得的抗体。抗体优选从培养物的培养基中纯化。优选地,所述抗体是亲和纯化的。
本发明的细胞例如是杂交瘤细胞系、CHO细胞、293F细胞、NS0细胞或已知适用于临床目的的抗体产生的其他细胞类型。在一个特别优选的实施方案中,所述细胞是人细胞。优选通过腺病毒E1区或其功能等同物转化的细胞。此类细胞系的一个优选实例是PER.C6细胞系或其等同物。在一个特别优选的实施方案中,所述细胞是CHO细胞或其变体。优选使用谷氨酰胺合成酶(GS)载体系统表达抗体的变体。
本发明还提供了产生抗体的方法,其包括培养本发明的细胞并从所述培养物中收获所述抗体。优选地,所述细胞在无血清培养基中培养。优选地,所述细胞适于悬浮生长。还提供了通过根据本发明用于产生抗体的方法可获得的抗体。抗体优选从培养物的培养基中纯化。优选地,所述抗体是亲和纯化的。
双特异性抗体通常也由表达编码抗体之核酸的细胞产生。在这种情况下,细胞表达构成双特异性抗体的不同轻链和重链。为此,细胞表达两条不同的重链和至少一条轻链。由于未修饰的重链可以彼此配对形成二聚体,所以除了双特异性抗体(异二聚体)之外,这样的细胞通常还产生两种单克隆抗体(同二聚体)。当细胞表达两条或更多条轻链时,产生的抗体中可能的重链/轻链组合的数目增加。为了减少产生的不同抗体种类(不同重链和轻链的组合)的数目,优选前述“共同轻链”。
表达共同轻链和等量的两条重链的抗体产生细胞通常产生50%的双特异性抗体和25%的每种单特异性抗体(即具有相同的重轻链组合)。已经公开了多种方法来有利于双特异性抗体的产生,或反之亦然,单特异性抗体的产生。在本发明中,优选地,相对于各单特异性抗体的产生,细胞有利于双特异性抗体的产生。这通常通过修饰重链的恒定区以使得相对于同二聚化它们有利于异二聚化(即与另一重链/轻链组合的重链二聚化)来实现。在一个优选的实施方案中,本发明的双特异性抗体包含具有相容性异二聚化结构域的两条不同的免疫球蛋白重链。本领域已经描述了多种相容性异二聚化结构域(参见例如Gunasekaran等,JBC 2010(285)19637-19646)。相容性异二聚化结构域优选是相容性免疫球蛋白重链CH3异二聚化结构域。本领域描述了多种可以实现重链的这种异二聚化的方式。一种方式是产生“结进孔(knob into hole)”双特异性抗体。参见美国专利申请20030078385(Arathoon等-Genentech)。
在US13/866,747(现为US 9,248,181)、US14/081,848(现为US 9,358,286)和PCT/NL2013/050294(公开为WO2013/157954)(通过引用并入本文)中,公开了用于使用相容性异二聚化结构域产生双特异性抗体的方法和手段。这些手段和方法也可有利地用于本发明。具体地,基本上仅产生双特异性全长IgG分子的一些优选突变是第一CH3结构域中的氨基酸替换L351K和T366K(根据Kabat编号)(‘KK变体’重链)和第二结构域中的氨基酸替换L351D和L368E(‘DE变体’重链),反之亦然。先前在我们的US 9,248,181和US 9,358,286专利以及WO2013/157954PCT申请中证明,DE变体和KK变体优先配对以形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。由于相同重链之间CH3-CH3界面中带电残基间的强烈排斥,几乎不发生DE变体重链的同二聚化(DEDE同二聚体)或KK变体重链的同二聚化(KKKK同二聚体)。在一个实施方案中,包含结合CD3的可变结构域的重链/轻链组合包含重链的KK变体。在该实施方案中,包含结合CD3以外的抗原之可变区的重链/轻链组合包含重链的DE变体。在一个优选的实施方案中,CD3以外的抗原是CLEC12A。在一个优选的实施方案中,结合CLEC12A的可变结构域的VH是图24中所示的MF4327_VH。
一些抗体在CH2/下铰链区中被修饰,例如以降低Fc-受体相互作用或降低C1q结合。在一些实施方案中,本发明的抗体是具有突变体CH2和/或下铰链结构域的IgG抗体,以使得双特异性IgG抗体与Fc-γ受体的相互作用降低。这样的突变体CH2和/或下铰链结构域优选包含在235位和/或236位(Kabat编号)处的氨基替换,优选L235G和/或G236R替换。
本发明还提供了治疗对象中的癌症或患癌症的风险的方法,其包括向有此需要的对象施用结合人CD3的双特异性抗体,所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,所述可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A;以及
包含结合肿瘤抗原的重链-轻链(H/L)组合。
轻链优选包含共同轻链可变区。所述共同轻链可变区优选包含O12/IgVκ1-39轻链可变区。所述轻链可变区优选是种系O12/IgVκ1-39*01可变区。所述轻链可变区优选包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。轻链可变区优选包含种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。所述轻链可变区优选包含以下氨基酸序列
并具有0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。优选地,结合肿瘤抗原的重链/轻链(H/L)链组合结合CLEC12A。
抗体优选是人抗体或人源化抗体。优选地,抗体包含具有相容性异二聚化结构域的两条不同的免疫球蛋白重链。所述相容性异二聚化结构域优选是相容性免疫球蛋白重链CH3异二聚化结构域。所述双特异性抗体优选是具有突变体CH2和/或下铰链结构域的IgG抗体,以使得双特异性IgG抗体与Fc-γ受体的相互作用降低。突变体CH2和/或下铰链结构域优选包含在235位和/或236位(Kabat编号)处的氨基替换,优选L235G和/或G236R替换。抗体优选包含共同轻链。
还提供了结合人CD3的双特异性抗体,所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,所述可变区包含以下氨基酸序列:
并在X1X2指示的位置以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合;
其中
X1=N且X2=A;
X1=N且X2=T;
X1=S且X2=G;
X1=H且X2=G;
X1=D且X2=G;或
X1=H且X2=A;以及
包含结合肿瘤抗原的重链和轻链。
本发明还提供了本发明的抗体或其衍生物或本发明的药物组合物,其用于治疗有此需要的对象。为了治疗患有肿瘤或具有患肿瘤风险的对象,优选地抗体是本发明的双特异性抗体。优选地,其中CD3结合抗体包含结合肿瘤抗原的重链/轻链组合。双特异性抗体优选是CD3/CLEC12A结合抗体。
