JP2018520169A

JP2018520169A - ヒトｃｄ３結合抗体

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Publication number: JP2018520169A
Application number: JP2018500711A
Authority: JP
Inventors: アレクサンデル・ベルトルト・ヘンドリック・バッケル; ピーテル・フォッコ・ファン・ロー
Original assignee: メルスナムローゼフェンノートシャップ
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2018-07-26
Anticipated expiration: 2036-07-08
Also published as: NZ739165A; CN108026174B; EP3757129A1; US10266593B2; EP3345928A1; HRP20181802T1; SI3115376T1; US20160368988A1; US20190211100A1; CA2991880A1; JP2022023228A; CN108026174A; MX2018000344A; US20180237523A1; US9914777B2; DK3115376T3; AU2016293942B2; EP3115376A1; HK1254029A1; RS57928B1

Abstract

本開示は、重鎖及び軽鎖を含むヒトCD3結合抗体であって、前記重鎖が、0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列: QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL EWVAA IWYX₁X₂RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED TAVYY CTRGT GYNWF DPWGQ GTLVT VSSを含む可変領域を含む、ヒトCD3結合抗体に関する。本開示はまた、本明細書上記に定義されるような重鎖を有する二重特異性抗体に関する。抗体の産生方法、抗体を産生する細胞及び抗体の(医学的)使用が提供される。

Description

本発明は、抗体の分野、特に治療用抗体の分野に関する。抗体は、ヒトの処置に使用することができる。更に詳細には、本発明は、腫瘍の処置のための抗体、好ましくは二重特異性抗体に関する。

ヒトCD3に結合するモノクローナル抗体は、ヒトにおける治療的使用のために開発された最初の抗体に含まれていた。モノクローナルCD3結合抗体は、概してその免疫抑制特質のために、例えば移植片拒絶反応に使用される。T細胞上のCD3及びがん細胞上の表面標的抗原に対して二重特異性の抗体は、T細胞受容体の特異性、共刺激、又はペプチド抗原の提示とは無関係に、任意の種類のT細胞をがん細胞に結合させる能力がある。そのような二重特異性T細胞会合抗体は、様々ながん及び腫瘍性成長の処置に大いに有望である。

WO2014/051433(参照により本明細書に組み込まれる)は、T細胞会合分子として作用する二重特異性抗体の生成における基本単位として役立つ適切な候補であるCD3 mAbを記載している。これらのCD3 mAbは、3056及び3896と称され、これらのmAbのVH及びVL配列は図22に開示されている。3056 CD3 mAb及び3896 CD3 mAbの両方は、機能活性に関して良好な特性を有する。それらは、ヒトT細胞株で細胞表面に発現しているCD3/TCRに、周知のマウス抗CD3抗体mOKT3の親和性(KD)よりも有意に低い親和性で結合し、その結果、CD3^POS細胞に関するフローサイトメトリー分析においてより低い平均蛍光強度が生じる。同様にそれらは、組織培養プレート上に固定化されたときに、T細胞の増殖を誘導するが、mOKT3と比較して程度は低い。

理論に縛られることなしに、mOKT3の親和性よりも有意に低いCD3の親和性が二重特異性T細胞会合形式において好ましいと考えられる。二重特異性抗体が、腫瘍抗原に対する結合親和性よりも低い親和性でCD3に結合することが好ましい。理論に縛られることなしに、この親和性の差異は二重特異性抗体による腫瘍細胞の優先的なオプソニン化を可能にすることによって、近くに存在するNK細胞及び/又はT細胞を含む免疫エフェクター細胞による破壊のために腫瘍細胞を標識すると考えられる。

本発明者らは、3056抗体を用いて得られた結果がバッチ間変動を示すことを観察した。抗体3056と同じVH配列を有するが、異なる軽鎖を有する抗体15C3(WO2005/118635に記載)では変動が生じなかったため、このことは、本発明者らを驚かせた。

WO2014/051433 WO2005/118635 WO2004/009618 WO2009/157771 米国特許出願第20030078385号 US13/866,747(US9,248,181) US14/081,848(US9,358,286) PCT/NL2013/050294(WO2013/157954)

Bakker A.ら、Cancer Res. 2004年、64、8843〜50頁 A.S. Marshallら、J Biol Chem 2004年、279、14792〜802頁 Y.Hanら、Blood 2004年、104、2858〜66頁 C.H. Chenら、Blood 2006年、107、1459〜67頁 Van Rhenenら、2007年Blood 110 Moshaverら、2008年Stem Cells 26:3059頁 Oncogene. 2013年5月23日;32(21):2670-81. doi: 10.1038/onc.2012.280. Epub 2012年7月16日 Spiess、C.ら、Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol. Immunol. (2015年) http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003 Cuiら、JBC 2012年(287) 28206〜28214頁 Kontermann、MABS 2012年(4) 182〜197頁 Chames及びBaty、MABS 2009年(1) 539〜547頁 Mooreら、Blood 2011年(117) 4542〜4551頁 Lofflerら、2000年、Blood 95:2098頁 Zeidlerら、1999年、J. Immunol. 163:1246頁 Gunasekaranら、JBC 2010年(285) 19637〜19646頁 Saliら、1993年: J. Mol. Biol. 234、779〜815頁 Liuら、Journal of Pharmaceutical Sciences、第97巻、2426〜2447頁(2008年) De Kruifら、Biotechnol Bioeng. 2010年(106)741〜50頁

本発明の目的は、種類が本質的に同じであるCD3結合特性を有し、必ずしも量ではなく、改善された特徴を有する抗体3056の変種を提供することである。

本発明は、重鎖及び軽鎖を含む、ヒトCD3と結合する抗体であって、前記重鎖が、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む可変領域を含む、抗体を提供する。

本発明は、更に、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
をコードする核酸分子を提供する。

本明細書記載の抗体における組合せX₁及びX₂は、好ましくはX₁=N及びX₂=Aである。

本発明は、更に、抗体を発現する、かつ/又は核酸分子を含む細胞を提供する。

特に別段に規定しない限り、本発明の抗体は、好ましくは二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、好ましくは少なくともヒトCD3と結合する。加えて二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト腫瘍細胞上に優先的に発現される表面分子と少なくとも結合する。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、BCMA、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CD44、CD123、CD138、CEA、CLEC12A、CS-1、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、DLL3、LGR5、MSLN、FOLR1、FOLR3、HER2、HM1.24、MCSP、又はPSMAに結合する。より好ましい実施形態では、二重特異性抗体はCLEC12Aに結合する。

本発明は、更に、本発明による抗体を含む医薬組成物を提供する。

更に、標識、好ましくはin vivoイメージング用の標識を更に含む、本発明による抗体が提供される。

本発明はまた、対象に本発明による二重特異性抗体を投与する工程を含む、腫瘍を有する又は腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法を提供する。腫瘍を有する又は腫瘍のリスクがある対象の処置に使用するための、本発明による二重特異性抗体も提供される。更に、腫瘍を有する又は腫瘍のリスクがある対象の処置のための医薬を調製するための、本発明の抗体の使用が提供される。好ましい実施形態では、腫瘍はCLEC12A陽性腫瘍である。

PG3055及びPG3056のIEFを示す図である。 PG3055及びPG3056のCEX-HPLC分析を示す図である。 CEX-HPLC分析によって分析されたPG3055及びPG3056のバッチ間変動及び安定性を示す図である。左は3055のバッチの経時性、右は3056のバッチの経時性であり、上の試料は-80℃で>3ヶ月間保存し、下の試料は2〜8℃で>3ヶ月間保存した。 IMDM+10%FBS培地中2〜8℃又は37℃で7日間インキュベートしたときの精製ヒトT細胞上のCD3へのPG3055及びPG3056の結合性についてのフローサイトメトリー分析を示す図である。PG3055及びPG3056:IMDM+10%FBS培地中2〜8℃で7日間インキュベートした。PG3055 37℃及びPG3056 37℃:PG3055及びPG3056は、IMDM+10%FBS培地中37℃で7日間インキュベートした。左:可変ドメインを拡大したPG3056 Fabの相同性モデルを示す図である。VLは薄い灰色、VHは黒、HCDR1〜3ループは薄い灰色。HCDR2において脱アミドモチーフを形成する残基Asn54及びGly55を示す。右:PG3055(薄い灰色)及びPG3056(濃い灰色)のFabの相同性モデルの重ね合わせを示す図である。 VH MF3056(MF3056_VH)とVH3-33生殖系列配列とのアライメントを示す図である。 VH MF3056とVH MF3872、MF3873及びMF3905とのアライメントを示す図である。 HPB-ALL細胞上のCD3への変種PG3872、PG3873及びPG3905の結合性についてのフローサイトメトリー分析を示す図である。PG3056をベンチマーク対照として含めた。 MF3056のVHとMF3874、MF3878、MF3883、MF3886及びMF3891のVHとのアライメントを示す図である。 HPB-ALL細胞上のCD3への変種PG3874、PG3878、PG3883、PG3886及びPG3891の結合についてのフローサイトメトリー分析を示す図である。PG3056をベンチマーク対照として含めた。 PG3891のCEX-HPLC分析を示す図である。 MF3056のVHとMF5192〜5197のVHとのアライメントを示す図である。 HPB-ALL細胞上のCD3への変種PG5192〜5197の結合についてのフローサイトメトリー分析を示す図である。PG3056をベンチマーク対照として含めた。 PG5196p06のIEF分析を示す図である。 PG5196のCEX-HPLCクロマトグラムを示す図である。膜発現したCD3(HPB-ALL)及びCLEC12A(HL-60)への5196×4327DM-Fc bsAbの結合を示す図である。 5196×4327DM-Fc bsAbが初期活性化マーカーCD69のアップレギュレーションによって反映されるCD4 T細胞及びCD8 T細胞のCLEC12A特異的活性化を維持したことを示す図である。bsAb及び対照IgGを1000ng/mLで検査した。T細胞活性化のフローサイトメトリーデータをCD4+T細胞集団又はCD8+T細胞集団内のCD69陽性細胞の率として表現する。HD1及びHD2は、異なる健康なドナーから得られたT細胞を使用した2つの異なる実験を反映している。 5196×4327が抗原介在性標的細胞溶解を誘導したことを示す図である。固定化5196×4327 DM-Fc bsAbへのCD3δε-Fc(A)及びCLEC12Aタンパク質(B)の結合速度及び解離速度を示すセンサーグラムである。センサーグラムに、応答(チップに結合したタンパク質の量(人為的単位))を時間(秒)の関数として示す。両方の欄に、抗原の濃度範囲を使用して得られたセンサーグラム(着色)及びBIAevaluationソフトウェアを使用して行ったそれぞれの曲線当てはめ(黒)を示す。共培養の開始時(0日目)に原発性AML患者の試料を、フローサイトメトリーにより、CLEC12A発現、並びにT細胞及びAML芽球の画分について表現型分類したことを示す図である。5196×4327 DM-Fc bsAb又はアイソタイプ対照と共に7日間共培養後に、T細胞及びAML芽球の画分及び総数をフローサイトメトリー分析によって定量した。実施例9に記載のDSC分析を示す図である。 WO2005/118635に記載の抗体15C3の重鎖可変配列(VH)を示す図である。その特許公報は、抗体15C3の2つの変種を記載している。両方の変種は、同じ重鎖可変ドメインを有するが、この重鎖可変ドメインが2つの異なる軽鎖可変ドメインと組み合わされている。本明細書において抗体15C3が参照される場合、本図に示される重鎖可変ドメインを、本図に示される軽鎖可変ドメインL2と組み合わせて有する抗体が参照される。15C3のVHにL2軽鎖を足したFab産物は、本明細書において更にMF3055と称される。抗体PG3056は、本明細書に示されるVHを、本図に示される軽鎖可変領域IGKV1-39と組み合わせて有する。15C3のVHにIGKV1-39の軽鎖を足したFab産物は、更にMF3056と称される。本発明の抗体が、好ましくは共通軽鎖を有することを示す図である。A)共通軽鎖は、好ましくは本図に配列IGKV1-39として示されるアミノ酸配列を含む。B)好ましい実施形態では、共通軽鎖は、IGKV1-39/jk1又はIGKV1-39/jk5と示されるアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態では、共通軽鎖は、本図に示されるIGKV1-39/jk1のアミノ酸配列を含む。抗CLEC12A結合抗体のFab(MF4327)のVH領域のアミノ酸配列及び抗破傷風トキソイド(TT)結合Fab(MF1337)のVH領域のアミノ酸配列を示す図である。これらのVHは、図23に示される共通軽鎖のアミノ酸配列と一緒になって、それぞれCLEC12A及び破傷風トキソイドと結合するFabであるMF4327及びMF1337の可変ドメインを形成する。 MF5196のCD3結合変種の例は、MF5603、MF5616、MF5626、MF5630、MF5648、MF5661及びMF5694であり、これらは全て再編成されたヒトIGKV1-39/IGKJ1 VL領域を含む。FabのVHのアミノ酸配列を示す。フローサイトメトリーによって分析した場合のHPB-ALL細胞上の膜発現したCD3への、MF5196 VH;MF5603 VH;MF5616 VH;MF5626 VH;MF5630 VH;MF5648 VH;MF5661 VH及びMF5694 VH及び図23Bに示されるような共通軽鎖を含む抗体の結合性を示す図である。 PG5661のCIEX-HPLCクロマトグラムを示す図である。表示のようなそれぞれのVHを有する、再編成されたヒトIGKV1-39/IGKJ1 VL領域から構成されるCD3結合FabであるMF5351、MF5354及びMF5356を示す図である。 HPB-ALL細胞上に膜発現したCD3へのPG形式の結合を示す図である。これらの例の全てがCD3に結合した。

本発明の抗体は、好ましくは二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、好ましくは、少なくともヒトCD3と結合する。加えて二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト腫瘍細胞上に発現される表面分子と少なくとも結合する。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、BCMA、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CD44、CD123、CD138、CEA、CLEC12A、CS-1、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、DLL3、LGR5、MSLN、FOLR1、FOLR3、HER2、HM1.24、MCSP、又はPSMAに結合する。特に好ましい実施形態では、二重特異性抗体はCLEC12Aに結合する。

BCMAは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー17(TNFRSF17);TNFRSF13A2;B細胞成熟抗原;BCM;B細胞成熟因子;B細胞成熟タンパク質;CD269又はCD269抗原とも称される。Id: HGNC:11913; Entrez Gene: 608; Ensembl: ENSG00000048462; OMIM: 109545; UniProtKB: Q02223。

