ES2613730T3 - Animales transgénicos no humanos que expresan anticuerpos humanizados y su uso - Google Patents

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Abstract

Un ratón transgénico que comprende: (a) un locus del gen de la cadena pesada endógena mutada y un locus del gen de la cadena ligera kappa endógena mutada con capacidad reducida o eliminada para producir tetrámeros funcionales de inmunoglobulina que comprenden cadenas pesadas y ligeras reordenadas, en donde las mutaciones comprenden la introducción de una mutación de cambio de marco, una secuencia que codifica un polipéptido o uno o más codones de parada en cada locus, en donde la mutación en el locus del gen de la cadena pesada endógena es la introducción de un codón de parada; y (b) (i) un locus transgénico que comprende un locus génico de cadena ligera kappa heteróloga y elementos reguladores específicos de células B asociados; y/o (b) (ii) un locus transgénico que comprende un locus génico de cadena ligera lambda heteróloga y elementos reguladores específicos de células B asociados; y (c) un locus transgénico que comprende uno o más loci genéticos heterólogos de cadena pesada, En donde los loci de cadena ligera heterólogos comprenden regiones variables humanas que comprenden segmentos VL y J y regiones constantes de rata, y en donde los loci de cadena pesada heterólogos comprenden regiones variables humanas que comprenden uno o más segmentos de gen V, uno o más segmentos de gen J y uno o más segmentos de gen D, regiones constantes de rata y un LCR de inmunoglobulina de cadena pesada de origen murino.

