KR20110089846A - 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키메라 항체를 인코딩하는 게놈을 갖는 녹-인 (knock-in) 인간 이외의 세포 및 포유동물, 및 녹-인 세포 및 포유동물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 측면은 키메라 항체, 인간화된 항체, 제약 조성물 및 키트를 포함한다. 본 발명의 특정 측면은 또한 본 발명의 항체를 이용한 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 35 U. S. C. § 119(e) 하의 2008년 10월 1일자로 제출된 미국 가특허 출원 제61/101,938호, 및 2008년 9월 30일자로 제출된 미국 가특허 출원 제61/101,597호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 두 가출원은 참고로 전문이 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 녹-인 (knock-in) 인간 이외의 포유동물 및 세포 및 키메라 면역글로불린 쇄 및 항체의 제조에 관한 것이다.
관련 분야의 서술
모노클로날 항체 (mAb)를 이용한 질환 치료는 의약에 대변혁을 일으켰고, mAb-기재 약물이 암, 자가면역, 염증, 황반 변성, 감염 등의 치료에 현재 이용되고 있다. 그러나, 질환 및 장애의 예방 및 치료에 사용하기 위한 mAb의 생성 및 발견을 위해 이용가능한 기술은 비능률, 충분한 효능의 부재 또는 상실, 특이성의 부재 또는 상실 및 치유적 mAb에 대한 면역 반응의 유도를 비롯한 심각한 문제점을 가지고 있다. 치료제로서 mAb를 사용하기 위한 첫 번째 시도는 mAb의 마우스 아미노산 조성물의 면역원성에 의해 저지되었다. 인간에게 투여하는 경우, 마우스 아미노산 서열은 약물의 효능 및 약력학을 극적으로 감소시킬 뿐만 아니라 심각하고 잠재적으로 치명적인 알레르기성 반응을 초래하는 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 끌어냈다.
mAb 치료제를 만들기 위한 추가적 방법은 인간 불변 영역에 부착된 마우스-유래된 가변 도메인을 합하는 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 키메라화된 mAb (cmAb)를 포함한다. 항체를 만드는 다른 방법은 mAb를 시험관 내에서 인간화하여 치유적 mAb에서 마우스 아미노산 서열의 양을 추가로 감소시키는 것을 포함한다. "완전한-인간" 항체를 시험관 내에서 생성하기 위해 개발한 항체-표시 기술은 생체 내 면역 반응 동안 발생하는 자연 항체 성숙 과정을 아직 적절히 모방하지 못하고 있다 (문헌 [pg. 1122-23, Lonberg, Nat. Biotech. (2005) 23:1117-1125] 참조). 이들 방법을 이용하여 개발된 mAb는 효능을 감소시키고/시키거나 생명을 위협할 수 있는 면역 반응을 끌어낼 수 있으며, 이들은 전형적으로 시간 소모적이며 값비싼 공정이다. 또한, 이들 방법에 내재하는 분자 과정 동안, 친화성의 손실 및 에피토프 이동이 발생할 수 있기 때문에, 효능 감소 및 특이성에서 바람직하지 않은 변화가 유도된다.
형질전환 마우스는 조작되어 인간 항체 전이유전자를 도입하여 비활성화된 마우스 면역글로불린 (Ig) 좌를 기능적으로 대체함으로써 완전 인간 항체를 제조한다. 그러나, 다수의 이들 형질전환 마우스 모델은 항체 개발 과정에서 중요한 성분, 예컨대 항체 가변 영역이 생성되는 유전자에서의 충분한 다양성, IgD를 만드는 능력 (문헌 [Loset et al., J. Immunol., (2004) 172:2925-2934]), 클래스 스윗치 재조합 (CSR)에 중요한 중요 시스 조절 요소, 또는 완전 기능적 3' 좌 제어 영역 (LCR) (예를 들어, 미국 특허 제7,049,426호; 및 문헌 [Pan et al., Eur. J. Immunol. (2000) 30:1019-1029])이 결여되어 있다. 몇 가지 형질전환 마우스는 통합된 전이유전자로서 효모 인공 염색체 또는 인간 작은 좌 (miniloci)를 함유한다. 다른 것은 유사분열 및 감수분열 불안정성의 다양한 빈도를 나타내는 전이염색체를 옮긴다. 또한, 이들 형질전환 마우스의 완전 인간 불변 영역은 정상 마우스와 비교하여, BCR 신호 형질도입 장치의 다른 내인성 및 트랜스-액팅 성분, 예를 들어, Igα 및 Igβ, 및 Fc 수용체 (FcR)과 함께 감소된 활성 때문에 차선적으로 기능한다.
마우스는 또한 유전적으로 조작되어 완전히 온전하게 남아있는 마우스 C 도메인에 부착된 인간 V 도메인과 J 유전자 클러스터의 모든 게놈 DNA 하류를 비롯한 완전히-온전한 및 변경된 부분으로 구성된 키메라 항체를 제조한다 (미국 특허 제5,770,429호 및 제6,596,541호 및 미국 특허 출원 공개공보 제2007/0061900호 참조). 이들 마우스로부터의 인간 V 영역은 회수되고, 분자 생물학적 방법에 의해 인간 불변 영역 유전자에 부착되고, 재조합체 방법에 의해 발현되어 완전-인간 항체를 제조할 수 있다. 인간 V 영역이 진화된 마우스 C 도메인의 맥락으로부터 제거된 후, 인간 C 영역에 부착되어 완전 인간 항체를 만드는 경우, 이들 마우스로부터의 항체는 활성, 효능, 용해성 등의 감소 또는 손실을 나타낼 수 있다.
치유적 mAb를 개발하는 현재의 방법은 초기 단계 발달 동안 선택되는 항체의 기능, 예컨대 용해성, 효능 및 항원 특이성을 변경시킬 수 있다. 게다가, 현재 방법에 의해 생성된 mAb는 투여시 위험한 면역 반응을 끌어낼 잠재력을 가지고 있다. 현재의 인간 및 키메라 항체 제조 마우스는, 예를 들어, 유전자 다양성, 시스 조절 요소, 트랜스 액팅 조절 요소, 신호전달 도메인, 유전자 안정성을 적절히 기능하게 하는 적당한 유전자 함량이 결여되어 있다. 면역 반응을 끌어내지 않으면서 항체 생성, 발견, 개발 및 제조 공정을 통해 효능 및 특이성을 보유하는 치유적 항체의 증진된 생성 및 발견을 위한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 그러한 항체의 제조 방법을 개발하는 것은 유익할 것이다. 본 발명은 형질전환 동물에서 그러한 항체를 생성하기 위한 해결책을 제공한다.
개요
본 발명은 녹-인 인간 이외의 포유동물 및 세포, 항체, 방법, (제약 조성물을 비롯한) 조성물 뿐만 아니라 본원에 개시된 다양한 실시양태의 키트에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 상기 키메라 항체의 가변 도메인으로부터 조작된 녹-인 인간 이외의 포유동물 및 세포 및 인간 항체 및 그의 단편에 의해 제조된 키메라 Ig 쇄 및 항체와 관련된 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 몇 가지 측면은, (1) 인간 VH 유전자 단편 및 (2) JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 게놈을 갖는 상동 재조합 수용성 (competent) 인간 이외의 포유동물 세포에 관한 것이며, 여기서 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체되고, 인간 VH 유전자 단편 및 동계 Ig 중쇄 좌는 내인성 Ig 중쇄, 또는 그의 일부분을 대체하여, 세포가 키메라 Ig 중쇄를 인코딩하는 게놈을 포함하도록 한다. 특정 실시양태에서, 일부분은 3' 좌 제어 영역 (LCR), 또는 그의 기능적 단편을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 인간 DH 유전자 단편을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포는 포유동물로부터의 DH 유전자 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, DH 유전자 단편은 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터, 및 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, DH 유전자 단편은 인간으로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 인간 CH1 도메인은 단일 CH 유전자 단편, 예를 들어, Cγ1 , Cγ2, 및 Cγ4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 세포는 인간 상부 힌지 유전자 단편을 추가로 포함한다. 관련된 실시양태에서, 세포는 인간 중간 힌지 유전자 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 힌지 유전자 단편은 IgG4 힌지 유전자 단편이다. 몇 가지 실시양태에서, 세린은 229 위치에서 프롤린 대신 치환된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 키메라 Ig 중쇄는 내인성 FcR을 결합시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 마우스 세포이다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 VH 유전자 단편을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계 (여기서, 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체됨); 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 VH 유전자 단편의 전부 또는 일부를 대체하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 중쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하여, 세포가 키메라 Ig 중쇄를 인코딩하는 게놈을 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 키메라 Ig 중쇄를 인코딩하는 게놈을 포함하는 상기 기재된 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 또는 제2 BAC는 인간 JH 유전자 단편을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 BAC는 제1 BAC의 3' 말단 근처의 제1 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하고, 제2 BAC는 제2 BAC의 5' 말단 근처의 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함한다. 관련된 실시양태는 부위-특이적 재조합효소를 발현시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열 사이의 개재 서열은 제거되었다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열은 loxP 또는 그의 변종이고, 부위-특이적 재조합효소는 CRE이다. 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열은 frt이고, 부위-특이적 재조합효소는 flp이다.
본 발명에 따른 세포를 제조하는 방법과 관련된 특정 실시양태에서, 제2 BAC의 도입 단계는 제1 BAC의 도입 단계 전에 일어난다.
본 발명의 몇 가지 측면은 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 게놈을 갖는 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포에 관한 것이며, 여기서 인간 Ig 경쇄 좌는 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하여, 세포가 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 인코딩하는 게놈을 포함하도록 한다. 한 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 인간 Igκ 가변 영역을 포함한다. 관련된 실시양태에서, Ig 경쇄 좌는 인간 Igκ 불변 영역을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 인간 Igλ 경쇄 좌 및 Igλ 3'LCR의 전부 또는 일부분, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 전체 인간 Igλ 좌를 포함한다. 다른 실시양태에서 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하며, 여기서 인간 Cλ는 동계 Cλ로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7 인간 Jλ 유전자 단편, 및 단일 인간 Cλ 유전자 단편을 포함하며, 여기서 인간 유전자 단편은 인간 Igλ 좌 배열과 유사하다. 특정 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 인간, 인간 이외의 영장류, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터 얻는다. 한 실시양태에서 Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 인간으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 NFκb와 결합한다. 한 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 마우스로부터 얻으며, NFκb의 결합을 회복시키도록 돌연변이화된다. 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 좌에서의 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 Igκ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편이다.
특정 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 마우스 세포이다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하는 단계; 및 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 대체하여 세포가 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 인코딩하는 게놈을 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 인코딩하는 게놈을 포함하는 상기 기재된 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 인간 Igκ 가변 영역을 포함한다. 관련된 실시양태는 인간 Igκ 불변 영역을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하는 단계; 및 내인성 Igκ 불변 영역의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 BAC는 제1 BAC의 3' 말단 근처의 제1 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하고, 제2 BAC는 제2 BAC의 5' 말단 근처의 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함한다. 관련된 실시양태에서, 상기 방법은 부위-특이적 재조합효소를 발현시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열 사이의 개재 서열은 제거된다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열은 loxP 또는 그의 변종이고, 부위-특이적 재조합효소는 CRE이다. 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열은 frt이고, 부위-특이적 재조합효소는 flp이다.
본 발명에 따른 세포의 제조 방법과 관련된 특정 실시양태에서, 제2 BAC의 도입 단계는 제1 BAC의 도입 단계 전에 일어난다.
특정 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 인간 Igλ 경쇄 좌 및 Igλ 3'LCR의 전부 또는 일부분, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Igλ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 관련된 실시양태는 인간 Igλ 불변 영역을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하는 단계; 및 내인성 Igλ 불변 영역의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계를 추가로 포함한다. 몇 가지 실시양태에서, 제1 BAC는 제1 BAC의 3' 말단 근처의 제1 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하고, 제2 BAC는 제2 BAC의 5' 말단 근처의 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함한다. 관련된 실시양태에서, 방법은 부위-특이적 재조합효소를 발현시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열 사이의 개재 서열은 제거된다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열은 loxP 또는 그의 변종이고, 부위-특이적 재조합효소는 CRE이다. 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열은 frt이고, 부위-특이적 재조합효소는 flp이다.
특정 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하며, 여기서 인간 Cλ는 동계 Cλ로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7 인간 Jλ 유전자 단편, 및 단일 인간 Cλ 유전자 단편을 포함하고, 여기서 상기 인간 유전자 단편은 인간 Igλ 좌 배열과 유사하다. 관련된 방법은 도입 단계 전에 스플라이스 서열의 BAC로의 혼입을 확인하고, 아직 BAC로 혼입되지 않은 경우, 스플라이스 서열을 혼입하는 것을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 단편은 클러스터 A를 포함한다. 관련된 실시양태는 클러스터 B 인간 Vλ 유전자 단편을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제2 BAC를 상기 세포로 도입하는 단계; 및 내인성 Vλ 유전자 단편을 대체하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 실시양태에서, 제2 BAC는 인간 클러스터 C Vλ 유전자 단편을 추가로 포함한다.
본 발명의 몇 가지 측면은 (1) 인간 Ig 좌, 또는 그의 일부분, 및 (2) 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 게놈을 갖는 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포에 관한 것이며, 여기서 인간 Ig 좌 및 FcR 유전자는 내인성 영역을 대체하며, 여기서 게놈은 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 인코딩한다. 특정 실시양태에서, 인간 Ig 좌는 JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하는 인간 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하여, 인간 Ig 중쇄의 일부분이 인간 FcR과 맞물리도록 한다. 특정 실시양태에서, 세포는 인간 이외의 배아 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 마우스 세포이다.
본 발명의 특정 측면은, 인간 Ig 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 및 제2 BAC를 상기 세포로 도입하고 상동 재조합을 통해 FcR 유전자의 내인성 클러스터를 대체하여, 세포가 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 인코딩하는 게놈을 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 인코딩하는 게놈을 갖는 상기 기재된 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 (1) 인간 VH 유전자 단편 및 (2) JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 게놈을 갖는 녹-인 인간 이외의 포유동물에 관한 것이며, 여기서 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체되고; 여기서 인간 VH 유전자 단편 및 동계 Ig 중쇄 좌는 내인성 Ig 중쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하여, 포유동물이 키메라 Ig 중쇄를 제조할 수 있도록 한다.
한 실시양태에서, 포유동물은 인간 JH 유전자 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 일부분은 3' 좌 제어 영역 (LCR), 또는 그의 기능적 단편을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 포유동물은 포유동물로부터의 DH 유전자 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, DH 유전자 단편은 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터 및 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, DH 유전자 단편은 인간으로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 인간 CH1 도메인은 단일 CH 유전자 단편, 예를 들어, Cγ1 , Cγ2, 및 Cγ4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간 상부 힌지 유전자 단편을 추가로 포함한다. 관련된 실시양태에서, 세포는 인간 중간 힌지 유전자 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 힌지 유전자 단편은 IgG4 힌지 유전자 단편이다. 몇 가지 실시양태에서, 세린은 229 위치에서 프롤린 대신 치환된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 키메라 Ig 중쇄는 내인성 FcR과 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 게놈을 갖는 녹-인 인간 이외의 포유동물에 관한 것이며, 여기서 상기 인간 Ig 경쇄 좌는 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하여, 상기 포유동물이 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 제조할 수 있도록 한다.
한 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 인간 Igκ 가변 영역을 포함한다. 관련된 실시양태에서, Ig 경쇄 좌는 인간 Igκ 불변 영역을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 인간 Igλ 경쇄 좌 및 Igλ 3'LCR의 전부 또는 일부분, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 전체 인간 Igλ 좌를 포함한다. 다른 실시양태에서 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하며, 여기서 인간 Cλ는 동계 Cλ로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7 인간 Jλ 유전자 단편, 및 단일 인간 Cλ 유전자 단편을 포함하며, 여기서 인간 유전자 단편은 인간 Igλ 좌 배열과 유사하다. 관련된 실시양태에서, 키메라 항체는 재배열하고 발현시켜 Igκ에 대한 Igλ의 비율이 40:60 보다 더 커졌다. 특정 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 인간, 인간 이외의 영장류, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터 얻는다. 한 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 인간으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 NFκb와 결합한다. 한 실시양태에서, Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 마우스로부터 얻고, 돌연변이화시켜 NFκb의 결합을 회복시키도록 한다. 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 좌에서 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편은 Igκ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편이다.
특정 실시양태에서, 상기 기재된 키메라 Ig 중쇄를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물은 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 추가로 포함하며, 여기서 인간 Ig 경쇄 좌는 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체한다.
본 발명의 다른 측면은 (1) 인간 Ig 좌, 또는 그의 일부분, 및 (2) 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 게놈을 갖는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 제공하며, 여기서 인간 Ig 좌 및 FcR 유전자는 이종상동성 (orthologous) 내인성 영역을 대체하고, 여기서 포유동물은 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 Ig 좌는 인간 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하며, 상기 일부분은 JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하여 상기 Ig 중쇄가 인간 FcR과 맞물리도록 한다. 관련된 실시양태에서, 인간 Ig 중쇄 좌는 인간 가변 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 추가로 포함하며, 여기서 상기 인간 Ig 경쇄 좌는 내인성 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 대체하여, 녹-인 인간 이외의 포유동물은 인간 항체 및 인간 FcR을 제조할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 녹-인 인간 이외의 포유동물은 마우스이다.
다른 실시양태는 본 발명에 따른 녹-인 인간 이외의 포유동물에 의해 제조된 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 인간 Ig 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부분을 포함한다. 한 실시양태는 본 발명에 따른 녹-인 인간 이외의 포유동물을 표적 항원으로 면역화하고, 인간 Ig 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부분을 포함하는 항체를 회수하는 것을 포함하는, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 항체를 항체의 일부분을 인식하는 2차 검출제로 검출하는 것을 포함하는, 표적 항원의 검출 방법을 제공한다. 관련된 실시양태에서, 일부분은 항체의 Fc 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 항체의 Fab 도메인, 항체의 F(ab')2 도메인, Cκ 도메인, 또는 항체의 Cλ 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 상기 표적 항원의 조직 분포를 평가하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태는 본 발명에 따른 항체 및 제약적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명에 따른 항체 및 상기 항체의 용도에 대한 지침서를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 (2) 인간 불변 영역의 나머지 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 부착된 (1) 본 발명에 따른 항체의 인간 유전자 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 인간화된 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 인간 유전자 단편은 인간 V 영역 유전자 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 인간화된 항체 및 제약적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 인간화된 항체 및 상기 항체의 용도에 대한 지침서를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 인간 VH 유전자 단편을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계 (여기서 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체됨); 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 VH 유전자 단편을 대체하는 단계; 제2 BAC를 상기 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 중쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 및 상기 세포로부터 키메라 Ig 중쇄를 생성할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 키메라 Ig 중쇄를 제조할 수 있는 포유동물의 제조 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 또는 제2 BAC는 인간 JH 유전자 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발생 단계는 배반포 미세주입, 상실배 응집, 또는 체세포 핵 이식을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 이종상동성 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 상기 세포로부터 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 인간 Ig 경쇄를 제조할 수 있는 포유동물의 제조 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 Igκ 가변 영역을 포함한다. 추가적 실시양태는 인간 Igκ 불변 영역을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하는 단계; 및 내인성 Igκ 불변 영역의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 포유동물의 제조 방법과 관련된 특정 실시양태에서, 제2 BAC의 도입 단계는 제1 BAC의 도입 단계 전에 일어난다.
한 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 좌는 상동 재조합을 통해 이종상동성 내인성 Igλ 좌 및 3' LCR을 대체하는 인간 Igλ 경쇄 좌 및 Igλ 3'LCR의 전부 또는 일부분, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 관련된 실시양태에서, Igλ는 Igκ에 대하여 약 40:60의 비율에서 발현되었다. 또 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 전체 인간 Igλ 좌를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하며, 여기서 인간 Cλ는 동계 Cλ로 대체된다.
한 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 좌는 인간 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7 Jλ 유전자 단편, 및 단일 Cλ 유전자 단편을 포함하며, 여기서 유전자 단편은 인간 Igλ 배열과 유사하도록 복원된다. 관련된 실시양태에서, 방법은 도입 단계 전에 스플라이스 서열의 BAC로의 혼입을 확인하고, 아직 BAC로 아직 혼입되지 않은 경우, 스플라이스 서열을 혼입하는 것을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서 Igλ 좌는 효율적으로 재배열하여 40:60 이상의 Igκ에 대한 Igλ의 보다 높은 비율을 초래한다. 한 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 단편은 클러스터 A를 포함한다. 관련된 실시양태는 클러스터 B 인간 Vλ 유전자 단편을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하는 단계; 내인성 Vλ 유전자 단편을 대체하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 관련된 실시양태에서, 제2 BAC는 인간 클러스터 C Vλ 유전자 단편을 추가로 포함한다.
본 발명의 한 측면은, 키메라 Ig 중쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물 (여기서, Ig 중쇄 좌는 (1) 인간 VH 유전자 단편 및 (2) JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하며, 여기서 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체됨)을 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물과 함께 육종하는 단계; 키메라 Ig 중쇄 좌 및 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 자손을 추가로 육종하는 단계; 및 키메라 중쇄 및 인간 경쇄 좌에 대해 동형접합성인 게놈을 갖는 자손을 제조하는 단계를 포함하는, 키메라 Ig 중쇄 및 인간 Ig 경쇄를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태는, 인간 Ig 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 제2 BAC를 상기 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 FcR 유전자의 내인성 클러스터의 전부 또는 일부를 대체하는 단계; 상기 세포로부터 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 인코딩하는 게놈을 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 제조할 수 있는 포유동물의 제조 방법에 관한 것이다. 관련된 실시양태에서, 인간 Ig 좌는 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하며, 상기 일부분은 JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하여 상기 Ig 중쇄가 인간 FcR과 맞물리도록 한다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 Ig 중쇄 좌를 포함하는 제1 BAC, 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 제2 BAC, 및 인간 FcR 유전자 단편의 클러스터를 포함하는 제3 BAC를 제조하는 단계; 제1, 제2 및 제3 BAC를 순차적으로 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 중쇄, Ig 경쇄, 및 FcR 유전자 단편 클러스터를 각각 대체하는 단계; 및 상기 세포로부터 인간 항체를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 인간 FcR과 맞물리는 인간 항체를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태는 인간 Ig 중쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물 (여기서, 상기 Ig 중쇄 좌는 JH의 인간 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함함)을 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물과 함께 육종하는 단계; 인간 Ig 중쇄 좌 및 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 자손을 추가로 육종하는 단계; 및 인간 중쇄 및 경쇄 좌에 대해 동형접합성인 게놈을 갖는 자손을 제조하는 단계를 포함하는, 인간 항체 및 인간 FcR을 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법에 관한 것이다.
면역 반응을 끌어내지 않으면서 항체 생성, 발견, 개발 및 제조 공정을 통해 효능 및 특이성을 보유하는 치유적 항체의 증진된 생성 및 발견을 위한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 그러한 항체의 제조 방법을 개발하는 것은 유익할 것이다. 본 발명은 형질전환 동물에서 그러한 항체를 생성하기 위한 해결책을 제시한다.
도 1은 순차적 상동 재조합 단계를 통해 키메라 Ig 중쇄의 도입을 도시한다. 도 1A, 도 1B, 도 1C는 IgH 좌의 상동 재조합 과정 동안 선택 및 스크리닝 단계의 단계 l, 단계 2, 및 단계 3을 각각 제시하는 도표이다.
도 2는 순차적 상동 재조합 단계를 통한 인간 Igκ 좌의 도입을 도시한다. 도 2A 및 도 2B는 Igκ 좌의 상동 재조합 동안 선택 및 스크리닝 단계의 단계 1 및 단계 2를 각각 제시한 도표이다.
도 3은 순차적 상동 재조합 단계를 통한 인간 Igλ 좌의 도입을 도시한다. 도 3A 및 도 3B는 Igλ 좌의 상동 재조합 과정 동안 선택 및 스크리닝 단계의 단계 1 및 단계 2를 각각 제시하는 도표이다.
도 4A는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제1 BAC의 마우스 IgH 좌로의 도입을 도시하는 도표이다. 도 4B는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제2 BAC의 마우스 IgH 좌로의 도입을 제시하는 도표이다. 도 4C는 기능적 부위-특이적 재조합효소의 도입을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열 사이에서의 개재 서열의 제거를 도시하는 도표이다.
도 5A는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제1 BAC의 마우스 Igκ 좌로의 도입을 도시하는 도표이다. 도 5B는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제2 BAC의 마우스 Igκ 좌로의 도입을 제시하는 도표이다. 도 5C는 기능적 부위-특이적 재조합효소의 도입을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열 사이에서의 개재 서열의 제거를 도시하는 도표이다.
도 6A는 상동 재조합을 통한 제1 BAC의 마우스 Igλ 좌로의 도입을 도시하는 도표이다. 도 6B는 제2 BAC의, 제1 BAC의 일부분 및 내인성 마우스 Igλ 좌의 일부분과 상동적으로 재조합되는 마우스 Igλ 좌로의 도입을 제시하는 도표이다.
<상세한 설명>
개요
본 발명은 키메라 또는 인간화된 항체를 제조하는 녹-인 인간 이외의 포유동물, 그러한 녹-인 인간 이외의 세포 및 포유동물의 제조 방법, 및 이로써 제조된 항체를 포함하는 조성물 및 키트를 포함한다.
