JP7269963B2 - 同じ軽鎖ｉを有する多様な抗体を産生するためのトランスジェニック動物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年６月８日に申請された米国仮出願シリアル番号第６２／６８２，６５１号および２０１８年６月１３日に申請された同第６２／６８４，５２９号の利益を主張し、これらの出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。

従来の抗体は、２つの同一の重鎖から構成されており、それらの各々が共通軽鎖とのヘテロダイマーを形成する。対照的に、二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖を有し得、各対は、異なる抗原に結合する。２つの異なる軽鎖および２つの異なる重鎖のランダムな会合は、構成成分鎖の多くの組み合わせの混合物を産生する。そのため、すべて同じ軽鎖を有する抗体を産生するアプローチが必要である。

いわゆる「共通軽鎖」動物、すなわち、すべて同じ軽鎖を含有する抗体を産生する動物を産生する際の課題のうちの１つは、体細胞超変異がＢ細胞の親和性成熟中に軽鎖可変領域コード配列をしばしば変化させることである。そのため、内因性軽鎖遺伝子座に単一の軽鎖配列を含有するように操作された動物は、依然として多様な軽鎖を有する抗体を産生する。

本開示のある特定の態様は、共通軽鎖を産生するトランスジェニック動物に関し、それを二重特異性抗体の産生に使用する。

本開示は以下の［１］から［２５］を含む。
［１］抗体多様化のために遺伝子変換を使用するトランスジェニック動物であって、
（ａ）軽鎖可変領域をコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子と、
（ｂ）上記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、上記軽鎖可変領域をコードする核酸にヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子と、を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含み、上記偽遺伝子が、上記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、上記偽遺伝子の各々が、上記（ａ）の機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上記軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列をコードしている、トランスジェニック動物。
［２］上記偽遺伝子が、上記軽鎖可変領域をコードする核酸の少なくとも一部と同一であるヌクレオチド配列を含有する、上記［１］に記載のトランスジェニック動物。
［３］上記トランスジェニック動物が、ニワトリである、上記［１］または［２］に記載のトランスジェニック動物。
［４］上記（ａ）の軽鎖可変領域をコードする核酸が、可変（Ｖ）セグメントおよび結合（Ｊ）セグメントを含む、上記［１］～［３］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［５］上記（ａ）の軽鎖可変領域が、ヒト生殖系列軽鎖Ｖセグメントおよびヒト生殖系列軽鎖Ｊセグメントによってコードされている、上記［４］に記載のトランスジェニック動物。
［６］上記（ａ）の軽鎖可変領域の上記Ｖセグメントが、生殖系列軽鎖カッパＶセグメントによってコードされている、上記［５］に記載のトランスジェニック動物。
［７］上記（ａ）の軽鎖可変領域の上記Ｖセグメントが、生殖系列軽鎖ラムダＶセグメントによってコードされている、上記［５］に記載のトランスジェニック動物。
［８］上記偽遺伝子が、上記Ｖセグメントと同じアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている、上記［４］～［７］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［９］上記偽遺伝子が、上記ＶおよびＪセグメントと同じアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている、上記［４］～［７］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１０］上記軽鎖可変領域が、ヒトモノクローナル抗体に由来する、上記［１］～［９］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１１］上記偽遺伝子が、４００ｎｔ未満の長さである、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１２］上記偽遺伝子が、３００～４００ヌクレオチドの長さである、上記［１］～［１１］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１３］最大３０個の上記偽遺伝子が存在する、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１４］上記トランスジェニック動物が、上記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１５］上記トランスジェニック動物が、上記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、上記［１］～［１４］のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
［１６］方法であって、
（ａ）上記［１］～［１５］のいずれかに記載のトランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、
（ｂ）上記動物から、上記抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む、方法。
［１７］上記抗体が、ポリクローナルである、上記［１６］に記載の方法。
［１８］上記抗体が、モノクローナルである、上記［１６］に記載の方法。
［１９］（ｃ）上記トランスジェニック動物のＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、
（ｄ）上記ハイブリドーマをスクリーニングして、上記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを識別することと、をさらに含む、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］（ｃ）ハイブリドーマを作製せずにＢ細胞をスクリーニングして、上記抗原に特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞を識別することをさらに含む、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２１］ＰＣＲを使用して、上記トランスジェニック動物のＢ細胞から少なくとも上記重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、上記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含む、上記［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］上記［１］～［１５］のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生されたポリクローナル抗体であって、上記抗血清中の上記抗体の少なくとも５０％が、実質的に同じ軽鎖配列を有する、ポリクローナル抗体。
［２３］上記［１］～［１５］のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生された、少なくとも１０００個のＢ細胞の集団であって、上記Ｂ細胞の少なくとも５０％が、実質的に同じ軽鎖配列を有する抗体を産生する、集団。
［２４］上記［１］～［１５］のいずれかに記載の動物から単離された、Ｂ細胞。
［２５］上記［１］～［１５］のいずれかに記載の動物によって産生された、モノクローナル抗体。
本開示は、とりわけ、抗体多様化のために遺伝子変換を使用する、動物における軽鎖多様性を低減するための２つの戦略を提供する。免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を変化させることを伴うこれらの戦略は、そのような変化を有さない同等の動物よりも軽鎖の多様性が少ないポリクローナル抗血清を産生する動物を産生するために、代替的にまたは組み合わせて使用され得る。

いくつかの実施形態では、動物は、（ａ）軽鎖可変領域をコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子と、（ｂ）機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、軽鎖可変領域をコードする核酸にヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子と、を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含み得、偽遺伝子は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、（ａ）の機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列をコードしている。

そのような動物のＢ細胞では、軽鎖可変領域コード配列が体細胞超変異によって多様化し得る。しかしながら、これらの実施形態では、偽遺伝子は、遺伝子変換によって変異の多くを修復し、それによって、可変領域のコード配列をオリジナルの形態に戻す必要がある。これらのトランスジーン動物では、偽遺伝子は、本質的に、トランスジェニック動物の配列多様性を減少させているという意味で、通常の役割とは反対の機能を果たしている。野生型動物では、偽遺伝子は、配列多様性を増加させる。

そのような偽遺伝子を有さない同等の動物よりも軽鎖の多様性が少ないそのような動物は、ポリクローナル抗血清を産生する。

代替的にまたは上記に加えて、トランスジェニック動物は、抗体コード配列のタンデムアレイを含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含み得、タンデムアレイ内の核酸の各々は、軽鎖可変ドメインおよび定常領域をコードし、プロモーターに作動可能に連結され、アレイ内の各コード配列は、同じアミノ酸配列をコードしている。したがって、そのような動物で産生される軽鎖は、最初に（すなわち、体細胞超変異の前などに）互いに同一であるいくつかの異なるコード配列によってコードされている。コード配列のタンデムアレイは、そのような動物のＢ細胞における体細胞超変異の影響を弱める。抗体コード配列のタンデムアレイを有さない同等の動物よりも軽鎖の多様性が少ないそのような動物は、ポリクローナル抗血清を産生する。現在の戦略は、産生において、いわゆる「共通軽鎖」を有する抗体の多様な集団、すなわち、すべてが同じか、またはほぼ同じ軽鎖可変領域を有する抗体の多様な集団の使用を見い出し、そのような抗体の軽鎖軽鎖可変領域は、抗体の結合特異性を決定する際に受動的な役割を果たすが、それにもかかわらず、正しい折り畳みおよび分泌のために存在する必要がある。これらの場合、抗体の軽鎖は、トランスジェニック動物を作製する前に事前に選択され得る。例えば、場合によっては、動物は、ヒト生殖系列によってコードされている共通軽鎖可変領域を有する抗体の多様な集団を産生するように操作され得、それによって、少なくとも共通軽鎖可変領域を含有する抗体の軽鎖がヒトに投与される場合、免疫学的に十分に必ず許容されることを確実にする。特に、二重特異性抗体に使用され得るそのような軽鎖は、２つの結合特異性を有する。これらの実施形態では、二重特異性抗体の両方のアームは、同じ軽鎖（すなわち、共通軽鎖）および異なる重鎖（アームの結合特異性を主に決定する）を有する。

当業者は、下記の図面が例示目的のみであることを理解するだろう。図面は、本教示の範囲を限定することを意図するものでは決してない。

（ａ）軽鎖可変領域をコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子（「ｆＶ」）と、（Ｂ）機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子（ｆＶ）に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、軽鎖可変領域をコードする核酸にヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子（Ｐ_１～Ｐ_４）と、を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を概略的に例示し、偽遺伝子は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列をコードしている。 機能的免疫グロブリン軽鎖（ｆＶ）における変異が、遺伝子変換を介して偽遺伝子（Ｐ_１～Ｐ_４）によってどのように修復され得るかを概略的に例示する。 独立して、または軽鎖の多様化が、機能的可変領域（ｆＶ_１～ｆＶ_４）のアレイを使用して低減され得る図１および図２に示される実施形態と組み合わせて用いられ得る代替的な実施形態を概略的に例示する。 ＣｍＬＣ１遺伝子座を例示する。ＣｍＬＣ１遺伝子座には、単一のヒト機能的可変領域がある。機能的ＶＫ領域の上流には、機能的遺伝子のＶＫ領域のＤＮＡ配列と同一である同一の偽遺伝子の６つのコピーがある。また、機能的遺伝子と同一ではない偽遺伝子を含有する対照遺伝子座も示される。 ＣｍＬＣ１遺伝子座がどのように作製されたかを概略的に例示する。 ＣｍＬＣ１／ニワトリＶＨトリが末梢に正常なＢ細胞集団を有することを示すグラフである。 ＣｍＬＣ１／ＳｙｎＶＨ－ＳＤトリが末梢に正常なＢ細胞集団を有することを示すグラフである。 ＣｍＬＣ１を発現するトリにおけるプログラニュリン特異的力価を示す。このデータは、ＣｍＬＣ１を発現するトリがヒトプログラニュリンに対して強力な抗体力価を産生することを示す。 多様化するヒト軽鎖を有するトリで得られた抗体（下のパネル）と比較した、ＣｍＬＣ１から得られた３２個のモノクローナル抗体のグループからのＶＫおよびＶＨ領域の配列（上のパネル）の分析を示す。これは、抗原特異性クローンが軽鎖にほとんどアミノ酸の多様性を有さないことを示す。 表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。このデータは、いくつかのＣｍＬＣ１クローンがナノモル未満のＫ_Ｄでヒトおよびマウスの両方のプログラニュリンに結合することを示す。 ＣｍＬＣ１トリの交差遮断関係およびエピトープビニング分析を示す。このデータは、ＣｍＬＣ１抗体が広いエピトープカバレッジを有することを示す。 ＣｍＬＣ１トリの交差遮断関係およびエピトープビニング分析を示す。このデータは、ＣｍＬＣ１抗体が広いエピトープカバレッジを有することを示す。 ＣｍＬＣ１トリの交差遮断関係およびエピトープビニング分析を示す。このデータは、ＣｍＬＣ１抗体が広いエピトープカバレッジを有することを示す。 ＣｍＬＣ４遺伝子座を例示する。ＣｍＬＣ４遺伝子座には、同一遺伝子の４つのコピーがあり、これらの各々は独自のプロモーター（矢印で示されている）を有し、ヒトＶＫ－ニワトリＣＬ軽鎖をコードしている。 ＣｍＬＣ４遺伝子座がどのように作製されたかを例示する。 ＣｍＬＣ４／ニワトリＶＨトリが末梢に正常なＢ細胞集団を有することを示すグラフである。 ＣｍＬＣ４／ＳｙｎＶＨ－Ｃトリが末梢に正常なＢ細胞集団を有することを示すグラフである。 ＣｍＬＣ４を発現するトリのプログラニュリン特異的力価を示す。このデータは、ＣｍＬＣ４を発現するトリがヒトプログラニュリンに対して強力な抗体力価を産生することを示す。 多様化するヒト軽鎖を有するトリで得られた抗体（下のパネル）と比較した、ＣｍＬＣ４から得られた５６個のモノクローナル抗体のグループからのＶＫおよびＶＨ領域の配列（上のパネル）の分析を示す。これは、ＣｍＬＣ４トリから得られた抗体が、多様化する軽鎖を有するトリと比較して、軽鎖のアミノ酸多様性が低減していることを示す。 ＣｍＬＣ４トリからの５６個のモノクローナル抗体のセットのアミノ酸多様性を示す。配列番号１および２。 ＣｍＬＣ４トリからの５６個のモノクローナル抗体のセットのアミノ酸多様性を示す。配列番号１および２。 表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。このデータは、いくつかのＣｍＬＣ４クローンがナノモル未満のＫ_Ｄでヒトおよびマウスの両方のプログラニュリンに結合することを示す。 ＣｍＬＣ４トリの交差遮断関係およびエピトープビニング分析を示す。このデータは、ＣｍＬＣ４抗体が広いエピトープカバレッジを有することを示す。 ＣｍＬＣ４トリの交差遮断関係およびエピトープビニング分析を示す。このデータは、ＣｍＬＣ４抗体が広いエピトープカバレッジを有することを示す。 ＣｍＬＣ４トリの交差遮断関係およびエピトープビニング分析を示す。このデータは、ＣｍＬＣ４抗体が広いエピトープカバレッジを有することを示す。