CD19は、CD19分子;T細胞表面抗原Leu-12;CD19抗原;CVID3;分化抗原CD19;B4;Bリンパ球表面抗原B4;Bリンパ球抗原CD19とも称される。Id: HGNC:1633; Entrez Gene: 930; Ensembl: ENSG00000177455; OMIM: 107265; UniProtKB: P15391。

CD20は、膜貫通4-ドメイン、サブファミリーA、メンバー1(MS4A1);MS4A2;CD20;S7;白血球表面抗原Leu-16;Bリンパ球抗原CD20;Bp35;Bリンパ球細胞表面抗原B1;CD20抗原;CD20受容体;CVID5;Bリンパ球表面抗原B1;B1;膜貫通4-ドメインサブファミリーAメンバー1;LEU-16とも称される。Id: HGNC: 7315; Entrez Gene: 931; Ensembl: ENSG00000156738; OMIM: 112210; UniProtKB: P11836。

CD30は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー8(TNFRSF8);Ki-1抗原;CD30;Ki-1;D1S166E;サイトカイン受容体CD30;白血球活性化抗原CD30;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー8;CD30L受容体;CD30抗原とも称される。Id: HGNC: 11923; Entrez Gene: 943; Ensembl: ENSG00000120949; OMIM: 153243; UniProtKB: P28908。

CD33は、CD33分子;SIGLEC-3;CD33抗原(Gp67);骨髄系細胞表面抗原CD33;シアル酸結合Ig様レクチン3;Siglec-3;SIGLEC3;CD33抗原及びgp67とも称される。Id: HGNC: 1659; Entrez Gene: 945; Ensembl: ENSG00000105383; OMIM: 159590; UniProtKB: P20138。

CD38は、CD38分子;T10;CD38抗原(P45);CADPrヒドロラーゼ1;ADP-リボシルシクラーゼ1;ADP-リボシルシクラーゼ/サイクリックADP-リボースヒドロラーゼ;NAD(+)ヌクレオシダーゼ;EC3.2.2.5;サイクリックADP-リボースヒドロラーゼ1;CD38抗原とも称される。Id: HGNC: 1667; Entrez Gene:952; Ensembl: ENSG00000004468; OMIM: 107270; UniProtKB: P28907。

CD44は、CD44分子(インド人血液型(Indian Blood Group));IN;MDU2;CD44抗原(ホーミング機能及びインド人血液型システム);MDU3;CDW44;MIC4;CSPG8;コンドロイチン硫酸プロテオグリカン8;HCELL;造血細胞E-及びL-セレクチンリガンド;MC56;細胞外マトリックス受容体III;Pgp1;ヘパラン硫酸プロテオグリカン;細胞表面糖タンパク質CD44;ヒアルロン酸受容体;エピカン(epican);食細胞糖タンパク質1;ホーミング機能及びインド人血液型システム;ECMR-III;CDw44;HUTCH-I;エピカン(Epican);LHR;PGP-1;CD44抗原;PGP-I;CP90リンパ球ホーミング/接着受容体;食細胞糖タンパク質I;ヘルメス抗原とも称される。Id: HGNC: 1681; Entrez Gene: 960; Ensembl: ENSG00000026508; OMIM: 107269; UniProtKB: P16070。

CD123は、細胞分裂周期123;細胞分裂周期123ホモログ;C10orf7;細胞分裂周期タンパク質123ホモログ;D123;タンパク質D123;HT-1080;CCEP123;PZ32;CEP89;細胞分裂周期123ホモログ(出芽酵母(S. Cerevisiae));FLJ14640;10番染色体オープンリーディングフレーム7とも称される。Id: HGNC:16827; Entrez Gene: 8872; Ensembl: ENSG00000151465; OMIM: 615470; UniProtKB: O75794。

CD138は、シンデカン1(SCD1);CD138;SDC;ヘパラン硫酸プロテオグリカン線維芽細胞成長因子受容体;シンデカンプロテオグリカン1;シンデカン;SYND1;シンデカン-1;CD138抗原とも称される。Id: HGNC:10658; Entrez Gene: 6382; Ensembl: ENSG00000115884; OMIM: 186355; UniProtKB: P18827。

CEAは、がん胎児抗原関連細胞接着分子5(CEACAM5);胎便抗原100;CD66e;がん胎児抗原;CD66e抗原とも称される。Id: HGNC:1817; Entrez Gene:1048; Ensembl: ENSG00000105388; OMIM:114890; UniProtKB: P06731。

CLEC12Aは、C型レクチンドメインファミリー12、メンバーA;C型レクチンタンパク質CLL-1;MICL;樹状細胞関連レクチン2;C型レクチンスーパーファミリー;骨髄抑制性C型レクチン様受容体;C型レクチン様分子-1;CLL-1;DCAL2;CLL1;C型レクチン様分子1;DCAL-2;キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーL、メンバー1(KLRL1);CD371(Bakker A.ら、Cancer Res. 2004年、64、8843〜50頁;GenBank(商標)受託番号:AY547296;Zhang W.ら、GenBank(商標)受託番号:AF247788;A.S. Marshallら、J Biol Chem 2004年、279、14792〜802頁;GenBank(商標)受託番号:AY498550;Y.Hanら、Blood 2004年、104、2858〜66頁;H.Floydら、GenBank(商標)受託番号:AY426759;C.H. Chenら、Blood 2006年、107、1459〜67頁)とも称される。Id: HGNC: 31713; Entrez Gene: 160364; Ensembl: ENSG00000172322; OMIM: 612088; UniProtKB: Q5QGZ9。CLEC12Aは、急性骨髄性白血病(AML)において、CD34陰性又はCD34低発現白血病幹細胞(サイドポピュレーション)を含む白血病芽細胞及び白血病幹細胞上に発現される抗原である(A.B. Bakkerら、Cancer Res 2004年、64、8443〜50頁;Van Rhenenら、2007年Blood 110:2659;Moshaverら、2008年Stem Cells 26:3059頁)。CLEC12Aの発現は、さもなければ造血系列に、特に末梢血及び骨髄中の骨髄系細胞に、すなわち顆粒球、単球及び樹状細胞前駆体に限定されると考えられる。より重要なことには、CLEC12Aは、造血幹細胞上に存在しない。この発現プロファイルは、CLEC12AをAMLにおける特に好都合な標的にする。全長形態のCLEC12Aは、大部分の他のアイソフォームに不在の10個のアミノ酸の追加的な細胞内ストレッチを含む275個のアミノ酸残基を含み、厳密に骨髄系の発現プロファイル(表面発現及びmRNAレベル)を示す。「CLEC12A又はその機能的等価物」という用語は、上記に参照される全ての(スプライス及び変異等の)変種並びにBakkerら、Cancer Res 2004年、64、8443〜50頁及びMarshall 2004年、J Biol Chem 279(15)、14792〜802頁に記載されるような厳密な骨髄系の発現プロファイル(表面発現レベル及びmRNAレベルの両方)を保持するそのアイソフォームを意味する。本発明のCLEC12A結合抗体は、ヒトCLEC12Aと結合する。本明細書においてCLEC12Aが参照される場合、特に別段に述べない限りヒトCLEC12Aが参照される。

CD3(分化クラスター3)T細胞共受容体は、タンパク質複合体であり、4つの異なる鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、CD3γ鎖、CD3δ鎖、及び2つのCD3ε鎖を含む。これらの鎖は、T細胞受容体(TCR)として知られる分子及びζ鎖と結合して、Tリンパ球において活性化シグナルを生成する。TCRα、TCRβ、ζ鎖、及びCD3分子は、一緒になってTCR複合体を形作る。CD3は、T細胞上に発現される。CD3と結合する抗体は、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖又はCD3δ/CD3ε若しくはCD3γ/CD3εの組合せと結合することができる。本発明のCD3結合抗体は、CD3ε鎖と結合する。CD3εは、様々な別名で知られており、そのいくつかは、「CD3e分子、イプシロン(CD3-TCR複合体)」;「CD3e抗原、イプシロンポリペプチド(TiT3複合体)」;T細胞表面抗原T3/Leu-4イプシロン鎖;T3E;T細胞抗原受容体複合体、T3のイプシロンサブユニット;CD3e抗原;CD3-イプシロン3;IMD18;TCREである。CD3E遺伝子に関するIdは、HGNC:1674; Entrez Gene:916; Ensembl: ENSG00000198851; OMIM: 186830及びUniProtKB: P07766である。CD3ε鎖を標的化する二重特異性CD3結合抗体は、異常細胞にT細胞を動員することに有効であると示されている。したがって、本発明による(二重特異性)抗体は、好ましくは、CD3εと結合する1つの重/軽鎖の組合せを含む。本発明のCD3結合抗体は、ヒトCD3と結合する。本明細書においてCD3が参照される場合、特に別段に述べない限りヒトCD3が参照される。

CS-1は、クエン酸シンターゼ;EC2.3.3.1;クエン酸シンターゼ、ミトコンドリア型;EC 2.3.3とも称される。Id: HGNC:2422; Entrez Gene:1431; Ensembl:ENSG00000062485; OMIM:118950; UniProtKB:O75390。

EGFRは、上皮成長因子受容体;赤芽球性白血病ウイルス(V-Erb-B)がん遺伝子ホモログ(トリ);ERBB1;PIG61;がん原遺伝子C-ErbB-1;トリ赤芽球性白血病ウイルス(V-Erb-B)がん遺伝子ホモログ;受容体型チロシンプロテインキナーゼErbB-1;細胞成長阻害タンパク質40;細胞増殖誘導タンパク質61;HER1;mENA;EC2.7.10.1;EC2.7.10;上皮成長因子受容体(トリ赤芽球性白血病ウイルス(V-Erb-B)がん遺伝子ホモログ)とも称される。Id: HGNC:3236; Entrez Gene:1956;Ensembl:ENSG00000146648; OMIM:131550; UniProtKB:P00533。

EGFRvIIIは、EGFRの一般的な変種である(Oncogene. 2013年5月23日;32(21):2670-81. doi: 10.1038/onc.2012.280. Epub 2012年7月16日)。

デルタ様3(DLL3)は、デルタ様3;ショウジョウバエ(Drosophila)デルタホモログ3;デルタ3;デルタ(ショウジョウバエ)様3;SCDO1とも称される。DLL3についてのIdは、HGNC: 2909; Entrez Gene: 10683; Ensembl: ENSG00000090932; OMIM: 602768及びUniProtKB: Q9NYJ7である。

LGR5は、ロイシン-リッチリピート含有Gタンパク質-共役受容体5である。遺伝子又はタンパク質についての代替名は、ロイシン-リッチリピート含有Gタンパク質-共役受容体5;ロイシン-リッチリピート-含有Gタンパク質-共役受容体5;G-タンパク質共役受容体HG38;G-タンパク質共役受容体49;G-タンパク質共役受容体67;GPR67;GPR49;オーファンGタンパク質-共役受容体HG38;Gタンパク質-共役受容体49;GPR49;HG38及びFEXである。LGR5と結合する、本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトLGR5と結合する。本発明のLGR5結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類オーソログとの間の配列及び三次構造類似性のために、そのようなオーソログとも結合する場合があるが、必ずしもそうではない。ヒトLGR5タンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース受託番号は、(NC_000012.12; NT_029419.13; NC_018923.2; NP_001264155.1; NP_001264156.1; NP_003658.1)である。

MSLN又はメソテリンは、メソテリン;プレプロ巨核球増強因子;CAK1抗原;MPF;可溶性MPFメソテリン関連タンパク質;巨核球増強因子及びSMRPとも称される。MSLNについてのIdは: HGNC:7371; Entrez Gene: 10232; Ensembl: ENSG00000102854; OMIM: 601051; UniProtKB: Q13421である。

葉酸受容体1は、FOLR1;葉酸受容体1;葉酸受容体1;卵巣腫瘍関連抗原MOv18;成体葉酸結合タンパク質;葉酸受容体、成体型;KB細胞FBP;FR-アルファ;FOLR;FBP;葉酸結合タンパク質;及び葉酸受容体1とも称される。FOLR1についてのIdは、HGNC: 3791; Entrez Gene 2348; Ensembl: ENSG00000110195; OMIM: 136430; UniProtKB: P15328である。

葉酸受容体3は、FOLR3;葉酸受容体3(ガンマ);FR-ガンマ;葉酸受容体3;ガンマ-HFR;及びFR-Gとも称される。FOLR3についてのIdは、HGNC:3795; Entrez Gene: 2352; Ensembl: ENSG00000110203; OMIM: 602469;及びUniProtKB: P41439である。

EPCAMは、上皮細胞接着分子;EGP40;M4S1;ESA;MIC18;KS1/4;腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子1;MK-1;TACSTD1;ヒト上皮糖タンパク質-2;TROP1;膜成分型4番染色体表面マーカー(35kD糖タンパク質);腺がん関連抗原;EGP;細胞表面糖タンパク質Trop-1;Ep-CAM;上皮糖タンパク質314;GA733-2;主要消化管腫瘍関連タンパク質GA733-2;M1S2;EGP314;CD326抗原;KSA;上皮細胞表面抗原;DIAR5;上皮糖タンパク質;HNPCC8;hEGP314;モノクローナル抗体AUA1により同定される抗原;KS1/4抗原;EGP-2;ACSTD1とも称される。Id: HGNC: 11529; Entrez Gene: 4072; Ensembl: ENSG00000119888; OMIM: 185535; UniProtKB: P16422。

HER2は、V-Erb-B2トリ赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ2;ERBB2;CD340;NGL;HER-2;HER-2/neu2;NEU2;TKR1;神経/神経膠芽腫由来がん遺伝子ホモログ;C-Erb B2/Neuタンパク質;転移性リンパ節遺伝子19タンパク質;ハースタチン;がん原遺伝子C-ErbB-2;神経芽腫/神経膠芽腫由来がん遺伝子ホモログ;がん原遺伝子Neu;受容体型チロシンプロテインキナーゼErbB-2;チロシンキナーゼ型細胞表面受容体HER2;V-Erb-B2赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ2、神経/神経膠芽腫由来がん遺伝子ホモログ;MLN 19;MLN19;p185erbB2;CD340抗原;EC2.7.10.1;EC2.7.10;V-Erb-B2トリ赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ2(神経/神経膠芽腫由来がん遺伝子ホモログ)とも称される。Id: HGNC: 3430; Entrez Gene: 2064; Ensembl: ENSG00000141736; OMIM: 164870; UniProtKB: P04626。

