CN109996441B - 具有经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座的非人类动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了非人类动物(和/或非人类细胞)以及它们的使用和制备方法，所述非人类动物(和/或非人类细胞)具有包含人类抗体编码序列(即，免疫球蛋白基因)的基因组。本文所述的非人类动物表达含有全部或部分的人类Igλ轻链的抗体。具体地讲，在一些实施方案中，本文提供的非人类动物的特征为表达含有全部或部分的人类Igλ轻链的抗体，所述人类Igλ轻链由插入所述非人类动物的内源性Igλ轻链基因座中的人类Igλ轻链编码序列编码。本发明还提供了从非人类动物产生抗体的方法。

Description

具有经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座的非人类动物
相关申请案
本专利申请要求2016年11月4日提交的美国临时专利申请序列号62/417,845和2017年10月4日提交的美国临时专利申请序列号62/567,932的优先权权益，每个专利申请据此以引用的方式整体并入。
背景技术
人类抗体是发展最快的一类治疗剂。在目前用于人类抗体产生的技术中，用编码全部或部分人类抗体的遗传物质工程化的转基因动物(如，啮齿动物)的开发彻底革新了用于治疗多种疾病的人类治疗性单克隆抗体领域。仍然需要开发生成人类单克隆抗体的改进的体内系统，该体内系统使宿主转基因动物中的人类抗体库最大化。
发明内容
在某些方面，本文提供了用于鉴定和开发可用于治疗影响人类的多种疾病的新型抗体和基于抗体的治疗剂的改进的体内系统。如本文所公开，在某些实施方案中，具有经工程化的免疫球蛋白基因座(具体地讲，经工程化的免疫球蛋白(Ig)λ轻链基因座)和/或另外表达、产生或含有特征为具有人类Vλ区的轻链的抗体库的本文提供的非人类动物(如，啮齿动物)是有用的，例如用于采用人类Vλ序列的多样性进行新型基于抗体的治疗剂的鉴定和开发。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了用于开发用于施用于人类的抗体和/或基于抗体的治疗剂的改进的体内系统。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了用于开发含有人类Vλ域的抗体和/或基于抗体的治疗剂的改进的体内系统，所述抗体和/或基于抗体的治疗剂的特征为与从含有人类Vλ区序列的现有的体内系统获得的抗体和/或基于抗体的治疗剂相比，具有改进的性能。
在某些方面，本文提供了具有Igλ轻链基因座的非人类动物，该Igλ轻链基因座含有经工程化的免疫球蛋白可变区和恒定区；在某些实施方案中，还包含经工程化的调节区(或序列)。如本文所述，在某些实施方案中，所提供的非人类动物在它们的生殖系基因组中含有Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含经工程化的Igλ轻链可变区，该工程化的Igλ轻链可变区的特征为存在一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段、一个或多个人类Cλ区基因和啮齿动物Cλ区基因，该人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段彼此可操作地连接并且可操作地连接至所述啮齿动物Cλ区基因。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含5个至25个、5个至24个、5个至23个、5个至22个、5个至21个、5个至20个、5个至19个、5个至18个、5个至17个、5个至16个、5个至15个、5个至14个、5个至13个、5个至12个、5个至11个、5个至10个、5个至9个、5个至8个、5个至7个或5个至6个人类Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含10个至70个、10个至69个、10个至68个、10个至67个、10个至66个、10个至65个、10个至64个、10个至63个、10个至62个、10个至61个、10个至60个、10个至59个、10个至58个、10个至57个、10个至56个、10个至55个、10个至54个、10个至53个、10个至52个、10个至51个、10个至50个、10个至49个、10个至48个、10个至47个、10个至46个、10个至45个、10个至44个、10个至43个、10个至42个、10个至41个、10个至40个、10个至39个、10个至38个、10个至37个、10个至36个、10个至35个、10个至34个、10个至33个、10个至32个、10个至31个、10个至32个、10个至31个、10个至30个、10个至29个、10个至28个、10个至27个、10个至26个、10个至25个、10个至24个、10个至23个、10个至22个、10个至21个、10个至20个、10个至19个、10个至18个、10个至17个、10个至16个、10个至15个、10个至14个、10个至13个、10个至12个或10个至11个人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含6个至25个、7个至25个、8个至25个、9个至25个、10个至25个、11个至25个、12个至25个、13个至25个、14个至25个、15个至25个、16个至25个、17个至25个、18个至25个、19个至25个、20个至25个、21个至25个、22个至25个、23个至25个或24个至25个人类Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含11个至70个、12个至70个、13个至70个、14个至70个、15个至70个、16个至70个、17个至70个、18个至70个、19个至70个、20个至70个、21个至70个、22个至70个、23个至70个、24个至70个、25个至70个、26个至70个、27个至70个、28个至70个、29个至70个、30个至70个、31个至70个、32个至70个、33个至70个、34个至70个、35个至70个、36个至70个、37个至70个、38个至70个、39个至70个、40个至70个、41个至70个、42个至70个、43个至70个、44个至70个、45个至70个、46个至70个、47个至70个、48个至70个、49个至70个、50个至70个、51个至70个、52个至70个、53个至70个、54个至70个、55个至70个、56个至70个、57个至70个、58个至70个、59个至70个、60个至70个、61个至70个、62个至70个、63个至70个、64个至70个、65个至70个、66个至70个、67个至70个、68个至70个或69个至70个人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含6个至24个、7个至23个、8个至22个、9个至21个、10个至20个、11个至19个、12个至18个、13个至17个、14个至16个或15个至16个人类Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含11个至69个、12个至68个、13个至67个、14个至66个、15个至65个、16个至64个、17个至63个、18个至62个、19个至61个、20个至60个、21个至59个、22个至58个、23个至57个、24个至56个、25个至55个、26个至54个、27个至53个、28个至52个、29个至51个、30个至50个、31个至49个、32个至48个、33个至47个、34个至48个、35个至47个、36个至46个、37个至45个、38个至44个、39个至43个、40个至42个或41个至42个人类Vλ基因区段。
在某些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含5个、16个或25个功能性人类Vλ基因区段。在某些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含10个、27个或40个人类Vλ基因区段。在某些实施方案中，人类Vλ基因区段包括连续的人类Vλ基因区段，因为所述人类Vλ基因区段出现于人类细胞的人类Igλ轻链基因座中。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含至少5个人类Jλ基因区段(例如但不限于5个人类Jλ基因区段、6个人类Jλ基因区段、7个人类Jλ基因区段、8个人类Jλ基因区段等)。在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座包含至少4个人类Cλ区基因(例如但不限于4个人类Cλ区基因、5个人类Cλ区基因、6个人类Cλ区基因、7个人类Cλ区基因、8个人类Cλ区基因等)。在某些实施方案中，所提供的非人类动物包含Igλ轻链基因座，该Igλ轻链基因座在内源性Igλ轻链等位基因处包含至少25个人类Vλ基因区段、至少5个人类Jλ基因区段和至少4个人类Cλ区基因。在一些实施方案中，所提供的非人类动物在内源性非人类Igλ轻链基因座处包含仅一个鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ区基因(如，小鼠Cλ1区基因或小鼠Cλ1基因区段)。在一些实施方案中，所述Igλ轻链基因座还包含特征为三个序列元件的人类Eλ区(或序列)。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物在内源性非人类Igλ轻链基因座处含有处于天然或生殖系构型的人类Vλ，Jλ和Cλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人类动物在内源性非人类Igλ轻链基因座处含有处于这样的构型的人类Vλ，Jλ和Cλ基因区段：该构型天然不出现于人类细胞的生殖系基因组的人类免疫球蛋白λ轻链基因座中。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物在内源性非人类Igλ轻链基因座处含有DNA序列，该DNA序列包括散布于非编码的人类免疫球蛋白λ轻链序列中(或与其并置、与其关联等)的多个人类Vλ、Jλ和Cλ编码序列。在一些实施方案中，所提供的非人类动物在内源性非人类Igλ轻链基因座处含有DNA序列，该DNA序列包括散布于非编码的非人类(如，鼠科动物)免疫球蛋白λ轻链序列中的多个人类Vλ、Jλ和Cλ编码序列。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物的特征为来自所述非人类动物的生殖系基因组中的内源性非人类Igλ轻链基因座的抗体的表达，该抗体含有人类Vλ域以及人类或非人类Cλ域。在一些实施方案中，与一种或多种参考经工程化的或野生型非人类动物(例如但不限于κ:λ之比为95:5)相比，所提供的非人类动物的特征为来自经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座的人类Vλ区的使用率增加(例如，κ:λ之比为60:40)。
在一些实施方案中，提供了非人类动物、非人类细胞或非人类组织，它们的基因组包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，该人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段可操作地连接至非人类Cλ基因区段，并且该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个非人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在一些实施方案中，提供了非人类动物、非人类细胞或非人类组织，它们的生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：(a)一个或多个人类Vλ基因区段，(b)一个或多个人类Jλ基因区段，和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和非人类Cλ基因区段，并且其中该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个非人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含三个人类Eλ。在一些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个人类Eλ，该人类Eλ的特征为存在三个序列元件。在某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个人类Eλ，该人类Eλ的特征为存在以模块化方式发挥作用(或发挥功能)的三个序列元件。
在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个非人类Eλ。在某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个啮齿动物Eλ。在某些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个小鼠Eλ。在某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。在某些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座不含有(或缺乏)小鼠Eλ2-4。在某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个大鼠Eλ。
在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含全部或部分内源性Vλ和Jλ基因区段的缺失。在某些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2基因区段和Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。在某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P基因区段和Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含非人类Eλ2-4的缺失。在某些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2、Vλ3、Jλ2、Cλ2、Jλ4P、Cλ4P、Eλ2-4、Vλ1、Jλ3、Jλ3P、Cλ3和Jλ1的缺失。在某些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含作为唯一存在的非人类基因区段或序列元件的Cλ1、Eλ和Eλ3-1。
在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ4-69至Vλ3-1、至少人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6、人类Jλ基因区段Jλ7和啮齿动物Cλ1基因区段的插入。在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ3-1、至少人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6、人类Jλ基因区段Jλ7和啮齿动物Cλ1基因区段的插入。在一些实施方案中，本文提供的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1、至少人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6、人类Jλ基因区段Jλ7和啮齿动物Cλ1基因区段的插入。在某些实施方案中，插入包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6之间的人类非编码DNA以及天然出现于人类Jλ基因区段Jλ7的上游(或5’)的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，非人类Cλ基因区段为或包含啮齿动物Cλ基因区段。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因区段为或包含鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ基因区段。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因区段为或包含大鼠Cλ基因区段。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因区段为或包含小鼠Cλ基因区段。在某些实施方案中，啮齿动物Cλ基因区段为小鼠Cλ1基因区段。
在一些实施方案中，小鼠Cλ基因(或基因区段)包含与选自小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3的小鼠Cλ基因至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％相同或100％相同的序列。在一些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与选自小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3的小鼠Cλ基因实质上相同或相同的序列。在某些实施方案中，小鼠Cλ1基因为或包含SEQ ID NO:1。在某些实施方案中，小鼠Cλ2基因为或包含SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，小鼠Cλ3基因为或包含SEQ ID NO:5。在某些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与小鼠Cλ1基因相同的序列。
在一些实施方案中，小鼠Cλ基因(或基因区段)包含与选自小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3的小鼠Cλ基因50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或98％至100％相同的序列。
在一些实施方案中，小鼠Cλ基因(或基因区段)包含与选自小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3的小鼠Cλ基因50％至98％、50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、50％至65％、50％至60％或50％至55％相同的序列。
在一些实施方案中，小鼠Cλ基因(或基因区段)包含与选自小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3的小鼠Cλ基因55％至98％、60％至95％、65％至90％、70％至85％或75％至80％相同的序列。
在一些实施方案中，大鼠Cλ基因(或基因区段)包含与选自大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因的大鼠Cλ基因至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％相同或100％相同的序列。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因包含与选自大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因的大鼠Cλ基因实质上相同或相同的序列。在某些实施方案中，大鼠Cλ1基因为或包含SEQ ID NO:7。在某些实施方案中，大鼠Cλ2基因为或包含SEQ ID NO:9。在某些实施方案中，大鼠Cλ3基因为或包含SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，大鼠Cλ4基因为或包含SEQ ID NO:13。
在一些实施方案中，大鼠Cλ基因(或基因区段)包含选自大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因的大鼠Cλ基因50％至100％、55％至100％、60％至100％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或98％至100％相同的序列。
在一些实施方案中，大鼠Cλ基因(或基因区段)包含选自大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因的大鼠Cλ基因50％至98％、50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、50％至65％、50％至60％或50％至55％相同的序列。
在一些实施方案中，大鼠Cλ基因(或基因区段)包含选自大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因的大鼠Cλ基因55％至98％、60％至95％、65％至90％、70％至85％或75％至80％相同的序列。
在所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织的一些实施方案中，所述非人类动物、非人类细胞或非人类组织的生殖系基因组或基因组还包含(i)内源性免疫球蛋白重链基因座：该内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，该人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区；或(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，该内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，该人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，该内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，该人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白Cκ区。
在一些实施方案中，所插入的一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段替换非人类VH、DH基因区段。在某些实施方案中，插入包括天然出现于人类VH、DH和JH区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。在一些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区为内源性非人类免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座包含从VH3-74至VH6-1的人类VH基因区段、从DH1-1至DH7-27的人类DH基因区段和人类JH基因区段JH1-JH6的插入。在某些实施方案中，插入包括天然出现(存在)于人类VH3-74至VH6-1之间的人类非编码DNA、天然出现(存在)于人类DH1-1至DH7-27之间的人类非编码DNA和天然出现(存在)于人类JH1-JH6之间的人类非编码DNA。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座包含所有功能性人类VH基因区段、所有功能性人类DH基因区段和所有功能性人类JH基因区段的插入。
在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性非人类Adam6基因。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种非人类Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入第一和第二人类VH基因区段之间。在一些实施方案中，第一人类VH基因区段为人类VH1-2，并且第二人类VH基因区段为人类VH6-1。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入人类VH基因区段和人类DH基因区段之间。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入人类Adam6假基因的位置。
在一些实施方案中，所插入的一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段替换非人类Vκ和Jκ基因区段。在某些实施方案中，插入包括天然出现于人类Vκ和Jκ基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。在一些实施方案中，非人类免疫球蛋白Cκ区是内源性非人类Cκ区。在一些实施方案中，免疫球蛋白κ轻链基因座包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的全部或部分近端Vκ重复的插入。在一些实施方案中，免疫球蛋白κ轻链基因座包含从Vκ2-40至Vκ4-1的人类Vκ基因区段和从Jκ1至Jκ5的人类Jκ基因区段的插入。在某些实施方案中，插入包括天然出现于人类Vκ2-40至Vκ4-1之间的人类非编码DNA，和天然出现于人类Jκ1-Jκ5之间的人类非编码DNA。
在本文提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织的一些实施方案中，非人类动物、非人类细胞或非人类组织如本文所述对于免疫球蛋白重链基因座(例如，如本文所述的内源性免疫球蛋白重链基因座)而言是杂合的或纯合的。
在本文提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织的一些实施方案中，非人类动物、非人类细胞或非人类组织如本文所述对于免疫球蛋白κ轻链基因座(例如，如本文所述的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座)而言是杂合的或纯合的。
在本文提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织的一些实施方案中，非人类动物、非人类细胞或非人类组织如本文所述对于免疫球蛋白λ轻链基因座(例如，如本文所述的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座)而言是杂合的或纯合的。
在本文提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织的一些实施方案中，所述非人类动物、非人类细胞或非人类组织的生殖系基因组还包含编码一种或多种非人类Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入，并且所述动物对于所述插入而言是杂合的或纯合的。
在一些实施方案中，非人类细胞为非人类淋巴细胞。在一些实施方案中，非人类细胞选自B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。
在一些实施方案中，非人类细胞是非人类胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，非人类ES细胞是啮齿动物ES细胞。在一些特定实施方案中，啮齿动物ES细胞是小鼠ES细胞(例如，来自129品系、C57BL品系、BALB/c或它们的混合物)。在某些实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且是129和C57BL品系的混合物。在某些实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且是129、C57BL和BALB/c品系的混合物。
在一些实施方案中，提供了将本文所述的非人类ES细胞用于制备非人类动物的用途。在某些实施方案中，非人类ES细胞是小鼠ES细胞，并且用于制备包含如本文所述的经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座的小鼠。在某些实施方案中，非人类ES细胞是大鼠ES细胞，并且用于制备包含如本文所述的经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座的大鼠。
在一些实施方案中，非人类组织选自脂肪、膀胱、脑部、乳房、骨髓、眼、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及它们的组合。
在一些实施方案中，提供了从如本文所述的分离的非人类细胞或组织制备、生成、产生或获得的永生化细胞。
在一些实施方案中，提供了从如本文所述的非人类ES细胞制备、生成、产生或获得的非人类胚胎。在某些实施方案中，非人类胚胎是啮齿动物胚胎；在一些实施方案中，是小鼠胚胎；在一些实施方案中，是大鼠胚胎。
在一些实施方案中，提供了包括如本文所述的非人类动物、非人类细胞、非人类组织、永生化细胞、非人类ES细胞或非人类胚胎的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗或诊断的药物(例如，抗体或其片段)的如本文所述的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗、预防或改善疾病、病症或病状的药物(例如，抗体或其片段)的如本文所述的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了一种制备非人类动物的方法，所述非人类动物的生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，所述方法包括(a)将DNA片段引入非人类胚胎干细胞中，所述DNA片段包含核苷酸序列，该核苷酸序列包括(i)一个或多个人类Vλ基因区段，(ii)一个或多个人类Jλ基因区段，和(iii)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(i)-(iii)可操作地连接至非人类Cλ基因区段，并且其中该核苷酸序列还包含一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)；(b)获得(a)中生成的非人类胚胎干细胞；以及(c)使用(b)的非人类胚胎干细胞来产生非人类动物。
在一些实施方案中，提供了一种制备非人类动物的方法，所述非人类动物的生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，该经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，该人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人类和/或人类Cλ基因区段，并且该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个非人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，所述方法包括修饰非人类动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座，该经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座包括一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，该人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人类和/或人类Cλ基因区段，并且该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)以及一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，从而产生所述非人类动物。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人类Vλ基因区段包括Vλ4-69至Vλ3-1、Vλ5-52至Vλ3-1或Vλ3-27至Vλ3-1。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人类Vλ基因区段包括Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1。在制备非人类动物的方法的某些实施方案中，所述一个或多个人类Vλ基因区段包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段包括人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和人类Jλ7基因区段。在制备非人类动物的方法的某些实施方案中，人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于人类Jλ和Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且人类Jλ7基因区段包括天然出现于人类Jλ7.上游(或5’)的人类非编码DNA。
在制备本文提供的非人类动物的方法的某些实施方案中，人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1的插入包括天然出现于人类Vλ基因区段之间的人类非编码DNA，人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6的插入包括天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且人类Jλ7基因区段的插入包括天然出现于人类Jλ7.上游(或5’)的人类非编码DNA。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，非人类Cλ基因区段是啮齿动物Cλ基因区段；在某些实施方案中，是小鼠Cλ1基因区段。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，DNA片段还包含一个或多个选择性标记。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，DNA片段还包含一个或多个位点特异性重组位点。在制备本文提供的非人类动物的方法的某些实施方案中，DNA片段还包含通过相同的重组酶重组的一组或多组位点特异性重组位点。在制备非人类动物的方法的某些实施方案中，DNA片段还包含通过不同的重组酶重组的一组或多组位点特异性重组位点。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，将DNA片段引入非人类胚胎干细胞中，所述非人类胚胎干细胞的生殖系基因组包含(i)内源性免疫球蛋白重链基因座：该内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，该人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区；或(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，该内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，该人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，该内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，该人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白Cκ区。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，将DNA片段引入非人类胚胎干细胞中，所述非人类胚胎干细胞的生殖系基因组包含(i)野生型内源性免疫球蛋白重链基因座；或(ii)野生型内源性免疫球蛋白重链基因座和野生型内源性免疫球蛋白κ轻链基因座；并且其中所述方法还包括将从所述非人类胚胎干细胞制备、生成、产生或获得的小鼠与第二小鼠杂交的步骤。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，修饰非人类动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座在非人类胚胎干细胞中进行，所述非人类胚胎干细胞的生殖系基因组还包含(i)内源性免疫球蛋白重链基因座：该内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，该人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区；或(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，该内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，该人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，该内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，该人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至非人类免疫球蛋白Cκ区。
在制备本文提供的非人类动物的方法的某些实施方案中，一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入包括天然出现于一个或多个人类VH基因区段之间的人类非编码DNA、天然出现于一个或多个人类DH基因区段之间的人类非编码DNA和天然出现于一个或多个人类JH基因区段之间的人类非编码DNA。在制备本文提供的非人类动物的方法的某些实施方案中，一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入包括天然出现于一个或多个人类Vκ基因区段之间的人类非编码DNA和天然出现于一个或多个人类Jκ基因区段之间的人类非编码DNA。
在制备本文提供的非人类动物的方法的一些实施方案中，修饰非人类动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座在非人类胚胎干细胞中进行，所述非人类胚胎干细胞的生殖系基因组包含(i)野生型内源性免疫球蛋白重链基因座；或(ii)野生型内源性免疫球蛋白重链基因座和野生型内源性免疫球蛋白κ轻链基因座；并且其中所述方法还包括将从所述非人类胚胎干细胞制备、生成、产生或获得的小鼠与第二小鼠杂交的步骤。
在一些实施方案中，如本文所述的小鼠具有生殖系基因组，该生殖系基因组包含野生型IgH和Igκ基因座、纯合的或杂合的人源化IgH和Igκ基因座(该纯合的或杂合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列)，或纯合的或杂合的人源化IgH基因座(含有或不含有Adam6编码序列的插入)和纯合的或杂合的失活的Igκ基因座。
在一些实施方案中，提供了从如本文所述的方法制备、生成、产生、获得或可从如本文所述的方法获得的非人类动物。
在一些实施方案中，提供了一种在非人类动物中产生抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)用所关注的抗原免疫如本文所述的非人类动物，(b)在足以使啮齿动物对所关注的抗原产生免疫应答的条件下维持非人类动物，以及(c)从非人类动物或非人类细胞回收结合所关注的抗原的抗体。在一些实施方案中，该抗体包含人类λ轻链可变域。
在一些实施方案中，提供了一种在非人类动物中产生编码人类λ轻链可变域的核酸的方法，该方法包括以下步骤：(a)用所关注的抗原免疫如本文所述的非人类动物，(b)在足以使啮齿动物对所关注的抗原产生免疫应答的条件下维持非人类动物，以及(c)从非人类动物或非人类细胞回收编码人类λ轻链可变域的核酸。在一些实施方案中，该方法还包括从非人类动物或非人类细胞回收编码人类重链可变域的核酸。
在非人类动物中产生抗体的方法的一些实施方案中，非人类细胞是B细胞。在非人类动物中产生抗体的方法的一些实施方案中，非人类细胞是杂交瘤。
在非人类动物中产生抗体的方法的一些实施方案中，从啮齿动物或啮齿动物细胞回收的结合所关注的抗原的抗体包含人类重链可变域和人类λ轻链可变域。
在非人类动物中产生抗体或核酸的方法的一些实施方案中，人类重链可变域包括选自VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2和VH6-1的重排的人类VH基因区段。
