KR20210020079A - 동일한 경쇄 i을 갖는 다양한 항체를 생산하기 위한 트랜스제닉 동물 - Google Patents
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Abstract
본원은 무엇보다도 항체 다양화를 위해 유전자 전환을 사용하는 트랜스제닉 동물에서 항체 다양화를 최소화하기위한 전략을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 동물은 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위(endogenous immunoglobulin light chain locus)를 포함하는 게놈(genome)을 포함한다: (a) 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 면역글로블린 경쇄 유전자; 및 (b) 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 유전자 전환에 의해, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산에 뉴클레오티드 서열을 기증하는 다수의 유사 유전자(pseudogenes)를 포함하며, 상기 유사 유전자가 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있으며, 각각의 상기 유사 유전자는 (a)의 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산을 인코딩한다. 다른 실시양태에서, 상기 유전자좌는 상기 경쇄에 대한 코딩 서열이 직렬 어레이를 가질 수 있다.
Description
본 출원은 2018년 6월 8일 출원된 미국 가특허출원 제62/682,651호 및 2018년 6월 13일에 출원된 미국 가특허출원 제62/684,529호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
고전적인 항체는 두 개의 동일한 중쇄로 구성되며, 각각은 공통 경쇄를 갖는 이종이량체를 형성한다. 대조적으로, 이중 특이적 항체(bispecific antibodies)는 두 개의 상이한 중쇄와 두 개의 상이한 경쇄를 가질 수 있으며, 각각의 쌍은 다른 항원에 결합한다. 두 개의 서로 상이한 경쇄와 두 개의 서로 상이한 중쇄의 무작위 결합은 구성 요소 사슬의 많은 조합의 혼합물을 생성한다. 따라서 모두 동일한 경쇄를 갖는 항체를 생산하는 접근 방식이 필요하다.
소위 “공통 경쇄(common light chain)”동물, 즉 모두 동일한 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 동물을 생산할 때의 과제 중 하나는, 체세포과 돌연변이가 종종 B 세포에서 친화성 성숙 동안 경쇄 가변 영역 코딩 서열을 종종 변경한다는 것이다. 따라서 내인성 경쇄 유전자좌에서 단일 경쇄 서열을 포함하도록 조작 된 동물은 여전히 다양한 경쇄를 갖는 항체를 생산한다.
본 기재 내용의 특정 양태는 공통 경쇄를 생성하고 이중 특이적 항체의 생성을 위해 이를 사용하는 트랜스제닉 동물에 관한 것이다.
본원은 무엇보다도 항체 다양화를 위해 유전자 전환을 사용하는 동물에서 경쇄 다양성을 감소시키는 두 가지 전략을 제공한다. 이러한 전략은면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위의 변화를 포함하여, 상기 경쇄가 그러한 변화가 없는 동등한 동물보다 덜 다양한 폴리클로날 항혈청(antisera)을 생성하는 동물을 생산하기 위해 대안적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 동물은 하기를 포함하는 면역 글로불린 경괘 유전자 좌위를 포함하는 게놈을 포함한다: (a) 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 면역글로블린 경쇄 유전자; 및 (b) 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 유전자 전환에 의해, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산에 뉴클레오티드 서열을 기증하는 다수의 유사 유전자(pseudogenes)를 포함하며, 상기 유사 유전자가 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있으며, 각각의 상기 유사 유전자는 (a)의 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산을 인코딩한다.
이러한 동물의 B 세포에서, 상기 경쇄 가변 영역 코딩 서열은 체세포 과돌연변이에 의해 다양화될 수 있다. 그러나, 이러한 실시양태에서 상기 유사 유전자는 유전자 전환에 의해 많은 돌연변이를 복구하여, 상기 가변 영역에 대한 코딩 서열을 원래 형태로 복원해야 한다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 상기 유사 유전자는 필수적으로 트랜스제닉 동물에서 서열 다양성을 감소시킨다는 점에서 정상적인 역할과 반대되는 기능을 수행한다. 야생형 동물에서, 상기 유사 유전자는 서열 다양성을 증가시킨다. 이러한 동물은 상기 경쇄가 그러한 유사 유전자가 없는 동등한 동물보다 덜 다양한 폴리클로날 항혈청을 생산한다.
대안적으로 또는 상기에 추가하여, 상기 트랜스제닉 동물은 항체 코딩 서열의 직렬 어레이를 포함하는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자를 포함하는 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위를 포함하는 게놈을 포함 할 수 있으며, 상기 직렬 어레이의 각 핵산은 경쇄 가변 도메인 및 불변 영역을 인코딩하고 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 상기 어레이의 각 코딩 서열은 동일한 아미노산 서열을 인코딩한다. 따라서 이러한 동물에서 생성된 경쇄는 초기에 (즉, 체세포 과돌연변이 전 등) 서로 동일한, 여러 상이한 코딩 서열에 의해 인코딩된다. 상기 코딩 서열의 직렬 어레이는 이러한 동물의 B 세포에서 체세포 과돌연변이의 효과를 희석시킨다. 이러한 동물은 항체 코딩 서열의 직렬 어레이를 갖지 않는 동등한 동물보다 경쇄가 덜 다양한 폴리클로날 항혈청을 생산한다. 현재 전략은 소위 “공통 경쇄(commone light chain)"를 갖는 항체의 다양한 집단, 즉 모두 동일하거나 거의 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 다양한 항체 집단의 생산에서의 용도를 발견하며, 이러한 항체의 사슬 경쇄 가변 영역은 항체의 결합 특이성을 결정하는 데 수동적인 역할을 하지만 그럼에도 불구하고 올바른 폴딩 및 분비를 위해 존재할 필요가 있다. 이러한 경우, 항체에 대한 상기 경쇄는 트랜스제닉 동물을 만들기 전에 사전-선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 상기 동물은 인간 생식 계열에 의해 인코딩 된 공통 경쇄 가변 영역을 갖는 항체의 다양한 집단을 생성하도록 조작될 수 있으며, 이에 따라 적어도 공통 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 경쇄가 인간에게 투여될 때 면역학적으로 잘 견디도록 보장한다. 특히, 이러한 경쇄는 2 개의 결합 특이성을 갖는 이중-특이적 항체(bi-specific antibodies)에 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 이중-특이적 항체의 두 팔(arms)은 동일한 경쇄 (즉, 공통 경쇄) 및 상이한 중쇄(상기 팔의 결합 특이성을 크게 결정 함)를 갖는다.
정의
용어 “결정하는(determining)”, “측정하는(measuring)”, “평가하는(evaluating)”, “가늠하는(assessing)” 및 “분석하는(assaying)”은 임의의 측정 형태를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 요소가 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 용어에는 양적 및/또는 정성적 결정이 모두 포함된다. 평가는 상대적이거나 절대적일 수 있다. “존재의 결정(Determining the presence of)”은 존재 여부를 결정하는 것뿐만 아니라 존재하는 것의 양을 결정하는 것을 포함한다.
상기 용어 “유전자(gene)"는 프로모터 영역, 코딩 서열 및 3'UTR로 이루어진 핵산 서열을 의미한다.
상기 용어 “단백질(protein)" 및 "폴리펩티드(polyepetide)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
상기 용어 “핵산(nucleic acid)”은 DNA, RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 그의 화학적 변형을 포함한다. 상기 용어 “핵산(nucleic acid)" 및 "폴리 뉴클레오티드(polynucleotide)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
상기 용어 “작동 가능하게 연결된(operably-linked)”은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편상의 핵산 서열의 결합을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 조절 하에 있음) 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, 인트론이 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 때, 상기 인트론은 코딩 서열의 발현을 제공하기 위해 mRNA로부터 스플라이싱된다. “연결되지 않음(Unlinked)"은 관련된 유전적 요소가 서로 밀접하게 관련되어 있지 않고 하나의 기능이 다른 요소에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
상기 용어 “동형 접합(homozygous)"은 동일한 대립 유전자가 상동 염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 것을 나타낸다. 대조적으로, “이형 접합(heterozygous)”은 상이한 대립 유전자가 상동 염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 것을 나타낸다. 트랜스제닉 동물은 이식 유전자에 대해 동형 접합성이거나, 동종 염색체의 동일한 유전자 좌위에 대응물(counterpart)이 없는 경우 이식 유전자에 대해 반접합성(hemizygous)일 수 있다.
유전자와 관련하여, 상기 용어 “내인성(endogenous)”은 유전자가 세포에 고유한 것임을 나타내며, 즉, 유전자가 비-변형 세포의 게놈에서 특정 유전자 좌위에 존재하는 것을 나타낸다. 내인성 유전자는 야생형 세포(자연에서 발견되는 바와 같이)의 유전자 좌위에 존재하는 야생형 유전자일 수 있다. 내인성 유전자는 야생형 유전자와 동일한 유전자 좌위에 존재하는 경우 변형된 내인성 유전자일 수 있다. 이러한 변형된 내인성 유전자의 예는 외래 핵산이 삽입된 유전자이다. 내인성 유전자는 핵 게놈, 미토콘드리아 게놈 등에 존재할 수 있다.
상기 용어 “구조물(construct)”은 특정 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 위해 생성되거나, 다른 재조합 뉴클레오티드 서열의 구성에 사용되는 재조합 핵산, 일반적으로 재조합 DNA를 의미한다. 구조물은 벡터 또는 게놈에 존재할 수 있습니다.
상기 용어 “재조합(recombination)”은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 재조합 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2 개 이상의 자연-발생 서열을 포함할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유한다. 세포가 재조합 핵산을 받으면, 상기 핵산은 세포에 대해 “외인성(exogenous)”이다.
상기 용어 “선택 가능한 마커(selectable marker)”는 도입된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주의 선택을 용이하게 하는 숙주에서 발현할 수 있는 단백질을 의미한다. 선택 가능한 마커의 예는 항균제 (예를 들어, 하이그로마이신(hygromycin), 블레오마이신(bleomycin) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol))에 대한 내성을 부여하는 단백질, 숙주 세포에 대한 영양적 이점과 같은 대사적 이점을 부여하는 단백질뿐만 아니라 세포에 기능적 또는 표현형 이점(예를 들어, 세포 분열)을 부여하는 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “발현(expression)”은 유전자의 핵산 서열에 기초하여 폴리펩티드가 생산되는 과정을 의미한다. 상기 과정에는 전사와 번역이 모두 포함된다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서, 상기 용어 “도입(introducing)”은 “형질 감염(transfection)”및 “형질 전환(transformation)”및 핵산을 세포로 도입하는 다른 모든 방법을 포함하며, 여기서 상기 핵산 서열은 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 색소체(plastid) 또는 미토콘드리아 DNA) 에 통합되거나 자율 레플리콘(autonomous replicon)으로 전환되거나 일시적으로 발현될 수 있다.
상기 용어 “코딩 서열(coding sequence)”은 적절한 조절 요소의 제어하에 배치될 때, 일단 전사되고 번역되면, 예를 들어 생체 내에서, 단백질을 생성하는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 코딩 서열은 연속적인 ORF를 가질 수 있거나 인트론 또는 비-코딩 서열의 존재에 의해 중단된 ORF를 가질 수 있다. 이 실시양태에서, 상기 비-코딩 서열은 성숙한 mRNA를 생성하기 위해 pre-mRNA로부터 스플라이싱된다.
하나의 유전자 좌위를 다른 유전자 좌위로 대체하는 맥락에서, 상기 용어 “교체(replacing)”는 단일 단계 프로토콜 또는 다단계 프로토콜을 의미한다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 것과 관련하여, 상기 용어 “도입된(introduced)”은 “형질 감염(transfection)”또는 “형질 전환(transformation)”또는 “형질 도입(transduction)”을 의미하고, 핵산 서열을 진핵 또는 원핵 세포로 통합하는 것에 대한 의미를 포함하며, 여기서 상기 핵산 서열은 세포에 일시적으로 존재하거나 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 색소체 또는 미토콘드리아 DNA)에 통합되어 자율 레플리콘으로 전환 될 수 있다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 것과 관련하여, 상기 용어 “도입된(introduced)”은 “형질 감염(transfection)”또는 “형질 전환(transformation)”또는 “형질 도입(transduction)”을 의미하고, 핵산 서열을 진핵 또는 원핵 세포로 통합하는 것에 대한 의미를 포함하며, 여기서 상기 핵산 서열은 세포에 일시적으로 존재하거나 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 색소체 또는 미토콘드리아 DNA)에 통합되어 자율 레플리콘으로 전환될 수 있다.
상기 용어 “복수(plurality)”는 적어도 2 이상, 적어도 5 이상, 적어도 10 이상, 적어도 20 이상, 적어도 50 이상, 적어도 100 이상, 적어도 200 이상, 적어도 500 이상, 적어도 1000 이상, 적어도 2000 이상, 적어도 5000 이상, 또는 10,000 이상 또는 적어도 50,000 이상을 의미한다. 특정 경우에, 복수는 적어도 10 내지 50을 포함한다. 다른 실시양태에서, 복수는 적어도 50 내지 1,000일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 “분리된(isolated)”은 세포와 관련하여, 시험관 내에서 배양되는 세포를 의미한다. 동물이 분리된 세포를 함유하는 것으로 설명되면, 그러한 분리된 세포를 시험관 내에서 배양한 다음 동물에 이식하였다.
