KR101711222B1 - 인간화 항체들을 발현하는 비-인간 유전자이식 동물들 및 그의 이용 - Google Patents

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로저 킹돈 크레이그
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Abstract

내생의 람다 경쇄 유전자좌, 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 포유동물로서, 이들 유전자좌들 각각은, 항원 도전 후, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자들이 B-세포들 내에 형성 및 발현되도록 재배열될 수 있으며, 상기 유전자좌들은 돌연변이되는데, 이 돌연변이된 유전자좌들로부터 생산된 재배열된 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성하는 능력이 실질적으로 감소 또는 제거되도록 돌연변이된다.

Description

인간화 항체들을 발현하는 비-인간 유전자이식 동물들 및 그의 이용{NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS EXPRESSING HUMANISED ANTIBODIES AND USE THEROF}
본 발명은, 항원 도전(challenge)에 반응하는 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 기능성, 친화도-성숙된 4량체(tetrameric) 면역글로불린들의 다양한 레퍼터리의 유전자이식(transgenic) 비-인간 포유동물들을 이용하는 개선된 유도 및 선발방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 내생의 카파 및/또는 람다 경쇄 면역글로불린들의 생성능 중 하나가 실질적으로 감소되거나 또는 경쇄의 중쇄와 복합체화되는 능력이 감소, 제거 또는 차단되도록 유전공학처리된, 비-인간 포유동물, 바람직하게는 마우스에 관한 것이다. 본 발명의 비-인간 포유동물들은 기능적인 내생의 마우스 중쇄들을 생성하는 능력도 감소된 것이다. 또한, 상기 돌연변이된 유전자좌들로부터 생산된 재배열된 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성하는 이들의 능력은 실질적으로 감소 또는 제거된다. 면역글로불린 종쇄 및 경쇄 이식유전자를 이용하여, 인간 4량체 항체 및 혼성 4량체 항체들을 생성하기 위한, 이러한 포유동물들의 생성 방법들 및 이러한 포유동물들의 이용방법들도 설명된다.
하기 설명에서, 모든 아미노산 잔기 위치 번호들은, Kabat 등(1991), US Public Health Services publication No 91-3242에 따라 제공된다.
항체들
항체들의 구조는 당 기술분야에서 공지이다. 대부분의 천연 항체들은, 2개의 중쇄들 및 경쇄들을 포함하는 4량체이다. 중쇄들은 각 중쇄를 따라 약 반 정도 위치에 있는 힌지 도메인(domain)들 사이에서 이황화물 결합을 통해 서로 연결된다. 경쇄는 힌지 도메인의 N-말단측 상에서 각 중쇄와 연결된다. 각 경쇄는 힌지 도메인 가까이에서 이황화물 결합에 의하여 그의 각각의 중쇄에 정상적으로 결합된다.
항체 분자가 정확하게 접힌 경우, 각 쇄는 보다 많은 선형 폴리펩티드 서열들에 의해 결합된 다수의 독특한 구형의 도메인들로 접힌다. 예로서, 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(Cκ 또는 Cλ)으로 접힌다. 중쇄들은 단일한 가변 도메인 VH, 제 1 불변 도메인 (CH1), 힌지 도메인 및 2 또는 3개의 추가의 불변 도메인들을 갖는다. 중쇄 불변 도메인들 및 힌지 도메인은 함께 일반적으로 항체 중쇄의 불변영역으로 알려져 있는 것을 형성한다. 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 도메인들의 상호작용은 항원 결합 영역(Fv)을 결과로서 형성한다. 중쇄 및 경쇄들의 상호작용은 중쇄의 CH1 도메인 및 경쇄의 Cκ 또는 Cλ에 의해 촉진된다. 일반적으로, 중쇄 이합체들 및 아미노-말단 단편들은 경쇄 부재시 활성을 보유하는 것으로 나타나지만, VH 및 VL 모두가 항원 결합에 요구된다(Jaton 등 (1968) Biochemistry, 7, 4185~4195). 일반적으로, 순환 λ 경쇄의 비율은 낮아, 혈장 중 4량체 면역글로불린으로서 복합체화된 총 경쇄의 약 2~5%를 나타낸다 (Goldsby 등(2003) Immunology, 제 5판, W.H. Freeman & Co NY).
새로운 항체들을 구축하기 위한 중쇄 면역글로불린 유전자들의 시험관내 조작은 1980년대에 처음 설명되었다. 초기의 항체의 공학적처리 작업의 다수는 잘 특징화된 항원에 대해 발생된 재배열된 마우스 면역글로불린 μ 유전자(IgM)를 사용하였다. 이 항원의 특징은, 무관한 경쇄와의 어셈블리 및 분비가 항원 결합의 보유를 나타내기 때문에, 항원 결합 특이성이 VH 도메인들에 존재하는 것으로 알려져 있다는 것이다(Neuberger and Williams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond., A317, 425~432). 이러한 시스템을 이용하여, 마우스 항원-특이적 VH 결합 도메인이 마우스 항원-특이적 VH 도메인에 융합된 인간 ε 불변 이펙터 영역을 포함하는 신규한 항체를 유도하도록 이용될 수 있는 것으로 나타났다. 결과의 하이브리드 IgE는 항원 특이성을 보유하였으며, IgE에서 기대되는 이펙터 활성을 나타내었다(Neuberger 등 (1985) Nature, 314, 268~270). 중쇄의 공학적처리에 대한 기타 문헌의 예들은 다음을 포함한다: 항-포스포콜린 활성을 보유하는 마우스 VH 인간/IgA 또는 IgG 항체 융합물들을 암호화하는 혼성 마우스-인간 항체 유전자들 (Morrison 등 (1984) PNAS, 81, 6851~6855); 마우스 VH 및 인간 IgG(γ3) 불변영역을 포함하는 항-암종-연관된 항원 17-IA 항체(Sun 등 (1987) PNAS, 84, 214~218); 및 인간 IgG(γ1) 불변 영역 및 마우스 VH 도메인들을 포함하는 항-인간 T-세포 항체(항 CD7) (Heinrich 등 (1989) J. Immunol., 143, 3589~97, 참조).
정상의 인간 B 세포들은 중쇄를 암호화하는 유전자가 재배열에 의해 생산되어지는 14번 염색체 상에서, 단일의 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 마우스에서, 중쇄 유전자좌는 12번 염색체 상에 위치된다. 정상의 중쇄 유전자좌는 복수의 V 유전자 세그먼트들(segments), 다수의 D 유전자 세그먼트들 및 다수의 J 유전자 세그먼트들을 포함한다. VH 도메인의 대부분은 V 유전자 세그먼트에 의해 암호화되지만, 각 VH 도메인의 C 말단 끝은 D 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트에 의해 암호화된다. B-세포들 내 VDJ 재배열 후, 친화도 성숙이 뒤따르는데, 이는 각 VH 도메인에 그의 항원-결합 특이성을 제공한다. 단일의 V 세그먼트를 포함하는 중쇄 면역글로불린으로부터 유도된 정상의 H2L2 4량체들의 서열 분석은, 항원 도전에 반응하는 차이는 우선적으로 VDJ 재배열 및 체세포 과다돌연변이의 조합으로부터 초래함을 증명하여 준다 (Xu and Davies (2000) Immunity, 13, 37~45). 50개의 인간 V 유전자 세그먼트들이 인간 게놈에 존재하며, 이들 중 단지 39개만이 기능적이다. 정상의 이배체 항원-생산 B-세포들에서, 각 세포는 하나의 세트의 중쇄 및 경쇄 항원 유전자좌들로부터의 항원 4량체를 생산한다. 유전자좌들의 다른 세트는 대립유전자 형질 배제(allelic exclusion)이라고 불리는 과정의 결과로서 생산적으로 이용되지 않는다(Singh 등 (2003) J. Exp. Med., 197, 743~750 및 이에 기재된 참고문헌들). 완전한(Fully) 인간 항체들(H2L2)은 이제, 항원 도전에 반응하여 유전자 이식 마우스들로부터 유도될 수 있다. 이러한 이식유전자 마우스들은 일반적으로 단일 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및 별도의 인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 대응하는 내생의 마우스 중쇄, 카파 경쇄 및 선택적으로 람다 경쇄 유전자좌들을 암호화하는 서열들은 결실되거나 또는 부분적으로 결실된다. 따라서, 카파 경쇄를 포함하는 인간 항체들만이, 인간 중쇄 및 마우스 람다 경쇄를 포함하는 마우스/인간 항체들의 로우 백그라운드(low background)에서 생산된다(WO90/04036; WO93/12227; WO98/24893; US5877397, US5814318 및 US6162963). 내생의 중쇄 및 경쇄 유전자 발현을 완전히 제거하기 위한 모든 내생의 쥐과의 경쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자들의 세그먼트들의 결실은 달성되기는 하지만 기술적으로 어려운 것으로 남아있으며, 특히 모든 람다 경쇄 코딩 서열의 제거가 필요한 것으로 여겨지는 경우 더욱 어렵다. 상기 쥐과의 람다 경쇄 코딩 서열의 제거는, 람다 유전자좌의 모든 기능성 V 및 J 유전자 세그먼트들 및 C1, C2 및 C3 불변영역들의 완전한 결실을 통하여 달성되며, 이는 사일런스된(silenced) 람다 경쇄 유전좌자를 갖는 마우스라는 결과를 초래한다(EP 1399559 참조).
상이한 시도로, 쥐과의 중쇄 유전자를 암호화하는 유전자의 막 엑손들을 붕괴시키므로써, 마우스 B-세포 개발 및 면역글로불린 분비를 제한하는 것이 있다. 이에따라, 내생의 쥐과의 중쇄 유전자는, 전사되고 항원 도전에 반응하여 VDJ 재배열된다는 점에서 기능적인 한편, IgM은 전구-B 세포들의 세포 표면 상에서 결코 발현되지 않기 때문에, 더이상의 개발이 저지되어, 내생의 마우스 카파 및 람다 경쇄 유전자들이 모두 구조적으로 온전하고 기능적이라 하더라도(Tuaillon (2000) Molecular Immunology, 37, 221~231), 항원 도전에 비생산적으로 반응하게 되는 결과를 초래한다(Kitamura 등 (1991) Nature, 350, 423~426).
내생의 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자좌들이 기능적으로 남는 경우, 임의의 부가적인 도입된 면역글로불린 중쇄 이식유전자도 대립유전자 형질 배제에 의해 조절되어, 일부 B-세포들은 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자좌들만을 발현하고, 다른 것들은 인간 중쇄 유전자좌들만을 그리고 마우스 경쇄 유전자좌들을 기능적으로 발현한다(Nussenzweig 등(1987) Science, 236, 816~819). 임의의 단일 비-인간 유전자이식 동물에서, 이질적인 항원 도전에 반응하여 잠재적으로 모든 면역글로불린 유전자좌들로부터 유도된 항체들을 발현하는 B-세포들의 매우 다양한 군이 존재한다. HAT 선발을 사용하는 수립된 하이브리도마 기술을 이용하는 항원-특이적 항체들의 이후의 선발(Davis 등 (1982) J. Immunol. Methods, 50, 161~171)은, 또다른 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대조적인 것을 발현하는 하이브리도마들을 구분하지 않는다.
면역글로불린 중쇄 이식유전자들에 존재하는 조절 성분들은, 복제수 의존 방식으로 B-세포 특이적 발현을 보장하기 위하여 필수적인 조직-특이적 인핸서 성분들을 포함한다. 5' 인트론성 인핸서 및 3' LCR의 존재는 이식유전자들이 B-세포 성숙의 모든 단계들에서 활성임을 보장한다 (Guglielmi 등 (2003) Biochim. Biophys. Acta, 1642, 181~190). 이식유전자좌들에서 중쇄 및 경쇄 특이적 LCRs의 포함은, 발현이 B-세포 특이적이지만은 않지만, 발현이 게놈 내로의 통합 자리에 관계없이 일어난다는 것을 보장한다 (WO90/10077, Mills 등 (1997) J. Exp. Med., 186, 845~858 및 Pettersson 등 (1997) Immunobiol., 198, 236~248)). 따라서, LCR이 존재하는 경우, 모든 이식유전자는 게놈 내에서의 그의 위치에 관계없이 기능적이다. 이식유전자 상에 존재하는 LCR이 부분적으로 결실된 경우, 이식유전자를 둘러싼 염색질(chromatin)은 단지 어떤 시점에서 부분적으로만 전사에 대해 개방되어, 위치 효과 모자이크 발현 및 이에 따라 타겟 조직에 걸친 이식유전자의 제한된 발현을 이끈다 (Festenstein 등 (1996) Science, 23, 271 (5252): 1123~5; Milot 등(1996) Cell, 87(1), 105~14).