在非人类动物中产生抗体或核酸的方法的一些实施方案中，人类λ轻链可变域包括选自Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1的重排的人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，提供了一种在非人类动物中诱导抗原特异性免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：(a)用所关注的抗原免疫如本文所述的非人类动物，(b)在足以使啮齿动物对所关注的抗原产生免疫应答的条件下维持非人类动物。
在一些实施方案中，提供了非人类动物，所述非人类动物的生殖系基因组包含纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，该纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含(i)人类Vλ基因区段Vλ4-69至Vλ3-1、Vλ5-52至Vλ3-1、Vλ3-27至Vλ3-1或Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1，(ii)人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6，(iii)人类Jλ基因区段Jλ7以及(iv)三个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(或具有三个序列元件的人类免疫球蛋白λ轻链增强子)的插入；其中(i)-(iv)彼此可操作地连接，并且该插入在非人类Cλ基因区段的上游，并且其中该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座缺乏内源性非人类免疫球蛋白Eλ2-4。
在一些实施方案中，提供了非人类动物，所述非人类动物的生殖系基因组包含纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，该纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：(i)人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1，(ii)人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6，(iii)人类Jλ基因区段Jλ7，和(iv)三个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(或具有三个序列元件的人类免疫球蛋白λ轻链增强子)；其中(i)-(iv)彼此可操作地连接并且(i)-(iii)在非人类Cλ基因区段的上游(或5’)，并且其中该内源性免疫球蛋白λ轻链基因座缺乏内源性非人类免疫球蛋白Eλ2-4，该人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1包括天然出现于人类Vλ基因区段之间的人类非编码DNA，该人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且该人类Jλ基因区段Jλ7包括天然出现于人类Jλ7的上游(或5’)的人类非编码DNA。
在所提供的非人类动物的某些实施方案中，非人类Cλ基因(或基因区段)为小鼠Cλ1基因(或基因区段)。在所提供的非人类动物的某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含内源性非人类免疫球蛋白λ轻链增强子Eλ和Eλ3-1。在所提供的非人类动物的某些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含内源性非人类Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P基因区段和Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗或诊断的药物(例如，抗体或其片段)的如本文所述的非人类动物、非人类细胞或非人类组织。
在一些实施方案中，提供了用于制造用于治疗、预防或改善疾病、病状或病症的药剂的如本文所述的非人类动物、非人类细胞或非人类组织。
在一些实施方案中，提供了将如本文所述的非人类动物、非人类细胞或非人类组织用于制造和/或开发用于医学(诸如用作药剂)的药物或疫苗的用途。
在一些实施方案中，提供了将如本文所述的非人类动物或细胞用于制造和/或开发抗体或其片段的用途。
在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织是啮齿动物、啮齿动物细胞或啮齿动物组织；在一些实施方案中，是小鼠、小鼠细胞或小鼠组织；在一些实施方案中，是大鼠、大鼠细胞或大鼠组织。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠、小鼠细胞或小鼠组织包含这样的遗传背景：该遗传背景包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、129xC57BL/6混合品系或它们的组合。
如本专利申请中所用，术语“约”和“大约”可等同使用。本专利申请中与或不与约或大约一起使用的任何数字意在涵盖由相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
附图说明
本文中包括的由以下各图组成的附图仅用于举例说明目的而非用于限制。
图1示出了用于构建啮齿动物的经工程化的内源性Igλ轻链基因座的示例性策略的未按比例绘制的示意图，该基因座的特征为存在多个人类Vλ、Jλ和Cλ编码序列，这些编码序列彼此可操作地连接并且可操作地连接至啮齿动物Cλ区(或啮齿动物Cλ基因)。如图所示，图中示出了五种具有各种量的来自人类Igλ轻链基因座的遗传物质的单独靶向载体(6286、6571、6596、6597和6680)，并且这些载体按顺序插入内源性啮齿动物(如，小鼠)Igλ轻链基因座中(如上图所示)。第一靶向载体(6286)插入啮齿动物Cλ1区的下游，并且构建为含有特征为三个序列元件的模块化人类Igλ增强子(Eλ)区(或序列)。第二靶向载体(6571)插入啮齿动物Cλ1区的上游，并且工程化为含有五个功能性人类Vλ基因区段、四个功能性人类Jλ-Cλ基因区段对和人类Jλ7基因区段(人类Jλ1-Cλ1-Jλ2-Cλ2-Jλ3-Cλ3-Jλ4-Cλ4-Jλ5-Cλ5-Jλ6-Cλ6-Jλ7)。第三(6596)和第四(6597)靶向载体还包括另外的人类Vλ基因区段(分别为十一个和九个)组，这些基因区段在第一靶向载体的成功靶向之后按顺序加入内源性小鼠Igλ轻链基因座的总体人类Vλ基因区段内容物。两种靶向载体均包括3’末端上的重叠区(条纹填充的矩形)，以便有助于一旦整合进内源性小鼠Igλ轻链基因座，即与前述靶向载体的5’末端的同源重组。还示出了具有与6597靶向载体相同的遗传物质的替代性第五靶向载体(6680)，但例外的是该替代性靶向载体包括具有与啮齿动物Vλ2基因区段5’(或上游)的序列相同的序列的5’同源臂，从而有助于在与靶向载体同源重组时内源性Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P-Eλ2-4-Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。除非另外指明，否则实心符号表示啮齿动物基因区段和/或序列，而空心符号表示人类基因区段和/或序列。还示出了位点特异性重组识别位点(如，loxP、Frt)侧接选择盒(HYG：在泛素启动子的转录控制下的潮霉素抗性基因[HYGR]；NEO：在泛素启动子的转录控制下的新霉素抗性基因[NEOR])。所选的核苷酸连接位置以横线标记于每个连接下，并且标明每个连接的SEQ ID NO。
图2示出了在实施例1中所述的靶向载体按顺序插入之后，示例性啮齿动物Igλ轻链等位基因的未按比例绘制的示意图。6597等位基因：含有25个功能性人类Vλ基因区段、四个功能性人类Jλ-Cλ基因区段对和可操作地连接至啮齿动物Cλ区(如，小鼠Cλ1区)的人类Jλ7基因区段的Igλ轻链等位基因，并且该Igλ轻链基因座还包括内源性Vλ-Jλ-Cλ基因区段、三个(即，E2.4、E和E3.1)内源性Igλ增强子区(或序列)和特征为三个序列元件的模块化人类Igλ增强子区(或序列)。6680等位基因：内源性Vλ-Jλ-Cλ基因区段和Igλ增强子Eλ2-4的位点特异性缺失之后的Igλ轻链等位基因，该Igλ轻链等位基因含有25个功能性人类Vλ基因区段、四个功能性人类Jλ-Cλ基因区段对和可操作地连接至啮齿动物Cλ区(如，小鼠Cλ1区)的人类Jλ7基因区段，该Igλ轻链基因座还包括两个(即，E和E3.1)内源性Igλ增强子区(或序列)和模块化人类Igλ增强子区(或序列，参见上文)。除非另外指明，否则实心符号表示啮齿动物基因区段和/或序列，而空心符号表示人类基因区段和/或序列。示出了位点特异性重组识别位点(如，Frt)侧接选择盒(HYG：在泛素启动子的转录控制下的潮霉素抗性基因[HYGR])。虚线表示两个所示的Igλ等位基因之间的缺失区。所选的核苷酸连接位置以横线标记于每个连接下，并且标明每个连接的SEQ ID NO。
图3示出了用于构建啮齿动物的经工程化的内源性Igλ轻链基因座的替代性示例性策略的未按比例绘制的示意图，该基因座的特征为存在多个人类Vλ、Jλ和Cλ编码序列，这些编码序列彼此可操作地连接并且可操作地连接至啮齿动物Cλ区。如图所示，图中示出了具有各种量的来自人类Igλ轻链基因座的遗传物质的两种不同的靶向载体，并且这些载体同时插入含有五个人类Vλ基因区段、人类Jλ-Cλ簇和小鼠Cλ1基因的经工程化的啮齿动物(如，小鼠)Igλ轻链基因座(如上图所示)中。6596靶向载体被修饰为移除新霉素选择盒并在5’和3’末端插入重叠序列(条纹填充的矩形)以提供同源区，从而有助于与对应的人类序列重组。第二靶向载体被设计为在构建体3’末端上含有重叠区(条纹填充的矩形)，该重叠区与修饰的6596靶向载体(修剪的6596靶向载体)共有序列同源性，这有助于与修剪的6596靶向载体的5’末端同源重组。这两个靶向载体还包括另外的人类Vλ基因区段(分别为十一个和九个)组，这些基因区段在第一靶向载体的成功靶向之后按顺序加入内源性小鼠Igλ轻链基因座的总体人类Vλ基因区段内容物。第二靶向载体包括具有与啮齿动物Vλ2基因区段5’(或上游)的序列相同的序列的5’同源臂，从而有助于在与靶向载体同源重组时内源性Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P-Eλ2-4-Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。两种靶向载体与引导RNA(gRNA)一起共同电穿孔，从而有助于整合进经工程化的Igλ轻链基因座中，这些引导RNA以箭头标记于每个序列位置附近，并且标明每个序列位置的SEQ ID NO。除非另外指明，否则实心符号表示啮齿动物基因区段和/或序列，而空心符号表示人类基因区段和/或序列。还示出了位点特异性重组识别位点(如，loxP、Frt)侧接选择盒(HYG：在泛素启动子的转录控制下的潮霉素抗性基因[HYGR]；NEO：在泛素启动子的转录控制下的新霉素抗性基因[NEOR])。所选的核苷酸连接位置以横线标记于每个连接下，并且标明每个连接的SEQ IDNO。
图4示出了实施例3所述的实验中采用的啮齿动物的野生型和示例性经工程化的啮齿动物Igλ轻链等位基因的未按比例绘制的示意图。野生型等位基因：野生型小鼠Igλ轻链基因座(还可参见例如，美国专利No.9,006,511的图2)；6571等位基因：含有5个功能性人类Vλ基因区段、四个功能性人类Jλ-Cλ基因区段对和可操作地连接至啮齿动物Cλ区(如，小鼠Cλ1区)的人类Jλ7基因区段的Igλ轻链等位基因，该Igλ轻链基因座还包括内源性Vλ-Jλ-Cλ基因区段、三个内源性Igλ增强子区(或序列)和模块化人类Igλ增强子区(或序列，参见上文)。6597等位基因：参见上文；6680等位基因：参见上文。所选的核苷酸连接位置以横线标记于每个连接下，并且标明每个连接的SEQ ID NO。
图5A和5B示出了指示对单细胞设门的脾细胞的代表性等高线图(A)(其示出了CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达)，和从用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)收集的每个脾脏的绝对细胞数(B)。
图6A和6B示出了指示对CD19+设门的脾细胞中的成熟和过渡B细胞的代表性等高线图(A)(其示出了IgD(y轴)和IgM(x轴)的表达)，和从用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)收集的每个脾脏的绝对细胞数(B)。每个点图上标注了特定B细胞亚群(如，成熟B细胞、过渡B细胞)。
图7A和7B示出了指示对CD19+设门的脾细胞中小鼠Igλ(mIgλ，y轴)、小鼠Igκ(mIgκ，x轴)或人类Igλ(hIgλ，y轴)表达的代表性等高线图，这些脾细胞从用于插入6680靶向载体(6680HO)的小鼠纯合子和野生型同窝仔(WT)收集。
图8A和8B示出了指示对单细胞设门的骨髓的代表性等高线图(A)(其示出了CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达)，和从用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)收集的每个股骨的绝对细胞数(B)。
图9A和9B示出了指示对CD19+IgMlowB220int设门的骨髓的代表性等高线图(A)(其示出了c-kit(y轴)和CD43(x轴)的表达)，和从用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)收集的每个股骨的绝对细胞数(B)。每个点图上标注了特定B细胞亚群(如，祖B细胞、前B细胞)。
图10A和10B示出了指示对CD19+设门的骨髓的代表性等高线图(A)(其示出了IgM(y轴)和B220(x轴)的表达)，和从用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)收集的每个股骨的绝对细胞数(B)。每个点图上标注了特定B细胞亚群(如，未成熟B细胞、成熟B细胞、前B细胞和祖B细胞)。
图11A和11B示出了指示未成熟骨髓的代表性等高线图(对CD19+IgM+B220int设门)(其示出了小鼠Igλ(mIgλ，y轴)、小鼠Igκ(mIgκ，x轴)或人类Igλ(hIgλ，y轴)的表达)，所述骨髓来自用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)。
图12A和12B示出了指示成熟骨髓的代表性等高线图(对CD19+IgM+B220+设门)(其示出了小鼠Igλ(mIgλ，y轴)、小鼠Igκ(mIgκ，x轴)或人类Igλ(hIgλ，y轴)的表达)，所述骨髓来自用于插入6680靶向载体的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)。
图13示出了来自本文所述的选择的工程化小鼠品系的脾脏、未成熟骨髓(未成熟BM)和成熟骨髓(成熟BM)中的表达Igκ(％κC)和表达人类Igλ(％humλC)的B细胞的代表性平均百分比。数据以平均值提供，还示出了标准偏差。6680HO/VI HO/Adam6 HO：含有以下基因座的经工程化的小鼠品系：纯合的经工程化的Igλ轻链基因座，该基因座被设计为含有25个功能性人类Vλ基因区段、四个功能性人类Jλ-Cλ基因区段对和可操作地连接至啮齿动物Cλ区(如，小鼠Cλ1区)的人类Jλ7基因区段，该Igλ轻链基因座还包括两个内源性Igλ增强子区(或序列)和模块化人类Igλ增强子区(或序列，参见上文)；以及纯合的人源化IgH和Igκ基因座，该纯合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940；据此以引用的方式整体并入)；6889HO/VI HO/Adam6 HO：含有以下基因座的经工程化的小鼠品系：纯合的经工程化的Igλ轻链基因座，该基因座含有25个功能性人类Vλ基因区段、四个功能性人类Jλ-Cλ基因区段对和可操作地连接至啮齿动物Cλ区(如，小鼠Cλ1区)的人类Jλ7基因区段，该Igλ轻链基因座还包括两个内源性Igλ增强子区(或序列)和模块化人类Igλ增强子区(或序列，参见上文)；以及纯合的人源化IgH和Igκ基因座，该纯合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940；据此以引用的方式整体并入)。所示的每个基因型队列的小鼠数量包括至少三只和至多八只动物/组。
图14A和14B示出了使用从用于插入6680靶向载体的经工程化的小鼠纯合子(6680HO)和野生型同窝仔(WT)分离的血清进行的非还原条件下SDS-PAGE的代表性免疫印迹(Western印迹)图，该图指示了小鼠(B，右图)或人类(A，左图)λ轻链的表达；每个样品以1.5μl血清的体积加入泳道。PHS：0.25μl的体积的合并人类血清(Labquip Ltd Cat#9101A)。分子量(单位为Kd)表示在每个凝胶图的右侧。
图15A示出了从RNA扩增的人类Cλ引发的序列中代表性人类Vλ(上图)和人类Jλ(下图)基因区段使用，所述RNA从6889HET小鼠(n＝5)收集的脾细胞分离。
图15B示出了从RNA扩增的小鼠Cλ引发的序列中代表性人类Vλ基因区段使用，所述RNA从6889HET小鼠(n＝5)收集的脾细胞分离。
图15C示出了从RNA扩增的人类Cλ引发的序列中代表性人类Vλ(上图)和人类Jλ(下图)基因区段使用，所述RNA从6889HO/VI HO/Adam6 HO小鼠(n＝6)收集的脾细胞分离。
图15D示出了从RNA扩增的小鼠Cλ引发的序列中代表性人类Vλ基因区段使用，所述RNA从6889HO/VI HO/Adam6 HO小鼠(n＝6)收集的脾细胞分离。
图16A和16B示出了第0和22天从用于插入6597靶向载体的免疫小鼠杂合子(6597HET，n＝6)或6680靶向载体的免疫小鼠杂合子(6680HET，n＝6)和免疫野生型对照(WT，n＝6)收集的血清中代表性总IgG(A)和抗原特异性IgG(B)的滴定度。
图17A-C示出了第0和22天从用于插入6597(6597HET，n＝6)或6680(6680HET，n＝6)靶向载体的免疫小鼠杂合子和免疫野生型对照(WT，n＝6)收集的血清中抗原特异性IgG的代表性人类λ轻链(hIgλ，左图)、小鼠λ轻链(mIgλ，中图)和小鼠κ轻链(mIgκ，右图)的滴定度。
图18A和18B示出了指示对单细胞设门的脾细胞的代表性等高线图(左)(其示出了CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达)，和从用于插入6889靶向载体的小鼠纯合子(6889HO VI HOAdam6 HO)和经工程化的参考小鼠(VI)收集的每个脾脏的总B细胞数(右)。6889HO/VI HO/Adam6 HO：参见上文；VI：含有纯合的人源化IgH和Igκ基因座的经工程化的小鼠品系，该纯合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940；据此以引用的方式整体并入)。通过活力染色(Thermo Fisher)定义活的单细胞脾细胞。
图19示出了指示对CD19+设门的脾细胞中的人类Igλ(hIgλ，y轴)和小鼠Igκ(mIgκ，x轴)表达的代表性等高线图，这些脾细胞从用于插入6889靶向载体的小鼠纯合子(6889HOVI HO Adam6 HO)和经工程化的参考小鼠(VI)收集。6889HO/VI HO/Adam6 HO：参见上文；VI：参见上文。
图20示出了指示对单细胞设门的来自骨髓的淋巴细胞的代表性等高线图(其示出了IgM(y轴)和B220(x轴)的表达)，所述骨髓从用于插入6889靶向载体的小鼠纯合子(6889HO VI HO Adam6 HO)和经工程化的参考小鼠(VI)的股骨收集。6889HO/VI HO/Adam6HO：参见上文；VI：参见上文。每个等高线图上标注了未成熟和成熟B细胞亚群。
图21示出了指示未成熟(对CD19+IgM+B220int设门，左栏)和成熟(对CD19+IgM+B220+设门，右栏)骨髓的代表性等高线图(其示出了人类Igλ(hIgλ，y轴)和小鼠Igκ(mIgκ，x轴)的表达)，所述骨髓来自用于插入6889靶向载体的小鼠纯合子(6889HO VI HO Adam6 HO)和经工程化的参考小鼠(VI)。6889HO/VI HO/Adam6 HO：参见上文；VI：参见上文。
序列表中选定的序列的简述
小鼠Cλ1 DNA(SEQ ID NO:1)：
GCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGATTTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGTATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTGACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAAGGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCC
小鼠Cλ1氨基酸(SEQ ID NO:2)：
GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS
小鼠Cλ2 DNA(SEQ ID NO:3)：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACTCTCACCGTGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGGAAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCCAACTTTTCCCCGAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGGCAACAAGTTCATGGCCAGCAGCTTCCTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGTCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC
小鼠Cλ2氨基酸(SEQ ID NO:4)：
GQPKSTPTLTVFPPSSEELKENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEGNKFMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL
小鼠Cλ3 DNA(SEQ ID NO:5)：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACCATGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGGAAAACAAAGCCACACTCGTGTGTCTGATTTCCAATTTTTCCCCAAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGACAACAAGTACATGGCCAGCAGCTTCTTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC
小鼠Cλ3氨基酸(SEQ ID NO:6)：
GQPKSTPTLTMFPPSPEELQENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEDNKYMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL
大鼠Cλ1 DNA(SEQ ID NO:7)：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTGTC
大鼠Cλ1氨基酸(SEQ ID NO:8)：
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
大鼠Cλ2 DNA(SEQ ID NO:9)：
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
大鼠Cλ2氨基酸(SEQ ID NO:10)：
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
大鼠Cλ3 DNA(SEQ ID NO:11)：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAAAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAGTGTGTC
大鼠Cλ3氨基酸(SEQ ID NO:12)：
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
大鼠Cλ4 DNA(SEQ ID NO:13)：
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
大鼠Cλ4氨基酸(SEQ ID NO:14)：
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
定义
本发明的范围由本文所附权利要求书限定，并且不受本文所述的某些实施方案的限制；本领域的技术人员在阅读本说明书后将认识到可以等同于这些所述的实施方案或者在权利要求书的范围内的多个修改。
一般来讲，本文所用的术语是根据该术语在本领域中所理解的含义，除非另外明确指明。下文提供了某些术语的明确定义；对于本领域的技术人员而言，这些和其他术语在整个本说明书中的特定实例中的含义将从上下文显而易见。以下和其他术语的附加定义在整个说明书中阐述。本说明书中引用的专利和非专利文献参考或其相关部分以引用的方式整体并入本文。
施用：如本文所用，包括将组合物施用于受试者或系统(例如施用于细胞、器官、组织、生物体或它们的相关组分或它们的组分组)。技术人员将理解，施用途径可以根据例如组合物所施用于的受试者或系统、组合物的性质、施用目的等而变化。例如，在某些实施方案中，针对动物受试者(例如，针对人或啮齿动物)的施用可以是支气管施用(包括通过支气管滴注)、面颊施用、肠内施用、皮内施用、动脉内施用、真皮内施用、胃内施用、髓内施用、肌肉内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、静脉内施用、心室内施用、粘膜施用、鼻腔施用、口服、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管施用(包括通过气管滴注)、透皮施用、阴道施用和/或玻璃体施用。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇给药。在一些实施方案中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)达至少一段选定的时间。
改善：如本文所用，包括预防、减少或缓解受试者的病情，或改善受试者的病情。改善包括但不需要完全恢复或完全预防疾病、病状或病症。
大约：应用于一个或多个所关注的值，包括与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有所指或根据上下文明显不同，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围(除了这样的数字将超过可能值的100％的情况之外)。
生物学活性的：如本文所用，是指在生物系统中、在体外或体内(例如，在生物体中)具有活性的任何试剂的特征。例如，当存在于生物体中时，在该生物体内具有生物学效应的药剂被认为具有生物学活性。在特定实施方案中，当蛋白质或多肽具有生物学活性时，共享该蛋白质或多肽的至少一种生物学活性的该蛋白质或多肽的部分通常称为“生物学活性”部分。
可比较的：如本文所用，是指这样的两种或更多种药剂、实体、情况、条件组等：它们可以彼此不相同但是足够相似以允许在其间进行比较，从而可以根据所观察到的差异或相似处来合理地得出结论。本领域的普通技术人员在上下文中将理解，在任何给定的情况下，对于两种或更多种这样的药剂、实体、情形、条件组等需要多大程度的同一性被认为是可比较的。
保守的：如本文所用，是指描述保守氨基酸置换的情况，包括氨基酸残基被含有具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基的置换。一般来讲，保守氨基酸置换实质上不会改变蛋白质的所关注的功能性质，例如，受体结合配体的能力。含有具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：脂族侧链诸如甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)和异亮氨酸(Ile，I)；脂族-羟基侧链诸如丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)；含酰胺侧链诸如天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)；芳族侧链诸如苯丙氨酸(Phe，F)、酪氨酸(Tyr，Y)和色氨酸(Trp，W)；碱性侧链诸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)和组氨酸(His，H)；酸性侧链诸如天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)；和含硫侧链诸如半胱氨酸(Cys，C)和甲硫氨酸(Met，M)。保守氨基酸置换组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸(Val/Leu/Ile，V/L/I)、苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr，F/Y)、赖氨酸/精氨酸(Lys/Arg，K/R)、丙氨酸/缬氨酸(Ala/Val，A/V)、谷氨酸/天冬氨酸(Glu/Asp，E/D)和天冬酰胺/谷氨酰胺(Asn/Gln，N/Q)。在一些实施方案中，保守氨基酸置换可为丙氨酸对蛋白质中的任何天然残基的置换，如例如丙氨酸扫描诱变中所用。在一些实施方案中，进行保守置换，该保守置换在Gonnet,G.H.等人,1992,Science 256:1443-1445公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值。在一些实施方案中，如果置换在PAM250对数似然矩阵中具有非负值，则该置换是适度保守置换。
对照：如本文所用，是指本领域理解的“对照”含义，即作为比较结果所针对的标准品。通常，对照通过分离变量以得出有关此类变量的结论而用于增进实验完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较的反应或测定。“对照”还包括“对照动物”。“对照动物”可具有如本文所述的修饰，与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。在一个实验中，施加“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，即“对照”，不施加所测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，此前进行的测试或测定，或此前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照为或包括印刷或以其他方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
衍生自：当用于重排的可变区基因或“衍生自”未重排的可变区和/或未重排的可变区基因区段的可变域时，是指将重排的可变区基因或可变域的序列追溯到一组未重排的可变区基因区段(其重排以形成表达可变域的重排的可变区基因)的能力(在适用的情况下，说明剪接差异和体细胞突变)。例如，发生过体细胞突变的重排的可变区基因不改变它衍生自未重排的可变区基因区段的事实。
断裂：如本文所用，是指与DNA分子(例如，与内源性同源序列诸如基因或基因座)同源重组事件的结果。在一些实施方案中，断裂可实现或代表插入、缺失、置换、替换、错义突变或DNA序列移码或它们的任何组合。插入可包括整个基因或基因片段(例如外显子)的插入，该插入可来源于除内源性序列之外的起源(例如，异源序列)。在一些实施方案中，断裂可增加基因或基因产物(例如，基因编码的多肽)的表达和/或活性。在一些实施方案中，断裂可减少基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，断裂可改变基因或编码的基因产物(例如，编码的多肽)的序列。在一些实施方案中，断裂可截短基因或编码的基因产物(例如，编码的多肽)或使其片段化。在一些实施方案中，断裂可以延伸基因或所编码的基因产物。在一些此类实施方案中，断裂可以实现融合多肽的组装。在一些实施方案中，断裂可影响基因或基因产物的水平但不影响其活性。在一些实施方案中，断裂可影响基因或基因产物的活性但不影响其水平。在一些实施方案中，断裂可对基因或基因产物的水平无显著影响。在一些实施方案中，断裂可对基因或基因产物的活性无显著影响。在一些实施方案中，断裂可对基因或基因产物的水平或活性都无显著影响。
确定、测量、评价、评估、测定和分析：在本文中可互换使用，是指任何形式的测量，并且包括确定某要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定。测定可为相对的或绝对的。“测定某物的存在”可为确定某物的存在量和/或确定其是否存在。
内源性基因座或内源性基因：如本文所用，是指在引入如本文所述的断裂、缺失、替换、改变或修饰之前可见于亲本或参考生物体的遗传基因座。在一些实施方案中，内源性基因座具有天然存在的序列。在一些实施方案中，内源性基因座为野生型基因座。在一些实施方案中，内源性基因座为经工程化的基因座。在一些实施方案中，参考生物体为野生型生物体。在一些实施方案中，参考生物体为经工程化的生物体。在一些实施方案中，参考生物体为实验室繁育的生物体(无论是野生型还是经工程化的)。
内源性启动子：如本文所用，是指与内源性基因天然关联(例如，在野生型生物体中)的启动子。
经工程化的：如本文所用，一般来讲是指已经由人工操纵的方面。例如，在一些实施方案中，当不以自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列通过人工操纵而在经工程化的多核苷酸中直接彼此连接时，多核苷酸可被视为“经工程化的”。在一些特定的此类实施方案中，经工程化的多核苷酸可以包含自然界中存在的与第一编码序列可操作地关联但不与第二编码序列可操作地关联的调控序列，该调控序列通过人工连接而使得其与第二编码序列可操作地关联。可替代地或另外地，在一些实施方案中，各自编码自然中不彼此连接的多肽元件或域的第一和第二核酸序列可以在单个经工程化的多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施方案中，如果细胞或生物体已被操纵而使得其遗传信息被改变(例如，此前不存在的新遗传物质已经被引入，或者此前存在的遗传物质已被改变或移除)，则该细胞或生物体可被视为“经工程化的”。如通常实践并且由本领域的技术人员所理解，即使实际的操作是对此前的实体进行的，经工程化的多核苷酸或细胞的子代通常也称为“经工程化的”。此外，本领域的技术人员将认识到，可以通过多种可用的方法来实现如本文所述的“工程化”。例如，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及通过使用计算机系统进行选择或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体的选择或设计)，所述计算机系统经编程以执行分析或比较，或者分析、推荐和/或选择序列、改变等)。可替代地或另外地，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及使用体外化学合成方法和/或重组核酸技术，例如核酸扩增(例如经由聚合酶链式反应)杂交、突变、转化、转染等，和/或多种控制交配方法中的任一种。如将由本领域的技术人员所理解，多种确立的此类技术(例如，用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染等))是本领域熟知的并且在本说明书全文中所引用和/或讨论的多种一般和更具体的参考文献中有所描述。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989和Principles of Gene Manipulation:AnIntroduction to Genetic Manipulation,第5版,Old,R.W.和S.B.Primrose编,BlackwellScience,Inc.,1994。
功能性：如本文所用，是指表现出特定性质(如，形成编码序列的一部分)和/或活性的实体(如，基因或基因区段)的形式或片段。例如，在免疫球蛋白的语境中，可变域由组装(或重组)以形成功能编码序列的独特基因区段(即，V、D和/或J)所编码。当基因区段存在于基因组中时，虽然它们发生了变化，但会以簇的形式组织。“功能性”基因区段是以表达序列(即，可变域)表示的基因区段，其中对应的基因组DNA已分离(即，克隆)并通过序列鉴定。一些免疫球蛋白基因区段序列含有开放阅读框，虽然它们未在表达库中表示，但被视为具有功能的，而其他免疫球蛋白基因区段序列则含有突变(如，点突变、插入、缺失等)，从而产生终止密码子和/或截短的序列，随后使得这些基因区段序列不能发挥与一种或多种非突变序列相关联的一种或多种性质和/或一种或多种活性。这些序列不以表达序列表示，所以被归类为假基因。
基因：如本文所用，是指编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)的染色体中的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可以包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列二者。在一些实施方案中，基因可以包括例如可以控制或影响基因表达(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达等)的一个或多个方面的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。为了清楚起见，我们注意到，如本公开中所用，术语“基因”一般指编码多肽或其片段的核酸的一部分；该术语可任选涵盖调控序列，如本领域的普通技术人员从上下文所显而易见。该定义无意排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是为了阐明，在大多数情况下，本文档所用的术语是指编码多肽的核酸。
异源的：如本文所用，是指来自不同来源的药剂或实体。例如，当参考存在于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物使用时，该术语阐明了相关多肽、基因或基因产物：1)被人工工程化；2)通过人工(例如，经由基因工程)引入细胞或生物体(或其前体)中；和/或3)不由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)天然地产生或非天然地存在于相关细胞或生物体中。“异源的”还包括通常存在于特定天然细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物，但已经在非天然相关联的并且在一些实施方案中非内源性的调控元件(例如，启动子)的控制下例如通过突变或替换而进行了改变或修饰。
宿主细胞：如本文所用，是指核酸或蛋白质已引入其中的细胞。本领域技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅指特定的主题细胞，而且还用于指该细胞的子代。因为某些修饰可因突变或环境影响而在后续世代中发生，所以这种子代事实上可不等同于亲本细胞，但仍然包括在短语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞为或包括原核细胞或真核细胞。一般来讲，宿主细胞是适于接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而与该细胞被指定所属的生命界无关。示例性细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四重杂交瘤。在一些实施方案中，细胞为人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.