HM1.24は、BST2;骨髄間質細胞抗原2;テザリン(TETHERIN);BST-2;骨髄間質抗原2;HM1.24抗原;テザリン(Tetherin);CD317;CD317抗原;NPC-A-7とも称される。Id: HGNC:1119; Entrez Gene:684; Ensembl:ENSG00000130303; OMIM:600534; UniProtKB:Q10589。

MCSPは、精子ミトコンドリア関連システインリッチタンパク質(SMCP);MCSP;MCS;ミトコンドリア鞘セレンタンパク質;HSMCSGEN1;精子ミトコンドリア関連システインリッチタンパク質とも称される。Id: HGNC:6962; Entrez Gene:4184; Ensembl:ENSG00000163206; OMIM:601148; UniProtKB:P49901。

PSMAは、葉酸ヒドロラーゼ(前立腺特異膜抗原)1;FOLH1;NAALAD1;FOLH;mGCP;グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII;N-アセチル化アルファ結合型酸性ジペプチダーゼI;PSM;NAALADアーゼI;PSMA;EC3.4.17.21;グルタミン酸カルボキシラーゼII;GCP2;細胞成長阻害遺伝子27タンパク質;NAALADアーゼ;ホリルポリ-ガンマ-グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ;グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2;膜グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ;N-アセチル化アルファ結合型酸性ジペプチダーゼ1;プテロイルポリ-ガンマ-グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ;前立腺特異膜抗原変種F;FGCP;葉酸ヒドロラーゼ1;GCPII;前立腺特異膜抗原とも称される。Id: HGNC: 3788; Entrez Gene: 2346; Ensembl: ENSG00000086205; OMIM: 600934; UniProtKB: Q04609。

PSMAは、別名PSMA1でも公知のプロテアソーム(プロソーム、マクロパイン(Macropain))サブユニットアルファ型1と混同すべきでない。

受託番号は、主として標的のさらなる同定方法を提供するために与えられるものであり、結合しているタンパク質の実際の配列は、例えば、一部のがん等に出現する変異等の、コードする遺伝子における変異のために変動し得る。抗原結合部位は、抗原及びその多様な変種、例えば一部の抗原陽性免疫細胞又は腫瘍細胞によって発現されるものと結合する。

本明細書において遺伝子又はタンパク質が参照される場合、好ましくはヒト形態の遺伝子又はタンパク質が参照される。本明細書において遺伝子又はタンパク質が参照される場合、天然の遺伝子又はタンパク質、及び腫瘍、がん等から検出できるような、好ましくはヒトの腫瘍、がん等から検出できるような変種形態の遺伝子又はタンパク質が参照される。

本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトBCMA、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CD44、CD123、CD138、CEA、CLEC12A、CS-1、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、DLL3、LGR5、MSLN、FOLR1、FOLR3、HER2、HM1.24、MCSP、PSMAタンパク質又はその変種に結合する。言うまでもなく、抗原結合重/軽鎖の組合せは、好ましくは、抗原の細胞外部分と結合する。本発明による二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトCLEC12A又はその変種に結合する。本発明による好ましい二重特異性抗体は、ヒトCD3及びヒトCLEC12A又はその変種に結合する。

HGNCは、HUGO遺伝子命名法委員会のことである。略語の後の番号は、遺伝子及び遺伝子によってコードされるタンパク質に関する情報をHGNCデータベースから検索することができる受託番号である。Entrez Geneは、遺伝子又は遺伝子によってコードされるタンパク質に関する情報をNCBI(米国国立生物工学情報センター)のデータベースから検索することができる受託番号又は遺伝子IDを提供する。Ensembleは、遺伝子又は遺伝子によってコードされるタンパク質に関する情報をEnsembleデータベースから得ることができる受託番号を提供する。Ensemblは、選択された真核生物ゲノムに関する自動アノテーションを作成及び維持するソフトウェアシステムを開発するためのEMBL-EBIとWellcome Trust Sanger研究所との共同プロジェクトである。

好ましい実施形態では、軽鎖は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23Aに示されるO12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。語句「O12軽鎖」は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23Aに示されるような「O12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖」の略として本明細書全体にわたり使用される。IgVκ1-39は、免疫グロブリン可変カッパ1-39遺伝子の略である。この遺伝子は、免疫グロブリンカッパ可変1-39;IGKV139;IGKV1-39;O12a又はO12としても公知である。この遺伝子についての外部Idは、HGNC:5740; Entrez Gene:28930; Ensembl:ENSG00000242371である。IgVκ1-39についての好ましいアミノ酸配列を図23Aに示す。これは、V領域の配列を記載している。V領域は、5つのJ領域のうち1つと組み合わせることができる。図23B及び図23Cに、J領域と組み合わせたIgVκ1-39についての2つの好ましい配列を記載する。一緒になった配列は、IGKV1-39/jk1及びIGKV1-39/jk5と表示され;代替名は、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01(imgt.orgのIMGTデータベースワールドワイドウェブによる命名)である。

軽鎖可変領域を含むO12/IgVκ1-39*01が生殖系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むIGJκ1*01又はIGJκ5*01が生殖系列配列であることが更に好ましい。好ましい実施形態では、IGKV1-39/jk1又はIGKV1-39/jk5軽鎖可変領域は、生殖系列配列である。

好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、生殖系列O12/IgVκ1-39*01を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。好ましい実施形態では、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01を含む。軽鎖可変領域は、好ましくは、生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又は生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ5*01、好ましくは生殖系列IgVκ1-39*01/IGJκ1*01を含む。

O12軽鎖を有する抗体を産生する成熟B細胞は、多くの場合に、生殖系列配列、すなわち生物の非リンパ系細胞における正常な配列に関して1つ又は複数の変異を受けた軽鎖を産生する。これらの変異の原因となるプロセスは、体細胞(超)変異と称されることが多い。結果として生じる軽鎖は、親和性成熟した軽鎖と称される。そのような軽鎖は、O12生殖系列配列に由来する場合、O12由来軽鎖である。本明細書において、語句「O12軽鎖」は、O12由来軽鎖を含む。体細胞超変異によって導入される変異は、もちろん、実験室において人工的に導入することもできる。実験室では、必ずしも量としてではなく、種類としての軽鎖の特性に影響を及ぼさずに他の変異も導入することができる。軽鎖は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23A、図23B又は図23Cに示されるような配列を含む場合、少なくともO12軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23A、図23B又は図23Cに示されるような配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0〜5個、好ましくは0〜4個、より好ましくは0〜3個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23A、図23B又は図23Cに示されるような配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0〜2個、より好ましくは0〜1個、最も好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23A、図23B又は図23Cに示されるような配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、言及されたアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23A又は図23Bに示されるような配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、軽鎖は、図23Bの配列を含む。

抗体は、好ましくは二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、好ましくは、CD3と結合する、1つの重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)組合せ及びCD3上の抗原以外の抗原と結合する第2のVH/VL組合せを有する。好ましい実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。好ましい実施形態では、前記第1のVH/VL組合せにおけるVLは、前記第2のVH/VL組合せにおけるVLと類似している。より好ましい実施形態では、第1及び第2のVH/VL組合せにおけるVLは同一である。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、CD3と結合する1つの重/軽(H/L)鎖組合せ及び別の抗原、好ましくは腫瘍抗原と結合する1つのH/L鎖組合せを有する全長抗体である。好ましい実施形態では、前記第1のH/L鎖組合せにおける軽鎖は、前記第2のH/L鎖組合せにおける軽鎖と類似している。より好ましい実施形態では、第1及び第2のH/L鎖組合せにおける軽鎖は同一であり、すなわち、類似又は同一のヒト軽鎖は、異なる重鎖と組み合わせて機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる軽鎖である、いわゆる「共通軽鎖」である。好ましい実施形態では、前記第1のH/L鎖組合せにおける軽鎖は、前記第2のH/L鎖組合せにおける軽鎖可変領域と類似している軽鎖可変領域を含む。より好ましい実施形態では、第1及び第2のH/L鎖組合せにおける軽鎖可変領域は同一であり、すなわち、類似又は同一のヒト軽鎖可変領域は、異なる重鎖可変領域と組み合わせて機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる軽鎖可変領域である、いわゆる「共通軽鎖可変領域」である。共通軽鎖可変領域を含む軽鎖は、好ましくは共通軽鎖である。軽鎖は、好ましくは、本明細書の他の箇所に更に定義されるような0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図23Aに示されるようなO12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、共通軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒトレパートリーにおいてしばしば使用され、良好な熱力学的安定性、収率及び溶解性を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、本明細書上記のO12である。O12/IgVκ1-39についての好ましい配列を図23Aに示す。本
図に、V領域の配列を記載する。図23B及び図23Cに、J領域と組み合わせたIgVκ1-39についての2つの好ましい配列を記載する。一緒になった配列は、IGKV1-39/jk1及びIGKV1-39/jk5と表示され;代替名はIgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01である。

O12/IgVκ1-39*01軽鎖可変領域が生殖系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むO12/IgVκ1-39*01が生殖系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むIGJκ1*01又はIGJκ5*01が生殖系列配列であることが、更に好ましい。好ましい実施形態では、IGKV1-39/jk1又はIGKV1-39/jk5軽鎖可変領域は生殖系列配列である。二重特異性抗体のO12軽鎖は、好ましくは本明細書上記のO12軽鎖である。

腫瘍抗原は、その発現パターンによって定義される。腫瘍特異抗原は、概して腫瘍細胞上にのみ存在し、出生後の、好ましくは成体のヒト身体における任意の他の細胞上には存在しない。腫瘍関連抗原は、概して腫瘍細胞上及び出生後の、好ましくは成体のヒト身体における一部の正常細胞上にも存在する。本明細書に使用される腫瘍抗原は、概して腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原である。腫瘍抗原は、発がんプロセスに関与する場合も、関与しない場合もある。これは、健康な個体における「正常」タンパク質と異なる又は異ならない場合がある。その後、様々な腫瘍特異抗原が一部の他の非腫瘍形成性細胞上にも発現していることが示されたことに留意されたい。好ましい腫瘍抗原は、細胞表面上に発現され、細胞外部分を有する腫瘍抗原である。抗体は、概して、抗原の細胞外部分に結合する。

本明細書に使用される「抗体」という用語は、抗原上のエピトープと結合する1つ又は複数のドメインを含む、免疫グロブリンクラスのタンパク質に属するタンパク質性分子を意味し、ここで、そのようなドメインは、抗体の可変領域に由来する、又は抗体の可変領域と配列相同性を共有する。抗体は、概して、それぞれが2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する基本構造単位からできている。治療用の抗体は、処置されるべき対象の天然抗体(例えば、ヒト対象のヒト抗体)とできる限り近いことが好ましい。抗体の結合は、特異性及び親和性により表すことができる。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定するものである。親和性は、特定の抗原又はエピトープに結合する強さの尺度である。結合又は「特異的に認識する」は、少なくとも1×10e-6M、1×10e-7M、1×10e-8M、又は少なくとも1×10e-9Mの親和性(KD)を有する結合と定義される。治療適用のための抗体は、1×10e-10M又はいっそうより高い親和性を有し得る。本発明の抗体は、概して二重特異性抗体であり、ヒトIgGサブクラスの抗体である。好ましくは本発明の抗体は、ヒトIgG1サブクラスの抗体である。最も好ましくは、本発明の抗体は全長IgG分子である。本発明は、本発明の抗体の誘導体及び/又は類似体も提供する。そのような誘導体及び/又は類似体は、好ましくは本明細書の他の箇所に定義されるような共通軽鎖可変領域を含む、本発明の抗体のVH/VLドメインを有する。適切な誘導体は、単鎖Fv断片、モノボディー(monobody)、VHH及びFab断片である。誘導体は、抗体の重鎖のC_H2及びC_H3ドメインと融合されている場合がある。誘導体は、好ましくは更に抗体の重鎖のC_H1ドメイン及び抗体軽鎖のC_Lドメインを含む。誘導体は、多価形式、好ましくは二重特異性形式の可能性もあり、ここで、抗体のVH/VLドメインの1つは、本発明のCD3と結合する重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)組合せ及びCD3抗原ではない抗原と結合する、抗体の少なくとも1つの他のVH/VLドメインを含む。抗体の少なくとも1つの他のVH/VLドメインは、好ましくは、腫瘍抗原、好ましくはCLEC12Aと結合する。例えば、VH/VLドメイン間に適切な及び/又は従来的なペプチドリンカー又はスペーサーを有する又は有さない融合タンパク質として誘導体を産生することによって、多価形式は容易に産生される。

「二重特異性抗体」は、CD3と結合する1つの重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)組合せ及びCD3以外の抗原、好ましくは腫瘍抗原と結合する第2のVH/VL組合せを含む、本明細書上記の抗体である。好ましい実施形態では、前記の第1のVH/VL組合せにおけるVLは、前記の第2のVH/VL組合せにおけるVLと類似している。より好ましい実施形態では、第1及び第2のVH/VL組合せにおけるVLは、同一である。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、CD3と結合する1つの重/軽鎖組合せ及び別の抗原、好ましくは腫瘍抗原と結合する1つの重/軽鎖組合せを含む全長抗体である。

抗原への重/軽鎖組合せの結合は、重/軽鎖組合せの可変領域における抗原結合部位を介して達成される。

本発明はまた、Spiess、C.ら(Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol. Immunol. (2015年) http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)に記載されているもののような代替的な二重特異性形式も提供する。2つのH/L組合せを有する古典的抗体ではない二重特異性抗体形式は、本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む少なくとも1つの可変ドメインを有する。この可変ドメインは、第2の結合活性を提供する単鎖Fv断片、モノボディー、VHH及びFab断片に連結されている場合がある。

二重特異性抗体という用語は、本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する、CD3と結合する免疫グロブリン可変ドメイン及び別の抗原と結合する抗原結合(ポリ)ペプチドを含む、「二重特異性結合タンパク質」というより広い用語に置き換えられる場合がある。この実施形態では、結合(ポリ)ペプチドは、好ましくは、Spiessら(上記)に明記される(ポリ)ペプチドである。