상기 용어 “자손(progeny)”또는 “자식(off-spring)”은 특정 동물 또는 세포에서 유래된 및 후손인 모든 미래 세대를 의미한다. 따라서, 임의의 연속 세대의 동물인 자손은 여기에 포함되어, F1, F2, F3, 세대 등이 이 정의에 포함된다.
상기 문구 “트랜스제닉 동물(transgenic animal)”은 외래 핵산 (즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포를 포함하는 동물을 의미한다. 상기 외래 핵산은 상기 동물의 모든 세포 또는 동물의 모든 세포가 아닌 일부 세포에 존재할 수 있다. 상기 외래 핵산 분자는 “전이 유전자(transgene)”라고 하며, 하나 이상의 유전자, cDNA 등을 포함 할 수 있다. 전이 유전자를 수정된 난모세포(oocyte) 또는 초기 배아의 세포에 삽입함으로써, 상기 생성된 트랜스제닉 동물은 완전히 트랜스제닉이 될 수 있고 생식 계열에서 외래 핵산을 안정적으로 전달할 수 있다. 대안적으로, 외래 핵산은 예를 들어, 이를 함유하는 재조합 세포 또는 조직을 동물에 이식하여, 부분적으로 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해 도입될 수 있다. 대안적으로, 유전적으로 변형된 체세포로부터 핵을 전달하거나 배아 줄기 세포 또는 원시 생식 세포와 같은 유전적으로 변형된 다능성 세포의 전달에 의해 트랜스제닉 동물을 생산할 수 있다. 키메라 동물은 생식 계열에 있는 다른 동물에 의해 공여된 세포를 가질 수 있으며, 이 경우 상기 동물의 자손은 공여된 세포의 염색체에 대해 이형 접합일 수 있다. 상기 공여된 세포가 외인성 핵산(즉, 세포에 내인성이 아닌 핵산)을 포함하는 경우, 상기 키메라 동물의 자손은 “트랜스제닉(transgenic)”일 수 있으며, 여기서 “트랜스제닉(transgenic)”동물은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 포함하는 세포로 이루어진 동물이다. 상기 외래 핵산 분자는 본원에서 “전이 유전자(transgene)”로 불릴 수 있다.
상기 문구 “하이브리드 동물(hybrid animal)”“트랜스제닉 하이브리드 동물(transgenic hybrid animal)”등은 본원에서 특정 특성을 갖는 제1 동물 및 특정 특성을 갖는 제2 동물의 교미로부터 수득된 동물을 의미하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 하이브리드 동물은 공통 경쇄를 생성하는 트랜스제닉 제1 동물과 합성 중쇄를 생성하는 제2 트랜스제닉 동물의 교배로부터 얻은 트랜스제닉 자손을 의미할 수 있다. 하이브리드 동물은 면역화될 수 있고 항원-특이적 항체 생산을 위한 공급원으로 사용될 수 있다.
상기 용어 “항체(antibody)”및 “면역 글로불린(immunoglobulin)”은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 해당 분야의 사람들이 잘 이해하고 있으며, 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미한다. 항체의 한 형태는 항체의 기본 구조 단위로 구성한다. 이 형태는 사량체(tetramer)이며 두 개의 동일한 항체 사슬 쌍으로 구성되며 각 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 갖는다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 함께 항원에 대한 결합을 담당하고, 상기 불변 영역은 항체 이펙터 기능을 담당한다.
상기 인식된 면역글로불린 폴리펩티드는 카파(kappa) 및 람다(lambda) 경쇄와 상기 알파(alpha), 감마(gamma) (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타(delta), 엡실론(epsilon) 및 mu 중쇄 또는 다른 종의 등가물을 포함한다. 전장 면역글로불린(full-length immunoglubulin) “경쇄(light chain)”약 25 kDa 또는 약 214개 아미노산)는 NH2-말단에서 약 110개 아미노산의 가변 영역 및 COOH-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역을 포함한다. 전장 면역 글로불린 “중쇄(heavy chain)”약 50kDa 또는 약 446개 아미노산), 유사하게는 가변 영역 (약 116개 아미노산) 및 상기 언급한 중쇄 불변 영역 중 하나, 예를 들어 감마 (약 330개 아미노산)를 포함한다.
상기 용어 “항체(antibody)”및 “면역글로불린(immunoglobulin)”은 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 이소타입(isotype)의 항체 또는 면역 글로불린을 포함하며, Fab, Fv, scFv 및 Fd 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체, 및 항체의 항원-결합 부분과 비-항체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 항체는, 예를 들어 방사성 동위 원소, 검출 가능한 생성물을 생성하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출 가능하게 표지될 수 있다. 상기 항체는, 예를 들어 비오틴(biotin) (비오틴-아비딘(avidin) 특이적 결합 쌍의 구성원) 등과 같은 특정 결합 쌍의 구성원과 같은 다른 모이어티에 추가로 접합될 수 있다. 상기 항체는 또한 폴리스티렌 플레이트 또는 비드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 또한 상기 용어에는 Fab ', Fv, F (ab') 2 및 또는 항원에 대한 특이 적 결합을 유지하는 기타 항체 단편 및 모노클로날 항체가 포함된다.
항체는 예를 들어 Fv, Fab 및 (Fab ') 2뿐만 아니라 이중 기능성 (즉, 이중 특이 적) 하이브리드 항체(e.g., Lanzavecchia and Scheidegger, Eur. J. Immunol. 1987, 17(1):105-111) 및 단일 사슬(예를 들어, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988, 85(16):5879-5883 and Bird et al., Science. 1988, 242(4877):423-426, 이는 참고문헌으로 본원에 포함됨)을 포함하는 다양한 다른 형태로 존재할 수 있다(일반적으로, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. 1984, and Hunkapiller and Hood, Nature. 1986, 323(6083):15-16 참조).
키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 다른 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 일반적으로 유전 공학에 의해 구성된 항체이다. 예를 들어, 닭 또는 토끼 모노클로날 항체의 유전자의 가변 세그먼트는 감마 1 및 감마 3과 같은 인간 불변 세그먼트에 연결될 수 있다. 치료용 키메라 항체의 예는 닭 또는 토끼 항체의 가변 또는 항원-결합 도메인과 인간 항체의 불변 또는 이펙터 도메인(예를 들어, A.T.C.C. 기탁 번호 CRL 9688의 세포에 의해 만들어진 항-Tac 키메라 항체)으로 이루어진 하이브리드 단백질이지만, 다른 포유류 종이 사용될 수 있다.
상기 용어 “유사 유전자(pseudogene)”는 시작 및/또는 중지 코돈을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 비전사 핵산 영역을 설명하는 데 사용된다.
아미노산 서열은 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열이 인 실리코(in silico)로 번역되어 아미노산 서열을 생성할 수 있다는 점에서 유사 유전자에 의해 “인코딩(encoded)”될 수 있다. 상기 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자 좌위의 맥락에서 유사 유전자는 프로모터 영역, 재조합 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하지 않는다.
상기 용어 “상류(upstream)”및 “하류(downstream)”은 전사 방향과 관련하여 사용된다.
상기 용어 “특이적 결합(specific binding)”은 상이한 분석물의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 분석물에 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 특정 실시양태에서, 특이적 결합 상호 작용은 샘플에서 바람직하고 바람직하지 않은 분석물을 구별할 것이며, 일부 실시양태에서 약 10 배 이상 내지 100 배 이상 (예를 들어, 약 1000 배 또는 10,000 배 초과)일 것이다.
특정 실시양태에서, 항체/분석물 복합체에 특이적으로 결합될 때 항체와 분석물 사이의 친화성은 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8M 미만, 10-9M 미만, 10-10M 미만, 10-11M 미만, 또는 약 10-12M 미만의 KD (해리 상수)를 특징으로 한다.
중쇄 또는 경쇄 항체 사슬의 "가변 영역(variable region)"은 CDR1, CDR2 및 CD3 및 프레임 워크 영역을 함유하는 사슬의 N- 말단 성숙 도메인이다 (여기서 CDR은 “상보성 결정 영역(complementarity determining region)”을 나타냄). 상기 항체의 중쇄 및 경쇄는 모두 가변 도메인을 포함한다. 모든 도메인, CDR 및 잔기 번호는 서열 정렬 및 구조적 지식을 기반으로 할당된다. 프레임 워크 및 CDR 잔기의 식별 및 번호 매기기는 Chothia et al. 다른 사람에 의해 기재된다(Chotia et al., J. Mol. Biol. 1998, 278 (2) : 457-479).
VH는 항체 중쇄의 가변 도메인이다. VL은 항체 경쇄의 가변 도메인이다.
상기 용어 “유전자(gene)”및 “유전자 좌위(locus)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 두 용어 모두 유전자가 능동적으로 전사되거나 온전한 것을 의미하지 않는다. 두 용어 모두 비활성화 된 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, “키메라(chimeric)”닭은 적어도 2 개 이상의 공급원으로부터 상당한 수의 유전적으로 구별되는 세포를 함유하는 닭이다. 키메라 동물은 한 동물의 세포를 다른 동물의 배아에 이식하거나 배양된 세포 (예를 들어, 변형된 게놈을 가짐)를 배아에 이식하여 만들 수 있다. 상기 이식된 세포는 숙주 배아에 삽입되기 전에 배양 물로부터 수확 될 수 있다. 상기 배아는 동물로 발달하고 결과 동물은 이식된 세포뿐만 아니라 숙주의 세포를 함유할 수 있다. 상기 공여된 세포가 외인성 핵산 (즉, 세포에 내인성이 아닌 핵산)을 함유하는 경우, 상기 키메라 동물의 자손은 “트랜스제닉(transgenic)”일 수 있으며, 여기서 “트랜스제닉(transgenic)”동물은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포로 구성된 동물이다. 상기 외래 핵산 분자는 본원에서 “전이 유전자(transgene)”로 불릴 수 있다.
상기 용어 “비활성화된(inactivated)”은 유전자에 의해 인코딩된 단백질이 발현되지 않는다는 의미로 발현되지 않는 유전자를 나타 내기위한 것이다. 유전자는 유전자의 코딩 서열 및/또는 조절자 서열의 일부를 제거함으로써 비활성화될 수 있다. 파괴된 유전자, 예를 들어 "녹아웃(knockout)"은 비활성화된 유전자의 한 유형이다. 한때 발현된 내인성 서열을 함유하고 그 이후에도 발현되는 인간 면역 글로불린 서열로 대체된 유전자 좌위는 비활성화된 내인성 유전자를 함유한다. 이와 같이, 발현된 인간 면역 글로불린 서열을 함유하는 유전자 좌위는 내인성 면역 글로불린 유전자가 인간 면역 글로불린 서열로 대체된 경우에 비활성화된 내인성 면역 글로불린 유전자를 가질 수 있다. 많은 경우에, 이것은 내인성 서열을 녹아웃 (예를 들어, 서열의 적어도 일부의 결실에 의해)한 다음 상기 내인성 서열이 한 번 차지했던 위치에 인간 면역 글로불린 서열을 삽입함으로써 수행될 수 있다.
상기 용어 “재조합(recombination)”은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리 뉴클레오타이드 또는 폴리 펩타이드를 의미한다. 재조합 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2 개 이상의 자연-발생 서열을 포함할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 세포가 재조합 핵산을 받는 경우, 상기 핵산은 세포에 대해 “외인성(exogenous)”이다.
상기 용어 “유전적으로 연결된(genetically linked)”은 동일한 염색체에 존재하는 두 가지 유전적 요소를 의미하여 감수 분열 동안 유전적 요소가 함께 유전되는 경향이 있다.(즉, 요소는 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 재조합 빈도를 갖는다). 서로 밀접하게 연결된 두 가지 유전적 요소는 염색체 교차 이벤트 (또는 “재조합(recombination)”동안 서로 다른 염색체로 분리될 가능성이 적다. 재조합 과정에서 유전적으로 연결된 두 가지 요소가 분리될 가능성은 두 가지 요소 사이의 서열 양에 따라 달라지며, “재조합 빈도(recombination frequency)”라고 하는 가능성의 백분율로 계산할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 “공통 경쇄(common light-chain)”또는 “공통 면역 글로불린 경쇄(common immunoglobulin light-chain)”는 여러 중쇄 가변 영역과 쌍을 이루어 상이한 항원에 결합하는 항체를 생성할 수 있는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 상기 공통 경쇄는 항원 결합을 위한 수동적 파트너이며 항원 결합은 중쇄에 의해 결정된다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 2 개의 결합 특이성을 가지며, 어떤 경우에는 이중-특이적 항체의 두 팔이 동일한 경쇄 (즉, “공통”경쇄) 및 상이한 중쇄 (팔의 결합 특이성을 주로 결정함)를 갖는다.