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细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞为或包括分离的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为组织的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞为生物体的一部分。
同一性：如本文结合序列比较所用，是指由可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的本领域已知的许多不同算法所确定的同一性。在一些实施方案中，使用ClustalWv.1.83(慢)比对(采用开放缺口罚分10.0、延伸缺口罚分0.1)和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM10.0.2,MacVector Inc.,2008)来确定本文所述的同一性。
体外：如本文所用，是指在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，是指在多细胞生物体，诸如人类和/或非人类动物内发生的事件。在基于细胞的系统的语境中，该术语可以用于指在活细胞内(与例如体外系统相对)发生的事件。
分离的：如本文所用，是指已经(1)从最初产生时(无论在自然界中和/或在实验环境中)所关联的至少一些组分分离，和/或(2)被人工设计、产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可从约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的它们最初关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂从10％至100％、15％-100％、20％-100％、25％-100％、30％-100％、35％-100％、40％-100％、45％-100％、50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、95％-100％、96％-100％、97％-100％、98％-100％或99％-100％的它们最初关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂从10％至100％、10％-99％、10％-98％、10％-97％、10％-96％、10％-95％、10％-90％、10％-85％、10％-80％、10％-75％、10％-70％、10％-65％、10％-60％、10％-55％、10％-50％、10％-45％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％或10％-15％的它们最初关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂从11％至99％、12％-98％、13％-97％、14％-96％、15％-95％、20％-90％、25％-85％、30％-80％、35％-75％、40％-70％、45％-65％、50％-60％或55％-60％的它们最初关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的试剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。在一些实施方案中，分离的药剂为80％-99％、85％-99％、90％-99％、95％-99％、96％-99％、97％-99％或98％-99％纯的。在一些实施方案中，分离的药剂为80％-99％、80％-98％、80％-97％、80％-96％、80％-95％、80％-90％或80％-85％纯的。在一些实施方案中，分离的药剂为85％-98％、90％-97％或95％-96％纯的。在一些实施方案中，如果物质实质上不含其他组分，则该物质是“纯的”。在一些实施方案中，如将由本领域的技术人员所理解，在与某些其他组分(例如，一种或多种载剂或赋形剂(如，缓冲液、溶剂、水等))组合后，物质仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施方案中，计算不包括此类载剂或赋形剂的物质的分离百分比或纯度。仅举一个例子，在一些实施方案中，天然存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸a)在因其衍生的起源或来源而不与在其天然状态下天然伴随其的一些或全部组分关联时；b)在其实质上不含与天然产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸时；c)当由不是天然产生其的物种的细胞或其他表达系统表达或以其他方式与这些细胞或其他表达系统的组分关联时，被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成的或在与天然产生多肽的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施方案中，已历经一种或多种纯化技术的多肽在其已与a)在自然界中与其关联的；和/或b)当最初产生时与其关联的其他组分分离的程度上可被认为是“分离的”多肽。
基因座或基因位点：如本文所用，是指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽编码序列的一个或多个特定位置，或生物体的基因组的染色体上的位置。例如，“免疫球蛋白基因座”可以指免疫球蛋白基因区段(如，V、D、J或C)、免疫球蛋白基因区段DNA序列、免疫球蛋白基因区段-编码序列的特定位置，或已鉴定为这种序列所在之处的生物体的基因组的染色体上的免疫球蛋白基因区段位置。“免疫球蛋白基因座”可以包含免疫球蛋白基因区段的调控元件，包括但不限于增强子、启动子、5’和/或3’调控序列或区，或它们的组合。“免疫球蛋白基因座”可以包含通常位于野生型基因座中的基因区段之间的DNA，但是该DNA本身缺乏免疫球蛋白基因区段(如，天然位于一组V基因区段和一组J基因区段之间的免疫球蛋白DNA序列、天然位于一组J基因区段和恒定区基因之间的免疫球蛋白DNA序列、或天然位于恒定区基因的3’的免疫球蛋白DNA序列)。本领域的普通技术人员将会理解，在一些实施方案中，染色体可以含有几百个或甚至几千个基因，并且在不同物种之间进行比较时显示出相似的遗传基因座的物理共定位。此类遗传基因座可以被描述为具有共有的同线性。
非人类动物：如本文所用，是指并非人类的任何脊椎动物生物体。在一些实施方案中，非人类动物为圆口纲脊椎动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟。在一些实施方案中，非人类动物为哺乳动物。在一些实施方案中，非人类哺乳动物为灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、奶牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人类动物为啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。
核酸：如本文所用，是指被掺入或可被掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是通过磷酸二酯键被掺入或可被掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”为或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”为或包含DNA。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与“核酸”的差别在于核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”、或者由一个或多个“肽核酸”组成，所述“肽核酸”是本领域已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键。可替代地或另外地，在一些实施方案中，“核酸”具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷、或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入型碱基以及它们的组合)、包含一个或多个核苷类似物或由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的糖相比，“核酸”包含一个或多个经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，“核酸”具有编码功能性基因产物(诸如RNA或多肽)的核苷酸序列。在一些实施方案中，“核酸”包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，“核酸”包括一个或多个外显子。在一些实施方案中，“核酸”通过下述方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶学合成、在重组细胞或系统中的复制以及化学合成。在一些实施方案中，“核酸”的长度为至少例如但不限于3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，“核酸”为单链的；在一些实施方案中，“核酸”为双链的。在一些实施方案中，“核酸”具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，“核酸”具有酶学活性。
可操作地连接的：如本文所用，是指并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系。例如，如果未重排的可变区基因区段能够重排以形成重排的可变区基因(该重排的可变区基因与作为抗原结合蛋白的多肽链的恒定区基因一起表达)，则未重排的可变区基因区段与邻接的恒定区基因“可操作地连接”。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作连接的”序列包括与所关注的基因邻接的表达控制序列和以反式或相距一定距离发挥作用来控制所关注的基因(或所关注的序列)的表达控制序列。术语“表达控制序列”包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列是影响它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的。“表达控制序列”包括：合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号(例如剪接和聚腺苷酸化信号)；使胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强多肽稳定性的序列；以及当需要时，增加多肽分泌的序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括这样的组分：它们的存在对于表达和加工来说是必需的，并且还可包括这样的另外组分，它们的存在是有利的，例如前导序列和融合伴侣序列。
生理条件：如本文所用，是指本领域理解的细胞或生物体生活和/或繁殖的参考条件的含义。在一些实施方案中，该术语包括在自然中对于生物体或细胞系统可能发生的外部或内部环境的条件。在一些实施方案中，生理条件是存在于人类或非人类动物体内的那些条件，尤其是存在于手术部位处和/或手术部位内的那些条件。生理条件通常包括例如温度范围为20-40℃、大气压为1、pH为6-8、葡萄糖浓度为1-20mM、大气水平的氧浓度，以及在地球上遇到的重力。在一些实施方案中，实验室中的条件在生理条件下被操纵和/或维持。在一些实施方案中，生理条件在生物体中遇到。
多肽：如本文所用，是指氨基酸的任何聚合链。在一些实施方案中，多肽具有在天然中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有不在天然中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有这样的氨基酸序列：其包含在自然中彼此单独存在的部分(即，来自两种或更多种不同的生物体，例如人类和非人类部分)。在一些实施方案中，多肽具有由于通过人工行为来设计和/或产生而工程化的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有由在自然中不存在的序列(例如，由于通过人工行为来设计和/或产生，以编码所述多肽而工程化的序列)编码的氨基酸序列。
重组子：如本文所用，旨在指通过重组手段来设计、工程化、制备、表达、形成或分离的多肽，诸如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的多肽，从重组、组合人类多肽文库分离的多肽(Hoogenboom,H.R.,1997,TIB Tech.15:62-70；Azzazy,H.和W.E.Highsmith,2002,Clin.Biochem.35:425-45；Gavilondo,J.V.和J.W.Larrick,2002,BioTechniques29:128-45；Hoogenboom H.和P.Chames,2000,Immunol.Today21:371-8)，从针对人类免疫球蛋白基因而转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95；Kellermann,S-A.和L.L.Green,2002,Curr.Opin.Biotechnol.13:593-7；Little,M.等人,2000,Immunol.Today21:364-70；Osborn,M.J.等人,2013,J.Immunol.190:1481-90；Lee,E-C.等人,2014,Nat.Biotech.32(4):356-63；Macdonald,L.E.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5147-52；Murphy,A.J.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-8)或通过涉及使所选的序列元件彼此剪接的任何其他手段来制备、表达、形成或分离的多肽。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一个或多个是天然存在的。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一个或多个是通过计算机模拟(in silico)来设计的。在一些实施方案中，一个或多个此类选定的序列元件由已知序列元件(例如，来自天然或合成来源)的诱变(例如，体内或体外)产生。例如，在一些实施方案中，重组多肽由存在于所关注的来源生物体(例如，人、小鼠等)的基因组中的序列构成。在一些实施方案中，重组多肽具有由诱变(例如，体外或体内，例如在非人类动物中)产生的氨基酸序列，以使得所述重组多肽的氨基酸序列为这样的序列：该序列虽然起源于多肽序列并且与多肽序列相关，但可能非天然地存在于非人类动物体内的基因组内。
参考：如本文所用，是指与所关注的药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值相比较的标准或对照药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施方案中，参考药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值的测试或确定与所关注的药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值的测试或确定实质上同时进行。在一些实施方案中，参考药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值为历史参考，其任选地以有形介质体现。在一些实施方案中，参考可以指对照。“参考”还包括“参考动物”。“参考动物”可以具有如本文所述的修饰，与本文所述不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。通常，本领域内的技术人员将理解，在一定的条件下确定或表征参考药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值，所述条件相当于确定或表征所关注的药剂、动物(例如哺乳动物)、队列、个体、群体、样品、序列或值所用的那些条件。
替换：如本文所用，是指将宿主基因座中(例如，基因组中)存在的“被替换的”核酸序列(例如，基因)从该基因座移除，并且将另一种“替换”核酸放置于该位置的过程。在一些实施方案中，被替换的核酸序列与替换核酸序列是可相互比较的，因为例如它们彼此同源和/或含有相应的元件(例如，蛋白质编码元件、调控元件等)。在一些实施方案中，被替换的核酸序列包括启动子、增强子、剪接供体位点、剪接受体位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)中的一者或多者；在一些实施方案中，替换核酸序列包括一个或多个编码序列。在一些实施方案中，替换核酸序列为被替换的核酸序列的同源物或变体(例如，突变体)。在一些实施方案中，替换核酸序列为被替换的序列的直系同源物或同源物。在一些实施方案中，替换核酸序列为或包含人类核酸序列。在一些实施方案中，包括在替换核酸序列为或包含人类核酸序列的情况下，被替换的核酸序列为或包含啮齿动物序列(例如，小鼠或大鼠序列)。在一些实施方案中，包括在替换核酸序列为或包含人类核酸序列的情况下，被替换的核酸序列为或包含人类序列。在一些实施方案中，替换核酸序列是被替换的序列的变体或突变体(即，与被替换的序列相比含有一处或多处序列差异(例如，置换)的序列)。这样放置的核酸序列可以包括一个或多个调控序列，该调控序列作为用于获得这样放置的序列(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)的来源核酸序列的一部分。例如，在多个实施方案中，替换是用异源序列置换内源性序列，从而导致从如此放置的核酸序列(包含异源序列)产生基因产物，但不表达内源性序列；替换是用编码与由内源性序列编码的多肽具有相似功能的多肽(例如，内源性基因组序列编码全部或部分的非人类可变域多肽，并且DNA片段编码全部或部分的一个或多个人类可变域多肽)的核酸序列替换内源性基因组序列。在多个实施方案中，内源性非人类免疫球蛋白基因区段或其片段被人类免疫球蛋白基因区段或其片段替换。
实质上：如本文所用，是指表现出全部或几乎全部范围或程度的所关注的特性或性质的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)进行至完成和/或进行至完全，或实现或避免绝对的结果。因此术语“实质上”在本文中用于捕获许多生物学和化学现象固有的完全性的潜在缺乏。
实质上同源性：如本文所用，是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所理解，如果两个序列在对应的位置上含有同源的残基，则它们通常被认为是“实质上同源的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域的普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或被归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的置换可以通常被认为是“同源”置换。典型的氨基酸分类汇总于下表中。
Figure GDA0002046896830000351
Figure GDA0002046896830000352
如本领域中所熟知，氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任何算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序在以下文献中有所描述：Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-10；Altschul,S.F.等人,1996,Meth.Enzymol.266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编)Bioinformatics:A Practical Guideto the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)Bioinformatics Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,第132卷,Humana Press,1998。除了鉴定同源序列以外，上文提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少例如但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在残基的相关序列段(stretch)上是同源的，则这两个序列被认为是实质上同源的。在一些实施方案中，相关序列段为完全序列。在一些实施方案中，相关序列段为至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或更多个残基。在一些实施方案中，相关序列段包括沿着完全序列的邻接的残基。在一些实施方案中，相关序列段包括沿着完全序列的非邻接的残基，例如通过多肽或其一部分的折叠构象集中在一起的非邻接的残基。在一些实施方案中，相关序列段为至少例如但不限于10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个残基。
实质上同一性：如本文所用，是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所理解，如果两个序列在对应的位置上含有相同残基，则这两个序列通常被认为是“实质上相同的”。如本领域中所熟知，氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任何算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序在以下文献中有所描述：Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-10；Altschul,S.F.等人,1996,Meth.Enzymol.266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,NucleicAcids Res.,25:3389-402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编)Bioinformatics:APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)Bioinformatics Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,第132卷,Humana Press,1998。除了鉴定相同的序列以外，上文提及的程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在残基的相关序列段上是相同的，则这两个序列被认为是实质上相同的。在一些实施方案中，残基的相关序列段为完全序列。在一些实施方案中，残基的相关区段为例如但不限于至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个残基。
靶向构建体或靶向载体：如本文所用，是指包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含这样的序列：该序列与靶细胞、组织或动物中的序列相同或实质上相同，并且提供了靶向构建体经由同源重组至所述细胞、组织或动物的基因组内的位置的整合。本文还包括和描述了使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP或Frt位点)来靶向的靶向区域。在一些实施方案中，如本文所述的靶向构建体还包含特别关注的核酸序列或基因、选择性标记、控制和/或调控序列，以及允许通过蛋白质的外源添加而介导的重组的其他核酸序列，所述蛋白质有助于或促进涉及此类序列的重组。在一些实施方案中，如本文所述的靶向构建体还包含全部或部分的所关注的基因，其中所关注的基因是编码全部或部分的多肽的异源基因，所述多肽具有与内源序列编码的蛋白质相似的功能。在一些实施方案中，如本文所述的靶向构建体还包含全部或部分的所关注的人源化基因，其中所关注的人源化基因编码全部或部分的多肽，所述多肽具有与内源序列编码的多肽相似的功能。在一些实施方案中，靶向构建体(或靶向载体)可以包含由人工操纵的核酸序列。例如，在一些实施方案中，靶向构建体(或靶向载体)可构建为包含含有两个或更多个序列的经工程化的或重组多核苷酸，所述两个或更多个序列不以自然界中的顺序连接在一起，而是由人工操纵为在经工程化的或重组多核苷酸中彼此直接连接。
转基因或转基因构建体：如本文所用，是指诸如通过本文所述的方法由人工引入细胞内的核酸序列(编码例如全部或部分的所关注的多肽)。转基因对于它所被引入其中的转基因动物或细胞可为部分或完全异源的，即外源的。转基因可以包括一个或多个转录调控序列和任何其他核酸，诸如内含子或启动子，它们对于选定的核酸序列的表达可为必需的。
转基因动物、转基因非人类动物或Tg+：在本文中可互换使用，并且是指任何非天然存在的非人类动物，其中非人类动物的一种或多种细胞含有全部或部分的编码所关注的多肽的异源核酸和/或基因。例如，在一些实施方案中，“转基因动物”或“转基因非人类动物”是指含有如本文所述的转基因或转基因构建体的动物或非人类动物。在一些实施方案中，通过有意的遗传操纵(诸如通过显微注射或通过用重组病毒感染)直接或间接引入前体细胞内，从而将异源核酸和/或基因引入细胞内。术语遗传操作不包括经典育种技术，而是涉及重组DNA分子的引入。该分子可以整合进染色体内，或者它可以是染色体外复制的DNA。术语“Tg+”包括异源核酸和/或基因的杂合子或纯合子动物，和/或具有单拷贝或多拷贝的异源核酸和/或基因的动物。
变体：如本文所用，是指显示出与参考实体的显著结构同一性，但相对于该参考实体在一个或多个化学部分的存在或水平上与该参考实体结构上不同的实体。在许多实施方案中，“变体”还在功能上与其参考实体不同。一般来讲，特定实体是否被适当地认为是参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如将由本领域的技术人员所理解，任何生物或化学参考实体具有某些特征性结构元件。根据定义，“变体”是共享一个或多个此类特征性结构元件的不同的化学实体。仅举几个例子，多肽可以具有由多个氨基酸构成的特征性序列元件，所述氨基酸具有在线性或三维空间中彼此相对的指定位置和/或有助于特定生物学功能，或核酸可以具有由多个核苷酸残基构成的特征性序列元件，所述多个核苷酸残基具有在线性或三维空间中彼此相对的指定位置。例如，“变体多肽”可以由于氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价附接至多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一个或多个差异而与参考多肽不同。在一些实施方案中，“变体多肽”显示出与参考多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。可替代地或另外地，在一些实施方案中，“变体多肽”不与参考多肽共享至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，“变体多肽”共享参考多肽的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，“变体多肽”缺乏参考多肽的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，“变体多肽”显示出相对于参考多肽而言降低水平的一种或多种生物学活性。在许多实施方案中，如果所关注的多肽具有与亲本的氨基酸序列相同但在特定位置上具有少数序列改变的氨基酸序列，则所关注的多肽被认为是亲本或参考多肽的“变体”。通常，相对于亲本而言，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的残基被置换。在一些实施方案中，相对于亲本而言，“变体”具有例如但不限于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个置换的残基。通常，“变体”具有极少数目(例如，少于5个、4个、3个、2个或1个)的置换的功能性残基(即，参与特定生物学活性的残基)。此外，相对于亲本而言，“变体”通常具有不超过例如但不限于5个、4个、3个、2个或1个添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个残基，并且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个残基。在一些实施方案中，亲本或参考多肽是天然存在的多肽。如将由本领域的普通技术人员所理解，所关注的特定多肽的多个变体通常可以是天然存在的，特别是当所关注的多肽为传染原多肽时。
载体：如本文所用，是指能够转运所关联的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞(诸如真核和/或原核细胞)中进行染色体外复制和/或表达它们所连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。
野生型：如本文所用，是指具有如在“正常”(相对于突变的、患病的、改变的等)状态或环境中天然存在的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
具体实施方式
在某些方面，本文提供了尤其是具有编码人类可变域，在一些实施方案中，人类恒定域的异源遗传物质的经工程化的非人类动物，所述异源遗传物质包含人类Vλ、Jλ和Cλ基因序列(即，基因区段)以及提供具有人类部分和非人类部分的抗体或具有实质上或实质上所有人类的序列的抗体的适当重排和表达的其他人类序列。在多个实施方案中，所提供的经工程化的非人类动物含有异源遗传物质，所述异源遗传物质以使得含有具有人类Vλ域和人类或非人类Cλ域的轻链的抗体在非人类动物的抗体库中表达的方式插入。另外，所提供的经工程化的非人类动物含有异源遗传物质，所述异源遗传物质以使得含有具有人类Vλ域和人类或非人类Cλ域的轻链的抗体从经工程化的Igλ轻链基因座表达的方式插入，所述经工程化的Igλ轻链基因座包括非人类动物的生殖系基因组中的人类和非人类Igλ增强子区(或序列)。
不希望受任何特定理论的束缚，预期如本文所述的非人类动物的实施方案提供了利用含有人类Vλ域的抗体的表达来产生治疗性抗体的改进的体内系统。还预期如本文所述的非人类动物的实施方案，在一些实施方案中，提供了含有异源遗传物质的Igλ轻链基因座的替代性经工程化的形式，所述异源遗传物质用于开发针对与偏向性抗体应答(如，以绝大部分κ或λ轻链为特征的抗体应答)相关联的疾病靶标的基于人类抗体的治疗剂(如，人类单克隆抗体、多特异性结合剂、scFv、融合多肽等)。因此，如本文所述的非人类动物的实施方案可特别用于开发针对与部分由于偏向性抗体库和/或应答而导致的低免疫原性相关联的靶标(如，病毒)的人类抗体。
具体地讲，在某些方面，本公开描述了具有含有经工程化的Igλ轻链基因座的生殖系基因组的非人类动物(如，啮齿动物，诸如大鼠或小鼠)的产生，在一些实施方案中，所述经工程化的Igλ轻链基因座的特征为引入多个人类Vλ、Jλ和Cλ基因序列，使这些基因序列与非人类Cλ区可操作地连接，导致含有包括人类Vλ域和人类或非人类Cλ域的轻链的抗体的表达。如本文所述，这种经工程化的Igλ轻链基因座的产生导致含有包括人类Vλ域和人类或非人类Cλ域的轻链的抗体的表达，所述人类Vλ域和人类或非人类Cλ域来自非人类动物的生殖系基因组中的所述经工程化的Igλ轻链基因座。在一些实施方案中，所提供的非人类动物的生殖系基因组还包含(1)人源化IgH和Igκ基因座或(2)人源化IgH基因座和功能沉默的或者功能赋予的非功能性Igκ轻链基因座。如本文所述，所提供的非人类动物表达含有包括人类Vλ域的Igλ轻链的抗体库。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物含有单个Igλ轻链基因座内的人类和非人类Igλ轻链序列。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物含有Igλ轻链基因座内的人类Igλ和鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Igλ轻链序列。在如本文所述的非人类动物的许多实施方案中，非人类Igλ轻链序列为或包含鼠科动物序列(如，小鼠或大鼠)。
在一些实施方案中，Igλ轻链序列包括人类和/或鼠科动物(如，小鼠或大鼠)起源的基因间DNA。在一些实施方案中，Igλ轻链序列包括合成的和基于人类或鼠科动物(如，小鼠或大鼠)起源的来源序列的基因间DNA。在一些实施方案中，所述基因间DNA是其中基因间DNA如此放置、插入、定位或工程化的相同的免疫球蛋白基因座的(如，Igλ轻链基因座中的Igλ基因间DNA)。在某些实施方案中，如本文所述的非人类动物含有经工程化的Igλ轻链基因座，所述经工程化的Igλ轻链基因座含有包括一个或多个非人类起源的Igλ轻链序列(如，小鼠或大鼠Igλ轻链序列)的基因间DNA。
在多个实施方案中，人源化IgH基因座含有可操作地连接至非人类IgH恒定区(如，包括一个或多个IgH恒定区基因(例如IgM、IgG等)的内源性非人类IgH恒定区)的多个人类VH、DH和JH基因区段。在多个实施方案中，人源化Igκ轻链基因座含有可操作地连接至非人类Igκ恒定区的多个人类Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人类动物具有包括本文提供的附图(例如参见图1、2、3和/或4)中描绘的免疫球蛋白基因座(或等位基因)的生殖系基因组。此类经工程化的非人类动物提供了人类抗体和人类抗体片段，和/或编码此类人类抗体和人类抗体片段的核酸的来源，并且提供了适用于利用人类Vλ序列来产生人类治疗性抗体的改进的体内系统。
如本文所述，在某些实施方案中，提供了具有基因组的非人类动物，所述基因组在内源性免疫球蛋白λ轻链基因座处的非人类免疫球蛋白λ轻链基因区段的位置含有多个人类λ轻链基因区段(如，Vλ、Jλ和Cλ)，并且包括人类可变区基因区段之间的人类非编码基因间DNA。在一些实施方案中，本文提供的非人类动物具有基因组，所述基因组分别在内源性免疫球蛋白重链和轻链基因座处的非人类重链(即，VH、DH和JH)和轻链(如，Vκ和Jκ)可变区基因区段的位置还包含人类重链(即，VH、DH和JH)和轻链(如，Vκ和Jκ)可变区基因区段。在许多实施方案中，人类免疫球蛋白基因区段(重链和/或轻链)用与所述基因区段天然相关联的人类基因间DNA(即，人类非编码免疫球蛋白基因间DNA)(即，与天然出现于人类细胞的人类免疫球蛋白基因座中的所述基因区段相关联的非编码基因组DNA)来工程化。这种基因间DNA包括例如启动子、前导序列以及在抗体的可变域的情况下允许人类基因区段的适当重组和表达的重组信号序列。技术人员理解，非人类免疫球蛋白基因座还含有这种非编码基因间DNA，并且在阅读本公开时会理解，其他人类或非人类基因间DNA可以用于构建此类经工程化的免疫球蛋白基因座，从而在非人类动物中的抗体的情况下引起人类可变域的相同表达。此类相似的经工程化的免疫球蛋白基因座仅需要含有所需的人类基因区段的人类编码序列(即，外显子)，或人类基因区段的组合，以实现含有人类可变域的抗体的表达。
在以下部分中详细描述了某些实施方案的多个方面，每个部分都可应用于如本文所述的任何方面或实施方案。部分的使用不是进行限制，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
非人类动物中的抗体库
免疫球蛋白(也称为抗体)是由宿主免疫系统的B细胞产生，以中和外源性抗原(如，病毒、细菌等)的大型(～150kD)Y形糖蛋白。每个免疫球蛋白(Ig)由两个相同的重链和两个相同的轻链构成，它们各自具有两种结构组件：可变域和恒定域。在由不同的B细胞产生的抗体中，重链和轻链可变域是不同的，但是对于由单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体，它们是相同的。每个抗体的重链和轻链可变域共同构成抗原结合区(或抗原结合位点)。免疫球蛋白根据它们所含有的重链恒定区(或域)可以不同的变型存在，这些变型称为同种型或类别。在相同同种型的所有抗体中，重链恒定域是相同的，但是在不同同种型的抗体中是不同的。下表汇总了小鼠和人(人类)中的九种抗体同种型。
Figure GDA0002046896830000411
Figure GDA0002046896830000421
在其他物种中鉴定了其他同种型。由于不同同种型之间的不同结构特征，同种型赋予抗体特定的生物学性质，并且存在于动物体内的不同位置(细胞、组织等)中。最初，B细胞产生具有相同抗原结合区的IgM和IgD。在活化时，B细胞通过称为类别转换的过程转换为不同的同种型，该过程涉及B细胞产生的抗体的恒定域的变化，而可变域仍然是相同的，从而保持了原始抗体(B细胞)的抗原特异性。
