CN116710472A

CN116710472A - 利用结合lgr5和egfr的抗体治疗癌症

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Publication number: CN116710472A
Application number: CN202180083865.7A
Authority: CN
Inventors: 莱昂纳多·安徳烈斯·西鲁尼克; 埃内斯托·伊萨克·沃瑟曼
Original assignee: Merus BV
Current assignee: Merus BV
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-09-05
Also published as: WO2022131912A1; KR20230120125A; IL303633A; TW202237656A; CA3202006A1; EP4263604A1; AU2021400721A1; JP2024501645A; CN117624324A; MX2023006983A

Abstract

本公开涉及治疗癌症的手段和方法。本公开特别涉及一种利用结合LGR5与EGFR的抗体治疗个体的癌症的方法。本发明进一步涉及用于此类方法中的组合以及用于制造用于治疗头颈癌的药剂的组合。

Description

利用结合LGR5和EGFR的抗体治疗癌症

技术领域

本公开涉及治疗癌症的手段和方法。本公开特别涉及一种利用结合LGR5和EGFR的抗体治疗个体的癌症的方法。本发明进一步涉及用于此类方法中的组合以及用于制造用于治疗头颈癌的药剂的组合。此类抗体在头颈癌的治疗中特别有用。

背景技术

传统上，大多数癌症药物的发现聚焦于经由化学疗法阻断必需的细胞功能和杀灭分裂细胞的药剂。然而，化学疗法很少能实现完全治愈。在大多数情况下，患者的肿瘤停止生长或暂时缩小(称为缓解)后才再次开始增生，有时速度更快(称为复发)，并且治疗难度也越来越大。最近，癌症药物开发的焦点已从广泛的细胞毒性化学疗法转移至毒性较小的靶向细胞生长抑制疗法。采用特异性抑制信号传导路径组分的靶向疗法治疗晚期癌症已在白血病中得到临床验证。然而，在大多数癌症中，靶向方法仍被证明无效。

尽管在该疾病的治疗方面取得了许多进展，并且在导致癌症的分子事件方面的知识有所增加，但癌症仍然是世界上主要的死亡原因。据报告，在美国，头颈癌，特别是口腔及咽部的头颈癌，已经占据恶性肿瘤的3％，每年大约有53,000名美国人罹患此种癌症，且10,800人死于此种癌症(Siegel等人,CACancer J Clin. 2020；70(1):7.Epub 2020 Jan 8.)。此外，据报道，头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是全球发病率第六的主要癌症，HNSCC患者的五年整体存活率是大约40％至50％(在头颈癌中，国际癌症控制联盟，2014年WHO基本药物清单中癌症药物的审查)。

对局部晚期头颈部鳞状细胞癌(locoregionally advanced head and necksquamous cell carcinoma,LA-HNSCC)的统合分析报告称，在放射疗法或化学放射疗法中添加抗EGFR剂并未改善LA-HNSCC患者的临床结果(Oncotarget.2017；8(60):102371-102380)。此外，据报道，添加抗EGFR剂会增加皮肤毒性及黏膜炎的风险。

因此，存在对改进的或替代的癌症治疗的需要，特别是对于治疗头颈癌的需要。

发明内容

本公开提供下列优选方面和实施例。然而，本发明并不限于此。

本公开提供一种抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域和结合LGR5的胞外部分的可变域，用于在治疗受试者的癌症中使用，其中该使用包含向受试者提供1500mg的平剂量的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物。待治疗的癌症优选为头颈癌。

本公开进一步提供治疗头颈癌的方法，其包含对有此需要的受试者施用抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，该抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域。

还提供一种抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物在制造用于治疗头颈癌的药剂中的用途，该抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域，其中该用途包含向受试者提供或施用1500mg的平剂量的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物。

本公开提供一种抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域，用于在治疗受试者的头颈癌中使用。本公开进一步提供治疗受试者的头颈癌的方法，其包含向有此需要的受试者提供抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物。优选的是，该用途包含向受试者提供1500mg的平剂量的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物。

优选的是，抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物是以静脉内方式提供。

优选的是，癌症在一或多种EGFR信号传导路径基因、更优选的是HRAS、MAP2K1、和/或PLCG2中具有突变。更优选的是，突变存在于其表达产物在EGFR信号传导路径中在EGFR的下游是活性的基因中，最优选的是在HRAS中。

优选的是，癌症在一或多种WNT信号传导路径基因中具有突变，更优选的是在APC、CREPPB、CUL1、EP300、SOX17、和/或TP53中具有突变。

优选的是，癌症在选自AKT1、KRAS、MAP2K1、NRAS、HRAS、PIK3CA、PTEN、及EGFR的基因中具有突变。更优选的是，癌症在编码TP53、PIK3CA、CDKN2A、NOTCH1、HRAS、和/或MAP2K1的基因中具有突变。优选的是，癌症在表1中所描述的一或多个基因中具有突变。优选的是，癌症具有表1中所描述的突变中的一或多者。

特别地，癌症是头颈癌，更特别的是鳞状细胞癌或腺癌，最特别的是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。特别地，头颈癌可能发生在咽部。此包括鼻咽、口咽、下咽。特别地，头颈癌可能发生在喉部。特别地，头颈癌可能发生在副鼻窦及鼻腔。特别地，头颈癌可能发生在唾液腺。在优选的公开中，癌症是口咽的HNSCC。

因此，头颈癌特别地包括腺癌，但更优选的是头颈部的鳞状细胞癌，诸如鼻咽癌、喉癌、下咽癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、口腔癌、口咽癌、及唾液腺癌。

优选的是，癌症表达EGFR、和/或表达LGR5。如本文中所使用，若癌症包含表达LGR5的细胞，则癌症表达LGR5。表达LGR5的细胞包含可检测水平的编码LGR5的RNA。如本文中所使用，若癌症包含表达EGFR的细胞，则癌症表达EGFR。表达EGFR的细胞包含可检测水平的编码EGFR的RNA。表达也可通过如下方式来检测：将细胞与结合至LGR5或EGFR的抗体一同培养，以及透过使用针对任一抗原或两种抗原的免疫组织化学法的检测。

优选的是，癌症以足以使抗体结合LGR5蛋白的水平表达LGR5，尤其是包含结合LGR5的可变域的VH链的抗体，其包含如图3所描绘的MF5816的VH链的氨基酸序列，或本文所述的结合LGR5的替代可变域。优选的是，癌症以足以使抗体结合EGFR蛋白的水平表达EGFR，尤其是包含结合EGFR的可变域的VH链的抗体，其包含如图3所描绘的MF3755的VH链的氨基酸序列，或本文所述的结合EGFR的替代可变域。

优选的是，结合EGFR的可变域的VH链包含如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个、优选不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，且优选具有不多于5、4、3、2、或1个氨基酸修饰，包括插入、缺失、取代、或其组合；且其中结合LGR5的该可变域的VH链包含如图3所描绘的VH链MF5816的氨基酸序列；或如图3所描绘的VH链MF5816的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个、优选不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，且优选具有不多于5、4、3、2、或1个氨基酸修饰，包括插入、缺失、取代、或其组合。

优选的是，结合LGR5的可变域结合位于图1所描绘的人类LGR5序列的氨基酸残基21-118内的表位。优选的是，在人类LGR5的位置43、44、46、67、90、及91处的氨基酸残基参与LGR5结合可变域与LGR5的结合。优选的是，LGR5结合可变域与包含选自43A、44A、46A、67A、90A、及91A的氨基酸残基变异中的一或多者的LGR5蛋白结合较少。

优选的是，结合EGFR的可变域结合位于图2所描绘的人类EGFR序列的氨基酸残基420-480内的表位。优选的是，在人类EGFR的位置I462、G465、K489、I491、N493、及C499处的氨基酸残基参与EGFR结合可变域与EGFR的结合。优选的是，EGFR结合可变域与包含选自I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及C499A的氨基酸残基取代中的一或多者的EGFR蛋白结合较少。

优选的是，抗体是经ADCC增强的。优选的是，抗体是经去岩藻糖基化的(afucosylated)。优选的是，正施用本公开的抗体的受试者具有允许接合本发明的抗体的Fc区的免疫系统。更优选的是，该受试者包含FcγRIIIa(CD16+)和/或FcγRIIa(CD32+)免疫效应细胞以便与本发明的抗体的Fc区接合。免疫效应细胞优选是包含该Fc受体的自然杀手细胞(NK cells)、巨噬细胞、或嗜中性球。

附图说明

图1是人类LGR5序列；序列ID NO:1。

图2是人类EGFR序列；序列ID NO:2。

图3a).重链可变区的氨基酸序列(序列ID No:3至15)与共同轻链可变区(诸如人类κ轻链IgVκ1 39*01/IGJκ1*01的可变区)一同形成结合LGR5和EGFR的可变域。CDR和架构区在图3b中指示。各自DNA序列在图3c中指示。

图4a).共同轻链氨基酸序列的氨基酸序列。b)共同轻链可变区DNA序列和转译(IGKV1-39/jk1)。c)轻链恒定区DNA序列及转译。d)V区IGKV1-39A；e)根据IMGT编号的共同轻链的CDR1、CDR2、及CDR3。

图5.用于产生双特异性分子的IgG重链。a)CH1区DNA序列及转译。b)铰链区DNA序列及转译。c)CH2区DNA序列及转译。d)含有变异L351K和T366K(KK)的CH3域的DNA序列及转译。e)含有变异L351D和L368E(DE)的CH3域的DNA序列及转译。残基位置是按照EU编号。

图6.以基于双侧测定的相关误差线显示出六个头颈部PDX模型中的平均肿瘤体积的数据，该六个头颈部PDX模型是利用对照与靶向EGFR和LGR5的抗体进行治疗。抗体与对照均按灰色区域所示每周给药一次，持续六周。

具体实施方式

为了可更容易地理解本说明书，首先定义某些用语。在整个实施方式中阐述其他定义。除非本文中另有定义，否则本文所使用的所有技术用语及科学用语具有与所属技术领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义，并且采用免疫学、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术、及药理学的常规方法。

如本文中所使用，单数形式“一(a/an)”及“该(the)”包括复数个指示物。用语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”、以及其他形式，诸如“包含(comprise/comprises/comprised)”、“具有(has/have/had)”、及“包括(include/includes/included)”的使用是非限制性的。

如本文中所使用的用语“抗体(antibody)”是指属于蛋白质的免疫球蛋白类的蛋白质分子，其含有一或多个结合抗原上的表位的域，其中此类域是、或衍生自、或与抗体的可变区共同拥有序列同源。抗体通常由基本结构单元构成——各自具有两个重链及两个轻链。根据本发明的抗体不限于任何特定格式或其产生方法。

“双特异性抗体(bispecific antibody)”是如本文所述的抗体，其中抗体的一个域结合至第一抗原，而抗体的第二域结合至第二抗原，其中该第一抗原及第二抗原并不相同，或者其中一个域结合抗原上的第一表位，而第二域结合至抗原上的第二表位。用语“双特异性抗体”也涵盖抗体，其中一个重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合结合第一抗原或抗原上的表位，且第二VH/VL组合结合第二抗原或抗原上的表位。该用语进一步包括抗体，其中VH能够特异性识别第一抗原，且在免疫球蛋白可变区中与VH配对的VL能够特异性识别第二抗原。所产生的VH/VL对将结合抗原1或抗原2。此类所谓“二合一抗体(two-in-oneantibod)”是描述于例如WO 2008/027236、WO 2010/108127、及Schaefer等人(Cancer Cell20,472-486,October 2011)中。根据本发明的双特异性抗体不限于任何特定双特异性格式或其产生方法。

如本文所使用的用语“共同轻链(common light chain)”是指双特异性抗体中的两个轻链(或其VL部分)。两个轻链(或其VL部分)可相同或具有一些氨基酸序列差异，而全长抗体的结合特异性不受影响。用语“共同轻链”、“共同VL(common VL)”、“单轻链(singlelight chain)”、“单VL(single VL)”，无论是否加上用语“重排的(rearranged)”，在本文中均可互换使用。“共同(Common)”也指氨基酸序列不相同的轻链的功能等效物。存在轻链的许多变体，其中存在不会影响功能性结合区的形成的突变(缺失、取代、插入、和/或添加)。本发明的轻链也可以是如本文所指定的轻链，具有0至10个、优选0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加、或其组合。例如在如本文中所使用的共同轻链定义的范围内，制备出或找到不相同但功能上仍等效的轻链，例如通过引入及测试保守性氨基酸变化(即当与重链配对时在不会促成或仅部分促成结合特异性的区中的氨基酸变化)及类似者。

如本文中所使用，“包含(to comprise)”及其变形是以其非限制性的意义使用，意味着包括该词之后的项目，但未具体提及的项目并不排除在外。此外，动词“由…组成(toconsist)”可由“基本上由…组成(to consist essentially of)”代替，意思是如本文中所定义的化合物或附属化合物可包含除了具体指出的那些的外的附加组分，该附加组分不改变本发明的独特特性。

根据本发明，用语“全长IgG(full length IgG)”或“全长抗体(full lengthantibody)”是定义为包含基本上整个IgG，然而其不必然具有完整IgG的所有功能。为了避免疑义，全长IgG含有两个重链及两个轻链。各链含有恒定(C)区及可变(V)区，其可分解成称为CH1、CH2、CH3、VH、及CL、VL的域。IgG抗体经由Fab部分中所含有的可变区域来结合至抗原，且在结合后可透过恒定域(大部分是透过Fc部分)来与免疫系统的分子及细胞交互作用。根据本发明的全长抗体涵盖IgG分子，其中可存在提供所期望特性的变异。全长IgG不应具有任何区的大量缺失。然而，缺失一或数个氨基酸残基但基本上不改变所得IgG分子的结合特性的IgG分子是涵盖于用语“全长IgG”内。例如，此类IgG分子可具有介于1与10个之间的氨基酸残基的缺失(优选位于非CDR区中)，其中所缺失的氨基酸对于该IgG的抗原结合特异性而言不是必要的。