구체적으로는, 본 발명의 실시양태는 키메라-항체를 제조하는 인간 이외의 포유동물 및 세포, 및 상기 포유동물 및 세포의 제조 방법을 제공한다. 항체를 제조하는 포유동물에서, 내인성 면역글로불린 (Ig) V, (D) 및 J 유전자는 배아 줄기 세포에서 상동 재조합을 이용하여 본원에 기재된 방법에 의해, 예컨대 인간 V, D 및 J 유전자의 큰 부분을 운반하는 BAC를 사용하여 그의 인간 이종상동체 (ortholog)에 의해 대체되고, 적당한 상동성 표적화 DNA가 측면에 위치하여 (flank) 내인성 IgH 좌로의 높은-빈도의 상동 재조합을 촉진하도록 한다. 이는 단일 대체에서 각각의 Ig 좌에서, 순차적 ("보행 (walking)") 대체에 의해, 또는 좌의 일부분을 대체한 후 개재 서열을 제거함으로써 이루어질 수 있다. JH의 상기 IgH 좌 하류의 전부 또는 일부를 운반하는 BAC는, 각각의 불변 영역 유전자에서 이. 콜라이 (E. coli)의 BAC로 운반된 DNA의 아주 정밀한 변형을 만드는 능력을 사용하여 내인성 CH1 도메인이 인간 CH1 도메인으로 대체되도록 조작될 수 있다. 별법으로, JH의 IgH 좌 하류의 전부 또는 일부를 운반하는 BAC는, 각각의 불변 영역 유전자에서 인간 및 다른 유기체, 예컨대 마우스의 공개된 게놈 서열에 기초한 DNA를 정밀하게 합성 및 조립하는 능력을 이용하여 내인성 CH1 도메인이 인간 CH1 도메인으로 대체되도록 조작될 수 있다. 그러한 합성 및 조립은 당업계에 공지되어 있으며, 상업적 단체에 의해 실행된다 (예를 들어, DNA2.0 (Menlo Park, CA; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA)).
내인성 Ig 좌를 인간 Ig 좌의 성분으로 대체하여 1차 및 2차 면역 반응 동안 생체 내에서 최적화된 인간 V 도메인을 제조하는 종합적 전략의 이점은 변경된 좌의 총수가 이용가능한 전략과 비교하여 감소된 것이다. 본 발명의 전략은 육종 과정을 매우 간소화하는 2 또는 3 변경된 좌를 이용함으로써, 다른 유용한 돌연변이를 유전자 배경으로 도입하는 기회를 제공한다. 그러한 유용한 돌연변이는 종들 사이에서 매우 높게 보존된 인간 항원에 대한 항체를 보다 효율적으로 발생시키도록 면역 관용을 중단하는 것을 돕는 것을 포함할 수 있다. 여기에는 CD19의 형질전환 과발현, 억제 수용체 FcγRIIb, lpr 또는 다른 자가면역 되기 쉬운 돌연변이의 녹아웃 (knockout), 항원에 대한 유전자의 녹아웃, 또는 특이적 유전자, 예컨대 항원의 발현을 침묵시키도록 (silence) 조작된 아연-집게 (zinc-finger) 전이유전자가 포함된다.
내인성 Ig 좌를 인간 Ig 좌의 성분으로 대체하는 종합적 전략의 다른 이점은 내인성 좌 외부의 염색체의 위치에 삽입된 인간 Ig 전이유전자 사이에서 일어난 트랜스 재조합 및 트랜스 스윗칭 (switching)을 배제한다는 것이다. 그러한 트랜스 재조합 및 트랜스 스윗칭 사건으로부터 초래된 Ig 쇄 생성물은 인간-내인성 Ig 서열에 대해 키메라지만, 전이유전자에서 조작된 생성물 고안으로부터 벗어난다.
또 다른 별법은 인간 C 영역을 비롯한 완전 인간 Ig 좌를 완전한 내인성 Ig 좌의 자리에 혼입하고, 또한 내인성 FcR 유전자의 클러스터를 인간 FcR 유전자의 이종상동성 클러스터로 상동 재조합 수용성 세포, 예컨대 ES 세포에서 유사한 BAC-기재 유전자 조작을 이용하여 대체하는 것이다. 이러한 방식으로 완전 인간 항체가 제조될 수 있고, 면역 반응 동안, 이들 인간 항체는 정상적으로 인간 FcR와 맞물릴 수 있다. 모델에 대한 적당한 유전자 배경, 즉, SCID, nu/nu, nod, 및 lpr 마우스를 육종시, 그러한 동물은 또한 질환의 동물 모델에서 인간 치유적 mAb 후보자의 이펙터 (effector) 기능의 활성에 대해 시험하기에 유용한 이점을 가질 수 있다. 또한, 인간 표적 유전자 서열은 항체의 표적 확인 및 기능성 시험을 위한 모델을 제공하는, 상동 재조합-수용성 세포, 예컨대 ES 세포에서 BAC 표적화 기술을 이용하여 내인성 유전자를 대체할 수 있다.
다른 실시양태는 CH1-힌지-CH2-CH3(-CH4)를 포함하는 인간 C 영역을 비롯한 완전 인간 Ig 및 동족의 동계, 예를 들어, 마우스, 막 및 세포내 도메인을 포함하여 천연 세포내 신호 형질도입을 제공하고, B-세포 수용체에 있는 IgH의 Igα및 Igβ와의 연계가 가능하게 하여, 그 안에 B-세포 수용체를 함유하는 Igα, Igβ 및 IgG로부터의 뮤린형 신호전달을 허용한다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 불변 영역의 막 및 세포내 도메인은 동일한 또는 비-동족의 마우스 중쇄 이소타입으로부터 얻는다. 불변 영역 유전자의 그러한 조작은 하기 상술된 바와 같이 본 발명의 방법을 이용하여 용이하게 달성될 수 있다.
이러한 방식으로 키메라 항체를 조작하면, 제1 C 영역으로부터 시험관 내 스윗칭으로부터 생성된 V 도메인 형태, 특히 CH1 도메인, 및 생체 내 면역 반응 동안 제2 C 영역으로 발달되는 하나의 종, 예를 들어, 마우스로부터의 힌지 영역의 임의의 일부분, 특히 CH1 도메인, 및 다른 종, 예를 들어, 인간으로부터의 힌지 영역의 임의의 일부분에서의 변경을 방지한다. 본 발명의 녹-인 동물에 의해 제조된 항체는 인간 V 영역이 인간 C 영역에 부착되어 완전 인간 항체를 만들 경우 다른 키메라 항체를 제조하는 동물로부터의 항체에서 보여진 활성 및 효능의 감소 또는 손실을 나타내지 않았으며, 이는 CH1 도메인의 변화로부터 초래된 VH 도메인의 변경된 형태, 및/또는 마우스로부터 인간 불변 영역으로 스윗칭하는 경우, 상부 힌지 영역의 변경된 길이 또는 가용성으로 인한 항원 결합에서의 차이 (길이, 및 조성이 가변적인, 상호-중쇄 이황화결합을 형성하는 힌지에서의 CH1의 말단부터 첫 번째 시스테인 잔기까지의 펩티드 서열)에 의해서 야기될 수 있다 (문헌 [Roux et al., J. Immunology (1997) 159:3372-3382] 및 그 안의 참조 문헌). 중간 힌지 영역은 상호-중쇄 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기에 의해 결합된다.
정의
특정 실시양태를 상술하기 전에, 본 발명은 달라질 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 체계로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 예시적 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 및 각각의 용어가 사용된 구체적 문맥에서 당업계에서 그의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 하기에서 또는 본 명세서의 다른 부분에서 논의되며, 본 발명의 조성물 및 방법을 기술함에 있어서 당업자에게 추가적 안내 및 이를 어떻게 제조하고 사용하는지를 제공하기 위함이다. 용어의 임의의 사용 범주 및 의미는 용어가 사용되는 구체적 문맥으로부터 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 정의는 특정 조성물 또는 생물학적 체계로 제한하지 않으면서, 본 발명의 특정 실시양태를 확인하는 데 있어서 예시적 안내를 제공하려 함이다. 본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같은, 단수 형태 "한", "하나의" 및 "그"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 특이적 항원을 인식하고 결합하며, 막 결합 또는 분비될 수 있는 B 세포에 의해 제조된 단백질 분자를 나타낸다. 항체는 모노클로날일 수 있으며, 그런 점에서 이는 B 세포의 단일 클론에 의해 제조되고, 따라서 동일한 에피토프를 인식하고 동일한 핵산 및 아미노산 서열을 가지며, 또는 항체는 폴리클로날일 수 있는데, 그런 점에서 이는 B 세포의 다중 클론에 의해 제조되고, 동일한 항원의 하나 이상의 에피토프를 인식하고 전형적으로 상이한 핵산 및 아미노산 서열을 갖는다.
항체, 또는 Ig 분자는 이황화결합을 통해 함께 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 전형적으로 구성된다. 중쇄 (IgH) 및 경쇄 (IgL) 둘 다는 가변 (V) 영역 또는 도메인 및 불변 (C) 영역 또는 도메인을 함유한다. V 영역을 인코딩하는 IgH 좌의 일부분은 가변 (V), 다양성 (D), 및 결합 (J) 유전자 단편의 다중 카피를 포함한다. V 영역을 인코딩하는 IgL 좌, Igκ 및 Igλ의 일부분은 V 및 J 유전자 단편의 다중 카피를 포함한다. IgH 및 IgL 좌의 V 영역 인코딩 부분은 유전자 재배열, 예를 들어, 유전자 단편 배열의 상이한 조합이 이루어져 IgH 및 IgL 가변 영역을 형성하고, 항체에서 다양한 항원 특이성을 발달시킨다. IgH C 영역의 분비된 형태는 3개의 C 도메인, CH1, CH2, CH3, 임의의 CH4 (Cμ), 및 힌지 영역으로 구성된다. IgH C 영역의 막-결합 형태는 또한 막 및 세포내 도메인을 갖는다. IgH 불변 영역은 항체의 이소타입, 예를 들어 IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgE를 결정한다. 다중 Ig 이소타입을 인코딩하는 인간 이외의 포유동물은 이소타입 클래스 스윗칭이 이루어질 수 있음이 인정될 것이다. 2가지 유형의 IgL, Igκ 및 Igλ가 존재한다.
"Fab" 도메인 또는 단편은 V 영역 및 IgH의 CH1 도메인, 및 전체 IgL을 포함하는 IgH의 N-말단 일부분을 포함한다. "F(ab')2" 도메인은 Fab 도메인 및 힌지 영역의 일부분을 포함하며, 여기서 두 IgH는 중간 힌지 영역에서 이황화 연결을 통해 함께 연결된다. Fab 및 F(ab')2 둘 다는 "항원-결합 단편"이다. CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgH의 C-말단 부분은 "Fc" 도메인이다. Fc 도메인은 세포 수용체, 예컨대 FcR에 의해 인식된 Ig의 일부분이며, 여기에 상보체-활성화 단백질인 C1q가 결합한다. CH2 엑손의 5' 부분에 인코딩된 낮은 힌지 영역은 FcR 수용체에 결합하기 위해 항체 내에 가요성을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 항체"는 인간 및 인간 이외의 포유동물 둘 다의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 번역된 항체를 나타낸다. "인간화된" 항체는 인간 이외의 세포 또는 포유동물에 의해 제조된 것이며, 인간 서열, 예를 들어, 키메라 항체를 포함한다. 인간화된 항체는 다른 종으로부터 제조된 비-인간화된 항체와 비교하는 경우, 인간에 투여한 후에 덜 면역성이다. 게다가, 본 발명의 인간화된 항체는 조작된 녹-인 인간 이외의 포유동물로부터 단리되어 완전 인간 항체 분자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 인간 불변 영역에 부착된 키메라 항체의 인간 가변 영역을 포함하여 완전 인간 항체를 제조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 Ig 쇄"는 인간 및 인간 이외의 동물 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 번역된 Ig 중쇄 또는 Ig 경쇄를 나타낸다. 예를 들어, 키메라 Ig 중쇄는 인간 VH, DH, JH, 및 CH1 유전자 단편 및 마우스 CH2 및 CH3 유전자 단편을 포함할 수 있다.
"폴리펩티드," "펩티드" 또는 "단백질"은 화학 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 쇄를 설명하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드 또는 단백질은 IgH, IgL, V 도메인, C 도메인, 또는 항체일 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 화학 결합에 의해 함께 연결된 핵산의 쇄를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는, 여기에 제한되지는 않지만, DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 유전자 서열 및 단편을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 생존하는 공급원, 예컨대 진핵생물 세포, 원핵생물 세포 또는 바이러스로부터 단리될 수 있거나, 또는 분자 생물학의 표준 기술의 사용, 또는 DNA 합성, 또는 다수의 기술의 조합에 의해 시험관 내 처리에 의해 유도될 수 있다.
"좌"는 하나 이상의 유전자 또는 엑손, 예컨대 IgH 또는 Igκ 좌, 시스 조절 요소, 및 트랜스-액팅 인자가 결합하는 결합 영역을 포함하는 염색체 상의 위치를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, "유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 폴리펩티드 또는 그의 일부분, 예컨대 VL 도메인, CH1 도메인, 상부 힌지 영역, 또는 그의 일부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 "유전자 단편" 및 "엑손"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부분을 나타낸다. 유전자, 또는 유전자 단편은 하나 이상의 인트론, 전사적 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 비-코딩 영역, 예를 들어, 시스 조절 요소, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 비번역된 영역, 폴리아데닐화 부위를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "내인성"은 세포 또는 동물 내에서 자연적으로 발생한 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "이종상동성"은 다른 종에서 상응하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 인간 CH1 도메인 및 마우스 CH1 도메인을 나타낸다. 용어 "동계"는 동일한 종의 동물로 도입될 수 있는 동일한 종 내에서 발견된 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 마우스 Igκ 좌로 도입된 마우스 Vκ 유전자 단편을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상동" 또는 "상동 서열"은 다른 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편과 매우 유사한 서열, 또는 높은 백분율 동일성 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 구조물은 그 특이적 위치에서 재조합을 촉진하기 위해 내인성 DNA 서열의 일부분에 상동인 서열을 포함할 수 있다. 상동 재조합은 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 일어날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "측면 서열" 또는 "측면 DNA 서열"은 내인성 DNA 서열 또는 이전에 재조합된 비-내인성 서열, 또는 그의 일부분에 상동인 DNA 구조물에서 비-내인성 DNA 서열에 인접한 DNA 서열을 나타낸다. 본 발명의 DNA 구조물은 하나 이상의 측면 서열, 예를 들어, 비-내인성 서열의 3' 및 5' 말단 상의 측면 서열 또는 비-내인성 서열의 3' 또는 5' 말단 상의 측면 서열을 가질 수 있다.
어구 "상동 재조합-수용성 세포"는 상동성의 중복 영역을 함유하는 DNA 단편을 상동 재조합할 수 있는 세포를 나타낸다. 상동 재조합-수용성 세포의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 유도된 분화다능 줄기 세포, 조혈모세포, 박테리아, 효모, 다양한 세포주 및 배아 줄기 (ES) 세포가 포함된다.
"인간 이외의 포유동물"은 포유류에 속하는 인간 이외의 다른 동물을 나타낸다. 인간 이외의 포유동물의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 인간 이외의 영장류, 설치류, 소류, 양류, 말류, 개, 고양이, 염소, 양, 돌고래, 박쥐, 토끼, 및 유대류가 포함된다. 바람직한 인간 이외의 포유동물은 유전자 전환 및/또는 체세포 과다 돌연변이에 주로 의지하여 항체 다양성, 예를 들어, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 및 소를 발생시킨다. 특히 바람직한 인간 이외의 포유동물은 마우스이다.
용어 "녹-인" 또는 "형질전환"은 그의 게놈으로 혼입된 다른 종으로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 전이유전자를 포함하는 세포 또는 동물을 나타낸다. 예를 들어, 내인성 마우스 IgH 좌 외부의 그의 게놈으로 통합된 인간 VH 유전자 단편을 함유하는 마우스는 형질전환 마우스이며; 내인성 마우스 IgH 좌에서 내인성 마우스 VH를 대체하는 그의 게놈으로 통합된 인간 VH 유전자 단편을 함유하는 마우스는 형질전환 또는 녹-인 마우스이다. 녹-인 세포 및 인간 이외의 포유동물에서, 다른 종으로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 세포 또는 인간 이외의 포유동물에서 처음에는 발견된 상응하는, 또는 이종상동성인 내인성 서열을 대체할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간화된" 동물은 유사한 인간 서열로 대체되는 본래의 유전자 구성의 하나 이상의 유전자 단편 및/또는 유전자 조절 서열 이외에, 마우스 또는 다른 인간 이외의 동물의 유전자 서열을 보유하는 복합체 유전자 구조를 갖는 인간 이외의 동물, 예를 들어, 마우스를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 벡터의 복제 능력의 손실 없이 다른 핵산 단편으로 통합될 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 벡터는 바이러스, 플라스미드 또는 고등 유기체의 세포로부터 유래할 수 있다. 벡터를 이용하여 외래 또는 재조합체 DNA를 숙주 세포로 도입하며, 여기서 벡터는 복제된다.
폴리뉴클레오티드 작용제는 폴리뉴클레오티드의 표적 세포로의 도입을 비롯한 폴리뉴클레오티드의 조작을 촉진할 수 있는 벡터 중에 함유될 수 있다. 벡터는 폴리뉴클레오티드를 유지하기에 유용한 클로닝 벡터이거나, 또는 폴리뉴클레오티드 이외에, RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 유용한 조절 요소, 특정 세포에서 인코딩된 RNA를 발현시키기에 유용한 조절 요소, 폴리펩티드에서 RNA의 후속적 번역 또는 상기 세포에서 RNA에 의해 후속적 트랜스 조절 활성에 유용한 조절 요소를 함유하는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, 인코딩 폴리뉴클레오티드의 지속되는 전사를 달성하기 위해 필요한 발현 요소를 함유할 수 있거나, 또는 조절 요소는 벡터로 클로닝되기 전에 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 벡터 (또는 폴리뉴클레오티드)는 일반적으로 구성요소인 또는, 경우에 따라, 인코딩 폴리뉴클레오티드의 유도성 또는 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 발현을 제공할 수 있는 프로모터 서열, 폴리-A 인식 서열, 및 리보좀 인식 부위 또는 내부 리보좀 입장 부위, 또는 조직 특이적일 수 있는 다른 조절 요소, 예컨대 인핸서를 함유하거나 인코딩한다. 벡터는 또한 경우에 따라, 원핵세포 또는 진핵세포 숙주계 또는 둘 다에서 복제를 위해 요구되는 요소를 함유할 수 있다. 플라스미드 벡터 및 바이러스성 벡터, 예컨대 박테리오파지, 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 알파 바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 비롯한 그러한 벡터는 익히 공지되어 있으며, 상업적 공급원 (Promega, Madison Wis.; Stratagene, La Jolla Calif.; GIBCO/BRL, Gaithersburg Md.)으로부터 구입할 수 있거나, 또는 당업자에 의해 구축될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990)]; [Jolly, Cane. Gene Ther. 1:51-64, 1994]; [Flotte, J. Bioenerg. Biomemb 25:37-42, 1993]; [Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest 92:381-387, 1993] 참조; 이들 각각은 참고로 본원에 포함됨).
본 발명의 방법에 이용된 DNA 벡터는 양성 및 음성 선택 마커를 함유할 수 있다. 양성 및 음성 마커는 발현시 이들 유전자를 발현하는 세포에게 약물 내성을 부여할 수 있는 유전자일 수 있다. 이. 콜라이에 적합한 선택 마커는, 여기에 제한되지는 않지만: Km (카나마이신 내성 유전자), tetA (테트라사이클린 내성 유전자) 및 베타-락타마제 (암피실린 내성 유전자)를 포함할 수 있다. 배양 중인 포유동물 세포에 적합한 선택 마커는, 여기에 제한되지는 않지만: hyg (하이그로마이신 내성 유전자), puro (퓨로마이신 내성 유전자) 및 G418 (네오마이신 내성 유전자)을 포함할 수 있다. 선택 마커는 또한 물질을 독성 물질로 전환시킬 수 있는 물질대사 유전자일 수 있다. 예를 들어, 유전자 티미딘 키나제는 발현시 약물 간시클로비르 (gancyclovir)를 독성 생성물로 전환시킨다. 따라서, 간시클로비르로 세포를 처리하면 티미딘 키나제를 발현하지 않는 유전자를 음성적으로 선택할 수 있다.
관련된 측면에서, 선택 마커는 "스크리닝가능한 마커", 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), GFP-유사 단백질, 및 루시페라제일 수 있다.
다양한 유형의 벡터가 당업계에서 이용가능하며, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아, 바이러스성, 및 효모 벡터가 포함된다. DNA 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, p1-유래된 인공 염색체 (PAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 또는 포유동물 인공 염색체 (MAC)를 비롯한 임의의 적합한 DNA 벡터일 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 벡터는 BAC이다. 다양한 DNA 벡터가 구조물에 삽입된 DNA의 크기에 대해 적당하게 선택된다. 한 실시양태에서, DNA 구조물은 박테리아 인공 염색체 또는 그의 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "박테리아 인공 염색체" 또는 "BAC"는 박테리아 DNA 벡터를 일컫는다. BAC, 예컨대 이. 콜라이로부터 유래된 것은 상동 재조합을 통해 인간 이외의 포유동물 세포 또는 동물의 DNA 서열을 도입, 결실 또는 대체하기 위해 이용될 수 있다. 이. 콜라이는 코스미드 또는 효모 인공 염색체보다 DNA 안정성이 더 큰 BAC의 형태로 350 kb만큼 큰 복합체 게놈의 DNA를 유지할 수 있다 (문헌 [Shizuya and Kouros-Mehr, Keio J Med. 2001, 50(1):26-30] 참조). 게다가, 인간 DNA 게놈의 DNA의 BAC 라이브러리는 코스미드 또는 효모 인공 염색체에서의 라이브러리보다 인간 게놈의 보다 완전하고 정확한 표현을 갖는다. BAC는 참고로 그 전문이 본원에 포함되는 미국 출원 제10/659,034호 및 제61/012,701호에 더 상세하게 기재되어 있다.
인간 이외의 포유동물로 혼입될 Ig 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 DNA 단편은 좌의 인간화 전에 인간 이외의 포유동물의 동일한 종으로부터 단리된다. Ig 좌의 중첩 단편을 함유하는 다중 BAC는 인간화될 수 있고, 중첩 단편은 재조합되어 연속 IgH 또는 IgL 좌를 생성한다. 그 결과로 생성된 키메라 Ig 좌는 인간 이외의 포유동물 Ig 유전자 단편에 작동가능하게 연결된 인간 유전자 단편을 포함하여 기능적 Ig 좌를 제조하며, 여기서 상기 좌는 유전자 재배열을 수행하고, 그럼으로써 키메라 항체의 다각화된 레퍼토리를 제조할 수 있다.
BAC 재조합 및/또는 키메라 Ig 좌 또는 그의 단편의 조작을 위한 이들 과정은 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이가 숙주 Ig 좌 또는 그의 일부분을 함유하는 BAC로 형질전환될 것이 요구된다. 이어서 바실러스를 함유하는 BAC는 숙주 Ig 좌 또는 그의 일부분을 함유하는 BAC와 공유된 측면 상동성 서열에 연결된 바람직한 인간 Ig 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된다. 공유된 서열 상동성은 상동 재조합을 매개하고, 재조합 벡터 상의 인간 Ig 유전자 단편과 BAC 상의 인간 이외의 포유동물 Ig 유전자 단편 사이에서 교차된다. 상동적으로 재조합된 BAC의 검출은 벡터로 혼입된 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커를 이용할 수 있다. 인간화된 BAC는 박테리아로부터 용이하게 단리될 수 있으며, 녹-인 인간 이외의 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. BAC를 재조합하고 BAC 상의 DNA 내에서의 삽입 및 결실을 조작하는 방법 및 그로부터 유전자 변경된 마우스의 제조 방법은 문서화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Valenzuela et al. Nature Biotech. (2003) 21:652-659]; [Testa et al. Nature Biotech. (2003) 21:443-447]; 및 [Yang and Seed. Nature Biotech. (2003) 21 :447-451]을 참조한다.
제1 재조합 단계는 sbcB, sbcC, recB, recC 또는 recD 활성이 결핍되고 recA에서 온도 감수성 돌연변이를 갖는 이. 콜라이 균주에서 수행될 수 있다. 재조합 단계 이후에, 다양한 서열 및 기재된 바와 같은 배향을 갖는 재조합된 DNA 구조물이 단리된다.
BAC 리컴바이니어링 (recombineering)에 사용된 영역은 상동 재조합을 허용하는 길이여야 한다. 예를 들어, 측면 영역은 약 0.1 내지 19 kb, 전형적으로 약 1 kb 내지 15 kb, 또는 약 2 kb 내지 10 kb일 수 있다.
