KR20180038554A - 공통 경쇄를 갖는 항체 생산을 위한 유전자도입 동물 - Google Patents
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Abstract
본 개시는, 특히, 유전자도입 동물 및 공통 경쇄를 갖는 항체를 제조하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 유전자도입 동물은 공통 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 포함할 수 있고, 여기서 상기 공통 경쇄 도입유전자는 비-면역글로불린 경쇄 프로모터 및 공통 경쇄 코딩 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 공통 경쇄는 구성적으로 발현된다.
Description
상호 참조
본원은 2015년 8월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/210,926호의 이점을 청구하고, 이 출원은 본원에 참고로 포함된다.
고전적인 항체는 각각이 공통 경쇄를 갖는 이종이량체를 형성하는 두 개의 동일한 중쇄로 구성되어 있다. 대조적으로, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 가질 수 있고, 각 쌍은 상이한 항원에 결합할 것이다. 2개의 상이한 경쇄와 2개의 상이한 중쇄의 무작위 결합은 구성 요소 쇄의 다수의 조합의 혼합물을 생성한다. 전형적으로, 조합 중 단지 적은 분획만이 각각 표적 항원을 인식하는 기능적 항체를 생산할 것이다. 두 항원을 결합시키는 능력은 인자 VIII을 모방하고(Sampei et al., PLoS One. 2013, 8(2):e57479), T 세포를 종양 세포에 표적화하고(Frankel and Baeuerle, Curr. Opin. Chem. Biol. 2013, 17(3):385-392), 혈액-뇌 관문을 가로 지르는 치료제를 샤페닝함(Bien-Ly et al., J. Exp. Med. 2014, 211(2):233-244)으로써 응고성 캐스케이드의 구성 요소를 동시-국부화하는데 사용되었다.
이중 특이적 항체의 잠재적인 결합 수를 제한함으로써 일관된 생성물을 제조하기 위한 많은 접근법이 문헌(참조: Spiess et al., Mol. Immunol. 2015, 67(2 Pt A):95-106)에 기재되어 있다. 다른 접근법에서, 상이한 경쇄로 이량체화되는 공통 중쇄가 생성되었다(Fischer et a., Nat. Communications. 2015, 6:6113). 다른 접근법에서, 상이한 중쇄로 이량체화되는 공통 경쇄가 생성되었다(미국 특허원 제2014/0314755호 및 제2011/0195454호).
항체는 항원 상의 에피토프를 인식하고, 각 항원 내에 유한 수의 에피토프가 존재한다. 실제로, 드러날 수 있는 에피토프의 수는 항원의 공급원과 항원이 도입된 동물 사이의 진화 거리에 의해 제한된다. 전형적으로, 목적이 치료제의 생성인 경우, 항원의 공급원은 인간이고, 전형적으로, 항원이 도입되는 뮤린이다. 진화 거리는 인간-뮤린 관계(약 9천 5백만년 전에 분리된 뮤린 및 인간 계통)보다 진화론적으로 서로 더 멀리 떨어져 있는 동물을 사용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 진화 거리는 약 3억년 전 인간과 공통 조상을 최종 공유한 닭을 면역화함으로써 증가될 수 있다. 면역화된 닭으로부터 유래된 항체의 약 30%가 뮤린 하이브리도마의 패널의 구성원에 의해 나타나지 않는 에피토프에 지시된다는 것을 나타내었다.
닭 항체는 독특한 에피토프를 인식하기 때문에 유용하지만, 그들은 치료제로서의 사용에 고려되는 경우 외래 단백질이다. 닭 항체가 인간 불변(C) 영역 상에서 그래프팅되어 치료제 효능의 손실을 유도하더라도, 환자는 항-닭 가변(V) 영역 항체를 생성할 것이다. 이 문제는 생성되는 유전자도입 닭이 인간 항체를 생성하도록 내인성 닭 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 V 유전자를 인간 등가물로서 대체함으로써 해결될 수 있다.
본 개시의 특정 국면은 사전 배열된 가변 영역을 갖는 공통 경쇄를 생성하는 유전자도입 동물 및 이중특이적 항체의 생산을 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 국면에서, 유전자도입 동물은 유전자도입 조류, 예를 들면, 닭이다.
본 개시는, 다른 것들 중에서, 공통 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 유전자도입 동물로서, 상기 공통 경쇄 도입유전자가 비-면역글로불린 경쇄 프로모터 및 공통 경쇄 코딩 서열을 포함하는, 유전자도입 동물을 제공한다. 특정 구현예에서, 공통 경쇄는 구성적으로 발현된다.
특정 구현예에서, 유전자도입 동물은 a) 재조합효소 도입유전자로서, 상기 재조합효소 도입유전자가 내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터에 작동적으로 연결된 재조합효소 코딩 서열을 포함하는, 재조합효소 도입유전자; 및 b) i. 비-면역글로불린 경쇄 프로모터; ii. 공통 경쇄 코딩 서열 및 iii. 개재 서열이 재조합효소에 의해 절제되지 않는 한, 경쇄가 발현되는 것을 방지하는 개재 서열을 포함하는 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 포함한다.
이중 특이적 항체를 생성하기 위해, 경쇄가 항체 분자의 두 분지에 공통적인 경우, 결합 특이성이 중쇄에 의해서만 결정되는 것이 유리하다. 경쇄는 전체 항체 분자의 조립을 위한 적절한 구조를 제공하지만, 항원 결합을 위한 수동적 파트너이다. 따라서, 이중특이성의 발현은 단지 두 개의 중쇄 및 하나의 공통 경쇄를 필요로 하기 때문에 단순화된다.
일반적으로, 경쇄 유전자는 다양한 서열의 레퍼토리를 생성하기 위해 B 세포 발달 동안 돌연변이 과정을 거치고, 항원 결합을 정제하고 개선시키기 위한 면역 반응 동안 추가의 다양화 및 선택을 거친다. 경쇄 접근법은 경쇄가 B 세포에서 변하지 않고 유지되도록 임의의 모든 돌연변이를 피하는 것을 목적으로 한다. 다양성의 원동력 중의 하나는 다양한 V 영역 중의 하나가 V-J 접합부에서 변동을 생성하는 부정확한 과정에서 다양한 J 영역 중의 하나와 배합하여 중요한 CDR3 루프를 형성하는 유전자 재배열 과정이다. 공통 경쇄 접근법은 이 단계를 우회하고, 모든 B 세포에서 동일한 서열을 갖는 사전 재배열된 가변 영역을 발현시킨다. 닭의 다양성의 제2 주요 공급원은 기능적 V에 서열을 기부하는 상류 유사유전자에 의한 유전자 전환으로부터 기인한다. 임의의 상류 유사유전자 없이 어떤 유전자 전환도 발생할 수 없다.
B 세포에서 항체 다양화의 메커니즘이 면역글로불린 유전자좌 중의 유전자에 주로 한정되기 때문에, 돌연변이를 거치지 않은 공통 경쇄를 갖는 유전자도입 동물, 예를 들면, 닭을 제조하기 위한 하나의 접근법은 비-면역글로불린 조절 요소의 전사 조절하에(도 1) 게놈 중의 다른 유전자좌에 경쇄를 삽입하는 것이다. B-세포 특이적 발현은 단지 B-세포에서 재조합효소 매개된 재조합시 활성화되는 조건부 이식 유전자를 사용하여 달성된다. 단지 B-세포에서 재조합효소 매개된 재조합을 달성하기 위해, 재조합효소 발현은 경쇄 유전자좌에 재조합효소 유전자를 삽입함으로써 B 세포 특이적이게 한다. 조기 B 세포 발달에서 경쇄 조절 요소에 의한 재조합효소 발현의 유도시, 재조합효소 활성은 공통 경쇄의 발현을 차단하는 정지 서열을 루프 아웃화한다(loop-out). 재조합효소 유전자는 잠재적으로 그것이 경쇄 유전자좌에 위치하기 때문에 그의 활성을 손상시키는 돌연변이로 고통받을 수 있지만, 활성 재조합효소는 상당한 비활성화 돌연변이 전에 루프 아웃을 수행하기에 충분히 조기에 생성된다. 루프 아웃이 발생하면, 재조합효소는 더 이상 필요하지 않다. 사실, 계속된 고수준의 재조합효소 발현은 B 세포 기능에 잠재적으로 유해한 영향을 줄 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 자기 불활성화 재조합효소 도입유전자, 예를 들면, 재조합효소 (Cre) 유전자의 측면에 위치하는 재조합 부위(예: loxP 부위)를 함유하는 것이 바람직하다. 재조합효소 유전자는 안정하고, 생식세포에 존재하고, 이는, 경쇄 조절 요소가 생식세포에서 재조합효소의 발현을 구동하지 않기 때문에, 생식세포 전달 및 도입유전자를 수반하는 완전 유전자도입 닭을 확립하는데 중요하다. B-세포 계통에서, 재조합효소 활성이 유도되어 공통 경쇄의 활성화 및 동시에 재조합효소 유전자의 결실을 유도한다.
잠재적으로 간단한 접근법은 사전 재배열된 V 영역을 경쇄 유전자좌에 삽입하고, 모든 유사유전자 상류를 제거하여 유전자 전환 가능성을 제거하는 것일 수 있다. 그러나, 이 접근법은 경쇄의 중요한 돌연변이를 유도하고, 공통 경쇄 전략 목적을 무너뜨릴 수 있다. 유전자 전환이 야생형 세포에서 순수한 면역 이전 다양성의 벌크를 제공하지만, 유사유전자의 부재하에서는 체세포 과돌연변이로의 이동이 존재한다. 면역글로불린 유전자좌에 삽입될 때, 사전 재배열된 가변 영역은 체세포 돌연변이를 겪는다는 것이 또한 마우스에서 나타났다.
도 1은 공통 경쇄의 B 세포 특이적 발현을 달성하기 위한 전략을 나타내는 개략도를 도시한다. 이 전략에서, B-세포 특이적 Cre 발현은 Cre 및 STOP 카세트의 루프 아웃을 유도하여 huVK의 발현을 유도한다. 누출성 Cre 발현이 우려되는 경우, 하이그로-pA가 제거되기 전에 Cre의 손실을 유도하고, Cre 자체의 플록싱(floxing) 없이 제조할 수 있다. B 세포에서 계속된 Cre 발현은 하이드로-pA의 루프 아웃이 완료되었는지를 확인한다.
도 2는 염색체 15 상에서 조건부 인간 VK를 유전자간 영역으로의 표적화를 입증하는 개략도를 도시한다.
도 3은 본 개시의 일부 육종 전략을 도시한다.
도 4는 자기 불활성화 Cre를 닭 경쇄 유전자좌에 삽입하기 위한 전략을 입증하는 개략도를 도시한다.
도 5는 재배열된 인간 VK의 삽입 및 유사유전자의 제거를 입증하는 개략도를 도시한다.
도 6은 공통 경쇄 도입유전자의 삽입 및 공통 경쇄의 Cre 유도성 발현을 위한 전략의 개략도를 도시한다.
도 7은 닭 경쇄 유전자좌를 둘러싸는 유전적 및 물리적 맵을 도시한다. 1Mb는 약 5cM (5% 재조합 빈도)이다.
정의
용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", "평가하는" 및 "검정하는"은 임의의 형태의 측정을 지칭하고, 요소가 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 정량적 및/또는 정성적 결정 모두를 포함한다. 평가는 상대적 또는 절대적일 수 있다. "의 존재를 결정하는"은 존재하거나 부재하는지를 결정하는 것 뿐만 아니라 존재하는 어떤 것의 양을 결정하는 것을 포함한다.
용어 "유전자"는 프로모터 영역, 코딩 서열 및 3'UTR로 구성된 핵산 서열을 의미한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "핵산"은 DNA, RNA, 일본쇄 또는 이본쇄 및 이의 화학적 변형을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "작동적으로 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 결합을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 그 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 경우(즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 조절하에 존재한다) 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 유사하게, 인트론이 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 경우, 인트론은 mRNA로부터 스플라이싱되어 코딩 서열의 발현을 제공한다. "연결되지 않은"은 결합된 유전적 요소가 서로 밀접하게 관련되어 있지 않고, 하나의 기능이 다른 것에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
용어 "동형접합성"은 동일한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에 거주함을 가리킨다. 대조적으로, "이형접합성"은 상이한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에 거주함을 가리킨다. 유전자도입 동물은 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에 대응물이 없는 경우 도입유전자에 대해 동형접합성이거나 도입유전자에 대해 반접합성일 수 있다.
유전자와 관련하여, 용어 "내인성"은 유전자가 세포에 대해 고유하다, 즉, 유전자가 비변형된 세포의 게놈에서 특별한 유전자좌에 존재한다는 것을 가리킨다. 내인성 유전자는 (자연에서 발견된) 야생형 세포에서 그 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자일 수 있다. 내인성 유전자는 야생형 유전자와 같은 게놈의 동일한 유전자좌에 존재하는 경우 변형된 내인성 유전자일 수 있다. 이러한 변형된 내인성 유전자의 예는 외래 핵산이 삽입되는 유전자이다. 내인성 유전자는 핵 게놈, 미토콘드리아 게놈 등에 존재할 수 있다.
용어 "작제물"은 특정 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 목적으로 생성되거나 다른 재조합 뉴클레오티드 서열을 작제하는 데 사용되는 재조합 핵산, 일반적으로 재조합 DNA를 의미한다. 작제물은 벡터 또는 게놈에 존재할 수 있다.
용어 "재조합"은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 제조합 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 둘 이상의 자연 발생 서열을 함유할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유한다. 세포가 재조합 핵산을 수용하는 경우, 핵산은 세포에 대해 "외인성"이다.
용어 "선택 가능한 마커"는 도입된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주의 용이한 선택을 가능하게 하는 숙주에서 발현될 수 있는 단백질을 의미한다. 선택 가능한 마커의 예는 항균제에 내성을 부여하는 단백질(예: 하이드로마이신, 블레오마이신 또는 클로람페니콜), 숙주 세포에 영양적 이점과 같은 대사 이점을 부여하는 단백질뿐만 아니라 기능적 또는 표현형 이점(예: 세포 분열)을 세포에 부여하는 단백질을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열에 기초하여 생성되는 과정을 의미한다. 과정은 전사 및 번역 모두를 포함한다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입하는"은 "형질감염" 및 "형질전환" 및 핵산을 세포에 도입하는 모든 다른 방법을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)로 도입되거나 자율적 레플리콘으로 전환되거나 일시적으로 발현될 수 있다.
용어 "코딩 서열"은 적절한 조절 요소의 조절하에 위치되면, 일단 전사되고 번역되면, 예를 들면, 생체내에서 단백질을 생성하는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용된 코딩 서열은 연속적 ORF를 가질 수 있거나 인트론 또는 비-코딩 서열의 존재에 의해 차단되는 ORF를 가질 수 있다. 이 구현예에서, 비-코딩 서열은 프리-mRNA로부터 스플라이싱되어 성숙한 mRNA를 생성한다.
