JP5514539B2 - ヒト抗体の調製に用いるためのキメラ抗体を発現するトランスジェニック動物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2006年3月31日に出願された米国特許仮出願第60/744,104号の優先権を主張し、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。

発明の背景
抗体は、がん、自己免疫疾患、および感染症を含む多種多様な障害を治療するための、ヒトにおける効果的な治療薬であることが判明している。当初はマウスモノクローナル抗体が治療薬として試みられたが、これは一般に、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が生じるために、ヒトでの使用に適していないことが判明した。それよりも、現在は、一部または完全にヒト抗体アミノ酸配列から構成される抗体が、ヒトでの使用に選択される抗体薬である。ヒトでの使用に関してFDAにより認可された、または現在臨床試験が行われている多くの抗体のうち、いくつかの抗体は、ヒト定常領域に連結されたマウス可変領域を含み、一般的にキメラ抗体と称される。他の抗体は、ヒトフレームワーク内のマウスCDR、およびヒト定常領域を含み、一般的にヒト化抗体と称される。さらに他の抗体は、完全にヒト由来配列(すなわち、完全ヒト可変領域および定常領域)から構成され、一般的にヒト抗体と称される。

ヒト抗体を調製するためのいくつかのアプローチが、当技術分野で公知である。あるタイプのアプローチでは、ヒト免疫グロブリン配列のライブラリーを、関心対象の抗原を用いてディスプレイ系(例えば、バクテリオファージ)でスクリーニングして、所望の抗原特異性を有する抗体配列を選択する(例えば、Ladner et al.に対する米国特許第5,223,409号；第5,403,484号；および第5,571,698号；Dower et al.に対する米国特許第5,427,908号および第5,580,717号；McCafferty et al.に対する米国特許第5,969,108号および第6,172,197号；ならびにGriffiths et al.に対する米国特許第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号；および第6,593,081号を参照されたい)。このアプローチはインビトロで行われるため、ヒト抗体配列は選択過程において親和性成熟も体細胞突然変異も起こさず、インビボで産生される抗体と比較して親和性の低い抗体が生じる場合がある。

したがって、別のタイプのアプローチでは、ヒト免疫グロブリン配列を含むようにゲノムが改変されているマウスを用いて、関心対象の抗原による免疫化により、抗原特異的抗体を産生させる。そのようなマウスは導入遺伝子および/または導入染色体(transchromosome)上に再編成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子(可変領域および定常領域)を有するため、これらの遺伝子は、マウスにおいて見かけ上正常な再編成およびアイソタイプスイッチを起こす。さらに、このようなマウスでは、抗体応答の成熟中に体細胞突然変異も起こる。

そのようなマウスの一例はHuMAb Mouse(登録商標)(Medarex, Inc.)であり、このマウスは、内因性μ鎖およびκ鎖遺伝子座を不活化する標的突然変異とともに、非再編成ヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン導入遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照されたい)。したがって、マウスはマウスIgMまたはκの発現減少を示し、免疫化に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラススイッチおよび体細胞突然変異を起こして、親和性の高いヒトIgGκモノクローナル抗体を産生する(Lonberg, N. et al. (1994)、前記；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546に概説されている)。HuMabマウスの作製および使用、ならびにそのようなマウスが有するゲノム改変は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123；Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591；およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、これらすべての内容は、全体として参照により本明細書に具体的に組み入れられる。さらに、すべてLonberg and Kayに対する米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；および第5,770,429号；Surani et al.に対する米国特許第5,545,807号；すべてLonberg and Kayに対するPCT国際公開番号 WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、およびWO 99/45962；ならびにKorman et al.によるPCT国際公開番号 WO 01/14424も参照されたい。

ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させるための別のトランスジェニックマウス系はXenomouse(Abgenix, Inc.)と称され、例えば、Kucherlapati et al.に対する米国特許第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号；および第6,162,963号に記載されている。HuMAb Mouse(登録商標)系と同様に、Xenomouse系は内因性マウス重鎖および軽鎖遺伝子の破壊、ならびにヒト可変領域および定常領域配列を含む非再編成ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する導入遺伝子のマウスゲノムへの挿入を含む。

ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させるための当技術分野で公知のその他の系には、マウスがヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入遺伝子を有する、Ishida et al.によりPCT国際公開番号 WO 02/43478に詳述されているKM Mouse(登録商標)系、ならびにマウスがヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を有する、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されているTCマウス系が含まれる。これらの系ではそれぞれ、マウスが有する導入遺伝子および/または導入染色体は、ヒト免疫グロブリン可変領域および定常領域配列を含む。

米国特許第6,596,541号は、マウス定常領域配列に連結されたヒト可変領域配列を有するキメラ抗体を発現する相同組換えマウスの机上の例を提供している。この例では、マウス重鎖遺伝子座可変領域(V-D-Jセグメント)を、多段階過程を経てヒト重鎖V-D-J対応物で正確に置換する。まず、関心対象のヒト免疫グロブリン可変遺伝子セグメントにまたがる大きなゲノム断片(20 kb超)を得て、細菌による組換えを用いて、全体で20 kbを超える相同アームを含む、真核細胞で用いるための大型のターゲティングベクター(LTVEC)を調製する。相同アームは、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座由来の配列を含む。次に、LTVECをマウス胚性幹細胞に導入する。ES細胞において対立遺伝子改変(MOA)を検出するための定量アッセイを用いて、LTVECと内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座との間で相同組換えが起こった細胞を同定する。しかし、キメラ抗体を発現する実際のマウスについては、記載も特徴づけもなされていない。

発明の概要
本発明では、ヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むキメラ抗体を発現するトランスジェニック動物について記載し、これを特徴づける。特に、定常領域は宿主動物のものである(例えば、マウスの場合、定常領域はマウス定常領域である)。本発明の動物は、遺伝子導入マイクロインジェクション技術を用いて作製することができ、相同組換え技術の使用を必要とせず、したがって相同組換えを用いるアプローチよりも調製および選択が容易である。さらに、本発明のトランスジェニック動物における宿主動物Ig定常領域に連結されたヒトIg可変領域の発現は、ヒトIg定常領域に連結されたヒトIg可変領域を発現するトランスジェニック動物と比較して、改善された抗体がこれらの動物で得られ得るように、インビボにおいてB細胞および抗体の輸送および発達の改善を可能にすると考えられる。抗体におけるそのような改善には、例えば、インビボにおける、体細胞突然変異の増加、内因性マウスアクセサリータンパク質との会合の改善、およびマウスFc受容体への結合の改善が含まれ得る。

さらに、ヒトV領域をコードする配列を単離し、標準的な組換えDNA技術をインビトロで用いてこれらの配列をヒト定常領域配列に連結することにより、キメラ抗体を完全ヒト抗体に容易に変換することができる。したがって、本発明は、トランスジェニック動物においてインビボで産生されたキメラ抗体中間体の使用を通して、治療での使用に適した改善ヒト抗体を得る手段を提供する。

本発明の動物では、非再編成ヒト免疫グロブリン可変領域配列および少なくとも1つの宿主動物定常領域配列(例えば、IgM定常領域)を含む導入遺伝子を調製し、宿主動物のゲノムに挿入する(例えば、宿主動物の接合子への前核マイクロインジェクションによる)。宿主動物のゲノムに挿入されると、導入遺伝子構築物は非ヒト宿主動物において再編成を起こし、ヒト可変領域および非ヒト宿主動物の定常領域を含むキメラ抗体を発現する。さらに、本明細書で実証されるように、挿入された導入遺伝子は、宿主動物において異なるアイソタイプのキメラ抗体が得られるように、宿主動物において内因性定常領域とトランススイッチを起こし得る。

したがって、1つの局面において、本発明は、非ヒト宿主動物の少なくとも1つの免疫グロブリン(Ig)定常領域配列に機能的に連結された複数の非再編成ヒト免疫グロブリン(Ig)可変領域配列を含む導入遺伝子構築物であって、非ヒト宿主動物において再編成を起こし、非ヒト宿主動物においてキメラ抗体を発現する導入遺伝子構築物に関する。キメラ抗体は、ヒト可変領域および非ヒト宿主動物の定常領域を含む。好ましい態様において、複数の非再編成ヒトIg可変領域配列は重鎖可変領域配列である。または、複数の非再編成ヒトIg可変領域配列は軽鎖可変領域配列であってもよい。

好ましい態様において、構築物は、V-D-J配列を含む重鎖可変領域配列を含む。例えば、構築物は、5'から3'方向に、複数のヒトV_H領域、複数のヒトDセグメント、複数のヒトJ_Hセグメント、非ヒト宿主動物由来のJ-μエンハンサー、非ヒト宿主動物由来のμスイッチ領域、および非ヒト宿主動物由来のμ定常領域を含み得る。1つの態様において、構築物は、4つのヒトV_H領域、15のヒトDセグメント、および6つのヒトJ_Hセグメントを含む。好ましい導入遺伝子構築物は9B2導入遺伝子構築物である。

本明細書で実証されるように、非ヒト宿主動物のμ定常領域に連結されたヒト重鎖V-D-J配列を含む導入遺伝子構築物は、導入遺伝子構築物が非ヒト宿主動物のゲノムに組み込まれた場合、宿主動物において2つ以上のアイソタイプのキメラ抗体が産生され得るように、非ヒト宿主動物の内因性定常領域とトランススイッチを起こし得る。特に好ましい態様において、本発明は、5'から3'方向に、複数のヒトV_H領域、複数のヒトDセグメント、複数のヒトJ_Hセグメント、マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、およびマウスμ定常領域を含む導入遺伝子構築物であって、マウスゲノムに組み込まれた場合に、マウスにおいてヒトV領域ならびにIgMおよびIgGアイソタイプのマウス定常領域を含むキメラ抗体が産生されるように、内因性マウスγ定常領域とトランススイッチを起こす導入遺伝子構築物を提供する。

導入遺伝子構築物中のμ定常領域の存在が、トランススイッチが起こるために十分であることが示されているが、特定の態様では、トランススイッチおよびシススイッチの両方が起こって異なるアイソタイプの抗体が産生され得るように、導入遺伝子構築物自体に比較的多くの宿主動物定常領域を含めることが好ましいと考えられる。したがって、特定の態様において、導入遺伝子構築物は、例えば、非ヒト宿主動物由来のγ定常領域または非ヒト宿主動物由来のα定常領域を含み得る。または、導入遺伝子構築物は、非ヒト宿主動物のIg定常領域をすべて含んでもよい(すなわち、導入遺伝子構築物は、非ヒト宿主動物の定常領域全体を含む)。

別の局面において、本発明は、非再編成ヒトIg可変領域配列が、非ヒト宿主動物由来の軽鎖定常領域配列に連結された、ヒトκV-J配列などのヒト軽鎖可変領域配列であるキメラ抗体を発現させるための導入遺伝子に関する。例えば、1つの態様において、構築物は、5'から3'方向に、複数のヒトVκ領域、複数のヒトJκセグメント、非ヒト宿主動物由来のJ-κエンハンサー、および非ヒト宿主動物由来のCκコード領域を含む。

