CN105191863B

CN105191863B - 产生抗体的非人哺乳动物

Info

Publication number: CN105191863B
Application number: CN201510514640.9A
Authority: CN
Inventors: E·豪特扎格尔; R·D·平托; T·洛戈滕伯格; M·思罗斯比; R·A·克拉默; C·A·德克吕夫
Original assignee: Moerloos Ltd By Share Ltd
Current assignee: Moerloos Ltd By Share Ltd
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2029-06-29
Also published as: KR20140127914A; RU2015119670A3; MX2010014542A; EP2556747B1; KR102112655B1; KR20110029156A; SI3456190T1; KR20200057093A; JP6824807B2; EP3456192A1; JP7439201B2; JP2017121256A; DK3456190T3; RU2020127564A3; ES2853226T3; EP2147594A1; KR102261586B1; CN105191863A; EP3456191A1; ZA201009312B

Abstract

本发明提供了转基因非人动物，其包含编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中所述免疫球蛋白轻链是人的、人样的或者人源化的。所述核酸具有使其呈现出对于DNA重排和/或体细胞超突变具有抗性的手段。在一个实施方案中，所述核酸包含在细胞发育成为成熟B细胞的一定发育阶段期间在细胞中表达希望的分子的表达盒。本发明进一步提供了从所述转基因非人动物中产生免疫球蛋白的方法。

Description

产生抗体的非人哺乳动物

本申请为申请日为2009年6月29日、申请号为200980131844.7、发明名称为“产生抗体的非人哺乳动物”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及能产生抗体及其衍生物的非人动物的产生和应用，所述抗体或者其衍生物从至少部分是外源的核酸(转基因)表达。本发明揭示了产生这种转基因动物的转基因以及产生这种异源抗体的方法，以及产生这种转基因动物的方法和载体。

发明背景

B细胞通过产生特异性抗体介导体液免疫。抗体(Ab)的基本结构亚单位是免疫球蛋白(Ig)分子。Ig分子由两个相同的重(H)多肽链和两个相同的轻(L)多肽链组成。在每个H链和L链的氨基末端是称作可变区(V)的区域，其氨基酸序列可改变。H链和L链的剩余部分在氨基酸序列中相对恒定，称作恒定区(C)。在Ig分子中，H链和L链的V区(VH和VL)并列形成潜在的抗原结合位点。编码H链和L链的V区的基因在前体B(pre-B)细胞分化期间从种系DNA区段中经体细胞装配：对于H链，V、D和J基因区段；对于L链，V和J基因区段。在Ig V区内是最大氨基酸序列可变性的三个区域，其相互作用形成抗原识别位点，并因此称作互补决定区(CDR)。

V基因区段编码大部分V区结构域，包括CDR1和CDR2。CDR1和CDR2中的多样性得自多个不同的种系编码的V区段中的序列异质性。CDR3由通过连接H链V、D和J基因区段与L链V和J基因区段以及通过组合这些区段产生核苷酸序列异质性的机制形成的序列编码。另外的多样性可得自不同的H和L链V区的配对。综合这些处理产生由种系基因区段编码的并由新形成的B细胞表达的最初的抗体储备库(repertoire)。

抗体多样性的另一来源是通过重组Ig基因区段产生的多样性。B细胞能在其表达的抗体V区中导入突变，这是被称作体细胞超突变的过程。因此，当动物首次遭遇抗原时，该抗原结合恰好携带具有结合该抗原的V区的抗体的特定B细胞。这种初始应答可激活这种B细胞继续分泌同种抗体(cognate antibody)。这些激活的B细胞此时也以其重排的抗体基因片段为目标发生体细胞突变，并因此产生子细胞，其产生初始应答的抗体的变体。选择处理扩增这些变体B细胞后代，产生抗原亲和性改良的抗体。在B细胞中，体细胞超突变被靶向受限的基因组区域，包括重排的VH和VL基因。因此，体细胞突变使得发生亲和性成熟——产生和选择高亲和性抗体。因此，体细胞突变对于高亲和性抗体的产生是重要的。

抗体的精确特异性和高亲和性以及发现可以产生单克隆抗体(mAb)的杂交瘤技术给抗体在人体疾病的靶向治疗中的应用带来了巨大希望。mAb是相同的，因为其是由单一B细胞及其后代产生的。mAb是通过融合已经用希望的抗原免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞产生永生化的杂交瘤而产生的。mAb在人体内应用的进展面临的一个主要障碍是非人Ig的固有的免疫原性。患者通过产生抗小鼠Ig序列的抗体(人抗小鼠抗体，HAMA)而对于治疗剂量的小鼠mAb作出反应，导致急性毒性，改变其生物分布及加速清除，因此降低后续给药的效力(Mirick，et al.，(2004)Q.Nucl.Med.Mol.Imaging 48，251-257)。

为了克服HAMA的产生，已经开发了抗体人源化方法，试图产生当用于人体时免疫原性降低的mAb。这些尝试产生不同的基于重组DNA方法，目的在于增加mAb中人氨基酸序列的含量，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和性。人源化起自构建小鼠-人嵌合型mAb(Morrison，S.L.，et al.，(1984).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，81，6851-5)，其中小鼠mAb中Ig C区域由人C区置换。嵌合型mAb含有60-70％的人氨基酸序列，且当注射进人体内时与其小鼠相应物相比免疫原性明显降低，但是仍观测到人抗嵌合抗体应答(Hwang，W.Y.，et al.(2005).Methods，36，3-10)。

在试图进一步人源化小鼠mAb中，开发了CDR移植法。在CDR移植法中，小鼠抗体被人源化，通过将小鼠抗体的CDR移植至人Ig分子的VL和VH构架上，同时保留认为是特异性和亲和性必需的那些小鼠构架，进行人源化(Jones，P.T.，et al.，(1986).Nature，321，522)。总之，CDR-移植的抗体由80％以上的人氨基酸序列组成(Queen，C.et al.(1989).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86，10029；Carter，P.et al.(1992).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，4285)。尽管取得这些成就，但是CDR-移植的人源化抗体仍示出产生抗移植的V区的抗体应答(Hwang，W.Y.，et al.(2005).Methods，36，3)。

在CDR移植法之后，开发了基于不同模式的人源化方法，如表面再建(resurfacing)(Padlan，E.A.，et al.，(1991).Mol.Immunol.，28，489)、超人源化(Tan，P.，D.A.，et al.，(2002)J.Immunol.，169，1119)、人string content优化(Lazar，G.A.，etal.，(2007).Mol.Immunol.，44，1986)以及人工程化(humaneering)，试图进一步降低治疗性mAb中非人序列的含量(Almagro，J.C.，et al.，(2008).Frontiers in Bioscience 13，1619)。如CDR移植法一样，这些方法依赖于分析抗体结构及非人和人mAb的序列对比，以评估终产物的免疫原性中人源化处理的影响。当对比嵌合型和人源化抗体的免疫原性时，可变区的人源化看起来进一步降低免疫原性(Hwang，W.Y.，et al.(2005).Methods，36，3-10)。

去免疫化(De-immunization)是降低嵌合型或者小鼠抗体的免疫原性的另一种方法。其包括使用生物信息学鉴别感兴趣的抗体中的线性T细胞表位，随后通过位点定向诱变置换为人或者无免疫原性序列(WO09852976A1)。尽管去免疫化的抗体在灵长类动物中呈现出与其嵌合的相应物相比降低的免疫原性，但是观测到丧失一些结合亲和性(Jain，M.，etal.，(2007).Trends in Biotechnol.25，307)。

噬菌体展示技术补充并扩展了人源化方法，以获得较低免疫原性mAb，以用于人体治疗中。在噬菌体展示中，人抗体VH和VL区的大量集合(文库)在丝状噬菌体颗粒的表面上表达。从这些文库中，通过与抗原的结合相互作用选择罕见的噬菌体；从感染的细菌中表达可溶的抗体片段以及通过突变改良选择的抗体的结合亲和性(Winter，G.，et al.(1994).Annu.Rev.Immunol.12，433)。这种方法模拟免疫选择，使用这种方法已经分离了具有许多不同结合特异性的抗体(Hoogenboom，H.R.，et al.(2005).Nat.Biotechnol.，23，1105)。不同来源的H和L链V区用于构建噬菌体展示文库，包括从非免疫或者免疫供体中分离的那些区域。此外，已经由含有人工随机合成的CDR区的V区构建噬菌体展示文库，以产生额外的多样性。通常地，对得自噬菌体展示文库的抗体进行体外亲和性成熟，以获得高亲和性抗体(Hoogenboom，H.R.，et al.(2005).Nat.Biotechnol.，23，1105)。

在不存在小鼠抗体条件下产生人抗体的转基因小鼠株系的产生，提供了产生用于人体的特异性和高亲和性人mAb的另一技术平台。在这些转基因动物中，内源小鼠抗体机制被失活，并由人Ig基因座置换，以在小鼠中充分再生人免疫系统(Jakobovits，A.，et al.(2007).Nat.Biotechnol.25，1134.Lonberg，N.(2005).Nat.Biotechnol.23，1117)。通过重组基因区段的B细胞发育以及Ig多样化在这些小鼠中真实再生，产生表达人Ig的小鼠B细胞的不同储备库。通过用抗原免疫这些小鼠，进一步证实这些转基因动物在重链和轻链的V区中积聚了体细胞突变，以产生多种不同的高亲和性人mAb(Lonberg，N.(2005).Nat.Biotechnol.23，1117)。

然而目前还不能回答“完全人的”mAb，如得自噬菌体展示文库或者转基因小鼠的mAb，是否比人源化mAb的免疫原性低的问题，因为目前只获得了两种人mAb的全部免疫原性数据。得自噬菌体展示的人文库的抗肿瘤坏死因子mAb在12％患者中诱导了抗体应答——这在人源化抗体的抗抗体应答发生率中也是较高的(Hwang，W.Y.，et al.(2005).Methods，36，3-10)。

评估通过转基因方法产生的第一个注册的人mAb的免疫原性证实mAb治疗导致在大约5.5％治疗的癌症患者中产生抗体(Jakobovits，A.，et al.(2007).Nat.Biotechnol.25，1134.，Lofgren，J.A.，et al.(2007).J.Immunol.178，7467)。

因此仍需要产生特异于其靶位、但是免疫原性较低的抗体的方法和手段。根据本发明，免疫原性的降低至少部分通过提供转基因非人哺乳动物动物而实现，所述转基因非人哺乳动物至少在其B细胞谱系中包含编码至少免疫球蛋白轻链或者重链的核酸，其中所述重链或轻链编码序列具有使其对于DNA重排和/或体细胞超突变有抗性的手段(means)，优选这种非人动物是啮齿动物，更特别优选是小鼠。所述核酸优选编码人、人样或者人源化免疫球蛋白链。

在本说明书随后的部分中，小鼠被典型用作非人哺乳动物的实例。所述转基因非人哺乳动物宿主能发起对抗原的免疫应答，其中所述应答产生具有灵长类动物、特别是人的可变区的抗体。可以应用不同的转基因宿主，特别是鼠、兔、绵羊、avine、猪、马、犬、猫等等。小鼠已经用于产生B-淋巴细胞以永生化，用于产生抗体。由于小鼠易于处理，可以大量繁殖，且已知具有强大的免疫储备库，因此小鼠通常是选择的动物。因此，在下文的讨论中，是针对小鼠进行讨论，但是应理解其它动物、特别是非灵长类哺乳动物可以代替小鼠进行相同程序。

防止重排和超突变的原因是以这种方式可以提前选择非免疫原性多肽，已知这种多肽链将保持非免疫原性。所得免疫球蛋白的至少一条链因此是低免疫原性的。所得抗体(通常)需要既具有轻链也具有重链。非免疫原性链因此必须能与其它链配对。其它链可以是内源链、外源链或者这两种链的杂交体。对于人体治疗，所述非免疫原性链应尽可能地接近人。

使编码免疫球蛋白链的基因对于DNA重排和/或突变有抗性的手段当然是除去造成所述重排和/或突变的所有遗传元件。其缺点是消除了这两条链的可变性，而本发明优选保留了一条链(优选重链)的可变性，并抑制和/或防止另一链(优选轻链)的重排-突变。

迄今为止鉴定的重排和/或超突变的元件位于免疫球蛋白的基因座内。因此，使免疫球蛋白编码序列对DNA重排和/或突变有抗性的手段是在免疫球蛋白基因座外部的基因座中插入基因。

因此，本发明提供了转基因非人哺乳动物，其中轻链/重链编码序列整合进非人哺乳动物的基因组免疫球蛋白基因座外部的基因座中。优选地，所述插入位于对基因沉默具有抗性的基因座中。根据本发明，所述整合位于Rosa-基因座或者相应基因座。

优选提供这样的表达盒，其可以通过一定手段插入Rosa基因座或者相应基因座中，使得免疫球蛋白链的表达基本限于B细胞谱系细胞，优选使用使轻链编码核酸在B细胞发育一定阶段期间表达的手段。术语“表达基本限于”是指所述表达主要在B细胞谱系的细胞中，但是在其它细胞中与在B细胞中表达水平相比可以较低水平表达。在一优选的实施方案中，术语“表达基本限于”是只在B细胞谱系细胞中表达。这种手段典型且优选包括B细胞(发育阶段)特异性启动子，如CD19、CD20、μHC(所有V基因)、VpreB1、VpreB2、VpreB3、λ5、Igα、Igβ、κLC(所有基因)、λLC(所有基因)、BSAP(Pax5)。尽管非常可能通过这种启动子指导DNA重排和/或突变抗性链的表达，但是其相对较弱。典型需要强启动子以保证B细胞受体(由膜附着的Ig H和L链组成)足够的表面表达，以及通过等位基因排斥与内源链(如果存在的话)的表达和配对竞争。然而这种启动子通常不是组织特异性的。为了赋予组织特异性，优选应用Cre/lox等的间接系统。将希望的链置于强启动子控制下，所述强启动子由可以通过Cre-蛋白质的作用除去的元件抑制，导致希望的免疫球蛋白编码基因活化。这种系统在如下文献中详细描述：Wunderlich F.T.(2004)，″Generation of inducible Cre systemsfor conditional gene inactivation in mice″，Inauguraldissertation zurErlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen

der

zu

http：//deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv？idn＝97557230x&dok_var＝d1&dok_ext＝pdf&filename＝97557230x.pdf.