하나의 유전적 유전자좌를 다른 것으로 대체하는 맥락에서 용어 "대체하는"은 단일 단계 프로토콜 또는 다중 단계 프로토콜을 의미한다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입된"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 핵산 서열의 진핵 세포 또는 원핵 세포에의 도입에 대한 참조를 포함하고, 여기서 핵산 서열은 세포에 일시적으로 존재할 수 있거나 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)으로 도입될 수 있거나 자율적 레플리콘으로 전환될 수 있다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입된"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 핵산 서열의 진핵 세포 또는 원핵 세포에의 도입에 대한 참조를 포함하고, 여기서 핵산 서열은 세포에 일시적으로 존재할 수 있거나 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)으로 도입될 수 있거나 자율적 레플리콘으로 전환될 수 있다.
용어 "복수"는 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2000, 적어도 5000 또는 적어도 10,000 또는 적어도 50,000 이상을 의미한다. 특정의 경우에, 복수는 적어도 10 내지 50을 포함한다. 다른 구현에에서, 복수는 적어도 50 내지 1,000일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여, 용어 "단리된"은 시험관내에서 배양된 세포를 의미한다. 동물이 단리된 세포를 함유하는 것으로 기재되면, 그러한 단리된 세포는 시험관내에서 배양된 다음, 동물에 이식된다.
용어 "자손" 또는 "자식(off-spring)"은 특정 동물이나 세포에서 유래되고 후행하는 임의의 모든 미래 세대를 의미한다. 따라서, 임의의 연속 세대의 동물의 자손은 자손, F1, F2, F3 세대 등이 이 정의에 포함되도록 본원에 포함된다.
구 "유전자도입 동물"은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포를 포함하는 동물을 의미한다. 외래 핵산은 동물의 모든 세포에 또는 동물의 모든 세포는 아니지만 일부에 존재할 수 있다. 외래 핵산 분자는 "도입유전자"라 지칭되고, 하나 또는 다수의 유전자, cDNA 등을 함유할 수 있다. 도입유전자를 수정된 난모세포 또는 초기 배아의 세포로 삽입함으로써, 생성되는 유전자도입 동물은 완전히 유전자도입될 수 있고, 이의 생식세포에서 외래 핵산을 안정하게 전달할 수 있다. 대안적으로, 외래 핵산은 재조합 세포 또는 이를 함유하는 조직을 동물에 전달하여, 예를 들면, 이식하여 도입함으로써 부분적으로 유전자도입 동물을 생성할 수 있다. 대안적으로, 유전자도입 동물은 유전적으로 변형된 체세포로부터 핵을 전달하거나 유전적으로 변형된 다능성 세포, 예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 원핵 세포의 전달에 의해 생성될 수 있다. 키메라 동물은 생식세포에서 다른 동물에 의해 기증된 세포를 가질 수 있고, 이 경우, 동물의 자손은 기증된 세포의 염색체에 대해 이형접합성일 수 있다. 기증된 세포가 외인성 핵산(즉, 세포에 대해 내인성이 아닌 핵산)을 함유하는 경우, 키메라 동물의 자손은 "유전자도입"될 수 있고, 여기서 "유전자도입" 동물은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포로 구성된 동물이다. 외래 핵산 분자는 본원에서 "도입유전자"로서 지칭될 수 있다.
구 "하이브리드 동물", "유전자도입 동물" 등은 특정 품질을 갖는 제1 동물과 특정 품질을 갖는 제2 동물의 교배로부터 수득된 동물을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 본 개시의 하이브리드 동물은 공통 경쇄를 생성하는 유전자도입 제1 동물과 합성 중쇄를 생성하는 제2 유전자도입 동물의 교배로부터 수득된 유전자도입 자손을 지칭할 수 있다. 하이브리드 동물은 멱역화되어 항원 특이적 항체의 생산 공급원으로서 사용될 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 당업자에 의해 잘 이해되며, 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 항체의 한 형태는 항체의 기본 구조 단위를 구성한다. 이 형태는 사량체이고, 항체 쇄의 두 개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 함께 항원에 대한 결합을 담당하고, 불변 영역은 항체 이펙터 기능을 담당한다.
인식된 면역글로불린 폴리펩티드는 카파 및 람다 경쇄 및 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄 또는 다른 종에서의 등가물을 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25kDa 또는 약 214개 아미노산)는 NH2-말단에 약 110개 아미노산의 가변 영역 및 COOH-말단에 카파 또는 람다 불변 영역을 포함한다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50kDa 또는 약 446개 아미노산)는 유사하게 (약 116개 아미노산의) 가변 영역 및 상기한 중쇄 불변 영역 중 하나, 예를 들면, (약 330개 아미노산의) 감마를 포함한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 임의의 이소타입의 항체 또는 면역글로불린, Fab, Fv, scFv, 및 Fd 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않는 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 항체의 단편, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일-쇄 항체, 및 항체의 항원-결합 부분 및 비항체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 항체는, 예를 들면, 방사성 동위 원소, 검출 가능한 제품을 생성하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출 가능하게 표지될 수 있다. 항체는 특정 결합 쌍의 구성원, 예를 들면, 비오틴(비오틴-아비딘 특정 결합 쌍의 구성원) 등과 같은 다른 잔기에 추가로 접합될 수 있다. 항체는 또한 폴리스티렌 플레이트 또는 비드 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 고체 지지체에 결합될 수 있다. Fab', Fv, F(ab')2, 및/또는 항원에 대한 특이적 결합을 유지시키는 다른 항체 단편, 및 모노클로날 항체가 또한 그 용어에 포함된다.
항체는, 예를 들면, Fv, Fab, 및 (Fab')2 뿐만 아니라 이작용성(즉, 이중특이적) 하이브리드 항체(예: Lanzavecchia and Scheidegger, Eur.J. Immunol. 1987, 17(1):105-111)를 포함하는 다양한 다른 형태 및 단일 쇄(예: Hustonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988, 85(16):5879-5883 및 Bird et al., Science. 1988, 242(4877):423-426, 이들은 본원에 참고로 포함된다)로 존재할 수 있다. (일반적으로, 문헌(참조: Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. 1984, 및 Hunkapiller and Hood, Nature. 1986, 323(6083):15-16))을 참고한다).
키메라 항체는 경쇄 및 중쇄가 전형적으로 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 유전자 조작에 의해 작제된 항체이다. 예를 들면, 닭 및 토끼 모노클로날 항체로부터 유전자의 가변 세그먼트는 인간 불변 세그먼트, 예를 들면, 감마 1 및 감마 3에 결합될 수 있다. 치료적 키메라 항체의 예는 닭 또는 토끼 항체의 가변 또는 항원 결합 도메인 및 인간 항체로부터의 불면 또는 이펙터 도메인(예: A.T.C.C. 기탁 수탁 번호 CRL 9688의 세포에 의해 제조된 항-Tac 키메라 항체)으로 구성된 하이브리드 단백질이지만, 다른 포유동물 종이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체" 또는 "인간화 면역글로불린"은 인간 항체의 상응하게 배치된 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 프레임워크 영역, 불변 영역 또는 CDR)을 함유하는 비인간 항체를 의미한다. 일반적으로, 인간화 항체는 동일한 항체의 비인간화 버전과 비교하여 인간 숙주에서 감소된 면역 반응을 생성할 것으로 예상된다.
본 발명에 의해 설계되고 생성된 인간화 항체는 항원 결합 또는 다른 항체 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 보존적 치환이란 다음 그룹으로부터의 것들과 같은 조합을 의도한다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr. 동일한 그룹에 존재하지 않는 아미노산은 "실질적으로 상이한" 아미노산이다.
용어 "유사유전자"는 개시 및/또는 정지 코돈을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 개방 판독 프레임을 함유하는 비전사 핵산 영역을 기재하기 위해 사용된다. 아미노산 서열은 개방 판독 프레임의 뉴클레오티드 서열이 인실리코(in silico) 번역되어 아미노산 서열을 생성할 수 있다는 점에서 유사유전자에 의해 "인코딩"될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 맥락에서, 유사유전자는 프로모터 영역, 재조합 신호 서열 또는 리더 서열을 함유하지 않는다.
용어 "상류" 및 "하류"는 전사 방향을 기준으로 사용된다.
용어 "특이적 결합"은 상이한 분석물의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 분석물에 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 특정 구현예에서, 특정 결합 상호작용은 샘플 중 바람직한 분석물 및 바람직하지 않은 분석물을, 일부 구현예에서는 약 10 내지 100배 이상(예: 약 1000배 또는 10,000배 이상) 구별할 것이다.
특정 구현예에서, 항체와 분석물 사이의 친화도는 그들이 항체/분석물 복합체에 특이적으로 결합되는 경우, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 10-11 M 미만 또는 약 10-12 M 미만 또는 그 이하의 KD (해리 상수)를 특징으로 한다.
중쇄 또는 경쇄 항체의 "가변 영역"은 CDR1, CDR2 및 CD3, 및 프레임워크 영역을 함유하는 쇄의 N-말단 성숙 도메인이다. 항체의 중쇄 및 경쇄는 둘 다 가변 도메인을 함유한다. 모든 도메인, CDR 및 잔기 번호는 서열 정렬 및 구조 지식에 기초하여 할당된다. 프레임워크 및 CDR 잔기의 동정 및 넘버링은 문헌[참조: Chothia et al. and others (Chotia et al., J. Mol . Biol . 1998, 278(2):457-479)]에 기재된 바와 같다.
VH는 항체 중쇄의 가변 도메인이다. VL은 항체 경쇄의 가변 도메인이다.
용어 "유전자" 및 "유전자좌"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 어느 용어도 유전자가 활동적으로 전사되거나 손상되지 않았음을 의미하지 않는다. 두 용어는 불활성화된 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키메라" 닭은 적어도 두 개의 공급원으로부터 상당수의 유전적으로 구별되는 세포를 함유하는 닭이다. 키메라 동물은 하나의 동물의 세포를 다른 동물의 배아에 이식하거나, (예를 들면, 변형된 게놈을 갖는) 배양된 세포를 배아에 이식함으로써 제조될 수 있다. 이식된 세포는 숙주 배아에 혼입되기 전에 배양물로부터 수거될 수 있다. 배아는 동물에서 발달하고, 생성되는 동물은 이식된 세포 뿐만 아니라 숙주의 세포를 함유할 수 있다. 기증된 세포가 외인성 핵산(즉, 세포에 대해 내인성이 아닌 핵산)을 함유하는 경우, 키메라 동물의 자손은 "유전자도입"될 수 있고, 여기서 "유전자도입" 동물은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포로 구성된 동물이다. 외래 핵산 분자는 본원에서 "도입유전자"로서 지칭될 수 있다.
용어 "불성화된"은 유전자에 의해 인코딩된 단백질이 발현되지 않는다는 의미에서 발현되지 않는 유전자를 나타내는 것을 의미한다. 유전자는 유전자의 코딩 서열 및/또는 조절자 서열의 일부를 제거함으로써 불활성화될 수 있다. 파괴된 유전자, 예를 들면, "녹아웃(knockout)"은 불활성화된 유전자의 유형이다. 그 이후로 또한 발현된 인간 면역글로불린 서열로 대체된 발현된 내인성 서열을 일단 함유한 유전자좌는 불활성화된 내인성 유전자를 함유한다. 이와 같이, 발현된 인간 면역글로불린 서열을 함유하는 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자가 인간 면역글로불린 서열에 의해 대체되면, 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자를 함유할 수 있다. 많은 경우, 이는 내인성 서열을 녹아웃시키고(예를 글면, 서열의 적어도 일부를 결실시킴으로써), 이어서 내인성 서열에 의해 일단 점유된 위치에 인간 면역글로불린 서열을 삽입함으로써 수행될 수 있다.
용어 "재조합체"는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 재조합 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 둘 이상의 자연 발생 서열을 함유할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유한다. 세포가 재조합 핵산을 수용하면, 핵산은 세포에 대해 "외인성"이다.
용어 "Cre"는 문헌(참조: Abremski et al., Cell. 1983, 32(4):1301-1311)에 개시된 바와 같이, lox 부위(하기 정의 참조)에서 DNA의 부위 특이적 재조합을 수행하는 재조합효소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합효소" 및 "재조합 부위"는 부위 특이적 재조합효소 및 이의 인식 부위(예: Cre/lox, Flp-FRT 등)를 의미하고, 여기서 재조합효소는 2개의 이의 인식 부위 사이의 서열을 절제할 수 있다.
구 "재조합효소 도입유전자"는 재조합효소, 예를 들면, Cre, 코딩 서열을 포함하는 도입유전자를 의미한다. 본원에서 사용된 구 "재조합효소-유도성" 또는 "재조합효소-유도성 도입유전자"는 재조합효소가 동일 세포 내에서 발현될 때까지 비기능성인 도입유전자를 의미한다. 일부 경우에서, 재조합효소의 발현은 정상이 하류 서열/유전자가 발현되는 것을 방지하는 서열(예: 개재 서열)의 절단을 초래한다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 구 "Lox 부위" 및 "LoxP 부위"는 Cre가 부위 특이적 재조합을 촉매화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 공지된 바와 같이, LoxP 부위는 8개의 염기 쌍 스페이서 영역에 의해 분리된 두 개의 13개 염기쌍 역 반복으로 구성된다. 다른 적합한 lox 부위는 이. 콜리(E. coli)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열인 LoxB, LoxL 및 LoxR 부위를 포함한다. 이들 서열은 문헌(참조: Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1982, 79(11):3398-3402)에 개시되고 기재된다. 일부 구현예에서, lox 부위는 LoxP, LoxC2, lox2272, lox5171 또는 lox511 부위일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자기-불활성화"(예: 자기-불활성화 재조합효소 도입유전자의 맥락에서)는 발현시 그 자체를 불활성화시키는 능력을 갖는 유전자를 의미한다. 예를 들면, 본 개시의 자기-불활성화 재조합효소 도입유전자는 재조합에 의해, 예를 들면, 재조합효소의 발현시 그 자체의 절제 및 자기-불활성화를 초래하는 부위인 Lox의 측면에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "개재 서열"은 두 개의 작동적으로 연결된 유전적 요소 사이에 삽입될 경우, 그러한 요소들이 작동적으로 연결되는 것을 방지하는 유전적 서열을 의미하고, 여기서 개재 서열은 두 개의 유전적 요소 사이에서 자연적으로 발견되지 않는다. 예를 들면, 개재 서열은 단백질 코딩 서열이 프로모터로부터 전사되는 것을 방지하는 프로모터(예: 비면역글로불린 경쇄 프로모터) 및 단백질 코딩 서열(예: 공통 경쇄에 대한 코딩 서열) 사이에 삽입되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 개재 서열은 재조합 부위가 측면에 위치할 수 있다. 적합한 재조합효소의 존재하에, 프로모터와 코딩 서열을 분리하는 개재 서열을 절제하여, 프로모터 및 코딩 서열을 작동적으로 연결시키고, 코딩 서열이 전사되도록 할 수 있다.