两个单独的基因座(Igκ和Igλ)含有编码抗体的轻链，并且表现出等位基因和同种型排斥的基因区段。κ+与λ+B细胞的表达比因物种而异。例如，人类展示出表达比为约60:40(κ:λ)。在小鼠和大鼠中，观察到表达比为95:5(κ:λ)。有趣的是，在猫中观察到的κ:λ表达比(5:95)与小鼠和大鼠相反。已经进行了若干研究来阐明这些观察到的表达比背后的可能原因，并且提出了基因座的复杂性(即，基因区段(具体地讲，V基因区段)的数量)和基因区段重排的效率的基本原理。人类免疫球蛋白λ轻链基因座延伸超过1,000kb，并且含有组织成三个簇的大约70个Vλ基因区段(29至33个功能性基因区段)和七个Jλ-Cλ基因区段对(四个至五个功能性基因区段对)(参见例如，美国专利No.9,006,511的图1)。表达抗体库中大部分观察到的Vλ区由最近端簇(即，簇A)内含有的基因区段编码。小鼠免疫球蛋白λ轻链基因座显著不同于人类基因座，并且根据品系，仅含有组织成两个不同的基因簇的几个Vλ和Jλ基因区段(参见例如，美国专利No.9,006,511的图2)。
用于治疗各种人类疾病的治疗性抗体的开发主要集中于经工程化的非人类动物品系(具体地讲，对应于人类免疫球蛋白基因的基因组中携带不同量的遗传物质的经工程化的啮齿动物品系)的形成(例如在Brüggemann,M.等人,2015,Arch.Immunol.Ther.Exp.63:101-8中有所综述)。形成此类转基因啮齿动物品系的最初努力集中于可单独支持基因区段的重组以及完全人类的、但内源性免疫球蛋白基因座失活的重链和/或轻链的产生的人类免疫球蛋白基因座的部分的整合(参见例如，Brüggemann,M.等人,1989,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.86:67-09-13；Brüggemann,M.等人,1991,Eur.J.Immunol.21:1323-6；Taylor,L.D.等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Davies,N.P.等人,1993,Biotechnol.11:911-4；Green,L.L.等人,1994,Nat.Genet.7:13-21；Lonberg,N.等人,1994,Nature 368:856-9；Taylor,L.D.等人,1994,Int.Immunol.6:579-91；Wagner,S.D.等人,1994,Eur.J.Immunol.24:2672-81；Fishwild,D.M.等人,1996,Nat.Biotechnol.14:845-51；Wagner,S.D.等人,1996,Genomics35:405-14；Mendez,M.J.等人,1997,Nat.Genet.15:146-56；Green,L.L.等人,1998,J.Exp.Med.188:483-95；Xian,J.等人,1998,Transgenics2:333-43；Little,M.等人,2000,Immunol.Today21:364-70；Kellermann,S.A.和L.L.Green,2002,Cur.Opin.Biotechnol.13:593-7)。具体地讲，一些努力包括人类Igλ轻链序列的整合(参见例如，美国专利申请公开No.2002/0088016 A1、2003/0217373 A1和2011/0236378 A1；美国专利No.6,998,514和7,435,871；Nicholson,I.C.等人,1999,J.Immunol.163:6898-906；Popov,A.V等人,1999,J.Exp.Med.189(10):1611-19)。这些努力集中于含有人类Vλ、Jλ和Cλ序列的酵母人工染色体的随机整合，从而形成表达完全人类λ轻链(即，人类可变和人类恒定)的小鼠品系。最近的努力采用了使用也含有人类Vλ、Jλ和Cλ序列的构建体的相似策略(Osborn,M.J.等人,2013,J.Immunol.190:1481-90；Lee,E-C.等人,2014,Nat.Biotech.32(4):356-63)。
其他努力包括将人类Vλ和Jλ基因区段特异性插入内源性啮齿动物Ig轻链基因座(κ和λ)中，以使得所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至内源性Ig轻链恒定区(参见例如，美国专利No.9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092；所有这些专利以引用的方式整体并入本文)。在这些动物中，来自簇A和B以及一个或四个人类Jλ基因区段的所有人类Vλ基因区段被插入内源性Igκ和Igλ轻链基因座中。因此，若干不同的人类Vλ和Jλ基因区段展示出两个经工程化的啮齿动物Ig轻链基因座之处的适当重排，以形成在啮齿动物抗体库的轻链中的Cκ和Cλ区的情况下表达的功能性人类Vλ域(参见例如，美国专利No.9,006,511的表7和图11-13)。具体地讲，具有携带人类Vλ和Jλ基因区段的经工程化的Igκ轻链基因座的小鼠展示出在脾脏区室中κ:λ之比为约1:1(参见例如，美国专利No.9,006,511的表4)。实际上，两种经工程化的小鼠品系(即，经工程化的Igκ或经工程化的Igλ轻链基因座)显示，人类Vλ域可从啮齿动物中的内源性Ig轻链基因座表达，该人类Vλ域通常显示出轻链表达的巨大偏差(参见上文)。本发明基于以下认识：可以产生其他经工程化的Ig轻链基因座结构，以使非人类动物中的针对治疗性靶标的抗体库中人类Vλ和Jλ基因区段的使用最大化，特别是与含有缺乏通常与人类Igλ轻链基因座相关联(即，出现于人类细胞中)的复杂性和稳健性质(如，小鼠和大鼠)的Igλ轻链基因座的非人类动物相比的最大化。此类替代性经工程化的Ig轻链基因座结构为该结构的设计所产生的独特的抗体库提供了该能力。
本公开描述了尤其是生殖系基因组含有经工程化的内源性Igλ轻链基因座的非人类动物的成功产生，所述经工程化的内源性Igλ轻链基因座包含与非人类Igλ轻链恒定区可操作地连接的多个人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段。具体地讲，本公开特别展示了表达具有人类可变域和非人类恒定域的抗体的经工程化的非人类动物的成功产生，该抗体包括含有人类Vλ域的轻链。如本文所述，此类轻链的表达通过将所述多个人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段插入内源性Igλ轻链基因座(或等位基因)中来实现。另外，如本文所述，在一些实施方案中，所提供的非人类动物是经工程化的，以使含有内源性Vλ域的轻链的表达失活(如，通过基因缺失)。因此，在至少一些实施方案中，本公开包括开发用于产生人类抗体的改进的体内系统，所述开发通过提供含有产生含有人类Vλ域的表达抗体库的替代性经工程化的Igλ轻链基因座的经工程化的非人类动物来进行。
DNA插入片段
通常，将含有人类Igλ轻链序列(如，Vλ、Jλ、Cλ和Igλ增强子)或它们的一个或多个部分的多核苷酸分子插入载体(优选地DNA载体)中，以在宿主细胞中复制多核苷酸分子。
人类Igλ轻链序列可以从已知的序列或来源(如，文库)直接克隆，或者从根据GenBank或其他可公开获得的数据库(如，IMGT)公开的序列通过计算机模拟来设计的生殖系序列合成。或者，细菌人工染色体(BAC)文库可以提供所关注的免疫球蛋白DNA序列(如，人类Vλ基因区段、人类Jλ-Cλ基因区段对、人类Eλ区或序列，以及它们的组合)。BAC文库可以含有100-150kb的插入片段大小，并且能够携带高达300kb的插入片段(Shizuya等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:8794-8797；Swiatek等人,1993,Genes and Development7:2071-2084；Kim等人,1996,Genomics34 213-218；以引用的方式并入本文)。例如，携带164-196kb的平均插入片段大小的人类BAC文库已有所描述(Osoegawa,K.等人,2001,GenomeRes.11(3):483-96；Osoegawa,K.等人,1998,Genomics52:1-8,文章No.GE985423)。已经构建了人类和小鼠基因组BAC文库，并且这些文库可商购获得(例如，ThermoFisher)。基因组BAC文库也可以作为免疫球蛋白DNA序列以及转录控制区的来源。
或者，可以从酵母人工染色体(YAC)分离、克隆和/或转移免疫球蛋白DNA序列。例如，已经确定了人类Igλ轻链基因座的核苷酸序列(参见例如，Dunham,I.等人,1999,Nature402:489-95)。另外，此前已采用YAC来组装人类Igλ轻链基因座转基因(参见例如，Popov,A.V.等人,1996,Gene177:195-201；Popov,A.V.等人,1999,J.Exp.Med.189(10):1611-19)。整个Igλ轻链基因座(人类或啮齿动物)可以克隆和包含在若干YAC内。如果使用多个YAC并且这些YAC含有重叠同源性区域，则它们可以在酵母宿主菌株内重组以产生代表整个基因座或基因座的所需部分(例如，靶向载体所靶向的区域)的单一构建体。YAC臂可以用哺乳动物选择盒进一步修饰，所述修饰通过改造以帮助通过本领域已知的和/或本文所述的方法将构建体引入胚胎干细胞或胚胎中来进行。
用于构建如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的人类Igλ轻链基因区段的DNA和氨基酸序列可以从公开的数据库(如，GenBank、IMGT等)和/或公开的抗体序列获得。在一些实施方案中，含有人类Igλ轻链基因区段的DNA插入片段包含一个或多个人类Igλ轻链增强子序列(或区)。在一些实施方案中，DNA插入片段包含包括一个或多个序列元件(如，一个、两个、三个等)的人类Igλ轻链增强子序列(或区)。在某些实施方案中，DNA插入片段包含人类Igλ轻链增强子序列(或区)(称为具有三个不同的序列元件的人类Eλ)。因此，在一些实施方案中，如本文所述的人类Eλ是模块化的，并且一个或多个序列元件一起作为增强子序列(或区)来发挥功能。在某些实施方案中，含有人类Igλ轻链增强子序列的DNA插入片段包含可操作地连接至非人类Igλ轻链序列(如，非人类Igλ轻链恒定区序列)的人类Igλ轻链增强子序列。在某些实施方案中，含有人类Igλ轻链增强子序列的DNA插入片段包含可操作地连接至非人类Igλ轻链序列(如，非人类Igλ轻链恒定区序列)以及可操作地连接至一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ-Cλ基因区段对和/或一个或多个人类Jλ基因区段的人类Igλ轻链增强子序列。在某些实施方案中，含有人类Igλ轻链增强子序列的DNA插入片段包含可操作地连接至非人类Igλ轻链序列(如，非人类Igλ轻链恒定区序列)、一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的人类Igλ轻链增强子序列。
DNA插入片段可以使用本领域已知的方法制备。例如，DNA插入片段可以制备为较大质粒的一部分。这种制备允许以本领域已知的有效方式克隆和选择正确的构建体。含有如本文所述的全部或部分的人类Igλ轻链序列的DNA插入片段可以定位于质粒上的简便限制性位点之间，使得它们可易于从其余的质粒序列分离，以掺入所需的非人类动物。
用于制备质粒和转化宿主生物体的各种方法是本领域已知的。对于用于原核和真核细胞二者的其他合适的表达系统，以及一般重组步骤，参见Principles of GeneManipulation:An Introduction to Genetic Manipulation,第5版,Old,R.W.和S.B.Primrose编,Blackwell Science,Inc.,1994和Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，Sambrook,J.等人编，Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989。
靶向载体
靶向载体可用于将DNA插入片段引入基因组靶基因座，并且包含DNA插入片段和侧接所述DNA插入片段的同源臂。靶向载体可以是线性形式或环形形式，并且它们可以是单链的或双链的。靶向载体可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。为了便于参考，同源臂在本文中称为5’和3’(即，上游和下游)同源臂。该术语涉及同源臂相对于靶向载体内DNA插入片段的位置。5’和3’同源臂对应于被靶向基因座内的区域或另一个靶向载体内的区域，它们在本文中分别称为“5’靶序列”和“3’靶序列”。在一些实施方案中，同源臂也可以作为5’或3’靶序列来发挥功能。
在一些实施方案中，本文所述的方法采用能够彼此重组的两个、三个或更多个靶向载体。在多个实施方案中，靶向载体是本文别处所述的大型靶向载体(LTVEC)。在这些实施方案中，第一、第二和第三靶向载体各自包含5’和3’同源臂。第一靶向载体的3’同源臂包含与第二靶向载体的5’同源臂重叠的序列(即，重叠序列)，该序列允许第一和第二LTVEC之间的同源重组。
就双重靶向方法而言，第一靶向载体的5’同源臂和第二靶向载体的3’同源臂与靶标基因组基因座内对应的区段(即，靶序列)同源，所述同源促进第一和第二靶向载体与对应的基因组区段的同源重组并修饰靶标基因组基因座。
就三重靶向方法而言，第二靶向载体的3’同源臂包含与第三靶向载体的5’同源臂重叠的序列(即，重叠序列)，该序列允许第二和第三LTVEC之间的同源重组。第一靶向载体的5’同源臂和第三靶向载体的3’同源臂与靶标基因组基因座内对应的区段(即，靶序列)同源，所述同源促进第一和第三靶向载体与对应的基因组区段的同源重组并修饰靶标基因组基因座。
当两个区域彼此共有足够水平的序列同一性以充当同源重组反应的底物时，同源臂和靶序列或者两个同源臂彼此“对应”或是彼此“对应的”。术语“同源性”包括与对应的序列相同或共有序列同一性的DNA序列。给定的靶序列和存在于靶向载体上的对应的同源臂(即，重叠序列)之间或者两个同源臂之间的序列同一性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。仅举一个例子，靶向载体的同源臂(或其片段)和另一个靶向载体的靶序列或靶标基因组基因座的靶序列(或其片段)共有的序列同一性的量可以为例如但不限于至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，以使得这些序列发生同源重组。
此外，同源臂和对应的靶序列之间对应的同源区可以具有足以促进靶标基因组基因座处的同源重组的任何长度。例如，给定的同源臂和/或对应的靶序列可以包含长度为例如但不限于至少约5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、100-200kb或200-300kb或更长的对应的同源区(诸如本文别处所述)，以使得同源臂具有足够的同源性来发生与细胞的靶标基因组基因座内或另一个靶向载体内的一个或多个对应的靶序列的同源重组。在一些实施方案中，给定的同源臂和/或对应的靶序列包含长度为例如但不限于至少约10-100kb、15-100kb、20-100kb、25-100kb、30-100kb、35-100kb、40-100kb、45-100kb、50-100kb、55-100kb、60-100kb、65-100kb、70-100kb、75-100kb、80-100kb、85-100kb、90-100kb或95-100kb或更长的对应的同源区(诸如本文别处所述)，以使得同源臂具有足够的同源性来发生与细胞的靶标基因组基因座内或另一个靶向载体内的一个或多个对应的靶序列的同源重组。
第一靶向载体的3’同源臂和第二靶向载体的5’同源臂的重叠序列或第二靶向载体的3’同源臂和第三靶向载体的5’同源臂的重叠序列可以具有足以促进所述靶向载体之间的同源重组的任何长度。例如，同源臂的给定重叠序列可以包含长度为至少约1-5kb、5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、100-200kb或200-300kb或更长的对应的重叠区，以使得同源臂的重叠序列具有足够的同源性来发生与另一个靶向载体内的对应的重叠序列的同源重组。在一些实施方案中，同源臂的给定重叠序列包含长度为至少约1-100kb、5-100kb、10-100kb、15-100kb、20-100kb、25-100kb、30-100kb、35-100kb、40-100kb、45-100kb、50-100kb、55-100kb、60-100kb、65-100kb、70-100kb、75-100kb、80-100kb、85-100kb、90-100kb或95-100kb或更长的重叠区，以使得同源臂的重叠序列具有足够的同源性来发生与另一个靶向载体内的对应的重叠序列的同源重组。在一些实施方案中，重叠序列为1-5kb(包括端值在内)。在一些实施方案中，重叠序列为约1kb至约70kb(包括端值在内)。在一些实施方案中，重叠序列为约10kb至约70kb(包括端值在内)。在一些实施方案中，重叠序列为约10kb至约50kb(包括端值在内)。在一些实施方案中，重叠序列为至少10kb。在一些实施方案中，重叠序列为至少20kb。例如，重叠序列可以为约1kb至约5kb(包括端值在内)、约5kb至约10kb(包括端值在内)、约10kb至约15kb(包括端值在内)、约15kb至约20kb(包括端值在内)、约20kb至约25kb(包括端值在内)、约25kb至约30kb(包括端值在内)、约30kb至约35kb(包括端值在内)、约35kb至约40kb(包括端值在内)、约40kb至约45kb(包括端值在内)、约45kb至约50kb(包括端值在内)、约50kb至约60kb(包括端值在内)、约60kb至约70kb(包括端值在内)、约70kb至约80kb(包括端值在内)、约80kb至约90kb(包括端值在内)、约90kb至约100kb(包括端值在内)、约100kb至约120kb(包括端值在内)、约120kb至约140kb(包括端值在内)、约140kb至约160kb(包括端值在内)、约160kb至约180kb(包括端值在内)、约180kb至约200kb(包括端值在内)、约200kb至约220kb(包括端值在内)、约220kb至约240kb(包括端值在内)、约240kb至约260kb(包括端值在内)、约260kb至约280kb(包括端值在内)或约280kb至约300kb(包括端值在内)。仅举一个例子，重叠序列可以为约20kb至约60kb(包括端值在内)。另外，重叠序列可以为至少1kb、至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少45kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少120kb、至少140kb、至少160kb、至少180kb、至少200kb、至少220kb、至少240kb、至少260kb、至少280kb或至少300kb。
在一些实施方案中，同源臂可以对应于细胞天然的基因座(如，被靶向基因座)，或者它们可以对应于整合进细胞的基因组内的DNA的异源或外源区段的区域，包括例如转基因、表达盒或DNA的异源或外源区域。另外，在一些实施方案中，同源臂可以对应于细胞中的靶向载体上的区域。在一些实施方案中，靶向载体的同源臂可以对应于酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体的区域，或适当的宿主细胞中含有的任何其他经工程化的区域。更进一步地，靶向载体的同源臂可以对应于或衍生自BAC文库、黏粒文库或P1噬菌体文库的区域。在某些实施方案中，靶向载体的同源臂对应于原核生物、酵母、鸟(如，鸡)、非人类哺乳动物、啮齿动物、人类、大鼠、小鼠、仓鼠、兔子、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如，狨猴、猕猴)、家畜、农畜或所关注的任何其他生物体天然、异源或外源的基因座。在一些实施方案中，同源臂对应于不能使用常规方法靶向或者在不存在核酸酶试剂(如，Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂的情况下仅不正确靶向或仅以显著较低的效率靶向的细胞的基因座。在一些实施方案中，同源臂衍生自合成DNA。
在一些实施方案中，一个或多个靶向载体的5’或3’同源臂中的一者对应于被靶向基因组基因座，而5’或3’同源臂中的另一者对应于另一个靶向载体上的区域。
在一些实施方案中，一个或多个靶向载体的5’和3’同源臂对应于被靶向基因组。另外，同源臂可以来自相关的基因组。例如，被靶向基因组是第一品系的小鼠基因组，并且靶向臂来自第二品系的小鼠基因组，其中第一品系和第二品系是不同的。在某些实施方案中，同源臂来自相同动物的基因组或来自相同品系的基因组，例如靶向基因组是第一品系的小鼠基因组，并且靶向臂来自相同小鼠或来自相同品系的小鼠基因组。
靶向载体的同源臂可以具有足以促进对应的靶序列的同源重组事件的任何长度，包括例如长度为至少1-5kb(包括端值在内)、5-10kb(包括端值在内)、5-15kb(包括端值在内)、5-20kb(包括端值在内)、5-25kb(包括端值在内)、5-30kb(包括端值在内)、5-35kb(包括端值在内)、5-40kb(包括端值在内)、5-45kb(包括端值在内)、5-50kb(包括端值在内)、5-55kb(包括端值在内)、5-60kb(包括端值在内)、5-65kb(包括端值在内)、5-70kb(包括端值在内)、5-75kb(包括端值在内)、5-80kb(包括端值在内)、5-85kb(包括端值在内)、5-90kb(包括端值在内)、5-95kb(包括端值在内)、5-100kb(包括端值在内)、100-200kb(包括端值在内)或200-300kb(包括端值在内)或更长。在一些实施方案中，靶向载体的同源臂具有足以促进对应的靶序列的同源重组事件的长度，即长度为至少1-100kb(包括端值在内)、5-100kb(包括端值在内)、10-100kb(包括端值在内)、15-100kb(包括端值在内)、20-100kb(包括端值在内)、25-100kb(包括端值在内)、30-100kb(包括端值在内)、35-100kb(包括端值在内)、40-100kb(包括端值在内)、45-100kb(包括端值在内)、50-100kb(包括端值在内)、55-100kb(包括端值在内)、60-100kb(包括端值在内)、65-100kb(包括端值在内)、70-100kb(包括端值在内)、75-100kb(包括端值在内)、80-100kb(包括端值在内)、85-100kb(包括端值在内)、90-100kb(包括端值在内)或95-100kb(包括端值在内)或更长。如本文所述，大型靶向载体可以采用长度更长的靶向臂。
核酸酶试剂(如，CRISPR/Cas系统)可以与靶向载体组合使用，以促进靶基因座(如，Igλ轻链基因座)的修饰。这些核酸酶试剂可以促进靶向载体和靶基因座之间的同源重组。当核酸酶试剂与靶向载体组合使用时，靶向载体可以包含对应于5’和3’靶序列的5’和3’同源臂，所述同源臂被定位为足够接近核酸酶切割位点，以促进核酸酶切割位点处切口或双链断裂时靶序列和同源臂之间的同源重组事件的发生。术语“核酸酶切割位点”包括核酸酶试剂(如，Cas9切割位点)形成的切口或双链断裂处的DNA序列。如果距离足以促进识别位点处切口或双链断裂时5’和3’靶序列和同源臂之间的同源重组事件的发生，那么对应于靶向载体的5’和3’同源臂的靶向基因座内的靶序列则“被定位为足够接近”核酸酶切割位点。因此，在某些实施方案中，对应于5’和/或3’靶向载体的同源臂的靶序列在给定识别位点的一个核苷酸内或在给定识别位点的至少10个核苷酸至约14kb内。在一些实施方案中，核酸酶切割位点紧邻至少一个或两个靶序列。
对应于靶向载体的同源臂的靶序列和核酸酶切割位点的空间关系可以变化。例如，靶序列可以定位于核酸酶切割位点的5’，靶序列可以定位于识别位点的3’，或靶序列可以侧接核酸酶切割位点。
与靶向载体的单独使用相比，靶向载体(包括例如，大型靶向载体)与核酸酶试剂的组合使用可以导致靶向效率增加。例如，与靶向载体的单独使用相比，当靶向载体与核酸酶试剂组合使用时，靶向载体的靶向效率可以增加至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍或由这些整数形成的范围内，诸如2-10倍。
一些靶向载体是“大型靶向载体”或“LTVEC”，它们包括包含同源臂的靶向载体，所述同源臂对应于和衍生自比希望在细胞中进行同源重组的其他方法通常所用的那些核酸序列更大的核酸序列。LTVEC的长度可以为例如至少10kb，或5’同源臂和3’同源臂的总和可以为例如至少10kb。LTVEC还包括包含比希望在细胞中进行同源重组的其他方法通常所用的那些DNA插入片段更大的DNA插入片段的靶向载体。例如，LTVEC使传统基于质粒的靶向载体由于大小限制而不能进行的大型基因座的修饰成为可能。例如，靶向基因座可以是(即，5’和3’同源臂可以对应于)不能使用常规方法靶向或者在不存在核酸酶试剂(如，Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂的情况下仅错误靶向或仅以显著较低的效率靶向的细胞的基因座。
在一些实施方案中，本文所述的方法采用能够在三向或四向重组事件中彼此以及与靶标基因组基因座重组的两个或三个LTVEC。这些方法使不能使用单个LTVEC实现的大型基因座的修饰成为可能。
LTVEC的实例包括衍生自细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体或酵母人工染色体(YAC)的载体。LTVEC的实例及其制备方法在例如美国专利No.6,586,251、6,596,541和No.7,105,348；以及国际专利申请公开No.WO2002/036789中有所描述，每个专利以引用的方式整体并入本文。LTVEC可以是线性形式或环形形式。
LTVEC可以具有任何长度，包括例如约20kb至约300kb(包括端值在内)、约20kb至约50kb(包括端值在内)、约50kb至约75kb(包括端值在内)、约75kb至约100kb(包括端值在内)、约100kb至125kb(包括端值在内)、约125kb至约150kb(包括端值在内)、约150kb至约175kb(包括端值在内)、约175kb至约200kb(包括端值在内)、约200kb至约225kb(包括端值在内)、约225kb至约250kb(包括端值在内)、约250kb至约275kb(包括端值在内)或约275kb至约300kb(包括端值在内)。另外，LTVEC可以为至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb或至少500kb或更长。在一些实施方案中，LTVEC的大小太大以致于不能够通过常规测定法(如，Southern印迹和长片段(如，1kb至5kb)PCR)来筛选靶向事件。
在一些实施方案中，LTVEC包含在约5kb至约200kb(包括端值在内)、约5kb至约10kb(包括端值在内)、约10kb至约20kb(包括端值在内)、约20kb至约30kb(包括端值在内)、约30kb至约40kb(包括端值在内)、约40kb至约50kb(包括端值在内)、约60kb至约70kb(包括端值在内)、约80kb至约90kb(包括端值在内)、约90kb至约100kb(包括端值在内)、约100kb至约110kb(包括端值在内)、约120kb至约130kb(包括端值在内)、约130kb至约140kb(包括端值在内)、约140kb至约150kb(包括端值在内)、约150kb至约160kb(包括端值在内)、约160kb至约170kb(包括端值在内)、约170kb至约180kb(包括端值在内)、约180kb至约190kb(包括端值在内)或约190kb至约200kb(包括端值在内)的范围内的DNA插入片段。在一些实施方案中，DNA插入片段可以在约5kb至约10kb(包括端值在内)、约10kb至约20kb(包括端值在内)、约20kb至约40kb(包括端值在内)、约40kb至约60kb(包括端值在内)、约60kb至约80kb(包括端值在内)、约80kb至约100kb(包括端值在内)、约100kb至约150kb(包括端值在内)、约150kb至约200kb(包括端值在内)、约200kb至约250kb(包括端值在内)、约250kb至约300kb(包括端值在内)、约300kb至约350kb(包括端值在内)或约350kb至约400kb(包括端值在内)的范围内。在一些实施方案中，LTVEC包含在约400kb至约450kb(包括端值在内)、约450kb至约500kb(包括端值在内)、约500kb至约550kb(包括端值在内)、约550kb至约600kb(包括端值在内)、约600kb至约650kb(包括端值在内)、约650kb至约700kb(包括端值在内)、约700kb至约750kb(包括端值在内)或约750kb至约800kb(包括端值在内)的范围内的DNA插入片段。
在一些实施方案中，LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和为至少10kb。在一些实施方案中，一种或多种LTVEC的5’同源臂在约1kb至约100kb(包括端值在内)的范围内，和/或一种或多种LTVEC的3’同源臂在约1kb至约100kb(包括端值在内)的范围内。5’和3’同源臂的总和可以为例如约1kb至约5kb(包括端值在内)、约5kb至约10kb(包括端值在内)、约10kb至约20kb(包括端值在内)、约20kb至约30kb(包括端值在内)、约30kb至约40kb(包括端值在内)、约40kb至约50kb(包括端值在内)、约50kb至约60kb(包括端值在内)、约60kb至约70kb(包括端值在内)、约70kb至约80kb(包括端值在内)、约80kb至约90kb(包括端值在内)、约90kb至约100kb(包括端值在内)、约100kb至约110kb(包括端值在内)、约110kb至约120kb(包括端值在内)、约120kb至约130kb(包括端值在内)、约130kb至约140kb(包括端值在内)、约140kb至约150kb(包括端值在内)、约150kb至约160kb(包括端值在内)、约160kb至约170kb(包括端值在内)、约170kb至约180kb(包括端值在内)、约180kb至约190kb(包括端值在内)或约190kb至约200kb(包括端值在内)。另外，在一些实施方案中，每个同源臂可以为至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少110kb、至少120kb、至少130kb、至少140kb、至少150kb、至少160kb、至少170kb、至少180kb、至少190kb或至少200kb。同样，在一些实施方案中，5’和3’同源臂的总和可以为至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少110kb、至少120kb、至少130kb、至少140kb、至少150kb、至少160kb、至少170kb、至少180kb、至少190kb或至少200kb。
在一些实施方案中，LTVEC和DNA插入片段被设计为允许约5kb至约10kb(包括端值在内)、约10kb至约20kb(包括端值在内)、约20kb至约40kb(包括端值在内)、约40kb至约60kb(包括端值在内)、约60kb至约80kb(包括端值在内)、约80kb至约100kb(包括端值在内)或约100kb至约150kb(包括端值在内)、约150kb至约200kb(包括端值在内)、约200kb至约300kb(包括端值在内)、约300kb至约400kb(包括端值在内)、约400kb至约500kb(包括端值在内)、约500kb至约600kb(包括端值在内)、约600kb至约700kb(包括端值在内)、约700kb至约800kb(包括端值在内)或约500kb至约1Mb(包括端值在内)、约1Mb至约1.5Mb(包括端值在内)、约1.5Mb至约2Mb(包括端值在内)、约2Mb至约2.5Mb(包括端值在内)或约2.5Mb至约3Mb(包括端值在内)的靶基因座处的内源性序列的缺失。另外，缺失可以为约3Mb至约4Mb(包括端值在内)、约4Mb至约5Mb(包括端值在内)、约5Mb至约10Mb(包括端值在内)、约10Mb至约20Mb(包括端值在内)、约20Mb至约30Mb(包括端值在内)、约30Mb至约40Mb(包括端值在内)、约40Mb至约50Mb(包括端值在内)、约50Mb至约60Mb(包括端值在内)、约60Mb至约70Mb(包括端值在内)、约70Mb至约80Mb(包括端值在内)、约80Mb至约90Mb(包括端值在内)或约90Mb至约100Mb(包括端值在内)。另外，缺失可以为至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb或至少500kb或更长。
在一些实施方案中，LTVEC和DNA插入片段被设计为允许插入至在约5kb至约10kb(包括端值在内)、约10kb至约20kb(包括端值在内)、约20kb至约40kb(包括端值在内)、约40kb至约60kb(包括端值在内)、约60kb至约80kb(包括端值在内)、约80kb至约100kb(包括端值在内)、约100kb至约150kb(包括端值在内)、约150kb至约200kb(包括端值在内)、约200kb至约250kb(包括端值在内)、约250kb至约300kb(包括端值在内)、约300kb至约350kb(包括端值在内)或约350kb至约400kb(包括端值在内)的范围内的外源性核酸序列的靶基因座中。另外，在一些实施方案中，插入可以为约400kb至约450kb(包括端值在内)、约450kb至约500kb(包括端值在内)、约500kb至约550kb(包括端值在内)、约550kb至约600kb(包括端值在内)、约600kb至约650kb(包括端值在内)、约650kb至约700kb(包括端值在内)、约700kb至约750kb(包括端值在内)或约750kb至约800kb(包括端值在内)。另外，在一些实施方案中，插入可以为至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb或至少500kb或更长。
在其他情况下，改变、缺失、被靶向、修饰、工程化等等的DNA插入片段和/或内源性基因座的区域为至少100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个或900个核苷酸或至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb或更长。在一些实施方案中，改变、缺失、被靶向、修饰、工程化等等的DNA插入片段和/或内源性基因座的区域为核苷酸至20kb、200个核苷酸至20kb、300个核苷酸至20kb、400个核苷酸至20kb、500个核苷酸至20kb、600个核苷酸至20kb、700个核苷酸至20kb、800个核苷酸至20kb、900个核苷酸至20kb、1kb至20kb、2kb至20kb、3kb至20kb、4kb至20kb、5kb至20kb、6kb至20kb、7kb至20kb、8kb至20kb、9kb至20kb、10kb至20kb、11kb至20kb、12kb至20kb、13kb至20kb、14kb至20kb、15kb至20kb、16kb至20kb、17kb至20kb、18kb至20kb或19kb至20kb。在一些实施方案中，改变、缺失、靶向、修饰、工程化等等的DNA插入片段和/或内源性基因座的区域为100个核苷酸至19kb、100个核苷酸至18kb、100个核苷酸至17kb、100个核苷酸至16kb、100个核苷酸至15kb、100个核苷酸至14kb、100个核苷酸至13kb、100个核苷酸至12kb、100个核苷酸至11kb、100个核苷酸至10kb、100个核苷酸至9kb、100个核苷酸至8kb、100个核苷酸至7kb、100个核苷酸至6kb、100个核苷酸至5kb、100个核苷酸至4kb、100个核苷酸至3kb、100个核苷酸至2kb、100个核苷酸至1kb、100个核苷酸至900个核苷酸、100个核苷酸至800个核苷酸、100个核苷酸至700个核苷酸、100个核苷酸至600个核苷酸、100个核苷酸至500个核苷酸、100个核苷酸至400个核苷酸、100个核苷酸至300个核苷酸或100个核苷酸至200个核苷酸。在一些实施方案中，改变、缺失、靶向、修饰、工程化等等的DNA插入片段和/或内源性基因座的区域为200个核苷酸至19kb、300个核苷酸至18kb、400个核苷酸至17kb、500个核苷酸至16kb、600个核苷酸至15kb、700个核苷酸至14kb、800个核苷酸至13kb、900个核苷酸至12kb、1kb至11kb、2kb至10kb、3kb至9kb、4kb至8kb、5kb至7kb或5kb至6kb。
所提供的非人类动物
在某些方面，提供了表达含有包括全部或部分的人类Igλ轻链序列的轻链的抗体的非人类动物，所述人类Igλ轻链序列由对应于人类Igλ轻链基因座的至少一部分的遗传物质的整合产生，并且它编码处于非人类动物的生殖系基因组中对应的非人类Igλ轻链序列的位置的至少人类Vλ域(即，重排的人类Vλ-Jλ序列)。本文所述的合适的实例包括但不限于啮齿动物，具体地讲，大鼠或小鼠。