优选地，以重排和超突变抗性方式产生的免疫球蛋白链是能与非人哺乳动物编码的不同的重链配对的轻链。所述轻链在所有抗体中均是相同的(且免疫原性较低)，但是通过重链中的重排和超突变保留特异性的不同。优选沉默编码轻链的至少一个内源基因座，不过等位基因排斥可使其不必要。

根据这个实施方案，优选内源κ(kappa)轻链被功能性沉默。

如果内源κ轻链基因座被沉默，并且由于其它原因，优选所述抗性轻链是κ轻链，优选具有种系样序列的轻链。根据本发明，这种轻链将导致抗体具有降低的免疫原性。优选的种系序列基于人IGKV1-39(Ol2)，因为这个轻链在人储备库中非常常见(de Wildt etal.1999.J.Mol.Biol.285(3)：895)，且具有良好的热力学稳定性、产量和可溶性(Ewert etal.2003.J.Mol.Biol.325(3)：531)。

下文提供了所述表达盒的更特异性的实施方案，使用该表达盒可以提供本发明的非人动物。尽管这对于免疫球蛋白是典型有利的，但是也涵盖其它感兴趣的基因。

因此，本发明在一特定实施方案中提供了转基因非人哺乳动物，其中轻链编码核酸在5’-3’方向包含：B细胞特异性启动子，前导序列，重排的人V基因，任选存在的MoEκi增强子，恒定区(κ)及任选存在的(截短的)MoEκ3’增强子。Neuberger鉴别和检验了位于κ恒定区下游的一个新的B细胞特异性增强子(EP004690251)。808bp增强子在κ基因的表达中起关键作用，因为随着这个增强子的除去表达显著降低。3’κ增强子的缺失也显著降低体细胞超突变(SHM)的水平。在转基因和细胞表达研究中，已经揭示缩小的(reduced)、突变的或者缺失的3’κ增强子不仅降低表达水平，而且还降低体细胞超突变水平。目前不能确定3’κ增强子是否包含于SHM加工、表达调节或者这两个过程中(参见Odegard，V.H.，et al.(2006).Nat.Rev.Immunol.6，573；Inlay，M.，et al.(2002).Nat.Immunol.3，463)。

使用3’κ增强子的工程化变体进行的详细表达研究表明50个核苷酸的区域足以驱动表达。然而对于适当表达而言，优选145个核苷酸的缩小的序列(EP04690251；Meyer，K.B.，et al.(1990)Nucleic Acids Res.18(19)：5609-15)。

因此，本发明一方面提供了插入非人动物基因组中的核酸，其是在细胞发育一定阶段期间在发育成为成熟B细胞的细胞中表达希望的蛋白质样分子的表达盒，所述表达盒包含在导入宿主细胞中之后防止希望的蛋白质样分子表达沉默的手段，以及用希望发育阶段的宿主细胞定时表达希望的蛋白质样分子的手段。

表达盒被定义为这样的核酸，其具有导入宿主细胞基因组中的手段，例如可以与基因组中一定位点同源重组的序列。通常所述核酸是DNA，典型是双链DNA。典型地，所述表达盒在载体中提供给细胞，从载体中其被转移至细胞基因组中。所述表达盒进一步包含在宿主细胞中实现基因表达所需的所有元件，但是在一些实施方案中，一些这样的元件可以存在于导入的第二个核酸上，从而这些元件反式作用。在宿主细胞中表达所需的元件包括启动子、增强子及其它调节元件。只有宿主细胞不能提供的那些元件是必需的。

根据本发明，重要的是感兴趣的基因的表达在宿主基因组中不是沉默的，特别是在表达需要的发育阶段不是沉默的。这可以通过各种手段进行，如插入内源基因座中或者通过提供具有防止沉默的核酸元件的表达盒(Kwaks et al.(2006)Trends Biotechnol.24(3)，p.137-142；并入本文作参考)。优选所述表达盒插入在宿主细胞中不沉默的基因座中(EP 01439234；并入本文作参考)。

所述防止沉默的手段包括稳定化抗抑制序列(STabilizing Anti-Repression-sequences，

-序列)和基质附着区(Matrix Attachment Regions，MAR)。STAR序列是包含顺式影响基因转录能力的核酸序列。典型地，尽管非必需，STAR序列自身不编码功能性蛋白质元件。在一个实施方案中，使用一个STAR元件。然而优选使用一个以上的STAR元件。在特别优选的实施方案中，本发明的表达盒具有两个STAR序列：一个STAR序列在免疫球蛋白基因编码序列的5’端，一个STAR序列在免疫球蛋白基因编码序列的3’端。MAR是参与使DNA/染色质锚定核基质的DNA序列，且其已经在哺乳动物和植物物种中描述。MAR具有促进常染色质打开和维持的许多特征。MAR可增加转基因表达及限制位置效应。

根据本发明，重要的是从所述表达盒中表达只在细胞发育的一定阶段期间发生，特别是发育中的B细胞，更特别是在转基因非人动物特别是小鼠中的B细胞。在这种特殊情况中，选择发育时期，由此基因从表达盒(典型为轻链或者重链样多肽)中的表达不明显干扰所述细胞的正常分化和/或成熟，且当适当时使得产生的多肽链与其配对体配对。

在本发明的一个实施方案中，这可以通过提供本发明的核酸而实现，其中定时表达的手段是启动子，其活性基本限于一定发育阶段。在发育中的的B细胞中，例如在免疫之后其成熟和/或分化，当感兴趣的基因是免疫球蛋白的多肽链之一时，其表达必须不(明显)干扰所述成熟和/或分化，且需要定时表达，由此所得多肽可以与其配对体配对。因此本发明提供了这样的核酸，其中所述一定阶段起自所述细胞在发育成成熟B细胞的一定阶段即将发生轻链分子表达之前或者与发生轻链分子表达相同的阶段。

这可以通过选择仅在所述合适时期期间是活性的启动子而实现。这种启动子可以是CD19启动子、Ig-α启动子、Ig-β启动子、μhc(所有基因)启动子、Vk启动子或者其类似物或者同源物。

在本发明的一特定实施方案中，如上述的启动子不直接驱动感兴趣的基因表达。代之的是其驱动其产物反式激活感兴趣的基因表达的基因的表达。这种激活基因可以是编码所谓Cre重组酶或者Cre-样蛋白质的基因。感兴趣的基因的表达盒可以例如具有抑制感兴趣的基因表达的序列。所述序列可以通过Cre重组酶的作用除去，其在希望的启动子(在发育的适当阶段是活性的)控制下。在这个实施方案中，需要一组表达盒。

因此本发明提供了一组作为表达盒的核酸，其中一个核酸包含在启动子控制下的编码Cre-样蛋白质的表达盒，所述启动子在希望的宿主细胞发育阶段期间是活性的，第二种核酸包含在组成型启动子控制下的编码希望的蛋白质样分子的序列，所述启动子可以通过Cre-样蛋白质的作用而被激活。所述激活优选通过除去在loxP位点两侧的终止序列而实现。所述Cre/lox系统在Rajewsky et al.(1996)J.Clin.Invest.98，p.600-603中详细描述，所述文献并入本文作参考。这种系统参见Wunderlich F.T.(2004)，″Generation ofinducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice″，Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen

der

zu

http：// deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv？idn＝97557230x&dok var＝d1&dok ext＝pdf& filename＝97557230x.pd，其并入本文作参考。

本发明进一步提供了转基因非人动物，其具有本发明的表达盒，其中希望的蛋白质样分子是免疫球蛋白的多肽链。优选的多肽链是轻链。更优选的多肽是种系或者种系样轻链。最优选的多肽是Ol2，优选重排的种系κ轻链IGKV1-39*01/IGKJ1*01(根据IMGT数据库命名，http：//www.imgt.org)。

进一步优选所述多肽链使得基本不能重排和/或排除任何序列修饰，如在B细胞亲和性成熟过程期间对Ig正常操作的序列修饰。因此，本发明提供了转基因非人动物，其具有本发明的表达盒，其中所述重排和/或序列修饰由于不存在至少部分造成体细胞超突变的元件而被阻止，所述元件例如是MoEκi增强子。

本发明优选的表达盒包含防止沉默的手段。在一个实施方案中，所述防止沉默的手段是插入宿主细胞基因组的对沉默具有抗性的基因座中的手段。所述插入手段优选是同源重组进所述对沉默具有抗性的位点中的手段。当所述非人动物是小鼠时，优选的基因座是rosa-基因座。

本发明进一步优选的表达盒在5’-3’方向包含：Vκ启动子，小鼠前导序列，人V基因，任选存在的MoEκi增强子，大鼠恒定区(Cκ)以及任选存在的(截短的)MoEκ3’增强子。

本发明再进一步优选的表达盒在5’-3’方向包含：Vκ启动子，人前导序列，人V基因，任选存在的MoEκi增强子，大鼠恒定区(Cκ)及任选存在的(截短的)MoEκ3’增强子。

当然，本发明的最终目的是产生用于人体治疗中的抗体。因此，本发明提供了产生希望的抗体的方法，所述方法包括使部分的非人哺乳动物暴露于抗原，由此抗体应答被诱导，并分离特异于所述抗原的抗体。

在另一实施方案中，本发明提供了产生希望的抗体的方法，所述方法包括使本发明的非人哺乳动物暴露于抗原，由此抗体应答被诱导，分离产生这种抗体的细胞，培养并使所述细胞永生化，并收获所述抗体。

在进一步的实施方案中，本发明提供了产生希望的抗体的方法，所述方法包括使本发明的非人哺乳动物暴露于抗原，由此抗体应答被诱导，分离编码至少一部分这种抗体的核酸，将所述核酸或者其拷贝或者衍生物插入表达盒中，并在宿主细胞中表达所述抗体。

从转基因小鼠中产生抗体的方法为本领域技术人员已知。特别优选的是从一个细胞中产生抗体混合物的方法，其中编码这些抗体的核酸得自本发明的小鼠。

这些所谓的寡克隆(oligoclonics)在WO04106375和WO05068622中揭示，所述文献在此并入本文作参考。

本发明提供了转基因非人哺乳动物，优选小鼠，其能产生特异的及高亲和性的杂交小鼠-人抗体，其优选具有种系构型或者近种系构型的人免疫球蛋白轻链可变(VL)区，以及优选鼠免疫球蛋白重链可变(VH)区，其在抗原驱动的亲和性成熟处理期间积聚体细胞突变。可以对所述杂交抗体的鼠VH区进行人源化处理，以产生当用于人体中时基于种系或者近种系VL区和已经人源化的鼠VH区而免疫原性降低的mAb。

特别地，本发明示出转基因小鼠能产生具有基本上未突变的L链的特异性及高亲和性小鼠-人杂交抗体，所述转基因小鼠具有在顺式作用遗传元件控制下的编码重排的人VL区的DNA表达构建体，在B细胞发育期间，所述顺式作用遗传元件使得转基因在大部分B细胞上的适时和受调节的表达，但缺少对转基因造成体细胞超突变机制的元件。本发明示出重排的人转基因能与不同的内源鼠免疫球蛋白H链配对，形成在B细胞表面上表达的小鼠-人杂交免疫球蛋白，以及足以促进鼠B细胞发育以获得相当大的且不同的周围B细胞组份。

在一优选的实施方案中，所述转基因表达构建体具有人重排的L链V区的编码序列，其在人VL启动子控制下以指导B细胞特异性表达。此外，所述构建体具有鼠3’Ck增强子序列，以进行B细胞特异性的及可诱导的且高水平的转基因表达。此外，所述构建体被设计为缺少促进体细胞超突变机制募集到转基因的调节元件，如内含子增强子和3’C-κ增强子。

在一相关的实施方案中，重排的人VL基因通过位点特异性整合插入在鼠Rosa26基因座中。就“靶向转基因”方法而言，Rosa26基因座可用于有效产生具有可预测的转基因表达模式的转基因生物体(如小鼠)。

在一优选的实施方案中，根据其与许多不同的鼠VH基因配对的能力选择重排的人VL区域，以保证具有不同的VH基因储备库的一群B细胞的产生。获得这种VL区的方法包括从小鼠B细胞中扩增重排的VH基因的储备库以及从人B细胞中扩增人重排的种系VL区的储备库，并将其克隆进噬菌粒展示载体中，以在细菌中制备杂交免疫球蛋白的不同文库。通过未选择的及经抗原选择的成对VH/VL集合的核苷酸序列分析，鉴别了与许多不同的鼠VH基因配对的人种系VL基因。本文描述了具有这种能力的人种系VL基因的集合。

在一个实施方案中，示出当用抗原免疫时，B细胞能发起免疫应答，导致分泌具有高特异性和亲和性的杂交抗体的B细胞产生。编码这些抗体的V区通过不具有或者具有极少突变的人转基因轻链以及具有通过体细胞超突变机制导入的不同数目的突变的鼠重链而鉴定。

在一相关的实施方案中，涵盖了通过杂交瘤和展示技术从转基因小鼠中获得高亲和性杂交的单克隆抗体的策略，以及人源化鼠VH区以获得用于人体中的免疫原性较低的抗体的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了免疫球蛋白L链转基因构建体，其包含编码人免疫球蛋白VL区组合动物免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的DNA序列，该序列与转录调节序列可操纵地连接，当整合进非人转基因动物中时产生具有无或者很少经历体细胞超突变的人VL区的Ig VL-CL多肽。所述Ig VL能与在非人转基因动物中在B细胞发育期间产生的重排的VH-CH多肽配对，所述VH-CH多肽保留在刺激时经历体细胞超突变的能力。所述CL区可以是任何动物物种的，通常能与非人转基因动物的CH区配对。

本发明还包括上述转基因构建体在产生转基因非人动物中的应用，所述转基因非人动物能产生由VL-CL多肽和VH-CH多肽组成的杂交抗体，其中VL区是人源的，CL、VH和CH可以源于任何动物物种包括人。在免疫时，这些转基因动物能产生由体细胞超突变的VH基因及由所述转基因编码的基本未突变的VL基因编码的高亲和性抗体。

另一方面，本发明提供了产生转基因非人动物的方法，所述转基因非人动物应答抗原攻击能产生杂交抗体，所述方法包括功能性破坏内源免疫球蛋白轻链基因座并在动物基因组中插入本发明的转基因构建体。

本发明包括通过这种方法可获得的动物在产生B细胞中的应用，所述B细胞产生具有人VL轻链的免疫球蛋白。本发明另一方面提供了产生B细胞的方法，所述B细胞产生具有人VL且结合选择的抗原的免疫球蛋白，所述方法包括用所述抗原攻击通过上述方法可获得的动物，并且从所述动物中筛选结合所述抗原的B细胞。本发明进一步包括通过这种方法可获得的B细胞以及通过使这种B细胞永生化可获得的杂交瘤，例如通过融合上述B细胞与骨髓瘤细胞获得的杂交瘤。本发明还包括产生单克隆抗体的方法，所述方法包括培养这种杂交瘤。再一方面，本发明提供了上述B细胞在产生杂交瘤或者相应单克隆抗体中的应用。

本发明再一方面提供了产生具有人VL链且结合选择的抗原的免疫球蛋白的方法，所述方法包括用所述抗原攻击上述获得的动物，并且从中获得免疫球蛋白。

在一种策略中，作为单独的步骤，将由人种系V和J基因区段编码的重排的VL区及任何动物物种的轻链恒定区但优选鼠的恒定区导入小鼠种系中。转基因DNA可以导入受精卵或者胚胎干细胞的中前核中。所述整合根据应用的特殊策略可以是随机或者同源的。例如，VL转基因可以通过随机插入而导入，导致小鼠基因组中携带所述转基因的一或多个拷贝。或者，使用本领域描述的位点特异性重组可以使人VL转基因靶向于特定基因组基因座。