마우스 백그라운드에서 인간 면역글로불린들의 생산을 위한 다른 시도는 쥐과의 면역글로불린 유전자 세그먼트들을 인간으로부터의 상동성 유전자 세그먼트들로 대체하는 것이다. 따라서, 마우스 V, D 및 J 유전자 세그먼트들만이 인간 상동체들로 치환되는 경우, 인간 VH 및 VL 도메인들 및 마우스 불변 (이펙터) 영역들을 포함하는 기능성 마우스/인간 혼성 항체가, 항원 도전 후 결과로서 초래될 것이다 (WO94/04667). 모든 쥐과의 유전자 세그먼트들은 인간 상동체들로 치환되는 경우, 전체 인간 면역글로불린이 항원 도전 후 결과로서 초래될 것이다(US6596541). 이러한 시도의 한 인식되는 장점은, 코딩 영역들만이 교환되는 한, 결과의 이식유전자가 모든 마우스 조절 성분들을 보유하여, 항원 도전에 대한 최대 반응을 보장하는 것이다. 이러한 시도는, 상기 이식유전자들의 최종 구조에 의존하여, 높은 친화도 인간 항체들 또는 마우스/인간 혼성 항체들의 높은 혈청 역가들을 제공한다. 그러나, 실제로는, 마우스 게놈 내에서 모든 개별적인 V, D 및 J 세그먼트들을 상동성 재조합물로 모두 치환하는 것은 시간이 오래걸리고 힘든 일이다. 유사하게, 불변 (이펙터) 영역들을 갖는 모든 39개의 기능성 인간 V, D 및 J 세그먼트들을 포함하는 중쇄 이식유전자의 구축은 기술적으로 매우 어려운 것이다. 따라서, 게놈 DNA의 많은 세그먼트들의 결실, 또는 다중 결실들에 의존하지 않으며, 하기 (i), (ii) 및 (iii)를 가능하게 하는 방법들이 당 기술분야에서 여전히 요구되고 있다:
(i) 항원 도전에 반응하여 B-세포 특이적 방식으로 내생의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자들을 발현하는 능력이 실질적으로 감소되거나, 또는 항원 도전 후에 B-세포들 내에서 내생의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자들을 발현하지만, 기능성 면역글로불린 4량체들로서 조립하는 능력이 결여된, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단백질들을 암호화하여, 항원 도전에 비-생산적으로 반응하는 결과를 일으키는 마우스들의 간단한 생성;
(ii) 총괄적으로는 모든 39개의 인간 V 유전자 세그먼트들을 포함할 수 있지만, 개별적으로는 모든 D 및 J 유전자 세그먼트들 및 일부 또는 모든 불변 (이펙터) 영역들과 조합된, V 유전자 세그먼트들의 바람직한 보다 작은 군들을 포함할 수 있으며, 그의 기능적 발현이 항원 의존적이고, 궁극적으로는 대립유전자 형질 배제에 의해 결정되는, 다수의 중쇄 이식유전자 유전자좌들의, 구축 및 B-세포 특이적 발현을 위한 간단하고 재현가능한 방법들; 및
(iii) 잔류 내생의 마우스 면역글로불린들을 발현하는 하이브리도마들에 대해서는 선발하지 않고, 중쇄 이식유전자좌들 상에 존재하는 전체(full) V 세그먼트 레퍼터리(repertoire)를 포함하는 조립된 면역글로불린 4량체들을 발현 및 분비하는 하이브리도마들에 대한 선발능, 또다르게는 다른 중쇄 이식유전자 유전자좌에 대조되는 것에 존재하는 V 유전자 세그먼트들의 서브세트를 발현하는 하이브리도마들에 대한 선발능.
본 발명의 제 1 측면에 따라, 내생의 람다 경쇄 유전자좌, 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 포유동물이 제공되며, 이들 각각은, 항원 도전 후, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자들이 B-세포들 내에 형성 및 발현되도록 재배열될 수 있으며, 상기 유전자좌들은 돌연변이되어, 돌연변이된 유전자좌들로부터 생산된 재배열된 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성하는 능력이 실질적으로 감소 또는 제거되도록 돌연변이된다.
비-인간 포유동물에서, 상기 내생의 람다 경쇄 유전자좌, 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌 중 적어도 하나는, 해당 또는 각각의 내생의 유전자좌 내로의 프레임 이동(frame shift) 돌연변이, 폴리펩티드-암호화 서열 및/또는 하나 이상의 정지 코돈들의 도입에 의해 돌연변이된 것일 수 있다.
상기 돌연변이는 바람직하게는 50개 미만의 뉴클레오티드들의 삽입이다. 상기 비-인간 포유동물에서, 상기 내생의 람다 경쇄 유전자좌, 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌 중 적어도 하나의 발현은 해당 또는 각각의 유전자좌에서 LCR의 일부 또는 전부의 제거에 의해 실질적으로 감소될 수 있다.
바람직하게는, 상기 도입은 내생의 카파 경쇄 유전자좌 내에서이다. 다르게는, 상기 도입은 내생의 람다 경쇄 유전자좌 내에서이다.
또다르게는, 상기 도입은 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 람다 경쇄 유전자좌 내에서이다.
상기 도입은 내생의 중쇄 유전자좌 내에서일 수도 있다.
다르게는, 상기 도입은 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌 내에서일 수 있다.
또 다르게는, 상기 도입은 내생의 람다 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌 내에서일 수 있다.
또 다르게는, 상기 도입은 내생의 람다 경쇄 유전자좌, 내생의 카파 경쇄 유전자좌 및 내생의 중쇄 유전자좌 내에서일 수 있다.
바람직하게는, 상기 정의된 것과 같이, 상기 도입은 내생의 카파 경쇄 유전자좌 내에 존재하고, 상기 정의된 것과 같은 일부 또는 완전한 LCR 결실은 내생의 람다 경쇄 유전자좌에 존재한다.
바람직한 경우, 상기 내생의 중쇄 유전자좌는 중쇄 유전자 재배열, mRNA 전사 및 단백질 합성이 일어나지만 B-세포 활성화는 차단되도록 돌연변이될 수 있다.
바람직하게는, 상기 정의된 것과 같은 비-인간 포유동물은 하나 이상의 이종성 카파 경쇄 유전자좌들 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함한다. 상기 비-인간 포유동물은 하나 이상의 이종성 람다 경쇄 유전자좌들 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함하는 이식유전자를 더 포함할 수 있다.
상기 정의된 것과 같은 비-인간 포유동물에서, 상기 이식유전자는 우성(dominant) 선발 마커 유전자를 포함하는 이종성 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 상기 정의된 것과 같은 상기 비-인간 포유동물도 하나 이상의 이종성 중쇄 유전자좌들 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함하는 이식유전자를 포함할 수도 있다.
바람직한 경우, 상기 비-인간 포유동물은 둘 이상의 상이한 이종성 중쇄 유전자좌들 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함하는 둘 이상이 이식유전자를 포함할 수 있다.
상기 비-인간 포유동물에서, 둘 이상의 상이한 이종성 중쇄 유전자좌들 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함할 수 있다.
상기 비-인간 포유동물에서, 각 이종성 중쇄 유전자좌는 CTCF 결합 자리들을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 비-인간 포유동물은 이종성 카파 경쇄 유전자좌를 포함하는 이식유전자 및 하나 이상의 이종성 중쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자를 포함한다.
다르게는, 상기 비-인간 포유동물은 이종성 람다 경쇄 유전자좌를 포함하는 이식유전자 및 하나 이상의 이종성 중쇄 유전자좌를 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
다른 대안에서, 상기 비-인간 포유동물은 이종성 카파 경쇄 유전자좌를 포함하는 이식유전자, 람다 경쇄 유전자좌를 포함하는 이식유전자 및 하나 이상의 이종성 중쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 각 이종성 유전자좌는 상동성 LCR을 포함한다. 각, 이종성 유전자좌는 바람직하게는 인간 유전자좌이다.
그러나, 각 이종성 유전자좌는 한 종 이상으로부터 유래된 가변영역들 및 불변영역들을 포함하는 혼성 유전자좌일 수 있으며, 예컨대 인간 가변영역들 및 쥐 또는 쥐과 동물의 불변영역들을 포함하는 혼성 유전자좌이다.
상기 비-인간 포유동물은 상이한 이종성 중쇄 유전자좌의 상이한 군들을 포함하는 이식유전자들의 군들을 포함하고, 상기 이식유전자들의 각 군은 상이한 우성 선발 마커 유전자를 포함한다.
다르게는, 상기 비-인간 포유동물은 이종성 경쇄 유전자좌를 포함하는 이식유전자들 및 이종성 중쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자들을 포함할 수 있고, 상기 이종성 경쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자들 및 이종성 중쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자들 각각은 상이한 우성 선발 마커 유전자를 포함한다.
상기 비-인간 포유동물은 바람직하게는, 마우스와 같은 설치류이다.
제 2 측면에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 항원-특이적 이종성 단일클론성(monoclonal) 항체의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 설명들 중 어느 하나의 비-인간 유전자이식 포유동물을 항원으로 면역화시키는 단계;
(b) 각각 상기 면역화된 유전자이식 포유동물의 B-세포들로부터의 단일클론성 항체를 생산하는, 하이브리도마들 또는 불멸화된(immortalised) B-세포주들을 제조하는 단계;
(c) 이종성 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자들 내에 존재하는 우성 선발 마커 유전자들의 이용에 의하여, 이종성 항체를 발현하는 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선택적으로 선발하는 단계; 및
(d) 상기 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선발하는 단계.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 하기 단계들을 포함하는, 혼성 항체로부터 포유동물, 바람직하게는 인간 항체를 유도하는 방법이 제공된다:
(a) 상기 설명된 방법을 실시하는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 선택 종들의 VH 및 VL 결합 도메인들을 포함하는 항체를 생산하는, 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선발하는 단계;
(c) 상기 VH 및 VL 도메인들을 클로닝 및 서열화하는 단계;
(d) 동일한 종들로부터의 선택물의 불변 이펙터 도메인들을 이용하여, VH 및 VL 결합 도메인 코딩 서열들을 포함하는 선발된 서열들을 재클로닝하는 단계; 및
(e) 선택된 세포 유형에서 발현 벡터를 이용하여, 원하는 종들의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드들을 암호화하는 재클로닝된 서열들을 공동발현시키는 단계.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 포유동물 전구세포(progenitor cell) 내에서 내생의 중쇄 유전자좌, 내생의 카파 경쇄 유전자좌, 및 선택적으로 내생의 람다 경쇄 유전자좌를 돌연변이시키고, 상기 전구세포로부터 포유동물을 생산하는 것을 포함하는, 상기 정의된 것과 같은 비-인간 포유동물의 생산방법이 제공되며, 상기 돌연변이는, 상기 포유동물에서, 각 유전자좌가 재배열되어서, 항원 도전 후 B-세포들에서 면역글로불린 중쇄 유전자들 및 경쇄 유전자들이 형성 및 발현되지만, 상기 돌연변이된 유전자좌들로부터 생산된 재배열된 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성하는 능력이 실질적으로 감소되거나 또는 제거되도록 재배열될 수 있는 것이다. 바람직하게는, 상기 전구세포는 비-인간 배아줄기세포이다. 상기 비-인간 포유동물은 바람직하게는, 마우스와 같은 설치류이다.
본 발명은 상기 정의된 것과 같은 비-인간 포유동물 또는 방법을 이용하여 유도된 바람직하게는 인간의 항원-특이적, 이종성, 기능성 면역글로불린 4량체들의 의약, 진단 또는 시약으로서의 이용도 제공한다.
본 발명자들은, 비-인간 포유동물들, 특히 마우스들의 단순화된 생산방법들의 개발을 통하여 놀랍게도 선행기술들의 한계들을 극복하였으며, 여기에서 내생의 카파 및/또는 람다 경쇄 유전자들의 기능적 발현은, 프레임-이동 또는 mRNA 번역의 미성숙 종결을 이끄는, 바람직하게는 카파 불변영역 및/또는 람다 불변영역내에서의 작은 삽입의 결과로서 비-기능성화된 불변영역들을 통하여 또는 동족의(cognate) 내생의 LCR의 일부 또는 전부의 제거를 통하여, 실질적으로 감소된다. 이는, 경쇄 유전자 코딩 서열이 일부 또는 전부의 완전한 결실 또는 부분 결실에 의한 내생의 면역글로불린 경쇄 유전자들의 기능적 사일런싱(silencing)을 요구하는 다른 전략들과는 대조된다.
설명된 상기 전략들은 면역글로불린 중쇄 유전자좌들에 균등하게 잘 적용될 수 있다. 따라서, 예로서 LCR의 완전한 결실 또는 일부 결실은 중쇄 유전자 발현을 실질적으로 감소시키는 결과를 초래한다. 바람직하게는 μC 영역의 CH1 도메인 내에서, 대안적으로는 모든 면역글로불린 아이소타입(isotype) 불변영역들의 CH1 영역 내에서 프레임-이동 또는 mRNA 번역의 미성숙 종결을 이끄는 서열들의 도입은 경쇄를 갖는 면역글로불린 4량체들의 형성을 실질적으로 감소, 제거 또는 차단할 것이다. 유사하게는, 상기 설명된 것과 같이, 전구-B 세포들(pre-B cells)의 표면 상에서의 IgM 발현이 mRNA 번역의 미성숙 종결에 의해 생체 내에서 차단되는 경우, 그 후 더이상의 발달은 구속되어, 항원 도전에 대하여 비-생산적인 반응을 일으킨다(Kitamura 등 (1991) Nature, 350, 423~426). 중쇄 면역글로불린 이식유전자의 도입은 B-세포 확장을 구제하고, 이식유전자-암호화된 중쇄 및 내생의 쥐과의 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로불린 4량체들은 혈청 내에서 순환된다.