本発明の別の局面は、ヒトIg可変領域および非ヒト宿主動物定常領域を含むキメラ抗体を発現する、本発明の1つまたは複数の導入遺伝子構築物を含むトランスジェニック非ヒト宿主動物に関する。好ましくは、導入遺伝子はトランススイッチを起こし、動物は、ヒトIg可変領域ならびに少なくともIgMおよびIgGアイソタイプの非ヒト宿主動物Ig定常領域を含むキメラ抗体を発現する。好ましい非ヒト宿主動物はマウスであるが、遺伝子導入に適した他の動物もまた本発明によって包含される。さらに、好ましくは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト宿主動物において、例えば相同組換えにより不活化されている。好ましい態様において、トランスジェニック宿主動物の内因性重鎖遺伝子座は、J_H領域の破壊により不活化されている。別の好ましい態様において、トランスジェニック宿主動物の内因性軽鎖遺伝子座は、Jκ領域の破壊により不活化されている。

本発明のさらに別の局面は、関心対象の抗原に特異的なキメラ抗体を作製する方法に関する。本方法は、本発明の導入遺伝子構築物を含む本発明のトランスジェニック非ヒト宿主動物に関心対象の抗原を免疫する段階、および関心対象の該抗原に特異的なキメラ抗体を該動物から得る段階を含む。例えば、標準的な技法を用いて、キメラ抗体を発現するハイブリドーマを免疫宿主動物から調製することができる。好ましい態様において、本方法は、キメラ抗体をコードする核酸を動物から単離する段階、非ヒト宿主動物Ig定常領域をコードする核酸を、ヒトIg定常領域をコードする核酸で置換し、それによってキメラ抗体をヒト抗体に変換する段階、および該ヒト抗体を発現させる段階をさらに含む。特定の態様において、ヒト抗体は、関心対象の抗原に対してキメラ抗体よりも高い親和性を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、関心対象の抗原に対するキメラ抗体を産生させ、次いで該キメラ抗体を完全ヒト抗体に変換するための、キメラ抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物の宿主としての使用を含む。トランスジェニック非ヒト宿主動物で発現されるキメラ抗体は、非ヒト宿主動物の定常領域に連結されたヒト可変領域を含む。本発明は、導入遺伝子構築物と、そのような導入遺伝子構築物を有する非ヒトトランスジェニック宿主動物と、完全ヒト抗体にさらに変換可能なキメラ抗体を産生させるためにそのような宿主動物を用いる方法とに関する。

本発明をより容易に理解できるように、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載する。

本明細書で用いる「キメラ抗体」という用語は、抗体鎖(重鎖または軽鎖)の少なくとも1つが、ある種(例えば、ヒト)に由来する可変領域配列および別の種(例えば、マウス)に由来する定常領域配列を含む抗体を指す。「キメラ抗体」という用語は、(i) 重鎖はキメラであるが、軽鎖は1つの種のみに由来するV領域およびC領域を含む；(ii) 軽鎖はキメラであるが、重鎖は1つの種のみに由来するV領域およびC領域を含む；ならびに(iii) 重鎖および軽鎖の両方がキメラである抗体を包含することが意図される。

本明細書で用いる「導入遺伝子構築物」という用語は、宿主動物のゲノムへの導入に適した核酸調製物を指す。本発明の「導入遺伝子構築物」は、単一断片の核酸(9B2導入遺伝子など)または複数断片の核酸(HCo26導入遺伝子など)を含み得る。導入遺伝子構築物が複数断片の核酸を含む場合、導入遺伝子構築物調製物を構成する個々の断片は、宿主動物のゲノムに導入された場合に組み換わって連続した導入遺伝子が作製されるように、重複した配列を含む(例えば、本明細書におけるHCo26導入遺伝子のさらなる説明を参照されたい)。

本明細書で用いる「アイソタイプスイッチ」という用語は、抗体のクラスまたはアイソタイプが、スイッチ配列によって媒介される組換え過程により、あるIgクラスから別のIgクラスに変化する現象を指す。

本明細書で用いる「非スイッチアイソタイプ」とは、アイソタイプスイッチが起こらなかった場合に産生される重鎖のアイソタイプクラスを指す。非スイッチアイソタイプをコードするC_H遺伝子は、典型的に、機能的に再編成されたVDJ遺伝子のすぐ下流の最初のC_H遺伝子である(例えば、IgMアイソタイプ)。

本明細書で用いる「スイッチ配列」または「スイッチ領域」という用語は、Igクラススイッチを引き起こすスイッチ組換えに関与する、当技術分野で公知のDNA配列を指す。

本明細書で用いる「トランススイッチ」という用語は、導入遺伝子スイッチ領域と、導入遺伝子を有する染色体と異なる染色体上に位置する内因性スイッチ領域との間の組換えのような、あるスイッチ領域と、異なる染色体上に位置する別のスイッチ領域との間の組換えを含むアイソタイプスイッチを指す。特に、これは、導入遺伝子スイッチ領域と、非ヒトトランスジェニック宿主動物の内因性Ig定常領域のスイッチ領域との間の組換えを指す。

本明細書で用いる「シススイッチ」という用語は、同じ導入遺伝子または内因性Ig遺伝子座が有するμ定常領域とγ定常領域との間のスイッチ組換えなど、導入遺伝子内の2つのスイッチ領域間または内因性Ig遺伝子座の2つのスイッチ領域間の組換えのような、同じ染色体上に位置するあるスイッチ領域と別のスイッチ領域との間の組換えを含むアイソタイプスイッチを指す。

本明細書で用いる、免疫グロブリンVセグメントに関する「非再編成」または「生殖系列配置」という用語は、Vセグメントが、DまたはJセグメントに直接隣接するように組換えられていない配置を指す。

本明細書で用いる、免疫グロブリンVセグメントに関する「再編成」という用語は、それぞれ完全なV_HまたはV_Lドメインを本質的にコードするように、VセグメントがD-JまたはJセグメントに直接隣接して位置する配置を指す。

本明細書で用いる「複数の非再編成免疫グロブリン(Ig)可変領域配列」という用語は、非再編成配置の2つ以上の重鎖または軽鎖可変領域セグメントを含む構築物を指すことが意図される。

本明細書で用いる「機能的に連結された」という用語は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた核酸配列の配置を表すことが意図される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に作用する場合、そのコード配列に機能的に連結されている。2つのタンパク質コード領域の連結に関して、機能的に連結されたとは、連結されている核酸配列が連続しており、読み枠内にあることを意味する。スイッチ配列に関して、機能的に連結されたとは、その配列がスイッチ組換えをもたらし得ることを意味する。

I. キメラ抗体を発現させるための導入遺伝子構築物
本発明の導入遺伝子構築物は、非ヒト宿主動物の少なくとも1つの免疫グロブリン(Ig)定常領域配列に機能的に連結された複数の非再編成ヒト免疫グロブリン(Ig)可変領域配列を含み、非ヒト宿主動物において再編成を起こし、非ヒト宿主動物においてヒト可変領域および非ヒト宿主動物の定常領域を含むキメラ抗体を発現する。この関連で、「少なくとも1つのIg定常領域配列」という用語は、IgM定常領域配列またはκ定常領域配列などの、少なくとも1つの定常領域アイソタイプ配列をコードする配列を意味することが意図される。本発明は、キメラ重鎖配列をコードするか、またはキメラ軽鎖配列をコードする導入遺伝子構築物を包含する。導入遺伝子構築物の可変領域は、非ヒトトランスジェニック宿主動物に組み込まれた場合、機能的な重鎖または軽鎖可変領域が作製されるように再編成を起こす。さらに、特定の態様では、トランスジェニック非ヒト宿主動物において2つ以上のアイソタイプのキメラ抗体が産生されるように、組み込まれた導入遺伝子構築物はトランススイッチを起こす。導入遺伝子構築物がキメラ重鎖配列をコードする場合、これは非ヒト宿主動物の少なくともIgM定常領域を含み、本明細書において実証されるように、宿主IgM定常領域のみの存在はたとえ公知の3' IgHエンハンサーが無くてもB細胞の確実な成熟およびトランススイッチの達成に十分であるが、さらなる宿主定常領域を含んでもよい。

したがって、1つの局面において、導入遺伝子構築物内の複数の非再編成ヒトIg可変領域配列は重鎖可変領域配列である。特に、そのような重鎖構築物は、典型的に非再編成ヒト重鎖V-D-J配列を含む。そのような重鎖構築物はまた、非ヒト宿主動物の少なくとも1つのIg定常領域配列も含み、典型的にはエンハンサーおよびスイッチ配列を含む調節配列も含む。したがって、好ましい態様において、導入遺伝子構築物は、5'から3'方向に、複数のヒトV_H領域、複数のヒトDセグメント、複数のヒトJ_Hセグメント、非ヒト宿主動物由来のJ-μエンハンサー、非ヒト宿主動物由来のμスイッチ領域、および非ヒト宿主動物由来のμ定常領域を含む。特に好ましい1態様において、前記構築物は、実施例においてさらに説明するように、4つのヒトV_H領域、15のヒトDセグメント、および6つのヒトJ_Hセグメントを含む。本発明の重鎖構築物の好ましいが非限定的な例は、9B2導入遺伝子である。

好ましくは、本発明の重鎖構築物は、非ヒト宿主動物ゲノムに組み込まれた場合、非ヒト宿主動物の内因性定常領域とトランススイッチを起こし得る。本明細書において実証されるように、導入遺伝子構築物中の非ヒト宿主動物のμスイッチ領域およびμ定常領域の存在は、宿主動物において、組み込まれた導入遺伝子と内因性定常領域配列との間でトランススイッチが起こるのに十分である。したがって、1つの宿主動物定常領域配列であるμのみを含む本発明の重鎖構築物は、それにもかかわらず、トランススイッチの結果として、宿主動物において複数のアイソタイプ(例えば、IgMおよびIgG)のキメラ抗体の産生をもたらし得る。

したがって、本発明の別の好ましい導入遺伝子構築物は、5'から3'方向に、複数のヒトV_H領域、複数のヒトDセグメント、複数のヒトJ_Hセグメント、マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、およびマウスμ定常領域を含み、この導入遺伝子構築物は、マウスゲノムに組み込まれた場合に、マウスにおいてヒトV領域ならびにIgMおよびIgGアイソタイプのマウス定常領域を含むキメラ抗体が産生されるように、内因性マウスγ定常領域とトランススイッチを起こす。