本発明の二重特異性抗体では、CD3結合H/L鎖組合せにおける軽鎖は、好ましくは、CD3以外の抗原、好ましくは腫瘍抗原と結合することができるH/L鎖組合せにおける軽鎖と類似している。より好ましい実施形態では、両方のH/L鎖組合せにおける軽鎖は同一であり、すなわち、前記ヒト軽鎖は、異なる重鎖と組み合わせて機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる軽鎖である、いわゆる「共通軽鎖」である。好ましくは、共通軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒトレパートリーにおいてしばしば使用され、良好な熱力学的安定性、収率及び溶解性を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、O12、好ましくは再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はその断片若しくは機能的等価物(すなわち同じIgVκ1-39遺伝子セグメントであるが異なるIGJκ遺伝子セグメント)(imgt.orgのIMGTデータベースワールドワイドウェブによる命名)である。

本明細書に使用される「共通軽鎖」という用語は、二重特異性抗体における2つの軽鎖(又はそのVL部分)を表す。2つの軽鎖(又はそのVL部分)は、同一である又はいくつかのアミノ酸配列差異を有する場合がある一方で、全長抗体の結合特異性は影響されない。例として、例えば、保存的アミノ酸変化、すなわち重鎖と対形成したときに結合特異性に寄与しない又は部分的にのみ寄与する領域にアミノ酸変化を導入し、検査すること等によって、同一ではないが、なお機能的に等価の軽鎖を調製又は発見することは、本明細書に使用される共通軽鎖の定義の範囲内である。「再編成された」という用語が付加された又は付加されていない「共通軽鎖」、「共通VL」、「単一軽鎖」「単一VL」は、全て本明細書において互換的に使用される。

好ましくは、共通軽鎖は生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒトレパートリーにおいてしばしば使用される軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、O12、好ましくは再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はその断片若しくは機能的等価物(すなわち同じIgVκ1-39遺伝子セグメントであるが異なるIGJκ遺伝子セグメント)(imgt.orgのIMGTデータベースワールドワイドウェブによる命名)である。再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39軽鎖又は略してhuVκ1-39という用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される。明らかに、当業者は、「共通」が、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物も表すことを認識している。機能的結合領域の形成に著しく影響するわけではない変異(欠失、置換、挿入及び/又は付加)が存在する、前記軽鎖の多数の変種が存在する。本発明の軽鎖は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、本明細書上記に明示された軽鎖でもあり得る。

本発明の抗体は、好ましくはIgG抗体、好ましくはIgG1抗体である。本発明による「全長IgG」という用語は、本質的に完全なIgGを含むが、必ずしも無傷IgGの全ての機能を有するわけではないIgGとして定義される。疑義を避けるために、全長IgGは、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む。各鎖は、CH1、CH2、CH3、VH、及びCL、VLと称されるドメインに分解することができる定常(C)領域及び可変(V)領域を含む。IgG抗体は、Fab部分に含まれる可変領域ドメインを介して抗原に結合し、結合の後、定常ドメインを経由して、たいていFc部分を経由して免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。本発明による全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得るIgG分子を包含する。全長IgGは、領域のいずれの実質的な部分の欠失も有するべきでない。しかし、結果として生じるIgG分子の結合特徴を本質的に変更することなく1つ又は複数のアミノ酸残基が欠失されているIgG分子は、「全長IgG」という用語の中に包含される。例えば、そのようなIgG分子は、好ましくは非CDR領域に1から10個の間のアミノ酸残基の欠失を有する可能性があり、ここで、欠失されたアミノ酸は、IgGの結合特異性に必須ではない。

全長IgG抗体は、半減期が好都合であるために、及び免疫原性ゆえに完全自己(ヒト)分子に類似したままにしておきたいという望みのために使用される。ヒトにおける長い循環半減期を根拠に、IgG1が好まれている。ヒトにおける免疫原性を防止又は回避するために、本発明による二重特異性全長IgG抗体がヒトIgG1であることが好ましい。「二重特異性」という用語は、一方の重鎖及び軽鎖組合せ(H/L組合せ)又は抗体の腕が第1の抗原に結合し、他方のH/L組合せ又は他の腕が第2の抗原に結合することを意味し、ここで、前記第1及び第2の抗原は同一でない。抗原は、概して、抗体に関する標的として役立つ分子である。本発明において、抗原が個体の細胞の膜上に発現されるタンパク質であることが好ましい。本発明によれば、前記第1及び第2の抗原は、好ましくは2つの異なる細胞型に位置する2つの異なる分子上にある。「[抗体の]1つの腕」という用語は、好ましくは、全長IgG抗体の1つのFab部分を含む重鎖/軽鎖組合せを意味する。内因性免疫細胞を動員及び活性化することによって細胞傷害性を媒介する二重特異性抗体は、新興クラスの次世代抗体治療薬である。これは、標的細胞(すなわち腫瘍細胞)及びエフェクター細胞(すなわち、T細胞、NK細胞、及びマクロファージ)に対する抗原結合特異性を1つの分子において組み合わせることによって達成することができる(Cuiら、JBC 2012年(287) 28206〜28214頁;Kontermann、MABS 2012年(4) 182〜197頁;Chames及びBaty、MABS 2009年(1) 539〜547頁;Mooreら、Blood 2011年(117) 4542〜4551頁;Lofflerら、2000年、Blood 95:2098頁;Zeidlerら、1999年、J. Immunol. 163:1246頁)。本発明によれば、1つの重/軽鎖組合せが異常(腫瘍)細胞上のCLEC12A抗原と結合し、第2の重/軽鎖組合せが免疫エフェクター細胞上のCD3と結合する二重特異性抗体が提供される。

本発明は、1つの重/軽鎖組合せが、CLEC12A又は上述の10個のアミノ酸の追加的な細胞内ストレッチを欠如する機能的CLEC12A等価物を含むその機能的等価物を特異的に認識する二重特異性IgG抗体を提供する。1つの重/軽鎖組合せが全長形態のCLEC12Aと結合する二重特異性IgG抗体が好ましい。腫瘍抗原結合重/軽鎖組合せが腫瘍抗原の細胞外部分と結合することは、言うまでもない。

「可変領域ドメイン」、「可変領域」、「可変ドメイン」、「VH/VL対」、「VH/VL」、「VH」、「VL」、「Fab部分」、「Fab腕」、「Fab」又は「腕」という用語は、本明細書において互換的に使用される。

抗体による抗原結合は、概して、抗体の相補性領域並びに抗原及び可変ドメインの両方の特異的三次元構造により媒介され、抗体のランダムな非特異性固着とは対照的に、これら2つの構造を正確に一緒に結合させる(鍵穴と鍵に類似した相互作用)。抗体は、概して抗原のエピトープを認識するので、そしてそのようなエピトープは他のタンパク質にも同様に存在し得るので、CD3又はCLEC12Aと結合する本発明による抗体は、他のタンパク質が同じエピトープを含む場合、そのような他のタンパク質を認識し得る。したがって、「結合」という用語は、同じエピトープを含む別の1つ又は複数のタンパク質への抗体の結合を排除しない。本発明の抗体におけるCD3と結合する重/軽鎖組合せは、出生後の、好ましくは成体のヒトにおける細胞の膜上の他のタンパク質に結合しない。本発明のCLEC12Aと結合する重/軽鎖組合せは、出生後の、好ましくは成体のヒトにおける細胞の膜上の他のタンパク質と結合しない。

CD3及び腫瘍抗原と結合する本発明による二重特異性抗体は、下に更に詳細に概略を述べるように、少なくとも1×10e-6Mの結合親和性でCD3(好ましくはエフェクター細胞上のCD3)に結合する。好ましい実施形態では、CD3結合親和性は、1×10e-6M〜1×10e-10M、好ましくは1×10e-7M〜1×10e-9Mである。

CD3及び腫瘍抗原と結合する本発明による二重特異性抗体は、好ましくはCD3と結合する親和性よりも高い結合親和性で、腫瘍抗原に結合する。好ましい実施形態では、腫瘍細胞上の腫瘍抗原の結合親和性は、CD3への結合親和性の少なくとも2倍、より好ましくは4倍、より好ましくは6倍、又は10倍である。好ましい実施形態では、腫瘍抗原結合親和性は、1×10e-6M〜1×10e-10M、好ましくは1×10e-7M〜1×10e-10M、より好ましくは少なくとも1×10e-8M、好ましくは少なくとも1×10e-9Mである。好ましくは、表示された腫瘍抗原への結合親和性の少なくとも2分の1、より好ましくは4分の1、より好ましくは6分の1、又は10分の1であるCD3親和性で組み合わされている。好ましい実施形態では、腫瘍抗原結合親和性は、1×10e-8M〜1×10e-10Mである。

本明細書に使用される「異常細胞」という用語には、腫瘍細胞、より具体的には骨髄異形成症候群(MDS)を引き起こす細胞等の前白血病細胞及び急性骨髄性白血病(AML)腫瘍細胞又は慢性骨髄性白血病(CML)細胞等の白血病細胞も含む、血液起源の腫瘍細胞が含まれる。

本明細書に使用される「免疫エフェクター細胞」又は「エフェクター細胞」という用語は、標的細胞の生存度に影響するように活性化させることができる、哺乳類免疫系における細胞の天然レパートリー内の細胞を表す。免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性T細胞を含むT細胞、又はB細胞等のリンパ系列の細胞を含むが、単球又はマクロファージ、樹状細胞及び好中球性顆粒球等の骨髄系列の細胞も、免疫エフェクター細胞としてみなすことができる。したがって、前記エフェクター細胞は、好ましくは、NK細胞、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は好中球性顆粒球である。本発明によれば、異常細胞へのエフェクター細胞の動員は、免疫エフェクター細胞が異常標的細胞の近傍に導かれることにより、エフェクター細胞が、動員された先の異常細胞を直接死滅させる又は死滅を間接的に開始することができることを意味する。CD3結合抗体がエフェクター細胞表面のCD3と結合することが好ましい。

本発明のヒトCD3と結合する抗体は、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む重鎖可変領域を含む。

重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はその組合せを有する可能性がある。表示の配列に関するアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せは、もちろん、X₁X₂によって示される位置以外の位置だけにある。X₁X₂によって示される位置には、表示のアミノ酸だけが許される。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して、X₁X₂によって示される位置以外の位置に、0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4個、好ましくは0〜3個、好ましくは0〜2個、好ましくは0〜1個、及び好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はその組合せを含む。挿入、付加、欠失又は置換の組合せは、整列された配列が10個以下、好ましくは5個以下の位置で異なることを条件に請求されるような組合せである。整列された配列の一方におけるギャップは、他方の配列でスキップされたアミノ酸の数と同数である。

アミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せは、好ましくは重鎖可変領域のCDR3領域内になく、好ましくは重鎖可変領域のCDR1及び/又はCDR2領域内にない。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、表示の配列に関して欠失、付加又は挿入を含まない。この実施形態では、重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸置換を有する可能性がある。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。

X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む重鎖可変領域を含む、本発明のヒトCD3と結合する抗体は、好ましくは、図12、図25及び図28に示されるような番号5192;5193;5196;5197;5351;5354;5356;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体である。重鎖可変領域は、好ましくは、図12及び図25に示されるような番号5196;5197;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を含む。抗体の重鎖可変領域は、好ましくは、図12に示されるような番号5196によって識別されるアミノ酸配列を含む。

本発明は、更に、重鎖及び軽鎖を含む、本発明のヒトCD3と結合する二重特異性抗体であって、前記重鎖の重鎖可変領域が、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む、二重特異性抗体を提供する。

軽鎖は、好ましくは、本明細書の他の箇所に定義されるような共通軽鎖である。二重特異性抗体は、更に、別の抗原、好ましくは腫瘍抗原と結合する重鎖及び軽鎖の組合せを含む。別の抗原と結合する重鎖及び軽鎖の組合せの軽鎖は、好ましくは、本明細書の他の箇所に定義されるような共通軽鎖である。X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む重鎖可変領域を含む重鎖は、好ましくは、図12、図25及び図28に示されるような番号5192;5193;5196;5197;5351;5354;5356;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む重鎖である。二重特異性抗体の重鎖可変領域は、好ましくは、図12及び図25に示されるような番号5196;5197;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体の重鎖可変領域は、好ましくは、図12に示されるような番号5196によって識別されるアミノ酸配列を含む。

X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE
WVAAI WYX₁X₂R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT
AVYYC TRGTG YNWFD PWGQG TLVTV SS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む重鎖可変領域を含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは更にヒトCLEC12Aと結合する重/軽鎖組合せを含む。好ましい実施形態では、ヒトCLEC12Aと結合する重/軽鎖組合せの重鎖は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFT SYYMH WVRQA PGQGL
EWMGI INPSG GSTSY AQKFQ GRVTM TRDTS TSTVY MELSS LRSED
TAVYY CAKGT TGDWF DYWGQ GTLVT VSS;
EVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFT SYYMH WVRQA PGQGL
EWMGI INPSG GSTSY AQKFQ GRVTM TRDTS TSTVY MELSS LRSED
TAVYY CARGN YGDEF DYWGQ GTLVT VSS;又は
QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFT GYYMH WVRQA PGQGL
EWMGW INPNS GGTNY AQKFQ GRVTM TRDTS ISTAY MELSR LRSDD
TAVYY CARDG YFADA FDYWG QGTLV TVSS;
を含む可変領域を含む。

ヒトCLEC12Aと結合する重/軽鎖組合せの重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する可能性がある。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4個、好ましくは0〜3個、好ましくは0〜2個、好ましくは0〜1個及び好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを含む。挿入、欠失、付加又は置換の組合せは、整列された配列が5個以下の位置で異なることを条件に請求されるような組合せである。整列された配列の一方におけるギャップは、他方の配列でスキップされたアミノ酸の数と同数である。

本明細書記載のCD3重鎖可変領域におけるアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せは、好ましくはH35、A61、Y102、N103、及びW104並びにCDR3 VHにおける位置を不変のままにする。A50が改変される場合、好ましくはS、Y、M又はQによって置換される。D59が改変される場合、好ましくはY又はEによって置換されるが、L、I、V、F、R、A、N、H、S、TによるD59の置換も可能である。A61が置換される場合、好ましくはN、I、H、Q、L、R、Y、E、S、T、D、K、Vによって置換される。F105が改変される場合、好ましくはY又はMによって置換される。本発明のCD3 VHについて、H35、Y102、N103、及びW104残基はCD3結合に関連すると考えられる。A50、D59、A61及びF105位置での他の特異的置換も関連するが、CD3の結合に影響する必要がない。Table 2(表2)の2列目に、導入されたアミノ酸置換を挙げる。同様に回収された置換を3列目に記載する。導入されたが回収されなかったアミノ酸置換は、抗体に影響を及ぼすと考えられ、所望されない。例えば、A50I変異は所望されない。保存後に実施例5A記載の方法をCIEX-HPLCと一緒に使用して、許容されるアミノ酸置換を容易に見出すことができる。

アミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せは、好ましくは、重鎖及び軽鎖の結合インタフェース(binding interphase)には行われない。

アミノ酸がH/L鎖相互作用のインタフェースにおいて変化される場合、その変化と適応するように他方の鎖における対応するアミノ酸が変化されることが好ましい。アミノ酸の挿入又は付加は、好ましくはプロリンの挿入又は付加を伴わない。

アミノ酸の付加は、原則として挿入と同じと考えることができる。ポリペプチド鎖の末端の一方にアミノ酸を付加することは、時に、挿入ではなく厳密な付加(延長)とみなされる。本発明について、鎖内の付加又は末端の一方への付加の両方が挿入と見なされる。

アミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はその組合せは、好ましくは重鎖可変領域のCDR3領域になく、好ましくは重鎖可変領域CDR1又はCDR2領域にない。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、表示の配列に関して欠失、付加又は挿入を含まない。この実施形態では、重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜5個のアミノ酸置換を有する可能性がある。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。本発明のCD3結合VHのCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれCDR1についてアミノ酸配列GFTFSSYG(IMGTによる)、CDR2についてIWYNARKQ及びCDR3についてGTGYNWFDPを含む。本発明のCLEC12A結合VHのCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれCDR1についてアミノ酸配列GYTFTSYY、CDR2についてINPSGGST、及びCDR3についてGTTGDWFDYを含む。

軽鎖可変領域は、好ましくは生殖系列O12可変領域Vセグメントを含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖VセグメントIgVκ1-39*01を含む。特に好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ1*05を含む。最も好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01配列を含む。

本発明の二重特異性抗体において、両方の重鎖/軽鎖組合せについて軽鎖が同じであることが好ましい。そのような軽鎖は、「共通軽鎖」とも称される。本発明による「共通軽鎖」という用語は、同一である又はいくつかのアミノ酸配列差を有する一方で抗体の結合特異性を保持し得る軽鎖を表す。例として、例えば保存的アミノ酸変化、すなわち重鎖と対形成したときに結合特異性に寄与しない又は部分的にのみ寄与する領域にアミノ酸変化を導入し、検査すること等によって、本明細書に使用されるような共通軽鎖の定義の範囲内で、同一ではないが、なお機能的に等価の軽鎖を調製又は発見することが可能である。「再編成された」という用語が付加された又は付加されていない「共通軽鎖」、「共通VL」、「単一軽鎖」、「単一VL」という用語は、全て本明細書において互換的に使用される。異なる重鎖と組み合わせて機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができるヒト軽鎖を共通軽鎖として使用することは、本発明の一態様である(WO2004/009618、WO2009/157771、Merchantら、1998年、Nissimら、1994年)。好ましくは、共通軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒトレパートリーにおいてしばしば使用され、多数の異なるVH領域と対形成する優れた能力を有し、良好な熱力学的安定性、収率及び溶解性を有する軽鎖可変領域である。

好ましい実施形態では、共通軽鎖は、生殖系列O12/IgVκ1-39*01を含む軽鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。好ましい実施形態では、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01を含む。軽鎖可変領域は、好ましくは生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又は生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。好ましい実施形態では、生殖系列IgVκ1-39*01/IGJκ1*01を含む。明らかに、当業者は、「共通」が、アミノ酸配列が同一でない軽鎖の機能的等価物も表すことを認識している。機能的結合領域の形成に著しく影響するわけではない変異(欠失、置換、付加)が存在する、前記軽鎖の多数の変種が存在する。

好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK又はDIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4個、好ましくは0〜3個、好ましくは0〜2個、好ましくは0〜1個及び好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを含む。挿入、欠失、付加又は置換の組合せは、整列された配列が5個以下の位置で異なることを条件に請求されるような組合せである。整列された配列の一方におけるギャップは、他方の配列でスキップされたアミノ酸の数と同数である。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK又はDIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IKを含む。別の好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。

アミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せは、好ましくは軽鎖可変領域のCDR3領域になく、好ましくは重鎖可変領域のCDR1又はCDR2領域にない。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、表示の配列に関して欠失、付加又は挿入を含まない。この実施形態では、重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜5個のアミノ酸置換を有する可能性がある。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。本発明の抗体の軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1-39のCDR(IMGTによる)を含む。

本明細書上述のように、本発明の抗体が二重特異性抗体であることが好ましい。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書記載のCD3結合重/軽鎖組合せ及び腫瘍抗原と結合する重/軽鎖組合せを含む。好ましい実施形態では、腫瘍抗原結合重/軽鎖組合せはCLEC12Aと結合する。

本発明の(二重特異性)抗体の定常領域は、好ましくはヒト定常領域である。定常領域は、天然ヒト抗体の定常領域と1つ又は複数、好ましくは10個以下、好ましくは5個以下のアミノ酸差を含み得る。本明細書において産生される抗体の様々な可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインライブラリーに由来する。したがって、これらの可変ドメインは、ヒト性である。独特なCDR領域は、ヒトに由来する、合成である、又は別の生物に由来する場合がある。本発明の抗体又は二重特異性抗体は、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。

当技術分野において、抗体を産生するための様々な方法が存在する。抗体は、概して抗体をコードする核酸を発現する細胞によって産生される。抗体の産生に適切な細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞又はPER-C6細胞である。特に好ましい実施形態では、前記細胞はCHO細胞である。

様々な機関及び企業が、例えば臨床用の抗体の大規模産生のために細胞株を開発した。そのような細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞又はPER.C6細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生等の他の目的のためにも使用される。タンパク質及び抗体の工業規模の産生のために開発された細胞株は、本明細書において更に工業用細胞株と称される。好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体を産生する工業用細胞株を提供する。

本発明は、一実施形態では、本発明による抗体及び/又は本発明による核酸を含む細胞を提供する。前記細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的で、適切な細胞は、本発明による抗体及び/又は本発明による核酸を含むことができる、好ましくは産生することができる任意の細胞である。

本発明は、更に、本発明による抗体を含む細胞を提供する。好ましくは前記細胞(概してin vitro、単離又は組換え細胞)は、前記抗体を産生する。好ましい実施形態では、前記細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞又はPER.C6細胞である。特に好ましい実施形態では、前記細胞はCHO細胞である。更に、本発明による細胞を含む細胞培養物が提供される。様々な機関及び企業が、例えば臨床用の抗体の大規模産生のために細胞株を開発した。そのような細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞又はPER.C6細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生等の他の目的のためにも使用される。タンパク質及び抗体の工業規模の産生のために開発された細胞株は、本明細書において更に工業用細胞株と称される。したがって好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体の産生のための、抗体の大規模産生のために開発された細胞株の使用を提供する。本発明は、更に、請求されるような抗体のVH、VL、並びに/又は重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を含む抗体を産生するための細胞を提供する。好ましくは、前記核酸分子は、図12の数字5196によって識別されるVH、図24の数字4327によって識別されるVH又はその組合せをコードする。

本発明は、更に、本発明の細胞を培養する工程及び前記培養から抗体を回収する工程を含む、抗体を産生するための方法を提供する。好ましくは、前記細胞は、無血清培地中で培養される。好ましくは、前記細胞は、懸濁成長に適応されている。更に、本発明による抗体を産生するための方法によって得ることができる抗体が提供される。抗体は、好ましくは、培養培地から精製される。好ましくは、前記抗体は、アフィニティー精製される。

本発明の細胞は、例えばハイブリドーマ細胞株、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞、又は臨床目的の抗体産生に適切であることが公知の別の細胞型である。特に好ましい実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスE1領域又はその機能的等価物によって形質転換された細胞である。そのような細胞株の好ましい例は、PER.C6細胞株又はその等価物である。特に好ましい実施形態では、前記細胞はCHO細胞又はその変種である。好ましくは、抗体の発現のためにグルタミンシンセターゼ(GS)ベクター系を利用する変種である。

二重特異性抗体は、概して、この抗体をコードする核酸を発現する細胞によっても産生される。この場合、細胞は、二重特異性抗体を作り上げる異なる軽鎖及び重鎖を発現する。このために、細胞は、2つの異なる重鎖及び少なくとも1つの軽鎖を発現する。未改変の重鎖が相互に対形成してダイマーを形成することができるので、細胞は、概して二重特異性抗体(ヘテロダイマー)に加えて2種のモノクローナル抗体(ホモダイマー)を産生する。細胞が2つ以上の軽鎖を発現する場合、産生される抗体における可能な重/軽鎖組合せの数は増加する。産生される、異なる抗体種(異なる重鎖及び軽鎖の組合せ)の数を減らすために、上述した「共通軽鎖」が好ましい。

共通軽鎖及び等量の2つの重鎖を発現する抗体産生細胞は、概して、二重特異性抗体を50%及び単一特異性抗体(すなわち同一の重鎖軽鎖組合せを有する)をそれぞれ25%産生する。二重特異性抗体又は反対に単一特異性抗体の産生に好都合ないくつかの方法が公開されている。本発明において、細胞が、それぞれの単一特異性抗体の産生よりも二重特異性抗体の産生に好都合であることが好ましい。そのようなことは、概してホモダイマー化よりもヘテロダイマー化(すなわち他の重/軽鎖組合せの重鎖とのダイマー化)に好都合なように重鎖の定常領域を改変することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、2つの異なる免疫グロブリン重鎖を適合性ヘテロダイマー化ドメインと共に含む。様々な適合性ヘテロダイマー化ドメインが、当技術分野において記載されている(例えば、Gunasekaranら、JBC 2010年(285) 19637〜19646頁を参照されたい)。適合性ヘテロダイマー化ドメインは、好ましくは適合性免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロダイマー化ドメインである。当技術分野は、重鎖のそのようなヘテロダイマー化を達成することができる様々な方法を説明している。1つの方法は、「ノブイントゥホール(knob into hole)」二重特異性抗体を生成させることである。米国特許出願第20030078385号(Arathoonら、Genentech社)を参照されたい。

参照により本明細書に組み込まれるUS13/866,747(現在はUS9,248,181として発行)、US14/081,848(現在はUS9,358,286として発行)及びPCT/NL2013/050294(WO2013/157954として公開)に、適合性ヘテロダイマー化ドメインを使用して二重特異性抗体を産生するための方法及び手段が開示されている。これらの手段及び方法も、本発明に好都合に採用することができる。具体的には、本質的に二重特異性全長IgG分子だけを産生するための好ましい変異は、第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366K(Kabatによる付番)(「KK変種」重鎖)並びに第2のドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368E(「DE変種」重鎖)、又はその反対である。以前に、本発明者らのUS9,248,181及びUS9,358,286特許並びにWO2013/157954PCT出願において、DE変種及びKK変種が優先的に対形成してヘテロダイマー(いわゆる「DEKK」二重特異性分子)を形成することが実証された。DE変種重鎖又はKK変種重鎖のホモダイマー化(それぞれDEDEホモダイマー又はKKKKホモダイマー)は、同一の重鎖の間のCH3-CH3界面における荷電残基間の強い反発のためにほとんど起こらない。一実施形態では、CD3と結合する可変ドメインを含む重鎖/軽鎖組合せは、重鎖のKK変種を含む。この実施形態では、CD3以外の抗原と結合する可変ドメインを含む重鎖/軽鎖組合せは、重鎖のDE変種を含む。好ましい実施形態では、CD3以外の抗原はCLEC12Aである。好ましい実施形態では、CLEC12Aと結合する可変ドメインのVHは、図24に示されるようなMF4327_VHである。

例えばFc-受容体相互作用を減少させるため又はC1q結合を減少させるために、一部の抗体は、CH2/ヒンジ領域下流で改変される。一部の実施形態では、本発明の抗体は、変異型CH2及び/又はヒンジ下流ドメインを有することにより、Fc-ガンマ受容体への二重特異性IgG抗体の相互作用が減少しているIgG抗体である。そのような変異型CH2及び/又はヒンジ下流ドメインは、好ましくは、位置235及び/又は236(Kabatの付番)にアミノ酸置換、好ましくはL235G及び/又はG236R置換を含む。

本発明は、更に、必要とする対象に、重鎖及び軽鎖を含む、ヒトCD3と結合する二重特異性抗体を投与する工程を含む、対象におけるがん又はがんのリスクを処置する方法であって、前記重鎖が、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL
EWVAA IWYX₁X₂RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED
TAVYY CTRGT GYNWF DPWGQ GTLVT VSS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む可変領域を含み、前記抗体が、腫瘍抗原と結合する重鎖-軽鎖(H/L)組合せを含む、方法を提供する。

軽鎖は、好ましくは共通軽鎖可変領域を含む。前記共通軽鎖可変領域は、好ましくはO12/IgVκ1-39軽鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、好ましくは生殖系列O12/IgVκ1-39*01可変領域である。前記軽鎖可変領域は、好ましくはカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。軽鎖可変領域は、好ましくは生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。前記軽鎖可変領域は、好ましくは、0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK又はDIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。好ましくは腫瘍抗原と結合する重鎖/軽鎖(H/L)組合せは、CLEC12Aと結合する。

抗体は、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。好ましくは、抗体は、2つの異なる免疫グロブリン重鎖を適合性ヘテロダイマー化ドメインと共に含む。前記適合性ヘテロダイマー化ドメインは、好ましくは適合性免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロダイマー化ドメインである。前記二重特異性抗体は、好ましくは変異型CH2及び/又はヒンジ下流ドメインを有することにより、Fc-ガンマ受容体への二重特異性IgG抗体の相互作用が減少しているIgG抗体である。変異型CH2及び/又はヒンジ下流ドメインは、好ましくは位置235及び/又は236(Kabatの付番)にアミノ酸置換、好ましくはL235G及び/又はG236R置換を含む。抗体は、好ましくは共通軽鎖を含む。

重鎖及び軽鎖を含む、ヒトCD3と結合する二重特異性抗体であって、前記重鎖が、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL
EWVAA IWYX₁X₂RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED
TAVYY CTRGT GYNWF DPWGQ GTLVT VSS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む可変領域を含む、腫瘍抗原と結合する重鎖及び軽鎖を含む二重特異性抗体も提供される。