在一个优选的实施方案中，VL转基因靶向鼠ROSA26基因座，该基因座是使插入的转基因强力且可预测地表达的合适整合位点(EP 1439234)。所述靶向载体使得可以插入基因表达盒的一个拷贝，因此避免了通过多个拷贝的重排调节转基因表达。通过选择常染色体Rosa26基因座作为插入位点，插入的转基因在非人动物中的表达模式可预测。此外，避免了随机X失活和/或通过染色体位置效应的调节。这也不需要产生和分析任何指定转基因的多个转基因株系。最后，针对位点特异性整合的Rosa26靶向载体可用于多个基因表达盒。因此，可以设想2或多个不同的重排的种系人VL区被插入Rosa26基因座中，以进一步增加杂交或者人抗体的储备库的多样性。

在另一实施方案中，重排的人VL区可以靶向鼠Igκ或者λ轻链，以功能性失活内源基因座，或者含有重排的人VL区的小鼠可以与没有功能性κ或者λIg或者这两个基因座的小鼠繁殖。因此，通过使用转化、使用重复步骤或者组合繁殖，可以获得能产生在基本不存在内源宿主免疫球蛋白轻链时携带人VL转基因的抗体的转基因动物。

在一个实施方案中，根据其与大部分(substantial portion)鼠VH区的配对形成在B细胞表面上表达的功能性小鼠-人杂交抗体的多样的储备库的能力选择人VL转基因。大部分鼠VH区是指人VL与在B细胞发育期间产生的至少0.1％的鼠VH区配对，更优选与至少1％及最优选至少10％的鼠VH区配对。鉴别具有这种特性的人VL基因的方法包括人VL区的储备库与鼠VH区的储备库的随机配对，VH与VL区在合适的真核或者原核表达载体中的共表达，以及筛选域大部分鼠VH区配对的人VL区。在一个实施方案中，可以使用噬菌粒载体指导小鼠-人抗体片段在细菌细胞中或者丝状噬菌体表面的表达，及通过本领域已知方法分析抗体片段的结合能力。

在另一实施方案中，根据其与大部分人VH区配对形成在B细胞表面上表达的人抗体的不同的储备库的能力选择人VL转基因。大部分人VH区是指与所述人VL与在B细胞发育期间产生的至少0.1％的人VH区配对，优选与至少1％及更优选至少10％的人VH区配对。

在后一实施方案中，如本领域所述使人VL转基因小鼠与携带功能性重排或者非重排的人H链免疫球蛋白基因座及功能性失活的内源H链基因座的小鼠杂交。三个宿主Ig基因座(重链，κ和λ轻链)的每一个基因座的两个拷贝的功能性失活使得可以产生纯人抗体分子，而没有宿主抗体或者宿主人嵌合抗体产生，其中所述宿主含有人IgH及重排的人VL转基因。通过用特异性抗原免疫，这种宿主株系通过产生特异性人抗体的小鼠B细胞的产生而作出应答，该B细胞随后与小鼠骨髓瘤细胞融合或者以任何其它方式永生化，以持续稳定产生人单克隆抗体。或者，所述B细胞群用作VH区的来源，其可以通过如本领域已知的构建cDNA文库或者通过使用人VH区的引物进行PCR扩增而获得。

人重排的VL基因在合适的真核或者原核微生物中重建，所得DNA片段可以导入小鼠受精卵或者胚胎干细胞的前核中。本领域已经描述了指导B细胞特异性表达的VL转基因的各种构建体，其通常具有如下通式：前导序列和相关的上游序列以指导B细胞特异性表达转基因，人VL转基因的编码序列，指导B细胞特异性和高水平表达转基因和鼠恒定区基因的增强子序列。在优选式中，所述增强子是C-κ3’增强子，因为当用于转基因构建体中时，其指导在B细胞谱系细胞中高水平表达，但是不募集体细胞超突变。

在一个实施方案中，分离动物并针对稳定表达进行分析，所述动物优选小鼠，其基因组中包含转基因的一或多个拷贝。选择示出优选在B细胞中长期稳定表达转基因的动物。如果需要，使优选在不同染色体上包含单独插入转基因的一或多个拷贝的不同动物株系杂交，以获得具有不同的插入转基因的一或多个拷贝的动物，以增加转基因在动物、优选在B细胞中的表达。

本发明进一步提供了本发明的转基因非人动物的后代，所述后代至少在其B细胞谱系中包含重链或者轻链编码序列以及使所述序列对于DNA重排和/或体细胞超突变有抗性的手段。

本发明进一步提供了本发明的转基因非人动物的后代，所述后代包含在细胞发育成成熟B细胞的一定发育阶段期间在细胞中表达希望的蛋白质样分子的表达盒。

本发明另外提供了分离自本发明转基因非人动物的细胞，所述细胞包含重链或者轻链编码序列以及使所述序列对于DNA重排和/或体细胞超突变有抗性的手段。本发明另外提供了分离自本发明转基因非人动物的细胞，所述细胞包含在细胞发育成成熟B细胞的一定发育阶段期间在细胞中表达希望的蛋白质样分子的表达盒。本发明的细胞，优选产生抗体的B细胞或者能分化或者成熟为产生抗体的B细胞的细胞，可用于在体外产生抗体，如本领域技术人员已知，例如Gascan et al.1991.J.Exp.Med.173：747-750所述。永生化本发明的细胞的方法为本领域已知，包括例如通过与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，用EB病毒转化；活化和转录的信号转导因子(STAT)的表达，通过CD40和IL4受体信号传导的活化，和/或Bc16的表达(Shvarts et al.2002.Genes Dev 16：681-686)。

在单独的步骤中，使小鼠内源κ和λ轻链基因座基本上无功能，由此转基因小鼠中至少大部分B细胞携带含有转基因人VL区的Ig受体。内源小鼠免疫球蛋白基因座的失活通过在小鼠胚胎干细胞中同源重组以靶向破坏适当的基因座而实现。所述靶向破坏包括改变基因组序列，由此产生基本无功能的内源小鼠免疫球蛋白κ和/或λ轻链。术语“基本上无功能的内源小鼠免疫球蛋白”表示所述内源κ和/或λ轻链基因座为功能性沉默，由此内源κ和/或λ轻链基因座、优选内源κ轻链基因座的功能性蛋白质表达水平降低为参考小鼠中表达水平的大约20％，更优选大约10％、5％、2％，及更优选大约1％。在最优选的实施方案中，内源κ和/或λ轻链基因座的功能性蛋白质表达水平降至0％。功能性蛋白质表达水平可以通过本领域技术人员已知的方式确定，包括western印迹及与小鼠重链配对。所述参考小鼠是其中内源κ和/或λ轻链基因座未被破坏的小鼠。所述改变包括为内源免疫球蛋白基因的功能性表达所必需的基因序列的突变和/或缺失。或者，所述改变包括在内源小鼠免疫球蛋白κ和/或λ轻链基因座中插入核酸，由此内源免疫球蛋白基因的功能性表达被降低。在一个实施方案中，所述核酸包含导致内源免疫球蛋白基因转录沉默的沉默元件。在进一步的实施方案中，或者额外地，所述核酸包含例如通过导入使编码序列移码的外显子破坏内源免疫球蛋白基因的沉默和/或翻译的序列，或者包含提前终止密码子的序列。在每种情况中均产生嵌合动物，其部分衍生自修饰的胚胎干细胞，且能通过种系传递该遗传修饰。具有人免疫球蛋白基因座的小鼠株系与具有失活的小鼠基因座的株系交配，产生可以产生基本上仅包含人轻链的抗体的动物。

通过本领域已知方法制备同源重组构建体，并除去任何不希望的序列，例如原核序列。可以应用将同源重组构建体导入靶细胞中的任何便利的技术。这些技术包括原生质球融合、脂染、电穿孔、磷酸钙介导的DNA转移或者直接显微注射。在靶细胞转化或者转染之后，利用阳性和/或阴性标志物选择靶细胞，例如通过新霉素抗性和/或无环鸟苷(acyclovir)和/或丙氧鸟苷(gancyclovir)抗性选择。然后对示出希望表型的那些细胞通过限制分析、电泳、Southern分析、PCR等进行进一步分析。通过鉴别在靶基因座示出存在损害的片段，鉴别其中已经发生同源重组以失活靶基因座拷贝的细胞。

此外，示出当接种时，前述转基因小鼠中的鼠和人VH区而不是VL区能经历体细胞超突变，产生高亲和性抗体。有利地，预测由种系VL区编码的这些抗体当用于人体中时有助于降低免疫原性，并获得聚集倾向更低且因此更安全地治疗性用于人体中的更稳定的抗体。

衍生自前述非人转基因动物或者细胞的mAb均共有相同的人VL区。已经描述了共有相同VL区的mAb可以在一个克隆细胞中共表达，产生具有功能性结合位点的重组抗体混合物(见WO04106375和WO05068622)。因此，本发明提供了产生特异性及高亲和性mAb的平台，其构成由克隆细胞产生的mAb混合物的基础。

优选衍生自前述非人转基因动物或细胞的mAb是针对细胞靶位。优选的靶是人表面表达的或者可溶的蛋白质或者碳水化合物分子。进一步优选的靶是表面表达的蛋白质或者碳水化合物分子，其在细菌、病毒及其它病原体特别是在人的表面上表达。

更特别地，优选的靶包括细胞因子和趋化因子，包括但不限于白细胞介素1β(IL1β)、IL2、IL4、IL5、IL7、IL8、IL12、IL13、IL15、IL18、IL21、IL23，及趋化因子如CXC趋化因子、CC趋化因子、C趋化因子(或者γ趋化因子)如XCL1(淋巴细胞趋化因子-α)和XCL2(淋巴细胞趋化因子-β)，以及CX3C趋化因子。优选的靶进一步包括细胞因子和趋化因子的受体分子，包括I型细胞因子受体如IL-2受体，II型细胞因子受体如干扰素受体，免疫球蛋白(Ig)超家族受体，肿瘤坏死因子受体家族包括CD40、CD27和CD30的受体，丝氨酸/苏氨酸-蛋白质激酶受体如TGFβ受体，G-蛋白质结合的受体如CXCR1-CXCR7，以及酪氨酸激酶受体如成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族成员，EGF受体家族成员包括erbB1(EGF-R；HER1)、erbB2(HER2)、erbB3(HER3)和erbB4(HER4)，胰岛素受体家族成员包括IGF-R1和IGF-RII，PDGF受体家族成员，肝细胞生长因子受体家族成员包括c-Met(HGF-R)，Trk受体家族成员，AXL受体家族成员，LTK受体家族成员，TIE受体家族成员，ROR受体家族成员，DDR受体家族成员，KLG受体家族成员，RYK受体家族成员，MuSK受体家族成员，以及血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族成员。

进一步优选的靶是在肿瘤中过表达或者选择性表达的靶，例如VEGF、CD20、CD38、CD33、CEA、EpCAM、PSMA、CD54、LewisY、CD52、CD40、CD22、CD51/CD61、CD74、MUC-1、CD38、CD19、CD262(TRAIL-R2)、RANKL、CTLA4和CD30；参与慢性炎症的靶，例如CD25、CD11a、TNF、CD4、CD80、CD23、CD3、CD14、IFNγ、CD40L、CD50、CD122、TGFβ和TGFα。

优选的在细菌、病毒及其它寄生性病原性特别是人表面上表达的表面表达的蛋白质或者碳水化合物分子包括如下病原体的表面标志物：甲型和乙型流感病毒如血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，丝状病毒如埃博拉病毒，狂犬病病毒，麻疹病毒，风疹病毒，腮腺炎病毒，黄病毒如1-4型登革热病毒，蜱传脑炎病毒，西尼罗河病毒，日本脑炎病毒及黄热病毒，副粘液病毒包括副粘液病毒如副流感病毒1、3，Rubulavirus如腮腺炎病毒和副流感病毒2、4，麻疹病毒，及肺病毒如呼吸道合胞病毒，痘苗病毒，天花病毒，冠状病毒包括严重急性呼吸综合征(SARS)病毒，甲型、乙型和丙型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，疱疹病毒包括巨细胞病毒，EB病毒，单纯疱疹病毒，以及水痘-带状疱疹病毒，细小病毒例如B19；嗜肺性军团病杆菌；单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌O157：H7；Borrelia burgdorferi；幽门螺杆菌；Ehrlichia chaffeensis；艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)；霍乱弧菌；肠道沙门氏菌血清型Typhimurium；Bartonella henselae；化脓性链球菌(Group A Strep)；无乳链球菌(Group B Strep)；多重药物抗性S.aureus(例如MRSA)；肺炎衣原体；肉毒杆菌；创伤弧菌；肺炎副变异性衣原体(Parachlamydia pneumonia)；无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)；Linezolid-抗性肠球菌(E.faecalis和E.faecium)；以及多重药物抗性Acinetobacter baumannii。

最优选的靶是IL-6及其受体，IL-6Rα，糖蛋白命名的gp130，RSV，特别是表面蛋白F、G和SH及非结构蛋白如N和M，及受体酪氨酸激酶，特别是erbB1(EGF-R；HER1)，erbB2(HER2)，erbB3(HER3)，erbB4(HER4)，IGF-R1以及IGF-RII，c-Met(HGF-R)。

因此，本发明提供了产生针对上述靶的特异性及高亲和性mAb的平台，其构成由克隆细胞产生的mAb混合物的基础。在一优选的实施方案中，所述特异性和高亲和性mAb包含针对至少一个靶上的不同表位的mAb。在进一步优选的实施方案中，所述特异性和高亲和性mAb包含针对不同靶的mb，所述靶如EGF-受体家族的一或多个成员，包括erbB1(EGF-R；HER1)、erbB2(HER2)、erbB3(HER3)和erbB4(HER4)。

除非特别指出，则本发明中使用科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。进一步地，除非特别指出，则单数术语应包括其复数形式，复数术语应包括其单数形式。通常地，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学及蛋白质和寡肽或多肽化学以及杂交相关的命名法为本领域熟知和惯用。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔，脂染)。酶反应和纯化技术根据厂商指导或者本领域常用或者本文所述进行。先前的技术和程序通常根据本领域熟知的常规方法进行，如在本说明书引用和讨论的各个一般和更特别的参考文献中描述。见例如Sambrook et al.MolecularCloning：ALaboratory Manual(3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))，将其并入本文作参考。本文所述与分析化学、合成有机化学以及医药化学的实验室程序和技术相关的命名法为本领域熟知及惯用。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和给药以及治疗患者。

附图简述

图1：小鼠特异性VH引物退火位置及通过引物3’末端突出序列导入的必需的限制位点的位置的拓扑结构图。

图2：PCR扩增步骤(扩增，中间体及位点导入)。图中示出了每个步骤的小鼠VH扩增引物(以及引物混合物)的位置和名称。

图3：MV1043载体的拓扑结构。这个载体用于克隆人或者鼠VH片段。Ol2(IGKV1-39)被标示为VL基因。这个载体的产物组合大肠杆菌细胞中的辅助噬菌体使得可以产生在噬菌体颗粒表面上展示作为与g3蛋白质的融合产物的Fab片段的噬菌体，且载体在噬菌体中作为遗传内容物存在(F1ORI)。