提供了CD3/肿瘤抗原双特异性抗体和包含此类双特异性抗体的药物组合物,其用于治疗实体瘤或血液肿瘤。优选的实体瘤是上皮来源的;妇科癌症,如卵巢和子宫内膜肿瘤;前列腺癌、脑癌或任何其他实体瘤。
还提供了本发明的CD3/肿瘤抗原双特异性抗体或其衍生物或包含此类双特异性抗体或其衍生物的药物组合物,其用于治疗骨髓来源的多种白血病和白血病前期疾病以及B细胞淋巴瘤。可根据本发明治疗的疾病包括髓性白血病或白血病前期疾病,例如急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)和慢性骨髓性白血病(CML),以及霍奇金淋巴瘤和大部分非霍奇金淋巴瘤。还有B-ALL、T-ALL、套细胞淋巴瘤也是用本发明抗体治疗的优选靶标。因此,本发明提供了根据本发明的双特异性全长IgG抗体,其用作治疗骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)或优选急性髓性白血病(AML)的药物。还提供了根据本发明的双特异性IgG抗体在制备用于治疗或预防MDS、CML、MM或优选AML的药物中的用途。肿瘤抗原优选CLEC12A。
待向患者施用的根据本发明的抗体的量通常在治疗窗内,这意味着使用足够的量以获得治疗效果,同时量不超过导致不期望程度的副作用的阈值。获得期望治疗效果所需抗体的量越低,治疗窗通常将越大。因此,在低剂量下发挥足够治疗作用的本发明抗体是优选的。
欧洲和美国每年有约30,000名患者被诊断患有AML。这些患者大多数年龄在60岁或更大。年龄较大是AML结局的主要负面决定因素,强化治疗的老年AML患者的长期生存(5年)为约10%。在几乎所有诱导化学疗法后已获得缓解的患者中,在3年内观察到疾病进展。目前的缓解后治疗在老年AML患者中显示出有限的价值(如果有的话)。因此,留下了显著负荷的残余抗性白血病,并且存活的耐药性白血病细胞亚群迅速产生复发。需要具有完全不同的作用模式的新型药物来靶向这些不响应于化学疗法的AML肿瘤细胞,以诱导和维持完全缓解。尽管在超过50%的老年AML患者和约80%的年轻患者中可利用许多强化化学疗法组合来实现完全缓解(complete remission,CR),但是响应或生存的进步仍然是主要的研究挑战。在最近公开的患有AML的老年患者的65个随机临床试验(15.110名患者)的网络荟萃分析(network meta-analysis)中,与利用柔红霉素和阿糖胞苷的常规3+7诱导方案相比,大部分修改的研究性诱导方案具有类似或甚至更差的效力谱。AML的这种标准治疗与高发病率甚至死亡率有关。由于化学疗法后剩余的白血病干细胞,因此大部分CR患者复发。由于不可接受的毒性,进一步的剂量强化受到限制。因此,特别是对于患有AML的老年患者,急需新的治疗方式,所述治疗方式优选具有较小毒性。
通过使用双特异性抗体将来自患者自身免疫系统的T细胞重定向至AML肿瘤细胞,并随后对T细胞进行肿瘤靶标特异性活化,可以实现对化学疗法无响应的AML的治疗。这个过程也被称为所谓的“T细胞衔接方法”。以这种方式,患者的免疫系统被加强和重新靶向,以攻击和根除AML肿瘤细胞。本发明提供了CD3xCLEC12A双特异性IgG抗体,其有效地将T细胞重定向至AML肿瘤细胞,从而诱导AML肿瘤细胞裂解。因此CD3xCLEC12A双特异性抗体是具有更少副作用的靶向疗法,其特异性根除AML胚细胞(blast)和白血病干细胞以改善AML患者的预后。因为CLEC12A在白血病干细胞(LSC)上表达而不在正常造血干细胞上表达,所以针对该抗原的疗法预期根除LSC,而保留正常干细胞。在复发性和/或难治性AML患者中对这些全长IgG双特异性抗体进行临床评估。作为客观响应标准,使用骨髓中的AML胚细胞的减少来分析临床效力。AML的有效双特异性IgG为目前没有可用治疗的大的患者群体提供了新的治疗选择。除了提供实现持久缓解的手段之外,在缓解期间,这种治疗选择在施加时还具有治愈AML的潜力。在微小残留病(Minimal Residual Disease,MRD)的情况下,其最有可能具有最大影响。由于根除了MRD,因此预期复发百分比将下降。因此,这种新的治疗方式对AML患者的影响将是一种毒性更小的治疗,并具有更低复发百分比,从而改善与更高生活质量相关的结局。
本领域中描述的抗体15C3和3056具有相同的重链可变区,但轻链可变区不同。在抗体3056的批次中观察到抗体结合潜力的批次间变化性。对于抗体15C3没有注意到这一点。由于抗体的轻链不同,所以行为差异的原因可能是不同的轻链。SDS-page表明,在具有较低活性抗体的批次中,3056抗体也是完整的。抗体可变结构域的3D建模确实揭示了两种抗体之间VH/VL结构域的折叠的一些变化。由于这些变化可能解释抗体的不同行为,设计实验以使得抗体3056的VH/VL结构域的折叠更类似于15C3。不幸的是,这并不能解释抗体15C3和3056之间的差异。等电聚焦(IEF)仅显示与抗体的高等电点处的主带相关的15C3(3055)和3056之间的轻微差异。随后使用CIEX-HPLC(一种允许分离电荷变体的色谱技术)的分析显示,取决于批次,抗体3056具有非常复杂的保留谱(retention spectrum)和宽的洗脱曲线,这与15C3(3055)观察的曲线相反。此外,发现3056模式随时间显著变化,表明3056抗体固有地不稳定。
只有设计出其中3056_VH链在一个或两个特定位置处变化的变体时,行为才改变。行为在不稳定、完全没有结合活性至结合而没有显著的批次间变化性之间变化。
3056重链在其CDR2区域中包含NG脱酰胺基序WYNGRKQ,其可能参与观察到的3056抗体的电荷异质性。在15C3和3056的计算机建模中,Fab并没有显示出HCDR2区域中NG脱酰胺基序折叠中的显著差异。这不支持这种基序参与了观察到的3056抗体的不稳定性。然而,出人意料地,如权利要求中所指出的,变化显著地降低了观察到的本发明抗体的批次间变化。
本发明还提供了包含结合CD3的可变结构域和结合CLEC12A的可变结构域的抗体,其中结合CLEC12A的可变结构域的VH包含通过图24的编号4327标识的氨基酸序列,并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合,并且结合CD3的可变结构域的VH包含通过图12、25和28中所示编号5192、5193、5196、5197、5351、5354、5356、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列,并在54位和55位以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。轻链优选包含具有图23、优选23B所示氨基酸的可变结构域。