본원의 공통 경쇄는 “사전-재배열된 경쇄 가변 영역(pre-rearranged light-chain variable region)”또는 “사전-재배열된 가변 영역”을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 정의된 서열을 가지며, 다양한 특이성의 항체를 생성하기 위해 다중 중쇄 가변 영역과 잘 짝을 이룰 수 있는 특성에 대해 선택되었다. 본원의 “공통 경쇄 이식 유전자(common light-chain transgene)”는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에서 공통 경쇄 코딩 서열 (또는 사전-재배열된 경쇄 가변 영역) 및 경쇄 불변 영역을 적어도 포함하는 이식 유전자 일 수 있다. 이 이식 유전자는 cDNA일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “기능성(functional)”은 상기 영역이 세포에 의해 전사되고 번역됨을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 “덜 다양화(less diversified)”“덜 다양함(less diverse)”“감소 다양 화(reduced diversification)”및 이들의 등가물은 동물에 의해 생성된 항체의 적어도 50% 이상의 경쇄 가변 영역을 의미하는 것으로 의도되며, 동물을 면역시키는 데 사용되는 항원에 특이적인 것은 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 또는 최대 5 개 아미노산 치환을 갖는 해당 서열의 변형된 버전을 가지고 있다. 예를 들어, 상기 동물에 의해 생산된 일부 항체의 경쇄 가변 영역은 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일하며, 일부는 하나의 아미노산 치환을 제외하고 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 일부는 두 개의 아미노산 치환을 제외하고 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 일부는 3 개의 아미노산 치환을 제외하고 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 일부는 4 개의 아미노산 치환을 제외하고 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 일부는 5 개의 아미노산 치환을 제외하고 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 최대 5 개의 아미노산 치환을 제외하고 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체의 총 수는 동물에 의해 생성된 상이한 항원 특이적 항체의 대부분(상기 항원-특이적 항체의 적어도 50% 이상, 적어도 80% 이상 또는 적어도 90% 이상)을 나타내는 아미노산 서열을 가질 것이다. 나머지 항체 (즉, 6 개 이상, 7 개 이상 또는 8 개 이상의 아미노산 치환을 함유하는 것은 소수에 해당한다).
추가 정의는 본 명세서의 다른 곳에서 찾을 수 있다.
예시적인 실시양태의 설명
본 발명이 추가로 설명되기 전에, 본 발명은 설명 된 특정 실시 예에 제한되지 않고, 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명시하지 않는 한 각각 중간 값은 하한 단위의 10 분의 1까지로 이해되며, 그 범위의 상한 및 하한과 그 언급 된 범위의 임의의 다른 언급되거나 기재된 값 사이는 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 방법 및/또는 자료를 기재하고 설명하기 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", " 및(and)" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야한다. 따라서, 예를 들어, “세포(a cell)”에 대한 언급은 복수의 세포를 포함하고 “후보 물질(a candidate agent)”에 대한 언급은 하나 이상의 후보 물질에 대한 언급 및 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함한다. 상기 청구 범위는 임의의 선택적 요소를 배제하기 위해 작성될 수 있다는 점에 유의한다. 따라서, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 “부정적인(negative)”제한의 사용과 관련하여 “단독(solely)”“오직(only)”등과 같은 배타적인 용어 사용에 대한 선행 기반으로 사용되도록 의도되었다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 공개를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공보에 선행 할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공되는 발행일은 개별 확인이 필요한 실제 발행일과 다를 수 있다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 바와 같이 본원에 참조로 포함되며, 이와 관련된 출판물이 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 참조로 본원에 포함된다. 모든 간행물의 인용은 출원일 이전의 공개를 위한 것이며 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공되는 발행일은 개별 확인이 필요한 실제 발행일과 다를 수 있다.
본 기재 내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별 실시양태는 본 발명의 범위 또는 정신으로부터 이탈하지 않고 다른 몇몇 실시양태의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성 요소 및 특징을 갖는다. 언급된 모든 방법은 언급된 이벤트의 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 트랜스제닉 동물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 동물은 비교적 적은 수의 경쇄 유전자를 갖는 임의의 비-인간 동물이거나, 1 차 항원 레퍼토리를 개발하기 위해 유전자 전환을 사용하는 동물일 수 있으며, 따라서 동물은 다양한 다른 동물 중 하나일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 동물은 조류, 예를 들어 닭 또는 칠면조와 같은 순계목(Galliformes)의 구성원, 또는 오리 또는 거위와 같은 기러기목의 구성원, 또는 포유 동물, 예를 들어 토끼와 같은 토끼목 또는 소, 양, 돼지 또는 염소와 같은 가축일 수 있다.
본원의 일부는 하나 이상의 전이 유전자를 함유하는 트랜스제닉 닭에 관한 것이다. 많은 동물의 면역 글로불린 유전자 좌위의 뉴클레오티드 서열과 그러한 동물의 게놈을 변형하는 방법이 알려져 있기 때문에, 아래에 설명된 일반적인 개념은 임의의 적합한 동물, 특히 1 차 항원 레파토리를 개발하기 위해 유전자 전환을 사용하는 동물에 쉽게 적용할 수 있다. 전사된 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자의 가변 영역과 상이한 가변 영역을 함유하는 작동 가능하게 연결된 (상류) 유사 유전자 간의 유전자 전환에 의한 항체 다양성의 생성은 다음과 같이, 예를 들어, Butler (Rev. Sci. Tech. 1998 17: 43-70), Bucchini (Nature 1987 326: 409-11), Knight (Adv. Immunol. 1994 56: 179-218), Langman (Res. Immunol. 1993 144: 422-46), Masteller (Int. Rev. Immunol. 1997 15: 185-206), Reynaud (Cell 1989 59: 171-83) 및 Ratcliffe (Dev. Comp. Immunol. 2006 30: 101-118)과 같은 다양한 간행물에 설명되어 있다. US20110055938도 참조한다.
다른 것들 중에서, 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위(endogenous immunoglobulin light chain locus)를 포함하는 게놈(genome)을 포함하는 항체 다양화를 위해 유전자 변환을 사용하는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 트랜스제닉 닭)이 제공된다: (a) 경쇄 가변 영역(즉, “기능성 V 영역(functional V region)”을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 면역글로블린 경쇄 유전자; 및 (b) 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 유전자 전환에 의해, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산에 뉴클레오티드 서열을 기증하는 다수의 유사 유전자(pseudogenes)를 포함하며, 상기 유사 유전자가 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있으며, 각각의 상기 유사 유전자는 (a)의 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산을 인코딩한다. 다른 말로, 상기 기능성 유전자와 유사 유전자에 의해 인코딩된 서열은 동일하여 상기 기능성 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역의 임의의 돌연변이가 유전자 변환을 통해 유사 유전자에 의해 복구될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유사 유전자는 기능성 유전자에서 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산의 적어도 일부 (예를 들어, 적어도 50% 이상, 적어도 80% 이상 또는 적어도 90% 이상)와 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 그러나, 상기 유전적 코드의 퇴행성은 동일한 아미노산 서열이 다른 염기 서열에 의해 암호화 되도록한다. 이와 같이, 일부 실시양태에서, 상기 유사 유전자는 기능성 유전자에서 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산의 적어도 일부와 거의 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 동일해야하며 이들의 서열 동일성은 유전자 전환이 일어나기에 충분해야한다. 이러한 실시양태에서, 상기 유사 유전자의 뉴클레오티드 서열은 기능성 유전자의 가변 영역에 대한 코딩 서열과 적어도 90% 이상 동일(예를 들어, 적어도 95 % 동일)해야 한다. 이 실시양태는 도 1에 예시되어 있다. 도 2는 상기 기능성 V 영역의 돌연변이가 유전자 변환을 통해 유사 유전자에 의해 복구될 수 있는 방법을 보여준다.
일부 실시양태에서, (a)의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 가변 (V) 세그먼트 및 연결 (J) 세그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, (a)의 경쇄 가변 영역은 인간 배선 경쇄 V 세그먼트 및 인간 배선 경쇄 J 세그먼트에 의해 코딩될 수 있다. 다른 말로, V 및 J 세그먼트에 의해 인코딩된 서열은 인간 생식 계열 서열이어야한다. 이러한 실시양태에서, (a)의 경쇄 가변 영역의 V 세그먼트는 생식 계열 경쇄 카파 V 세그먼트 또는 생식 계열 경쇄 람다 V 세그먼트에 의해 인코딩될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 유사 유전자는 V 세그먼트와 동일한 아미노산 서열의 적어도 일부를 코딩할 수 있다. 상기 경쇄 가변 영역은 인간 모노클로날 항체에서 유래할 수 있다. 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, 상기 C 영역은 별도의 엑손에 의해 인코딩될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 상기 경쇄 C 영역은 V 및 J 세그먼트와 동일한 개방 판독 프레임에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 유사 유전자는 길이가 400 nt 미만, 예를 들어 길이가 200-400 뉴클레오티드 또는 길이가 300-400 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 최대 30 개, 예를 들어 최대 20 개 또는 최대 10 개의 유사 유전자가 존재한다.
상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 경쇄 유전자 좌위에 대해 이형 접합성 또는 동형 접합성일 수 있다. (a) 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역화하는 단계; 및 (b) 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 동물로부터 수득하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 상기 트랜스제닉 동물의 B 세포를 사용하여 하이브리도마를 만드는 단계; 및 (d) 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하기 위해 상기 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 B 세포는 하이브리도마를 만들지 않고 스크리닝될 수 있다. 이 방법은 PCR을 사용하여 트랜스제닉 동물의 B 세포로부터 적어도 중쇄 가변 영역-인코딩 핵산을 증폭하고, 상기 증폭된 핵산을 사용하여 재조합 항체를 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 경쇄 서열은 이미 알려져 있어야 하며 서열화할 필요가 없다.
또한, 트랜스제닉 동물에 의해 생산된 폴리클로날 항체가 제공되며, 상기 항혈청 중 항체의 적어도 50% 이상 (예를 들어, 적어도 60% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상 또는 적어도 90% 이상)은 실질적으로 동일한 경쇄 서열 (예를 들어, 서로 적어도 90% 이상, 적어도 95 이상 또는 적어도 98% 이상인 경쇄 가변 도메인 경쇄 가변 도메인 기능적 V 영역 코딩 서열에 대한 5 개 (즉, 0, 1, 2, 3, 4 또는 5) 아미노산 치환을 함유함)을 갖는다. 또한, 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 적어도 100개 이상의 B 세포 (예를 들어, 1,000, 10,000 또는 100,000개 B 세포)의 집단이 제공되며, 상기 B 세포는 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 생성하고 상기 경쇄는 B 세포의 적어도 50% 이상(예를 들어, 적어도 60% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상 또는 적어도 90% 이상)에 의해 생성된 경쇄는 실질적으로 동일한 경쇄 서열(예를 들어, 서로 적어도 90% 이상, 적어도 95 이상 또는 적어도 98% 이상인 경쇄 가변 도메인 경쇄 가변 도메인 기능적 V 영역 코딩 서열에 대한 5 개 (즉, 0, 1, 2, 3, 4 또는 5) 을 갖는다.
상기 동물의 중쇄 유전자 좌위는 야생형이거나 변형되었을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 중쇄 유전자 좌위는 인간 서열로 구성된 중쇄 서열 (예를 들어, PCT/US19/20799, 2918, 2019 년 3 월 5 일에 출원되었으며 참조로 통합됨), 예를 들어 인간 생식 계열 서열을 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 중쇄 유전자 좌위는 기능성 인간 VH 서열 및 VH 유사 유전자를 함유할 수 있으며, 여기서 VH 유사 유전자는 유전자 전환을 통해 기능 인간 VH 서열을 다양화한다.
일부 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 동물은 다음을 포함하는 “합성(synthetic)" 면역 글로불린 중쇄 (IgH) 유전자 좌위( "SynV")를 추가로 포함하는 게놈을 가질 수 있다: a) i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및 ii) 중쇄 프레임 워크;를 포함하는 중쇄 가벼 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 IgH 유전자; 및 b) i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및 ii) 아미노산 서열이 a) (ii)의 중쇄 프레임워크와 동일한 중쇄 프레임 워크 영역을 각각 포함하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 복수의 유사 유전자; 상기 재조합 IgH 유전자 좌위는 다음을 포함한다: 작동 가능한 연결에서: 인트론 영역, 불변 도메인 영역-암호화 영역 및 3‘비-번역 영역; 인트론 영역의 적어도 일부는 트랜스재닉 동물의 게놈에 내인성이고; a)의 핵산 및 b)의 유사 유전자는 트랜스 제닉 동물의 게놈에 외인성이고, 상기 복수의 유사 유전자는 기능성 IgH 유전자에 작동 가능하게 연결되고 형질 전환 동물에서의 유전자 전환에 의해 a)의 핵산에 뉴클레오타이드 서열을 기증하며; 상기 트랜스제닉 동물은 다양한 형태의 기능성 IgH 가변 영역을 포함하는 재조합 면역 글로불린을 발현한다. 상기 동물은 변형된 중쇄 유전자 좌위에 대해 동형 접합성 또는 이형 접합성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 V 영역의 코딩 서열은 사전-재배열 된 가변 영역 또는 cDNA를 포함하는 면역 글로불린 경쇄를 인코딩할 수 있다.