定義
「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、および「アッセイする」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書では互換的に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的決定および／または定性的決定の両方を含む。評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、相対的または絶対的であり得る。「～の存在を決定すること」は、存在する何かの量を決定すること、ならびにそれが存在するのかどうかを決定することを含む。

「遺伝子」という用語は、プロモーター領域、コード配列、および３’ＵＴＲから構成される核酸配列を指す。

「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、およびそれらの化学改変を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響を与えられるように、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と作動可能に連結されている。同様に、イントロンがコード配列に作動可能に連結されている場合、イントロンは、ｍＲＮＡからスプライシングされて、コード配列の発現を提供する。「連結されていない」は、会合される遺伝的要素が互いに密接に会合しておらず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。

「ホモ接合性」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。対照的に、「ヘテロ接合性」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。トランスジェニック動物は、トランスジーンについてホモ接合性であるか、または相同染色体上の同じ遺伝子座に対応物がない場合、トランスジーンについてヘミ接合性であり得る。

遺伝子に関する「内因性」という用語は、遺伝子が細胞に固有であること、すなわち、遺伝子が非改変細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に存在することを示す。内因性遺伝子は、野生型細胞のその遺伝子座に存在する野生型遺伝子であり得る（自然界に見られるように）。内因性遺伝子は、ゲノム内に野生型遺伝子と同じ遺伝子座に存在する場合、改変内因性遺伝子であり得る。そのような改変内因性遺伝子の例は、外来核酸が挿入される遺伝子である。内因性遺伝子は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノムなどに存在し得る。

「構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列（複数可）の発現を目的として生成されたか、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸、一般に組換えＤＮＡを指す。構築物は、ベクターまたはゲノムに存在し得る。

「組換え」という用語は、宿主細胞に自然には発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には発生しない方法で一緒に連結された２つ以上の自然に発生する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受け取る場合、その核酸は、細胞に対して「外因性」である。

「選択可能なマーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にすることを可能にする、宿主において発現することができるタンパク質を指す。選択可能なマーカーの例には、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）に対する耐性を付与するタンパク質、宿主細胞に栄養上の利点などの代謝上の利点を付与するタンパク質、ならびに細胞に機能的または表現型の利点（例えば、細胞分裂）を付与するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写および翻訳の両方が含まれる。

細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入する」という用語は、「トランスフェクション」および「形質転換」、ならびに細胞に核酸を導入する他の全ての方法を含み、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、または自律レプリコンに変換されるか、または一過性に発現され得る。

「コード配列」という用語は、転写および翻訳されると、適切な調節要素の制御下に置かれたときに、例えば、インビボでタンパク質を産生する核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、コード配列は、連続的なＯＲＦを有し得るか、またはイントロンもしくは非コード配列の存在によって中断されたＯＲＦを有し得る。この実施形態では、非コード配列は、プレｍＲＮＡからスプライシングされて、成熟ｍＲＮＡを産生する。

ある遺伝子座を別の遺伝子座で置き換えるという文脈での「置き換える」という用語は、単一のステッププロトコルまたは複数のステッププロトコルを指す。

細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組み込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれて、自律レプリコンに変換され得る。

細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組み込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれて、自律レプリコンに変換され得る。

「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、もしくは少なくとも５０，０００、またはそれ以上を指す。ある特定の場合では、複数は、少なくとも１０～５０を含む。他の実施形態では、複数は、少なくとも５０～１，０００であり得る。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞に関してであり、インビトロで培養される細胞を指す。動物が単離された細胞を含有すると記載されている場合、それらの単離された細胞は、インビトロで培養され、次いで動物に移植された。

「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」または「子孫（ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ）」という用語は、特定の動物または細胞に由来し、その子孫であるすべての将来の世代を指す。したがって、子孫、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、世代などがこの定義に含まれるように、任意の連続する世代の動物の子孫が本明細書に含まれる。

「トランスジェニック動物」という句は、外来核酸（すなわち、動物に固有ではない組換え核酸）を含有する細胞を含む動物を指す。外来核酸は、動物のすべての細胞、または動物のすべてではないがいくつかの細胞に存在し得る。外来核酸分子は、「トランスジーン」と呼ばれ、１つ以上の遺伝子、ｃＤＮＡなどを含有し得る。トランスジーンを初期胚からの受精卵母細胞または受精細胞に挿入することによって、結果として生じるトランスジェニック動物は完全にトランスジェニックであり得、安定して外来核酸をその生殖系列に伝達することができる。あるいは、外来核酸は、それを含有する組換え細胞または組織を動物に移入して、例えば、移植して、部分的にトランスジェニック動物を産生することによって導入され得る。あるいは、トランスジェニック動物は、遺伝子改変された体細胞からの核の移入によって、または胚性幹細胞もしくは始原生殖細胞などの遺伝子改変された多能性細胞の移入によって産生され得る。キメラ動物は、生殖系列内の別の動物によって供与された細胞を有し得、その場合、動物の子孫は、供与された細胞内の染色体に対してヘテロ接合性であり得る。供与された細胞が外因性核酸（すなわち、細胞に内因性ではない核酸）を含有する場合、キメラ動物の子孫は、「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸（すなわち、動物に固有ではない組換え核酸）を含有する細胞からなる動物である。外来核酸分子は、本明細書では「トランスジーン」と呼ばれ得る。

「ハイブリッド動物」、「トランスジェニックハイブリッド動物」などの句は、本明細書では互換的に使用されて、ある特定の特質を有する第１の動物とある特定の特質を有する第２の動物との交配から得られた動物を意味する。例えば、本開示のハイブリッド動物は、共通軽鎖を産生する第１のトランスジェニック動物と、合成重鎖を産生する第２のトランスジェニック動物との交配から得られたトランスジェニック子孫を指し得る。ハイブリッド動物は、免疫化され、抗原特異性抗体の産生源として使用され得る。

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は当業者に十分に理解されており、抗原に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。抗体の一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、各対が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する２対の同一の抗体鎖からなる。各対では、軽鎖および重鎖可変領域は一緒に抗原への結合に関与し、定常領域は抗体のエフェクター機能に関与する。

認識されている免疫グロブリンのポリペプチドには、カッパおよびラムダの軽鎖、ならびにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミューの重鎖、または他の種における等価物が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸の）は、ＮＨ２末端における約１１０アミノ酸の可変領域、およびＣＯＯＨ末端におけるカッパまたはラムダの定常領域を含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸の）は、同様に可変領域（約１１６アミノ酸の）および前述の重鎖定常領域うちの１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸の）を含む。

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、抗原への特異的な結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質などを用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むが、これらに限定されない固体支持体に結合され得る。この用語には、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体もまた包含される。

抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｅｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７，１７（１）：１０５－１１１）および単鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８，８５（１６）：５８７９－５８８３およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８，２４２（４８７７）：４２３－４２６、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる）。（一般に、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．１９８４およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８６，３２３（６０８３）：１５－１６を参照されたい）を含む様々な他の形態で存在し得る。

「キメラ抗体」は、抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作することによって、異なる種に属している抗体可変および定常領域遺伝子から構築されている抗体を指す。例えば、ニワトリまたはウサギモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントは、ガンマ１およびガンマ３などのヒト定常セグメントに結合され得る。療法用キメラ抗体の例は、ニワトリまたはウサギ抗体からの可変または抗原結合ドメイン、およびヒト抗体からの定常またはエフェクタードメインから構成されているハイブリッドタンパク質であるが（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポジットアクセッション番号ＣＲＬ９６８８の細胞によって作製された抗Ｔａｃキメラ抗体）、他の哺乳動物種も使用され得る。

「偽遺伝子」という用語は、開始および／または停止コドンを含有する場合も含まない場合もあるオープンリーディングフレームを含有する非転写核酸領域を説明するために使用される。アミノ酸配列は、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列をインシリコで翻訳して、アミノ酸配列を産生することができるという意味で、偽遺伝子によって「コード」され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の文脈では、偽遺伝子は、プロモーター領域、組換えシグナル配列、またはリーダー配列を含有しない。

「上流」および「下流」という用語は、転写の方向に関して使用される。

「特異的な結合」という用語は、異なる検体の均質な混合物中に存在する特定の検体に優先的に結合する抗体の能力を指す。ある特定の実施形態では、特異的な結合の相互作用によって、試料中の望ましい検体と望ましくない検体とが区別され、いくつかの実施形態では、約１０～１００倍またはそれ以上を超えて（例えば、約１０００～１０，０００倍を超えて）区別するであろう。