μ定常領域(および関連スイッチ配列)の存在のみで、複数のアイソタイプのキメラ抗体の産生に十分であり得るが、場合によっては、トランススイッチおよびシススイッチの両方が起こり得るように、重鎖導入遺伝子構築物中に2つ以上の宿主動物定常領域配列を含めることが望ましいと考えられる。したがって、種々の態様において、本発明の重鎖導入遺伝子構築物は、非ヒト宿主動物の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の定常領域を含み得る。例えば、別の態様では、構築物は、μ定常領域に加えて、非ヒト宿主動物由来のγ定常領域(および関連スイッチ配列)をさらに含み得る。例えば、トランスジェニック非ヒト宿主動物としてマウスを用いる場合、重鎖導入遺伝子構築物は、ネズミμコード配列(および関連スイッチ配列)を含んでよく、さらにネズミγ1、γ2a、γ2b、およびγ3コード配列(および関連スイッチ配列)の1つまたは複数を含み得る。さらに別の態様では、前記構築物は、非ヒト宿主動物の免疫グロブリン(Ig)定常領域をすべて含み得る(すなわち、前記構築物は、μ、δ、γ、α、およびε定常配列を包含する非ヒト宿主動物のC領域全体を含む)。

別の局面において、本発明の導入遺伝子構築物は、非ヒトトランスジェニック宿主動物の軽鎖定常領域配列に連結された複数の非再編成ヒト軽鎖可変領域配列を含む。特に、そのような軽鎖構築物は典型的に、非再編成ヒト軽鎖V-J配列である、κV-J配列またはλV-J配列のいずれかを含む。好ましい態様において、キメラ構築物は、5'から3'方向に、複数のヒトVκ領域、複数のヒトJκセグメント、非ヒト宿主動物由来のJ-κエンハンサー(例えば、マウスκ内部エンハンサー)、および非ヒト宿主動物由来のCκコード領域を含むキメラκ軽鎖構築物である。

別の態様において、キメラ軽鎖構築物はλ軽鎖構築物であってもよい。マウスおよびヒトのどちらのIg遺伝子座にも、複数のV_λ遺伝子のクラスター、およびそれに続くJ_λ-C_λ単位の反復クラスターが存在する。したがって、1つの態様では、複数のヒトV_λ領域を複数のヒトJ_λ-非ヒトC_λ組み合わせ単位に連結することによって、キメラλ鎖導入遺伝子を構築することができる。または、複数のヒトV_λ領域の下流に置かれる単一のヒトJ_λ-非ヒトC_λを選択することもできる。考えられる別の配置は、内因性非ヒトJ_λ-C_λクラスターの上流に複数のヒトV_λ領域を置くことであり、これによって、非ヒトJ_λ領域および非ヒトC_λ領域に連結されたヒトV_λ領域を含むキメラ抗体が得られる。

本発明の導入遺伝子構築物は、標準的な組換えDNA技法を用いて調製することができる。ポリリンカーを含むクローニングベクターは、関心対象のDNA断片を挿入するための開始ベクターとして有用である。そのような適切なクローニングベクターの非限定的な例を、実施例に記載する。ヒト非再編成重鎖または軽鎖免疫グロブリン配列を有するプラスミドまたは他のベクター(例えば、YAC)が、当技術分野において記載されている(例えば、すべてLonberg and Kayに対する米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；および第5,770,429号；ならびにすべてKucherlapati et al.に対する米国特許第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号；および第6,162,963号を参照されたい)。本発明の導入遺伝子構築物中に含めようとするヒト非再編成重鎖または軽鎖可変領域の供給源として、そのようなプラスミドおよび他のベクターを用いることができる。加えて、またはあるいは、適切なヒトIg可変領域DNAは、標準的な技法を用いてゲノムライブラリーから得ることもできる。定常領域のコード配列ならびに関連のエンハンサーおよびスイッチ領域を含む、非ヒト宿主動物の定常領域配列をコードするDNAも同様に、標準的な技法を用いてゲノムライブラリーから得ることができる。例えば、ネズミゲノムDNAのB6 BACライブラリー(Invitrogen)を、本発明の導入遺伝子構築物中に含めるためのネズミ定常領域配列の供給源として用いることができる。

クロマチン接近性、適切なV(D)J組換え、クラススイッチ、高レベルの抗体発現、およびその他の遺伝子座制御機能には、可変および定常コード領域に加えて、シス作動性調節配列が典型的に必要である。V(D)J遺伝子セグメントの近傍に位置するプロモーター領域は、クロマチン接近性およびV(D)J組換えにおいて役割を果たし得る。J_Hコード領域とIgMコード領域との間、およびJκコード領域とκコード領域との間のイントロンエンハンサーが同定されている。加えて、下流の3' DNase高感受性領域が同定されており、これはIgH遺伝子座制御領域(LCR)を構成する。クラススイッチ組換えは、プロモーター、および種々の重鎖定常領域の上流にあるスイッチ領域のステライル(sterile)転写産物に依存する。複製起点もまた、IgH遺伝子座の境界を定め得る3' DNase高感受性部位の下流に同定されている。好ましくは、本発明の構築物は、少なくとも、V(D)J遺伝子セグメントの近傍に位置するプロモーター領域、1つまたは複数の機能的スイッチ領域、およびイントロンエンハンサーを含む。高レベルのAb産生、発達、および成熟には、5'イントロンエンハンサーから下流の3' LCRまで、および場合によってはそれを超えるすべてのゲノムDNAを含めることが好ましい(が必須ではない)場合がある。

次に、ヒトIg可変領域および非ヒト宿主動物Ig定常領域由来の適切なゲノムDNA断片を、ライゲーションによりクローニングベクターに機能的に連結し、次いで該ベクターの特徴づけを行い(例えば、制限断片解析または配列決定などによる)、ゲノム断片の適切な配置を確実にする。本発明の重鎖導入遺伝子構築物を作製する非限定的な例を、実施例1に詳述する。

マイクロインジェクションまたは遺伝子導入のためのその他の技法用に導入遺伝子構築物を調製するためには、適した制限酵素で切断して導入遺伝子構築物断片を遊離させることにより、ベクターから導入遺伝子構築物を単離することができる。アガロースゲルでのパルスフィールドゲル電気泳動、およびその後のβアガラーゼ消化または電気溶出などによるアガロースゲルからの断片の単離など、標準的な技法を用いて、断片を単離することができる。例えば、導入遺伝子構築物断片を含むアガロースゲル切片をゲルから切り出すことができ、標準的な方法を用いてβ-アガラーゼ(例えば、Takara製)でアガロースを消化することができる。

II. トランスジェニック非ヒト宿主動物の作製および特徴づけ
本発明の別の局面は、ヒトIg可変領域および非ヒト宿主動物Ig定常領域を含むキメラ抗体を発現するように、本発明の導入遺伝子構築物の1つまたは複数を含むトランスジェニック非ヒト宿主動物に関する(すなわち、導入遺伝子構築物は宿主動物のゲノム中に組み込まれる)。好ましくは、導入遺伝子構築物はトランススイッチを起こし、動物は、ヒトIg可変領域ならびに少なくともIgMおよびIgGアイソタイプの非ヒト宿主動物Ig定常領域を含むキメラ抗体を発現する。

本発明のトランスジェニック非ヒト宿主動物は、外因性核酸を非ヒト動物のゲノムに導入するための、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて作製する。好ましい非ヒト動物はマウスであるが、(i) 遺伝子導入に適しており、かつ(ii) 免疫グロブリン遺伝子セグメントを再編成して抗体応答を生じ得る、その他の動物種もまた用いることができる。そのような種の例には、これらに限定されないが、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、およびウシが含まれる。

トランスジェニック非ヒト動物、特にトランスジェニックマウスを作製する好ましい方法は、前核マイクロインジェクション法である。この技術は20年以上にわたって知られており、十分に確立されている(例えば、Wagner, T.E. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376-6380；Wagner and Hoppeによる米国特許第4,873,191号を参照されたい)。一般に、この方法は、マイクロインジェクションにより外因性遺伝物質を哺乳動物接合子(例えば、マウス接合子)の前核に導入して、遺伝的に形質転換した接合子を得る段階、および次に遺伝的に形質転換した該接合子を偽妊娠雌性動物に移植する段階を含む。次に胚を発生させて出産させ、得られた子孫のゲノムを導入遺伝子物質の存在に関して解析する。サザンブロット解析、PCR、またはゲノムDNAを解析するための他のそのような技法を用いて、非トランスジェニック動物中に存在しないがトランスジェニック動物中には存在する特有の核酸断片の存在を検出する。トランスジェニック子孫の選択的交配により、導入遺伝子のホモ接合性が達成され得る。

本発明の好ましい態様は、前核マイクロインジェクションによって作製されたトランスジェニックマウスを含むが、本発明は、これらに限定されないが、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、およびニワトリを含むその他の非ヒト宿主動物も包含する。これらの種のそれぞれのトランスジェニック動物を作製する技法は、当技術分野において記載されている。

例えば、トランスジェニックラットの作製は、Tesson, L. et al. (2005) Transgenic Res. 14:531-546に記載されており、これにはDNAマイクロインジェクション、初期胚へのレンチウイルスベクター媒介DNA移入、および精子媒介遺伝子導入などの技法によるものが含まれる。ラットにおける遺伝子導入の方法は、Mullin, L. J. et al. (2002) Methods Mol. Biol. 180:255-270にも記載されている。

トランスジェニックウサギの作製は、例えば、Fan, J. et al. (1999) Pathol. Int. 49:583-594；Fan, J. and Watanabe, T. (2000) J. Atheroscler. Thromb. 7:26-32；Bosze, Z. et al. (2003) Transgenic Res. 12:541-553に記載されている。

トランスジェニックブタの作製は、例えば、Zhou, C.Y. et al. (2002) Xenotransplantation 9:183-190；Vodicka, P. et al. (2005) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1049:161-171に記載されている。ブタにおける前核マイクロインジェクションに代わる遺伝子導入技法には、ブタ精子へのDNAのアデノウイルス媒介導入(例えば、Farre, L. et al. (1999) Mol. Reprod. Dev. 53:149-158を参照されたい)およびリンカーに基づく精子媒介遺伝子移入(Chang, K. et al. (2002) BMC Biotechnol. 2:5)が含まれる。

トランスジェニックヤギの作製は、例えば、Ebert, K.M. et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:835-838；Baldassarre, H. et al. (2004) Reprod. Fertil. Dev. 16:465-470に記載されている。ヤギにおける体細胞核移植は、例えば、Behboodi, E. et al. (2004) Transgenic Res. 13:215-224に記載されている。

トランスジェニックヒツジの作製は、例えば、Ward, K.A. and Brown, B.W. (1998) Reprod. Fertil. Dev. 10:659-665；Gou, K.M. et al. (2002) Shi Yan Sheng Wu Xue Bao 35:103-108に記載されている。