“抗体衍生物(derivative of an antibody)”是指除CDR区外，偏离天然抗体的氨基酸序列至多20个氨基酸的蛋白质。如本文所公开的抗体的衍生物是指偏离该氨基酸序列至多20个氨基酸的抗体。

当在本文中指涉核酸或氨基酸序列时，“同一性百分比(％)”是定义为在为了达最佳比较结果的目的而比对序列后，候选序列中的残基与所选序列中的残基同一的百分比。比较核酸序列的序列同一性百分比是使用Vector NTI11.5.2软件的AlignX应用程序并使用默认设定来判定，其采用改良ClustalW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,and Gibson T.J.,(1994)Nuc.Acid Res.22(22):4673-4680)、swgapdnamt分数矩阵、15的间隙开放罚分(gap opening penalty)、及6.66的间隙延伸罚分(gap extensionpenalty)。氨基酸序列是使用Vector NTI/>11.5.2软件的AlignX应用程序并使用默认设定来比对，其采用改良ClustalW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,and GibsonT.J.,(1994)Nuc.AcidRes.22(22):4673-4680)、blosum62mt2分数矩阵、10的间隙开放罚分、及0.1的间隙延伸罚分。

由于抗体一般识别抗原的表位，且此类表位也可存在于其他化合物中，因此若此类其他化合物含有相同种类的表位，则“特异性识别(specifically recognize)”抗原，例如EGFR或LGR5的根据本发明的抗体也可识别其他化合物。因此，就抗原及抗体相互作用而言，用语“特异性识别(specifically recognize)”是指不排除抗体与含有相同种类表位的其他化合物的结合。

用语“表位(epitope)”或“抗原决定位(antigenic determinant)”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上的部位。表位可由邻接氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非邻接氨基酸两者形成(所谓的线性表位及构型表位)。由邻接、线性氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时一般会保留，而由三级折叠、构型形成的表位在用变性溶剂处理时一般会损失。表位一般可包括呈独特空间构型的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸。

如本文中所使用，用语“受试者(subject)”及“患者(patient)”可互换使用，且是指哺乳动物，诸如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、猫、狗、猴、牛、马、猪、及类似者(例如，患有癌症的患者，诸如人类患者)。优选的是，受试者是人类受试者。

如本文中所使用，用语“治疗(treat/treating/treatment)”是指对受试者进行的任何类型的干预或程序、或施用活性剂或活性剂组合，目的是逆转、减轻、改善、抑制、或者减缓或预防与疾病相关联的症状、并发症、病况、或生物化学指标的进展、发展、严重程度、或复发。

如本文中所使用，“有效治疗(effective treatment)”或“正面治疗反应(positive therapeutic response)”是指产生有益效果的治疗，有益效果例如改善疾病或病症(例如癌症)的至少一种症状。有益效果的形式可为相对于基线的改善，包括相对于在起始根据该方法的疗法前所做测量或观察的改善。例如，有益效果的形式可为减慢、稳定、停止、或逆转受试者的处于任何临床阶段的癌症的进展，如由疾病的临床或诊断症状或癌症标记的减少或消除所证明。有效治疗可例如减小肿瘤大小、减少循环肿瘤细胞的存在、减少或预防肿瘤转移、减慢或停止肿瘤生长、和/或预防或延迟肿瘤复发(recurrence)或重新恶化(relapse)。

用语“有效量(effective amount)”或“治疗有效量(therapeutically effectiveamount)”是指药剂或药剂的组合提供所期望生物、治疗、和/或疾病预防结果的量。该结果可以是疾病的一或多种征象、症状、或起因的减少、改善、缓和、降低、推迟、和/或减轻，或者生物系统的任何其他所期望改变。在一些实施例中，有效量是足以推迟肿瘤发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或推迟肿瘤复发的量。有效量可以一或多次施用来施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数目；(ii)减少肿瘤大小；(iii)抑制、推迟、减慢至一定程度，并可停止癌细胞浸润至周边器官中；(iv)抑制肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)将与癌症相关的症状中的一或多者缓解至一定程度。在一个实例中，“有效量”是影响癌症减少(例如癌细胞数目减少)，减缓癌症的发展，或防止癌症的再生长或复发的EGFR/LGR5抗体的量。

本文中的用语“平剂量(flat dose)”是指给药方案，其中在多次施用中，不依赖受试者的体重，以固定量的治疗物质施用于受试者。平剂量给药通常缩写为qnw，其中n是表示间隔时间的整数，且w是周。例如，1500mg抗体的q2w平剂量施用方案是指每2周施用1500mg的固定量的抗体。在本文中，治疗物质优选为以1500mg的q2w给药方案施用的结合EGFR和LGR5的抗体。

平剂量可以是预先用药的，意味着在施用本发明的抗体之前向受试者施用药物。优选的是，1500mg的平剂量的抗体用抗组织胺、疼痛减轻药物、发热减轻药物、和/或抗发炎药物进行预先用药。

本公开提供一种抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域，用于在治疗癌症中使用。词语癌症与肿瘤在本文中使用，并且除非另有特别说明，否则一般两者均是指癌症。

表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)受体(EGFR、ErbB1、或HER1)是命名为Her-或cErbB-1、-2、-3及-4的四种受体酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)的家族的成员。EGFR是以各种同义词而为已知的，其中最常见的是EGFR。EGFR具有由四个子域所组成的胞外域(ECD)，其中两个子域涉及配体结合，且其中两个子域涉及同二聚化及异二聚化。EGFR整合来自各种配体的胞外信号，以产生多种胞内反应。由EGFR活化的主要信号转导路径是由Ras-有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)促有丝分裂信号传导级联。此路径的活化是由将Grb2募集至酪胺酸磷酸化的EGFR所起始。这导致Ras透过Grb2结合的Ras-鸟嘌呤核苷酸交换因子无七之子(Son of Sevenless,SOS)而活化。此外，PI3-激酶-Akt信号转导路径也通过EGFR而活化，但是该活化在存在ErbB-3(HER3)的共表达的情况下强得多。EGFR涉及数种人类上皮恶性肿瘤，尤其是乳癌、膀胱癌、非小细胞肺癌肺癌、结肠癌、卵巢癌、及脑癌。已发现基因中的活化突变、以及受体及其配体的过度表达会产生自分泌活化环(autocrine activation loop)。因此，此RTK已广泛用作癌症疗法的目标。已开发靶向RTK的小分子抑制剂及针对胞外配体结合域的单株抗体(mAb)两者，且至今已显示数次临床成功，但是大部分是针对经挑选的患者组。人类EGFR蛋白及其编码基因的数据库登记号是GenBank NM_005228.3。给予此登记号主要是为了提供将EGFR蛋白识别为目标的进一步方法，抗体所结合的EGFR蛋白的实际序列可有所变化，例如因为编码基因中的突变，诸如发生于一些癌症或类似者中的突变。

在本文中提及EGFR，该提及是指人类EGFR，除非另有说明。结合EGFR的可变域抗原结合部位结合EGFR及其各种变体，诸如在一些EGFR阳性肿瘤上表达的变体。

用语“LGR”是指被称为富含白胺酸重复序列G蛋白偶联受体的蛋白质家族。已知该家族的几个成员参与WNT信号传导路径，值得注意的是LGR4；LGR5；及LGR6。

LGR5是富含白胺酸重复序列的G蛋白偶联受体5。该基因或蛋白的替代名称是富含白胺酸重复序列的G蛋白偶联受体5；富含白胺酸重复序列G蛋白偶联受体5；G蛋白偶联受体HG38；G蛋白偶联受体49；G蛋白偶联受体67；GPR67；GPR49；孤儿(Orphan)G蛋白偶联受体HG38；G蛋白偶联受体49；GPR49；HG38；及FEX。结合LGR5的本发明蛋白质或抗体结合人类LGR5。本发明的LGR5结合蛋白或抗体因在人类与其他哺乳动物异种同源物之间的序列及三级结构相似性而也可结合此类异种同源物，但不一定如此。人类LGR5蛋白及其编码基因的数据库登记号是(NC_000012.12；NT_029419.13；NC_018923.2；NP_001264155.1；NP_001264156.1；NP_003658.1)。给予登记号主要是为了提供进一步将LGR5识别为目标的方法，所结合的LGR5蛋白质的实际序列可有所变化，例如因为编码基因中的突变，诸如发生于一些癌症或类似者中的突变。LGR5抗原结合部位结合LGR5及其各种变体，诸如由一些LGR5阳性肿瘤细胞表达的变体。

统称为头颈癌的癌症通常始于排列在头部及颈部内(诸如在口、鼻、及喉内)潮湿黏膜表面的鳞状细胞。这些鳞状细胞癌通常被称为头颈部的鳞状细胞癌。尽管罕见，但头颈癌也可发生在唾液腺。特别地，头颈癌可发生在口腔。这包括唇，舌的前部三分之二、牙龈、脸颊与唇内侧的膜、舌下口腔底部、硬腭、以及智齿后面的小面积牙龈。

因此，特别地，头颈癌包括鼻咽癌、喉癌、下咽癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、口腔癌、口咽癌、或唾液腺癌。更特别地，本发明涉及治疗包含位于口咽部的鳞状细胞头颈癌的癌症。

在一些公开中，癌症表达LGR5和/或EGFR。如本文中所使用，若癌症包含表达LGR5的细胞，则癌症表达LGR5。表达LGR5的细胞包含可检测水平的编码LGR5的RNA。如本文中所使用，若癌症包含表达EGFR的细胞，则癌症表达EGFR。表达EGFR的细胞包含可检测水平的编码EGFR的RNA。表达也可通过将细胞与结合至LGR5或EGFR的抗体一同培养的方式进行检测。然而，某些细胞未表达出用于此类抗体测试的足够高的蛋白。在此类情况下，mRNA或其他形式的核酸序列检测是优选的。优选的是，检测到EGFR蛋白表达，并且检测到LGR5 mRNA表达。优选的是，EGFR及LGR5检测通过组织微数组(Tissue MicroArray,TMA)染色法进行。LGR5表达优选使用原位杂交(In-Situ Hybridization,ISH)来判定。因此，优选的是，癌症对LGR5呈ISH阳性。ISH阳性优选指表达的特征在于H评分是1分或以上。EGFR表达优选使用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)来判定。因此，优选的是，癌症对EGFR呈IHC阳性。优选的是，癌症的EGFR IHC评分是0、1+、2+、或3+，更优选的是1+、2+、或3+，甚至更优选的是2+、或3+。通过TMA、ISH、及IHC进行检测以及基于其进行评分的技术各自是所属技术领域中普通技术人员所熟知的，且一般可作为标准套组而购得。优选的是，使用市售EGFR检测套组来判定EGFR评分，诸如用于Dako自动染色机的EGFR pharmDx^TM套组(Agilent)。关于使用ISH来定量mRNA水平且根据H评分(诸如对于LGR5)来表达此情况，可使用市售套组(诸如来自Advanced Cell Diagnostics(Hayward,CA,USA)的套组)在诸如BondRx平台(Leica,Wetzlar,Germany)的染色平台上进行。通常，ISH H评分在0至400范围。替代地，LGR5和EGFR表达通过RNA测序(RNAseq)来判定。

受试者可能以前未曾用抗EGFR剂治疗。更优选的是，受试者未曾用靶向EGFR的抗体治疗，最优选的是，受试者未曾用西妥昔单抗治疗。此类受试者也称为西妥昔单抗-初治或抗EGFR-初治受试者。

此外，受试者可能以前曾用一套或多套标准核准疗法或标准照护。虽然手术或放射疗法可能对于大多数患有早期或局限性疾病(且也可能被视为局部晚期疾病)的患者而言是优选的，但例如由于癌症的解剖位置，或许无法适用于所有患者。本文的标准核准疗法或标准照护优选包括通过施用化学治疗剂进行的治疗、优选是一或多种基于铂的化合物(例如顺铂、卡铂)、抗肿瘤化合物(例如胺甲喋呤)、氟嘧啶(例如氟尿嘧啶、5-FU、卡培他滨(capecitabine))、紫杉烷(例如欧洲紫杉醇(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel))核苷类似物(例如吉西他滨(gemcitabine))、或其任何组合。

癌症，诸如头颈癌，可与突变的存在有关。此类突变包括诸如PIK3CA、KRAS、BRAF、HRAS、MAP2K1、及NOTCH1的已知致癌基因中的突变。致癌突变通常被描述为活化突变或引起新功能的突变。另一种类型的癌症突变涉及肿瘤抑制基因，诸如如TP53、MLH1、CDKN2A、及PTEN。肿瘤抑制基因中的突变通常是去活化的。

优选的是，癌症在一或多个EGFR信号传导路径基因中具有突变。优选的是，突变存在于这样的基因，即其表达产物在EGFR信号传导路径中在EGFR的下游是活性的。更优选的是，癌症在一或多种EGFR信号传导路径基因中具有突变，该基因在EGFR的下游并非活性的。