따라서, 내생의 경쇄 유전자들 및/또는 중쇄 유전자들의, 기능성 면역글로불린 4량체들과 상호작용하고 이들을 형성하는 능력은, 프레임 이동 돌연변이의 도입 후 제거되거나 또는 실질적으로 감소될 수 있어, 비관련 단백질 서열의 합성을 일으킬 수 있으며, 이는 일반적으로. 프레임 밖의 정지 코돈들의 존재로 인해 단백질 합성의 미성숙 종결이 수반된다.
이는, 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성시키는 중쇄 또는 경쇄폴리펩티드 서열들 내 또는 이들의 업스트림에서의 DNA의 삽입 또는 작은 DNA 결실에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 시도는 새로운 서열을 삽입하는 것이다. 아미노산 코딩 서열에서 프레임 이동을 일으켜서 암호화된 mRNA의 번역을 미성숙 종결시키도록 설계된 효과적인 삽입 경우들(events)은 단일 뉴클레오티드의 도입으로 제한될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 코딩 영역 내로의 삽입은 프레임이동을 일으킬 수 있다. 다르게는, 정지 코돈을 포함하는 추가적인 펩티드 서열들을 암호화하는 인-프레임(in-frame) 서열의 삽입은 절단된(truncated) 단백질의 합성을 초래한다(US5591669). 타겟된(targeted) 삽입 경우들은, 모든 내생의 서열이 보유되고 결과의 융합 단백질이 면역글로불린 4량체들의 형성을 교란시키거나, 또는 하나 이상의 인-프레임 정지 코돈(들)의 존재가 mRNA 번역의 미성숙 종결을 일으켜서 그 결과 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성할 수 없는 절단된 단백질이 합성된다면선택적인 마커 유전자들 및 다른 관능기들의 도입을 포함할 수도 있다.
바람직하게는, 삽입 경우들은 면역글로불린 κ 경쇄 불변영역들 내에 있다. 선택적으로, 삽입 경우들은 면역글로불린 κ 및/또는 λ 경쇄 불변영역들 내에 있다. 실시에서, 삽입물들은 임의의 재조합효소(recombinase) 인식 자리(들), 예컨대 lox 자리를 포함할 수 있다. 이것만으로 프레임 이동을 일으킬 수 있다. 프레임 이동을 보장하기 위한 추가의 뉴클레오티드, 하나 이상의 정지 코돈들을 위한 코돈들의 포함도, 중쇄 CH1 도메인들 및 경쇄 κ 및/또는 λ 불변영역들의 상호작용을 통한, 삽입된 서열의 중쇄 및 경쇄 이합체화의 붕괴에 대한 효력에 부가될 수도 있다. 삽입물은 단일한 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 50개 미만의 뉴클레오티드들이다. 상기 삽입물은 단지 프레임이동만을 초래할 수 있지만, 바람직하게는 하나 이상의 정지 코돈들이 mRNA 번역의 미성숙 종결을 일으키도록 설계된다. 상기 삽입물은 삽입 자리에 측면근접하는 암들(arms)을 이용하는 상동성 재조합을 이용하여 수행된다. 바람직하게는, 선발 마커는 조작 공정 동안 포함된 후, 이어서 절제되어 게놈 내에서 제위치의(in situ) 임의의 부가적으로 삽입된 서열이 붙은, 인식 자리들, 예로서 lox 자리들만을 남기게 된다.
프레임 이동들 및 절단된 단백질들의 합성도 코딩 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드들의 결실 및 정지코돈들을 포함하는 최소 부가 서열의 포함에 의해 달성될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 바람직하게는 삽입 또는 결실은 중쇄 및 경쇄 유전자들의 불변영역들에서 일어나며, 내생의 유전자좌들의 다수의 V, D 및J 영역들에서는 일어나지 않는다. 바람직한 선택은 카파 경쇄 불변 영역이다.
따라서, 내생의 면역글로불린 유전자 재배열 또는 mRNA 전사의 제거를 위한 큰 규모 유전자 결실 전략에 대한 의존성이 없다. 동일한 삽입 전략들은 내생의 중쇄 면역글로불린이, 중쇄 아이소타입들의 CH1 영역들 내에서 타겟되 삽입을 통하여 경쇄와 함께 기능성 4량체 복합체들을 형성하는 것을 저해하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 내생의 면역글로불린 중쇄 유전자들의 발현은, Kitamura 등(1991) Nature, 350, 423~426에 기재된 바와 유사한 방법을 이용하여, 예비-B 세포 단계에서 차단되어 내생의 중쇄들이 B 세포들의 표면상에 발현되지 않고, B-세포 팽창으로 인한 결과로 생산적인 발현이 차단되는 한편, 내생의 IgM의 기능성 CH1와 연결된 경쇄는 삽입에 의해 저해되어, 면역글로불린 중쇄와 기능적으로 상호작용할 수 없는 경쇄 불변영역(들)을 암호화하는 카파 및/또는 람다 경쇄 mRNA를 생성하여, 기능성인 내생의 면역글로불린 4량체의 형성을 방해한다.
내생의 면역글로불린 4량체들의 기능성 어셈블리가 기능적으로 손상되면, VH 도메인들의 연관된 친화도 돌연변이를 갖는 B-세포 팽창은 내생의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이식유전자들의 존재 및 발현으로 제한 및 의존될 것이다. 면역글로불린 이식유전자들은 B-세포 특이적 방식으로 선택된 비-인간 포유동물 숙주의 대립유전자 형질 배제에 참여하여, 항원 도전에 대해 생산적인 반응, B-세포 팽창 및 이식유전자-암호화된 항원-특이적 면역글로불린 4량체들을 순환시키는 결과를 초래할 것이다.
내생의 람다 경쇄 유전자 발현이 람다 경쇄 LCR 일부 또는 전부의 제거에 의해 실질적으로 감소되고, 내생의 카파 경쇄 유전자 발현이 카파 경쇄 LCR의 일부 또는 전부의 제거에 의해 실질적으로 감소된 비-인간 포유동물도 제공된다. 본 발명의 한 구체예에서, 단지 내생의 카파 경쇄 발현 또는 단지 람다 경쇄 발현은 관련 LCR 일부 또는 전부의 제거에 의해 실질적으로 감소된다.
내생의 경쇄 유전자좌들은, 재배열하여 기능성 mRNA로 전사될 수 있다는 점에서 기능성을 보유, 내생의 LCR 기능성의 일부 또는 전부의 제거를 통하여 전사 수준이 실질적으로 감소된다(WO90/10077). LCR 기능성은 마우스 ES 세포들에서, 또는 ES 세포들의 부재 하에서, 핵 전달(Soulter (1998) Nature, 394, 315~316) 또는 다른 포유동물 종들로부터 유래된 iPS 세포들(Gottweiss. 및 Minger (2008) Nature Biotechnology, 26, 271~272) 중 어느 하나를 사용하는 클로닝에 의하여 유전자 타겟팅 뉴클레아제 과민감성 자리들에 의해 제거된다. 선택적으로, 중쇄 또는 경쇄들의 붕괴는, 아연 집게(zinc finger) 뉴클레아제 기술 및 DNA 복구(예로서, http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology)에 의해 타겟된 돌연변이들을 통하여 달성될 수 있다.
내생의 카파 경쇄 유전자 발현은, 카파 경쇄 LCR의 일부 또는 전체의 제거에 의해 실질적으로 감소될 수 있으며, 결실 또는 삽입 후 람다 경쇄 유전자는 기능적으로 사일런스될 수 있다. 내생의 람다 경쇄 유전자 발현은 람다 경쇄 LCR의 부분 또는 전부의 제거에 의하여 실질적으로 감소될 수 있으며, 결실 또는 삽입 후 카파 경쇄 유전자는 기능적으로 사일런스될 수 있다.
내생의 카파 경쇄 유전자는 LCR 제거 또는 삽입 후 기능적으로 사일런스될 수 있다. 본 발명은 내생의 카파 경쇄 유전자 발현 및 내생의 람다 경쇄 유전자 발현들 중 하나 또는 모두가, 카파 경쇄 LCR의 부분 또는 전부의 제거 및/또는 람다 경쇄 LCR의 부분 또는 전부의 제거에 의해 실질적으로 감소된 비-인간 포유동물들도 제공한다. 내생의 카파 유전자는 기능적으로 사일런스될 수 있고, 람다 경쇄 LCR의 부분 또는 전부의 제거에 의하여 내생의 람다 유전자 활성은 실질적으로 감소될 수 있다.
카파 경쇄 유전자 발현은, 감소된 카파 경쇄 LCR의 부분 또는 전부의 제거에 의하여 실질적으로 감소될 수 있으며, 람다 유전자 발현은 기능적으로 사일런스될 수 있다. 단지, 내생의 카파 경쇄 유전자 발현은 카파쇄 LCR의 제거에 의하여 실질적으로 감소될 수 있거나, 또는 ss결실 또는 삽입에 의하여 기능적으로 사일런스될 수 있다.
상기 설명된 것과 같은 내생의 카파 및/또는 람다 경쇄 유전자 발현 또는 실질적으로 감소된 내생의 카파 및/또는 람다 경쇄 유전자 발현을 갖는 상기 비-인간 포유동물들도 감소되거나 또는 기능적으로 사일런스된 내생의 중쇄 유전자 발현을 갖는다. 본 발명의 한 구체예에 따르면, 내생의 중쇄 유전자 발현은, LCR을 포함하는 뉴클레아제 과민감성 자리들의 일부 또는 전부의 결실 후 감소되거나 또는 본 발명의 비-인간 포유동물들에서 결실 또는 삽입 후 기능적으로 사일런스된다. 바람직하게는, 내생의 중쇄 유전자들의 발현은 예비-B 세포 단계에서 차단되어 내생의 중쇄들이 B 세포들의 표면 상에서 발현되지 않고, B-세포 팽창 결과 생산적 발현이, Kitamura 등(1991) Nature, 350, 423~426에 의해 설명된 것과 유사한 방법을 사용하여 차단되도록 한다.
상기 설명된 비-인간 포유동물들은 하나 이상의 이종성 중쇄 및 경쇄 유전자좌들 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함하는, 바람직하게는 동족 LCRs을 포함하는 하나 이상의 이식유전자들을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, "이종성(heterologous)"이라는 용어는, 여기 설명된 것과 같은 뉴클레오티드 또는 유전자좌가, 그것이 위치된 척추동물에 대해 내생이 아닌 것을 의미한다.
상기 비-인간 포유동물은 따라서 이종성 카파 경쇄 유전자좌 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들, 바람직하게는 LCR을 포함하는 이식유전자 및/또는 이종성 람다 경쇄 유전자 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들, 바람직하게는 LCR을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
동족 LCRS의 존재는 B-세포 특이적 발현에 필수적이지 않다. 이들의 유전자좌 내로의 포함은, 높은 수준의 이식유전자 발현이 통합(integration)의 모든 자리에서 일어나도록 보장하며, 이는 임의의 통합 경우들에 의존하지 않아, 단지 이들 중 일부만이 B-세포들에서 활발하게 전사된 염색질 영역 내에서 우연히 일어난다. 동족 LCRs의 이용은 항체 발현에 대해 스크리닝되는 것이 요구되는 이식유전자 동물들의 수를 현저히 감소시키고, 삽입된 모든 유전자좌가 B-세포 특이적 방식으로 본질적으로 정상 수준으로 확실히 발현될 것인 하나의 유전자좌 이상의 삽입을 허용한다. 따라서, 대립유전자 형질 배제 메커니즘이 내생의 면역글로불린 유전자들과 다수의 경쟁 이식유전자들을 구별할 것이라는 놀라운 관찰과 조합된, LCR 기술의 이용은 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자좌들을 포함하고, 각 유전자좌는 내생의 유전자들에 비해 감소된 V 유전자 복잡성을 갖고, 내생의 유전자좌들(1~2Mb)에 비해 시험관 내 조립에 대해 비교적 다룰만한 양의 DNA(<300kb)를 포함하는 것인, 유전자이식 비-인간 포유동물의 조립에 대한 방법을 여는 것이다. 예로서, 39개의 기능성 인간 면역글로불린 중쇄 V 유전자 세그먼트들이 2 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자좌들 내로 클로닝될 수 있다. 이들 각각은 상이한 V 유전자 세그먼트들을 포함할 것이지만, 공통으로 D 및 J 유전자 세그먼트들 및 불변(이펙터) 영역들을 갖는다. LCR의 포함은, 이들 각각이 게놈 네의 통합 자리에 관계없이 동일한 방식으로 발현되는 것을 보장한다. 따라서, 이러한 방식으로 둘 이상의 작은 유전자좌들의 포함은, 기술적으로 조작하기 어려운 단일의 큰 유전자 단편에 존재하는 단일한 보다 복잡한 유전자의 동일한 V 유전자 복잡성을 제공한다.