Ig 좌의 일부분을 포함하는 보다 큰 및/또는 조정된 BAC를 제조하기 위한 BAC 재조합 과정은 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이가 제1 Ig 좌, 그의 일부분, 또는 몇 가지 다른 표적 서열을 운반하는 BAC로 형질전환될 것이 요구된다. 이어서 이. 콜라이를 함유하는 BAC는 바람직한 Ig 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 BAC)로 형질전환되어 마우스 IgH 좌로부터의 영역에 결합될 표적 DNA, 예를 들어, 하나 이상의 인간 VH, DH 및/또는 JH 유전자 단편으로 도입되며, 여기서 벡터는 둘 다 서열 동일성의 영역을 갖는다. 이. 콜라이에서 기능적 recA의 존재 하에 동일성의 이 공유된 영역은 재조합 벡터 상의 Ig 유전자 단편과 BAC 상의 인간 이외의 포유동물 Ig 유전자 단편 사이에 교차를 매개한다. 상동적으로 재조합된 BAC의 선택 및 분석 (resolution)은 벡터로 혼입되는 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커를 이용할 수 있다. 인간화된 및 키메라 인간-마우스 BAC는 이. 콜라이로부터 용이하게 정제될 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 DNA를 도입하고, 임의 또는 표적화된 통합 사건에 대해 선택하고/하거나 스크리닝함으로써 형질전환 및 녹-인 인간 이외의 세포 및 동물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
별법으로, 인간 이외의 포유동물로 혼입될 Ig 좌를 함유하는 DNA 단편은 시험관 내에서 합성된 DNA로부터 유래된다. 다수의 유기체의 게놈은 완전히 시퀀싱되었고 (예를 들어, 인간, 침팬지, 레서스 (rhesus) 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 닭, 기니아 피그, 토끼, 말, 소), 주석으로 공개적으로 이용가능하다. 특히 여기에 제한되는 것은 아니지만, 인간 및 마우스 면역글로불린 좌가 연구되었고, 코딩 유전자 단편 및 비-코딩 조절 요소의 위치 및 활성에 대해 특성화되었다. Ig 좌의 서열은 핵산 서열 분석을 위해 통상적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 조작되고 인실리코 (in silico) 재조합될 수 있다. 인실리코 재조합은 동일한 좌 내에서, 동일한 종으로부터의 2개의 좌 사이에서, 또는 둘 이상의 종으로부터의 2개의 좌 사이에서 일어날 수 있다. Ig 좌의 서열은 또한 동일한 또는 상이한 종으로부터의 비-면역글로불린 좌로부터 얻은 것으로 인실리코 재조합될 수 있다. 그러한 서열은 여기에 제한되지는 않지만, 양성 및 음성 약물 선택 마커에 대한 유전자, 예컨대 G418, hyg, puro 및 tk, 및 부위-특이적 재조합효소 인식 서열, 예컨대 loxP 부위 및 그의 변종 및 frt 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 서열을 인실리코 조립 후에, 이어서 이는 합성되고 오류 없이 조립될 수 있다 (문헌 [Kodumal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2004) 101:15573-15578]). 큰 DNA의 합성, 조립 및 시퀀싱은 계약을 기반으로 제공된다 (예를 들어, 디엔에이 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA); 블루 헤론 바이오테크놀로지 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA); 및 유로젠텍 (Eurogentec, San Diego, CA)). 그러한 합성 DNA 서열은 벡터, 예컨대 플라스미드 및 BAC 내에서 운반되고, 다른 벡터 예컨대 YAC로 옮겨질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "구조물"은 유전자 조작, 리콤비니어링 또는 합성에 의해 인공적으로 구축된 DNA 서열을 일컫는다. 한 실시양태에서, DNA 구조물은 재조합 전에 선형화된다. 다른 실시양태에서, DNA 구조물은 재조합 전에 선형화되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "loxP" 및 "CRE"는 P1 박테리오파지로부터 유래된 부위-특이적 재조합 시스템을 일컫는다. loxP 부위는 34개의 뉴클레오티드 길이이다. DNA가 loxP 부위에 의해 어느 한 측면에 붙으면 CRE 매개된 재조합에 노출되고, 개재 DNA는 삭제되며, 두 loxP 부위가 하나로 만난다. 마우스를 비롯한 다수의 종에서 유전자 조작을 위한 변종-서열 lox 부위를 비롯한 CRE/lox 시스템의 사용은 익히 문서화되어 있다. 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)로부터의 frt 부위 및 flp 재조합효소를 이용하는 유사한 시스템이 이용되어 유사한 효과를 낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 배양 중인 포유동물 세포에서 결실 사건을 매개하기 위한 CRE/loxP의 임의의 구현은 또한 flp/frt 시스템에 의해 매개될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역화하다", "면역화", 또는 "면역화하는"은 동물의 후천성 면역계를 항원에 노출시키는 것을 일컫는다. 항원은 투여, 예컨대 주사, 흡입 또는 섭취의 다양한 경로를 이용하여 도입될 수 있다. 동일한 항원에 두 번째 노출 시, 후천성 면역 반응, 즉 T 세포 및 B 세포 반응이 증진된다.
"항원"은 후천성 면역계에 의해 인식되는 펩티드, 지질 또는 아미노산을 일컫는다. 항원의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아 세포벽 성분, 화분, 및 rh 인자가 포함된다. "표적 항원"은 특이적 감염제 또는 내인성 세포에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 선택된 후천성 면역계에 의해 인식되는 항원, 펩티드, 지질, 당류, 또는 아미노산을 일컫는다. 표적 항원에는, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아 및 바이러스성 성분, 종양-특이적 항원, 사이토카인, 세포 표면 분자 등이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약" 또는 "제약 약물"은 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있는 임의의 약리학적, 치유적 또는 활성 생물학적 작용제를 일컫는다. 특정 실시양태에서 대상체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다.
용어 "제약적으로 허용가능한 담체"는 제약 약물을 동반할 수 있고, 대상체의 면역계와 역반응을 야기하지 않는 임의의 물질을 일반적으로 일컫는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는"은 제약 약물 또는 다른 작용제, 예컨대 표적 항원을 대상체에게 전이, 전달, 도입, 또는 수송하는 임의의 방식을 일컫는다. 그러한 방식에는 경구 투여, 국소 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 비강내, 또는 피하 투여가 포함된다.
녹-인 인간 이외의 포유동물 및 세포
본 발명의 녹-인 인간 이외의 포유동물 및 세포는 내인성 유전자 단편을 대체하는 변경된 IgH 또는 IgL, 또는 둘 다, 이종상동성 인간 Ig 유전자 단편을 포함하는 좌를 포함한다. 예를 들어, 구체적 실시양태에서 특이적 내인성 CH 유전자에서 CH1 도메인을 대체하는 인간 CH1 도메인, 예를 들어, Cμ, Cδ, Cγ는 각각의 마우스 CH 영역에 대해 이종상동성 서열일 수 있다. 내인성 Cγ 유전자 각각에 대해, 대체 CH1은 이종상동성 인간 CH1일 수 있거나, 또는 치유적 mAb로 보다 빈번하게 사용되는 인간 IgG 이소타입의 인간 CH 유전자로부터의 단일 Cγ, 전형적으로 Cγ1 , Cγ2 또는 Cγ4일 수 있어서, 보다 임상적으로 관련된 인간 CH1 도메인의 맥락에서 인간 V 도메인의 생체 내 돌연변이를 더욱 촉진한다.
임의로, 내인성 C 유전자의 상부 힌지 서열은 또한 이종상동성 인간 C 힌지 서열로 각각 대체될 수 있다. 별법으로, 내인성 C 유전자의 상부 및 중간 힌지 서열은 또한 이종상동성 인간 C 힌지 서열로 각각 대체될 수 있다. 인간 중간 힌지 영역이 사용된 경우, 인간 Cγ4 중간 힌지 서열은 이황화결합을 통한 상호-중쇄 이량체화를 유도하기 위해 229 잔기 위치에서 세린보다는 프롤린을 함유하도록 조작될 수 있다. 내인성 Cγ 유전자의 보다 낮은 힌지 영역인 CH2 도메인의 일부는 내인성 FcγR로 최적의 결합을 촉진하도록 남겨질 수 있다. 이러한 조작은 상부 및 중간 힌지 영역이 또한 인간으로 전환되는 경우, 인간 중쇄 Fab 도메인, Fab 도메인 플러스 상부 힌지, 또는 F(ab')2를 제조할 것이며, 이는 완전 인간 IgG로 전환시 최적의 특성을 보유하도록 할 것이다.
J 유전자 클러스터의 내인성 IgH 좌 하류 및 인간 CH1-내인성 CH2-CH3 (및 Cμ에 대해 CH4)를 갖는 각각의 보유된 C 유전자 및 막 및 세포내 도메인 엑손을 포함하는 BAC는 제1 도입 단계에 이어 내인성 V-D-J 유전자의 그의 인간 이종상동체로의 대체 또는 반대 순서로, 인간 V, D 및 J의 도입에 이어 상기 기재된 바와 같이 조작된 내인성 C 유전자의 도입과 같이, 상동 재조합-수용성 세포, 예컨대 마우스 ES 세포에서 내인성 IgH 좌로 상동적으로 재조합될 것이다. BAC 상의 Ig 좌에서의 함량은 하나 상의 유일한 C 유전자 단편 및 다른 하나 상의 V, D 및 J 유전자 단편으로 제한되지 않는다. C 유전자 단편을 갖는 BAC는 J 유전자 단편 및 D 유전자 단편까지 및 하나 이상의 V 유전자 단편까지 또한 함유할 수 있다. 별법으로, V 유전자 단편을 갖는 BAC는 D 유전자 단편 및 J 유전자 단편까지 및 하나 이상의 C 유전자 단편까지 함유할 수 있다.
불변 영역 유전자를 운반하는 BAC는 임의의 원치 않는 유전자 단편, 예컨대 Cε 및 Cα 유전자를 결실시키기 위해 ES 세포로 도입하기 전에 이. 콜라이에서 조작되거나 또는 시험관 내 합성될 수 있다. 이는 녹-인 동물로 하여금 1차 면역 반응에 대한 Cμ 및 Cδ, 및 2차, 친화성-성숙된 면역 반응에 대한 Cγ 이소타입을 만들도록 할 것이며, 이로부터 치유적 항체 후보자가 전형적으로 회수될 것이다. 내인성 IgH 3' LCR은 변경되지 않은 채로 둘 수 있다.
내인성 Cκ 좌를 대체하기 위해서 완전한 인간 Cκ 유전자가 임의로 또한 BAC로 혼입될 수 있는 것을 제외하고, 유사한 대체 전략이 내인성 Igκ 좌에 대해 이용될 수 있으며, 그에 따라 완전 인간 Igκ 쇄를 제조한다. 인간 Cλ 좌는 또한 유사한 방식으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 C 영역을 비롯한 완전 인간 Ig 좌를 완전한 내인성 Ig 좌의 자리에 혼입하는 것을 포함한다. 이 실시양태에서, 내인성 FcR 유전자의 클러스터는 또한 상동 재조합 수용성 세포, 예컨대 마우스 ES 세포에서 유사한 BAC-기재 유전자 조작을 이용하여 인간 FcR 유전자의 이종상동성 클러스터로 대체된다. 내인성 FcγR 유전자의 클러스터는 인간 IgH 좌 또는 그의 일부분이 내인성 좌를 대체하는 동일한 ES 세포에서, 또는 개별 ES 세포에서 대체될 수 있다. 후자의 경우에서, 마우스는 상기 ES 세포로부터 유래될 수 있고, 조작된 Ig 좌(들)을 운반하는 마우스와 함께 육종하여 마우스 FcγR 유전자의 자리에서 인간 FcγR에 결합하는 인간 IgG 항체를 만드는 마우스를 제조한다. 각각의 방식으로 완전 인간 항체가 제조될 수 있고, 면역 반응 동안 인간 FcR 수용체와 정상적으로 맞물리게 할 수 있다. 그러한 녹-인 동물은 또한 모델에 대한 적당한 유전자 배경, 즉, SCID, nu/nu, nod, 및 lpr 마우스로 육종시, 질환 모델에서 인간 치유적 mAb 후보자의 활성 및 이펙터 기능에 대해 시험하기에 유용한 이점을 갖는다. 추가로, 인간 표적 유전자 서열은 상동 재조합-수용성 세포에서 BAC 표적화 기술을 이용하여 내인성 유전자를 대체할 수 있으며, 이는 항체의 표적 확인 및 기능적 시험을 위한 모델을 제공한다. 이 경우에서, 인간 CH 유전자는 B 세포에서 천연 (native) 신호 형질도입을 촉진하기 위해 마우스 또는 다른 이종상동성 종으로부터의 세포질 및/또는 막 도메인 유전자 단편을 갖도록 조작될 수 있다.
게다가, 본 발명의 다른 측면은 바람직한 인간 V 영역의 고안에 관한 것이다. 구체적으로, 전체 인간 V 도메인 레퍼토리 또는 그의 일부분은 세포의 게놈으로 혼입될 수 있거나, 또는 조정된 V 도메인 레퍼토리가 혼입될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 모든 공지된 인간 일배체형에 걸쳐 통상적인 기능적 V 유전자 단편으로만 구성되는 V 도메인 레퍼토리를 조정하는 대신, 몇 가지 인간 일배체형으로부터 빠진 V 도메인 유전자 단편을 제외하는 것이 바람직하다. 이는 모든 잠재적 환자에 걸쳐 보다 면역 내성화된 V 도메인을 갖는 항체 약물 후보자를 제공하며, 그렇게 함으로써 대상체에게 인코딩된 항체의 투여시 위험한 면역 반응의 유도를 방지한다. 하나 이상의 V 도메인 유전자 단편이 혼입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 바람직한 Ig 좌 유전자 단편을 함유하는 BAC는 상동 재조합을 통해 이 유전자 정보를 표적 세포로 혼입하기 위해 사용된다. 이. 콜라이에서 BAC 조작의 특징은 수용성 세포로 도입하기 전에 면역글로불린 좌를 정교하게 조정하기 위한 추가적 기회를 제공한다. 예를 들어, 인간 DH 클러스터는 다른 종, 예컨대 인간 이외의 영장류, 토끼, 래트, 햄스터 등으로부터의 D 유전자로 대체되거나 보충될 수 있다. BAC 라이브러리 및 Ig 좌의 완전한 서열은 다수의 종에 대해 이용가능하다. IgH 좌 내의 D 유전자 단편은 공개적으로 이용가능한 서열 또는 유전자 구조 정보로부터, 또는 적당한 D 특이적 프로브 또는 프라이머를 이용한 시험에 의해 한정될 수 있다. 이종상동성 D 유전자 클러스터 또는 그의 일부분은 BAC로 상동적으로 재조합될 수 있거나 또는 인실리코 조립된 후에 합성될 수 있고, 그 안에 인간 D 유전자 단편의 클러스터를 대체하거나 첨가할 수 있다. 상보성 결정 영역-3 (CDR3)을 만드는 데서 발생하는 유의한 다양화의 이유 및 V 영역의 구조가 CDR3이 일반적으로 용매 접근불가능하기 때문에, CDR3 서열에 대한 면역원성은 덜 고려된다. 따라서, CDR3에 혼입된 인간 이외의 D 유전자에 의해 인코딩된 아미노산은 덜 면역성일 수 있다. 인간 이외의 D 유전자는 항원-특이적 항체의 패널에서 에피토프 특이성 및 친화성의 범위를 확장할 신규 CDR3 구조물을 제조함으로써 이점을 부여할 수 있으며, 그 안에서 mAb의 패널에 의해 매개된 활성의 질을 확장한다.
유사하게, JH 유전자 클러스터, 즉, 하나 이상의 JH 유전자 단편은 포유동물에 걸친 상대적 서열 보존성으로 인해 인간 이외의 다른 종으로부터 얻을 수 있다. JH 유전자 단편은 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터, 및 마우스로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, JH 유전자 단편은 인간으로부터 유래된다.
내인성 Ig 좌의 부분 또는 전체를 대체하기 위해 Ig 좌의 상동 재조합-수용성 세포로의 조작 후에, 유전적으로 조작된 인간 이외의 포유동물, 예컨대 마우스는 현재-표준 방법, 예컨대 배반포 미세주입에 이어 키메라 동물의 육종, 상실배 응집 또는 클로닝 방법론, 예컨대 체세포 핵 이식에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 변경된 IgH 및 IgL 좌를 갖는 마우스는 동형접합성 IgH 및 IgL (Igκ 또는 Igλ)을 제조하기 위해 육종될 수 있다. 다단계 육종은 변경된 IgH, Igκ 및 Igλ 좌에 대해 동형접합성인 동물을 제조할 수 있다. 동형접합성 동물을 사용하는 것보다 다소 덜 효율적일지라도, 활성 내인성 Ig 좌로부터의 항체의 제조가 또한 있을 수 있기 때문에, 완전-마우스 및 인간-마우스 항체 둘 다 제조할 수 있는 IgH 및 IgL 좌에 대해 이형접합성인 동물이 또한 항원-특이적 인간 V-마우스 C mAb를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 변경된 IgL 좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 마우스로부터의 VL 도메인과 혼합된 경우, 특히 마우스가 면역화된 경우에 단 하나의 변경된 좌, 예를 들어, IgH에 대해 이형접합성 및 동형접합성인 마우스는 또한 항체 표시 라이브러리에 대한 인간 VH 도메인 (VH-CH1)의 공급원으로서 유용할 수 있다 (하기 참조). 예를 들어, 하나는 인간 VH-CH1-마우스 CH2-CH3을 갖고 다른 하나는 인간 VK-CK-를 갖는 두 개별 마우스로부터의 항체 표시 라이브러리는 분자 생물학에서 익히 성립된 기술을 이용하여 완전 인간 항체를 회수하기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 변경된 좌, 예를 들어, IgH 및 Igκ에 대해 이형접합성 및 동형접합성인 마우스는 또한 항체 표시 라이브러리에 대한 인간 VH 및 VL 도메인의 공급원으로서 유용할 수 있다.
특정 실시양태는 인간 VH 및 CH1 유전자 단편을 포함하는 키메라 Ig 중쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물을, 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물과 함께 육종하는 단계; 키메라 Ig 중쇄 좌 및 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 자손을 추가로 육종하는 단계; 및 키메라 중쇄 및 인간 경쇄 좌에 대해 동형접합성인 게놈을 갖는 자손을 제조하는 단계를 포함하는, 인간 VH 및 CH1 유전자 단편 및 인간 Ig 경쇄 좌를 인코딩하는 게놈을 갖는 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법을 제공한다. 관련된 실시양태에서, 포유동물의 게놈은 또한 인간 JH 유전자 단편을 인코딩한다.
이 유전자 조작 전략은 또한 마우스 이외의 동물의 조작에 적용하여 이종발생성 C 영역, 또는 완전하게 인간 항체, 또는 몇 가지 그의 중간체와 함께 인간 서열 V 영역을 발현하도록 할 수 있다. 배반포 미세주입 또는 상실배 응집을 통한 유전자 조작을 위한 ES 세포 기술이 현재 부족한 동물에 대해, 내인성 좌는 다양한 클로닝 기술 또는 발달 리프로그래밍을 잘 받아들이는 세포에서 변경될 수 있다 (예를 들어, 유도된 분화다능 줄기 세포, IPS). BAC 기술에 의해 제공된 상동 재조합의 증가된 빈도는 세포에서 두 배로 복제된 좌를 발견하는 능력을 제공하며, 그로부터 유래된 클로닝된 동물은 돌연변이에 대해 동형접합성일 수 있어, 특히 긴 세대 기간을 갖는 큰 동물을 육종하는 경우 시간 및 비용을 절약한다. 배양된 세포에서 반복 대체는 다중 좌에서 필요한 모든 조작을 제공할 수 있으며, 이어서 적당한 유전자형을 얻기 위해 교배-육종 없이 클로닝 또는 IPS 기술을 이용하여 동물을 직접 제조할 수 있도록 한다. 도입된 Ig 유전자를 정교하게 조정하는 능력 및 또한 이들이 도입된 부위를 정교하게 특정하는 능력은 더 나은 기능을 제공할 증진된 결과물의 조작 능력을 제공한다. 조작된 동물, 예컨대 염소, 소류, 양류, 말류, 토끼, 개 등은 완전 인간 폴리클로날 항체의 공급원일 수 있다.
또한, BAC가 염색체 기능을 위해 요구되는 DNA 성분, 예를 들어, 말단소체 및 동원체, 바람직하게는, 요구되지는 않지만, 최적의 기능을 위한 수용체 종의 DNA 성분, 예를 들어, 마우스 말단소체 및 마우스 동원체를 갖는 이. 콜라이에서 조작되는 경우, 이는 전기천공, 미세주입 등에 의해 수용체 세포로 도입될 수 있으며, 인공 염색체로서 기능할 것이다. 이들 BAC-기재 인공 염색체는 또한 보다 큰 인공 염색체를 개발하기 위한 상동 재조합의 후속적 단계를 위한 토대로서 사용될 수 있다.
벡터, 예컨대 플라스미드, BAC 또는 YAC 상의 본원에 기재된 조작된 Ig 좌 또는 좌들은 또한 미세주입을 통해 배아, 예컨대 마우스, 토끼, 래트, 또는 햄스터의 전핵으로 도입된 표준 전이유전자로서 사용될 수 있다. 수 가지 BAC, YAC, 플라스미드 또는 그의 임의의 조합은 공동-미세주입될 수 있고, 공동-통합되어 기능성 좌를 만들 것이다. 당업계에 공지된 다양한 방법이 이용되어 내인성 Ig 좌를 비활성화시킬 수 있고, 조작된 Ig 전이유전자를 갖는 동물을 하나 이상의 비활성화된 내인성 좌를 갖는 동물과 함께 육종하여 비활성화된 내인성 좌로부터의 완전한 천연 면역글로불린의 생산없이 전이유전자로부터 항체를 발현시키는 유전자형을 유도한다.
항체
변경된 좌를 운반하는 동물은 당업계의 다양한 기술을 이용하여 표적 항원으로 면역화될 수 있다. 표적 항원은 특정 질환 또는 장애, 예컨대 다양한 유형의 암, 이식 편대 숙주 질환, 심혈관 질환 및 관련된 장애, 신경학적 질환 및 장애, 자가면역 및 염증성 장애, 및 병원성 감염의 치료 또는 예방을 위해 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 항원은 상기 질환 또는 장애 중 하나를 검출하기 위한 진단제로 유용할 항체를 개발하기 위해 선택될 수 있다.
항원-특이적 레퍼토리는 하이브리도마 (hybridoma) 기술, 선택된 B 세포에 대한 단일-세포 RT-PCR, 항체 표시 기술, 및 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 면역화된 마우스로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 마우스-유래된 하이브리도마로부터 mAb를 회수하기 위해, 인간 V-CH1-마우스 힌지+CH2+CH3 항체 또는 인간 V-CH1-상부/중간 힌지-마우스 하부 힌지+CH2+CH3 항체 (IgH 좌 조작에 따라 달라짐)가 배양 상층액으로 분비될 것이고, 당업계에 공지된 수단, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 등을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 그러한 정제된 항체는 항체의 추가적 시험 및 특성화를 위해 사용되어 시험관 내 및 생체 내 효능, 친화성 등을 결정할 수 있다.
게다가, 이는 항-마우스 불변 영역 2차 작용제로 검출될 수 있으므로, 인간 V-CH1 (상부/중간 힌지)-마우스 CH2-CH3 mAb는 표적 항원의 조직 분포 및 발현을 평가하기 위한 인간 조직의 면역화학 분석에 유용할 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 이러한 특성은 정상 인간 Ig를 함유하는 조직에 대한 항-인간 불변 영역 2차 검출제를 사용하는 데 있어서 때때로의 도전으로 인해 인간 Fc 영역의 몇 가지 조직에서의 세포 상에 발현되는 인간 FcR로의 결합으로부터 완전 인간 mAbs에 걸친 mAb의 특이적 확인을 가능하게 한다.
mAb의 인간 가변 영역은 표준 방법에 의해 회수 및 시퀀싱될 수 있다. 리드 후보자 mAb를 확인하기 전 또는 후에, 인간 VH 및 VL 도메인에 대한 유전자, 게놈 DNA 또는 cDNA는 다양한 분자 생물학적 방법, 예컨대 RT-PCR에 의해 회수된 후에, 인간 불변 영역의 나머지 부분을 인코딩하는 DNA에 부착되어, 완전 인간 mAb를 제조할 수 있다. 완전 인간 VH-CH 및 인간 VL-CL을 인코딩하는 DNA는 당업계에 공지되거나 주문제작될 수 있는 적합한 발현 벡터로 클로닝되고, 포유동물 세포, 효모 세포, 예컨대 피치아 (Pichia), 다른 균류 등으로 형질감염되어 항체를 배양 상층액으로 분비할 수 있다. 다른 생산 방법, 예컨대 마우스에서 하이브리도마 세포를 이용한 복수, 우유 또는 계란으로 항체를 분비하는 형질전환 동물, 및 과일, 뿌리 또는 잎에서 항체를 만드는 형질전환 식물은 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 완전 인간 재조합체 항체는 다양한 방법, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 등을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
정제된 항체는 저장을 위해 동결건조되거나, 또는 인간을 비롯한 동물로의 안전한 투여에 지장이 없는 용해성 및 안정성에 대해 당업계에 공지된 다양한 용액으로 제제화될 수 있다. 정제된 재조합체 항체는 효능, 친화성, 특이성 등, 효능에 대한 동물 모델, 독성학 및 약동학 등에 대한 시험관 내 분석을 이용한 추가적 특성화를 위해 사용될 수 있다. 또한, 정제된 항체는 임상적 목적, 예컨대 질환의 치료 및 진단을 위해 인간에게 투여될 수 있다.
인간 V-CH1-(상부/중간 힌지)-내인성 CH2-CH3 mAb의 다양한 단편은 시약, 진단 및 치료를 비롯한 다양한 목적을 위해 효소에 의한 절단, 재조합체 기술 등을 비롯한 방법에 의해 단리될 수 있다. 인간 가변 도메인+CH1 또는 인간 가변 도메인만의 cDNA는 상기 기재된 조작된 인간 이외의 포유동물, 구체적으로 2차 림프기관, 예컨대 비장 및 림프절로부터 얻은 RNA, 및 다양한 항체 표시계, 예컨대 파지, 리보좀, 이. 콜라이, 효모, 포유동물 등으로 구현된 VH 및 VL cDNA로부터 단리될 수 있다. 녹-인 포유동물은 면역학적으로 감염되지 않거나, 또는 선택 항원에 대해 최적으로 면역화될 수 있다. 적당한 PCR 프라이머, 예컨대 가변 도메인의 리더 영역 또는 프레임워크 1에서의 5' 및 Cγ 유전자의 인간 CH1에서의 3'을 이용함으로써, 육체적으로 성숙된 V 영역은 친화성 성숙된 레퍼토리를 단독으로 표시하기 위해 회수될 수 있다. 표시된 항체는 표적 항원에 대해 선택되어 높은-친화성 항원-특이적 완전 인간 Fv 또는 Fab를 효율적으로 회수할 수 있고, mAb가 녹-인 포유동물로부터 직접 회수되는 경우, 존재할 수 있는 CH2-CH3 도메인의 녹-인 포유동물을 제거할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 정제된 항체는 특정 질환 또는 장애, 예컨대 다양한 유형의 암, 이식 편대 숙주 질환, 심혈관 질환 및 관련 장애, 신경학적 질환 및 장애, 자가면역 및 염증성 장애, 알러지, 및 병원성 감염의 치료 또는 예방을 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태, 대상체는 인간이다.
