KR20140136462A - 공통 경쇄 마우스 - Google Patents

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KR20140136462A
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로버트 밥
존 맥훠터
린 맥도날드
션 스티븐스
사뮤엘 데이비스
데이빗 알. 버클러
캐롤리나 에이. 메거
앤드류 제이. 머피
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 제한된 수의 경쇄 가변 도메인을 특징으로 하는 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 그것의 생식선의 제한된 레퍼토리로부터 단지 하나 또는 소수의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스가 제공된다. 또한 마우스에서 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 제조하는 방법이 제공된다. 또한 다중특이성 결합 단백질, 예컨대 이중특이성 항체에 사용하기에 적당한 사람 가변 영역을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

공통 경쇄 마우스{COMMON LIGHT CHAIN MOUSE}
본 발명에서는 다양한 사람 가변/마우스 불변 중쇄와 결합된 공통 사람 가변/마우스 불변 경쇄를 가지고 있는 항체를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 또한 본 발명에는 마우스의 B 세포의 사람 가변 영역 유전자 서열로부터 사람 이중특이성 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항체는 전형적으로 동종이량체 중쇄 성분을 포함하는데, 이때 각각의 중쇄 단량체는 동일한 경쇄와 결합된다. 이종이량체 중쇄 성분을 가지고 있는 항체(예컨대 이중특이성 항체)는 치료용 항체로서 바람직하다. 그러나 이중특이성 항체의 각각의 중쇄와 만족스럽게 결합할 수 있는 적당한 경쇄 성분을 가지고 있는 이중특이성 항체를 제조하는 것은 문제가 많은 것으로 증명되었다.
한 접근법에서, 경쇄는 모든 경쇄 가변 도메인에 대한 용법 통계자료를 조사하고, 사람 항체에서 가장 빈번하게 사용된 경쇄를 확인하며, 시험관 내에서 그 경쇄를 상이한 특이성의 두 개의 중쇄와 짝을 이룸으로써 선택될 수 있을 것이다.
다른 접근법에서, 경쇄는 파지 디스플레이 라이브러리(예컨대 사람 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 파지 디스플레이 라이브러리, 예를 들면 사람 scFv 라이브러리)에서 경쇄 서열을 관찰하고, 그 라이브러리로부터 가장 공통적으로 사용된 경쇄 가변 영역을 선택함으로써 선택될 수 있을 것이다. 그런 다음 경쇄는 관심의 두 개의 상이한 중쇄에 대해 시험될 수 있다.
또 다른 접근법에서, 경쇄는 프로브로서 관심의 두 개의 중쇄의 중쇄 가변 서열을 사용하여 경쇄 가변 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 분석함으로써 선택될 수 있을 것이다. 두 개의 중쇄 가변 서열과 결합하는 경쇄는 중쇄에 대한 경쇄로서 선택될 수 있을 것이다.
또 다른 접근법에서, 후보 경쇄는 중쇄의 동족 경쇄와 나란히 배열될 수 있을 것이고, 두 개의 중쇄의 동족 경쇄에 공통적인 서열 특징을 더욱 친밀하게 매치시키기 위하여 경쇄에 변형이 이루어진다. 만약 면역원성의 기회가 최소화될 필요가 있다면, 변형은 바람직하게는 공지된 사람 경쇄 서열에 존재하는 서열을 유발하고, 그로써 단백질 가수분해성 처리로 인해 면역원성의 가능성을 평가하기 위하여 해당 기술분야에 공지되어 있는 매개변수 및 방법(예컨대 습식 분석뿐 아니라 가상 환경에서의)을 토대로 T 세포 에피토프가 생성되는 것같지는 않다.
상기의 모든 접근법은 선행하는 많은 규제, 예를 들면 서열 동일성, 특이한 사전-선택된 중쇄와의 결합 능력 등을 포함하는 시험관 내 방법에 의존한다. 따라서 공통 경쇄를 포함하는 사람 에피토프-결합 단백질을 제조하기 위하여 시험관 내 조건을 조작하는 것에 의존하지 않지만, 대신에 보다 생물학적으로 민감한 접근법을 사용하는 조성물 및 방법에 대한 요구가 해당 기술분야에 있다.
본 발명에서는 사람 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 제한된 경쇄 가변 레퍼토리를 가진다. 또한 본원에서는 친화성-성숙된 사람 중쇄 가변 도메인의 다양한 레퍼토리와 결합하고 그것을 발현하는 사람 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 또한 면역글로불린 가변 도메인을 포함하고 있는 결합 단백질의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 관심의 항원으로 제한된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 가지는 마우스를 면역시키고, 관심의 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질에 마우스의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 사용하는 것으로 이루어진다. 방법은 다중-특이성 항원-결합 단백질을 제조하는데 사용하기에 적당한 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 제조하기 위한 방법을 포함한다.
재배열되지 않은 사람 중쇄 가변 영역 유전자 절편의 레퍼토리로부터 유도된 적당한 친화성-성숙된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 선택하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공되는데, 이때 친화성-성숙된 사람 중쇄 가변 도메인은 하나의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편으로부터 유도된 단일한 사람 경쇄 가변 도메인과 결합하고 그것을 발현한다. 또한 선택된 두 개의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 제공하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공된다.
사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편의 제한된 레퍼토리로부터 제한된 레퍼토리의 사람 경쇄 가변 도메인, 또는 단일한 사람 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공된다. 마우스는 단일한 경쇄를 발현하는(또는 두 개의 경쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는) 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자(또는 두 개의 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자)를 형성하기 위하여 재배열하는 단일한 재배열되지 않은 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편(또는 두 개의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편)을 포함하도록 유전자가 공학처리된다. 재배열된 사람 경쇄 가변 도메인은 마우스에 의해 선택된 다수의 친화성-성숙된 사람 중쇄와 짝을 이룰 수 있으며, 이때 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
사람 경쇄 가변 영역 서열의 제한된 레퍼토리로부터 제한된 레퍼토리의 사람 경쇄 가변 도메인, 또는 단일한 사람 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공된다. 마우스는 단일 경쇄의 가변 영역을 발현하는(또는 두 개의 가변 영역중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는) 단일한 V/J 사람 경쇄 서열(또는 두 개의 V/J 서열)을 포함하도록 유전자 공학처리된다. 가변 서열을 포함하고 있는 경쇄는 마우스에 의해 클론적으로 선택된 다수의 친화성-성숙된 사람 중쇄와 짝을 이룰 수 있고, 이때 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 측면으로, 사람 J 유전자 절편(하나 또는 다수의 JL 절편으로부터 선택됨)과 재배열될 수 있고, 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 코드화할 수 있는 단일한 사람 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 영역 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 다른 측면으로, 마우스는 두 개 이하의 사람 VL 유전자 절편을 포함하는데, 그것들의 각각은 사람 J 유전자 절편(하나 또는 다수의 JL 절편으로부터 선택됨)과 재배열될 수 있고, 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 코드화할 수 있다.
한 구체예에서, 단일한 사람 VL 유전자 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5로부터 선택된 사람 JL 유전자 절편에 작동가능하게 연결되는데, 이때 단일한 사람 VL 유전자 절편은 경쇄 가변 영역 유전자를 코드화하는 서열을 형성하기 위하여 하나 또는 그 이상의 사람 JL 유전자 절편으로 재배열할 수 있다.
한 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 면역글로불린 경쇄 유전자를 형성하기 위하여 재배열할 수 있는 내인성 마우스 VL 유전자 절편을 포함하지 않는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는데, 이때 VL 유전자좌는 경쇄 유전자의 VL 영역을 코드화하기 위하여 재배열할 수 있는 단일한 사람 VL 유전자 절편을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 VL 유전자 절편은 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 절편이거나 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 절편이다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 면역글로불린 경쇄 유전자를 형성하기 위하여 재배열할 수 있는 내인성 마우스 VL 유전자 절편을 포함하지 않는 VL 유전자좌를 포함하고, 이때 VL 유전자좌는 경쇄 유전자의 VL 영역을 코드화하기 위하여 재배열할 수 있는 두 개 이하의 사람 VL 유전자 절편을 포함한다. 특정 구체예에서, 두 개 이하의 사람 VL 유전자 절편은 Vκ1-39Jκ5 유전자 절편 및 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 절편이다.
한 측면으로, 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 코드화하는 단일한 재배열된(V/J) 사람 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 영역(즉 VL/JL 영역)을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 다른 측면으로, 마우스는 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 코드화할 수 있는 두 개 이하의 재배열된 사람 VL 영역을 포함한다.
한 구체예에서, VL 영역은 재배열된 사람 Vκ1-39/J 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20/J 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 VL/JL 서열의 사람 JL 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5로부터 선택된다. 특정 구체예에서, VL 영역은 사람 Vκ1-39Jκ5 서열이거나 사람 Vκ3-20Jκ1 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ1-39Jκ5 서열과 사람 Vκ3-20Jκ1 서열을 둘 다 가진다.
한 구체예에서, 사람 VL 유전자 절편은 사람 또는 마우스 리더 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 리더 서열은 마우스 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 리더 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 리더 서열은 재배열되지 않은 사람 VL 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 리더 서열은 재배열된 사람 VL/JL 서열에 작동가능하게 연결된다.
한 구체예에서, VL 유전자 절편은 면역글로불린 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터 서열은 사람 프로모터 서열이다. 특정 구체예에서, 사람 면역글로불린 프로모터는 사람 Vκ3-15 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열되지 않은 사람 VL 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열된 사람 VL/JL 서열에 작동가능하게 연결된다.
한 구체예에서, 경쇄 유전자좌는 5'(VL 유전자 절편의 전사 방향과 관련하여) 쪽에 사람 면역글로불린 프로모터가 있고, 3' 쪽에 사람 J 절편과 재배열하는 VL 유전자 절편이 있는 리더 서열을 포함하는 내인성 마우스 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하고 있는 역 키메릭 경쇄의 VL 도메인을 코드화한다. 특정 구체예에서, VL 유전자 절편은 마우스 Vκ 유전자좌에 있고, 마우스 CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 경쇄 유전자좌는 5'(VL 유전자 절편의 전사 방향과 관련하여) 쪽에 사람 면역글로불린 프로모터가 있고, 3' 쪽에 재배열된 사람 VL 영역(VL/JL 서열)이 있는 리더 서열을 포함하며, 내인성 마우스 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하고 있는 역 키메릭 경쇄의 VL 도메인을 코드화한다. 특정 구체예에서, 재배열된 사람 VL/JL 서열은 마우스 카파(κ) 유전자좌에 있고, 마우스 CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 변형된 마우스의 VL 유전자좌는 κ 경쇄 유전자좌이고, κ 경쇄 유전자좌는 마우스 κ 인트로닉 인핸서, 마우스 κ3' 인핸서, 또는 인트로닉 인핸서와 3' 인핸서 둘 다를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 비기능성 면역글로불린 람다(λ) 경쇄 유전자좌를 포함한다. 특정 구체예에서, λ 경쇄 유전자좌는 유전자좌의 하나 또는 그 이상의 서열의 결실을 포함하는데, 이때 하나 또는 그 이상의 결실은 λ 경쇄 유전자좌를 경쇄 유전자를 형성하기 위하여 재배열할 수 없도록 만든다. 다른 구체예에서, λ 경쇄 유전자좌의 모든 또는 실질적으로 모든 VL 유전자 절편이 결실된다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 VL 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 만든다. 한 구체예에서, 경쇄는 사람 VL 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 VL 도메인과, 마우스 Cκ 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 λ 경쇄를 발현하지 않는다.
한 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 사람 VL 영역 서열을 체세포성 과돌연변이할 수 있다. 특정 구체예에서, 마우스는 VL 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는 사람 VL 유전자 절편으로부터 유도된 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하는 세포를 포함하고, 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자는 체세포성 돌연변이된 VL 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 Cκ에 연결된 체세포성 돌연변이된 사람 VL 도메인을 포함하고 있는 경쇄를 발현하는 세포를 포함하는데, 이때 경쇄는 사람 VH 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 VH 도메인을 포함하고 있는 중쇄와 결합하고, 중쇄는 마우스 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 마우스 CH1, 마우스 힌지, 마우스 CH2 및 마우스 CH3를 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 사람 CH1, 힌지, 마우스 CH2 및 마우스 CH3를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 하나 또는 그 이상의 사람 VH 유전자 절편으로 내인성 마우스 VH 유전자 절편이 대체되는 것을 포함하는데, 이때 사람 VH 유전자 절편은 마우스 CH 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어서, 마우스가 사람 VH 유전자 절편을 재배열하고 사람 VH 도메인과 마우스 CH를 포함하는 역 키메릭 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 절편의 90 내지 100%는 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 절편은 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 19, 적어도 39, 또는 적어도 80 또는 81개의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 일어난다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편 또는 적어도 43개의 기능성 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 일어난다. 한 구체예에서, 마우스는 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 DH 절편과 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 JH 절편으로 모든 마우스 DH 및 JH 절편이 대체되는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 DH 절편은 1-1, D1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 JH 절편은 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 사람 VH 유전자 절편은 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 관심의 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포를 포함하는데, 이때 결합 단백질은 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열 또는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고, 세포는 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59 및 5-51 유전자 절편으로부터 선택된 사람 VH 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 사람 VH 유전자 절편은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 사람 중쇄 JH 유전자 절편으로 재배열된다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 사람 VH 및 JH 유전자 절편은 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 및 7-27로부터 선택된 사람 DH 유전자 절편으로 재배열된다. 특정 구체예에서, 경쇄 유전자는 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 그 이상의 체세포성 과돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 마우스는 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 VH/DH/JH 영역을 포함하는 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, B 세포는 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 마우스 경쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고 있는 결합 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 재배열된 사람 VL 영역은 사람 Vκ1-39Jκ5 서열이고, 마우스는 (i) 사람 VL/JL 서열로부터 유도된 VL 도메인 및 (ii) 마우스 CL을 포함하고 있는 역 키메릭 경쇄를 발현하는데; 이때 경쇄는 (i) 마우스 CH 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인을 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포성 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다. 특정 구체예에서, 사람 VH 유전자 절편은 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51 및 1-69 유전자 절편으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인은 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 및 7-27로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 JH 절편으로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인은 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 1-69/6-6/5 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열에 의해 코드화된다.
한 구체예에서, 재배열된 사람 VL 영역은 사람 Vκ3-20Jκ1 서열이고, 마우스는 (i) 재배열된 사람 VL/JL 서열로부터 유도된 VL 도메인 및 (ii) 마우스 CL을 포함하고 있는 역 키메릭 경쇄를 발현하는데; 이때 경쇄는 (i) 마우스 CH 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 사람 VH를 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포성 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다. 특정 구체예에서, 사람 VH 유전자 절편은 3-30, 3-33, 3-53, 4-39 및 5-51 유전자 절편으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인은 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16 및 6-13으로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인은 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 JH 절편으로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인은 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열에 의해 코드화된다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 및 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열을 둘 다 포함하고, 마우스는 (i) 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 VL 도메인 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역 키메릭 경쇄를 발현하는데; 이때 경쇄는 (i) 마우스 CH와 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 사람 VH를 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포성 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 내인성 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 절편의 90 내지 100%가 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 절편이 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 18, 적어도 39, 적어도 80 또는 81의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 이루어진다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편 또는 적어도 43개의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 이루어진다.
한 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 C57BL 계통이고, 특정 구체예에서, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합이다. 다른 특정 구체예에서, 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합이거나, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합이다. 특정 구체예에서, 혼합의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 Cκ와 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 사람 VL 도메인을 포함하는 경쇄와, 마우스 CH와 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 및 6-1 사람 VH 유전자 절편으로부터 선택된 사람 VH 유전자 절편으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고 있는 역 키메릭 항체를 발현하는데, 이때 마우스는 전체 마우스 항체를 발현하지 않고 전체 사람 항체를 발현하지 않는다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편의 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1서열로의 대체를 포함하며, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 절편의 완전한 또는 실질적으로 완전한 레퍼토리의 사람 VH 유전자 절편으로의 대체를 포함한다.
한 측면으로, 본원에서 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되는데, 이때 항체는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열 또는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고, 항체는 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51 및 6-1 사람 VH 유전자 절편으로부터 선택된 사람 VH 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 사람 VH 유전자 절편은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 사람 중쇄 JH 유전자 절편으로 재배열된다. 특정 구체예에서, 경쇄는 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 그 이상의 체세포성 과돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 1, 2, 3 또는 4개의 체세포성 과돌연변이를 가진다. 한 구체예에서, 경쇄 유전자는 1 또는 2개의 돌연변이를 가진다. 다양한 구체예에서, 경쇄 유전자는 그것의 서열을 따라 다수의 돌연변이를 일으킬 수 있다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 경쇄는 적어도 하나 또는 4개 이하의 체세포성 과돌연변이를 가진다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 2개의 체세포성 과돌연변이를 가진다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 3개의 체세포성 과돌연변이를 가진다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 4개의 체세포성 과돌연변이를 가진다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역(FW)에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 또는 그이상의 상보성 결정 영역(CDR)에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 FW 및/또는 하나 또는 그 이상의 CDR에 존재한다. 다양한 구체예에서, 프레임워크 영역은 프레임워크 1(FW 1), 프레임워크 2(FW 2), 프레임워크 3(FW 3), 및/또는 그것들의 조합으로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, CDR은 CDR1, CDR2, CDR3 및/또는 그것들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 중쇄는 하나 또는 그 이상의 FW 또는 하나 또는 그 이상의 CDR에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 또는 그 이상의 FW 및 하나 또는 그 이상의 CDR에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 또는 그 이상의 FW 및 하나 또는 그 이상의 CDR에서 적어도 두 개의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 또는 그 이상의 FW 및 하나 또는 그 이상의 CDR에서 적어도 세 개의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 또는 그 이상의 FW 및 하나 또는 그 이상의 CDR에서 적어도 네 개의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 또는 그 이상의 FW 및 하나 또는 그 이상의 CDR에서 적어도 다섯 개 또는 5개 이상의 돌연변이를 포함하고; 특정 구체예에서, 중쇄는 하나의 FW와 하나의 CDR에 적어도 5개 또는 5개 이상의 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고, 약 9%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 9%의 경쇄는 FW1에 존재하는 하나의 돌연변이를 가진다. 한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고, 약 25%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 두 개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 19%의 경쇄는 CDR1에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 5%의 경쇄는 CDR1에 존재하는 2개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고, 약 20%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 세 개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 17%의 경쇄는 FW2에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 1%의 경쇄는 FW2에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 1%의 경쇄는 FW2에 존재하는 3개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고, 약 10%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 CDR2에 존재하는 적어도 하나 또는 2개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 10%의 경쇄는 CDR2에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 1%의 경쇄는 CDR2에 존재하는 두 개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고, 약 29%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 4개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 21%의 경쇄는 FW3에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 5%의 경쇄는 FW3에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 2%의 경쇄는 FW3에 존재하는 3개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 2%의 경쇄는 FW3에 존재하는 4개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고, 약 37%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 CDR3에 존재하는 적어도 하나 또는 4개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 27%의 경쇄는 CDR3에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 8%의 경쇄는 CDR3에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 1%의 경쇄는 CDR3에 존재하는 3개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 1%의 경쇄는 CDR3에 존재하는 4개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되는데, 이때 항체는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 9%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 FW1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 25%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 CDR1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 20%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 FW2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 10%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 CDR2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 29%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 FW3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 37%의 Vκ1-39/Jκ5-유도된 경쇄는 CDR3에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 35%의 중쇄는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 25%의 중쇄는 FW1에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 9%의 중쇄는 FW1에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 1%의 중쇄는 FW1에 존재하는 3개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 1%의 중쇄는 FW1에 존재하는 5개 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 92%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 4개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 92%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 26%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 44%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 19%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 3개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 3%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 4개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 66%의 중쇄는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 3개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 66%의 중쇄는 FW2에 존재하는 적어도 1, 적어도 2 또는 적어도 3개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 35%의 중쇄는 FW2에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 23%의 중쇄는 FW2에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 8%의 중쇄는 FW2에 존재하는 3개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 70%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 적어도 하나 또는 4개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 70%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 34%는 CDR2에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 20%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 12%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 3개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 5%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 4개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 91%의 중쇄는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 5개까지 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 91%의 중쇄는 FW3에 존재하는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 19%의 중쇄는 FW3에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 33%의 중쇄는 FW3에 존재하는 2개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 22%의 중쇄는 FW3에 존재하는 3개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 11%의 중쇄는 FW3에 존재하는 4개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 7%의 중쇄는 FW3에 존재하는 5개 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도되고 약 63%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 적어도 하나 또는 2개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 63%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 54%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 9%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 2개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되는데, 이때 항체는 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고 적어도 35%의 중쇄는 FW1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 92%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 66%의 중쇄는 FW2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 70%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 91%의 중쇄는 FW3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 63%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 경쇄는 적어도 하나 또는 2개 이하의 체세포성 과돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4개 또는 그 이상의 체세포성 과돌연변이를 가진다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 또는 그 이상의 CDR 영역에 존재한다. 다양한 구체예에서, 프레임워크 영역은 프레임워크 1(FW 1), 프레임워크 2(FW 2), 프레임워크 3(FW 3), 및/또는 그것들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 10%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 10%의 경쇄는 FW1에 하나의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 53%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 2개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 27%의 경쇄는 CDR1에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 약 54%의 경쇄는 CDR1에 존재하는 하나 또는 2개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 6%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 2개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 6%의 경쇄는 FW2에 적어도 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 3%의 경쇄는 FW2에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 3%의 경쇄는 FW2에 존재하는 2개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 적어도 약 3%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 CDR2에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 3%의 경쇄는 CDR2에 하나의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 17% 또는 그 이상의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 2개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 20%의 경쇄는 FW3에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 17%의 경쇄는 FW3에 존재하는 2개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 적어도 43%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 CDR3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 43%의 경쇄는 CDR3에 하나의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되는데, 이때 항체는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고 약 10%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 적어도 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 53%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 CDR1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 6%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 FW2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 3%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 CDR2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 37%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 FW3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 43%의 Vκ3-20/Jκ1-유도된 경쇄는 CDR3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 43%의 중쇄는 FW1에 존재하는 적어도 하나 또는 2개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 41%의 중쇄는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 약 41%의 중쇄는 FW1에 존재하는 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 약 2%의 중쇄는 FW1에 존재하는 2개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 92%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 4개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 43%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 25%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 2개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 15%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 적어도 3개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 10%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 4개 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 46%의 중쇄는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 3개 이하의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 34%의 중쇄는 FW2에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 10%의 중쇄는 FW2에 존재하는 2개 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 2%의 중쇄는 FW2에 존재하는 3개 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 84%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 적어도 하나 또는 5개까지 또는 5개 이상의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 39%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 18%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 2개 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 21%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 3개 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 3%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 4개 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 2%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 5개 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 92%의 중쇄는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 5개까지 또는 5개 이상의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서 적어도 21%의 경쇄는 FW3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서 적어도 20%의 중쇄는 FW3에 존재하는 적어도 2개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 13%의 중쇄는 FW3에 존재하는 적어도 3개의 돌연변이를 가지고; 한 구체예에서, 적어도 20%의 중쇄는 FW3에 적어도 4개의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 적어도 18%의 중쇄는 FW3에 적어도 5개의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 경쇄는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 7%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 가지며; 한 구체예에서, 약 7%의 중쇄는 CDR3에 하나의 돌연변이를 가진다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되는데, 이때 항체는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도되고 약 43%의 중쇄는 FW1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 92%의 중쇄는 CDR1에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 46%의 중쇄는 FW2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 84%의 중쇄는 CDR2에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지고, 약 92%의 중쇄는 FW3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지며, 약 7%의 중쇄는 CDR3에 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다.