优选的是，癌症在选自AKT1、KRAS、MAP2K1、NRAS、HRAS、PIK3CA、PTEN、及EGFR的基因、以及其经编码的蛋白产物中具有突变。更优选的是，癌症在编码HRAS和/或PLCG2的基因中具有突变。

HRAS基因中的突变优选是错义突变、体细胞突变、和/或致癌驱动突变。更优选的是，HRAS包含其蛋白序列中的突变G12S、或引起G>S氨基酸变化的G>A错义突变，更优选的是在HRAS基因的相应GGC密码子的编码序列(CDS)中的错义突变G34A。优选的是，癌症是口腔鳞状细胞癌、或颊黏膜的鳞状细胞癌，且在编码HRAS的基因中包含错义突变G12S。

PLCG2基因中的突变优选是在PLCG2基因的密码子CGC的编码序列(CDS)中的突变R956H、或引起R>H氨基酸变化的G>A错义突变、或错义突变G2867A。

癌症可在编码MAP2K1的基因中具有突变。MAP2K1基因中的突变优选是错义突变、体细胞突变、和/或致癌驱动突变。更优选的是，MAP2K1包含其蛋白序列中的突变L375R、或引起L>R氨基酸变化的T>G错义突变，更优选的是在编码MAP2K1的基因中的相应CTC密码子的编码序列(CDS)中的错义突变T1124G。

优选的是，癌症在编码PIK3C2B和/或PTPN11的基因中没有突变。优选的是，PIK3C2B中的突变包含其蛋白序列中的突变E1169K、或引起E>K氨基酸变化的G>A错义突变，更优选的是在编码PIK3C2B的基因的相应GAG密码子的编码序列(CDS)中的错义突变G3505A。优选的是，PTPN11中的突变包含其蛋白序列中的突变G39E、或引起G>E氨基酸变化的G>A错义突变，更优选的是在编码PTPN11的基因的相应GGA密码子的编码序列(CDS)中的错义突变G116A。

Notch 1(HGNC ID 7881；NOTCH1)，也称为AOS5、hN1、AOVD1、及TAN1，是一种编码跨膜蛋白的基因，该跨膜蛋白在多重发育程序及相邻细胞间的相互作用中发挥作用。跨膜蛋白也作为膜结合配体的受体发挥作用。融合、错义突变、无义突变、沉默突变、框移缺失及插入、以及框内缺失及插入是在癌症，诸如食道癌、造血与淋巴癌、及胃癌中被观察到。NOTCH1在结肠癌、肺腺癌、侵袭性乳管癌、子宫内膜子宫内膜样腺癌、及皮肤鳞状细胞癌的所有癌症的4.48％中发生改变，具有最高的改变盛行率。在头颈部鳞状细胞癌中，约16％的患者中NOTCH1发生改变(The AACR Project GENIE Consortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831)。

TP53(HGNC ID 11998)编码一种转录因子，其调节许多活性，包括压力反应及细胞增生。TP53中的突变与各种癌症相关联，且据估计，发生在多于50％的人类癌症中，包括胃癌及食道癌。特别地，TP53 R248Q突变显示与癌症相关联，包括胃癌及食道癌(Pitolli等人,Int.J.Mol.Sci.2019 20:6241)。在位置R196及R342处的无义突变已在许多肿瘤中得到鉴定，诸如分别来自乳房及食道；以及卵巢、前列腺、乳房、胰脏、胃、结肠/直肠、肺、食道、骨的肿瘤(Priestly等人,Nature 2019 575:210-216)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有TP53突变、特别是引起TP53表达或活性减少的突变的癌症。

MLH1(HGNC ID 7127；MutL同源物1)编码一种参与DNA失配修补的蛋白质，且是一种已知的肿瘤抑制基因。MLH1中的突变与包括胃肠癌的各种癌症相关联。低水平的MLH1也与有食道癌家族史的食道癌患者相关联(Chang等人,Oncol Lett.2015 9:430-436)，且MLH1在1.39％的恶性食道赘瘤患者中发生突变(The AACR Project GENIEConsortium.AACR Project GENIE:powering precision medicine through aninternational consortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version6)。特别地，MLH1 V384D突变显示与癌症相关联，例如大肠直肠癌(Ohsawa等人,MolecularMedicine Reports 2009 2:887-891)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有MLH1突变、特别是引起MLH1表达或活性减少的突变的癌症。

PIK3CA(HGCN:8975，磷脂酸肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化次单元α)编码PI3K(磷脂酸肌醇3-激酶)的110 kDa催化次单元。PIK3CA中的突变与包括胃肠癌的各种癌症相关联。如美国癌症研究协会所报告，PIK3CA在12.75％的恶性实性肿瘤患者中发生突变。特别地，PIK3CA H1047R突变存在于2.91％的所有恶性实性肿瘤患者中，且PIK3CA E545K存在于2.55％的所有恶性实性肿瘤患者中(参见，The AACR Project GENIE Consortium.AACRProject GENIE:powering precision medicine through an internationalconsortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version 6)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有PIK3CA突变、特别是PIK2CA中的致癌突变的癌症。

PIK3C2B(HGNC:8972，磷脂酸肌醇-4-磷酸3-激酶催化次单元类型2β)编码属于磷脂肌醇3-激酶(PI3K)家族的蛋白。PI3-激酶在参与细胞增生、致癌转化、细胞存活、细胞迁移、及细胞内蛋白运输的信号传导路径中发挥作用。此蛋白含有脂质激酶催化域、以及C-末端C2域、II类PI3-激酶的特性。C2域充当钙依赖性磷脂结合模体，其介导蛋白质至膜的易位，且也可介导蛋白质-蛋白质相互作用。

CDKN2A(HGNC ID 1787；周期蛋白依赖型激酶抑制剂2A)编码抑制CDK4及ARF的蛋白。如美国癌症研究协会报道，CDKN2A在22.21％的食道癌患者、28.7％的食道鳞状细胞癌患者、及6.08％的胃腺癌患者中发生突变。特别地，CDKN2AW110Ter突变存在于大约0.11％的癌症患者中。(The AACR Project GENIE Consortium.AACR Project GENIE:poweringprecision medicine through an international consortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version 6)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有CDKN2A突变的癌症，特别是引起CDKN2A表达或活性减少的突变。

PTEN(HGNC ID 9588；磷酸酶及张力蛋白同源物)编码磷脂酸肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶。如美国癌症研究协会报道，PTEN在6.28％的癌症患者、3.41％的胃腺癌患者、2.37％的食道癌患者、以及在2.22％的食道腺癌患者中发生突变。特别地，PTEN R130Ter突变(其中Ter是指终止/停止密码子(termination/stop codon))存在于0.21％的所有大肠直肠癌患者中(The AACR Project GENIE Consortium.AACR Project GENIE:poweringprecision medicine through an international consortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version 6)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有PTEN突变、特别是引起PTEN表达或活性减少的突变的癌症。

BRAF(HGNC ID:1097)编码丝胺酸/苏胺酸-蛋白激酶B-Raf，其参与生长信号传导。如美国癌症研究协会报道，BRAF在1.91％的胃癌患者、及1.93％的胃腺癌患者中发生突变。特别地，BRAF V600E突变存在于2.72％的癌症患者中(参见，The AACR Project GENIEConsortium.AACR Project GENIE:powering precision medicine through aninternational consortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version6)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有BRAF突变、特别是BRAF中的致癌突变的癌症。

KRAS(HGNC ID 6407；Kirsten RAt肉瘤)编码作为RAS/MAPK路径一方的蛋白。如美国癌症研究协会报道，KRAS在14.7％的恶性实性肿瘤患者中发生突变，KRAS G12C存在于2.28％的所有恶性实性肿瘤患者中(参见，The AACR Project GENIE Consortium.AACRProject GENIE:powering precision medicine through an internationalconsortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version 6)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有KRAS突变、特别是KRAS中的致癌突变的癌症。

HRAS(HGNC ID:5173)基因产物参与Ras蛋白信号转导的活化。Ras蛋白结合GDP/GTP且具有固有的GTPase活性。HRAS原癌基因中的体细胞突变已显示与膀胱癌、甲状腺、唾腺管癌、上皮肌上皮癌、及肾癌有关(Chiosea等人,in Am.J.of Surg.Path.39(6):744–52；Chiosea等人,in Head and Neck Path.2014.8(2):146–50)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有HRAS突变，特别是HRAS中的致癌突变，更优选的是HRAS突变G12S的癌症。癌症特别是口腔或颊黏膜的HNSCC。

MAP2K1(HGNC ID:6840)属于有丝分裂原活化蛋白激酶激酶的群组。其在MAP激酶信号传导中是活性的，且编码蛋白双特异性有丝分裂原活化蛋白激酶激酶1。作为MAP激酶路径的一部分，MAP2K1参与许多细胞程序，包括细胞增生、分化、及转录调节。MAP2K1在皮肤黑色素瘤、肺腺癌、结肠腺癌、黑色素瘤、及侵袭性乳管癌的所有癌症的1.05％中发生改变，具有最高的改变盛行率(The AACR Project GENIE Consortium.Cancer Discovery.2017；7(8):818-831.Dataset Version 8)。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有MAP2K1突变，特别是MAP2K1突变L375R的癌症。

UGT1A1(HGNC ID 12530；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1)和UGT1A8(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A8)编码葡萄糖醛酸化路径的酶。已知几种降低酶活性的多型性会影响伊立替康(irinotecan)的代谢及效果。例如，在中国人、韩国人、及日本人族群中具有大约0.13％的等位基因频率的UGT1A1*6等位基因(G71R多型性)，及UGT1A1*28等位基因(启动子区的TATA序列中的二核苷酸重复多型性)是伊立替康诱导的嗜中性球减少症的风险因素。在一些实施例中，本文所公开的治疗性化合物可用于治疗具有UGT1A1和/或UGT1A8突变、特别是引起UGT1A1和/或UGT1A8的表达或活性减少的突变的癌症。

在本公开中，头颈癌优选包含一或多个如存在于头颈部模型HN2167、HN2590、HN2579、HN5124、HN3164、HN3642、HN3411、和/或HN5125(参见表1)中的基因突变，更优选的是一或多个如存在于头颈部模型HN2167、HN2590、HN2579、HN5124、HN3642、HN3411、和/或HN5125中的基因突变。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。

在本公开中，头颈癌在存在于如下模型中的LGR5和/或EGFR路径中具有一或多个突变，该模型选自由HN5124、HN5125、HN2579、HN2590、HN2167、HN3642、及HN3164所组成的群组(参见表1)。

在本公开中，头颈癌优选包含如存在于头颈部模型HN2167、HN2590、HN2579、HN5124、HN3164、HN3642、HN3411、和/或HN5125(参见表1)中的一或多个致癌突变，更优选的是如存在于头颈部模型HN2167、HN2590、HN2579、HN5124、HN3642、HN3411、和/或HN5125中的一或多个致癌突变。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。

优选的是，头颈癌、特别是喉癌、或模型HN2167中的一或多个突变选自由下列所组成的群组：CDKN2A(HGNC:1787)、CREBBP(HGNC:2348)、CUL1(HGNC:2551)、EPHA3(HGNC:3387)、EXT1(HGNC:3512)、FAT2(HGNC:3596)、FOXP1(HGNC:3823)、HIST1H3B(HGNC:4776)、HSP90AB1(HGNC:5258)、IKZF3(HGNC:13178)、IL6ST(HGNC:6021)、INHBA(HGNC:6066)、LMO1(HGNC:6641)、LPP(HGNC:6679)、MSR1(HGNC:7376)、NBN(HGNC:7652)、RAD54B(HGNC:17228)、RGS3(HGNC:9999)、TAOK1(HGNC:29259)、TP53(HGNC:11998)、及WNK1(HGNC:14540)。更优选的是，头颈癌、特别是鳞状细胞喉癌中的一或多个突变包含CDKN2A、CREPPB、CUL1、和/或TP53。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。CDKN2A优选在CDKN2A蛋白的位置99-103处包含缺失、和/或框移突变，特别是氨基酸RAGAR的缺失，更特别是在CDKN2A编码序列的位置296-309处包含氨基酸GGGCCGGGGCGCGG的缺失。CREPPB优选在CREPPB基因的密码子CGC的编码序列(CDS)中包含突变R1446C、或引起R>C氨基酸变化的C>T错义突变、或错义突变C4336T。CUL1优选在CUL1基因的密码子GAT的编码序列(CDS)中包含突变D483N、或引起D>N氨基酸变化的G>A错义突变、或错义突变G1447A。TP53优选在TP53基因的密码子CGT的编码序列(CDS)中包含突变R273C、或引起R>C氨基酸变化的C>T错义突变、或错义突变C817T。

优选的是，头颈癌、特别是舌部的鳞状细胞癌、或模型HN2590中的一或多个突变选自由下列所组成的群组：AHR(HGNC:348)、ALK(HGNC:427)、ATP6AP2(HGNC:18305)、CDKN2A(HGNC:1787)、EP300(HGNC:3373)、FGFR1(HGNC:3688)、FLT4(HGNC:3767)、FN1(HGNC:3778)、HLA-B(HGNC:4932)、IREB2(HGNC:6115)、MCM8(HGNC:16147)、PLCG2(HGNC:9066)、RB1(HGNC:9884)、THRAP3(HGNC:22964)、TP53(HGNC:11998)、WNK1(HGNC:14540)、YBX1(HGNC:8014)及ZNF638(HGNC:17894)。更优选的是，头颈癌、特别是舌癌中的一或多个突变包含EP300、PLCG2、和/或TP53。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。EP300优选在EP300基因的密码子TCT的编码序列(CDS)中包含突变S1730C、或引起S>C氨基酸变化的C>G错义突变、或错义突变C5189G。PLCG2优选在PLCG2基因的密码子CGC的编码序列(CDS)中包含突变R956H、或引起R>H氨基酸变化的G>A错义突变、或错义突变G2867A。TP53优选在TP53基因的密码子GGC的编码序列(CDS)中包含突变G245S、或引起G>S氨基酸变化的G>A错义突变、或错义突变G733A。