トランスジェニックウシの作製は、例えば、Donovan, D.M. et al. (2005) Transgenic Res. 14:563-567に記載されている。ウシ胚の核移植のためのドナー細胞の遺伝子トランスフェクションは、例えば、Lee S.L. et al. (2005) Mol Reprod. Dev. 72:191-200に記載されている。

トランスジェニック家畜動物の作製における最新技術もまた、Niemann, H. et al. (2005) Rev. Sci. Tech. 24:285-298に概説されている。

トランスジェニックニワトリの作製は、例えば、Pain, B. et al. (1999) Cells Tissues Organs 165:212-219；Lillico, S.G. et al. (2005) Drug Discov. Today 10:191-196に記載されている。トランスジェニックニワトリの作製におけるレトロウイルスベクターの使用は、例えば、Ishii, Y. et al. (2004) Dev. Dyn. 229:630-642に記載されている。

本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、キメラ抗体を発現させるためのIg重鎖導入遺伝子構築物、もしくはキメラ抗体を発現させるためのIg軽鎖導入遺伝子構築物、またはキメラ抗体を発現させるための軽鎖および重鎖構築物の両方を含み得る。典型的に、2つ以上の導入遺伝子を有する動物を作製するには、個々の導入遺伝子を有する動物を作製し、次に交雑させて、2つ以上の導入遺伝子を有する動物を作製する。動物のゲノムDNAを解析する標準的技法により、両導入遺伝子を受け継ぐ動物を同定し、選択することができる。さらに、1つのキメラIg鎖(例えば、キメラ重鎖)を発現させるための導入遺伝子構築物を有する本発明の動物を、非キメラ型の他のIg鎖(例えば、完全ヒト軽鎖)を発現する導入遺伝子を有する動物と交雑させることができる。そのような動物では、発現される抗体は、1つのキメラ鎖(例えば、キメラ重鎖)および1つの非キメラ鎖(例えば、非キメラ完全ヒト軽鎖)を含む。そのような動物もまた本発明によって包含され、関心対象の抗原に対するキメラ抗体を産生させる上で用いるのに適している。キメラ重鎖導入遺伝子構築物および完全ヒト軽鎖導入遺伝子構築物を発現するトランスジェニック動物であって、キメラ重鎖導入遺伝子構築物がトランススイッチを起こして、動物において複数のアイソタイプ(例えば、IgMおよびIgG)の抗体を産生するトランスジェニック動物のさらなる説明については、実施例を参照されたい。

本発明の非ヒトトランスジェニック宿主動物は、抗体の少なくとも1つの鎖がヒト可変領域配列および宿主動物の定常領域配列を含む、キメラ抗体を発現する。本発明の非ヒトトランスジェニック宿主動物は、そのゲノム中にヒト定常領域配列(ヒトC_HおよびヒトC_L)を両方有しているわけではないため、いかなる完全ヒト抗体(完全ヒト重鎖および完全ヒト軽鎖を両方含む)も発現しない。したがって、これらの動物の抗体レパートリーは、HuMab Mouse(登録商標)のもの(例えば、PCT公報 WO 94/25585に記載されている)とは異なる。HuMab Mouse(登録商標)におけるIg導入遺伝子は、内因性マウスIg定常領域とトランススイッチを起こしてキメラ抗体を産生し得るとWO 94/25585に記載されているが、HuMab Mouse(登録商標)におけるIg導入遺伝子はヒト可変領域配列およびヒト定常領域配列を含んでいるため、これらのマウスは、キメラ抗体の発現可能性に加えて、完全ヒト抗体のレパートリーもまた発現し得る。対照的に、本発明のトランスジェニック非ヒト宿主動物は、キメラ抗体のレパートリーしか発現せず、動物において完全ヒト抗体がさらに存在することはない。

さらに、宿主動物によって発現されるキメラ抗体における非ヒト宿主動物の定常領域の存在は、別の種の定常領域(例えば、ヒト定常領域)を有する抗体を発現するトランスジェニック動物と比較して、インビボにおいてB細胞および抗体の発達の改善を可能にすると考えられる。例えば、宿主動物Fc領域を含むキメラ抗体は、より自然な受容体シグナル伝達のために内因性宿主動物アクセサリータンパク質(例えば、Igα/Igβまたはその他のシグナル伝達分子)とより良好に会合して、より正常なB細胞発達およびより高い抗体産生をもたらすと考えられる。さらに、キメラ抗体は、宿主Fc受容体とより良好に結合して、再循環および抗原提示の増加、およびひいてはより正常な免疫応答をもたらすと考えられる。なおさらに、導入遺伝子構築物中の宿主動物由来定常領域内の宿主動物調節配列の存在は、抗体発現の遺伝子調節の改善をもたらすと考えられる。したがって、より正常なB細胞発達、より多くの血清抗体、抗体発現の遺伝子調節の改善、およびより良好な胚中心形成が存在するそのような環境は、適切な体細胞突然変異によってより多様であり、かつおそらくは親和性のより高い抗体集団をもたらすはずである。

したがって、特定の態様において、本発明の非ヒトトランスジェニック宿主動物で産生されたキメラ抗体は、非ヒトトランスジェニック宿主動物で産生された完全ヒト抗体と比較して、体細胞突然変異の増加を示し得る。本発明のキメラ抗体中の非ヒト宿主動物の定常領域の存在は、抗体が宿主動物種において、ヒト定常領域を有する抗体には存在しないさらなるエフェクター機能(例えば、ADCC、補体結合)を有し得るという利点もまた提供し得る。よって、本発明に従って産生されるキメラ抗体は、完全ヒト抗体が使用に適さない可能性のある特定の動物疾患モデルにおける使用に適していると考えられる。例えば、ネズミ定常領域を含む、本発明に従って産生されたキメラ抗体が、ネズミFc領域によって媒介されるマウスエフェクター機能が関与しているマウス疾患モデルにおける使用に適している可能性がある。

好ましい態様において、本発明の非ヒトトランスジェニック宿主動物は、その内因性免疫グロブリン遺伝子座の1つまたは複数が不活化されている。キメラ抗体の発現とともに内因性宿主動物抗体が動物において発現されないように、内因性Ig遺伝子座は不活化されることが好ましい。特に、内因性Ig遺伝子座の不活化により、内因性抗体からの干渉が妨げられ、キメラ抗体の検出が単純化される。したがって、1つの態様において、本発明のトランスジェニック宿主動物(例えば、マウス)は、少なくとも1つの内因性重鎖遺伝子座が不活化されており、より好ましくは内因性重鎖遺伝子座が両方不活化されている。加えて、またはあるいは、本発明のトランスジェニック宿主動物(例えば、マウス)は、少なくとも1つの内因性軽鎖遺伝子座が不活化されており、より好ましくはκ遺伝子座もしくはλ遺伝子座またはその両方の、両対立遺伝子が不活化されている。最も好ましい態様では、宿主動物は、内因性Ig重鎖遺伝子座のホモ接合性不活化、および内因性Igκ軽鎖遺伝子座のホモ接合性不活化を有する。κ遺伝子座が不活化された場合、λ遺伝子座を破壊することは必須ではない；しかし、キメラλ軽鎖導入遺伝子を用いようとする場合には、内因性λ遺伝子座を不活化することが望ましい。

内因性Ig遺伝子座は、内因性Ig遺伝子座の発現が妨害されるように、外因性配列を内因性Ig遺伝子座に挿入するターゲティングベクターを用いて、相同組換えによって不活化することが好ましい。挿入に好ましい領域はJ_H領域およびJκ領域である。重鎖または軽鎖遺伝子座のヘテロ接合性破壊を有する宿主動物が得られたならば、標準的な交配技法によりこの動物を交配させて、破壊に関してホモ接合性とすることができる。J_Hにおいて内因性重鎖遺伝子座のホモ接合性破壊を有するマウス株は、以前に当技術分野において記載されており(例えば、米国特許第5,545,806号の実施例10および11を参照されたい)、JκおよびCκにおいて内因性κ軽鎖遺伝子座のホモ接合性破壊を有するマウス株も記載されている(例えば、米国特許第5,545,806号の実施例9を参照されたい)。そのようなマウスを、本発明の1つまたは複数の導入遺伝子を有するマウスとの交配パートナーとして用いて、1つまたは複数の導入遺伝子を有し、かつその内因性Ig遺伝子座が不活化されているマウス株を得ることができる。そのようなマウス株を、実施例においてさらに詳述する。

III. トランスジェニック非ヒト動物におけるキメラ抗体の調製
本発明の別の局面は、関心対象の抗原に特異的なキメラ抗体を作製する方法に関する。本方法は、本発明のトランスジェニック非ヒト宿主動物に関心対象の抗原を免疫する段階、および関心対象の該抗原に特異的なキメラ抗体を該動物から得る段階を含む。

したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物においてキメラ抗体を調製するには、最初に、関心対象の抗原を本動物に免疫する。例えば、ヒトIg重鎖および軽鎖導入遺伝子を有するトランスジェニックマウス(HuMab Mouse(登録商標)またはXenomouseなど)において完全ヒト抗体を産生させるために以前に用いられている免疫化技法を同様に用いて、本発明の動物において抗体を産生させることができる。HuMab Mouse(登録商標)において以前に用いられた免疫化技法は、例えば、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859；Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851、ならびにPCT公報 WO 98/24884およびWO 01/14424に記載されている。好ましくは、マウスは最初の抗原注入時に6〜16週齢であり、抗原の精製または組換え調製物(例えば、5〜50μg)を用いて、マウスを腹腔内より免疫する。通常、各抗原に関して複数の動物(例えば、動物6〜24匹)を免疫する。

HuMab Mouse(登録商標)における種々の抗原を用いた度重なる実験から、最初に完全フロイントアジュバント中の抗原により腹腔内より免疫し、その後不完全フロイントアジュバント中の抗原により1週間おきにIP免疫(全部で6回まで)した場合に、トランスジェニックマウスが良好に応答することが示された。しかし、フロイント以外のアジュバントも効果的であることが認められており、それを付加的にまたは代わりに用いることもできる。血漿試料を眼窩後採血によって採取して、免疫化手順の過程にわたり免疫応答をモニターすることができる。ELISAにより血漿をスクリーニングすることができ、関心対象の抗原に対して十分な力価を有するマウスを用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。マウスに抗原を静脈より追加免疫して、3日後に屠殺し、脾臓および/またはリンパ節を摘出することができる。

ポリクローナル混合物としてのキメラ抗体を前記宿主動物から得ることができ、または、より好ましくは、宿主動物から得られたB細胞を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。これらに限定されないが、(i) ハイブリドーマの作製(以下にさらに考察する)、(ii) 宿主動物から得られたB細胞からの、抗体遺伝子の直接的なPCR増幅(例えば、Babcook, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848を参照されたい)、および(iii) 宿主動物のB細胞から調製された抗体ライブラリーのファージディスプレイ、およびそれに続く関心対象のモノクローナル抗体に関するファージディスプレイライブラリーのスクリーニング(例えば、PCT公報 WO 01/25492を参照されたい)を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の種々の適切な方法の1つにより、モノクローナル抗体を調製し選択することができる。