图4：J-区段下游小鼠Cκ基因座的拓扑结构。图中标示出增强子和Cκ区。下面的箭头标示除去的区域以使该基因座沉默。

图5：小鼠C-λ基因座的拓扑结构。图中示出所有三个活性V区(Igl-V1、V2和V3)以及J-区段(Igl-J1、Igl-J2、Igl-J3、Igl-J4和假区段Igl-J3p)和恒定区(Igl-C1、Igl-C2、Igl-C3和Igl-C4)。被缺失以使基因座沉默的区域通过缺失标志示出。这些缺失包括所有活性V基因(1、2和3)及V2与V3基因之间的区段。

图6：具有位于前导序列开放读框(ORF)内的内含子的IGKV1-39/J-Ck拓扑结构。

图7：具有位于前导序列开放读框(ORF)内的内含子的IGLV2-14/J-Ck拓扑结构。

图8：VkP-IGKV1-39/J-Ck(VkP-Ol2)的拓扑结构。启动子源自IGKV1-39基因，直接位于有效转录和翻译必需的元件的前面。基因间序列(包括增强子)衍生自小鼠及得自BAC克隆。C-κ序列编码大鼠的κ恒定区。

图9：VkP-IGLV2-14/J-Ck(VkP-2a2)的拓扑结构。启动子源自IGKV1-39基因，直接位于有效转录和翻译必需的元件的前面。基因间序列(包括增强子)衍生自小鼠及得自BAC克隆。C-κ序列编码大鼠的κ恒定区。

图10：VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1(VkP-Ol2-del1)的拓扑结构与图9的VkP-IGKV1-39/J-Ck除了内含子增强子区域之外是相同的。

图11：VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2(VkP-Ol2-del2)的拓扑结构与图10的VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1除了缺失Ck基因与3’增强子之间的一段基因间序列之外是相同的。此外，所述3’增强子的大小从809bp降低至125bp。

图12：本申请中使用或者提及的序列的综述。

图13：Rosa26-IgVk1-39KI等位基因的产生。(A)pCAGGS-IgVK1-39靶向载体的示意图。(B)pCAGGS-IgVK1-39靶向载体的核苷酸序列。(C)靶向策略。

图14：(A)包含插入pCAGGS-IgVK1-39靶向载体的ES克隆的基因组DNA的Southern印迹分析。将4个独立克隆的基因组DNA用AseI消化，并用指示靶向载体的5′-边界的5el探查。所有克隆在5’末端均包含正确插入的靶向载体。(B)包含插入pCAGGS-IgVK1-39靶向载体的ES克隆的基因组DNA的Southern印迹分析。将4个独立克隆的基因组DNA用MscI消化，并用指示靶向载体的3′-边界的3el探查。所有克隆在3’末端均包含正确插入的靶向载体。(C)包含插入pCAGGS-IgVK1-39靶向载体的ES克隆的基因组DNA的Southern印迹分析。将4个独立克隆的基因组DNA用BamHI消化，并用指示靶向载体的5′-边界的内部Neo探针探查。所有克隆均包含正确单一插入的靶向载体。

图15：Rosa26-IgVl2-14KI等位基因的产生。(A)pCAGGS-IgVL2-14靶向载体的示意图。(B)基于重排的种系IGLV2-14/J Vλ区(IGLV2-14/J-Ck)的含有CAGGS表达插入序列的pCAGGS-IgVL2-14靶向载体的核苷酸序列。(C)靶向策略。

图16：IGKV1-39残基1-107的

图。子图A示出DRB1同种异型的结合强度，而C示出DRB3/4/5、DQ和DP同种异型的结合强度。图中数值表示解离常数(Kd)，在0.01μM-0.1μM范围内绘制对数标度图(极强结合物可能已超出该图)。对于中等结合肽，仅给出定性数值，弱和无结合物未示出。将数值绘制在靶序列中肽的第一个残基上(所述肽自身延伸另外9个残基)。重要的是，仅示出了每种肽的最强的结合受体：具有较低亲和性的交叉反应同种异型在这个图中不可观测。最强的结合受体通过其血清型名称表示。最后，任何种系过滤的肽均以较亮的颜色在表位图中标绘(在这种情况中，发现没有非自身表位)。子图B示出每个十肽的HLA结合混杂性(binding promiscuity)(Y-轴：识别每个肽中关键表位的HLA同种异型的数目，从X-轴上示出的指定残基开始)。所述混杂性根据共47个是关键结合物的肽的同种异型的数目测量。白色列表示自身肽，黑色列(在此没有)表示非自身肽。

图17：IGKV1-39的表位图，显示通过15聚体形式血清型在IGKV1-39序列中预测的肽结合物的存在。每个15聚体编号示于该图的上方。相应15聚体的完整序列在表7中示出。黑框表示15聚体中存在一或多个关键的自身表位，血清型在左侧列出。关键表位是定义为强或者中等DRB1结合物及强DRB3/4/5或者DP或者DQ结合物。

图18：Igκ基因座的组成型敲除(KO)示意图。(A)靶向策略。(B)pIgκ靶向载体的示意图。

图19：Igλ基因座的组成型KO。(A)靶向策略的第一个步骤。(B)靶向策略的第二个步骤。

图20：靶向载体的示意图。

(A)pVkP-Ol2(VkP-IGKV1-39/J-Ck)；

(B)pVkP-Ol2-del1(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1)；

(C)pVkP-Ol2-del2(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2)。

图21：使用RMCE通过靶向转基因使转基因插入Rosa26基因座的靶向策略。

(A)VkP-Ol2(VkP-IGKV1-39/J-Ck)；

(B)VkP-Ol2-del1(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1)；

(C)VkP-Ol2-del2(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2)。

图22：MV1057载体的拓扑结构。用VH片段置换指定的填充片段产生这样的表达载体，其可以转染真核细胞以产生具有含有Ol2(IGKV1-39)VL基因的轻链的IgG1抗体。

图23：在脾的非B细胞群中没有转基因的人Vk1轻链表达。

图24：转基因人Vk1轻链在脾的所有B细胞群中表达。

图25：转基因人Vk1轻链在腹膜腔的B1细胞中表达。

图26：转基因人Vk1轻链在原-和前-B细胞中不表达，但是在骨髓的未成熟和再循环B细胞群中表达。(A)骨髓细胞的门控(Gating)。(B)叠加来自一个WT对照的转基因表达的直方图。

图27：转基因人Vk1轻链与血液循环B细胞中内源轻链及IgM表达直接相关。

实施例

实施例1：人轻链V基因克隆

本实施例描述选择两个人轻链V基因背后的原理，所述轻链V基因一个是κ类型的基因，一个是λ类型的基因，用它们来证明表达轻链的转基因小鼠的概念。De Wildt etal.1999(de Wildt et al.(1999)J.Mol.Biol.285(3)：895)分析了外周IgG阳性B细胞中人轻链的表达。基于这些数据，选择IGKV1-39(Ol2)和IGLV2-14(2a2)作为轻链，因为它们在B细胞储备库中有很好的表现。轻链的J区段序列基于GenBank ABA26122(针对IGKV1-39)(Rabquer，B.J.，Smithson，S.L.，Shriner，A.K.and Westerink，M.A.J.)和GenBankAAF20450(针对IGLV2-14)(Ignatovich，O.，Tomlinson，I.M.，Popov，A.V.，Bruggemann，M.and Winter，G.J.Mol.Biol.294(2)，457-465(1999))中存在的序列而被选择。

所有构架区段均转化为种系氨基酸序列以提供在潜在临床应用中可能的最低免疫原性。

实施例2：获得与人IGKV1-39基因区段配对的小鼠重链V基因以形成功能抗体结合位点

本实施例描述能与单个重排人种系IGKV1-39/J区域配对的小鼠重链V基因的鉴别。来自用破伤风类毒素免疫接种小鼠的脾VH储备库被克隆在具有单一人IGKV1-39-Cκ轻链的噬菌体展示Fab载体，并针对破伤风类毒素淘选。分析在一轮淘选后获得的克隆的结合特异性。编码破伤风类毒素特异性Fab片段的小鼠VH基因进行序列分析以鉴别独特克隆并分配VH、DH和JH利用。

本文描述的许多方案是构建噬菌体展示文库及淘选用于结合感兴趣抗原的噬菌体的标准方案并且描述于Antibody Phage Display：Methods and Protocols(editor(s)：Philippa M.O’Brien，Robert Aitken)。

免疫接种

BALB/c小鼠接受一次破伤风类毒素免疫接种，6周后用破伤风类毒素加强。

脾细胞分离

制备脾细胞悬液。在解剖后，脾用PBS洗涤，并转移至具有20ml PBS的60mm皮氏皿中。使用20mlPBS和G20针的注射器重复冲洗脾。在用PBS洗涤冲洗的细胞后，细胞用20mlPBS小心加入悬液中，并置于实验台上5分钟以分离碎片和细胞簇。脾细胞悬液转移到Ficoll-Paque^TM PLUS填充的试管的上面，并根据用于淋巴细胞分离的厂商程序加工(Amersham Biosciences)。

RNA分离和cDNA合成

在分离和沉淀淋巴细胞后，细胞重悬于TRIzol LS Reagent(Invitrogen)中用于根据所附厂商方案分离总RNA，并用1微克RNA、Superscript III RT组合的dT20根据厂商程序进行逆转录反应(Invitrogen)。

cDNA的PCR扩增

在PCR反应中使用允许扩增大约110种属于15个VH家族的不同小鼠V基因的引物组合(表1；RefSeq NG_005838；Thiebe et al.，1999.European Journal of Immunology 29：2072-2081)扩增cDNA。在第一轮中，使用结合V基因5’末端和J区3’末端的引物组合。在第二轮中，用MJH-Rev2引物产生的PCR产物被扩增以在3’区域引入修饰，以使得有效克隆产物。在最后一轮扩增中，所有PCR产物均使用在5’末端引入SfiI限制位点及在3’末端引入BstEII限制位点的引物进行扩增(见图1和2，及表1)。

第一轮PCR的反应条件：组合所有25个正向引物(MVH1至MVH25，表1和图2)及每个反应1个反向引物(MJH-Rev1，MJH-Rev2，MJH-Rev3或MJH-Rev4；见表1和图2)的4个不同反应。50微升PCR体积由2微升cDNA(来自RT反应)、10微升5*Phusion聚合酶HF缓冲液、各40nM的25个正向引物(总浓度为1微摩尔)、1微摩尔反向引物、1微升10mM dNTP原液、1.25单位Phusion聚合酶及无菌MQ水组成。热循环仪程序由降落(touch down)程序组成：1个循环的98℃30秒，30个循环的98℃10秒、58℃10秒且每个循环降低0.2℃、72℃20秒，及1个循环的72℃3分钟。第二轮PCR程序仅针对含有MJH-Rev2引物的第一轮PCR的产物建立：2个不同反应，组合ExtMVH-1或者ExtMVH-2引物(表1和图2)及反向引物ExtMJH-Rev2int(表1和图2)。50微升PCR体积由50ng PCR产物(来自第一轮PCR)、10微升5*Phusion聚合酶HF缓冲液、500nM每种正向引物、1微摩尔反向引物、1微升10mM dNTP原液、1.25单位Phusion聚合酶和无菌MQ水组成。热循环仪程序由降落程序组成，随后是常规扩增步骤：1个循环的98℃30秒，10个循环的98℃10秒、65℃10秒且每个循环降低1.5℃、72℃20秒，10个循环的98℃10秒、55℃10秒、72℃20秒及1个循环的72℃3分钟。第三轮PCR程序如图2所述建立。50微升PCR体积由50ng PCR产物(来自前面的各轮PCR)、10微升5*Phusion聚合酶HF缓冲液、1微摩尔正向引物(表1和图2)、1微摩尔反向引物、1微升10mM dNTP原液、1.25单位Phusion聚合酶和无菌MQ水组成。程序由降落程序组成，随后是常规扩增步骤：1个循环的98℃30秒，10个循环的98℃10秒、65℃10秒且每个循环降低1.5℃、72℃20秒，10个循环的98℃10秒、55℃10秒、72℃20秒及1个循环的72℃3分钟。PCR扩增后，所有PCR产物用Qiaex II根据厂商方案凝胶纯化。

限制酶消化

纯化产物在两个步骤中用BstEII和SfiI消化。首先，1微克DNA在100微升反应中在炉中在60℃消化6小时，所述反应由10微升10*NEB缓冲液3(New England Biolabs)、1微升100*BSA、12.5单位BstEII和无菌水组成。产物用来自Qiagen的Qiaquick PCR纯化试剂盒根据手册指导纯化，并洗脱在40微升水中。接下来，所有产物在100微升反应中进一步用SfiI在炉中在50℃消化12小时，所述反应由10微升10*NEB缓冲液2(New England Biolabs)、1微升100*BSA、12.5单位SfiI和无菌水组成。消化片段在20cm 1.5％琼脂糖TBE加溴化乙锭凝胶上在80V凝胶分离，之后用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化。100微克接纳体载体(MV1043，图3和12)在600微升中在标准条件下(Tango缓冲液)用50单位Eco91I消化，接下来在0.9％琼脂糖凝胶上纯化。在规定条件下在500微升中用400单位SfiI消化12小时的第二个消化步骤后，加入100单位BsrGI，在50℃保持3小时。

连接

每个PCR产物根据下述方案分别连接：70ng消化的PCR产物、300ng消化的接纳体载体、100单位T4连接酶(NEB)、1*连接酶缓冲液于30微升中在12℃保持16小时。连接反应用苯酚/氯仿/异戊醇提取纯化，随后根据厂商方案进行糖原沉淀，最后溶解于25微升无菌水中。

转化及文库储存

纯化的连接产物每个连接批次用1200微升TG1电感受态细菌(Stratagene#200123)经电穿孔转化，并在含有4％葡萄糖的LB羧苄青霉素铺板。通过将细菌刮下置于50ml LB羧苄青霉素中而收获文库。在2000g、4℃离心20分钟后，细菌沉淀小心重悬于在冰水上的2ml冰冷2*TY/30％甘油中，在干冰/乙醇上冷冻，之后储存在-80℃。

文库扩增

根据Kramer et al.2003(Kramer et al.2003.Nucleic Acids Res.31(11)：e59)所述程序使用VCSM13(Stratagene)作为辅助噬菌体株生长及收获。

在包被的免疫试管上选择噬菌体

破伤风类毒素以2μg/ml浓度溶解于PBS中并在4℃包被MaxiSorp Nunc-ImmunoTube(Nunc 444474)过夜。弃去包被溶液后，试管用在PBS中的2％脱脂乳(ELK)(封闭缓冲液)在室温(RT)封闭1小时。平行地，0.5ml噬菌体文库与1ml封闭缓冲液混合，在室温保温20分钟。封闭噬菌体后，将噬菌体溶液加入破伤风类毒素包被试管中并在缓慢旋转台上于室温保温2小时以使之结合。接下来，试管用1ml 50mM甘油-HCl pH 2.2在旋转轮上于室温保温10分钟进行噬菌体洗脱，直接随后用0.5ml 1M Tris-HCl pH 7.5中和收获的洗脱液。