优选的是，头颈癌、特别是颊黏膜的鳞状细胞癌、或模型HN2579中的一或多个突变选自由下列所组成的群组：DCC(HGNC:2701)、DLC1(HGNC:2897)、HRAS(HGNC:5173)、LZTS1(HGNC:13861)、SMARCA4(HGNC:11100)、及WRN(HGNC:12791)。更优选的是，头颈癌、特别是颊黏膜的鳞状细胞癌中的一或多个突变包含HRAS。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。HRAS优选包含其蛋白序列中的突变G12S、或引起G>S氨基酸变化的G>A错义突变，更优选的是在HRAS基因的密码子GGC的编码序列(CDS)中的错义突变G34A。

优选的是，头颈癌、特别是头颈部的鳞状细胞癌、或模型HN5124中的一或多个突变选自由下列所组成的群组：APC(HGNC:583)、ERCC6(HGNC:3438)、MAD1L1(HGNC:6762)、及ROS1(HGNC:10261)。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。APC优选包含其蛋白序列中的突变R2505Q、或引起R>Q变化的G>A错义突变，更优选的是在APC基因的密码子CGA的编码序列(CDS)中的错义突变G7514A。

优选的是，头颈癌、特别是腺癌或腮腺腺癌、或模型HN3164中的一或多个突变选自由下列所组成的群组：DLC1(HGNC:2897)、EPHA4(HGNC:3388)、KIAA1549(HGNC:22219)、MAP2K1(HGNC:6840)、MSH3(HGNC:7326)、及TP53(HGNC:11998)。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。MAP2K1优选包含其蛋白序列中的突变L375R、或引起L>R氨基酸变化的T>G错义突变，更优选的是在MAP2K1基因的密码子CTC的编码序列(CDS)中的错义突变T1124G。TP53优选包含其蛋白序列中的突变Y234C、或引起Y>C氨基酸变化的A>G错义突变，更优选的是在TP53基因的密码子TAC的编码序列(CDS)中的错义突变A701G。

优选的是，头颈癌、特别是颈部的鳞状细胞癌、或模型HN5125中的一或多个突变选自由下列所组成的群组：ATM(HGNC:795)、ECT2L(HGNC:21118)、HLA-B(HGNC:4932)、ITGA9(HGNC:6145)、RB1(HGNC:9884)、RGS3(HGNC:9999)、SOX17(HGNC:18122)、及TP53(HGNC:11998)。突变优选是体细胞突变、错义突变、框移突变、缺失、或其任何组合。SOX17优选包含其蛋白序列中的突变L156P、或引起L>P氨基酸变化的T>C错义突变，更优选的是在SOX17基因的密码子CTG的编码序列(CDS)中的错义突变T467C。TP53优选包含其蛋白序列中的突变R337C、或引起R>C氨基酸变化的C>T错义突变，更优选的是在TP53基因的密码子CGC的编码序列(CDS)中的错义突变C1009T。

如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合表皮生长因子(EGF)受体的胞外部分的可变域、及结合LGR5的可变域。EGFR优选是人类EGFR。LGR5优选是人类LGR5。如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合人类表皮生长因子(EGF)受体的胞外部分的可变域、及结合人类LGR5的可变域。

优选的是，本文所述的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合表皮生长因子(EGF)受体的胞外部分并干扰EGF与受体结合的可变域、及结合LGR5的可变域，其中抗体在表达LGR5的细胞上与LGR5的相互作用不会阻断Rspondin(RSPO)与LGR5的结合。用于判定抗体阻断或不阻断Rspondin与LGR5的结合的方法在WO2017069528中描述，其特此以引用方式并入本文中。

在本文中给予蛋白质/基因的登记号或替代名称时，给予此登记号或替代名称主要是为了提供将所提及的蛋白识别为目标的进一步方法，本发明的抗体所结合的目标蛋白的实际序列可有所变化，例如因为编码基因中的突变和/或选择式剪接，诸如发生于一些癌症或类似者中的突变和/或选择式剪接。只要表位存在于蛋白质中，且表位是抗体可接近的，则目标蛋白质就由抗体结合。

如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物优选干扰EGFR的配体与EGFR的结合。如本文所使用的用语“干扰结合(interferes with binding)”是指抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物与EGFR的结合与用于结合至EGF受体的配体进行竞争。抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物可减少配体结合，当配体已经与EGF受体结合时置换配体，或者其可例如透过位阻，至少部分地防止配体结合至EGF受体。

如本文所提及的EGFR抗体优选分别抑制EGFR配体诱导的信号传导，其以BxPC3细胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)的配体诱导的生长、或A431细胞(ATCC CRL-1555)的配体诱导的细胞死亡来测量。EGFR可结合许多配体并刺激所提及的BxPC3细胞或BxPC3-luc2细胞的生长。在EGFR配体的存在下，BxPC3或BxPC3-luc2细胞的生长受到刺激。BxPC3细胞的EGFR配体诱导的生长可通过比较配体不存在与存在时细胞的生长来测量。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的EGFR配体诱导的生长的优选EGFR配体是EGF。配体诱导的生长优选使用饱和量的配体进行测量。在优选的实施例中，EGF以100ng/ml培养基的量使用。EGF优选为EGF R&D系统、目录号nr.396-HB、及236-EG(另参见WO2017/069628；其以引用方式并入本文中)。

如本文所提及的EGFR抗体优选抑制BxPC3细胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)的EGFR配体诱导的生长。EGFR可结合许多配体并刺激所提及的BxPC3细胞或BxPC3-luc2细胞的生长。在配体存在的情况下，BxPC3或BxPC3-luc2细胞的生长受到刺激。BxPC3细胞的EGFR配体诱导的生长可通过比较配体不存在与存在时细胞的生长来测量。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的EGFR配体诱导的生长的优选EGFR配体是EGF。配体诱导的生长优选使用饱和量的配体进行测量。在优选的实施例中，EGF以100ng/ml培养基的量使用。EGF优选为R&D系统的EGF、目录号nr.396-HB及236-EG(也参见WO2017/069628；其以引用方式并入本文中)。

为避免疑问，本文所使用的对细胞的生长的提及是指细胞数目的变化。生长的抑制是指原本可获得的细胞数目的减少。生长的增加是指原本可获得的细胞数目的增加。细胞的生长一般是指细胞的增生。

本文所述的抗体抑制信号传导或抑制多特异性形式的生长优选使用单特异性单价或单特异性二价版本的抗体并通过如上文所述的方法来判定。此类抗体优选具有其信号传导有待判定的受体的结合部位。单特异性单价抗体可具有可变域，其具有不相关的结合特异性，诸如破伤风类毒素特异性。优选的抗体是二价单特异性抗体，其中抗原结合可变域由结合EGF受体家族成员的可变域组成。

在其抗体程序中，Merus开发出多特异性抗体，其靶向EGFR及LGR5(富含白胺酸重复序列的G蛋白偶联受体)。已分别使用患者衍生的CRC类器官与小鼠PDX模型在体外与体内评估此类多特异性抗体的疗效(参见例如WO2017/069628；其以引用方式并入本文中)。靶向EGFR与LGR5的多特异性抗体显示出抑制肿瘤生长。此类抑制性抗体的效力显示出与通过源自癌症的细胞的LGR5 RNA表达的水平相关。特别优选的是如WO2017/069628中所述的靶向EGFR及LGR5的多特异性抗体。

如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合LGR5的胞外部分的可变域。结合LGR5的胞外部分的可变域优选结合位于图1的序列的氨基酸残基21-118内的表位，其中氨基酸残基D43；G44、M46、F67、R90、及F91参与抗体与表位的结合。

LGR5可变域优选是其中LGR5中的氨基酸残基取代D43A；G44A、M46A、F67A、R90A、及F91A中的一或多者减少可变域与LGR5的结合的可变域。

LGR5的胞外部分上的表位优选位于图1的序列的氨基酸残基21-118内。其优选是如下表位，其中LGR5可变域与LGR5的结合被下列氨基酸残基取代中的一或多者减少：LGR5中的D43A、G44A、M46A、F67A、R90A、及F91A。

本公开进一步提供具有结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域的抗体，其中LGR5可变域结合位于图1的序列的氨基酸残基21-118内的LGR5上的表位。

LGR5上的表位优选为构型表位。表位优选位于图1的序列的氨基酸残基40-95内。抗体与LGR5的结合优选利用下列氨基酸残基取代中的一或多者来减少：D43A；G44A、M46A、F67A、R90A、及F91A。

不受理论限制，据信如图1所描绘的LGR5的M46、F67、R90、及F91是如以上本文所指示的可变域的接触残基，即结合LGR5表位的可变域的抗原结合部位。氨基酸残基取代D43A和G44A减少抗体的结合，这可归因于该氨基酸残基取代也是接触残基的事实，然而，该氨基酸残基取代也可能诱导LGR5的部分的构型的(轻微)修饰，其具有其他接触残基(即在位置46、67、90、或91处)中的一或多者，且构型变化是使得抗体结合减少。表位的特征在于所提及的氨基酸取代。抗体是否结合相同表位可用多种方式来判定。在例示性方法中，CHO细胞在细胞膜上、或在丙胺酸取代突变体上表达LGR5，优选包含取代M46A、F67A、R90A、或F91A中的一或多者的突变体。测试抗体与CHO细胞接触，且比较抗体与细胞的结合。若与LGR5结合且在较小程度上与具有M46A、F67A、R90A、或F91A取代的LGR5结合，则测试抗体结合表位。优选的是将与一组各包含一个丙胺酸残基取代的突变体的结合进行比较。此类结合研究是本领域中所熟知的。通常该组包含基本上覆盖所有氨基酸残基的单丙胺酸取代突变体。对于LGR5，该组仅需要覆盖蛋白质的胞外部分、以及在使用细胞时一定保证与细胞膜的缔合的部分。特定突变体的表达可受到影响，但这很容易通过一或多种结合至不同区的LGR5抗体检测到。若这些对照抗体的表达也减少，则该特定突变体的膜上蛋白质的水平或折叠会受到影响。测试抗体与该组的结合特性很容易识别测试抗体是否展现出与具有M46A、F67A、R90A、或F91A取代的突变体的结合减少，且因此测试抗体是否是本发明的抗体。与具有M46A、F67A、R90A、或F91A取代的突变体的结合减少也识别位于图1的序列的氨基酸残基21-118内的表位。在优选的实施例中，该组包括D43A取代突变体；两者的G44A取代突变体。具有MF5816的VH的VH序列的抗体展现出与这些取代突变体的结合减少。

不受任何理论限制，据信如图2所描绘的氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；及C499参与通过包含如上文所指示的可变域的抗体结合表位。参与结合优选的是通过观察可变域与具有选自下列的氨基酸残基取代中的一或多者的EGFR的结合减少来判定：I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；及C499A。

在一个方面中，结合人类EGFR的胞外部分上的表位的可变域是结合位于图2所描绘序列的氨基酸残基420-480内的表位的可变域。优选的是，可变域与EGFR的结合通过下列氨基酸残基取代中的一或多者而减少：EGFR中的I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；及C499A。抗体与人类EGFR的结合优选干扰EGF与受体的结合。EGFR上的表位优选是构型表位。在一个方面中，表位位于图2所描绘序列的氨基酸残基420-480内，优选的是位于图2所描绘序列的430-480内；优选的是位于图2所描绘序列的438-469内。

不受理论限制，据信表位的接触残基，即可变域接触人类EGFR的位置可能是I462；K489；I491；及N493。氨基酸残基G465及C499可能间接参与抗体与EGFR的结合。

结合人类EGFR的可变域优选是具有重链可变区的可变域，该重链可变区至少包含如图3所描绘MF3755的VH的CDR3序列，或与如图3所描绘MF3755的VH的CDR3序列的不同在于至多三个、优选至多两个、优选不多于一个氨基酸的CDR3。

结合人类EGFR的可变域优选为具有重链可变区的可变域，该重链可变区至少包含如图3所描绘MF3755的VH的CDR1、CDR2、及CDR3序列；或具有至多三个、优选至多两个、优选至多一个氨基酸取代的如图3所描绘MF3755的VH的CDR1、CDR2、及CDR3序列。

结合人类EGFR的可变域优选为具有重链可变区的可变域，该重链可变区包含如图3所描绘MF3755的VH链的序列；或图3所描绘MF3755的VH链的氨基酸序列，其相对于MF3755的VH链而言，具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

在一个方面中，本公开提供一种抗体，其包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域，其中该可变域的重链可变区至少包含选自由如图3所描绘的MF3370；MF3755；MF4280；或MF4289所组成的群组中的EGFR特异性重链可变区的CDR3序列，或其中该可变域的重链可变区包含重链CDR3序列，该重链CDR3序列与选自由如图3所描绘的MF3370；MF3755；MF4280；或MF4289所组成的群组中的VH的CDR3序列的不同在于至多三个、优选至多两个、优选不多于一个氨基酸。该可变域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含如图3所描绘的MF3370；MF3755；MF4280；或MF4289的CDR3序列。