ある特定の実施形態では、抗体／検体の複合体において特異的に結合する場合、抗体と検体との間の親和性は、１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、^{１０－１０}Ｍ、１０^－１１Ｍ未満、または約１０^－１２Ｍ未満のＫＤ（解離定数）を特徴とする。

重抗体鎖または軽抗体鎖の「可変領域」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤ３、およびフレームワーク領域（ＣＤＲは、「相補性決定領域」を指す）を含有する鎖のＮ末端成熟ドメインである。抗体の重鎖および軽鎖の両方が、可変ドメインを含有する。すべてのドメイン、ＣＤＲ、および残基番号は、配列アラインメントおよび構造知識に基づいて割り当てられる。フレームワークおよびＣＤＲ残基の識別および番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２７８（２）：４５７－４７９）によって記載されている通りである。

ＶＨは、抗体重鎖の可変ドメインである。ＶＬは、抗体軽鎖の可変ドメインである。

「遺伝子」および「遺伝子座」という用語は、本明細書では互換的に使用される。どちらの用語も、遺伝子が活性転写されている、または無傷であることを意味しない。どちらの用語も、不活性化された遺伝子を包含する。

本明細書で使用される場合、「キメラ」ニワトリは、少なくとも２つの供給源からのかなりの数の遺伝的に異なる細胞を含有するニワトリである。キメラ動物は、ある動物からの細胞を別の動物の胚に移植することによって、または培養細胞（例えば、改変されたゲノムを有する）を胚に移植することによって作製され得る。移植された細胞は、宿主胚に組み込まれる前に培養物から収集され得る。胚は動物に成長し、結果として生じる動物は、宿主からの細胞、ならびに移植された細胞を含有し得る。供与された細胞が外因性核酸（すなわち、細胞に内因性ではない核酸）を含有する場合、キメラ動物の子孫は、「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸（すなわち、動物に固有ではない組換え核酸）を含有する細胞からなる動物である。外来核酸分子は、本明細書では「トランスジーン」と呼ばれ得る。

「不活性化」という用語は、遺伝子によってコードされたタンパク質が発現されないという意味で発現されない遺伝子を示すことを意図する。遺伝子は、遺伝子のコード配列および／または調節配列の一部を除去することによって不活性化され得る。破壊された、例えば、「ノックアウト」遺伝子は、不活性化遺伝子の一種である。発現されたヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられている発現された内因性配列を含有したことのある遺伝子座は、不活性化された内因性遺伝子を含有する。そのため、発現されたヒト免疫グロブリン配列を含有する遺伝子座は、内因性免疫グロブリン遺伝子がヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられた場合、不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有し得る。多くの場合、これは、内因性配列をノックアウトし（例えば、配列の少なくとも一部を削除することによって）、次いで、内因性配列によって占められていたことのある位置にヒト免疫グロブリン配列を挿入することによって行うことができる。

「組換え」という用語は、宿主細胞に自然には発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には発生しない方法で一緒に連結された２つ以上の自然に発生する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受け取る場合、その核酸は、細胞に対して「外因性」である。

「遺伝的に連結された」という用語は、減数分裂中に遺伝的要素が一緒に遺伝する傾向があるように、同じ染色体上に存在する２つの遺伝的要素を指す（すなわち、要素は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満の組換え頻度を有する）。互いに密接に連結している２つの遺伝的要素は、染色体の乗換え事象（または「組換え」）中に異なる染色分体に分離される可能性が低くなる。組換え中に２つの遺伝的に連結された要素が分離される可能性は、２つの要素間の配列の量に依存し、「組換え頻度」と呼ばれる可能性のパーセンテージに計算され得る。

本明細書で使用される場合、「共通軽鎖」または「共通免疫グロブリン軽鎖」という用語は、複数の重鎖可変領域と対になって、異なる抗原に結合する抗体を産生することができる軽鎖可変領域を指す。共通軽鎖は抗原結合の受動的パートナーであり、抗原結合は重鎖によって決定される。例えば、二重特異性抗体は、２つの結合特異性を有し、場合によっては、二重特異性抗体の両アームは、同じ軽鎖（すなわち、「共通」軽鎖）および異なる重鎖（主にアームの結合特異性を決定する）を有する。

本開示の共通軽鎖は、「事前に再配置された軽鎖可変領域」（または「事前に再配置された可変領域」）を含み、軽鎖可変領域は、定義された配列を有し、複数の重鎖可変領域とうまく対になって、異なる特異性の抗体を産生することを可能にする特性について選択されている。本開示の「共通軽鎖トランスジーン」は、１つの長いオープンリーディングフレームにおいて共通軽鎖コード配列（または事前に再配置された軽鎖可変領域）および軽鎖定常領域を少なくとも含むトランスジーンであり得る。このトランスジーンは、ｃＤＮＡであり得る。

本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、その領域が細胞によって転写および翻訳されることを意味することを意図している。

本明細書で使用される場合、「多様性が低い」、「多様性が少ない」、「多様化が低減されている」という用語、およびそれらの同義語は、動物を免疫化するために使用される抗原に特異的である、動物によって産生された抗体の少なくとも５０％の軽鎖可変領域（すなわち、異なる配列を有する抗原特異性抗体の大部分、例えば、抗原特異性抗体の少なくとも８０％または少なくとも９０％）が、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同一であるアミノ酸配列、または最大５つのアミノ酸置換（１、２、３、４、または５つの置換）を有するその配列の改変バージョンのいずれかを有することを意味することを意図している。例えば、動物によって産生された抗体のいくつかの軽鎖可変領域は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同じであるアミノ酸配列を有し、いくつかは、１つのアミノ酸置換を除いて機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同一であるアミノ酸配列を有し、いくつかは、２つのアミノ酸置換を除いて機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同一であるアミノ酸配列を有し、いくつかは、３つのアミノ酸置換を除いて機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同一であるアミノ酸配列を有し、いくつかは、４つのアミノ酸置換を除いて機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同一であるアミノ酸配列を有し、いくつかは、５つのアミノ酸置換を除いて機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同一であるアミノ酸配列を有し、最大５つのアミノ酸置換を除いて機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子によってコードされている可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体の総数は、動物によって産生された異なる抗原特異性抗体の大部分を表す（抗原特異性抗体の少なくとも５０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）。残りの抗体（すなわち、６つ以上、７つ以上、または８つ以上のアミノ酸置換を含有するものは少数派である）。

さらなる定義は、本開示の他の場所で見ることができる。

典型的な実施形態の説明
本主題発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で言及された全ての公開物は、それらの公開物が引用されることに関して方法かつ／または材料を開示および説明するために参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含み、「１つの候補薬剤（ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の候補薬剤および当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して、「唯一」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞として役割を果たすことを意図している。

本明細書に論じられる公開物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書内のいずれのものも、先行の発明という理由によってそのような公開物に先立する権利がないという了解として解釈されるべきではない。さらに、提示された公開日は実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。

本明細書に引用されるすべての公開物および特許は、それぞれ個々の公開物または特許が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、公開物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の公開物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明のためにその公開物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提示された公開日は実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載され例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。

上記のように、トランスジェニック動物が提供される。ある特定の実施形態では、動物は、比較的少数の軽鎖遺伝子を有する任意の非ヒト動物、またはそれらの一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる動物であり得、そのため、動物は、様々な任意の異なる動物であり得る。一実施形態では、動物は、トリ、例えば、ニワトリまたはシチメンチョウなどのキジ目のメンバー、あるいはアヒルまたはガチョウなどのガンカモ目のメンバー、あるいは哺乳動物、例えば、ウサギなどのラガモルフ、またはウシ、ヒツジ、ブタ、もしくはヤギなどの家畜であり得る。

本開示のいくつかは、１つ以上のトランスジーンを含有するトランスジェニックニワトリに関する。多くの動物の免疫グロブリン遺伝子座のヌクレオチド配列が知られており、同じく、そのような動物のゲノムを改変するための方法も知られているため、下記の一般的な概念は、任意の好適な動物、特に一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる動物に容易に適合され得る。転写された免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子の可変領域と、異なる可変領域を含有する作動可能に連結された（上流の）偽遺伝子との間の遺伝子変換による抗体多様性の生成は、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ（Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９９８ １７：４３－７０）、Ｂｕｃｃｈｉｎｉ（Ｎａｔｕｒｅ１９８７ ３２６：４０９－１１）、Ｋｎｉｇｈｔ（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４ ５６：１７９－２１８）、Ｌａｎｇｍａｎ（Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３ １４４：４２２－４６）、Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ １５：１８５－２０６）、Ｒｅｙｎａｕｄ（Ｃｅｌｌ１９８９ ５９：１７１－８３）、およびＲａｔｃｌｉｆｆｅ（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ ３０：１０１－１１８）などの様々な公開物に記載されている。ＵＳ２０１１／００５５９３８も参照されたい。

本明細書で提供されるのは、とりわけ、（ａ）軽鎖可変領域（すなわち、「機能的Ｖ領域」）をコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子と、（ｂ）機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、軽鎖可変領域をコードする核酸にヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子と、を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含む、抗体多様化のために遺伝子変換を使用するトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックニワトリ）であり、偽遺伝子は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、（ａ）の機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列をコードしている。言い換えれば、機能的遺伝子および偽遺伝子によってコードされている配列は同じであるため、機能的遺伝子によってコードされている可変領域の任意の変異は、遺伝子変換を介して偽遺伝子によって修復され得る。いくつかの実施形態では、偽遺伝子は、機能的遺伝子における軽鎖可変領域をコードする核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも５０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）と同一またはほぼ同一であるヌクレオチド配列を含有し得る。しかしながら、遺伝コードの縮退によって、同じアミノ酸配列を異なるヌクレオチド配列でコードすることができる。そのため、いくつかの実施形態では、偽遺伝子は、機能的遺伝子における軽鎖可変領域をコードする核酸の少なくとも一部とほぼ同一であるヌクレオチド配列を含有し得る。これらの実施形態では、配列によってコードされているアミノ酸配列は同じでなければならず、それらの配列同一性は、遺伝子変換が発生するのに十分でなければならない。これらの実施形態では、偽遺伝子のヌクレオチド配列は、機能的遺伝子の可変領域のコード配列と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一）でなければならない。この実施形態は、図１に例示される。図２は、機能的Ｖ領域の変異が、遺伝子変換を介して偽遺伝子によってどのように修復され得るかを例示する。