本発明は、更に、本発明の抗体若しくはその誘導体又は本発明の医薬組成物を必要とする対象の処置に使用するための、抗体若しくはその誘導体又は医薬組成物を提供する。腫瘍を有する又は腫瘍を有するリスクがある対象を処置するために、抗体が本発明の二重特異性抗体であることが好ましい。好ましくは、CD3結合抗体は、腫瘍抗原と結合する重/軽鎖組合せを含む。二重特異性抗体は、好ましくはCD3/CLEC12A結合抗体である。

固形腫瘍又は血液腫瘍の処置に使用するためのCD3/腫瘍抗原二重特異性抗体及びそのような二重特異性抗体を含む医薬組成物が提供される。好ましい固形腫瘍は、上皮起源のもの;卵巣及び子宮内膜腫瘍等の婦人科がん;前立腺がん、脳がん又は任意の他の固形腫瘍である。

骨髄系起源の様々な白血病及び前白血病疾患だけでなくB細胞リンパ腫の処置にも使用するための、本発明のCD3/腫瘍抗原二重特異性抗体若しくはその誘導体又はそのような二重特異性抗体若しくはその誘導体を含む医薬組成物も提供される。本発明により処置することができる疾患には、急性骨髄系白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)及び慢性骨髄性白血病(CML)等の骨髄系白血病又は前白血病疾患、並びにホジキンリンパ腫及び大部分の非ホジキンリンパ腫が含まれる。B-ALL;T-ALL、マントル細胞リンパ腫も、本発明の抗体を用いた処置に好ましい標的である。したがって、本発明は、医薬品として骨髄異形成症候群(MDS)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)又は好ましくは急性骨髄系白血病(AML)の処置に使用するための、本発明による二重特異性全長IgG抗体を提供する。MDS、CML、MM又は好ましくはAMLの処置又は予防のための医薬の調製における本発明による二重特異性IgG抗体の使用も提供される。腫瘍抗原がCLEC12Aであることが好ましい。

患者に投与されるべき本発明による抗体の量は、概して、治療効果を得るために十分な量が使用される一方で、その量が許容されない程度の副作用に至る閾値を超えないことを意味する治療ウインドウ内にある。所望の治療効果を得るために必要な抗体の量が少ないほど、治療ウインドウは概して大きい。したがって、低投薬量で十分な治療効果を発揮する本発明による抗体が好ましい。

毎年約30,000人の患者がヨーロッパ及び米国においてAMLと診断されている。これらの患者の大多数は、60歳以上である。高齢は、AMLにおける転帰の主要な負の決定要因であり、集中的に処置された高齢AML患者の長期生存率(5年時)は、約10%である。導入化学療法で寛解を達成したほぼ全ての患者において、疾患の進行が3年以内に観察される。現行の寛解後処置は、AMLを有する高齢患者においては、もしあるとしても限定的な価値を示している。したがって、残りの抵抗性白血病のかなりの負荷が残り、薬物耐性白血病細胞の生存亜集団が再発を急速に発生させる。完全寛解を誘導し、持続させるための取組みにおいて、これらの化学療法非応答性AML腫瘍細胞を標的化するために、完全に異なる作用機序を有する新規なタイプの薬物が必要である。完全寛解(CR)は、高齢AML患者の50%超及び若齢患者の約80%でいくつかの集中化学療法の組合せにより達成することができるものの、応答又は生存率の向上は、依然として主要な研究課題である。AMLを有する高齢患者における65件の無作為化臨床試験(15,110人の患者)の最近公開されたネットワークメタ分析において、修正された治験用導入レジメンの大部分は、ダウノルビシン及びシタラビンを用いた従来の3+7導入レジメンと比較して同様又はいっそう悪い有効性プロファイルを有する。このAMLの標準処置は高い罹病率及び死亡率にさえ関連する。CRにある患者の大多数は、化学療法後の残存白血病幹細胞が原因で再発する。さらなる用量増大は、許容されない毒性のため限定される。したがって、好ましくはより低い毒性を有する新たな処置様式の差し迫った必要が特に高齢AML患者に生じている。

化学療法非応答性AMLの処置は、二重特異性抗体を用いて患者自身の免疫系のT細胞をAML腫瘍細胞に方向付けし直し、続いてT細胞を腫瘍標的特異的に活性化させることによって達成することができよう。このプロセスは、いわゆる「T細胞会合アプローチ」としても公知である。このように、AML腫瘍細胞を攻撃して根絶するように患者の免疫系が強化及び再標的化される。本発明は、T細胞をAML腫瘍細胞に効率的に方向付けし直すことによってAML腫瘍細胞の溶解を誘導するCD3×CLEC12A二重特異性IgG抗体を提供する。したがって、CD3×CLEC12A二重特異性抗体は、AML患者の予後を改善するためにAML芽球及び白血病幹細胞を特異的に根絶する、より少ない副作用を伴う標的療法である。CLEC12Aは、白血病幹細胞(LSC)上に発現し、正常な造血幹細胞上には発現しないため、この抗原に対する治療法は、LSCを根絶する一方で正常幹細胞を残すと期待される。これらの全長IgG二重特異性抗体は、再発及び/又は難治性AML患者において臨床的に評価されている。臨床的有効性は、客観的奏効基準としての骨髄におけるAML芽球の減少を用いて分析されている。AML用の効果的な二重特異性IgGは、現在のところ利用可能な処置がない大きな患者セグメントのための新規な治療選択肢を提供する。長期寛解を達成する手段を提供することに加えて、この処置選択肢は、寛解中に適用すると、AMLを治癒する可能性も有する。最も可能性が高いことに、それは、微小残存病変(MRD)の状況において最大の影響を有する。MRDの根絶のために再発率が低下することが期待される。そこで、AML患者に対するこの新しい処置様式の影響は、より良い生活の質に関連する転帰の改善を招く、より低い再発率を有する、より毒性の低い処置であろう。

当技術分野において記載される抗体15C3及び3056は、同じ重鎖可変領域を共有するが、軽鎖可変領域が異なる。抗体3056のバッチにおいて抗体の結合能にバッチ間変動が観察された。これは、抗体15C3では確認されなかった。抗体の軽鎖が異なるので、この挙動差の理由は、軽鎖が異なることであろう。SDS-pageから、より活性の低い抗体を有するバッチでも3056抗体が無傷であったことが明らかとなった。抗体の可変ドメインの3Dモデル化から、2つの抗体の間でVH/VLドメインのフォールディングに幾分の変化があることが実際に明らかになった。これらの変化が抗体の異なる挙動を説明し得るので、抗体3056のVH/VLドメインのフォールディングを15C3により類似させる実験を計画した。残念ながら、これにより、抗体15C3と3056との間の差は説明されなかった。等電点電気泳動(IEF)からは、高い等電点での抗体の主バンドに関連して15C3(3055)と3056との間のわずかな差が明らかになるだけであった。荷電変種の分離を可能にするクロマトグラフィー技法であるCIEX-HPLCを用いたその後の分析から、バッチに応じて抗体3056について幅広い溶出プロファイルを有する非常に複雑な保持スペクトルが明らかとなったが、これは、15C3(3055)について観察されたプロファイルと対照的であった。更に、3056のパターンが経時的に顕著に変化したことが見出されたが、これは、3056抗体が本質的に不安定であることを示唆している。

3056_VH鎖を1つ又は2つの特定の位置で変化させた変種が設計された場合のみ、挙動が変化した。挙動は、不安定で全くの無結合性から有意なバッチ間変動なしの結合まで変動した。

3056重鎖は、3056抗体の観察された電荷不均一性に関与する可能性があるNG脱アミドモチーフWYNGRKQをそのCDR2領域に含む。15C3及び3056 Fabのin silicoモデル化から、HCDR2領域におけるNG脱アミドモチーフのフォールディングの有意な差は明らかとならなかった。これにより、3056抗体の観察された不安定性にこのモチーフが関与しないことが立証された。しかし驚くべきことに、特許請求の範囲に示されたような変化は、本発明の抗体の観察されたバッチ間変動を有意に減少させた。

本発明は、更に、CD3と結合する可変ドメイン及びCLEC12Aと結合する可変ドメインを含む抗体であって、CLEC12Aと結合する可変ドメインが、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図24の番号4327によって識別されるアミノ酸配列を含むVHを有し、CD3と結合する可変ドメインが、位置54及び55以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図12、図25及び図28に示されるような番号5192、5193;5196;5197;5351;5354;5356;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を含むVHを有する、抗体を提供する。軽鎖は、好ましくは、図23、好ましくは図23Bに示されるようなアミノ酸を有する可変ドメインを含む。

本発明は、更に、CD3と結合する可変ドメイン及びCLEC12Aと結合する可変ドメインを含む抗体であって、CLEC12Aと結合する可変ドメインが、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図24の番号4327によって識別されるアミノ酸配列を含むVHを有し、CD3と結合する可変ドメインが、位置54及び55以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図12に示される番号5196によって識別されるアミノ酸配列を含むVHを有する、抗体を提供する。

CD3と結合する可変ドメインの重鎖は、好ましくは位置54及び55以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図12及び図25に示されるような番号5196;5197;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を有する。CD3と結合する可変ドメインは、好ましくは位置54及び55以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有する、図12に示されるような番号5196によって識別されるアミノ酸配列を有する。

好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、表示のアミノ酸配列に関して0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4個、好ましくは0〜3個、好ましくは0〜2個、好ましくは0〜1個及び好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はその組合せを含む。CD3重鎖について、表示のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加は、位置54及び55以外の位置にある。挿入、付加、欠失又は置換の組合せは、整列された配列が10個以下、好ましくは5個以下の位置で異なることを条件に請求されるような組合せである。整列された配列の一方におけるギャップは、他方の配列でスキップされたアミノ酸の数と同数である。

本発明は、更に、CD3と結合する可変ドメイン及びCLEC12Aと結合する可変ドメインを含む抗体であって、CLEC12Aと結合する可変ドメインが、図24の番号4327によって識別されるアミノ酸配列を含むVHを有し、CD3と結合する可変ドメインが、図12、図25及び図28に示されるような番号5192;5193;5196;5197;5351;5354;5356;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を含むVHを有する、抗体を提供する。CD3と結合する可変ドメインの重鎖は、好ましくは図12及び図25に示されるような番号5196;5197;5603;5616;5626;5630;5648;5661;又は5694によって識別されるアミノ酸配列を有する。CD3と結合する可変ドメインは、好ましくは図12に示されるような番号5196によって識別されるアミノ酸配列を有する。

本明細書に使用される「MFXXXX」[ここで、Xは、独立して数字0〜9である]は、VHが4桁の数字によって識別されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを含むFabを表す。別段に示さない限り、可変ドメインの軽鎖可変領域は、概して、図23、概して23Bの配列を有する。「MFXXXX VH」は、4桁の数字によって識別されるVHのアミノ酸配列を表す。MFは、更に、軽鎖の定常領域及び軽鎖の定常領域と通常相互作用する重鎖の定常領域を含む。PGは、同一の重鎖及び軽鎖を含む単一特異性抗体を表す。PBは、2つの異なる重鎖を有する二重特異性抗体を表す。重鎖の可変領域は異なり、概してCH3領域も異なり、ここで、重鎖の一方がそのCH3ドメインのKK変異を有し、他方がそのCH3ドメインの相補的DE変異を有する(参照のためPCT/NL2013/050294(WO2013/157954として公開)を参照されたい)。

(実施例1)
3055及び3056 mAbの電荷不均一性
IGVK1-39/JK1共通軽鎖と対形成したMF3056 VHを含む全長IgG1モノクローナル抗体であるPG3056及び15C3 VL2-IGKV1-13軽鎖と対形成した同じVHを含む全長IgG1モノクローナル抗体であるPG3055のpI及び電荷不均一性を決定するために等電点電気泳動(IEF)を使用した。このために、10℃に冷却した冷却プレートを備えるGE Healthcare社のMultiphor II電気泳動装置を用いて、pI範囲6〜11を有するFocusgel(Webscientific社、カタログ番号1006-03)を泳動した。高pIレンジマーカー(GE Healthcare社、カタログ番号17047301V)の隣の試料スロットに未処置試料10μgを負荷した。電気泳動プログラムは、500Vで10分間の初期フォーカシング、続いて1,500Vで90分、及び2,000Vで10分間の最終フォーカシング相の3相からなった。結果的に、ゲルを固定し、コロイド状クマシー色素(Pierce社、カタログ番号24590)を用いて染色した。

PG3056及びPG3055のIEF分析の結果、図1に示されるゲルが生じた。PG3055について、主バンドが高pI(約9)に、サテライトバンドが幾分より高いpI値に見られる。PG3056は類似のIEFパターンを示したが、わずかにより高いpI値を示し、わずかにより拡散性の主バンドを有していた。

陽イオン交換クロマトグラフィーHPLC(CEX-HPLC)を用いて両方のIgGを分析して、直交法を用いてそれらの電荷不均一性を分析した。SP STAT 7μmカラム及びUV/Vis検出器を備えるDionex HPLCシステムを用いてCEX-HPLCを室温で行った。試料10μgを注入し、NaCl濃度を漸増させる25mMリン酸塩緩衝液(pH6.0)の勾配を使用して抗体の電荷変種を分離した。Chromeleonソフトウェアを使用してデータを分析した。

PG3055及びPG3056のCEX-HPLCクロマトグラムを図2に示す。PG3055は、18.8分に主ピークを示し、それにIgGの酸性アイソフォーム及び塩基性アイソフォームに相当する小ピークが隣接していた。驚くべきことに、PG3056のクロマトグラムは、大きな時間間隔にわたり複数のピークを含み、2つの幅広い主ピークが18.4及び20.4分に視認可能である。クロマトグラムは、IGVK1-39/JK1共通軽鎖抗CD3抗体(PG3056)を15C3 VL2-IGKV1-13軽鎖を有するIgG (PG3055)と比較すると、前者の電荷不均一性がかなり増加していることを示している。

抗CD3抗体のバッチ間変動性及び安定性を判断するためにもCEX-HPLCを使用した。両方の抗体を、2〜8℃で3ヶ月超保存した後及び-80℃で長期保存後に分析した。PG3055試料(図3、左)の重ね合わせから、試料間に軽微な差が観察され、2〜8℃で長期間保存すると、17.1分及び19.8分の副ピークの相対ピーク面積がわずかに変化することが示される。PG3056試料(図3右)間で観察された差は、ずっとより大きい。2〜8℃で保存すると20.4分のピークがかなり減少するのに対して、18.4分のピークは、試料の主ピークになる程度まで増加する。IgGの他の酸性アイソフォームに相当する他の早期溶出ピーク、例えば16.4分のピークも、ピーク面積の相対的な増加を示す。2〜8℃で長時間保存後のCEX-HPLCクロマトグラムにおいて観察された変化は、IGVK1-39/JK1共通軽鎖を含む抗CD3抗体がこれらの条件で保存されている間に安定でなく、一方で15C3 VL2-IGKV1-13軽鎖を含むPG3055抗体がずっとより安定であることを示している。