한 측면으로, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열로부터 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스가 제공되는데, 이때 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 마우스의 생식선에 존재하며, 면역글로불린 경쇄는 사람 가변 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 생식선은 재배열된 경쇄 서열을 포함하는 마우스의 모든 B 세포에 존재하는 모든 비-대용 경쇄 서열과 동일한 V 절편 및 동일한 J 절편으로부터 유도된 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스의 생식선에는 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 유전자 절편이 결핍되어 있다. 한 구체예에서, 마우스의 생식선에는 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 J 유전자 절편이 결핍되어 있다.
한 구체예에서, 마우스의 생식선은 하나 이하, 2개 이하, 또는 3개 이하의 재배열된(V/J) 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 재배열된 V/J 서열은 κ 경쇄 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 κ 경쇄 서열이다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 Vκ1-39/J 서열, 사람 Vκ3-20/J 서열, 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 Vκ1-39/Jκ5 서열이다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 Vκ3-20/Jκ1 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 추가로 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열과 관련하여 마우스 κ 인트로닉 인핸서 5', 마우스 κ 3' 인핸서 및 그것들의 조합으로부터 선택된 서열을 그것의 생식선에 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편, 재배열되지 않은 사람 DH 유전자 절편 및 재배열되지 않은 사람 JH 유전자 절편을 포함하고, 이때 상기 VH, DH 및 JH 유전자 절편은 중쇄 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열을 형성하기 위해 재배열될 수 있다. 한 구체예에서, 마우스는 다수의 사람 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 VH, DH 및 JH 유전자 절편은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 내인성 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 대체한다. 특정 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 기능성 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 절편의 모든 또는 실질적으로 모든 기능성 사람 VH, DH 및 JH 유전자 절편으로의 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 불변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 사람 불변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 마우스 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스의 생식선의 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다. 특정 구체예에서, 마우스의 생식선의 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 경쇄 V 및 J 서열을 대체한다.
한 측면으로, 단일한 사람 V 절편과 단일한 사람 J 절편으로부터 유도된 재배열된 경쇄 유전자를 포함하는 비-대용 경쇄 서열을 포함하는 각각의 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 집단을 포함하는 마우스가 제공되는데, 이때 마우스의 생식선의 유일한 경쇄 가변 서열은 단일한 사람 V 절편과 단일한 사람 J 절편으로부터 유도된 재배열된 서열이고, 재배열된 경쇄 유전자를 포함하는 각각의 B 세포는 추가로 동족의 사람 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 유전자를 포함하며, 재배열된 경쇄 유전자는 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4개의 체세포성 과돌연변이를 포함한다.
한 측면으로, 본원에서 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 다능성, 유도된 다능성 또는 분화전능성 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 마우스 배아 줄기(ES) 세포이다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 조직이 제공된다. 한 구체예에서, 조직은 본원에 기술된 것과 같은 마우스의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유도된다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 핵이 제공된다. 한 구체예에서, 핵은 B 세포가 아닌 이배체 세포로부터 유래한다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 분리된 마우스 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 림프구이다. 한 구체예에서, 림프구는 B 세포이다. 한 구체예에서, B 세포는 사람 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인, 및 재배열된 사람 Vκ1-39/J 서열, 재배열된 사람 Vκ3-20/J 서열 또는 그것들의 조합으로부터 유도된 경쇄를 포함하는 키메릭 중쇄를 발현하는데; 이때 중쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 또는 사람 불변 영역에 융합된다.
한 측면으로, 하이브리도마가 제공되는데, 그 하이브리도마는 본원에 기술된 것과 같은 마우스의 B 세포로 만들어진다. 특정 구체예에서, B 세포는 관심의 에피토프를 포함하는 면역원으로 면역된, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유래하고, B 세포는 관심의 에피토프에 결합하는 결합 단백질을 발현하며, 그 결합 단백질은 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인 및 마우스 CH를 가지고, 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 사람 VL 도메인과 마우스 CL을 가진다.
한 측면으로, 마우스 배아가 제공되는데, 그 배아는 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유도된 공여 ES 세포를 포함한다.
한 측면으로, 표적화 벡터가 제공되는데, 그 벡터는 벡터의 5' 및 3' 마우스 상동성 아암의 서열과 관련하여 전사 방향으로 5'으로부터 3' 방향으로, 5' 마우스 상동성 아암, 사람 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 사람 또는 마우스 리더 서열, 및 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1으로부터 선택된 사람 VL 영역 및 3' 마우스 상동성 아암을 포함하고 있다. 한 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 5' 및 마우스 Cκ 유전자 가까이에 존재하는 인핸서 서열과 관련하여 5'에 있는 서열로 벡터를 표적화한다. 한 구체예에서, 프로모터는 사람 면역글로불린 가변 영역 유전자 절편 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 사람 Vκ3-15 프로모터이다. 한 구체예에서, 리더 서열은 마우스 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 리더 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열이다.
한 측면으로, 표적화 벡터는 상기에서 기술된 것과 같이 제공되지만, 5' 마우스 상동성 아암 대신에 사람 또는 마우스 프로모터의 5' 쪽에는 부위-특이적 재조합효소 인지 부위(SRRS)가 5'에 있고, 3' 마우스 상동성 아암 대신 사람 VL 영역의 3' 쪽에는 SRRS가 있다.
한 측면으로, 역 키메릭 항체는 본원에 기술된 것과 같은 마우스에 의해 만들어지는데, 이때 역 키메릭 항체는 사람 VL과 마우스 CL을 포함하는 경쇄, 및 사람 VH와 마우스 CH를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 측면으로, 항체의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 단일 세포에서 (a) 사람 CH 유전자 서열과 융합된, 본원에 기술된 것과 같이 면역된 마우스의 첫 번째 VH 유전자 서열; (b) 사람 CL 유전자 서열과 융합된, 본원에 기술된 것과 같이 면역된 마우스의 VL 유전자 서열을 발현시키고, (c) 그 세포를 전체 사람 항체를 발현하기에 충분한 조건 하에서 유지시키며, 그리고 항체를 분리하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 세포는 사람 CH 유전자 서열과 융합된, 본원에 기술된 것과 같이 면역된 두 번째 마우스의 두 번째 VH 유전자 서열, 첫 번째 에피토프를 인지하는 VH 도메인을 코드화하는 첫 번째 VH 유전자 서열, 및 두 번째 에피토프를 인지하는 VH 도메인을 코드화하는 두 번째 VH 유전자 서열을 포함하고, 이때 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프는 동일하지 않다.
한 측면으로, 에피토프-결합 단백질의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 본원에 기술된 것과 같은 마우스를 관심의 에피토프를 포함하는 면역원으로 노출시키고, 그 마우스를 마우스가 관심의 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 생성하기에 충분한 조건하에서 유지시키며, 관심의 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 분리하는 것으로 이루어지고; 이때 에피토프-결합 단백질은 마우스 CL과 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1으로부터 유도된 사람 VL을 포함하고 있는 경쇄와 결합된, 체세포성 돌연변이된 사람 VH 및 마우스 CH를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 측면으로, 에피토프-결합 단백질을 발현하는 세포가 제공되는데, 이때 세포는 (a) 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1으로부터 유도된 사람 VL 도메인을 코드화하고, 사람 면역글로불린 경쇄 불변 도메인 cDNA 서열(예컨대 사람 κ 불변 도메인 DNA 서열)에 (직접 또는 링커를 통하여) 융합되어 있는 사람 뉴클레오티드 서열; 및 (b) 첫 번째 사람 VH 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 사람 VH 도메인을 코드화하고, 사람 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 cDNA 서열에 (직접 또는 링커를 통하여) 융합되어 있는 첫 번째 사람 VH 뉴클레오티드 서열을 포함하며; 에피토프-결합 단백질은 첫 번째 에피토프를 인지한다. 한 구체예에서, 에피토프-결합 단백질은 첫 번째 에피토프에 10-6M보다 낮은, 10-8M보다 낮은, 10-9M보다 낮은, 10-10M보다 낮은, 10-11M보다 낮은 또는 10-12M보다 낮은 해리 상수로 결합한다.
한 구체예에서, 세포는 두 번째 사람 VH 도메인을 코드화하는 두 번째 사람 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이때 두 번째 사람 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 cDNA 서열에 (직접 또는 링커를 통해) 융합되고, 두 번째 사람 VH 도메인은 첫 번째 에피토프를 특이적으로 인지하지 못하며(예컨대 10-6M, 10-5M, 10-4M 또는 그것보다 높은 값의 해리상수를 나타낸다), 에피토프-결합 단백질은 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프를 인지하고, 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 중쇄는 각각 (a)의 동일한 경쇄에 결합한다.
한 구체예에서, 두 번째 VH 도메인은 10-6M보다 낮은, 10-7M보다 낮은, 10-8M보다 낮은, 10-9M보다 낮은, 10-10M보다 낮은, 10-11M보다 낮은 또는 10-12M보다 낮은 해리 상수로 두 번째 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 에피토프-결합 단백질은 각각 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1으로부터 선택된 재배열된 사람 VL 영역으로부터 유도된 동일한 경쇄와 결합되어 있는 첫 번째 면역글로불린 중쇄 및 두 번째 면역글로불린 중쇄를 포함하는데, 이때 첫 번째 면역글로불린 중쇄는 첫 번째 에피토프에 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리상수로 결합하고, 두 번째 면역글로불린 중쇄는 두 번째 에피토프에 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리상수로 결합하며, 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프는 동일하지 않고, 첫 번째 면역글로불린 중쇄는 두 번째 에피토프에 결합하지 않거나 또는 두 번째 에피토프에 마이크로몰 범위보다 약한(예컨대 밀리몰 범위의) 해리 상수로 결합하고, 두 번째 면역글로불린 중쇄는 첫 번째 에피토프에 결합하지 않거나 첫 번째 에피토프에 마이크로몰 범위보다 약한(예컨대 밀리몰 범위의) 해리 상수로 결합하며, 하나 또는 그 이상의 VL, 첫 번째 면역글로불린 중쇄의 VH 및 두 번째 면역글로불린 중쇄의 VH는 체세포성 돌연변이된다.
한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 중쇄는 단백질 A-결합 잔기를 포함하고, 두 번째 면역글로불린 중쇄는 단백질 A-결합 잔기가 결핍되어 있다.
한 구체예에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예컨대 PERC.6TM 세포)로부터 선택된다.
한 측면으로, 사람 VH와 마우스 중쇄 불변 도메인, 사람 VL 및 마우스 경쇄 불변 도메인을 포함하고 있는 역 키메릭 항체가 제공되는데, 이때 항체는 에피토프를 포함하고 있는 면역원으로 본원에 기술된 것과 같은 마우스를 면역시키는 것을 포함하는 방법에 의해 만들어지고, 항체는 마우스가 면역된 그 면역원의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, VL 도메인은 체세포성 돌연변이된다. 한 구체예에서, VH 도메인은 체세포성 돌연변이된다. 한 구체예에서, VL 도메인과 VH 도메인은 둘 다 체세포성 돌연변이된다. 한 구체예에서, VL은 마우스 Cκ 도메인에 연결된다.
한 측면으로, 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편을 대체하는 사람 VH 유전자 절편; 모든 마우스 경쇄 유전자 절편을 대체하는, 재배열된 Vκ1-39/J 및 Vκ3-20/J 또는 그것들의 조합으로부터 선택된 하나 또는 두 개의 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열을 포함하는 마우스가 제공되는데, 이때 사람 중쇄 가변 유전자 절편은 마우스 불변 유전자에 연결되고, 재배열된 사람 경쇄 서열은 사람 또는 마우스 불변 유전자에 연결된다.
한 측면으로, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 중쇄 가변 유전자 절편이 사람 중쇄 가변 유전자 절편으로 대체되어 있고, 하나 또는 두 개의 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열을 포함하고 있는 마우스 ES 세포가 제공되는데, 이때 사람 중쇄 가변 유전자 절편은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 유전자에 연결되고, 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열은 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 연결된다. 특정 구체예에서, 경쇄 불변 유전자는 마우스 불변 유전자이다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스에 의해 만들어진 항원-결합 단백질이 제공된다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 마우스 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 Vκ1-39 유전자 절편 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 경쇄 불변 영역은 마우스 불변 영역이다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터의 면역글로불린 가변 영역으로부터 만들어진 전체 사람 항원-결합 단백질이 제공되는데, 이때 항원-결합 단백질은 본원에 기술된 것과 같은 마우스의 서열로부터 유도된 사람 가변 영역을 포함하고 있는 전체 사람 중쇄, 및 Vκ1-39 또는 Vκ3-20을 포함하고 있는 전체 사람 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 1 내지 5개의 체세포성 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 마우스의 B 세포에서 중쇄 가변 영역과 짝을 이루는 동족의 경쇄 가변 영역이다.
한 구체예에서, 전체 사람 항원-결합 단백질은 첫 번째 중쇄 및 두 번째 중쇄를 포함하는데, 이때 첫 번째 중쇄 및 두 번째 중쇄는 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 독립적으로 유도된 동일하지 않은 가변 영역을 포함하고, 첫 번째 및 두 번째 중쇄의 각각은 Vκ1-39 유전자 절편 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된 사람 경쇄와 결합된 숙주 세포로부터 발현된다. 한 구체예에서, 첫 번째 중쇄는 첫 번째 항원의 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 중쇄 가변 영역을 포함하고, 두 번째 중쇄는 두 번째 항원의 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 첫 번째 항원 및 두 번째 항원은 상이하다. 특정 구체예에서, 첫 번째 항원 및 두 번째 항원은 동일하고, 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프는 동일하지 않다; 특정 구체예에서, 결합 단백질의 첫 번째 분자에 의한 첫 번째 에피토프의 결합은 결합 단백질의 두 번째 분자에 의한 두 번째 에피토프의 결합을 차단하지 못한다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스의 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 전체 사람 결합 단백질은 첫 번째 면역글로불린 중쇄와 두 번째 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 이때 첫 번째 면역글로불린 중쇄는 두 번째 면역글로불린 중쇄의 가변 영역에 동일하지 않은 첫 번째 가변 영역을 포함하며, 첫 번째 면역글로불린 중쇄는 야생형 단백질 A 결합 결정기를 포함하고, 두 번째 중쇄는 야생형 A 결합 결정기가 결핍되어 있다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 중쇄는 분리 조건 하에서 단백질 A에 결합하고, 두 번째 면역글로불린 중쇄는 단백질 A에 결합하지 않거나 분리 조건 하에서 단백질 A에 결합하는 첫 번째 면역글로불린 중쇄보다 적어도 10-배, 100-배 또는 천배 더 약하게 단백질 A에 결합한다. 특정 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 중쇄는 IgG1 아이소타입이고, 이때 두 번째 중쇄는95R(EU 435R), 96F(EU 436F) 및 그것들의 조합으로부터 선택된 변형을 포함하며, 첫 번째 중쇄는 그런 변형이 없다.
한 측면으로, 이중특이성 항원-결합 단백질의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 본원에 기술된 것과 같은 첫 번째 마우스를 첫 번째 에피토프를 포함하는 관심의 첫 번째 항원에 노출시키고, 본원에 기술된 것과 같은 두 번째 마우스를 두 번째 에피토프를 포함하는 관심의 두 번째 항원에 노출시키며, 첫 번째 및 두 번째 마우스를 각각 관심의 항원에 대한 면역 반응을 시작하도록 허용하고, 관심의 첫 번째 항원의 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 사람 중쇄 가변 영역을 첫 번째 마우스에서 확인하며, 두 번째 마우스에서 관심의 두 번째 항원의 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 사람 중쇄 가변 영역을 확인하고, 관심의 첫 번째 항원의 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 중쇄를 코드화하는 첫 번째 전체 사람 중쇄 유전자를 제조하며, 관심의 두 번째 항원의 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 중쇄를 코드화하는 두 번째 전체 사람 중쇄 유전자를 제조하고, 이중특이성 항원-결합 단백질을 형성하기 위하여 사람 Vκ1-39 또는 사람 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된 단일한 전체 사람 경쇄를 발현하는 세포에서 첫 번째 중쇄 및 두 번째 중쇄를 발현시키며, 이중특이성 항원-결합 단백질을 분리하는 것으로 이루어진다.
한 구체예에서, 첫 번째 항원 및 두 번째 항원은 동일하지 않다.
한 구체예에서, 첫 번째 항원 및 두 번째 항원은 동일하고, 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프는 동일하지 않다. 한 구체예에서, 첫 번째 중쇄 가변 영역의 첫 번째 에피토프에 대한 결합은 두 번째 중쇄 가변 영역의 두 번째 에피토프에 대한 결합을 차단하지 못한다.
한 구체예에서, 첫 번째 항원은 가용성 항원 및 세포 표면 항원(예컨대 종양 항원)으로부터 선택되고, 두 번째 항원은 세포 표면 수용체를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 표면 수용체는 면역글로불린 수용체이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 수용체는 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, 첫 번째 항원 및 두 번째 항원은 동일한 세포 표면 수용체이고, 첫 번째 중쇄의 첫 번째 에피토프에 대한 결합은 두 번째 중쇄의 두 번째 에피토프에 대한 결합을 차단하지 못한다.
한 구체예에서, 경쇄의 경쇄 가변 도메인은 2 내지 5개의 체세포성 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 첫 번째 또는 두 번째 중쇄 가변 도메인 중 어느 하나로 면역된 첫 번째 또는 두 번째 마우스의 B 세포에서 발현된 체세포성 돌연변이된 동족의 경쇄이다.
한 구체예에서, 첫 번째 전체 사람 중쇄는 그것의 단배질 A에 대한 친화성을 감소시키는 아미노산 변형을 포함하고, 두 번째 전체 사람 중쇄는 단백질 A에 대한 그것의 친화성을 감소시키는 변형을 포함하지 않는다.
한 측면으로, 본 발명에 따라 만들어진 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 항체 또는 이중특이성 항체가 제공된다. 다른 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 마우스를 전체 사람 항체 또는 전체 사람 이중특이성 항체를 제조하기 위해 사용하는 마우스의 용도가 제공된다.
한 측면으로, 내인성 조절 또는 제어 요소, 예컨대 마우스 κ 인트로닉 인핸서, 마우스 κ 3' 인핸서, 또는 인트로닉 인핸서와 3' 인핸서 둘 다를 보유하는 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는, 본원에 기술된 유전자 변형된 마우스, 배아 또는 세포가 제공되는데, 이때 조절 또는 제어 요소는 체세포성 돌연변이와 κ 경쇄 유전자좌의 발현된 서열의 친화성 돌연변이를 촉진한다.
한 측면으로, 하나 이하, 또는 두 개 이하의 재배열된 또는 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 절편으로부터 유도된 면역글로불린 경쇄를 가지는 것을 특징으로 하는 B 세포 집단을 포함하는 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 절편의 야생형 보충물을 포함하는 마우스와 거의 동일한 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다.
한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄는 하나 이하, 또는 두 개 이하의 재배열된 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 절편으로부터 유도된다. 특정 구체예에서, 경쇄는 하나 이하의 재배열된 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 절편으로부터 유도된다.
한 측면으로, 하나 이하 또는 두 개 이하의 사람 Vκ/Jκ 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄를 발현하는, 본원에 기술된 것과 같은 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 절편의 하나 또는 그 이상의 사람 중쇄 가변 영역 유전자 절편으로의 대체를 포함하고, 마우스는 약 1 내지 약 20의 (a) λ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 (b) κ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포에 대한 비율을 나타낸다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ1-39Jκ5 서열로부터 유도된 단일한 κ 경쇄를 발현하고, λ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 κ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포에 대한 비율은 약 1 내지 약 20이며; 한 구체예에서, 그 비율은 약 1 내지 적어도 약 66이고; 특정 구체예에서, 그 비율은 약 1 내지 66이다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 단일한 κ 경쇄를 발현하고, λ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 κ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포에 대한 비율은 약 1 내지 약 20이며; 한 구체예에서, 그 비율은 약 1 내지 약 21이다. 특정 구체예에서, 그 비율은 1 내지 20 또는 1 내지 21이다.
한 측면으로, 단일한 재배열된 κ 경쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 기능성 λ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 마우스는 동일한 단일한 재배열된 κ 경쇄로부터 유도된 κ 경쇄를 발현하는 Igκ+ 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 %는 야생형 마우스에서의 것과 거의 동일하다. 특정 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 %는 약 2 내지 약 6%이다. 특정 구체예에서, 단일한 재배열된 κ 경쇄가 Vκ1-39Jκ5 서열로부터 유도된 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 %는 약 2 내지 약 3이고; 특정 구체예에서, %는 약 2.6이다. 특정 구체예에서, 단일한 재배열된 κ 경쇄가 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 %는 약 4 내지 약 8이고; 특정 구체예에서는 약 6이다.