いくつかの実施形態では、（ａ）の軽鎖可変領域をコードする核酸は、可変（Ｖ）セグメントおよび結合（Ｊ）セグメントを含み得る。これらの実施形態では、（ａ）の軽鎖可変領域は、ヒト生殖系列軽鎖Ｖセグメントおよびヒト生殖系列軽鎖Ｊセグメントによってコードされ得る。言い換えれば、ＶおよびＪセグメントによってコードされた配列は、ヒト生殖系列配列でなければならない。これらの実施形態では、（ａ）の軽鎖可変領域のＶセグメントは、生殖系列軽鎖カッパＶセグメントまたは生殖系列軽鎖ラムダＶセグメントによってコードされ得る。これらの実施形態では、偽遺伝子は、Ｖセグメントと同じアミノ酸配列の少なくとも一部をコードし得る。場合によっては、偽遺伝子は、ＶおよびＪセグメントと同じアミノ酸配列の少なくとも一部をコードし得る。軽鎖可変領域は、ヒトモノクローナル抗体に由来し得る。図１および２に示されるように、Ｃ領域は、別々のエクソンによってコードされ得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、軽鎖Ｃ領域は、ＶおよびＪセグメントと同じオープンリーディングフレーム内にあり得る。

いくつかの実施形態では、偽遺伝子は、４００ｎｔ未満の長さ、例えば、２００～４００ヌクレオチドの長さまたは３００～４００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、最大３０個、例えば、最大２０個または最大１０個の偽遺伝子が存在する。

トランスジェニック動物は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。

（ａ）トランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、（ｂ）動物から、抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む方法が提供される。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｃ）トランスジェニック動物のＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、（ｄ）ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを識別することと、をさらに含む。あるいは、Ｂ細胞は、ハイブリドーマを作製せずにスクリーニングされ得る。本方法は、ＰＣＲを使用して、トランスジェニック動物のＢ細胞から少なくとも重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含み得る。軽鎖配列はすでにわかっているはずであり、配列決定する必要はない。

トランスジェニック動物によって産生されたポリクローナル抗体も提供され、抗血清中の抗体の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）は、実質的に同じ軽鎖配列を有する（例えば、機能的Ｖ領域コード配列と比較して、互いに少なくとも９０％、少なくとも９５、もしくは少なくとも９８％であるか、または最大５（すなわち、０、１、２、３、４、または５）つのアミノ酸置換を含有する軽鎖可変ドメイン）。トランスジェニック動物によって産生された少なくとも１００個のＢ細胞（例えば、１，０００個、１０，０００個、または１００，０００個のＢ細胞）の集団も提供され、Ｂ細胞は、異なるエピトープに結合する抗体を産生し、Ｂ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）によって産生される軽鎖は、実質的に同じ軽鎖配列を有する（例えば、機能的Ｖ領域コード配列と比較して、互いに少なくとも９０％、少なくとも９５、もしくは少なくとも９８％であるか、または最大５（すなわち、０、１、２、３、４、または５）つのアミノ酸置換を含有する軽鎖可変ドメイン）。

動物の重鎖遺伝子座は野生型である可能性があるか、または改変されている可能性がある。いくつかの実施形態では、重鎖遺伝子座は、ヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列から構成される重鎖を産生し得る（例えば、参照によって組み込まれる２０１８年２０１９年３月５日に申請されたＰＣＴ／ＵＳ１９／２０７９９を参照されたい）。例えば、重鎖遺伝子座は、機能的ヒトＶＨ配列およびＶＨ偽遺伝子を含有し得、ＶＨ偽遺伝子は、遺伝子変換を介して機能的ヒトＶＨ配列を多様化する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、ａ）ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ならびにｉｉ）重鎖フレームワークを含む重鎖可変領域をコードする核酸を含む機能的ＩｇＨ遺伝子と、ｂ）ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ならびにｉｉ）アミノ酸配列においてａ）の重鎖フレームワークと同一である重鎖フレームワーク領域を各々が含む重鎖可変領域をコードする複数の偽遺伝子と、を含む「合成」免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座（「ＳｙｎＶ」）をさらに含むゲノムを有し得、（ｉｉ）組換えＩｇＨ遺伝子座は、作動可能な連結において、イントロン領域、定常ドメイン領域をコードする領域、および３’非翻訳領域を含み、イントロン領域の少なくとも一部が、トランスジェニック動物のゲノムに対して内因性であり、ａ）の核酸およびｂ）の偽遺伝子は、トランスジェニック動物のゲノムに対して外因性であり、複数の偽遺伝子は、機能的ＩｇＨ遺伝子に作動可能に連結され、トランスジェニック動物における遺伝子変換によってａ）の核酸にヌクレオチド配列を供与し、トランスジェニック動物は、多様な形態の機能的ＩｇＨ可変領域を含む組換え免疫グロブリンを発現する。動物は、改変された重鎖遺伝子座についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。

いくつかの実施形態では、機能的Ｖ領域のコード配列は、事前に再配置された可変領域またはｃＤＮＡを含む免疫グロブリン軽鎖をコードし得る。

図に示されるように、軽鎖遺伝子座は、発現されて（すなわち、転写されて、その後翻訳されるｍＲＮＡを産生する）、抗体の軽鎖を産生し、機能的軽鎖遺伝子（この場合、これはニワトリであり、他の多くの種がそのすぐ上流にある）に作動可能に連結されている機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子と、複数の異なる偽遺伝子軽鎖可変領域と、を含み、偽遺伝子の可変領域は、機能的免疫グロブリン軽鎖に作動可能に連結されており、それらは、遺伝子変換によって機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の配列を変更する（すなわち、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域の配列を偽遺伝子可変領域の配列で置換することによって）。トランスジェニック動物では、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域と偽遺伝子可変領域との間の遺伝子変換は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域の配列を、可変領域の全長までわずか単一のコドンだけ変更する。ある特定の場合では、偽遺伝子可変領域は、偽遺伝子可変領域から少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）の配列を機能的遺伝子の可変領域に供与し得る。したがって、トランスジェニック動物によって産生された抗体の軽鎖は、偽遺伝子可変領域から機能的軽鎖遺伝子の可変領域に供与される任意の配列によってコードされている。偽遺伝子によってコードされている可変領域は互いに同じであり、機能的軽鎖遺伝子の可変領域と同じであるため、遺伝子変換は、例えば、親和性成熟中にＢ細胞で行われる変異の多くを修復する。

同様に、トランスジェニック動物はまた、転写および翻訳されて抗体の重鎖を産生し、機能的重鎖遺伝子に（例えば、そのすぐ上流で）作動可能に連結された機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、複数の異なる偽遺伝子重鎖可変領域と、を含有し、偽遺伝子の可変領域は、機能的免疫グロブリン軽鎖に作動可能に連結されており、それらは、遺伝子変換によって機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の配列を変更する。トランスジェニック動物では、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域と偽遺伝子可変領域との間の遺伝子変換は、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域の配列を、可変領域の全長までわずか単一のコドンだけ変更する。ある特定の場合では、偽遺伝子可変領域は、偽遺伝子可変領域から少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）の配列を機能的遺伝子の可変領域に供与し得る。したがって、トランスジェニック動物によって産生された抗体の重鎖は、偽遺伝子可変領域から機能的重鎖遺伝子の可変領域に供与される任意の配列によってコードされている。

したがって、トランスジェニック動物によって産生された抗体は、偽遺伝子可変領域から機能的遺伝子の可変領域に供与される任意の配列によってコードされている。異なる配列が動物の異なる細胞に供与されるため、動物の抗体レパートリーは、どの配列が偽遺伝子可変領域から機能的遺伝子の可変領域に供与されるかによって決定される。

特定の実施形態では、軽鎖生殖系列配列は、Ａ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０、Ａ２３、Ａ２６、Ａ２７、Ａ３、Ａ３０、Ａ５、Ａ７、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ１、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ９、Ｏ１、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１４、Ｏ１８、Ｏ２、Ｏ４、およびＯ８を含むが、これらに限定されないヒトＶＫ配列から選択される。ある特定の実施形態では、軽鎖ヒト生殖系列フレームワークは、Ｖ１～１１、Ｖ１～１３、Ｖ１～１６、Ｖ１～１７、Ｖ１～１８、Ｖ１～１９、Ｖ１～２、Ｖ１～２０、Ｖ１～２２、Ｖ１～３、Ｖ１～４、Ｖ１～５、Ｖ１～７、Ｖ１～９、Ｖ２～１、Ｖ２～１１、Ｖ２～１３、Ｖ２～１４、Ｖ２～１５、Ｖ２～１７、Ｖ２～１９、Ｖ２～６、Ｖ２～７、Ｖ２～８、Ｖ３～２、Ｖ３～３、Ｖ３～４、Ｖ４～１、Ｖ４～２、Ｖ４～３、Ｖ４～４、Ｖ４～６、Ｖ５～１、Ｖ５～２、Ｖ５～４、およびＶ５～６から選択される。異なる生殖系列配列の説明については、ＰＣＴ ＷＯ２００５／００５６０４を参照されたい。

いくつかの実施形態では、導入された転写可変領域のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列はヒトであり得、すなわち、ヒト抗体のヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列、または生殖系列配列を含有し得る。これらの実施形態では、ＣＤＲおよびフレームワークの両方がヒトであり得る。他の実施形態では、導入された転写可変領域のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列はヒトではなく、代わりに、ヒト配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％以上同一であり得る。例えば、ヒト配列と比較して、導入された転写可変領域は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸置換を含有し得る。

特定の実施形態では、定常ドメインをコードする領域を含む軽鎖遺伝子座の一部、イントロンの一部、および機能的遺伝子の３’ＵＴＲは、動物に対して内因性であり得、機能的遺伝子の可変領域を含む軽鎖遺伝子座の残り、イントロンの残り、および偽遺伝子は、動物に対して外因性であり得、すなわち、組換え的に作製され、機能的軽鎖遺伝子が産生され、偽遺伝子が遺伝子変換によって機能的軽鎖遺伝子に配列を供与することができるような方法で定常ドメイン、部分イントロン、および３’ＵＴＲの近位で動物に導入され得る。ある特定の場合では、動物の軽鎖遺伝子座は、作動可能な連結において、イントロン領域と、定常ドメインをコードする領域と、３’非翻訳領域と（イントロン領域、定常ドメインをコードする領域、および３’非翻訳領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して内因性である）、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域と、を含有し得、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して外因性である。定常ドメインをコードする領域は、ヒトであり得るか、またはそれは、トランスジェニック動物のゲノムに対して外因性であり得る。他の実施形態では、定常領域は、機能的遺伝子のオープンリーディングフレームにコードされ得る。