항체 조성물은 약 0.1 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 약 1 내지 10 mg/ml의 농도로 대상체에게 투여된다. 항체 조성물은 국소적으로, 비강 내로, 또는 주사를 통해, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 안내, 또는 피하 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 주사이다. 투여는 약 10분 내지 24시간, 바람직하게는 30분 내지 약 6시간에 걸쳐 단일 주사 또는 주입으로 이루어질 수 있다. 유효 투여가 1회 또는 연속 주사로 투여될 수 있다. 반복 투여는 약력학, 약동학 및 임상 징후에 따라 1일 2회, 1일 1회, 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 1달 1회, 또는 3달 1회로 투여될 수 있다. 요법은 임의의 증상의 부재시에도 확장된 기간 동안 지속될 수 있다.
정제된 항체 조성물은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 항체 조성물은 다중 이소타입의 항체 또는 단일 이소타입의 항체를 함유할 수 있다. 항체 조성물은 변경되지 않은 키메라 항체를 함유할 수 있거나, 또는 항체는 몇 가지 방식으로, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변경될 수 있다. 항체 조성물은 변경되지 않은 인간 항체를 포함할 수 있거나, 또는 인간 항체는 몇 가지 방식, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변경될 수 있다. 따라서 항체 조성물은 온전한 Ig 분자 또는 그의 단편, 즉, Fab, F(ab')2, 또는 Fc 도메인을 함유할 수 있다.
단독 또는 다른 요법제와 조합으로 감염제에 대한 항체 조성물의 투여는 대상체로부터 감염제의 제거를 초래한다. 항체 조성물의 투여는 대상체에 존재하는 감염성 유기체의 수를 10 내지 100배, 바람직하게는 1,000배 또는 1,000배 이상 감소시킨다.
유사하게는, 단독 또는 다른 화학요법제와 조합하여 암 세포에 대한 항체 조성물의 투여는 대상체로부터 암 세포의 제거를 초래한다. 항체 조성물의 투여는 대상체에 존재하는 암 세포의 수를 10 내지 100배, 바람직하게는 1,000배, 또는 1,000배 이상 감소시킨다.
본 발명의 특정 측면에서, 항체는 또한 가용성이거나 또는 세포 표면에 결합된 항원 분자에 결합하고 중화시키기 위해 이용될 수 있다. 그러한 중화는 순환계에서 항원 분자의 제거를 증진시킬 수 있다. 중화를 위한 표적 항원 분자에는, 여기에 제한되지는 않지만, 독소, 내분비 분자, 사이토카인, 케모카인, 상보체 단백질, 박테리아, 바이러스, 균류, 및 기생충이 포함된다. 그러한 항체는 단독으로 또는 다른 항체, 다른 생물학적 약물, 또는 화학 작용제를 비롯한 다른 요법제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체가 세포 표면 수용체 신호전달을 증진시키거나 억제하기 위해 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 세포 표면 수용체에 특이적인 항체는 요법제 또는 연구 도구로 이용될 수 있다. 세포 표면 수용체의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 면역 세포 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 작용성 수용체, 안지오텐신 수용체, 도파민 및 세로토닌 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 히스타민 수용체 등이 포함된다. 그러한 항체는 단독으로 또는 다른 항체, 다른 생물학적 약물, 또는 화학 작용제를 비롯한 다른 요법제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 추가로 변경되어 치유적 잠재력을 증진시킬 수 있음이 또한 고려된다. 변형은 화학물질, 예컨대 화학요법제, 방사성 동위원소, siRNA, 이중 가닥 RNA 등에 직접- 및/또는 간접-접합을 포함할 수 있다. 다른 변형은 증가된 또는 감소된 항체-의존성 세포의 세포독소, 증가된 또는 감소된 상보체-의존성 세포독소, 또는 증가된 또는 감소된 순환 반감기에 대해 조작된 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 상기 질환 또는 장애 중 하나를 검출하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다. 키메라 항체는 항체의 일부분, 예컨대 Fc 또는 Fab 도메인을 인식하는 2차 검출제를 사용하여 검출될 수 있다. 불변 영역의 경우에서, 인식된 일부분은 CH1, CH2, 또는 CH3 도메인일 수 있다. Cκ 및 Cλ 도메인은 또한 검출을 위해 인식될 수 있다. 면역조직화학 분석, 예컨대 표적 항원의 조직 분포 평가는 본 발명의 항체의 키메라 성질의 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 인간 조직 샘플의 평가시, 2차 검출제 시약은 Ig 분자의 인간 이외의 일부분을 인식함으로써, 조직 샘플에 존재할 수 있는 배경 또는 인간 Ig 분자로의 비-특이적 결합을 감소시킨다.
제약 조성물 및 키트
본 발명은 또한 제약 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제약 조성물은 제약적으로 허용가능한 담체 중에 항체, 또는 그의 단편을 포함한다. 제약 조성물은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 생체 내로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물은 조합해서 사용하기 위한 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 작용제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 항체, 또는 그의 단편, 및/또는 방법과 관련된 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 진단 또는 치료 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 조성물 또는 항체의 용도 및 포장에 대한 지침서를 추가로 제공할 수 있다.
본 발명의 키트는 디바이스, 시약, 용기 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 또한 컴퓨터를 비롯한 장치, 기구 또는 디바이스의 사용이 요구될 수 있다.
도 2는 순차적 상동 재조합 단계를 통한 인간 Igκ 좌의 도입을 도시한다. 도 2A 및 도 2B는 Igκ 좌의 상동 재조합 동안 선택 및 스크리닝 단계의 단계 1 및 단계 2를 각각 제시한 도표이다.
도 3은 순차적 상동 재조합 단계를 통한 인간 Igλ 좌의 도입을 도시한다. 도 3A 및 도 3B는 Igλ 좌의 상동 재조합 과정 동안 선택 및 스크리닝 단계의 단계 1 및 단계 2를 각각 제시하는 도표이다.
도 4A는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제1 BAC의 마우스 IgH 좌로의 도입을 도시하는 도표이다. 도 4B는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제2 BAC의 마우스 IgH 좌로의 도입을 제시하는 도표이다. 도 4C는 기능적 부위-특이적 재조합효소의 도입을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열 사이에서의 개재 서열의 제거를 도시하는 도표이다.
도 5A는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제1 BAC의 마우스 Igκ 좌로의 도입을 도시하는 도표이다. 도 5B는 상동 재조합을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열을 함유하는 제2 BAC의 마우스 Igκ 좌로의 도입을 제시하는 도표이다. 도 5C는 기능적 부위-특이적 재조합효소의 도입을 통한 부위-특이적 재조합효소에 대한 인식 서열 사이에서의 개재 서열의 제거를 도시하는 도표이다.
도 6A는 상동 재조합을 통한 제1 BAC의 마우스 Igλ 좌로의 도입을 도시하는 도표이다. 도 6B는 제2 BAC의, 제1 BAC의 일부분 및 내인성 마우스 Igλ 좌의 일부분과 상동적으로 재조합되는 마우스 Igλ 좌로의 도입을 제시하는 도표이다.
<상세한 설명>
개요
본 발명은 키메라 또는 인간화된 항체를 제조하는 녹-인 인간 이외의 포유동물, 그러한 녹-인 인간 이외의 세포 및 포유동물의 제조 방법, 및 이로써 제조된 항체를 포함하는 조성물 및 키트를 포함한다.
구체적으로는, 본 발명의 실시양태는 키메라-항체를 제조하는 인간 이외의 포유동물 및 세포, 및 상기 포유동물 및 세포의 제조 방법을 제공한다. 항체를 제조하는 포유동물에서, 내인성 면역글로불린 (Ig) V, (D) 및 J 유전자는 배아 줄기 세포에서 상동 재조합을 이용하여 본원에 기재된 방법에 의해, 예컨대 인간 V, D 및 J 유전자의 큰 부분을 운반하는 BAC를 사용하여 그의 인간 이종상동체 (ortholog)에 의해 대체되고, 적당한 상동성 표적화 DNA가 측면에 위치하여 (flank) 내인성 IgH 좌로의 높은-빈도의 상동 재조합을 촉진하도록 한다. 이는 단일 대체에서 각각의 Ig 좌에서, 순차적 ("보행 (walking)") 대체에 의해, 또는 좌의 일부분을 대체한 후 개재 서열을 제거함으로써 이루어질 수 있다. JH의 상기 IgH 좌 하류의 전부 또는 일부를 운반하는 BAC는, 각각의 불변 영역 유전자에서 이. 콜라이 (E. coli)의 BAC로 운반된 DNA의 아주 정밀한 변형을 만드는 능력을 사용하여 내인성 CH1 도메인이 인간 CH1 도메인으로 대체되도록 조작될 수 있다. 별법으로, JH의 IgH 좌 하류의 전부 또는 일부를 운반하는 BAC는, 각각의 불변 영역 유전자에서 인간 및 다른 유기체, 예컨대 마우스의 공개된 게놈 서열에 기초한 DNA를 정밀하게 합성 및 조립하는 능력을 이용하여 내인성 CH1 도메인이 인간 CH1 도메인으로 대체되도록 조작될 수 있다. 그러한 합성 및 조립은 당업계에 공지되어 있으며, 상업적 단체에 의해 실행된다 (예를 들어, DNA2.0 (Menlo Park, CA; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA)).
내인성 Ig 좌를 인간 Ig 좌의 성분으로 대체하여 1차 및 2차 면역 반응 동안 생체 내에서 최적화된 인간 V 도메인을 제조하는 종합적 전략의 이점은 변경된 좌의 총수가 이용가능한 전략과 비교하여 감소된 것이다. 본 발명의 전략은 육종 과정을 매우 간소화하는 2 또는 3 변경된 좌를 이용함으로써, 다른 유용한 돌연변이를 유전자 배경으로 도입하는 기회를 제공한다. 그러한 유용한 돌연변이는 종들 사이에서 매우 높게 보존된 인간 항원에 대한 항체를 보다 효율적으로 발생시키도록 면역 관용을 중단하는 것을 돕는 것을 포함할 수 있다. 여기에는 CD19의 형질전환 과발현, 억제 수용체 FcγRIIb, lpr 또는 다른 자가면역 되기 쉬운 돌연변이의 녹아웃 (knockout), 항원에 대한 유전자의 녹아웃, 또는 특이적 유전자, 예컨대 항원의 발현을 침묵시키도록 (silence) 조작된 아연-집게 (zinc-finger) 전이유전자가 포함된다.
내인성 Ig 좌를 인간 Ig 좌의 성분으로 대체하는 종합적 전략의 다른 이점은 내인성 좌 외부의 염색체의 위치에 삽입된 인간 Ig 전이유전자 사이에서 일어난 트랜스 재조합 및 트랜스 스윗칭 (switching)을 배제한다는 것이다. 그러한 트랜스 재조합 및 트랜스 스윗칭 사건으로부터 초래된 Ig 쇄 생성물은 인간-내인성 Ig 서열에 대해 키메라지만, 전이유전자에서 조작된 생성물 고안으로부터 벗어난다.
또 다른 별법은 인간 C 영역을 비롯한 완전 인간 Ig 좌를 완전한 내인성 Ig 좌의 자리에 혼입하고, 또한 내인성 FcR 유전자의 클러스터를 인간 FcR 유전자의 이종상동성 클러스터로 상동 재조합 수용성 세포, 예컨대 ES 세포에서 유사한 BAC-기재 유전자 조작을 이용하여 대체하는 것이다. 이러한 방식으로 완전 인간 항체가 제조될 수 있고, 면역 반응 동안, 이들 인간 항체는 정상적으로 인간 FcR와 맞물릴 수 있다. 모델에 대한 적당한 유전자 배경, 즉, SCID, nu/nu, nod, 및 lpr 마우스를 육종시, 그러한 동물은 또한 질환의 동물 모델에서 인간 치유적 mAb 후보자의 이펙터 (effector) 기능의 활성에 대해 시험하기에 유용한 이점을 가질 수 있다. 또한, 인간 표적 유전자 서열은 항체의 표적 확인 및 기능성 시험을 위한 모델을 제공하는, 상동 재조합-수용성 세포, 예컨대 ES 세포에서 BAC 표적화 기술을 이용하여 내인성 유전자를 대체할 수 있다.
다른 실시양태는 CH1-힌지-CH2-CH3(-CH4)를 포함하는 인간 C 영역을 비롯한 완전 인간 Ig 및 동족의 동계, 예를 들어, 마우스, 막 및 세포내 도메인을 포함하여 천연 세포내 신호 형질도입을 제공하고, B-세포 수용체에 있는 IgH의 Igα및 Igβ와의 연계가 가능하게 하여, 그 안에 B-세포 수용체를 함유하는 Igα, Igβ 및 IgG로부터의 뮤린형 신호전달을 허용한다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 불변 영역의 막 및 세포내 도메인은 동일한 또는 비-동족의 마우스 중쇄 이소타입으로부터 얻는다. 불변 영역 유전자의 그러한 조작은 하기 상술된 바와 같이 본 발명의 방법을 이용하여 용이하게 달성될 수 있다.
이러한 방식으로 키메라 항체를 조작하면, 제1 C 영역으로부터 시험관 내 스윗칭으로부터 생성된 V 도메인 형태, 특히 CH1 도메인, 및 생체 내 면역 반응 동안 제2 C 영역으로 발달되는 하나의 종, 예를 들어, 마우스로부터의 힌지 영역의 임의의 일부분, 특히 CH1 도메인, 및 다른 종, 예를 들어, 인간으로부터의 힌지 영역의 임의의 일부분에서의 변경을 방지한다. 본 발명의 녹-인 동물에 의해 제조된 항체는 인간 V 영역이 인간 C 영역에 부착되어 완전 인간 항체를 만들 경우 다른 키메라 항체를 제조하는 동물로부터의 항체에서 보여진 활성 및 효능의 감소 또는 손실을 나타내지 않았으며, 이는 CH1 도메인의 변화로부터 초래된 VH 도메인의 변경된 형태, 및/또는 마우스로부터 인간 불변 영역으로 스윗칭하는 경우, 상부 힌지 영역의 변경된 길이 또는 가용성으로 인한 항원 결합에서의 차이 (길이, 및 조성이 가변적인, 상호-중쇄 이황화결합을 형성하는 힌지에서의 CH1의 말단부터 첫 번째 시스테인 잔기까지의 펩티드 서열)에 의해서 야기될 수 있다 (문헌 [Roux et al., J. Immunology (1997) 159:3372-3382] 및 그 안의 참조 문헌). 중간 힌지 영역은 상호-중쇄 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기에 의해 결합된다.
정의
특정 실시양태를 상술하기 전에, 본 발명은 달라질 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 체계로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 예시적 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 및 각각의 용어가 사용된 구체적 문맥에서 당업계에서 그의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 하기에서 또는 본 명세서의 다른 부분에서 논의되며, 본 발명의 조성물 및 방법을 기술함에 있어서 당업자에게 추가적 안내 및 이를 어떻게 제조하고 사용하는지를 제공하기 위함이다. 용어의 임의의 사용 범주 및 의미는 용어가 사용되는 구체적 문맥으로부터 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 정의는 특정 조성물 또는 생물학적 체계로 제한하지 않으면서, 본 발명의 특정 실시양태를 확인하는 데 있어서 예시적 안내를 제공하려 함이다. 본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같은, 단수 형태 "한", "하나의" 및 "그"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 특이적 항원을 인식하고 결합하며, 막 결합 또는 분비될 수 있는 B 세포에 의해 제조된 단백질 분자를 나타낸다. 항체는 모노클로날일 수 있으며, 그런 점에서 이는 B 세포의 단일 클론에 의해 제조되고, 따라서 동일한 에피토프를 인식하고 동일한 핵산 및 아미노산 서열을 가지며, 또는 항체는 폴리클로날일 수 있는데, 그런 점에서 이는 B 세포의 다중 클론에 의해 제조되고, 동일한 항원의 하나 이상의 에피토프를 인식하고 전형적으로 상이한 핵산 및 아미노산 서열을 갖는다.
항체, 또는 Ig 분자는 이황화결합을 통해 함께 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 전형적으로 구성된다. 중쇄 (IgH) 및 경쇄 (IgL) 둘 다는 가변 (V) 영역 또는 도메인 및 불변 (C) 영역 또는 도메인을 함유한다. V 영역을 인코딩하는 IgH 좌의 일부분은 가변 (V), 다양성 (D), 및 결합 (J) 유전자 단편의 다중 카피를 포함한다. V 영역을 인코딩하는 IgL 좌, Igκ 및 Igλ의 일부분은 V 및 J 유전자 단편의 다중 카피를 포함한다. IgH 및 IgL 좌의 V 영역 인코딩 부분은 유전자 재배열, 예를 들어, 유전자 단편 배열의 상이한 조합이 이루어져 IgH 및 IgL 가변 영역을 형성하고, 항체에서 다양한 항원 특이성을 발달시킨다. IgH C 영역의 분비된 형태는 3개의 C 도메인, CH1, CH2, CH3, 임의의 CH4 (Cμ), 및 힌지 영역으로 구성된다. IgH C 영역의 막-결합 형태는 또한 막 및 세포내 도메인을 갖는다. IgH 불변 영역은 항체의 이소타입, 예를 들어 IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgE를 결정한다. 다중 Ig 이소타입을 인코딩하는 인간 이외의 포유동물은 이소타입 클래스 스윗칭이 이루어질 수 있음이 인정될 것이다. 2가지 유형의 IgL, Igκ 및 Igλ가 존재한다.
"Fab" 도메인 또는 단편은 V 영역 및 IgH의 CH1 도메인, 및 전체 IgL을 포함하는 IgH의 N-말단 일부분을 포함한다. "F(ab')2" 도메인은 Fab 도메인 및 힌지 영역의 일부분을 포함하며, 여기서 두 IgH는 중간 힌지 영역에서 이황화 연결을 통해 함께 연결된다. Fab 및 F(ab')2 둘 다는 "항원-결합 단편"이다. CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgH의 C-말단 부분은 "Fc" 도메인이다. Fc 도메인은 세포 수용체, 예컨대 FcR에 의해 인식된 Ig의 일부분이며, 여기에 상보체-활성화 단백질인 C1q가 결합한다. CH2 엑손의 5' 부분에 인코딩된 낮은 힌지 영역은 FcR 수용체에 결합하기 위해 항체 내에 가요성을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 항체"는 인간 및 인간 이외의 포유동물 둘 다의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 번역된 항체를 나타낸다. "인간화된" 항체는 인간 이외의 세포 또는 포유동물에 의해 제조된 것이며, 인간 서열, 예를 들어, 키메라 항체를 포함한다. 인간화된 항체는 다른 종으로부터 제조된 비-인간화된 항체와 비교하는 경우, 인간에 투여한 후에 덜 면역성이다. 게다가, 본 발명의 인간화된 항체는 조작된 녹-인 인간 이외의 포유동물로부터 단리되어 완전 인간 항체 분자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 인간 불변 영역에 부착된 키메라 항체의 인간 가변 영역을 포함하여 완전 인간 항체를 제조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 Ig 쇄"는 인간 및 인간 이외의 동물 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 번역된 Ig 중쇄 또는 Ig 경쇄를 나타낸다. 예를 들어, 키메라 Ig 중쇄는 인간 VH, DH, JH, 및 CH1 유전자 단편 및 마우스 CH2 및 CH3 유전자 단편을 포함할 수 있다.
"폴리펩티드," "펩티드" 또는 "단백질"은 화학 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 쇄를 설명하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드 또는 단백질은 IgH, IgL, V 도메인, C 도메인, 또는 항체일 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 화학 결합에 의해 함께 연결된 핵산의 쇄를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는, 여기에 제한되지는 않지만, DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 유전자 서열 및 단편을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 생존하는 공급원, 예컨대 진핵생물 세포, 원핵생물 세포 또는 바이러스로부터 단리될 수 있거나, 또는 분자 생물학의 표준 기술의 사용, 또는 DNA 합성, 또는 다수의 기술의 조합에 의해 시험관 내 처리에 의해 유도될 수 있다.
"좌"는 하나 이상의 유전자 또는 엑손, 예컨대 IgH 또는 Igκ 좌, 시스 조절 요소, 및 트랜스-액팅 인자가 결합하는 결합 영역을 포함하는 염색체 상의 위치를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, "유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 폴리펩티드 또는 그의 일부분, 예컨대 VL 도메인, CH1 도메인, 상부 힌지 영역, 또는 그의 일부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 "유전자 단편" 및 "엑손"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부분을 나타낸다. 유전자, 또는 유전자 단편은 하나 이상의 인트론, 전사적 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 비-코딩 영역, 예를 들어, 시스 조절 요소, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 비번역된 영역, 폴리아데닐화 부위를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "내인성"은 세포 또는 동물 내에서 자연적으로 발생한 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "이종상동성"은 다른 종에서 상응하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 인간 CH1 도메인 및 마우스 CH1 도메인을 나타낸다. 용어 "동계"는 동일한 종의 동물로 도입될 수 있는 동일한 종 내에서 발견된 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 마우스 Igκ 좌로 도입된 마우스 Vκ 유전자 단편을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상동" 또는 "상동 서열"은 다른 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편과 매우 유사한 서열, 또는 높은 백분율 동일성 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 구조물은 그 특이적 위치에서 재조합을 촉진하기 위해 내인성 DNA 서열의 일부분에 상동인 서열을 포함할 수 있다. 상동 재조합은 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 일어날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "측면 서열" 또는 "측면 DNA 서열"은 내인성 DNA 서열 또는 이전에 재조합된 비-내인성 서열, 또는 그의 일부분에 상동인 DNA 구조물에서 비-내인성 DNA 서열에 인접한 DNA 서열을 나타낸다. 본 발명의 DNA 구조물은 하나 이상의 측면 서열, 예를 들어, 비-내인성 서열의 3' 및 5' 말단 상의 측면 서열 또는 비-내인성 서열의 3' 또는 5' 말단 상의 측면 서열을 가질 수 있다.
어구 "상동 재조합-수용성 세포"는 상동성의 중복 영역을 함유하는 DNA 단편을 상동 재조합할 수 있는 세포를 나타낸다. 상동 재조합-수용성 세포의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 유도된 분화다능 줄기 세포, 조혈모세포, 박테리아, 효모, 다양한 세포주 및 배아 줄기 (ES) 세포가 포함된다.
"인간 이외의 포유동물"은 포유류에 속하는 인간 이외의 다른 동물을 나타낸다. 인간 이외의 포유동물의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 인간 이외의 영장류, 설치류, 소류, 양류, 말류, 개, 고양이, 염소, 양, 돌고래, 박쥐, 토끼, 및 유대류가 포함된다. 바람직한 인간 이외의 포유동물은 유전자 전환 및/또는 체세포 과다 돌연변이에 주로 의지하여 항체 다양성, 예를 들어, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 및 소를 발생시킨다. 특히 바람직한 인간 이외의 포유동물은 마우스이다.
용어 "녹-인" 또는 "형질전환"은 그의 게놈으로 혼입된 다른 종으로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 전이유전자를 포함하는 세포 또는 동물을 나타낸다. 예를 들어, 내인성 마우스 IgH 좌 외부의 그의 게놈으로 통합된 인간 VH 유전자 단편을 함유하는 마우스는 형질전환 마우스이며; 내인성 마우스 IgH 좌에서 내인성 마우스 VH를 대체하는 그의 게놈으로 통합된 인간 VH 유전자 단편을 함유하는 마우스는 형질전환 또는 녹-인 마우스이다. 녹-인 세포 및 인간 이외의 포유동물에서, 다른 종으로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 세포 또는 인간 이외의 포유동물에서 처음에는 발견된 상응하는, 또는 이종상동성인 내인성 서열을 대체할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간화된" 동물은 유사한 인간 서열로 대체되는 본래의 유전자 구성의 하나 이상의 유전자 단편 및/또는 유전자 조절 서열 이외에, 마우스 또는 다른 인간 이외의 동물의 유전자 서열을 보유하는 복합체 유전자 구조를 갖는 인간 이외의 동물, 예를 들어, 마우스를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 벡터의 복제 능력의 손실 없이 다른 핵산 단편으로 통합될 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 벡터는 바이러스, 플라스미드 또는 고등 유기체의 세포로부터 유래할 수 있다. 벡터를 이용하여 외래 또는 재조합체 DNA를 숙주 세포로 도입하며, 여기서 벡터는 복제된다.