한 측면으로, 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 그 마우스는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로부터 유도된 단일한 재배열된 κ 경쇄를 발현하고, 마우스는 단일한 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일한 κ 경쇄를 포함하는 B 세포 집단을 발현하며, 유전자 변형된 마우스는 체세포성 과돌연변이에 대해 내성이 되지 않았다. 한 구체예에서, 마우스의 B 세포상에서 발현된 κ 경쇄의 적어도 90%가 적어도 1 내지 약 5개의 체세포성 과돌연변이를 나타낸다.
한 측면으로, 하나 이하 또는 두 개 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일한 κ 경쇄를 발현하도록 변형된 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 야생형 마우스에 의해 나타나는 κ 경쇄 용법보다 적어도 약 2-배 또는 그 이상, 적어도 3-배 또는 그 이상, 적어도 약 4-배 또는 그 이상, 또는 κ 경쇄 유전자 절편의 야생형 레퍼토리를 포함하는 동일한 계통의 마우스에 의해 나타나는 κ 경쇄 용법보다 더 큰 κ 경쇄 용법을 나타낸다. 특정 구체예에서, 마우스는 하나 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 단일한 κ 경쇄를 발현한다. 보다 구체적인 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 측면으로, 하나 이하, 또는 두 개 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일한 κ 경쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 완전한 또는 실질적으로 완전한 사람 κ 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스에 의해 나타난 동일한 κ 경쇄 용법보다 약 100-배 또는 그 이상, 적어도 약 200-배 또는 그 이상, 적어도 약 300-배 또는 그 이상, 적어도 약 400-배 또는 그 이상, 적어도 약 500-배 또는 그 이상, 적어도 약 600-배 또는 그 이상, 적어도 약 700-배 또는 그 이상, 적어도 약 800-배 또는 그 이상, 적어도 약 900-배 또는 그 이상, 적어도 약 900-배 또는 그 이상, 적어도 약 1000-배 또는 그 이상 또는 그 이상의 κ 경쇄 용법을 나타낸다. 특정 구체예에서, 완전한 또는 실질적으로 완전한 사람 κ 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스는 기능성 재배열되지 않은 마우스 κ 경쇄 서열이 결핍되어 있다. 특정 구체예에서, 마우스는 하나 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 단일한 κ 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 κ 경쇄 서열의 한 복사물을 포함한다(예컨대 이형접합체). 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 κ 경쇄 서열의 두 개의 복사물을 포함한다(예컨대 동형접합체). 보다 구체적인 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 측면으로, 하나 이하 또는 두 개 이하의 재배열된 경쇄 서열로부터 유도된 단일한 경쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 유전자 변형된 마우스에서 경쇄는 완전한 또는 실질적으로 완전한 경쇄 유전자좌를 내포하는 마우스에 의해 나타난 동일한 재배열된 경쇄의 발현보다 적어도 10-배 내지 약 1,000-배, 100-배 내지 약 1,000-배, 200-배 내지 약 1,000-배, 300-배 내지 약 1,000-배, 400-배 내지 약 1,000-배, 500-배 내지 약 1,000-배, 600-배 내지 약 1,000-배, 700-배 내지 약 1,000-배, 800-배 내지 약 1,000-배 또는 900-배 내지 약 1,000-배 더 높은 발현 수준을 나타낸다. 한 구체예에서, 경쇄는 사람 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 서열은 κ 서열이다. 한 구체예에서, 사람 서열은 λ 서열이다. 한 구체예에서, 경쇄는 전체 사람 경쇄이다.
한 구체예에서, 발현 수준은 전사된 경쇄 서열의 mRNA를 정량하고, 그것을 완전한 또는 실질적으로 완전한 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스의 전사된 경쇄 서열과 비교함으로써 특성확인된다.
한 측면으로, 하나 또는 두 개의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일한 κ 경쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 항원으로 면역될 때 동일한 항원으로 면역된 야생형 마우스에 비교할만한 혈청 역가를 나타낸다. 특정 구체예에서, 마우스는 하나의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 단일한 κ 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 혈청 역가는 총 면역글로불린으로서 특성확인된다. 특정 구체예에서, 혈청 역가는 IgM 비역가(specific titer)로서 특성확인된다. 특정 구체예에서, 혈청 역가는 IgG 비역가로서 특성확인된다. 보다 구체적인 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 측면으로, 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 항원-특이적 항체의 집단의 모든 면역글로불린 경쇄는 동일한 단일 사람 VL 유전자 절편으로부터 유도된 사람 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 면역글로불린 중쇄는 다수의 사람 VH 유전자 절편 중 하나로부터 유도된 사람 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
다양한 구체예에서, 사람 VH 유전자 절편은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택된다.
다양한 구체예에서, 동일한 단일 사람 VL 유전자 절편은 사람 Vκ1-39 유전자 절편 및 사람 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 모든 면역글로불린 경쇄는 Jκ 및 Jλ 유전자 절편으로부터 선택된 사람 경쇄 J(JL) 유전자 절편을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 JL 유전자 절편은 사람 Jκ1 및 Jκ5 유전자 절편으로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 마우스 면역글로불린 VL 유전자 절편, 마우스 면역글로불린 JL 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된 서열이 결핍되어 있다. 다양한 구체예에서, 사람 VL 영역은 사람, 마우스 또는 쥐 면역글로불린 경쇄 불변(CL) 영역에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 사람 VL 영역은 마우스 Cκ 영역에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 사람 VL 영역은 쥐 Cκ 영역에 작동가능하게 연결된다.
다양한 구체예에서, 사람 VL 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 발현된다. 다양한 구체예에서, 사람 VH 영역은 사람, 마우스 또는 쥐 면역글로불린 중쇄 불변(CH) 영역에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구체예에서, (CH) 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4 및/또는 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 VH 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 발현된다.
한 측면으로, 단일한 경쇄와 결합된 다수의 면역글로불린 중쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 중쇄는 사람 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 서열은 가변 서열, CH1, 힌지, CH2, CH3 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일한 경쇄는 사람 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 서열은 가변 서열, 불변 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 마우스는 장애를 가진 내인성 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 이식유전자 또는 염색체 외 에피솜으로부터 중쇄 및/또는 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 유전자좌에서 일부 또는 모든 내인성 마우스 중쇄 유전자 절편(즉 V, D, J), 및/또는 일부 또는 모든 내인성 마우스 중쇄 불변 서열(예컨대 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 그것들의 조합)의 하나 또는 그 이상의 사람 면역글로불린 서열로의 대체를 포함한다.
한 측면으로, 동일한 경쇄를 가지는 항체를 제조하기에 적당한 마우스가 제공되는데, 이때 마우스에서 만들어지는 모든 또는 실질적으로 모든 항체는 동일한 경쇄로 발현된다. 한 구체예에서, 경쇄는 내인성 경쇄 유전자좌로부터 발현된다.
한 측면으로, 사람 항체에 대한 경쇄를 제조하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 얻고, 그 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 사람 항체의 제조에 사용하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 사람 항체는 이중특이성 항체이다.
한 측면으로, 관심의 항원에 결합할 수 있고 본원에 기술된 것과 같은 공학처리된 경쇄를 가지는 사람 중쇄 가변 도메인을 확인하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 항원에 결합할 수 있는 첫 번째 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인을 제공하고, 그 중쇄 가변 도메인을 생식선 경쇄 서열로 보수하며 세포를 형질전환시켜서 각각이 두 번째 항체를 발현하도록 하고, 그 두 번째 항체를 항원에 노출시키고 두 번째 항체의 항원에 대한 결합을 측정하는 것으로 이루어진다.
한 구체예에서, 첫 번째 항체의 경쇄는 사람 Vκ1-39 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 항체의 경쇄는 사람 Vκ3-20 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 생식선 경쇄 서열은 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 두 번째 항체의 항원에 대한 결합은 첫 번째 항체의 항원에 대한 결합을 비교함으로써 측정된다.
본원에서 기술된 구체예와 측면은 어느 것이든지 맥락과 다르게 표시되거나 드러나지 않는 한 다른 것과 함께 사용될 수 있다. 다른 구체예들도 다음의 설명을 개관함으로써 해당 기술분야의 숙련자들에게 드러날 것이다.
도 1은 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 대체하기 위한 표적화 전략을 도시한다.
도 2는 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 대체하기 위한 표적화 전략을 도시한다.
도 3은 사람 VpreB/Jλ5 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 대체하기 위한 표적화 전략을 도시한다.
도 4는 야생형 마우스(WT), 공학처리된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대해 동형접합성인 마우스(Vκ1-39Jκ5 HO) 및 공학처리된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대해 동형접합성인 마우스(Vκ3-20Jκ1 HO)에 대한 말초혈로부터의 CD19+ B 세포의 %(y-축)를 도시한다.
도 5a는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 대체하는 것에 대해 동형접합성인 마우스(Hκ), 야생형 마우스(WT), 및 공학처리된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대해 이형접합성인 마우스(Vκ1-39Jκ5 HET)에서, 공학처리된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역(Vκ1-39Jκ5 접합 프로브)과 사람 Vκ1-39 유전자 절편(Vκ1-39 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하여 정량적 PCR 분석에서 Vκ1-39-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현(y-축)을 도시한다. 신호는 마우스 Cκ의 발현에 대해 정상화된다. N.D.: 검출되지 않음.
도 5b는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 대체하는 것에 대해 동형접합성인 마우스(Hκ), 야생형 마우스(WT), 및 공학처리된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대해 동형접합성인 마우스(Vκ1-39Jκ5 HO)에서, 공학처리된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역(Vκ1-39Jκ5 접합 프로브)과 사람 Vκ1-39 유전자 절편(Vκ1-39 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하여 정량적 PCR 분석에서 Vκ1-39-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현(y-축)을 도시한다. 신호는 마우스 Cκ의 발현에 대해 정상화된다.
도 5c는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 대체하는 것에 대해 동형접합성인 마우스(Hκ), 야생형 마우스(WT), 및 공학처리된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대해 이형접합성(HET)이거나 동형접합성(HO)인 마우스에서, 공학처리된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역(Vκ3-20Jκ1 접합 프로브)과 사람 Vκ3-20 유전자 절편(Vκ3-20 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하여 정량적 PCR 분석에서 Vκ3-20-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현(y-축)을 도시한다. 신호는 마우스 Cκ의 발현에 대해 정상화된다.
도 6a는 β-갈락토시다제로 면역된 야생형(WT; N=2) 및 공학처리된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대하여 동형접합성인 마우스(Vκ1-39Jκ5 HO; N=2)에서의 IgM(좌측) 및 IgG(우측) 역가를 도시한다.
도 6b는 β-갈락토시다제로 면역된 야생형(WT; N=5) 및 공학처리된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대하여 동형접합성인 마우스(Vκ3-20Jκ1 HO; N=5)에서의 총 면역글로불린(IgM, IgG, IgA) 역가를 도시한다.
본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않지만, 그런 방법 및 조건들은 달라질 수 있다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특별한 구체예를 기술할 목적에만 대한 것이고, 제한하기 위해 의도된 것이 아니라는 것이 인지되어야 하는데, 본 발명의 범주는 청구범위에 의해 규정되기 때문이다.
다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 및 구절은 분명하게 반대로 표시되거나 그것들이 사용되는 맥락으로부터 반대로 드러나지 않는 한, 그 용어와 구절이 해당 기술분야에서 획득한 의미를 포함한다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 재료든지 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료를 아래에 기술한다.
본원에 사용되는 것과 같은 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호연결되어 있는 두 개의 무거운(H) 사슬과 두 개의 가벼운(L) 사슬을 포함하고 있는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변(VH) 영역과 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변(VL) 영역 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. VH와 VL 영역은 추가로 더 보존되고 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 영역들이 중간에 끼어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 다시 나누어질 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR과 네 개의 FR을 포함하며, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수 있다). 용어 "고친화성" 항체는 그것의 표적 에피토프와 관련하여 약 10-9M 또는 그 이하(예컨대 약 1×10-9M, 1×10-10M, 1×10-11M 또는 약 1×10-12M)의 KD를 가지는 항체를 나타낸다. 한 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예컨대 BIACORETM에 의해 측정되며; 다른 구체예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
구절 "이중특이성 항체"는 둘 또는 그 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 두 개의 동일하지 않은 중쇄를 포함하는데, 이때 각각의 중쇄는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다 - 두 개의 상이한 분자상에서(예컨대 두 개의 상이한 면역원 상의 상이한 에피토프) 또는 동일한 분자상에서(예컨대 동일한 면역원 상의 상이한 에피토프). 만약 이중특이성 항체가 두 개의 상이한 에피토프(첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있다면, 첫 번째 중쇄의 첫 번째 에피토프에 대한 친화성은 일반적으로 첫 번째 중쇄의 두 번째 에피토프에 대한 친화성보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4 또는 그 이상의 크기의 차수만큼 더 낮을 것이고, 그 역도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 특이적으로 결합된 에피토프는 동일하거나 상이한 표적(예컨대 동일하거나 상이한 단백질 상에)에 있을 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들면 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄 가변 서열을 코드화하는 핵산 서열은 동일하거나 상이한 중쇄 불변 영역을 코드화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 그런 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체는 각각이 세 개의 중쇄 CDR과, 이어서(N-말단에서 C-말단 쪽으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 가지는 두 개의 중쇄와, 에피토프-결합 특이성을 부여하지는 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 에피토프-결합 영역에 의해 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 하나 또는 둘 다의 에피토프에 대한 하나 또는 둘 다의 중쇄의 결합을 가능하게 하는 면역글로불린 경쇄를 가진다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적당한 모든 세포를 포함한다. 세포는 원핵 및 진핵 세포(단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포(예컨대 대장균, 바실루스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예컨대 맥주효모균, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 세포 융합물, 예컨대 하이브리도마 또는 콰드로마를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐 또는 마우스 세포이다. 어떤 구체예에서, 세포는 진핵세포이고 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예컨대 CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예컨대 COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60(예컨대 BHK21), Jurkat, Daudi, A431(상피성), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT 1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 셀라인. 어떤 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예컨대 PER.C6TM 세포)를 포함한다.
구절 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 정상적으로(즉 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자(예컨대 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에 있는 두 개의 프레임워크 영역 사이에서 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들면 생식선 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해 코드화될 수 있고, 예컨대 단순한(naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 코드화될 수 있다. CDR은 체세포성 돌연변이될 수 있고(예컨대 동물의 생식선에 코드화된 서열로부터 달라진다), 인간화될 수 있으며, 및/또는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실로 변형될 수 있다. 어떤 상황에서는(예컨대 CDR3에 대해), CDR은 연속적이지 않지만(예컨대 재배열되지 않은 핵산 서열에서), 예컨대 서열의 스플라이싱 또는 연결(예컨대 중쇄 CDR3를 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열에서 연속적인 둘 또는 그 이상의 서열(예컨대 생식선 서열)에 의해 코드화될 수 있다.
용어 "보존성"은 보존성 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용될 때, 유사한 화학적 특성(예컨대 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 R 기를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 아미노산 잔기가 치환되는 것을 포함한다. 일반적으로 보존성 아미노산 치환은 실질적으로는 단백질의 관심의 기능적 특성, 예를 들면 가변 영역이 원하는 친화성으로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 가지는 측쇄를 가지는 아미노산 그룹의 실례로는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 쓰레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아마이드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄를 들 수 있다. 보존성 아미노산 치환기로는 예를 들면 발린/로이신/이소로이신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파테이트 및 아스파라긴/글루타민이 있다. 어떤 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 예를 들면 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 사용되는 것과 같이, 알라닌으로 단백질의 어떠한 천연 잔기를 치환하는 것일 수 있다. 어떤 구체예에서, 문헌에 개시된 PAM250 로그-유사성 매트릭스(Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45)에서 포지티브 값을 가지는 보존성 아미노산 치환이 만들어진다. 어떤 구체예에서, 치환은 치환이 PAM250 로그-유사성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가지는 적당하게 보존성인 치환이다.
어떤 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 잔기 위치는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 다르다. 어떤 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 그것의 기능성 단편(예컨대 B 세포로부터의 발현 및 분비를 가능하게 하는 단편)에서 잔기 위치는 그것의 아미노산 서열이 본원에서 열거된 경쇄와 동일하지는 않지만, 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 상이하다.
구절 "에피토프-결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR를 가지고 있고 선택적으로 에피토프를 인지할 수 있는, 예컨대 약 1 마이크로몰 또는 그 이하의 KD(예컨대 약 1×10-6M, 1×10-7M, 1×10-8M, 1×10-9M, 1×10-10M, 1×10-11M 또는 약 1×10-12M인 KD)로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료적 에피토프-결합 단백질(예컨대 치료적 항체)은 자주 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD를 필요로 한다.
구절 "기능성 단편"은 발현되고, 분비되며, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인지는 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위의 KD를 가지는 것을 포함한다.
면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식선"은 자손에게 계대될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하여, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 다르게 명시되지 않는 한 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄 단편은 CDR, CDR과 FR 및 그것들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 다음에 (N-말단으로부터 C-말단 쪽으로), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능성 단편은 에피토프를 특이적으로 인지할 수 있고(예컨대 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인지할 수 있음), 세포로부터 발현되고 분비될 수 있으며, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열과 관련하여 사용될 때, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 해당 기술분야에 공지되어 있는 많은 상이한 알고리즘에 의해 측정된 것과 같은 동일성을 포함한다. 본원에서 기술되는 어떤 구체예에서, 동일성은 10.0의 오픈 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 사용하는 ClustalW v.1.83(slow) 배열을 사용하고, Gonnet 유사성 매트릭스(MACVECTORTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 측정된다. 서열의 동일성과 관련하여 비교되는 서열의 길이는 특정 서열에 따라 좌우되겠지만, 경쇄 불변 도메인의 경우 길이는 자체-결합되어 규준적인 경쇄 불변 도메인을 형성할 수 있는, 예컨대 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트를 형성할 수 있고 사람 또는 마우스의 적어도 하나의 CH1 도메인과 상호작용할 수 있는 경쇄 불변 도메인으로 접히기에 충분한 길이의 서열을 함유하여야 한다. CH1 도메인의 경우, 서열의 길이는 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트를 형성할 수 있고 사람 또는 마우스의 적어도 하나의 경쇄 불변 도메인과 상호작용할 수 있는 CH1 도메인으로 접히기에 충분한 길이의 서열을 함유하여야 한다.
구절 "면역글로불린 분자"는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 상이하며, 경쇄는 동일하거나 상이할 수 있다.
구절 "경쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 다르게 명시되지 않는 한 사람 카파 및 람다 경쇄 및 VpreB, 및 대체 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 전형적으로, 다르게 명시되지 않는 한 세 개의 경쇄 CDR과 네 개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로 전체 길이의 경쇄는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄는 예를 들면 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 첫 번째 또는 두 번째 에피토프 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합하고 그것들을 인지함으로써 중쇄와 결합하고, 인지하거나 또는 보조하는 것들을 포함한다. 공통 경쇄는 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자로부터 유도된 것들을 포함하고, 그것들의 체세포성 돌연변이된(예컨대 친화성 성숙된) 버전을 포함한다.
구절 "마이크로몰 범위"는 1 내지 999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되고; 구절 "나노몰 범위"는 1 내지 999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되며; 구절 "피코몰 범위"는 1 내지 999 피코몰"을 의미하는 것으로 의도된다.
구절 "체세포성 돌연변이된"은 본원에서 사용되는 것과 같이, 부류간 스위칭을 진행하는 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함하는데, 이때 부류간 스위칭된 B 세포의 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열(예컨대 중쇄 가변 도메인을 코드화하거나 또는 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 뉴크레오티드 서열)은 예를 들면 부류간 스위칭이 진행되지 않은 B 세포와 부류간 스위칭이 진행된 B 세포 사이의 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열의 차이와 같이, 부류간 스위칭 전의 B 세포의 핵산 서열과 동일하지 않다. "체세포성 돌연변이된"은 친화성-성숙되지 않은 B 세포의 해당하는 면역글로불린 가변 영역 서열(즉 생식 세포의 게놈 서열)에 동일하지 않은 친화성-성숙된 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함한다. 구절 "체세포성 돌연변이된"은 또한 관심의 에피토프에 대한 B 세포의 노출 후에 B 세포로부터의 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 언급을 포함하는데, 이때 핵산 서열은 관심의 에피토프에 대한 B 세포의 노출 전의 해당하는 핵산 서열과는 다르다. 구절 "체세포성 돌연변이된"은 또한 면역원 도전에 대한 반응으로 사람 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 가지는 동물, 예컨대 마우스에서 생성된, 그리고 그런 동물에서 고유하게 작동하는 선택 과정으로부터 유발된 항체로부터의 서열을 말한다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "재배열되지 않은"은 동물 세포의 생식선에 존재하는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "가변 도메인"은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로(다른 표시가 없는 한) 순서대로 다음의 아미노산 영역: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4를 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다.
공통 경쇄
유용한 다중특이성 에피토프-결합 단백질, 예컨대 이중특이성 항체를 제조하기 위한 선행 노력들은 공통되는 패러다임, 즉 이종이량체의 이중특이성 사람 면역글로불린의 짝짓기를 위한 적당한 형식을 합리적으로 공학처리하기 위해, 또는 시행착오를 통해 공학처리하기 위해 서열을 시험관 내 선택 또는 조작하는 것을 빈번하게 공유하는 다양한 문제들에 의해 방해를 받아왔다. 불행하게도, 전부가 아니라면 대부분의 시험관 내 공학처리적 접근법은 개별적인 분자에 적당한, 주로 즉석 고정을 제공한다. 다른 한편으로, 사람 치료제로 유도할 수 있는 적절한 짝짓기를 선택하기 위하여 복잡한 유기체를 사용하는 생체 내 방법은 현실화되지 못하였다.