同様に、定常領域を含む重鎖遺伝子座の一部、イントロン領域の一部、および３’ＵＴＲは、動物に対して内因性であり得、機能的遺伝子の可変ドメインを含む重鎖遺伝子座の残り、イントロンの残り、および偽遺伝子は、動物に対して外因性であり得、すなわち、組換え的に作製され、機能的遺伝子が産生され、偽遺伝子が遺伝子変換によって機能的遺伝子に配列を供与することができるような方法で定常ドメイン、部分イントロン、および３’ＵＴＲの近位で動物に導入され得る。ある特定の場合では、動物の重鎖遺伝子座は、作動可能な連結において、イントロン領域と、定常ドメインをコードする領域と、３’非翻訳領域と（イントロン領域、定常ドメインをコードする領域、および３’非翻訳領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して内因性である）、複数の偽遺伝子重鎖可変領域とを含有し得、複数の偽遺伝子重鎖可変領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して外因性である。

ある特定の実施形態では、対象のトランスジェニック動物によって産生された抗体は、内因性定常ドメインおよび動物に対して外因性である可変ドメインを含有し得る。これらの実施形態では内因性定常領域が用いられ得るため、抗体は依然としてクラススイッチおよび親和性成熟を受け得、これによって動物は、正常な免疫系の発達を受け、正常な免疫応答を開始することができる。特定の実施形態では、トランスジェニックニワトリは、ＩｇＭ、ＩｇＹ、およびＩｇＡをコードする重鎖遺伝子座に３つの内因性定常領域を有する。Ｂ細胞の発達の初期段階では、Ｂ細胞は、ＩｇＭを発現する。親和性成熟が進むにつれて、クラススイッチは、定常領域をＩｇＹまたはＩｇＡに変換する。ＩｇＹは、卵黄に沈着した予備を介して約２００ｍｇのＩｇＹを受け取る成体および初生ヒヨコの両方に体液性免疫を提供する。ＩｇＡは、主にリンパ組織（例えば、脾臓、パイエル板、およびハーダー腺）および卵管に見られる。他の実施形態では、定常領域は、ヒト定常領域であり得る。

軽鎖および／または重鎖遺伝子座に存在する導入された偽遺伝子可変領域の数は変動し得、特定の実施形態では、１～５０個、例えば、２～５０個、または１０～２５個の範囲であり得る。特定の実施形態では、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域のうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個以上）は、転写された軽鎖可変領域に対して逆配向であり得る。同様に、特定の実施形態では、複数の偽遺伝子重鎖可変領域のうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個以上）は、重鎖の転写された可変領域に対して逆配向であり得る。特定の実施形態では、複数の偽遺伝子可変領域は交互の配向ではなく、ある特定の場合には、転写された可変領域に対して反対配向である一連の少なくとも５個または少なくとも１０個の隣接する偽遺伝子領域を含有し得る。一実施形態では、転写された可変領域から最も遠位にある偽遺伝子領域は、転写された可変領域と同じ配向にあり、最も遠位の領域と転写された可変領域との間の偽遺伝子領域は、転写可変領域に対して逆配向にある。

偽遺伝子は、典型的には、転写領域の配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも３００の連続するヌクレオチドの配列を含有する。

代替の実施形態
代替の実施形態は、抗体コード配列のタンデムアレイを含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含む、抗体多様化のために遺伝子変換を使用するトランスジェニック動物を提供し、タンデムアレイ内の核酸の各々は、軽鎖可変ドメインおよび定常領域をコードし、プロモーターに作動可能に連結され、アレイ内の各コード配列は、同じアミノ酸配列をコードしている。この実施形態は、図３に概略的に例示される。任意の実施形態では、少なくとも２（例えば、少なくとも３、４、５、例えば、５～３０）つのコード配列があり得る。任意の実施形態では、コード配列は、事前に配置されたＶセグメント、Ｊセグメント、およびＣ領域を含み得る。これらの実施形態では、事前に配置されたＶセグメント、Ｊセグメント、およびＣ領域はすべて、ヒト生殖系列抗体配列をコードし得る。任意の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトモノクローナル抗体に由来し得る。任意の実施形態では、遺伝子座は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、抗体コード配列のタンデムアレイにヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子をさらに含み得、偽遺伝子は、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、タンデムアレイの抗体コード配列と同じアミノ酸配列をコードしている。任意の実施形態では、トランスジェニック動物は、ニワトリであり得る。この遺伝子座および／または重鎖遺伝子座にあり得る様々な構成成分のオプションは、上および下に記載される。使用方法は下記のとおりである。

これらの実施形態では、コード配列のすべては独立して、転写および翻訳されて、対応する数の完全長の軽鎖（事前に再配置され得る）が産生される必要がある。個々のリピートで発生する変異は、同じ変異を必ず有さない他のコピーによって希釈される。したがって、各細胞で発現される軽鎖のプールは、タンデムコピーによって産生されたタンパク質の混合物であり、標的への機能的結合のための免疫応答中に単一の軽鎖配列が選択されることはない。このシステムを使用して産生された軽鎖は、一般的な軽鎖であるはずである。

上記のトランスジェニック動物は、動物のゲノムを組換え改変することによって作製され得る。トランスジェニック動物、例えば、マウスおよびニワトリなどを産生するための方法は知られており、特に、遺伝子変換を使用する動物のゲノムを改変するための方法がまた知られており（例えば、Ｓａｙｅｇｈ，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９９９ ７２：３１－７およびＫａｍｉｈｉｒａ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４ ９１：１７１－８９（トリの場合）、ならびにＢｏｓｚｅ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２００３ １２：５４１－５３およびＦａｎ，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．１９９９ ４９：５８３－９４（ウサギの場合）、ならびにＳａｌａｍｏｎｅ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６ １２４：４６９－７２（ウシの場合）を参照されたい）、同じくこれらの種の多くの生殖系列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の構造および／または配列も知られており（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ １９９８ １７：４３－７０およびＲａｔｃｌｉｆｆｅ Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６ ３０：１０１－１１８）、上記の動物は、本開示で供与される通常の方法によって作製され得る。トランスジェニックニワトリを作製するための方法が知られている。例えば、８，５９２，６４４、ＵＳ８，８８９，６６２、Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ（Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ．２０１５ ９４：７９９－８０３）、ｖａｎ ｄｅ Ｌａｖｏｉｒ（Ｎａｔｕｒｅ．２００６ ４４１：７６６－９）、およびＳｃｈｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ １１０：２０１７０－５を参照されたい。

共通軽鎖を含有する抗体を産生するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、上記のようにトランスジェニック動物を抗原で免疫化することを含み得、抗体がポリクローナルである場合、本方法は、動物の出血からの抗体を単離することを含み得る。動物が共通軽鎖配列についてホモ接合である場合、ポリクローナル抗血清中の抗体のすべては、同じ軽鎖を有するはずである。モノクローナル抗体が所望される場合、本方法は、ｂ）免疫化されたトランスジェニック動物の細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、ｃ）ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原特異性ハイブリドーマを識別することと、ｄ）抗原特異性ハイブリドーマから抗原特異性抗体を単離することと、を含み得る。

ある特定の実施形態では、動物は、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２０、Ｌｙｍ－１、ＣＤ６、補体活性化受容体（ＣＡＲ）、ＥＧＰ４０、ＶＥＧＦ、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ－７２ ＡＦＰ（アルファ－胎児性タンパク質）、ＢＬｙＳ（ＴＮＦおよびＡＰＯＬ－関連リガンド）、ＣＡ１２５（癌抗原１２５）、ＣＥＡ（癌胚性抗原）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲに関連するヘテロ多量体）、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ－Ｌ）、ＣＤ１４（単球分化抗原））、ＣＤ２０、ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体アルファ鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体））、ＣＤ４４ｖ６（白血球の接着を仲介する）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１）、ＣＤ８０（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４の共刺激因子）、補体構成成分Ｃ５、ＣＴＬＡ、ＥＧＦＲ、エオタキシン（サイトカインＡ１１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ ＣｌａｓｓＩＩ、ＩｇＥ、ＧＰｉｉｂ／ｉｉｉａ（インテグリン）、インテグリンａＶβ３、インテグリンａ４β１およびａ４β７、インテグリンβ２、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ－２）、ルイス、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤＧＦβＲ（ベータ血小板由来成長因子受容体）、ＰＭＳＡ、腎癌抗原Ｇ２５０、ＲＳＶ、Ｅ－セレクチン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＮＦα、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＡＰ－１（血管接着タンパク質１）、またはＶＥＧＦなどで免疫化されて、療法用抗体が産生され得る。

抗原は、アジュバントの有無にかかわらず、任意の便利な方法でトランスジェニック宿主動物に投与され得、所定のスケジュールに従って投与され得る。

機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子がヒトである任意の実施形態では、内因性偽遺伝子は、存在するか、または存在しない可能性がある。例えば、機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子がヒト生殖系列配列で構成されている場合、内因性のニワトリ偽遺伝子は、存在するか、または存在しない可能性がある。内因性のニワトリ偽遺伝子が存在する場合、配列同一性が遺伝子変換には低すぎるため、それらは機能的遺伝子に配列を一切寄与しない。

免疫化後、免疫化されたトランスジェニック動物からの血清または乳汁は、抗原に特異的な医薬品グレードのポリクローナル抗体の精製のために分画され得る。トランスジェニックトリの場合、抗体は、卵黄を分画することによって作製され得る。濃縮された精製免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（親和性、イオン交換、ゲル濾過など）、硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーによる選択的沈殿によって得ることができる。

モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞、例えば、脾臓細胞が、免疫化されたトランスジェニック動物から単離され、ハイブリドーマの産生のために形質転換細胞株との細胞融合に使用され得るか、または抗体をコードするｃＤＮＡが、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、トランスフェクトされた細胞で発現され得る。モノクローナル抗体を作製するための手順は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願第０ ５８３ ９８０ Ａ１号、米国特許第４，９７７，０８１号、ＷＯ９７／１６５３７、およびＥＰ０４９１ ０５７ Ｂ１を参照されたく、これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。クローン化されたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のインビトロ産生は、Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２：１５９（２０００）、およびＢｕｒｔｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：８７（１９９５）によって記載されており、これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。

抗体がまだヒトフレームワーク領域を含有しない場合、本方法は、抗体をヒト化することをさらに含み得、本方法は、抗体の定常ドメインをヒト定常ドメインと交換して、キメラ抗体を作製すること、ならびにある特定の場合には、例えば、ＣＤＲグラフト化またはリサーフェシングなどによって抗体の可変ドメインをヒト化することを含み得る。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号、同第４，８１６，５６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５、ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６の方法に従って行われ得、各々は、そこに引用されている参考文献を含めて参照によって本明細書に完全に組み込まれる。

そのため、トランスジェニック動物に加えて、トランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、トランスジェニック動物から抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む方法も提供される。本方法は、トランスジェニック動物の細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを識別することと、を含み得る。あるいは、Ｂ細胞は、ハイブリドーマを作製せずにスクリーニングされ得る。