收获噬菌体克隆

将5ml O.D.0.4的XL1-Blue MRF(Stratagene)培养物加入到收获的噬菌体溶液中，不经振荡在37℃保温30分钟以使得噬菌体感染。细菌铺板在羧苄青霉素/四环素4％葡萄糖2*TY平板上，在37℃生长过夜。

噬菌体产生

噬菌体如Kramer et al.2003(Kramer et al.2003.Nucleic Acids Res.31(11)：e59)所述进行生长及加工，使用VCSM13作为辅助噬菌体株。

噬菌体ELISA

ELISA平板每孔用100微升浓度为2微克/ml于PBS中的破伤风类毒素在4℃包被过夜。用100微升浓度为2微克/ml于PBS中的甲状腺球蛋白包被的平板用作阴性对照。倒空各孔，在纸巾上轻敲而干燥，用PBS-4％脱脂乳(ELK)填满，在室温保温1小时以封闭孔。弃去封闭溶液后，加入与50μl封闭溶液预混合的噬菌体微量制备物，在室温保温1小时。接下来用PBS-0.05％Tween-20的5次洗涤步骤除去未结合噬菌体。通过将孔与100微升抗-M13-HRP抗体缀合物(在封闭缓冲液中稀释1/5000)在室温保温1小时而检测结合的噬菌体。通过重复上述洗涤步骤除去游离抗体，随后进行TMB底物保温直至显色可见。通过每孔加入100微升2M H₂SO₄而终止反应，在ELISA分析仪上在450nm发射波长进行分析(表2)。更高数字表示更强信号及因此更高的噬菌体-Fab复合物的特异性结合的发生率。

测序

对给出至少3倍高于背景信号的克隆(表2)进行繁殖，用于DNA微量制备程序(见Qiagen miniPrep手册程序)并进行核苷酸序列分析。根据Big Dye 1.1试剂盒手册(Applied Biosystems)使用识别人IgG1重链的CH1区域的5’序列(存在于Fab展示载体MV1043中，图3和12)的反向引物(CH1_Rev1，表1)进行测序。28个破伤风类毒素结合克隆的小鼠VH序列见表3。结果示出选择的小鼠VH基因属于不同基因家族，来自这些基因家族的不同个体成员能与重排的人IGKV1-39/J VH区域配对以形成功能性破伤风类毒素特异的抗体结合位点。从这些序列分析，可以得出结论小鼠VH区域使用多样性的DH和JH基因区段。

实施例3：小鼠κ轻链基因座的沉默

本实施例描述小鼠内源κ轻链基因座的沉默。所述内源κ基因座通过在ES细胞中同源重组修饰，随后将遗传修饰的ES细胞导入小鼠胚胎以获得遗传适应的后代。

含有组装的核苷酸序列的载体用于在ES细胞中的同源重组，所述核苷酸由融合于3’CK增强子的3’末端的序列的包含J区至J5基因区段下游338bp的部分组成。组装的序列用于缺失从JK区的3’至3’CK增强子的3’的基因组片段。这个程序的结果是，CK恒定基因、3’增强子及一些基因间区域被除去(见图4和18)。

靶向载体的构建

一种载体用于在ES细胞系中的靶向同源重组，所述载体接受融合于所述缺失区段的在3’和5’末端的4.5-8kb侧翼臂。两个臂均得经PCR手段获得以保证最大同源性。靶向策略使得产生组成型KO等位基因。涵盖Igk内含子增强子、Igk恒定区及Igk 3’增强子的小鼠基因组序列被PuroR盒置换，所述PuroR盒侧翼为F3位点并且插入Jk元件下游。选择标记的Flp介导的除去导致组成型KO等位基因。Igk MiEk-Igk C-Igk 3′E基因组区域(大约10kb)由F3-Puro盒(大约3kb)置换可能降低同源重组的效率。因此，同源臂由此延长并且在转染后分析更多的ES细胞集落以鉴别同源重组克隆。

携带缺失的κ片段的ES细胞的产生

遗传修饰的ES细胞的产生基本上如所述进行(Seibler et al.Nucleic AcidsRes.2003Feb 15；31(4)：e12)。也参见实施例14的详细描述。

经四倍体胚胎互补作用产生ES小鼠

使用遗传修饰的ES细胞经四倍体胚胎互补作用产生小鼠基本上如所述进行(Eggan et al.，PNAS 98，6209-6214；Seibler J，et al.Nucleic Acids Res.2003Feb 15；31(4)：e12；Hogan et al.，(Summary of mouse development.Manipulating the MouseEmbryo，(1994)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY.)，pp.253-289.))。

实施例4：小鼠λ轻链基因座的沉默

本实施例描述小鼠内源λ轻链基因座的沉默。所述内源λ基因座通过在ES细胞中同源重组修饰，随后将遗传修饰的ES细胞导入小鼠胚胎以获得遗传适应的后代。

在一起含有所有功能性λV区域的小鼠λ基因座的两个区域用于进行缺失。

被靶向用于基于同源重组的缺失的第一个区域是位于IGLV2基于区段的起始位点上游408bp并结束于IGLV3基因区段下游215bp的一个区域，包括这些IGLV基因区段之间的基因间序列段。进行缺失的第二个区域是从IGLV1基因区段的上游392bp至下游171bp的片段。这两个缺失步骤的结果是，所有功能性V-λ基因区段均被缺失，导致所述基因座功能失活(图5和图19)。

靶向载体的构建

接受融合于所述缺失区段的在3’和5’末端的3-9.6kb侧翼臂的载体用于在ES细胞系中的靶向同源重组。两个臂均得经PCR手段获得以保证最大同源性。在第一个步骤中，涵盖IglV2-V3区的小鼠基因组序列被侧翼为F3位点的PuroR盒置换，其在选择标记的Flp介导的除去后产生组成型KO等位基因(见图19A)。在第二个步骤中，涵盖Igl V1区的小鼠基因组序列被已携带Igl V2-V3区缺失的ES细胞克隆中的Neo盒置换(见图19B)。选择标记(NeoR)侧翼为FRT位点。在Flp介导的选择标记除去后获得组成型KO等位基因。

携带缺失的λ片段的ES细胞的产生

遗传修饰的ES细胞的产生基本上如所述进行(Seibler J，Zevnik B，Küter-LuksB，Andreas S，Kern H，Hennek T，Rode A，Heimann C，Faust N，Kauselmann G，Schoor M，Jaenisch R，Rajewsky K，Kühn R，Schwenk F.Nucleic Acids Res.2003Feb 15；31(4)：e12)。也参见实施例14的详细描述。为了表明两个靶向事件发生在同一染色体上，选择一些双靶向克隆用于用pCMV C31deltaCpG进行体外缺失。克隆在抗生素压力下在有丝分裂失活的饲养层上扩增，所述饲养层由在DMEM高葡萄糖培养基中的小鼠胚胎成纤维细胞组成，所述培养基含有20％FCS(PAN)和1200u/mL白血病抑制因子(Millipore ESG 1107)。来自每个克隆的1x10⁷个细胞用20μg环状pCMV C31deltaCpG在240V和500μF电穿孔，并每个铺板在4个10cm培养皿上。电穿孔2-3天后收获细胞并经PCR分析。所用引物是：

2005_5：CCCTTTCCAATCTTTATGGG

2005_7：AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC

2005_9：GTCATGTCGGCGACCCTACGCC

PCR反应在包含5μl PCR缓冲液10x(Invitrogen)、2μl MgCl₂(50mM)、1μl dNTP(10mM)、1μl第一引物(5μM)、1μl第二引物(5μM)、0.4μl Taq(5U/ul，Invitrogen)、37.6μlH₂O和2μl DNA的混合物中进行。所用程序是95℃5′；随后35个循环的95℃30″；60℃30″；72℃1′；随后72℃10′。

经四倍体胚胎互补作用产生ES小鼠

使用遗传修饰的ES细胞经四倍体胚胎互补作用产生小鼠基本上如所述进行(Eggan et al.，PNAS 98，6209-6214；Seibler J，Zevnik B，Küter-Luks B，Andreas S，Kern H，Hennek T，Rode A，HeimannC，Faust N，Kauselmann G，Schoor M，Jaenisch R，Rajewsky K，Kühn R，Schwenk F.Nucleic Acids Res.2003Feb 15；31(4)：e12；Hogan etal.，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY.)，pp.253-289)。

实施例5：基于重排的人种系IGKV1-39/J-Ck基因的CAGGS表达插入序列(IGKV1-39/J-Ck)的构建

本实施例描述掺入重排的人种系IGKV1-39/J区域的CAGGS表达盒的构建。这个插入表达盒包含克隆位点、Kozak序列、含有内含子的前导序列、重排的IGKV1-39区域的开放读框、来自等位基因a的大鼠CK恒定区及翻译终止序列(IGKV1-39/J-Ck；图6)。所述初级构建体由天然发生序列组成并且已被分析及通过除去不希望的顺式作用元件而优化，所述元件例如内部TATA盒、聚腺苷酸化信号、chi位点、核糖体进入位点、富AT或富GC序列段、ARE-、INS-及CRS序列元件、重复序列、RNA二级结构、(隐蔽的)剪接供体和接纳体位点和剪接分支点(GeneArt GmbH)。另外，在开放读框区域中的密码子使用被优化以用于在小鼠中表达。内含子序列未改变，因此代表与人IGKV1-39前导内含子的编码部分相同的序列。

在表达盒的5’末端，导入一个NotI位点，在3’位点导入一个NheI位点。两个位点均用于克隆到CAGGS表达模块中。在根据GeneArt使用的方法进行基因组装后，插入序列用NotI-NheI消化并克隆进表达模块中，所述表达模块含有CAGGS启动子、侧翼为LoxP位点的终止子序列(‘floxed′)、聚腺苷酸化信号序列以及在5’和3’末端的促进同源重组进小鼠ES细胞系的Rosa26基因座中的序列。启动子和/或cDNA片段经PCR扩增，经测序证实和/或从输送质粒直接克隆进携带指示的特征的RMCE交换载体中。最终靶向载体pCAGGS-IgVK1-39的示意图和证实的序列在图13A和13B中示出。靶向策略示于图13C。

实施例6：基于重排的人种系IGLV2-14/JVλ区域的CAGGS表达插入序列(IGLV2-14/J-Ck)

本实施例描述掺入重排的人种系IGLV2-14/JVλ区域的表达盒的序列和插入。这个插入序列包含克隆位点、Kozak序列、含有内含子的前导序列、重排的IGLV2-14/J区域的开放读框、来自等位基因a的大鼠CK恒定区及翻译终止序列(IGLV2-14/J-Ck；图7)。所述初级构建体由天然发生序列组成并且已被分析及通过除去不希望的顺式作用元件而优化，所述元件例如内部TATA盒、聚腺苷酸化信号、chi位点、核糖体进入位点、富AT或富GC序列段、ARE-、INS-及CRS序列元件、重复序列、RNA二级结构、(隐蔽的)剪接供体和接纳体位点和剪接分支点(GeneArt GmbH)。另外，在开放读框区域中的密码子使用被优化以用于在小鼠中表达。内含子序列未改变，因此代表与人IGKV1-39前导内含子相同的序列。

在表达盒的5’末端，导入一个NotI位点，在3’位点导入一个NheI位点。两个位点均用于克隆到CAGGS表达模块中，如TaconicArtemis所述。在根据GeneArt使用的方法进行基因组装后，插入序列用NotI-NheI消化并克隆进表达模块中，所述表达模块含有CAGGS启动子、侧翼为LoxP位点的终止子序列(‘floxed′)、聚腺苷酸化信号序列以及在5’和3’末端的促进同源重组进小鼠ES细胞系的Rosa26基因座中的序列。为构建最终的ROSA26RMCE靶向载体，启动子和/或cDNA片段经PCR扩增。扩增产物经测序证实和/或从输送质粒直接克隆进携带指示的特征的RMCE交换载体中。最终靶向载体pCAGGS-IgVL2-14的示意图和证实的序列在图15A和15B中示出。靶向策略示于图15C。

实施例7：IGKV1-39/J-Ck在HEK293细胞系中的表达(pSELECT-IGKV1-39/J-Ck)

本实施例描述了一种方法，以验证实施例5中描述的IGKV1-39/J-Ck构建体使得IGKV1-39/J-Ck L链在HEK293细胞中表达和缺失。IGKV1-39/J插入序列(图6)在5’末端通过将NotI位点改变为SalI位点而修饰。这一改变是将产物克隆进表达盒质粒pSELECT-hygro(InvivoGen)所需的。CAGGS表达插入序列IGKV1-39/J-Ck和pSELECT-hygro用SalI和NheI消化，连接并用于使用标准技术转化感受态XL1-Blue细胞。挑取菌落，用Qiagen Midi-prep柱根据厂商程序纯化DNA。命名为0817676_pSELECT_0815426的所得轻链(LC)表达载体用于使用Fugene6(Roche)根据厂商方案转染HEK293细胞。使用抗大鼠Ck抗体(BecktonDickinson#550336和553871)的ELISA和western印迹和现有技术中使用的方案筛选上清中IGKV1-39/J-Ck轻链的存在。

抗破伤风类毒素(TT)IgG MG1494的VH用限制位点SfiI和BstEII克隆进IgG表达载体MV1056中。所得克隆经序列验证。HEK293T细胞用表4所示的5种不同载体组合转染(载体0817678_pSELECT_0815427的详情参见实施例8)。收获上清并确定IgG浓度(见表4)。如所预期的，仅含有轻链的上清A和B不能检测到IgG(检测抗体识别IgG的Fc部分)。上清C和D中的IgG浓度与阳性对照上清E的相当，表示轻链构建体的正确表达。

经ELISA分析与TT的结合以检查产生的抗体的功能性，使用血红蛋白作为阴性对照抗原。如所预期的，仅含轻链的上清A和B未能检测到TT特异性结合。上清C和D的TT特异性结合至少与阳性对照上清E一样好，证实轻链构建体的正确表达和与重链的功能组装。抗体不仅用抗人IgG二抗检测到，而且用抗大鼠Cκ轻链二抗检测到。结果证实抗大鼠Cκ抗体(BDPharmingen#553871，clone MRK-1)识别由pSELECT载体表达的轻链。

上清经非还原SDS-PAGE和Western印迹(未示出)分析。使用抗人IgG重链抗体的检测未显示针对仅含轻链的上清A和B的条带，如所预期的那样。上清C和D的结果与阳性对照上清E相当，如针对完整IgG预期的，具有接近170kD的条带。上清C、D和E也观测到额外的较低分子量条带，它们可能代表降解产物，得自(部分)还原的IgG片段和/或由于检测抗体的非特异性结合所致无关蛋白质条带。

使用抗大鼠Cκ轻链抗体的检测显示上清A和B中接近26kD标记物的条带，如预期仅轻链。这个条带在A中相对于B中强度大得多，表明游离IGKV1-39轻链可能比游离IGLV2-14轻链更好表达和/或更稳定。如预期对照上清E为检测到条带，因为表达的IgG含有人Cκ轻链。对于上清C和D，观测到接近170kD的预期条带；较低分子量条带也被观测到，但是程度比上述使用抗人IgG抗体低。