일반적으로, 천연 마우스 서열은 자주 사람 치료제 서열을 위한 좋은 공급원은 아니다. 적어도 그 이유에 대해서, 공통 사람 경쇄와 짝을 이루는 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 생성하는 것은 실제 활용도가 제한된다. 공통 사람 경쇄와 결합시키는 능력을 유지하는 한편 에피토프 특이성과 친화성은 보유되기를 희망하면서 마우스 중쇄 가변 서열을 인간화하기 위해 더 많은 시험관 내 공학처리하는 노력이 시행착오적인 과정에서 쏟아부어졌지만, 결과는 불확실하였다. 그런 과정이 끝날 시점에, 최종 생성물은 특이성과 친화성의 일부를 유지할 수 있고, 공통 경쇄와 결합할 수 있지만, 궁극적으로는 사람에서의 면역원성은 엄청난 위험성을 안고 있는 것 같다.
그러므로, 사람 치료제를 제조하기에 적당한 마우스는 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 절편 대신 사람 중쇄 가변 영역 유전자 절편의 적당하게 큰 레퍼토리를 포함할 것이다. 사람 중쇄 가변 영역 유전자 절편은 재배열되고 역 키메릭 중쇄(즉 사람 가변 도메인과 마우스 불변 영역을 포함하고 있는 중쇄)를 형성하기 위하여 내인성 마우스 중쇄 불변 도메인과 재조합될 수 있다. 중쇄는 부류간 스위칭할 수 있고 체세포성 과돌연변이를 할 수 있어서, 중쇄 가변 도메인의 적당하게 큰 레퍼토리는 마우스가 사람 경쇄 가변 영역의 제한된 레퍼토리와 결합될 수 있는 것을 선택하기 위해 활용될 수 있다.
다수의 중쇄에 대해 공통 경쇄를 선택하는 마우스는 실제적인 활용성을 가진다. 다양한 구체예에서, 유일하게 공통 경쇄를 발현할 수 있는 마우스에서 발현하는 항체는 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 경쇄와 결합하고 그것과 함께 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 특히 이중특이성 항체를 만들 때 유용하다. 예를 들어 그런 마우스는 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해 첫 번째 면역원으로 면역될 수 있다. 마우스(또는 유전적으로 동일한 마우스)는 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위하여 두 번째 면역원으로 면역될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클론될 수 있고, 동일한 중쇄 불변 영역, 및 동일한 경쇄와 함께 발현하며, 이중특이성 항체를 만들기 위해 세포에서 발현될 수 있고, 이때 이중특이성 항체의 경쇄 성분은 경쇄 성분과 결합하고 그것과 함께 발현하기 위해 마우스에 의해 선택되었다.
본 발명자들은 중쇄, 이를테면 그것의 가변 영역, 예컨대 친화성 성숙된 또는 체세포성 돌연변이된 가변 영역이 생식선 서열로부터 유래한 중쇄의 상당히 다양한 패밀리와 적당하게 짝을 이룰 면역글로불린 경쇄를 제조하기 위한 마우스를 공학처리하였다. 다양한 구체예에서, 마우스는 사람 경쇄 가변 도메인을 체세포성 돌연변이를 포함하는 사람 중쇄 가변 도메인과 짝을 이루고, 그로써 사람 치료제로서 사용하기에 적당한 고친화성 결합 단백질로의 경로를 가능하게 하도록 고안된다.
유전자 공학처리된 마우스는 유기체 내에서 길고 복작합 항체 선택의 과정을 통해서, 사람 중쇄 가변 도메인의 다양한 수집을 제한된 수의 사람 경쇄 옵션과 짝을 이루는 데 있어 생물학적으로 적절한 선택을 한다. 이것을 이루기 위하여, 마우스는 매우 다양한 사람 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 사람 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 공학처리된다. 그 마우스는 면역원으로 도전받을 때, 그것의 레퍼토리에 수 또는 경쇄 옵션에 의해 한정적으로 크게 또는 단독으로, 그것의 레퍼토리에 면역원에 대한 항체를 발생시키도록 해결의 수를 최대화한다. 다양한 구체예에서, 이것은 마우스가, 그럼에도 불구하고, 특히 체세포성 돌연변이된 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하여 상대적으로 매우 다양한 사람 중쇄 가변 도메인과 부합하게 될 경쇄 가변 도메인의 적당하고 부합하는 체세포성 돌연변이를 이루는 것을 허용하는 것을 포함한다.
경쇄 옵션의 제한된 레퍼토리를 이루기 위하여, 마우스는 천연 마우스 경쇄 가변 도메인을 만들거나 재배열하는 능력을 비기능성으로, 또는 실질적으로 비기능성으로 만들도록 공학처리된다. 이것은 예를 들면 마우스의 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 결실시킴으로써 이루어질 수 있다. 그런 다음 내인성 마우스 유전자좌가 선택된 외부의 적당한 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편에 의해 변형될 수 있는데, 그것은 외인성 사람 가변 영역 유전자 절편이 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 유전자와 조합될 수 있고 그로써 재배열된 역 키메릭 경쇄 유전자(사람 가변, 마우스 불변)를 형성할 수 있는 방식으로, 내인성 마우스 경쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 체세포성 돌연변이될 수 있다. 다양한 구체예에서, 체세포성 돌연변이를 획득하는 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하기 위하여, 적절한 인핸서(들)이 마우스에 보유된다. 예를 들어 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편을 사람 κ 경쇄 유전자 절편으로 대체하기 위하여 마우스 κ 경쇄를 변형시킬 때 마우스 κ 인트로닉 인핸서와 마우스 κ 3' 인핸서가 기능적으로 유지되거나, 또는 파괴되지 않는다.
다양한 역 키메릭(사람 가변, 마우스 불변) 중쇄와 결합된 역 키메릭(사람 가변, 마우스 불변) 경쇄의 제한된 레퍼토리를 발현하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공된다. 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편이 결실되고, 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 단일(또는 두 개의) 재배열된 사람 경쇄 영역으로 대체된다. 재배열된 사람 경쇄 영역의 체세포성 과돌연변이를 최대화하기 위한 구체예에서, 마우스 κ 인트로닉 인핸서와 마우스 κ 3' 인핸서가 유지된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 또한 비기능성 λ 경쇄 유전자좌, 또는 그것의 결실 또는 유전자좌가 λ 경쇄를 만들 수 없도록 만드는 결실을 포함한다.
다양한 구체예에서, 내인성 마우스 경쇄 VL 및 JL 유전자 절편이 결핍되어 있고, 재배열된 사람 경쇄 가변 영역을 포함하고 있는 경쇄 가변 영역, 한 구체예에서는, 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 재배열된 사람 VL/JL 서열을 포함하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공되는데, 이때 유전자좌는 체세포성 과돌연변이를 진행할 수 있고, 유전자좌는 마우스 불변 영역에 연결된 사람 VL/JL 서열을 포함하고 있는 경쇄를 발현한다. 그로써, 다양한 구체예에서, 유전자좌는 정상적인, 또는 야생형 수준의 체세포성 과돌연변이와 상호관련된 마우스 κ3' 인핸서를 포함한다.
다양한 구체예에서, 유전자 공학처리된 마우스는 관심의 항원으로 면역될 때 하나 또는 두 개의 재배열된 경쇄를 사용하여 발현하고 기능하는 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 재배열의 다양성을 나타내는 B 세포를 생성하는데, 이를테면 하나 또는 두 개의 경쇄가 예컨대 1 내지 5개의 체세포성 돌연변이를 포함하는 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 구체예를 들 수 있다. 다양한 구체예에서, 그렇게 발현된 사람 경쇄는 마우스에서 발현된 어떠한 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역과도 결합하여 발현될 수 있다.
하나 이상의 에피토프와 결합하는 에피토프-결합 단백질
본원에 기술된 조성물 및 방법은 하나 이상의 에피토프에 고친화성으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들면 이중특이성 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 장점은 그것의 각각이 단일한 경쇄와 결합하게 될 적당히 고결합(예컨대 친화성 성숙된) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함한다.
이중특이성 결합 단백질의 합성 및 발현은 부분적으로는 두 개의 상이한 중쇄와 결합하여 발현할 수 있는 적당한 경쇄를 확인하는 것과 관련된 문제들로 인해, 또 부분적으로는 분리 문제로 인해 많은 문제가 되어 왔다. 본원에 기술된 방법과 조성물은 유전자 변형된 마우스가 그렇지 않다면 자연적 과정을 통해서, 하나 이상의 중쇄, 이를테면 체세포성 돌연변이된(예컨대 친화성 성숙된) 중쇄와 결합하고 발현할 수 있는 적당한 경쇄를 선택하는 것을 허용한다. 본원에 기술된 것과 같이 역 키메릭 중쇄(즉 사람 가변 및 마우스 불변)를 가지는 친화성 성숙된 항체를 발현하는 면역된 마우스의 적당한 B 세포로부터의 사람 VL 및 VH 서열은 적당한 사람 불변 영역 유전자 서열(예컨대 사람 IgG1)을 포함하는 발현 벡터에서 확인되고 한 프레임으로 클론될 수 있다. 그런 두 개의 구성물이 제조될 수 있는데, 각 구성물은 상이한 에피토프에 결합하는 사람 중쇄 가변 도메인을 코드화한다. 생식선 서열에서 또는 서열이 체세포성 돌연변이되어 있는 B 세포로부터의 사람 VL들 중 하나(예컨대 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1)는 적당한 사람 불변 영역 유전자(예컨대 사람 κ 불변 유전자)에 한 프레임으로 융합될 수 있다. 이들 세 개의 전체 사람 중쇄 및 경쇄 구성물은 발현을 위해 적당한 세포에 놓일 수 있다. 세포는 두 개의 주요 종, 즉 동일한 경쇄를 가지는 동종이량체의 중쇄, 및 동일한 경쇄를 가지는 이종이량체의 중쇄를 발현할 것이다. 이들 주요 종의 용이한 분리를 가능하게 하기 위해, 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정기를 생략하도록 변형되어 이종이량체 결합 단백질과는 다른 동종이량체 결합 단백질의 친화성을 유발한다. 이 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 US 2010/0331527A1으로 공개된, 2010년 6월 25일에 출원된 USSN 12/832,838에 "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format"이란 제목으로 설명되어 있다.
한 측면으로, 본원에서 기술된 것과 같은 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 이때 사람 VL과 VH 서열은 관심의 에피토프를 포함하고 있는 항원으로 면역되어 있는, 본원에서 기술된 마우스로부터 유도된다.
한 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 첫 번째 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단 쪽으로 첫 번째 에피토프에 선택적으로 결합하는 첫 번째 에피토프-결합 영역과, 이어서 IgG1, IgG2, IgG4 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 IgG의 첫 번째 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하고 있고; 두 번째 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단 쪽으로, 두 번째 에피토프에 선택적으로 결합하는 두 번째 에피토프-결합 영역과, 이어서 IgG1, IgG2, IgG4 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 IgG의 두 번째 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하고 있으며, 이때 두 번째 CH3 영역은 단백질 A에 대한 두 번째 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 영역은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R)을 포함한다. 다른 구체예에서, 두 번째 CH3 영역은 추가로 Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F)을 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 영역은 변형된 사람 IgG1으로부터 유래하고, 추가로 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 영역은 변형된 사람 IgG2로부터 유래하고, 추가로 N44S, K52N, 및 V82I(IMGT; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V422I)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 영역은 변형된 사람 IgG4로부터 유래하고, 추가로 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함한다.
하나 이상의 에피토프에 결합하는 에피토프-결합 단백질을 제조하기 위한 한 가지 방법은 본 발명에 따르는 첫 번째 마우스를 관심의 첫 번째 에피토프를 포함하는 항원으로 면역시키는 것인데, 이때 마우스는 경쇄를 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 마우스 VL을 함유하지 않는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하고, 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에는 마우스 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일한 재배열된 사람 VL 영역이 있으며, 재배열된 사람 VL 영역은 사람 Vκ1-39Jκ5 및 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되고, 내인성 마우스 VH 유전자 절편은 전체적으로 또는 부분적으로 사람 VH 유전자 절편으로 대체되어 있어서, 마우스에 의해 제조된 면역글로불린 중쇄는 단독으로 또는 실질적으로 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 포함하는 중쇄이다. 그런 마우스는 면역될 때, 두 개의 사람 경쇄 가변 도메인 중 하나만(예컨대 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 중 하나) 포함하는 역 키메릭 항체를 만들 것이다. 일단 B 세포가 관심의 에피토프에 결합하는 VH를 코드화하는 것으로 확인되면, 그 VH(및 임의로, VL)의 뉴클레오티드 서열은 회수될 수 있고(예컨대 PCR에 의해), 적당한 사람 면역글로불린 불변 도메인과 한 프레임으로 발현 구성물 안으로 클론될 수 있다. 이 과정은 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 VH 도메인을 확인하기 위해 반복될 수 있고, 두 번째 VH 유전자 서열은 회수되고 두 번째 적당한 면역글로불린 불변 도메인과 한 프레임으로 발현 벡터 안에 클론될 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 불변 도메인은 동일하거나 상이한 아이소타입일 수 있고, 면역글로불린 불변 도메인들 중 하나(다른 것이 아닌)는 본원에 기술되거나 US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 변형될 수 있으며, 에피토프-결합 단백질은 적당한 세포에서 발현되고 예를 들면 US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이, 동종이량체 에피토프-결합 단백질과 비교하여 그것의 단백질 A에 대한 차등 친화성을 토대로 분리될 수 있다.
한 구체예에서, 이중특이성 에피토프-결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 본원에서 기술된 것과 같은 마우스로부터 첫 번째 친화성-성숙된(예컨대 하나 또는 그 이상의 체세포성 과돌연변이를 포함함) 사람 VH 뉴클레오티드 서열(VH1)을 확인하고, 본원에서 기술된 것과 같은 마우스로부터 두 번째 친화성-성숙된(예컨대 하나 또는 그 이상의 체세포성 과돌연변이를 포함함) 사람 VH 뉴클레오티드 서열(VH2)을 확인하며, US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 단백질 A-결정기 변형이 결핍되어 있는 사람 중쇄와 한 프레임으로 VH1을 클로닝하여 중쇄 1(HC1)을 형성하고, US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 단백질 A-결정기 변형이 결핍되어 있는 사람 중쇄와 한 프레임으로 VH2를 클로닝하여 중쇄 2(HC2)를 형성하며, HC1을 포함하고 있는 발현 벡터 및 HC2를 포함하고 있는 동일하거나 상이한 발현 벡터를 세포 안에 도입하고, 이때 세포는 또한 사람 경쇄 불변 도메인에 융합된 사람 Vκ1-39/사람 Jκ5 또는 사람 Vκ3-20/사람 Jκ1을 포함하는 사람 면역글로불린 경쇄를 발현하며, 세포가 VH1에 의해 코드화된 VH 도메인과 VH2에 의해 코드화된 VH 도메인을 포함하고 있는 이중특이성 에피토프-결합 단백질을 발현하도록 허용하고, 그 이중특이성 에피토프-결합 단백질을 단일특이성 동종이량체 에피토프-결합 단백질과 비교하여 단백질 A에 대한 그것의 차등 결합 능력을 토대로 분리하는 것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, HC1은 IgG1이고 HC2는 변형 H95R(IMGT; EU에 의하면 H435R)을 포함하고, 추가로 변형 Y96F(IMGT; EU에 의하면 Y436F)를 포함하는 IgG1이다. 한 구체예에서, VH1에 의해 코드화된 VH 도메인, VH2에 의해 코드화된 VH 도메인 또는 둘 다는 체세포성 돌연변이된다.
공통 사람 V L 과 함께 발현하는 사람 V H 유전자
4개의 상이한 항원에 대하여 발생한 친화성-성숙된 항체로부터의 다양한 사람 가변 영역은 그것들의 어느 하나의 동족의 경쇄와 함께, 또는 사람 Vκ1-39Jκ5, 사람 Vκ3-20Jκ1 또는 사람 VpreBJλ5로부터 선택된 적어도 하나의 사람 경쇄와 함께 발현되었다(실시예 1 참조). 각 항원에 대한 항체에 대해, 상이한 유전자 패밀리로부터의 체세포성 돌연변이된 고친화성 중쇄가 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 영역과 성공적으로 짝이 이루어졌고, 중쇄 및 경쇄를 발현하는 세포로부터 분비되었다. Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1에 대해, 다음의 사람 VH 유전자 패밀리로부터 유도된 VH 도메인이 우선적으로 발현되었다: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 및 6-1. 그로써 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 중 하나 또는 둘 다로부터 제한된 레퍼토리의 사람 VL 도메인을 발현하도록 공학처리된 마우스는 사람 VH 유전자 절편으로 마우스 VH 유전자 절편이 대체되도록 변형된 VH 유전자좌로부터 체세포성 돌연변이된 사람 VH 도메인의 다양한 집단을 생성할 것이다.
단일한 재배열된 경쇄(예컨대 Vκ1-39/J 또는 Vκ3-20/J)와 결합된 역 키메릭(사람 가변, 마우스 불변) 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 유전자 공학처리된 마우스는 관심의 항원으로 면역될 때, 다양한 사람 VH 재배열을 포함하고 항원의 리간드에 대한 항원의 결합을 차단하는 능력, 및 항원의 변이체에 결합하는 능력과 관련하여 다양한 특성을 나타내는 다양한 고-친화성 항원-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 생성하였다(실시예 5 내지 실시예 10 참조).
그로써 본원에 기술된 마우스와 방법은 다양한 재배열로부터 유발되고, 매우 다양한 친화성(약 나노몰 또는 그 미만의 KD를 나타내는 것을 포함함), 광범위한 특이성(동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 포함함)을 나타내며, 동일하거나 실질적으로 동일한 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 결합하고 발현하는, 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 이를테면 체세포성 돌연변이된 사람 중쇄 가변 도메인을 제조하고 선택하는 데 유용하다.
다음의 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법과 조성물을 해당 기술분야에 공통 지식을 가진 사람들에게 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명이라 여기는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치(예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 많은 노력이 기울여졌지만, 일부 실험상의 에러와 편차는 설명되어야 한다. 다른 표시가 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법과 조성물을 해당 기술분야에 공통 지식을 가진 사람들에게 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명이라 여기는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치(예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 많은 노력이 기울여졌지만, 일부 실험상의 에러와 편차는 설명되어야 한다. 다른 표시가 없는 한, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이며, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이다.
실시예 1
선택된 사람 경쇄 가변 영역과 결합하는 사람 중쇄 가변 영역의 확인
단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄가 항원 특이적 사람 항체로부터 사람 중쇄와 함께 공동-발현될 수 있는지를 측정하기 위하여 시험관 내 발현 시스템을 구성하였다.
유전자 변형된 마우스에서 사람 항체를 생성하기 위한 방법은 알려져 있다(예컨대 US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). VELOCIMMUNE® 기술은 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동가능하게 연결됨으로써 마우스가 항원성 자극에 대한 반응으로 사람 가변 영역과 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산하게 되는 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고 있는 게놈을 가지는 유전자 변형된 마우스의 생성을 포함한다. VELOCIMMUNE® 마우스로부터 생성된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드화하는 DNA는 전체 사람이다. 초기에, 사람 가변 영역과 마우스 불변 영역을 가지는 고친화성 키메릭 항체가 분리된다. 아래에서 기술되는 것과 같이, 항체는 바람직한 특성, 이를테면 친화성, 선택성, 에피토프 등에 대해 특성확인되고 선택된다. 마우스 불변 영역은 바람직한 사람 불변 영역으로 대체되어 비-IgM 아이소타입, 예를 들면 야생형 또는 변형된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 함유하는 전체 사람 항체가 생성된다. 선택된 불변 영역이 특정 용도에 따라 달라질 수 있는 한편, 고친화성 항원-결합 및 표적 특이성 특징들은 가변 영역에 잔재한다.
VELOCIMMUNE® 마우스를 혈관형성을 촉진하는 성장 인자(항원 C)로 면역시키고, 항원-특이적 사람 항체를 분리한 후 해당 기술분야에 인지된 표준 기법을 사용하여 V 유전자 용법에 대해 서열화하였다. 선택된 항체를 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역 상에 클론하였고, 69개의 중쇄를 선택하여 다음 세 개의 사람 경쇄 중 하나와 짝을 이루었다: (1) 사람 κ 불변 영역에 연결된 동족의 κ 경쇄, (2) 사람 κ 불변 영역에 연결된 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5, 또는 (3) 사람 κ 불변 영역에 연결된 재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1. 각각의 중쇄 및 경쇄쌍을 표준 기법을 사용하여 CHO-K1 세포에 공동-형질전환하였다. 상층액 중의 항체의 존재를 ELISA 분석에서 항-사람 IgG에 의해 검출하였다. 각 중쇄/경쇄 쌍에 대해 항체 역가(ng/ml)를 측정하고, 상이한 재배열된 생식선 경쇄의 역가를 원래의 항체 분자(즉 동족의 경쇄와 짝을 이룬 중쇄)로 얻어진 역가와 비교하였으며, 원래의 역가의 %를 계산하였다(표 1). VH: 중쇄 가변 유전자. ND: 현재의 실험 조건 하에서는 발현이 검출되지 않음.