好ましい態様では、本発明のキメラモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する。そのようなハイブリドーマを作製するには、免疫化マウス由来の脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株(例えば、P3X63-Ag8.653(ATCC、CRL-1580)またはSP2/0(ATCC、CRL-1581))などの適切な不死化細胞株と融合させることができる。化学物質媒介融合(例えば、PEGによる)または電気融合など、当技術分野で十分に確立された技法を用いて、細胞を融合させることができる。大規模なハイブリドーマ増殖が起こったならば、個々のウェルをELISAによりスクリーニングすることができる。例えば、キメラIg重鎖導入遺伝子および完全ヒトκ軽鎖導入遺伝子を発現する動物では、マウスIgMおよびヒトκまたはマウスIgGおよびヒトκを含む抗体の発現に関して、ELISAによりウェルをスクリーニングすることができる。同様の技法を用いて、免疫化に用いた抗原に結合するマウスIgGの存在に関して、上清を試験することもできる。関心対象の抗体に関して陽性であるハイブリドーマを、限界希釈により少なくとも2回サブクローニングすることができる。次に安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらなる特徴づけのために組織培養液中で抗体物質を産生させることができる。

IV. キメラ抗体の完全ヒト抗体への変換
本発明の方法では、トランスジェニック非ヒト宿主動物において関心対象のキメラ抗体が産生されたならば、本方法は、キメラ抗体をコードする核酸を該動物または該動物由来のB細胞から単離する段階、および非ヒト宿主動物Ig定常領域をコードする核酸をヒトIg定常領域をコードする核酸で置換し、それによってキメラ抗体をヒト抗体に変換する段階、および該ヒト抗体を発現させる段階をさらに含み得る。

したがって、関心対象のキメラ抗体が同定されたならば、標準的な組換えDNA技法を用いて、これを完全ヒト抗体に変換することができる。例えば、標準的な分子生物学技法(例えば、関心対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いたPCR増幅またはcDNAクローニング)を用いて、キメラ抗体由来の可変領域(軽鎖または重鎖)をコードするDNAを得ることができ、可変領域配列がヒト定常領域配列と、ならびに転写および翻訳制御配列と機能的に連結されるように、該DNAを発現ベクターに挿入することができる。抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができるが、より一般的には両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。

標準的方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション)により、抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。V_Hセグメントがベクター内のC_Hセグメントに機能的に連結され、V_Lセグメントがベクター内のC_Lセグメントに機能的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターを用いることができる。完全ヒト抗体の発現に適した発現ベクターの非限定的な例は、Blackによる米国特許出願第20050153394号に記載されているpIEファミリーのベクターである。発現ベクター内に存在する好ましい定常領域アイソタイプには、重鎖についてはヒトIgG1およびIgG4定常領域、ならびに軽鎖についてはヒトκ定常領域が含まれる。

抗体発現ベクターとの関連において、「機能的に連結された」という用語は、可変領域のコード配列が定常領域のコード配列とインフレームになるように、抗体可変領域が発現ベクターに連結されることを意味することが意図される。さらに、可変領域および定常領域は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するという目的の機能を果たすように、ベクター内に位置する。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合するように選択する。加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であってよい。

組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依存し得ることが、当業者によって理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス(CMV)、サルウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター)、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーなど、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。または、ユビキチンプロモーターまたはβグロビンプロモーターなどの、非ウイルス性調節配列を用いることも可能である。なおさらに、調節エレメントは、SV40初期プロモーターおよび1型ヒトT細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列に由来する配列を含むSRαプロモーター系(Takabe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)など、異なる供給源に由来する配列から構成されてもよい。

組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)および選択マーカー遺伝子など、さらなる配列を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、すべてAxel et al.による米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、および第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキセート選択/増幅とともに、dhfr-宿主細胞で用いるため)およびneo遺伝子(G418選択用)が含まれる。

発現ベクターに含まれ得る他の配列には、トランスフェクションされた遺伝子のサイレンシングを妨げるためにクロマチン構造を変化させる配列など、安定なトランスフェクタントにおいて抗体遺伝子の発現を増強する配列が含まれる。好ましい例はUCOE(遍在性クロマチンオープニングエレメント)であり、これは安定なトランスフェクタントにおいて、組込み部位にかかわらずトランスフェクションされた配列の発現を増強する。

軽鎖および重鎖を発現させるため、標準的技法により、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションする。種々の形態の「トランスフェクション」という用語は、外因性DNAを原核宿主細胞または真核宿主細胞に導入するために一般的に用いられる多種多様な技法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。理論上、原核宿主細胞または真核宿主細胞において抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞は原核細胞よりも、正確に折りたたまれ、かつ免疫学的に活性のある抗体を組み立てて分泌する可能性がより高いため、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性抗体の高効率産生には効果的でないことが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。

本発明の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されているように、DHFR選択マーカーとともに用いられる、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているdhfr-CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞、およびSP2細胞が含まれる。特に、NSO骨髄腫細胞との使用に関して、別の好ましい発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036、およびEP 338,841に開示されているGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入した場合、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞を培養する培養液への抗体の分泌に十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて、培養液から回収することができる。

本発明のキメラ抗体の完全ヒト抗体への変換を、実施例6にさらに詳述する。この実施例において実証されるように、キメラ型の完全ヒト型への変換は、その標的抗原に対する抗体の結合特性を維持した。場合によっては(実施例6の場合など)、完全ヒト型の抗体は、キメラ型よりも、その標的に対するより高い親和性など、その標的に対する結合の改善をも示し得る。したがって、キメラ抗体をヒト抗体に変換する方法の特定の態様において、得られたヒト抗体は、関心対象の抗原に対して元のキメラ抗体よりも高い親和性を示す。

実施例
以下の実施例では、以前に記載されている特定のプラスミド、相同組換えマウス、およびトランスジェニックマウスを、さらなる導入遺伝子およびトランスジェニックマウス株を作製するための出発材料として使用した。

プラスミドおよびDNAクローン：
pGP1およびpGP2は、その構築が米国特許第5,545,806号に記載されている(特に、実施例4ならびに図7および8を参照されたい)一般的なクローニングベクターである。いずれも、大きなポリリンカーを含むように改変された、pBR322派生プラスミドである。pGP1では、大きな挿入物を構築するための、少ない頻度で切断されるNotI部位がポリリンカーに隣接している。pGP2はpGP1から派生したもので、ポリリンカー内のMluI部位とSpeI部位との間に位置するさらなるSfiI部位を含む。pGP1bおよびpGP2bは、類似のpBR322派生クローニングベクターである。pGP1bの構築もまた米国特許第5,545,806号に記載されており(特に、実施例12を参照されたい)、pGP2bの構築は米国特許第5,625,126号に記載されている(特に、実施例36ならびに図77Aおよび77Bを参照されたい)。

pHC2プラスミドもまた、米国特許第5,545,806号に記載されている(特に、実施例12ならびに図25および31を参照されたい)。pHC2は、NotI断片上に含まれるステライル転写産物開始部位の上流の4 kb隣接配列とともに、4つの機能的ヒト免疫グロブリン重鎖可変(V_H)領域、15のヒトDセグメント、全6つのヒトJ_Hセグメント、ヒトJ-μエンハンサー、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエキソンのすべて、ならびに関連スイッチ領域およびステライル転写産物関連エキソンを含むヒトγ1定常領域を含む。

C57BL/6JマウスのRP23-109B20(B20)ゲノムDNAクローンはInvitrogenから入手したが、これはマウスJ_H領域からマウスIgG2aコード領域を含む。C57BL/6JマウスのRP23-116C22(C22)ゲノムDNAクローンもまたInvitrogenから入手したが、これはマウスIgG2bコード領域およびマウスIgG2bコード領域の下流約200 kbを含む。

相同組換えマウス：
内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および/または内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が相同組換えによって破壊されているマウスが、以前に記載されている。これらの実施例では、(i) ネズミ軽鎖Jκ領域が欠失し、neo^R遺伝子で置換された(本明細書では「JKD」遺伝子型と称する)；(ii) ネズミ重鎖Cμ領域が、Cμ遺伝子の逆の読み枠内でのneo^R遺伝子の挿入により破壊された(本明細書では「CMD」遺伝子型と称する)；および/または(iii) ネズミ重鎖J_H領域が欠失し、neo^R遺伝子で置換された(本明細書では「JHD」遺伝子型と称する)マウスを用いた。JHD改変を有するマウスの構築は、米国特許第5,545,806号の実施例10および11に記載されている。CMD改変を有するマウスの構築は、米国特許出願第20020086014号の実施例1に記載されている。JKD改変を有するマウスの構築は、米国特許第5,545,806号の実施例9に記載されている。

トランスジェニックマウス：
複数のVκ領域、Jκ領域、およびヒトκ定常領域全体を含む非再編成ヒト軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を有するマウスが、以前に記載されている。これらの実施例では、ヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座、および複数のヒトVκセグメントを含むYACクローンの同時注入により作製された、KCo5軽鎖導入遺伝子を有するマウスを用いた。KCo5軽鎖導入遺伝子を有するマウス株の構築および特徴づけは、米国特許第6,255,458号の実施例38に詳述されている。上記の相同組換えマウス株との交配により、(i) KCo5導入遺伝子が存在し(KCo5 +)；(ii) 内因性軽鎖遺伝子が破壊され(JKD +/+)；かつ(iii) 内因性重鎖遺伝子が破壊された(JHD +/+またはCMD +/+)、さらなるマウス株が得られた。

実施例1：ヒトV_H領域およびマウスC_H領域を含むキメラ抗体を発現させるためのキメラ導入遺伝子の構築
マウスJμエンハンサー領域、μスイッチ領域、およびμコード領域に連結された非再編成ヒト重鎖VDJセグメントを含む導入遺伝子構築物を、以下の通りに調製した。

中間ベクター
先に記載したpGP2bをNotIで消化してポリリンカーを遊離させ、重複オリゴ

および

のアニーリングにより構築した合成リンカーと連結することによって、中間ベクターpGP2-1を構築した。その結果得られたpGP2-1プラスミドは、NotI部位の後にMluI部位およびSalI部位が続くポリリンカーを有した。配列決定により、配向性およびリンカー配列を確認した。

先に記載したpGP1bをNotIで消化してポリリンカーを遊離させ、重複オリゴ

および

のアニーリングにより構築した合成リンカーと連結することによって、中間ベクターpIM-m2を構築した。その結果得られたpIM-m2プラスミドは、NotI部位の後にNgoMIV部位、NarI部位、MluI部位が続くポリリンカーを有した。