在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列包含来自人类Igλ轻链基因座的遗传物质，其中所述人类Igλ轻链序列编码包含来自人类Igλ轻链基因座的遗传物质的编码部分的免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，如本文所述的人类Igλ轻链序列包含至少一个人类Vλ基因区段和至少一个人类Jλ基因区段，以及促进所述至少一个人类Vλ基因区段与所述至少一个人类Jλ基因区段的重排(如，一个或多个重组信号序列)以形成编码人类Vλ域的功能性重排人类Vλ-Jλ序列所需的一个或多个序列。在许多实施方案中，人类Igλ轻链序列包含多个人类Vλ基因区段以及促进所述人类Vλ基因区段与至少一个人类Jλ基因区段的重排所需的一个或多个序列。在许多实施方案中，如本文所述的人类Igλ轻链序列是人类Igλ轻链基因座的基因组序列(例如，从细菌人工染色体分离和/或克隆)，并且含有处于生殖系构型的多个人类Vλ基因区段。在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列包含处于生殖系构型的人类Vλ、Jλ和Cλ序列(即，如出现于人类细胞中的Igλ轻链基因座中的所述人类Vλ、Jλ和Cλ序列)。在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列为或包含出现于附图(例如参见图1-4)中的人类序列。在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列编码全部或部分的Igλ轻链多肽，所述Igλ轻链多肽出现于免疫球蛋白(具体地讲，由人类B细胞表达的免疫球蛋白)中。还提供了用于制备含有处于对应的非人类Igλ轻链序列(如，内源性啮齿动物Igλ轻链基因座)的位置的所述人类Igλ轻链序列的非人类动物、非人类胚胎和细胞的非人类动物、胚胎、细胞和靶向构建体。
在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列被插入非人类动物的生殖系基因组内对应的非人类Igλ轻链序列的位置.在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列被插入非人类Igλ轻链序列(如，非人类Igλ轻链恒定区序列)的上游。在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列被插入一个或多个非人类Igλ轻链序列的中间，以使得所述人类Igλ轻链序列与非人类Igλ轻链序列并置(例如参见图1、2、3和/或4)。
在一些实施方案中，非人类Igλ轻链基因座的一个或多个非人类Igλ轻链序列(或其部分)未缺失。在一些实施方案中，非人类Igλ轻链基因座的一个或多个非人类Igλ轻链序列(如，Vλ、Jλ和/或Cλ)是改变的、替代的、断裂的、缺失的或被尤其是可操作地连接至非人类Igλ轻链恒定区和非人类Igλ轻链基因座的一个或多个增强子和/或一个或多个调控元件的如本文所述的人类Igλ轻链序列(如，包括一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段、一个或多个人类Cλ基因区段或它们的组合的序列)替换。在一些实施方案中，所有或实质上所有非人类Igλ轻链基因座被可操作地连接至非人类Igλ轻链恒定区和非人类Igλ轻链基因座的一个或多个非人类Igλ轻链增强子和/或一个或多个调控元件的一个或多个人类Igλ轻链序列(如本文所述)替换。在某些实施方案中，一个或多个非人类Igλ轻链恒定区基因在包括如本文所述的人类Igλ轻链序列的非人类动物中是未缺失的或未被替换的。仅举一个非限制性例子，在被插入非人类Igλ轻链基因座中的人类Igλ轻链序列的插入的情况下，所述插入以维持插入点(例如，非人类Igλ轻链恒定区和/或非人类Igλ轻链增强子区或序列)附近的非人类Igλ轻链序列的完整性的方式制备。因此，此类非人类动物具有野生型Igλ轻链恒定区。在一些实施方案中，改变的、替代的、断裂的、缺失的、被如本文所述的一个或多个人类Igλ轻链序列替换的或工程化的非人类Igλ轻链基因座是鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Igλ轻链基因座。在一些实施方案中，人类Igλ轻链序列被插入两个拷贝的所述非人类Igλ轻链基因座中的一个拷贝的非人类Igλ轻链基因座(即，等位基因)中，产生就人类Igλ轻链序列而言杂合的非人类动物。在一些实施方案中，提供了对于包括如本文所述的人类Igλ轻链序列的Igλ轻链基因座而言纯合的非人类动物。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的非人类Igλ轻链基因座包含可操作地连接至非人类Igλ轻链恒定区和一个或多个非人类Igλ轻链增强子和/或调控元件的人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段。在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的非人类Igλ轻链基因座包含可操作地连接至非人类Igλ轻链恒定区、一个或多个非人类Igλ轻链增强子和/或调控元件和一个或多个人类Igλ轻链增强子和/或调控元件的人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段。
在一些实施方案中，非人类动物含有随机整合进基因组(如，作为随机整合的人类Igλ轻链序列的一部分)的如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座。因此，此类非人类动物可以被描述为具有含有多个人类Vλ、Jλ和/或Cλ基因区段的人类Igλ轻链转基因，所述人类Vλ、Jλ和/或Cλ基因区段被构造为使得所述人类Vλ、Jλ和/或Cλ基因区段能够重排和编码非人类动物的表达库中的抗体的全部或部分的Igλ轻链。如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座或转基因可使用多种方法(包括例如PCR、Western印迹、Southern印迹、限制性片段长度多态性(RFLP)或等位基因的获得或丢失测定)来检测。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物就如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座而言是杂合子。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物就如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座而言是半合子。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物含有如本文所述的一个或多个拷贝的经工程化的Igλ轻链基因座或转基因。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物含有如附图(例如参见图1、2、3和/或4)所描绘的Igλ轻链基因座。
在一些实施方案中，提供了用于产生生殖系基因组包含经工程化的Igλ轻链基因座的非人类动物的组合物和方法，包括用于制备表达包含含有人类可变域和人类或非人类恒定域的Igλ轻链的抗体的非人类动物的组合物和方法(所述抗体从含有可操作地连接至非人类Igλ轻链恒定区的人类Vλ、Jλ和Cλ区段的Igλ轻链基因座组装)，所述经工程化的Igλ轻链基因座包括处于非人类Igλ轻链序列的位置的一个或多个人类Igλ轻链序列(如，人类Vλ、Jλ和/或Cλ基因区段)，包括包含特定多态性形式的人类Vλ、Jλ和/或Cλ区段(如，特定V和/或J等位基因或变体)的人类Igλ轻链编码序列。在一些实施方案中，还提供了用于制备在一个或多个内源性增强子和/或一个或多个内源性调控序列的控制下表达此类抗体的非人类动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供了用于制备在一个或多个异源性增强子和/或一个或多个异源性调控序列的控制下表达此类抗体的非人类动物的组合物和方法。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括将编码全部或部分的人类Igλ轻链的序列插入非人类Igλ轻链恒定区(如，鼠科动物Cλ区)的上游，以表达抗体，所述抗体的特征为存在含有至少人类Vλ域(在一些实施方案中，人类Vλ和Cλ域)的轻链，并且在B细胞的表面上和非人类动物的血清中表达。
在一些实施方案中，方法包括对应于人类Igλ轻链基因座的遗传物质的连续插入。在一些实施方案中，对应于人类Igλ轻链基因座的遗传物质可以是合成的或基因组的(如，从细菌人工染色体克隆)。在一些实施方案中，对应于人类Igλ轻链基因座的遗传物质可以从公开的来源和/或细菌人工染色体设计，以使得所述遗传物质含有处于与人类Igλ轻链基因座中出现的不同的方向的人类Vλ、Jλ和/或Cλ区段，但所述遗传物质仍含有支持所述人类Vλ、Jλ和/或Cλ区段的重排以编码功能性Igλ轻链的序列。仅举一个例子，对应于人类Igλ轻链基因座的遗传物质可以使用本文提供的构建含有人类Vλ、Jλ和/或Cλ区段的人类Igλ轻链序列的指南设计，所述人类Vλ、Jλ和/或Cλ区段的顺序和/或排列与人类细胞的人类Igλ轻链基因座中出现的不同。在这个实例中，人类Vλ、Jλ和/或Cλ区段的内容物可以等同于人类细胞中对应的区段，然而，顺序和排列将是不同的。当构建用于产生如本文所述的非人类动物的人类Igλ轻链基因座时，必要的重组信号序列可以被构造为使得人类区段可以正确地重排和形成功能性Igλ轻链。适当重组所需的人类Igλ轻链区段和序列的生殖系构型指南可见于Molecular Biology of B Cells,London:Elsevier Academic Press,2004年版Honjo,T.,Alt,F.W.,Neuberger,M.,第4章(第37-59页)和第5章(第61-82页)；该文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，连续插入包括单个ES细胞克隆中的异源遗传物质的部分的多个插入。在一些实施方案中，连续插入包括连续ES细胞克隆中的异源遗传物质的部分的顺序插入。
在一些实施方案中，方法包括将约11,822bp的DNA插入鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区下游，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区，所述DNA包括一个或多个人类Igλ轻链增强子区(或序列)。在某些实施方案中，方法包括插入包含三个人类Igλ轻链增强子区(或序列)的约11,822bp的DNA，所述三个人类Igλ轻链增强子区(或序列)被插入所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区的下游。
在一些实施方案中，方法包括将约125,473bp的DNA插入鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区上游，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1、人类Jλ-Cλ区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和人类Jλ基因区段Jλ7。在某些实施方案中，方法包括插入包含一个或多个人类Igλ轻链增强子区(或序列)的约11,822bp的DNA，所述一个或多个人类Igλ轻链增强子区(或序列)被插入所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区的下游。
在一些实施方案中，方法包括将约171,458bp的DNA插入鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区上游，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25和Vλ3-27。在某些实施方案中，方法包括将约171,458bp的DNA插入可操作地连接至鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区的人类Vλ3-10基因区段上游，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25和Vλ3-27。
在一些实施方案中，方法包括将约121,188bp的DNA插入鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区上游，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51和Vλ5-52。在某些实施方案中，方法包括将约121,188bp的DNA插入可操作地连接至鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区的人类Vλ3-27基因区段上游，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51和Vλ5-52。
在一些实施方案中，方法包括将约121,188bp的DNA插入鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区上游，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51和Vλ5-52，并且所述DNA包括包含处于小鼠Vλ2基因区段的5’的序列的同源臂。在某些实施方案中，方法包括将约121,188bp的DNA插入可操作地连接至鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区的人类Vλ3-27基因区段上游，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51和Vλ5-52，并且所述DNA包括包含处于小鼠Vλ2基因区段的5’的小鼠序列的同源臂，以在与所述DNA片段同源重组时引导小鼠Igλ基因组序列(如，Igλ轻链基因座)的缺失。
另外的人类Vλ、Jλ和/或Cλ基因区段的插入可以使用本文所述的方法实现，以进一步补充经工程化的Igλ轻链基因座的多样性。例如，在一些实施方案中，方法可以包括将约300kb的DNA插入鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区上游，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ10-54、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在这些实施方案中，所述DNA被插入可操作地连接至鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Cλ1区的人类Vλ5-52基因区段上游，所述DNA包括人类Vλ基因区段Vλ10-54、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在某些实施方案中，所述DNA包括人类VpreB基因。上文所述的另外的人类Vλ区段可以使用本文所述的或者本领域已知的重组技术从可商购获得的BAC克隆直接克隆并排列成较小的DNA片段。另外，上文所述的另外人类Vλ基因区段可以合成至DNA片段中，并且加入如上文所述的经工程化的Igλ轻链基因座中。同样，另外的人类Jλ和/或Cλ基因区段可以从可商购获得的BAC克隆获得或直接从公开的序列合成。另外，内源性Igλ轻链增强子区(或序列)可以从如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座缺失。示出如本文所述的非人类动物的经工程化的Igλ轻链基因座的示例性图示如图1、2、3和4中的任一者所示。
在适当的情况下，编码全部或部分的Igλ轻链的人类Igλ轻链序列(即，含有人类Vλ、Jλ和/或Cλ基因区段的序列)可以分别修饰为包括针对在非人类动物中表达优化的密码子(例如参见美国专利No.5,670,356和5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，并且优选地编码与非密码子优化的亲本多核苷酸所编码的多肽相同的多肽(或具有与全长多肽实质上相同活性的全长多肽的生物学活性片段)。在一些实施方案中，编码全部或部分的Igλ轻链的人类Igλ轻链序列可单独地包括针对特定细胞类型(例如，啮齿动物细胞)而优化密码子使用的改变的序列。例如，待插入非人类动物(例如，啮齿动物)的基因组的每个核苷酸序列的密码子可以针对在非人类动物的细胞中表达而优化。此序列可描述为密码子优化的序列。
在一些实施方案中，编码全部或部分的人类Igλ轻链的核苷酸序列的插入采用如本文所述的非人类动物的生殖系基因组的最小修饰，并且引起包含全部或部分的人类轻链的抗体的表达。用于产生转基因非人类动物的方法(包括敲除和敲入)是本领域熟知的(参见例如Gene Targeting:A Practical Approach,Joyner编,Oxford University Press,Inc.(2000))。例如，转基因啮齿动物的产生可以任选地涉及一个或多个内源性啮齿动物基因(或基因区段)的遗传基因座的断裂以及一个或多个异源基因(或基因区段或核苷酸序列)引入啮齿动物基因组，在一些实施方案中，与内源性啮齿动物基因(或基因区段)相同的位置处。在一些实施方案中，编码全部或部分的人类Igλ轻链的核苷酸序列被引入啮齿动物的生殖系基因组中的随机插入的Igλ轻链转基因的鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Igλ轻链恒定区基因上游。在一些实施方案中，编码全部或部分的人类Igλ轻链的核苷酸序列被引入啮齿动物的生殖系基因组中的内源性Igλ轻链基因座的鼠科动物(如，小鼠或大鼠)Igλ轻链恒定区基因上游；在某些实施方案中，内源性Igλ轻链基因座被改变、修饰或工程化为含有可操作地连接至啮齿动物Cλ1区的人类Igλ基因区段(如，Vλ、Jλ和/或Cλ)。
图1-4提供了示例性经工程化的Igλ轻链基因座的示意图(未按比例绘制)。具体地讲，图1和3示出了用于构建经工程化的Igλ轻链基因座的示例性策略，所述经工程化的Igλ轻链基因座的特征为含有多个人类Vλ、Jλ和Cλ区段的核苷酸序列的插入。如图1所示，含有人类Eλ序列(或区)的DNA片段通过同源重组插入啮齿动物Cλ区下游。该DNA片段含有定位于人类Eλ序列3’的新霉素选择盒(如，loxP重组识别位点侧接的新霉素抗性基因[NEOR])，所述人类Eλ序列含有啮齿动物Cλ1区下游(或3’)的三个经工程化的人类Eλ元件。图1还示出了含有人类Vλ区段的第一部分、一组人类Jλ-Cλ区段对(如，人类Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cl3、Jλ6-Cλ6)和人类Jλ7区段的DNA片段通过同源重组插入啮齿动物Cλ1区上游。如图所示，潮霉素选择盒(如，侧接Frt重组识别位点的潮霉素抗性基因[HYGR])定位于靶向载体的5’末端和靶向载体中包含的人类Igλ轻链序列上游。如下文实例部分所述，通过与后续靶向载体同源重组来移除潮霉素选择盒。然后将靶向载体电穿孔至啮齿动物胚胎干(ES)细胞，以形成生殖系基因组包含经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物。一旦确认到阳性的啮齿动物ES细胞克隆，即可以连续方式电穿孔另外描绘的靶向载体，并在每个步骤确认完成经工程化的Igλ轻链基因座的构建(参见图2)。最终靶向载体可以被设计为含有(6680靶向载体)或不含有(6597靶向载体)通过同源重组引导内源性Igλ轻链区段的缺失，从而产生两种潜在的经工程化的Igλ轻链等位基因的同源臂(图2)。另外，任何其余的选择盒可以根据需要通过重组酶介导的缺失来缺失。使用引导RNA(gRNA)将另外的人类Vλ基因区段插入经工程化的Igλ轻链基因座的替代性策略如图3所示。
一旦人类Igλ轻链序列插入BAC克隆的非人类Igλ轻链恒定区上游，即产生用于整合进Igλ轻链基因座的靶向载体。用于产生靶向载体的人类Igλ轻链序列靶向的BAC克隆可以含有鼠科动物(如，小鼠或大鼠)起源的5’和/或3’侧接基因组DNA。可替代地或另外地，用于产生靶向载体的人类Igλ轻链序列靶向的BAC克隆可以含有人类起源的5’和/或3’侧接基因组DNA，以产生与人类Igλ轻链序列重叠的区域。以这种方式实现了多个经工程化的BAC克隆的连续靶向(例如，参见图1)。最终靶向载体并入非人类细胞(如，啮齿动物胚胎干细胞)的基因组中的Igλ轻链基因座中。在一些实施方案中，如本文所述的靶向载体并入非人类细胞的生殖系基因组中的Igλ轻链基因座中，所述靶向载体还含有与一个或多个IgH恒定区基因可操作地连接的人类VH、DH和JH基因组DNA(例如，含有多个人类VH、DH和JH基因区段)和/或与Igκ恒定区基因可操作地连接的人类Vκ和Jκ基因组DNA(如，含有多个人类Vκ和Jκ基因区段)(例如参见美国专利No.8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323，这些专利以引用的方式整体并入本文)。
通过电穿孔将靶向载体引入啮齿动物(如，小鼠)胚胎干细胞，以使靶向载体中含有的序列插入啮齿动物胚胎干细胞的基因组中，并使非人类细胞或非人类动物(如，小鼠)能够表达具有全部或部分的人类Igλ轻链的抗体。如本文所述，产生这样的转基因啮齿动物；其中啮齿动物基因组的生殖系中产生经工程化的Igλ轻链基因座(如，含有可操作地连接至如本文所述的内源性啮齿动物Cλ区的人类Igλ轻链序列的内源性Igλ轻链基因座)。抗体在啮齿动物B细胞的表面上和所述啮齿动物的血清中表达，该抗体的特征为具有人类Vλ域(在一些实施方案中，人类Vλ和Cλ域)的轻链。当啮齿动物基因组的生殖系中的内源性Igλ轻链基因座不被靶向载体靶向时，经工程化的Igλ轻链基因座优选地插入除内源性啮齿动物Igλ轻链基因座之外的位置(如，随机插入的转基因)。
如上文所述在非人类动物中形成经工程化的Igλ轻链基因座提供了经工程化的啮齿动物品系，所述经工程化的啮齿动物品系产生包括从具有人类Vλ域(在一些实施方案中，人类Vλ和Cλ域)的此类经工程化的Igλ轻链基因座表达的Igλ轻链的抗体。利用包括可操作地连接至IgH恒定区基因的多个人类VH、DH和JH基因区段的经工程化的IgH基因座的存在，形成了产生用于开发基于人类抗体的治疗剂的抗体和抗体组分的经工程化的啮齿动物品系。因此，实现了能够提供利用人类Vλ域来开发用于治疗人类疾病的新型基于抗体的药物的替代性体内系统的单个经工程化的啮齿动物品系。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的基因组还包含(如，通过杂交或多基因靶向策略)如美国专利No.8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323所述的一个或多个人类免疫球蛋白重链和/或轻链可变区；所有这些专利以引用的方式整体并入本文。另外，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座可以被工程化为包含人源化IgH和/或Igκ基因座的胚胎干细胞，或包含本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的非人类动物可以与包含人源化IgH和/或Igκ基因座的另一种非人类动物交配。包含人源化IgH和/或Igκ基因座的多种此类动物是已知的，例如
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品系(参见例如，美国专利No.8,502,018和/或8,642,835；这些专利以引用的方式整体并入本文)、XENOMOUSETM品系(参见例如，Mendez,M.J.等人,1997,Nat.Genetics15(2):146-56和Jakobovits,A.等人,1995,Ann.NYAcad.Sci.764:525-35)。随后可以通过繁育实现如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的纯合子。另外，就随机插入的经工程化的Igλ轻链转基因(上文所述)而言，可以根据尤其是人类Vλ域从转基因的表达来选择啮齿动物品系。
可替代地和/或另外地，在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的生殖系基因组还包含缺失的、失活的、功能沉默的或者非功能性内源性Igκ轻链基因座。缺失或赋予非功能性基因或基因座的遗传修饰可以使用本文所述的方法和/或本领域已知的方法实现。
可以根据生殖系基因组中经工程化的Igλ轻链基因座的存在和/或非人类动物的组织或细胞中具有全部或部分的人类Igλ轻链序列的抗体的表达来鉴定转基因首建者非人类动物。然后转基因首建者非人类动物可用于繁育携带经工程化的Igλ轻链基因座的另外的非人类动物，从而形成各自携带一个或多个拷贝的经工程化的Igλ轻链基因座的非人类动物队列。此外，根据需要，如本文所述的携带经工程化的Igλ轻链基因座的转基因非人类动物还可与携带其他转基因(例如，人类免疫球蛋白基因)的其他转基因非人类动物交配。
在一些实施方案中，还可以产生含有允许转基因或一个或多个整合序列的调控、引导、诱导型和/或细胞类型特异性表达的选定系统的转基因非人类动物。例如，如本文所述的非人类动物可以工程化为含有编码条件表达的抗体的全部或部分的人类Igλ轻链的序列(例如，Rajewski,K.等人,1996、J.Clin.Invest.98(3):600-3中所综述)。示例性系统包括噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统(参见例如，Lakso,M.等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6232-6)以及酿酒酵母的FLP/Frt重组酶系统(O’Gorman,S.等人，1991,Science251:1351-5)。可通过构建“双重”转基因动物，例如通过使两种转基因动物交配来提供此类动物，其中一种含有包含选定修饰(例如，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座)的转基因，另一种含有编码重组酶(例如，Cre重组酶)的转基因。
如本文所述的非人类动物可以如上文所述那样或使用本领域已知的方法制备为包含另外的人类、人源化或者经工程化的基因，这通常取决于非人类动物的预期用途。此类人类、人源化或者经工程化的基因的遗传物质可以通过进一步改变具有如上文所述的遗传修饰或改变的细胞(例如，胚胎干细胞)的基因组，或通过本领域已知的繁育技术利用所需的其他经基因修饰的或经工程化的品系来引入。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物被制备为还包含转基因人类IgH和/或Igκ轻链基因或基因区段(参见例如，Murphy,A.J.等人,(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-5158；美国专利No.8,502,018；美国专利No.8,642,835；美国专利No.8,697,940；美国专利No:8,791,323；和美国专利申请公开No.2013/0096287 A1；它们以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物可以通过将本文所述的靶向载体引入经修饰的品系的细胞来制备。仅举一个例子，如上文所述的靶向载体可以引入
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小鼠内。
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小鼠表达具有完全人类可变域和小鼠恒定域的抗体。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物被制备为还包含人类免疫球蛋白基因(可变和/或恒定区基因)。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座和来自异源物种(例如，人类)的遗传物质，其中所述遗传物质全部或部分地编码一个或多个人类重链和/或Igκ轻链可变域。
例如，如本文所述，包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的非人类动物还可以包含(例如，通过杂交或多基因靶向策略)一种或多种修饰，如Murphy,A.J.等人,(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-8；Macdonald,L.E.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5147-52；美国专利No.8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323所述；所有这些文献以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，将包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物与包含人源化的IgH和/或Igκ轻链可变区基因座的啮齿动物杂交(参见例如，美国专利No.8,502,018、8,642,835、8,697,940和/或8,791,323；这些专利以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，将包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物与包含人源化IgH可变区基因座(参见例如，美国专利No.8,502,018、8,642,835、8,697,940和/或8,791,323；这些专利以引用的方式整体并入本文)和失活的内源性Igκ轻链基因座(参见例如，美国专利No.9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092，这些专利以引用的方式整体并入本文)的啮齿动物杂交。
虽然本文广泛讨论了描述小鼠(即，具有经工程化的Igλ轻链基因座的小鼠，所述经工程化的Igλ轻链基因座的特征为存在与小鼠Cλ区可操作地连接的多个人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段，以表达含有全部或部分的人类Igλ轻链的抗体)中的经工程化的Igλ轻链基因座的构建的实施方案，但是还提供了包含经工程化的Igλ轻链基因座的其他非人类动物。此类非人类动物包括任何可经遗传修饰以表达如本文所述的抗体的那些动物，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，狨猴、猕猴)等。例如，对于合适的可经遗传修饰的ES细胞不容易获得的那些非人类动物，采用其他方法来制备包含遗传修饰的非人类动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多能细胞)并利用体细胞核转移(SCNT)来将经遗传修饰的基因组转移至合适的细胞，例如去核卵母细胞，以及在适于形成胚胎的条件下在非人类动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)。
用于修饰非人类动物的生殖系基因组(例如，猪、奶牛、啮齿动物、鸡等等的基因组)的方法包括例如采用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或Cas蛋白(即，CRISPR/Cas系统)以包括如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座。用于修饰非人类动物的生殖系基因组的方法指南可见于例如美国专利申请No.14/747,461(2015年6月23日提交)、14/948,221(2015年11月20日提交)和14/974,623(2015年12月18日提交)；其中全部三个申请据此以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是哺乳动物。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自鼠总科。在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的动物来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠和冠鼠。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是啮齿动物。在某些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是小鼠。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是啮齿动物，所述啮齿动物是选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠是选自以下品系的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人,1999,MammalianGenome10:836；Auerbach,W.等人,2000,Biotechniques29(5):1024-1028,1030,1032)。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合品系。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠是前述129品系的混合品系，或前述BL/6品系的混合品系。在某些实施方案中，如本文所述的混合品系的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠是BALB品系和另一种前述品系的混合品系。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是大鼠。在某些实施方案中，如本文所述的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和DarkAgouti。在某些实施方案中，如本文所述的大鼠品系是选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti的两个或更多个品系的混合品系。
大鼠多能和/或全能细胞可以来自任何大鼠品系，包括例如ACI大鼠品系、DarkAgouti(DA)大鼠品系、Wistar大鼠品系、LEA大鼠品系、Sprague Dawley(SD)大鼠品系或Fischer大鼠品系(诸如Fisher F344或Fisher F6)。大鼠多能细胞和/或全能细胞也可从来源于上述两种或更多种品系的混合品系的品系获得。例如，大鼠多能细胞和/或全能细胞可以来自DA品系或ACI品系。ACI大鼠品系的特征为具有黑灰色，伴有白色腹部和足部以及RT1av1单倍型。此类品系可以从多种来源(包括Harlan Laboratories)获得。来自ACI大鼠的大鼠ES细胞系的实例是ACI.G1大鼠ES细胞。Dark Agouti(DA)大鼠品系的特征为具有野灰色皮毛和RT1av1单倍型。此类大鼠可以从多种来源(包括Charles River和HarlanLaboratories)获得。来自DA大鼠的大鼠ES细胞系的实例是DA.2B大鼠ES细胞系和DA.2C大鼠ES细胞系。在一些实施方案中，大鼠多能和/或全能细胞来自近交大鼠品系(参见例如，美国专利申请公开No.2014-0235933 A1，2014年8月21日公开，该专利以引用的方式整体并入本文)。
具体示例性实施方案–经工程化的IgH基因座
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座，并且还包含经工程化的IgH基因座(或等位基因)，所述经工程化的IgH基因座(或等位基因)的特征为存在排列成生殖系构型并且可操作地连接至非人类IgH恒定区、增强子和调节区的多个人类VH、DH和JH基因区段。在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含可操作地连接至非人类IgH恒定区的一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段。
在一些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或更多个(例如，41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个等)人类VH基因区段。在某些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类IgH基因座的人类VH3-74和人类VH6-1基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类VH基因区段。在某些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含至少人类VH基因区段VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2和VH6-1。