VH 항체 역가 (ng/mL) 원래 역가의 %
동족 LC Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1 Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1
3-15 63 23 11 36.2 17.5
1-2 103 53 ND 51.1 -
3-23 83 60 23 72.0 27.5
3-33 15 77 ND 499.4 -
4-31 22 69 17 309.4 76.7
3-7 53 35 28 65.2 53.1
- 22 32 19 148.8 89.3
1-24 3 13 ND 455.2 -
3-33 1 47 ND 5266.7 -
3-33 58 37 ND 63.1 -
- 110 67 18 60.6 16.5
3-23 127 123 21 96.5 16.3
3-33 28 16 2 57.7 7.1
3-23 32 50 38 157.1 119.4
- 18 45 18 254.3 101.7
3-9 1 30 23 2508.3 1900.0
3-11 12 26 6 225.9 48.3
1-8 16 ND 13 - 81.8
3-33 54 81 10 150.7 19.1
- 34 9 ND 25.9 -
3-20 7 14 54 203.0 809.0
3-33 19 38 ND 200.5 -
3-11 48 ND 203 - 423.6
- 11 23 8 212.7 74.5
3-33 168 138 182 82.0 108.2
3-20 117 67 100 57.5 86.1
3-23 86 61 132 70.7 154.1
3-33 20 12 33 60.9 165.3
4-31 69 92 52 133.8 75.0
3-23 87 78 62 89.5 71.2
1-2 31 82 51 263.0 164.6
3-23 53 93 151 175.4 285.4
- 11 8 17 75.7 151.4
3-33 114 36 27 31.6 23.4
3-15 73 39 44 53.7 59.6
3-33 1 34 16 5600.0 2683.3
3-9 58 112 57 192.9 97.6
3-33 67 20 105 30.1 157.0
3-33 34 21 24 62.7 70.4
3-20 10 49 91 478.4 888.2
3-33 66 32 25 48.6 38.2
3-23 17 59 56 342.7 329.8
- 58 108 19 184.4 32.9
- 68 54 20 79.4 29.9
3-33 42 35 32 83.3 75.4
- 29 19 13 67.1 43.9
3-9 24 34 29 137.3 118.4
3-30/33 17 33 7 195.2 43.1
3-7 25 70 74 284.6 301.6
3-33 87 127 ND 145.1 -
6-1 28 56 ND 201.8 -
3-33 56 39 20 69.9 36.1
3-33 10 53 1 520.6 6.9
3-33 20 67 10 337.2 52.3
3-33 11 36 18 316.8 158.4
3-23 12 42 32 356.8 272.9
3-33 66 95 15 143.6 22.5
3-15 55 68 ND 123.1 -
- 32 68 3 210.9 10.6
1-8 28 48 ND 170.9 -
3-33 124 192 21 154.3 17.0
3-33 0 113 ND 56550.0 -
3-33 10 157 1 1505.8 12.5
3-33 6 86 15 1385.5 243.5
3-23 70 115 22 163.5 31.0
3-7 71 117 21 164.6 29.6
3-33 82 100 47 122.7 57.1
3-7 124 161 41 130.0 33.5
유사한 실험으로, VELOCIMMUNE® 마우스를 여러 상이한 항원으로 면역시키고, 항원 특이적 사람 항체의 선택된 중쇄를 상이한 재배열된 사람 생식선 경쇄와 짝을 이루는 능력에 대해 시험하였다(상술된 것과 같음). 이 실험에 사용된 항원은 콜레스테롤 항상성에 포함된 효소(항원 A), 글루코스 항상성 조절에 포함된 혈청 호르몬(항원 B), 혈관형성을 촉진하는 성장인자(항원 C) 및 세포-표면 수용체(항원 D)를 포함하였다. 항원 특이적 항체를 각각의 면역화 그룹으로부터 분리하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클론하고 서열화하였다. 중쇄 및 경쇄 서열로부터 V 유전자 용법을 측정하였고, 선택한 중쇄를 그것들의 동족 경쇄 또는 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 영역과 짝을 이루었다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍을 CHO-K1 세포에 공동-형질전환하고, 상층액 중의 항체의 존재를 ELISA 분석으로 항-사람 IgG에 의해 검출하였다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍에 대해 항체 역가(㎍/ml)를 측정하고, 상이한 재배열된 사람 생식선 경쇄의 역가를 원래의 항체 분자(즉 동족의 경쇄와 짝을 이룬 중쇄)로 얻어진 역가와 비교하였으며, 원래 역가의 %를 계산하였다(표 2). Vκ: κ 경쇄 가변 유전자. ND: 현재의 실험 조건 하에서는 발현이 검출되지 않음.
항원 항체 VH Vκ 역가 (㎍/ml) 원래 역가의
%
VH 단독 VH + Vκ VH +
Vκ1-39Jκ5
A 320 1-18 2-30 0.3 3.1 2.0 66
321 2-5 2-28 0.4 0.4 1.9 448
334 2-5 2-28 0.4 2.7 2.0 73
313 3-13 3-15 0.5 0.7 4.5 670
316 3-23 4-1 0.3 0.2 4.1 2174
315 3-30 4-1 0.3 0.2 3.2 1327
318 4-59 1-17 0.3 4.6 4.0 86
B 257 3-13 1-5 0.4 3.1 3.2 104
283 3-13 1-5 0.4 5.4 3.7 69
637 3-13 1-5 0.4 4.3 3.0 70
638 3-13 1-5 0.4 4.1 3.3 82
624 3-23 1-17 0.3 5.0 3.9 79
284 3-30 1-17 0.3 4.6 3.4 75
653 3-33 1-17 0.3 4.3 0.3 7
268 4-34 1-27 0.3 5.5 3.8 69
633 4-34 1-27 0.6 6.9 3.0 44
C 730 3-7 1-5 0.3 1.1 2.8 249
728 3-7 1-5 0.3 2.0 3.2 157
691 3-9 3-20 0.3 2.8 3.1 109
749 3-33 3-15 0.3 3.8 2.3 62
750 3-33 1-16 0.3 3.0 2.8 92
724 3-33 1-17 0.3 2.3 3.4 151
706 3-33 1-16 0.3 3.6 3.0 84
744 1-18 1-12 0.4 5.1 3.0 59
696 3-11 1-16 0.4 3.0 2.9 97
685 3-13 3-20 0.3 0.5 3.4 734
732 3-15 1-17 0.3 4.5 3.2 72
694 3-15 1-5 0.4 5.2 2.9 55
743 3-23 1-12 0.3 3.2 0.3 10
742 3-23 2-28 0.4 4.2 3.1 74
693 3-23 1-12 0.5 4.2 4.0 94
D 136 3-23 2-28 0.4 5.0 2.7 55
155 3-30 1-16 0.4 1.0 2.2 221
163 3-30 1-16 0.3 0.6 3.0 506
171 3-30 1-16 0.3 1.0 2.8 295
145 3-43 1-5 0.4 4.4 2.9 65
49 3-48 3-11 0.3 1.7 2.6 155
51 3-48 1-39 0.1 1.9 0.1 4
159 3-7 6-21 0.4 3.9 3.6 92
169 3-7 6-21 0.3 1.3 3.1 235
134 3-9 1-5 0.4 5.0 2.9 58
141 4-31 1-33 2.4 4.2 2.6 63
142 4-31 1-33 0.4 4.2 2.8 67
이들 실험으로부터 얻어진 결과는 상이한 유전자 패밀리로부터의 체세포성 돌연변이된, 고친화성 중쇄가 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 영역과 짝을 이룰 수 있고, 정상적인 항체 분자로서 세포로부터 분비될 수 있다는 것을 증명한다. 상기 표 1에서 알 수 있는 것과 같이, 항체 역가는 원래의 항체의 동족 경쇄와 비교하여 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄와 짝을 이룰 때 약 61%(69개 중 42개)의 중쇄에 대해, 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 경쇄와 짝을 이룰 때 약 29%(69개 중 20개)의 중쇄에 대해 증가하였다. 약 20%(69개 중 14개)의 중쇄에 대해서는 둘 다의 재배열된 사람 생식선 경쇄가 원래의 항체의 동족 경쇄와 비교하여 발현에 증가를 부여하였다. 상기 표 2에서 알 수 있는 것과 같이, 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 영역은 원래의 항체의 동족 경쇄와 비교하여 광범위한 항원의 상이한 부류에 특이적인 여러 중쇄의 발현의 증가를 부여하였다. 항체 역가는 원래의 항체의 동족 경쇄에 비교하여 중쇄의 약 35%(43개 중 15개)에 대해 2-배 이상 증가하였다. 두 개의 중쇄(315 및 316)에 대해, 증가의 폭은 원래의 항체에 비교하여 10-배 이상 컸다. 원래의 항체의 동족 경쇄에 비교하여 발현의 증가를 나타내는 모든 중쇄 내에서, 제 3 패밀리(VH3) 중쇄가 다른 중쇄 가변 영역 유전자 패밀리에 비교하여 과잉으로 나타났다. 이것은 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 경쇄와 짝을 이루는 사람 VH3 중쇄의 바람직한 관계를 증명한다.
실시예 2
재배열된 사람 생식선 경쇄 유전자좌의 생성
다양한 재배열된 사람 생식선 경쇄 표적화 벡터를 VELOCIGENE® 기술(미국 특허 번호 6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659)을 사용하여 만들어서, 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 302g12 및 254m04(Invitrogen)를 변형시켰다. 이들 두 개의 BAC 클론을 사용하여, 게놈 구성물을 단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 함유하도록 공학처리하고, 앞서 내인성 κ 가변 및 연결용 유전자 절편을 결실하도록 변형시켜 놓은 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 삽입하였다.
재배열된 사람 생식선 경쇄 표적화 벡터의 구성. 세 개의 상이한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 해당 기술분야에서 인지된 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 만들었다. 이들 세 개의 영역을 구성하기 위해 사용된 사람 가변 유전자 절편은 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열, 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열 및 재배열된 사람 VpreBJλ5 서열을 포함하였다.
마우스 Vκ3-7 유전자의 엑손 1(리더 펩티드를 코드화함) 및 인트론 1을 함유하고 있는 DNA 절편을 드노보 DNA 합성(통합된 DNA 기술)에 의해 만들었다. 자연 발생적인 BlpI 제한 효소에 이르기까지의 5' 미번역 영역의 부분이 포함되었다. 사람 Vκ1-39 및 Vκ3-20의 엑손을 사람 게놈 BAC 라이브러리로부터 PCR 증폭시켰다. 전방 프라이머는 마우스 Vκ3-7 유전자의 인트론 1의 스플라이스 억셉터(acceptor) 부위를 함유하는 5' 연장부를 포함하였다. 사람 Vκ1-39 서열의 PCR을 위해 사용한 역 프라이머는 사람 Jκ5를 코드화하는 연장을 포함한 반면, 사람 Vκ3-20 서열의 PCR을 위해 사용한 역 프라이머는 사람 Jκ1을 코드화하는 연장을 포함하였다. 사람 VpreBJλ5 서열을 드노보 DNA 합성(통합된 DNA 기술)에 의하여 만들었다. 스플라이스 공여 부위를 포함하고 있는 사람 Jκ-Cκ 인트론 부분을 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI로부터 PCR 증폭시켰다. 전방 PCR 프라이머는 사람 Jκ5, Jκ1 또는 Jλ5 서열 중 어느 하나의 부분을 코드화하는 연장을 포함하였다. 역 프라이머는 PI-SceI 부위를 포함하였는데, 그것은 앞서 인트론 안에 공학처리되었다.
마우스 Vκ3-7 엑손 1/인트론 1, 사람 가변 경쇄 엑손 및 사람 Jκ-Cκ 인트론 단편을 중첩 연장 PCR에 의해 함께 연결시키고, BlpI 및 PI-SceI로 소화시킨 후, 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI에 결찰시켰는데, 그것은 사람 Vκ3-15 가변 유전자 절편으로부터의 프로모터를 함유하였다. 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI 내에 있는 록스트(loxed) 하이그로마이신 카세트를 양옆에 NotI과 AscI 부위가 있는 FRTed 하이그로마이신 카세트로 대체하였다. 이 플라스미드의 NotI/PI-SceI 단편을 마우스 Jκ-Cκ 인트론 부분, 마우스 Cκ 엑손 및 마우스 κ 유전자좌의 하류에 있는 약 75kb의 게놈 서열을 함유하고 있고, 마우스 ES 세포에서 동종 재조합을 위한 3' 상동성 아암을 제공하는 변형된 마우스 BAC 254m04에 결찰시켰다. 그런 다음 이 BAC의 NotI/AscI 단편을 FRTed 네오마이신 카세트 및 마우스 ES 세포에서의 동종 재조합을 위하여 내인성 κ 유전자좌의 상류에 약 23kb의 게놈 서열을 함유하고 있는 변형된 마우스 BAC 302g12에 결찰시켰다.
재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 표적화 벡터(도 1). 제한 효소 부위를 표적화 벡터 안으로의 클로닝을 위해 공학처리된 경쇄 삽입물의 5' 및 3' 단부에 도입하였다: 5' 단부에 AscI 부위 및 3' 단부에 PI-SceI 부위. 5' AscI 부위 및 3' PI-SceI 부위 내에서 표적화 구성물은 5' 에서 3' 방향으로 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻은 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌에 대해 5' 서열을 함유하고 있는 5' 상동성 아암, FRTed 네오마이신 내성 유전자, 사람 Vκ3-15 프로모터를 포함하고 있는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 절편의 리더 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 절편의 인트론 서열, 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 영역의 오픈 리딩 프레임, 사람 Jκ-Cκ 인트론의 부분을 함유하고 있는 게놈 서열 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻은 내인성 마우스 Jκ5 유전자 절편의 서열 3'을 함유하고 있는 3' 상동성 아암을 포함하였다(도 1, 중간). 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌의 상류 및 대부분의 3' Jκ 유전자 절편의 하류에 있는 유전자 및/또는 서열(예컨대 내인성 3' 인핸서)을 표적화 구성물에 의해 변형시키지 않았다(도 1 참조). 공학처리된 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자좌의 서열을 SEQ ID NO:1에 표시한다.
재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 영역의 BAC DNA 안으로의 표적화된 삽입을 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역 내부의 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 확인하였다. 간단히 설명하면, 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 대해 3'에 있는 인트론 서열을 프라이머 ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO:2) 및 ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO:3)을 사용하여 확인하였다. 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 영역의 오픈 리딩 프레임은 프라이머 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO:4) 및 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO:5)을 사용하여 확인하였다. 네오마이신 카세트는 프라이머 neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID NO:6) 및 neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO:7)을 사용하여 확인하였다. 그런 다음 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이션하여 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 영역을 발현하는 키메릭 마우스를 제조하기 위해 변형된 ES 세포를 생성하였다.
포지티브 ES 세포 클론을 TAQMANTM 선별 및 내인성 유전자좌 안에 삽입된 공학처리된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하는 염색체 분석에 의해 확인하였다. 간단히 설명하면, 프로브 neoP(TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8)는 네오마이신 마커 유전자 내에서 결합하고, 프로브 ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO:9)는 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 대해 3'인 인트론 서열 내부에서 결합하며, 프로브 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO:10)는 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 오픈 리딩 프레임 내에서 결합한다. 그런 다음 포지티브 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하여 한배 새끼가 생식선 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역을 발현하도록 유발하였다.
또는 다르게, 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역을 포함하는 ES 세포를 FLP를 발현하는 구성물로 형질전환시켜서 표적화 구성물에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하였다. 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 교배함으로써 제거된다(US 6,774,279 참조). 임의로 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 표적화 벡터(도 2). 유사한 형식으로, 재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 영역을 발현하는 공학처리된 경쇄 유전자좌를, 5'에서 3' 방향으로, 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻은 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌에 대해 5' 서열을 함유하고 있는 5' 상동성 아암, FRTed 네오마이신 내성 유전자, 사람 Vκ3-15 프로모터를 포함하고 있는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 절편의 리더 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 절편의 인트론 서열, 재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 영역의 오픈 리딩 프레임, 사람 Jκ-Cκ 인트론의 부분을 함유하고 있는 게놈 서열 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻은 내인성 마우스 Jκ5 유전자 절편의 서열 3'을 함유하고 있는 3' 상동성 아암을 포함하고 있는 표적화 구성물을 사용하여 만들었다(도 2, 중간). 공학처리된 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자좌의 서열을 SEQ ID NO:11에 나타낸다.
재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 영역의 BAC DNA 안으로의 표적화된 삽입을 재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 내부의 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 확인하였다. 간단히 설명하면, 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 대해 3'에 있는 인트론 서열을 프라이머 ULC-m1F(SEQ ID NO:2) 및 ULC-m1R(SEQ ID NO:3)을 사용하여 확인하였다. 재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 영역의 오픈 리딩 프레임은 프라이머 1635-h2F(TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO:12) 및 1635-h2R(AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO:13)을 사용하여 확인하였다. 네오마이신 카세트는 프라이머 neoF(SEQ ID NO:6) 및 neoR(SEQ ID NO:7)을 사용하여 확인하였다. 그런 다음 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이션하여 재배열된 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 경쇄를 발현하는 키메릭 마우스를 제조하기 위해 변형된 ES 세포를 생성하였다.
포지티브 ES 세포 클론을 TAQMANTM 선별 및 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입된 공학처리된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하는 염색체 분석에 의해 확인하였다. 간단히 설명하면, 프로브 neoP(SEQ ID NO:8)는 네오마이신 마커 유전자 내에서 결합하고, 프로브 ULC-m1P(SEQ ID NO:9)는 마우스 Vκ3-7 리더 서열 내에서 결합하며, 프로브 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO:14)는 사람 Vκ3-20Jκ1 오픈 리딩 프레임 내에서 결합한다. 그런 다음 포지티브 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하였다. 한배 새끼는 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 발현하였다.
또는 다르게, 사람 생식선 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 내포하는 ES 세포를 FLP를 발현하는 구성물로 형질전환시켜서 표적화 구성물에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하였다. 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 교배함으로써 제거된다(US 6,774,279 참조). 임의로 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 표적화 벡터(도 3). 유사한 형식으로, 재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 영역을 발현하는 공학처리된 경쇄 유전자좌를, 5'에서 3' 방향으로, 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻은 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌에 대해 5' 서열을 함유하고 있는 5' 상동성 아암, FRTed 네오마이신 내성 유전자, 사람 Vκ3-15 프로모터를 포함하고 있는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 절편의 리더 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 절편의 인트론 서열, 재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 영역의 오픈 리딩 프레임, 사람 Jκ-Cκ 인트론의 부분을 함유하고 있는 게놈 서열 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻은 내인성 마우스 Jκ5 유전자 절편의 서열 3'을 함유하고 있는 3' 상동성 아암을 포함하고 있는 표적화 구성물을 사용하여 만들었다(도 3, 중간). 공학처리된 사람 VpreBJλ5 유전자좌의 서열을 SEQ ID NO:15에 나타낸다.
재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 영역의 BAC DNA 안으로의 표적화된 삽입을 재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 경쇄 영역 내부의 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 확인하였다. 간단히 설명하면, 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 대해 3'에 있는 인트론 서열을 프라이머 ULC-m1F(SEQ ID NO:2) 및 ULC-m1R(SEQ ID NO:3)을 사용하여 확인하였다. 재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 영역의 오픈 리딩 프레임은 프라이머 1616-h1F(TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO:16) 및 1616-h1R(CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO:17)을 사용하여 확인하였다. 네오마이신 카세트는 프라이머 neoF(SEQ ID NO:6) 및 neoR(SEQ ID NO:7)을 사용하여 확인하였다. 그런 다음 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이션하여 재배열된 사람 생식선 VpreBJλ5 경쇄를 발현하는 키메릭 마우스를 제조하기 위해 변형된 ES 세포를 생성하였다.
포지티브 ES 세포 클론을 TAQMANTM 선별 및 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입된 공학처리된 VpreBJλ5 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하는 염색체 분석에 의해 확인하였다. 간단히 설명하면, 프로브 neoP(SEQ ID NO:8)는 네오마이신 마커 유전자 내에서 결합하고, 프로브 ULC-m1P(SEQ ID NO:9)는 마우스 IgVκ3-7 리더 서열 내에서 결합하며, 프로브 1616h1P(ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO:18)는 사람 VpreBJλ5 오픈 리딩 프레임 내에서 결합한다. 그런 다음 포지티브 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하여 한배 새끼가 생식선 경쇄 영역을 발현하도록 하였다.
또는 다르게, 사람 생식선 VpreBJλ5 경쇄 영역을 포함하는 ES 세포를 FLP를 발현하는 구성물로 형질전환시켜서 표적화 구성물에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하였다. 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스에 교배함으로써 제거된다(US 6,774,279 참조). 임의로 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 3
단일한 재배열된 사람 경쇄를 발현하는 마우스의 제조
상기에서 설명된 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의하여 8-세포 단계 마우스 배아 안에 도입하였다(미국 특허 제 7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 공학처리된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역, Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 또는 VpreBJλ5 경쇄 영역을 독립적으로 내포하고 있는 VELOCIMICE®을 독특한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역의 존재를 검출하는 대립형질 분석(Valenzuela et al., 상기 동일)을 변형시켜 사용하는 유전형 분석에 의해 확인한다.
새끼들의 유전형을 분석하고, 독특한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역에 대해 이형접합성이거나 동형접합성인 새끼를 선택하여 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역의 발현을 특성확인한다.
유동 세포 분석. 공통 경쇄 마우스의 정상적인 항체 레퍼토리에서 재배열된 사람 경쇄 영역의 발현을, 공통 경쇄 마우스의 비장 세포 및 말초혈에서의 면역글로불린 κ 및 λ 발현을 분석함으로써 확인하였다. 표준 방법을 사용하여 야생형(n=5), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 이형접합체(n=3), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 동형접합체(n=3), Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 이형접합체(n=2) 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 동형접합체(n=2) 마우스의 수득된 비장 및 말초혈로부터의 세포 현탁액을 만든 다음, 형광표지된 항체(BD Pharmigen)를 사용하여 CD19+, Igλ+ 및 Igκ+로 염색하였다.
간단히 설명하면, 1×106의 세포를 항-마우스 CD16/CD32(클론 2.4G2, BD Pharmigen)로, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 다음의 항체 칵테일로 30분 동안 얼음 상에서 표지화하였다: APC 포합된 항-마우스 CD19(클론 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 포합된 항-마우스 CD3(클론 17A2, BioLegend), FITC 포합된 항-마우스 Igκ(클론 187.1, BD Pharmigen), PE 포합된 항-마우스 Igλ(클론 RML-42, BioLegend). 염색 후에 세포를 세척하고 2% 폼알데하이드에 고정하였다. 데이터 획득은 LSRII 유동 세포분석기 상에서 수행하고, FlowJo로 분석하였다. 게이팅(Gating): 총 B 세포(CD19+CD3-), Igκ+ B 세포(Igκ+Igλ-CD19+CD3-), Igλ+ B 세포(Igκ-Igλ+CD19+CD3-). 혈액과 비장세포 샘플로부터 모아진 데이터는 유사한 결과를 증명하였다. 아래의 표 3은 Igλ+, Igκ+ 또는 Igλ+Igκ+인 각 그룹으로부터의 대표적인 한 마우스의 말초혈로부터의 포지티브 CD19+ B 세포의 %를 나타낸다. 야생형(WT) 및 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 중 어느 하나에 대해 동형접합성인 마우스로부터의 말초혈 중의 CD19+ B 세포의 %를 도 4에 나타낸다.