Description

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El mamífero no humano puede comprender grupos de transgenes que comprenden diferentes grupos de diferentes loci de genes de cadenas pesadas heterólogo, en donde cada grupo de transgenes comprende un gen marcador selectivo dominante diferente.
Alternativamente, el mamífero no humano puede comprender transgenes que comprenden loci de cadena ligera heteróloga y transgenes que comprenden loci heterólogos de cadena pesada, en donde los transgenes que comprenden loci de cadena ligera heterólogos y transgenes que comprenden loci heterólogos de cadena pesada comprenden cada uno un gen marcador selectivo dominante diferente.
El mamífero no humano es preferiblemente un roedor, tal como un ratón.
También aquí se describe un método para producir un anticuerpo monoclonal heterólogo específico de antígeno que comprende:
(a)
inmunizar a un mamífero transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones precedentes con el antígeno;
(b)
preparar hibridomas o líneas de células B inmortalizadas, cada una de las cuales produce un anticuerpo monoclonal procedente de las células B del mamífero transgénico inmunizado;
(c)
opcionalmente seleccionar al menos un hibridoma o línea de células B inmortalizadas que expresan el anticuerpo heterólogo mediante el uso de los genes marcadores selectivos dominantes presentes en los transgenes que comprenden los loci heterólogos de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina; y
(d)
seleccionar al menos un hibridoma o línea de células B inmortalizadas que produce un anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
Aquí también se describe un método para derivar un anticuerpo de mamífero, preferiblemente humano, a partir de un anticuerpo híbrido que comprende:
(a)
llevar a cabo el procedimiento descrito anteriormente;
(b)
seleccionar al menos un hibridoma o línea de células B inmortalizada que produce un anticuerpo que se une específicamente al antígeno y comprende dominios de unión a VH y VL de la especie de elección;
(c)
clonación y secuenciación de los dominios VH y VL;
(d)
reclonación de secuencias seleccionadas que comprenden las secuencias de codificación del dominio de unión VH y VL con dominios de efectores constantes de elección de las mismas especies; y
(e)
coexpresar las secuencias reclonadas que codifican polipéptidos de cadena pesada y ligera de la especie deseada usando un vector de expresión en un tipo celular de elección.
En la presente memoria también se describe un método para la producción del mamífero no humano como se ha definido anteriormente que comprende la mutación del locus del gen de la cadena pesada endógena, el locus del gen de la cadena ligera kappa endógena y opcionalmente el locus del gen de la cadena ligera lambda endógena en una célula progenitora de mamífero y produciendo un mamífero a partir de dicha célula progenitora, en el que la mutación es tal que, en el mamífero, cada locus puede reordenar de manera que los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina se formen y expresen en células B después de la estimulación con antígeno, pero la capacidad para formar tetrameros de inmunoglobulina funcional que comprende cadenas pesadas y ligeras reordenadas producidas a partir de dichos loci mutados que se ha reducido sustancialmente o se ha eliminado.
Preferiblemente, la célula progenitora es una célula madre embrionaria no humana.
El mamífero no humano es preferiblemente un roedor, tal como un ratón.
También aquí se describe el uso de tetrámeros de inmunoglobulina heterólogos, específicos de antígenos, preferiblemente humanos, derivados usando un mamífero no humano o el método definido anteriormente como medicamentos, diagnósticos o reactivos.
Los presentes inventores han superado sorprendentemente las limitaciones de la técnica anterior, a través del desarrollo de métodos simplificados para la producción de mamíferos no humanos, particularmente ratones, en donde la expresión funcional func-30 de kappa y/o los genes de cadena ligera lambda se han reducido sustancialmente ya sea a través de las regiones constantes que se han hecho no funcionales como resultado de un pequeño evento de inserción preferiblemente en la región constante kappa y/o región constante lambda, dando lugar a un cambio de marco o terminación prematura de traducción de mR-NA o la eliminación de parte o de la totalidad
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introducen como transgenes, comprendiendo cada locus una LCR afín.
Cada locus comprende 5' y 3' elementos reguladores necesarios para dirigir la expresión específica de células B. Cada locus de cadena pesada o ligera se expresa de una manera esencialmente idéntica a los loci endógenos en respuesta a la estimulación con antígeno, lo que conduce a la circulación en suero de ratón de inmunoglobulinas tetraméricas maduras por afinidad, específicas de antígeno, codificadas por transgenes.
Preferiblemente, cada locus del gen de la cadena pesada comprende uno o múltiples segmentos del gen V,
p. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 60 o más segmentos génicos V que pueden derivarse de cualquier especie vertebrada, preferiblemente un mamífero no humano. Preferiblemente, no más de 20 segmentos de genes V están presentes en cualquier locus de cadena pesada única.
En una realización, cada locus puede comprender sólo un segmento de gen V. En una alternativa de esta realización, hay una serie de segmentos de gen V y cada segmento de gen V es diferente de todos los demás segmentos de gen V. En esta realización, los segmentos del gen V en cualquier locus pueden derivarse todos de un organismo de la misma especie, ej. todos los segmentos del gen V pueden ser de origen humano. Alternativamente, los segmentos del gen V en cualquier locus pueden derivarse de organismos de diferentes especies, ej. algunos segmentos del gen V de humanos y otros de ovejas, vacas, conejos, camélidos o incluso tiburones. En una segunda alternativa, cada segmento del gen V es idéntico a todos los otros segmentos del gen V. Independientemente del número y naturaleza de los segmentos del gen V presentes, los segmentos de los genes D y J restantes en cada locus pueden ser iguales o diferentes de los de todos los otros loci.
Por lo tanto, se prevé que el mamífero no humano puede contener múltiples copias de un locus genético de cadena pesada. Esto tiene la ventaja de optimizar las posibilidades de que se produzca un reordenamiento productivo en una célula B, permitiendo así la producción óptima de una cadena pesada de inmunoglobulina para el reconocimiento de antígenos.
En otra realización, cada locus comprende segmentos génicos V múltiples.
Preferiblemente, los segmentos del gen V son de origen humano.
El término "segmento génico V" abarca cualquier segmento génico de V natural derivado de un vertebrado, incluyendo, pero no limitado a, tiburones, roedores, camélidos y humanos. El segmento del gen V debe ser capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y un segmento génico que codifica una región constante (efectora) de la cadena pesada para generar un anticuerpo de cadena pesada de inmunoglobulina capaz de complejarse con ambas cadenas ligeras de inmunoglobulina kappa o lamdba cuando el ácido nucleico reordenado se expresa en las células B.
Una secuencia genética V incluye también dentro de su alcance cualquier secuencia génica que codifique un homólogo natural o modificado, derivado o fragmento de proteína que sea capaz de recombinarse con un segmento génico D, un segmento génico J y un segmento génico que codifique una región constante de cadena pesada para generar una cadena pesada de inmunoglobulina capaz de complejarse con una cadena ligera de inmunoglobulina kappa o lambda cuando el ácido nucleico reordenado se expresa en las células B. Un segmento de gen V puede, por ejemplo, derivarse de un locus de receptor de células T.
Preferiblemente, los múltiples lugares de cadena pesada de la invención comprenden cualquier número o combinación de los 39 segmentos de gen V humanos funcionales y variantes de ingeniería de los mismos. Estos pueden estar en cualquier número de loci, ej. cuatro loci que comprenden ocho segmentos génicos V más un locus que comprende siete segmentos génicos V; Siete loci que comprenden cuatro segmentos génicos V más un locus que comprende tres segmentos génicos V; O treinta y nueve loci que comprenden un segmento del gen V cada uno.
Los genes V humanos se clasifican en siete familias, VH1 a VH7, y los genes individuales dentro de cada familia numerada. La frecuencia a la que se utiliza cada gen depende de los diversos requisitos de la respuesta inmune particular. Por ejemplo, los genes de la familia VH3 pueden usarse preferentemente en comparación con los de la familia VH5 cuando responden a antígenos bacterianos. Por lo tanto, en una realización preferida adicional de la invención, grupos de segmentos de gen V que han demostrado ser útiles para generar una respuesta de anticuerpos contra antígenos específicos se agrupan en loci separados, comprendiendo cada uno un gen marcador selectivo dominante diferente. Los segmentos del gen V pueden agruparse de acuerdo con la familia o pueden agruparse de acuerdo con la función individual. Por ejemplo, si los genes V de la familia VH3 se muestran útiles para generar una respuesta inmunitaria frente a antígenos bacterianos, entonces éstos pueden usarse para generar un locus que es particularmente útil para generar anticuerpos sólo de cadena pesada contra antígenos bacterianos. Alternativamente, si se demuestra que varios genes individuales de las familias VH3 y VH5 son útiles para generar una respuesta inmune contra antígenos bacterianos, entonces éstos pueden agruparse y usarse para generar un locus que es particularmente útil para generar anticuerpos contra antígenos bacterianos.
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