在一些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含5个、10个、15个、20个、25个或更多个(例如，26个、27个等)人类DH基因区段。在某些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类IgH基因座的人类DH1-1和人类DH7-27基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类DH基因区段。在某些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含至少人类DH基因区段DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26和DH7-27。
在一些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个功能性人类JH基因区段。在某些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类IgH基因座的人类JH1和人类JH6基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类JH基因区段。在某些实施方案中，经工程化的IgH基因座(或等位基因)包含至少人类JH基因区段JH1、JH2、JH3、JH4、JH5和JH6。
在一些实施方案中，非人类IgH恒定区包括一个或多个非人类IgH恒定区基因，例如免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白A(IgA)。在某些实施方案中，非人类IgH恒定区包括啮齿动物IgM、啮齿动物IgD、啮齿动物IgG3、啮齿动物IgG1、啮齿动物IgG2b、啮齿动物IgG2a、啮齿动物IgE和啮齿动物IgA恒定区基因。在一些实施方案中，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至一个或多个非人类IgH增强子(即，增强子序列或增强子区)。在一些实施方案中，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至一个或多个非人类IgH调节区(或调控序列)。在一些实施方案中，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至一个或多个非人类IgH增强子(或增强子序列)和一个或多个非人类IgH调节区(或调控序列)。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的IgH基因座不含有内源性Adam6基因。在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的IgH基因座不含有相同物种的野生型非人类动物的生殖系基因组中存在的相同生殖系基因组位置中的内源性Adam6基因(或Adam6编码序列)。在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的IgH基因座不含有人类Adam6假基因。在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的IgH基因座包含编码一个或多个非人类(如，啮齿动物)Adam6多肽的至少一个核苷酸序列的插入。所述插入可以在如本文所述的经工程化的免疫球蛋白重链基因座的外部(例如，VH基因区段的最5’的上游)、在经工程化的IgH基因座内或者非人类动物(例如，随机引入的非人类Adam6编码序列)、细胞或组织的生殖系基因组中。
在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织不可检测地全部或部分表达抗体分子中的内源性非人类VH区。在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织不含有全部或部分地编码抗体分子中的内源性非人类VH区(例如，VH、DH和/或JH)的一个或多个核苷酸序列(或缺乏它们或含有它们的缺失)。在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织具有包括全部或部分的内源性非人类VH、DH和JH基因区段的缺失的生殖系基因组。在多个实施方案中，所提供的非人类动物是可育的。
用于产生携带此类经工程化的IgH基因座(或等位基因)的靶向载体、非人类细胞和动物的指南可见于例如美国专利No.8,642,835和8,697,940，这些专利以引用的方式整体并入。本领域的技术人员知道本领域已知的用于实现非人类(如，哺乳动物)基因组的这种基因工程和/或操纵或者用于制备、提供或制造引入非人类动物的生殖系基因组的此类序列的许多技术。
具体示例性实施方案–经工程化的Igκ轻链基因座
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座，并且还包含经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)，所述经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)的特征为存在排列成生殖系构型并且可操作地连接至非人类Igκ轻链恒定区、Igκ增强子和调节区的多个人类Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含可操作地连接至非人类Igκ恒定区(Cκ)的一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段。
在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含天然出现的人类Igκ轻链基因座的远端可变簇(或远端臂或远端重复)中出现的至少人类Vκ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含天然出现的人类Igκ轻链基因座的近端可变簇(或近端臂或近端重复)中出现的至少人类Vκ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含天然出现的人类Igκ轻链基因座的远端和近端可变簇中出现的人类Vκ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igκ轻链基因座的人类Vκ2-40(或Vκ3D-7)和人类Vκ4-1基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Vκ基因区段。
在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个或更多个(例如，36个、37个、38个、39个、40个等)人类Vκ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含人类Vκ基因区段Vκ3D-7、Vκ1D-8、Vκ1D-43、Vκ3D-11、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ3D-15、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ3D-20、Vκ6D-21、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ1D-33、Vκ1D-39、Vκ2D-40、Vκ2-40、Vκ1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ6-21、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2和Vκ4-1。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含至少人类Vκ基因区段Vκ3D-7、Vκ1D-8、Vκ1D-43、Vκ3D-11、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ3D-15、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ3D-20、Vκ6D-21、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ1D-33、Vκ1D-39和Vκ2D-40。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含至少人类Vκ基因区段Vκ2-40、Vκ1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ6-21、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2和Vκ4-1。
在一些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含1个、2个、3个、4个、5个或更多个功能性人类Jκ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igκ轻链基因座的人类Jκ1和人类Jκ5基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Jκ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含至少人类Jκ基因区段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一些实施方案中，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至一个或多个非人类Igκ轻链增强子(即，增强子序列或增强子区)。在一些实施方案中，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至一个或多个非人类Igκ轻链调节区(或调控序列)。在一些实施方案中，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至一个或多个非人类Igκ轻链增强子(或增强子序列或增强子区)和一个或多个非人类Igκ轻链调节区(或调控序列)。
在一些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cκ区包括啮齿动物Cκ区，例如小鼠Cκ区或大鼠Cκ区。在某些实施方案中，经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cκ区为或包含来自包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、混合129xC57BL/6品系或它们的组合的遗传背景的小鼠Cκ区。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座，并且还包含失活的Igκ轻链基因座(或等位基因)。
在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织不可检测地全部或部分表达抗体分子中的内源性非人类Vκ区。在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织不含有全部或部分地编码抗体分子中的内源性非人类Vκ区的一个或多个核苷酸序列(或缺乏它们或含有它们的缺失)。在多个实施方案中，如本文所述的所提供的非人类动物、非人类细胞或非人类组织具有包括全部或部分的内源性非人类Vκ和Jκ基因区段的缺失的生殖系基因组。
用于产生携带此类经工程化的Igκ轻链基因座(或等位基因)的靶向载体、非人类细胞和动物的指南可见于例如美国专利No.8,642,835和8,697,940，这些专利据此以引用的方式整体并入。本领域的技术人员知道本领域已知的用于实现非人类(如，哺乳动物)基因组的这种基因工程和/或操纵或者用于制备、提供或制造引入非人类动物的生殖系基因组的此类序列的许多技术。
具体示例性实施方案–经工程化的Igλ轻链基因座
在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含经工程化的Igλ轻链基因座，所述经工程化的Igλ轻链基因座的特征为存在排列成生殖系构型并且插入非人类Cλ基因区段(或Cλ区基因)的上游以及与它们可操作地连接的多个人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段。如本文所述，此类经工程化的Igλ轻链基因座还包括一个或多个人类Igλ轻链增强子区(或增强子序列)。在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座包含可操作地连接至非人类Igλ轻链恒定(Cλ)区的一个或多个人类Vλ基因区段和一个或多个人类Jλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含出现于至少人类Igλ轻链基因座的簇A；在一些实施方案中，人类Igλ轻链基因座的簇A和簇B；在某些实施方案中，人类Igλ轻链基因座的簇A、簇B和簇C中的人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含5个、10个、15个、20个、25个、30个或更多个(例如，31个、32个、33个、34个、35个等)人类Vλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igλ轻链基因座的人类Vλ4-69和人类Vλ3-1基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Vλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igλ轻链基因座的人类Vλ5-52和人类Vλ3-1基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Vλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igλ轻链基因座的人类Vλ3-27和人类Vλ3-1基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Vλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含人类Vλ基因区段Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含至少从Vλ5-52至Vλ1-40和从Vλ3-27至Vλ3-1的功能性人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个功能性人类Jλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igλ轻链基因座的人类Jλ1和人类Jλ7基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Jλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含至少人类Jλ基因区段Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7。
在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个功能性人类Cλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含存在于天然出现的人类Igλ轻链基因座的人类Cλ1和人类Cλ7基因区段(包括端值在内)之间的所有或实质上所有功能性人类Cλ基因区段。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含至少人类Cλ基因区段Cλ1、Cλ2、Cλ3和Cλ6。
在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)不含有出现于野生型Igλ轻链基因座(或等位基因)中的相同非人类Igλ轻链增强子区(或增强子序列)。在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)缺乏至少一个非人类Igλ轻链增强子区(或增强子序列)的全部或部分(例如，Igλ增强子2-4或Eλ2-4)。
在一些实施方案中，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至一个或多个非人类Igλ轻链增强子(即，增强子序列或增强子区)和一个或多个人类Igλ轻链增强子(即，增强子序列或增强子区)。在一些实施方案中，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至一个或多个非人类Igλ轻链调节区(或调控序列)。在一些实施方案中，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至一个或多个非人类Igλ轻链增强子(或增强子序列或增强子区)、一个或多个人类Igλ轻链增强子(即，增强子序列或增强子区)和一个或多个非人类Igλ轻链调节区(或调控序列)。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)不含有人类VpreB基因(或人类VpreB基因编码序列)。
在一些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区包括啮齿动物Cλ区，例如小鼠Cλ区或大鼠Cλ区。在某些实施方案中，经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区为或包含来自包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、混合129xC57BL/6品系或它们的组合的遗传背景的小鼠Cλ区。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:1(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:3(小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:5(小鼠Cλ3)至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在某些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:1(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:3(小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:5(小鼠Cλ3)实质上相同或相同的序列。在某些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区为或包含小鼠Cλ1区的序列。
在一些实施方案中，由定位于如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的序列编码的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:2(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:4(小鼠Cλ2)或SEQID NO:6(小鼠Cλ3)至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在某些实施方案中，由定位于如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的序列编码的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:2(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:4(小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:6(小鼠Cλ3)实质上相同或相同的序列。在某些实施方案中，由定位于如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的序列编码的非人类Cλ区为或包含小鼠Cλ1区多肽。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:7(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:9(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:11(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:13(大鼠Cλ4)至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在某些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:7(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:9(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:11(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:13(大鼠Cλ4)实质上相同或相同的序列。在某些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的非人类Cλ区为或包含大鼠Cλ1区的序列。
在一些实施方案中，由定位于如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的序列编码的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:8(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:10(大鼠Cλ2)、SEQID NO:12(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:14(大鼠Cλ4)至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在某些实施方案中，由定位于如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的序列编码的非人类Cλ区包含与SEQ ID NO:8(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:10(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:12(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:14(大鼠Cλ4)实质上相同或相同的序列。在某些实施方案中，由定位于如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的序列编码的非人类Cλ区为或包含大鼠Cλ1区多肽。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)的特征为存在位于内源性基因座处的非人类Igλ轻链序列的位置或在它们之内的人类Igλ轻链序列(基因组的或合成的)对应的人类遗传物质的插入所产生的一个或多个独特核苷酸序列接合区(或独特序列接合区的组合)。示例性核苷酸序列接合区如SEQ ID NO:117、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ IDNO:129所示。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129中的一者或多者。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:122和SEQ ID NO:123。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:128和SEQ IDNO:129。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:126和SEQ IDNO:127。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座(或等位基因)包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124和SEQ IDNO:125。
关于人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段的指南可见于例如Lefranc,M.P.,2000,Nomenclature of the human immunoglobulin lambda(IGL)genes,Current Protocolsin Immunology,增补号,40:A.1p.1-A.1p.37。本公开尤其展示了，与不包含此类经工程化的Igλ轻链等位基因的非人类动物的表达抗体库中轻链的多样性相比，Igλ轻链基因座(或等位基因)处人类Vλ和Jλ基因区段的存在增加了所提供的非人类动物的轻链库的多样性。
方法
在某些方面，如本文所述的非人类动物可用于制备人类抗体和/或编码人类抗体的核酸序列，所述人类抗体包含来源于由如本文所述的非人类动物的细胞的遗传材料编码的核酸序列的可变域。例如，在非人类动物对所述所关注的抗原产生免疫应答的条件下，用所关注的抗原免疫如本文所述的非人类动物，并持续足以产生免疫应答的时间。从这样免疫的非人类动物(或一种或多种细胞，例如一种或多种B细胞)分离抗体，并且使用多种测定法进行表征，这些测定法测量例如亲和力、特异性、表位作图、阻断配体-受体相互作用的能力、抑制性受体活化等。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物产生的抗体包含一个或多个人类可变域，所述人类可变域来源于从非人类动物分离的一个或多个人类可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，抗药物抗体(例如，抗独特型抗体)可在如本文所述的非人类动物中产生。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物提供了用于产生可用于多种测定法的人类抗体的改进的体内系统和生物材料(例如，细胞)来源。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于开发靶向所关注的多肽(例如，跨膜或分泌多肽)和/或调控与所述所关注的多肽相关联的一种或多种活性和/或调控所述所关注的多肽与其他结合伴侣(例如，配体或受体多肽)的相互作用的治疗剂。例如，在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于开发靶向一种或多种受体多肽，调控受体多肽活性和/或调控受体多肽与其他结合伴侣的相互作用的治疗剂。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于鉴定、筛选和/或开发结合一种或多种所关注的多肽的候选治疗剂(例如，抗体、siRNA等)。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于筛选和开发阻断一种或多种所关注的多肽的活性或阻断一种或多种所关注的受体多肽的活性的候选治疗剂(例如，抗体、siRNA等)。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于确定一种或多种所关注的多肽的拮抗剂和/或激动剂的结合特征。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物用于确定结合一种或多种所关注的多肽的一种或多种候选治疗性抗体的一个或多个表位。
在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于确定一种或多种人类抗体候选物的药代动力学特征。在多个实施方案中，如本文所述的一种或多种非人类动物和一种或多种对照或参考非人类动物各自以不同的剂量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更多)暴露于一种或多种人类抗体候选物。候选治疗性抗体可以经由各种所需的施用途径(包括肠胃外和非肠胃外施用途径)来给药。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如口服、鼻腔、透皮、肺部、直肠、面颊、阴道、眼部。施用也可以通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射来进行。在多个时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或最多30天或更多天)从非人类动物(人源化和对照)分离血液。可以使用从如本文所述的非人类动物获得的样品来进行多种测定，以确定所施用的候选治疗性抗体的药代动力学性质，包括但不限于总IgG、抗治疗性抗体应答、凝集等。
在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于确定阻断或调控所关注的多肽的活性的治疗作用，以及作为细胞变化的结果或在受体多肽的情况下对基因表达的作用，非人类动物中的细胞表面上受体多肽的密度。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物或从它们分离的细胞暴露于结合所关注的多肽的候选治疗剂，并在随后的一段时间后，分析对与所述所关注的多肽相关联的特定细胞过程(例如配体-受体相互作用或信号转导)的作用。
在某些方面，如本文所述的非人类动物表达人类抗体可变域，因此可以产生细胞、细胞系和细胞培养物，以作为用于结合和功能测定的人类抗体可变域的来源，例如测定拮抗剂或激动剂的结合或功能，尤其是其中拮抗剂或激动剂对所关注的人类抗原具有特异性或对在配体-受体相互作用(结合)中发挥功能的表位具有特异性的情况下。在多个实施方案中，可以使用从如本文所述的非人类动物分离的细胞来确定候选治疗性抗体或siRNA结合的表位。
可以分离来自所提供的非人类动物的细胞并随时使用，或者可以在培养中维持多代。在多个实施方案中，来自所提供的非人类动物的细胞是永生化的(例如，通过使用病毒)并且在培养中无限期维持(例如，在连续培养中)。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物提供了用于产生结合所关注的多肽的人类抗体可变域的变体(如，人类Vλ域变体)的体内系统。此类变体包括具有所需功能性、特异性、所关注的多肽的两种或更多种变体共享的共同表位的低交叉反应性的人类抗体可变域。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物用于产生人类抗体可变域组，所述人类抗体可变域包含针对所需或改进的功能性而筛选的一系列变体可变域。
在某些方面，如本文所述的非人类动物提供了用于产生人类抗体可变区文库(例如，人类Vλ域文库)的体内系统。此类文库提供了重链和/或轻链可变区序列的来源，所述重链和/或轻链可变区序列根据所需的效应子功能可以移植到不同的Fc区，用作使用本领域已知的技术(例如，定点诱变、易错PCR等)的可变区序列的亲和力成熟的来源和/或用作产生基于抗体的治疗性分子(例如，嵌合抗原受体(即，使用抗体组分(如，scFv)工程化的分子)、多特异性结合剂(如，双特异性结合剂)和融合蛋白(如，单域抗体、scFv等))的抗体组分的来源。
在一些方面，如本文所述的非人类动物提供了用于分析和测试药物或疫苗的体内系统。在多个实施方案中，候选药物或疫苗可以递送至一种或多种如本文所述的非人类动物，然后监测该非人类动物以确定对药物或疫苗的一种或多种免疫应答、药物或疫苗的安全性特征，或对疾病或病症和/或疾病或病症的一个或多个症状的作用。用于确定安全性特征的示例性方法包括毒性、最佳剂量浓度、抗体(即，抗药物)应答、药物或疫苗的功效以及可能的危险因素的测量。此类药物或疫苗可以在此类非人类动物中进行改进和/或开发。
疫苗功效可以多种方式确定。简而言之，使用本领域已知的方法对如本文所述的非人类动物接种疫苗，然后用疫苗挑战或将疫苗施用于已感染的非人类动物。一种或多种非人类动物对疫苗的应答可以通过以下方法进行测量：监测一种或多种非人类动物(或从它们分离的细胞)，和/或对一种或多种非人类动物(或从它们分离的细胞)进行一种或多种测定以确定疫苗的功效。然后使用本领域已知的和/或本文所述的一种或多种测量，将一种或多种非人类动物对疫苗的应答与对照动物进行比较。
疫苗功效还可以通过病毒中和测定来确定。简而言之，对如本文所述的非人类动物进行免疫，并且在免疫后的不同天数收集血清。将连续稀释的血清与病毒一起预温育，在此期间血清中对病毒具有特异性的抗体将与其结合。然后将病毒/血清混合物加入受纳细胞，以通过噬菌斑测定或微量中和测定来确定传染性。如果血清中的抗体中和病毒，则与对照组相比，存在较少的噬菌斑或较低的相对荧光素酶单位。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物产生人类抗体可变域，因此提供了产生用于诊断应用(如，免疫学、血清学、微生物学、细胞病理学等)的人类抗体的体内系统。在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物可以用于产生结合用于鉴定细胞变化(例如，指示病理学变化的特定细胞表面标记物的表达)的有关抗原位点的人类抗体可变域。根据需要，此类抗体可以缀合至各种化学实体(例如，放射性示踪物)并用于各种体内和/或体外测定。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物提供了用于开发和选择肿瘤学和/或传染性疾病所用的人类抗体的改进的体内系统。在多个实施方案中，可以用肿瘤(或肿瘤细胞)植入或用病毒(例如，流感病毒、HIV、HCV、HPV等)感染如本文所述的非人类动物和对照非人类动物(例如，具有不同于如本文所述的遗传修饰或不具有遗传修饰，即野生型)。在植入或感染之后，可以给非人类动物施用候选治疗剂。在候选治疗剂施用之前，可以允许肿瘤或病毒在非人类动物内的一个或多个位置中建立足够的时间。可替代地和/或另外地，可以监测此类非人类动物中的免疫应答，以表征和选择可以作为治疗剂开发的潜在人类抗体。
试剂盒
在一些方面，本公开还提供包装或试剂盒，所述包装或试剂盒包括装有如本文所述的至少一种非人类动物、非人类细胞、DNA片段、靶向载体或它们的任何组合的一个或多个容器。试剂盒可以用于任何适用的方法(例如，研究方法)。任选地与一个或多个此类容器相关的可以是由政府机构规定形式的注意事项，该注意事项规定药物或生物产品的制造、使用或销售，该注意事项反映了(a)机构关于用于人类施用的制造、使用或销售的批准，(b)使用说明，和/或(c)管理两个或更多个实体之间的材料和/或生物产品(例如，如本文所述的非人类动物或非人类细胞)的转移的合约以及它们的组合。
某些实施方案的其他特征将在示例性实施方案的以下描述的过程中变得显而易见，所述示例性实施方案为了说明而给出，并且不旨在限制本发明。
另外的示例性实施方案
在示例性实施方案1中，本文提供了生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含(a)一个或多个人类Vλ基因区段，(b)一个或多个人类Jλ基因区段，和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和啮齿动物Cλ基因区段，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在示例性实施方案2中，本文提供了根据实施方案1所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个啮齿动物Eλ。
在示例性实施方案3中，本文提供了根据实施方案2所述的啮齿动物，其中所述两个啮齿动物Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
在示例性实施方案4中，本文提供了根据实施方案1-3中任一项所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
在示例性实施方案5中，本文提供了根据实施方案1-4中任一项所述的啮齿动物，其中所述生殖系基因组还包含(i)内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在示例性实施方案6中，本文提供了根据实施方案5所述的啮齿动物，其中一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入替换啮齿动物VH、DH基因区段。
在示例性实施方案7中，本文提供了根据实施方案6所述的啮齿动物，其中所述插入包括天然出现于人类VH、DH和JH基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案8中，本文提供了根据实施方案5或6所述的啮齿动物，其中一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入替换啮齿动物Vκ和Jκ基因区段。