용어 "유전적으로 연결된"은 유전적 요소가 감수분열 동안 함께 유전되는 경향이 있도록 동일한 염색체 상에 존재하는 두 개의 유전적 요소(즉, 요소가 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 재조합 빈도를 갖는다)를 의미한다. 서로 밀접하게 연결된 두 개의 유전적 요소는 염색체 크로스오버 사상 (또는 "재조합") 동안 상이한 염색분체 상에서 분리될 가능성이 적다. 두 개의 유전적으로 연결된 요소가 재조합 동안 분리될 확률은 두 요소 사이의 서열의 양에 의존하고, "재조합 빈도"로 지칭되는 가능성의 백분율로 계산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공통 경쇄" 또는 "공통 면역글로불린 경쇄"는 상이한 항원에 결합하는 항체를 생성하기 위해 다수의 중쇄 가변 영역과 쌍을 이룰 수 있는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 공통 경쇄는 항원 결합을 위한 수동적 파트너이고, 항원 결합은 중쇄에 의해 결정된다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 두 개의 결합 특이성을 갖고, 일부 경우에, 이중특이적 항체의 두 암은 동일한 경쇄(즉, "공통" 경쇄) 및 (주로 암의 결합 특이성을 결정하는) 상이한 중쇄를 갖는다.
본 개시의 공통 경쇄는 "사전-재배열된 경쇄 가변 영역" (또는 "사전-재배열된 가변 영역")을 포함하고, 여기서, 경쇄 가변 영역은 정의된 서열을 갖고, 상이한 특이성의 항체를 생성하기 위해 다수의 중쇄 가변 영역과 충분히 쌍을 이룰 수 있도록 하는 특성을 위해 선택되었다. 본 개시의 "공통 경쇄 도입유전자"는 하나의 긴 개방 판독 프레임에 적어도 공통 경쇄 코딩 서열 (또는 사전-재배열된 경쇄 가변 영역) 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 도입유전자일 수 있다. 이 도입유전자는 cDNA일 수 있다. 추가의 정의는 본 개시에서의 다른 부분에 존재할 수 있다.
예시적 구현예의 설명
본 발명의 대상을 추가로 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 특성 구현예로 제한되지 않고, 당연히 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 것이고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도는 아니라는 것을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 당해 범위의 상한선과 달리 언급되거나 개재하는 값 사이의 하한 단위의 1/10까지의 각 개재 값은 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이하 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기재하기 위해 본원에서 참조로서 도입된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "and" 및 "the"는, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함하는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 복수의 세포를 포함하고, "후보 약제"에 대한 언급은 하나 이상의 후보 약제 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 드래프팅될 수 있음에 추가로 유의한다. 이와 같이, 이러한 언급은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용을 위해 선행 기준으로 작용하는 것으로 의도된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 공개를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물에 선행하는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 간행물의 일자는 실제 공개일과 상이할 수 있고, 이는 독립적으로 확인해야 할 수도 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개개 간행물 또는 특허가 인용에 의해 도입되고 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 본원에서 참조로서 도입되며, 당해 간행물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시 및 기재하기 위해 본원에서 참조로서 도입된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 이의 개시를 위한 것이고, 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물보다 선행하는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 간행물의 일자는 실제 공개일과 상이할 수 있고, 이는 독립적으로 확인해야 할 수도 있다.
본 개시를 읽을 때에 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재되고 설명된 개별적 구현예 각각은, 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고서 다른 몇몇 구현예의 임의의 특징과 용이하게 분리되거나 조합될 수 있는 개개 요소 및 특징을 갖는다. 언급된 모든 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 유전자도입 동물이 제공된다. 특정 구현예에서, 동물은 상대적으로 소수의 경쇄 유전자를 갖는 임의의 비-인간 동물, 또는 이들의 일차 항원 레퍼토리를 개발하기 위한 유전자 전환을 이용하는 동물일 수 있고, 따라서 동물은 다양한 임의의 상이한 동물일 수 있다. 한 가지 구현예에서, 동물은 조류, 예를 들면, 닭 또는 칠면조 등의 갈리아 목(Galliformes)의 구성원, 오리 또는 거위 등의 기러기 목(Anseriformes)의 구성원, 포유동물, 예를 들면, 토끼 또는 암소, 양, 돼지 또는 염소 등의 농장 동물일 수 있다. 특정 구현예에서, 유전자도입 동물은 설치류(예: 마우스 또는 래트) 또는 비-설치류(예: 비-마우스 또는 비-래트), 비-영장류 유전자도입 동물일 수 있다.
본 개시의 일부는 하나 이상의 도입유전자를 함유하는 유전자도입 닭에 관한 것이다. 이러한 동물의 게놈을 변형시키는 방법과 같이, 다수의 동물의 면역글로불린 유전자좌의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있기 때문에, 하기 기재된 일반적 개념은 임의의 적합한 동물, 특히 이들의 원발성 항원 레퍼토리를 발달시키기 위한 유전자 전환을 이용하는 동물에 용이하게 적용할 수 있다. 전사된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자의 가변 영역과 상이한 가변 영역을 함유하는 작동적으로 연결된 (상류) 유사유전자 사이의 유전자 전환에 의한 항체 다양성의 생성은 다양한 간행물, 예를 들면, 문헌[참조: Butler(Rev. Sci. Tech. 1998 17: 43-70), Bucchini (Nature 1987 326: 409-11), Knight (Adv. Immunol. 1994 56: 179-218), Langman (Res. Immunol. 1993 144: 422-46), Masteller (Int. Rev. Immunol. 1997 15: 185-206), Reynaud (Cell 1989 59: 171-83) and Ratcliffe (Dev. Comp. Immunol. 2006 30: 101-118)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 유전자도입 동물의 게놈은 재조합효소 도입유전자, 즉 재조합효소(예: Cre) 코딩 서열을 함유하도록 변형되고, 여기서, 재조합효소 코딩 서열은 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터에 작동적으로 연결되고, 용어 "내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터는" 변형되지 않은 동물에서 면역글로불린 경쇄 위치에 존재하는 면역글로불린 경쇄 프로모터인 것으로 의도된다. 달리 말하면, 재조합효소 도입유전자는 프로모터가 항체를 생성하는 B 세포 및 기타 세포에서 재조합효소의 발현을 유도하는 방식으로 내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터의 하류에 위치한다. 이러한 변형은 내인성 경쇄 코딩 서열의 발현을 불활성화시킨다. 동물의 게놈은 또한, 비-면역글로불린 경쇄 프로모터(예: 구성 프로모터, 또는 B 세포에서 활성인 것으로 예상되는 또 다른 프로모터)를 포함하는 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자, 공통 경쇄를 위한 코딩 서열(예: 공통 경쇄를 코딩하는 cDNA), 및 개재 서열이 재조합효소에 의해 절제되지 않는 한, 공통 경쇄가 발현되는 것을 방지하는 개재 서열을 함유한다. 명백한 바와 같이, 개재 서열은 재조합 부위, 예를 들면, lox 부위의 측면에 위치할 수 있고, 이와 같이 B 세포에서 재조합효소의 발현은 개재 서열을 절제하여 비-면역글로불린 경쇄 프로모터에 의한 공통 경쇄의 발현을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 재조합효소 도입유전자 및 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자는 서로 유전적으로 연결될 수 있지만, 동일한 유전자좌에서는 연결되지 않는다. 예를 들면, 재조합효소 도입유전자(이는 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 본래 존재한다) 및 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자는 적어도 100kb, 적어도 200kb, 적어도 300kb, 적어도 400kb, 적어도 500kb 또는 적어도 1Mb의 거리로 서로 분리되고, 이에 의해 공통 경쇄 코딩 서열이 과돌연변이, 재배열 및 유전자 전환(이는 공통 경쇄 코딩 서열이 재조합효소 도입유전자에 바로 인접한 경우에 발생할 수 있음)에 제공되는 것을 방지하지만, 그럼에도 불구하고 재조합효소 도입유전자 및 공통 경쇄 도입유전자 사이의 재조합이 비교적 낮은 빈도, 즉 최대 10%, 최대 5%, 최대 2.5% 또는 최대 1%의 빈도로 발생하도록 동일한 염색체 상에서 연결된다. 재조합효소 도입유전자 사이의 연결은 교배 전략을 보다 더 효율적으로 작동하게 한다.
유전자도입 동물은, 특히 이들 도입유전자가 유전적으로 연결되는 경우, 재조합효소 도입유전자 및 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 유전자도입 동물이 도입유전자에 대해 이형접합성인 경우, 경쇄 유전자좌의 다른 대립인자는 불활성화될 수 있고, 이는 동물에 의해 생성된 경쇄만이 공통 경쇄일 수 있음을 의미한다(제US2010082759호 참조).
동물의 중쇄 유전자좌는 야생형일 수 있거나, 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자도입 동물은, a) i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및 ii) 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 기능적 IgH 유전자; 및 b) i) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및 ii) 아미노산 서열에서 a)(ii)의 중쇄 프레임워크와 동일한 중쇄 프레임워크 영역을 각각 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 복수의 유사유전자를 포함하는 "합성" 면역글로불린 중쇄(IgH) 유전자좌("SynV")를 포함하고, 여기서 재조합 IgH 유전자좌는, 작동가능한 연결로, 인트론 영역, 불변 도메인 영역-코딩 영역 및 3' 비번역된 영역을 포함하고, 인트론 영역의 적어도 일부는 상기 유전자도입 동물의 게놈에 대해 내인성이고; 상기 a)의 핵산 및 b)의 유사유전자는 상기 유전자도입 동물의 게놈에 대해 내외인성이고, b)의 유사유전자에 의해 코딩된 CDR의 각 아미노산 잔기 및 a)의 경쇄 가변 영역의 CDR의 각 아미노산 잔기는 2 내지 5개 아미노산 잔기의 동일한 그룹으로부터 선택되고, 상기 복수의 유사유전자는 상기 기능적 IgH 유전자에 작동적으로 연결되고 상기 유전자도입 동물에서 유전자 전환에 의해 핵산 서열을 a)의 핵산에 제공하고; 상기 유전자도입 동물은 다양한 형태의 상기 기능적 IgH 가변 영역을 포함하는 재조합 면역글로불린을 발현한다. 상기 그룹 중의 2 내지 5개 아미노산 중의 적어도 하나는 티로신 또는 트립토판 잔기일 수 있고, 그룹 중의 2 내지 5개 아미노산 중의 적어도 하나는 알라닌, 글리신 또는 세린 잔기일 수 있다. 이들 구현예에서, 중쇄 프레임워크 영역은 인간 프레임워크일 수 있고, 예를 들면, 인간 생식세포 프레임워크와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 동물은 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 이에 대한 추가의 상세는 본원에서 참조로서 도입되는 미국 특허 제US8,592,644호에서 발견할 수 있다.
일부 구현예에서, 공통 경쇄 코딩 서열은 사전-재배열된 가변 영역 또는 cDNA를 포함하는 공통 면역글로불린 경쇄를 코딩한다.
일부 구현예에서, 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자의 개재 서열은, 당해 작제물을 함유하는 세포가 선택될 수 있도록, 선택 가능한 마커 카세트, 예를 들면, 하이그로마이신 내성 카세트를 함유할 수 있다. 이들 구현예에서, 선택 가능한 마커 카세트는 하류 전사를 방지하는 폴리아데닐화 부위를 함유할 수 있다.
상기 기재된 유전자도입 동물은 동물의 게놈을 재조합에 의해 변형시킴으로써 제조할 수 있다. 유전자도입 동물, 예를 들면, 마우스 및 닭 등을 제조하는 방법은 공지되어 있고, 특히 유전자 전환을 사용하는 동물의 게놈을 변형시키는 방법도 또한 공지되어 있고[참조: 조류의 경우, Sayegh, Vet. Immunol. Immunopathol. 1999 72:31-7 and Kamihira, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004 91: 171-89 for birds, 및 소의 경우, Bosze, Transgenic Res. 2003 12 :541-53 and Fan, Pathol. Int. 1999 49: 583-94 for rabbits and Salamone J. Biotechnol. 2006 124: 469-72], 다수의 이들 종의 생식세포 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 구조 및/또는 서열이 그렇듯이[참조: Butler Rev Sci Tech 1998 17:43 - 70 and Ratcliffe Dev Comp Immunol 2006 30: 101-118], 상기 기재된 동물은 본 개시에 제공된 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 유전자도입 닭을 제조하는 방법은 공지되어 있다[참조: US8,592,644, US8,889,662, Collarini et al (Poult Sci. 2015 94: 799-803), van de Lavoir (Nature. 2006 441: 766-9) and Schusser et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 110: 20170-5].
또한, 공통 경쇄를 함유하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 상기 기재된 바와 같은 유전자도입 동물을 항원으로 면역화시키는 것을 포함하고, 상기 항체가 폴리클로날인 경우, 상기 방법은 동물의 출혈로부터 항체를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 동물이 공통 경쇄 서열에 대해 동형접합성인 경우, 폴리클로날 항혈청 중의 모든 항체는 동일한 경쇄를 가져야 한다. 모노클로날 항체가 바람직한 경우, 이 방법은 b) 면역화된 유전자도입 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 제조하고; c) 하이브리도마를 스크리닝하여 항원-특이적 하이브리도마를 동정하고; d) 항원-특이적 항체를 항원-특이적 하이브리도마로부터 단리하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 동물은 GD2, EGF-R, CEA, CD52, CD20, Lym-1, CD6, 상보성 활성화 수용체(CAR), EGP40, VEGF, 종양-연관된 당 단백질 TAG-72 AFP(알파-페토단백질), BLyS (TNF 및 APOL - 관련 리간드), CA125(암종 항원 125), CEA(암배아성 항원), CD2(T-세포 표면 항원), CD3(TCR과 연관된 이종다량체), CD4, CD11a(인테그린 알파-L), CD14(단핵구 분화 항원), CD20, CD22(B-세포 수용체), CD23(저친화성 IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체 알파 쇄), CD30(사이토킨 수용체), CD33(골수 세포 표면 항원), CD40(종양 괴사 인자 수용체), CD44v6(백혈구의 부착 매개), CD52(CAMPATH-1), CD80(CD28 및 CTLA-4에 대한 공자극제), 상보성 성분 C5, CTLA, EGFR, 에오탁신(사이토킨 A11), HER2/neu, HER3, HLA-DR, HLA-DR10, HLA ClassII, IgE, GPiib/iiia(인테그린), 인테그린 aVß3, 인테그린 a4ß1 및 a4ß7, 인테그린 ß2, IFN-감마, IL-1ß, IL-4, IL-5, IL-6R(IL6 수용체), IL-12, IL-15, KDR(VEGFR-2), 르위시(lewisy), 메소텔린, MUC1, MUC18, NCAM(신경 세포 부착 분자), 태아기 피브로넥틴, PDGFßR(베타 혈소판-유래 성장 인자 수용체), PMSA, 신장 암 항원 G250, RSV, E-셀렉틴, TGFbeta1, TGFbeta2, TNFα, DR4, DR5, DR6, VAP-1(혈관 부착 단백질 1) 또는 VEGF 등으로 면역화시켜 치료 항체를 생성할 수 있다.