(実施例2)
PG3056抗体のバッチ間変動が抗原結合に及ぼす影響
血清の存在下における抗CD3抗体の安定性を評価するために、10%FBS(PAA社、カタログ番号A15-101)を補充したIMDM(Invitrogen社、カタログ番号21980-065)にPG3055及びPG3056抗体を10μg/mLになるように希釈し、続いて37℃で7日間インキュベートした。この分析にアイソタイプ対照IgG(PG1207)を含めた。7日後に、健康ドナー由来のMACS精製T細胞に対するフローサイトメトリーによって、CD3へのIgGの結合性を評価した。比較のために、同じ培地に2〜8℃で7日間保存したPG3055及びPG3056をフローサイトメトリー分析に含めた。IMDM+10%FBSで希釈した濃度10、1、0.1及び0.01μg/mLで全ての抗体のCD3結合性を検査した。IMDM+10%FBSに染色を行ったこと以外は以前にWO2014/051433に記載されたFACS手順に従って、ヤギ-抗ヒトFc抗体(Southern Biotech社、2043-02)を用いて、結合した抗体を視覚化した。データ(図4)は、血清の存在下で2〜8℃でインキュベートした場合にPG3055及びPG3056がT細胞に対して類似の結合性を示したことを示している。PG3055の結合性は、IMDM+10%FBS中37℃で7日間インキュベートすることによって影響されなかった(PG3055対PG3055 37℃)のに対し、T細胞上のCD3へのPG3056の結合性は、有意に減少した(PG3056対PG3056 37℃)。

結論として、IGVK1-39/JK1共通軽鎖を含む抗CD3抗体であるPG3056は、血清中37℃で7日間インキュベーション後にCD3に対して激しく減少した結合性を示した。対照的に、PG3055抗体は、同じ条件で完全なCD3結合性を保持した。

(実施例3)
PG3055抗体とPG3056抗体との間の差は何か
抗体PG3055及びPG3056は、軽鎖可変領域以外は同一の配列を有する。見たところ共通軽鎖は、抗体、特に共通軽鎖が密接に接触する重鎖可変領域を有する抗体の他のアミノ酸配列の状況でうまく作用しない。3056抗体の欠陥を試して修正するための最も明白な方法は、共通軽鎖を抗体3055における軽鎖により類似させるように、共通軽鎖を変えることがどんな方法でもできるか確かめることであろう。加えて、抗体PG3056の軽鎖を、CD3分子と結合する抗原結合部位の部分として選択しなかった。その目的のために重鎖可変領域を選択した。これは、共通軽鎖を親抗体PG3055における軽鎖により類似させることができるかを確かめる別の理由である。

異なる軽鎖の結果としてPG3055及びPG3056可変領域がどこで異なったかを見出すために、それらのFab領域をモデル化した。MODELLER(Saliら、1993年: J. Mol. Biol. 234、779〜815頁)を使ってPG3056及びPG3055のFab領域の相同性モデルを構築した。生成した構造集合から最適なエネルギースコアを有するモデル構造を選択した。側鎖最適化及びエネルギー最小化アルゴリズムを使用して、鋳型側鎖が標的配列と異なっていた場所で鋳型側鎖を置き換えた。3055 Fab及び3056 Fabの相同性モデルを、Yasara(http://www.yasara.org)を使用して目視検証した。PG3055及びPG3056についてのモデルの重ね合わせ(図5、右の図)は、軽鎖だけの配列差が少数の構造変化を引き起こし、重鎖に対する軽鎖のいくつかの部分の配向が2つのIgGの間である程度変化していることを示している。変化した部分は、本質的により不安定であり、かつ観察された安定性の差の根本原因である可能性がある。或いは、変化した部分は、異なる不均一性誘導プロセスに多かれ少なかれ感受性である可能性がある。既知であれ未知であれ、様々なプロセスが、PG3056抗体について観察された特徴の原因である可能性がある。ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、N-末端グルタミン環化、C-末端リジンのプロセシング、脱アミド化、酸化、糖化、及びペプチド結合切断を含めた酵素的及び非酵素的改変は、不均一性を引き起こし得るプロセスに含まれる(Liuら、Journal of Pharmaceutical Sciences、第97巻、2426〜2447頁(2008年))。改変の種類に応じて、モノクローナル抗体の不均一性は、例えば血清、腹水、及び/又は細胞培養培地中で実施される細胞内プロセス、細胞外プロセスによって導入される可能性がある。不均一性は、高温又は強光曝露等の異なるストレス条件下での精製プロセス、保存の間に緩衝液と共にインキュベートすることによっても導入される可能性がある。

モデル化により、PG3056の可変領域を変異させる作用が集中する特定のアミノ酸又は領域は突き止められなかった。PG3055及びPG3056の相同性モデルの間で観察された差は、軽微であった。

本発明において、PG3056抗体の軽鎖のアミノ酸配列を変化させる必要がないことが見出された。重鎖を適応させることで、重鎖が共通軽鎖と共に可変領域に存在する場合であっても、良好な結合特性、良好な安定性及び良好な均一性を有する抗体を産生することができる。本明細書下記により詳細に例示されるように、驚くべきことに、重鎖のCDR2領域における特定の変化が結合性に関して許容され、所望の安定性及び均一性を有する抗体を提供することが見出された。

その変化は、重鎖のCDR2領域におけるNG脱アミドモチーフの変化を招く。PG3055及びPG3056の両方のHCDR2領域は、Asn54及びGly55残基を含む。図5に示されるように、これらの残基は両方の抗体の表面に露出している。構造位置及び表面露出は、両方の分子で非常に類似しており、アスパラギン側鎖に関して配向がわずかに異なっている。両方の抗体においてこのモチーフが表面に露出していることで周囲環境と容易に接触可能であること及びPG3055とP3056においてHCDR2 NGモチーフのフォールディングに顕著な差が見られないことを考慮すると、PG3056におけるAsn54の脱アミド化の強化が、異なるPG3056バッチで観察される結合変動性の根本原因ではなさそうに思われる。

(実施例4)
PG3056変種の生成及び特徴付け
CIEX-HPLCによるPG3056の分析的特徴付けから、IgGが高度に不均一であることが示された。この不均一性は、CD3×CLEC12A二重特異性IgGのCIEX-HPLCに基づく精製を妨げるおそれがあったので、本発明者らは、MF3056 FabのCIEX-HPLCプロファイルを改善することを目指した。MF3056の重鎖可変領域は、PG3056の不均一性の原因となり得るいくつかの残基及び/又はモチーフを含む。これらは、C末端リジン残基、HCDR2におけるNGアスパラギン脱アミドモチーフ及びHCDR3における酸不安定DPモチーフである(MF3056_VH対VH3-33生殖系列配列のアライメントについては図6参照)。

in silicoモデル化は、観察された不均一性のありそうな原因としてHCDR2 NGモチーフを全く特定しなかったものの、この翻訳後修飾モチーフを欠如し、同時に改善されたCIEX-HPLC保持プロファイルと並んで改善された安定性を示し得るMF3056のVHの変種を同定することを試みた。このために、以下のMF3056のVHの変種:MF3872、MF3873及びMF3905を生成させ、検査した(図7)。

これらのVH変種及び共通軽鎖(MF3872、MF3873及びMF3905)を含むこれらのFabを、全長モノクローナルIgG(PG3872、PG3873及びPG3905)として発現させ、HPB-ALL細胞上の膜発現したCD3への結合性をフローサイトメトリーによって検査した(以前にWO2014/051433に記載されたFACS手順による)。以下の結果が得られた(図8)。

これらの結果は、変種PG3873及びPG3905がCD3結合性を完全に失ったのに対し、変種PG3872についてはCD3への非常に低い結合性が保持されたことを示している。

不均一性が減少し、かつ免疫原性が減少した、改善された変種を得るための代替アプローチとして、いくつかの残基で個別又は複合アミノ酸置換を行うことによってMF3056のVHをVH3-33配列に向けて生殖系列化した。MF3056_VHの以下の変種:MF3874_VH、MF3878_VH、MF3883_VH、MF3886_VH及びMF3891_VHを生成させた(図9)。

更に、これらのVH変種及び共通軽鎖(MF3874_VH、MF3878_VH、MF3883_VH、MF3886_VH及びMF3891_VH)を含むFabを、全長モノクローナルIgG(PG3874、PG3878、PG3883、PG3886及びPG3891)として発現させ、上記のようにCD3結合性について検査した。以下の結果が得られた(図10)。

図10に示されるように、全ての個別(PG3874(Q6E)、PG3878(V23A)、PG3883(A50V)、PG3886(T97A))及び複合(PG3891(Q6E/V23A/T97A))生殖系列化変種は、完全CD3結合能を保持した。続いて、PG3891をCIEX-HPLCによって(実施例1に記載のように)分析して、生殖系列化が不均一性の減少を招いたかどうか評価した。

図11に示されるように、PG3891のCIEX-HPLCプロファイルは、依然として顕著な電荷不均一性を示した。個別の生殖系列化変種について類似のCIEX-HPLCプロファイルが得られた(データは示さず)。

PG3056の電荷不均一性を減少させる次の試みとして、HCDR2 NGモチーフを欠如するMF3056_VH変種を生成させた(図12)。

これらのVH変種及び共通軽鎖(MF5192-5197_VH)を含むFabを生成させ、全長モノクローナルIgG(PG番号)として発現させ、HPB-ALL細胞上に膜発現したCD3への結合性について上記のフローサイトメトリーによって検査した。この分析(図13)から、PG5196(N₅₄G₅₅をN₅₄A₅₅に置換する)がPG3056に匹敵するCD3結合性を保持したのに対し、全ての他の検査されたMF3056変種が有意に減少したCD3結合性(PG5192、PG5193若しくはPG5197)又はCD3の無結合性(PG5194及びPG5195)を示したことが示された。

PG5196 mAbの電荷不均一性を評価するために、実施例1に記載したように等電点電気泳動を行った。ゲルの染色後、PG5196について高pIに細いバンド及び幾分より高いpI値に副サテライトバンドが観察される(図14参照)。

PG5196の電荷不均一性を更に詳細に評価するために、実施例1に記載の手順によりCIEX-HPLCを行った。結果として生じたクロマトグラムを図15に示す。クロマトグラムに、16.9分の小さなピークが先行する保持時間19分の主ピークを示す。驚くべきことに、これらのデータにより、PG5196がPG3056と比較して有意に改善された電荷不均一性プロファイルを示すことが実証されている。

(実施例5)
ファージディスプレイ選択を使用するPG5196の追加的な変種の生成
MF5196 VHに基づき、同様に減少した電荷不均一性を有する追加的なCD3結合Fabを得る目的で、ファージディスプレイライブラリーを設計した。再編成ヒトIGKV1-39/IGKJ1 VL領域(De Kruifら、Biotechnol Bioeng. 2010年(106)741-50頁)及びVH/VL界面を潜在的に改善し得るアミノ酸置換を組み込んでいるMF5196に基づくVH領域の一群を含むファージディスプレイライブラリーを生成させた。特異的置換及び許される代替アミノ酸をTable 1(表1)に位置毎に示す。変異された位置毎に、全ての表示された置換及び本来のアミノ酸を等しい比で導入した。

HBP-ALL細胞及び/又は組換えヒトCD3δε-Fcタンパク質を使用して当業者に公知の手順を用いてこれらのファージディスプレイライブラリーからのバクテリオファージを1又は2ラウンドで選択した。結合性のファージを化学的に溶出させ、細菌に再感染させるために使用した。いくつかの生存している細菌コロニーを釣り上げた後、ファージをレスキューし、細胞表面に発現しているCD3/TCR複合体への結合性についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。CD3結合性を示した全てのファージについてコロニーPCRを行って、VH領域を増幅させ配列決定した。

VH遺伝子の分析から、どの置換変種がCD3結合性を保持したかが明らかとなった。選択されたMF5196_VH変種は、以下の置換を有した:A50をQSYL、D59をLIVFRANEHST、A61をNIHQLRYESTDKV及び/又はF105をMY(Table 2(表2))。対照的に、全ての選択されたCD3結合変種が位置35、102、103及び104に本来のアミノ酸を保持したので、Table 1(表1)に挙げられたH35、Y102、N103、及びW104での置換は、許されなかった。これは、H35、Y102、N103、及びW104残基がCD3結合にとって重大なアミノ酸であることを示している。

MF5196_VHのCD3結合変種の例は、全てが再編成ヒトIGKV1-39/IGKJ1 VL領域と組み合わされたMF5603_VH、MF5616_VH、MF5626_VH、MF5630_VH、MF5648_VH、MF5661_VH及びMF5694_VHである。これらのMFのVH配列を図25に挙げる。これらのMF変種をHPB-ALL細胞上の膜発現したCD3への結合性について上記のフローサイトメトリーによって単一特異性IgG形式で検査することによって、これら全ての例がCD3に結合したことが示された(図26)。それらの本来の安定性の例として、実施例1に記載された手順によりPG5661をCIEX-HPLCによって分析した。結果として生じたクロマトグラムを図27に示す。クロマトグラムは、PG5196について示されたプロファイルと同様に約20分の保持時間を有する主ピークを示す。

(実施例5B)
MF5196 VHに基づき、追加の安定なCD3結合Fabを得る目的で、ファージディスプレイライブラリーを設計した。再編成ヒトIGKV1-39/IGKJ1 VL領域(De Kruifら、Biotechnol Bioeng. 2010年(106)741-50頁)及びMF5196の重鎖CDR3領域が融合されたVH3-33変種の一群を含むファージディスプレイライブラリーを生成させた。

結果として生じたMF5196_VHの追加的なCD3結合変種の例は、全てが再編成ヒトIGKV1-39/IGKJ1 VL領域と組み合わされたMF5351_VH、MF5354_VH及びMF5356_VHである(図28に挙げる)。

これらのMF変種をHPB-ALL細胞上の膜発現したCD3への結合性について上記のフローサイトメトリーによって単一特異性IgG形式で検査することによって、これら全ての例がCD3に結合したことが示された(図29)。