異なる抗原に結合するモノクローナル抗体が単離されると、任意の便利な方法を使用して、二重特異性抗体が作製され得る。例えば、２つの重鎖配列は、単一の共通軽鎖とともに単一の宿主細胞で発現され得、その場合、それらの細胞によって分泌される抗体の一部は、二重特異性でなければならない。あるいは、２つの重鎖および共通軽鎖は、別々に発現され、インビトロで折り畳まれるか、または一緒に結合され得る。

この動物によって産生された抗体のすべては、遺伝子変換によって修復されていない比較的少数のアミノ酸置換（例えば、１～５つの置換）を除いて、同一でなければならない軽鎖を有するべきである。

抗体の重鎖可変ドメインは、動物の免疫系によって「自然に」作製される。そのような抗体は、ある特定の場合には、宿主細胞によって翻訳後改変（例えば、グリコシル化）され得、トランスジェニック動物の種に特徴的なグリコシル化パターンおよび組成を有し得る。

必要に応じて、動物の重鎖の多様性を最小限に抑えるために同一の戦略が用いられ得る。これらの実施形態では、動物は、機能的重鎖遺伝子およびその遺伝子と同じ配列をコードしている偽遺伝子を含有する。

上記のトランスジェニック動物によって産生された抗体の抗原特異性結合領域の配列は、所望される場合、重鎖可変ドメインの多様な集団のコード配列のすべてまたはいずれかがＰＣＲプライマーの単一の対を使用してｃＤＮＡから増幅され得るため、比較的簡単に得られるはずである。各抗体の特異性および親和性は、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列によってのみ決定されるべきであるため、同族の軽鎖を識別または配列決定する必要はない。そのため、抗原特異性重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、比較的簡単に得られるはずである。上記のように、場合によっては、抗原特異性重鎖を発現する細胞を選択するために、Ｂ細胞またはハイブリドーマを機能的にスクリーニングすることができる。重鎖可変ドメインコード配列は、Ｂ細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の濃縮または非濃縮集団からまとめて増幅され得る。配列がＢ細胞の非濃縮集団から増幅される場合、抗原特異性可変ドメインをコードする配列は、抗原特異性でない配列よりも高度に発現され（Ｂ細胞の活性化のため）、かつより可変的なクレードに潜在的に属するため、識別可能であるはずである。さらに、これらの重鎖は結合のために特定の軽鎖を必要としないため、フォローアップ作業を実行する前に、どの軽鎖がどの重鎖と対であるかを決定する必要はない。

条項
実施形態１．抗体多様化のために遺伝子変換を使用するトランスジェニック動物であって、（ａ）軽鎖可変領域をコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子と、（ｂ）前記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、前記軽鎖可変領域をコードする核酸にヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子と、を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含み、前記偽遺伝子が、前記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、前記偽遺伝子の各々が、前記（ａ）の機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の前記軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列をコードしている、トランスジェニック動物。

実施形態２．前記偽遺伝子が、前記軽鎖可変領域をコードする核酸の少なくとも一部と同一であるヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載のトランスジェニック動物。

実施形態３．前記トランスジェニック動物が、ニワトリである、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態４．前記（ａ）の軽鎖可変領域をコードする核酸が、可変（Ｖ）セグメントおよび結合（Ｊ）セグメントを含む、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態５．前記（ａ）の軽鎖可変領域が、ヒト生殖系列軽鎖Ｖセグメントおよびヒト生殖系列軽鎖Ｊセグメントによってコードされている、実施形態４に記載のトランスジェニック動物。

実施形態６．前記（ａ）の軽鎖可変領域の前記Ｖセグメントが、生殖系列軽鎖カッパＶセグメントによってコードされている、実施形態５に記載のトランスジェニック動物。

実施形態７．前記（ａ）の軽鎖可変領域の前記Ｖセグメントが、生殖系列軽鎖ラムダＶセグメントによってコードされている、実施形態５に記載のトランスジェニック動物。

実施形態８．前記偽遺伝子が、前記Ｖセグメントと同じアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている、実施形態４～７のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態９．前記偽遺伝子が、前記ＶおよびＪセグメントと同じアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている、実施形態４～７のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態１０．前記軽鎖可変領域が、ヒトモノクローナル抗体に由来する、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１１．前記偽遺伝子が、４００ｎｔ未満の長さである、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１２．前記偽遺伝子が、３００～４００ヌクレオチドの長さである、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１３．最大３０個の前記偽遺伝子が存在する、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１４．前記トランスジェニック動物が、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性である、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１５．前記トランスジェニック動物が、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１６．抗体多様化のために遺伝子変換を使用するトランスジェニック動物であって、
抗体コード配列のタンデムアレイを含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含み、前記タンデムアレイ内の前記核酸の各々が、軽鎖可変ドメインおよび定常領域をコードし、プロモーターに作動可能に連結され、前記アレイ内の各コード配列が、同じアミノ酸配列をコードしている、トランスジェニック動物。

実施形態１７．少なくとも２（例えば、少なくとも３、４、５、例えば５～３０）つの前記コード配列が存在する、実施形態１６のトランスジェニック動物。

実施形態１８．前記コード配列が、事前に配置されたＶセグメント、Ｊセグメント、およびＣ領域を含む、実施形態１６または１７に記載のトランスジェニック動物。

実施形態１９．前記事前に配置されたＶセグメント、Ｊセグメント、およびＣ領域がすべて、ヒト生殖系列抗体配列をコードしている、実施形態１６～１８のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態２０．前記軽鎖可変ドメインが、ヒトモノクローナル抗体に由来する、実施形態１６～１８のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態２１
（ｂ）前記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、前記抗体コード配列のタンデムアレイにヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子をさらに含み、前記偽遺伝子が、前記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、前記偽遺伝子の各々が、前記（ａ）のタンデムアレイの前記抗体コード配列と同じアミノ酸配列をコードしている、実施形態１６～２０のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態２２．前記偽遺伝子が、前記抗体コード配列の少なくとも一部と同一であるヌクレオチド配列を含有する、実施形態２１のトランスジェニック動物。

実施形態２３．前記トランスジェニック動物が、ニワトリである、実施形態２１または２２のトランスジェニック動物。

実施形態２４．前記偽遺伝子が、４００ｎｔ未満の長さである、実施形態２１～２３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態２５．前記偽遺伝子が、３００～４００ヌクレオチドの長さである、実施形態２１～２４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。

実施形態２６．方法であって、（ａ）任意の先行する実施形態に記載のトランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、（ｂ）前記動物から、前記抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む、方法。

実施形態２７．前記抗体が、ポリクローナルである、実施形態２６に記載の方法。

実施形態２８．前記抗体が、モノクローナルである、実施形態２６の方法。

実施形態２９．（ｃ）前記トランスジェニック動物のＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、（ｄ）前記ハイブリドーマをスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを識別することと、をさらに含む、実施形態２６～２８のいずれかに記載の方法。

実施形態３０．（ｃ）ハイブリドーマを作製せずにＢ細胞をスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞を識別することをさらに含む、実施形態２６～２８のいずれかの方法。

実施形態３１．ＰＣＲを使用して、前記トランスジェニック動物のＢ細胞から少なくとも前記重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、前記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含む、実施形態２６～３０のいずれかに記載の方法。

実施形態３３．実施形態１～２５のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生されたポリクローナル抗体であって、前記抗血清中の前記抗体の少なくとも５０％が、実質的に同じ軽鎖配列を有する、ポリクローナル抗体。

実施形態３３．実施形態１～２５のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生された、少なくとも１０００個のＢ細胞の集団であって、前記Ｂ細胞の少なくとも５０％が、実質的に同じ軽鎖配列を有する抗体を産生する、集団。

実施形態３４．実施形態１～２５のいずれかに記載の動物から単離された、Ｂ細胞。

実施形態３５．実施形態１～２５のいずれかに記載の動物によって産生された、モノクローナル抗体。

以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態および態様を実証し、さらに例示するために提供されたものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１
ＣｍＬＣ１ニワトリの構築
ＣｍＬＣ１は、Ｂ細胞系統における固定または非変異のヒトカッパ軽鎖の発現のためにトランスジェニックニワトリの生殖系列に挿入するための構築物である。構築物は、ニワトリ軽鎖遺伝子座に挿入し、内因性転写調節要素を使用して、Ｂ細胞での発現を促進するように設計されている。構築物は、ヒト生殖系列ＪＫ１＊０１遺伝子に結合された事前に再配置されたヒト生殖系列ＶＫ３－１５＊０１遺伝子からなる単一の機能的Ｖカッパ遺伝子を含有する。配列を事前に再配置されたＶ領域として設計および合成した。このＶ領域配列は、ＮＣＢＩデータベースに存在するヒト由来の配列に一般的に見られるため、自然に発生する配列と同等である。単一の機能的Ｖ領域の上流に、発現されたＶ領域と同一のＤＮＡ配列の６つの偽遺伝子のアレイを配置した。６つの偽遺伝子はすべて、単一の機能的Ｖ領域に対して逆配向にある。それらは、転写のためのプロモーターを欠き、下流の定常領域へのスプライシングのためのスプライスドナーを欠き、翻訳開始部位を含有せず、かつ分泌のためのシグナルペプチドリーダー配列を含有しないため、偽遺伝子として定義される。ニワトリなどの遺伝子変換種では、これらの上流の偽遺伝子は通常、遺伝子変換のプロセスによって単一の機能的Ｖ領域を変異させる配列多様性の供給源として使用される。ＣｍＬＣ１構築物の場合、偽遺伝子による遺伝子変換の試みは、一切の配列の変化を導入せず、むしろ、機能的Ｖのランダムな体細胞超変異によって生じた一切の変化を生殖系列配列に戻す傾向がある。したがって、偽遺伝子は、機能的Ｖにクレンジングの影響を有し、オリジナルの生殖系列配列を保持する。

図４は、ＣｍＬＣ１遺伝子座を例示する。この遺伝子座は、ニワトリの定常領域にスプライシングされた、ヒトＶＫ３－１５／ＪＫ１可変領域からなるキメラ軽鎖を発現するように設計されている。ＣｍＬＣ１遺伝子座には、単一のヒト機能的可変領域がある。機能的ＶＫ領域の上流には、機能的遺伝子のＶＫ領域のＤＮＡ配列と同一である同一の偽遺伝子の６つのコピーがある。これらの偽遺伝子は、遺伝子変換に参加して、機能的Ｖで生じ得る一切の変異を生殖系列配列に戻し得る。