항원은, 보조제와 함께 또는 없이, 임의의 편리한 방식으로 유전자도입 숙주 동물에게 투여할 수 있고, 예정된 스케쥴에 따라 투여할 수 있다.
면역화 후, 면역화된 유전자도입 동물로부터의 혈청 또는 우유는 항원에 특이적인 약제 등급의 폴리클로날 항체의 정제를 위해 분획할 수 있다. 유전자도입 조류의 경우에, 항체는 또한 난황을 분획하여 제조할 수 있다. 농축되고 정제된 면역글로불린 분획은 크로마토그래피(친화성, 이온 교환, 겔 여과 등), 황산암모늄 등의 염, 에탄올 등의 유기 용매 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 중합체를 사용한 선택적 침전에 의해 수득할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 항체-생성 세포, 예를 들면, 비장 세포를 면역화된 유전자도입 동물로부터 단리할 수 있고, 하이브리도마의 생성을 위해 형질전환된 세포주와의 세포 융합에 사용할 수 있거나, cDNA 코딩 항체를 표준 분자 생물학 기술로 클로닝시켜 형질감염된 세포에서 발현시킨다. 모노클로날 항체를 제조하는 절차는 당래 기술분야에서 잘 확립되어 있다(예를 들면, 유럽 특허원 제0 583 980 A1호, 미국 특허 제4,977,081호, WO 97/16537, 및 EP 0 491 057 B1, 이의 개시는 본원에서 참조로 도입된다). 클로닝된 cDNA 분자로부터 모노클로날 항체의 시험관내 생성은 문헌[참조: Andris-Widhopf et al., J Immunol Methods 242:159 (2000), 및 Burton, Immunotechnology1:87 (1995), 이의 개시는 본원에서 참조로서 도입된다]에 기재되어 있다.
항체가 인간 프레임워크 영역을 이미 함유하지 않는 경우, 상기 방법은 항체를 인간화시키는 것을 추가로 포함할 수 있고, 이 방법은 항체의 불변 도메인을 인간 불변 도메인으로 교환하여 키메라 항체를 제조하는 것 뿐만 아니라 특정 경우에 항체의 가변 도메인을, 예를 들면, CDR 그래프팅 또는 재표면화 등에 의해 인간화시키는 것을 포함할 수 있다. 인간화는 하기 방법에 따라 수행한다[참조: Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), U.S. Pat. Nos. 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5,814,476, 5,763,192, 5,723,323, 5,766,886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, 본원에 인용된 참조문헌을 포함하여, 이들 각각은 전체가 본원에서 참조로서 도입됨].
이와 같이, 유전자도입 동물 이외에, 유전자도입 동물을 항원으로 면역화시키고, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 유전자도입 동물로부터 수득하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 유전자도입 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 제조하고; 하이브리도마를 스크리닝하여, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 동정하는 것을 포함할 수 있다.
상이한 항원에 결합하는 모노클로날 항체가 단리되는 경우, 임의의 편리한 방법을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 2개의 중쇄 서열은 단일 공통 경쇄와 함께 단일 숙주 세포에서 발현시킬 수 있고, 이 경우에 이들 세포에 의해 분비된 항체의 일부는 이중특이적이어야 한다. 대안적으로, 2개 중쇄 및 공통 경쇄는 별도로 발현되고 중첩될 수 있거나 함께 시험관내에서 결합시킬 수 있다.
합성 VH를 갖는 동물의 경우에, 동물에 의해 생성된 모든 항체는 공통 경쇄 및 중쇄를 가져야 하고, 친화성 돌연변이(즉, 이는 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만의 아미노산에서 발생한다) 동안 기능적 유전자 중의 가변 도메인에 대한 비-유전자 전환 기본 아미노산 변화를 가져온 비교적 소수의 아미노산을 제외하고는, CDR은 상기 기재된 유전자좌에 의해 코딩된 2 내지 5개 아미노산으로 구성된다. 마찬가지로, 프레임워크 영역은, 단량체 형태, 제조 용이성, 고용해도 및 열역학적 안정성 등의 바람직한 특성을 갖는 것으로 공지된 소정의 서열로 구성된다.
항체의 중쇄 가변 도메인은 동물의 면역계에 의해 "천연"으로 제조된다. 이러한 항체는, 특정 경우에, 숙주 세포에 의해 번역후 변형(예: 글리코실화)될 수 있고, 유전자도입 동물의 종의 글리코실화 패턴 및 조성물 특성을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 유전자도입 동물에 의해 생성된 항체가 제공되고, 상기 항체는 가변 도메인에 연결된 불변 도메인을 포함하고, 여기서 가변 도메인은 a) 공통 경쇄 가변 도메인; 및 a) i. 2 내지 5개의 상이한 아미노산으로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 및 ii. 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 양태를 설명하고 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 원리 중의 일부는 하기 실시예에서 설명된다. 명백한 바와 같이, 하기 VK 유전자에 적용된 원리는 다른 경쇄 유전자에 적용될 수 있다.
실시예 1
돌연변이를 일으키지 않은 공통 경쇄를 갖는 유전자도입 닭의 제조
B 세포에서 항체 다양화의 메카니즘은 면역글로불린 유전자좌 중의 유전자에 주로 국한되기 때문에, 돌연변이를 일으키지 않은 공통 경쇄를 갖는 유전자도입 닭을 제조하는 한가지 접근법은 비-면역글로불린 조절 요소의 전사 조절하에 게놈 중의 또 다른 유전자좌에 경쇄를 삽입하는 것이었다(도 1). B 세포-특이적 발현은 B 세포에서만 Cre-매개된 재조합시에 활성화된 조건적 도입유전자를 사용하여 달성했다. B 세포에서만 Cre 재조합을 달성하기 위해, Cre 발현은 경쇄 유전자좌에 Cre 유전자를 삽입하여 B 세포-특이적으로 제조했다(도 2). 초기 B 세포 발달에서 경쇄 조절 요소에 의한 Cre 발현의 유도시에, Cre 재조합효소 활성은 공통 경쇄의 발현을 차단하는 정지 서열을 반복했다.
대안적 접근법은 경쇄 유전자좌에 사전-재배열된 V 영역을 삽입하고 모든 유사유전자를 상류로 제거하여 유전자 전환의 가능성을 제거하는 것일 수 있다(도 3 및 4).
실시예 2
결정 인간 중쇄와 쌍을 이루고 이를 발현하는 사전-재배열된 인간 VK 공통 경쇄에 대한 경쇄 라이브러리의 스크리닝
선택된 인간 중쇄 가변 영역과 양호하게 쌍을 이루는 인간 사전-재배열된 경쇄 가변 영역을 동정할 수 있다. 인간 VK3 계열 서열의 라이브러리는 결정 인간 VH3-23 유전자를 포함하는 발현 작제물로 293 세포에 동시-형질감염시킨다. 배양 상청액을 생성된 IgG의 수준에 대해 ELISA로 스크리닝한다. 생식세포 서열과 가장 유사한 인간 VK 서열이 바람직하다. 이러한 인간 VK 서열은 공통 경쇄로 지칭된다. 공통 경쇄 유전자는 인간 VK 영역 및 닭 경쇄 작제물 영역을 하나의 긴 개방 판독 프레임에 함유한다. 어떠한 인트론도 필요하지 않다.
실시예 3
닭 염색체 15 내로 사전-재배열된 인간 VK 유전자(공통 경쇄 )의 삽입
인간 VK 공통 경쇄는 B 세포에서 고도의 발현 수준을 보장하기 위해 닭 B-액틴 프로모터 또는 CAG 프로모터에 의해 유도한다(도 3). B 세포에서만 공통 경쇄의 고도 발현을 갖는 것이 바람직하기 때문에, 도입유전자는 Cre 재조합에 의해 활성화시킨다. lox2272 부위의 측면에 위치하는 하이그로마이신-내성 카세트는, 프로모터가 Cre 재조합 전에 하이그로마이신-내성 유전자의 발현을 유도하도록, 프로모터 영역과 공통 경쇄 유전자 사이에 위치시킨다. Cre 발현시, 하이그로 유전자는 절제되어, 단일 lox2272 부위를 잔류시키고, 프로모터가 공통 경쇄의 발현을 유도하는 것을 가능하게 한다. 작제물은 또한 염색질 절연체로서 작용하는 닭 B-글로빈 유전자좌로부터 HS4 부위를 함유한다.
공통 경쇄 도입유전자는 동질성 DNA 표적화 암을 사용하여 상동성 재조합에 의해 염색체 15 내로 삽입한다. 삽입 위치는, IgL-Cre 및 공통 경쇄 도입유전자가 존재할 필요가 있기 때문에, 하류 육종 전략이 단순화되도록, 내인성 경쇄 유전자좌에 충분히 근접하도록 선택된다. 경쇄 유전자좌를 둘러싸고 있는 닭 염색체 15 상에서, 500kb는 대략 2.5cM 또는 2.5% 재조합 빈도에 동일하다. 따라서, 닭 경쇄 유전자좌의 500kb 내의 공통 경쇄 유전자의 위치는, 공통 경쇄 도입유전자 및 Cre 도입유전자(하기 참조)가 약 98%의 시간에서 연결된 상태를 유지하는 것을 보장한다(도 7). 내인성 경쇄 유전자좌로부터 약 500kb 미만의 유전자간 영역은 공통 경쇄의 삽입을 위해 선택된다. 공통 경쇄 도입유전자의 돌연변이율을 증가시킬 수도 있는 잠재적 돌연변이 메카니즘을 회피하기 위해 내인성 경쇄 유전자좌에 과도하게 근접하지 않는 것이 바람직하다. IgL-Cre/공통 경쇄 염색체 또는 일배체는 단위로서 본질적으로 상속되어, 완전 인간 항체를 생성하기 위해 중쇄 도입유전자를 공통 경쇄와 조합하는데 필요한 하류 육종 전략을 크게 단순화시킨다.
염색체 15 내로 공통 경쇄를 삽입하기 위한 표적화 작제물은 표적화에 사용된 PGC 세포와 동등한 5' 및 3' 상동성 영역을 함유한다. 상동성 영역은, 서열이 당해 염색체와 동등한 것을 보장하기 위해, 세포에 존재하는 경쇄 유전자좌에 동형접합성인 조류의 게놈 DNA로부터 증폭시킨다. 이들 세포는 이전 경쇄 녹아웃 및 녹인 도입유전자에 사용되었고, 조류는 세포의 생식세포 전달에 의해 생성되었다. 교차 이형접합성 조류는 두 염색체 상에 경쇄 유전자좌 및 밀접하게 연결된 서열(예를 들면, 표적화를 위해 선택된 영역)을 포함하는 동형접합성 조류를 생성했다. 동형접합성 DNA로부터 상동성 영역의 클로닝은, 서열이 이미 표적화한 경쇄와 동일한 염색체로부터 유래하는 것을 보장한다. 닭 PGC에서, 상동성 영역이 정확하게 게놈에 정합하고, 심지어 몇몇 단일 뉴클레오티드 변화도 표적화 빈도를 억제하거나 심각하게 감소시킬 필요가 있다. 닭은 근친교배되지 않기 때문에, 표적화에 사용되는 PGC 세포는 서로에 대해 광범위한 단일 뉴클레오티드 다형태를 포함하는 염색체의 상이한 2개 세트를 함유하고, 하나의 대립인자에 정합하는 상동성 영역은 다른 대립인자에 대한 다형태를 함유하는 것이 보장된다. 정확한 서열 상동성에 대한 요구 때문에, 특정 대립인자를 위해 설계된 표적화 벡터는 당해 대립인자만을 표적화한다. 적어도 4kb 전체 길이의 상동성 영역은 표적화에 충분하다. 대안적으로, 표적화 영역에 인접한 이중 사슬 절단을 제조하기 위해 CRISPR과 조합하여 전체 1-2kb의 보다 짧은 상동성 영역을 또한 사용할 수 있다.
닭 B-액틴 또는 CAG(B-액틴 + CMV 중간-초기 인핸서) 등의 범용의 강력한 프로모터가 사용된다. PGC에서 표적화 사상의 선별을 위해 및 비-B 계통 세포에서 공통 경쇄의 발현을 차단하는 정지 서열로서 작용하기 위해, 하이그로마이신 내성 카세트는 프로모터와 공통 경쇄 사이에 위치된다. 하이드로마이신 카세트는, 공통 경쇄 유전자가 전사되지 않도록, 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 하이그로마이신 유전자 및 공통 경쇄 둘 다를 함유하는 긴 전사체가 제조되는 경우에, 하이그로 유전자의 긴 개방 판독 프레임 및 정지 코돈은 공통 경쇄의 전사를 방지할 것이다. lox511, lox2272 또는 lox5171 등의 대안적 loxP 부위는 하이드로마이신 카세트의 측면에 위치한다. 2개 도입유전자 사이에 재조합이 없도록, 자가 활성화 Cre 및 공통 경쇄 주변에 부정합 loxP 부위를 사용하는 것이 중요하다.
IgL-Cre/공통 경쇄 염색체를 포함하는 닭은 IgL 녹아웃 및 다양한 중쇄 도입유전자 등의 다른 도입유전자를 포함하는 닭과 육종된다(도 4). IgL 녹아웃 닭과의 육종은 내인성 닭 경쇄의 동형접합성 기능적 녹아웃을 갖는 조류를 생성한다(하나의 대립인자는 단일 녹아웃을 갖고, 다른 대립인자는 IgL-Cre 도입유전자를 갖는다). 공통 경쇄는 이들 닭에서 발현된 유일한 경쇄이다. IgL-Cre/공통 경쇄 염색체를 함유하는 조류는 공통 경쇄 및 인간 중쇄 녹아웃을 함유하는 조류를 생성하기 위해 중쇄 녹아웃과 교차시킨다. 이들 조류는 유전자형: 공통 경쇄/IgL 녹아웃; 인간 중쇄 녹인/IgH 녹아웃을 갖는 조류를 생성하기 위해 경쇄 녹아웃 및 인간 중쇄 녹인을 함유하는 조류와 육종한다(도 4).