폴리뉴클레오티드 작용제는 폴리뉴클레오티드의 표적 세포로의 도입을 비롯한 폴리뉴클레오티드의 조작을 촉진할 수 있는 벡터 중에 함유될 수 있다. 벡터는 폴리뉴클레오티드를 유지하기에 유용한 클로닝 벡터이거나, 또는 폴리뉴클레오티드 이외에, RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 유용한 조절 요소, 특정 세포에서 인코딩된 RNA를 발현시키기에 유용한 조절 요소, 폴리펩티드에서 RNA의 후속적 번역 또는 상기 세포에서 RNA에 의해 후속적 트랜스 조절 활성에 유용한 조절 요소를 함유하는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, 인코딩 폴리뉴클레오티드의 지속되는 전사를 달성하기 위해 필요한 발현 요소를 함유할 수 있거나, 또는 조절 요소는 벡터로 클로닝되기 전에 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 벡터 (또는 폴리뉴클레오티드)는 일반적으로 구성요소인 또는, 경우에 따라, 인코딩 폴리뉴클레오티드의 유도성 또는 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 발현을 제공할 수 있는 프로모터 서열, 폴리-A 인식 서열, 및 리보좀 인식 부위 또는 내부 리보좀 입장 부위, 또는 조직 특이적일 수 있는 다른 조절 요소, 예컨대 인핸서를 함유하거나 인코딩한다. 벡터는 또한 경우에 따라, 원핵세포 또는 진핵세포 숙주계 또는 둘 다에서 복제를 위해 요구되는 요소를 함유할 수 있다. 플라스미드 벡터 및 바이러스성 벡터, 예컨대 박테리오파지, 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 알파 바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 비롯한 그러한 벡터는 익히 공지되어 있으며, 상업적 공급원 (Promega, Madison Wis.; Stratagene, La Jolla Calif.; GIBCO/BRL, Gaithersburg Md.)으로부터 구입할 수 있거나, 또는 당업자에 의해 구축될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990)]; [Jolly, Cane. Gene Ther. 1:51-64, 1994]; [Flotte, J. Bioenerg. Biomemb 25:37-42, 1993]; [Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest 92:381-387, 1993] 참조; 이들 각각은 참고로 본원에 포함됨).
본 발명의 방법에 이용된 DNA 벡터는 양성 및 음성 선택 마커를 함유할 수 있다. 양성 및 음성 마커는 발현시 이들 유전자를 발현하는 세포에게 약물 내성을 부여할 수 있는 유전자일 수 있다. 이. 콜라이에 적합한 선택 마커는, 여기에 제한되지는 않지만: Km (카나마이신 내성 유전자), tetA (테트라사이클린 내성 유전자) 및 베타-락타마제 (암피실린 내성 유전자)를 포함할 수 있다. 배양 중인 포유동물 세포에 적합한 선택 마커는, 여기에 제한되지는 않지만: hyg (하이그로마이신 내성 유전자), puro (퓨로마이신 내성 유전자) 및 G418 (네오마이신 내성 유전자)을 포함할 수 있다. 선택 마커는 또한 물질을 독성 물질로 전환시킬 수 있는 물질대사 유전자일 수 있다. 예를 들어, 유전자 티미딘 키나제는 발현시 약물 간시클로비르 (gancyclovir)를 독성 생성물로 전환시킨다. 따라서, 간시클로비르로 세포를 처리하면 티미딘 키나제를 발현하지 않는 유전자를 음성적으로 선택할 수 있다.
관련된 측면에서, 선택 마커는 "스크리닝가능한 마커", 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), GFP-유사 단백질, 및 루시페라제일 수 있다.
다양한 유형의 벡터가 당업계에서 이용가능하며, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아, 바이러스성, 및 효모 벡터가 포함된다. DNA 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, p1-유래된 인공 염색체 (PAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 또는 포유동물 인공 염색체 (MAC)를 비롯한 임의의 적합한 DNA 벡터일 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 벡터는 BAC이다. 다양한 DNA 벡터가 구조물에 삽입된 DNA의 크기에 대해 적당하게 선택된다. 한 실시양태에서, DNA 구조물은 박테리아 인공 염색체 또는 그의 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "박테리아 인공 염색체" 또는 "BAC"는 박테리아 DNA 벡터를 일컫는다. BAC, 예컨대 이. 콜라이로부터 유래된 것은 상동 재조합을 통해 인간 이외의 포유동물 세포 또는 동물의 DNA 서열을 도입, 결실 또는 대체하기 위해 이용될 수 있다. 이. 콜라이는 코스미드 또는 효모 인공 염색체보다 DNA 안정성이 더 큰 BAC의 형태로 350 kb만큼 큰 복합체 게놈의 DNA를 유지할 수 있다 (문헌 [Shizuya and Kouros-Mehr, Keio J Med. 2001, 50(1):26-30] 참조). 게다가, 인간 DNA 게놈의 DNA의 BAC 라이브러리는 코스미드 또는 효모 인공 염색체에서의 라이브러리보다 인간 게놈의 보다 완전하고 정확한 표현을 갖는다. BAC는 참고로 그 전문이 본원에 포함되는 미국 출원 제10/659,034호 및 제61/012,701호에 더 상세하게 기재되어 있다.
인간 이외의 포유동물로 혼입될 Ig 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 DNA 단편은 좌의 인간화 전에 인간 이외의 포유동물의 동일한 종으로부터 단리된다. Ig 좌의 중첩 단편을 함유하는 다중 BAC는 인간화될 수 있고, 중첩 단편은 재조합되어 연속 IgH 또는 IgL 좌를 생성한다. 그 결과로 생성된 키메라 Ig 좌는 인간 이외의 포유동물 Ig 유전자 단편에 작동가능하게 연결된 인간 유전자 단편을 포함하여 기능적 Ig 좌를 제조하며, 여기서 상기 좌는 유전자 재배열을 수행하고, 그럼으로써 키메라 항체의 다각화된 레퍼토리를 제조할 수 있다.
BAC 재조합 및/또는 키메라 Ig 좌 또는 그의 단편의 조작을 위한 이들 과정은 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이가 숙주 Ig 좌 또는 그의 일부분을 함유하는 BAC로 형질전환될 것이 요구된다. 이어서 바실러스를 함유하는 BAC는 숙주 Ig 좌 또는 그의 일부분을 함유하는 BAC와 공유된 측면 상동성 서열에 연결된 바람직한 인간 Ig 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된다. 공유된 서열 상동성은 상동 재조합을 매개하고, 재조합 벡터 상의 인간 Ig 유전자 단편과 BAC 상의 인간 이외의 포유동물 Ig 유전자 단편 사이에서 교차된다. 상동적으로 재조합된 BAC의 검출은 벡터로 혼입된 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커를 이용할 수 있다. 인간화된 BAC는 박테리아로부터 용이하게 단리될 수 있으며, 녹-인 인간 이외의 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. BAC를 재조합하고 BAC 상의 DNA 내에서의 삽입 및 결실을 조작하는 방법 및 그로부터 유전자 변경된 마우스의 제조 방법은 문서화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Valenzuela et al. Nature Biotech. (2003) 21:652-659]; [Testa et al. Nature Biotech. (2003) 21:443-447]; 및 [Yang and Seed. Nature Biotech. (2003) 21 :447-451]을 참조한다.
제1 재조합 단계는 sbcB, sbcC, recB, recC 또는 recD 활성이 결핍되고 recA에서 온도 감수성 돌연변이를 갖는 이. 콜라이 균주에서 수행될 수 있다. 재조합 단계 이후에, 다양한 서열 및 기재된 바와 같은 배향을 갖는 재조합된 DNA 구조물이 단리된다.
BAC 리컴바이니어링 (recombineering)에 사용된 영역은 상동 재조합을 허용하는 길이여야 한다. 예를 들어, 측면 영역은 약 0.1 내지 19 kb, 전형적으로 약 1 kb 내지 15 kb, 또는 약 2 kb 내지 10 kb일 수 있다.
Ig 좌의 일부분을 포함하는 보다 큰 및/또는 조정된 BAC를 제조하기 위한 BAC 재조합 과정은 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이가 제1 Ig 좌, 그의 일부분, 또는 몇 가지 다른 표적 서열을 운반하는 BAC로 형질전환될 것이 요구된다. 이어서 이. 콜라이를 함유하는 BAC는 바람직한 Ig 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 BAC)로 형질전환되어 마우스 IgH 좌로부터의 영역에 결합될 표적 DNA, 예를 들어, 하나 이상의 인간 VH, DH 및/또는 JH 유전자 단편으로 도입되며, 여기서 벡터는 둘 다 서열 동일성의 영역을 갖는다. 이. 콜라이에서 기능적 recA의 존재 하에 동일성의 이 공유된 영역은 재조합 벡터 상의 Ig 유전자 단편과 BAC 상의 인간 이외의 포유동물 Ig 유전자 단편 사이에 교차를 매개한다. 상동적으로 재조합된 BAC의 선택 및 분석 (resolution)은 벡터로 혼입되는 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커를 이용할 수 있다. 인간화된 및 키메라 인간-마우스 BAC는 이. 콜라이로부터 용이하게 정제될 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 DNA를 도입하고, 임의 또는 표적화된 통합 사건에 대해 선택하고/하거나 스크리닝함으로써 형질전환 및 녹-인 인간 이외의 세포 및 동물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
별법으로, 인간 이외의 포유동물로 혼입될 Ig 좌를 함유하는 DNA 단편은 시험관 내에서 합성된 DNA로부터 유래된다. 다수의 유기체의 게놈은 완전히 시퀀싱되었고 (예를 들어, 인간, 침팬지, 레서스 (rhesus) 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 닭, 기니아 피그, 토끼, 말, 소), 주석으로 공개적으로 이용가능하다. 특히 여기에 제한되는 것은 아니지만, 인간 및 마우스 면역글로불린 좌가 연구되었고, 코딩 유전자 단편 및 비-코딩 조절 요소의 위치 및 활성에 대해 특성화되었다. Ig 좌의 서열은 핵산 서열 분석을 위해 통상적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 조작되고 인실리코 (in silico) 재조합될 수 있다. 인실리코 재조합은 동일한 좌 내에서, 동일한 종으로부터의 2개의 좌 사이에서, 또는 둘 이상의 종으로부터의 2개의 좌 사이에서 일어날 수 있다. Ig 좌의 서열은 또한 동일한 또는 상이한 종으로부터의 비-면역글로불린 좌로부터 얻은 것으로 인실리코 재조합될 수 있다. 그러한 서열은 여기에 제한되지는 않지만, 양성 및 음성 약물 선택 마커에 대한 유전자, 예컨대 G418, hyg, puro 및 tk, 및 부위-특이적 재조합효소 인식 서열, 예컨대 loxP 부위 및 그의 변종 및 frt 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 서열을 인실리코 조립 후에, 이어서 이는 합성되고 오류 없이 조립될 수 있다 (문헌 [Kodumal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2004) 101:15573-15578]). 큰 DNA의 합성, 조립 및 시퀀싱은 계약을 기반으로 제공된다 (예를 들어, 디엔에이 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA); 블루 헤론 바이오테크놀로지 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA); 및 유로젠텍 (Eurogentec, San Diego, CA)). 그러한 합성 DNA 서열은 벡터, 예컨대 플라스미드 및 BAC 내에서 운반되고, 다른 벡터 예컨대 YAC로 옮겨질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "구조물"은 유전자 조작, 리콤비니어링 또는 합성에 의해 인공적으로 구축된 DNA 서열을 일컫는다. 한 실시양태에서, DNA 구조물은 재조합 전에 선형화된다. 다른 실시양태에서, DNA 구조물은 재조합 전에 선형화되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "loxP" 및 "CRE"는 P1 박테리오파지로부터 유래된 부위-특이적 재조합 시스템을 일컫는다. loxP 부위는 34개의 뉴클레오티드 길이이다. DNA가 loxP 부위에 의해 어느 한 측면에 붙으면 CRE 매개된 재조합에 노출되고, 개재 DNA는 삭제되며, 두 loxP 부위가 하나로 만난다. 마우스를 비롯한 다수의 종에서 유전자 조작을 위한 변종-서열 lox 부위를 비롯한 CRE/lox 시스템의 사용은 익히 문서화되어 있다. 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)로부터의 frt 부위 및 flp 재조합효소를 이용하는 유사한 시스템이 이용되어 유사한 효과를 낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 배양 중인 포유동물 세포에서 결실 사건을 매개하기 위한 CRE/loxP의 임의의 구현은 또한 flp/frt 시스템에 의해 매개될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역화하다", "면역화", 또는 "면역화하는"은 동물의 후천성 면역계를 항원에 노출시키는 것을 일컫는다. 항원은 투여, 예컨대 주사, 흡입 또는 섭취의 다양한 경로를 이용하여 도입될 수 있다. 동일한 항원에 두 번째 노출 시, 후천성 면역 반응, 즉 T 세포 및 B 세포 반응이 증진된다.
"항원"은 후천성 면역계에 의해 인식되는 펩티드, 지질 또는 아미노산을 일컫는다. 항원의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아 세포벽 성분, 화분, 및 rh 인자가 포함된다. "표적 항원"은 특이적 감염제 또는 내인성 세포에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 선택된 후천성 면역계에 의해 인식되는 항원, 펩티드, 지질, 당류, 또는 아미노산을 일컫는다. 표적 항원에는, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아 및 바이러스성 성분, 종양-특이적 항원, 사이토카인, 세포 표면 분자 등이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약" 또는 "제약 약물"은 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있는 임의의 약리학적, 치유적 또는 활성 생물학적 작용제를 일컫는다. 특정 실시양태에서 대상체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다.
용어 "제약적으로 허용가능한 담체"는 제약 약물을 동반할 수 있고, 대상체의 면역계와 역반응을 야기하지 않는 임의의 물질을 일반적으로 일컫는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는"은 제약 약물 또는 다른 작용제, 예컨대 표적 항원을 대상체에게 전이, 전달, 도입, 또는 수송하는 임의의 방식을 일컫는다. 그러한 방식에는 경구 투여, 국소 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 비강내, 또는 피하 투여가 포함된다.
녹-인 인간 이외의 포유동물 및 세포
본 발명의 녹-인 인간 이외의 포유동물 및 세포는 내인성 유전자 단편을 대체하는 변경된 IgH 또는 IgL, 또는 둘 다, 이종상동성 인간 Ig 유전자 단편을 포함하는 좌를 포함한다. 예를 들어, 구체적 실시양태에서 특이적 내인성 CH 유전자에서 CH1 도메인을 대체하는 인간 CH1 도메인, 예를 들어, Cμ, Cδ, Cγ는 각각의 마우스 CH 영역에 대해 이종상동성 서열일 수 있다. 내인성 Cγ 유전자 각각에 대해, 대체 CH1은 이종상동성 인간 CH1일 수 있거나, 또는 치유적 mAb로 보다 빈번하게 사용되는 인간 IgG 이소타입의 인간 CH 유전자로부터의 단일 Cγ, 전형적으로 Cγ1 , Cγ2 또는 Cγ4일 수 있어서, 보다 임상적으로 관련된 인간 CH1 도메인의 맥락에서 인간 V 도메인의 생체 내 돌연변이를 더욱 촉진한다.
임의로, 내인성 C 유전자의 상부 힌지 서열은 또한 이종상동성 인간 C 힌지 서열로 각각 대체될 수 있다. 별법으로, 내인성 C 유전자의 상부 및 중간 힌지 서열은 또한 이종상동성 인간 C 힌지 서열로 각각 대체될 수 있다. 인간 중간 힌지 영역이 사용된 경우, 인간 Cγ4 중간 힌지 서열은 이황화결합을 통한 상호-중쇄 이량체화를 유도하기 위해 229 잔기 위치에서 세린보다는 프롤린을 함유하도록 조작될 수 있다. 내인성 Cγ 유전자의 보다 낮은 힌지 영역인 CH2 도메인의 일부는 내인성 FcγR로 최적의 결합을 촉진하도록 남겨질 수 있다. 이러한 조작은 상부 및 중간 힌지 영역이 또한 인간으로 전환되는 경우, 인간 중쇄 Fab 도메인, Fab 도메인 플러스 상부 힌지, 또는 F(ab')2를 제조할 것이며, 이는 완전 인간 IgG로 전환시 최적의 특성을 보유하도록 할 것이다.
J 유전자 클러스터의 내인성 IgH 좌 하류 및 인간 CH1-내인성 CH2-CH3 (및 Cμ에 대해 CH4)를 갖는 각각의 보유된 C 유전자 및 막 및 세포내 도메인 엑손을 포함하는 BAC는 제1 도입 단계에 이어 내인성 V-D-J 유전자의 그의 인간 이종상동체로의 대체 또는 반대 순서로, 인간 V, D 및 J의 도입에 이어 상기 기재된 바와 같이 조작된 내인성 C 유전자의 도입과 같이, 상동 재조합-수용성 세포, 예컨대 마우스 ES 세포에서 내인성 IgH 좌로 상동적으로 재조합될 것이다. BAC 상의 Ig 좌에서의 함량은 하나 상의 유일한 C 유전자 단편 및 다른 하나 상의 V, D 및 J 유전자 단편으로 제한되지 않는다. C 유전자 단편을 갖는 BAC는 J 유전자 단편 및 D 유전자 단편까지 및 하나 이상의 V 유전자 단편까지 또한 함유할 수 있다. 별법으로, V 유전자 단편을 갖는 BAC는 D 유전자 단편 및 J 유전자 단편까지 및 하나 이상의 C 유전자 단편까지 함유할 수 있다.
불변 영역 유전자를 운반하는 BAC는 임의의 원치 않는 유전자 단편, 예컨대 Cε 및 Cα 유전자를 결실시키기 위해 ES 세포로 도입하기 전에 이. 콜라이에서 조작되거나 또는 시험관 내 합성될 수 있다. 이는 녹-인 동물로 하여금 1차 면역 반응에 대한 Cμ 및 Cδ, 및 2차, 친화성-성숙된 면역 반응에 대한 Cγ 이소타입을 만들도록 할 것이며, 이로부터 치유적 항체 후보자가 전형적으로 회수될 것이다. 내인성 IgH 3' LCR은 변경되지 않은 채로 둘 수 있다.
내인성 Cκ 좌를 대체하기 위해서 완전한 인간 Cκ 유전자가 임의로 또한 BAC로 혼입될 수 있는 것을 제외하고, 유사한 대체 전략이 내인성 Igκ 좌에 대해 이용될 수 있으며, 그에 따라 완전 인간 Igκ 쇄를 제조한다. 인간 Cλ 좌는 또한 유사한 방식으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 C 영역을 비롯한 완전 인간 Ig 좌를 완전한 내인성 Ig 좌의 자리에 혼입하는 것을 포함한다. 이 실시양태에서, 내인성 FcR 유전자의 클러스터는 또한 상동 재조합 수용성 세포, 예컨대 마우스 ES 세포에서 유사한 BAC-기재 유전자 조작을 이용하여 인간 FcR 유전자의 이종상동성 클러스터로 대체된다. 내인성 FcγR 유전자의 클러스터는 인간 IgH 좌 또는 그의 일부분이 내인성 좌를 대체하는 동일한 ES 세포에서, 또는 개별 ES 세포에서 대체될 수 있다. 후자의 경우에서, 마우스는 상기 ES 세포로부터 유래될 수 있고, 조작된 Ig 좌(들)을 운반하는 마우스와 함께 육종하여 마우스 FcγR 유전자의 자리에서 인간 FcγR에 결합하는 인간 IgG 항체를 만드는 마우스를 제조한다. 각각의 방식으로 완전 인간 항체가 제조될 수 있고, 면역 반응 동안 인간 FcR 수용체와 정상적으로 맞물리게 할 수 있다. 그러한 녹-인 동물은 또한 모델에 대한 적당한 유전자 배경, 즉, SCID, nu/nu, nod, 및 lpr 마우스로 육종시, 질환 모델에서 인간 치유적 mAb 후보자의 활성 및 이펙터 기능에 대해 시험하기에 유용한 이점을 갖는다. 추가로, 인간 표적 유전자 서열은 상동 재조합-수용성 세포에서 BAC 표적화 기술을 이용하여 내인성 유전자를 대체할 수 있으며, 이는 항체의 표적 확인 및 기능적 시험을 위한 모델을 제공한다. 이 경우에서, 인간 CH 유전자는 B 세포에서 천연 (native) 신호 형질도입을 촉진하기 위해 마우스 또는 다른 이종상동성 종으로부터의 세포질 및/또는 막 도메인 유전자 단편을 갖도록 조작될 수 있다.
게다가, 본 발명의 다른 측면은 바람직한 인간 V 영역의 고안에 관한 것이다. 구체적으로, 전체 인간 V 도메인 레퍼토리 또는 그의 일부분은 세포의 게놈으로 혼입될 수 있거나, 또는 조정된 V 도메인 레퍼토리가 혼입될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 모든 공지된 인간 일배체형에 걸쳐 통상적인 기능적 V 유전자 단편으로만 구성되는 V 도메인 레퍼토리를 조정하는 대신, 몇 가지 인간 일배체형으로부터 빠진 V 도메인 유전자 단편을 제외하는 것이 바람직하다. 이는 모든 잠재적 환자에 걸쳐 보다 면역 내성화된 V 도메인을 갖는 항체 약물 후보자를 제공하며, 그렇게 함으로써 대상체에게 인코딩된 항체의 투여시 위험한 면역 반응의 유도를 방지한다. 하나 이상의 V 도메인 유전자 단편이 혼입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 바람직한 Ig 좌 유전자 단편을 함유하는 BAC는 상동 재조합을 통해 이 유전자 정보를 표적 세포로 혼입하기 위해 사용된다. 이. 콜라이에서 BAC 조작의 특징은 수용성 세포로 도입하기 전에 면역글로불린 좌를 정교하게 조정하기 위한 추가적 기회를 제공한다. 예를 들어, 인간 DH 클러스터는 다른 종, 예컨대 인간 이외의 영장류, 토끼, 래트, 햄스터 등으로부터의 D 유전자로 대체되거나 보충될 수 있다. BAC 라이브러리 및 Ig 좌의 완전한 서열은 다수의 종에 대해 이용가능하다. IgH 좌 내의 D 유전자 단편은 공개적으로 이용가능한 서열 또는 유전자 구조 정보로부터, 또는 적당한 D 특이적 프로브 또는 프라이머를 이용한 시험에 의해 한정될 수 있다. 이종상동성 D 유전자 클러스터 또는 그의 일부분은 BAC로 상동적으로 재조합될 수 있거나 또는 인실리코 조립된 후에 합성될 수 있고, 그 안에 인간 D 유전자 단편의 클러스터를 대체하거나 첨가할 수 있다. 상보성 결정 영역-3 (CDR3)을 만드는 데서 발생하는 유의한 다양화의 이유 및 V 영역의 구조가 CDR3이 일반적으로 용매 접근불가능하기 때문에, CDR3 서열에 대한 면역원성은 덜 고려된다. 따라서, CDR3에 혼입된 인간 이외의 D 유전자에 의해 인코딩된 아미노산은 덜 면역성일 수 있다. 인간 이외의 D 유전자는 항원-특이적 항체의 패널에서 에피토프 특이성 및 친화성의 범위를 확장할 신규 CDR3 구조물을 제조함으로써 이점을 부여할 수 있으며, 그 안에서 mAb의 패널에 의해 매개된 활성의 질을 확장한다.
유사하게, JH 유전자 클러스터, 즉, 하나 이상의 JH 유전자 단편은 포유동물에 걸친 상대적 서열 보존성으로 인해 인간 이외의 다른 종으로부터 얻을 수 있다. JH 유전자 단편은 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터, 및 마우스로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, JH 유전자 단편은 인간으로부터 유래된다.
내인성 Ig 좌의 부분 또는 전체를 대체하기 위해 Ig 좌의 상동 재조합-수용성 세포로의 조작 후에, 유전적으로 조작된 인간 이외의 포유동물, 예컨대 마우스는 현재-표준 방법, 예컨대 배반포 미세주입에 이어 키메라 동물의 육종, 상실배 응집 또는 클로닝 방법론, 예컨대 체세포 핵 이식에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 변경된 IgH 및 IgL 좌를 갖는 마우스는 동형접합성 IgH 및 IgL (Igκ 또는 Igλ)을 제조하기 위해 육종될 수 있다. 다단계 육종은 변경된 IgH, Igκ 및 Igλ 좌에 대해 동형접합성인 동물을 제조할 수 있다. 동형접합성 동물을 사용하는 것보다 다소 덜 효율적일지라도, 활성 내인성 Ig 좌로부터의 항체의 제조가 또한 있을 수 있기 때문에, 완전-마우스 및 인간-마우스 항체 둘 다 제조할 수 있는 IgH 및 IgL 좌에 대해 이형접합성인 동물이 또한 항원-특이적 인간 V-마우스 C mAb를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 변경된 IgL 좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 마우스로부터의 VL 도메인과 혼합된 경우, 특히 마우스가 면역화된 경우에 단 하나의 변경된 좌, 예를 들어, IgH에 대해 이형접합성 및 동형접합성인 마우스는 또한 항체 표시 라이브러리에 대한 인간 VH 도메인 (VH-CH1)의 공급원으로서 유용할 수 있다 (하기 참조). 예를 들어, 하나는 인간 VH-CH1-마우스 CH2-CH3을 갖고 다른 하나는 인간 VK-CK-를 갖는 두 개별 마우스로부터의 항체 표시 라이브러리는 분자 생물학에서 익히 성립된 기술을 이용하여 완전 인간 항체를 회수하기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 변경된 좌, 예를 들어, IgH 및 Igκ에 대해 이형접합성 및 동형접합성인 마우스는 또한 항체 표시 라이브러리에 대한 인간 VH 및 VL 도메인의 공급원으로서 유용할 수 있다.
특정 실시양태는 인간 VH 및 CH1 유전자 단편을 포함하는 키메라 Ig 중쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물을, 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물과 함께 육종하는 단계; 키메라 Ig 중쇄 좌 및 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 자손을 추가로 육종하는 단계; 및 키메라 중쇄 및 인간 경쇄 좌에 대해 동형접합성인 게놈을 갖는 자손을 제조하는 단계를 포함하는, 인간 VH 및 CH1 유전자 단편 및 인간 Ig 경쇄 좌를 인코딩하는 게놈을 갖는 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법을 제공한다. 관련된 실시양태에서, 포유동물의 게놈은 또한 인간 JH 유전자 단편을 인코딩한다.