Ｖ領域の下流には、ニワトリ軽鎖定常領域がある。したがって、ＣｍＬＣ軽鎖は、ヒト可変領域－ニワトリ定常領域からなるキメラ軽鎖である。プロモーター、リーダーイントロン、ＪＣイントロン、および３’ＵＴＲなどの構築物上の非コード配列はすべて、ニワトリ軽鎖遺伝子座に由来する。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを使用して、以前に軽鎖遺伝子座を標的としたａｔｔＰ部位に挿入するためのａｔｔＢ部位も含まれる。インテグラーゼを介した挿入を選択するために、Ｂ－アクチンプロモーターが含まれ、これは、遺伝子座のｎｅｏ遺伝子の上流に挿入し、その転写を活性化して、正しいインテグラントのＧ４１８選択を可能にする。最後に、ｌｏｘＰ部位は、構築物をゲノムに挿入した後、Ｃｒｅ組換えを使用して、プラスミドバックボーンおよびすべての選択可能なマーカーを除去し、免疫グロブリン配列、ならびに単一のｌｏｘＰ部位およびａｔｔＲ部位のみを残すことができるように構築物上に位置付けされる。

図５は、ＣｍＬＣ１遺伝子座がどのように作製されたかを例示する。ＣｍＬＣ１挿入ベクターを、軽鎖遺伝子座のノックアウト（ＩｇＬ ＫＯ対立遺伝子）を運ぶニワトリ始原生殖細胞にトランスフェクトした。軽鎖Ｖ－Ｊ－Ｃ領域を、隣接するａｔｔＰ部位を有するプロモーターのないｎｅｏ遺伝子を含む選択可能なマーカーカセットで置き換えた。ａｔｔＰ部位はｐｈＣ３１インテグラーゼによって認識され、ａｔｔＢ部位とｂ－アクチンプロモーターを運ぶＣｍＬＣ１プラスミドの挿入に使用される。挿入すると、ｂ－アクチンプロモーターは、ｎｅｏ遺伝子の発現を促進し、薬物Ｇ４１８に対する耐性を提供する。最後のステップでは、Ｃｒｅ組換えを使用して、選択可能なマーカーおよびプラスミドバックボーンを除去し、単一のｌｏｘＰ部位、単一のａｔｔＲ部位、ＣｍＬＣ１機能的Ｖ、および偽遺伝子を残す。ニワトリ軽鎖偽遺伝子は上流にとどまるが、ヒト機能的Ｖに配列多様性を導入することは不明であった。

ＣｍＬＣ１／ＩｇＬ ＫＯおよび野生型重鎖を有する５羽のトリをフローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＬをフィコール密度勾配遠心分離によって調製し、ニワトリＢ細胞マーカーＢｕ１、ニワトリＩｇＭ（重鎖特異性）、ニワトリＩｇＬ（定常領域特異性）、ヒトＶＫ／ＶＨに対して産生された抗血清、ならびにＴ細胞マーカーＴＣＲ１およびＴＣＲ２／３に対する抗体で染色した。３羽の野生型対照トリと比較して、Ｂ細胞集団のすべては正常に見えた。予想通り、抗ヒトＶＫ／ＶＨ抗体は、ＣｍＬＣ１トリのみを染色した。このデータを図５に示す。このデータは、ＣｍＬＣ１／ニワトリＶＨトリが、末梢に正常なＢ細胞集団（すなわち、野生型対照トリと同様）を有することを示す。

遺伝子型ＣｍＬＣ１／ＳｙｎＶＨ－ＳＤ／ＩｇＬ ＫＯ／ＩｇＨ ＫＯを有する４羽のトリのＰＢＬをフローサイトメトリーによって分析した。これらのトリは、ヒトＶＫおよびヒトＶＨからなるキメラ抗体を発現する。ＰＢＬをフィコール密度勾配遠心分離によって調製し、ニワトリＢ細胞マーカーＢｕ１、ニワトリＩｇＭ（重鎖特異性）、ニワトリＩｇＬ（定常領域特異性）、ヒトＶＫ／ＶＨに対して産生された抗血清、ならびにＴ細胞マーカーＴＣＲ１およびＴＣＲ２／３に対する抗体で染色した。３羽の野生型対照トリと比較して、Ｂ細胞集団のすべては正常に見えた。予想通り、抗ヒトＶＫ／ＶＨ抗体は、ＣｍＬＣ１トリからのＰＢＬのみを染色した。これらのニワトリはまた、末梢に正常なＢ細胞集団を有する。

次の一連の実験では、各遺伝子型の小さなコホートをヒトプログラニュリンで免疫化した。ＧＥＭアッセイで識別された抗原特異性クローン（ＵＳ８，０３０，０９５を参照されたい）。エピトープビニングおよび反応速度分析を実行し、抗体の交差反応性を評価した。クローンの配列を決定し、ＣｍＬＣ１トリの配列多様性を、同一の偽遺伝子を有さない対照トリと比較した。

プログラニュリン特異的力価を、ＣｍＬＣ１を発現するトリで経時的にモニターした。このデータを図８に示す。対照（軽鎖の多様化を伴う）および野生型トリで得られたものと同様の強い力価が観察された。上のパネル、野生型重鎖を有するＣｍＬＣ１－トリ。下のパネル、図４に示すように、ヒト重鎖Ｖ領域を有するニワトリ。

ＣｍＬＣ１から得られた３２個のモノクローナル抗体のグループからのＶＫおよびＶＨ領域の配列（図９の上のパネル）を、多様化するヒト軽鎖を有するトリで得られた抗体と比較した（図９の下のパネル）。各抗体配列について、生殖系列配列と比較した可変領域配列あたりの変化の総数を数えた。ＶＫは青であり、ＶＨは赤である。結果は、ＣｍＬＣ１由来の抗体の場合、通常の親和性成熟を受けるヒトトランスジーンと比較して、軽鎖の変化の数が明らかに低減していることを示す。重鎖の場合、ＣｍＬＣ１および通常のＶＫ３－１５トリの両方に、配列ごとに多くの変化が含有されていた。このデータは、ＣｍＬＣ１トリからの抗原特異性クローンは、軽鎖のアミノ酸の多様性がほとんどないことを示す。

抗原ヒトプログラニュリン（上）およびマウスプログラニュリン（下）への結合親和性を決定するために、ＣｍＬＣ１抗体のコホートを表面プラズモン共鳴によって分析した。図１０を参照されたい。抗体の多くはマウスタンパク質と交差反応性があり、マウスへの結合親和性が示される（下）。抗体の多くは、抗原に対して非常に高い親和性を示した。結合親和性の中央値は３．２５ｎＭであり、いくつかの抗体はナノモル未満の親和性（＜１ｎＭ）を有した。

ＣｍＬＣ１由来の抗体のコホートを、交差遮断関係およびエピトープビニングを決定するために、ハイスループットアレイＳＰＲによっても分析した。データを図１１に示す。プログラニュリンのエピトープビンを、既知の結合の抗体標準のセットによって定義した。エピトープビンを右の列に示す。ヒトおよびマウスプログラニュリンへの結合親和性を他の２つの列に示す。配列樹状図は、抗体がどのように関連しているかを示しており、一般に、エピトープビンに対応する配列は互いに関連している。

上記の実験は次のことを示す。
ＣｍＬＣ１ニワトリは、対照ニワトリ、ならびに野生型ニワトリの抗原認識能力を保持する。
ＣｍＬＣ１抗体は、対照ニワトリに見られる高い特異性および結合親和性を保持する。
ＣｍＬＣ１テクノロジーを使用して、一般的な軽鎖抗体、すなわち、ＶＫが本質的に生殖系列配列および完全にＶＨドメイン上に多様性を有する抗体を作製できる。

実施例２
ＣｍＬＣ４遺伝子座の構築
ＣｍＬＣ４は、Ｂ細胞系統における固定または非変異のヒトカッパ軽鎖の発現のためにトランスジェニックニワトリの生殖系列に挿入するための構築物である。構築物は、ニワトリ軽鎖遺伝子座に挿入し、内因性転写調節要素を使用して、Ｂ細胞での発現を促進するように設計されている。構築物は、ヒト生殖系列ＪＫ１＊０１遺伝子およびニワトリ定常領域遺伝子に結合された事前に再配置されたヒト生殖系列ＶＫ３－１５＊０１遺伝子からなる機能的軽鎖遺伝子の４つのコピーを含有する。機能的軽鎖遺伝子（ＶＪＣ）の各コピーは、独自のプロモーターを含有する。軽鎖３’エンハンサーは下流にあり、４重ではなかった。軽鎖遺伝子をニワトリの定常領域にインフレームで融合された、事前に再配置されたヒトＶ領域として設計および合成した。このＶ領域配列は、ＮＣＢＩデータベースに存在するヒト由来の配列に一般的に見られるため、自然に発生する可変領域と同等である。４つの機能的Ｖ領域の上流に、機能的Ｖ領域と同一のＤＮＡ配列の６つの偽遺伝子のアレイを配置した。６つの偽遺伝子はすべて、４つの機能的軽鎖に対して逆配向にある。それらは、転写のためのプロモーターを欠き、下流の定常領域へのスプライシングのためのスプライスドナーを欠き、翻訳開始部位を含有せず、かつ分泌のためのシグナルペプチドリーダー配列を含有しないため、偽遺伝子として定義される。ニワトリなどの遺伝子変換種では、これらの上流の偽遺伝子は通常、遺伝子変換のプロセスによって機能的Ｖ領域を変異させる配列多様性の供給源として使用される。ＣｍＬＣ４構築物の場合、偽遺伝子による遺伝子変換は、一切の配列の変化を導入せず、むしろ、機能的Ｖのランダムな体細胞超変異によって生じた一切の変化を生殖系列配列に戻す傾向がある。したがって、偽遺伝子は、機能的Ｖにクレンジングの影響を有し、配列をオリジナルの生殖系列配列に戻す。さらに、コピーのいずれか１つで生じる可能性のある任意の変異を希釈するために、機能的Ｖの４つのコピーを提供した。コピーのうちの１つに変異が生じた場合、結果として生じる軽鎖タンパク質は、細胞表面の総軽鎖タンパク質の１／４しか寄与しないであろう。したがって、いずれの単一の変異も、抗原結合にわずかなブーストしか提供できなかった。胚中心での親和性成熟およびクローン選択の間、どの１つの変異も細胞表面の軽鎖プール全体の一部しか寄与しないため、有益な変異のプラスの選択が効率的になされないであろう。

ＣｍＬＣ４軽鎖は、ヒト可変領域－ニワトリ定常領域からなるキメラ軽鎖である。構築物上の非コード配列、例えば、４つのプロモーター、リーダーイントロン、および３’ＵＴＲはすべて、ニワトリ軽鎖遺伝子座に由来する。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを使用して、以前に軽鎖遺伝子座を標的としたａｔｔＰ部位に挿入するためのａｔｔＢ部位も含まれる。インテグラーゼを介した挿入を選択するために、Ｂ－アクチンプロモーターが含まれ、これは、遺伝子座のｎｅｏ遺伝子の上流に挿入し、その転写を活性化して、正しいインテグラントのＧ４１８選択を可能にする。最後に、ｌｏｘＰ部位は、構築物をゲノムに挿入した後、Ｃｒｅ組換えを使用して、プラスミドバックボーンおよびすべての選択可能なマーカーを除去し、免疫グロブリン配列、ならびに単一のｌｏｘＰ部位およびａｔｔＲ部位のみを残すことができるように構築物上に位置付けされる。