대안적으로, 인간 VK 도입유전자는 phiC31 인테그라제를 사용하여 게놈에 무작위로 삽입한다.
실시예 4
IgL-Cre를 제조하기 위한 닭 IgL 유전자좌 내로 Cre 재조합효소 녹-인
Cre 발현 B-세포에 특이적으로 하기 위해, Cre 유전자를 닭 경쇄 유전자좌에 삽입하고, 이의 발현은 경쇄 프로모터 및 인핸서 요소에 의해 유도한다(도 5). 닭에서, 경쇄 및 중쇄 유전자 둘 다는 초기 B 세포 발달에서 동시에 재배열되고 발현되며, 대리 경쇄는 없다. 따라서, 경쇄 유전자좌로부터의 발현은 B 세포 수용체 발현이 중요한 B 세포 발달의 단계와 일치한다. Cre를 경쇄 유전자좌 내로 삽입하기 위해, 먼저 attP 부위를, phiC31 인테그라제를 사용하여 삽입용 도킹 부위로 작용하는 유전자좌로 표적화한다. 결정은 attP 부위 및 무프로모터 neo 유전자가 상동성 재조합에 의해 경쇄 유전자좌 내로 삽입되어 V, J 및 C 코딩 영역 및 인트론을 대체하는 경쇄 녹아웃을 생성했다. Cre 삽입 작제물은 B-세포 특이적 발현을 위한 닭 경쇄 프로모터에 연결된 Cre 유전자, 및 B-액틴 프로모터에 연결된 attB 부위를 함유한다. 경쇄 유전자좌에서 attP 부위 내로 작제물의 삽입시, B-액틴 프로모터는 neo 유전자의 발현을 유도하여 G418과의 정확한 통합의 선택을 용이하게 한다. 이어서, Cre 유전자는 유전자좌에서 내인성 경쇄 프로모터 및 인핸서 요소의 전사 조절하에 존재하여 B-세포 특이적 발현을 제공한다. 작제물은 순서대로 하기를 포함한다: attB 부위, B-액틴 프로모터, B-글로빈 HS4 염색질 절연체의 2개 카피, 닭 IgL 프로모터, Cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 토끼 글로빈 polyA 신호, 닭 IgL JC 인트로, loxP 부위. Cre 작제물의 삽입은, V 및 J 영역이 Cre로 대체되고 JC 인트론이 대체되지만 불변 영역이 부재하는 경쇄 유전자좌의 재구축을 유도한다.
또한, Cre 유전자는, Cre가 B-세포 계통에서 일시적으로만 발현되도록, 자가-불활성화시킬 수 있다. LoxP 부위는, B 세포 계통에서 발현 유도시에 생성된 Cre 재조합효소가 Cre 유전자를 절단하도록, Cre 유전자의 양측에 위치된다. 이 경우에, 변이체 loxP 부위(예를 들면, lox511, lox2272 또는 lox5171)는, 이들이 경쇄 유전자좌에서 Cre의 측면에 위치하는 고전적 loxP 부위와 조합되지 않도록, 인간 VK 도입유전자 중의 하이드로마이신 카세트를 플록스(flox)하기 위해 사용된다.
도 2는 염색체 15 상에서 조건부 인간 VK를 유전자간 영역으로의 표적화를 입증하는 개략도를 도시한다.
도 3은 본 개시의 일부 육종 전략을 도시한다.
도 4는 자기 불활성화 Cre를 닭 경쇄 유전자좌에 삽입하기 위한 전략을 입증하는 개략도를 도시한다.
도 5는 재배열된 인간 VK의 삽입 및 유사유전자의 제거를 입증하는 개략도를 도시한다.
도 6은 공통 경쇄 도입유전자의 삽입 및 공통 경쇄의 Cre 유도성 발현을 위한 전략의 개략도를 도시한다.
도 7은 닭 경쇄 유전자좌를 둘러싸는 유전적 및 물리적 맵을 도시한다. 1Mb는 약 5cM (5% 재조합 빈도)이다.
정의
용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", "평가하는" 및 "검정하는"은 임의의 형태의 측정을 지칭하고, 요소가 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 정량적 및/또는 정성적 결정 모두를 포함한다. 평가는 상대적 또는 절대적일 수 있다. "의 존재를 결정하는"은 존재하거나 부재하는지를 결정하는 것 뿐만 아니라 존재하는 어떤 것의 양을 결정하는 것을 포함한다.
용어 "유전자"는 프로모터 영역, 코딩 서열 및 3'UTR로 구성된 핵산 서열을 의미한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "핵산"은 DNA, RNA, 일본쇄 또는 이본쇄 및 이의 화학적 변형을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "작동적으로 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 결합을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 그 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 경우(즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 조절하에 존재한다) 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 유사하게, 인트론이 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 경우, 인트론은 mRNA로부터 스플라이싱되어 코딩 서열의 발현을 제공한다. "연결되지 않은"은 결합된 유전적 요소가 서로 밀접하게 관련되어 있지 않고, 하나의 기능이 다른 것에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
용어 "동형접합성"은 동일한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에 거주함을 가리킨다. 대조적으로, "이형접합성"은 상이한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에 거주함을 가리킨다. 유전자도입 동물은 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에 대응물이 없는 경우 도입유전자에 대해 동형접합성이거나 도입유전자에 대해 반접합성일 수 있다.
유전자와 관련하여, 용어 "내인성"은 유전자가 세포에 대해 고유하다, 즉, 유전자가 비변형된 세포의 게놈에서 특별한 유전자좌에 존재한다는 것을 가리킨다. 내인성 유전자는 (자연에서 발견된) 야생형 세포에서 그 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자일 수 있다. 내인성 유전자는 야생형 유전자와 같은 게놈의 동일한 유전자좌에 존재하는 경우 변형된 내인성 유전자일 수 있다. 이러한 변형된 내인성 유전자의 예는 외래 핵산이 삽입되는 유전자이다. 내인성 유전자는 핵 게놈, 미토콘드리아 게놈 등에 존재할 수 있다.
용어 "작제물"은 특정 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 목적으로 생성되거나 다른 재조합 뉴클레오티드 서열을 작제하는 데 사용되는 재조합 핵산, 일반적으로 재조합 DNA를 의미한다. 작제물은 벡터 또는 게놈에 존재할 수 있다.
용어 "재조합"은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 제조합 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 둘 이상의 자연 발생 서열을 함유할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유한다. 세포가 재조합 핵산을 수용하는 경우, 핵산은 세포에 대해 "외인성"이다.
용어 "선택 가능한 마커"는 도입된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주의 용이한 선택을 가능하게 하는 숙주에서 발현될 수 있는 단백질을 의미한다. 선택 가능한 마커의 예는 항균제에 내성을 부여하는 단백질(예: 하이드로마이신, 블레오마이신 또는 클로람페니콜), 숙주 세포에 영양적 이점과 같은 대사 이점을 부여하는 단백질뿐만 아니라 기능적 또는 표현형 이점(예: 세포 분열)을 세포에 부여하는 단백질을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열에 기초하여 생성되는 과정을 의미한다. 과정은 전사 및 번역 모두를 포함한다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입하는"은 "형질감염" 및 "형질전환" 및 핵산을 세포에 도입하는 모든 다른 방법을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)로 도입되거나 자율적 레플리콘으로 전환되거나 일시적으로 발현될 수 있다.
용어 "코딩 서열"은 적절한 조절 요소의 조절하에 위치되면, 일단 전사되고 번역되면, 예를 들면, 생체내에서 단백질을 생성하는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용된 코딩 서열은 연속적 ORF를 가질 수 있거나 인트론 또는 비-코딩 서열의 존재에 의해 차단되는 ORF를 가질 수 있다. 이 구현예에서, 비-코딩 서열은 프리-mRNA로부터 스플라이싱되어 성숙한 mRNA를 생성한다.
하나의 유전적 유전자좌를 다른 것으로 대체하는 맥락에서 용어 "대체하는"은 단일 단계 프로토콜 또는 다중 단계 프로토콜을 의미한다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입된"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 핵산 서열의 진핵 세포 또는 원핵 세포에의 도입에 대한 참조를 포함하고, 여기서 핵산 서열은 세포에 일시적으로 존재할 수 있거나 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)으로 도입될 수 있거나 자율적 레플리콘으로 전환될 수 있다.
핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입된"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 핵산 서열의 진핵 세포 또는 원핵 세포에의 도입에 대한 참조를 포함하고, 여기서 핵산 서열은 세포에 일시적으로 존재할 수 있거나 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)으로 도입될 수 있거나 자율적 레플리콘으로 전환될 수 있다.
용어 "복수"는 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2000, 적어도 5000 또는 적어도 10,000 또는 적어도 50,000 이상을 의미한다. 특정의 경우에, 복수는 적어도 10 내지 50을 포함한다. 다른 구현에에서, 복수는 적어도 50 내지 1,000일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여, 용어 "단리된"은 시험관내에서 배양된 세포를 의미한다. 동물이 단리된 세포를 함유하는 것으로 기재되면, 그러한 단리된 세포는 시험관내에서 배양된 다음, 동물에 이식된다.
용어 "자손" 또는 "자식(off-spring)"은 특정 동물이나 세포에서 유래되고 후행하는 임의의 모든 미래 세대를 의미한다. 따라서, 임의의 연속 세대의 동물의 자손은 자손, F1, F2, F3 세대 등이 이 정의에 포함되도록 본원에 포함된다.
구 "유전자도입 동물"은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포를 포함하는 동물을 의미한다. 외래 핵산은 동물의 모든 세포에 또는 동물의 모든 세포는 아니지만 일부에 존재할 수 있다. 외래 핵산 분자는 "도입유전자"라 지칭되고, 하나 또는 다수의 유전자, cDNA 등을 함유할 수 있다. 도입유전자를 수정된 난모세포 또는 초기 배아의 세포로 삽입함으로써, 생성되는 유전자도입 동물은 완전히 유전자도입될 수 있고, 이의 생식세포에서 외래 핵산을 안정하게 전달할 수 있다. 대안적으로, 외래 핵산은 재조합 세포 또는 이를 함유하는 조직을 동물에 전달하여, 예를 들면, 이식하여 도입함으로써 부분적으로 유전자도입 동물을 생성할 수 있다. 대안적으로, 유전자도입 동물은 유전적으로 변형된 체세포로부터 핵을 전달하거나 유전적으로 변형된 다능성 세포, 예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 원핵 세포의 전달에 의해 생성될 수 있다. 키메라 동물은 생식세포에서 다른 동물에 의해 기증된 세포를 가질 수 있고, 이 경우, 동물의 자손은 기증된 세포의 염색체에 대해 이형접합성일 수 있다. 기증된 세포가 외인성 핵산(즉, 세포에 대해 내인성이 아닌 핵산)을 함유하는 경우, 키메라 동물의 자손은 "유전자도입"될 수 있고, 여기서 "유전자도입" 동물은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포로 구성된 동물이다. 외래 핵산 분자는 본원에서 "도입유전자"로서 지칭될 수 있다.
구 "하이브리드 동물", "유전자도입 동물" 등은 특정 품질을 갖는 제1 동물과 특정 품질을 갖는 제2 동물의 교배로부터 수득된 동물을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 본 개시의 하이브리드 동물은 공통 경쇄를 생성하는 유전자도입 제1 동물과 합성 중쇄를 생성하는 제2 유전자도입 동물의 교배로부터 수득된 유전자도입 자손을 지칭할 수 있다. 하이브리드 동물은 멱역화되어 항원 특이적 항체의 생산 공급원으로서 사용될 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 당업자에 의해 잘 이해되며, 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 항체의 한 형태는 항체의 기본 구조 단위를 구성한다. 이 형태는 사량체이고, 항체 쇄의 두 개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 함께 항원에 대한 결합을 담당하고, 불변 영역은 항체 이펙터 기능을 담당한다.
인식된 면역글로불린 폴리펩티드는 카파 및 람다 경쇄 및 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄 또는 다른 종에서의 등가물을 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25kDa 또는 약 214개 아미노산)는 NH2-말단에 약 110개 아미노산의 가변 영역 및 COOH-말단에 카파 또는 람다 불변 영역을 포함한다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50kDa 또는 약 446개 아미노산)는 유사하게 (약 116개 아미노산의) 가변 영역 및 상기한 중쇄 불변 영역 중 하나, 예를 들면, (약 330개 아미노산의) 감마를 포함한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 임의의 이소타입의 항체 또는 면역글로불린, Fab, Fv, scFv, 및 Fd 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않는 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 항체의 단편, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일-쇄 항체, 및 항체의 항원-결합 부분 및 비항체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 항체는, 예를 들면, 방사성 동위 원소, 검출 가능한 제품을 생성하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출 가능하게 표지될 수 있다. 항체는 특정 결합 쌍의 구성원, 예를 들면, 비오틴(비오틴-아비딘 특정 결합 쌍의 구성원) 등과 같은 다른 잔기에 추가로 접합될 수 있다. 항체는 또한 폴리스티렌 플레이트 또는 비드 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 고체 지지체에 결합될 수 있다. Fab', Fv, F(ab')2, 및/또는 항원에 대한 특이적 결합을 유지시키는 다른 항체 단편, 및 모노클로날 항체가 또한 그 용어에 포함된다.
항체는, 예를 들면, Fv, Fab, 및 (Fab')2 뿐만 아니라 이작용성(즉, 이중특이적) 하이브리드 항체(예: Lanzavecchia and Scheidegger, Eur.J. Immunol. 1987, 17(1):105-111)를 포함하는 다양한 다른 형태 및 단일 쇄(예: Hustonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988, 85(16):5879-5883 및 Bird et al., Science. 1988, 242(4877):423-426, 이들은 본원에 참고로 포함된다)로 존재할 수 있다. (일반적으로, 문헌(참조: Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. 1984, 및 Hunkapiller and Hood, Nature. 1986, 323(6083):15-16))을 참고한다).
키메라 항체는 경쇄 및 중쇄가 전형적으로 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 유전자 조작에 의해 작제된 항체이다. 예를 들면, 닭 및 토끼 모노클로날 항체로부터 유전자의 가변 세그먼트는 인간 불변 세그먼트, 예를 들면, 감마 1 및 감마 3에 결합될 수 있다. 치료적 키메라 항체의 예는 닭 또는 토끼 항체의 가변 또는 항원 결합 도메인 및 인간 항체로부터의 불면 또는 이펙터 도메인(예: A.T.C.C. 기탁 수탁 번호 CRL 9688의 세포에 의해 제조된 항-Tac 키메라 항체)으로 구성된 하이브리드 단백질이지만, 다른 포유동물 종이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체" 또는 "인간화 면역글로불린"은 인간 항체의 상응하게 배치된 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 프레임워크 영역, 불변 영역 또는 CDR)을 함유하는 비인간 항체를 의미한다. 일반적으로, 인간화 항체는 동일한 항체의 비인간화 버전과 비교하여 인간 숙주에서 감소된 면역 반응을 생성할 것으로 예상된다.