이 유전자 조작 전략은 또한 마우스 이외의 동물의 조작에 적용하여 이종발생성 C 영역, 또는 완전하게 인간 항체, 또는 몇 가지 그의 중간체와 함께 인간 서열 V 영역을 발현하도록 할 수 있다. 배반포 미세주입 또는 상실배 응집을 통한 유전자 조작을 위한 ES 세포 기술이 현재 부족한 동물에 대해, 내인성 좌는 다양한 클로닝 기술 또는 발달 리프로그래밍을 잘 받아들이는 세포에서 변경될 수 있다 (예를 들어, 유도된 분화다능 줄기 세포, IPS). BAC 기술에 의해 제공된 상동 재조합의 증가된 빈도는 세포에서 두 배로 복제된 좌를 발견하는 능력을 제공하며, 그로부터 유래된 클로닝된 동물은 돌연변이에 대해 동형접합성일 수 있어, 특히 긴 세대 기간을 갖는 큰 동물을 육종하는 경우 시간 및 비용을 절약한다. 배양된 세포에서 반복 대체는 다중 좌에서 필요한 모든 조작을 제공할 수 있으며, 이어서 적당한 유전자형을 얻기 위해 교배-육종 없이 클로닝 또는 IPS 기술을 이용하여 동물을 직접 제조할 수 있도록 한다. 도입된 Ig 유전자를 정교하게 조정하는 능력 및 또한 이들이 도입된 부위를 정교하게 특정하는 능력은 더 나은 기능을 제공할 증진된 결과물의 조작 능력을 제공한다. 조작된 동물, 예컨대 염소, 소류, 양류, 말류, 토끼, 개 등은 완전 인간 폴리클로날 항체의 공급원일 수 있다.
또한, BAC가 염색체 기능을 위해 요구되는 DNA 성분, 예를 들어, 말단소체 및 동원체, 바람직하게는, 요구되지는 않지만, 최적의 기능을 위한 수용체 종의 DNA 성분, 예를 들어, 마우스 말단소체 및 마우스 동원체를 갖는 이. 콜라이에서 조작되는 경우, 이는 전기천공, 미세주입 등에 의해 수용체 세포로 도입될 수 있으며, 인공 염색체로서 기능할 것이다. 이들 BAC-기재 인공 염색체는 또한 보다 큰 인공 염색체를 개발하기 위한 상동 재조합의 후속적 단계를 위한 토대로서 사용될 수 있다.
벡터, 예컨대 플라스미드, BAC 또는 YAC 상의 본원에 기재된 조작된 Ig 좌 또는 좌들은 또한 미세주입을 통해 배아, 예컨대 마우스, 토끼, 래트, 또는 햄스터의 전핵으로 도입된 표준 전이유전자로서 사용될 수 있다. 수 가지 BAC, YAC, 플라스미드 또는 그의 임의의 조합은 공동-미세주입될 수 있고, 공동-통합되어 기능성 좌를 만들 것이다. 당업계에 공지된 다양한 방법이 이용되어 내인성 Ig 좌를 비활성화시킬 수 있고, 조작된 Ig 전이유전자를 갖는 동물을 하나 이상의 비활성화된 내인성 좌를 갖는 동물과 함께 육종하여 비활성화된 내인성 좌로부터의 완전한 천연 면역글로불린의 생산없이 전이유전자로부터 항체를 발현시키는 유전자형을 유도한다.
항체
변경된 좌를 운반하는 동물은 당업계의 다양한 기술을 이용하여 표적 항원으로 면역화될 수 있다. 표적 항원은 특정 질환 또는 장애, 예컨대 다양한 유형의 암, 이식 편대 숙주 질환, 심혈관 질환 및 관련된 장애, 신경학적 질환 및 장애, 자가면역 및 염증성 장애, 및 병원성 감염의 치료 또는 예방을 위해 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 항원은 상기 질환 또는 장애 중 하나를 검출하기 위한 진단제로 유용할 항체를 개발하기 위해 선택될 수 있다.
항원-특이적 레퍼토리는 하이브리도마 (hybridoma) 기술, 선택된 B 세포에 대한 단일-세포 RT-PCR, 항체 표시 기술, 및 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 면역화된 마우스로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 마우스-유래된 하이브리도마로부터 mAb를 회수하기 위해, 인간 V-CH1-마우스 힌지+CH2+CH3 항체 또는 인간 V-CH1-상부/중간 힌지-마우스 하부 힌지+CH2+CH3 항체 (IgH 좌 조작에 따라 달라짐)가 배양 상층액으로 분비될 것이고, 당업계에 공지된 수단, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 등을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 그러한 정제된 항체는 항체의 추가적 시험 및 특성화를 위해 사용되어 시험관 내 및 생체 내 효능, 친화성 등을 결정할 수 있다.
게다가, 이는 항-마우스 불변 영역 2차 작용제로 검출될 수 있으므로, 인간 V-CH1 (상부/중간 힌지)-마우스 CH2-CH3 mAb는 표적 항원의 조직 분포 및 발현을 평가하기 위한 인간 조직의 면역화학 분석에 유용할 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 이러한 특성은 정상 인간 Ig를 함유하는 조직에 대한 항-인간 불변 영역 2차 검출제를 사용하는 데 있어서 때때로의 도전으로 인해 인간 Fc 영역의 몇 가지 조직에서의 세포 상에 발현되는 인간 FcR로의 결합으로부터 완전 인간 mAbs에 걸친 mAb의 특이적 확인을 가능하게 한다.
mAb의 인간 가변 영역은 표준 방법에 의해 회수 및 시퀀싱될 수 있다. 리드 후보자 mAb를 확인하기 전 또는 후에, 인간 VH 및 VL 도메인에 대한 유전자, 게놈 DNA 또는 cDNA는 다양한 분자 생물학적 방법, 예컨대 RT-PCR에 의해 회수된 후에, 인간 불변 영역의 나머지 부분을 인코딩하는 DNA에 부착되어, 완전 인간 mAb를 제조할 수 있다. 완전 인간 VH-CH 및 인간 VL-CL을 인코딩하는 DNA는 당업계에 공지되거나 주문제작될 수 있는 적합한 발현 벡터로 클로닝되고, 포유동물 세포, 효모 세포, 예컨대 피치아 (Pichia), 다른 균류 등으로 형질감염되어 항체를 배양 상층액으로 분비할 수 있다. 다른 생산 방법, 예컨대 마우스에서 하이브리도마 세포를 이용한 복수, 우유 또는 계란으로 항체를 분비하는 형질전환 동물, 및 과일, 뿌리 또는 잎에서 항체를 만드는 형질전환 식물은 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 완전 인간 재조합체 항체는 다양한 방법, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 등을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
정제된 항체는 저장을 위해 동결건조되거나, 또는 인간을 비롯한 동물로의 안전한 투여에 지장이 없는 용해성 및 안정성에 대해 당업계에 공지된 다양한 용액으로 제제화될 수 있다. 정제된 재조합체 항체는 효능, 친화성, 특이성 등, 효능에 대한 동물 모델, 독성학 및 약동학 등에 대한 시험관 내 분석을 이용한 추가적 특성화를 위해 사용될 수 있다. 또한, 정제된 항체는 임상적 목적, 예컨대 질환의 치료 및 진단을 위해 인간에게 투여될 수 있다.
인간 V-CH1-(상부/중간 힌지)-내인성 CH2-CH3 mAb의 다양한 단편은 시약, 진단 및 치료를 비롯한 다양한 목적을 위해 효소에 의한 절단, 재조합체 기술 등을 비롯한 방법에 의해 단리될 수 있다. 인간 가변 도메인+CH1 또는 인간 가변 도메인만의 cDNA는 상기 기재된 조작된 인간 이외의 포유동물, 구체적으로 2차 림프기관, 예컨대 비장 및 림프절로부터 얻은 RNA, 및 다양한 항체 표시계, 예컨대 파지, 리보좀, 이. 콜라이, 효모, 포유동물 등으로 구현된 VH 및 VL cDNA로부터 단리될 수 있다. 녹-인 포유동물은 면역학적으로 감염되지 않거나, 또는 선택 항원에 대해 최적으로 면역화될 수 있다. 적당한 PCR 프라이머, 예컨대 가변 도메인의 리더 영역 또는 프레임워크 1에서의 5' 및 Cγ 유전자의 인간 CH1에서의 3'을 이용함으로써, 육체적으로 성숙된 V 영역은 친화성 성숙된 레퍼토리를 단독으로 표시하기 위해 회수될 수 있다. 표시된 항체는 표적 항원에 대해 선택되어 높은-친화성 항원-특이적 완전 인간 Fv 또는 Fab를 효율적으로 회수할 수 있고, mAb가 녹-인 포유동물로부터 직접 회수되는 경우, 존재할 수 있는 CH2-CH3 도메인의 녹-인 포유동물을 제거할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 정제된 항체는 특정 질환 또는 장애, 예컨대 다양한 유형의 암, 이식 편대 숙주 질환, 심혈관 질환 및 관련 장애, 신경학적 질환 및 장애, 자가면역 및 염증성 장애, 알러지, 및 병원성 감염의 치료 또는 예방을 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태, 대상체는 인간이다.
항체 조성물은 약 0.1 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 약 1 내지 10 mg/ml의 농도로 대상체에게 투여된다. 항체 조성물은 국소적으로, 비강 내로, 또는 주사를 통해, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 안내, 또는 피하 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 주사이다. 투여는 약 10분 내지 24시간, 바람직하게는 30분 내지 약 6시간에 걸쳐 단일 주사 또는 주입으로 이루어질 수 있다. 유효 투여가 1회 또는 연속 주사로 투여될 수 있다. 반복 투여는 약력학, 약동학 및 임상 징후에 따라 1일 2회, 1일 1회, 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 1달 1회, 또는 3달 1회로 투여될 수 있다. 요법은 임의의 증상의 부재시에도 확장된 기간 동안 지속될 수 있다.
정제된 항체 조성물은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 항체 조성물은 다중 이소타입의 항체 또는 단일 이소타입의 항체를 함유할 수 있다. 항체 조성물은 변경되지 않은 키메라 항체를 함유할 수 있거나, 또는 항체는 몇 가지 방식으로, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변경될 수 있다. 항체 조성물은 변경되지 않은 인간 항체를 포함할 수 있거나, 또는 인간 항체는 몇 가지 방식, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변경될 수 있다. 따라서 항체 조성물은 온전한 Ig 분자 또는 그의 단편, 즉, Fab, F(ab')2, 또는 Fc 도메인을 함유할 수 있다.
단독 또는 다른 요법제와 조합으로 감염제에 대한 항체 조성물의 투여는 대상체로부터 감염제의 제거를 초래한다. 항체 조성물의 투여는 대상체에 존재하는 감염성 유기체의 수를 10 내지 100배, 바람직하게는 1,000배 또는 1,000배 이상 감소시킨다.
유사하게는, 단독 또는 다른 화학요법제와 조합하여 암 세포에 대한 항체 조성물의 투여는 대상체로부터 암 세포의 제거를 초래한다. 항체 조성물의 투여는 대상체에 존재하는 암 세포의 수를 10 내지 100배, 바람직하게는 1,000배, 또는 1,000배 이상 감소시킨다.
본 발명의 특정 측면에서, 항체는 또한 가용성이거나 또는 세포 표면에 결합된 항원 분자에 결합하고 중화시키기 위해 이용될 수 있다. 그러한 중화는 순환계에서 항원 분자의 제거를 증진시킬 수 있다. 중화를 위한 표적 항원 분자에는, 여기에 제한되지는 않지만, 독소, 내분비 분자, 사이토카인, 케모카인, 상보체 단백질, 박테리아, 바이러스, 균류, 및 기생충이 포함된다. 그러한 항체는 단독으로 또는 다른 항체, 다른 생물학적 약물, 또는 화학 작용제를 비롯한 다른 요법제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체가 세포 표면 수용체 신호전달을 증진시키거나 억제하기 위해 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 세포 표면 수용체에 특이적인 항체는 요법제 또는 연구 도구로 이용될 수 있다. 세포 표면 수용체의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 면역 세포 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 작용성 수용체, 안지오텐신 수용체, 도파민 및 세로토닌 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 히스타민 수용체 등이 포함된다. 그러한 항체는 단독으로 또는 다른 항체, 다른 생물학적 약물, 또는 화학 작용제를 비롯한 다른 요법제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 추가로 변경되어 치유적 잠재력을 증진시킬 수 있음이 또한 고려된다. 변형은 화학물질, 예컨대 화학요법제, 방사성 동위원소, siRNA, 이중 가닥 RNA 등에 직접- 및/또는 간접-접합을 포함할 수 있다. 다른 변형은 증가된 또는 감소된 항체-의존성 세포의 세포독소, 증가된 또는 감소된 상보체-의존성 세포독소, 또는 증가된 또는 감소된 순환 반감기에 대해 조작된 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 상기 질환 또는 장애 중 하나를 검출하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다. 키메라 항체는 항체의 일부분, 예컨대 Fc 또는 Fab 도메인을 인식하는 2차 검출제를 사용하여 검출될 수 있다. 불변 영역의 경우에서, 인식된 일부분은 CH1, CH2, 또는 CH3 도메인일 수 있다. Cκ 및 Cλ 도메인은 또한 검출을 위해 인식될 수 있다. 면역조직화학 분석, 예컨대 표적 항원의 조직 분포 평가는 본 발명의 항체의 키메라 성질의 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 인간 조직 샘플의 평가시, 2차 검출제 시약은 Ig 분자의 인간 이외의 일부분을 인식함으로써, 조직 샘플에 존재할 수 있는 배경 또는 인간 Ig 분자로의 비-특이적 결합을 감소시킨다.
제약 조성물 및 키트
본 발명은 또한 제약 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제약 조성물은 제약적으로 허용가능한 담체 중에 항체, 또는 그의 단편을 포함한다. 제약 조성물은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 생체 내로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물은 조합해서 사용하기 위한 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 작용제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 항체, 또는 그의 단편, 및/또는 방법과 관련된 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 진단 또는 치료 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 조성물 또는 항체의 용도 및 포장에 대한 지침서를 추가로 제공할 수 있다.
본 발명의 키트는 디바이스, 시약, 용기 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 또한 컴퓨터를 비롯한 장치, 기구 또는 디바이스의 사용이 요구될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 추가적인 예시로 제공된 것이고 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 본 명세서를 통해 인용된 모든 참고문헌, 특허, 공개된 출원의 교시 뿐만 아니라 도면은 참고로 본원에 포함된다.
실시예
1
이. 콜라이에서 BAC의 고안
미국 특허 출원 공개공보 제2004/0128703호에 기재된 바와 같이, 이. 콜라이에서 BAC의 조작은 BAC에 운반된 게놈 DNA의 미세 조정을 위한 강력한 도구를 제공한다. 마우스 불변 영역 유전자, 예를 들어, Cγ1 또는 모든 마우스 Cγ 유전자 또는 마우스 Cμ, Cδ 및 모든 마우스 Cγ 유전자 중 하나 이상에서 마우스 CH1을 인간 CH1로 대체하기 위해 변경된 마우스 BAC를 이. 콜라이에서 제조한 후에, 배아 줄기 세포에서 상동 재조합에 사용하였다. 예를 들어, 표적화된 BAC에서, Cγ 유전자의 적어도 하나에서 전체까지의 마우스 CH1 엑손은 인간 CH1 엑손으로 대체하였다. 이러한 대체는 이. 콜라이에서 상동 재조합 방법을 이용하여 유사하게 수행하였다. 이로써 생긴 변경된 BAC는 인간 D 영역, 인간 J 영역, 및 하류 마우스 Cμ 영역, Cδ 영역, Cγ3 영역 (γ3의 마우스 CH1은 인간 CH1에 의해 대체됨), 변경된 Cγ1 영역 (γ1의 마우스 CH1은 인간 CH1에 의해 대체됨), 변경된 Cγ2B 영역 (γ2B의 마우스 CH1는 인간 CH1로 대체됨), 및 변경된 Cγ2C (γ2C의 마우스 CH1는 인간 CH1에 의해 대체됨)을 운반하는 점라인-배치 (germline-configured) 단편을 가졌다. 이러한 전략은 또한 Cμ 및 Cδ 유전자의 CH1 엑손을 변형하기 위해 사용할 수 있다. 마우스에 대한 인간의 상류 및 중간 힌지 영역 코딩 서열과 같은 다른 정확한 대체도 또한 만들어질 수 있었다. 단일 코돈 및 단일 뉴클레오티드 변화와 같이 작은 것을 포함하는 추가적으로 정교하게 조정된 변화도 대체되는 DNA로 조작할 수 있었다.
실시예
2
이. 콜라이에서 BAC의 상동 재조합
BAC 벡터는 이. 콜라이에서 발견되는 F-팩터에 기초하였다. F-팩터 및 그로부터 유래된 BAC 벡터는 생활사에 의존하여 일반적으로 세포당 하나 또는 두 개의 카피로 발견되는 낮은 카피의 플라스미드로서 유지하였다. F-팩터 및 BAC 벡터 둘 다는 세포에서 플라스미드의 부가적 카피를 배제하는 fi+ 표현형을 제시하였다. 이 기작에 의하여, 이. 콜라이가 하나의 BAC를 이미 운반하고 유지할 때, 그 후 이. 콜라이에 부가적 BAC가 도입되고 세포는 세포에 이전에 존재한 BAC, 또는 새로 도입된 외부 BAC 중 오직 하나의 BAC를 유지하였다. 이러한 특성은 하기 기재된 바와 같이 상동 재조합된 BAC를 선택적으로 단리하는데 매우 유용하였다.
이. 콜라이에서 상동 재조합은 기능적 RecA 유전자 생성물을 필요로 하였다. 이 실시예에서, RecA 유전자는 온도-민감성 돌연변이를 가지고 있어 인큐베이션 온도가 37℃ 이하 일 때만 ReaA 단백질이 기능적이었다. 인큐베이션 온도가 37℃ 이상인 경우, RecA 단백질은 기능을 상실하게 되거나 또는 현저히 감소된 재조합 활성을 갖게 되었다. 온도 민감성 재조합은 바람직한 경우에만 조건부 상동 재조합을 활성화하기 위해 이. 콜라이에서 RecA 기능의 조작을 허용하였다. 또한 RecA의 저온-민감성 돌연변이의 수득, 선택 또는 조작이 가능하여, 상기 단백질은 특정 온도, 예를 들어 37℃ 이상에서만 오직 기능적이었다. 그러한 조건에서, 이. 콜라이는 비록 느린 세대 기간을 갖지만, 더 낮은 온도에서 성장하며, 재조합은 37℃ 이상에서 짧은 기간의 시간 동안 인큐베이팅함으로써 유발되어 재조합의 짧은 간격만을 허용할 것이다.
이. 콜라이에서의 상동 재조합은 2개의 원형 BAC에서 발견되는 중복 DNA 기질을 제공함으로써 수행하였다. 제1 BAC (BAC1)는 A로부터 E까지의 연속된 단편을 운반하고, 제2 BAC (BAC2)는 E로부터 I까지의 연속된 단편을 운반하였다. BAC 둘 다에 의해 운반되는 단편 E는 DNA 교차가 발생하는 중복 단편이고, 그 결과로서 A로부터 I까지의 연속적인 단편을 운반하는 재조합체를 제조하였다.
상기 기재된 BAC1은 세포에 이미 존재하는 것이고, BAC2가 세포 내로 도입되는 경우, BAC 둘 다가 아닌 BAC1 또는 BAC2 둘 중 하나가 세포에 존재하였다. BAC2를 세포 내로 전기 천공할 때, 조건부 RecA 활성을 허용하기 위해 온도를 37℃ 이하로 낮추어, 상동 재조합을 매개하였다. BAC1 및 BAC2가 선택가능한 마커를 각각 가지며 마커가 특징적으로 상이한 경우, 예를 들어, BAC1은 Kan (카나마이신 내성을 부여하는 유전자)을 운반하고 BAC2는 Amp (암피실린 내성을 부여하는 유전자)를 운반하며, 항생제 Kan 및 Amp 둘 다의 존재하에 재조합 BAC만이 성장하였다.
재조합 BAC의 개별 영역에서 2개의 E 유전자 단편이 존재하기 때문에, 두 벡터에 의해 측면에 위치한 E 단편은 두 가지 방법 중 하나에 의해 제거되어야 하며, 하나는 벡터 또는 E 영역에서의 상동 재조합에 의해 제거되는 것이고, 다른 하나는 CRE 재조합효소에 의한 loxP 부위 특이적 재조합에 의해 수행된다. 분해된 BAC는 이제 E의 단일 카피를 갖는 A로부터 I까지의 연속적인 구간을 가졌다.
실시예
3
이. 콜라이에서의 상동 재조합
상기 기재한 절차에 따라, BAC1 및 BAC2는 이. 콜라이에서 재조합을 수행하였다. BAC1 및 BAC2는 각각 156,427 bp 및 122,500 bp를 가지며, 이들은 42,363 bp가 중복되었다. 재조합 및 분해 후 결과적으로 얻어진 BAC의 크기는 236,564 bp였다. BAC 벡터 내에 또는 BAC의 적합한 영역에 Amp 유전자를 함유하는 BAC2를 BAC 벡터 내에 또는 BAC의 적합한 영역에 Kan 유전자를 갖는 BAC1을 운반하는 이. 콜라이 바실러스로 도입하였다.
BAC의 이. 콜라이 세포로의 도입은 전기천공법에 의해 전형적으로 이루어졌다. 전기천공 전에, 세포는 재조합을 허용하지 않는 온도인 40℃에서 유지하였고, 전기천공 후 세포를 재조합을 허용하는 온도인 30℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 동안, 상동 재조합이 일어났고 세포는 항생제 둘 다에 내성이 되기 위해 필요한 효소를 발현하였다. 인큐베이션 시간은 약 45분 내지 90분이었다. 이어서 세포를 항생제 둘 다를 함유하는 배지 플레이트에 도말하고 상기 플레이트를 40℃에서 인큐베이션시켜 추가적 상동 재조합을 방지하였다. 배지 플레이트에서 성장하는 다수의 콜로니 분리주는 예상되는 크기를 갖는 조합된 BAC를 가졌다. 이는 펄스 장 겔 전기영동 분석에 의해 확인될 수 있었다. 재조합된 DNA의 통합은 펄스 장 겔 전기영동에 의해 분석된 희귀한-컷팅 및 드문 컷팅 제한 효소 다이제스트를 사용하여 제한 다이제스트로 확인하였다.
실시예
4
내인성 CH1을 인간 CH1으로 대체하기 위한 BAC의 고안
이 실시예에서, 2개의 BAC (173,869 bp 및 102,413 bp)의 6,116 bp 중복을 재조합하여 270,165 bp의 BAC를 제조하였다. 마우스 BAC에서 마우스 CH1을 인간 CH1로 대체하기 위해 적합한 DNA 구조물을 제조하였다. 구조물은 화학 합성, PCR, 통상적인 클로닝 기술 또는 이들 방법의 조합에 의해 제조하였다. 구조물은 마우스 게놈에서는 또한 마우스 CH1 영역 측면에 위치하는 마우스 서열 아암 (arm)이 측면에 위치한 인간 CH1 서열을 가졌다.
구조물은 상동 측면에 위치한 마우스 DNA 서열의 한쪽 또는 다른 쪽에서 본래 마우스 BAC를 갖는 이. 콜라이에서 재조합하였고, Cre 재조합 효소에 의해 반복된 재조합 및 분해 후에, 마우스 CH1을 대체하는 인간 CH1을 갖는 키메라 BAC를 제조하였다. 이 과정을 반복함으로써, Cγ 유전자의 마우스 CH1 영역의 전부를 인간 CH1 영역으로 대체하여, 마우스 CH1 대신에 인간 CH1을 갖는 Cγ 유전자 전부를 운반하는 변경된 BAC를 제조하였다.
유사하게, Cμ, Cδ의 마우스 CH1 도메인은 상응하는 인간 CH1 도메인으로 대체될 수 있다. 바람직한 경우, Cα 및 Cε은 또한 이러한 방식으로 변경할 수 있다. 유사한 대체(들)이 또한 C 유전자(들)의 상부 및/또는 중간 힌지 단편으로 수행될 수 있다. 인간의 중간 힌지 영역을 통합하는 경우, DNA 서열을 인코딩하는 인간 Cγ4 중간 힌지를 세린 299를 인코딩하는 코돈을 대체하는 프롤린 인코딩 코돈으로, 예컨대 화학 합성에 의해 조작하여 IgG4 이량체를 안정화시키기 위한 내부쇄 (intrachain) 이황화결합 형성보다 상호쇄 (interchain)에 영향을 주었다.
실시예
5
세포내로 BAC의 도입
배아 줄기 세포 내로의 도입을 위한 준비에서, 선택가능한 마커 및 스크리닝가능한 마커에 대한 포유동물 발현 카세트가 BAC 상으로 재조합될 수 있다. 그러한 카세트는 포유동물 세포, 예컨대 마우스 배아 줄기 세포에서 유전자의 발현을 위한 프로모터, 인핸서, 및 폴리-아데닐화 부위와 같이 필수적 조절 요소를 갖는 유전자를 운반한다. 카세트 상의 유전자는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 간시클로비르 (티미딘 키나아제), 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 등에 대한 약물-내성 및 약물-감수성 유전자와 같은 선택가능한 마커, 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 루시퍼라아제 등과 같은 스크리닝가능한 마커일 수 있다. 그러한 마커는 BAC가 도입되어 상동적으로 재조합된 세포를 선택 및 스크리닝하기 위해 사용하였다.