结论是，轻链表达构建体与抗破伤风类毒素(TT)IgG MG1494的重链组合的转染导致与对于pSELECTκ和λ轻链构建体的阳性对照构建体相当的IgG产生。两者IgG产生在TTELISA中均产生比对照IgG好或者与其相当的ELISA信号。SDS-PAGE和Western印迹分析证实完整IgG的存在。测试的抗大鼠Cκ抗体在ELISA和Western印迹中均有效工作。来自用仅轻链构建体转染的细胞的培养上清不导致可检测的IgG产生，也不导致可检测的TT特异性结合，而在Western印迹上检测到游离轻链。

实施例8：IGLV2-14/J-Ck在HEK293细胞系中的表达(pSELECT-IGLV2-14/J-Ck)

本实施例描述了一种方法，以验证实施例6中描述的IGLV2-14/J构建体使得IGLV2-14/J-Ck L链在HEK293细胞中表达和缺失。IGLV2-14/J-Ck插入序列(图7)在5’末端通过将NotI位点改变为SalI位点而修饰。这一改变是将产物克隆进表达盒质粒pSELECT-hygro(InvivoGen)所需的。CAGGS表达插入序列IGLV2-14/J-Ck和pSELECT-hygro用SalI和NheI消化，连接并用于使用标准技术转化感受态XL1-Blue细胞。挑取菌落，用Qiagen Midi-prep柱根据厂商程序纯化DNA。命名为0817678_pSELECT_0815427的所得轻链(LC)表达载体用于使用Fugene6(Roche)根据厂商方案转染HEK293细胞。经使用抗大鼠Ck抗体(BecktonDickinson#550336和553871)的ELISA和western印迹和现有技术中使用的方案筛选上清中IGLV2-14/J-Ck轻链的存在。细节及结果见实施例7

实施例9：构建含有IGKV1-39/J插入序列及多个衍生自小鼠CK基因座的增强子元件的VK启动子驱动表达构建体(VkP-IGKV1-39/J-Ck；VkP-Ol2)

本实施例描述一种表达盒的构建，其含有相关元件以使得重排的人IGKV1-39VK区域的B细胞和发育/分化阶段特异性表达，所述重排的人IGKV1-39VK区域基于IGKV1-39VK启动子区、含有内含子的前导序列、种系V基因、CDR3、IGKJ区段、位于Jk和CK之间的小鼠基因间区域、大鼠Ck等位基因a开放读框和从小鼠CK基因的3′末端开始并结束于3′CK增强子的正好3′的小鼠基因间片段。

如实施例5所述的前导序列、IGKV1-39重排基因及大鼠CK等位基因a基因的优化开放读框用于构建所述表达盒。VK启动子区通过基因合成程序(GeneArt，GmbH)获得并且几乎与基因的-500bp和ATG(起始位点)之间的人IGKV1-39序列相同。与天然序列的唯一差异是在ATG(起始)位点导入GCCACCATGG Kozak序列以促进翻译。来自小鼠BAC克隆的基因组片段(TaconicArtemis)用作导入各个元件的基础。这个片段与起自直接位于JK5区域3′的内含子供体位点及结束于3′CK增强子的正好3′的小鼠VK基因座的序列相同，并且覆盖大约12.5kb。

最终构建体从5′至3′末端含有下述元件：人基因组IGKV1-39启动子(500bp)、Kozak序列、人IGKV1-39前导序列部分1(优化的)、人IGKV1-39前导序列内含子、人IGKV1-39前导序列部分2(优化的)、人IGKV1-39种系基因(优化的)、人J区域(优化的)、包括内含子增强子元件的小鼠基因间区域、大鼠(Rattus norvegicus)κ恒定区(优化的)及包括3′κ增强子的小鼠基因间区域。这个表达盒的元件示于图8并且命名为VkP-IGKV1-39/J-Ck(VkP-Ol2)。pVkP-Ol2载体及靶向策略的概括图见图20A和21A。载体经标准程序导入ES细胞(见实施例14)。

实施例10：含有IGLV2-14/J克隆及多个CK基因座衍生的增强子元件的VK启动子驱动表达构建体(VkP-IGLVL2-14/J-Ck；VkP-2a2)的构建

本实施例描述与实施例9所述相同的构建体，不同之处是IGKV1-39基因和J区由包括独特V-J区的优化的人IGLV2-14种系基因置换(VkP-IGLV2-14/J-Ck；VkP-2a2；图9)。

实施例11：构建含有缺少CK内含子增强子元件的IGKV1-39克隆的VK启动子驱动表达构建体(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1；VkP-Ol2-del1)

实施例9所述构建体通过标准PCR修饰及DNA克隆方法学(GeneArt，GmBH)除去位于人J区和大鼠CK区之间的基因间区域中的CK内含子增强子元件而修饰。所得表达盒示于图10并且命名为VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1(VkP-Ol2-del1)。

pVkP-Ol2-del1载体及靶向策略的概括图见图20B和21B。载体经标准程序导入ES细胞(见实施例14)。

实施例12：构建含有缺少CK内含子增强子元件的IGKV1-39克隆及截短的3′CK增强子元件的VK启动子驱动表达构建体(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2；VkP-Ol2-del2)

实施例11所述构建体通过截短3′CK增强子元件及缺失大鼠Ck基因3′的基因间区域的部分以除去潜在抑制元件而修饰。这通过使用标准方法除去EcoRV位点(位于大鼠Ck基因的3′)和3′增强子中存在的NcoI位点之间的基因间序列(5993bp)并进一步除去3′增强子BstXI位点和3′增强子的3′的BstXI位点之间的序列(474bp)而实现。所得表达盒示于图11并且命名为VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2(VkP-Ol2-del2)。

pVkP-Ol2-del2载体及靶向策略的概括图见图20C和21C。载体经标准程序导入ES细胞(见实施例14)。

实施例13：Vk构建体在细胞系中的表达

测试实施例9-12所述构建体在骨髓瘤细胞系MPC11(ATCC CCL167)、B细胞淋巴瘤WEHI231(ATCC CRL-1702)、T细胞淋巴瘤EL4(ATCC TIB-39)和HEK293(ATCC CRL1573)中产生轻链蛋白的能力。构建体中的增强子和启动子元件使得在B细胞系中表达，但是在衍生自其它组织的细胞系中不表达。在用纯化的线性化DNA和Fugene6(Roche)转染细胞系后，培养细胞用于瞬时表达。收获细胞和上清，进行SDS-PAGE分析，随后用特异性抗大鼠C-κ抗体western印迹。用抗大鼠CK抗体(Beckton Dickinson#550336)在ELISA中分析上清中分泌的L链。

实施例14：产生转基因ES细胞系

实施例3、4、5、6、9、10、11和12所述的所有构建体用于通过同源重组方式产生各个稳定的转基因ES细胞系。经同源重组产生转基因ES细胞系的方法是本领域已知的(例如Eggan et al.，PNAS 98，6209-6214；Seibler J，Zevnik B，Küter-Luks B，Andreas S，KernH，Hennek T，Rode A，HeimannC，Faust N，Kauselmann G，Schoor M，Jaenisch R，RajewskyK，Kühn R，Schwenk F.Nucleic Acids Res.2003Feb 15；31(4)：el2；Hogan et al.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY.)，pp.253-289.)。

对于实施例5-6和实施例9-12中描述的所有构建体，RMCE ES细胞系(衍生自小鼠株系129S6B6F1-Gt(ROSA)26Sortm10Arte)在有丝分裂失活的饲养层上生长，所述饲养层由在DMEM高葡萄糖培养基中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)组成，所述培养基含有15％FBS(PAN1302-P220821)。白血病抑制因子(Chemicon ESG 1107)以900U/mL的浓度加入到所述培养基中。为了操作，将2x10⁵ES细胞在2ml培养基中铺板在3.5cm培养皿上。在即将转染前，将2ml新鲜培养基加入到细胞中。将3ul Fugene6Reagent(Roche；Catalog No.1 814 443)与100ul无血清培养基(OptiMEM I with Glutamax I；Invitrogen；Catalog No.51985-035)混合并保温5分钟。将100ul Fugene/OptiMEM溶液加入到2ug环状载体和2ug CAGGS-Flp中并保温20分钟。这个转染复合物滴加到细胞并混合。第二天将新鲜培养基加入到细胞。从第2天开始，每天将培养基用含有250ug/mL G418(Geneticin；Invitrogen；CatalogNo.10131-019)的培养基置换。转染后7天，分离单个克隆，扩增，根据标准程序经Southern印迹进行分子学分析。

对于每种构建体，对单个克隆的基因组DNA限制酶消化，随后与5′探针、3′探针和内部探针杂交，这样进行的多个克隆的分析产生在Rosa26基因座的正确位置包含正确的单个插入的克隆。一个例子在图14中提供。

实施例15：产生转基因小鼠株系

如实施例14所述产生及证实其修饰的所有ES细胞系用于通过四倍体重组产生稳定的转基因小鼠。所述方法为本领域已知。通常地，在给予激素之后，使排卵过度的Balb/c雌鼠与Balb/c雄鼠交配。在dpc 3.5从子宫中分离胚泡。对于显微注射，将胚泡置于一滴在矿物油下的具有15％FCS的DMEM中。使用内径为12-15μm的平头电极压电驱动的显微注射移液管将10-15个靶向的C57BL/6N.tac ES细胞注射进每个胚泡中。在恢复后，将注射的胚泡转移至性交后2.5天假孕的NMRI雌鼠的每个子宫角。在嵌合体(G0)中通过提供ES细胞的Balb/c宿主的毛色(黑色/白色)测量嵌合现象。使高度嵌合的小鼠与C57BL/6株系雌鼠繁殖。根据方案要求，C57BL/6交配配偶是非突变体(W)或者存在重组酶基因的突变体(Flp-缺失或者Cre-缺失或者CreER可诱导的缺失或者Flp-缺失/CreER组合)。通过黑色C57BL/6株系后代(G1)的存在鉴别种系传递。

例如，将ESC克隆IgVK1-39 2683 8(见实施例5和14)在3个独立实验中注射进共62个胚泡中。获得3窝共6只幼仔。所有幼仔均是嵌合型的。获得3只杂合后代幼仔，用于进一步杂交。

将ESC克隆κ2692A-C10(见实施例3和14)在3个独立实验中注射进共54个胚泡中。获得3窝共11只幼仔，其中10只是嵌合型的。获得8只杂合后代幼仔，用于进一步杂交。

将ESC克隆κ2692B-C1(见实施例3和14)在3个独立实验中注射进共51个胚泡中。获得2窝共6只幼仔，其中4只是嵌合型的。获得3只杂合后代幼仔，用于进一步杂交。

实施例16：繁殖

这个实施例描述了获得含有如实施例14所述转基因表达盒的小鼠以及其中内源λ和κ基因座已经沉默的敲除小鼠的繁殖方法。V-λ位于染色体16及CD19位于染色体7上使得可以进行标准繁殖程序。Vk基因座与Rosa26基因座以大约24cM的距离共同位于染色体6上的小鼠的繁殖在筛选期间需要特别留心，因为仅一部分后代示出以两个修饰处于一个染色体上的方式杂交。

所有四个基因座组合在一个小鼠株系中，其对于CD19-cre(未描述)和修饰的Rosa26转基因是纯合或者杂合的，对于其它基因座是纯合的。通过合适的及由商业繁殖公司(例如TaconicArtemis)提议的标准繁殖和筛选技术进行繁殖。

实施例17：免疫小鼠

使用标准方案进行初始免疫和强化免疫。

为了证实人重排的VκOl2(IGKV1-39)-大鼠Cκ轻链(见实施例5、14-16)在来自CD19-HuVκ1小鼠的B细胞中的转基因表达，以及为了评估在免疫后其对于VH储备库大小、VH家族使用(family usage)的多样性以及V(D)J重组的影响，用破伤风类毒素疫苗(TT疫苗)免疫CD19-HuVκ1转基因小鼠，将CD19-HuVκ1小鼠的随机挑选的克隆的VH序列多样性与TT免疫的野生型小鼠和CD19-Cre HuVk1阴性同窝出生幼仔进行对比。获得关于在免疫的小鼠中人VκOl2转基因的SHM频率的数据。通过噬菌体展示技术从CD19-HuVκ1小鼠中回收至少40个TT特异性的克隆不相关的含有人VκOl2的mAb的一个多样集合。

为此，使用标准免疫程序将三只成熟的CD19-HuVκ1小鼠用TT疫苗免疫。在免疫后，使用TT特异性ELISA测量血清效价(TT：Statens Serum Institute，Art.no.2674)，在用大鼠Cκ-特异性单克隆抗体染色后通过FACS方法对脾悬浮液进行细胞分选，以分离转基因B细胞(克隆RG7/9.1；BD Pharmingen#553901，Lot#06548)。从大鼠Cκ-阳性B细胞中提取RNA，并将所得cDNA材料用于文库构建和SHM分析。

将标准的单克隆小鼠抗大鼠Cκ抗体(克隆RG7/9.1；BD Pharmingen#553901，Lot#06548)用于转基因表达B细胞的FACS分析中(Meyer et al.，1996，Int.Immunol.，8：1561)。克隆RG7/9.1抗体与单型(常见的)κ链决定簇反应。这种抗大鼠Cκ抗体(克隆RG7/9.1(BDPharmingen#553901，Lot#06548)用R-藻红蛋白(PE)标记，使用LYNX快速缀合试剂盒根据厂商指导进行标记，用以进行FACS分析和分选。首先通过流式细胞计量术检测标记的抗体与在瞬时转染的HEK-293T细胞中产生的含有功能性轻链蛋白质的大鼠Cκ的结合；未缀合的抗体作为阳性对照。通过ELISA和Western-印迹示出结合大鼠Cκ的两个其它抗体(见实施例7)也通过流式细胞计量术检测。

使用一组设计为扩增C57BL/6VH基因的优化简并PCR引物进行Fab-噬菌体展示文库构建；最小的文库大小为10⁶个克隆，最小的插入频率为80％。使用的载体MV1043(图3和12)含有与人Cκ区融合的人VκOl2。在文库产生过程中，大鼠Cκ因此被置换为人相应物。

在选择之前，对96个随机挑选的克隆进行VH测序，与得自使用相同方法从用TT免疫的BALB/c小鼠中事先产生的未选择的文库的多样性对比证实VH储备库多样性。得自以相同方式免疫的C57B1/6野生型小鼠的文库可以在共用相同疫苗和相同遗传背景的两个预先选择的文库之间进行多样性对比。

对在免疫试管中包被的TT进行一些独立的选择。可包含的变量是使用生物素酰化的抗原在溶液中选择或者在捕获的TT上选择。基于在第一次选择中获得的ELISA阳性克隆的数目和多样性，决定另外的选择次数。当阳性数相对于阴性对照克隆超过3倍(＞3x)时，认为克隆是阳性的。通过ELISA针对一组阴性对照抗原分析阳性克隆，以证实抗原特异性。目的是基于独特的CDR3序列和V_HDJ_H重排，鉴别至少40个独特的VH区。