본 발명에 의해 설계되고 생성된 인간화 항체는 항원 결합 또는 다른 항체 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 보존적 치환이란 다음 그룹으로부터의 것들과 같은 조합을 의도한다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr. 동일한 그룹에 존재하지 않는 아미노산은 "실질적으로 상이한" 아미노산이다.
용어 "유사유전자"는 개시 및/또는 정지 코돈을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 개방 판독 프레임을 함유하는 비전사 핵산 영역을 기재하기 위해 사용된다. 아미노산 서열은 개방 판독 프레임의 뉴클레오티드 서열이 인실리코(in silico) 번역되어 아미노산 서열을 생성할 수 있다는 점에서 유사유전자에 의해 "인코딩"될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 맥락에서, 유사유전자는 프로모터 영역, 재조합 신호 서열 또는 리더 서열을 함유하지 않는다.
용어 "상류" 및 "하류"는 전사 방향을 기준으로 사용된다.
용어 "특이적 결합"은 상이한 분석물의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 분석물에 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 특정 구현예에서, 특정 결합 상호작용은 샘플 중 바람직한 분석물 및 바람직하지 않은 분석물을, 일부 구현예에서는 약 10 내지 100배 이상(예: 약 1000배 또는 10,000배 이상) 구별할 것이다.
특정 구현예에서, 항체와 분석물 사이의 친화도는 그들이 항체/분석물 복합체에 특이적으로 결합되는 경우, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 10-11 M 미만 또는 약 10-12 M 미만 또는 그 이하의 KD (해리 상수)를 특징으로 한다.
중쇄 또는 경쇄 항체의 "가변 영역"은 CDR1, CDR2 및 CD3, 및 프레임워크 영역을 함유하는 쇄의 N-말단 성숙 도메인이다. 항체의 중쇄 및 경쇄는 둘 다 가변 도메인을 함유한다. 모든 도메인, CDR 및 잔기 번호는 서열 정렬 및 구조 지식에 기초하여 할당된다. 프레임워크 및 CDR 잔기의 동정 및 넘버링은 문헌[참조: Chothia et al. and others (Chotia et al., J. Mol . Biol . 1998, 278(2):457-479)]에 기재된 바와 같다.
VH는 항체 중쇄의 가변 도메인이다. VL은 항체 경쇄의 가변 도메인이다.
용어 "유전자" 및 "유전자좌"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 어느 용어도 유전자가 활동적으로 전사되거나 손상되지 않았음을 의미하지 않는다. 두 용어는 불활성화된 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키메라" 닭은 적어도 두 개의 공급원으로부터 상당수의 유전적으로 구별되는 세포를 함유하는 닭이다. 키메라 동물은 하나의 동물의 세포를 다른 동물의 배아에 이식하거나, (예를 들면, 변형된 게놈을 갖는) 배양된 세포를 배아에 이식함으로써 제조될 수 있다. 이식된 세포는 숙주 배아에 혼입되기 전에 배양물로부터 수거될 수 있다. 배아는 동물에서 발달하고, 생성되는 동물은 이식된 세포 뿐만 아니라 숙주의 세포를 함유할 수 있다. 기증된 세포가 외인성 핵산(즉, 세포에 대해 내인성이 아닌 핵산)을 함유하는 경우, 키메라 동물의 자손은 "유전자도입"될 수 있고, 여기서 "유전자도입" 동물은 외래 핵산(즉, 동물에 고유하지 않은 재조합 핵산)을 함유하는 세포로 구성된 동물이다. 외래 핵산 분자는 본원에서 "도입유전자"로서 지칭될 수 있다.
용어 "불성화된"은 유전자에 의해 인코딩된 단백질이 발현되지 않는다는 의미에서 발현되지 않는 유전자를 나타내는 것을 의미한다. 유전자는 유전자의 코딩 서열 및/또는 조절자 서열의 일부를 제거함으로써 불활성화될 수 있다. 파괴된 유전자, 예를 들면, "녹아웃(knockout)"은 불활성화된 유전자의 유형이다. 그 이후로 또한 발현된 인간 면역글로불린 서열로 대체된 발현된 내인성 서열을 일단 함유한 유전자좌는 불활성화된 내인성 유전자를 함유한다. 이와 같이, 발현된 인간 면역글로불린 서열을 함유하는 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자가 인간 면역글로불린 서열에 의해 대체되면, 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자를 함유할 수 있다. 많은 경우, 이는 내인성 서열을 녹아웃시키고(예를 글면, 서열의 적어도 일부를 결실시킴으로써), 이어서 내인성 서열에 의해 일단 점유된 위치에 인간 면역글로불린 서열을 삽입함으로써 수행될 수 있다.
용어 "재조합체"는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 재조합 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 둘 이상의 자연 발생 서열을 함유할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유한다. 세포가 재조합 핵산을 수용하면, 핵산은 세포에 대해 "외인성"이다.
용어 "Cre"는 문헌(참조: Abremski et al., Cell. 1983, 32(4):1301-1311)에 개시된 바와 같이, lox 부위(하기 정의 참조)에서 DNA의 부위 특이적 재조합을 수행하는 재조합효소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합효소" 및 "재조합 부위"는 부위 특이적 재조합효소 및 이의 인식 부위(예: Cre/lox, Flp-FRT 등)를 의미하고, 여기서 재조합효소는 2개의 이의 인식 부위 사이의 서열을 절제할 수 있다.
구 "재조합효소 도입유전자"는 재조합효소, 예를 들면, Cre, 코딩 서열을 포함하는 도입유전자를 의미한다. 본원에서 사용된 구 "재조합효소-유도성" 또는 "재조합효소-유도성 도입유전자"는 재조합효소가 동일 세포 내에서 발현될 때까지 비기능성인 도입유전자를 의미한다. 일부 경우에서, 재조합효소의 발현은 정상이 하류 서열/유전자가 발현되는 것을 방지하는 서열(예: 개재 서열)의 절단을 초래한다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 구 "Lox 부위" 및 "LoxP 부위"는 Cre가 부위 특이적 재조합을 촉매화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 공지된 바와 같이, LoxP 부위는 8개의 염기 쌍 스페이서 영역에 의해 분리된 두 개의 13개 염기쌍 역 반복으로 구성된다. 다른 적합한 lox 부위는 이. 콜리(E. coli)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열인 LoxB, LoxL 및 LoxR 부위를 포함한다. 이들 서열은 문헌(참조: Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1982, 79(11):3398-3402)에 개시되고 기재된다. 일부 구현예에서, lox 부위는 LoxP, LoxC2, lox2272, lox5171 또는 lox511 부위일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자기-불활성화"(예: 자기-불활성화 재조합효소 도입유전자의 맥락에서)는 발현시 그 자체를 불활성화시키는 능력을 갖는 유전자를 의미한다. 예를 들면, 본 개시의 자기-불활성화 재조합효소 도입유전자는 재조합에 의해, 예를 들면, 재조합효소의 발현시 그 자체의 절제 및 자기-불활성화를 초래하는 부위인 Lox의 측면에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "개재 서열"은 두 개의 작동적으로 연결된 유전적 요소 사이에 삽입될 경우, 그러한 요소들이 작동적으로 연결되는 것을 방지하는 유전적 서열을 의미하고, 여기서 개재 서열은 두 개의 유전적 요소 사이에서 자연적으로 발견되지 않는다. 예를 들면, 개재 서열은 단백질 코딩 서열이 프로모터로부터 전사되는 것을 방지하는 프로모터(예: 비면역글로불린 경쇄 프로모터) 및 단백질 코딩 서열(예: 공통 경쇄에 대한 코딩 서열) 사이에 삽입되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 개재 서열은 재조합 부위가 측면에 위치할 수 있다. 적합한 재조합효소의 존재하에, 프로모터와 코딩 서열을 분리하는 개재 서열을 절제하여, 프로모터 및 코딩 서열을 작동적으로 연결시키고, 코딩 서열이 전사되도록 할 수 있다.
용어 "유전적으로 연결된"은 유전적 요소가 감수분열 동안 함께 유전되는 경향이 있도록 동일한 염색체 상에 존재하는 두 개의 유전적 요소(즉, 요소가 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 재조합 빈도를 갖는다)를 의미한다. 서로 밀접하게 연결된 두 개의 유전적 요소는 염색체 크로스오버 사상 (또는 "재조합") 동안 상이한 염색분체 상에서 분리될 가능성이 적다. 두 개의 유전적으로 연결된 요소가 재조합 동안 분리될 확률은 두 요소 사이의 서열의 양에 의존하고, "재조합 빈도"로 지칭되는 가능성의 백분율로 계산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공통 경쇄" 또는 "공통 면역글로불린 경쇄"는 상이한 항원에 결합하는 항체를 생성하기 위해 다수의 중쇄 가변 영역과 쌍을 이룰 수 있는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 공통 경쇄는 항원 결합을 위한 수동적 파트너이고, 항원 결합은 중쇄에 의해 결정된다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 두 개의 결합 특이성을 갖고, 일부 경우에, 이중특이적 항체의 두 암은 동일한 경쇄(즉, "공통" 경쇄) 및 (주로 암의 결합 특이성을 결정하는) 상이한 중쇄를 갖는다.
본 개시의 공통 경쇄는 "사전-재배열된 경쇄 가변 영역" (또는 "사전-재배열된 가변 영역")을 포함하고, 여기서, 경쇄 가변 영역은 정의된 서열을 갖고, 상이한 특이성의 항체를 생성하기 위해 다수의 중쇄 가변 영역과 충분히 쌍을 이룰 수 있도록 하는 특성을 위해 선택되었다. 본 개시의 "공통 경쇄 도입유전자"는 하나의 긴 개방 판독 프레임에 적어도 공통 경쇄 코딩 서열 (또는 사전-재배열된 경쇄 가변 영역) 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 도입유전자일 수 있다. 이 도입유전자는 cDNA일 수 있다. 추가의 정의는 본 개시에서의 다른 부분에 존재할 수 있다.
예시적 구현예의 설명
본 발명의 대상을 추가로 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 특성 구현예로 제한되지 않고, 당연히 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 것이고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도는 아니라는 것을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 당해 범위의 상한선과 달리 언급되거나 개재하는 값 사이의 하한 단위의 1/10까지의 각 개재 값은 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이하 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기재하기 위해 본원에서 참조로서 도입된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "and" 및 "the"는, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함하는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 복수의 세포를 포함하고, "후보 약제"에 대한 언급은 하나 이상의 후보 약제 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 드래프팅될 수 있음에 추가로 유의한다. 이와 같이, 이러한 언급은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용을 위해 선행 기준으로 작용하는 것으로 의도된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 공개를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물에 선행하는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 간행물의 일자는 실제 공개일과 상이할 수 있고, 이는 독립적으로 확인해야 할 수도 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개개 간행물 또는 특허가 인용에 의해 도입되고 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 본원에서 참조로서 도입되며, 당해 간행물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시 및 기재하기 위해 본원에서 참조로서 도입된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 이의 개시를 위한 것이고, 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물보다 선행하는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 간행물의 일자는 실제 공개일과 상이할 수 있고, 이는 독립적으로 확인해야 할 수도 있다.
본 개시를 읽을 때에 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재되고 설명된 개별적 구현예 각각은, 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고서 다른 몇몇 구현예의 임의의 특징과 용이하게 분리되거나 조합될 수 있는 개개 요소 및 특징을 갖는다. 언급된 모든 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 유전자도입 동물이 제공된다. 특정 구현예에서, 동물은 상대적으로 소수의 경쇄 유전자를 갖는 임의의 비-인간 동물, 또는 이들의 일차 항원 레퍼토리를 개발하기 위한 유전자 전환을 이용하는 동물일 수 있고, 따라서 동물은 다양한 임의의 상이한 동물일 수 있다. 한 가지 구현예에서, 동물은 조류, 예를 들면, 닭 또는 칠면조 등의 갈리아 목(Galliformes)의 구성원, 오리 또는 거위 등의 기러기 목(Anseriformes)의 구성원, 포유동물, 예를 들면, 토끼 또는 암소, 양, 돼지 또는 염소 등의 농장 동물일 수 있다. 특정 구현예에서, 유전자도입 동물은 설치류(예: 마우스 또는 래트) 또는 비-설치류(예: 비-마우스 또는 비-래트), 비-영장류 유전자도입 동물일 수 있다.
본 개시의 일부는 하나 이상의 도입유전자를 함유하는 유전자도입 닭에 관한 것이다. 이러한 동물의 게놈을 변형시키는 방법과 같이, 다수의 동물의 면역글로불린 유전자좌의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있기 때문에, 하기 기재된 일반적 개념은 임의의 적합한 동물, 특히 이들의 원발성 항원 레퍼토리를 발달시키기 위한 유전자 전환을 이용하는 동물에 용이하게 적용할 수 있다. 전사된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자의 가변 영역과 상이한 가변 영역을 함유하는 작동적으로 연결된 (상류) 유사유전자 사이의 유전자 전환에 의한 항체 다양성의 생성은 다양한 간행물, 예를 들면, 문헌[참조: Butler(Rev. Sci. Tech. 1998 17: 43-70), Bucchini (Nature 1987 326: 409-11), Knight (Adv. Immunol. 1994 56: 179-218), Langman (Res. Immunol. 1993 144: 422-46), Masteller (Int. Rev. Immunol. 1997 15: 185-206), Reynaud (Cell 1989 59: 171-83) and Ratcliffe (Dev. Comp. Immunol. 2006 30: 101-118)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 유전자도입 동물의 게놈은 재조합효소 도입유전자, 즉 재조합효소(예: Cre) 코딩 서열을 함유하도록 변형되고, 여기서, 재조합효소 코딩 서열은 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터에 작동적으로 연결되고, 용어 "내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터는" 변형되지 않은 동물에서 면역글로불린 경쇄 위치에 존재하는 면역글로불린 경쇄 프로모터인 것으로 의도된다. 달리 말하면, 재조합효소 도입유전자는 프로모터가 항체를 생성하는 B 세포 및 기타 세포에서 재조합효소의 발현을 유도하는 방식으로 내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터의 하류에 위치한다. 이러한 변형은 내인성 경쇄 코딩 서열의 발현을 불활성화시킨다. 동물의 게놈은 또한, 비-면역글로불린 경쇄 프로모터(예: 구성 프로모터, 또는 B 세포에서 활성인 것으로 예상되는 또 다른 프로모터)를 포함하는 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자, 공통 경쇄를 위한 코딩 서열(예: 공통 경쇄를 코딩하는 cDNA), 및 개재 서열이 재조합효소에 의해 절제되지 않는 한, 공통 경쇄가 발현되는 것을 방지하는 개재 서열을 함유한다. 명백한 바와 같이, 개재 서열은 재조합 부위, 예를 들면, lox 부위의 측면에 위치할 수 있고, 이와 같이 B 세포에서 재조합효소의 발현은 개재 서열을 절제하여 비-면역글로불린 경쇄 프로모터에 의한 공통 경쇄의 발현을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 재조합효소 도입유전자 및 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자는 서로 유전적으로 연결될 수 있지만, 동일한 유전자좌에서는 연결되지 않는다. 예를 들면, 재조합효소 도입유전자(이는 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 본래 존재한다) 및 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자는 적어도 100kb, 적어도 200kb, 적어도 300kb, 적어도 400kb, 적어도 500kb 또는 적어도 1Mb의 거리로 서로 분리되고, 이에 의해 공통 경쇄 코딩 서열이 과돌연변이, 재배열 및 유전자 전환(이는 공통 경쇄 코딩 서열이 재조합효소 도입유전자에 바로 인접한 경우에 발생할 수 있음)에 제공되는 것을 방지하지만, 그럼에도 불구하고 재조합효소 도입유전자 및 공통 경쇄 도입유전자 사이의 재조합이 비교적 낮은 빈도, 즉 최대 10%, 최대 5%, 최대 2.5% 또는 최대 1%의 빈도로 발생하도록 동일한 염색체 상에서 연결된다. 재조합효소 도입유전자 사이의 연결은 교배 전략을 보다 더 효율적으로 작동하게 한다.