先に記載したpGP1bをXhoIおよびHindIIIで消化してポリリンカーの一部を遊離させ、重複オリゴ

および

のアニーリングにより構築した合成リンカーと連結することによって、中間ベクターpIM-m3を構築した。その結果得られたpIM-m3プラスミドは、これらの部位：NotI-XhoI-NgoMIV-NarI-SalI-HindIII-NotIを有するポリリンカーを有した。

キメラ導入遺伝子の構築
pHC2は、ヒトJ_Hセグメントの最も3'側の下流かつヒトJ-μエンハンサーの5'側に位置する独特なMluI制限部位を有する。4つの機能的ヒト可変領域、15のヒトDセグメント、および全6つのヒトJ_Hセグメントを含む、pHC2由来の約44 kb NotI-MluI断片を単離し、中間ベクターpGP2-1にクローニングした。NotIおよびMluI消化により遊離される約44 kb断片の観察、ならびにヒトJ-μエンハンサーのすぐ5'側のプローブへのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、新たなプラスミド(phVDJ2)をスクリーニングした。

マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、マウスμコード領域のすべて、およびマウスδコード領域を単離するため、B20 BACをNgoMIVおよびNarIで消化した。得られた40 kb断片をパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)により単離し、pIM-m2にクローニングした。マウスIgMに特異的なプライマーを用いたPCR断片の出現により、ならびにNgoMIVおよびNarI消化により遊離される約40 kb断片の観察により、得られたプラスミド(pIM-m2-mED)をスクリーニングした。さらに、マウスμスイッチ領域の一部が欠失する場合が多いため、サザンブロットによりこの領域が全長(最初のB20 BACと比較して)であることをチェックした。

マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、マウスμコード領域のすべてを単離するため、pIM-m2-mEDをXhoI(マウスIgMコード領域の3'側に位置する)およびNarIで消化し、重複するオリゴ

および

のアニーリングにより構築した合成リンカーと連結した。新たに得られたプラスミド(pIM-m2-mEM)は、内部にXhoI部位もSalI部位も有さずに、約13 kb NgoMIV-NarI断片上に、マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、マウスμコード領域のすべてを含んだ。DMTM73、およびXhoI部位の5'側の領域に特異的であり、新たに挿入されたリンカーの方へ下流に向いているDMTM76を用いたPCR断片の出現により、pIM-m2-mEMをスクリーニングした。

次に、マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、およびマウスμコード領域のすべてを含む約13 kb NgoMIV-NarI断片をpIM-m3にクローニングして、この断片に5' XhoI部位および3' SalI部位を付加するpIM-m3-mEMを作製した。NgoMIVおよびNarI消化ならびにXhoIおよびSalI消化により遊離される13 kb断片の観察により、pIM-m3-mEMをスクリーニングした。

次に、pIM-m3-mEM由来の、マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、およびマウスμコード領域のすべてを含む13 kb XhoI-SalI断片を、phVDJ2内のヒトVDJ領域の3'側のSalI部位に連結することにより、最終的なphVDJ2-mEM構築物を構築した。ヒトJ_H領域のすぐ下流とアニールし、下流を向いた

、およびマウスJ-μエンハンサーとアニールし、上流を向いた

によるPRC産物の生成により、クローンを方向性クローニングに関してチェックした。さらに、サザンブロットにより、phVDJ2-mEMの最終クローン(9B2と称する、図1に模式的に図示する)が全長マウスμスイッチ領域(最初のB20 BACと比較して)を含むことをチェックした。したがって、最終構築物は、約57 kb断片上に、マウスJ-μエンハンサー、マウスμスイッチ領域、およびマウスμコード領域のすべての上流に位置する、pHC2のヒトVDJ領域を含む。

実施例2：トランスジェニックマウスの作製およびスクリーニング
phVDJ-mEMのクローン9B2(実施例1に記載)由来の約57 kb NotI-SalI断片をベクターから遊離させ、PFGEにより単離した。9B2挿入物を含むアガロースゲル切片を切り出し、製造元のプロトコールに従ってアガロースをβ-アガラーゼ(Takara)で消化した。9B2断片を、(標準的方法により)受精卵にマイクロインジェクションした。野生型(JHD-/-、CMD-/-、JKD-/-、KCo5-) × KCo5マウス(JHD-/-、CMD+/+、JKD+/+、Kco5+/+)のF1マウスに、DNAを注入した。尾部DNAを鋳型として使用する、DMTM79およびDMTM80を用いたPCRにより、潜在的なファウンダーマウス(founder mouse)を9B2導入遺伝子についてスクリーニングした。JHD-/-、CMD+/-、JKD+/-、KCo5+/-の株背景の4匹のファウンダーマウス(9B2-52、9B2-56、9B2-58、および9B2-65)が得られた。

CMD+/-遺伝子型のマウスは内因性マウス重鎖J領域をなお有するため、これらのファウンダーマウスをJHD欠失を有するマウスと交配させて、遺伝子型CMD -/-、JHD +/+のマウスを得ることが望ましかった。したがって、次に、9B2導入遺伝子について陽性であるファウンダーマウスをJHD(KCo5)マウス(JHD+/+、CMD-/-、JKD +/+、KCo5+/+マウス)と交配させて、9B2、JHD、CMD、JKD、およびKCo5について遺伝子型を同定した。

適切な株背景の9B2トランスジェニック動物：(9B2+、JHD+/+、(CMD-/-)、JKD +/+、KCo5+)を作製するため、ファウンダー子孫を、それらの遺伝子型(それらが最終的な所望の株構造とどの程度似ているか)、およびそれらがいくらかの免疫前マウスIgGレベル、または一見して上昇した免疫後マウスIgGレベルを有することが示されるかどうかによって、ある程度選択した。JKD+/+およびKCo5+背景のJHD+/+(マウスJ_H領域に関してノックアウト)またはJHD+/-およびCMD+/-(マウス重鎖産生に関して機能的にノックアウト)を有する子孫で、全マウスIgG/ヒトκおよびマウスIgM/ヒトκについて、免疫前の力価測定を行った。次に、RIBIアジュバント全量100μ中の破傷風トキソイド(TT) 50μgおよびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH) 25μgを用いて、TTを1〜2週間間隔でマウスに投与し、最終免疫の10日後に、マウスIgG/ヒトκ、マウスIgM/ヒトκ、およびTT特異的マウスIgGレベルについて力価測定を行った。9B2+、JHD+/+ (CMD-/-) JKD+/+株が得られるまで、この様式で各ファウンダー系統について交配を継続した。

9B2導入遺伝子を有する4つのファウンダー系統、9B2-52、9B2-56、9B2-58、および9B2-65が得られた。各9B2ファウンダー系統はメンデルの様式で導入遺伝子を伝達し、導入遺伝子は性染色体にもいかなる明白な身体的毛色遺伝子にも連鎖していない。

実施例3：キメラ抗体を発現するトランスジェニックマウスの特徴づけ
本実施例では、実施例2に記載した4つのトランスジェニックマウスファウンダー系統の、破傷風トキソイド(TT)およびインターフェロン-α(IFN-α)に対する抗体応答を調べて、ヒトκ軽鎖がマウスIgG定常領域を有する重鎖と組みとなった高レベルの抗体を発現するマウスを同定し、抗体に用いられた重鎖が、再編成および内因性マウスIgG定常領域とのトランススイッチを起こした導入遺伝子構築物に由来することを示した。

破傷風トキソイド応答
4つの9B2マウス系統のTTに対する抗体応答を、以下のようにして調べた。トランスジェニック陽性マウス4〜5匹、および陰性対照として用いるための少なくとも1匹の非トランスジェニック(ntg)マウスからなる各株のマウス5匹または6匹に、RIBIアジュバント全量100μl中のTT 50μgで、TTを4週間にわたり毎週投与した。最終免疫の10日後に、マウスIgG/ヒトκ、マウスIgM/ヒトκ、およびTT特異的マウスIgGレベルについて血清の力価測定を行った。他の対照は、HC2 HuMab株(ヒトV_H、D、およびJ_H遺伝子セグメントが9B2と同じである完全ヒト重鎖導入遺伝子、pHC2、ならびに完全ヒト軽鎖導入遺伝子を有する)およびB6野生型マウス株であった。

以下の表1に、非トランスジェニック対照、HC2株、およびB6株とともに、コホート内の各マウスの力価レベルを要約する。9B2株について示した結果は、μg/mlでの全マウスIgG/ヒトκ抗体の免疫前(未処置)血清レベル(第3列)、μg/mlでの全マウスIgM/ヒトκ抗体の免疫前レベル(第4列)、μg/mlでの全マウスIgG/ヒトκ抗体の免疫後血清レベル(第5列)、3×バックグラウンドの最低力価希釈での全マウスIgM/ヒトκ抗体の免疫後血清レベル(第6列)、およびμg/mlでのTT特異的/マウスγ抗体(第7列)である。HC2株およびB6株についても、これに見合う類似の結果を示す。

（表１）TT免疫化トランスジェニックマウスの血清力価

予想通り、各系統由来の非トランスジェニックマウスは、免疫前にも免疫後にも、いかなるマウスIgM/ヒトκ抗体もマウスIgG/ヒトκ抗体も発現しない。トランスジェニックマウスにおいて、マウスIgM/ヒトκ抗体の発現は、機能的V領域を形成するためのトランスジェニックヒトVDJセグメントの再編成、および下流のトランスジェニックマウスIgM定常領域へのスプライシングの結果であると考えられる。さらに、トランスジェニックマウスにおいて、マウスIgG/ヒトκ抗体は、内因性マウスIgG定常領域にトランススイッチされた再編成トランスジェニックヒトVDJ領域を含むトランススイッチ抗体であると考えられる。

表1の結果から実証されるように、系統9B2-52および9B2-56が低レベルの未処置マウスIgG(トランススイッチ抗体)およびマウスIgM(導入遺伝子由来)を有するのに対し、系統9B2-58および9B2-65は、未処置血清中に、より高レベルのマウスIgG抗体を含んでいた。さらに、系統9B2-58および9B2-65では、免疫後に、マウスIgG/ヒトκ抗体の血清力価が上昇した。系統9B2-58の試験したマウスはすべて、TT特異的マウスIgGを発現したが、他の系統では結果はより変動し、試験したマウスのうち、免疫後にTT特異的マウスIgGを発現するものもあれば、発現しないものもあった。HC2 HuMab株もまた、個々のマウスのTT特異的応答についてばらつきを示した。マウスによっては、血清中のTT特異的マウスIgGのレベルが、血清中の全マウスIgG/ヒトκのレベルよりも高かった。このことは、血清が、内因性マウスλ軽鎖と組みとなったTT特異的マウスIgGを含むことを表し得ると考えられる。