使用特异于人前导序列的PCR正向引物和特异于大鼠Cκ序列的PCR反向引物，对来自大鼠Cκ-阳性分选的B细胞的cDNA材料在非富集小鼠Cκ序列的区域中进行扩增，如在最近的研究中报道(Brady et al.，2006，JIM，315：61)。首先对用0817676_pSELECT_0815426＝pSELECT载体与IGKV1-39DNA表达盒转染的HEK-293T细胞的cDNA检测引物组合及退火温度(见实施例7)。

将扩增产物克隆在pJET-1载体中，在XL1-blue转化后，对96个菌落进行测序以通过与VκOl2(IGKV1-39)种系序列直接对比评估VL SHM频率。如在我们的研究中针对人TT特异性抗体的描述(de Kruifet al.，2009，J.Mol.Biol.，387：548)，R/S比率方法可以区分在VL序列上发生的随机突变与抗原驱动的突变。

实施例18：转基因小鼠株系中B细胞群的免疫荧光分析

这个实施例描述了抗体和流式细胞计量术在初级(骨髓)和二级(脾、腹膜)淋巴器官和血液中分析B细胞群的应用。所用方法和试剂在Middendorp et al.(2002)J.Immunol.168：2695和Middendorp et al.(2004)J.Immunol.172：1371中描述。为了分析骨髓中早期B细胞发育，将细胞表面用特异于B220、CD19、CD25、IgM、IgD、小鼠Cκ、小鼠Cλ和大鼠Cκ的抗体(Becton Dickinson)组合染色，以检测在其表面表达转基因的原-B细胞(pro-B)、前B细胞、大型前B细胞、早期和晚期幼稚B细胞以及再循环B细胞群。包括DAPI染色(Invitrogen)以从分析中排除死亡的细胞，以及包括FC封闭(Becton Dickinson)以抑制抗体与骨髓细胞上Fc受体相互作用。为了分析外周淋巴器官和血液中B细胞群上表面转基因表达，将细胞用特异于B220、CD5、CD19、CD21、CD23、IgM、IgD、小鼠Cκ、小鼠Cλ和大鼠Cκ的抗体(Becton Dickinson)的组合染色。包括DAPI染色以从分析中排除死亡的细胞，以及包括FC封闭以抑制抗体与骨髓细胞上Fc受体的相互作用。此外，包括特异于CD3、CD4、CD11b、CD11c和NK1.1的抗体(Becton Dickinson)的组合，以确定在B细胞组份之外的细胞类型中是否发生转基因表达。

分析对于IGKV1-39/大鼠Cκ转基因是杂合的及在C57BL6背景对于CD19-Cre转基因是杂合的三只小鼠(HuVk1/CD19-Cre)。作为FACS分析的对照，包括对于人IGKV1-39/大鼠Cκ转基因是野生型及在C57BL6背景(CD19-Cre)背景对于CD19-Cre转基因是杂合型的三只同窝出生小鼠以及两只C57BL6/Ntac小鼠(野生型)。使所有动物在动物实验场所中适应环境1周之后进行分析，所有小鼠均是雄性6周龄。使用先前所述常规技术从小鼠的股骨、脾、腹膜腔和血液中分离淋巴细胞(Middendorp et al.(2002)J.Immunol.168：2695和Middendorpet al.(2004)J.Immunol.172：1371)。如表10所示预先组合抗体，及在96孔平板中进行染色。在用大鼠抗鼠抗体染色之前与PE-缀合的抗大鼠Cκ(上述)保温以避免非特异性结合。在完成细胞染色之后，在Becton Dickinson LSR II FACS器械上分析标记的细胞，所得数据用FlowJo软件(v6.4.7)分析。

转基因小鼠的体重、外观和活动性与野生型小鼠相似。在组织收获期间观测到无显而易见的解剖学改变。骨髓(BM)和脾中B细胞数目(表11)或者周围器官中B细胞、T细胞和骨髓细胞的数目在转基因小鼠与野生型小鼠之间观测到无差异。此外，当对比转基因小鼠与野生型小鼠时，不同淋巴细胞发育途径中所述细胞的出现频率或者比例没有改变。因此，在双转基因(HuVk1/CD19-Cre)和转基因(CD19-Cre)小鼠中，淋巴细胞和最重要的B细胞发育与野生型小鼠无明显差别。

在外周淋巴器官中，转基因特异性抗体(抗大鼠Cκ-PE)染色仅在B细胞群中观测到。T细胞、骨髓细胞和NK细胞群对于在脾中转基因的表面表达均是阴性的(图23)。相反，在pan B细胞标志物B220和CD19染色的细胞中，所有细胞在FACS图中均出现向右漂移，表示转基因的细胞表面表达(图24)。在腹膜的CD5⁺B1细胞中测量到相似的转基因特异性染色，该细胞是B细胞的发育独特群(图25)。

B细胞从多系前体分化为成熟B细胞在骨髓中发生。在对来自骨髓的淋巴细胞的分析中，胞外和转基因表达在最早的B细胞祖细胞原B和前B细胞中与正常轻链表达模式一致地不可检测(图26)。转基因表达首先在幼稚B细胞中变得可检测，幼稚B细胞是在预先选择重链的情况中种系鼠轻链经历重排及在细胞表面表达的发育阶段(图26)。在成熟的再循环的B细胞上也检测到与脾转基因轻链表达中的染色一致(图26)。因此，CD19-Cre驱动的转基因表达与正常轻链表达模式一致。内源轻链特异性抗体的染色比转基因特异性轻链抗体的染色更强。这可以表示内源轻链的较高水平表达、内源轻链特异性抗体更敏感的染色或者这二者。重要的是，如在血液循环B细胞的染色中所观测到转基因轻链的表面表达强度与内源轻链和IgM表面表达均相关(图27)。

因此，总体上这个分析证实人IGKV1-39/Cκ转基因的表达限于B细胞组份，其表达的时序调节与内源κ和λ轻链相似，导致所有B细胞群正常发育。转基因的显然较低水平的表达可以通过启动子与内源轻链基因上存在的启动子和增强子相比的强度而解释，或者通过为内源轻链提供与重排的重链配对的竞争优势的转基因表达的延迟而解释。这个结果与观测到随着B细胞成熟，转基因染色的相对强度与内源轻链相比增加的结果相一致。此外，B细胞数目是正常的以及每个表面Ig+B细胞共表达内源和转基因轻链的观测结果支持这样的推断，即IGKV1-39可变区能与不同的鼠重链可变区的正常储备库配对。我们从这个分析中推断在Rosa基因座中插入由CD19-Cre激活的CAGGS启动子驱动的IGKV1-39/大鼠Cκ转基因促进该转基因的适时且B细胞特异性的表达，所述转基因能与鼠重链的正常储备库配对。

实施例19：IGKV1-39的

T细胞表位谱

扫描IGKV1-39的蛋白质序列(图12，人种系IGKV1-39/J蛋白)中推定的HLA II型限制表位(也称作T_H-表位)的存在。为此，将Algonomics’

平台用于IGKV1-39。简而言之，该平台分析衍生自靶序列的所有可能的10聚体肽的HLA结合特异性(Desmet etal.Nature 1992，356：539-542；Desmet et al.FASEB J.1997，11：164-172；Desmet etal.Proteins 2002，48：31-43；Desmet et al.Proteins 2005，58：53-69)。在同种异型水平对20个DRB1、7个DRB3/4/5、13个DQ和7个DP(即共47个HLA II型受体)(见表5)进行作图。

计算47个HLA II型受体的每一个受体的肽结合ΔG_bind的自由能的数量估算值。然后对这些数据如下进一步处理：

·通过ΔG_bind＝RT ln(Kd)将自由能转变为Kd-值。

·将肽分为强(S)、中等(M)、弱和非(N)结合物(binder)。使用如下截断值(cutoffs)：

S：强结合物：Kd＜0.1μM

M：中等结合物：0.1μM≤Kd＜0.8μM

N：弱和非结合物：0.8μM≤Kd

·分别处理相应于自身肽的肽。自身肽的列表取自293个抗体种系序列。它们被称作“种系过滤的”肽。

S-肽和M-肽作图到在所谓的表位谱中的靶序列上；S-亲和性定量绘图；M-值定性示出。作为结果的综述，表6列出了在分析的蛋白质中对于相应于DRB1、DQ、DP和DRB3/4/5基因的HLA II型受体组的强和中等结合物的数目。对于强和中等亲和性结合物分别进行计数。结合同一组多个同种异型的肽计数为1。括号内的数值是指种系过滤的肽。在表7中，以适于实验工作的形式示出序列。所述序列分解为有12个残基重叠的连续15聚体。对于每个15聚体，列出了混杂性(共47个含有关键结合物的15聚体中的同种异型数目)以及提示的血清型。

图及表位作图在图16和17中示出。

推断IGKV1-39不含有强非自身DRB1结合物。典型地，针对DRB1较其它HLA基因显然发现更多的结合物。这与属于DRB1的同种异型是更强力的肽结合物的实验证据一致。预期DRB1同种异型的中等强度的表位有助于群应答，且不能被忽视。再一次，在IGKV1-39中发现没有非自身DRB1结合物。

在针对抗原产生的体液应答中，观测到的T_H细胞活化/增殖通常用DRB1特异性来解释。然而，不能忽视DRB3/4/5、DQ和DP基因的可能作用。假定这些基因的表达水平与DRB1相比较低，则要注意DRB3/4/5、DQ和DP的强表位的类别。“关键表位”是对于任何DRB1、DRB3/4/5、DQ或者DP同种异型是强结合物或者对于DRB1是中等结合物的那些表位。IGKV1-39不含有DRB3/4/5、DQ或者DP的强或者中等非自身结合物。

许多肽也存在于种系序列中(表6中括号内的数值)。这种肽可非常良好地结合HLA，但是假定其是自身的且因此是非免疫原性的。在IGKV1-39中发现总计6个强的和16个中等的种系过滤的DRB1结合物。构架区1至构架区3与种系V-区段VKI 2-1-(1)Ol2(VBase)，a.k.a.IGKV1-39*01(IMGT)精确匹配。构架区4与种系J-区段JK1(V-base)a.k.a.IGKJ1*01(IMGT)精确匹配。这些区段不含有任何非自身表位，这并不意外。

实施例20：IGKV1-39的生产特性

特别需要产生热力学稳定的治疗性抗体及提供良好表达产量的抗体发现平台。这些特性在保证所述药物在生产期间及药物注射进患者体内之后的稳定性中是重要的。此外，良好的表达对药物生产成本及因此的定价、患者使用权和盈利产生直接影响。实际上目前临床上使用的所有治疗性抗体均由人IgG1和κ恒定区组成，但是使用赋予特异性的不同重链和轻链可变区。人可变重链和轻链结构域可以分为具有高于80％序列差异的家族。当在种系构型中组合这些家族的重排的实例并对比稳定性和产量时，清晰可见这些基因家族在生物物理学性质方面是不同的。特别地，V_H3、V_H1和V_H5对于重链具有有利的稳定性，Vk1和Vk3对于轻链具有最佳稳定性和产量。此外，当突变作为体细胞超突变过程的一部分而导入时，其可以干扰V_H/V_L配对。为了评估具有不同突变率的不同轻链基因对于固定的V_H链的生产特性的作用，使用来自6个自然健康供体的轻链(κ和λ)组合来自免疫的供体的一组44个TT结合重链构建Fab噬菌体展示文库。在一次选择后，分离TT结合的Fab克隆。一些这样的克隆共有与组合不同轻链的TT克隆PG1433相同的V_H基因。将Fab轻链片段再克隆进κ表达载体中，并与编码PG1433的重链的DNA组合转染进293细胞中，通过ELISA测量特异性IgG的产生。如表8所证实，选择的含有PG1433V_H组合不同轻链的克隆的蛋白质表达低于PG1433V_H组合IGKV1-39的蛋白质表达5-10倍。注意在其编码区内含有氨基酸突变的所有轻链可能破坏V_H配对及降低生产稳定性。因此，除了降低不希望的免疫原性之外，预期使用没有突变的轻链IGKV1-39可以改良各种赋予特异性的V_H基因的生产稳定性及产量。事实上通过转染均与IGKV1-39配对的不同的V_H基因产生的稳定克隆能大量传代，且仍保留如表9所示的强生产特性。

实施例21：表达完全人VH和VL区的小鼠的产生

使本发明的转基因小鼠与已经含有人VH基因座的小鼠杂交。举例的包含人VH基因座的合适小鼠在Taylor et al.(1992).Nucleic Acids Res 20：6287-95；Lonberg et al.(1994).Nature 368：856-9；Green et al.(1994).Nat Genet 7：13-21；Dechiara et al.(2009).Methods Mol Biol 530：311-24.)中揭示。

在杂交和选择对于IGKV1-39转基因和人VH基因座至少是杂合的小鼠之后，用靶免疫选择的小鼠。如上所述收获VH基因。这种方法的优势是VH基因已经是完全的人基因且因此不需要人源化。

实施例22：用以治疗慢性炎症疾病如类风湿性关节炎的靶向人IL6的抗体的分离、鉴定、寡克隆格式化(Oligoclonics formatting)和产生

将取自用人重组IL6免疫的转基因小鼠的脾VH储备库与单一人IGKV1-39-Cκ轻链(等于小鼠转基因)克隆进噬菌体展示Fab载体中，并针对免疫原人IL6进行分选。分析在2-4次分选后获得的克隆的结合特异性。对编码IL6特异性Fab片段的VH基因进行序列分析，以鉴别独特的克隆，并分配(assign)VH、DH和JH用途。将Fab片段再格式化为IgG1分子及瞬时表达。然后基于结合测定中的非竞争性对独特的克隆分组，进行亲和性和功能性分析。随后最强力的抗-IL6IgG1mAb表达为包含寡克隆(Oligoclonics)形式的不同VU区的2、3、4或者5个重链与1个基于IGKV1-39-C的κ轻链的组合，在体外检测与IL-6的复合物形成。也在体内测试了寡克隆(Oligoclonics)将人IL-6从小鼠中清除的情况。选择具有最强力清除活性的寡克隆(Oligoclonic)，根据常规方法人源化鼠VH基因。将人源化IgG1转染进哺乳动物细胞系中，产生稳定克隆。选择最佳的亚克隆以产生原始细胞库(master cell bank)以及临床试验材料。

本文描述的一些方案是构建噬菌体展示文库及分选结合感兴趣的抗原的噬菌体的标准方案，例如在Antibody Phage Display：Methods and Protocols.2002.Editor(s)：Philippa M.O’Brien，Robert Aitken.Humana Press，Totowa，New Jersey，USA中描述。

免疫

转基因小鼠每两周接受三次人IL6免疫接种，使用佐剂Sigma titerMax根据厂商指导进行。

RNA分离与cDNA合成

在最后一次免疫之后3天，从小鼠中取出脾和淋巴结，通过70微米过滤进含有PBSpH 7.4的管中，产生单细胞悬浮液。在洗涤及沉淀淋巴细胞之后，将细胞悬浮于TRIzol LSReagent(Invitrogen)中，根据厂商指导分离总RNA，并使用1μg RNA、Superscript III RT组合dT20根据厂商(Invitrogen)指导进行逆转录反应。