该可变域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含选自由如图3所描绘的MF3370；MF3755；MF4280；或MF4289所组成的群组中的EGFR特异性重链可变区的CDR1、CDR2、及CDR3序列；或至少包含与选自由如图3所描绘的MF3370；MF3755；MF4280；或MF4289所组成的群组中的EGFR特异性重链可变区的CDR1、CDR2、及CDR3序列的不同在于至多三个、优选至多两个、优选至多一个氨基酸的CDR1、CDR2、及CDR3序列的重链可变区。该可变域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含如图3所描绘的MF3370；MF3755；MF4280；或MF4289的CDR1、CDR2、及CDR3序列。优选的重链可变区是MF3755。另一优选的重链可变区是MF4280。

抗体包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域，其中EGFR结合可变域具有上文所指示的CDR3序列、CDR1、CDR2、及CDR3序列、和/或VH序列，优选具有结合LGR5的可变域，其至少包含选自由图3所描绘的MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818所组成的群组中的LGR5特异性重链可变区的CDR3序列；或与选自由如图3所描绘的MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818所组成的群组中的VH的CDR3序列的不同在于至多三个、优选至多两个、优选不多于一个氨基酸的重链CDR3序列。该可变域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含如图3所描绘的MF5790；MF5803；MF 5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818的CDR3序列。

LGR5可变域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含选自由如图3所描绘的MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818所组成的群组中的LGR5特异性重链可变区的CDR1、CDR2、及CDR3序列；或与选自由如图3所描绘的MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818所组成的群组中的LGR5特异性重链可变区的CDR1、CDR2、及CDR3序列的不同在于至多三个、优选至多两个、优选至多一个氨基酸的重链CDR1、CDR2、及CDR3序列。该可变域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含如图3所描绘的MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818的CDR1、CDR2、及CDR3序列。优选的重链可变区是MF5790；MF5803；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818。特别优选的重链可变区是MF5790；MF5814；MF5816；及MF5818；优选是MF5814、MF5818、及MF5816，特别优选是重链可变区MF5816。另一优选的重链可变区是MF5818。

已显示，当用于抑制EGFR配体反应性癌症或细胞的生长时，包含具有重链可变区MF3755或其一或多种CDR的一或多个可变域的抗体具有更好的有效性。在双特异性或多特异性抗体的情况下，包含具有重链可变区MF3755或其一或多种CDR的可变域的抗体的臂与包含具有重链可变区MF5818或其一或多种CDR的可变域的臂组合良好。

相对于图3所描绘的序列而言，结合EGFR或LGR5的可变域的VH链可具有一或多个氨基酸取代。VH链优选具有图3的EGFR或LGR5 VH的氨基酸序列，其相对于图3的VH链序列而言，具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

相对于图中的CDR序列而言，CDR序列可具有一或多个氨基酸残基取代。此类一或多个取代例如是为了优化的目的而进行，优选是为了改善抗体的结合强度或稳定性。优化例如是通过诱变程序进行的，其中在优选测试所得抗体的稳定性和/或结合亲和力、以及优选选择经改进的EGFR特异性CDR序列或LGR5特异性CDR序列之后。根据本发明，所属技术领域中的技术人员有充分能力产生包含至少一个经改变CDR序列的抗体变体。例如，可应用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代的实例包括：一种疏水性残基(诸如异白胺酸、缬胺酸、白胺酸、或甲硫胺酸)以另一种疏水性残基取代；以及一种极性残基以另一种极性残基取代，诸如精胺酸以离胺酸、麸胺酸以天冬胺酸、或麸酰胺酸以天冬酰胺酸取代。

优选的是，所提及的如本文所指定的VH或VL中的至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选1、2、3、4、或5个氨基酸取代优选是保守性氨基酸取代。本文所指定的VH或VL中的氨基酸插入、缺失、及取代优选不存在于CDR3区中。所提及的氨基酸插入、缺失、及取代优选也不存在于CDR1及CDR2区中。所提及的氨基酸插入、缺失、及取代优选也不存在于FR4区中。

所提及的至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个，且优选1、2、3、4、5个氨基酸取代优选是保守性氨基酸取代，插入、缺失、取代、或其组合优选不在VH链的CDR3区，优选不在VH链的CDR1、CDR2、或CDR3区中，且优选不在FR4区中。

包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域的抗体优选包含:

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合；并且

其中结合LGR5的可变域的VH链包含：

-如图3所描绘的VH链MF5790的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF5790的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域的抗体优选包含：

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或

其中结合LGR5的可变域的VH链包含：

-如图3所描绘的VH链MF5803的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF5803的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或

其中结合LGR5的可变域的VH链包含：

-如图3所描绘的VH链MF5814的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF5814的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或

其中结合LGR5的可变域的VH链包含：

-如图3所描绘的VH链MF5816的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF5816的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或

其中结合LGR5的可变域的VH链包含：

-如图3所描绘的VH链MF5817的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF5817的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

-如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列，或

其中结合LGR5的可变域的VH链包含：

-如图3所描绘的VH链MF5818的氨基酸序列；或

-如图3所描绘的VH链MF5818的氨基酸序列，其就该VH而言，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，且优选具有1、2、3、4、或5个氨基酸插入、缺失、取代、或其组合。

保留EGFR或LGR5结合的本文所述氨基酸序列的额外变体可从例如噬菌体显示库获得，所述库含有重排的人类IGKVl-39/IGKJl VL区(De Kruif等人,BiotechnolBioeng.2010(106)741-50)、以及VH区的集合，所述VH区将氨基酸取代并入至本文所公开的EGFR或LGR5 VH区的氨基酸序列，如先前所述(例如，WO2017/069628)。可选择编码结合EGFR或LGR5的Fab区的噬菌体并通过流动式细胞测量术分析，且进行测序以识别保留抗原结合的具有氨基酸取代、插入、缺失、或添加的变体。

EGFR/LGR5抗体的VH/VL EGFR及LGR5可变域的轻链可变区可相同或不同。在一些实施例中，EGFR/LGR5抗体的VH/VL EGFR可变域的VL区类似于VH/VL LGR5可变域的VL区。在某些实施例中，第一VH/VL可变域与第二VH/VL可变域中的VL区是相同的。

在某些方面中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区包含共同轻链可变区。在一些方面中，一个或两个VH/VL可变域的共同轻链可变区包含生殖系IgVκ1-39可变区V区段。在某方面中，一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区包含κ轻链V区段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因(Immunoglobulin Variable Kappa 1-39Gene)的缩写。此基因也称为免疫球蛋白κ可变1-39；IGKV139；IGKV1-39。此基因的外部Id为HGNC:5740；Entrez Gene:28930；Ensembl:ENSG00000242371。合适V区的氨基酸序列在图4中提供。V区可与五个J区中的一者组合。优选的J区是jk1和jk5，且连接的序列被指示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5；替代名称为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据imgt.org上的IMGT数据库全球信息网的命名法)。在某些实施例中，一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05(描述于图4中)。

在一些方面中，EGFR/LGR5双特异性抗体的一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区包含：LCDR1，其包含氨基酸序列QSISSY(描述于图4中)；LCDR2，其包含氨基酸序列AAS(描述于图4中)；以及LCDR3，其包含氨基酸序列QQSYSTP(描述于图4中)(即，根据IMGT的IGKV1-39的CDR)。在一些方面中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区包含：LCDR1，其包含氨基酸序列QSISSY(描述于图4中)；LCDR2，其包含氨基酸序列AASLQS(描述于图4中)；以及LCDR3，其包含氨基酸序列QQSYSTP(描述于图4中)。

在一些方面中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域包含轻链可变区，该轻链可变区包含与图4中所阐述的氨基酸序列至少90％、优选的是至少95％、更优选的是至少97％、更优选的是至少98％、更优选的是至少99％、或100％一致的氨基酸序列。在一些方面中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域包含轻链可变区，该轻链可变区包含与图4中所阐述的氨基酸序列至少90％、优选的是至少95％、更优选的是至少97％、更优选的是至少98％、更优选的是至少99％、或100％一致的氨基酸序列。

例如，在一些方面中，就图4中的序列而言，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域的可变轻链可具有0至10个、优选0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加、或其组合。在一些方面中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区相对于所指示的氨基酸序列而言包含0至9、0至8、0至7、0至6、0至5、0至4、优选0至3、优选0至2、优选0至1、及优选0个氨基酸插入、缺失、取代、添加、或其组合。

在其他方面中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变域的轻链可变区包含图4中所描绘的序列的氨基酸序列。在某些方面中，EGFR/LGR5抗体的VH/VL可变域均包含相同的VL区。在一个实施例中，EGFR/LGR5双特异性抗体的两个VH/VL可变域的VL包含图4中所阐述的氨基酸序列。在一个方面中，EGFR/LGR5双特异性抗体的两个VH/VL可变域的VL包含图4中所阐述的氨基酸序列。

如本文所述的EGFR/LGR5抗体优选为具有两个可变域的双特异性抗体，其中一个结合EGFR，且另一个结合LGR5，如本文所述。用于本文所公开的方法中的EGFR/LGR5双特异性抗体可以多种格式提供。许多不同格式的双特异性抗体均为本领域中已知的，且已由Kontermann(Drug Discov Today,2015Jul；20(7):838-47；MAbs,2012 Mar-Apr；4(2):182-97)且在Spiess等人,(Alternativemolecular formats and therapeutic applicationsfor bispecific antibodies.Mol.Immunol.(2015)http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)中评述，其各自以引用方式并入本文中。例如，不是具有两个VH/VL组合的典型抗体的双特异性抗体格式至少具有包含重链可变区及轻链可变区的可变域。此可变域可连接至单链Fv片段、单抗体、VH、及提供第二结合活性的Fab片段。

在一些方面中，用于本文所提供的方法中的EGFR/LGR5双特异性抗体通常属于人类IgG子类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些方面中，抗体属于人类IgG1子类别。全长IgG抗体因其有利的半衰期且由于低免疫原性的故而是优选的。因此，在某些方面中，EGFR/LGR5双特异性抗体是全长IgG分子。在一个方面中，EGFR/LGR5双特异性抗体是全长IgG1分子。

因此，在某些方面中，EGFR/LGR5双特异性抗体包含可结晶片段(fragmentcrystallizable,Fc)。EGFR/LGR5双特异性抗体的Fc优选包含人类恒定区。EGFR/LGR5双特异性抗体的恒定区或Fc相较于自然产生的人类抗体的恒定区，可含有一或多个、优选不多于10、优选不多于5个氨基酸差异。例如，在某些方面中，双特异性抗体的各Fab臂可进一步包括Fc区，该Fc区包含促进双特异性抗体的形成、促进稳定性和/或本文所述的其他特征的修饰。

双特异性抗体一般是由表达编码该抗体的核酸的细胞产生。因此，在一些方面中，本文所公开的双特异性EGFR/LGR5抗体是通过提供包含编码双特异性EGFR/LGR5抗体的重链可变区与轻链可变区以及恒定区的一或多种核酸的细胞而产生。细胞优选的是动物细胞、更优选的是哺乳动物细胞、更优选的是灵长类细胞、最佳的是人类细胞。合适的细胞是能够包含且优选产生EGFR/LGR5双特异性抗体的任何细胞。

用于抗体产生的合适细胞是本领域已知的，且包括融合瘤细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞、NS0细胞、或PER-C6细胞。各种机构及公司已研发出用于大规模生产抗体的细胞是，例如用于临床用途。此类细胞是的非限制性实例是CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。在一特别优选的实施例中，该细胞是人类细胞。优选的是，细胞通过腺病毒E1区或其功能等效物而转化。此类细胞系的优选实例是PER.C6细胞是或其等效物。在一特别优选的实施例中，该细胞是CHO细胞或其变体。优选的是，变体使用用于表达抗体的麸酰胺酸合成酶(Glutamine synthetase,GS)载体系统。在一个优选的方面中，细胞是CHO细胞。

在一些方面中，细胞表达构成EGFR/LGR5双特异性抗体的不同轻链和重链。在某些方面中，细胞表达两个不同的重链和至少一个轻链。在一个优选的实施例中，细胞表达本文所述的“共同轻链”以减少不同抗体物种(不同重链与轻链的组合)的数目。例如，使用本领域已知的用于生产双特异性IgG的方法将相应的VH区与重排的人类IGKV1 39/IGKJ1(huVκ139)轻链一同克隆至表达载体中(WO2013/157954；以引用方式并入本文中)，该轻链先前显示能够与多于一个重链配对，从而产生具有不同特异性的抗体，这有利于双特异性分子的产生(De Kruif等人,J.Mol.Biol.2009(387)548 58；WO2009/157771)。

一种表达共同轻链及等量的两个重链的抗体产生细胞一般产生50％的双特异性抗体及25％的各单特异性抗体(即，具有相同的重轻链组合)。已公布了几种方法来支持双特异性抗体的产生而非单独单特异性抗体的产生。此类一般是通过修饰重链的恒定区以便所述重链有利于异二聚化(即，与其他重链/轻链组合的重链的二聚化)而非同二聚化来实现。在一优选的方面中，本发明的双特异性抗体包含具有兼容异二聚化域的两种不同的免疫球蛋白重链。本领域中已描述了各种相容的异二聚化域。相容的异二聚化域优选为相容的免疫球蛋白重链CH3异二聚化域。本领域描述了可实现重链的此类异二聚化的各种方法。