本发明还提供了包含结合CD3的可变结构域和结合CLEC12A的可变结构域的抗体,其中结合CLEC12A的可变结构域的VH包含通过图24的编号4327标识的氨基酸序列,并具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合,并且结合CD3的可变结构域的VH包含通过图12中所示编号5196标识的氨基酸序列,并在54位和55位以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。
结合CD3的可变结构域的重链优选具有通过图12和25中所示编号5196、5197、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列,并在54位和55位以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。结合CD3的可变结构域优选具有通过图12中所示编号5196标识的氨基酸序列,并在54位和55位以外的一个或更多个位置处具有0-10个,优选0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。
在一个优选的实施方案中,相对于指定的氨基酸序列,重链可变区包含0-9个、0-8个、0-7个、0-6个、0-5个、0-4个,优选0-3个,优选0-2个,优选0-1个,优选0个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合。对于CD3重链,指出的氨基酸插入、缺失、替换、添加在54位和55位以外的位置处。如果比对序列不在超过10个位置,优选不超过5个位置处不同,则插入、添加、缺失或替换的组合是要求保护的组合。比对序列之一中的空位计数为与另一个序列中跳过的氨基酸一样多。
本发明还提供了包含结合CD3的可变结构域和结合CLEC12A的可变结构域的抗体,其中结合CLEC12A的可变结构域的VH包含通过图24的编号4327标识的氨基酸序列,并且结合CD3的可变结构域的VH包含通过图12、25和28中所示编号5192、5193、5196、5197、5351、5354、5356、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列。结合CD3的可变结构域的重链优选具有通过图12和25中所示编号5196、5197、5603、5616、5626、5630、5648、5661或5694标识的氨基酸序列。结合CD3的可变结构域优选具有通过图12中所示编号5196标识的氨基酸序列。
附图说明
图1.PG3055和PG3056的IEF。
图2.PG3055和PG3056的CEX-HPLC分析。
图3.通过CEX-HPLC分析的PG3055和PG3056的批次间变化性和稳定性。左侧为随着时间的3055批次,右侧为随着时间的3056批次,顶部样品储存在-80℃下,底部样品储存在2-8℃下>3个月。
图4.在2-8℃或37℃下在IMDM+10%FBS培养基中孵育7天后,PG3055和PG3056与纯化的人T细胞上CD3的结合的流式细胞术分析。PG3055和PG3056:在2-8℃下在IMDM+10%FBS培养基中孵育7天。PG3055 37℃和PG3056 37℃:PG3055和PG3056在37℃下在IMDM+10%FBS培养基中孵育7天。
图5.左:放大可变结构域的PG3056 Fab的同源模型,VL为浅灰色,VH为黑色,HCDR1-3环为浅灰色。示出了HCDR2中形成脱酰胺基序的残基Asn54和Gly55。右:PG3055(浅灰色)和PG3056(深灰色)Fab的同源模型的叠加。
图6.VH MF3056(MF3056_VH)与VH3-33种系序列的比对。
图7.VH MF3056与VH MF3872、MF3873和MF3905的比对。
图8.变体PG3872、PG3873和PG3905与HPB-ALL细胞上CD3的结合的流式细胞术分析,包括PG3056来作为基准对照。
图9.MF3056的VH与MF3874、MF3878、MF3883、MF3886和MF3891的VH的比对。
图10.变体PG3874、PG3878、PG3883、PG3886和PG3891与HPB-ALL细胞上CD3的结合的流式细胞术分析,包括PG3056来作为基准对照。
图11.PG3891的CEX-HPLC分析。
图12.MF3056的VH与MF5192-5197 VH的VH的比对。
图13.变体PG5192-5197与HPB-ALL细胞上CD3的结合的流式细胞术分析,包括PG3056来作为基准对照。
图14.PG5196p06的IEF分析。
图15.PG5196的CEX-HPLC色谱图。
图16:5196x4327 DM-Fc bsAb与膜表达的CD3(HPB-ALL)和CLEC12A(HL-60)的结合。
图17. 5196x4327 DM-Fc bsAb保留了由早期活化标志物CD69的上调所反映的CD4和CD8 T细胞的CLEC12A特异性活化。在1000ng/mL下测试bsAb和对照IgG。T细胞活化流式细胞术数据以CD4+或CD8+T细胞群内CD69阳性细胞的百分比表示。HD1和HD2反映了使用从不同健康供体获得的T细胞的两个不同的实验。
图18. 5196x4327诱导的抗原介导的靶细胞裂解。
图19.示出了CD3δε-Fc(A)和CLEC12A蛋白(B)与固定化5196x4327 DM-Fc bsAb的结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)的传感图。传感图示出了作为时间(以秒计)的函数的响应(与芯片结合的蛋白质的量,以人工单位(artificial unit)计)。这两个图显示了使用抗原浓度范围获得的传感图(彩色)和使用BIA评估软件进行的相应曲线拟合(黑色)。
图20.通过在共培养开始(天=0)时的流式细胞术分析,对原代AML患者样品进行CLEC12A表达的分型以及T细胞和AML胚细胞的分级。在与5196x4327 DM-Fc bsAb或同种型对照共培养7天后,通过流式细胞术分析定量T细胞和AML胚细胞的总数和级分。
图21.如实施例9中所述的DSC分析。
图22.WO2005/118635中描述的抗体15C3的重链可变序列(VH)。该专利公开描述了抗体15C3的两种变体。这两种变体具有相同的重链可变结构域,但该重链可变结构域与两个不同的轻链可变结构域组合。当本文提到抗体15C3时,是指具有与如该图所示的轻链可变结构域L2组合的如该图所示的重链可变结构域的抗体。本文将15C3 VH加L2轻链的Fab产物进一步称为MF3055。
抗体PG3056具有与如该图所示的轻链可变区IGKV1-39组合的如本文所述的VH。15C3 VH加上IGKV1-39轻链的Fab产物进一步称为MF3056。
图23.本发明的抗体优选具有共同轻链。A)共同轻链优选地包含在该图中描述为序列IGKV1-39的氨基酸序列。B)在一个优选的实施方案中,共同轻链包含描述为IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5的氨基酸序列。在一个特别优选的实施方案中,共同轻链包含如该图所示的IGKV1-39/jk1的氨基酸序列。