図１２は、ＣｍＬＣ４遺伝子座を例示する。この遺伝子座は、ニワトリの定常領域に結合したヒトＶＫ３－１５／ＪＫ１可変領域からなるキメラ軽鎖を発現するように設計されている。ＣｍＬＣ４遺伝子座には、同一遺伝子の４つのコピーがあり、これらの各々は独自のプロモーター（矢印で示されている）を有し、ヒトＶＫ－ニワトリＣＬ軽鎖をコードしている。これらの４つのコピーは、機能的軽鎖遺伝子である。機能的軽鎖の上流には機能的遺伝子のＶＫ領域のＤＮＡ配列と同一である同一の偽遺伝子の６つのコピーがある（上記のＣｍＬＣ１遺伝子座で使用されているように）。これらの偽遺伝子は、遺伝子変換に参加して、機能的遺伝子で生じ得る変異を生殖系列配列に戻し得る。

図１３は、ＣｍＬＣ４遺伝子座がどのように作製されたかを例示する。示されるように、ＣｍＬＣ１ベクターを、軽鎖遺伝子座のノックアウト（挿入ＩｇＬ ＫＯ対立遺伝子）を運ぶニワトリ始原生殖細胞にトランスフェクトした。軽鎖Ｖ－Ｊ－Ｃ領域を、隣接するａｔｔＰ部位を有するプロモーターのないｎｅｏ遺伝子を含む選択可能なマーカーカセットで置き換えた。ａｔｔＰ部位はｐｈＣ３１インテグラーゼによって認識され、ａｔｔＢ部位とｂ－アクチンプロモーターを運ぶＣｍＬＣ１プラスミドの挿入に使用される。挿入すると、ｂ－アクチンプロモーターはｎｅｏ遺伝子の発現を促進し、薬物Ｇ４１８に対する耐性を提供する。最後のステップでは、Ｃｒｅ組換えを使用して、選択可能なマーカーおよびプラスミドバックボーンを除去する。

ＣｍＬＣ４／ＩｇＬ ＫＯおよび野生型重鎖を有する６羽のトリからのＰＢＬをフローサイトメトリーによって分析した（図１４を参照されたい）。ＰＢＬをフィコール密度勾配遠心分離によって調製し、ニワトリＢ細胞マーカーＢｕ１、ニワトリＩｇＭ（重鎖特異性）、ニワトリＩｇＬ（定常領域特異性）、ヒトＶＫ／ＶＨに対して産生された抗血清、ならびにＴ細胞マーカーＴＣＲ１およびＴＣＲ２／３に対する抗体で染色した。３羽の野生型対照トリと比較して、Ｂ細胞集団のすべては正常に見えた。予想通り、抗ヒトＶＫ／ＶＨ抗体は、ＣｍＬＣ４トリのみを染色した。このデータは、ＣｍＬＣ４／ニワトリＶＨトリが末梢に正常なＢ細胞集団を有することを示す。

遺伝子型ＣｍＬＣ４／ＳｙｎＶＨ－Ｃ／ＩｇＬ ＫＯ／ＩｇＨ ＫＯを有する６羽のトリをフローサイトメトリーによって分析した（図１５を参照されたい）。これらのトリは、ヒトＶＫおよびヒトＶＨからなるキメラ抗体を発現する。ＰＢＬをフィコール密度勾配遠心分離によって調製し、ニワトリＢ細胞マーカーＢｕ１、ニワトリＩｇＭ（重鎖特異性）、ニワトリＩｇＬ（定常領域特異性）、ヒトＶＫ／ＶＨに対して産生された抗血清、ならびにＴ細胞マーカーＴＣＲ１およびＴＣＲ２／３に対する抗体で染色した。３羽の野生型対照トリと比較して、Ｂ細胞集団のすべては正常に見えた。予想通り、抗ヒトＶＫ／ＶＨ抗体は、ＣｍＬＣ４トリのみを染色した。このデータも、ＣｍＬＣ４トリが末梢に正常なＢ細胞集団を有することを示す。

次の一連の実験では、各遺伝子型の小さなコホートをヒトプログラニュリンで免疫化した。ＧＥＭアッセイで識別された抗原特異性クローン（ＵＳ８，０３０，０９５を参照されたい）。エピトープビニングおよび反応速度分析を実行し、抗体の交差反応性を評価した。クローンの配列を決定し、ＣｍＬＣ１トリの配列多様性を対照トリと比較した。

プログラニュリン特異的力価を、ＣｍＬＣ４を発現するトリで経時的にモニターした。これらの結果を図１６に示す。対照（軽鎖の多様化を伴う）および野生型トリで得られたものと同様の強い力価が観察された。上のパネル、野生型重鎖を有するＣｍＬＣ４－トリ。下のパネル、ヒト重鎖Ｖ領域を有するＯｍｎｉＣｌｉｃ（ＣｍＬＣ４）。

ＣｍＬＣ４から得られた５６個のモノクローナル抗体のグループからのＶＫおよびＶＨ領域の配列（図１７の上のパネル）を、多様化するヒト軽鎖を有するトリで得られた抗体と比較した（図１７の下のパネル）。各抗体配列について、生殖系列配列と比較した可変領域あたりの変化の総数を数えた。ＶＫは青であり、ＶＨは赤である。結果は、ＣｍＬＣ４由来の抗体の場合、通常の親和性成熟を受けるヒトトランスジーンと比較して、軽鎖の変化の数が明らかに低減していることを示す。重鎖の場合、ＣｍＬＣ４および通常のＶＫ３－１５トリの両方に、配列ごとに多くの変化が含有されていた。

図１８は、ＣｍＬＣ４トリによって作製された５６個のモノクローナル抗体のセット間のアミノ酸の多様性を示す。軽鎖可変領域（上）または重鎖可変領域（下）の各位置で、生殖系列配列とは異なる残基を数える。バーの高さは、各位置の変化を含有する配列の％を示す。色は、見つかったアミノ酸を示す。このデータは、ＣｍＬＣ４トリでは、多様性が重鎖に集中していることを示す。

５６個の抗体のコホートの表面プラズモン共鳴を使用して、抗原ヒトプログラニュリン（図１９、上のパネル）およびマウスプログラニュリン（図１９、下のパネル）への結合親和性を決定した。抗体の多くはマウスタンパク質と交差反応性があり、マウスへの結合親和性が右に示される。抗体の多くは、抗原に対して非常に高い親和性を示した。結合親和性の中央値は３．４ｎＭであり、多くの抗体はナノモル未満の親和性（＜１ｎＭ）を有した。

５６個の抗体のコホートを、交差遮断関係およびエピトープビニングを決定するために、ハイスループットアレイＳＰＲによって分析した。これを図２０に示す。プログラニュリンのエピトープビンを、既知の結合の抗体標準のセットによって定義した。エピトープビンを右の列に示す。ヒトおよびマウスプログラニュリンへの結合親和性を他の２つの列に示す。配列樹状図は、抗体がどのように関連しているかを示し、一般に、エピトープビンに対応する配列は互いに関連している。

上記の実験は次のことを示す。
ＣｍＬＣ４ニワトリは、対照および野生型ニワトリの抗原認識能力を保持する。
ＣｍＬＣ４抗体は、対照に見られる高い特異性および結合親和性を保持する。
ＣｍＬＣ４テクノロジーを使用して、一般的な軽鎖抗体、すなわち、ＶＫが本質的に生殖系列配列および完全にＶＨドメイン上に多様性を有する抗体を作製できる。

Claims (22)

1. 抗体多様化のために遺伝子変換を使用するトランスジェニック非ヒト動物であって、
   （ａ）軽鎖可変領域をコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子と、
   （ｂ）前記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、前記軽鎖可変領域をコードする核酸にヌクレオチド配列を供与する複数の偽遺伝子と、を含む内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むゲノムを含み、前記偽遺伝子が、前記機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流または下流にあり、前記偽遺伝子の各々が、前記（ａ）の機能的免疫グロブリン軽鎖遺伝子の前記軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列をコードしている、トランスジェニック非ヒト動物。
2. 前記偽遺伝子が、前記軽鎖可変領域をコードする核酸の少なくとも一部と同一であるヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
3. 前記トランスジェニック非ヒト動物が、ニワトリである、請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
4. 前記（ａ）の軽鎖可変領域をコードする核酸が、可変（Ｖ）セグメントおよび結合（Ｊ）セグメントを含む、請求項１～３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
5. 前記（ａ）の軽鎖可変領域が、ヒト生殖系列軽鎖Ｖセグメントおよびヒト生殖系列軽鎖Ｊセグメントによってコードされている、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
6. 前記（ａ）の軽鎖可変領域の前記Ｖセグメントが、生殖系列軽鎖カッパＶセグメントによってコードされている、請求項５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
7. 前記（ａ）の軽鎖可変領域の前記Ｖセグメントが、生殖系列軽鎖ラムダＶセグメントによってコードされている、請求項５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
8. 前記軽鎖可変領域が、ヒトモノクローナル抗体に由来する、請求項１～７のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
9. 前記偽遺伝子が、４００ｎｔ未満の長さである、請求項１～８のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
10. 前記偽遺伝子が、３００～４００ヌクレオチドの長さである、請求項１～８のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
11. 最大３０個の前記偽遺伝子が存在する、請求項１～１０のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
12. 前記トランスジェニック非ヒト動物が、前記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性である、請求項１～１１のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
13. 前記トランスジェニック非ヒト動物が、前記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１～１１のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
14. 方法であって、
    （ａ）請求項１～１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物を抗原で免疫化することと、
    （ｂ）前記トランスジェニック非ヒト動物から、前記抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む、方法。
15. 前記抗体が、ポリクローナルである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗体が、モノクローナルである、請求項１４に記載の方法。
17. （ｃ）前記トランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、
    （ｄ）前記ハイブリドーマをスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを識別することと、をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
18. （ｃ）ハイブリドーマを作製せずにＢ細胞をスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞を識別することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
19. ＰＣＲを使用して、前記トランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞から重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、前記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 請求項１～１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物によって産生されたポリクローナル抗体であって、前記トランスジェニック非ヒト動物がニワトリであり、前記ポリクローナル抗体中の抗体の少なくとも５０％が、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して最大５つのアミノ酸置換を含有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、ポリクローナル抗体。
21. 請求項１～１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物によって産生された、少なくとも１０００個のＢ細胞の集団。
22. 請求項１～１３のいずれかに記載の非ヒト動物から単離された、Ｂ細胞。

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