각각의 이종성 경쇄 유전자좌는 VL 유전자 세그먼트들, J 유전자 세그먼트들 및 경쇄 불변 영역 세그먼트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 VL 및 J 유전자 세그먼트들 및 경쇄 불변 영역 세그먼트는, 동일한 포유동물원, 예로서 설치류, 돼지, 소, 염소 또는 양으로부터 유래된다. 바람직하게는, 이들은 인간 기원이다.
다르게는, 이종성 경쇄 유전자좌들은 포유동물 기원, 바람직하게는 인간 기원의 가변 도메인들, 및 다른 포유동물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 마우스, 쥐, 햄스터, 돼지, 염소 및 소로부터의 불변(이펙터) 영역들을 포함하는 혼성 유전자좌일 수 있다. 숙주 포유동물이 마우스인 경우, 바람직하게는 상기 불변영역들은 설치류 기원이며, 보다 바람직하게는 마우스 또는 쥐이다. 이러한 이종성 경쇄 유전자좌들은, 바람직하게는 단지 하나의 종으로부터의 VL 및 J 세그먼트들 및 다른 종들로부터의 경쇄 불변영역을 포함한다.
혼성 카파 경쇄 이식유전자들이 고려되는 경우, 상기 VL 및 J 유전자 세그먼트들은 바람직하게는 동일한 종들로부터의 것으로, 중쇄 V, D 및 J 유전자 세그먼트들에 기여하며, 바람직하게는 인간 기원의 것이다. 상기 카파 경쇄 불변 및 중쇄 불변 영역들도 바람직하게는 동일한 종들로부터 유래되지만, 가변 도메인들을 기여하는 것들과는 상이한 종일 수 있으며, 바람직하게는 설치류 기원, 바람직하게는 쥐 또는 마우스로부터 유래된다.
고려되는 모든 경쇄 이식유전자들의 특징은, 항원 도전 후, 경쇄가 B-세포 특이적 방식으로 재배열한다는 것과, 전사 및 번역 후, 결과의 경쇄가 동일한 B-세포 내에서 생산된 이식유전자-유래 중쇄 면역글로불린과 복합체화될 수 있다는 것이다. 면역글로불린 4량체들의 생산적인 발현은 B-세포 팽창을 일으키고, 이식유전자-암호화된 항원-특이적 4가 면역글로불린 복합체들은 내생의 면역글로불린 4량체들의 현저한 수준 없이 혈청 내에 축적된다.
내생의 람다 경쇄 발현이 기능적으로 억제되지 않은 경우, 내생의 람다 경쇄들을 포함하는 숙주 또는 혼성 항체는 낮은 농도로 검출가능할 것이다. 이들은 하이브리도마 상등액의 스크리닝 후 폐기될 수 있다.
인간에는, 36개의 기능성 카파 VL 유전자 세그먼트들, 5개의 JL 유전자 세그먼트들 및 단일한 카파 경쇄 불변영역이 있다(http://imgt.cines.fr). 바람직하게는, 본 발명의 비-인간 포유동물 내 이식유전자에 존재하는 이종성 카파 경쇄 유전자좌는 하나 이상의 인간 VL 유전자 세그먼트들, 모든 인간 JL 유전자 세그먼트들 및 단일의 인간 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 선택적으로, 인간 카파 경쇄 불변영역은, 바람직하게는 쥐 또는 마우스 기원의, 교호하는(alternate) 포유동물 카파 경쇄 불변 영역으로 치환될 수 있다. 본 발명의 비-인간 포유동물 내 이식유전자에 존재하는 이종성 람다 경쇄 유전자좌는 바람직하게는 쥐 람다 LCR, 인간 람다 경쇄 V1 및 V2 유전자 세그먼트들, 인간 람다 J1, J2, J3 및 J4 세그먼트들, 및 인간 람다 경쇄 C1, C2, C3 및 C4 불변 영역 세그먼트들을 포함한다(WO90/10077 및 WO2003/000737). 선택적으로, 인간 람다 경쇄 C1, C2, C3 및 C4 불변영역 세그먼트들은, 바람직하게는 쥐 또는 마우스 기원의, 대체가능한 람다 경쇄 불변영역들에 의해 치환될 수 있다.
본 발명의 비-인간 포유동물 내 이식유전자에 존재하는 이종성 중쇄 유전자좌는, 바람직하게는 쥐과 기원의 중쇄 면역글로불린 LCR, 하나 이상의 인간 V 유전자 세그먼트들, 하나 이상의 J 유전자 세그먼트들 및 하나 이상의 D 유전자 세그먼트들을 포함한다. 바람직하게는, 10 이상의 상이한 V 유전자 세그먼트들 및 모든 인간 J 및 D 유전자 세그먼트들이 존재한다.
상기 유전자좌도 하나 이상의 인간 불변(이펙터) 영역들, 바람직하게는 μ 및 γ 불변 영역들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인간 불변 이펙터 영역들은 다른 비-인간 포유동물들로부터의 이펙터 영역들에 의해 치환될 수 있다. 상기 비-인간 포유동물 숙주는 마우스 또는 쥐로, 바람직하게는 불변(이펙터) 영역들은 쥐 또는 마우스로부터 유래된다. 인간과 대조적으로, 마우스의 경막(transmembrane) 도메인들 및 쥐 B-세포 수용체 복합체(BCR)는 100% 보존된다. 따라서, 쥐 불변(이펙터) 영역 유전자들을 포함하는 항체 유전자좌들에 대한 유전자이식 마우스들은 항원 도전 후 마우스 불변(이펙터)영역 유전자들을 포함하는 것들만큼 잘 기능하여야 하며, 인간 불변(이펙터) 영역 유전자들을 포함하는 것들에 비해 뛰어날 수 있다(De Franco 등 (1995) Ann. NY Acad. Sci., 766, 195~201). 이식유전자들은, 바람직하게는 마우스 또는 인간 기원의, 중쇄, 카파 및 람다 경쇄 LCRs을 포함할 수 있다. 모든 포유동물 종들에 걸쳐서 기능하는 LCRs은 알려져 있으며, 이식유전자들 내에서 인간 또는 마우스 LCRs에 대해 치환될 수 있다 (Li 등(1999) Trends Genet., 10, 403~8).
완전한(fully) 인간 항체들의 생성이 고려되는 경우, 하이브리도마에 의해 발현된 혼성 항체들로부터 유래된 클로닝된 인간 항원-특이적 VH 및 VL 결합 도메인들이 인간 불변 중쇄 및 경쇄 불변영역들에 융합되어, 임의의 부류의 완전한 인간 4량체 항체들을 유도할 수 있다.
보다 정밀하게는, 각 면역글로불린 카파 및/또는 람다 경쇄 유전자좌는 우성 선발 마커 유전자를 포함할 수도 있다.
상기 유전자되들에 통합된 우성 선발 마커 유전자들은 동일하거나 상이한 작용 메커니즘을 가질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는, 임의의 우성 선발 마커 유전자가 사용될 수 있으나, 단 유전자의 발현은 선택적 또는 독성 도전 존재하에서 비-인간 유전자이식 포유동물로부터 유래된 형질전환된 B-세포들 또는 하이브리도마에 선택적인 장점을 부여한다. 전형적으로, 우성 선발 마커 유전자들은 원핵생물 기원일 것이며, 푸로마이신(Vara 등 (1986) NAR, 14, 4617~4624), 하이그로마이신(Santerre 등 (1984) Gene, 30, 147~156) 및 G418 (Colbere-Garapin 등 (1981) 150, 1~14)과 같은 독성 약물에 대한 내성을 부여하는 군 또는 특정 영양 요구조건들을 제거하여 그들의 발현이 독성 물질을 필수 아미노산으로 전환, 예로서 인돌의 트립토판으로의 전환 또는 히스티딘올의 히스티딘으로의 전환되도록 하는(Hartmann and Mulligan,(1988) PNAS, 85, 8047~8051) 유전자를 포함하는 군으로부터 선택될 것이다.
본 발명의 이 측면에서 필수적인 요구조건은 우성 선발 마커가 상기 면역글로불린 경쇄 이식유전자좌 내에 통합되고, 원하는 면역글로불린 경쇄 대립유전자와 공동발현하여 B-세포 특이적 발현을 보장하는 것이다. 다르게는, 약물 내성 유전자가, ES 세포들 또는 핵 전달 방법들과 조합된 동종성 재조합을 이용하여 내생 또는 외생의 (유전자이식성) 면역글로불린 유전자좌 내로 삽입될 수 있다(te Riele 등 (1992), PNAS, 89, 11, 5128~5132). 상기 비-인간 포유동물은, 이종성 중쇄 유전자좌 및 연관 B-세포 특이적 LCR 및 조절 성분들을 포함하는 이식유전자 또는 이식유전자들도 포함할 수 있다. 하나 이상의 상이한 유전자이식 중쇄 유전자좌가 존재할 수 있으며, 이들 각각은 LCR 및 조절 성분들을 포함한다.
각각 하나 이상의 V 유전자 세그먼트들, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트들, 하나 이상의 J 유전자 세그먼트들, 및 하나 이상의 불변(이펙터) 영역들을 포함하는 중쇄 유전자좌들이 유전자좌 이식유전자들로서 도입되며, 각 유전자좌는 동족 LCR을 포함한다.
각 유전자좌는 B-세포 특이적 발현을 유도하기 위하여 필요한 5' 및 3' 조절 서열들을 포함한다. 각 중쇄 또는 경쇄 유전자좌는 항원 도전에 반응하여 내생의 유전자좌와 본질적으로 동일한 방식으로 발현되어, 이식유전자-암호화되는, 항원-특이적 친화도-성숙된, 4량체 면역글로불린들의 마우스 혈청 내에서의 순환을 일으킨다.
바람직하게는, 각 중쇄 유전자좌는 하나 또는 다수의 V 유전자 세그먼트들, 예로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 60 이상의 V 유전자 세그먼트들을 포함하며, 이들은 임의의 척추동물 종들, 바람직하게는 비-인간 포유동물로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 20 이하의 V 유전자 세그먼트들이 임의의 단일 중쇄 유전자좌에 존재한다.
한 구체예에서, 각 유전자좌는 단지 하나의 V 유전자 세그먼트만을 포함할 수 있다. 이 구체예의 하나의 대안에서, 다수의 V 유전자 세그먼트들이 존재하고, 각 V 유전자 세그먼트는 모든 다른 V 유전자 세그먼트들과 상이하다. 이 구체예에서, 임으의 하나의 유전자좌 내의 V 유전자 세그먼트들은 동일한 종들의 생물로부터 모두 유래될 수 있으며, 예로서 모든 V 유전자 세그먼트들은 인간 기원일 수 있다. 다르게는, 임의의 하나의 유전자좌 내에서 상기 V 유전자 세그먼트들은 상이한 종들, 예로서 인간으로부터의 V 유전자 세그먼트들 일부 및 나머지들은 양, 소, 토끼, 카펠리드들 또는 상어로부터의 것들로부터 유래될 수 있다. 두번째 대안에서, 각 V 유전자 세그먼트는 모든 다른 V 유전자 세그먼트들과 동일하다. 존재하는 V 유전자 세그먼트들의 수와 성질에 관계없이, 각 유전자좌에서 잔여 D 및 J 유전자 세그먼트들은 모든 다른 유전자좌들에 있는 것들과 동일하거나 상이할 수 있다.
이에따라, 상기 비-인간 포유동물이 중쇄 유전자좌의 다수의 복제물들을 포함할 수 있다는 것이 구체화되어진다. 이는 B-세포에서의 생산적인 재배열이 일어나도록 할 기회를 최적화시켜, 이에따라 항원 재인식에 대한 면역글로불린 중쇄의 최적 생산을 가능케한다는 장점을 갖는다.
또다른 구체예에서, 각 유전자좌는 다수의 V 유전자 세그먼트들을 포함하낟. 바람직하게는, 상기 V 유전자 세그먼트들은 인간 기원이다.
상기 'V 유전자 세그먼트'라는 용어는, 이에 제한되지는 않지만 상어, 설치류, 카멜리드류 및 인간을 포함하는 척추동물로부터 유래된 임의의 자연에 존재하는 V 유전자 세그먼트를 포괄한다. 상기 V 유전자 세그먼트는, 재배열된 핵산이 B-세포들 내에서 발현되는 경우 카파 또는 람다 면역글로불린 경쇄와 복합체화될 수 있는 면역글로불린 중쇄 항체를 생성하기 위해, D 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트 및 중쇄 불변(이펙터) 영역을 암호화하는 유전자 세그먼트와 재조합될 수 있어야만 한다. V 유전자 세그먼트도, 재배열된 핵산이 B-세포들 내에서 발현되는 경우 카파 또는 람다 면역글로불린 경쇄와 복합체화될 수 있는 면역글로불린 중쇄 항체를 생성하기 위해, D 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트 및 중쇄 불변영역을 암호화하는 유전자 세그먼트와 재조합될 수 있는, 천연 또는 유전공학처리된 상동체, 유도체 또는 단백질 단편을 암호화하는 임의의 유전자 서열을 그 범주 내에 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 다수의 중쇄 유전자좌들은, 39 기능성 인간 V 유전자 세그먼트들과 이들의 유전공학처리된 변이체들의 임의의 수 또는 조합물을 포함한다. 이들은 임의의 수의 유전자좌들, 예로서, 8개의 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 4개의 유전자좌들에 더하여 7개의 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 하나의 유전자좌; 4개의 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 7개의 유전자좌들에 더하여 3개의 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 하나의 유전자좌; 또는 하나의 V 유전자 세그먼트를 각각 포함하는 39개 유전자좌들 상에 있을 수 있다.