图24.抗CLEC12A结合抗体Fab(MF4327)的VH区的氨基酸序列和抗破伤风类毒素(TT)结合Fab(MF1337)的VH区的氨基酸序列。连同图23中所示的共同轻链的氨基酸序列,这些VH形成分别结合CLEC12A和破伤风类毒素的Fab MF4327和MF1337的可变结构域。
图25.MF5196的CD3结合变体的实例是MF5603、MF5616、MF5626、MF5630、MF5648、MF5661和MF5694,其均包含重排的人IGKVl-39/IGKJl VL区。示出了Fab的VH的氨基酸序列。
图26.包含图23B所示的共同轻链以及MF5196 VH、MF5603 VH、MF5616 VH、MF5626VH、MF5630 VH、MF5648 VH、MF5661 VH和MF5694 VH的抗体与HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合,如通过流式细胞术分析的。
图27.PG5661 CIEX-HPLC色谱图。
图28.由重排的人IGKV1-39/IGKJ1VL区域构成的CD3结合Fab MF5351、MF5354和MF5356具有如所示的各自的VH。
图29.PH-形式与HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合,所有这些实例都与CD3结合。
实施例
如本文所用,“MFXXXX”(其中X独立地为数字0-9)是指包含可变结构域的Fab,其中VH具有由4个数字标识的氨基酸序列。除非另外指出,否则可变结构域的轻链可变区通常具有图23(通常图23B)的序列。“MFXXXX VH”是指由4个数字标识的VH的氨基酸序列。MF还包含轻链恒定区和通常与轻链恒定区相互作用的重链恒定区。PG是指包含相同重链和轻链的单特异性抗体。PB是指具有两个不同重链的双特异性抗体。重链的可变区不同,通常CH3区也不同,其中一个重链具有其CH3结构域的KK突变,另一个具有其CH3结构域的互补DE突变(参见参考文献PCT/NL2013/050294(公开为WO2013/157954))。
实施例1:3055和3056mAb的电荷异质性
使用等电聚焦(IEF)测定PG3056(包含与IGVK1-39/JK1共同轻链配对的MF3056 VH的全长IgG1单克隆抗体)和PG3055(包含与15C3 VL2-IGKV1-13轻链配对的相同VH的全长IgG1单克隆抗体)的pI和电荷异质性。为此,在配备有冷却板的冷却至10℃的GEHealthcare Multiphor II电泳单元上运行pI范围为6-11的Focusgel(Webscientific,cat#1006-03)。将10μg未处理的样品挨着高pI范围标志物(GE Healthcare,cat#17047301V)装载到样品槽。电泳程序由三个阶段组成;在500V初始聚焦10分钟,接着在1500V下90分钟,以及最后在2000V下10分钟的聚焦阶段。因此,固定凝胶并使用胶体考马斯染料(Pierce,cat#24590)染色。
PG3056和PG3055的IEF分析得到了图1所示的凝胶。对于PG3055,观察到在高pI(约9)处的主带,以及在稍更高pI值处的随体带(satellite band)。PG3056显示出类似的IEF图案,但是在稍微更高的pI值处,并具有稍微更加扩散的主带。
使用阳离子交换色谱HPLC(CEX-HPLC)分析这两种IgG以使用正交方法分析它们的电荷异质性。在配备有SP STAT 7μm柱和UV/Vis检测器的Dionex HPLC系统上在环境温度下进行CEX-HPLC。注射10μg样品;使用具有增加的NaCl浓度的25mM磷酸盐缓冲液pH 6.0的梯度来分离抗体电荷变体。使用Chromeleon软件分析数据。
PG3055和PG3056的CEX-HPLC色谱图在图2中示出。PG3055显示在18.8分钟处的主峰,其侧面是代表IgG的酸性和碱性同工型的小峰。令人惊讶的是,PG3056的色谱图包含在大时间间隔上的多个峰;在18.4和20.4分钟处可见两个宽主峰。色谱图显示,与具有15C3VL2-IGKV1-13轻链的IgG(PG3055)相比,IGVK1-39/JK1共同轻链抗CD3抗体(PG3056)的电荷异质性明显提高。
还使用CEX-HPLC来评估抗CD3抗体的批次间变化性和稳定性。在2-8℃下已储存超过3个月以及在-80℃下长期储存后分析这两种抗体。PG3055样品的叠加(图3,左)显示在样品之间观察到小的差异;在2-8℃下长时间储存后,17.1分钟和19.8分钟的小峰的相对峰面积稍有变化。PG3056样品之间观察到的差异(图3,右)明显得多。在2-8℃下储存后20.4分钟的峰显著降低,而18.4分钟的峰增加到成为样品主峰的程度。代表IgG的其他酸性同工型的其他早期洗脱峰也显示峰面积的相对增加,例如16.4分钟的峰。观察到的在2-8℃下长期储存后CEX-HPLC色谱图中的变化表明,包含IGVK1-39/JK1共同轻链的抗CD3抗体在这些条件下储存时不稳定,而包含15C3 VL2-IGKV1-13轻链的PG3055抗体稳定得多。
实施例2:PG3056抗体批次间变化对抗原结合的影响
为了评估在血清存在下抗CD3抗体的稳定性,将PG3055和PG3056抗体在补充有10%FBS(PAA,Cat#A15-101)的IMDM(Invitrogen,Cat#21980-065)中稀释至10μg/mL,随后在37℃下孵育七天。在该分析中,包括同种型对照IgG(PG1207)。七天后,在来源于健康供体的MACS纯化的T细胞上通过流式细胞术分析来评估IgG与CD3的结合。为了比较,将在2-8℃下在相同介质中储存七天的PG3055和PG30566包括在流式细胞术分析中。在IMDM+10%FBS中稀释的10、1、0.1和0.01μg/mL浓度下测试所有抗体的CD3结合。根据WO2014/051433中先前描述的FACS程序(不同之处是用IMDM+10%FBS进行染色),用山羊抗人Fc抗体(SouthernBiotech,2043-02)使结合的抗体可视化。数据显示(图4),当在血清的存在下在2-8℃下孵育时,PG3055和PG3056显示出与T细胞类似的结合。然而,在IMDM+10%FBS中在37℃下孵育7天,PG3055的结合不受影响(PG3055相对于PG3055 37℃),PG3056与T细胞上CD3的结合显著降低(PG3056相对于PG3056 37℃)。
总之,在37℃下孵育血清7天后,包含IGVK1-39/JK1共同轻链的抗CD3抗体PG3056显示出与CD3的结合的强烈降低。相比之下,在相同条件下PG3055抗体保持完全的CD3结合。
实施例3:PG3055和PG3056抗体的区别是什么?