在示例性实施方案9中，本文提供了根据实施方案8所述的啮齿动物，其中所述插入包括天然出现于人类Vκ和Jκ基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案10中，本文提供了根据实施方案5-8中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区是内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在示例性实施方案11中，本文提供了根据实施方案5-10中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cκ区是内源性啮齿动物Cκ区。
在示例性实施方案12中，本文提供了根据实施方案1-9中任一项所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含全部或部分的内源性Vλ和Jλ基因区段的缺失。
在示例性实施方案13中，本文提供了根据实施方案12所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2基因区段和Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在示例性实施方案14中，本文提供了根据实施方案12所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P基因区段和Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在示例性实施方案15中，本文提供了根据实施方案1-14中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在示例性实施方案16中，本文提供了根据实施方案1-13中任一项所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含啮齿动物Eλ2-4的缺失。
在示例性实施方案17中，本文提供了根据实施方案1-16中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物不可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链。
在示例性实施方案18中，本文提供了根据实施方案5-17中任一项所述的啮齿动物，其中所述免疫球蛋白重链基因座包含从VH3-74至VH6-1的人类VH基因区段、从DH1-1至DH7-27的人类DH基因区段和人类JH基因区段JH1-JH6的插入。
在示例性实施方案19中，本文提供了根据实施方案18所述的啮齿动物，其中所述插入包括天然出现于人类VH3-74至VH6-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类DH1-1至DH7-27之间的人类非编码DNA和天然出现于人类JH1-JH6之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案20中，本文提供了根据实施方案5-19中任一项所述的啮齿动物，其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的全部或部分的近端Vκ重复的插入。
在示例性实施方案21中，本文提供了根据实施方案20所述的啮齿动物，其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含从Vκ2-40至Vκ4-1的人类Vκ基因区段和Jκ1-Jκ5的人类Jκ基因区段的插入。
在示例性实施方案22中，本文提供了根据实施方案21所述的啮齿动物，其中所述插入包括天然出现于人类Vκ2-40至Vκ4-1之间的人类非编码DNA，和天然出现于人类Jκ1-Jκ5之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案23中，本文提供了根据实施方案1-22中任一项所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1、至少人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6、人类Jλ基因区段Jλ7和啮齿动物Cλ1基因区段的插入。
在示例性实施方案24中，本文提供了根据实施方案23所述的啮齿动物，其中所述插入包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6之间的人类非编码DNA以及天然出现于人类Jλ基因区段Jλ7的上游(或5’)的人类非编码DNA。
在示例性实施方案25中，本文提供了根据实施方案5-24中任一项所述的啮齿动物，其中所述免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性啮齿动物Adam6基因。
在示例性实施方案26中，本文提供了根据实施方案5-25中任一项所述的啮齿动物，其中所述免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
在示例性实施方案27中，本文提供了根据实施方案26所述的啮齿动物，其中所述一个或多个核苷酸序列被插入第一和第二人类VH基因区段之间。
在示例性实施方案28中，本文提供了根据实施方案26所述的啮齿动物，其中所述一个或多个核苷酸序列被插入人类Adam6假基因的位置。
在示例性实施方案29中，本文提供了根据实施方案27所述的啮齿动物，其中所述第一人类VH基因区段是人类VH1-2，并且所述第二人类VH基因区段是人类VH6-1。
在示例性实施方案30中，本文提供了根据实施方案26所述的啮齿动物，其中所述一个或多个核苷酸序列被插入人类VH基因区段和人类DH基因区段之间。
在示例性实施方案31中，本文提供了根据实施方案5-30中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是所述内源性免疫球蛋白重链基因座的杂合子或纯合子。
在示例性实施方案32中，本文提供了根据实施方案5-31中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的杂合子或纯合子。
在示例性实施方案33中，本文提供了根据实施方案1-32中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的杂合子或纯合子。
在示例性实施方案34中，本文提供了根据实施方案1-33中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
在示例性实施方案35中，本文提供了生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的分离的啮齿动物细胞，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：(a)一个或多个人类Vλ基因区段，(b)一个或多个人类Jλ基因区段，和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，(i)其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和啮齿动物Cλ基因区段，并且(ii)其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在示例性实施方案36中，本文提供了由根据实施方案35所述的啮齿动物细胞制备的永生化细胞。
在示例性实施方案37中，本文提供了根据实施方案35所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。
在示例性实施方案38中，本文提供了从根据实施方案35所述的啮齿动物胚胎干细胞产生的啮齿动物胚胎。
在示例性实施方案39中，本文提供了一种产生生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物的方法，所述方法包括(a)将DNA片段引入啮齿动物胚胎干细胞，所述DNA片段包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括(i)一个或多个人类Vλ基因区段，(ii)一个或多个人类Jλ基因区段，和(iii)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(i)-(iii)可操作地连接至啮齿动物Cλ基因区段，并且其中所述核苷酸序列还包含一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)；(b)获得(a)中生成的啮齿动物胚胎干细胞；以及(c)使用(b)的啮齿动物胚胎干细胞来产生啮齿动物。
在示例性实施方案40中，本文提供了根据实施方案39所述的方法，其中所述核苷酸序列还包括一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在示例性实施方案41中，本文提供了一种产生生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物的方法，所述经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至啮齿动物或人类Cλ基因区段，并且所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，所述方法包括修饰啮齿动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座，所述经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座包括一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至啮齿动物或人类Cλ基因区段，并且所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)以及一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，从而产生所述啮齿动物。
在示例性实施方案42中，本文提供了根据实施方案39或41所述的方法，其中所述一个或多个人类Vλ基因区段包括Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1。
在示例性实施方案43中，本文提供了根据实施方案42所述的方法，其中所述一个或多个人类Vλ基因区段包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案44中，本文提供了根据实施方案39-43中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人类Jλ基因区段和所述一个或多个人类Cλ基因区段包括人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和人类Jλ7基因区段。
在示例性实施方案45中，本文提供了根据实施方案44所述的方法，其中所述人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于人类Jλ和Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且所述人类Jλ7基因区段包括天然出现于人类Jλ7.上游(或5’)的人类非编码DNA。
在示例性实施方案46中，本文提供了根据实施方案39-45中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在示例性实施方案47中，本文提供了根据实施方案39-46中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
在示例性实施方案48中，本文提供了根据实施方案39-46中任一项所述的方法，其中内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个啮齿动物Eλ。
在示例性实施方案49中，本文提供了根据实施方案48所述的方法，其中所述两个啮齿动物Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
在示例性实施方案50中，本文提供了根据实施方案38和42-49中任一项所述的方法，其中所述DNA片段还包含一个或多个选择性标记。
在示例性实施方案51中，本文提供了根据实施方案39和42-50中任一项所述的方法，其中所述DNA片段还包含一个或多个位点特异性重组位点。
在示例性实施方案52中，本文提供了根据实施方案39和42-51中任一项所述的方法，其中(a)的DNA片段被引入啮齿动物胚胎干细胞中，所述啮齿动物胚胎干细胞的生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，和内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在示例性实施方案53中，本文提供了根据实施方案39和42-51中任一项所述的方法，其中(a)的DNA片段被引入啮齿动物胚胎干细胞中，所述啮齿动物胚胎干细胞的生殖系基因组包含野生型内源性免疫球蛋白重链基因座；或野生型内源性免疫球蛋白重链基因座和野生型内源性免疫球蛋白κ轻链基因座；并且其中所述方法还包括将从所述非人类胚胎干细胞产生的小鼠与第二小鼠杂交的步骤。
在示例性实施方案54中，本文提供了根据实施方案47-49中任一项所述的方法，其中修饰啮齿动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座在啮齿动物胚胎干细胞中进行，所述啮齿动物胚胎干细胞的生殖系基因组还包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在示例性实施方案55中，本文提供了根据实施方案52或54所述的方法，其中一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入包括天然出现于一个或多个人类VH基因区段之间的人类非编码DNA、天然出现于一个或多个人类DH基因区段之间的人类非编码DNA和天然出现于一个或多个人类JH基因区段之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案56中，本文提供了根据实施方案52或54所述的方法，其中一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入包括天然出现于一个或多个人类Vκ基因区段之间的人类非编码DNA和天然出现于一个或多个人类Jκ基因区段之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案57中，本文提供了根据实施方案41-49中任一项所述的方法，其中修饰非人类动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座在非人类胚胎干细胞中进行，所述非人类胚胎干细胞的生殖系基因组包含野生型内源性免疫球蛋白重链基因座；或野生型内源性免疫球蛋白重链基因座和野生型内源性免疫球蛋白κ轻链基因座；并且其中所述方法还包括将从所述非人类胚胎干细胞产生的小鼠与第二小鼠杂交的步骤。
在示例性实施方案58中，本文提供了根据实施方案53或57所述的方法，其中所述第二小鼠具有包含野生型IgH和Igκ基因座的生殖系基因组。
在示例性实施方案59中，本文提供了根据实施方案53或57所述的方法，其中所述第二小鼠具有包含纯合的或杂合的人源化IgH和Igκ基因座的生殖系基因组，所述纯合的或杂合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列。
在示例性实施方案60中，本文提供了根据实施方案53或57所述的方法，其中所述第二小鼠具有包含纯合的或杂合的人源化IgH基因座和纯合的或杂合的失活的Igκ基因座的生殖系基因组。
在示例性实施方案61中，本文提供了一种在啮齿动物中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)用所关注的抗原免疫啮齿动物，所述啮齿动物具有包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的生殖系基因组，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含(ai)一个或多个人类Vλ基因区段、(b)一个或多个人类Jλ基因区段和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和啮齿动物Cλ基因区段，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)；(2)在足以使啮齿动物对所关注的抗原产生免疫应答的条件下维持所述啮齿动物；以及(3)从啮齿动物或啮齿动物细胞回收结合所关注的抗原的抗体。
在示例性实施方案62中，本文提供了根据实施方案61所述的方法，其中所述啮齿动物具有生殖系基因组，所述生殖系基因组还包含：内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在示例性实施方案63中，本文提供了根据实施方案61或62所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是B细胞。
在示例性实施方案64中，本文提供了根据实施方案61或62所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是杂交瘤。
在示例性实施方案65中，本文提供了根据实施方案61-64中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1、人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和人类Jλ基因区段Jλ7的插入。
在示例性实施方案66中，本文提供了根据实施方案65所述的方法，其中所述插入包括天然出现于人类VλVλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6之间的人类非编码DNA以及天然出现于人类Jλ基因区段Jλ7.上游(或5’)的人类非编码DNA。
在示例性实施方案67中，本文提供了根据实施方案61-66中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在示例性实施方案68中，本文提供了根据实施方案62-67中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座包含从VH3-74至VH6-1的人类VH基因区段、从DH1-1至DH7-27的人类DH基因区段和人类JH基因区段JH1-JH6的插入，并且所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在示例性实施方案69中，本文提供了根据实施方案68所述的方法，其中所述插入包括天然出现于人类VH3-74至VH6-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类DH1-1至DH7-27之间的人类非编码DNA和天然出现于人类JH1-JH6之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案70中，本文提供了根据实施方案68所述的方法，其中所述人类VH、DH和JH基因区段替换啮齿动物VH、DH和JH基因区段。
在示例性实施方案71中，本文提供了根据实施方案62-70中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含从Vκ2-40至Vκ4-1的人类Vκ基因区段和Jκ1-Jκ5的人类Jκ基因区段的插入，并且所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至内源性啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在示例性实施方案72中，本文提供了根据实施方案71所述的方法，其中所述插入包括天然出现于人类Vκ2-40至Vκ4-1之间的人类非编码DNA，和天然出现于人类Jκ1-Jκ5之间的人类非编码DNA。
在示例性实施方案73中，本文提供了根据实施方案71所述的方法，其中所述人类Vκ和Jκ基因区段替换啮齿动物Vκ和Jκ基因区段。
在示例性实施方案74中，本文提供了根据实施方案61-73中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的生殖系基因组还包含编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
在示例性实施方案75中，本文提供了根据实施方案62-74中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性啮齿动物Adam6基因。
在示例性实施方案76中，本文提供了根据实施方案75所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
在示例性实施方案77中，本文提供了根据实施方案76所述的方法，其中编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列被插入第一和第二人类VH基因区段之间。
在示例性实施方案78中，本文提供了根据实施方案77所述的方法，其中所述第一人类VH基因区段是人类VH1-2，并且所述第二人类VH基因区段是人类VH6-1。
在示例性实施方案79中，本文提供了根据实施方案76所述的方法，其中编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入人类Adam6假基因的位置。
在示例性实施方案80中，本文提供了根据实施方案76所述的方法，其中编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列被插入人类VH基因区段和人类DH基因区段之间。
在示例性实施方案81中，本文提供了根据实施方案61-80中任一项所述的方法，其中从啮齿动物或啮齿动物细胞回收的结合所关注的抗原的抗体包含人类重链可变域和人类λ轻链可变域。
在示例性实施方案82中，本文提供了根据实施方案81所述的方法，其中所述人类重链可变域包括选自VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2和VH6-1的重排的人类VH基因区段。
在示例性实施方案83中，本文提供了根据实施方案81或82所述的方法，其中所述人类λ轻链可变域包括选自Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1的重排的人类Vλ基因区段。
在示例性实施方案84中，本文提供了根据实施方案39-83中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
在示例性实施方案85中，本文提供了一种生殖系基因组包含纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物，所述纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：(i)人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1，(ii)人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6，(iii)人类Jλ基因区段Jλ7，和(iv)三个人类免疫球蛋白λ轻链增强子；其中(i)-(iv)彼此可操作地连接，并且(i)-(iii)在啮齿动物Cλ基因区段上游，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座缺乏内源性啮齿动物免疫球蛋白Eλ2-4，所述人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1包括天然出现于人类Vλ基因区段之间的人类非编码DNA，所述人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且所述人类Jλ基因区段Jλ7包括天然出现于人类Jλ7上游(或5’)的人类非编码DNA。
在示例性实施方案86中，本文提供了根据实施方案85所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在示例性实施方案87中，本文提供了根据实施方案85或86所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含内源性啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子Eλ和Eλ3-1。
在示例性实施方案88中，本文提供了根据实施方案85-87中任一项所述的啮齿动物，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含内源性啮齿动物Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P基因区段和Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在示例性实施方案89中，本文提供了根据实施方案85-88中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
在一些实施方案中，本文提供了生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含(a)一个或多个人类Vλ基因区段，(b)一个或多个人类Jλ基因区段，和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和啮齿动物Cλ基因区段，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个啮齿动物Eλ。
在一些实施方案中，所述两个啮齿动物Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
在一些实施方案中，所述生殖系基因组还包含(i)内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在一些实施方案中，一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入替换啮齿动物VH、DH基因区段。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类VH、DH和JH基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入替换啮齿动物Vκ和Jκ基因区段。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类Vκ和Jκ基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区是内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，其中所述啮齿动物Cκ区是内源性啮齿动物Cκ区。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含全部或部分的内源性Vλ和Jλ基因区段的缺失。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2基因区段和Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P基因区段和Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在一些实施方案中，所述啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含啮齿动物Eλ2-4的缺失。
在一些实施方案中，所述啮齿动物不可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链基因座包含从VH3-74至VH6-1的人类VH基因区段、从DH1-1至DH7-27的人类DH基因区段和人类JH基因区段JH1-JH6的插入。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类VH3-74至VH6-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类DH1-1至DH7-27之间的人类非编码DNA和天然出现于人类JH1-JH6之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的全部或部分的近端Vκ重复的插入。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含Vκ2-40至Vκ4-1的人类Vκ基因区段和Jκ1-Jκ5人类Jκ基因区段的插入。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类Vκ2-40至Vκ4-1之间的人类非编码DNA，和天然出现于人类Jκ1-Jκ5之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1、至少人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6、人类Jλ基因区段Jλ7和啮齿动物Cλ1基因区段的插入。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6之间的人类非编码DNA以及天然出现于人类Jλ基因区段Jλ7的上游(或5’)的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性啮齿动物Adam6基因。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸序列被插入第一和第二人类VH基因区段之间。
在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸序列插入人类Adam6假基因的位置。
在一些实施方案中，所述第一人类VH基因区段是人类VH1-2，并且所述第二人类VH基因区段是人类VH6-1。
在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸序列被插入人类VH基因区段和人类DH基因区段之间。
在一些实施方案中，所述啮齿动物是内源性免疫球蛋白重链基因座的杂合子或纯合子。
在一些实施方案中，所述啮齿动物是内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的杂合子或纯合子。
在一些实施方案中，所述啮齿动物是内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的杂合子或纯合子。
在一些实施方案中，所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
在一些实施方案中，本文提供了生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的分离的啮齿动物细胞，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：(a)一个或多个人类Vλ基因区段，(b)一个或多个人类Jλ基因区段，和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，(i)其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和啮齿动物Cλ基因区段，并且(ii)其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在一些实施方案中，本文提供了由本文提供的啮齿动物细胞制备的永生化的细胞。
在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。
在一些实施方案中，本文提供了从本文提供的啮齿动物胚胎干细胞产生的啮齿动物胚胎。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物的方法，所述方法包括(a)将DNA片段引入啮齿动物胚胎干细胞，所述DNA片段包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括(i)一个或多个人类Vλ基因区段，(ii)一个或多个人类Jλ基因区段，和(iii)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(i)-(iii)可操作地连接至啮齿动物Cλ基因区段，并且其中所述核苷酸序列还包含一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)；(b)获得(a)中生成的啮齿动物胚胎干细胞；以及(c)使用(b)的啮齿动物胚胎干细胞来产生啮齿动物。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列还包括一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物的方法，所述经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至啮齿动物或人类Cλ基因区段，并且所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，所述方法包括修饰啮齿动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座，所述经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座包括一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，所述人类Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至啮齿动物或人类Cλ基因区段，并且所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)以及一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，从而产生所述啮齿动物。
在一些实施方案中，所述一个或多个人类Vλ基因区段包括Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1。
在一些实施方案中，所述一个或多个人类Vλ基因区段包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述一个或多个人类Jλ基因区段和所述一个或多个人类Cλ基因区段包括人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和人类Jλ7基因区段。
在一些实施方案中，所述人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于人类Jλ和Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且所述人类Jλ7基因区段包括天然出现于人类Jλ7.上游(或5’)的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个啮齿动物Eλ。
在一些实施方案中，所述两个啮齿动物Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
在一些实施方案中，DNA片段还包含一个或多个选择性标记。
在一些实施方案中，DNA片段还包含一个或多个位点特异性重组位点。
在一些实施方案中，(a)的DNA片段被引入啮齿动物胚胎干细胞中，所述啮齿动物胚胎干细胞的生殖系基因组包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，和内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在一些实施方案中，(a)的DNA片段被引入啮齿动物胚胎干细胞中，所述啮齿动物胚胎干细胞的生殖系基因组包含野生型内源性免疫球蛋白重链基因座；或野生型内源性免疫球蛋白重链基因座和野生型内源性免疫球蛋白κ轻链基因座；并且其中所述方法还包括将从所述非人类胚胎干细胞产生的小鼠与第二小鼠杂交的步骤。