배아 줄기 세포 내로 도입하기 위해, 알카라인 용해법, 상용 DNA 정제 키트, CsCl 밀도 구배, 수크로스 구배, 또는 아가라아제로의 처리가 따를 수 있는 아가로스 겔 전기영동과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 BAC DNA는 이. 콜라이 및 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 정제하였다. 정제된 DNA를 선형화하기 위해, 그 후에 NotI로 소화시켰다. 2개의 NotI 부위가 BAC 벡터의 클로닝 부위의 측면에 위치하여 NotI 소화는 벡터로부터 삽입물을 분리하였다. 삽입 DNA는 클로닝 부위와 NotI부위 사이의 작은 영역을 제외하고 loxP 부위를 갖는 벡터 DNA로부터 떨어졌다. 따라서, 포유동물 세포 내로 형질감염될 DNA 내로 일부러 조작되지 않는 한 포유동물 세포 내로 형질감염될 DNA는 loxP 부위를 운반하지 않았다. NotI 부위가 인간 및 마우스 면역글로불린 게놈 DNA 상에서 극히 드문 경우임에도 불구하고, BAC DNA 구조물이 하나 이상의 NotI 부위를 함유하는 경우, AscI, AsiSI, FseI, PacI, PmeI, SbfI, 및 SwaI과 같은 다른 드문 제한 효소 및 I-CeuI, I-SceI, PI-PspI, PI-SceI, 또는 람다 터미나아제 (lambda terminase)와 같은 귀속성 엔도뉴클리아제를 위한 부위가 삽입물과 벡터 사이의 연결 영역으로 도입될 것이다. 이는 트랜스포존 (transposon), 상동 재조합 및 다른 클로닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 선형화된 DNA, 전형적으로 0.1 - 10 μg의 크기에 따라 달라지는 DNA는 형질감염, 리포펙틴, 전기천공법, 칼슘-침전법 또는 직접 핵 미세주입과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 포유동물 세포, 예컨대 배아 줄기 세포 내로 도입하였다.
실시예
6
배아 줄기 세포에서 순차적 대체를 통한
거대 BAC의 통합을 통한 IG 좌의 조작
보다 큰 BAC를 구축하기 위한 이. 콜라이에서의 상동 재조합은 미국 특허 출원 공개공보 제2004/0128703호에 기재되어 있다. 그러한 방법은 현재 입수가능한 BAC 라이브러리의 삽입물의 평균 크기로 표현된 것보다 DNA의 큰 삽입물을 갖는 BAC를 제조하는데 사용될 수 있다. 그러한 보다 큰 삽입물은 IgH, lgκ 및 Igλ와 같은 인간 Ig 좌를 나타내는 DNA를 포함할 수 있다. DNA 삽입물은 DNA 내로 고안된 변형을 또한 운반할 수 있는 불변영역의 유전자를 나타내는 DNA의 일부 또는 전부를 포함하는 내인성 Ig 좌를 나타내는 DNA를 또한 포함할 수 있다.
한 예로, 그러한 보다 긴 BAC를 사용하여, 인간 IgH V, D 및 J 유전자 단편을 함유하는 영역을 각각의 크기가 대략 300 kb 이하인 오직 3 내지 4개의 분리된 BAC에 의해 커버되었다 (도 1). JH 유전자 단편 클러스터의 하류로부터 마우스 3' 좌 조절 영역의 상류까지의 마우스 IgH 불변영역 유전자 단편을 포함하는 영역은 170-180 kb의 단일 BAC에 포함될 수 있다. 이들 BAC는 또한 중복 단편을 운반하여 배아 줄기 세포와 같은 세포에서 상동 재조합을 위한 다음의 BAC에 상동성을 제공하였다. 이들 보다 긴 BAC를 사용하여, 마우스 IgH의 V, D 및 J 유전자 단편은 해당 인간 서열로 순차적으로 대체하고, 마우스 IgH의 불변 영역 유전자 단편은 조작된 인간-마우스 불변 영역 유전자 단편으로 대체하였다. 순차적인 대체는 실질적으로 바람직한 양을 충족하였다.
배아 줄기 세포 내로 도입되는 제1 BAC는 배아 줄기 세포에서 상응하는 내인성 마우스 게놈으로부터 양 측면에 1 kb 내지10 kb 내지 100 kb 또는 그 이상의 마우스 DNA가 위치한 인간 Ig DNA로 이루어져 있다. 이어서, 제1 BAC는 배아 줄기 세포에서 상동 재조합에 의해 내인성 마우스 게놈의 일부분을 대체하고, 표적화 부위인 양쪽 측면 DNA 사이의 내인성 마우스 DNA를 BAC에서 측면 DNA 사이로 조작된 인간 DNA로 대체하였다. 예를 들어, 이. 콜라이에서 마우스 JH 좌의 3' 영역에 상응하는 마우스 DNA 3' 측면에 위치하고 마우스 JH 클러스터의 5' 수 킬로베이스의 동일한 공지된 크기인 영역에 상응하는 마우스 DNA의 5' 측면에 위치하는 인간 가변 영역, DH 유전자 클러스터 및 JH 클러스터를 함유하는 인간 IgH DNA의 수 킬로베이스의 공지된 크기를 함유하는 BAC를 구축하고, 정제된 BAC를 상동 재조합을 위해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입하여 상응하는 마우스 VH, DH 및 JH 유전자가 이종상동성 인간 DNA에 의해 대체될 수 있었다.
측면의 마우스 DNA는 또한 더 멀어질 수 있는데, 예를 들어, 5' 상동성이 다수의 5' 내인성 VH 유전자의 상류에 위치할 수 있어, 상동 재조합시 전체 마우스 VH-DH-JH 영역이 BAC 상의 인간 VH-DH-JH에 의해 대체될 수 있었다. 다른 말로 하면, 대체될 내인성 DNA의 영역의 길이는 BAC 상의 2개의 측면 마우스 단편 사이의 거리에 의해서 결정되었다. 거리는 BAC에서 측면에 위치한 마우스 단편 사이의 실제 거리는 아니었으며; 실은 이는 내인성 마우스 염색체에서 측면에 위치한 마우스 단편 사이의 거리이다. 이 거리는 입수가능한 게놈 데이터 베이스, 예컨대 UCSC 게노믹 바이오인포메틱스 (UCSC Genomic Bioinformatics), NCBI, 및 당업계에 공지된 다른 것으로부터 계산될 수 있었다.
제2, 및 임의의 후속적 BAC는 도입될 DNA의 측면에 위치한 2개의 단편을 가질 수 있었다. 2개의 측면 DNA에 대해, 하나는 첫 번째 대체에서 세포 게놈에 도입되는 인간 DNA의 전부 또는 일부분에 상응하는 인간 DNA로 이루어졌으며, 다른 하나는 두 번째 도입에서 대체될 영역의 내인성 DNA 상류 (또는 경우에 따라서는 하류)에 상응하는 마우스 DNA였다.
제1 BAC DNA가 내인성 좌의 일부분, 예를 들어 마우스 IgH 좌를 대체하는 마우스 배아 줄기 세포와 같이 상동 재조합 수용성 세포 내로 도입시, 하나의 교차는 BAC의 인간 측면 서열과 변경된 마우스 염색체에서의 인간 서열 사이에서 일어나고, 다른 교차는 BAC의 마우스 서열과 상기 염색체의 상응하는 마우스 영역 사이에서 일어났다 (도 1B 및 도 1C 참조). 다르게 말하면, 제2 BAC에서, 인간 측면 서열은 이전에는 염색체에 통합되었던 제1 BAC의 인간 DNA 서열의 말단 일부분에 상동적인 단편을 포함하였다.
이러한 방식으로, 배아 줄기 세포에서 상동 재조합으로 결합되는 경우, 결합된 단편은 연속적인 단편이 되었다. 그러한 단편은 인간에서 자연적으로 발견되기 때문에 점라인-배치일 수 있거나 또는 의도적으로 조작된 삽입, 결실, 또는 재배열이기 때문에 점라인과 상이한 배치를 가질 수 있다. 제2 BAC에서 마우스 측면 서열은 마우스 염색체에서 새로 도입된 인간 서열로부터 명시된, 바람직한 거리만큼 떨어진 마우스 내인성 염색체 DNA에 상응하였다. 2개의 마우스 단편 사이의 거리는 충분히 길어서 반복된 상동 재조합 후에 계획된 바와 같이 마우스 내인성 IgH의 대체가 완료되었다.
예를 들어, VH, DH, 및 JH 좌의 적합한 인간 DNA 삽입물을 갖는, 적합하게 위치된 표적화 DNA가 측면에 위치한 BAC를 사용하여, 인간 V-D-J 유전자가 마우스 불변 영역 좌 하류에 작동가능하게 연결되어 있는 배아 줄기 세포를 포함하는 포유동물 세포에서 상동 재조합을 촉진하기 위해, 상기 약술된 바와 같은 이. 콜라이에서 적합하게 조작된 BAC로 2 내지 3번 순차적 대체한 내인성 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 전체를 그들의 상응하는 인간 대응 유전자로 대체하는 것이 가능할 것이다. 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 대체에서, 도입된 및 내인성 DNA에 각각 상응하는 인간 및 마우스 DNA의 측면에 위치한, 인간 Cμ, Cδ 및 Cγ 유전자 및 임의로 Cα, Cε를 운반하는 적합한 인간 DNA 삽입물 및 인간 3' 좌 제어 영역 (LCR)을 갖는 BAC를 사용하여, 내인성 마우스 C 영역이 그의 인간 대응 유전자에 의해 대체될 수 있다.
별법으로, 불변 영역 유전자를 포함하는 게놈 DNA는 마우스 근원일 수 있으며, 바람직한 변형, 예컨대 이들 모두는 상기에 약술된 바와 같이 적합한 표적화 DNA에 의해 측면에 위치한, CH 도메인 전체 또는 선택된 마우스 불변 영역을 인간 CH1 DNA로, 및/또는 마우스 C 유전자의 상부 및 임의의 중간 힌지 영역의 일부 또는 전부를 상응하는 인간 유전자 서열로 대체하도록 조작될 수 있다. 또한, 마우스 C 영역의 일부, 예를 들어, Cε 및/또는 Cα 및/또는 Cγ 유전자 단편 중 하나에서 전체까지 결실될 수 있어, 내인성 마우스 3' LCR이 BAC에서 다수의 3' 불변영역에 가까운 점라인보다 더 근접할 수 있고, 게놈에 상동 재조합할 때, 표적화 BAC가 없는 내인성 C 유전자 단편의 결실에 영향을 주었다.
BAC의 도입 및 순차적 대체의 순서는 먼곳에서 가까운곳 또는 가까운 곳에서 먼곳일 수 있었다.
실시예
7
배아 줄기 세포에서 거대 BAC의 통합을 통한 IG 좌의 조작 및
부위-특이적 재조합효소의 용도
별법으로, 부위-특이적 재조합 효소에 대한 부위, 예컨대 loxP/CRE 또는 frt/flp는 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 상동 재조합 벡터로 도입될 DNA 내로 도입하여 Ig 좌의 조작을 촉진하기 위해 사용될 수 있고, 그 후 부위-특이적 재조합효소가 발현 또는 도입될 때, 재조합은 서열 사이에서 발생하여 개재 서열을 삭제할 것이다. 이러한 방식으로, 2개 이상의 비-중복 BAC는 상동재조합을 통해 내인성 Ig 좌에 통합하였다. 5' BAC는 그의 3' 영역에 loxP 또는 frt 인식 서열을 함유하며, 한편 3' BAC는 그의 5' 영역에 loxP 또는 frt 인식 서열을 함유하고, 새로 도입된 서열 사이에 남아있는 내인성 서열은 부위-특이적 재조합을 통해 제거하였다.
BAC는 개재 서열의 측면에 위치할 loxP 또는 frt를 도입하기 위해 조작될 수 있었다. 후속적으로, 세포 또는 그로부터 유래된 유전자 조작된 유기체에서 각각 CRE 또는 flp 재조합효소의 발현은 loxP와 frt 부위 사이에서 부위-특이적 재조합을 촉발시켜 개재 서열을 제거하였다 (도 4 및 5).
정확한 위치에서 제2 BAC 표적화 벡터를 통합한 상동적으로 재조합된 클론을, 예를 들어 제1 및 제2 BAC로부터 DNA 프로브로 형광 계내 (in situ) 혼성화의 수행을 비롯한 분석으로 확인한 후, 제1 BAC 구성요소를 운반하는 염색체 상에서 제2 BAC의 시스 통합을 확인하기 위해, 제1 및 제2 BAC를 마우스 좌로부터의 개재 내인성 DNA의 양에 의해 분리하였다. 이 개재 내인성 DNA의 양과 함량은 제1 BAC의 3' 측면 DNA 및 제2 BAC의 5' 측면 DNA의 위치에 의해 결정하였다. 상동 재조합에 의해 도입된 loxP 또는 frt 부위 사이에 함유된 마우스 서열의 이 나머지 개재 부분은 CRE 재조합효소 또는 flp 재조합효소에 의해 제거하였다. CRE 재조합효소 또는 flp 재조합효소는 둘 다 정확하게 표적화된 BAC 삽입물을 갖는 클론에서 일시적으로 발현될 수 있다. CRE 재조합효소 또는 flp 재조합효소는 효율적으로 및 정확하게 loxP 부위 또는 flp 부위에서 각각 작용하여 상기 부위 사이의 개재 DNA를 삭제하였다. 결실 및 두 BAC의 정확한 결합, 즉 제1 BAC의 3'이 제2 BAC의 5'에 결합은 본원에 기재된 바와 같이 서던 블롯팅에 의해 검출할 수 있다.
다른 별법으로, loxP 부위 및 Cre 재조합효소는 lox-부위 운반 외인성 DNA를 조작된 Ig 좌에 이미 통합된 lox-P 부위로 선택적으로 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 부가적인 DNA 함량이 조작된 좌로 도입될 수 있다.
실시예
8
5' 방향으로부터 내인성 DNA의 순차적 대체
배아 줄기 세포와 같은 상동 재조합을 할 수 있는 세포에서 대체의 방향은 전사 방향의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 수행될 수 있다. 그러나, BAC 변형은 상동재조합 가능한 세포에서 상동재조합을 위한 상동성 필요의 배치에 따라 실시되어야 한다.
예를 들어, 5' 말단 방향에서, 사용되는 제1 BAC는 마우스 IgH 좌 내로 표적화를 위한 내인성 마우스 DNA에 의해 양 측면에 위치한 인간 서열의 IgH V 유전자 단편의 말단소체 측면 (telomere side)을 가지고 있다. 반복적인 대체 절차에서 사용되는 마지막 BAC는 내인성 마우스 불변 영역의 일부 또는 전부에서 마우스 CH1 도메인을 대체하는 인간 CH1 도메인을 갖는 상기에 기술된 바와 같이 변경된 BAC였다. 마우스 C 영역 점라인 배치 DNA의 DNA 상류 (CH1 도메인 대체 및 임의로 상류 및 또한 임의로 중간 힌지 대체를 제외함)는 변경된 IgH 좌 내로 이미 통합된 부분에 해당하는 인간 DNA이고 Cα 및 Cε 및 어떠한 Cγ 유전자 단편의 결실을 초래하나 마우스 3' LCR의 내용물은 있는 그대로 유지하기 위해 하류 DNA는 대체하는 DNA상의 3' 마우스 Cγ의 3' 마우스 서열이다. 상기에 기술된 바, 측면에 위치하는 DNA는 1 kb 내지 10kb 내지 100kb 내지 이보다 더 큰 크기의 범위에 있다.
실시예
9
3' 방향으로부터 내인성 DNA의 순차적 대체
3' 방향에서, 제1 BAC는 5' 방향의 대체를 위한 마지막 BAC에 기초한 변경된 BAC이다. 더욱이, 제1 BAC는 인간 서열의 다른 쪽에 부가적으로 1 kb 내지 10 kb 내지 100 kb 또는 이보다 더 큰 마우스 단편을 가진다. 예를 들어, 1 kb 내지 10 kb 내지 100 kb 또는 이보다 더 큰 kb 단편은 D 영역의 5' 말단 주위로부터 시작하여 마우스 염색체의 텔로미어로 향한다. 마지막 BAC는 5' 방향으로부터 대체를 위해 사용된 제1 BAC의 변경된 BAC이다. 상기 변형은 인간 서열 말단에 1 kb 내지 10 내지 100 또는 이보다 더 큰 kb의 마우스 절편의 부가적 반응이다. 1 kb 내지 10 내지 100 또는 이보다 더 큰 kb의 영역은 첫 번째 IgH V 유전자 단편 말단으로부터 시작하여 IgH 밖으로 향한다.
실시예
10
IGk 좌의 상동 재조합
상기에서 언급된 대체 전략은 세포 염색체 예를 들어 마우스 배아 줄기 세포에서의 내인성인 lgκ 좌에서도 수행될 수 있다. 내인성 마우스 VK 유전자를 해당 인간 VK 유전자 내용물로 대체하기 위해, 오직 두 번의 반복 대체가 필요하다. 이것은 인간 VK 유전자 내용물이 풍부하기 때문이고 인간의 VK 유전자는 약 2배로 나타내지고 인접한 클러스터가 JK 및 CK 유전자와 같은 5'-3' 방향이고 이들 클러스터가 멀리서는 반대방향으로 복제되어있다. 이러한 반대방향으로 복제된 클러스터는 인간에서 발현된 VK 레파토리의 오직 약 10 %만을 나타낸다. 추가로, 이렇게 멀고 반대방향으로의 복제는 인간의 약 10 %로부터 없어졌다. 결론적으로 두 개 만큼 적은 겹치는 BAC는 도2와 같이 독특한 인간 VK 레파토리를 포함하며 추가로 인간 JK 유전자 및 인간 CK 유전자를 포함한다.
별법으로, 2개의 비-중복 BAC는 Igκ 좌 내로 상동 재조합되어 각 BAC는 loxP 또는 frt와 같은 부위-특이적 재조합 인식 서열을 도입하였다. 예를 들어, 5' BAC는 그것의 3' 영역에 부위-특이적 재조합 인식 부위를 포함하고, 3' BAC는 그것의 5' 영역에 부위-특이적 재조합 인식 부위를 포함하였다. 부위-특이적 재조합효소가 발현하면, 두 개의 부위-특이적 재조합 인식 부위사이의 개재 마우스 lgκ 서열이 제거되어 BAC에 의해 도입된 서열을 결합하였다 (도 5).
실시예
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IGλ 좌의 상동 재조합
상기에서 언급된 대체 전략은 세포 염색체 예를 들어 마우스 배아 줄기 세포에서의 내인성인 Igλ 좌에서도 수행될 수 있다. 내인성 마우스 Vλ 유전자를 해당 인간 Vλ 유전자로 대체하기 위해, 오직 두 번의 반복 대체가 필요할 수 있다 (도 3). 그러나, Igλ 좌의 게놈 구성이 마우스 대 인간에서 다르므로, 이와는 다른 조작 전략이 인간 Igλ Vλ-Jλ 유전자를 이식시키기 위해 추구되어야 한다. 마우스에서 Igλ 좌는 두 개의 분리된 하지만 연결된 유전자 클러스터 이들 각각은 두 쌍의 Jλ-Cλ 유전자 세트의 상류에 위치한 하나 또는 두 개의 Vλ 유전자로 이루어져 있다. 가장 상류에 위치한 Vλ는 가장 하류의 Jλ-Cλ 쌍으로 재배열하지 않았다. 인간에서, 7 Jλ-Cλ 클러스터 상류에 약 30개의 기능적 Vλ 유전자가 존재하였다.
추가로, 마우스 불변 영역, 특히 마우스 Igλ 3' LCRs, Eλ2-4 및/또는 Eλ3-1을 손상되지 않고 변형되지 않게 남겨 놓는 것은 돌연변이 즉, 마우스 Igλ 3' LCRs에 존재하는 NF-κB 결합에 결함을 유발하기 때문에 인간의 60/40 비로 κ:λ를 발현하지 않고 마우스의 95/5 비로 κ:λ를 발현하는 조작된 좌를 야기시켰다 (예를 들어, 문헌 [Combriato and Klobeck, J. Immunol. 168:1259-1266] 참조). 인간 Igλ는 다양성의 상당한 양을 전체 인간 경쇄 레파토리에 기여하기 때문에 인간의 Igλ BAC를 적절하게 조작하여 광범위한 항원 표적에 대한 유용항 항체를 치료학적으로 생성하는 효율 및 가능성을 증대시키기 위해 진정한 인간 면역 반응을 되풀이하는 것은 이롭다.
조작된 BAC는 내인성 마우스 Igλ 좌를 인간 카운터파트로 대체하고 불변 영역의 하류의 보더 더 완전하게 기능적인 Igλ 3' LCR를 복구한다(도 6). 몇몇 이와는 다른 전략도 사용될 수 있다. 전체 마우스 Igλ 좌는 완전히 기능적인 인간 Igλ 3' LCR을 마우스 Igλ 좌에 포함하여 순차적으로 그것의 전부를 대체하고 3' LCR을 포함하는 인간 Igλ 좌에 걸쳐 겹치는 일련의 BAC를 순차적으로 표적화하여 인간 좌에 의해 대체될 수 있다. 이와는 달리, 겹치는 BAC는 조작되어 인간 Vλ 유전자 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 쌍의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고 마우스 Cλ 유전자를 가지고 인간 Cλ 유전자를 대체하여 키메라 인간 Vλ- 마우스 Cλ Igλ 쇄이 마우스에 의해 생성될 수 있다. 이와는 달리 인간 Igλ 좌는 겹치는 BAC 상에서 인간 Vλ 유전자, 1 내지 7 Jλ 유전자의 클러스터 및 단일로 선택된 인간 또는 마우스의 Cλ 유전자, 그 후에 따르는 인간 3' LCR의 완전한 세트 또는 서브세트를 가지고 재구성되어 인간 lgκ 좌의 배치를 닮을 수 있다. Jλ 클러스터 및 Cλ 유전자에서 적합한 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용체의 포함이 확인되었고, 필요로 한다면, 배아 줄기 세포 내로의 도입 전에 화학합성 또는 결집 동안 이. 콜라이에서 BAC 내로 조작되었다, 이러한 재배치된 좌는 재배열되어 적절하게 스플라이싱되었다. 그러나, 그러한 구조체가 점라인 배치된 인간 Igλ 좌보다 더 효율적으로 재배열하여 인간에서 보다 경쇄 레파토리의 lgκ에 대한 Igλ의 비례적으로 높은 표시를 유도한다.
인간 또는 마우스 Cλ 유전자와 결합된 인간 Igλ V 영역을 생성하기 위해 인간 좌의 다른 배치 및 마우스 Igλ 좌로의 도입은 쉽게 고안되어 조작될 수 있다. 기능적 NFkB 결합 부위를 가지는 인간 Igλ 3'LCR 영역 또는 NFkB 결합 (문헌 [Combriato and Klobeck, J. Immunol. 168:1259-1266] 참조)을 복구하려고 예를 들어 시험관 내에서 위치 지정 돌연변이에 의한 도입된 돌연변이를 가지는 마우스 Igλ 3'LCR 컨트롤, 또는 인간 Igλ 3'LCR의 DNAse I 초고감도 부위 3과 같은 둘 중 하나의 기능적 서브포션 (sub-portion)이 모든 구조체의 클러스터에서 마지막 Cλ 유전자의 하류에 포함된다. 이와는 달리, 기능적 Igλ 3'LCR 또는 랫트, 비인간 영장류와 같은 다른 종으로부터의 기능적 서브포션도 포함될 수 있다. 이와는 달리, 인간, 마우스, 또는 다른 종으로부터 기능적 lgκ 3' LCR 도 포함될 수 있다.
특별히 지워지지 않았거나 화학 합성되고 결집된 인간 DNA에 포함되지 않은 서열이 아니라면, 인간 Vλ 레파토리를 도입하는 단계는 점라인 DNA의 인간 Vλ 유전자 어레이 안에 있는 인간 대리의 경쇄 (SLC)에 대한 유전자를 또한 도입할 것이다. 마우스 SLC는 Igλ 좌에 연결되어 있지만 백만 킬로베이스 떨어져 있고 이 전략에서 온존하게 보존되어 이식 유전자 마우스가 인간 및 마우스 SLC를 공동 발현한다.
인간의 Vλ 레파토리는 3개의 클러스터로 그룹화 될 수 있다: A, B, C. J-C 쌍에 가장 가까운 A 클러스터가 가장 흔하게 사용되고 다음은 B 그 다음은 C 클러스터가 따른다. 이들 Vλ 클러스터의 하나, 둘, 또는 세개가 통합될 수 있다. 여기의 전략은 인간 Vλ 클러스터의 어느 하나 또는 전부 또는 일부를 마우스 게놈 내로 조작 및 내인성 마우스 좌의 대체를 허용하였다.
실시예
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상동 재조합을 따르는 비인간 포유동물 세포의 선택
상동 재조합의 결과인 배아 줄기 세포와 같은 포유동물 세포를 확인하기 위해, 일련의 선택 및 스크리닝에 따른 분자적 분석을 이용하였다 (도 1, 2 및 3). 첫째로, 적어도 하나의 약물 내성 유전자에 대한 약물의 존재하에서 성장한 세포는 BAC를 안정적으로 운반하는 세포를 선택하기 위해 도입된 BAC에 나타났다. 상기 BAC는 무작위 구성요소를 선택하는 측면의 표적화 영역의 하나 또는 둘의 바깥 말단에 이미딘 키나아제와 같은 음성-선택 마커를 선택적으로 운반할 수 있다. 이와는 달리, 하나의 약물 내성 마커에 대해 양성인 클론은 픽킹 (picking)되어 플레이트가 복제될 수 있어 하나는 약물 내성을 시험하려고 쓰고 다른 하나는 약물 민감도 검사를 위해 쓴다. 선택적으로, BAC는 선택 마커에 인접한 GFP 또는 RFP와 같은 스크리닝될 수 있는 마커를 또한 운반할 수 있다. GFP+ 또는 RFP+ 클론은 유세포 분석기 또는 형광 형미경을 가지고 감지될 수 있다. 대체 DNA와 더불어 게놈 내에 안정적으로 통합하기 위해 양성 선택 및 스크리닝 가능한 마커는 측면의 표적화 DNA에 내부적이다.