在US 9,248,181和US 9,358,286中公开了一种用于生产EGFR/LGR5双特异性抗体的优选方法。具体而言，基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是第一CH3域中的氨基酸取代L351K与T366K(EU编号)(“KK变体”重链)、以及第二域中的氨基酸取代L351D与L368E(“DE变体”重链)，反之亦然。如先前所述，DE变体与KK变体优先配对以形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。由于在相同重链之间的CH3-CH3界面中的带电残基之间强烈的排斥作用，几乎不会发生DE变体重链(DEDE同二聚体)或KK变体重链(KKKK同二聚体)的同二聚化。

因此，在一个方面中，包含结合EGFR的可变域的重链/轻链组合包含重链的DE变体。在此实施例中，包含结合LGR5的可变域的重链/轻链组合包含重链的KK变体。

候选EGFR/LGR5 IgG双特异性抗体可使用任何合适的测定来测试结合。例如，与CHO细胞上的膜表达的EGFR或LGR5的结合可通过流动式细胞测量术来评估(根据如先前在WO2017/069628中所述的FACS程序)。在一个方面中，候选EGFR/LGR5双特异性抗体与CHO细胞上的LGR5的结合是通过根据本领域已知的标准程序进行的流动式细胞测量术来证明。将与CHO细胞的结合与未利用EGFR和/或LGR5的表达匣转染的CHO细胞进行比较。使用利用EGFR表达建构体转染的CHO细胞来判定候选双特异性IgG1与EGFR的结合；LGR5单特异性抗体与EGFR单特异性抗体、以及不相关的IgG1同型对照mAb作为对照(例如，结合LGR5及另一种抗原诸如破伤风毒素(tetanus toxin,TT)的抗体)而被包括于测定中。

候选EGFR/LGR5双特异性抗体的LGR5和EGFR Fab对于其目标的亲和力可通过表面电浆共振(surface plasmon resonance,SPR)技术并使用BIAcore T100来测量。简言之，抗人类IgG小鼠单株抗体(Becton and Dickinson,目录号Nr.555784)使用游离胺化学(NHS/EDC)偶联至CM5传感器芯片的表面。然后将bsAb捕获至传感器表面上。随后，重组纯化抗原人类EGFR(Sino Biological Inc,目录号Nr.11896-H07H)及人类LGR5蛋白是在浓度范围内在传感器表面上运行，以测量缔合速率及解离速率。在各周期之后，传感器表面通过HCl的脉冲而再生，并且再次捕获bsAb。根据所获得的感应谱，如先前在US 2016/0368988中针对CD3所述，使用BIAevaluation软件来判定与人类LGR5和EGFR结合的缔合速率及解离速率以及亲和力值。

如本文所述的抗体一般是双特异性全长抗体，优选属于人类IgG子类别，优选属于人类IgG1子类别。此类抗体具有良好的ADCC性质(若需要，其可通过本领域中已知的技术来增强)，在对人类进行体内施用方面具有有利的半衰期，且存在CH3工程技术，其在克隆细胞中的共表达方面可提供优先形成异二聚体而非同二聚体的经修饰的重链。

当抗体本身具有低ADCC活性时，可通过修饰抗体的恒定区来改善抗体的ADCC活性。另一种改善抗体的ADCC活性的方法是通过以酶促进方式干扰导致岩藻醣减少的糖基化路径。存在几种体外方法用于判定抗体或效应细胞在引发ADCC中的疗效。此类方法中包括铬-51[Cr51]释放测定、铕[Eu]释放测定、以及硫-35[S35]释放测定。通常，将表达某种表面曝露抗原的标记目标细胞与针对该抗原的抗体一同培养。洗涤后，将表达Fc受体CD16的效应细胞与抗体标记的目标细胞共培养。随后通过释放胞内标记并通过闪烁计数器或分光亮度法来测量目标细胞溶解。

如本文所述的双特异性抗体优选为经ADCC增强的。在一个方面中，双特异性抗体可是经去岩藻糖基化的。当与在正常CHO细胞中产生的相同抗体比较时，双特异性抗体优选包含Fc区中N-连接的碳水化合物结构的减少量的岩藻糖基化。

包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域的抗体可进一步包含一或多个额外可变域，该可变域可结合一或多个进一步的目标。进一步的目标优选为蛋白质，优选为包含胞外部分的膜蛋白。本文所使用的膜蛋白是细胞膜蛋白，诸如位于细胞的外膜中的蛋白，该膜将细胞与外界隔开。膜蛋白具有胞外部分。若膜蛋白含有位于细胞的细胞膜中的跨膜区，则膜蛋白至少是在细胞上。

具有多于两个可变域的抗体是本领域已知的。例如，可能将额外可变域附接至抗体的恒定部分。具有三或更多个可变域的抗体优选是如PCT/NL2019/050199(其以引用方式并入本文中)中所述的多价多聚体抗体。

在一个方面中，抗体是包含两个可变域的双特异性抗体，其中一个可变域结合EGFR的胞外部分，且另一个可变域结合LGR5的胞外部分。可变域优选是如本文所述的可变域。

如本文所述的抗体的功能部分如本文所述至少包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域。因此，其包含如本文所述抗体的抗原结合部分，且一般含有抗体的可变域。功能部分的可变域可是单链Fv片段或所谓的单域抗体片段。单域抗体片段(sdAb)是具有单个单体可变抗体域的抗体片段。就像完整抗体，其能够选择性结合至特定抗原。单域抗体片段的分子量仅为12–15kDa，远远小于由两个重蛋白链与两个轻链构成的共同抗体(150–160kDa)，甚至小于Fab片段(～50kDa，一个轻链与半个重链)及单链可变片段(～25kDa，两个可变域，一个来自轻链，且一个来自重链)。单域抗体本身并非远远小于正常抗体(一般是90-100kDa)。单域抗体片段主要工程改造自骆驼科动物(camelid)中所发现的重链抗体；这些被称为VHH片段()。一些鱼类也具有仅重链抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，从这些抗体可以获得称为VNAR片段的单域抗体片段。替代方法是将来自人类或小鼠的共同免疫球蛋白G(IgG)的二聚体可变域分成单体。虽然大多数针对单域抗体的研究目前是基于重链可变域，衍生自轻链的奈米抗体(nanobody)也已显示特异性地结合至目标表位。抗体部分的此类可变域的非限制性实例是VHH、人类域抗体(dAb)、及单抗体(Unibody)。优选的抗体部分或衍生物具有抗体或其等效物的至少两个可变域。此类可变域或其等效物的非限制性实例是F(ab)片段及单链Fv片段。双特异性抗体的功能部分包含双特异性抗体的抗原结合部分、或结合部分的衍生物和/或类似物。如上文所提及，抗体的结合部分涵盖于可变域中。

也提供如本文所公开的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物(即，治疗性化合物)、以及医药上可接受的载剂。此类医药组合物适用于治疗癌症，特别适用于治疗头颈癌。如本文所使用，用语“医药上可接受的(pharmaceutically acceptable)”是指经政府监管机构核准或在美国药典或另一种公认的药典中列出，供在动物、特别是人类中使用，且包括任何及所有溶剂、盐、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、及吸收延迟剂、以及生理学上兼容的类似者等。用语“载剂(carrier)”是指与化合物一同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或媒剂。此类医药载剂可以是无菌液体，诸如水与油，包括石油、动物、植物、或合成来源者，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯、及类似者。水或盐水溶液以及葡萄糖水溶液及甘油溶液可用作载剂，特别是用于可注射溶液。用于肠胃外施用的液体组合物可经配制用于通过注射或连续输注进行的施用。通过注射或输注施用的途径包括膀胱内、瘤内、静脉内、腹膜内、肌内、鞘内、及皮下。根据施用途径(例如静脉内、皮下、关节内、及类似者)，活性化合物可涂布于材料中以保护化合物免于酸及其他可使化合物去活化的自然条件的作用。

适合对人类患者施用的医药组合物一般经配制用于肠胃外施用，例如在液体载剂中，或适合于重组至用于静脉内施用的液体溶液或悬浮液。为了便于施用及剂量的均一度，组合物可以剂量单位形式配制。也包括固体制剂，其意在用于在使用前不久转换为口服或肠胃外施用的液体制剂。此类液体形式包括溶液、悬浮液、及乳液。

所公开的治疗性化合物可根据合适的剂量及合适的途径(例如，静脉内、腹膜内、肌内、鞘内、或皮下)来施用。例如，可施用单次大剂量，可随时间的推移施用几个分割的剂量，或者如由治疗情况的紧迫性指示，剂量可按比例减少或增加。在一个实施例中，向受试者施用单剂量的如本文所公开的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物。在一些实施例中，治疗性化合物将在一个治疗过程中重复施用。例如，在某些实施例中，向需要治疗的受试者施用多(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多)剂量的治疗性化合物。在一些实施例中，治疗性化合物的施用可每周、每两周、或每月进行。优选的是，本发明的抗体每两周施用一次。

临床医师可根据所治疗患者的病况来使用优选剂量。剂量可取决于许多因素，包括疾病分期等。根据一或多种此类因素的存在来判定应施用的具体剂量是在所属技术领域中普通技术人员的技能范围内。通常，治疗是以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始。此后，少量增加剂量，直至达到该情况下的最佳效果。为方便起见，若需要，可将总日剂量分割并在一天内分次施用。也可使用间歇性疗法(例如，三周中的一周、或四周中的三周)。

在某些方面中，治疗性化合物是以0.1、0.3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10mg/kg体重的剂量施用。在另一实施例中，治疗性化合物是以0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10mg/kg体重的剂量施用。

在一优选的方面中，治疗性化合物(即，包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物)是以1500mg的剂量提供给受试者。平剂量在体表或重量给药上提供几个优点，因为其减少制备时间，并减少潜在的剂量计算错误。在一些实施例中，治疗性化合物是以至少1100mg的剂量提供，优选的是以1100mg至2000mg之间的剂量提供，更优选的是以1100mg至1800mg之间的剂量提供。如所属技术领域中普通技术人员所理解的，剂量可随时间的推移来施用。例如，剂量可通过IV例如以1-6小时输注、优选2-4小时输注来施用。在一些实施例中，治疗性化合物每2周施用一次。在一些实施例中，本文所公开的平剂量适用于成人和/或体重至少35kg的受试者。优选的是，受试者患有头颈癌。

本公开提供可使用预先用药方案。此类方案可应用于降低输注相关反应的可能性或严重性。优选的是，在抗体治疗前(例如，口服、静脉内)施用类固醇或皮质类固醇(诸如迪皮质醇(dexamethasone))和/或抗组织胺或H1拮抗剂(诸如右旋氯菲安明(dexchlorpheniramine)、二苯安明(diphenhydramine)、或氯菲安明(chlorpheniramine))、或用以减少胃酸产生的药物(诸如雷尼替丁(ranitidine))。此外，用以减轻、治疗、或缓解疼痛或发热的药物可预先用药，诸如通过施用醋氨酚或类似者。

优选的预先用药方案包括迪皮质醇20mg(IV)、右旋氯菲安明5mg(IV)或二苯安明50mg(PO)或氯菲安明10mg(IV)及雷尼替丁50mg(IV)或150mg(PO)、以及醋氨酚1g(Iv)或650mg(PO)。

本文所描述的治疗方法一般持续至监督患者照护的临床医师认为该治疗方法有效，即患者对治疗有反应之时。指示治疗方法有效的非限制性参数可包括下列的一或多者：肿瘤细胞减少；抑制肿瘤细胞增生；肿瘤细胞消除；无恶化存活期；通过合适的肿瘤标记作出的适当反应(若适用)。

关于施用治疗性化合物的频率，所属领域中普通技术人员将能够判定适当的频率。例如，临床医师可决定相对不频繁地(例如，每两周一次)施用治疗性化合物，并逐渐缩短患者所耐受的剂量之间的周期。根据所主张的方法，与疗法过程相关联的例示性时间长度包括：约一周；两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年；约五年；永久(例如，持续的维持疗法)。前述持续时间可能与一或多轮/周期的治疗相关联。

本文所提供的治疗的疗效可使用任何合适的手段来评估。在一个实施例中，利用癌细胞数目减少作为客观反应标准来分析治疗的临床疗效。根据本文所公开的方法治疗的患者例如人类优选经历至少一种癌症迹象的改善。在一些实施例中，可发生下列的一或多者：癌细胞的数目可减少；预防或延迟癌症复发；与癌症相关联的一或多种症状可在某种程度上缓解。此外，用以判定T细胞的体外测定介导了目标细胞溶解。在一些实施例中，肿瘤评估基于CT扫描和/或MRI扫描，参见例如RECIST 1.1指南(Response Evaluation Criteriain SolidTumours)(Eisenhauer等人,2009 Eur J Cancer 45:228–247)。此类评估通常在治疗后每4-8周进行一次。

在一些方面中，肿瘤细胞在如本文所述的治疗后不再可检测。在一些实施例中，受试者呈部分或完全缓解。在某些方面中，受试者的整体存活期、中位存活率、和/或无恶化存活期有所提高。

治疗性化合物(即，包含结合EGFR的胞外部分的可变域及结合LGR5的胞外部分的可变域的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物)也可与其他熟知的疗法(例如，化学疗法或放射疗法)配合而使用，所述疗法因其针对所治疗的癌症的特殊有用性而被选择。

安全且有效的化学治疗剂的施用方法是所属领域中普通技术人员已知的。此外，其施用描述于标准文献中。例如，许多化学治疗剂的施用描述于Physicians'DeskReference(PDR)中，例如，1996年版(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)；其公开在此以引用方式并入本文中。