마우스 CD19+ B 세포
Igλ+ Igκ+ Igλ+Igκ+
야생형 4.8 93 0.53
Vκ1-39Jκ5 1.4 93 2.6
Vκ3-20Jκ1 4.2 88 6
공통 경쇄 발현. 각각의 공통 경쇄(Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1)의 발현을 이형접합성 및 동형접합성 마우스에서 정량적 PCR 분석(예컨대 TAQMANTM)을 사용하여 분석하였다.
간단히 설명하면, CD19+ B 세포를 야생형, 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 유전자좌의 해당하는 사람 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 유전자좌(Hκ)로의 대체에 대해 동형접합성인 마우스, 및 각각의 재배열된 사람 경쇄 영역(Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1)에 대해 동형접합성인 마우스 및 이형접합성인 마우스로부터, 마우스 CD19 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조업체의 명세서에 따라 정제하였다. 총 RNA를 CD19+ B 세포로부터 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 제조업체의 명세에 따라 정제하고, 게놈 RNA를 RNase-유리 DNase 온-칼럼 처리(Qiagen)를 사용하여 제거하였다. 200ng의 mRNA를 First Strand cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사하고, 그 결과의 cDNA를 Taqman Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 증폭시켰다. 모든 반응을 (1) 두 개의 공통 경쇄애 대한 Vκ-Jκ 접합, (2) Vκ 유전자 단독(즉 Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 (3) 마우스 Cκ 영역을 스패닝하는 프라이머와 Taqman MGB 프로브를 사용하여 ABI 7900 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 아래의 표 4는 이 분석에 대해 사용한 프라이머와 프로브의 서열을 나타낸다. 상대적인 발현을 마우스 Cκ 영역의 발현에 대해 정상화하였다. 그 결과를 도 5a, 도 5b 및 도 5c에 나타낸다.
영역 프라이머/프로브 설명 (5'-3') SEQ ID NO:
Vκ1-39Jκ5 접합 (센스) AGCAGTCTGC AACCTGAAGA TTT
(안티-센스) GTTTAATCTC CAGTCGTGTC CCTT
(프로브) CCTCCGATCA CCTTC		 19
20
21
Vκ1-39 (센스) AAACCAGGGA AAGCCCCTAA
(안티-센스) ATGGGACCCC ACTTTGCA
(프로브) CTCCTGATCT ATGCTGCAT		 22
23
24
Vκ3-20Jκ1 접합 (센스) CAGCAGACTG GAGCCTGAAG A
(안티-센스) TGATTTCCAC CTTGGTCCCT T
(프로브) TAGCTCACCT TGGACGTT		 25
26
27
Vκ3-20 (센스) CTCCTCATCT ATGGTGCATC CA
(안티-센스) GACCCACTGC CACTGAACCT
(프로브) CCACTGGCAT CCC		 28
29
30
마우스 Cκ (센스) TGAGCAGCAC CCTCACGTT
(안티-센스) GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTT
(프로브) ACCAAGGACG AGTATGAA		 31
32
33
항원 특이적 공통 경쇄 항체. 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌에 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄중 어느 하나를 내포하고 있는 공통 경쇄 마우스를 β-갈락토시다제로 면역시키고 항체 역가를 측정하였다.
간단히 설명하면, β-갈락토시다제(Sigma)를 제조업체의 지시대로 타이터맥스 보조제(Sigma)에 유화시켰다. 야생형(n=7), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 동형접합체(n=2) 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 동형접합체(n=5)를 100㎍의 β-갈락토시다제/타이터맥스로 피하 주사함으로써 면역시켰다. 마우스들을 3주 간격으로 2회, 50㎍의 β-갈락토시다제/타이터맥스로 피하 주사함으로써 추가면역시켰다. 두 번째 추가면역 후에 혈액을 마취된 마우스로부터 제조업체의 지시대로 혈청 분리기 튜브(BD Biosciences) 안으로 후안와 출혈을 사용하여 수집하였다. 항-β-갈락토시다제 IgM 또는 IgG 항체를 측정하기 위하여, ELISA 플레이트(Nunc)를 1㎍/mL의 β-갈락토시다제로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 과잉 항원을 세척하여 제거한 후에 1% BSA가 첨가된 PBS로 한 시간 동안 실온에서 차단하였다. 연속적으로 희석한 혈청을 그 플레이트에 첨가하고 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 HRP 포합된 항-IgM(Southern Biotech) 또는 항-IgG(Southern Biotech)와 함께 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 한 번 세척한 후에 TMB 기질(BD Biosciences)로 전개시켰다. 반응을 1N 황산으로 중단시키고 OD450을 Victor X5 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 판독하였다. 데이터를 GraphPad Prism으로 분석하고, 신호를 바탕값 이상으로 2배인 혈청의 희석률로서 계산하였다. 그 결과를 도 6a와 도 6b에 도시한다.
이 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 마우스의 비장 및 말초 구획 둘 다에서 κ/λ B 세포의 비율은 거의 야생형 패턴을 입증하였다(표 3 및 도 4). 그러나 VpreBJλ5 공통 경쇄 마우스는 더 적은 수의 말초 B 세포를 입증하였는데, 그것의 약 1 내지 2%는 공학처리된 사람 경쇄 영역을 발현한다(데이터는 제시하지 않음). 내인성 κ 경쇄 유전자좌로부터의 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 재배열된 사람 경쇄 영역의 발현 수준은 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 절편이 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로 완전하게 대체되어 있는 내인성 κ 경쇄 유전자좌와 비교하여 상승되었다(도 5a, 도 5b 및 도 5c). VpreBJλ5 재배열된 사람 경쇄 영역의 발현 수준은 이형접합성 및 동형접합성 마우스 둘 다에서 내인성 κ 경쇄 유전자좌로부터의 유사한 고발현을 입증하였다(데이터는 제시하지 않음). 이것은 마우스 λ, κ 또는 둘 다의 내인성 경쇄 유전자좌와 직접 비교할 때 단일 재배열된 사람 VL/JL 서열은 내인성 κ 경쇄 유전자좌로부터의 야생형 발현 수준보다 더 좋게 생산되며, 정상적인 비장 및 혈액 B 세포 빈도를 유발한다. 나아가, 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 서열 중 하나를 가지는 공학처리된 κ 경쇄 유전자좌의 존재는 마우스에 의해 잘 보유되었고, 면역 반응의 체액 성분에 경쇄 레퍼토리의 실질적인 부분을 대표함으로써 야생형 방식으로 기능하는 것으로 나타난다(도 6a 및 도 6b).
실시예 4
단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄를 발현하는 마우스의 교배
이 실시예는 다수의 유전자 변형된 면역글로불린 유전자좌를 은닉하는 다수의 유전자 변형된 마우스 계통을 만들기 위하여 본원에 기술된 공통 경쇄 마우스 중 어떠한 하나와 교배될 수 있는 여러 다른 유전자 변형된 마우스 계통을 설명한다.
내인성 Igλ 녹아웃(KO). 공학처리된 경쇄 유전자좌의 용법을 최적화하기 위하여, 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역 중 하나를 내포하고 있는 마우스를 내인성 λ 경쇄 유전자좌에 결실을 함유하고 있는 다른 마우스와 교배한다. 이런 방식으로, 얻어진 자손은 그것의 유일한 경쇄로서, 실시예 2에서 기술된 것과 같은 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 발현할 것이다. 교배는 해당 기술분야에서 인지된 표준 기법에 의해 수행되거나, 또는 다르게는 상업적인 사육자(예컨대 Jackson Laboratory)에 의해 수행된다. 공학처리된 경쇄 유전자좌 및 내인성 λ 경쇄 유전자좌의 결실을 내포하고 있는 마우스 계통은 독특한 경쇄 영역의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대해 선별된다.
인간화된 내인성 중쇄 유전자좌. 공학처리된 사람 생식선 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스를 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 대체되어 있는 마우스와 교배한다(US 6,596,541 참조; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® 마우스는 내인성 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 사람 중쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 포함함으로써, 항원성 자극에 대한 반응으로 마우스는 사람 중쇄 가변 영역과 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하게 된다. 항체의 중쇄의 가변 영역을 코드화하는 DNA는 분리되고 사람 중쇄 불변 영역을 코드화하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 그런 다음 DNA는 항체의 전체 사람 중쇄를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.
내인성 마우스 VH 유전자좌의 사람 VH 유전자좌로의 대체 및 내인성 κ 경쇄 유전자좌에서 단일한 재배열된 사람 생식선 VL 영역을 내포하고 있는 마우스가 얻어진다. 단일한 사람 경쇄(사람 VL 및 마우스 CL)를 포함하는 체세포성 돌연변이된 중쇄(사람 VH 및 마우스 CH)를 함유하고 있는 역 키메릭 항체가 관심의 항원으로 면역될 때 얻어진다. 항체를 발현하는 B 세포의 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열이 확인되고, 전체 사람 항체는 적당한 발현 시스템에서 사람 CH 및 CL 뉴클레오티드 서열에의 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열의 융합에 의해 만들어진다.
실시예 5
사람 중쇄 및 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 발현하는 마우스로부터의 항체의 생성
공학처리된 사람 경쇄 영역을 함유하는 마우스를 다른 내인성 Ig 유전자좌의 변형 및 결실(실시예 4에서 설명된 것과 같이)을 함유하고 있는 다양한 원하는 계통으로 교배한 후에, 선택된 마우스를 관심의 항원으로 면역시킬 수 있다.
일반적으로, 단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역 중 하나를 함유하고 있는 VELOCIMMUNE® 마우스를 항원으로 도전시키고, 림프 세포(예컨대 B-세포)를 동물의 혈청으로부터 회수한다. 그 림프 세포를 골수종 셀라인과 융합시켜서 불멸의 하이브리도마 셀라인을 제조하고, 그런 하이브리도마 셀라인을 사람 중쇄 가변 및 면역화에 사용된 항원에 특이적인 재배열된 사람 생식선 경쇄를 함유하고 있는 항체를 생성하는 하이브리도마 셀라인을 확인하기 위해 선별하고 선택한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드화하는 DNA를 분리하고 중쇄 및 경쇄의 바람직한 아이소타입 불변 영역에 연결시킨다. 내인성 유전자좌에 존재하는 내인성 마우스 서열과 어떠한 추가의 시스-작용 요소의 존재로 인해, 각 항체의 단일 경쇄는 체세포성 돌연변이될 수 있다. 이것은 추가의 다양성을 단일 경쇄 및 다양한 중쇄 서열을 포함하고 있는 항원-특이적 레퍼토리에 부가한다. 그 결과의 클론된 항체 서열은 계속해서 세포, 예컨대 CHO 세포에서 발현된다. 또는 다르게는, 항원-특이적 키메릭 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 코드화하는 DNA는 항원-특이적 림프구로부터 직접 확인된다.
초기에, 사람 가변 영역과 마우스 불변 영역을 가지는 고친화성 키메릭 항체를 분리한다. 상기에서 기술된 것과 같이, 항체는 특성확인되고 바람직한 특징, 이를테면 친화성, 선택성, 에피토프 등에 대해 선택된다. 마우스 불변 영역을 원하는 사람 불변 영역으로 대체하여 체세포성 돌여변이된 사람 중쇄 및 본 발명의 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역으로부터 유도된 단일 경쇄를 함유하고 있는 전체 사람 항체를 생성한다. 적당한 사람 불변 영역은 예를 들면 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 포함한다.
내인성 마우스 중쇄 유전자좌의 사람 VH, DH 및 JH 유전자 절편으로의 대체 및 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌의 공학처리된 생식선 Vκ1-39Jκ5 사람 경쇄 영역 또는 공학처리된 생식선 Vκ3-20Jκ1 사람 경쇄 영역(상기에서 설명됨) 중 하나로의 대체를 함유하고 있는 VELOCIMMUNE® 마우스의 별도의 집단을 사람 세포-표면 수용체 단백질(항원 E)로 면역시켰다. 항원 E를 마우스의 후방 발바닥 위에 매 3 내지 4일마다 연속적인 6회의 주사로 직접 투여한다. 2 내지 3㎍의 항원 E를 10㎍의 CpG 올리고뉴클레오티드(Cat# tlrl-modn - ODN1826 올리고뉴클레오티드; Invitrogen, San Diego, CA) 및 25㎍의 Adju-Phos(알루미늄 포스페이트 겔 보조제, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)와 주사 전에 혼합한다. 총 6회의 주사를 준 후에, 최종 항원을 리콜한 다음 3 내지 5일 후에 마우스를 희생시킨다. 4회 및 6회 주사 후에 출혈을 수집하고, 항체 면역 반응을 표준 항원-특이적 면역분석에 의해 모니터한다.
원하는 면역 반응이 이루어지면, 비장세포를 수득하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 그것의 생존성을 보존하고 하이브리도마 셀라인을 형성한다. 하이브리도마 셀라인을 선별하고 선택하여 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 생성하는 셀라인을 확인한다. 이 기법을 사용하여 여러 항-항원 E-특이적 공통 경쇄 항체(즉 사람 중쇄 가변 도메인, 동일한 사람 경쇄 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 가지고 있는 항체)를 얻는다.
또는 다르게는, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 U.S. 2007/0280945A1에 기술되어 있는 것과 같이, 직접 항원-포지티브 B 세포로부터 골수종 세포에의 융합 없이 분리한다. 이 방법을 사용하여 여러 전체 사람 항-항원 E 공통 경쇄 항체(즉 사람 중쇄 가변 도메인, 공학처리된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄 또는 공학처리된 사람 Vκ3-20Jκ1 경쇄 중 하나 및 사람 불변 도메인을 가지고 있는 항체)를 얻었다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 생물학적 특성을 아래에서 설명되는 단원에서 상세하게 기술한다.
실시예 6
항원-특이적 공통 경쇄 항체에서 중쇄 유전자 절편 용법
생성된 사람 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 구조를 분석하기 위하여, 중쇄 항체 가변 영역을 코드화하는 핵산을 클론하고 서열화하였다. 항체의 핵산 서열 및 예측된 아미노산 서열로부터, 공학처리된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄 또는 공학처리된 사람 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 중 하나를 함유하고 있는 면역된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 얻어진 선택된 공통 경쇄의 중쇄 가변 영역(HCVR)에 대한 유전자 용법을 확인하였다. 그 결과를 아래의 표 5와 표 6에 나타내는데, 그것은 본 발명에 따르는 마우스가, 사람 κ1-39- 또는 사람 Vκ3-20-유도된 경쇄 단독으로부터 경쇄를 발현하는 마우스를 사용할 때, 다양한 재배열로 인해 다양한 사람 중쇄 유전자 절편으로부터 항원-특이적 공통 경쇄 항체를 생성한다는 것을 증명한다. 2, 3, 4 및 5 패밀리의 사람 VH 유전자 절편이 다양한 사람 DH 절편 및 사람 JH 절편과 재배열되어 항원-특이적 항체를 생성한다.
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 HCVR 항체 HCVR
VH DH JH VH DH JH
2952 2-5 6-6 1 6030 3-30 6-6 5
5978 2-5 6-6 1 6032 3-30 6-6 5
5981 2-5 3-22 1 2985 3-30 6-13 4
6027 3-13 6-6 5 2997 3-30 6-13 4
3022 3-23 3-10 4 3011 3-30 6-13 4
3028 3-23 3-3 4 3047 3-30 6-13 4
5999 3-23 6-6 4 5982 3-30 6-13 4
6009 3-23 2-8 4 6002 3-30 6-13 4
6011 3-23 7-27 4 6003 3-30 6-13 4
5980 3-30 1-1 4 6012 3-30 6-13 4
3014 3-30 1-7 4 6013 3-30 6-13 4
3015 3-30 1-7 4 6014 3-30 6-13 4
3023 3-30 1-7 4 6015 3-30 6-13 4
3024 3-30 1-7 4 6016 3-30 6-13 4
3032 3-30 1-7 4 6017 3-30 6-13 4
6024 3-30 1-7 4 6020 3-30 6-13 4
6025 3-30 1-7 4 6034 3-30 6-13 4
6031 3-30 1-7 4 2948 3-30 7-27 4
6007 3-30 3-3 4 2987 3-30 7-27 4
2982 3-30 3-22 5 2996 3-30 7-27 4
6001 3-30 3-22 5 3005 3-30 7-27 4
6005 3-30 3-22 5 3012 3-30 7-27 4
6035 3-30 5-5 2 3020 3-30 7-27 4
3013 3-30 5-12 4 3021 3-30 7-27 4
3042 3-30 5-12 4 3025 3-30 7-27 4
2955 3-30 6-6 1 3030 3-30 7-27 4
3043 3-30 6-6 3 3036 3-30 7-27 4
3018 3-30 6-6 4 5997 3-30 7-27 4
2949 3-30 6-6 5 6033 3-30 7-27 4
2950 3-30 6-6 5 3004 3-30 7-27 5
2954 3-30 6-6 5 6028 3-30 7-27 6
2978 3-30 6-6 5 3010 4-59 3-16 3
3016 3-30 6-6 5 3019 4-59 3-16 3
3017 3-30 6-6 5 6018 4-59 3-16 3
3033 3-30 6-6 5 6026 4-59 3-16 3
3041 3-30 6-6 5 6029 4-59 3-16 3
5979 3-30 6-6 5 6036 4-59 3-16 3
5998 3-30 6-6 5 6037 4-59 3-16 3
6004 3-30 6-6 5 2964 4-59 3-22 3
6010 3-30 6-6 5 3027 4-59 3-16 4
6019 3-30 6-6 5 3046 5-51 5-5 3
6021 3-30 6-6 5 6000 1-69 6-13 4
6022 3-30 6-6 5 6006 1-69 6-6 5
6023 3-30 6-6 5 6008 1-69 6-13 4
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 HCVR 항체 HCVR
VH DH JH VH DH JH
5989 3-30 3-3 3 5992 4-39 1-26 3
5994 3-33 1-7 4 2975 5-51 6-13 5
5985 3-33 2-15 4 2972 5-51 3-16 6
5987 3-33 2-15 4 5986 5-51 3-16 6
5995 3-33 2-15 4 5993 5-51 3-16 6
2968 4-39 1-26 3 5996 5-51 3-16 6
5988 4-39 1-26 3 5984 3-53 1-1 4
5990 4-39 1-26 3
실시예 7
LUMINEX TM 분석에 의한 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 차단 능력의 측정
항원 E에 대해 발생한 98개의 사람 공통 경쇄 항체를 그것들의 항원 E에 대한 항원 E의 천연 리간드(리간드 Y)의 결합을 차단하는 능력에 대해 비드-기초 분석으로 시험하였다.
항원 E의 세포외재성 도메인(ECD)을 2개의 myc 에피토프 태그와 6X 히스티딘 태그(항원 E-mmH)에 포합시키고, MES 완충액 중의 20㎍/mL 농도의 카복실화된 마이크로스피어에 아민-결합시켰다. 그 혼합물을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 1M 트리스 pH 8.0으로 비드를 탈활성화한 후, PBS중에서 0.05%(v/v)의 트윈-20으로 세척하였다. 그런 다음 비드를 2%(w/v)의 BSA(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하고 있는 PBS(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 차단하였다. 96-웰 필터 플레이트에서 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 함유하고 있는 상층액을 완충액으로 1:15로 희석하였다. 항체 상층액에 대한 것과 동일한 배지 성분을 포함하는 mock 상층액을 함유하고 있는 네거티브 대조표준을 준비하였다. 항원 E-표지된 비드를 그 상층액에 첨가하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 거기에 비오티닐화된 리간드 Y 단백질을 0.06nM의 최종 농도로 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 항원 E-myc-myc-6His표지된 비드에 결합된 비오티닐화된-리간드 Y의 검출을 스트렙트아비딘(Moss Inc., Pasadena, MD)에 포합된 R-파이코에리트린으로 측정한 후, LUMINEXTM 유동 세포분석-기초 분석기에서 측정하였다. 리간드 Y가 없는 샘플의 바탕값 평균 형광 세기(MFI)를 모든 샘플로부터 뺐다. % 차단을, 각 샘플의 바탕값을 뺀 MFI를 조정된 네거티브 대조값으로 나누고, 곱하기 100을 하고 그 결과의 값을 100으로부터 뺌으로써 계산하였다.
유사한 실험으로, 항원 E에 대해 발생한 동일한 98개의 사람 공통 경쇄 항체를 그것들의 리간드 Y-표지된 비드에 대한 항원 E의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다.
간단하게 설명하면, 리간드 Y를 MES 완충액으로 희석된 20㎍/mL 농도의 카복실화된 마이크로스피어에 아민-결합시켰다. 그 혼합물을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 1M 트리스 pH 8로 비드를 탈활성화시키고, PBS에서 0.05%(v/v)의 트윈-20으로 세척하였다. 그런 다음 비드를 2%(w/v)의 BSA(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하고 있는 PBS(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 차단하였다. 96-웰 필터 플레이트에서 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 함유하고 있는 상층액을 완충액으로 1:15로 희석하였다. 항체 상층액에 대한 것과 동일한 배지 성분을 포함하는 mock 상층액을 함유하고 있는 네거티브 대조표준을 준비하였다. 비오티닐화된-항원 E-mmH를 0.42nM의 최종 농도로 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 리간드 Y-표지된 비드를 항체/항원 E 혼합물에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 리간드 Y-비드에 결합된 비오티닐화된-항원 E-mmH의 검출을 스트렙트아비딘(Moss Inc., Pasadena, MD)에 포합된 R-파이코에리트린으로 측정한 후, LUMINEXTM 유동 세포분석-기초 분석기에서 측정하였다. 항원 E가 없는 샘플의 바탕값 평균 형광 세기(MFI)를 모든 샘플로부터 뺐다. % 차단을, 각 샘플의 바탕값을 뺀 MFI를 조정된 네거티브 대조값으로 나누고, 곱하기 100을 하고 그 결과의 값을 100으로부터 뺌으로써 계산하였다.
아래의 표 7 및 표 8은 두 개의 LUMINEXTM 분석에서 시험된 98개의 모든 항-항원 E 공통 경쇄 항체에 대한 % 차단을 나타낸다. ND: 현재의 실험 조건 하에서는 측정되지 않음.