1匹のTT免疫化9B2-58マウスに由来する脾細胞を電気融合により融合させ、TT特異的ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは安定しており、抗TT抗体を産生する12のハイブリドーマが最初に単離された。それらのハイブリドーマのうちの9つに由来する抗体において、cDNAの配列決定、タンパク質の特徴づけ、およびBIACORE解析をさらに行った。ハイブリドーマの上清をBIACORE実験で用いて、TTに対する親和性ならびに結合速度(on-rate)および解離速度(off-rate)を決定した。比較には、完全ヒト抗TT抗体(HuMab Mouse(登録商標)で産生され、CHO細胞で発現された)を使用し(TT hu IgGと称する)、TT hu IgGと同じヒトVDJおよびヒトκ鎖を含む、組換えによって作製されたキメラマウスIgG/ヒトκ抗体(CHOで発現された)もまた使用した。親和性、結合速度、および解離速度の比較の結果を、以下の表2に示す。ハイブリドーマクローン名を第1列に示し、BIACOREデータを第2〜4列に示す。

（表２）TT免疫化トランスジェニックマウス由来の抗体のBIACORE解析

このデータから、トランスジェニックマウスで産生されたキメラ抗TT抗体が、完全ヒト抗TT抗体および完全ヒト抗TT抗体から組換えによって作製されたキメラ抗体と匹敵する親和性、結合速度、および解離速度を有することが実証される。実際に、9B2-58マウスで産生されたキメラ抗体のいくつかは、調べた1つの完全ヒト抗TT抗体よりも高い親和性を有する。

IFN-α応答
IFN-αに対するトランスジェニックマウスの抗体応答を調べるため、マウス6〜13匹(各株由来のトランスジェニックマウス5〜11匹、および陰性対照として用いるための少なくとも1匹の非トランスジェニックマウス)に、RIBIアジュバント全量100μl中のIFN-α 20μgを毎週投与した。4回および7回免疫した10日後に、マウスIgG/ヒトκ、マウスIgM/ヒトκ、およびIFN-α特異的マウスIgGレベルについて血清の力価測定を行った。

以下の表3に、非トランスジェニック対照とともに、コホート内の各マウスの力価レベルを要約する。示した結果は、μg/mlでの全マウスIgG/ヒトκ抗体の免疫前(未処置)血清レベル(第3列)、μg/mlでの全マウスIgM/ヒトκ抗体の免疫前レベル(第4列)、μg/mlでの全マウスIgG/ヒトκ抗体の4回免疫後血清レベル(第5列)、μg/mlでの全マウスIgM/ヒトκ抗体の4回免疫後血清レベル(第6列)、3×バックグラウンドの最も低い力価希釈でのIFN-α特異的/マウスγ抗体(第7列)、μg/mlでの全マウスIgG/ヒトκ抗体の7回免疫後血清レベル(第8列)、μg/mlでの全マウスIgM/ヒトκ抗体の7回免疫後血清レベル(第9列)、および3×バックグラウンドの最も低い力価希釈でのIFN-α特異的/マウスγ抗体(第10列)である。

（表３）IFN-α免疫化トランスジェニックマウスの血清力価

DM＝マウス死亡

この場合も予想通り、各系統由来の非トランスジェニック(ntg)マウスは、免疫前にも免疫後にも、いかなるマウスIgM/ヒトκ抗体もマウスIgG/ヒトκ抗体も発現しない。IFN-α免疫化トランスジェニックマウスにおいて、マウスIgM/ヒトκ抗体の発現は、機能的V領域を形成するためのトランスジェニックヒトVDJセグメントの再編成、および下流のトランスジェニックマウスIgM定常領域へのスプライシングの結果であると考えられる。さらに、トランスジェニックマウスにおいて、マウスIgG/ヒトκ抗体は、内因性マウスIgG定常領域にトランススイッチされた再編成トランスジェニックヒトVDJ領域を含むトランススイッチ抗体であると考えられる。

TT応答の結果と同様に、系統9B2-52および9B2-56が低レベルの未処置マウスIgG(トランススイッチ抗体)およびマウスIgM(導入遺伝子に由来)を有するのに対し、系統9B2-58および9B2-65は、未処置血清中により高レベルのマウスIgG抗体を含んでいた。さらに、系統9B2-58および9B2-65では、4回免疫後に、マウスIgG/ヒトκの血清力価が上昇した。この場合も概して、系統9B2-58のマウスはすべて、高いIFN-α特異的マウスIgGを発現したが、他の系統では一部のマウスしか、免疫後にIFN-α特異的マウスIgGを発現しなかった。

実施例4：キメラ抗体における体細胞突然変異の解析
本実施例では、9B2-58トランスジェニックマウス株由来の抗TTキメラ抗体で起こった体細胞突然変異の数、およびHuMabマウス(キメラ抗体および完全ヒト抗体の両方を発現する)由来のキメラ抗体で起こった体細胞突然変異の数を解析した。

9B2-58トランスジェニックマウス
上記の実施例3に詳述した、9B2-58トランスジェニックマウスの免疫化により作製された抗TTハイブリドーマにより産生された抗体を、cDNA配列決定に基づき、V_HおよびJ_Hの使用について、ならびにどの重鎖アイソタイプが存在するかについてさらに特徴づけした。加えて、DNAレベルおよびアミノ酸レベルで起こる体細胞突然変異の数を、V_Hセグメントについてのみ決定した(DおよびJ_Hセグメントでは決定しなかった)。結果を以下の表4に要約する。

（表４）TT免疫化9B2マウス由来の抗体の配列解析

SM＝体細胞突然変異；HC＝重鎖
^*同じ軽鎖を共有すると判定された抗体を示す
^**同じ軽鎖および重鎖を共有すると判定された抗体を示す

V_H領域使用に関して、9B2-58トランスジェニック株は、ヒト抗TT抗体を産生させるために用いたHuMabマウスのV_H領域と異なるV_H領域を含むが、3-30.3 VH領域と3-33 VH領域はわずか2アミノ酸のみが異なり類似していることに留意されたい。したがって、ハイブリドーマのいくつかに関しては、TT免疫化により、9B2-58トランスジェニック株において、HuMabマウスで産生されたヒト抗TT抗体に用いられたVH領域と類似のV_H領域が選択された。

重鎖アイソタイプの決定に関しては、9B2-58株に挿入された導入遺伝子はマウスIgM定常領域しか含まないため、本明細書で認められたヒト可変領域およびマウスIgG2bまたはIgG1を含むキメラ抗体はすべて、導入遺伝子から種々の内因性マウス定常領域へのトランススイッチを介して生成された。

体細胞突然変異に関しては、DNAレベルにおいて、9B2-58トランスジェニック株由来の抗体のいくつかは、HuMabマウス由来のヒト抗TT抗体よりも多くの体細胞突然変異を示した。さらに、TTに対してより高い親和性を有するキメラ抗体もまた、同じトランスジェニックマウスから同定された他の抗TT抗体よりも多くの体細胞突然変異を含んでいた。アミノ酸レベルでは、9B2-58トランスジェニック株由来のキメラ抗体は、HuMabマウス由来のヒト抗TT抗体よりも多くの体細胞突然変異を示さなかったが(遺伝暗号の縮重による)、9B2-58トランスジェニック株由来のキメラ抗体のいくつかに関する、DNAレベルで認められた体細胞突然変異の数の増加は、宿主定常領域を含むキメラ抗体のトランスジェニックマウスにおける発現により、キメラ抗体において体細胞突然変異率が増加し得るという見解を支持する。

HuMabマウス
体細胞突然変異に関する9B2-58株についての上記のデータは、完全ヒト抗体を発現するが、ヒト重鎖導入遺伝子と内因性マウス定常領域との間のトランススイッチに起因してキメラ抗体もまた発現し得るHuMabマウスにおける体細胞突然変異率についてなされた観察と一致する。

例えば、HuMabマウス(HCo12/7およびHCo12マウス)に細胞表面受容体を免疫し、脾臓を単離し、標準的なハイブリドーマ技法に従って融合させた。融合混合物から8つの抗受容体抗体を単離し、これらの配列決定を行った。抗体のうち3つは、実際に、マウスIgG2b定常領域に連結されたヒトVDJ領域からなるキメラであった。残りの5つの抗体は、完全ヒト抗体であった。重鎖可変領域すべてのcDNA配列解析から、キメラ抗体とヒト抗体が異なる可変領域組換えを用いたこと、ならびにキメラ抗体が、完全ヒト抗体よりもDNAレベルでのより高い体細胞突然変異、および相関する、より高いアミノ酸相違を有したことが示された。上記の9B2-58マウスに関しては、体細胞突然変異の定量化はV_Hセグメントについてしか行わなかった(DセグメントもJ_Hセグメントも行わなかった)。結果を以下の表5に要約する。

（表５）HuMabマウス由来のヒト抗体およびキメラ抗体の配列解析

nd＝未検、SM＝体細胞突然変異；HC＝重鎖

別の実験セットでは、HuMabマウス(HCo12/7)に可溶性サイトカインを免疫し、脾臓を単離し、標準的なハイブリドーマ技法に従って融合させた。融合物から6つの抗サイトカイン抗体を単離し、これらの配列決定を行った。抗体のうち5つは、実際に、マウスIgG2aおよびIgG2b定常領域に連結されたヒトVDJ領域からなるキメラであった。残りの抗体は完全ヒト抗体であった。重鎖可変領域すべてのcDNA配列解析から、キメラ抗体とヒト抗体が類似のおよび異なる可変領域組換えを用いたこと、ならびにやはりキメラ抗体が、完全ヒト抗体よりもDNAレベルでのより高い体細胞突然変異、および相関する、より高いアミノ酸相違を有したことが示された。さらに、キメラ抗体#5は、機能阻害アッセイにおいて完全ヒト抗体#1よりも高い阻害効率を有した。結果を以下の表6に要約する。

（表６）HuMabマウス由来のヒト抗体およびキメラ抗体の配列解析

nd＝未検、SM＝体細胞突然変異；HC＝重鎖

したがって、2つの異なる抗原を免疫したHuMabマウスに関する上記実験の結果は、宿主定常領域を含むキメラ抗体のトランスジェニックマウスにおける発現により、トランスジェニックマウスで発現される完全ヒト抗体と比較して、キメラ抗体において体細胞突然変異が増加し得るという見解を支持する。

実施例5：キメラ抗体を発現させるための第2の導入遺伝子の作製
本実施例では、マウスにおいてキメラ抗体を発現させるための、HCo26と称する別の導入遺伝子を作製した。9B2導入遺伝子がマウスIgM定常領域しか含まないのに対して、HCo26導入遺伝子はマウス定常領域コード配列のすべてを含む点で、HCo26導入遺伝子は実施例1に記載した9B2導入遺伝子と異なる。

HCo26は、非再編成ヒトV、D、およびJ領域、ならびに5' Eμエンハンサーから、同定された3' DNase高感受性部位および複製起点までのマウスIgH遺伝子座を含む、3つの重なり合ったDNA断片からなる(Zhou, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13693-13698)。HCo26導入遺伝子の構築を、図1に模式的に図示する。