인간 V 유전자들은 7개의 군들, VH1 내지 VH7, 및 각 번호의 군 내에서의 개별적인 유전자들로 분류된다. 각 유전자가 사용되는 빈도는 특정 면역 반응의 변화되는 요구에 따라 달라진다. 예로서, VH3군의 유전자들은, 세균 항원들에 반응하는 경우 VH5군의 유전자들에 비해 더 우선적으로 사용될 수 있다. 따라서,
따라서, 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 특이적 항원들에 대한 항체 반응을 생성하는데 유용한 것으로 보이는 V 유전자 세그먼트들의 군들은 별도의 유전자좌들로 분류되며, 이들은 별도의 유전자좌들은 상이한 우성 선발 마커 유전자를 포함한다. 상기 V 유전자 세그먼트들은 군(family)에 따라 분류될 수 있거나 또는 이들은 개별적인 기능에 따라 분류될 수 있다. 예로서, VH3군의 V 유전자들은 세균 항원들에 대한 면역 반응을 생성하는데 유용한 것으로 나타나므로, 따라서 이들은 세균 항원들에 대한 중쇄만의 항체들을 생성하는데 특히 유용한 유전자좌를 생성하는데 사용될 수 있다. 다르게는, VH3 및 VH5 군으로부터의 몇몇 개별적인 유전자들이 세균 항원들에 대한 면역 반응을 생성하는데 유용한 것으로 나타나는 경우, 이들은 함께 분류되어 세균 항원들에 대한 항체들을 생성하는데 특히 유용한 유전자좌를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 "면역글로불린 중쇄 유전자좌"는, 중쇄 불변(이펙터) 영역들을 암호화하는 하나 이상의 유전자 세그먼트들에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 V 유전자 세그먼트들, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트들 및 하나 이상의 J 유전자 세그먼트들을 포함하는 VH 도메인을 암호화하는 최소 마이크로-유전자좌에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체 레퍼터리 가변성의 일차적인 원은 V, D 및 J 유전자 세그먼트들, 및 V-D 및 D-J 연접부들에 의해 형성된 CDR 영역이다. 본 발명의 장점은 항체 레퍼터리 및 재배열된 V, D 및 J 유전자 세그먼트들에 서 수득된 다양성이, 대립유전자 형질 배제를 이용하므로써 동일한 유전자이식성 비-인간 포유동물에서 다중 면역글로불린 중쇄 유전자좌들의 이용을 통하여 최대화될 수 있다는 것이다. 재조합을 시작하기 위하여 유전자좌들 중 하나를 임의로 선택하고, 이어서 첫번째 재조합이 비-생산적인 경우, 생산적인 재조합이 상기 유전자좌들 중 하나로부터 생산될 때까지 다음 유전자좌가 선택되는, 대립유전자 형질 배제 과정은 조합된 유전자좌들 중에 존재하는 실질적으로 모든 V 유전자 세그먼트들이 전체 재조합 공정의 일부일 수 있도록 보장할 수 있을 것이다.
VDJ 재배열들에 생산적으로 참여하는 임의의 소정의 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 모든 VH 유전자 세그먼트들의 확률을 증진시키기 위하여, CTCF 자리들은 VH 유전자 세그먼트들의 군들 사이에 상호분산될 수 있다(interdispersed).
그의 정상 구조의 면역글로불린 유전자좌는, B 세포들에서 제조된 거리 측정들에 기초하여, VH 영역의 방향으로 이를 통하여 측정시, 3차원의 접힌 구조를 갖는 것으로 나타난다 (Jhunjhunwala 등 (2008) Cell, 133, 265~279). 이러한 접히거나 또는 고리화된(looped) 구조는, 상이한 VH 영역이 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 D, J 및 불변영역으로부터 매우 상이한 거리에 배열된 경우라 하더라도 균등하게 효율적으로 사용될 수 있는 이유를 설명하는 것이다.
다수의 유전자좌에서의 고리화에 의해 형성된 접힌 구조가 CTCF라고 명명되는 특정 염색질 결합 단백질을 통하여 매개된다는 것이 최근 밝혀졌다. CTCF는 돌연변이생성 실험에 의해 증명된 것과 같이 염색질 고리화의 형성에 직접 관련되는 것으로 보인다(Splinter 등 (2006) Genes Dev., 20, 2349~2354). 보다 최근, 자매 크로마티드들(sister chromatids)을 함께 보유하는 단백질 복합체인 코헤신(cohesin)이 CTCF 결합 자리들에 존재하는 것으로 나타났다(Wendt 등 (2008) Nature, 451, 796~801). 면역글로불린 VH 영역으로부터의 다수의 CTCF 자리들의 포함(Kim 등 (2007) Cell, 128, 1231~1245; Denger, Wong, Jankevicius and Feeney (2009) J. Immunol., 182, 44~48)은, 유전자이식 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 VH 영역이 적절하게 접히고, 그 유전자좌에 존재하는 모든 다른 V 유전자 세그먼트들의 효율적인 이용을 가능하게 하는 가능성을 증가시킨다.
이종성 중쇄 유전자좌를 포함하는 각 이식유전자는 우성 선발 마커를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 우성 선발 마커는 카파 또는 람다 경쇄 유전자좌 내에 도입된 우성 선발 마커와는 상이하다.
본 발명의 목적으로 위하여, 임의의 우성 선발 마커 유전자가 사용될 수 있으나, 단 상기 유전자의 발현은 선택 또는 독성 도전의 존재하에서 비-인간 이식유전자 포유동물로부터 유래된 형질전환된 B-세포들 또는 하이브리도마들에 선택적인 장점을 부여한다. 전형적으로, 우성 선발 마커 유전자들은 원핵생물 기원일 것이며, 푸로마이신(Vara 등 (1986) NAR, 14, 4617~4624), 하이그로마이신(Santerre 등 (1984) Gene, 30, 147~156) 및 G418 (Colbere-Garapin 등 (1981) 150, 1~14)과 같은 독성 약물에 대한 내성을 부여하는 군 또는 특정 영양 요구조건들을 제거하여 그들의 발현이 독성 물질을 필수 아미노산으로 전환, 예로서 인돌의 트립토판으로의 전환 또는 히스티딘올의 히스티딘으로의 전환되도록 하는(Hartmann and Mulligan,(1988) PNAS, 85, 8047~8051) 유전자를 포함하는 군으로부터 선택될 것이다. 본 발명의 필수 요구조건은, 사용되는 경우, 우성 선발 마커(들)이 면역글로불린 중쇄 유전자이식 유전자좌 내에 존재하여, B-세포 특이적 공동발현을 보장하여 주는 것이다. 다르게는, ES 세포들 또는 핵 전달 방법들과 조합된 동종성 재조합을 이용하여 약물 내성 유전자가 내생 또는 외생의 (유전자이식성) 면역글로불린 유전자좌 내로 삽입될 수 있다(예로서, te Riele, Robanus Maandag and Berns (1992), PNAS, 89, 11, 5128~5132).
동일한 우성 선발 마커 유전자가 모든 중쇄 유전자좌들 내에 통합될 수 있다. 다르게는, 중쇄 유전자좌들의 상이한 중쇄 유전자좌들 또는 군들은 상이한 우성 선발 마커 유전자들을 포함할 수 있다.
하이브리도마 또는 형질전환된 B-세포들, 바람직하게는 형질전환된 장수(long-lived) 혈장 세포들로(Slifka 등 (1998) Immunity, 8, 363~372), 4량체 항체들을 발현하는 본 발명의 이식유전자 마우스들로부터 유래된 것들이 선발될 수 있으며, 이들은 유전자이식 경쇄 유전자좌들 내의 기능성 우성 선발 마커 유전자의 공동발현으로 인하여, 내생의 면역글로불린을 발현하는 세포들이 없다. 또한, 유전자이식 중쇄 유전자좌 상에 존재하는 V 세그먼트들의 특이적 군들로부터 유래된 항체들을 발현하는 하이브리도마들 또는 형질전환된 B-세포주들도, 경쇄 유전자좌 내에 통합된 우성 선발 마커들에 비해 중쇄 유전자좌 내에 상이한 우성 선발 마커들의 존재 또는 공동발현으로 인하여, 선발될 수 있다. 예로서, 푸로마이신 내성 유전자의 카파 경쇄 유전자이식 유전자좌 내로의 포함은 카파 경쇄 이식유전자를 발현하는 모든 세포들이 선발을 가능하게 할 것이다. 다르게는, 바람직한 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 중쇄 유전자이식 유전자좌 내로의 G418 내성 유전자의 포함은 바람직한 V 유전자 세그먼트들을 발현하는 모든 세포들의 선발을 가능하게 할 것이다.
특히, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 항원-특이적 이종성 단일클론성 항체의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 설명된 것과 같은 비-인간 유전자이식 포유동물을 항원으로 면역화시키는 단계;
(b) 각각 상기 면역화된 유전자이식 포유동물의 B-세포들로부터의 단일클론성 항체를 생산하는, 하이브리도마들 또는 불멸화된 B-세포주들을 제조하는 단계;
(c) 이종성 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자좌들을 포함하는 이식유전자들 내에 존재하는 우성 선발 마커 유전자들의 이용에 의하여, 이종성 항체를 발현하는 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선택적으로 선발하는 단계; 및
(d) 상기 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선발하는 단계.
이제, 단지 예시적인 목적으로, 하기 도면들을 참조하여 하기의 상세한 설명을 통하여 본 발명을 설명한다.
도 1a: 마우스 IgH 유전자좌의 3' 말단.
이 맵(map)은 IMGT 데이터베이스로부터의 복사한 것이다(http://imgt.cines.f). 단위는 킬로염기(kb)이다. 초록색 사각형들은 기능성 VH 세그먼트들; 적색 및 황색 사각형들은 비-기능성 VH 세그먼트들; 주황색 사각형들은 JH 세그먼트들; 청색 사각형들은 불변영역들이다. 인트론성 IgH 인핸서 및 유전자좌의 3' 말단의 LCR은 나타내지 않았다.
도 1b: IgH의 불능화 전략
최상단 줄은 막 형태의 IgM를 코딩하는 두 개의 엑손들을 포함하는 상이한 엑손들을 갖는 마우스의 Cμ 영역을 나타낸다. 왼쪽으로 상기 유전자좌의 J, D 및 VH 영역이며, 오른쪽으로 Cδ로부터 출발하는 나머지 불변영역들이다. 아래 줄들은 재조합 후 정상의 M1 엑손의 아미노산 서열의 부분을 나타낸다. DNA 서열은 통합 서열을 나타낸다. 정지코돈은 적색이고, Spe I 자리는 적색 및 청색으로 나타내었다.
도 1c: Cμ의 불능화를 위한 ES 세포들에서의 재조합
이 도는, 재조합 삽입물의 3' 측면을 커버하는 PCR 분석에 의한, ES 세포들의 재조합 양성 클론들 중 2개를 나타낸다. 보다 큰 단편은, 도 5B에 나타낸 위치에서 M1 엑손 내로 neo 선발가능한 마커의 삽입에 대응한다.
도 1d: Cμ 넉아웃(knock out) 마우스들의 FACS 분석
M1 엑손을 정지코돈 및 neo 유전자에 의해 방해시킨 후(interrupted), ES 세포들을 배반포들 내로 도입시켜 키메라들을 수득하였다. 이들을 동형접합성으로 육종하고, B 세포들의 존재에 대하여 혈액을 분석하였다. 최상부의 2개의 패널들은, B 세포 마커들 B220 및 CD19를 이용한 정상의 야생형 마우스 및 동형접합성 방해된 M1 엑손 마우스의 FACS 분석을 나타낸다. 아래 두 개의 패널들은 2개의 동형접합성 마우스들을 나타내며, 이는 B220+, CD19+ 세포들, 즉 기능성이 아닌 B 세포들을 나타낸다.
도 1e: 재조합 마우스들로 육종 후 neo의 결실
도 5d의 마우스들을 재조합효소-발현 마우스들을 교배하여 neo 유전자를 결실시킨다. 오른쪽 두 개의 래인들은 부모 동물들에서 neo 유전자에 대한 긴 범위 PCR 산물을 나타내고, 왼쪽방향으로 다음 두 개의 래인들은 neo 결실 및 야생형 대립유전자를 갖는 두 개의 동형접합성 마우스들이다. 왼쪽방향으로 다음 4개의 래인들은 야생형 마우스들인 한편, 가장 왼쪽의 래인은 비활성화된 M1 엑손을 갖는 neo 유전자의 동형접합성 결실을 갖는 마우스를 나타낸다.