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 항원 E-표지된 비드의 % 차단 용액중의 항원 E의 % 차단
2948 81.1 47.8
2948G 38.6 ND
2949 97.6 78.8
2949G 97.1 73.7
2950 96.2 81.9
2950G 89.8 31.4
2952 96.1 74.3
2952G 93.5 39.9
2954 93.7 70.1
2954G 91.7 30.1
2955 75.8 30.0
2955G 71.8 ND
2964 92.1 31.4
2964G 94.6 43.0
2978 98.0 95.1
2978G 13.9 94.1
2982 92.8 78.5
2982G 41.9 52.4
2985 39.5 31.2
2985G 2.0 5.0
2987 81.7 67.8
2987G 26.6 29.3
2996 87.3 55.3
2996G 95.9 38.4
2997 93.4 70.6
2997G 9.7 7.5
3004 79.0 48.4
3004G 60.3 40.7
3005 97.4 93.5
3005G 77.5 75.6
3010 98.0 82.6
3010G 97.9 81.0
3011 87.4 42.8
3011G 83.5 41.7
3012 91.0 60.8
3012G 52.4 16.8
3013 80.3 65.8
3013G 17.5 15.4
3014 63.4 20.7
3014G 74.4 28.5
3015 89.1 55.7
3015G 58.8 17.3
3016 97.1 81.6
3016G 93.1 66.4
3017 94.8 70.2
3017G 87.9 40.8
3018 85.4 54.0
3018G 26.1 12.7
3019 99.3 92.4
3019G 99.3 88.1
3020 96.7 90.3
3020G 85.2 41.5
3021 74.5 26.1
3021G 81.1 27.4
3022 65.2 17.6
3022G 67.2 9.1
3023 71.4 28.5
3023G 73.8 29.7
3024 73.9 32.6
3024G 89.0 10.0
3025 70.7 15.6
3025G 76.7 24.3
3027 96.2 61.6
3027G 98.6 75.3
3028 92.4 29.0
3028G 87.3 28.8
3030 6.0 10.6
3030G 41.3 14.2
3032 76.5 31.4
3032G 17.7 11.0
3033 98.2 86.1
3033G 93.6 64.0
3036 74.7 32.7
3036G 90.1 51.2
3041 95.3 75.9
3041G 92.4 51.6
3042 88.1 73.3
3042G 60.9 25.2
3043 90.8 65.8
3043G 92.8 60.3
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 항원 E-표지된 항체의
% 차단		 용액중의 항원 E의 % 차단
2968 97.1 73.3
2968G 67.1 14.6
2969 51.7 20.3
2969G 37.2 16.5
2970 92.2 34.2
2970G 92.7 27.2
2971 23.4 11.6
2971G 18.8 18.9
2972 67.1 38.8
2972G 64.5 39.2
2973 77.7 27.0
2973G 51.1 20.7
2974 57.8 12.4
2974G 69.9 17.6
2975 49.4 18.2
2975G 32.0 19.5
2976 1.0 1.0
2976G 50.4 20.4
상기 기술된 첫 번째 LUMINEXTM 실험에서, Vκ1-39Jκ5 공학처리된 경쇄를 함유하고 있는 80개의 공통 경쇄를 그것들의 항원 E-표지된 비드에 대한 리간드 Y 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 이들 80개의 공통 경쇄 항체 중에서, 68개가 50%보다 큰 차단을 입증한 반면, 12개는 50%보다 작은 차단을 입증하였다(6개는 25 내지 50%의 차단이었고, 6개는 25%보다 작은 차단을 보임). Vκ3-20Jκ1 공학처리된 경쇄를 함유하고 있는 18개의 공통 경쇄 항체에 대해서는 12개가 항원 E-표지된 비드에 대한 리간드 Y 결합의 50%보다 큰 차단을 보인 반면, 6개는 50%보다 작은 차단을 보였다(3개는 25 내지 50%의 차단이었고, 3개는 25%보다 작은 차단을 보임).
상기에서 기술된 두 번째 LUMINEXTM 실험에서, Vκ1-39Jκ5 공학처리된 경쇄를 함유하고 있는 80개의 공통 경쇄를 그것들의 리간드 Y-표지된 비드에 대한 항원 E의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 이들 80개의 공통 경쇄 항체 중에서, 36개가 50%보다 큰 차단을 입증한 반면, 44개는 50%보다 작은 차단을 입증하였다(27개는 25 내지 50%의 차단이었고, 17개는 25%보다 작은 차단을 보임). Vκ3-20Jκ1 공학처리된 경쇄를 함유하고 있는 18개의 공통 경쇄 항체에 대해서는 1개가 리간드 Y-표지된 비드에 대한 항원 E 결합의 50%보다 큰 차단을 보인 반면, 17개는 50%보다 작은 차단을 보였다(5개는 25 내지 50%의 차단이었고, 12개는 25%보다 작은 차단을 보임).
표 7 및 표 8의 데이터는 표 5 및 표 6에 기술된 재배열이, 리간드 Y의 그것의 동족 수용체 항원 E에 대한 결합을 다양한 정도의 효능으로 차단하는 항-항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 유발하였음을 보여주는데, 그것은 항원 E와 관련하여 중복하는 및 비-중복하는 에피토프 특이성을 가지는 항체를 포함하는 표 5와 표 6의 항-항원 E 공통 경쇄 항체와 일치한다.
실시예 8
ELISA에 의한 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 차단 능력의 측정
항원 E에 대하여 발생한 사람 공통 경쇄 항체를 ELISA 분석으로 리간드 Y-코팅된 표면에 대한 항원 E 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다.
리간드 Y를 96-웰 플레이트 상에서 PBS중에 희석된 2㎍/mL 농도로 코팅하고, 밤새 인큐베이션한 후, 0.05% 트윈-20이 첨가된 PBS로 4회 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 0.5%(w/v)의 BSA(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하고 있는 PBS(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 차단하였다. 별도의 플레이트에서, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하고 있는 상층액을 완충액으로 1:10으로 희석하였다. 항체의 동일 성분을 포함하는 mock 상층액을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다. 항원 E-mmH(상기에서 기술됨)를 0.150nM의 최종 농도로 첨가하고, 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 항체/항원 E-mmH 혼합물을 리간드 Y를 함유하고 있는 플레이트에 첨가하고 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 리간드 Y에 결합된 항원 E-mmH의 검출을 항-Penta-His 항체(Qiagen, Valencia, CA)에 포합된 서양고추냉이 과산화효소(HRP)를 사용하여 측정하고, 황산에 의해 중화된 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(BD Biosciences, San Jose, CA)을 사용하여 표준 비색 반응에 의해 전개시켰다. 흡광도는 OD450에서 0.1초 동안 판독하였다. 항원 E가 없는 샘플의 바탕 흡광도를 모든 샘플로부터 뺐다. % 차단을, 각 샘플의 바탕값을 뺀 MFI를 조정된 네거티브 대조값으로 나누고, 곱하기 100을 하고 그 결과의 값을 100으로부터 뺌으로써 계산하였다.
아래의 표 9 및 표 10은 ELISA 분석으로 시험한 98개의 모든 항-항원 E 공통 경쇄 항체에 대한 % 차단을 나타낸다. ND: 현재의 실험 조건 하에서는 측정되지 않음.
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 용액 중의 항원 E의
% 차단		 항체 용액 중의 항원 E의
% 차단
2948 21.8 3015 23.7
2948G 22.9 3015G 10.2
2949 79.5 3016 78.1
2949G 71.5 3016G 37.4
2950 80.4 3017 61.6
2950G 30.9 3017G 25.2
2952 66.9 3018 40.6
2952G 47.3 3018G 14.5
2954 55.9 3019 94.6
2954G 44.7 3019G 92.3
2955 12.1 3020 80.8
2955G 25.6 3020G ND
2964 34.8 3021 7.6
2964G 47.7 3021G 20.7
2978 90.0 3022 2.4
2978G 90.2 3022G 15.0
2982 59.0 3023 9.1
2982G 20.4 3023G 19.2
2985 10.5 3024 7.5
2985G ND 3024G 15.2
2987 31.4 3025 ND
2987G ND 3025G 13.9
2996 29.3 3027 61.4
2996G ND 3027G 82.7
2997 48.7 3028 40.3
2997G ND 3028G 12.3
3004 16.7 3030 ND
3004G 3.5 3030G 9.5
3005 87.2 3032 ND
3005G 54.3 3032G 13.1
3010 74.5 3033 77.1
3010G 84.6 3033G 32.9
3011 19.4 3036 17.6
3011G ND 3036G 24.6
3012 45.0 3041 59.3
3012G 12.6 3041G 30.7
3013 39.0 3042 39.9
3013G 9.6 3042G 16.1
3014 5.2 3043 57.4
3014G 17.1 3043G 46.1
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 용액 중의 항원 E의
% 차단		 항체 용액 중의 항원 E의
% 차단
2968 68.9 2972G 35.7
2968G 15.2 2973 20.7
2969 10.1 2973G 23.1
2969G 23.6 2974 ND
2970 34.3 2974G 22.0
2970G 41.3 2975 8.7
2971 6.3 2975G 19.2
2971G 27.1 2976 4.6
2972 9.6 2976G 26.7
이 실시예에서 기술된 것과 같이, 리간드 Y-코팅된 표면에 대한 항원 E 결합을 차단하는 능력에 대해 시험된 Vκ1-39Jκ5 공학처리된 경쇄를 함유하고 있는 80개의 공통 경쇄 항체 중에서, 22개가 50%보다 큰 차단을 나타낸 반면, 58개는 50%보다 작은 차단을 나타냈다(20개는 25 내지 50%의 차단이었고, 38개는 25%보다 작은 차단을 보임). Vκ3-20Jκ1 공학처리된 경쇄를 함유하고 있는 18개의 공통 경쇄 항체에 대해서는 1개가 리간드 Y-코팅된 표면에 대한 항원 E 결합의 50%보다 큰 차단을 보인 반면, 17개는 50%보다 작은 차단을 보였다(5개는 25 내지 50%의 차단이었고, 12개는 25%보다 작은 차단을 보임).
이들 결과는 또한 항원 E와 관련하여 중복하는 및 비-중복하는 에피토프 특이성을 가지는 항체를 포함하는 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체 푸울과 일치한다.
실시예 9
항원-특이적 공통 경쇄 항체에 대한 BIACORE TM 친화성 측정
선택된 항체 상층액에 대한 평형 해리 상수(KD)를 BIACORETM T100 기기(GE Healthcare)를 사용하여 SPR(표면 플라스몬 공명)에 의하여 측정하였다. 모든 데이터를 HBS-EP(10mM의 Hepes, 150mM의 NaCl, 0.3mM의 EDTA, 0.05%의 계면활성제 P20, pH 7.4)를 작동 및 샘플 완충액으로서 사용하여 25℃에서 얻었다. 항체를 앞서 표준 아민 결합 화학을 사용하여 고밀도의 항-사람 Fc로 유도된(derivatized) CM5 센서 칩 표면 상에서 미정제 상층액 샘플로부터 포획하였다. 포획 단계 중에, 상층액을 항-사람 Fc 표면을 가로질러 3μL/분의 유속으로 총 3분 동안 주입하였다. 포획 단계 후에 100nM의 농도로 2분 동안 35μL/분의 유속으로 작동 완충액 또는 분석물 중 하나를 주입하였다. 포획된 항체로부터 항원의 해리를 6분 동안 모니터하였다. 포획된 항체를 10mM의 글리신, pH 1.5를 간단하게 주입함으로써 제거하였다. 모든 센서그램을 분석물 센서그램으로부터 완충액 주입으로부터의 센서그램을 뺌으로써 이중 기준화하였고, 그로써 포획 표면으로부터 항체의 해리에 의해 유발된 인공물을 제거하였다. 각각의 항체에 대한 결합 데이터를 BIAcore T100 평가 소프트웨어 v2.1을 사용하여 질량 수송으로 1:1 결합 모델로 맞추었다. 그 결과를 아래의 표 11과 표 12에 나타낸다.
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 100 nM 항원 E 항체 100 nM 항원 E
KD (nM) T1/2 (분) KD (nM) T1/2 (분)
2948 8.83 28 3015 29.1 11
2948G 95.0 1 3015G 65.9 0
2949 3.57 18 3016 4.99 17
2949G 6.37 9 3016G 18.9 4
2950 4.91 17 3017 9.83 8
2950G 13.6 5 3017G 55.4 2
2952 6.25 7 3018 11.3 36
2952G 7.16 4 3018G 32.5 3
2954 2.37 24 3019 1.54 59
2954G 5.30 9 3019G 2.29 42
2955 14.4 6 3020 5.41 39
2955G 12.0 4 3020G 41.9 6
2964 14.8 6 3021 50.1 6
2964G 13.0 9 3021G 26.8 4
2978 1.91 49 3022 25.7 17
2978G 1.80 58 3022G 20.8 12
2982 6.41 19 3023 263 9
2982G 16.3 9 3023G 103 5
2985 64.4 9 3024 58.8 7
2985G 2.44 8 3024G 7.09 10
2987 21.0 11 3025 35.2 6
2987G 37.6 4 3025G 42.5 8
2996 10.8 9 3027 7.15 6
2996G 24.0 2 3027G 4.24 18
2997 7.75 19 3028 6.89 37
2997G 151 1 3028G 7.23 22
3004 46.5 14 3030 46.2 7
3004G 1.93 91 3030G 128 3
3005 2.35 108 3032 53.2 9
3005G 6.96 27 3032G 13.0 1
3010 4.13 26 3033 4.61 17
3010G 2.10 49 3033G 12.0 5
3011 59.1 5 3036 284 12
3011G 41.7 5 3036G 18.2 10
3012 9.71 20 3041 6.90 12
3012G 89.9 2 3041G 22.9 2
3013 20.2 20 3042 9.46 34
3013G 13.2 4 3042G 85.5 3
3014 213 4 3043 9.26 29
3014G 36.8 3 3043G 13.1 22
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 100 nM 항원 E 항체 100 nM 항원 E
KD (nM) T1/2 (분) KD (nM) T1/2 (분)
2968 5.50 8 2973 5.35 39
2968G 305 0 2973G 11.0 44
2969 34.9 2 2974 256 0
2969G 181 1 2974G 138 0
2970G 12.3 3 2975 38.0 2
2971G 32.8 22 2975G 134 1
2972 6.02 13 2976 6.73 10
2972G 74.6 26 2976G 656 8
상기 표 5와 표 6에 나타낸 재배열을 포함하는 공통 경쇄 항체의 결합 친화성은 달라지는데, 거의 모든 것이 나노몰 범위의 KD를 나타낸다. 친화성 데이터는 고친화성, 클론적으로 선택되고, 체세포성 돌연변이되는 점에서 표 5 및 표 6에 기술된 재배열된 가변 도메인의 조합적인 결합으로부터 유발되는 공통 경쇄 항체와 일치한다. 앞서 제시된 데이터와 함께, 표 5와 표 6에 기술된 공통 경쇄 항체는 항원 E 상의 하나 또는 그 이상의 에피토프에 대한 특이성을 나타내는 다양한 고친화성 항체의 집단을 포함한다.
실시예 10
LUMINEX TM 분석에 의한 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 결합 특이성의 측정
선택된 항-항원 E 공통 경쇄 항체를, 그것의 아미노산 잔기의 대략 10%가 사람 단백질과 상이한 게잡이 원숭이 오르솔로그(Mf 항원 E); ECD의 C-말단 단부로부터 마지막 10개의 아미노산이 결핍된 항원 E의 결실 돌연변이(항원 E-△CT); 및 리간드 Y와 상호작용하는 것으로 추정되는 위치에서 알라닌 치환을 함유하고 있는 두 개의 돌연변이(항원 E-Ala1 및 항원 E-Ala2)를 포함하여 항원 E의 ECD 및 항원 E ECD 변이체에 대한 그것의 결합 능력에 대해 시험하였다. 항원 E 단백질은 CHO 세포에서 생성하였고, 각각은 myc-myc-His C-말단 태그를 함유하였다.
결합 연구를 위해 1mL의 배양 배지로부터 항원 E ECD 단백질 또는 변이체 단백질(상기에서 설명됨)을 2시간 동안 실온에서 myc 단클론성 항체(MAb 9E10, 하이브리도마 셀라인 CRL-1729TM; ATCC, Manassas, VA)로 공유적으로 코팅된 1×106의 마이크로스피어(LUMINEXTM) 비드와 함께 인큐베인션함으로써 포획하였다. 그런 다음 비드를 사용 전에 PBS로 세척하였다. 항-항원 E 공통 경쇄를 함유하고 있는 상층액을 완충액으로 1:4로 희석하고 96-웰 필터 플레이트에 첨가하였다. 항체가 없는 mock 상층액을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다. 그런 다음 포획된 항원 E 단백질을 함유하고 있는 비드를 항체 샘플(웰단 3000 비드)에 첨가하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 샘플 비드를 세척하고 결합된 공통 경쇄 항체를 R-파이코에리트린-포합된 항-사람 IgG 항체를 사용하여 검출하였다. 비드의 형광 세기(각각의 항원 E 단백질에 결합하는 각각의 항체 샘플에 대해 대략 100개의 비드를 계수함)를 LUMINEXTM 유동 세포분석-기초 분석기를 사용하여 측정하고, 비드/항체 상호작용 에 대해 적어도 100개의 계수된 비드에 대해 중간 형광 세기(MFI)를 기록하였다. 그 결과를 아래의 표 13 및 표 14에 나타낸다.
Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 항체
항체 평균 형광 세기 (MFI)
항원 E-ECD 항원 E-△CT 항원 E-Ala1 항원 E-Ala2 Mf 항원 E
2948 1503 2746 4953 3579 1648
2948G 537 662 2581 2150 863
2949 3706 4345 8169 5678 5142
2949G 3403 3318 7918 5826 5514
2950 3296 4292 7756 5171 4749
2950G 2521 2408 7532 5079 3455
2952 3384 1619 1269 168 911
2952G 3358 1001 108 55 244
2954 2808 3815 7114 5039 3396
2954G 2643 2711 7620 5406 3499
2955 1310 2472 4738 3765 1637
2955G 1324 1802 4910 3755 1623
2964 5108 1125 4185 346 44
2964G 4999 729 4646 534 91
2978 6986 2800 14542 10674 8049
2978G 5464 3295 11652 8026 6452
2982 4955 2388 13200 9490 6772
2982G 3222 2013 8672 6509 4949
2985 1358 832 4986 3892 1669
2985G 43 43 128 244 116
2987 3117 1674 7646 5944 2546
2987G 3068 1537 9202 6004 4744
2996 4666 1917 12875 9046 6459
2996G 2752 1736 8742 6150 4873
2997 5164 2159 12167 8361 5922
2997G 658 356 3392 2325 1020
3004 2794 1397 8542 6268 3083
3004G 2753 1508 8267 5808 4345
3005 5683 2221 12900 9864 5868
3005G 4344 2732 10669 7125 5880
3010 4829 1617 2642 3887 44
3010G 3685 1097 2540 3022 51
3011 2859 2015 7855 5513 3863
3011G 2005 1072 6194 4041 3181
3012 3233 2221 8543 5637 3307
3012G 968 378 3115 2261 1198
3013 2343 1791 6715 4810 2528
3013G 327 144 1333 1225 370
3014 1225 1089 5436 3621 1718
3014G 1585 851 5178 3705 2411
3015 3202 2068 8262 5554 3796
3015G 1243 531 4246 2643 1611
3016 4220 2543 8920 5999 5666
3016G 2519 1277 6344 4288 4091
3017 3545 2553 8700 5547 5098
3017G 1972 1081 5763 3825 3038
3018 2339 1971 6140 4515 2293
3018G 254 118 978 1020 345
3019 5235 1882 7108 4249 54
3019G 4090 1270 4769 3474 214
3020 3883 3107 8591 6602 4420
3020G 2165 1209 6489 4295 2912
3021 1961 1472 6872 4641 2742
3021G 2091 1005 6430 3988 2935
3022 2418 793 7523 2679 36
3022G 2189 831 6182 3051 132
3023 1692 1411 5788 3898 2054
3023G 1770 825 5702 3677 2648
3024 1819 1467 6179 4557 2450
3024G 100 87 268 433 131
3025 1853 1233 6413 4337 2581
3025G 1782 791 5773 3871 2717
3027 4131 1018 582 2510 22
3027G 3492 814 1933 2596 42
3028 4361 2545 9884 5639 975
3028G 2835 1398 7124 3885 597
3030 463 277 1266 1130 391
3030G 943 302 3420 2570 1186
3032 2083 1496 6594 4402 2405
3032G 295 106 814 902 292
3033 4409 2774 8971 6331 5825
3033G 2499 1234 6745 4174 4210
3036 1755 1362 6137 4041 1987
3036G 2313 1073 6387 4243 3173
3041 3674 2655 8629 5837 4082
3041G 2519 1265 6468 4274 3320
3042 2653 2137 7277 5124 3325
3042G 1117 463 4205 2762 1519
3043 3036 2128 7607 5532 3366
3043G 2293 1319 6573 4403 3228
Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 항체
항체 평균 형광 세기 (MFI)
항원 E-ECD 항원 E-△CT 항원 E-Ala1 항원 E-Ala2 Mf 항원 E
2968 6559 3454 14662 3388 29
2968G 2149 375 9109 129 22
2969 2014 1857 7509 5671 3021
2969G 1347 610 6133 4942 2513
2970 5518 1324 14214 607 32
2970G 4683 599 12321 506 31
2971 501 490 2506 2017 754
2971G 578 265 2457 2062 724
2972 2164 2158 8408 6409 3166
2972G 1730 992 6364 4602 2146
2973 3527 1148 3967 44 84
2973G 1294 276 1603 28 44
2974 1766 722 8821 241 19
2974G 2036 228 8172 135 26
2975 1990 1476 8669 6134 2468
2975G 890 315 4194 3987 1376
2976 147 140 996 1079 181
2976G 1365 460 6024 3929 1625
항-항원 E 공통 경쇄 항체 상층액은 항원 E-ECD에 결합된 비드에 매우 특이적인 결합을 나타냈다. 이들 비드에 대해, 네거티브 대조 mock 상층액은 항원 E-ECD 비드 샘플과 결합할 때 무시할만한 신호(<10 MFI)를 유발한 반면, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하고 있는 상층액은 강력한 결합 신호(98개의 항체 상층액에 대해 2627의 평균 MFI; 91/98 항체 샘플에 대해 MFI>500)를 나타냈다.