선택된 (약물 내성) 클론 및 선택적으로 스크리닝된 (예, GFP+) 클론에서 상동 재조합을 확인하기 위해, 게놈 DNA가 분리된 클론으로부터 회수되어 내인성 좌로부터 DNA 프로브를 가지고 서던 블롯팅과 같은 기술을 사용하여 제한효소 절편 길이 다형성 (RFLP)을 수행하였다 상기 프로브는 대체된 영역의 바깥쪽에 맵핑된다. 상동 재조합이 새로운 재조합 효소 부위의 대체 DNA로의 도입을 통해 일어날 때 RFLP 분석은 내인성 DNA 및 들어온 DNA의 두 대립유전자 간의 차이를 보여준다. 크기로 10 kb 보다 큰 측면 DNA가 크기가 크고 표준 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분해가 어려운 RFLP를 생성하기 때문에, 낮은 퍼센트의 아가로스 겔 전기 영동이 사용되거나 CHEF 겔 전기 영동이 사용될 수 있다. 크기로 10 kb 이거나 이것보다 작은 측면 DNA 아암은 표준 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분해가 가능한 RFLP를 생성한다. 이와는 달리, 제한효소 부위가 대체 벡터 구축 동안 BAC상의 대체 DNA 내로 고의적으로 조작하여 제한 효소 소화시 도입된 DNA 및 내인성 DNA의 접합부위에 걸치고 고안된 프로브 서열을 포함하는 편리한 크기의 단편을 조작한다. RFLP 분석뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 방법에 따라 도입된 DNA의 위치를 확인하고자 혈광 인 시투 혼성화 (FISH)를 사용하여 시스 통합도 스크리닝될 수 있다.
다음의 조작을 대해, 다른 선택 및/또는 스크리닝 마커는 하나의 측면 암에 단지 내부적인 반면 반대쪽 측면 아암은 상동 재조합을 위한 것이고 BAC1 표적화에 사용된 선택 및/또는 스크리닝 마커를 운반하는 측면 아암과 겹치고, 어떠한 마커도 포함하지 않아 상동 재조합 이벤트가 표적화 BAC1에 도입된 마커를 지우고 새로운 선택 및/또는 스크리닝 마커를 반대쪽 말단에 도입한다 (반대쪽 측면 암으로부터 내부적인). 예를 들어, 형광 마커는 상동 재조합의 각 라운드가 일어난 후 GFP 및RFP사이에서 번갈아 일어나 라운드 1이 GFP를 도입하고 라운드 2는 GFP를 지우고 RFP를 도입한다. 무작위 삽입이 일어난다면, 두 개의 형광 마커가 배아 줄기 세포에 존재하게 된다. 세포 선별 능력을 갖는 유세포 분석기를 사용하여 하나의 형광 단백질로부터의 신호 존재 및 다른 단백질로부터의 신호없음에 기반하여 세포를 분류 및 보존할 수 있다. 양성 및 음성 선택 마커의 쌍을 사용하여 약물 내성 마커도 유사하게 사용될 수 있다 (도 6A 및 6B).
표준 고등 계획에 통해, 오직 선택 마커와 스크리닝 마커의 2 개의 다른 조합의 쌍을 사용한 상동 재조합의 반복적 라운드를 통해 메가베이스-크기의 좌를 거친 내인성 DNA를 인간 DNA로 대체함이 가능하다. 그러나 세 개 또는 그 이상의 선택 마커와 스크리닝 마커의 세트도 또한 사용될 수 있다.
상기에 기술된 다양한 구현 예는 조합되어 추가의 구현 예를 제공할 수 있다. 이 명세서 및/또는 명세서 데이터 시트에 언급된 미국 특허, 미국 특허출원 등록, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공개문헌은 여기에 전체적으로 참고로 포함된다. 더 추가적인 구현 예를 제공하기 위해 필요한 경우 다양한 특허, 출원, 및 공개문헌의 개념을 사용하여 구현 예의 일면이 변형될 수 있다.
상기 자세히 기술된 관점에서 상기 구현 예에서 이것들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기의 청구항에서, 사용된 용어는 명세서와 청구항에 기술된 특이적 구현 예에 대한 청구항을 제한하고자 해석되지 말아야 하나, 청구항이 명명된 유사어구의 전체 범위와 더불어 모든 가능한 구현 예를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 상기 청구항은 상기 명세에 의해 제한적이지 않는다.
Claims (161)
- (1) 인간 VH 유전자 단편 및 (2) JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 게놈을 가지며, 여기서 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체되고, 인간 VH 유전자 단편 및 동계 Ig 중쇄 좌는 내인성 Ig 중쇄, 또는 그의 일부분을 대체하여, 세포가 키메라 Ig 중쇄를 인코딩하는 게놈을 포함하도록 하는, 상동 재조합 수용성 (competent) 인간 이외의 포유동물 세포.
- 제1항에 있어서, 추가로 인간 JH 유전자 단편을 포함하는 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 일부가 추가로 3' 좌 제어 영역 (LCR) 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 세포.
- 제1항에 있어서, 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터, 및 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터의 DH 유전자 단편을 추가로 포함하는 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 DH 유전자 단편이 인간인 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인이 단일 CH 유전자 단편을 포함하는 세포.
- 제6항에 있어서, 상기 단일 CH 유전자 단편이 Cγ1 , Cγ2, 및 Cγ4으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
- 제1항에 있어서, 인간의 상류 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 세포.
- 제8항에 있어서, 인간의 중간 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 세포.
- 제8항에 있어서, 상기 인간의 힌지 유전자 단편이 lgG4 힌지 유전자 단편인 세포.
- 제9항에 있어서, 세린이 위치 229에서 프롤린으로 대체된 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 키메라 Ig 중쇄가 내인성 FcR과 결합할 수 있는 세포.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포인 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 마우스 세포인 세포.
- 인간 VH 유전자 단편을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 동계 CH1 도메인이 인간 CH1 도메인으로 대체된 JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 VH 유전자 단편의 전부 또는 일부를 대체하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 중쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하여, 세포가 키메라 Ig 중쇄를 인코딩하는 게놈을 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 세포의 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 BAC 또는 상기 제2 BAC가 인간 JH 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 BAC가 상기 제1 BAC의 3' 말단 근처에 첫 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 BAC가 상기 제2 BAC의 5' 말단 근처에 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합 효소 인식 서열 사이의 개재 서열 (intervening sequence)이 제거된 부위-특이적 재조합효소를 발현하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합 효소 인식 서열이 loxP인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소가 CRE인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열이 frt인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소가 flp인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 일부분이 3' LCR 또는 그의 기능적 단편을 추가적으로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 BAC 또는 상기 제2 BAC가 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터, 및 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터의 DH 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 DH 유전자 단편이 인간인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인이 단일 CH 유전자를 포함하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 단일 CH 유전자가 Cγ1, Cγ2, 및 Cγ4로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제2 BAC가, 동계 Ig 중쇄 좌의 상류 힌지 유전자 단편을 대체하는 인간의 상류 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 동계 Ig 중쇄 좌의 중간 힌지 유전자 단편을 대체하는 인간의 중간 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기의 인간 힌지 유전자 단편이 IgG4 힌지 유전자 단편인 방법.
- 제29항에 있어서, 위치 229에 있는 프롤린이 세린으로 대체되는 방법.
- 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부를 대체하는 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 게놈을 갖고 인간 Ig 경쇄 또는 그의 일부분을 포함하는 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포.
- 제32항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 인간 lgκ 가변 영역을 포함하는 세포.
- 제33항에 있어서, 상기 Ig 경쇄 좌가 인간 lgκ 불변 영역을 추가로 포함하는 세포.
- 제32항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 인간 Igλ 경쇄 좌의 전부 또는 일부 및 Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 세포.
- 제35항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 전체의 인간 Igλ 좌를 포함하는 세포.
- 제35항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간의 Vλ 유전자 단편, 및 인간의 Cλ가 동계 Cλ로 대체된 1 내지 7의 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하는 세포.
- 제35항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간의 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7의 인간 Jλ 유전자 단편, 및 단일 인간 Cλ 유전자 단편을 포함하며, 여기서 상기 인간 유전자 단편이 인간 Igλ 좌 배치와 유사한 세포.
- 제35항에 있어서, 상기 Igλ 3' LCR 또는 그의 기능적 단편이 인간, 인간 이외의 영장류, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터인 세포.
- 제39항에 있어서, 상기 Igλ 3' LCR 또는 그의 기능적 단편이 인간인 세포.
- 제32항 내지 제40항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포인 세포.
- 제32항 내지 제41항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 마우스 세포인 세포.
- 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하는 단계; 및 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 대체하여 세포가 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 인코딩하는 게놈을 포함하도록 하는 단계를 포함하는, 제32항에 따른 세포의 제조 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 인간 Igκ 가변 영역을 포함하는 방법.
- 제44항에 있어서, 인간 lgκ 불변 영역을 포함하는 제2 BAC를 생산하고, 상기 제2 BAC를 상기 세포내로 도입하고, 내인성 lgκ 불변 영역의 전부 또는 일부를 대체하는 단계를 추가로 이루어진 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 제1 BAC가 상기 제1 BAC의 3' 말단 근처에 첫 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 BAC가 상기 제2 BAC의 5' 말단 근처에 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제46항에 있어서, 부위-특이적 재조합효소를 발현하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열간의 개재 서열이 제거된 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열이 loxP인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소가 CRE인 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열이 frt인 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소가 flp인 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 인간 Igλ 경쇄 좌 및 Igλ 3'LCR의 전부 또는 일부, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 전체 인간 Igλ 좌를 포함하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Igλ 경쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
- 제54항에 있어서, 인간 Igλ 불변 영역을 포함하는 제2 BAC를 제조하고, 상기 제2 BAC를 상기 세포내로 도입하고, 내인성 Igλ 불변 영역의 전부 또는 일부를 대체하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 제1 BAC가 상기 제1 BAC의 3' 말단 근처에 첫 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 BAC가 상기 제2 BAC의 5' 말단 근처에 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제56항에 있어서, 부위-특이적 재조합효소를 발현하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열간의 개재서열이 제거된 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열이 loxP인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소가 CRE인 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 부위-특이적 재조합효소 인식 서열이 frt인 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소가 flp인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하고, 상기 인간 Cλ가 동계 Cλ로 대체된 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7 인간 Jλ 유전자 단편, 및 단일 인간 Cλ 유전자 단편을 포함하고, 상기 인간 유전자 단편이 인간 Igλ 좌 배치를 닮은 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편이 인간, 인간 이외의 영장류, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터인 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 Igλ 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편이 인간인 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 BAC에 스플라이스 서열을 통합하는 것을 확인하고, 상기 BAC에 통합되지 않았을 때 상기 도입 단계 전에 상기 스플라이스 서열을 통합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 Vλ 유전자 단편이 클러스터 A를 포함하는 방법.
- 제67항에 있어서, 클러스터 B 인간 Vλ 유전자 단편을 포함하는 제2 BAC를 제조하고, 상기 제2 BAC를 상기 세포내로 도입하고, 내인성 Vλ 유전자 단편을 대체하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 제2 BAC가 인간 클러스터 C Vλ 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- (1) 인간 Ig 좌, 또는 그의 일부분, 및 (2) 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하고, 상기 인간 Ig 좌 및 FcR 유전자가 내인성 영역을 대체하고, 인간 Ig 쇄 또는 그의 일부분 및 인간 FcR을 인코딩하는 게놈을 갖는 상동 재조합을 할 수 있는 인간 이외의 포유동물 세포.
- 제70항에 있어서, 상기 인간 Ig 좌가 JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하고 상기 인간 Ig 중쇄의 일부분이 인간 FcR에 참여하는 세포.
- 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 세포가 인간 이외의 배아 줄기세포인 세포.
- 제70항 또는 제72항에 있어서, 상기 세포가 마우스세포인 세포.
- 제70항에 있어서, 인간 Ig 좌 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하고, 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 제2 BAC를 제조하고, 상기 제1 BAC를 상동 재조합 할 수 있는 인간 이외의 포유동물 세포내로 도입하여 내인성 Ig 좌의 전부 또는 일부를 상동 재조합으로 대체하고, 상기 제2 BAC를 상기 세포내로 도입하여 FcR 유전자의 내인성 클러스터를 상동 재조합으로 대체하고 인간 Ig 쇄 또는 그의 일부분 및 인간 FcR을 인코딩하는 게놈을 포함하는 단계를 포함하는 세포.
- 제74항에 있어서, 상기 인간 Ig 좌가 JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하고 인간 Ig 중쇄의 상기 일부분이 인간 FcR에 참여하는 방법.
- 제15항, 제45항, 제55항 및 제74항 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 BAC의 도입 단계 전에 상기 제2 BAC의 도입 단계가 일어나는 방법.
- (1) 인간 VH 유전자 단편 및 (2) JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 게놈을 갖고, 여기서 동계 CH1 도메인이 인간 CH1 도메인으로 대체되고, 상기의 인간 VH 유전자 단편 및 상기 동계 Ig 중쇄 좌가 내인성 Ig 중쇄 좌의 전부 또는 일부를 대체하여 포유동물이 키메라 Ig 중쇄를 제조할 수 있도록 하는, 녹-인 (knock-in) 인간 이외의 포유동물.
- 제77항에 있어서, 인간 JH 유전자 단편을 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항에 있어서, 상기 일부분이 3' LCR 또는 그의 기능적 단편을 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항에 있어서, 상기 키메라 Ig 중쇄가 내인성 FcR에 결합할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항에 있어서, 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터 및 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터의 DH 유전자 단편을 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제81항에 있어서, 상기 DH 유전자 단편이 인간이고, 상기 키메라 IG 중쇄가 인간 중쇄 Fab 도메인을 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인이 단일 CH 유전자를 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제83항에 있어서, 상기 단일 CH 유전자가 Cγ1 , Cγ2, 및 Cγ4로 이루어진 군으로부터 선택된 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제83항에 있어서, 인간 상류 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제85항에 있어서, 인간 중간 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제85항에 있어서, 상기 인간 힌지 유전자 단편이 lgG4 힌지 유전자 단편인 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제87항에 있어서, 세린이 위치 229의 프롤린을 대체하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 인간 Ig 경쇄 좌 또는 그의 일부분을 포함하는 게놈을 가지며, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부를 대체하고, 인간 Ig 경쇄 또는 그의 일부분을 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제89항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 인간 lgκ 가변 영역을 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제90항에 있어서, 상기 lgκ 경쇄 좌가 인간 lgκ 불변 영역을 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제89항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 인간 Igλ 경쇄 좌의 전부 또는 일부분 및 Igλ 3' LCR 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제92항에 있어서, 상기 인간 Igλ가 Igκ에 대하여 약 40:60의 비로 발현되는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제92항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 전체 인간 Igλ 좌를 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제92항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7 Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하고, 인간 Cλ가 동계 Cλ로 대체되는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제92항에 있어서, 상기의 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Vλ 유전자, 1 내지 7 인간 Jλ 유전자 단편 및 단일 인간 Cλ 유전자 단편을 포함하고, 상기 인간 유전자 단편이 인간 Igλ 좌 배치를 닮은 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제96항에 있어서, 상기 키메라 항체가 Igλ가 LGκ에 대해 40:60 보다 크게 표현하면서 재배열 및 발현하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제92항에 있어서, 상기 Igλ 3' LCR 또는 그의 기능적 단편이 인간, 인간 이외의 영장류 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터인 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제98항에 있어서, 상기 Igλ 3' LCR 또는 그의 기능적 단편이 인간인 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항에 있어서, 인간 Ig 경쇄 좌 또는 그의 일부분을 추가로 포함하고, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부를 대체하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- (1) 인간 Ig 좌 또는 그의 일부분 및 (2) 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 게놈을 가지며, 상기 인간 Ig 좌 및 FcR 유전자가 이종상동성 내인성 영역을 대체하고, 인간 Ig 쇄 또는 그의 일부분 및 인간 FcR을 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제101항에 있어서, 상기 인간 Ig 좌가 JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하고, 상기 Ig 중쇄가 인간 FcR에 참여하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제102항에 있어서, 상기 인간 Ig 중쇄 좌가 인간 가변 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제103항에 있어서, 인간Ig 경쇄 좌 또는 그의 일부분을 추가로 포함하고, 상기 인간의 Ig 경쇄 좌가 내인성 Ig 경쇄 좌를 대체하여 인간 항체 및 인간 FcR을 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항 내지 제104항 중 어느 하나에 있어서, 상기 녹-인 인간 이외의 포유동물이 마우스인 녹-인 인간 이외의 포유동물.
- 제77항 내지 제105항 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 키메라 Ig 중쇄 또는 인간 Ig 경쇄 또는 그의 일부분을 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물에 의해 제조된 항체.
- 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법이며, 제77항 내지 제105항 중 어느 하나에 따른 녹-인 인간 이외의 포유동물을 상기 표적 항원으로 면역화한 후, 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하며, 상기 항체가 키메라 인간 Ig 중쇄 또는 인간 Ig 경쇄 또는 그의 일부분을 포함하는 방법.
- 표적 항원을 검출하는 방법이며, 제106항에 따른 항체를 2차 검출제로 검출하며, 상기 검출제가 상기 항체의 일부분을 인식하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 일부분이 상기 항체의 Fc 영역을 포함하는 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 일부분이 CH1 도메인을 포함하는 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 일부분이 CH2 도메인을 포함하는 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 일부분이 CH3 도메인을 포함하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 일부분이 상기 항체의 Fab 도메인을 포함하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 일부분이 상기 항체의 F(ab')2 도메인을 포함하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 일부분이 상기 항체의 CK 도메인을 포함하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 일부분이 상기 항체의 Cλ 도메인을 포함하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 표적 항원의 조직 분포를 평가함을 추가로 포함하는 방법.
- 제106항에 따른 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
- 제106항에 따른 항체 및 상기 항체를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 키트.
- (1) 제106항에 따른 항체의 인간 유전자 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 (2) 인간 불변 영역의 나머지 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 인간화된 항체.
- 제120항에 있어서, 상기 인간 유전자 단편이 인간 V 영역 유전자 단편을 포함하는 인간화된 항체.
- 제120항에 있어서, 항체를 포함하는 제약 조성물 및 제약상 허용가능한 담체
- 제120항에 있어서, 항체를 포함하는 키트 및 상기 항체를 사용하기 위한 지침서.
- 인간 VH 유전자 단편을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체하는, JH의 유전자 단편 하류 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 VH 유전자 단편의 전부 또는 일부를 대체하는 단계; 제2 BAC를 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 중쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 상기 세포로부터 키메라 Ig 중쇄를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 제77항에 따른 포유동물의 제조 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 제1 BAC 또는 상기 제2 BAC가 인간 JH 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 일부분이 3' LCR 또는 그의 기능적 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 제조 단계가 배반포 미세주입을 포함하는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 제조 단계가 상실배 군집을 포함하는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 제조 단계가 체세포 핵 이식을 포함하는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 키메라 Ig 중쇄가 내인성 FcR에 결합할 수 있는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 제1 BAC가 인간, 인간 이외의 영장류, 토끼, 양, 래트, 햄스터 및 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물로부터의 DH 유전자 단편을 포함하는 방법.
- 제131항에 있어서, 상기 DH 유전자 단편이 인간이고, 상기 Ig 중쇄가 인간 중쇄 Fab 도메인을 포함하는 방법.
- 제132항에 있어서, 상기 인간 CH1 도메인이 단일 CH 유전자 단편을 포함하는 방법.
- 제133항에 있어서, 상기 단일 CH 유전자 단편이 Cγ1, Cγ2, 및 Cγ4로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제131항에 있어서, 상기 제2 BAC가 동계 Ig 중쇄 좌의 상류 힌지 유전자 단편을 대체하는 인간 상류 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제135항에 있어서, 동계 Ig 중쇄 좌의 중간 힌지 유전자 단편을 대체하는, 인간의 중간 힌지 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제135항에 있어서, 상기 인간의 힌지 유전자 단편이 lgG4 힌지 유전자 단편인 방법.
- 제136항에 있어서, 위치 299의 프롤린이 세린으로 대체되는 방법.
- 인간 Ig 경쇄 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 이종상동성 내인성 Ig 경쇄 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 상기 세포로부터 인간 Ig 경쇄, 또는 그의 일부분을 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 제89항의 포유동물의 제조 방법.
- 제139항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 lgκ 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
- 제140항에 있어서, 인간 lgκ 불변 영역을 포함하는 제2 BAC를 제조하고, 상기 제2 BAC를 상기 세포내로 도입하여 내인성 lgκ 불변 영역의 전부 또는 일부를 대체하는 단계를 포함하는 방법.
- 제139항에 있어서, 상기 인간 Ig 경쇄 좌가 상동재조합을 통해 올소로거스 내인성 Igλ 좌 및 3' LCR를 대체하는, 인간 Igλ 경쇄 좌의 전부 또는 일부분 및 Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 Igλ가 LGκ에 상대적으로 약 40:60의 비로 발현되는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 전체 인간 Igλ 좌를 포함하는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Vλ 유전자 단편 및 1 내지 7Jλ-Cλ 유전자 단편 쌍을 포함하고, 인간 Cλ가 동계 Cλ로 대체되는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 인간 Igλ 경쇄 좌가 인간 Vλ 유전자 단편, 1 내지 7 Jλ 유전자 단편 및 단일 Cλ 유전자 단편을 포함하고, 상기 유전자 단편이 인간 Ig λ 배치를 닮도록 재구성된 것인 방법.
- 제146항에 있어서, 상기 BAC내로 스플라이스 서열을 통합하는 것을 확인하고, 상기 스플라이스 서열을 만약 통합되지 않았다면 상기의 도입 단계 이전에 BAC내로 통합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제146항에 있어서, 상기 Igλ 좌가 재배열하여 Igλ가 lgκ에 상대적으로 40:60보다 큰 비율로 더 높게 발현되는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 인간 Vλ 유전자 단편이 클러스터 A를 포함하는 방법.
- 제149항에 있어서, 클러스터 B 인간 Vλ 유전자 단편을 포함하는 제2 BAC를 제조하고, 상기 제2 BAC를 상기 세포내로 도입하여 내인성 Vλ 유전자 단편을 대체하는 단계를 포함하는 방법.
- 제150항에 있어서, 상기 제2 BAC가 인간 클러스터 C Vλ 유전자 단편을 추가로 포함하는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편이 인간, 인간 이외의 영장류, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제142항에 있어서, 상기 3' LCR, 또는 그의 기능적 단편이 인간인 방법.
- (1) 인간 VH 유전자 단편 및 (2) JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 동계 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하며, 여기서 동계 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인으로 대체되는 키메라 Ig 중쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물을 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물과 함께 육종하는 단계; 키메라 Ig 중쇄 좌 및 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 자손을 추가로 육종하는 단계; 및 키메라 중쇄 및 인간 경쇄 좌에 대해 동형접합성인 게놈을 갖는 자손을 제조하는 단계를 포함하는, 제100항의 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법.
- 제154항에 있어서, 상기 첫 번째 인간 이외의 포유동물이 인간 JH 유전자 단편을 포함하는 방법.
- 인간 Ig 좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 제1 BAC를 제조하는 단계; 인간 FcR 유전자의 클러스터를 포함하는 제2 BAC를 제조하는 단계; 제1 BAC를 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 좌의 전부 또는 일부분을 대체하는 단계; 제2 BAC를 상기 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 FcR 유전자의 내인성 클러스터의 전부 또는 일부를 대체하는 단계; 상기 세포로부터 인간 Ig 쇄, 또는 그의 일부분, 및 인간 FcR을 인코딩하는 게놈을 포함하는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 제101항의 포유동물의 제조 방법.
- 제156항에 있어서, 상기 인간 Ig 좌가 JH의 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 Ig 중쇄 좌의 일부분을 포함하여 상기 Ig 중쇄 좌가 인간 FcR에 참여하는 방법.
- 제124항, 제141항, 제150항 및 제156항 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 BAC의 상기 도입 단계가 상기 제1 BAC의 상기 도입 단계보다 먼저 일어나는 방법.
- 인간 Ig 중쇄 좌를 포함하는 제1 BAC, 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 제2 BAC, 및 인간 FcR 유전자 단편의 클러스터를 포함하는 제3 BAC를 제조하는 단계; 제1, 제2 및 제3 BAC를 순차적으로 상동 재조합 수용성 인간 이외의 포유동물 세포로 도입하고, 상동 재조합을 통해 내인성 Ig 중쇄, Ig 경쇄, 및 FcR 유전자 단편 클러스터를 각각 대체하는 단계; 및 상기 세포로부터 인간 항체를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물을 발생시키는 단계를 포함하는, 인간 FcR과 맞물리는 인간 항체를 제조할 수 있는 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법.
- 인간 유전자 단편 하류의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 Ig 중쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물을 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 인간 이외의 포유동물과 함께 육종하는 단계; 인간 Ig 중쇄 좌 및 인간 Ig 경쇄 좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 자손을 추가로 육종하는 단계; 및 인간 중쇄 및 경쇄 좌에 대해 동형접합성인 게놈을 갖는 자손을 제조하는 단계를 포함하는, 제104항의 녹-인 인간 이외의 포유동물의 제조 방법.
- 제124항 내지 제160항 중 어느 하나에 있어서, 상기 녹-인 인간 이외의 포유동물이 마우스인 방법.
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