도 2: 마우스 Igκ 유전자좌의 맵
이 맵은 IMGT 데이터베이스(http://imgt.cines.f)로부터 복사한 것이다. 단위는 킬로염기(kb)이다. 초록색 사각형들은 Vκ 세그먼트들; 주황색 사각형들은 Jκ 세그먼트들; 청색 사각형들은 불변영역; 흑색 원형 κ-인핸서 및 적색 원형은 K-LCR 서열들이다.
도 3: 마우스 Vκ 넉다운(knock down)
LCR의 결실에 의해 마우스 Igκ 유전자좌를 기능적으로 비활성시키는 도식. lox 네오마이신 내성 유전자 카세트를 ES 세포들 내에서 상동성 재조합에 의해 삽입하여 3'κ-LCR(아래 선)을 치환하였다. cre 재조합효소 (+cre) 처리하여 lox 자리들간의 모든 서열들을 제거하여, κ 유전자좌 내 단일 lox 자리를 남겼다(최상부 선)
도 4: κ 유전자좌를 비활성화하기 위한 마우스 Cκ 삽입
유전자좌(최상부 선)는 도 3과 동일하다. 아래는 염기들 위에 적힌 아미노산 코딩을 갖는 Cκ 엑손(최상부 선 중 청색)의 5' 말단에서의 서열을 나타낸다. 처음 GG 염기쌍은 스플라이싱(splicing) 후 아미노산 R을 코딩하는 스플라이스 수용체에 바로 측면근접한다. 가운데 선은 34개 염기쌍 lox 자리 삽입의 삽입물을 나타내며(청색 및 적색 전환된 반복 서열), 이는 불변영역의 코돈 이용을 프레임 밖으로 하여 다운스트림(downstream) 정지코돈들을 만든다(예로서, 진하게 프린트트한 밑줄친 TGA). 흑색 원은 κ-인핸서이고, 적색 원은 κ-LCR 서열들이다.
도 5: 마우스 Cκ 삽입
유전자좌(최상부 선)는 도 3과 동일하다. 아래는 염기들 위에 적힌 아미노산 코딩을 갖는 Cκ 엑손(최상부 선 중 청색)의 5' 말단에서의 서열을 나타낸다. 처음 GG 염기쌍은 스플라이싱 후 아미노산 R을 코딩하는 스플라이스 수용체에 바로 측면근접한다. 가운데 선은 lox 서열(청색 및 적색 전환된 반복 서열) 및 4개의 정지코돈을 포함하는 46개 염기쌍 삽입물의 삽입을 나타내며, 이 또한 불변영역의 코돈 이용을 프레임 밖으로 하여 다운스트림 정지코돈들을 만든다(예로서, 진하게 프린트한 밑줄친 TGA). 흑색 원은 κ-인핸서이고, 적색 원은 κ-LCR 서열들이다.
도 6a: 마우스 Cκ 불변영역 정지코돈 및 프레임 이동 삽입물
유전자좌(최상단 선)은 도 3과 동일하다. 아래는 염기들 위에 적힌 아미노산 코딩을 갖는 Cκ 엑손(흑색)의 서열을 나타낸다. 가운데 선은 Cκ 코딩 영역의 서열부분을 나타낸다. 그 위의 선은 lox 서열(청색 및 적색의 전환된 반복 서열), 3 개의 정지코돈을 포함하는 44개 염기쌍 삽입물의 삽입을 나타내며, 이 또한 불변영역의 코돈 이용을 프레임 밖으로 하여 다운스트림 정지코돈들을 만든다(예로서, 진하게 프린트트한 밑줄친 TAA). 흑색 원은 κ-인핸서이고, 적색 원은 κ-LCR 서열들이며, 삽입물에 대해 사용된 Hpa I 자리는 적색으로 나타난다.
도 6b: Cκ 불능화를 위한 ES 세포들 내 재조합
겔은 도 13a에 나타낸 ES 세포들 내 Cκ 재조합의 다수의 클론들의 삽입 자리에 대한 PCR 증폭 결과를 나타낸다. 클론들 351 및 623은 양성이며, 배반포들 내로 주입되어 Igκ 음성 마우스들을 생성할 것이다.
도 7: 인간 Igκ 유전자좌
이 맵은 IMGT 데이터베이스(http://imgt.cines.f)로부터 복사한 것이다. 단위는 킬로염기(kb)이다. 초록색 사각형들은 기능성 Vκ 세그먼트들; 적색 및 황색 사각형들은 비-기능성 Vκ 세그먼트들; 주황색 사각형들은 Jκ 세그먼트들; 청색 사각형들은 불변영역들; 흑색 원은 κ-인핸서이고 적색 원은 κ-LCR 서열들이다.
도 8: 유전자이식을 위한 혼성 인간/쥐 Igκ 유전자좌의 생성
유전자좌의 3' 말단은 마우스 κ3' 인핸서(황색)을 포함하는 마우스(황색)으로부터 수득된다. 마우스 불변 코딩 서열들은, 쥐 게놈 DNA(적색)으로부터의 긴 범위 PCR에 의해 수득된 그의 5' 인핸서를 포함하는, 쥐의 서열들로 치환된다. Vκ4-1로부터 인간 Jκ 서열들까지의 인간 세그먼트 다운스트림은 마우스(황색)로부터 수득되어 V와 J 영역들 사이에서 적절한 간격을 유지한다. 인간 Jκ 세그먼트들은 인간 유전자좌의 이 부분(녹색)을 커버하는 PAC로부터 수득된다. 상기 녹색 사각형들은 개별적으로 또는 블럭(block)으로서 부가된 Vκ 세그먼트들(내용 참조). PAC 벡터 내 존재하는 푸로마이신 내성 유전자는 적색이고, 흑색 원은 κ-인핸서이고 적색 원은 κ-LCR 서열들이다.
도 9: VH4 중쇄 유전자좌의 맵
5' 말단에 네오마이신 선발가능한 마커를 포함하는 이 유전자좌가 인간/마우스 혼성 유전자좌의 구축을 위한 출발물질로서 사용된다. 이 유전자좌는 WO2008/035216에서 설명된 것과 같이 구축되었다. 단위는 킬로염기(kb)이다. 이 유전자좌는 4개의 영역들(1-46, 3-53, 3-23, 3-11), 모든 인간 D 세그먼트들, 모든 인간 J 세그먼트들 및 IgG 불변영역들 및 3' 인간 IgH LCR을 포함한다.
도 10: 4 VH 인간/쥐 불변영역 IgH 유전자좌의 생성
VH 인간 유전자좌에 존재하는 CeuI 자리(도 6)를 사용하여, 쥐 게놈 DNA로부터의 PCR에 의해 증폭된 쥐 불변 코딩 및 스위치 영역들을 부가하므로써, 인간/쥐 유전자좌를 생성하였다. 유사하게, 마우스 LCR 영역을 몇 개의 단편들로서 마우스 게놈 DNA로부터 증폭시키며, 상기 단편들은 먼저 함께 클로닝되어 완전한 마우스 IgH LCR을 생성한다. 4개의 VH 세그먼트들, 모든 인간 D 및 모든 인간 J 세그먼트들을 포함하는 인간 VH 유전자좌의 5' 말단(도 6). 모든 인간 서열들은 청색으로, 모든 마우스 서열들은 연녹색으로, 쥐 서열들은 적색으로, 그리고 네오마이신 내성 유전자는 보라색으로 나타내었다.
도 11: λ LCR을 포함하는 Igλ 인핸서들의 결실
인핸서 2-4에 측면근접하는 영역들에 대해 상동성인 서열들에 의해 측면근접되는 하이그로마이신 내성 유전자 및 4-10 인핸서에 측면근접하는 영역들에 대해 상동성인 서열들에 의해 측면근접되는 블라스티딘 S 내성 유전자를 이용하여, 표준 치환 벡터들을 이용하는 동종성 재조합에 의하여, 상기 λ 유전자좌 인핸서들을 제거한다. 치환 결과 인핸서들이 소실한 λ 유전자좌를 수득되며, 이는 감소된 발현을 나타낸다. 하이그로마이신 내성 유전자는 적색으로, 블라스티딘 S 내성 유전자는 주황색으로 나타내었다. 마우스 Vλ 세그먼트들은 녹색으로, J 세그먼트들은 황색을고, 그리고 불변 영역은 청색으로 나타내었다. 맵들은 IGMT 데이타베이스로부터 복사하였다.
도 12: 유전자이식생성(transgenesis)을 위한 인간 쥐 Vκ 유전자좌
유전자좌는 도 8에서와 동일하지만, 부가적인 인간 Vκ 세그먼트들이 상기 유전자좌에 부가되었다. 결과의 유전자좌는 빈번하게 이용되는 인간 Vκ 세그먼트들 및 중간정도로 빈번하게 이용되는 인간 Vκ 세그먼트들을 모두 포함한다. 녹색 원 및 녹색 선은 쥐과의 κ-인핸서 및 인트론; 적색 사각형 및 원은 쥐 κ-불변영역 및 인핸서; 청색 사각형들은 인간 VH 세그먼트들; 암청색은 푸로마이신 선발가능한 마커를 나타낸다.
도 13a: 인간 쥐 혼성 유전자좌의 생성
이 유전자좌는, VH 영역들을 함께, SceI 자리들 사이에 클로닝된 17개의 연속된 인간 VH 영역들의 연쇄체(concatemer)에 결찰시키므로써 생성된다. DH 및 VH 세그먼트들 간에 적절한 간격을 유지하기 위하여, 마우스 스페이서 영역을 모든 인간 DH 및 JH 세그먼트들을 포함하는 인간 40kb 단편에 부가되었다. 이후 SceI 자리를 포함하는 VH6-1 세그먼트를 부가한다. 상기 연쇄체를 그 후 VH6-1 상에 부가한다. 최종적으로, 각종 쥐 불변 영역들 및 쥐과의 LCR을 3'측에 부가한다. 결과의 유전자좌는 빈번하게 및 중간정도로 빈번하게 사용되는 인간 VH 세그먼트들을 모두 포함한다.
도 13b: 인간/쥐 IgH 유전자좌의 출발 구축물
이 겔은 VH6-1의 부가 후 인간 쥐 IgH 유전자좌 구축물의 첫번째 단계들의 결과를 나타낸다. 오른쪽의 래인들은 2개의 클로닝된 플라스미드들의 NotI 분해물을 나타낸다. 래인들(NotI x MluI)은 래인 1의 플라스미드가 벡터 내에서 정확한 배향(orientation)을 갖는다는 것을 나타내는 반면, 래인 2의 플라스미드는 잘못된 배향을 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 래인 1 플라스미드는 유전자좌의 생성의 다음 단계에 사용된다.
도 13c: VH 세그먼트들의 연쇄체
이 겔은 17개의 상이한 VH 영역들의 연쇄체의 XhoI/SalI 분해물을 나타낸다. 마커 래인은 BstEII로 분해시킨 λ 파아지 DNA를 포함한다.
도 14: 유전자이식 인간 쥐 중쇄 면역글로불린 유전자좌
동일한 동물 내로 도입된 2개의 중쇄 유전자좌의 예. 다른 하나에 대조적인 것의 선발은 대립유전자 형질 배제를 통한 것이다. 부가적인 VH 세그먼트들이 상기 유전자좌들 각각에 부가될 수 있다. 다르게는, 부가적인 VH 세그먼트들은 추가의 중쇄 유전자좌들을 이용하여 도입될 수 있다. κ 또는 λ 경쇄 유전자좌들에 따른 다양성을 증가시키는데 동일한 방법이 사용될 수 있음은 명백하다.
도 15: 인간/쥐 λ 유전자이식 경쇄 유전자좌
인간/쥐 유전자좌의 예를 나타내었다. 이의 3' 말단은 마우스 λ 3' LCR(황색)을 포함하는 마우스(황색)으로부터 수득되었다. 마우스 불변 코딩 서열들은, 쥐 게놈 DNA로부터의 긴범위 PCR에 의해 쥐의 서열들(적색)로 치환된다. Vλ2-14로부터 인간 Jκ 서열들까지의 인간 세그먼트 다운스트림을 마우스으로부터 수득하여(황색), V와 J 영역들 간에 적절한 간격을 유지시킨다. 인간 Jλ 세그먼트들은 인간 유전자좌이 이 부분을 망라하는 인간 PAC의 긴범위 PCR에 의하여 수득된다(청색). 청색 사각형은 개별적으로 또는 블럭으로서 부가된 Vκ 세그먼트들이다. PAC 벡터에 존재하는 하이그로마이신 내성 유전자는 보라색으로 나타내었다.