선택된 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 항원 E의 ECD 상의 상이한 에피토프를 확인하는 능력의 척도로서, 변이체에 대한 항체의 상대적인 결합을 측정하였다. 4개의 모든 항원 E 변이체를 천연 항원 E-ECD 결합 연구에 대해 상기에서 기술된 것과 같이 항-myc LUMINEXTM 비드에 포획시키고, 상대적인 결합 비율(MFI변이체/MFI항원 E-ECD)을 측정하였다. 표 12 및 표 13에 나타낸 98개의 시험된 공통 경쇄 항체 상층액에 대해, 평균 비율(MFI변이체/MFI항원 E-ECD)은 각 변이체에 대해 달랐고, 그것은 비드 상의 단백질의 상이한 포획량을 반영하는 것 같다(항원 E-△CT, 항원 E-Ala1, 항원 E-Ala2 및 Mf 항원 E에 대해서 각각 0.61, 2.9, 2.0 및 1.0의 평균 비율). 각 단백질 변이체에 대해, 98개의 시험된 공통 경쇄 항체의 하위세트에 대한 결합은 매우 감소된 결합을 보였고, 그것은 주어진 변이체를 특징짓는 돌연변이에 대한 민감성을 가리킨다. 예를 들어 공통 경쇄 항체 샘플 중 19개가 Mf 항원 E에 <8%의 MFI변이체/MFI항원 E-ECD로 결합하였다. 이 그룹의 많은 것이 높거나 적당히 높은 친화성 항체를 포함하기 때문에(5개의 KD는 <5nM, 15개의 KD는 <50nM), 이 그룹의 더 낮은 신호는 더 낮은 친화성보다는 천연 항원 E-ECD와 주어진 변이체 사이의 서열(에피토프) 차이에 대한 민감성으로부터 유발되는 것 같다.
이들 데이터는 표 5와 표 6에 기술된 공통 경쇄 항체가 항원 E 상의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인지하는 항원-E-특이적 공통 경쇄 항체의 다양한 그룹을 나타낸다는 것을 수립한다.
실시예 11
공통 경쇄 항체의 경쇄 셔플링
선택된 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 중쇄를 생식선 Vκ1-39Jκ5 또는 생식선 Vκ3-20Jκ1 공학처리된 경쇄 중 하나로 중쇄를 보수한 후에(실시예 1에서 설명한 것과 같이) 항원 E에 대한 결합에 대해 시험하였다.
간단히 설명하면, 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체(Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1)의 247개의 중쇄를 생식선 Vκ1-39 또는 생식선 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 중 하나로 형질전환하고, LUMINEXTM 분석에 의해(실시예 7 및 실시예 10에서 설명한 것과 같이) 항원 E에의 결합에 대해 재선별하였다. 항원 E에의 결합을 BIACORETM에 의해(실시예 9에서 설명한 것과 같이) 확인하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다.
이 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, 항원 E에 대한 28개의 공통 경쇄 항체는 경쇄의 생식선 형태로 보수될 때 항원 E에 결합할 수 있었다.
원래의 경쇄 보수된 경쇄 시험된 수 확인된 결합제 수
1-39 1-39 198 23
3-20 3-20 49 5
실시예 12
공통 경쇄 항체에서 중쇄 유전자 용법 및 체세포성 과돌연변이 빈도
VELOCIMMUNE® 마우스(예컨대 US 6,596,541 및 U 7,105,348 참조)에서 발생한 항체의 중쇄 및 경쇄 서열(>6000)은 항체 사슬의 중쇄 유전자 절편 용법 및 체세포성 과돌연변이 빈도를 비교하기 위하여 공학처리된 경쇄 마우스(상기에서 기술됨)를 사용한 다중-항원 면역화 도식에 의해 얻어진 공통 경쇄 항체의 중쇄 및 경쇄 서열(>600)을 따랐다.
중쇄 유전자 용법. 내인성 마우스 중쇄 유전자좌의 사람 VH, DH 및 JH 유전자 절편으로의 대체 및 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌의 공학처리된 생식선 Vκ1-39Jκ5 사람 경쇄 영역 또는 공학처리된 생식선 Vκ3-20Jκ1 사람 경쇄 영역(실시예 2에서 기술됨) 중 어느 하나로의 대체를 함유하고 있고, 사람 세포-표면 수용체(항원 E)로 면역된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 얻어진 중쇄 및 경쇄 서열, 두 개의 사람 세포-표면 당단백질(항원 E)의 이종이량체, 사람 사이토킨 수용체(항원 G) 및 사람 종양 분화 항원(항원 H)을 중쇄 유전자 절편 용법에 대해 분석하고, VH 및 JH 유전자 절편을 기록하였다. 그 결과를 표 16 내지 표 18에 나타낸다. 표 16 내지 표 18에서 백분율은 회기 값을 나타내고 어떤 경우에는 함께 첨가될 때 100%가 아닐 수 있다.
표 16은 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체(VI), 동족의 Vκ1-39 경쇄를 가지는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체(VI-Vκ1-39), Vκ1-39 공학처리된 경쇄 마우스로부터의 항체(Vκ1-39), 동족의 Vκ3-20 경쇄를 가지는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체(VI-Vκ3-20) 및 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 마우스로부터의 항체(Vκ3-20)에 대한 % 중쇄 패밀리 용법을 나타낸다. 표 17은 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체(VI), 동족의 Vκ1-39 경쇄를 가지는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체(VI-Vκ1-39), Vκ1-39 공학처리된 경쇄 마우스로부터의 항체(Vκ1-39), 동족의 Vκ3-20 경쇄를 가지는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체(VI-Vκ3-20) 및 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 마우스로부터의 항체(Vκ3-20)에 대한 % VH 및 JH 유전자 용법을 나타낸다. 표 18은 각 면역화 그룹(항원 E, F, G 및 H)으로부터의 Vκ1-39 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ1-39 마우스)로부터의 항체에 대한 % VH 유전자 용법 및 선택된 면역화 그룹(항원 E 및 G)으로부터의 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ3-20 마우스)로부터의 항체에 대한 % VH 유전자 용법을 나타낸다.
이 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, Vκ1-39Jκ5 공학처리된 경쇄 마우스에서 시험된 항원에 대한 중쇄 유전자 용법은 VH 패밀리 III 하위그룹(VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33 및 VH3-48)의 우세함을 특징으로 한다. 다른 VH 패밀리 하위그룹의 주지할만한 용법은 VH1-18, VH1-69, VH2-5, VH4-59 및 VH6-1의 용법을 특징으로 하였다. Vκ3-20Jκ1 공학처리된 경쇄 마우스에서 시험된 항원에 대해, 중쇄 유전자 용법은 VH 패밀리 III, VH 패밀리 IV 및 VH 패밀리 V 하위그룹(VH3-11, VH3-30, VH3-33, VH4-39, VH4-59 및 VH5-51)의 우세함을 특징으로 하였다. 다른 VH 패밀리 하위그룹의 주지할만한 용법은 VH1-18, VH1-69, VH2-70 및VH6-1의 용법을 특징으로 하였다.
체세포성 과돌연변이 빈도. VELOCIMMUNE® 마우스 및 공학처리된 경쇄 마우스(상기에서 기술됨)에서 발생된 항체로부터의 중쇄 및 경쇄를 각각의 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 증명된 중쇄 및 경쇄 유전자 용법에 따라 생식선 서열에 일렬배열하였다. 각 서열의 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 각각의 프레임워크 영역(FW) 및 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 아미노산 변화를 계산하였다. 그 결과를 표 19 내지 표 22에 나타낸다. 표 19 내지 표 22에서 백분율은 회기 값을 나타내고, 어떤 경우에는 함께 첨가될 때 100%가 아닐 수 있다.
표 19는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체의 중쇄, Vκ1-39 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ1-39 마우스)로부터의 항체의 중쇄 및 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ3-20 마우스)로부터의 항체의 중쇄의 각각의 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산(AA) 변화의 수를 나타낸다. 표 20은 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체의 경쇄, Vκ1-39 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ1-39 마우스)로부터의 항체의 경쇄 및 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ3-20 마우스)로부터의 항체의 경쇄의 각각의 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산(AA) 변화의 수를 나타낸다. 표 21은 선택된 면역화 그룹(항원 E, F 및 H)에 대한 Vκ1-39 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ1-39 마우스)로부터의 항체의 중쇄의 각각의 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산(AA) 변화의 수를 나타낸다. 표 22는 선택된 면역화 그룹(항원 E 및 G)에 대한 Vκ3-20 공학처리된 경쇄 마우스(Vκ3-20 마우스)로부터의 항체의 중쇄의 각각의 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산(AA) 변화의 수를 나타낸다.
VH 패밀리 VI VI-Vκ1-39 Vκ1-39 VI-Vκ3-20 Vκ3-20
1 9.0 14.8 3.3 7.1 4.9
2 2.2 1.8 4.6 0 1.6
3 77.8 69.8 77.3 61.4 29.5
4 8.4 8.3 11.2 27.1 39.3
5 0.9 0 0.7 4.3 23.0
6 1.7 5.3 3.0 0 1.6
VH 유전자 VI VI-Vκ1-39 Vκ1-39 VI-Vκ3-20 Vκ3-20
1-2 3.9 8.3 0 2.9 0
1-3 0 0 0 0 0
1-8 1.3 0.6 0 1.4 0
1-18 3.0 0.6 1.3 2.1 1.6
1-24 0.4 3.6 0 0.7 0
1-46 0.1 0 0 0 0
1-58 0 0 0 0 0
1-69 0.3 1.8 2.0 0 3.3
2-5 1.9 0 4.6 0 0
2-26 0.2 1.8 0.0 0 0
2-70 0.1 0 0 0 1.6
3-7 3.0 14.8 0 1.4 0
3-9 8.5 3.6 29.6 16.4 0
3-11 5.4 10.7 0 7.1 1.6
3-13 3.2 1.8 0.7 2.1 0
3-15 4.0 4.7 0.3 0.7 0
3-20 1.0 0.6 0.3 5.0 0
3-21 0.8 0.6 0 2.1 0
3-23 20.4 8.9 3.3 8.6 0
3-30 17.6 4.1 35.2 12.9 1.6
3-33 12.6 14.8 0 5.0 26.2
3-43 0.2 0.6 0 0 0
3-48 0.8 1.2 7.2 0 0
3-53 0.3 3.6 0.3 0 0
3-64 0 0 0.3 0 0
3-72 0 0 0 0 0
3-73 0 0 0 0 0
4-31 2.7 0 0.7 8.6 0
4-34 1.8 0.6 0.3 14.3 0
4-39 1.6 0.6 3.0 2.1 14.8
4-59 2.3 7.1 7.2 2.1 24.6
5-51 0.9 0 0.7 4.3 23.0
6-1 1.7 5.3 3.0 0 1.6
JH 유전자 VI VI-Vκ1-39 Vκ1-39 VI-Vκ3-20 Vκ3-20
1 1.5 1.2 7.1 0 0
2 4.5 2.4 0.7 5.0 26.9
3 10.5 16.6 13.1 13.6 26.9
4 44.0 34.3 32.3 50.7 9.6
5 9.6 10.1 16.8 7.9 1.9
6 29.7 35.5 30.0 22.9 34.6
VH 유전자 Vκ1-39 마우스 Vκ3-20 마우스
항원 E 항원 F 항원 G 항원 H 항원 E 항원 G
1-2 0 0 0 0 0 0
1-3 0 0 0 0 0 0
1-8 0 0 0 0 0 0
1-18 0 0 0 8.3 0 3.1
1-24 0 0 0 0 0 0
1-46 0 0 0 0 0 0
1-58 0 0 0 0 0 0
1-69 2.9 0 25.0 0 0 6.3
2-5 8.2 0 0 0 0 0
2-26 0 0 0 0 0 0
2-70 0 0 0 0 0 3.1
3-7 0 0 0 0 0 0
3-9 1.2 98.8 0 14.6 0 0
3-11 0 0 0 0 0 3.1
3-13 0.6 0 25.0 0 0 0
3-15 0 1.2 0 0 0 0
3-20 0 0 25.0 0 0 0
3-21 0 0 0 0 0 0
3-23 4.1 0 25.0 4.2 0 0
3-30 62.9 0 0 0 3.4 0
3-33 0 0 0 0 13.8 37.5
3-43 0 0 0 0 0 0
3-48 0.6 0 0 43.8 0 0
3-53 1.6 0 0 0 0 0
3-64 1.6 0 0 0 0 0
3-72 0 0 0 0 0 0
3-73 0 0 0 0 0 0
4-31 0 0 0 4.2 0 0
4-34 0 0 0 2.1 0 0
4-39 5.3 0 0 0 31.0 0
4-59 11.8 0 0 4.2 3.4 43.8
5-51 1.2 0 0 0 48.3 0
6-1 0 0 0 18.8 0 3.1
# AA 변화 VELCOIMMUNE® 마우스로부터의 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 63 32 36 26 12 82
1 23 32 41 31 22 17
2 9 25 17 23 27 1
3 4 10 5 16 13 0
4 0 1 1 3 12 0
>5 1 0 0 1 14 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스로부터의 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 65 8 34 30 9 37
1 25 26 35 34 19 54
2 9 44 23 20 33 9
3 1 19 8 12 22 0
4 0 3 0 5 11 0
>5 1 0 0 0 7 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스로부터의 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 57 8 54 16 8 93
1 41 43 34 39 21 7
2 2 25 10 18 20 0
3 0 15 2 21 13 0
4 0 10 0 3 20 0
>5 0 0 0 2 18 0
# AA 변화 VELCOIMMUNE® 마우스로부터의 항체의 경쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 65 24 49 60 33 23
1 24 20 34 31 27 38
2 9 27 16 9 18 28
3 1 20 1 0 14 7
4 0 7 0 0 4 3
>5 1 1 0 0 3 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스로부터의 항체의 경쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 91 75 80 90 71 63
1 9 19 17 10 21 27
2 0 5 1 1 5 8
3 0 0 1 0 2 1
4 0 0 0 0 2 1
>5 0 0 0 0 0 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스로부터의 항체의 경쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 90 47 93 97 63 57
1 10 27 3 3 20 43
2 0 27 3 0 17 0
3 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
>5 0 0 0 0 0 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스로부터의 항-항원 E 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 75 8 49 41 14 36
1 21 25 33 35 25 52
2 4 43 14κ 18 28 12
3 0 20 4 5 16 0
4 0 5 0 1 12 0
>5 1 0 0 0 5 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스로부터의 항-항원 F 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 52 0 6 6 2 15
1 35 24 32 35 15 78
2 11 59 46 22 49 7
3 0 17 16 24 29 0
4 0 0 0 12 4 0
>5 1 0 0 0 1 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스로부터의 항-항원 H 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 54 21 29 33 4 77
1 17 35 50 27 6 23
2 23 21 15 21 25 0
3 6 21 4 15 27 0
4 0 2 2 2 15 0
>5 0 0 0 2 23 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스로부터의 항-항원 E 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 79 17 62 24 17 90
1 21 28 34 55 31 10
2 0 28 3 21 24 0
3 0 14 0 0 10 0
4 0 14 0 0 3 0
>5 0 0 0 0 14 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스로부터의 항-항원 G 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 38 0 47 9 0 97
1 59 56 34 25 13 3
2 3 22 16 16 16 0
3 0 16 3 41 16 0
4 0 6 0 6 34 0
>5 0 0 0 3 22 0
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Common Light Chain Mouse <130> 802C-WO <140> To be assigned <141> Filed herewith <150> 13/412,936 <151> 2012-03-06 <160> 33 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tgacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 2400 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 2460 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 2520 ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 2580 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 2640 acccctccga tcaccttcgg ccaagggaca cgactggaga ttaaacgtaa gtaatttttc 2700 actattgtct tctgaaattt gggtctgatg gccagtattg acttttagag gcttaaatag 2760 gagtttggta aagattggta aatgagggca tttaagattt gccatgggtt gcaaaagtta 2820 aactcagctt caaaaatgga tttggagaaa aaaagattaa attgctctaa actgaatgac 2880 acaaagtaaa aaaaaaaagt gtaactaaaa aggaaccctt gtatttctaa ggagcaaaag 2940 taaatttatt tttgttcact cttgccaaat attgtattgg ttgttgctga ttatgcatga 3000 tacagaaaag tggaaaaata cattttttag tctttctccc ttttgtttga taaattattt 3060 tgtcagacaa caataaaaat caatagcacg ccctaagatc tagatgcatg ctcgagtgcc 3120 atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagat 3155 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 aggtgagggt acagataagt gttatgag 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tgacaaatgc cctaattata gtgatca 27 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gggcaagtca gagcattagc a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 tgcaaactgg atgcagcata g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 ggtggagagg ctattcggc 19 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gaacacggcg gcatcag 17 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 tgggcacaac agacaatcgg ctg 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 ccattatgat gctccatgcc tctctgttc 29 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 atcagcagaa accagggaaa gcccct 26 <210> 11 <211> 3166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400 ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460 gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520 atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580 cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640 agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700 agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760 ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820 tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880 aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940 aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000 attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060 ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120 gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 tccaggcacc ctgtctttg 19 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 aagtagctgc tgctaacact ctgact 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 aaagagccac cctctcctgc aggg 24 <210> 15 <211> 3187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 ctcctgatct atgctgcat 19 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 cagcagactg gagcctgaag a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 tgatttccac cttggtccct t 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 27 tagctcacct tggacgtt 18 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 28 ctcctcatct atggtgcatc ca 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 29 gacccactgc cactgaacct 20 <210> 30 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 ccactggcat ccc 13 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 tgagcagcac cctcacgtt 19 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 gtggcctcac aggtatagct gtt 23 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 accaaggacg agtatgaa 18

Claims (28)

  1. 항원으로의 도전에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는 마우스로서, 그 항원-특이적 항체의 집단의 모든 면역글로불린 경쇄는 동일한 단일 사람 경쇄 가변(VL) 유전자 절편으로부터 유도된 사람 VL 영역을 포함하고, 면역글로불린 중쇄는 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택된 사람 중쇄 가변(VH) 유전자 절편으로부터 유도된 사람 VH 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  2. 제 1항에 있어서, 동일한 단일 사람 VL 유전자 절편은 사람 Vκ1-39 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 마우스.
  3. 제 1항에 있어서, 동일한 단일 사람 VL 유전자 절편은 사람 Vκ3-20 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 마우스.
  4. 제 1항에 있어서, 모든 면역글로불린 경쇄는 사람 경쇄 J(JL) 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 마우스.
  5. 제 4항에 있어서, 사람 JL 유전자 절편은 사람 Jκ1 및 Jκ5 유전자 절편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  6. 제 1항에 있어서, 마우스는 마우스 면역글로불린 VL 유전자 절편, 마우스 면역글로불린 JL 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택되는 서열이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
  7. 제 1항에 있어서, 사람 VL 영역은 사람, 마우스 또는 쥐 면역글로불린 경쇄 불변(CL) 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  8. 제 1항에 있어서, 사람 VL 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  9. 제 1항에 있어서, 사람 VH 영역은 사람, 마우스 또는 쥐 면역글로불린 중쇄 불변(CH) 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  10. 제 1항에 있어서, 사람 VH 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  11. 항원으로의 도전에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는 마우스로서, 그 항원-특이적 항체의 집단의 모든 면역글로불린 경쇄는 사람 Vκ1-39 유전자 절편으로부터 유도된 사람 VL 영역을 포함하고, 면역글로불린 중쇄는 VH1-18, VH1-69, VH2-5, VH3-9, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택된 사람 중쇄 가변(VH) 유전자 절편으로부터 유도된 사람 VH 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  12. 제 11항에 있어서, 사람 VL 영역은 Jκ5 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  13. 제 11항에 있어서, 마우스는 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 절편이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
  14. 제 11항에 있어서, 사람 VL 영역은 사람, 쥐 또는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변(CL) 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  15. 제 11항에 있어서, 사람 VL 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  16. 제 11항에 있어서, 사람 VH 영역은 사람 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 및 JH6 유전자 절편으로부터 선택된 사람 JH 영역을 코드화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  17. 제 11항에 있어서, 사람 VH 영역은 사람, 쥐 또는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변(CH) 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  18. 제 11항에 있어서, 사람 VH 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 발현되는 마우스.
  19. 항원으로의 도전에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는 마우스로서, 그 항원-특이적 항체의 집단의 모든 면역글로불린 경쇄는 사람 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된 사람 VL 영역을 포함하고, 면역글로불린 중쇄는 VH1-18, VH1-69, VH2-70, VH3-11, VH3-30, VH3-33, VH3-53, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택된 사람 중쇄 가변(VH) 유전자 절편으로부터 유도된 사람 VH 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  20. 제 19항에 있어서, 사람 VL 영역은 Jκ5 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  21. 제 19항에 있어서, 마우스는 마우스 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 절편이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
  22. 제 19항에 있어서, 사람 VL 영역은 사람, 쥐 또는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변(CL) 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  23. 제 19항에 있어서, 사람 VL 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  24. 제 19항에 있어서, 사람 VH 영역은 사람 JH2, JH3, JH4, JH5 및 JH6 유전자 절편으로부터 선택된 사람 JH 영역을 코드화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  25. 제 19항에 있어서, 사람 VH 영역은 사람, 쥐 또는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변(CH) 영역에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  26. 제 19항에 있어서, 사람 VH 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  27. 유전자 변형된 마우스의 제조 방법으로서, 그 방법은 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에 있는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편을 사람 VH 유전자 절편으로 대체하는 것으로 이루어지고, 이때 마우스는 모든 마우스 경쇄 유전자 절편을 대체하는 하나 또는 두 개의 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열을 포함하도록 유전자 변형되며; 사람 중쇄 가변 유전자 절편은 마우스 불변 유전자에 연결되고; 재배열된 사람 경쇄 서열은 사람 또는 마우스 불변 유전자에 연결되며; 사람 VH 유전자 절편은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH6-1 및 그것들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 두 개의 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 유전자 절편은 재배열된 Vκ1-39/J, 재배열된 Vκ3-20/J 및 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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