도면에 나타난 바와 같이, 상기 경쇄 유전자 좌위는 항체의 경쇄를 생성하기 위해 발현(즉, 나중에 번역되는 mRNA를 생성하기 위해 전사됨)되는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자를 포함하고, 기능성 경쇄 유전자, 복수의 상이한 유사 유전자 경쇄 가변 영역에 작동 가능하게 연결(이 경우에는 닭고기이고 다른 많은 종은 바로 상류에 있습니다)되며, 여기서 상기 유사 유전자의 가변 영역은 유전자 전환(즉, 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자 가변 영역의 서열을 유사 유전자 가변 영역의 서열로 대체함)에 의해 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자의 서열을 변경한다는 점에서 기능성 면역 글로불린 경쇄에 작동 가능하게 연결된다. 상기 트랜스제닉 동물에서 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자 가변 영역과 유사 유전자 가변 영역 사이의 유전자 전환은 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자 가변 영역의 서열을 상기 가변 영역의 전체 길이까지 단일 코돈만큼 적게 변경한다. 특정 경우에, 유사 유전자 가변 영역은 유사 유전자 가변 영역으로부터의 적어도 하나 이상의 CDR (예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3)의 서열을 상기 기능성 유전자의 가변 영역으로 공여할 수 있다. 따라서 상기 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 항체의 경쇄는 유사 유전자 가변 영역에서 기능성 경쇄 유전자의 가변 영역으로 공여된 모든 서열에 의해 인코딩된다. 상기 유사 유전자에 의해 인코딩된 가변 영역이 서로 동일하고 상기 기능성 경쇄 유전자의 가변 영역과 동일하기 때문에, 유전자 변환은 예를 들어 친화성 성숙 동안 B 세포에서 만들어진 많은 돌연변이를 복구한다.
마찬가지로, 상기 트랜스제닉 동물은 항체의 중쇄를 생성하기 위해 전사되고 번역되는 기능성 면역 글로불린 중쇄 유전자, 및 기능성 중쇄 유전자에 작동 가능하게 연결된(예를 들어, 바로 상류에) 다수의 상이한 유사 유전자 중쇄 가변 영역을 또한 함유할 수 있으며, 여기서 유사 유전자의 가변 영역은 유전자 전환에 의해 기능성 면역 글로불린 중쇄 유전자의 서열을 변경한다는 점에서 기능성 면역 글로불린 경쇄에 작동 가능하게 연결된다.
상기 트랜스제닉 동물에서, 상기 기능성 면역 글로불린 중쇄 유전자 가변 영역과 유사 유전자 가변 영역 사이의 유전자 전환은 상기 기능성 면역 글로불린 중쇄 유전자 가변 영역의 서열을 상기 가변 영역의 전체 길이까지 단일 코돈만큼 적게 변경한다. 특정 경우에, 유사 유전자 가변 영역은 유사 유전자 가변 영역으로부터 상기 기능성 유전자의 가변 영역으로 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3)의 서열을 기증할 수 있다. 따라서 상기 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 항체의 중쇄는 유사 유전자 가변 영역에서 기능성 중쇄 유전자의 가변 영역으로 공여된 모든 서열에 의해 인코딩된다.
따라서 상기 트랜스제닉 동물에 의해 생산된 항체는 유사 유전자 가변 영역에서 기능성 유전자의 가변 영역으로 공여되는 모든 서열에 의해 인코딩된다. 상기 동물의 다른 세포에서 다른 서열이 공여되기 때문에, 상기 동물의 항체 레퍼토리는 어떤 서열이 유사 유전자 가변 영역에서 기능 유전자의 가변 영역으로 공여되는지에 따라 결정된다.
특정 실시양태에서, 상기 경쇄 생식 계열 서열이 인간 VK 서열로부터 선택되며ㅡ 이는 A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4, 및 O8을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정(certain) 실시양태에서, 상기 경쇄 인간 생식계열 프레임 워크는 V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, 및 V5-6로부터 선택된다. 상이한 생식 계열 서열에 대한 설명은 PCT/WO 2005/005604를 참조한다.
일부 실시양태에서, 상기 도입된 전사 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열은 인간일 수 있으며, 즉 인간 항체 또는 생식 계열 서열의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 CDR 및 프레임 워크는 모두 인간일 수 있다. 다른 실시양태에서, 도입된 전사된 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열은 인간이 아니고, 대신 인간 서열과 적어도 80% 이상 동일, 적어도 90% 이상 동일, 적어도 95% 이상 또는 그 이상 동일할 수 있다. 예를 들어, 인간 서열에 비해 도입된 전사 가변 영역은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 불변 도메인-인코딩 영역, 인트론의 일부 및 기능성 유전자의 3'UTR을 포함하는 경쇄 유전자 좌위의 일부는 동물 및 경쇄 유전자 좌위의 나머지 부분에 내인성일 수 있고, 기능성 유전자의 가변 영역, 인트론 및 유사 유전자의 나머지 부분은 동물에 외인성일 수 있으며, 즉, 기능성 경쇄 유전자가 생성되고 유사 유전자가 유전자 전환에 의해 기능적 경쇄 유전자에 서열을 제공할 수 있도록 재조합적으로 만들어지고 불변 도메인, 부분 인트론 및 3 'UTR에 근접한 동물에 도입될 수 있다. 특정 경우에 상기 동물의 경쇄 유전자 좌위는 작동 가능한 연결에서: 인트론 영역, 불변 도메인-인코딩 영역 및 3 '비-번역 영역; 상기 인트론 영역, 불변 도메인-인코딩 영역 및 3 '비-번역 영역은 상기 트랜스제닉 동물의 게놈 및 복수의 유사 유전자 경쇄 가변 영역에 내인성이며, 여기서 복수의 유사 유전자 경쇄 가변 영역은 상기 트랜스제닉 동물의 게놈에 대해 외인성이다. 상기 불변 도메인 인코딩 영역은 인간일 수 있거나 상기 트랜스제닉 동물의 게놈에 대해 외인성일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 불변 영역은 기능성 유전자의 오픈 리딩 프레임에서 인코딩될 수 있다.
마찬가지로, 상기 불변 영역, 인트론 영역의 일부 및 기능성 유전자의 3'UTR을 포함하는 중쇄 유전자 좌위의 일부는 동물 및 중쇄 유전자 좌위의 나머지 부분에 내인성일 수 있고, 상기 기능성 유전자, 나머지 인트론 및 유사 유전자는 동물의 외인성일 수 있으며, 즉, 기능성 유전자가 생성되고 유사 유전자가 유전자 변환에 의해 기능성 유전자에 서열을 공여할 수 있는 방식으로 재조합적으로 만들어져 불변 도메인, 부분 인트론 및 3 'UTR에 근접한 동물에 도입된다. 특정 경우에, 상기 동물의 중쇄 유전자 좌위는 작동 가능한 연결에서: 인트론 영역, 불변 도메인-인코딩 영역 및 3'비-번역 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 인트론 영역, 불변 도메인-인코딩 영역 및 3'비-번역 영역은 트랜스제닉 동물의 게놈에 내인성이고, 복수의 유사 유전자 중쇄 가변 영역은 트랜스제닉 동물의 게놈에 대해 외인성인 복수의 유사 유전자 중쇄 가변 영역이다.
특정 실시양태에서, 개체 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 항체는 내인성 불변 도메인 및 상기 동물에 대해 외인성인 가변 도메인을 함유할 수있다. 내인성 불변 영역이 이들 실시양태에서 사용될 수 있기 때문에, 상기 항체는 여전히 클래스 전환 및 친화성 성숙을 겪을 수 있으며, 이는 상기 동물이 정상적인 면역계 발달을 겪고, 정상적인 면역 반응을 일으킬 수 있게한다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 닭은 IgM, IgY 및 IgA를 인코딩하는 중쇄 유전자 좌위에 3 개의 내인성 불변 영역을 갖는다. B 세포 발달의 초기 단계에서 B 세포는 IgM을 발현한다. 친화성 성숙이 진행됨에 따라, 클래스 전환은 불변 영역을 IgY 또는 IgA로 변환한다. IgY는 난황에 축적된 비축량을 통해 약 200mg의 IgY를 받는 성인과 신생 병아리 모두에게 체액성 면역을 제공한다. IgA는 주로 림프 조직 (예를 들어, 비장, Peyer의 패치 및 Harderian 땀샘) 및 난관에서 발견된다. 다른 실시양태에서, 상기 불변 영역은 인간 불변 영역일 수 있다.
경쇄 및/또는 중쇄 유전자 좌위에 존재하는 도입된 유사 유전자 가변 영역의 수는 다양할 수 있으며, 특정 실시양태에서 1-50, 예를 들어, 2 내지 50 또는 10 내지 25의 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 복수의 유사 유전자 경쇄 가변 영역 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 적어도 2 개 이상, 적어도 3 개 이상, 적어도 5 개 이상, 적어도 10 개 이상)은 전사된 경쇄 가변 영역에 대해 역 방향일 수 있다. 마찬가지로, 특정 실시양태에서, 복수의 유사 유전자 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 적어도 2 개 이상, 적어도 3 개 이상, 적어도 5 개 이상, 적어도 10 개 이상)은 중쇄 전사된 가변 영역에 대해 역 방향일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 복수의 유사 유전자 가변 영역은 교대 방향이 아니며, 특정 경우에 전사된 가변 영역에 대해 반대 방향인 일련의 적어도 5 개 이상 또는 적어도 10 개 이상의 인접한 유사 유전자 영역을 함유 할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 전사된 가변 영역으로부터 가장 먼 유사 유전자 영역은 상기 전사된 가변 영역과 동일한 방향에 있고, 가장 먼 영역과 상기 전사된 가변 영역 사이의 유사 유전자 영역은 전사된 가변 영역에 대해 반대 방향이다.
유사 유전자는 전형적으로 전사된 영역의 서열과 적어도 80% 이상 동일, 예를 들어 적어도 85% 이상 동일, 적어도 90% 이상 동일 또는 적어도 95% 이상 동일한 적어도 50개 이상, 적어도 100개 이상, 적어도 200개 이상 또는 적어도 300개 이상의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
대체 실시양태
대안인 실시양태는 다음을 포함하는 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위를 포함하는 게놈을 포함하는, 항체 다양화를 위한 유전자 전환을 사용하는 트랜스제닉 동물을 제공한다: 항체 코딩 서열의 직렬 배열을 포함하는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자. 여기서 상기 직렬 어레이의 각 핵산은 경쇄 가변 도메인 및 불변 영역을 인코딩하고 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 상기 어레이의 각 코딩 서열은 동일한 아미노산 서열을 인코딩한다. 이 실시양태는 도 3에 개략적으로 도시되어 있다. 임의의 실시양태에서, 적어도 2 개 이상(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 예를 들어, 5-30)의 코딩 서열이 있을 수 있다. 임의의 실시양태에서, 상기 코딩 서열은 미리 배열된 V 세그먼트, J 세그먼트 및 C 영역을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 미리 배열된 V 세그먼트, J 세그먼트 및 C 영역은 모두 인간 생식 계열 항체 서열을 인코딩할 수 있다. 임의의 실시양태에서, 상기 경쇄 가변 도메인은 인간 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 상기 유전자 좌위는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 작동 가능하게 연결되고 유전자 전환에 의해 뉴클레오티드 서열을 항체 코딩 서열의 직렬 어레이에 제공하는 복수의 유사 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 유사 유전자는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자의 상류 또는 하류이고, 직렬 어레이에서 항체 코딩 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 임의의 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 동물은 닭일 수 있다. 이 유전자 좌위 및/또는 중쇄 유전자 좌위에 있을 수 있는 다양한 성분에 대한 옵션은 상기와 하기에 설명되어 있다. 사용 방법은 하기에 설명되어 있다.
이들 실시양태에서, 모든 코딩 서열은 (사전 재배열될 수 있는) 상응하는 수의 전장 경쇄를 생성하기 위해 독립적으로 전사되고 번역되어야한다. 개별 반복에서 발생하는 돌연변이는 동일한 돌연변이가 없어야하는 다른 복사본에 의해 희석된다. 따라서 각 세포에서 발현되는 경쇄 풀은 탠덤 복제(tandem copies)에 의해 생성된 단백질의 혼합물이 될 것이며, 표적에 대한 기능성 결합에 대한 면역 반응 동안 단일 경쇄 서열이 선택되지 않을 것이다. 이 시스템을 사용하여 생산된 경쇄는 일반적인 경쇄여야한다.