실시예
하기 실시예들에서, 혼성 인간/쥐 중쇄 및 경쇄 유전자좌들을, 통상적인 유전자이식생성 절차인, 수정난들 내 마이크로주사에 의해 도입된 이식유전자들로서 발현하는 유전자이식 마우스들이 생성된다. 난자-공여 마우스들은 내생의 마우스 중쇄 유전자들 및 마우스 경쇄 유전자들의 발현이 없거나 매우 낮도록 변경되었다. 마우스들에는 κ 및 λ 쇄들에 대한, 두 개의 경쇄 유전자좌들이 있으며, 이들 중 λ는 마우스 H2L2 항체들의 약 2%에서만 사용된다. 따라서 실시예들은, IgH 유전자좌 및 비활성화된 내생의 κ 유전자좌만을 갖는 마우스 또는 IgH 및 비활성화된 κ 유전자좌 및 λ 유전자좌의 발현을 더욱 낮추기 위하여 제거된 λ 유전자좌의 조절 서열들을 갖는 마우스들에서의 것들이다. 중쇄 및 경쇄 유전자좌들의 구축물, 항원 도전 후 유전자이식 마우스들의 생성 및 스크리닝을 위해 사용된 방법론은, CH1 도메인이 모든 중쇄 유전자좌에 보유된다는 것을 제외하고는, 본질적으로 이전에 이미 설명되었다(Janssens 등 (2006) PNAS, 10, 103(41), 15130~5, WO2006/008548, WO2007/096779, GB0805281.3 및 GB0805281.3으로부터의 우선권을 주장하여 2008년 6월 11일 출원된 PCT 출원). 쥐는 제외하고, 기능성 이종성 면역글로불린 유전자좌를 발현 및/또는 공학적처리된 내생의 유전자좌들을 갖는, 포유동물들을 포함하는 척추동물들을 유도하는 일반적인 방법들은 WO2006/047367에 설명되어 있다. 하기 실시예들에서, ES 세포들에서의 재조합이 이용되었으며, 변형된 ES 세포들을 이용하여 원하는 성질들을 갖는 마우스들을 생성하였다. 그러나, 유도만능 줄기세포들(induced pluripotent stem cell: iPS 세포들)에서 동일한 절차들을 실시하여, 이후 마우스들을 생성하는데 사용할 수 있다(예로서, Boland, Hazen, Nazor, Rodriguez, Gifford, Martin, Kupriyanov 및 Baldwin (2009), 461, 7260, 91~4 및 이 문헌 내 참고문헌들). 다르게는, 상기 변형들은 체세포들 또는 체세포 줄기세포들에서 실시되고, 이들은 이어서 iPS 세포들 내로 재프로그램되어(reprogrammed) 변형된 마우스들을 생성한다. 또한, 변형된 조혈모세포들을 B 세포들이 결여된 수령 마우스들 내로 이식시켜 인간 또는 인간 혼성 항체들을 생성할 수 있다.
실시예 1
이 실시예에서, IgH 유전자좌(도 IA)는 Kitamura와 Rajewsky에 의해 간행된 것과 유사하지만, 정지 코돈이 Kitamura 등(1991) Nature, 350, 423~426에서 이전에 설명된 아미노산 위치 하나 전에서 Cμ 영역들 내로 도입되는 차이를 갖는 방법에 의해 비활성되었다. ES(또는 iPS) 세포들은, 마우스 IgM 유전자의 제 1막 엑손의 두번째 코돈을 정지코돈으로 변경시키는 구조물로 형질감염되었다. 이는 형질감염을 위해 neo 선발을 포함하는 통상의 절차를 포함한다. 성공적인 재조합을 감독할 수 있기 위하여, SpeI 자리가 재조합 서열들 내에 포함되었다(도 1b). ES 세포들은 이어서, 성공적인 재조합 클론들을 확인하기 위하여 서던 블롯들에 의해 스크리닝되었다. 이는 10 개의 정확한 재조합물들을 결과로서 초래하였다(예로서, 도 1c). 이들 중, 3개를 마우스 배반포들(blastocysts) 내로 주입하여 키메라들을 수득하고, 이어서 이들을 발생시켜(bred) IgH 돌연변이에 대해 동형접합성인 마우스들을 수득하였다. 이들 마우스들의 B 세포들의 FACS 분석(B220 대 CD 19)은 말초혈액에서 B 세포들의 부재를 나타내었다(도 ID). 마우스들을 이어서 재조합효소-발현 마우스들과 교배하여 neo 유전자를 제거하였다(도 IE). 유사하게, 마우스 Igκ 유전자좌(도 2)는 ES 세포들 내 재조합에 의해 비활성화 또는 감소되었다(도 2, 3, 4~6). 결과의 κ 비활성화된 마우스들은 중쇄 KO 마우스들에 대해 교배되었다. 활성의 넉다운은 3'κ 유전자 LCR을 lox 자리들에 의해 측면근접되는 neo 내성 마커로 치환하므로써 달성되었다 (도 3). 상기 neo 유전자는 재조합효소 처리에 의해 선택적으로 제거되었다.
다르게는, κ 대립유전자들은 IgH KO 세포들 내에서 직접적으로 넉아웃될 수 있다. 몇몇 상이한 방법들을 사용하여 κ 비활성화를 달성할 수 있다. κ 유전자의 활성의 차단은, lox 자리에 의해 측면근접되는 neo 유전자를 Cκ의 5' 말단 내로 삽입(도 4)하기 위하여 ES 세포들 또는 iPS 세포들 내 상동성 재조합을 이용하므로써 또는 lox 자리들에 의해 측면근접되는 neo 유전자 및 정지코돈들을 코딩하는 부가적인 서열을 삽입하므로써(도 5 및 6A) 달성될 수 있다. 재조합된 ES 세포들의 cre 처리는 서열을 프레임 외측에 있도록 하거나(도 4) 또는 부가적으로 새로운 정지코돈들을 포함할 것이다(도 5~6A). 도 6b는, 도 6a에나타낸 구축물의 형질감염 후 ES 세포들에서의 재조합 결과를 나타내며, 이는 2개의 ES 세포들에서 비활성화된 하나의 Cκ 대립유전자를 갖는 클론들을 결과로서 초래하였다(이러한 클론들을 총 5개 수득하였다). 세포들을 액틴-유도된(actin-driven) 재조합효소 플라스미드를 이용한 표준 일시(transient) 형질감염에 의해 재조합효소로 처리되어 두 개의 lox 자리들 사이의 영역을 제거하였다. 이어서, 통상의 방법들에 의해 마우스 및 동형접합성 마우스들을 수득하기 위해 육종된 자손을 생성하기 위하여 세포들을 사용하였다. 이러한 마우스들은, 카파 경쇄들을 포함하는 면역글로불린 4량체의 조립물(assembly)이 실질적으로 손상되거나 또는 완전히 차단된 B-세포들을 포함하였다. 다음으로, 인간 Igκ 유전자좌 중 가장 흔히 사용되는 Vκ 유전자들(Ig 데이타베이스를 이용하여 평가함; http://imgt.cines.fr/; 도 7, 8 참조)을, 표준 PCR에 의해 증폭시키고, 이전에 인간 VH 세그먼트들에 대해 설명된 것과 같이, XhoI/SalI 자리들 사이에 서브클로닝시켰다. 이는 Vκ 영역들의 다중결합(multimerisation)을 허용하여, XhoI와 SalI 자리들 사이에 다합체(multimer)를 유지시킨다. 또한, 3'κ 인핸서를 포함하는 마우스 κ 유전자좌의 3' 말단, 및 쥐 불변(Cκ)영역과 쥐 5'인핸서를 함께 클로닝하였다(도 8). 다음으로, 인간 Jκ 영역 및 마우스 Vκ 및 Jκ(도 2) 사이의 영역 (17 kb)을 클로닝하여 Vκ 영역들과 Jκ 사이에 정상의 간격을 유지시켰다. 최종적으로, 통상의 절차들(예로서, Janssens 등 (2006), 상기참조)에 의해, 푸로마이신 선택가능 마커들을 포함하는 PAC(도 8) 내로 인간 Vκ를 삽입하였다.
나타낸 실시예에서, 가장 빈번하게 사용된 Vκ 세그먼트들(4-1, 3-11, 3-15, 3-20 및 1-39)을 다중결합시키고, 인간 J 영역들 및 마우스 인핸서들 및 쥐 Cκ 영역들을 포함하는 PAC 벡터 내로 결찰시켰다. 이는 푸로(puro) 내성 마커 유전자, 인간 Vκ 세그먼트들 및 쥐 불변(Cκ) 영역으로 이루어지는 인간-쥐 혼성 유전자좌를 결과로서 초래하였다(도 8).
또한, 혼성 인간/쥐 IgH 유전자좌를 구축하였다. 출발 물질 면에서 수많은 가능성들이 역시 존재한다. 이 실시예에서는, 출발 물질은 4개의 인간 VH 영역들, 즉 인간 DH 및 JH 세그먼트들 및 2 개의 인간 불변영역 및 인간 LCR 모두를 포함하는 인간 PAC였다(도 9 및 UK 특허출원 제0905023.8호).
상기 UK 특허출원의 PAC는 J 영역 및 불변영역들 사이에 있는 독특한 CeuI 메가뉴클레아제(meganuclease) 자리를 갖는다. 혼성 유전자좌의 용이한 구축을 가능하게 하기 위하여, 이 CeuI 자리를 이용하여 인간 3' 말단 서열을 제거하고, 이들을 쥐 불변 및 스위치 영역들로 치환시켰다(Cμ, Cγ3, Cγ1 및 Cγ2). 이들을 쥐 게놈 DNA로부터의 표준의 긴 범위 PCR(long range PCR)에 의해 증폭시켰다. 마지막으로, 마우스 중쇄 LCR을 부가하였다. 이 조절 서열을 마우스 게놈 DNA로부터 세 부분들로 증폭시키고, 함께 서브클로닝시켜 완전한 LCR을 복구하고, 쥐 불변영역들의 3'쪽에 첨가하였다(도 10). 결과의 혼성 IgH 유전자좌는 이에 따라 neo 선발 마커, 인간 V, D 및 J 영역들 및 마우스 조절 서열들을 갖는 쥐 불변 영역들을 포함한다.
혼성 유전자좌들 삽입물들을 이어서 PAC로부터, 큰 DNA 단편들로서 분리시키고 IgH/Igκ 이형접합성 또는 동형접합성 널(null) 마우스들로부터 유래된 마우스 수정난들 내로 주입하여, 인간/쥐 혼성 IgH 및 Igκ 유전자좌들에 대해 이식유전자성인 마우스들을 생성한다. 이들 모두는 통상의 방법들에 의해 수행되었다(예로서, Janssens 등 (2006), 상기 참조).
이어서, 혼성 IgH 및 혼성 Igκ 유전자이식 마우스들을 육종하여, 내생의 마우스 IgH 및 Igκ 발현에 대해 동형접합성 널(null)이고, 인간/쥐 혼성 IgH 및 Igκ 발현에 대해서는 양성인 마우스들을 수득하였다. 이어서, 이들 마우스들을 통상의 절차들에 의해 면역화하여 항원-특이적 혼성 인간/쥐 H2L2 항체들을 생성하였다. 하이브리도마들을 통한 단일클론성 인간/쥐 Igs를 생성하는 경우, 푸로마이신 및 네오마이신에서의 이중 선발은, IgH 및 Igκ 유전자좌를 모두 포함하는 골수종 융합체들만이 선발되는 것을 보장할 것이다.
당업자는 혼성 이식유전자 마우스들을 생성하기 위하여 이러한 절차에 대한 변형들, 예컨대 상이한 벡터들, 상이한 선발 마커들, 마우스 유전자들을 불활성화하기 위한 상이한 재조합 위치들 또는 혼성 유전자좌들의 현행 (통상의) 클로닝 방법에서의 변형들이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 동일한 절차를 사용하여, 임의의 단일 포유동물 종들로부터 유래된 면역글로불린 DNA을 이용하는 임의의 정상의 또는 혼성 유전자좌, 또는 둘 이상의 종들로부터의 DNA를 이용하여 유래된 혼성 유전자좌들을 생성할 수 있다.
실시예 2
이 실시예는 실시예 1과 동일한 원리이나, IgH/Igκ H2L2 항체들을 수득하는 높은 빈도가 내생의 마우스 Igλ 유전자좌의 발현 빈도 저하에 의해 더욱 증가되었다는 점에서 차이가 있다. 이는 양 Igλ의 조절 영역들을 선발가능한 마커로, 이 경우에서는 하이그로마이신 내성 유전자 및 TK-BSD 유전자로 치환시키므로써 달성될 수 있다(도 11).
후자인 TK-BSD는, 블라스티시딘 S(blasticidin S)에 내성인, 양성 선발을 가능하게 한다(Karreman, (1998) NAR, 26, (10), 2508~2510). 마커들의 이러한 조합은, 조절 영역들을 치환하는 경우, 두 개의 ES 세포 재조합들에서 양성 선발을 가능하게 한다. 재조합은 실시예 1에서 생성된 ES 세포들에서 실시되거나, 또는 다르게는 정상의 ES 세포들에서 유사하게 실시되고, 상기 실시예 1 에서 설명된 마우스 내에서 육종될 수 있다. 결과의 유전자이식 마우스들은 쥐 IgH 및 Igκ 유전자좌들을 포함하고, 내생의 마우스 IgH 및 Igκ에 대해 음성이며(또는 Cκ를 매우 낮은 수준으로 발현), Igλ를 매우 낮운 수준으로 발현한다. 통상적인 방법들에 의한 면역화 및 하이브리도마들의 생성 후, 단지 인간 쥐 혼성 H2L2 항체들만을 발현하는 하이브리도마들이, neo 및 puro (도 8) 선발에 의해 유전자이식 혼성 유전자좌들의 발현에 대해 선발될 수 있다.