除了轻链可变区,抗体PG3055和PG3056具有相同的序列。显然,在抗体的其他氨基酸序列,特别是与其紧密接触的重链可变区的情况下,共同轻链并不很好地起作用。尝试纠正3056抗体的缺陷的最明显方式是观察是否可以以任何方式改变共同轻链以使其与抗体3055中的轻链更相似。另外,并未选择抗体PG3056的轻链为结合CD3分子的抗原结合位点的一部分。选择重链可变区用于该目的。这是看是否可以使得共同轻链更类似于亲本抗体PG3055中的轻链的另一个原因。
为了找出PG3055和PG3056可变区由于不同的轻链而不同的地方,将其Fab区建模。使用MODELLER建立PG3056和PG3055 Fab区的同源模型(Sali等,1993:J.Mol.Biol.234,779-815)。从生成的结构集合中选择具有最佳能量得分的模型结构。使用侧链优化和能量最小化算法来替换与靶序列不同的模板侧链。使用Yasara(http://www.yasara.org)可视地检查3055和3056Fab的同源模型。PG3055和PG3056的模型的叠加(图5,右图)表明,轻链中的序列差异仅造成一些结构变化;两种IgG之间,轻链的某些部分相对于重链的取向在一定程度上变化。变化的部分固有地可能更不稳定,是观察到的稳定性差异的根本原因。或者,变化的部分可能或多或少地易感于不同异质性诱导过程。多种已知和未知过程可能是PG3056抗体观察到的特征的原因。酶促和非酶促修饰包括二硫键的形成、糖基化、N-末端谷氨酰胺环化、C-末端赖氨酸加工、脱酰胺化、氧化、糖化和肽键裂解,这些是可引起异质性的过程(Liu等,Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol.97,2426–2447(2008))。取决于修饰类型,可以通过细胞内过程、细胞外过程(例如在血清、腹水和/或细胞培养基中发生)来引入单克隆抗体的异质性。也可以通过用缓冲液孵育、在纯化过程期间、在储存期间、在不同应激条件下(例如升高的温度或暴露于强光)引入异质性。
建模并没有指出PG3056的可变区的突变努力集中的特定氨基酸或区域。观察到的PG3055和PG3056同源模型之间的差异较小。
在本发明中,发现不需要改变PG3056抗体轻链的氨基酸序列。即使当重链与共同轻链存在于可变区中时,调节重链也可以产生具有良好结合特性、良好稳定性和良好均一性的抗体。如将在下文中更详细示例的,出乎意料地发现,重链CDR2区域中的特定变化在结合方面是耐受的,并提供了具有期望稳定性和均一性的抗体。
这些变化导致重链CDR2区中NG脱酰胺基序的变化。PG3055和PG3056两者的HCDR2区含有Asn54和Gly55残基。如图5所示,在这两种抗体中残基都是表面暴露的。这两种分子的结构位置和表面暴露非常相似,天冬酰胺侧链的取向略微不同。考虑到在这两种抗体中该基序是表面暴露的并因此易于接近环境,并且PG3055相比于P3056中HCDR2 NG基序的折叠似乎没有显著差异,所以认为PG3056中Asn54的增强的脱酰胺作用不太可能是观察的不同PG3056批次的结合变化的根本原因。
实施例4:PG3056变体的产生和表征
通过CIEX-HPLC对PG3056的分析表征显示IgG是高度异质的。由于这种异质性可能阻碍基于CIEX-HPLC的CD3xCLEC12A双特异性IgG的纯化,我们旨在改善MF3056 Fab的CIEX-HPLC谱。MF3056的重链可变区包含多个可有助于PG3056异质性的残基和/或基序。这些是C-末端赖氨酸残基、HCDR2中的NG天冬酰胺脱酰胺基序和HCDR3中的酸不稳定性DP基序(参见图6中MF3056_VH与VH 3-33种系序列的比对)。
虽然计算机建模完全没有指出HCDR2 NG基序是观察到的异质性的可能原因,但是尝试鉴定MF3056之缺少这种翻译后修饰基序的VH变体,其同时可能表现出改善的CIEX-HPLC保留谱以及改善的稳定性。为此目的,产生并测试MF3056的VH的以下变体:MF3872、MF3873和MF3905(图7)。
将包含这些VH变体和共同轻链的这些Fab(MF3872、MF3873和MF3905)表达为全长单克隆IgG(PG3872、PG3873和PG3905),并通过流式细胞术测试与HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合(根据WO2014/051433中以前描述的FACS程序)。获得了以下结果(图8):
这些结果表明,变体PG3873和PG3905完全失去了CD3结合,而变体PG3872保留了对CD3的非常低的结合。
作为获得具有降低的异质性和降低的免疫原性之改良变体的替代方法,通过进行单独的或组合的氨基酸替换,将MF3056的VH在几个残基处向VH3-33序列种系化。产生MF3056_VH的以下变体:MF3874_VH、MF3878_VH、MF3883_VH、MF3886_VH和MF3891_VH(图9)。
再一次,将包含这些VH变体和共同轻链的Fab(MF3874_VH、MF3878_VH、MF3883_VH、MF3886_VH和MF3891_VH)表达为全长单克隆IgG(PG3874、PG3878、PG3883、PG3886和PG3891),并如上所述测试CD3结合。获得了以下结果(图10):
如图10所示,所有个体(PG3874(Q6E)、PG3878(V23A)、PG3883(A50V)、PG3886(T97A))和组合(PG3891(Q6E/V23A/T97A))种系变体保留了完整的CD3结合能力。随后,通过CIEX-HPLC(如实施例1所述)分析PG3891以评估种系化是否导致异质性降低。
如图11所示,PG3891的CIEX-HPLC谱仍然显示明显的电荷异质性。对于个体种系化变体获得了类似的CIEX-HPLC谱(数据未示出)。
在降低PG3056的电荷异质性的下一步尝试中,产生了缺少HCDR2NG基序的MF3056_VH变体(图12)。
产生包含这些VH变体和共同轻链的Fab(MF5192-5197_VH)并表达为全长单克隆IgG(PG编号),并如上所述通过流式细胞术测试与HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合。该分析(图13)显示PG5196(N54G55至N54A55替换)保留了与PG3056相当的CD3结合,而所有其他测试的MF3056变体显示显著降低的CD3结合(PG5192、PG5193或PG5197)或无CD3结合(PG5194和PG5195)。
为了评估PG5196 mAb的电荷异质性,如实施例1中所述进行等电聚焦。在凝胶染色后,观察到PG5196在高pI处的窄带,以及在稍更高pI值处的小随体带(参见图14)。
为了更详细地评估PG5196的电荷异质性,根据实施例1中所述的程序进行CIEX-HPLC,得到的色谱图在图15中示出。色谱图显示了具有19分钟保留时间的主峰,之前是在16.9分钟的小峰。出人意料地,这些数据证明,与PG3056相比,PG5196显示出显著改善的电荷异质性谱。
实施例5:使用噬菌体展示选择产生PG5196的另外的变体
基于MF5196 VH,设计噬菌体展示文库以获得另外的具有类似降低电荷异质性的CD3结合Fab。产生了包含重排的人IGKVl-39/IGKJl VL区的噬菌体展示文库(De Kruif等,Biotechnol Bioeng.2010(106)741-50),以及基于MF5196的VH区的集合,所述VH区并入了潜在地可改善VH/VL界面的氨基酸替换。表1中示出了每个位置的特定替换和允许的替选氨基酸。每个突变位置,还以相等的比例引入所有指定的替换以及原始氨基酸。