对所属技术领域中普通技术人员而言显而易见的是，施用化学治疗剂和/或放射疗法可根据所治疗的疾病以及化学治疗剂和/或放射疗法对该疾病的已知作用而变化。另外，依据熟练临床医师的知识，治疗方案(例如，施用的剂量及次数)可鉴于所观察到的所施用的治疗剂对患者的作用，并鉴于所观察到的疾病对所施用的治疗剂的反应而改变。

优选的是，人类受试者满足下列任何或全部要求。

1.在开始任何研究程序之前签署知情同意书。

2.签署知情同意书时年龄≥18岁。

3.组织学或细胞学上确诊的实性瘤，伴有转移性或局部晚期疾病的证据，不适合具有治愈意图的标准疗法：

扩展群组非CRC肿瘤类型：可探查患有晚期或转移性头颈部鳞状细胞癌的患者，无论其是否先前已使用至少2线标准核准疗法进行治疗。

4.来自转移部位或原发部位的基线新鲜肿瘤样本(FFPE，且若有足够的材料，也冷冻)。

5.顺从活检。

6.通过放射方法并由RECIST版本1.1所定义的可测量疾病。

7.美国东岸癌症临床研究合作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)体能状态0或1。

8.根据研究者，预期寿命≥12周。

9.通过超音波心电图(echocardiogram,ECHO)或多频道心室功能扫描(multiplegated acquisition scan,MUGA)显示的左心室射出分率(left ventricularejectionfraction,LVEF)≥50％。

10.适当的器官功能：

·绝对嗜中性球计数(ANC)≥1.5×109/L

·血红素≥9 g/dL

·血小板≥100×109/L

·正常范围内的校正总血清钙

·正常范围内的血清镁(或用补充剂校正)

·丙胺酸转胺酶(ALT)、天门冬胺酸转胺酶(AST)≤2.5×正常上限(ULN)且总胆红素≤1.5×ULN(除非是由于已知的捷倍耳氏症候群，若总胆红素>3.0×ULN或直接胆红素>1.5×ULN则其被排除在外)；在肝脏侵害(liver involvement)的情况下，允许ALT/AST≤5×ULN且总胆红素≤2×ULN，除非是由于已知的捷倍耳氏症候群，此情况下允许总胆红素≤3.0×ULN或直接胆红素≤1.5×ULN，或是肝细胞癌[Child-Pugh分级A]，此情况下允许总胆红素<3 mg/dL

·根据针对年龄>65岁患者的Cockroft and Gault公式或MDRD公式计算出的血清肌酸酐≤1.5×ULN或肌酸酐清除≥60 mL/min

·血清白蛋白>3.3g/dL。

本文所描述的化合物和组合物可用作疗法且用于治疗性治疗，且因此可用作药剂且用于制备药剂的方法中。

本文所描述的所有文件及参考文献，包括基因库项目、专利及公开专利申请案、以及网站各自在相同程度上明确地以引用方式并入本文中，如同全部或部分地写入此文件中。

出于清晰性及简洁说明的目的，本文将特征描述为相同或独立实施例的一部分，然而应了解，本发明的范围可包括具有所述特征的全部或一部分的组合的方面或实施例。

本发明现通过参考下列实例来描述，其仅是说明性的，并不旨在限制本发明。虽然已详细地说明了本发明，并参考其特定实施例，但是对所属技术领域中普通技术人员而言，显然在不脱离本发明精神及范围的情况下，可对本发明进行各种变更及修改。

实例

如本文所使用，“MFXXXX”其中X独立地是数字0-9，是指包含可变域的Fab，其中VH具有通过图3中所描绘的4位数识别的氨基酸序列。除非另有指示，否则可变域的轻链可变区一般具有图4b的序列。实例中的轻链具有如图4a中所描绘的序列。“MFXXXX VH”是指4位数识别的VH的氨基酸序列。MF进一步包含轻链的恒定区以及通常与轻链的恒定区相互作用的重链的恒定区。重链的VH/可变区不同，且一般CH3区也如此，其中重链中的一者具有其CH3域的KK突变，且另一者具有其CH3域的补充DE突变(参见PCT/NL2013/050294(公开为WO2013/157954)以及图5d及图5e供参考)。在实例中的双特异性抗体具有：Fc尾，其具有KK/DE CH3异二聚化域、如图5所指示的CH2域及CH1域；如图4a所指示的共同轻链；及如MF数字所指明的VH。例如，由MF3755 xMF5816所指示的双特异性抗体具有以上一般序列、及带有具有MF3755的序列的VH的可变域、以及带有具有MF5816的序列的VH的可变域。

图3中指示各种重链可变区(VH)的氨基酸及核酸序列。双特异性抗体EGFR/LGR5、MF3755xMF5816；包含重链可变区MF3755和MF5816及共同轻链，且包括源自去岩藻糖基化的针对增强ADCC的修饰、以及图3所描绘的LGR5与EGFR组合，已在WO2017/069628中显示有效。

双特异性抗体的产生

通过编码具有不同VH域的IgG的两种质粒的瞬时共转染来产生双特异性抗体，使用专有的CH3工程技术以确保高效的异二聚体化及双特异性抗体的形成。共同轻链也在同一细胞中共转染，在同一质粒上或在另一质粒上。在我们的申请案中(例如WO2013/157954与WO2013/157953；以引用方式并入本文中)，我们已公开用于从单细胞产生双特异性抗体的方法及手段，藉此提供有利于形成双特异性抗体而非形成单特异性抗体的手段。此方法也可有利地用于本发明中。具体而言，基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是在位置351及366处的氨基酸取代，例如第一CH3域(“KK变体”重链)中的L351K与T366K(根据EU编号来进行编号)、以及在位置351及368处的氨基酸取代，例如第二CH3域中的L351D与L368E(“DE变体”重链)，反之亦然(参见图5d及图5e)。先前已在所提及的申请案中证实，带负电DE变体重链与带正电KK变体重链优先配对形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。由于在相同重链之间的CH3-CH3界面中的带电残基之间强烈的排斥作用，几乎不会发生DE变体重链(DE-DE同二聚体)或KK变体重链(KK-KK同二聚体)的同二聚化。

将上文所述结合LGR5的可变域的VH基因克隆至编码带正电的CH3域的载体中。将结合EGFR的可变域的VH基因，诸如在WO 2015/130172中所公开者(以引用方式并入本文中)克隆至编码带负电的CH3域的载体中。将悬浮液生长适应性293F自由式细胞培养在摇动器平台上的T125烧瓶中，直至密度为3.0×10e6个细胞/ml。将细胞以0.3-0.5×10e6个活细胞/ml的密度接种在24深孔板的各孔中。细胞是利用编码不同抗体的两种质粒的混合物瞬时转染，克隆至专有的载体系统中。转染后7天，采集细胞上清液并透过0.22μM过滤器(Sartorius)进行过滤。将无菌上清液储存在4℃下，直到抗体纯化。

IgG纯化及定量

使用蛋白质A亲和层析法在无菌条件下在过滤板中进行纯化。首先，将培养基的pH调整至pH 8.0，且随后，将含IgG的上清液与蛋白质A琼脂糖CL-4B珠粒(50％v/v)(Pierce)在25℃下、以600rpm在摇动平台上一同培养2小时。接着，通过过滤来采集珠粒。用pH 7.4的PBS洗涤珠粒两次。然后用0.1M柠檬酸盐缓冲液在pH 3.0下洗提经结合的IgG，并立即使用Tris pH 8.0来中和洗出液。使用多屏幕Ultracel 10多板(Millipore)并通过离心来执行缓冲液更换。最终在pH7.4的PBS中采集样本。使用Octet来测量IgG浓度。在4℃下储存蛋白质样本。

为了测定纯化的IgG的量，抗体的浓度是使用蛋白质A生物传感器(Forte-Bio，根据供货商建议)并使用人类IgG(Sigma Aldrich,目录号nr.I4506)作为标准，通过Octet分析进行判定。

下列双特异性抗体适合用于此实例中及用于本发明的方法中：MF3370xMF5790、MF3370x5803、MF3370x5805、MF3370x5808、MF3370x5809、MF3370x5814、MF3370x5816、MF3370x5817、MF3370x5818、MF3755xMF5790、MF3755x5803、MF3755x5805、MF3755x5808、MF3755x5809、MF3755x5814、MF3755x5816、MF3755x5817、MF3755x5818、MF4280xMF5790、MF4280x5803、MF4280x5805、MF4280x5808、MF4280x5809、MF4280x5814、MF4280x5816、MF4280x5817、MF4280x5818、MF4289xMF5790、MF4289x5803、MF4289x5805、MF4289x5808、MF4289x5809、MF4289x5814、MF4289x5816、MF4289x5817、及MF4289x5818。各双特异性抗体包含两个分别由能够结合EGFR及LGR5的MF编号指定的VH，进一步包含：Fc尾，其具有分别由SEQ ID NO:136(图5d)及SEQ ID NO:138(图5e)所指示的KK/DE CH3异二聚化域、如由SEQIDNO:134所指示的CH2域(图5c)、以及如由SEQ ID NO:131所指示的CH1域(图5a)、如由SEQ IDNO:121所指示的共同轻链(图4)。

实例1：使用患者衍生的异种移植物(PDX)小鼠模型对针对头颈癌的抗EGFR x抗LGR5抗体的体内评估

小鼠PDX模型

Crown Biosciences Inc.已开发一批衍生自手术切除的人类原发性肿瘤的患者衍生的异种移植物(PDX)模型。本文所使用的PDX模型是临床及分子标注的，并如实地代表相应肿瘤的临床流行病学。此等模型可皮下注射在免疫缺陷小鼠的侧腹。使用不同的头颈PDX模型来评估全长IgG1双特异性抗体的治疗效果，该抗体包含MF3755 x MF5816以及所指示的进一步相关域(即CH1、CH2、KK/DE修饰的CH3异二聚化域以及共同轻链)。表1中描述此等模型的详细信息，包括癌症亚型、基因体突变的存在、以及EGFR/LGR5表达水平。

表1：源自头颈癌患者的PDX模型的特性。

LGR5及EGFR表达通过RNA测序(RNAseq)来判定。突变状态通过基因体分析来判定。HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌；ADC：腺癌；BW＝体重，FPKM＝基于外显子模型每百万映像读取的每千碱基的片段的标准化。

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肿瘤接种及随机分组

从携带已建立的原发性人类肿瘤的小鼠采集用于接种的新鲜肿瘤组织。将新鲜肿瘤切成小片(直径大约2-3 mm)，并皮下移植在小鼠的右上背侧。将肿瘤块接种在平均体重约16至20克的6-8周龄雌性BALB/c裸鼠或NOD/SCID小鼠中。当平均肿瘤大小达到100-150mm³时，将小鼠随机分组。将每个模型总共16只小鼠纳入研究中(4只对照小鼠与12只抗体治疗的小鼠)。基于“匹配分布(Matched distribution)”方法(StudyDirectorTM软件，版本3.1.399.19)进行随机分组。对照小鼠接受PBS。

治疗及取样时程表

在随机分组当天给予首次治疗，该天被视为实验的第0天。以在给药之前从20mg/mL储备液抗体新鲜制备剂量，使用200μl注射体积对所有小鼠进行腹膜内注射(i.p.)，每周一次，持续6周。对照小鼠接受PBS，而抗体治疗的小鼠以针对体重而调整给药体积(给药体积＝10μL/g)来治疗。与其重量无关，各小鼠接受0.5mg抗体(大约25mg\kg)，如表2中所详述。治疗期结束后，所有小鼠必须经受3周的观察期。若肿瘤未生长至伦理上可接受的最大肿瘤大小，则观察期延长。使用相同的注射体积向对照小鼠注射PBS。

表2：治疗计划

QW＝每周一次，ROA＝施用途径，i.p.＝腹膜内。

观察、样本及数据收集

肿瘤接种后，每天检查动物的发病率与死亡率。在常规监测期间，检查动物的肿瘤生长、行为变化、移动性变化、食物与水消耗量、体重增加/减少(随机分组后，每周测量两次体重)、眼睛/毛发铺垫的任何影响以及任何其他异常。针对个别动物，记录死亡率及所观察到的临床征象。

随机分组后，在两个维度上使用卡尺每周测量两次肿瘤体积，且体积是使用公式：V＝(L×W×W)/2且以mm³来表达，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。通过使用StudyDirectorTM软件(版本3.1.399.19)来记录体重及肿瘤体积。在第9周结束时或当动物达到人道终点时(例如：肿瘤体积大于2000mm³或重量减轻多于起始体重的15％)，以先发生者为准，处死小鼠。

结果

在所测试的头颈癌PDX模型中，在所涉及的时段测试的七种头颈部鳞状细胞癌中的七种中用双特异性抗体治疗显示出治疗有效性(图6)。此外，在三个模型中观察到肿瘤生长显著减少。模型HN2167与HN2590在观察期结束时比在治疗开始时显示出更低的肿瘤体积，表明了在头颈癌中由双特异性抗体介导的肿瘤抑制。与经媒剂治疗的小鼠相比，模型HN2579、HN5124、HN3642、HN3411、及HN5125的小鼠也对抗体治疗有良好反应，并显示肿瘤体积减少。