실시예 3
실시예 3은 상기 설명된 실시예들과 유사하나, 혼성 Igκ 유전자좌가 덜 빈번하게 사용되는 Vκ 세그먼트들(도 12; Vκ 1-9, 1-33, 2-30, 2-28, 1-27, 1-5)의 부가에 의하여 신장될 수 있다. 다르게는, 돌연변이된/변형된 Vκ 세그먼트들 또는 Vλ 세그먼트들이 추가적으로 부가될 수 있다. 추가의 세그먼트들의 부가는 상기 설명된 동일한 XhoI/SalI 클로닝 전략을 사용하므로써 실시될 수 있다. 이 실시예에서 생성된 마우스들의 면역화는 항원을 이용한 면역화에 반응하여 더욱 큰 복잡성을 허용할 것이다. VL 영역들의 수는 다른 Vκ 세그먼트들의 부가 또는 상기 VL 세그먼트들의 모든 조합들의 이용에 의하여 더욱 변화될 수 있다.
실시예 4
실시예 4는 상기 설명된 실시예들에서의 설명과 유사하지만, 여기에서는 18 VH 세그먼트들(도 13a; 인간 VH 6-1, 1-2, 4-4, 2-5, 3-07, 1-8, 4-39, 3-15, 1- 18, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-34, 3-49, 3-53, 4-59, 1-69) 및 5 개의 쥐 불변 영역들을 이용하므로써 혼성 인간/쥐 IgH 유전자좌가 생성된다. 먼저, 인간 유전자좌의 중심 70kb DJ 영역을 마우스 IgH 인트론으로부터의 8kb으로 5' 말단에서 신장시켜, VH 세그먼트들 및 D 영역간의 적절한 거리를 유지시켰다. 그 후, 인공 SceI 메가뉴클레아제를 이용하여 10kb의 첫번째 VH 영역(6-1)을 마우스 인트론 서열들의 5'말단에서 클로닝하였다(도 10B). 별도의 플라스미드에서, 모든 남아있는 VH 영역을, 상기 설명된 것과 같이 XhoI/SalI VH 세그먼트들에 끼워넣음(slotting)하므로써 함께 클로닝시켰다(도 10C). 이들 유전자좌들에 변형/돌연변이된 VH 세그먼트들 또는 VH 세그먼트들을 부가할 수도 있을 것이다. 또한, CTCF 자리를 포함시킬 수도 있다. 나타낸 실시예에서, 세 개의 이러한 자리들이 사용되었다. 이들은 업스트림 CTCF 자리를 포함하는 VH 영역의 긴 범위 PCR에 의해 수득되었다. 나아가, 도 10의 유전자좌에 대해 비교하여, 쥐 Cα가 부가되었다. 이 실시예에서, 면역화는, 항원을 이용한 면역화에 대하여, 특히 실시예 3과 조합되어, 더욱 큰 복잡성(complexity)을 가능하게 할 수 있다. VH 다합체를 VH6-1DJ 플라스미드 내로 클로닝시키고, 그 후 쥐 불변영역들을 부가하여 유전자좌를 완성시켰다. 이들 실시예들 모두에서, 반응의 복잡성은, 동일한 마우스에 존재하는 부가적인 중쇄 또는 경쇄 유전자이식성 유전자좌들의 일부로서 V 세그먼트들을 부가하여 더욱 향상될 것이다. 모든 유전자좌들은 대립유전자 형질 배제되기때문에(WO2007/096779), 바람직한 재배열만이 항원 도전 이후 생체 내에서 선발되어 B-세포 증가 및 혈청에서의 항체 축적이라는 결과를 초래할 것이다. 도 14는 동일한 동물 내로 도입될 수 있는 2개의 중쇄 유전자좌들의 예를 나타내며, 이들 각각은 대립유전자 형질 배제를 통하여 사용될 것이다. 명백하게, 더욱 많은 VH 세그먼트들이 첨가되거나 (변형된 VH 세그먼트들을 포함), 또는 더욱 많은 유전자좌들이 도입되어 유전자이식 면역 레퍼터리들의 복잡성을 증가시킬 수 있을 것이다. 이 방법은 이들 종들에 대해 특이적인 V 세그먼트들을 사용하여, 다른 종들에 대해 적용될 수도 있다.
실시예 5
이 실시예에서는, 상기 실시예들에서 설명된 인간/쥐 IgH 및/또는 Igκ 유전자좌들을 갖는 마우스들로의 육종을 통하여 인간/쥐 Igλ 유전자좌의 부가에 의해, 인간/쥐 혼성 항체의 다양성(diversity)이 더욱 증가된다. 인간/쥐 혼성 λ 유전자좌는, 상기 실시예들에서 설명된 인간/쥐 Igκ 유전자좌에 대해 설명된 것과 거의 같이 생성된다. 차이점은 Jλ과 Cλ 영역들이 쌍으로 발생하여, 2 개의 쥐 Cλ 영역들이 2 개의 인간 Jλ 영역들 상에 클로닝된다는 사실로부터 유발된다(도 15). Vλ과 Jλ 세그먼트들간의 간격은, 발생되는 정상의 마우스 서열들을 그 위치에서 클로닝하므로써 유지된다(도 11 참조). 이 실시예에서, 2개의 인간 Jλ 및 쥐 Cλ 세그먼트들을 4개의 인간 Vλ 세그먼트들과 함께 사용하였다. 이들은 함께, 인간 Igλ 반응의 80% 초과를 커버하였다. 조절 서열들(LCR, 도 15)은 최적 발현을 보장하기 위하여 마우스로부터 유래되었으며, 선발가능한 마커를 유전자좌의 5' 말단에 부가하였다. 상기 설명된 것과 같이, 유전자좌를 제한 단편으로서 분리시키고, 수정난들 내에 주입하여 이식유전성 λ 유전자좌를 갖는 마우스들을 생성하였다.
이들 모든 실시예들에서, VH, VL, D, J 및 상이한 종들로부터의 불변 영역들이 다른 단일종 항체들 또는 혼성종 항체들을 생성하는데 사용될 수 있다. 일단 항원-특이적 항체가 확인되면, 완전히 통상적인 방법들에 의해, 상기 VHDJ 및 VLJ 영역들이 동일종들 또는 상이한 종들로부터의 다른 불변영역들 상에 클로닝될 수 있음은 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims (38)

  1. 다음 (a), (b), 및 (c)를 포함하는 유전자 이식 마우스로서, 이종성 경쇄 유전자좌는 VL과 J 세크멘트들을 포함하는 인간 가변영역들과 렛(rat) 불변영역들을 포함하고, 이종성 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 V 유전자 세크멘트, 하나 이상의 J 유전자 세크멘트, 그리고 하나 이상의 D 유전자 세크멘트들을 포함하는 인간 가변영역들과 렛 불변영역들 및 설치류 기원의 중쇄 면역글로블린 LCR을 포함하는 유전자 이식 마우스.
    (a) 재배열된 중쇄와 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로불린 4량체들을 형성하는 능력이 제거되도록 돌연변이된 내생의 중쇄 유전자좌와 돌연변이된 내생의 카파 경쇄 유전자좌로서, 상기 돌연변이들은 각각의 유전자좌 내로의 프레임 이동 돌연변이, 폴리펩티드-암호화 서열, 또는 하나 이상의 정지 코돈들의 도입으로 이루어지며, 내생의 중쇄 유전자좌의 돌연변이는 정지 코돈의 도입으로 이루어지는 돌연변이된 내생의 중쇄 유전자좌와 돌연변이된 내생의 카파 경쇄 유전자좌.
    (b) 다음 (i) 또는(ii) 중 적어도 하나의 이식 유전자좌
    (i) 하나 이상의 이종성 카파 경쇄 유전자좌 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함하는 이식 유전자좌 (ii) 하나 이상의 이종성 람다 경쇄 유전자좌 및 연관된 B-세포 특이적 조절 성분들을 포함하는 이식 유전자좌
    (c) 하나 이상의 이종성 중쇄 유전자좌를 포함하는 이식 유전자좌
  2. 제 1항에 있어서, 각각의 이종성 중쇄 유전자좌는 10개 이상의 V 유전자 세크멘트를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  3. 제 2항에 있어서, 각각의 이종성 중쇄 유전자좌는 18개의 V 유전자 세크멘트를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  4. 제 3항에 있어서, 각각의 이종성 중쇄 유전자좌는 5개의 렛 불변영역들과 인간 VH 영역들 6-1, 1-2, 4-4, 2-5, 3-07, 1-8, 4-39, 3-15, 1-18, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-34, 3-49, 3-53, 4-59, 그리고 1-69를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 이종성 카파 경쇄 유전자좌는 인간 J 영역들, 마우스의 인핸서 영역들, 렛의 Cκ 영역들, 그리고 인간 Vκ 세크멘트들 4-1, 3-11, 3-15, 3-20 그리고 1-39를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 이종성 카파 경쇄 유전자좌는 인간 Vκ 세크멘트들 4-1, 3-11, 3-15, 3-20, 1-39, 1-9, 1-33, 2-30, 2-28, 1-27, 그리고 1-5를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 이종성 람다 경쇄 유전자좌는 4 인간 Vλ 세그멘트, 2 렛 Cλ 세그멘트, 2 인간 Jλ 세그멘트를 포함하는 유전자 이식 마우스
  8. 제 1항에 있어서, 상기 이종성 카파 경쇄 유전자 또는 람다 경쇄 유전자좌를 포함하는 이식 유전자좌가 우성 선발 마커 유전자를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 이종성 중쇄 유전자좌를 포함하는 이식 유전자좌가 우성 선발 마커 유전자를 포함하는 유전자 이식 마우스.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 이종성 중쇄 유전자좌 내의 우성 선발 마커가 카파 또는 람다 경쇄 유전자좌 내에 도입되는 우성 선발 마커와 다른, 유전자 이식 마우스.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 정지 코돈이 내생의 중쇄 유전자좌의 Cμ 영역의 C H1도메인에 존재하는 유전자 이식 마우스.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 정지 코돈이 상기 Cμ 영역에서 IgM 유전자의 첫번째 막 엑손의 두번째 코돈에 존재하는 유전자 이식 마우스.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 내생의 카파 경쇄 유전자좌의 돌연변이가 프래임 이동 돌연변이의 도입인 유전자 이식 마우스.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 프래임 이동 돌연변이는 상기 내생의 카파 경쇄 유전자좌의 카파 불변영역에 존재하는 유전자 이식 마우스.
  15. 마우스 전구 세포에서 내생의 중쇄 유전자좌와 내생의 카파 경쇄 유전자좌를 돌연변이시키며, 상기 돌연변이들은 각각의 유전자좌에 프래임 이동 돌연변이, 폴리펩티드-암호화 서열, 또는 하나 이상의 정지 코돈의 도입을 포함하며, 상기 내생의 중쇄 유전자좌의 돌연변이는 정지 코돈의 도입이며;
    상기 돌연변이된 유전자좌들로부터 생산된 재배열된 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 기능성 면역글로블린 4량체들을 생성하는 능력이 제거된 마우스를 상기 전구세포에서 생성하며;
    이종성 하이브리드 인간/렛 중쇄 및 경쇄 유전자좌들을 이식 유전자로서 상기 마우스에서 얻어진 수정란에 마이크로주사로 도입하는;
    것을 포함하는 제 1항 내지 제 14항 중 어느 하나에 따른 유전자 이식 마우스를 생성하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 전구 세포는 마우스 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 다음 단계들을 포함하는 항원-특이적 이종성 단일클론성 항체 제조방법:
    (a) 제 1항 내지 제 14항 중 어느 하나에 따른 유전자 이식 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계;
    (b) 상기 면역화된 유전자 이식 마우스의 B 세포들에서 각각 단일클론성 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 불멸화된 B세포주를 준비하는 단계;
    (c) 상기 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선발하는 단계.
  18. 다음 단계들을 포함하는 하이브리드 항체로부터 항원-특이적 인간 항체 제조방법:
    (a) 제 1항 내지 제 14항 중 어느 하나에 따른 유전자 이식 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계
    (b) 상기 면역화된 유전자 이식 마우스의 B세포들에서 각각 단일클론성 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 불멸화된 B세포주를 준비하는 단계
    (c) 상기 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 적어도 하나의 하이브리도마 또는 불멸화된 B-세포주를 선발하는 단계
    (d) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 VH와 VL 도메인을 클로닝하고 시퀀싱하는 단계
    (e) 인간 불변 이펙터 도메인들을 이용하여, 상기 VH와 VL 결합 도메인 코딩 서열들을 포함하는 선발된 서열들을 재클로닝하는 단계; 및
    (f) 세포 내의 발현 벡터를 사용하여, 인간 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드들을 암호화하는 재클로닝된 서열들을 공동발현시키는 단계.
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