表1
使用HBP-ALL细胞和/或重组人CD3δε-Fc蛋白,使用本领域技术人员已知的程序在一轮或两轮中选择来自这些噬菌体展示文库的噬菌体。化学洗脱结合噬菌体,并用于再次感染细菌。在挑取若干存活细菌菌落后,释放噬菌体,并通过流式细胞术筛选与细胞表面表达的CD3/TCR复合物的结合。对所有显示CD3结合的噬菌体进行菌落PCR以扩增和测序VH区。
VH基因的分析揭示了哪个替换变体保留了CD3结合。所选MF5196_VH变体具有以下替换:QSYL中的A50,LIVFRANEHST中的D59,NIHQLRYESTDKV中的A61,和/或MY中的F105(表2)。相比之下,表1中列出的H35、Y102、N103和W104的替换是不允许的,因为所有选择的CD3结合变体在35位、102位、103位和104位处保留了原始氨基酸。这表明H35、Y102、N103和W104残基是CD3结合的关键氨基酸。
MF5196_VH的CD3结合变体的实例是MF5603_VH、MF5616_VH、MF5626_VH、MF5630_VH、MF5648_VH、MF5661_VH和MF5694_VH,其均与重排的人IGKVl-39/IGKJl VL区组合。这些MF的VH序列在图25中列出。通过如上所述的流式细胞术测试这些单特异性IgG形式的MF变体与HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合,表明所有这些实例都与CD3结合(图26)。作为其固有稳定性的实例,根据实施例1中所述的程序进行通过CIEX-HPLC来分析PG5661,得到的色谱图在图27中示出。色谱图显示具有约20分钟保留时间的主峰,类似于PG5196所示的谱。
表2
实施例5B
基于MF5196 VH,设计噬菌体展示文库以获得另外的稳定的CD3结合Fab。产生了包含重排的人IGKVl-39/IGKJl VL区的噬菌体展示文库(De Kruif等,BiotechnolBioeng.2010(106)741-50),以及MF5196的重链CDR3区融合的VH3-33变体的集合。
使用HBP-ALL细胞和/或重组人CD3δε-Fc蛋白,使用本领域技术人员已知的程序在一轮或两轮中选择来自这些噬菌体展示文库的噬菌体。化学洗脱结合噬菌体,并用于再次感染细菌。在挑取若干存活细菌菌落后,释放噬菌体,并通过流式细胞术筛选与细胞表面表达的CD3/TCR复合物的结合。对所有显示CD3结合的噬菌体进行菌落PCR以扩增和测序VH区。
MF5196_VH的所得另外的CD3结合变体的实例是MF5351_VH、MF5354_VH和MF5356_VH(在图28中列出),其均与重排的人IGKVl-39/IGKJl VL区组合。
通过如上所述的流式细胞术测试这些单特异性IgG形式的MF变体与HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合,表明所有这些实例都与CD3结合(图29)。
实施例6:CD3xCLEC12A双特异性IgG形式的MF5196 Fab的功能表征
为了检查MF5196 Fab的功能活性,将该CD3 Fab和MF3056 CD3 Fab与作为固定臂的CLEC12A Fab MF4327一起表达。如WO2014/051433中所述,CD3xCLEC12A双特异性IgG以全长双特异性IgG形式表达,包括在235-236位改造的下铰链/CH2(称为DM-Fc,Fc区中的CH2双重突变(double mutation))。像MF3056和MF5196一样,MF4327 Fab使用人IGKV1-39/IGKJl轻链。在专利申请WO2014/051433中给出了MF4327 Fab序列。首先,使用CD3+HPB-ALL细胞和CLEC12A+HL-60细胞通过流式细胞术(根据WO2014/051433中先前描述的程序)证明5196x4327DM-Fc bsAb与CD3和CLEC12A的结合。包括3056x4327 DM-Fc bsAb作为参照,并包括不相关的IgG1同种型对照PG1337作为对照(图16)。这两种CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb结合膜表达的CD3和HPB-ALL,5196x4327 DM-Fc bsAb具有稍微改善的结合。
接下来,测试了5196x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb的功能活性。首先,用健康供体静息T细胞研究T细胞刺激能力。根据专利WO2014/051433中描述的程序获得纯化的静息T细胞。随后如WO2014/051433中所述,将纯化的静息T细胞与来自白血病衍生HL-60细胞系的细胞在10%人血清(HS)中以5:1的效应物:靶细胞比孵育2天。包括3056x4327 DM-Fc bsAb作为参照。作为阴性对照,包括基准IgG同种型对照IgG(对照IgG)和5196x1337 DM-FcbsAb。5196x1337 DM-Fc bsAb用一个臂(MF5196)结合CD3,并用第二臂(MF1337)结合破伤风类毒素(TT),并被包括以检查MF5196潜在的脱靶诱导活性。以1000ng/mL测试bsAb和对照IgG。T细胞活化数据表示为CD4阳性或CD8阳性T细胞群内CD69阳性细胞的百分比(图17)。5196x4327 DM-Fc bsAb诱导CD4和CD8 T细胞的活化,如通过CD69早期活化标志物的上调所反映的。3056x4327 DM-Fc bsAb也诱导CD4和CD8 T细胞上CD69的上调,然而与5196x4327DM-Fc bsAb相比程度较低。在两个T细胞亚群中观察到的CD69的上调是CLEC12A抗原特异性的,因为5196x1337 DM-Fc bsAb不诱导CD69的上调。
该分析显示5196x4327 DM-Fc bsAb能够诱导CD4和CD8 T细胞的抗原特异性活化,略优于3056x4327 DM-Fc bsAb(图17)。5196x4327 DM-Fc bsAb诱导的T细胞活化是CLEC12A特异性的,因为对照5196x1337DM-Fc bsAb不诱导T细胞活化。综合来看,这表明导致CD3结合MF5196Fab的HCDR2 N至A的氨基酸替换完全保留了CLEC12A特异性T细胞活化。
为了研究5196x4327相对于3056x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb的T细胞活化程度是否足以诱导靶细胞裂解,用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记HL-60细胞,并在10%HS的存在下与来自健康供体的T细胞以5:1的效应物:靶细胞比共培养。包括5196x1337 CD3xTT DM-Fc bsAb以检查潜在的脱靶裂解。在从1,000ng/ml开始的4倍稀释范围内测试双特异性IgG。两天后,通过流式细胞术定量存活的CFSE阳性HL-60细胞。结果表示为相对于PBS对照条件的特异性裂解的百分比(图18)。
该分析显示5196x4327 DM-Fc bsAb完全保留了诱导CLEC12A抗原特异性靶细胞裂解的能力。出人意料地,5196x4327 DM-Fc的效力比3056x4327 DM-Fc bsAb显著更好。