如实施例2所述进行Fab噬菌体展示文库的产生。

在包被的免疫试管(immunotube)上选择噬菌体

将人重组IL6溶解于PBS中，浓度为5μg/ml，并在4℃包被MaxiSorp Nunc-ImmunoTube(Nunc 444474)过夜。在弃去包被溶液之后，将该管用在PBS中2％脱脂乳(ELK)(封闭缓冲液)在室温(RT)封闭1小时。相应地，将0.5ml噬菌体文库与1ml封闭缓冲液混合，在室温保温20分钟。在噬菌体封闭后，向IL6包被的管中加入噬菌体溶液，在室温缓慢旋转平台上保温2小时以使得结合。接下来，将该管用PBS/0.05％Tween-20洗涤10次，随后在旋转轮上与1ml 50mM甘氨酸-HCl pH 2.2在室温保温10分钟进行噬菌体洗脱，随后用0.5ml 1M Tris-HCl pH 7.5中和收获的洗脱液。

收获噬菌体克隆

将O.D.0.4的5ml XL1-Blue MRF(Stratagene)培养物加入收获的噬菌体溶液中，在37℃不摇动保温30分钟，以使得噬菌体感染。将细菌铺板于羧苄青霉素/四环素4％葡萄糖2*TY平板上，在37℃生长过夜。

产生噬菌体

如Kramer et al.2003(Kramer et al.2003.Nucleic Acids Res.31(11)：e59)所述生长和处理噬菌体，使用VCSM13作为辅助噬菌体。

噬菌体ELISA

ELISA平板用每孔100μl浓度为在PBS中2.5μg/ml人重组IL6在4℃包被过夜。用浓度为在PBS中2μg/ml的100μl甲状腺球蛋白包被的平板用作阴性对照。倒空孔，在纸巾上轻击干燥，充填PBS-4％脱脂乳(ELK)，并在室温保温1小时以封闭所述孔。在弃去封闭溶液之后，加入与50μl封闭溶液预先混合的噬菌体微量制备物(minipreps)，在室温保温1小时。随后通过用PBS-0.05％Tween-20洗涤5次除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体通过将孔与100μl抗-M13-HRP抗体缀合物(在封闭缓冲液中稀释1/5000)在室温保温1小时进行检测。游离的抗体通过重复上述洗涤步骤除去，随后与TMB底物保温直至可观测到生色。通过加入100μl的2M/孔H₂SO₄终止反应，在450nm发射波长在ELISA分析仪上分析。

测序

增殖提供高于背景信号至少3倍的信号的克隆，用于DNA微量制备程序(见QiagenminiPrep手册)，并进行核苷酸序列分析。根据Big Dye 1.1试剂盒附带的手册(AppliedBiosystems)指导，使用识别人IgG1重链CH1区的5’序列(在Fab展示载体MV1043中呈现，图3和12)的反向引物(CH1_Rev1，表1)进行测序。分析鼠VH区的序列的DH和JH基因区段的多样性。

嵌合型IgG1的构建及表达

载体MV1057(图12和22)通过将转基因(IGKV1-39)L链片段克隆进载体pcDNA3000Neo(Crucell，Leiden，The Netherlands)的衍生物中而产生，所述载体衍生物含有人IgGl-和κ恒定区。将VH去克隆进MV1057中，根据标准技术核实所有构建体的核苷酸序列。使所得构建体在HEK293T细胞中瞬时表达，获得含有嵌合型IgG1的上清并纯化，使用如先前所述标准方法进行(Throsby，M.2006.J Virol 80：6982-92)。

IgG1结合及竞争分析

使用如上所述IL6包被的平板及抗人IgG过氧化物酶缀合物在ELISA中对IgG1抗体进行滴定。进行基于表位识别的针对一组抗体的竞争性ELISA，即将Fab噬菌体与IgG1或者与商购的IL6的抗体(例如Abcam cat.no.ab9324)在IL6包被的平板中一起保温，随后使用抗-M13过氧化物酶缀合物检测结合的Fab噬菌体。

IgG1亲和性测量

使用Octet(ForteBio)定量动力学方案确定所述抗体与IL6的亲和性。抗体被捕获在抗人IgG Fc捕获生物传感器上，并暴露于游离IL6，使用专有软件计算每个抗体的Kd进行分析。

IL6抗体的功能活性

为了检测选择的抗体抑制IL6与IL6受体(IL6R)之间结合的能力，使用基于ELISA的测定。将不同浓度的抗体与固定浓度(10ng/ml)的生物素酰化的IL6混合，如Naoko etal.2007，Can.Res.67：817-875所述。将所述IL6-抗体免疫复合物加入固定的IL6R中。使用辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素检测生物素酰化的IL6与IL6R的结合。通过ELISA信号降低测量抑制情况。作为IL6与IL6R之间结合抑制的阳性对照，使用抗-IL6R抗体(Abcamcat.no.ab34351；克隆B-R6)或者抗IL6抗体(Abcam cat.no.ab9324)。

在增殖测定中使用IL6依赖性细胞系7TD1测量选择的抗-IL6抗体的体外封闭活性。简而言之，将细胞与不同浓度的人IL6在具有或者没有抗IL6抗体条件下保温。可利用的IL6量确定增殖的程度。因此，如果加入的抗体封闭IL6结合，则增殖读出值与非结合抗体对照组相比降低。通过使用BrdU试剂盒(Roche cat.no.11444611001)根据厂商指导在DNA中掺入5-溴-2′-脱氧-尿苷(BrdU)进行测量。

抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)的产生

从每个表位组选择最强力的抗-IL6抗体。将表达这些抗体的表达构建体在3个非竞争性组中以不同比率转染进HEK293T细胞中(1∶1∶1；3∶1∶1；1∶3∶1；1∶1∶3；3∶3∶1；1∶3∶3；3∶1∶3；10∶1∶1；1∶10∶1；1∶1∶10；10∶10∶1；1∶10∶10；10∶1∶10；3∶10∶1；10∶3∶1；1∶10∶3；3∶1∶10；10∶1∶3；1∶3∶10)。收获含有抗体的上清并纯化以及如上述鉴定。

抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)的复合物形成及体内清除

为了测量抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)形成免疫复合物的能力及分析这些复合物，使用根据Min-Soo Kim et al.(2007)JMB 374：1374-1388揭示的大小排阻层析法(SEC)鉴定与TNFα的不同抗体形成的免疫复合物。将不同摩尔比率的抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)与人IL6混合，在4℃或者25℃保温20小时。将此混合物在装备大小排阻柱的HPLC系统上分析；使用分子量标准使不同的洗脱时间与分子量相关联。

使抗体与IL6形成复合物的能力与其在体内从循环中快速清除细胞因子的能力相关联。这通过测量放射性标记的IL6从小鼠中的清除而证实。简而言之，获得雌性6-8周龄的Balb/c小鼠，在实验前18小时通过侧面尾静脉经静脉内(IV)注射不同剂量的纯化的抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)。在第0天，在相同条件下为小鼠IV注射50μl放射性标记的IL-6(1x10E7cpm/mL)。在一些时间间隔收集血样(大约50μl)，并在4℃贮存。将样品在4000×g离心5分钟，确定血清的放射性。所有药动学实验均使用每种处理三只动物同时进行。

抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)稳定克隆的产生及临床前开发

基于如上文确定的体外和体内效力选择先导抗-IL6。鼠VH基因根据标准方法人源化，并且与完全人GKV1-39轻链在上述表达载体中组合。人源化方法的实例包括基于范例的那些方法，如表面再建(Padlan，E.A.，et al.，(1991).Mol.Immunol.，28，489)、超人源化(Tan，P.，D.A.，et al.，(2002)J.Immunol.，169，1119)及人string content优化(Lazar，G.A.，et al.，(2007).Mol.Immunol.，44，1986)。将这三个构建体以预定的最佳比率(如上述)在G418选择压力下根据标准方法转染进PER.C6细胞中。选择稳定的高产量抗-IL6寡克隆克隆(Oligoclonic clone)，产生合格的工作原始细胞库。

表1

引物列表

DO-	引物	序列
			0012	CH1_Rev	TGCCAGGGGGAAGACCGATG
0656	MVH-1	GCCGGCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTCAGGAC
			0657	MVH-2	GCCGGCCATGGCCGAGGTSCAGCTKCAGCAGTCAGGAC
0658	MVH-3	GCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTCAGG
			0659	MVH-4	GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCSGGAC
0660	MVH-5	GCCGGCCATGGCCGARGTCCAGCTGCAACAGTCYGGAC
			0661	MVH-6	GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTKCAGCAATCTGG
0662	MVH-7	GCCGGCCATGGCCCAGSTBCAGCTGCAGCAGTCTGG
			0663	MVH-8	GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTGCAGCAGTCTGGRC
0664	MVH-9	GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTYCAGCAGTCTGG
			0665	MVH-10	GCCGGCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACAATCTGGACC
0666	MVH-11	GCCGGCCATGGCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTCTGGG
			0667	MVH-12	GCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATCTG
0668	MVH-13	GCCGGCCATGGCCGAVGTGAAGYTGGTGGAGTCTG
			0669	MVH-14	GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTCTGGGG
0670	MVH-15	GCCGGCCATGGCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTCTGGG
			0671	MVH-16	GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTCTGG
0672	MVH-17	GCCGGCCATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTCTGGTG
			0673	MVH-18	GCCGGCCATGGCCGARGTRAAGCTTCTCGAGTCTGGA
0674	MVH-19	GCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTCTGG
			0675	MVH-20	GCCGGCCATGGCCGAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGG
0676	MVH-21	GCCGGCCATGGCCCAGGTTACTCTRAAAGWGTSTGGCC
			0677	MVH-22	GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCCTGG
0678	MVH-23	GCCGGCCATGGCCCAGGTYCARCTGCAGCAGTCTG
			0679	MVH-24	GCCGGCCATGGCCGATGTGAACTTGGAAGTGTCTGG
0680	MVH-25	GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTCTGG
			0681	ExtMVH-	CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCSA
0682	ExtMVH-	CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCSA
			0683	MJH-Rev	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GTGG
0684	MJH-Rev	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC TGTGAGA GTGG
			0685	MJH-Rev	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGCAGAGAC AGTGACC AGAG
0686	MJH-Rev	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACT GAGG
			0687	ExtMJH-	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GTGG
0688	ExtMJH-	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACA GTGG
			0690	ExtMJH-	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC AGAG
0691	ExtMJH-	GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GAGG

表7.在经典15聚体肽格式中Merus IGKV1-39的

预测的作图。这个表显示跨越Merus IGKV1-39序列的每个15聚体的关键表位的同种异型计数及所涉及的血清型。

表8：与各种具有不同氨基酸突变率的轻链基因配对的来自PG1433的V_H基因与含有IGKV1-39基因的原始克隆比较产生水平

IgG名称	轻链基因	氨基酸突变数	浓度(μg/ml)
				PG1433	1-39	0	63，45.5，38.6(avg＝49)
PG1631	1-12	4	10.5
				PG1632	1-27	7	9.3
PG1634	1D-12	10	10.8
				PG1635	1D-33	6	10.2
PG1642	1-5	8	7.1
				PG1644	1-9	3	7.8
PG1650	1D-39	3	9.1
				PG1652	2D-28	3	7.1
PG1653	3-15	14	7
				PG1654	3-20	2	5.2
PG1674	1-40	7	8.2
				PG1678	2-11	2	8.1
PG1680	2-14	15	10.8
				PG1682	3-1	13	9.9
PG1683	6-57	6	13.9

表10用于染色淋巴细胞群的抗体混合物。BM＝骨髓，PC＝腹膜腔，PP＝Peyer’s斑。

表11从野生型及转基因小鼠的骨髓和脾中收获的淋巴细胞数

Claims

1.一种制备转基因小鼠的方法，包括通过位点特异性重组向小鼠种系中引入表达盒的步骤，其中所述表达盒包括编码人免疫球蛋白的重排的人VL区的核酸，其中所述VL区由人种系V和种系J区段编码，其中所述编码VL区的核酸靶向至小鼠Igκ或者λ轻链基因座以失活内源基因座，其中所述VL区基于其与至少两个人或鼠VH区配对的能力来选择，且其中所述转基因小鼠能够产生携带所述VL区和鼠或人轻链恒定区的抗体。

2.一种制备转基因小鼠的方法，包括通过位点特异性重组向小鼠种系中引入表达盒的步骤，其中所述表达盒包括编码人免疫球蛋白的重排的人VL区的核酸，其中所述VL区由人种系V和种系J区段编码，其中所述编码VL区的核酸靶向至Rosa基因座，其中所述VL区基于其与至少两个人或鼠VH区配对的能力来选择，且其中所述表达盒进一步编码鼠或人轻链恒定区。

3.如权利要求1或2的方法，其中所述VL区基于其与大部分人或鼠VH区配对的能力来选择。

4.如权利要求1或2的方法，其中所述编码重排的人VL区的核酸被导入小鼠受精卵或者胚胎干细胞的前核中。

5.如权利要求1或2的方法，其中所述转基因小鼠包含人VH基因座。

6.如权利要求1或2的方法，其中所述转基因小鼠进一步携带非重排的人VH基因座，其中所述人VL区能与在B细胞发育期间产生的至少0.1％的人VH区配对，且其中所述内源小鼠VH基因座被失活。

7.如权利要求1或2的方法，其中抗体特异性的不同通过重链中的重排和超突变保留。

8.分离自转基因小鼠的细胞，所述转基因小鼠包含引入其种系中的编码重排VL区的核酸，其中所述VL区由人种系V和种系J区段编码，其中编码所述VL区的核酸靶向至小鼠Igκ或者λ轻链基因座以失活内源基因座，其中所述VL区基于其与至少两个人或鼠VH区配对的能力来选择，且其中所述转基因小鼠能够产生携带所述VL区和鼠或人轻链恒定区的抗体。

9.分离自转基因小鼠的细胞，所述转基因小鼠包含引入其种系中的编码重排VL区的核酸，其中所述VL区由人种系V和种系J区段编码，其中编码所述VL区的核酸靶向至Rosa基因座，其中所述VL区基于其与至少两个人或鼠VH区配对的能力来选择，且其中所述核酸进一步编码鼠或人轻链恒定区。

10.如权利要求8或9的细胞，其中所述VL区基于其与大部分人或鼠VH区配对的能力来选择。

11.如权利要求8或9的细胞，其中所述转基因小鼠包含人VH基因座。

12.如权利要求8或9的细胞，其中所述转基因小鼠进一步携带非重排的人VH基因座，其中所述人VL区能与在B细胞发育期间产生的至少0.1％的人VH区配对，且其中所述内源小鼠VH基因座被失活。

13.如权利要求8或9的细胞，其中抗体特异性的不同通过重链中的重排和超突变保留。

14.从用特定抗原免疫后的权利要求11或12的转基因小鼠获得的B细胞用作VH区来源的用途，其中所述VH区通过构建cDNA文库或者通过使用人VH区的引物进行PCR扩增而可以被获得。

15.如权利要求14的用途，其中所述VH区通过构建cDNA文库或者通过使用人VH区的引物进行PCR扩增而获得。