统计分析

为了比较不同组在预先指定日的肿瘤体积，首先运行Bartlett检验以确认所有组的变异数同构型的假设。若Bartlett检验的p值≥0.05，则运行单因素ANOVA以检验所有组的整体均值相等性。若单因素ANOVA的p值<0.05，则通过运行针对所有成对比较的Tukey'sHSD(诚实显著差异)检验以及用于比较各治疗组与媒剂组的Dunnett检验来进行进一步的事后检验。若Bartlett检验的p值<0.05，则运行Kruskal-Wallis检验以检验所有组中的中位数的整体相等性。若Kruskal-Wallis检验的p值<0.05，则通过运行针对所有成对比较、或用于比较各治疗组与媒剂组(两者均进行单步p值调整)的Conover非参数检验来进行进一步的事后检验。所有统计分析均是用R—a语言且在用于统计计算及图形(版本3.3.1)的环境中进行。除非另外指定，否则所有检测均是双侧，且p值<0.05视为具有统计学意义。

实例2：用于患有头颈癌的患者的抗EGFR x抗LGR5抗体的剂量扩展及疗效：

晚期实性瘤中的1期剂量递增研究

研究设计

用初始剂量递增部分进行1期开放标签多中心研究来判定本公开的抗EGFRx抗LGR5双特异性抗体用于起始剂量是5mg平剂量的mCRC患者的实性瘤的推荐2期剂量(recommended phase 2 dose,RP2D)。一旦建立RP2D，则在研究的扩展部分、包括在诊断患有头颈癌的患者中进一步评估抗体。在所有患者中表征抗体的安全性、PK、免疫原性、及初步抗肿瘤活性，且进行生物标志物分析，包括EGFR和LGR5状态。

纳入标准

患者必须满足下列全部要求方可进入本研究。

1.在开始任何研究程序之前签署知情同意书。

2.签署知情同意书时年龄≥18岁。

扩展群组非CRC肿瘤类型：可探查患有晚期或转移性头颈部鳞状细胞癌的患者，无论其是否先前已使用至少2套标准核准疗法进行治疗。

5.顺从活检。

6.通过放射方法并由RECIST版本1.1所定义的可测量疾病。

8.根据研究者，预期寿命≥12周。

10.适当的器官功能：

·绝对嗜中性球计数(ANC)≥1.5×109/L

·血红素≥9g/dL

·血小板≥100×109/L

·正常范围内的校正总血清钙

·正常范围内的血清镁(或用补充剂校正)

·丙胺酸转胺酶(ALT)、天门冬胺酸转胺酶(AST)≤2.5×正常上限(ULN)且总胆红素≤1.5×ULN(若总胆红素>3.0×ULN或直接胆红素>1.5×ULN则被排除在外，除非是由于已知的捷倍耳氏症候群)；在肝脏侵害(liver involvement)的情况下，允许ALT/AST≤5×ULN且总胆红素≤2×ULN，除非是由于已知的捷倍耳氏症候群，此情况下允许总胆红素≤3.0×ULN或直接胆红素≤1.5×ULN，或是肝细胞癌[Child-Pugh分级A]，此情况下允许总胆红素<3mg/dL

·根据针对年龄>65岁患者的Cockroft and Gault公式或MDRD公式计算出的血清肌酸酐≤1.5×ULN或肌酸酐清除≥60mL/min

·血清白蛋白>3.3g/dL。

排除标准

存在下列任何标准均排除患者参与研究。

1.中枢神经系统转移未经治疗或有症状，或需要放射、手术、或持续类固醇疗法以控制在进入研究的14天内的症状。

2.已知的软脑膜侵害。

3.在研究开始之前的4周内参与另一项临床试验或使用任何研究性药物进行治疗。

4.在4周内或5个半衰期内的任何系统性抗癌疗法，以研究治疗的第一剂量较长者为准。对于具有严重延迟毒性的细胞毒性剂(例如丝裂霉素C、亚硝脲)、或抗癌免疫疗法，要求6周的消除期。

5.需要免疫抑制药物(例如胺甲喋呤、环磷酰胺)。

6.在研究治疗第一剂量的3周内接受重大手术或放射疗法。既往接受过至≥25％骨髓的放射疗法的患者不符合条件，无论接受时间是何时。

7.与先前抗癌疗法相关的持续>1级的临床显著毒性(脱发除外)；允许稳定的感觉神经病变≤2级NCI-CTCAE v4.03。

8.过敏反应史、或任何由人类蛋白质引起的毒性史、或保证此等剂的永久停用的任何赋形剂史。

9.不受控高血压(收缩压>150mmHg和/或舒张压>100mmHg)，伴有适当治疗或不稳定型心绞痛。

10.II-IV级纽约心脏协会(NYHA)标准的郁血性心衰竭史、或需要治疗的严重心律不整(心房震颤、阵发性室上性心博过速除外)。

11.在进入研究的6个月内有心肌梗塞史。

12.既往恶性肿瘤史，切除的子宫颈上皮内瘤样病变或非黑色素瘤皮肤癌、或至少3年无疾病证据而被视为复发风险低的经治愈性治疗的癌症除外。

13.任何起因引起的目前休息时呼吸困难、或需要持续氧疗法的其他疾病。

14.有间质性肺部疾病(例如：肺炎或肺纤维化)史、或在基线胸部CT扫描中有ILD证据的患者。

15.目前的重大疾病或医疗病况，包括但不限于不受控活动性感染、有临床意义的肺部病症、代谢或精神病症。

16.需要治疗的活动性HIV、HBV、或HCV感染。

17.目前硬变状态是Child-Pugh B级或C级的患者；已知的纤维层状HCC、肉瘤样HCC、或胆管癌与HCC混合的患者。

18.妊娠期或哺乳期女性；在参与研究期间、以及在最后一次抗体剂量后的6个月，有生育潜力的患者必须在进入研究前使用高度有效的避孕方法。

剂量递增

在剂量递增部分，患有转移性结肠直肠癌(mCRC)腺癌的患者先前在转移情况下用标准核准疗法治疗，所述标准核准疗法包括奥沙利铂(oxaliplatin)、伊立替康及氟嘧啶(5-FU和/或卡培他滨)，无论是否有抗血管生成，并处理用于KRAS及NRAS野生型RASwt的抗EGFR。

基于来自初步及GLP食蟹猕猴毒物学研究的可用双特异性抗体血清浓度数据产生PK模型。在异速生长定标后，使用该模型来预测人类的抗体暴露。抗体起始剂量是每2周5mg(平剂量)IV，周期是4周。将研究至多11种剂量水平：5、20、50、90、150、225、335、500、750、1100及1500mg(平剂量)。基于患者安全性、PK及PD资料，每个患者及每个群组的施用剂量、剂量增量、及给药频率可能发生变化，然而剂量不会超过每个周期4500mg。

剂量限制毒性(DLT)

在第一周期(28天)期间发生的、且研究者认为其与抗体治疗相关的下列临床毒性和/或实验室异常的任一者将被视为DLT：

血液学毒性：

-4级嗜中性球减少症(绝对嗜中性球计数[ANC]<0.5×109个细胞/L)≥7天

-3-4级发热性嗜中性球减少症

-4级血小板减少症

-与出血发作相关联的3级血小板减少症

-其他4级血液学毒性

·3-4级非血液学AE及实验室毒性，下列除外：

-3-4级输注相关反应

-3级皮肤毒性，其利用最佳治疗在2周内恢复至≤2级

-3级腹泻、恶心、和/或呕吐，其利用最佳治疗在3天内恢复至≤1级或基线

-3级电解质异常，其利用最佳治疗在48小时内消退

-持续≤48小时的3-4级肝脏异常。

·符合Hy定律的定义的任何肝功能异常。

·任何阻止接下来两次施用的持续≥15天的药物相关毒性。

剂量扩展

在扩展部分，本公开的双特异性抗体将在患有头颈癌的患者中以RP2D施用。一旦已定义RP2D，将用此剂量及计划来治疗额外患者，以进一步表征抗体的安全性、耐受性、PK、及免疫原性，并对抗肿瘤活性及生物标志物评估进行初步评定。将得知所治疗的恶性肿瘤共表达两种目标(即，LGR5及EGFR)，且可具有对于EGFR抑制的敏感性的预先指示。

将探索在患有头颈癌的患者中的抗体治疗，例如，各指示10至20名患者，以初步抗肿瘤活性的征象为条件，可能扩展至多40名患者。在本研究的扩展部分期间，安全监察委员会将持续评估RP2D的安全性。若对于任何群组，DLT的发生率超过33％的预定义阈值，则该群组的报名将暂停，并由SMC来执行对安全性、PK、及生物标志物的全面审查，以判定继续在该群组中累积是否安全。届时也对药物的整体安全性进行询问。

研究性疗法及方案

将抗EGFR x抗LGR5双特异性抗体配制成用于IV输注的透明液体溶液。利用标准输注程序每2周进行一次IV输注，起始剂量是5mg(平剂量)，且推荐2期剂量是1500mg(平剂量)。一旦已达到RP2D，则停止剂量递增。输注在第1周期期间必须施用最低4小时以上。在研究者的酌情决定下且在不存在IRR的情况下，第1周期之后的后续输注可减少至2小时。

预先用药

在第1周期期间，所有输注均将在至少4小时的时段内以下列预先用药方案施用：在输注开始前的24小时，施用8mg迪皮质醇PO，在输注开始前的1小时，每位患者将接受迪皮质醇20mg IV、右旋氯菲安明5mg IV或二苯安明50mg PO或氯菲安明10mg IV、雷尼替丁50mgIV或150mg PO以及醋氨酚1g IV或650mg PO。

若患者耐受所有第1周期输注且无IRR，且研究者认为其适当，则患者可继续接受进一步的抗体输注，没有伴随预先用药迪皮质醇，且输注持续时间可减少至2小时。在此类情况下，输注持续时间可向后延长至多～4小时，其中被认为适合避免或降低IRR的发生率或严重程度。对于初始抗体输注，(第1周期第1天)，从输注开始起观察每位患者6小时，且从第二次输注开始起观察4小时。此后，将在所有后续施用的持续时间(至少2小时)内观察患者。

一个周期视为4周。对于各患者，在针对初始抗体输注的输注开始后，执行6小时的观察期，第二次输注时是4小时观察期，且所有后续施用均是至少2小时，至少对应于输注持续时间。以4周的周期每2周以2至4小时IV输注施用抗体。后续周期的第1天是第29天、或从与前一周期相关联的任何不良反应中恢复之后。

治疗持续时间

施用研究治疗，直至确认的疾病进展(根据RECIST 1.1)、不可接受的毒性、撤销同意、患者不依从、研究者决定(例如，临床恶化)、或抗体中断>6个连续周。在末次抗体输注后，对患者进行至少30天的安全性随访，且直至所有相关毒性恢复或稳定，并对疾病进展及存活状态进行12个月的追踪。

疗效评估

在治疗开始后每8周根据RECIST 1.1(Eisenhauer等人,2009 Eur J Cancer 45:228–247)，利用对比剂基于CT/MRI进行肿瘤评估。目标反应必须在第一次观察后至少4周进行确认。对于具有基线骨转移或研究中的疑似病灶的患者，依临床指示执行骨扫描。在筛选时且在各周期的第1天评估循环血液肿瘤标志物，包括癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)。

Claims

1.一种抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域和结合LGR5的胞外部分的可变域，并用于在治疗受试者的头颈癌中使用，其中所述使用包含向所述受试者提供1500mg的平剂量的所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物。

2.如权利要求1所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述受试者是人类受试者。

3.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物以静脉内方式提供。

4.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述头颈癌是鳞状细胞癌或腺癌。

5.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述头颈癌是鳞状细胞癌。

6.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述头颈癌是鼻咽癌、喉癌、下咽癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、口腔癌、及口咽癌。

7.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述头颈癌是口咽鳞状细胞癌。

8.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述头颈癌具有存在于选自HN5124、HN5125、HN2579、HN2590、及HN2167的模型中的LGR5和/或EGFR路径中的一或多种突变。

9.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述癌症的特征在于LGR5和/或EGFR的表达。

10.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中结合EGFR的可变域的VH链包含如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列；或如图3所描绘的VH链MF3755的氨基酸序列，其就所述VH而言，具有至多15个，优选不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，且优选具有不多于5、4、3、2、或1个氨基酸修饰，所述修饰包括插入、缺失、取代、或其组合；并且其中结合LGR5的所述可变域的VH链包含如图3所描绘的VH链MF5816的氨基酸序列；或如图3所描绘的VH链MF5816的氨基酸序列，其就所述VH而言，具有至多15个，优选不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，且优选具有不多于5、4、3、2、或1个氨基酸修饰，所述修饰包括插入、缺失、取代、或其组合。

11.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中结合LGR5的所述可变域结合位于图1所描绘的人类LGR5序列的氨基酸残基21-118内的表位。

12.如权利要求11所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中在人类LGR5的位置43、44、46、67、90、及91处的氨基酸残基参与所述LGR5结合可变域与LGR5的结合。

13.如权利要求11或12所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述LGR5结合可变域与包含选自43A、44A、46A、67A、90A、及91A中的氨基酸残基变异的一者或多者的LGR5蛋白结合较少。

14.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中结合EGFR的所述可变域结合位于图2所描绘的人类EGFR序列的氨基酸残基420-480内的表位。

15.如权利要求14所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中在人类EGFR的位置I462、G465、K489、I491、N493、及C499处的氨基酸残基参与所述EGFR结合可变域与EGFR的结合。

16.如权利要求14或15所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述EGFR结合可变域与包含选自I462A、G465A、K489A、I491A、N493A、及C499A中的氨基酸残基取代的一者或多者的EGFR蛋白结合较少。

17.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述抗体经ADCC增强。

18.如前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，其中所述抗体经去岩藻糖基化。

19.一种治疗头颈癌的方法，其包含对有需要的受试者施用抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物、和/或类似物包含结合EGFR的胞外部分的可变域和结合LGR5的胞外部分的可变域。