전술한 트랜스제닉 동물은 동물의 게놈을 재조합적으로 변형하여 만들 수 있다. 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스 및 닭 등을 생산하는 방법이 알려져 있고, 특히 유전자 전환을 사용하는 동물의 게놈을 변형하는 방법도 알려져 있으며(예를 들어, 조류에 대하여 Sayegh, Vet. Immunol. Immunopathol. 1999 72:31-7 및 Kamihira, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004 91: 171-89를 참조하고, 토끼에 대하여, Bosze, Transgenic Res. 2003 12 :541-53 및 Fan, Pathol. Int. 1999 49: 583-94 참조하고, 소에 대하여 Salamone J. Biotechnol. 2006 124: 469-72를 참조), 많은 종의 생식 계열 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위의 구조 및/또는 서열과 같이(예를 들어., Butler Rev Sci Tech 1998 17:43 - 70 및 Ratcliffe Dev Comp Immunol 2006 30: 101-118), 상기 기재된 동물은 본원에 주어진 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 트랜스제닉 닭을 만드는 방법은 알려져있다. 예를 들어, 8,592,644, US8,889,662, Collarini et al (Poult Sci. 2015 94: 799-803), van de Lavoir (Nature. 2006 441: 766-9) 및 Schusser et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 110: 20170-5 참조.
또한 일반적인 경쇄를 함유하는 항체를 생산하는 방법도 제공된다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 항원으로 상기 기재된 바와 같은 트랜스제닉 동물을 면역화하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 항체가 폴리클로날인 경우, 상기 방법은 동물로부터의 출혈로부터 항체를 분리하는 것을 포함 할 수 있다. 상기 동물이 공통 경쇄 서열에 대해 동형 접합성인 경우, 상기 폴리클로날 항혈청의 모든 항체는 동일한 경쇄를 가져야한다. 모노클로날 항체가 필요한 경우, 상기 방법은 b) 면역화된 트랜스제닉 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 만드는 단계; c) 하이브리도마를 스크리닝하여 항원-특이적 하이브리도마를 확인하는 단계; 및 d) 항원-특이적 하이브리도마로부터 항원-특이적 항체를 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 동물은 다음으로 면역될 수 있다: GD2, EGF-R, CEA, CD52, CD20, Lym-1, CD6, 보체 활성화 수용체(complement activating receptor, CAR), EGP40, VEGF, 종양-관련 당단백질(tumor-associated glycoprotein) TAG-72 AFP (알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)), BLyS (TNF 및 APOL - 관련 리간드(TNF and APOL - related ligand)), CA125 (암종 항원(carcinoma antigen) 125), CEA (암 배아 항원(carcinoembrionic antigen)), CD2 (T-cell 표면 항원), CD3 (TCR과 관련된 이종 다량체(heteromultimer)), CD4, CD11a (인테그린 알파-L(integrin alpha-L)), CD14 (단핵구 분화 항원(monocyte differentiation antigen)), CD20, CD22 (B-cell 수용체), CD23 (낮은 친화성 IgE 수용체), CD25 (IL-2 수용체 알파 사슬(receptor alpha chain)), CD30 (사이토카인 수용체), CD33 (골수세포(myeloid cell) 표면 항원), CD40 (종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor)), CD44v6 (백혈구(leukocytes) 유사 매개), CD52 (CAMPATH-1), CD80 (CD28 및 CTLA-4 용 공종 자극기(costimulator)), 보체 성분(complement component) C5, CTLA, EGFR, 에오탁신(eotaxin) (사이토카인 A11), HER2/neu, HER3, HLA-DR, HLA-DR10, HLA ClassII, IgE, GPiib/iiia (인테그린), 인테그린(Integrin) aVβ3, 인테그린 a4β1 및 a4β7, 인테그린 β2, IFN-감마, IL-1ß, IL-4, IL-5, IL-6R (IL6 수용체), IL-12, IL-15, KDR (VEGFR-2), 루이스(lewisy), 메조텔린(mesothelin), MUC1, MUC18, NCAM (신경세포 부착 분자(neural cell adhesion molecule)), 암 태아 피브로넥틴(oncofetal fibronectin), PDGFß(베타 혈소판-유래 성장 인자 수용체(Beta platelet-derived growth factor receptor)), PMSA, 신장 암 항원(renal carcinoma antigen) G250, RSV, E-Selectin, TGFbeta1, TGFbeta2, TNFα, DR4, DR5, DR6, VAP-1 (혈관 접착 단백질 1(vascular adhesion protein 1)) 또는 VEGF, 등을 통해 치료용 항체를 생산할 수 있다.
상기 항원은 보조제와 함께 또는 보조제없이 임의의 편리한 방식으로 트랜스제닉 숙주 동물에게 투여될 수 있고, 미리 결정된 일정에 따라 투여 될 수 있다.
상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자가 인간인 임의의 실시양태에서, 상기 내인성 유사 유전자는 존재하거나 부존재일 수 있다. 예를 들어, 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자가 인간 생식 계열 서열로 구성되면 내인성 닭 유사 유전자가 존재하거나 부존재일 수 있다. 상기 내인성 닭 유사 유전자가 존재하는 경우, 서열 동일성이 유전자 변환에 너무 낮기 때문에 기능성 유전자에 어떤 서열도 기여하지 않을 것이다.
면역화 후, 상기 면역화된 트랜스제닉 동물의 혈청 또는 우유는 상기 항원에 특이적인 제약 등급 폴리클로날 항체의 정제를 위해 분획화될 수 있다. 트랜스제닉 조류의 경우, 계란 노른자를 분별하여 항체를 만들 수도 있다. 농축되고 정제된 면역 글로불린 분획은 크로마토그래피 (친화성, 이온 교환, 겔 여과 등), 황산 암모늄과 같은 염, 에탄올과 같은 유기 용매 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체를 사용한 선택적 침전에 의해 수득할 수 있다.
모노클로날 항체를 만들기 위해, 항체-생산 세포, 예를 들어 비장 세포는 상기 면역화된 트랜스제닉 동물로부터 분리되고 하이브리도마 생산을 위해 형질 전환된 세포주와의 세포 융합에 사용될 수 있거나, 항체를 인코딩하는 cDNA는 표준 분자 생물학 기술에 의해 복제되고 형질 감염된 세포에서 발현된다. 상기 모노클로날 항체를 만드는 절차는 당업계에 잘 확립되어있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 0 583 980 A1, U.S. Pat. 미국 특허 번호 4,977,081, WO 97/16537 및 EP 0 491 057 B1 참조, 이의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 클로닝된 cDNA 분자로부터 모노클로날 항체의 시험관 내 생산은 Andris-Widhopf et al., , J Immunol Methods 242:159 (2000), and by Burton, Immunotechnology 1:87 (1995)에 의해 기재되어 있으며, 상기 기재는 본원에 참조로 사용된다.
상기 항체가 아직 인간 프레임 워크 영역을 포함하지 않는 경우, 상기 방법은 항체를 인간화하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 방법은 항체의 불변 도메인을 인간 불변 도메인으로 스와핑하여 키메라 항체를 제조하는 단계 포함할 수 있을뿐만 아니라 특정 경우에 예를 들어, CDR 이식 또는 재포장 등에 의한 항체의 가변 도메인을 인간화하는 단계를 포함할 수 있다. 인간화는 Winter(Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), U.S. Pat. Nos. 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5,814,476, 5,763,192, 5,723,323, 5,766,886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 각각은 여기에 인용된 참고 문헌을 포함하여 전체적으로 본 명세서에 포함된다.
이와 같이, 트랜스제닉 동물에 더하여, 상기 트랜스 제닉 동물을 항원으로 면역화하는 단계 및 트랜스제닉 동물로부터 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 트랜스제닉 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 만드는 단계; 및 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하기 위해 상기 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 대안적으로 B 세포는 하이브리도마를 만들지 않고 스크리닝 될 수 있다. 다른 항원에 결합하는 모노클로날 항체가 분리되면, 임의의 편리한 방법을 사용하여 이중-특이적 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 2 개의 중쇄 서열은 단일 공통 경쇄와 함께 단일 숙주 세포에서 발현될 수 있으며, 이 경우 이들 세포에 의해 분비되는 항체의 일부는 이중-특이적이어야 한다. 대안적으로, 2 개의 중쇄 및 상기 공통 경쇄는 개별적으로 발현되고 시험 관내에서 함께 폴딩 또는 결합될 수 있다.
이 동물에 의해 생성된 모든 항체는, 유전자 전환에 의해 복구되지 않은 비교적 적은 수의 아미노산 치환 (예 : 1-5 개 치환)을 제외하고는 동일해야하는 경쇄를 가져야한다.
상기 항체의 중쇄 가변 도메인은 동물의 면역 체계에 의해 “자연적으로(naturally)”만들어진다. 이러한 항체는 특정 경우에, 사익 숙주 세포에 의해 번역-후 변형 (예를 들어, 글리코실화)될 수 있고, 트랜스제닉 동물 종의 특징적인 글리코실화 패턴 및 조성물을 가질 수 있다.
필요한 경우, 동일한 전략이 동물의 중쇄 다양성을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 동물은 기능성 중쇄 유전자 및 그 유전자와 동일한 서열을 인코딩하는 유사 유전자를 함유할 것이다.
상기 기재된 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 항체의 항원-특이적 결합 영역의 서열은 원하는 경우, 중쇄 가변 도메인의 다양화된 집단에 대한 전부 또는 임의의 코딩 서열이 한 쌍의 PCR 프라이머를 사용하여 cDNA로부터 증폭될 수 있기 때문에 비교적 간단하게 얻을 수 있다. 각 항체의 특이성 및 친화성은 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열에 의해서만 결정되어야 하기 때문에, 동족 경쇄를 확인하거나 서열화할 필요가 없다. 따라서 항원-특이적 중쇄 가변 도메인에 대한 아미노산 서열은 비교적 쉽게 얻을 수 있어야한다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, B 세포 또는 하이브리도마는 항원-특이적 중쇄를 발현하는 세포를 선택하기 위해 기능적으로 스크리닝 될 수 있다. 중쇄 가변 도메인 코딩 서열은 농축되거나 농축되지 않은 B 세포 집단 (예를 들어, PBMC)에서 일제히(en masse) 증폭될 수 있다. 비-농축 B 세포 집단에서 서열이 증폭되는 경우, 항원-특이적 가변 도메인을 인코딩하는 서열은 항원-특이적이 아닌 서열 (B 세포 활성화로 인해)보다 더 많이 발현되고 잠재적으로 더 다양한 클레드(clades)에 속하기 때문에 식별 가능해야 한다. 게다가, 이들 중쇄는 결합을 위해 특정한 경쇄를 필요로 하지 않기 때문에, 후속 작업을 수행하기 전에 어떤 경쇄와 어떤 중쇄가 쌍을 이루는지 결정할 필요가 없다.
항목(CLAUSES)
실시양태 1. 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위(endogenous immunoglobulin light chain locus)를 포함하는 게놈(genome)을 포함하는 항체 다양화를 위해 유전자 변환을 사용하는 트랜스제닉 동물로서,
(a) 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 면역글로블린 경쇄 유전자; 및
(b) 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 유전자 전환에 의해, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산에 뉴클레오티드 서열을 기증하는 다수의 유사 유전자(pseudogenes)를 포함하며, 상기 유사 유전자가 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있으며, 각각의 상기 유사 유전자는 (a)의 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산을 인코딩하는, 트랜스제닉 동물.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 상기 유사 유전자는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산의 적어도 일부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 3. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 닭인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 가변 (V) 세그먼트(variable (V) segment) 및 결합 (J) 세그먼트(joining (J) segment)를 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역은 인간 생식세포 경쇄 V 세그먼트(human germline light chain V segment) 및 인간 생식세포 경쇄 J 세그먼트(human germline light chain J segment)에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역의 V 세그먼트는 생식세포 경쇄 카파 V 세그먼트(germline light chain kappa V segment)에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 7. 실시양태 5에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역의 V 세그먼트는 생식세포 경쇄 람다(lanbda) V 세그먼트에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 8. 상기 실시양태 4-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자(pseudogenes)는 상기 V 세그먼트와 동일한 아미노산 서열의 적어도 일부를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 9. 상기 실시양태 4-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자는 상기 V 및 J 세그먼트와 동일한 아미노산 서열의 적어도 일부를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 10. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 인간 모노클로날 항체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 11. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자의 길이가 400 nt 미만인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 12. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자의 길이가 300-400 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 13. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자가 30개 이하인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 경쇄 유전자 좌위에 대해 이형접합성(heterozygous)인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 경쇄 유전자좌위에 대해 동형접합성(homozygous)인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 16. 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위를 포함하는 게놈을 포함하는 항체 다양화를 위해 유전자 변환을 사용하는 트랜스제닉 동물로서,
항체 코딩 서열의 직렬 어레이를 포함하는 기능성 면역 글로불린 경쇄를 포함하며, 상기 직렬 어레이의 각각의 핵산은 경쇄 가변 도매인 및 불변 영역을 인코딩하고 프로모터에 작동 가능하게 연결괴며, 상기 어레이의 각 코딩 서열은 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는, 트랜스제닉 동물.