유전자도입 동물은, 특히 이들 도입유전자가 유전적으로 연결되는 경우, 재조합효소 도입유전자 및 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 유전자도입 동물이 도입유전자에 대해 이형접합성인 경우, 경쇄 유전자좌의 다른 대립인자는 불활성화될 수 있고, 이는 동물에 의해 생성된 경쇄만이 공통 경쇄일 수 있음을 의미한다(제US2010082759호 참조).
동물의 중쇄 유전자좌는 야생형일 수 있거나, 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자도입 동물은, a) i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및 ii) 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 기능적 IgH 유전자; 및 b) i) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및 ii) 아미노산 서열에서 a)(ii)의 중쇄 프레임워크와 동일한 중쇄 프레임워크 영역을 각각 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 복수의 유사유전자를 포함하는 "합성" 면역글로불린 중쇄(IgH) 유전자좌("SynV")를 포함하고, 여기서 재조합 IgH 유전자좌는, 작동가능한 연결로, 인트론 영역, 불변 도메인 영역-코딩 영역 및 3' 비번역된 영역을 포함하고, 인트론 영역의 적어도 일부는 상기 유전자도입 동물의 게놈에 대해 내인성이고; 상기 a)의 핵산 및 b)의 유사유전자는 상기 유전자도입 동물의 게놈에 대해 내외인성이고, b)의 유사유전자에 의해 코딩된 CDR의 각 아미노산 잔기 및 a)의 경쇄 가변 영역의 CDR의 각 아미노산 잔기는 2 내지 5개 아미노산 잔기의 동일한 그룹으로부터 선택되고, 상기 복수의 유사유전자는 상기 기능적 IgH 유전자에 작동적으로 연결되고 상기 유전자도입 동물에서 유전자 전환에 의해 핵산 서열을 a)의 핵산에 제공하고; 상기 유전자도입 동물은 다양한 형태의 상기 기능적 IgH 가변 영역을 포함하는 재조합 면역글로불린을 발현한다. 상기 그룹 중의 2 내지 5개 아미노산 중의 적어도 하나는 티로신 또는 트립토판 잔기일 수 있고, 그룹 중의 2 내지 5개 아미노산 중의 적어도 하나는 알라닌, 글리신 또는 세린 잔기일 수 있다. 이들 구현예에서, 중쇄 프레임워크 영역은 인간 프레임워크일 수 있고, 예를 들면, 인간 생식세포 프레임워크와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 동물은 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 이에 대한 추가의 상세는 본원에서 참조로서 도입되는 미국 특허 제US8,592,644호에서 발견할 수 있다.
일부 구현예에서, 공통 경쇄 코딩 서열은 사전-재배열된 가변 영역 또는 cDNA를 포함하는 공통 면역글로불린 경쇄를 코딩한다.
일부 구현예에서, 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자의 개재 서열은, 당해 작제물을 함유하는 세포가 선택될 수 있도록, 선택 가능한 마커 카세트, 예를 들면, 하이그로마이신 내성 카세트를 함유할 수 있다. 이들 구현예에서, 선택 가능한 마커 카세트는 하류 전사를 방지하는 폴리아데닐화 부위를 함유할 수 있다.
상기 기재된 유전자도입 동물은 동물의 게놈을 재조합에 의해 변형시킴으로써 제조할 수 있다. 유전자도입 동물, 예를 들면, 마우스 및 닭 등을 제조하는 방법은 공지되어 있고, 특히 유전자 전환을 사용하는 동물의 게놈을 변형시키는 방법도 또한 공지되어 있고[참조: 조류의 경우, Sayegh, Vet. Immunol. Immunopathol. 1999 72:31-7 and Kamihira, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004 91: 171-89 for birds, 및 소의 경우, Bosze, Transgenic Res. 2003 12 :541-53 and Fan, Pathol. Int. 1999 49: 583-94 for rabbits and Salamone J. Biotechnol. 2006 124: 469-72], 다수의 이들 종의 생식세포 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 구조 및/또는 서열이 그렇듯이[참조: Butler Rev Sci Tech 1998 17:43 - 70 and Ratcliffe Dev Comp Immunol 2006 30: 101-118], 상기 기재된 동물은 본 개시에 제공된 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 유전자도입 닭을 제조하는 방법은 공지되어 있다[참조: US8,592,644, US8,889,662, Collarini et al (Poult Sci. 2015 94: 799-803), van de Lavoir (Nature. 2006 441: 766-9) and Schusser et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 110: 20170-5].
또한, 공통 경쇄를 함유하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 상기 기재된 바와 같은 유전자도입 동물을 항원으로 면역화시키는 것을 포함하고, 상기 항체가 폴리클로날인 경우, 상기 방법은 동물의 출혈로부터 항체를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 동물이 공통 경쇄 서열에 대해 동형접합성인 경우, 폴리클로날 항혈청 중의 모든 항체는 동일한 경쇄를 가져야 한다. 모노클로날 항체가 바람직한 경우, 이 방법은 b) 면역화된 유전자도입 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 제조하고; c) 하이브리도마를 스크리닝하여 항원-특이적 하이브리도마를 동정하고; d) 항원-특이적 항체를 항원-특이적 하이브리도마로부터 단리하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 동물은 GD2, EGF-R, CEA, CD52, CD20, Lym-1, CD6, 상보성 활성화 수용체(CAR), EGP40, VEGF, 종양-연관된 당 단백질 TAG-72 AFP(알파-페토단백질), BLyS (TNF 및 APOL - 관련 리간드), CA125(암종 항원 125), CEA(암배아성 항원), CD2(T-세포 표면 항원), CD3(TCR과 연관된 이종다량체), CD4, CD11a(인테그린 알파-L), CD14(단핵구 분화 항원), CD20, CD22(B-세포 수용체), CD23(저친화성 IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체 알파 쇄), CD30(사이토킨 수용체), CD33(골수 세포 표면 항원), CD40(종양 괴사 인자 수용체), CD44v6(백혈구의 부착 매개), CD52(CAMPATH-1), CD80(CD28 및 CTLA-4에 대한 공자극제), 상보성 성분 C5, CTLA, EGFR, 에오탁신(사이토킨 A11), HER2/neu, HER3, HLA-DR, HLA-DR10, HLA ClassII, IgE, GPiib/iiia(인테그린), 인테그린 aVß3, 인테그린 a4ß1 및 a4ß7, 인테그린 ß2, IFN-감마, IL-1ß, IL-4, IL-5, IL-6R(IL6 수용체), IL-12, IL-15, KDR(VEGFR-2), 르위시(lewisy), 메소텔린, MUC1, MUC18, NCAM(신경 세포 부착 분자), 태아기 피브로넥틴, PDGFßR(베타 혈소판-유래 성장 인자 수용체), PMSA, 신장 암 항원 G250, RSV, E-셀렉틴, TGFbeta1, TGFbeta2, TNFα, DR4, DR5, DR6, VAP-1(혈관 부착 단백질 1) 또는 VEGF 등으로 면역화시켜 치료 항체를 생성할 수 있다.
항원은, 보조제와 함께 또는 없이, 임의의 편리한 방식으로 유전자도입 숙주 동물에게 투여할 수 있고, 예정된 스케쥴에 따라 투여할 수 있다.
면역화 후, 면역화된 유전자도입 동물로부터의 혈청 또는 우유는 항원에 특이적인 약제 등급의 폴리클로날 항체의 정제를 위해 분획할 수 있다. 유전자도입 조류의 경우에, 항체는 또한 난황을 분획하여 제조할 수 있다. 농축되고 정제된 면역글로불린 분획은 크로마토그래피(친화성, 이온 교환, 겔 여과 등), 황산암모늄 등의 염, 에탄올 등의 유기 용매 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 중합체를 사용한 선택적 침전에 의해 수득할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 항체-생성 세포, 예를 들면, 비장 세포를 면역화된 유전자도입 동물로부터 단리할 수 있고, 하이브리도마의 생성을 위해 형질전환된 세포주와의 세포 융합에 사용할 수 있거나, cDNA 코딩 항체를 표준 분자 생물학 기술로 클로닝시켜 형질감염된 세포에서 발현시킨다. 모노클로날 항체를 제조하는 절차는 당래 기술분야에서 잘 확립되어 있다(예를 들면, 유럽 특허원 제0 583 980 A1호, 미국 특허 제4,977,081호, WO 97/16537, 및 EP 0 491 057 B1, 이의 개시는 본원에서 참조로 도입된다). 클로닝된 cDNA 분자로부터 모노클로날 항체의 시험관내 생성은 문헌[참조: Andris-Widhopf et al., J Immunol Methods 242:159 (2000), 및 Burton, Immunotechnology1:87 (1995), 이의 개시는 본원에서 참조로서 도입된다]에 기재되어 있다.
항체가 인간 프레임워크 영역을 이미 함유하지 않는 경우, 상기 방법은 항체를 인간화시키는 것을 추가로 포함할 수 있고, 이 방법은 항체의 불변 도메인을 인간 불변 도메인으로 교환하여 키메라 항체를 제조하는 것 뿐만 아니라 특정 경우에 항체의 가변 도메인을, 예를 들면, CDR 그래프팅 또는 재표면화 등에 의해 인간화시키는 것을 포함할 수 있다. 인간화는 하기 방법에 따라 수행한다[참조: Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), U.S. Pat. Nos. 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5,814,476, 5,763,192, 5,723,323, 5,766,886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, 본원에 인용된 참조문헌을 포함하여, 이들 각각은 전체가 본원에서 참조로서 도입됨].
이와 같이, 유전자도입 동물 이외에, 유전자도입 동물을 항원으로 면역화시키고, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 유전자도입 동물로부터 수득하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 유전자도입 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 제조하고; 하이브리도마를 스크리닝하여, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 동정하는 것을 포함할 수 있다.
상이한 항원에 결합하는 모노클로날 항체가 단리되는 경우, 임의의 편리한 방법을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 2개의 중쇄 서열은 단일 공통 경쇄와 함께 단일 숙주 세포에서 발현시킬 수 있고, 이 경우에 이들 세포에 의해 분비된 항체의 일부는 이중특이적이어야 한다. 대안적으로, 2개 중쇄 및 공통 경쇄는 별도로 발현되고 중첩될 수 있거나 함께 시험관내에서 결합시킬 수 있다.
합성 VH를 갖는 동물의 경우에, 동물에 의해 생성된 모든 항체는 공통 경쇄 및 중쇄를 가져야 하고, 친화성 돌연변이(즉, 이는 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만의 아미노산에서 발생한다) 동안 기능적 유전자 중의 가변 도메인에 대한 비-유전자 전환 기본 아미노산 변화를 가져온 비교적 소수의 아미노산을 제외하고는, CDR은 상기 기재된 유전자좌에 의해 코딩된 2 내지 5개 아미노산으로 구성된다. 마찬가지로, 프레임워크 영역은, 단량체 형태, 제조 용이성, 고용해도 및 열역학적 안정성 등의 바람직한 특성을 갖는 것으로 공지된 소정의 서열로 구성된다.
항체의 중쇄 가변 도메인은 동물의 면역계에 의해 "천연"으로 제조된다. 이러한 항체는, 특정 경우에, 숙주 세포에 의해 번역후 변형(예: 글리코실화)될 수 있고, 유전자도입 동물의 종의 글리코실화 패턴 및 조성물 특성을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 유전자도입 동물에 의해 생성된 항체가 제공되고, 상기 항체는 가변 도메인에 연결된 불변 도메인을 포함하고, 여기서 가변 도메인은 a) 공통 경쇄 가변 도메인; 및 a) i. 2 내지 5개의 상이한 아미노산으로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 및 ii. 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 양태를 설명하고 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 원리 중의 일부는 하기 실시예에서 설명된다. 명백한 바와 같이, 하기 VK 유전자에 적용된 원리는 다른 경쇄 유전자에 적용될 수 있다.
실시예 1
돌연변이를 일으키지 않은 공통 경쇄를 갖는 유전자도입 닭의 제조
B 세포에서 항체 다양화의 메카니즘은 면역글로불린 유전자좌 중의 유전자에 주로 국한되기 때문에, 돌연변이를 일으키지 않은 공통 경쇄를 갖는 유전자도입 닭을 제조하는 한가지 접근법은 비-면역글로불린 조절 요소의 전사 조절하에 게놈 중의 또 다른 유전자좌에 경쇄를 삽입하는 것이었다(도 1). B 세포-특이적 발현은 B 세포에서만 Cre-매개된 재조합시에 활성화된 조건적 도입유전자를 사용하여 달성했다. B 세포에서만 Cre 재조합을 달성하기 위해, Cre 발현은 경쇄 유전자좌에 Cre 유전자를 삽입하여 B 세포-특이적으로 제조했다(도 2). 초기 B 세포 발달에서 경쇄 조절 요소에 의한 Cre 발현의 유도시에, Cre 재조합효소 활성은 공통 경쇄의 발현을 차단하는 정지 서열을 반복했다.
대안적 접근법은 경쇄 유전자좌에 사전-재배열된 V 영역을 삽입하고 모든 유사유전자를 상류로 제거하여 유전자 전환의 가능성을 제거하는 것일 수 있다(도 3 및 4).