3つの断片の1つめは、マウスJ-μエンハンサー領域、μスイッチ領域、およびμコード領域に連結された非再編成ヒト重鎖VDJセグメントを含む、phVDJ-mEMのクローン9B2由来の約57 kb NotI-SalI断片である(実施例1に記載)。別の断片は、マウスJ-μエンハンサー、マウスμ定常コード領域、およびマウスγ2bコード定常領域までの介在マウスゲノム領域を含む、先に記載したB20 BACの約140 kb NgoMIV-NotI断片からなる。マウスJ-μエンハンサーおよびマウスμスイッチ領域は9B2断片の一部を構成するため、これらの領域は9B2とB20断片の重複領域の部分である。別の断片は、マウスγ2bコード定常領域、およびマウスαコード領域の3'側のDNase高感受性部位を経て、C22 BAC断片中に認められる内因性NotI部位までの介在マウスゲノム領域からなる、C22 BACの約180 kb NotI-NotI断片からなる。マウスγ2bコード領域は、B20とC22 BAC断片の重複領域を構成する。

phVDJ-mEMのクローン9B2由来の約57 kb NotI-SalI断片をベクターから遊離させ、同様にB20 BACの約140 kb NgoMIV-NotI断片およびC22 BACの約180 kb NotI-NotI断片も遊離させた。次に、それぞれをPFGEにより単離した。各断片を含むアガロースゲル切片を切り出し、このアガロースを製造元のプロトコールに従ってβ-アガラーゼ(Takaraから市販されているものを入手)で消化した。次に3つの断片を1:1:1の化学量論で混合した。この混合物をHCo26と称する。次に、HCo26 DNA混合物を、(標準的方法により)受精卵にマイクロインジェクションした。JHD(KCo5)(JHD+/+、CMD-/-、JKD+/+、KCo5+)マウスに、DNAを注入した。尾部DNAを鋳型として使用する、DMTM79およびDMTM80を用いたPCRにより、潜在的ファウンダーマウスを9B2導入遺伝子についてスクリーニングした。2つの異なるファウンダーマウスであるHCo26-05およびHCo26-16が、JHD+/+、CMD-/-、JKD+/+、KCo5+の株背景で、9B2導入遺伝子に関して陽性と出た。さらに、HCo26-05マウス由来のゲノムDNAのサザンブロット解析で、C22断片の3'末端で約1 kbプローブとハイブリダイズする2つの陽性BamHIバンドが得られた。一方のバンドは内因性マウスIgH遺伝子座の3'末端を表し、もう一方は、C22断片のマウスゲノムへの無作為な組込みを表す。

次に、HCo26導入遺伝子について陽性であるファウンダーマウスをJHD(KCo5)マウス(JHD+/+、CMD-/-、JKD+/+、KCo5+/+マウス)と交配させて、9B2、JHD、CMD、JKD、およびKCo5について遺伝子型を同定した。HCo26-05ファウンダーマウスは、HCo26導入遺伝子をいくつかの子孫に伝達した。

これらのHCo26ファウンダーマウスをJHD(KCo5)マウスと交配させて、異なる安定なHCo26系統を作製した。上記の実施例に記載したように、HCo26陽性マウスを、マウスIgM/ヒトκおよびマウスIgG/ヒトκの免疫前レベルについて試験した。さらに、上記の実施例に記載したように、HCo26マウスにTTまたは他の抗原を免疫し、マウスIgG/ヒトκおよび抗原+/マウスIgGレベルについて力価測定することができる。

実施例6：キメラ抗体の完全ヒト抗体への変換およびそれらの比較
キメラ抗体を完全ヒト抗体に変換するため、重鎖および軽鎖の可変領域(再編成ヒトVDJセグメントを含む)のcDNAを単離し、配列を決定する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞ペレットから、Qiagen RNeasy Mini Kitを使用して全RNAを得る。次に、Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kitを使用して、5' RACE手順によりcDNAを調製する。次いで、マウス定常領域に特異的な3'プライマーを5' RACE汎用プライマー混合物と対にして用いて、各抗体の可変領域を増幅する。次に、可変領域を含むPCR産物を、Invitrogen TOPO TA DNA配列決定ベクターにクローニングする。ミニプレップしたDNA試料を調製し、DNA配列を決定する。次いで、所望の抗体の可変領域のみを含むように、DNA配列を切り取る。次に、抗体の可変領域を、9B2マウスを作製するために用いた生殖系列のヒトV(D)J領域に対応させて、それらが導入遺伝子起源のものであり、したがってヒト起源のものであることを確実にする。可変領域はまたマウス可変領域とも比較して、いかなるマウス由来可変領域も排除する。cDNA配列を所望の抗体のN末端アミノ酸配列決定および質量スペクトル解析と比較して、正しいcDNA配列が得られたことを確実にする。

正しいcDNA配列が得られたならば、プライマーを合成して、重鎖および軽鎖可変領域のコード領域の独立したPCRを行う。さらに、ヒト定常領域を既にコードする発現ベクターにコード可変領域を直接クローニングできるように、適切な制限部位をコード領域にインフレームで付加する。このようにして、適切な可変領域配列が適切なヒト定常領域配列、ならびに転写および翻訳制御配列に機能的に連結されるように、可変領域(軽鎖または重鎖)を発現ベクターに挿入する。抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することができ、より一般的には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入する。V_Hセグメントがベクター内のC_Hセグメントに機能的に連結され、V_Lセグメントがベクター内のC_Lセグメントに機能的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターを用いることができる。完全ヒト抗体の発現に適した発現ベクターの非限定的な例には、Blackによる米国特許出願第20050153394号に記載されているpIEファミリーのベクターが含まれる。

軽鎖および重鎖を発現させるため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的技法により宿主細胞にトランスフェクションする。本発明の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞、およびSP2細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入した場合、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞を培養する培養液への抗体の分泌に十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて、培養液から回収することができる。

キメラ抗体を完全ヒト抗体に変換するための上記の一般的方法を用いて、トランスジェニックマウス9B2-58株で産生された抗TT mAbを完全ヒト抗体に変換した。より具体的には、ヒト重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列がそれぞれヒトγ1定常領域およびヒトκ定常領域をコードする配列に機能的に連結されるように、抗TT抗体43H7C10(実施例4に記載)(マウスγ2b定常領域に機能的に連結され、完全ヒトκ軽鎖と対形成したヒトVDJ可変領域からなるキメラ抗体)の重鎖および軽鎖可変領域を発現ベクターにクローニングして、組換え完全ヒト43H7C10抗体の調製を可能にした。43H7C10ヒト重鎖および軽鎖可変領域配列はまた、それぞれマウスγ2a定常領域およびヒトκ定常領域をコードする配列に機能的に連結されるように、発現ベクターにクローニングして、組換えキメラ43H7C10抗体の調製を可能にした。組換え完全ヒト43H7C10抗体および組換えキメラ43H7C10抗体をコードする発現ベクターを、標準的技法によりCHO細胞にトランスフェクションし、43H7C10抗体タンパク質の両形態を独立して産生させ、標準的タンパク質精製法を用いて精製した。次に、2つの精製抗体タンパク質をBIACORE実験で用いて、TTに対する親和性ならびに結合速度および解離速度を標準的方法により決定し、比較した。比較のため、1D6(最初にHuMab Mouse(登録商標)で産生された完全ヒト抗TT抗体)もまた、完全ヒト抗体および組換えキメラマウスIgG/ヒトκ抗体として産生させた(いずれも、CHO細胞で発現させた)。親和性、結合速度、および解離速度の比較の結果を、以下の表7に示す。

（表７）キメラ対ヒト抗TT抗体の結合動態

このデータから、本発明のトランスジェニックマウスで産生されたキメラ抗TT抗体を組換えにより完全ヒト抗体型に再構成することができ、この抗体がその標的抗原に対して結合特性をなお維持し得ることが実証される。実際に、組換え完全ヒト型の抗体は、標的抗原に対して組換えキメラ型よりもいくぶん高い結合親和性を示す。さらに、キメラ組換え型および完全ヒト組換え型の43H7C10抗体はいずれも、標的抗原に対して、HuMab Mouse(登録商標)で産生された完全ヒト1D6 mAbよりも高い結合親和性を示し、よって、本発明のトランスジェニックマウスが、関心対象の標的に対してHuMab Mouse(登録商標)で産生された完全ヒト抗体よりも高い親和性を有する、前記標的に対する完全ヒト抗体の調製を可能にすることが、実証される。

マウスゲノム免疫グロブリン遺伝子座上に並べた、9B2導入遺伝子構築物、およびHCo26導入遺伝子構築物を構成する3つの断片の模式図である。

Claims (8)

1つのマウス免疫グロブリン(Ig)定常領域配列に機能的に連結された1つの非再編成ヒト免疫グロブリン(Ig)可変領域配列を含む導入遺伝子構築物であって、
該定常領域配列が、5'から3'方向に、
(a)B20バクテリア人工染色体（BAC）の約140kbのNgoMIV-NotI断片およびC22 BACの約180kbのNotI-NotI断片、または
(b)B20 BACの約13kbのNgoMIV-XhoI断片
を含み、
マウスゲノムに組み込まれた場合に、再編成を起こし、該マウスがヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含むキメラ抗体を発現する、導入遺伝子構築物。

非再編成ヒト重鎖可変領域配列がヒト重鎖Vセグメント配列、ヒト重鎖Dセグメント配列およびヒト重鎖Jセグメント配列を含む、請求項1記載の構築物。

5'から3'方向に、複数のヒト重鎖Vセグメント配列、複数のヒト重鎖Dセグメント配列、複数のヒト重鎖Jセグメント配列、および該マウスの定常領域配列を含む、請求項2記載の構築物。

4つのヒトV_H領域、15のヒトDセグメント、および6つのヒトJ_Hセグメントを含む、請求項3記載の構築物。

(a)9B2導入遺伝子、または(b)HCo26導入遺伝子を含む、請求項4記載の構築物。

ヒトIg可変領域およびマウスIg定常領域を含むキメラ抗体を発現する、請求項1〜5のいずれか一項記載の導入遺伝子構築物をゲノムに含むトランスジェニックマウス。

請求項6記載のトランスジェニックマウスに関心対象の抗原を免疫する段階、および関心対象の該抗原に特異的なキメラ抗体を該マウスから得る段階を含む、関心対象の抗原に特異的なキメラ抗体を作製する方法。

キメラ免疫グロブリン(Ig)重鎖をコードする核酸を前記マウスから単離する段階、およびマウスIg重鎖定常領域をコードする核酸を、ヒトIg重鎖定常領域をコードする核酸で置換し、該キメラIg重鎖をコードする核酸をヒト重鎖をコードする核酸に変換する段階、および該ヒト抗体を発現させる段階をさらに含む、請求項7記載の方法。

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