总之,该实施例显示MF5196 Fab是功能性的,因为5196x4327CD3xCLEC12A DM-FcbsAb有效诱导CLEC12A抗原特异性T细胞活化和CLEC12A+HL-60细胞的裂解。此外,该实例显示,与3056x4327 DM-Fc bsAb相比,5196x4327 DM-Fc bsAb具有改善的效力。
实施例7:5196x4327 DM-Fc bsAb的抗CD3和抗CLEC12A臂的亲和力
使用BIAcore T100通过表面等离子体共振(SPR)技术测量MF5196CD3和MF4327CLEC12A Fab对其靶标的亲和力。使用游离胺化学(NHS/EDC)将抗人IgG小鼠单克隆抗体(Becton and Dickinson,cat.Nr.555784)偶联在CM5传感器芯片的表面。然后将5196x4327DM-Fc bsAb捕获到该传感器表面上。随后,将重组纯化的抗原人CLEC12A(Sino BiologicalInc,cat.Nr.11896-H07H)和人CD3δε-Fc蛋白在浓度范围内在传感器表面上运行以测量结合速率和解离速率。在每个循环之后,通过HCl脉冲再生传感器表面,并再次捕获5196x4327DM-Fc bsAb。从获得的传感图中,使用BIAevaluation软件确定结合速率和解离速率。
这些数据(图19)显示,5196x4327 DM-Fc bsAb对于人CLEC12A具有3nM的亲和力,对CD3具有177nM的亲和力。这表明在5196x4327DM-Fc bsAb中,CLEC12A臂的亲和力比人CD3结合臂的亲和力高约60倍。
表3:与人CD3和人CLEC12A结合的结合速率和解离速率以及亲和力值。
该值是三次测量的平均值。KD:亲和力(平衡解离)常数。
实施例8:5196x4327 DM-Fc bsAb在原代AML患者样品中诱导AML胚细胞裂解的效力
实施例6中显示5196x4327 DM-Fc bsAb有效诱导通过健康供体来源的T细胞的HL-60靶细胞裂解。在专利WO2014/051433中,发明人示出CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb能够以5:1的效应物:靶标比诱导自体AML患者来源的T细胞对AML胚细胞的裂解。这里检查了CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb,更具体地5196x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb以低效应物靶标比(T细胞与AML胚细胞的比)诱导原代AML样品中AML胚细胞的裂解的效力。
将诊断时获得的AML患者样品(来自AML FAB分类M1、M2、M4、M4/M5,表4)解冻,并通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD14、CD33、CD34、CD45和7AAD表征T细胞和AML胚细胞级分。分析的AML样品具有1:7-1:40的效应物与靶标比。
随后,将原代AML患者骨髓样品培养在IMDM培养基中,所述培养基补充有10%正常HS加20ng/mL IL-15(Miltenyi,#130-095-766)、2.5ng/mL GM-CSF(Immunotools,#11343125)、12.5ng/mL G-CSF(描述在Norde等,2009中)、6.25ng/mL IL-3(Immunotools,#11340035)、3.0ng/mL SCF(Immunotools,#11343325)和2.5ng/mL Flt3L(Immunotools,#311340035)。测试的条件包括PBS、同种型对照Ab WT-Fc、5196x4327DM-Fc bsAb、5196x1337DM-Fc bsAb和阳性对照CD3 WT-Fc Ab(所有抗体为1,000ng/mL)。培养七天后,使用与第0天所用相同的标志物通过流式细胞术分析测定T细胞扩增和AML胚细胞杀伤。结果表示为相对于PBS条件的T细胞扩增倍数或AML胚细胞裂解的频率。
这些数据(表4和图20)证明,7天后,5196x4327 DM-Fc bsAb有效诱导T细胞扩增(5-30倍T细胞扩增)。更重要的是,这些数据显示,在5/5测试的原代AML患者样品中,甚至是在具有非常低的效应物与靶标比的AML样品中,5196x4327 DM-Fc bsAb有效诱导患者AML肿瘤细胞的裂解(26-88%)。
表4
在诊断时采集的另外的AML患者样品中分析5196x4327 DM-Fc bsAb诱导T细胞增殖和AML胚细胞裂解的效力。
将诊断时采集的AML患者样品(来自AML FAB分类M1、M2、M4、M4/M5,表5)解冻,并通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD14、CD33、CD34、CD45和7AAD表征T细胞和AML胚细胞级分。分析的AML样品具有1:3-1:97的效应物与靶标比。随后,如实施例8中所述培养原代AML患者样品。测试的条件包括PBS、同种型对照Ab WT-Fc、5196x4327DM-Fc bsAb、5196x1337 DM-FcbsAb和阳性对照CD3 WT-Fc Ab(所有抗体为200ng/mL)。培养7天和10天后,使用与第0天所用相同的标志物通过流式细胞术分析测定T细胞扩增和AML胚细胞杀伤。结果表示为相对于PBS条件的T细胞扩增倍数或AML胚细胞裂解的频率。
这些数据(表5)证明,10天后,5196x4327 DM-Fc bsAb有效诱导T细胞扩增(7-226倍T细胞扩增)。更重要的是,这些数据显示,在6/8测试的原代AML患者样品中,甚至是在具有1:45-1:97的非常低的效应物与靶标比的AML样品中,5196x4327 DM-Fc bsAb有效诱导患者AML肿瘤细胞的裂解(38-99%)。
表5
实施例9
使用差示扫描量热法(DSC)来测量本文描述的IgG结构域的热稳定性。使用Originv7.0(VPViewer和VPAnalyzer)软件在MicroCal VP-DSC上进行DSC实验。首先用pH 6.5的10mM磷酸盐、150mM NaCl缓冲液对抗体进行透析。在通过UV吸收测定的0.25mg/mL的蛋白质浓度下分析IgG样品,使用透析缓冲液作为参照样品。从50℃至95℃以扫描速率1℃/min进行扫描,并使用GraphPad Prism 5和Microsoft Excel 2010软件进行分析。
野生型(WT)IgG1的DSC分析产生如图21所示的两个峰(表示为CH2|CH3的WT|WT)。在70.9℃的Tm1对应于CH2结构域的熔解,而在85.0℃(Tm2)的峰表示Fab和CH3结构域的熔解。具有在CH2结构域(DM|WT)中包含两个突变(L235G,G236R)的相同Fab的IgG1的DSC图显示非常相似的在85.0℃的Tm2峰。然而,Tm1峰转移到73.5℃,表明这些突变显著提高了CH2结构域的稳定性。由于CH2结构域不仅是WT IgG1的最脆弱结构域,而且也是CH3工程化的双特异性IgG1的最脆弱结构域,因此可以推断L235G、G236R工程化的CH2结构域也赋予携带这些CH2突变的CD3xCLEC12A双特异性IgG抗体额外的稳定性。
Claims (36)
1.结合人CD3的抗体,所述抗体包含含有重链和轻链的重/轻(H/L)链组合,
其中所述重链包含可变区,所述可变区由选自以下的氨基酸序列组成:
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其在除CDR区以外的一个或更多个位置处具有0-10个保守氨基酸替换;
并且其中所述轻链包含IgVκ1-39/Jκ1的可变区,其在除CDR区以外的一个或更多个位置处具有0-5个氨基酸插入、缺失、替换、添加、或其组合,并且根据IMGT,所述轻链可变区包含CDR1氨基酸序列QSISSY、CDR2氨基酸序列AAS以及CDR3氨基酸序列QQSYSTPPT。
2.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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3.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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4.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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5.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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6.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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7.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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8.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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9.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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10.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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11.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAQIWYNARKQEYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS。
12.权利要求1所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
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13.权利要求12所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAMIWYDGKNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS。
14.权利要求13所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAQIYYDGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS。
15.权利要求14所述的抗体,其中所述重链包含可变区,所述可变区由以下氨基酸序列组成:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSKYGMHWVRQAPGKGLEWVAQIWHDGRKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS。
16.权利要求1至15中任一项所述的抗体,其中所述轻链可变区由以下氨基酸序列组成:
DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPSRFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK。
17.权利要求1至15中任一项所述的抗体,其是双特异性抗体。
18.权利要求16所述的抗体,其是双特异性抗体。
19.权利要求17所述的双特异性抗体,其包含权利要求1至16中任一项所限定的重/轻(H/L)链组合,以及结合肿瘤抗原的H/L链组合。
20.权利要求18所述的双特异性抗体,其包含权利要求1至16中任一项所限定的重/轻(H/L)链组合,以及结合肿瘤抗原的H/L链组合。
21.权利要求19所述的双特异性抗体,其中所述结合肿瘤抗原的H/L链组合结合CLEC12A。
22.权利要求20所述的双特异性抗体,其中所述结合肿瘤抗原的H/L链组合结合CLEC12A。
23.权利要求1至15中任一项所述的抗体或双特异性抗体,其是人抗体或人源化抗体。
24.权利要求17所述的双特异性抗体,其是人抗体或人源化抗体。
25.权利要求17所述的双特异性抗体,其包含具有相容性异二聚化结构域的两条不同的免疫球蛋白重链。
26.权利要求25所述的双特异性抗体,其中所述相容性异二聚化结构域是相容性免疫球蛋白重链CH3异二聚化结构域。
27.权利要求17所述的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体是具有突变体CH2和/或下铰链结构域的IgG抗体,以使得所述双特异性IgG抗体与Fc-γ受体的相互作用降低。
28.权利要求27所述的双特异性抗体,其中所述突变体CH2和/或下铰链结构域包含在235和/或236位处的氨基酸替换。
29.权利要求27所述的双特异性抗体,其中所述突变体CH2和/或下铰链结构域包含L235G和/或G236R替换。
30.权利要求17所述的双特异性抗体,其包含共同轻链。
31.权利要求1至15中任一项所述的抗体在制备用于治疗患有实体瘤或血液肿瘤的对象的药物中的用途。
32.权利要求31所述的用途,其中所述肿瘤选自急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B-ALL、T-ALL和套细胞淋巴瘤。
33.权利要求17所述的抗体在制备用于治疗患有实体瘤或血液肿瘤的对象的药物中的用途。
34.权利要求33所述的用途,其中所述肿瘤选自急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B-ALL、T-ALL和套细胞淋巴瘤。
35.权利要求18所述的抗体在制备用于治疗患有实体瘤或血液肿瘤的对象的药物中的用途。
36.权利要求35所述的用途,其中所述肿瘤选自急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B-ALL、T-ALL和套细胞淋巴瘤。
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