실시양태 17. 실시양태 16에 있어서, 상기 코딩 서열이 적어도 2 개 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5개 이상 예를 들어, 5-30 )이상인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 18. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 상기 코딩 서열은 미리 배열된 V 세그먼트, J 세그먼트 및 C 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물
실시양태 19. 실시양태 16-18 중 어느 하나에 있어서, 미리 배열된 V 세그먼트, J 세그먼트 및 C 영역은 모두 인간 생식 계열 항체 서열을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 20. 실시양태 16-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인은 인간 모노클로날 항체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 21. 실시양태 16-20 중 어느 하나에 있어서,
(b) 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 유전자 전환에 의해, 뉴클레오티드 서열을 항체 코딩 서열의 직렬 어레이에 제공하는 복수의 유사 유전자를 추가로 포함하며,상기 유사 유전자가 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있으며, 각각의 상기 유사 유전자는 (a)의 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서, 상기 유사 유전자는 항체 코딩 서열의 적어도 일부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 23. 실시양태 21 또는 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 닭인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 24. 실시양태 21-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자의 길이가 400 nt 미만인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 25. 실시양태 21-24 중 어느 하나에 있어서, 상기 유사 유전자의 길이가 300-400 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
실시양태 26. (a) 상기 실시양태 중 어느 하나의 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역화하는 단계; (b) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 동물로부터 수득하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인 것을 특징으로 하는 방법.
실시양태 28. 실시양태 26에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인 것을 특징으로 하는 방법.
실시양태 29. 실시양태 26-28중 어느 하나에 있어서, (c)상기 트랜스제닉 동물의 B 세포를 사용하여 하이브리도마를 만드는 단계; 및 (d) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기 위해 상기 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시양태 30. 실시양태 26-28 중 어느 하나에 있어서, (c) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 확인하기 위해 하이브리도마를 만들지 않고 B 세포를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시양태 31. 실시양태 26-30 중 어느 하나에 있어서, PCR을 사용하여 트랜스제닉 동물의 B 세포로부터 적어도 중쇄 가변 영역-인코딩 핵산을 증폭시키는 단계, 및 상기 증폭된 핵산을 사용하여 재조합 항체를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 32. 실시양태 1-25 중 어느 하나의 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 폴리클로날 항체로서, 상기 항혈청(antiserum) 내 항체의 적어도 50% 이상이 실질적으로 동일한 경쇄 서열을 갖는 폴리클로날 항체.
실시양태 33. 실시양태 1-25 중 어느 하나의 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 적어도 1000개 이상의 B 세포 집단으로서, 상기 B 세포의 적어도 50% 이상이 실질적으로 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체를 생성하는 집단.
실시양태 34. 실시양태 1-25 중 어느 하나의 동물로부터 분리된 B 세포.
실시양태 35. 실시양태 1-25 중 어느 하나의 동물에 의해 생성된 모노클로날 항체.
숙련된 기술자는 하기에 기재된 도면이 단지 설명을 위한 것임을 이해할 것이다. 상기 도면은 어떤 방식으로든 본원의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 (a) 경쇄 가변 영역 (“fV”)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능적 면역 글로불린 경쇄 유전자 및 (b) 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자 (fV)에 작동 가능하게 연결되고 유전자 전환에 의해 뉴클레오티드 서열을 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산에 기증하는 복수의 유사 유전자 (P1-P4)를 포함하는 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위를 개략적으로 나타내며, 상기 유사 유전자는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자의 상류 또는 하류에 있고, 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 인코딩한다.
도 2는 상기 기능성 면역글로불린 경쇄(fV)에서 돌연변이가 유전자 전환을 통해 유사 유전자(P1-P4)에 의해 복구될 수 있는 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 3은 상기 경쇄의 다양화는 기능적 가변 영역(fV1-fV4)의 어레이를 사용하여 감소될 수 있는 도 1 및 도 2에 나타낸 상기 실시양태와 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 대안적인 실시양태를 개략적으로 나타낸다.
도 4는 CmLC1 유전자 좌위를 나타낸다. 상기 CmLC1 유전자 좌위에는, 단일 인간 기능성 가변 영역이 있다. 상기 기능성 VK 영역의 상류에는 상기 기능성 유전자의 VK 영역의 DNA 서열과 동일한 동일한 유사 유전자의 6 개 카피(copies)가 있다. 또한 상기 기능성 유전자와 동일하지 않은 유사 유전자를 포함하는 대조군 유전자 좌위도 나타낸다.
도 5는 상기 CmLC1 유전자 좌위가 만들어지는 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 6은 CmLC1/닭 VH 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 7은 CmLC1/SynVH-SD 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 8은 CmLC1-발현 조류에서 프로그래눌린-특이적 역가(progranulin-specific titers)를 나타낸다. 이 데이터는 CmLC1-발현 조류가 인간 프로그래눌린에 대해 강력한 항체 역가를 생성하는 것을 나타낸다.
도 9는 다양한 인간 경쇄(하단 패널)를 갖는 조류에서 얻은 항체와 비교하여 CmLC1 (상단 패널)에서 얻은 32 개의 모노클로날 항체 그룹의 VK 및 VH 영역의 서열을 분석한 결과를 나타낸다. 이는 항원-특이적 클론이 상기 경쇄에서 아미노산 다양성이 거의 없음을 나타낸다.
도 10은 표면 플라즈몬 공명 분석 결과이다. 이 데이터는 일부 CmLC1 클론이 서브나노몰(subnanomolar) KD로 인간 및 마우스 프로그래눌린 모두에 결합하는 것을 나타낸다.
도 11은 CmLC1 조류의 교차-차단 관계 및 에피토프 비닝 분석(epitope binning analysis)을 나타낸다. 이 데이터는 CmLC1 항체가 광범위한 에피토프 범위를 가지고 있음을 나타낸다.
도 12는 CmLC4 유전자 좌위를 나타낸다. 상기 CmLC4 유전자 좌위에는 인간 VK- 닭 CL 경쇄를 인코딩하는 자체 프로모터(화살표로 표시)가 각각 있는 동일한 유전자의 4 개 사본이 있다.
도 13은 CmLC4 유전자 좌위를 만드는 방법을 나타낸다.
도 14는 CmLC4/닭 VH 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 CmLC4/SynVH-C 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 16은 CmLC4-발현 조류에서 프로그래눌린-특이적 역가를 나타낸다. 이 데이터는 CmLC4-발현 조류가 인간 프로그래눌린에 대해 강력한 항체 역가를 생성하는 것을 나타낸다.
도 17은 다양한 인간 경쇄(하단 패널)를 갖는 조류에서 얻은 항체와 비교하여 CmLC4 (상단 패널)에서 얻은 56 개의 모노클로날 항체 그룹의 VK 및 VH 영역의 서열의 분석을 나타낸다. 이것은 CmLC4 조류에서 얻은 항체가 다양한 경쇄를 가진 조류에 비해 경쇄의 아미노산 다양성이 감소했음을 나타낸다.
도 18은 CmLC4 조류로부터 얻은 56 개의 모노클로날 항체 세트의 아미노산 다양성을 나타낸다. 서열 번호 1 및 2.
도 19는 표면 플라즈몬 공명 분석(surface plasmon resonance analysis) 결과를 나타낸다. 이 데이터는 일부 CmLC4 클론이 서브나노몰 KD로 인간 및 마우스 프로그래눌린 둘 다에 결합하는 것을 나타낸다.
도 20은 CmLC4 조류의 교차-차단 관계 및 에피토프 비닝 분석을 나타낸다. 이 데이터는 CmLC4 항체가 광범위한 에피토프 범위를 가지고 있음을 나타낸다.
도 1은 (a) 경쇄 가변 영역 (“fV”)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능적 면역 글로불린 경쇄 유전자 및 (b) 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자 (fV)에 작동 가능하게 연결되고 유전자 전환에 의해 뉴클레오티드 서열을 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산에 기증하는 복수의 유사 유전자 (P1-P4)를 포함하는 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위를 개략적으로 나타내며, 상기 유사 유전자는 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자의 상류 또는 하류에 있고, 상기 기능성 면역 글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 인코딩한다.
도 2는 상기 기능성 면역글로불린 경쇄(fV)에서 돌연변이가 유전자 전환을 통해 유사 유전자(P1-P4)에 의해 복구될 수 있는 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 3은 상기 경쇄의 다양화는 기능적 가변 영역(fV1-fV4)의 어레이를 사용하여 감소될 수 있는 도 1 및 도 2에 나타낸 상기 실시양태와 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 대안적인 실시양태를 개략적으로 나타낸다.
도 4는 CmLC1 유전자 좌위를 나타낸다. 상기 CmLC1 유전자 좌위에는, 단일 인간 기능성 가변 영역이 있다. 상기 기능성 VK 영역의 상류에는 상기 기능성 유전자의 VK 영역의 DNA 서열과 동일한 동일한 유사 유전자의 6 개 카피(copies)가 있다. 또한 상기 기능성 유전자와 동일하지 않은 유사 유전자를 포함하는 대조군 유전자 좌위도 나타낸다.
도 5는 상기 CmLC1 유전자 좌위가 만들어지는 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 6은 CmLC1/닭 VH 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 7은 CmLC1/SynVH-SD 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 8은 CmLC1-발현 조류에서 프로그래눌린-특이적 역가(progranulin-specific titers)를 나타낸다. 이 데이터는 CmLC1-발현 조류가 인간 프로그래눌린에 대해 강력한 항체 역가를 생성하는 것을 나타낸다.
도 9는 다양한 인간 경쇄(하단 패널)를 갖는 조류에서 얻은 항체와 비교하여 CmLC1 (상단 패널)에서 얻은 32 개의 모노클로날 항체 그룹의 VK 및 VH 영역의 서열을 분석한 결과를 나타낸다. 이는 항원-특이적 클론이 상기 경쇄에서 아미노산 다양성이 거의 없음을 나타낸다.
도 10은 표면 플라즈몬 공명 분석 결과이다. 이 데이터는 일부 CmLC1 클론이 서브나노몰(subnanomolar) KD로 인간 및 마우스 프로그래눌린 모두에 결합하는 것을 나타낸다.
도 11은 CmLC1 조류의 교차-차단 관계 및 에피토프 비닝 분석(epitope binning analysis)을 나타낸다. 이 데이터는 CmLC1 항체가 광범위한 에피토프 범위를 가지고 있음을 나타낸다.
도 12는 CmLC4 유전자 좌위를 나타낸다. 상기 CmLC4 유전자 좌위에는 인간 VK- 닭 CL 경쇄를 인코딩하는 자체 프로모터(화살표로 표시)가 각각 있는 동일한 유전자의 4 개 사본이 있다.
도 13은 CmLC4 유전자 좌위를 만드는 방법을 나타낸다.
도 14는 CmLC4/닭 VH 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 CmLC4/SynVH-C 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 갖는 것을 나타내는 그래프이다.
도 16은 CmLC4-발현 조류에서 프로그래눌린-특이적 역가를 나타낸다. 이 데이터는 CmLC4-발현 조류가 인간 프로그래눌린에 대해 강력한 항체 역가를 생성하는 것을 나타낸다.
도 17은 다양한 인간 경쇄(하단 패널)를 갖는 조류에서 얻은 항체와 비교하여 CmLC4 (상단 패널)에서 얻은 56 개의 모노클로날 항체 그룹의 VK 및 VH 영역의 서열의 분석을 나타낸다. 이것은 CmLC4 조류에서 얻은 항체가 다양한 경쇄를 가진 조류에 비해 경쇄의 아미노산 다양성이 감소했음을 나타낸다.
도 18은 CmLC4 조류로부터 얻은 56 개의 모노클로날 항체 세트의 아미노산 다양성을 나타낸다. 서열 번호 1 및 2.
도 19는 표면 플라즈몬 공명 분석(surface plasmon resonance analysis) 결과를 나타낸다. 이 데이터는 일부 CmLC4 클론이 서브나노몰 KD로 인간 및 마우스 프로그래눌린 둘 다에 결합하는 것을 나타낸다.