(実施例6)
CD3×CLEC12A二重特異性IgG形式におけるMF5196 Fabの機能的特徴付け
MF5196 Fabの機能活性を調査するために、このCD3 Fab及びMF3056 CD3 FabをCLEC12A Fab MF4327と一緒に固定腕として発現させた。位置235〜236でのヒンジ下流/CH2操作(DM-Fc、Fc領域におけるCH2二重変異と称される)を含む、WO2014/051433記載の全長二重特異性IgG形式でCD3×CLEC12A二重特異性IgGを発現させた。MF3056及びMF5196のように、MF4327 FabはヒトIGKV1-39/IGKJ1軽鎖を使用する。MF4327 Fab配列は、特許出願WO2014/051433に示されている。最初に、CD3+HPB-ALL細胞及びCLEC12A+HL-60細胞を使用して、CD3及びCLEC12Aへの5196×4327 DM-Fc bsAbの結合性をフローサイトメトリーによって実証した(以前にWO2014/051433に記載された手順による)。3056×4327 DM-Fc bsAbを参照として含め、無関係のIgG1アイソタイプ対照PG1337を対照として含めた(図16)。両方のCD3×CLEC12A DM-Fc bsAbは、膜発現したCD3及びHPB-ALLと結合し、5196×4327 DM-Fc bsAbに対する結合性がわずかに改善された。

次に、5196×4327 CD3×CLEC12A DM-Fc bsAbの機能活性を検査した。最初に、健康なドナーの休止T細胞を用いてT細胞の刺激能を検討した。特許WO2014/051433に記載された手順により精製休止T細胞を得た。続いてWO2014/051433に記載されたように、10%ヒト血清(HS)中で精製休止T細胞を白血病由来HL-60細胞株からの細胞と共にエフェクター:標的細胞比5:1で2日間インキュベートした。3056×4327 DM-Fc bsAbを参照として含めた。陰性対照ベンチマークIgGとして、アイソタイプ対照IgG(対照IgG)及び5196×1337 DM-Fc bsAbを含めた。5196×1337 DM-Fc bsAbは、一方の腕(MF5196)でCD3と結合し、第2の腕(MF1337)で破傷風トキソイド(TT)と結合するので、MF5196による潜在的オフターゲット誘導活性を調査するために含める。bsAb及び対照IgGを1,000ng/mLで検査した。T細胞活性化データを、CD4陽性T細胞集団又はCD8陽性T細胞集団内のCD69陽性細胞の率として表現する(図17)。CD69初期活性化マーカーのアップレギュレーションによって反映されるように、5196×4327 DM-Fc bsAbはCD4 T細胞及びCD8 T細胞の活性化を誘導した。同様に、3056×4327 DM-Fc bsAbは、CD4 T細胞及びCD8 T細胞上のCD69のアップレギュレーションを誘導したが、5196×4327 DM-Fc bsAbと比較してより低い程度であった。5196×1337 DM-Fc bsAbがCD69のアップレギュレーションを誘導しなかったので、両方のT細胞サブセット上のCD69の観察されたアップレギュレーションは、CLEC12A抗原に特異的であった。

この分析から、5196×4327 DM-Fc bsAbが、3056×4327 DM-Fc bsAbよりもわずかに良好にCD4 T細胞及びCD8 T細胞の抗原特異活性化を誘導する能力を有したことが示された(図17)。対照5196×1337 DM-Fc bsAbがT細胞活性化を誘導しなかったので、5196×4327 DM-Fc bsAbが誘導したT細胞活性化はCLEC12Aに特異的であった。まとめると、これは、CD3結合MF5196 Fabを生じるHCDR2のNからAへのアミノ酸置換は、CLEC12A特異的T細胞活性化を完全に保持したことを示している。

5196×4327対3056×4327 CD3×CLEC12A DM-Fc bsAbによるT細胞活性化の程度が標的細胞の溶解を誘導するために十分であったかどうかを検討するために、HL-60細胞をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)で標識し、健康なドナーからのT細胞と10%HSの存在下、エフェクター:標的細胞比5:1で共培養した。潜在的オフターゲット溶解を調査するために5196×1337 CD3×TT DM-Fc bsAbを含めた。1,000ng/mlから開始して4倍希釈レンジで二重特異性IgGを検査した。2日後に、生存CFSE陽性HL-60細胞をフローサイトメトリーによって定量した。結果をPBS対照条件に対する特異的溶解率として表現した(図18)。

この分析から、5196×4327 DM-Fc bsAbがCLEC12A抗原特異的標的細胞溶解を誘導する能力を完全に保持したことが示された。驚くべきことに、5196×4327 DM-Fcの効力は、3056×4327 DM-Fc bsAbよりも有意に良好だった。

結論として、本実施例により、5196×4327 CD3×CLEC12A DM-Fc bsAbがCLEC12A抗原特異的T細胞活性化及びCLEC12A+HL-60細胞の溶解を効率的に誘導したので、MF5196 Fabが機能的であることが示された。更に、本実施例により、5196×4327 DM-Fc bsAbが3056×4327 DM-Fc bsAbと比較した場合に改善された効力を有することが示された。

(実施例7)
5196×4327 DM-Fc bsAbの抗CD3腕及び抗CLEC12A腕の親和性
MF5196 CD3 Fab及びMF4327 CLEC12A Fabのそれらの標的に対する親和性を、BIAcore T100を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)技法によって測定した。遊離アミン化学反応(NHS/EDC)を使用して抗ヒトIgGマウスモノクローナル抗体(Becton and Dickinson社、カタログ番号555784)をCM5センサーチップの表面に結合させた。次に、5196×4327 DM-Fc bsAbをこのセンサー表面に捕捉した。続いて、結合速度及び解離速度を測定する濃度範囲で組換え精製抗原であるヒトCLEC12A(Sino Biological社、カタログ番号11896-H07H)及びヒトCD3δε-Fcタンパク質をセンサー表面に流した。各サイクルの後、センサー表面をHClのパルスによって再生し、5196×4327 DM-Fc bsAbを再度捕捉した。得られたセンサーグラムから、BIAevaluationソフトウェアを使用して結合速度及び解離速度を決定した。

これらのデータ(図19)により、5196×4327 DM-Fc bsAbがヒトCLEC12Aに対して3nMの親和性及びCD3に対して177nMの親和性を有したことが示された。これにより、5196×4327 DM-Fc bsAbにおいてCLEC12A腕の親和性がヒトCD3結合腕の親和性よりも約60倍高かったことが示された。

(実施例8)
原発性AML患者試料において5196×4327 DM-Fc bsAbがAML芽球の溶解を誘導する有効性
実施例6において、5196×4327 DM-Fc bsAbが健康ドナー由来T細胞によるHL-60標的細胞の溶解を強力に誘導することが示された。特許WO2014/051433において、本発明者らは、CD3×CLEC12A DM-Fc bsAbが自己AML患者由来T細胞によるAML芽球の溶解をエフェクター対標的比5:1で誘導する能力を有したことを示した。本実施例では、CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb、より具体的には5196×4327 CD3×CLEC12A DM-Fc bsAbが、低エフェクター対標的比、すなわちT細胞対AML芽球比で原発性AML試料におけるAML芽球の溶解を誘導する有効性を調査した。

診断時に採取したAML患者の試料(AML FAB分類M1、M2、M4、M4/M5から、Table 4(表4))を解凍し、CD4、CD8、CD14、CD33、CD34、CD45及び7AADについてのフローサイトメトリー分析によってT細胞及びAML芽球の画分について特徴付けた。分析したAML試料は、1:7〜1:40の範囲のエフェクター対標的比を有した。

続いて、10%正常HSを20ng/mL IL-15(Miltenyi社、番号130-095-766)、2.5ng/mL GM-CSF(Immunotools社、番号11343125)、12.5ng/mL G-CSF(Nordeら、2009年に記載)、6.25ng/mL IL-3(Immunotools社、番号11340035)、3.0ng/mL SCF(Immunotools社、番号11343325)及び2.5ng/mL Flt3L(Immunotools社、番号311340035)と共に補充したIMDM培地中で原発性AML患者の骨髄試料を培養した。被験条件は、PBS、アイソタイプ対照Ab WT-Fc、5196×4327 DM-Fc bsAb、5196×1337 DM-Fc bsAb及び陽性対照CD3 WT-Fc Ab(全ての抗体は1,000ng/mL)を含んでいた。7日培養後、0日目に使用したのと同じマーカーを使用するフローサイトメトリー分析によってT細胞増大及びAML芽球の死滅を決定した。結果を、PBS条件に対するT細胞増大倍率又はAML芽球の溶解頻度として表現した。

これらのデータ(Table 4(表4)及び図20)により、5196×4327 DM-Fc bsAbが7日後にT細胞増大を効率的に誘導した(5〜30倍のT細胞増大)ことが実証された。より重要なことには、これらのデータにより、5196×4327 DM-Fc bsAbが被験原発性AML患者試料5個中5個で、非常に低いエフェクター対標的比のAML試料においても、患者のAML腫瘍細胞の溶解を効率的に誘導した(26〜88%)ことが示された。

診断時に採取した追加的なAML患者試料において5196×4327 DM-Fc bsAbがT細胞の増殖及びAML芽球の溶解を誘導する有効性を分析した。

診断時に採取したAML患者の試料(AML FAB分類M1、M2、M4、M4/M5から、Table 5(表5))を解凍し、CD4、CD8、CD14、CD33、CD34、CD45及び7AADについてのフローサイトメトリー分析によってT細胞及びAML芽球の画分について特徴付けた。分析したAML試料は、1:3〜1:97の範囲のエフェクター対標的比を有した。続いて、原発性AML患者の試料を上の実施例8に記載するように培養した。被験条件は、PBS、アイソタイプ対照Ab WT-Fc、5196×4327 DM-Fc bsAb、5196×1337 DM-Fc bsAb及び陽性対照CD3 WT-Fc Ab(全ての抗体は200ng/mL)を含んでいた。7及び10日培養後、0日目に使用したのと同じマーカーを使用するフローサイトメトリー分析によってT細胞増大及びAML芽球の死滅を決定した。結果を、PBS条件に対するT細胞増大倍率又はAML芽球の溶解頻度として表現した。

これらのデータ(Table 5(表5))により、5196×4327 DM-Fc bsAbが10日後にT細胞増大を効率的に誘導した(7〜226倍のT細胞増大)ことが実証された。より重要なことには、これらのデータにより、5196×4327 DM-Fc bsAbが被験原発性AML患者試料8個中6個で、1:45〜1:97という非常に低いエフェクター対標的比のAML試料においても、患者のAML腫瘍細胞の溶解を効率的に誘導した(38〜99%)ことが示された。

(実施例9)
示差走査熱量測定(DSC)を使用して本明細書記載のIgGのドメインの熱安定性を測定した。DSC実験をOrigin v7.0(VPViewer及びVPAnalyzer)ソフトウェアを使用するMicroCal VP-DSCで行った。抗体を最初に10mMリン酸塩、150mM NaCl緩衝液(pH6.5)に対して透析した。UV吸収によって決定されたタンパク質濃度0.25mg/mLでIgG試料を分析し、透析緩衝液を参照試料として使用した。50℃〜95℃でスキャン速度1℃/minでスキャンを行い、GraphPad Prism 5及びMicrosoft Excel 2010ソフトウェアを使用して分析した。

野生型(WT)IgG1のDSC分析の結果、図21に示されるような2つのピークが生じた(CH2|CH3についてWT|WTと表示)。70.9℃でのTm1は、CH2ドメインの融解に対応し、一方で85.0℃(Tm2)でのピークは、Fab及びCH3ドメインの融解に相当する。CH2ドメインに2つの変異(L235G、G236R)を含む同一のFabを有するIgG1(DM|WT)のDSCグラフは、85.0℃に非常に類似したTm2ピークを示す。しかし、Tm1ピークは73.5℃に移動し、これは、これらの変異がCH2ドメインの安定性を有意に増加させることを示している。CH2ドメインは、WT IgG1だけでなく、CH3操作二重特異性IgG1の最も脆弱なドメインでもあるので、L235G、G236R操作CH2ドメインが、これらのCH2変異を有するCD3×CLEC12A二重特異性IgG抗体に追加的な安定性も付与すると結論することができる。

Claims

重鎖及び軽鎖を含む、ヒトCD3と結合する抗体であって、前記重鎖が、X₁X₂によって示される位置以外の1つ又は複数の位置に0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL
EWVAA IWYX₁X₂RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED
TAVYY CTRGT GYNWF DPWGQ GTLVT VSS
[式中、
X₁=N及びX₂=A;
X₁=N及びX₂=T;
X₁=S及びX₂=G;
X₁=H及びX₂=G;
X₁=D及びX₂=G;又は
X₁=H及びX₂=Aである]
を含む可変領域を含む、抗体。
前記軽鎖が、共通軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。
前記共通軽鎖可変領域が、O12/IgVκ1-39軽鎖可変領域を含む、請求項1又は2に記載の抗体。
前記軽鎖可変領域が、生殖系列O12/IgVκ1-39*01可変領域である、請求項3に記載の抗体。
軽鎖可変領域が、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む、請求項4に記載の抗体。
軽鎖可変領域が、生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む、請求項5に記載の抗体。
前記軽鎖可変領域が、0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はその組合せを有するアミノ酸配列:
DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK又はDIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
二重特異性抗体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
請求項1から7のいずれか一項に規定のH/L鎖組合せ及び腫瘍抗原と結合するH/L鎖組合せを含む、請求項8に記載の二重特異性抗体。
腫瘍抗原と結合する前記H/L鎖組合せが、CLEC12Aと結合する、請求項9に記載の二重特異性抗体。
ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
適合性ヘテロダイマー化ドメインを有する2つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む、請求項8から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記適合性ヘテロダイマー化ドメインが、適合性免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロダイマー化ドメインである、請求項12に記載の二重特異性抗体。
変異型CH2及び/又はヒンジ下流ドメインを有することにより、Fc-ガンマ受容体への二重特異性IgG抗体の相互作用が減少しているIgG抗体である、請求項8から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
変異型CH2及び/又はヒンジ下流ドメインが、位置235及び/又は236(Kabatの付番)にアミノ置換、好ましくはL235G及び/又はG236R置換を含む、請求項14に記載の二重特異性抗体。
共通軽鎖を含む、請求項8から15のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
必要とする対象の処置に使用するための、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体。