실시예 2
결정 인간 중쇄와 쌍을 이루고 이를 발현하는 사전-재배열된 인간 VK 공통 경쇄에 대한 경쇄 라이브러리의 스크리닝
선택된 인간 중쇄 가변 영역과 양호하게 쌍을 이루는 인간 사전-재배열된 경쇄 가변 영역을 동정할 수 있다. 인간 VK3 계열 서열의 라이브러리는 결정 인간 VH3-23 유전자를 포함하는 발현 작제물로 293 세포에 동시-형질감염시킨다. 배양 상청액을 생성된 IgG의 수준에 대해 ELISA로 스크리닝한다. 생식세포 서열과 가장 유사한 인간 VK 서열이 바람직하다. 이러한 인간 VK 서열은 공통 경쇄로 지칭된다. 공통 경쇄 유전자는 인간 VK 영역 및 닭 경쇄 작제물 영역을 하나의 긴 개방 판독 프레임에 함유한다. 어떠한 인트론도 필요하지 않다.
실시예 3
닭 염색체 15 내로 사전-재배열된 인간 VK 유전자(공통 경쇄 )의 삽입
인간 VK 공통 경쇄는 B 세포에서 고도의 발현 수준을 보장하기 위해 닭 B-액틴 프로모터 또는 CAG 프로모터에 의해 유도한다(도 3). B 세포에서만 공통 경쇄의 고도 발현을 갖는 것이 바람직하기 때문에, 도입유전자는 Cre 재조합에 의해 활성화시킨다. lox2272 부위의 측면에 위치하는 하이그로마이신-내성 카세트는, 프로모터가 Cre 재조합 전에 하이그로마이신-내성 유전자의 발현을 유도하도록, 프로모터 영역과 공통 경쇄 유전자 사이에 위치시킨다. Cre 발현시, 하이그로 유전자는 절제되어, 단일 lox2272 부위를 잔류시키고, 프로모터가 공통 경쇄의 발현을 유도하는 것을 가능하게 한다. 작제물은 또한 염색질 절연체로서 작용하는 닭 B-글로빈 유전자좌로부터 HS4 부위를 함유한다.
공통 경쇄 도입유전자는 동질성 DNA 표적화 암을 사용하여 상동성 재조합에 의해 염색체 15 내로 삽입한다. 삽입 위치는, IgL-Cre 및 공통 경쇄 도입유전자가 존재할 필요가 있기 때문에, 하류 육종 전략이 단순화되도록, 내인성 경쇄 유전자좌에 충분히 근접하도록 선택된다. 경쇄 유전자좌를 둘러싸고 있는 닭 염색체 15 상에서, 500kb는 대략 2.5cM 또는 2.5% 재조합 빈도에 동일하다. 따라서, 닭 경쇄 유전자좌의 500kb 내의 공통 경쇄 유전자의 위치는, 공통 경쇄 도입유전자 및 Cre 도입유전자(하기 참조)가 약 98%의 시간에서 연결된 상태를 유지하는 것을 보장한다(도 7). 내인성 경쇄 유전자좌로부터 약 500kb 미만의 유전자간 영역은 공통 경쇄의 삽입을 위해 선택된다. 공통 경쇄 도입유전자의 돌연변이율을 증가시킬 수도 있는 잠재적 돌연변이 메카니즘을 회피하기 위해 내인성 경쇄 유전자좌에 과도하게 근접하지 않는 것이 바람직하다. IgL-Cre/공통 경쇄 염색체 또는 일배체는 단위로서 본질적으로 상속되어, 완전 인간 항체를 생성하기 위해 중쇄 도입유전자를 공통 경쇄와 조합하는데 필요한 하류 육종 전략을 크게 단순화시킨다.
염색체 15 내로 공통 경쇄를 삽입하기 위한 표적화 작제물은 표적화에 사용된 PGC 세포와 동등한 5' 및 3' 상동성 영역을 함유한다. 상동성 영역은, 서열이 당해 염색체와 동등한 것을 보장하기 위해, 세포에 존재하는 경쇄 유전자좌에 동형접합성인 조류의 게놈 DNA로부터 증폭시킨다. 이들 세포는 이전 경쇄 녹아웃 및 녹인 도입유전자에 사용되었고, 조류는 세포의 생식세포 전달에 의해 생성되었다. 교차 이형접합성 조류는 두 염색체 상에 경쇄 유전자좌 및 밀접하게 연결된 서열(예를 들면, 표적화를 위해 선택된 영역)을 포함하는 동형접합성 조류를 생성했다. 동형접합성 DNA로부터 상동성 영역의 클로닝은, 서열이 이미 표적화한 경쇄와 동일한 염색체로부터 유래하는 것을 보장한다. 닭 PGC에서, 상동성 영역이 정확하게 게놈에 정합하고, 심지어 몇몇 단일 뉴클레오티드 변화도 표적화 빈도를 억제하거나 심각하게 감소시킬 필요가 있다. 닭은 근친교배되지 않기 때문에, 표적화에 사용되는 PGC 세포는 서로에 대해 광범위한 단일 뉴클레오티드 다형태를 포함하는 염색체의 상이한 2개 세트를 함유하고, 하나의 대립인자에 정합하는 상동성 영역은 다른 대립인자에 대한 다형태를 함유하는 것이 보장된다. 정확한 서열 상동성에 대한 요구 때문에, 특정 대립인자를 위해 설계된 표적화 벡터는 당해 대립인자만을 표적화한다. 적어도 4kb 전체 길이의 상동성 영역은 표적화에 충분하다. 대안적으로, 표적화 영역에 인접한 이중 사슬 절단을 제조하기 위해 CRISPR과 조합하여 전체 1-2kb의 보다 짧은 상동성 영역을 또한 사용할 수 있다.
닭 B-액틴 또는 CAG(B-액틴 + CMV 중간-초기 인핸서) 등의 범용의 강력한 프로모터가 사용된다. PGC에서 표적화 사상의 선별을 위해 및 비-B 계통 세포에서 공통 경쇄의 발현을 차단하는 정지 서열로서 작용하기 위해, 하이그로마이신 내성 카세트는 프로모터와 공통 경쇄 사이에 위치된다. 하이드로마이신 카세트는, 공통 경쇄 유전자가 전사되지 않도록, 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 하이그로마이신 유전자 및 공통 경쇄 둘 다를 함유하는 긴 전사체가 제조되는 경우에, 하이그로 유전자의 긴 개방 판독 프레임 및 정지 코돈은 공통 경쇄의 전사를 방지할 것이다. lox511, lox2272 또는 lox5171 등의 대안적 loxP 부위는 하이드로마이신 카세트의 측면에 위치한다. 2개 도입유전자 사이에 재조합이 없도록, 자가 활성화 Cre 및 공통 경쇄 주변에 부정합 loxP 부위를 사용하는 것이 중요하다.
IgL-Cre/공통 경쇄 염색체를 포함하는 닭은 IgL 녹아웃 및 다양한 중쇄 도입유전자 등의 다른 도입유전자를 포함하는 닭과 육종된다(도 4). IgL 녹아웃 닭과의 육종은 내인성 닭 경쇄의 동형접합성 기능적 녹아웃을 갖는 조류를 생성한다(하나의 대립인자는 단일 녹아웃을 갖고, 다른 대립인자는 IgL-Cre 도입유전자를 갖는다). 공통 경쇄는 이들 닭에서 발현된 유일한 경쇄이다. IgL-Cre/공통 경쇄 염색체를 함유하는 조류는 공통 경쇄 및 인간 중쇄 녹아웃을 함유하는 조류를 생성하기 위해 중쇄 녹아웃과 교차시킨다. 이들 조류는 유전자형: 공통 경쇄/IgL 녹아웃; 인간 중쇄 녹인/IgH 녹아웃을 갖는 조류를 생성하기 위해 경쇄 녹아웃 및 인간 중쇄 녹인을 함유하는 조류와 육종한다(도 4).
대안적으로, 인간 VK 도입유전자는 phiC31 인테그라제를 사용하여 게놈에 무작위로 삽입한다.
실시예 4
IgL-Cre를 제조하기 위한 닭 IgL 유전자좌 내로 Cre 재조합효소 녹-인
Cre 발현 B-세포에 특이적으로 하기 위해, Cre 유전자를 닭 경쇄 유전자좌에 삽입하고, 이의 발현은 경쇄 프로모터 및 인핸서 요소에 의해 유도한다(도 5). 닭에서, 경쇄 및 중쇄 유전자 둘 다는 초기 B 세포 발달에서 동시에 재배열되고 발현되며, 대리 경쇄는 없다. 따라서, 경쇄 유전자좌로부터의 발현은 B 세포 수용체 발현이 중요한 B 세포 발달의 단계와 일치한다. Cre를 경쇄 유전자좌 내로 삽입하기 위해, 먼저 attP 부위를, phiC31 인테그라제를 사용하여 삽입용 도킹 부위로 작용하는 유전자좌로 표적화한다. 결정은 attP 부위 및 무프로모터 neo 유전자가 상동성 재조합에 의해 경쇄 유전자좌 내로 삽입되어 V, J 및 C 코딩 영역 및 인트론을 대체하는 경쇄 녹아웃을 생성했다. Cre 삽입 작제물은 B-세포 특이적 발현을 위한 닭 경쇄 프로모터에 연결된 Cre 유전자, 및 B-액틴 프로모터에 연결된 attB 부위를 함유한다. 경쇄 유전자좌에서 attP 부위 내로 작제물의 삽입시, B-액틴 프로모터는 neo 유전자의 발현을 유도하여 G418과의 정확한 통합의 선택을 용이하게 한다. 이어서, Cre 유전자는 유전자좌에서 내인성 경쇄 프로모터 및 인핸서 요소의 전사 조절하에 존재하여 B-세포 특이적 발현을 제공한다. 작제물은 순서대로 하기를 포함한다: attB 부위, B-액틴 프로모터, B-글로빈 HS4 염색질 절연체의 2개 카피, 닭 IgL 프로모터, Cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 토끼 글로빈 polyA 신호, 닭 IgL JC 인트로, loxP 부위. Cre 작제물의 삽입은, V 및 J 영역이 Cre로 대체되고 JC 인트론이 대체되지만 불변 영역이 부재하는 경쇄 유전자좌의 재구축을 유도한다.
또한, Cre 유전자는, Cre가 B-세포 계통에서 일시적으로만 발현되도록, 자가-불활성화시킬 수 있다. LoxP 부위는, B 세포 계통에서 발현 유도시에 생성된 Cre 재조합효소가 Cre 유전자를 절단하도록, Cre 유전자의 양측에 위치된다. 이 경우에, 변이체 loxP 부위(예를 들면, lox511, lox2272 또는 lox5171)는, 이들이 경쇄 유전자좌에서 Cre의 측면에 위치하는 고전적 loxP 부위와 조합되지 않도록, 인간 VK 도입유전자 중의 하이드로마이신 카세트를 플록스(flox)하기 위해 사용된다.
Claims (26)
- 공통 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 유전자도입 동물로서, 상기 공통 경쇄 도입유전자가 비-면역글로불린 경쇄 프로모터 및 공통 경쇄 코딩 서열을 포함하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 공통 경쇄가 구성적으로 발현되는, 유전자도입 동물.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 공통 경쇄 도입유전자가
i. 비-면역글로불린 경쇄 프로모터;
ii. 공통 경쇄 코딩 서열 및
iii. 개재 서열이 재조합효소에 의해 절제되지 않는 한, 상기 공통 경쇄가 발현되는 것을 방지하는 상기 개재 서열
을 포함하는 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자인, 유전자도입 동물. - 청구항 3에 있어서, 상기 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자의 상기 개재 서열이, 상기 재조합효소가 발현될 때 절제되는, 유전자도입 동물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 재조합효소-유도성 공통 경쇄 도입유전자의 상기 개재 서열이 재조합 부위의 측면에 위치하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 개재 서열이 선택 가능한 마커를 포함하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 선택 가능한 마커 카세트가 하류 전사를 방지하는 폴리아데닐화 부위를 함유하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소 도입유전자를 추가로 포함하되, 상기 재조합효소 도입유전자가 면역글로불린 경쇄 프로모터에 작동적으로 연결된 재조합효소 코딩 서열을 포함하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 프로모터가 내인성 면역글로불린 경쇄 프로모터인, 유전자도입 동물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 재조합효소 도입유전자가 자기 불활성화 재조합효소 도입유전자인, 유전자도입 동물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 자기 불활성화 재조합효소 도입유전자가 재조합 부위의 측면에 위치된 재조합효소 코딩 서열을 포함하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소가 Cre이고, 상기 재조합 부위가 lox 부위인, 유전자도입 동물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 재조합효소 도입유전자 및 상기 공통 경쇄 도입유전자가 유전적으로 연결된, 유전자도입 동물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 재조합효소 도입유전자와 상기 공통 경쇄 도입유전자 사이의 재조합이 최대 2.5%의 빈도로 발생하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 유전자도입 동물이 상기 유전적으로 연결된 도입유전자에 대해 이형접합성인, 유전자도입 동물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 유전자도입 동물이 상기 유전적으로 연결된 도입유전자에 대해 동형접합성인, 유전자도입 동물.
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 경쇄 코딩 서열이 사전 재배열된 가변 영역을 포함하는 공통 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 경쇄 코딩 서열이 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 인간 가변 영역을 인코딩하는, 유전자도입 동물.
- 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자도입 동물이 유전자도입 조류인, 유전자도입 동물.
- 청구항 19에 있어서, 상기 유전자도입 조류가 유전자도입 닭인, 유전자도입 조류.
- 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 경쇄 도입유전자가 상기 동물의 게놈의 내부에 존재하는 임의의 유사유전자를 포함하는 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 적어도 일부를 대체하는, 유전자도입 동물.
- 하이브리드 동물을 생성하는 방법으로서,
공통 경쇄를 생성하는 유전자도입 동물을 합성 중쇄 녹-인(knock-in)을 포함하는 게놈을 포함하는 제2 유전자도입 동물과 교배시키는 단계; 및
상기 교배의 자손을 수집하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 22에 있어서, 상기 합성 중쇄 녹-인이 인간 중쇄 녹-인인, 방법.
- 공통 경쇄를 갖는 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 항체가 항원에 대해 특이적이고, 상기 방법이
a) 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항의 유전자도입 동물을 상기 항원으로 면역화시키는 단계;
b) 면역화된 상기 유전자도입 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 제조하는 단계;
c) 상기 하이브리도마를 스크리닝하여 항원-특이적 하이브리도마를 동정하는 단계; 및
d) 상기 항원-특이적 하이브리도마로부터 항원-특이적 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 24에 있어서, 상기 합성 중쇄가 합성 인간 중쇄인, 방법.
- 청구항 24에 있어서, 상기 유전자도입 동물이 유전자도입 닭인, 방법.
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