도 20은 CmLC4 조류의 교차-차단 관계 및 에피토프 비닝 분석을 나타낸다. 이 데이터는 CmLC4 항체가 광범위한 에피토프 범위를 가지고 있음을 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태 및 측면을 입증하고 추가로 예시하기 위해 제공되며 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
CmLC1 닭의 제조
CmLC1은 B 세포 계통에서 고정되거나 돌연변이 되지 않은 인간 카파 경쇄의 발현을 위해 트랜스제닉 닭의 생식 계열에 삽입하기 위한 구조물이다. 상기 구조물은 상기 닭 경쇄 유전자 좌위에 삽입하고 내인성 전사 조절 요소를 사용하여 B 세포에서 발현을 유도하도록 디자인되었다. 상기 구조물은 인간 생식 계열 JK1*01 유전자에 결합된 사전-재배열된 인간 생식 계열 VK3-15*01 유전자로 이루어진 단일 기능성 V-카파 유전자(V-kappa gene)를 포함한다. 상기 서열은 사전-재배열된 V 영역으로 디자인되고 합성되었다. 이 V 영역 서열(V region sequence)은 NCBI 데이터베이스에 존재하는 인간-유래 서열에서 일반적으로 발견되므로 자연적으로 발생하는 서열과 동일하다. 상기 단일 기능성 V 영역의 상류에 상기 발현된 V 영역과 동일한 DNA 서열의 6 개의 유사 유전자의 어레이가 배치되었다. 모든 6개 유사 유전자는 단일 기능성 V 영역에 대해 반대 방향이다. 그들은 전사를 위한 프로모터가 부족하고, 하류 불변 영역에 스플라이싱하기 위한 스플라이스 공여자(splice donor)가 부족하고, 번역 시작 부위를 함유하지 않으며, 분비를 위한 신호 펩티드 리더 서열을 함유하지 않기 때문에 유사 유전자로 정의된다. 상기 닭과 같은 유전자 전환 종에서, 이러한 상류 유사 유전자는 일반적으로 유전자 전환 과정에 의해 단일 기능성 V 영역을 돌연변이시키는 서열 다양화의 원천으로 사용된다. CmLC1 구조의 경우, 상기 유사 유전자에 의해 시도된 유전자 변환은 임의의 서열 변화를 도입하지 않으며, 오히려 상기 기능성 V에서 무작위 체세포 과돌연변이에 의해 발생한 임의의 변화를 생식 계열 서열로 되돌리는 경향이 있다. 따라서 상기 유사 유전자는 원래의 생식 계열 서열을 유지하면서, 기능성 V에 대한 정화 효과를 갖는다.
도 4는 CmLC1 유전자 좌위를 나타낸다. 이 유전자 좌위는 닭 불변 영역에 스플라이싱된 인간 VK3-15/JK1 가변 영역으로 이루어진 키메라 경쇄를 발현하도록 디자인되었다. 상기 CmLC1 유전자 좌위에는 단일 인간 기능성 가변 영역이 있다. 상기 기능성 VK 영역의 상류에는 동일한 유사 유전자의 6 개 사본이 있으며, 상기 기능성 유전자의 VK 영역의 DNA 서열과 동일한다. 이러한 유사 유전자는 유전자 변환에 참여하여, 상기 기능성 V에서 발생할 수 있는 임의의 돌연변이를 생식 계열 서열로 되돌릴 수 있다.
상기 V 영역의 하류에는 닭 경쇄 불변 영역이 있다. 따라서 상기 CmLC 경쇄는 인간 가변 영역-닭 불변 영역으로 구성된 키메라 경쇄이다. 상기 프로모터, 리더 인트론(leader intron), J-C 인트론 및 3 'UTR과 같은 구조물의 비-코딩 서열은 모두 닭 경쇄 유전자 좌위에서 유래된다. phiC31 인테그라제(integrase)를 사용하여 이전에 경쇄 유전자 좌위를 표적으로 한 attP 사이트에 삽입하기위한 attB 사이트도 포함된다. 인테그라제-매개 삽입을 선택하기 위해, B-액틴 프로모터가 포함되어, 상기 유전자 좌위에 네오 유전자의 상류에 삽입되고 전사를 활성화하여 G418에서 올바른 통합제(integrants)를 선택할 수 있다. 마지막으로, 상기 구조물을 게놈에 삽입한 후, loxP 부위가 상기 구조물에 위치하며, Cre 재조합은 플라스미드 백본과 모든 선택 가능한 마커를 제거하는 데 사용할 수 있으며, 면역 글로불린 서열과 단일 loxP 사이트 및 attR 사이트만 남는다.
도 5는 CmLC1 유전자 좌위가 만들어지는 방법을 나타낸다. 상기 CmLC1 삽입 벡터를 상기 경쇄 유전자 좌위(IgL KO 대립 유전자(allele))의 녹아웃(knockout)을 운반하는 닭 원시 생식 세포(primordial germ cells)로 형질 감염시켰다. 상기 경쇄 V-J-C 영역은 인접한 attP 사이트를 가진 프로모터없는 neo 유전자를 포함하는 선택 가능한 마커 카세트로 대체되었다. 상기 attP 사이트는 phC31 인테그라제에 의해 인식되고 attB 사이트 및 b-액틴 프로모터를 운반하는 상기 CmLC1 플라스미드의 삽입에 사용된다. 삽입시, 상기 b-액틴 프로모터는 neo 유전자의 발현을 유도하고 약물 G418에 대한 내성을 제공한다. 마지막 단계에서, Cre 재조합은 선택 가능한 마커 및 플라스미드 백본을 제거하는데 사용되고, 단일 loxP 사이트, 단일 attR 사이트, CmLC1 기능성 V 및 유사 유전자를 남긴다. 상기 닭 경쇄 유사 유전자는 상류에 남아 있지만, 인간 기능성 V에 서열 다양성을 도입하는 것으로 밝혀지지 않았다.
CmLC1/IgL KO 및 야생형 중쇄를 가진 5 마리의 조류를 유세포 분석으로 분석했다. PBL은 Ficoll 밀도 구배 원심 분리에 의해 제조되고, 닭 B 세포 마커 Bu1, 닭 IgM (중쇄-특이적), 닭 IgL (불변 영역-특이적), 인간 VK/VH에 대한 항혈청 및 T 세포 마커 TCR1 및 TCR2/3에 대한 항체로 염색되었다. 모든 B 세포 집단은 3 마리의 야생형 대조군 조류에 비해 정상으로 보였다. 상기 항-인간 VK/VH 항체는 예상대로 CmLC1 조류만 염색하였다. 이 데이터는 도 5에 나타내었다. 이 데이터는 CmLC1/닭 VH 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단(즉, 야생형 대조군 조류와 유사함)을 가지고 있음을 나타낸다.
유전형 CmLC1/SynVH-SD/IgL KO/IgH KO를 갖는 네 마리의 조류로부터 수득한 PBL을 유세포 분석법으로 분석하였다. 이러한 조류들은 인간 VK와 인간 VH로 이루어진 키메라 항체를 발현한다. PBL은 Ficoll 밀도 구배 원심 분리로 제조하고, 닭 B 세포 마커 Bu1, 닭 IgM (중쇄-특이적), 닭 IgL (불변 영역-특이적), 인간 VK/VH에 대해 생성된 항혈청 및 T 세포 마커 TCR1 및 TCR2/3에 대한 항체로 염색하였다. 상기 모든 B 세포 집단은 3 마리의 야생형 대조군 조류에 비해 정상으로 보였다. 상기 항-인간 VK/VH 항체는 예상대로 CmLC1 조류의 PBL만 염색하였다. 이러한 닭은 또한 주변에 정상적인 B 세포 집단을 가지고 있다.
다음 실험의 세트에서, 각각 유전자형의 작은 코호트(cohort)를 인간 프로그래눌린으로 면역화하였다. 항원-특이적 클론은 GEM 분석으로 확인되었다 (US8,030,095 참조). 에피토프 비닝 및 동역학 분석을 수행하였고, 항체의 교차-반응성을 평가하였다. 상기 클론을 시퀀싱하고 상기 CmLC1 조류의 서열 다양성을 동일한 유사 유전자가 없는 대조군 조류와 비교하였다.
프로그래눌린-특이적 역가는 CmLC1-발현 조류에서 시간이 지남에 따라 모니터링되었다. 이 데이터는 도 8에 나타낸다. 대조군(다양한 경쇄 포함) 및 야생 조류에서 수득한 것과 유사한 강력한 역가가 관찰되었다. 상단 패널, 야생형 중쇄가 있는 CmLC1-bird. 하단 패널, 인간 중쇄 V 영역이 있는 닭, 도 4에 표시.
CmLC1 (도 9의 상단 패널)에서 수득한 32 개의 모노클로날 항체 그룹에서 VK 및 VH 영역의 서열을 다양한 인간 경쇄(도 9의 하단 패널)를 가진 조류에서 얻은 항체와 비교하였다 . 각 항체 서열에 대해, 상기 생식 계열 서열과 비교하여 가변 영역 서열 당 총 변화 수를 계수하였다. VK는 파란색, VH는 빨간색이다. 상기 결과는 CmLC1-유래 항체의 경우, 정상적인 친화성 성숙을 겪는 인간 이식 유전자와 비교하여, 경쇄의 변화 수가 분명하게 감소한다는 것을 나타낸다. 상기 중쇄의 경우, CmLC1 및 일반 VK3-15 조류 모두 시퀀스 당 많은 변화를 함유하였다. 이 데이터는 CmLC1 조류의 항원-특이적 클론이 상기 경쇄에서 아미노산 다양성이 거의 없음을 보여준다.
항원 인간 프로그래눌린(상단) 및 마우스 프로그래눌린(하단)에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 CmLC1 항체 코호트를 표면 플라스몬 공명으로 분석하였다. 도 10 참조. 많은 항체가 마우스 단백질에 교차-반응하며, 상기 마우스에 대한 결합 친화도를 나타낸다(하단). 상기 많은 항체가 상기 항원에 대해 매우 높은 친화성을 나타냈다. 상기 중앙 결합 친화도는 3.25 nM이고, 일부 항체는 서브나노몰 친화도 (<1 nM)를 가졌다.
교차-차단 관계 및 에피토프 비닝을 결정하기 위해 CmLC1-유래 항체의 코호트를 고-처리량 어레이 SPR(high-throughput array SPR)로 분석하였다. 이 데이터는 도 11에 나와있다. 프로그래눌린상의 상기 에피토프 빈은 알려진 결합의 항체 표준 세트에 의해 정의되었다. 상기 에피토프 빈은 오른쪽 열에 표시된다. 인간 및 마우스 프로그래눌린에 대한 결합 친화성은 다른 두 열에 표시된다. 서열 덴드로그램(sequence dendrogram)은 항체가 어떻게 관련되어 있는지를 보여주고 있으며, 일반적으로 에피토프 빈에 상응하는 서열은 서로 관련되어 있다.
상기 기재된 실험은 다음을 나타낸다:
CmLC1 닭은 야생형 닭뿐만 아니라 대조군 닭의 항원 인식 능력을 유지한다.
CmLC1 항체는 상기 대조군 닭에서 발견되는 높은 특이성과 결합 친 화성을 유지한다; 및
CmLC1 기술을 사용하여 일반적인 경쇄 항체, 즉 VK가 필수적으로 생식 계열 서열을 갖고 상기 VH 도메인에서 전체적으로 다양성을 갖는 항체를 만들 수 있다.
실시예 2
CmLC4 유전자 좌위의 구조물
CmLC4는 B 세포 계통에서 고정되거나 돌연변이 되지 않은 인간 카파 경쇄의 발현을 위해 트랜스제닉 닭의 생식 계열에 삽입하기위한 구조물이다. 상기 구축물은 닭 경쇄 유전자 좌위에 삽입하고 내인성 전사 조절 요소를 사용하여 B 세포에서 발현을 유도하도록 디자인되었다. 상기 구조물은 인간 생식 계열 JK1*01 유전자 및 닭 불변 영역 유전자에 결합 된 사전-재배열된 인간 생식 계열 VK3-15*01 유전자로 이루어진 기능성 경쇄 유전자의 4 개 사본을 포함한다. 상기 기능성 경쇄 유전자(VJC)의 각 사본은 자체 프로모터를 함유한다. 상기 경쇄 3‘인핸서는 하류에 있으며 4중화(quadruplicated)되지 않았다. 상기 경쇄 유전자는 닭 불변 영역에 인-프레임(in-frame) 융합된 사전-재배열된 인간 V 영역으로 디자인되고 합성되었다. 이 V 영역 서열은 NCBI 데이터베이스에 존재하는 인간-유래 서열에서 일반적으로 발견되므로 자연 발생 가변 영역과 동일하다. 4 개의 기능성 V 영역의 상류에 상기 기능성 V 영역과 동일한 DNA 서열의 6 개의 유사 유전자 어레이가 배치되었다. 모든 6 개의 유사 유전자는 4 개의 기능적 경쇄에 대해 역방향이다. 그들은 전사를 위한 프로모터가 부족하고, 상기 하류 불변 영역에 스플라이싱하기 위한 스플라이스 공여자가 부족하고, 번역 시작 사이트를 함유하지 않으며, 분비를 위한 신호 펩티드 리더 서열을 함유하지 않기 때문에 유사 유전자로 정의된다. 닭과 같은 유전자 전환 종에서, 이러한 상류 유사 유전자는 일반적으로 유전자 전환 과정에 의해 기능성 V 영역을 돌연변이시키는 서열 다양성의 원천으로 사용된다. CmLC4 구조물의 경우, 상기 유사 유전자에 의한 유전자 변환은 임의의 서열 변화도 도입하지 않고, 오히려 기능성 V에서 무작위 체세포 과돌연변이에 의해 발생한 모든 변화를 생식 계열 서열로 되돌리는 경향이 있다. 따라서 상기 유사 유전자는 기능성 V에 대한 정화 효과를 가져서, 서열을 원래의 생식 계열 서열로 되돌린다. 또한 상기 카피 중 임의의 하나에서 발생할 수 있는 돌연변이를 희석하기 위해 기능성 V의 4 개 카피를 제공하였다. 상기 카피들 중 하나에서 돌연변이가 발생하면, 상기 생성된 경쇄 단백질은 세포 표면에 있는 전체 경쇄 단백질의 1/4에 불과하다. 따라서 임의의 단일 돌연변이는 약간 향상시킨 항원 결합만 제공할 수 있다. 배아 중심에서 친화성 성숙 및 클론 선택 중에 유익한 돌연변이는 효율적으로 긍정적으로 선택되지 않을 것이며, 이는 임의의 하나의 돌연변이가 세포 표면의 전체 경쇄 풀의 일부에만 기여하기 때문이다.
상기 CmLC4 경쇄는 인간 가변 영역-닭 불변 영역으로 구성된 키메라 경쇄이다. 4 개의 프로모터, 리더 인트론 및 3’과 같은 구조물의 비-코딩 서열은 모두 닭 경쇄 유전자 좌위에서 유래된다. phiC31 인테그라제를 사용하여, 이전에 경쇄 유전자 좌위를 표적으로 한 attP 부위에 삽입하기 위한 attB 부위도 포함된다. 인테그라제-매개 삽입을 선택하기 위해, B-액틴 프로모터가 포함되어, 상기 유전자 좌위에 네오 유전자의 상류에 삽입되고 전사를 활성화하여 G418에서 올바른 통합제를 선택할 수 있다. 마지막으로, 상기 구조물을 게놈에 삽입한 후, loxP 부위가 상기 구조물에 위치하며, Cre 재조합은 플라스미드 백본과 모든 선택 가능한 마커를 제거하는데 사용할 수 있으며, 면역 글로불린 서열과 단일 loxP 사이트 및 attR 사이트만 남는다.
도 12는 CmLC4 유전자 좌위를 나타낸다. 이 유전자 좌위는 닭 불변 영역에 연결된 인간 VK3-15/JK1 가변 영역으로 이루어진 키메라 경쇄를 발현하도록 디자인되었다. 상기 CmLC4 유전자 좌위에는 인간 VK-닭 CL 경쇄를 인코딩하는 자체 프로모터(화살표로 표시)를 가진 동일한 유전자의 4 개 카피가 있다. 이러한 4개의 카피는 기능성 경쇄 유전자이다. 상기 기능성 경쇄의 상류에는 동일한 유사 유전자의 6 개 카피가 있으며, 이는 상기 기능성 유전자에서 VK 영역의 DNA 서열과 동일하다 (상기 기재된 CmLC1 유전자 좌위에서 사용됨). 이러한 유사 유전자는 유전자 변환에 참여하여 상기 기능성 유전자에서 발생할 수 있는 돌연변이를 생식 계열 서열로 되돌릴 수 있습니다.
도 13은 CmLC4 유전자 좌위가 만들어지는 방법을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 상기 CmLC1 벡터를 경쇄 유전자 좌위(삽입 IgL KO 대립 유전자)의 녹아웃을 운반하는 닭 원시 생식 세포로 형질 감염시켰다. 상기 경쇄 V-J-C 영역은 인접한 attP 사이트를 가진 프로모터없는 neo 유전자를 포함하는 선택 가능한 마커 카세트로 대체되었다. 상기 attP 사이트는 phC31 인테그라제에 의해 인식되고 attB 사이트 및 b-액틴 프로모터를 운반하는 상기 CmLC1 플라스미드의 삽입에 사용된다. 삽입시, 상기 b-액틴 프로모터는 neo 유전자의 발현을 유도하고 약물 G418에 대한 내성을 제공한다. 마지막 단계에서, Cre 재조합은 선택 가능한 마커 및 플라스미드 백본을 제거하는데 사용된다.
CmLC4/IgL KO 및 야생형 중쇄를 가진 5 마리의 조류를 유세포 분석으로 분석했다(도 14 참조). PBL은 Ficoll 밀도 구배 원심 분리에 의해 제조되고, 닭 B 세포 마커 Bu1, 닭 IgM (중쇄-특이적), 닭 IgL (불변 영역-특이적), 인간 VK/VH에 대한 항혈청 및 T 세포 마커 TCR1 및 TCR2/3에 대한 항체로 염색되었다. 모든 B 세포 집단은 3 마리의 야생형 대조군 조류에 비해 정상으로 보였다. 상기 항-인간 VK/VH 항체는 예상대로 CmLC4 조류만 염색하였다. 이 데이터는 CmLC4/닭 VH 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 가지고 있음을 나타낸다.
유전형 CmLC1/SynVH-SD/IgL KO/IgH KO를 갖는 6 마리의 조류로부터 수득한 PBL을 유세포 분석법으로 분석하였다(도 15 참조). 이러한 조류들은 인간 VK와 인간 VH로 이루어진 키메라 항체를 발현한다. PBL은 Ficoll 밀도 구배 원심 분리로 제조하고, 닭 B 세포 마커 Bu1, 닭 IgM (중쇄-특이적), 닭 IgL (불변 영역-특이적), 인간 VK/VH에 대해 생성된 항혈청 및 T 세포 마커 TCR1 및 TCR2/3에 대한 항체로 염색하였다. 상기 모든 B 세포 집단은 3 마리의 야생형 대조군 조류에 비해 정상으로 보였다. 상기 항-인간 VK/VH 항체는 예상대로 CmLC4 조류만 염색하였다. 이 데이터는 또한 CmLC4 조류가 주변에 정상적인 B 세포 집단을 가지고 있음을 나타낸다.
다음 실험의 세트에서, 각각 유전자형의 작은 코호트(cohort)를 인간 프로그래눌린으로 면역화하였다. 항원-특이적 클론은 GEM 분석으로 확인되었다 (US8,030,095 참조). 에피토프 비닝 및 동역학 분석을 수행하였고, 항체의 교차-반응성을 평가하였다. 상기 클론을 시퀀싱하고 상기 CmLC1 조류의 서열 다양성을 동일한 유사 유전자가 없는 대조군 조류와 비교하였다.
프로그래눌린-특이적 역가는 CmLC4-발현 조류에서 시간이 지남에 따라 모니터링되었다. 이러한 결과는 도 16에 나타낸다. 대조군(다양한 경쇄 포함) 및 야생 조류에서 수득한 것과 유사한 강력한 역가가 관찰되었다. 상단 패널, 야생형 중쇄가 있는 CmLC4-bird. 하단 패널, 인간 중쇄 V 영역이 있는 OmniClic (CmLC4).
CmLC4 (도 17의 상단 패널)에서 수득한 56 개의 모노클로날 항체 그룹에서 VK 및 VH 영역의 서열을 다양한 인간 경쇄(도 17의 하단 패널)를 가진 조류에서 얻은 항체와 비교하였다. 각 항체 서열에 대해, 상기 생식 계열 서열과 비교하여 가변 영역 서열 당 총 변화 수를 계수하였다. VK는 파란색, VH는 빨간색이다. 상기 결과는 CmLC4-유래 항체의 경우, 정상적인 친화성 성숙을 겪는 인간 이식 유전자와 비교하여, 경쇄의 변화 수가 분명하게 감소한다는 것을 나타낸다. 상기 중쇄의 경우, CmLC4 및 일반 VK3-15 조류 모두 시퀀스 당 많은 변화를 함유하였다.
도 18은 CmLC4 조류에 의해 만들어진 56 개의 모노클로날 항체 세트 사이의 아미노산 다양성을 나타낸다. 상기 경쇄 가변 영역(상단) 또는 중쇄 가변 영역(하단)의 각 위치에서, 상기 생식 계열 서열과 상이한 잔기가 계수된다. 상기 막대의 높이는 각 위치의 변화를 함유하는 시퀀스의 %를 나타낸다. 색깔은 발견된 아미노산을 나타낸다. 이 데이터는 CmLC4 조류에서 다양성이 중쇄에 집중되어 있음을 나타낸다.
56 개 항체의 코호트에 대한 표면 플라스몬 공명을 사용하여, 항원 인간 프로그래눌린 (도 19, 상단 패널) 및 마우스 프로그래눌린 (도 19, 하단 패널)에 대한 결합 친화성을 결정하였다. 많은 항체가 마우스 단백질에 교차-반응하며, 상기 마우스에 대한 결합 친화도는 오른쪽에 나타낸다. 상기 많은 항체가 상기 항원에 대해 매우 높은 친화성을 나타냈다. 상기 중앙 결합 친화도는 3.4 nM이고, 많은 항체는 서브나노몰 친화도 (<1 nM)를 가졌다.
교차-차단 관계 및 에피토프 비닝을 결정하기 위해 56개 항체의 코호트를 고-처리량 어레이 SPR(high-throughput array SPR)로 분석하였다. 이는 도 20에 나타낸다. 프로그래눌린상의 상기 에피토프 빈은 알려진 결합의 항체 표준 세트에 의해 정의되었다. 상기 에피토프 빈은 오른쪽 열에 표시된다. 인간 및 마우스 프로그래눌린에 대한 결합 친화성은 다른 두 열에 표시된다. 서열 덴드로그램(sequence dendrogram)은 항체가 어떻게 관련되어 있는지를 보여주고 있으며, 일반적으로 에피토프 빈에 상응하는 서열은 서로 관련되어 있다.
상기 기재된 실험은 다음을 나타낸다:
CmLC4 닭은 대조군 닭과 야생형 닭의 항원 인식 능력을 유지한다.
CmLC4 항체는 상기 대조군 닭에서 발견되는 높은 특이성과 결합친 화성을 유지한다; 및
CmLC4 기술을 사용하여 일반적인 경쇄 항체, 즉 VK가 필수적으로 생식 계열 서열을 가지고, 상기 VH 도메인에서 전체적으로 다양성을 갖는 항체를 만들 수 있다.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 1
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
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<220>
<223> synthetic sequence
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Gly Arg Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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100 105 110
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115 120 125
Claims (25)
- 내인성 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌위(endogenous immunoglobulin light chain locus)를 포함하는 게놈(genome)을 포함하는 항체 다양화를 위해 유전자 변환을 사용하는 트랜스제닉 동물로서,
(a) 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 면역글로블린 경쇄 유전자; 및
(b) 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 유전자 전환에 의해, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산에 뉴클레오티드 서열을 기증하는 다수의 유사 유전자(pseudogenes)를 포함하며, 상기 유사 유전자가 상기 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있으며, 각각의 상기 유사 유전자는 (a)의 기능성 면역글로불린 경쇄 유전자의 경쇄 가변 영역과 동일한 아미노산을 인코딩하는, 트랜스제닉 동물. - 제1항에 있어서, 상기 유사 유전자가 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산의 적어도 일부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물이 닭인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 가변 (V) 세그먼트(variable (V) segment) 및 결합 (J) 세그먼트(joining (J) segment)를 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제4항에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역은 인간 생식세포 경쇄 V 세그먼트(human germline light chain V segment) 및 인간 생식세포 경쇄 J 세그먼트(human germline light chain J segment)에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제5항에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역의 V 세그먼트는 생식세포 경쇄 카파 V 세그먼트(germline light chain kappa V segment)에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제5항에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역의 V 세그먼트는 생식세포 경쇄 람다(lanbda) V 세그먼트에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유사 유전자(pseudogenes)는 상기 V 세그먼트와 동일한 아미노산 서열의 적어도 일부를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유사 유전자는 상기 V 및 J 세그먼트와 동일한 아미노산 서열의 적어도 일부를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 인간 모노클로날 항체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유사 유전자의 길이가 400 nt 미만인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유사 유전자의 길이가 300-400 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유사 유전자가 30개 이하인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 경쇄 유전자 좌위에 대해 이형접합성(heterozygous)인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 경쇄 유전자좌위에 대해 동형접합성(homozygous)인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 동물로부터 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
(c)상기 트랜스제닉 동물의 B 세포를 사용하여 하이브리도마를 만드는 단계; 및
(d) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기 위해 상기 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
(c) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 확인하기 위해 하이브리도마를 만들지 않고 B 세포를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PCR을 사용하여 트랜스제닉 동물의 B 세포로부터 적어도 중쇄 가변 영역-인코딩 핵산을 증폭시키는 단계, 및 상기 증폭된 핵산을 사용하여 재조합 항체를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 폴리클로날 항체로서, 상기 항혈청(antiserum) 내 항체의 적어도 50% 이상이 실질적으로 동일한 경쇄 서열을 갖는 폴리클로날 항체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 동물에 의해 생성된 적어도 1000개 이상의 B 세포 집단으로서, 상기 B 세포의 적어도 50% 이상이 실질적으로 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체를 생성하는 집단.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 동물로부터 분리된 B 세포.
- 제1항 내지 제15항 어느 한 항의 동물로 생성된 모노클로날 항체.
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