在一些实施方案中，修饰啮齿动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座在啮齿动物胚胎干细胞中进行，所述啮齿动物胚胎干细胞的生殖系基因组还包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在一些实施方案中，一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入包括天然出现于一个或多个人类VH基因区段之间的人类非编码DNA、天然出现于一个或多个人类DH基因区段之间的人类非编码DNA和天然出现于一个或多个人类JH基因区段之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入包括天然出现于一个或多个人类Vκ基因区段之间的人类非编码DNA和天然出现于一个或多个人类Jκ基因区段之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，修饰非人类动物的生殖系基因组，以使其包含经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座在非人类胚胎干细胞中进行，所述非人类胚胎干细胞的生殖系基因组包含野生型内源性免疫球蛋白重链基因座；或野生型内源性免疫球蛋白重链基因座和野生型内源性免疫球蛋白κ轻链基因座；并且其中所述方法还包括将从所述非人类胚胎干细胞产生的小鼠与第二小鼠杂交的步骤。
在一些实施方案中，所述第二小鼠具有包含野生型IgH和Igκ基因座的生殖系基因组。
在一些实施方案中，所述第二小鼠具有包含纯合的或杂合的人源化IgH和Igκ基因座的生殖系基因组，所述纯合的或杂合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列。
在一些实施方案中，所述第二小鼠具有包含纯合的或杂合的人源化IgH基因座和纯合的或杂合的失活的Igκ基因座的生殖系基因组。
在一些实施方案中，本文提供了一种在啮齿动物中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)用所关注的抗原免疫啮齿动物，所述啮齿动物具有包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的生殖系基因组，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含(ai)一个或多个人类Vλ基因区段、(b)一个或多个人类Jλ基因区段和(c)一个或多个人类Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和啮齿动物Cλ基因区段，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)；(2)在足以使啮齿动物对所关注的抗原产生免疫应答的条件下维持所述啮齿动物；以及(3)从啮齿动物或啮齿动物细胞回收结合所关注的抗原的抗体。
在一些实施方案中，所述啮齿动物具有生殖系基因组，所述生殖系基因组还包含：内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区；或内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是B细胞。
在一些实施方案中，所述啮齿动物细胞是杂交瘤。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1、人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和人类Jλ基因区段Jλ7的插入。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类VλVλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6之间的人类非编码DNA以及天然出现于人类Jλ基因区段Jλ7.上游(或5’)的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链基因座包含从VH3-74至VH6-1的人类VH基因区段、从DH1-1至DH7-27的人类DH基因区段和人类JH基因区段JH1-JH6的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类VH3-74至VH6-1之间的人类非编码DNA、天然出现于人类DH1-1至DH7-27之间的人类非编码DNA和天然出现于人类JH1-JH6之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，所述人类VH、DH和JH基因区段替换啮齿动物VH、DH和JH基因区段。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含从Vκ2-40至Vκ4-1的人类Vκ基因区段和Jκ1-Jκ5的人类Jκ基因区段的插入，并且所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至内源性啮齿动物免疫球蛋白Cκ区。
在一些实施方案中，所述插入包括天然出现于人类Vκ2-40至Vκ4-1之间的人类非编码DNA，和天然出现于人类Jκ1-Jκ5之间的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，人类Vκ和Jκ基因区段替换啮齿动物Vκ和Jκ基因区段。
在一些实施方案中，啮齿动物的生殖系基因组还包含编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性啮齿动物Adam6基因。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入第一和第二人类VH基因区段之间。
在一些实施方案中，所述第一人类VH基因区段是人类VH1-2，并且所述第二人类VH基因区段是人类VH6-1。
在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入人类Adam6假基因的位置。
在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列插入人类VH基因区段和人类DH基因区段之间。
在一些实施方案中，从啮齿动物或啮齿动物细胞回收的结合所关注的抗原的抗体包含人类重链可变域和人类λ轻链可变域。
在一些实施方案中，人类重链可变域包括选自VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2和VH6-1的重排的人类VH基因区段。
在一些实施方案中，人类λ轻链可变域包括选自Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1的重排的人类Vλ基因区段。
在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠或大鼠。
在一些实施方案中，本文提供了生殖系基因组包含纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的啮齿动物，所述纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：(i)人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1，(ii)人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6，(iii)人类Jλ基因区段Jλ7，和(iv)三个人类免疫球蛋白λ轻链增强子；其中(i)-(iv)彼此可操作地连接，并且(i)-(iii)在啮齿动物Cλ基因区段上游，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座缺乏内源性啮齿动物免疫球蛋白Eλ2-4，所述人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1包括天然出现于人类Vλ基因区段之间的人类非编码DNA，所述人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于人类Jλ-Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且所述人类Jλ基因区段Jλ7包括天然出现于人类Jλ7上游(或5’)的人类非编码DNA。
在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含内源性啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子Eλ和Eλ3-1。
在一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含内源性啮齿动物Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P基因区段和Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1基因区段的缺失。
在一些实施方案中，所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
实施例
提供以下实施例以便向技术人员描述如何制备和使用如本文所述的方法和组合物，并且不旨在对本公开的发明人视为其发明的范围进行限制。除非另外指明，否则温度以摄氏度表示，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1.用于工程化啮齿动物Igλ轻链基因座的靶向载体的构建
本实施例展示了构建用于插入非人类动物诸如啮齿动物(例如，小鼠)的基因组内的靶向载体的示例性方法。本实施例描述的方法展示了生殖系基因组包含经工程化的Igλ轻链基因座的非人类动物的产生。具体地讲，本实施例展示了构建用于工程化非人类动物中的内源性Igλ轻链基因座，以使得非人类动物表达和/或产生包括Igλ轻链的抗体的一系列靶向载体，所述Igλ轻链具有人类可变域和非人类可变域，或者在一些实施方案中，来自非人类动物的生殖系基因组中的所述内源性Igλ轻链基因座的人类恒定域。如下文所述，含有不同量的人类Igλ轻链基因座(即，人类Vλ、Jλ、Cλ和Igλ增强子序列)对应的遗传物质的一系列靶向载体被插入内源性啮齿动物Igλ轻链基因座中。具体地讲，所述遗传物质被插入啮齿动物Cλ基因(或基因区段)上游，以使得人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段可操作地连接至所述啮齿动物Cλ基因。本实施例所述的方法提供了内源性啮齿动物Igλ基因区段(或序列)的保留和/或缺失。图1-4示出了用于构建经工程化的内源性Igλ轻链基因座的一系列靶向载体的示例性示意图。
使用
Figure GDA0002046896830000971
技术(参见例如，美国专利No.6,586,251和Valenzuela等人,2003,Nature Biotech.21(6):652-9；这些文献以引用的方式整体并入本文)和本领域已知的分子生物学技术产生了用于插入啮齿动物Igλ轻链基因座中的含有各种量的人类Vλ、Jλ、Cλ和Igλ增强子序列(或区)的一系列靶向载体。本实施例所述的方法可用于根据需要利用任何人类Vλ，Jλ，Cλ和Igλ增强子序列或序列(或序列片段)的组合。表1示出了图1所示的每个靶向载体的简要描述。
简而言之，将约12kb(11,822bp)的来自人类细菌人工染色体(BAC)克隆CTD-2502m16的人类Igλ基因组序列连接至小鼠BAC克隆RP23-60e14。该小鼠BAC克隆被工程化为缩短BAC克隆约90kb，在小鼠Cλ1基因下游插入独特的AsiSI和PI-SceI限制性酶识别位点，并通过两个连续的细菌同源重组(BHR)步骤用壮观霉素抗(SpecR)基因和独特的I-CeuI限制性位点替换初始的氯霉素抗性(CMR)基因，然后连接至人类Igλ基因组序列。还通过两个连续的BHR步骤修饰人类BAC克隆CTD-2502m16：用新霉素选择盒和独特的PI-SceI限制性位点从3’末端修剪约53kb的人类序列，并用潮霉素盒和独特的AsiSI限制性位点从5’末端修剪CMR基因和约101.5kb的人类序列，从而分别在模块化人类增强子区上游约2885bp和下游约1418bp放置AsiSI位点和新霉素选择盒(参见例如，Asenbauer,H.和H.G.Klobeck,1996,Eur.J.Immunol.26(1):142-50，该文献据此以引用的方式整体并入)。人类Igλ基因组序列含有对应于人类Igλ增强子(Eλ)区(或序列)的约7.5kb，它是模块化的并且含有三个序列元件(图1；Asenbauer,H.和H.G.Klobeck,1996,Eur.J.Immunol.26(1):142-50)以及分别2.9kb和1.4kb的5’和3’侧接序列，以及新霉素选择盒(即，在泛素启动子的转录控制下并与loxP位点侧接的新霉素抗性基因[NEOR])。用AsiSI和PI-SceI位点消化修饰的人类和小鼠BAC克隆并连接在一起。在连接至经工程化的小鼠BAC克隆之后，所得的靶向载体含有作为5’同源臂的约39,166bp的小鼠序列，并且包括小鼠Igλ基因区段Vλ1、Jλ3、Jλ3P、Cλ3、Jλ1和Cλ1(6286靶向载体，图1)。3’同源臂(约30,395bp)包括小鼠Igλ增强子(mEλ)。为简明起见，在图1中的6286靶向载体的描述中，未示出小鼠同源臂。与该靶向载体的同源重组产生了三个人类Igλ增强子序列以及无任何小鼠序列缺失的5’和3’侧接序列的插入。通过Cre重组酶的瞬时表达在ES细胞中实现了重组酶介导的新霉素选择盒的缺失(参见例如，Lakso,M.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6232-6；Orban,P.C.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6861-5；Gu,H.等人,1993,Cell73(6):1155-64；Araki,K.等人,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:160-4；Dymecki,S.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(12):6191-6；所有这些文献以引用的方式整体并入本文)。
第二构建体(6571靶向载体)被工程化为包括一组五个功能性人类Vλ基因区段和跨越约125,473bp的实质上所有人类Jλ-Cλ簇(即，人类Jλ1-Cλ1-Jλ2-Cλ2-Jλ3-Cλ3-Jλ4-Cλ4-Jλ5-Cλ5-Jλ6-Cλ6-hJλ7)，这些人类Jλ-Cλ簇从人类BAC克隆CTD-2079i4获得。为了构建靶向载体，首先通过BHR用小鼠Cλ1基因和约1588bp的侧接序列替换人类BAC克隆CTD-2079i4中的人类Cλ7基因，小鼠Cλ1基因使用小鼠BAC克隆RP23-60e14作为模板通过PCR扩增。然后使用分别通过BHR引入小鼠和人类BAC克隆的独特的I-CeuI和PI-SceI限制性酶识别位点，将含有约37,161bp小鼠序列的5’同源臂(对应于小鼠BAC克隆RP23-60e14中的小鼠Cλ1基因5’的序列)连接至含有合成的小鼠Cλ1基因的经修饰的人类BAC克隆CTD-2079i4。该5’同源臂含有小鼠Vλ1、Jλ3、Jλ3P、Cλ3和Jλ1基因区段(图1)。3’同源臂含有来自6286靶向载体的两个人类Eλ对应的约9,189bp人类序列(图1)。
第三构建体(6596靶向载体)被工程化为含有另外十一个功能性人类Vλ基因区段。该靶向载体含有来自BAC克隆RP11-761L13的约171,458bp人类序列。通过设计，将三个人类Vλ基因区段包括在内，以提供与6571靶向载体的3’重叠同源性(约33,469bp)。如上文所述，使用分别通过BHR引入小鼠和人类BAC克隆的独特的I-CeuI和AscI限制性酶识别位点，将含有约37,161bp小鼠序列的5’同源臂连接至含有人类Vλ基因区段的DNA片段的5’末端。
第四构建体(6597靶向载体)被工程化为含有另外九个功能性人类Vλ基因区段。该靶向载体含有来自两个BAC克隆(即，RP11-22L18和RP11-761L13)的约121,188bp人类序列。如上文所述，该人类序列的3’末端含有另外的人类Vλ基因区段，该人类Vλ基因区段提供与6596靶向载体(约27,468bp)的3’重叠同源性。如上文针对6571和6596靶向载体所述，使用分别通过BHR引入小鼠和人类BAC克隆的独特的I-CeuI和AscI限制性酶识别位点，将含有来自BAC克隆RP23-60e14的小鼠序列的约37,161bp5’同源臂连接至人类序列的5’末端。
第五构建体(6680靶向载体)以类似的方式工程化为含有与6597靶向载体相同的另外九个功能性人类Vλ基因区段，不同的是5’同源臂被改为允许通过同源重组缺失小鼠Igλ轻链基因座。该5’同源臂含有来自小鼠BAC克隆RP23-15m16的约22,298bp，并使用分别通过BHR引入小鼠和人类BAC克隆的独特的I-CeuI和AscI限制性酶识别位点连接至人类序列的5’末端(～121,188bp片段，如上文所述)。该5’同源臂含有小鼠Vλ2基因区段5’的小鼠序列，在同源重组时，有效地缺失小鼠Igλ轻链基因座。该靶向载体含有与6597靶向载体(上文所述)相同的3’重叠同源性。图2展示了由6597或6680靶向载体的插入产生的不同的等位基因。
以类似的方式，借助使用CRISPR/Cas9系统(图3)的引导RNA(gRNA)，通过将两种不同的靶向载体一起共电穿孔至ES细胞中来产生另外的经工程化的小鼠品系，参见例如美国专利No.9,228,208(2016年1月5日授予)和美国专利申请公开No.U.S.2015-0159174 A1(2014年12月15日提交)、U.S.2015-0376650 A1(2015年6月5日提交)、U.S.2015-0376628A1(2015年6月23日提交)、U.S.2016-0060657 A1(2015年10月30日提交)、U.S.2016-0145646 A1(2015年11月20日提交)和U.S.2016-0177339 A1(2015年12月18日提交)；所有这些专利以引用的方式整体并入本文。ES细胞具有6571靶向载体构建体的插入杂合的基因组。
简而言之，如图3所示，修剪的6596靶向载体(即，不具有如上文所述的5’同源臂和盒)被设计为含有约33kb3’同源臂，所述3’同源臂包括6571靶向载体中的三个人类Vλ基因区段对应的重叠序列、包含11个另外的人类Vλ基因区段的约111kb序列和含有单个人类Vλ基因区段并作为与第二靶向载体的重叠区的约27kb序列。第二靶向载体(6680靶向载体)包含定位于靶向载体的3’末端上的相同的约27kb重叠区序列、包含另外的九个人类Vλ基因区段的约94kb序列、新霉素选择盒(如，在泛素启动子的转录控制下并与Frt重组识别位点侧接的新霉素抗性基因[NEOR])和约22kb5’小鼠λ同源臂。这两个靶向载体的电穿孔中采用的ES细胞具有6571靶向载体的插入杂合的基因组(图3)。用上文所述的两种靶向载体，以及在核苷酸序列CGACCTGATG CAGCTCTCGG(SEQ ID NO:130)处靶向来自6571靶向载体的潮霉素抗性基因的引导RNA(gRNA)和靶向小鼠Vλ2基因区段上游的区域(即，负链上的小鼠Vλ2基因区段的3’；gRNA1：GTACATCTTG TCTTCAACGT，SEQ ID NO:139，小鼠Vλ2上游约1000bp；gRNA2：GTCCATAATT AATGTAGTTA C，SEQ ID NO:140，小鼠Vλ2上游约380bp)并促进这些序列处的双链断裂的两种gRNA对这些ES细胞进行共电穿孔。这两种共电穿孔靶向载体通过同源重组插入ES细胞基因组中的潮霉素序列处，替换含有和围绕潮霉素选择盒的区域。所得的ES细胞含有包括人类免疫球蛋白可变区的经工程化的内源性Igλ基因座，所述人类免疫球蛋白可变区包含可操作地连接至人类Jλ-Cλ簇的25个功能性人类Vλ基因区段，可操作地连接至小鼠Cλ1基因的人类Jλ7基因区段(图3)。
上文所述的靶向载体被引入小鼠胚胎干(ES)细胞中，以构建经工程化的Igλ轻链基因座。在每个靶向载体插入ES细胞的基因组之后(参见下文)和下一个靶向载体插入之前确认阳性ES细胞克隆。在一些情况下，产生用于表型分析的中间品系。
表1.靶向载体汇总
Figure GDA0002046896830001001
在上文所述的靶向载体的插入后通过测序确认整个选定接合点的核苷酸序列。图1-4中所示的选定接合点在下文提供。
SEQ ID NO:117 CCCTATTCACTGAGTTCTGGAAGCTCTGCTATTTCCATGATCGTTCACACTGACCCCTGTTGATCTTACCGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTA
SEQ ID NO:118 TTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAGGGTTTCACCGGTGGCGCGCCGATGTACATCAGTTCAGTCTGGAAAGGTGGAACAGCTCCAGGTGAAGGCAGG
SEQ ID NO:119 CTCTACGGGTGATGTTCATCTAAGGTGACAGGAGTCAGTGAGGGCTTCTCAAGCTTTATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCACTCGAGCCCTGCTGGTGCCTTCTGTTGTATCCACGCCTTCAGTAGATTTGATGA
SEQ ID NO:120 GAGTTTTTCCCTTTCCTGTCTGTCGAAGGCTAAGGTCTAAGCCTGTCTGGTCACACTAGGTAAAGAATTTCTTTCTTCTCTAGATGCTTTGTCTCATTTC
SEQ ID NO:121 TATGTCACTGGAATTTAGAGTAGTGTGTGGAATGTCTTGGCAACCTGGACACGCGTCCTGGCACCCAGTGAGAAAGTGGCCCTGAGGGAGAGGCTCATAG
SEQ ID NO:122 AGCAGCCGACATTTAGCAAAGAGGATTGGAAAATGAACCCCCCCTTAAAATACAGTTAAACACAGAGGAGGGAGCAAACCGGTATAACTTCGTATAATGT
SEQ ID NO:123 ATGCTATACGAAGTTATGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGTCTCATTCCTTCCCTGTCTCAAGGCATAATGGTTCAATATGCACCTGTA
SEQ ID NO:124 TTCTCTCCAAGACTTGAGGTGCTTTTTGTTGTATACTTTCCCTTTCTGTATTCTGCTTCATACCTATACTGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTA
SEQ ID NO:125 TTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAGGGTTTCACCGGTGGCGCGCCTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATAAGCTTTGGATTGGATTCAGTGAGCAAGAATTCACAAACACAATGGACTTATC
SEQ ID NO:126 TTCTCTCCAAGACTTGAGGTGCTTTTTGTTGTATACTTTCCCTTTCTGTATTCTGCTTCATACCTATACTGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTA
SEQ ID NO:127 TTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAGGGTTTCACCGGTGGCGCGCCCCCCTGCTGGTGCCTTTTGTTGTATCCACGCCTTCAGTAGATTTGATGATGC
SEQ ID NO:128 TTCTCTCCAAGACTTGAGGTGCTTTTTGTTGTATACTTTCCCTTTCTGTATTCTGCTTCATACCTATACTGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTA
SEQ ID NO:129 TTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAGGGTTTCACCGGTGGCGCGCCGATGTACATCAGTTCAGTCTGGAAAGGTGGAACAGCTCCAGGTGAAGGCAGG
在经工程化的基因座(具体地讲，经工程化的免疫球蛋白基因座)的构建中，发明人认识到一些人类Vλ基因区段可以从某些单倍型缺失，所以不在跨越人类Igλ轻链基因座的选定BAC克隆中表示。仅举一个例子，一个报告提供了以下证据：与此前报告的等位基因(例如，人类Vλ1-50、Vλ5-48、Vλ5-45和Vλ5-39；参见Moraes,J.C.和G.A.Passos,2003,Immunogenetics55(1):10-5)相比，最近发现的等位基因含有人类Igλ轻链基因座的簇B中的一个或多个人类Vλ基因区段的插入/缺失。因此，发明人设计了包括用于靶向载体设计和构建的特定BAC克隆中的缺失的人类Vλ基因区段的策略。
简而言之，通过末端测序将人类BAC克隆绘制到人类Igλ轻链基因座。具体地讲，使用GRCh37/hg19 Assembly(UCSC基因组浏览器，人类，2009年2月)，将人类BAC克隆RP11-346I4、CTD-2523F21和CTD-2523E22鉴定为跨越包括人类Vλ7-46至Vλ1-36的人类Igλ轻链基因座的簇B的区域。例如，可以使用被鉴定为含有插入所需的一个或多个人类Vλ基因区段的这些BAC克隆中的任一者，将一个或多个缺失人类Vλ基因区段(如，Vλ5-39、Vλ5-37和/或Vλ1-36)插入上文所述的靶向载体(6680或6889)中。例如，通过用与重组酶识别位点(如，lox2372)侧接的选择盒(如，在泛素启动子的转录控制下的潮霉素抗性基因[HYGR])和具有与6597靶向载体的重叠序列的～27kb3’同源臂(参见上文)替换3’来修饰BAC克隆CTD-2523F21。人类BAC克隆的5’末端作为具有与6680或6889靶向载体的重叠序列的5’同源臂，从而有助于任何缺失的人类Vλ基因区段以及选择盒的同源重组和插入。可以采用重组酶(如，Cre)的瞬时表达的任选最后步骤来移除选择盒。
实施例2.具有经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物的产生
本实施例展示了生殖系基因组包含内源性Igλ轻链基因座的非人类动物(如，啮齿动物)的产生，所述内源性Igλ轻链基因座包含多个人类Vλ、Jλ和Cλ序列的插入，所述人类Vλ、Jλ和Cλ序列可操作地连接至啮齿动物Cλ基因(或基因区段)，并且所述内源性Igλ轻链基因座还包括一个或多个人类Igλ增强子(Eλ)。在一些实施方案中，所述内源性Igλ轻链基因座包括一个或多个内源性Igλ轻链增强子区(或序列)的缺失。在一些实施方案中，通过完全人类的Igλ轻链(即，人类可变和恒定域)的表达来表征此类非人类动物。
通过聚合酶链式反应确认实施例1所述的靶向载体的靶向插入。然后经由电穿孔将通过聚合酶链式反应确认的靶向BAC DNA引入F1杂种(129S6SvEvTac/C57BL6NTac)小鼠胚胎干(ES)细胞内，随后在选择培养基中进行培养。在一些实施方案中，用于一系列靶向载体的电穿孔的ES细胞可以具有包括野生型IgH和Igκ基因座、纯合的人源化IgH和Igκ基因座的生殖系基因组(所述纯合的人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940；这些专利据此以引用的方式整体并入))或纯合的人源化IgH基因座(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940，出处同上)和纯合的失活的Igκ基因座。在其他实施方案中，在使用如本文所述的靶向ES细胞产生小鼠(参见下文)之后，将包含如本文所述的经工程化的人类Igλ基因座的所得的小鼠用于与包含人源化IgH和Igκ基因座的小鼠杂交，所述人源化IgH基因座含有插入的啮齿动物Adam6编码序列(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940，出处同上)或人源化IgH基因座(参见例如，美国专利No.8,642,835和8,697,940，出处同上)和失活的Igκ基因座。如上文所述在电穿孔后10天挑选抗药性集落，并且通过TAQMANTM和核型分析筛选正确的靶向(Valenzuela等人，出处同上；Frendewey,D.等人，2010,Methods Enzymol.476:295-307)。表2示出了用于筛选阳性ES细胞克隆的示例性引物/探针组(F：正向引物；R：反向引物；P：探针)。
使用
Figure GDA0002046896830001042
方法(DeChiara,T.M.等人,2010,MethodsEnzymol.476:285-294；Dechiara,T.M.,2009,Methods Mol.Biol.530:311-324；Poueymirou等人,2007,Nat.Biotechnol.25:91-99)，其中将被靶向的ES细胞注射到未压实的8细胞期Swiss Webster胚胎内，以产生健康的完全ES细胞来源的经工程化的Igλ轻链等位基因的杂合子F0代小鼠。使F0代杂合子小鼠与C57Bl6/NTac小鼠杂交产生F1杂合子，所述F1杂合子互交以产生用于表型分析的F2代动物。
总之，本实施例展示了生殖系基因组包含经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物(如，小鼠)的产生，所述经工程化的Igλ轻链基因座的特征为存在可操作地连接至啮齿动物Cλ基因的多个人类Vλ、Jλ和Cλ序列，所述啮齿动物经工程化的Igλ轻链基因座包括内源性啮齿动物和人类Igλ轻链增强子序列(或区)。本文所述的用于将人类Vλ、Jλ和Cλ序列插入内源性啮齿动物Igλ轻链基因座的策略允许构建表达含有融合至人类或啮齿动物Cλ域的人类Vλ域的抗体的啮齿动物。如本文所述，此类人类Vλ域从生殖系啮齿动物基因组中的内源性Igλ轻链基因座表达。
表2.用于筛选阳性ES细胞克隆的代表性引物/探针组
Figure GDA0002046896830001041
Figure GDA0002046896830001051
Figure GDA0002046896830001061
Figure GDA0002046896830001071
Figure GDA0002046896830001081
Figure GDA0002046896830001091
Figure GDA0002046896830001101
实施例3.具有经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物的表型评估
本实施例展示了被工程化为含有如上文所述的内源性Igλ轻链基因座的啮齿动物(如，小鼠)中的各种免疫细胞群的表征。具体地讲，本实施例特别展示了，与野生型同窝仔相比，具有如本文所述的经工程化的内源性Igλ轻链基因座的啮齿动物显示出相似的B细胞产生。具体地讲，携带不同量的人类Igλ轻链基因座对应的遗传物质的若干经工程化的啮齿动物各自在啮齿动物B细胞表面上可检测地表达具有人类可变和人类或啮齿动物恒定域的Igλ轻链。
简而言之，从图4所描绘的Igλ轻链等位基因纯合的或杂合的选定的经工程化的小鼠品系以及野生型同窝仔收集脾脏和股骨。通过用含2.0％胎牛血清(FBS)的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco)冲洗来从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液(Gibco)裂解来自脾脏和骨髓制备物的红细胞，随后用含2.0％FBS的1×PBS洗涤。将分离的细胞(1×106)与选定抗体混合物一起在+4℃下温育30分钟(参见表3)。
表3.用于通过流式细胞术分析细胞染色的抗体
Figure GDA0002046896830001102
Figure GDA0002046896830001111
在染色后，洗涤并在2％甲醛中固定细胞。数据采集在BD FORTESSATM流式细胞仪上进行，并用FLOWJOTM软件进行分析。代表性结果如图5-13和18-21所示。获得图4中所描绘的其他品系的相似数据，但仅示出指定的品系。
结果显示，携带不同量的人类Igλ轻链基因座对应的遗传物质的每种品系在脾脏和骨髓区室中展示出相似的免疫细胞群特征。具体地讲，如图5-7所示的数据所证实，与野生型同窝仔对照相比，经工程化的小鼠展示出相似数量的CD19+脾脏B细胞、相似的脾脏中成熟和过渡B细胞群、相似的脾脏中κ使用率以及相似的边缘区和滤泡B细胞群。另外，在存在另外的人源化IgH和人源化Igκ基因座的情况下，与含有单独的人源化IgH和人源化Igκ基因座的小鼠相比，含有如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的小鼠不展示出B细胞产生的显著差异(例如参见图18A和18B)。另外，如图8-12描绘的小鼠所示，与野生型同窝仔对照相比，经工程化的小鼠具有相似的CD19+、pro-、pre-、未成熟和成熟B细胞数和相似的骨髓中κ使用率。图13提供了与野生型同窝仔对照相比，选定的经工程化的品系(纯合子–HO；杂合子–HET)的轻链表达汇总。与已知的野生型小鼠的典型外周λ利用率(如，脾脏中为5％)相比，如本文所述的经工程化的人源化Igλ基因座的小鼠纯合子，以及人源化IgH和Igκ基因座的纯合子和啮齿动物Adam6编码序列的纯合子展示出增加的λ基因座使用率(约40％)(参见图13的6680HO/VI HO/Adam6 HO和6689HO/VI HO/Adam6 HO小鼠的列)。另外，在这些小鼠中检测到少量小鼠Igλ阳性B细胞(～3-5％)，这证实了经工程化的λ轻链基因座内的小鼠Cλ基因也在这些小鼠中功能性λ轻链的情况下表达。
实施例4.具有经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物中的抗体表达
本实施例展示了来自非人类动物的抗体的表达，所述抗体含有轻链，所述轻链的特征为存在人类Vλ区和人类或啮齿动物Cλ区，并且所述轻链从经工程化的内源性啮齿动物Igλ轻链基因座表达。具体地讲，本实施例特别展示了非人类动物(如，啮齿动物)的血清中抗体的表达，所述非人类动物的生殖系基因组包含内源性Igλ轻链基因座，所述内源性Igλ轻链基因座包含一个或多个人类Vλ基因区段、一个或多个人类Jλ基因区段和一个或多个人类Cλ基因区段的插入，所述人类Vλ、Jλ和Cλ基因区段可操作地连接至啮齿动物Cλ基因，并且所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含一个或多个啮齿动物Igλ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类Igλ轻链增强子(Eλ)。
简而言之，从选定的经工程化的小鼠品系和野生型同窝仔采血(参见实施例3)。使用Eppendorf管在4℃下以9000rcf离心五分钟来从血液分离血清。将收集的血清用于免疫印迹，以鉴定抗体的Ig轻链表达。在PBS(无Ca2+和Mg2+)中1.5:10稀释小鼠血清，并在4-20％Novex Tris-甘氨酸凝胶上在还原和非还原条件下运行。根据制造商的说明将凝胶转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用溶于含0.05％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBST,Sigma)的5％脱脂乳封闭印迹过夜。将PVDF膜暴露于不同的一抗(缀合至HRP的小鼠抗hIgλ(SouthernBiotech)；缀合至HRP的山羊抗mIgλ,Southern Biotech)中，在溶于TBST的0.1％脱脂乳中在室温下1:1,000稀释一小时。洗涤印迹四次，每次洗涤十分钟，并用Amersham ECLWestern印迹检测试剂(GE Healthcare Life Sciences)根据制造商的说明显像一分钟。然后使用GE Healthcare ImageQuant LAS-4000制冷CCD相机凝胶记录系统对印迹进行成像。以15秒间隔捕获图像直到捕获到20幅图像或图像完全暴露，以先到者为准。代表性结果如图14A和14B所示。结果表明，所有经工程化的品系在它们的血清中表达可检测水平的含有人类Igλ轻链的抗体(图14，数据未示出)。
实施例5.具有经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物中的人类基因区段使用率
本实施例展示了被工程化为含有如本文所述的内源性Igλ轻链基因座的啮齿动物(如，小鼠)中表达的抗体轻链中的人类基因使用率。上文所述的选定的经工程化的啮齿动物品系中人类Igλ基因区段的使用率通过新一代测序抗体库分析来确定。
简而言之，从25个功能性人类Vλ基因区段、4个功能性人类Jλ-Cλ簇和小鼠Cλ1基因上游的人类Jλ7基因区段、以及插入小鼠Cλ1基因和内源性小鼠Igλ增强子3.1之间的人类Igλ增强子的插入片段的杂合子小鼠(图4中的6889杂合子小鼠)收集脾细胞。通过抗小鼠CD19磁珠和MACS柱(Miltenyi Biotech)从总脾细胞正向富集B细胞。使用RNeasy Plus试剂盒(Qiagen)从脾脏B细胞分离总RNA。
使用寡聚dT引物进行逆转录，然后使用SMARTerTMRACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)进行基因特异性PCR，以产生含有人类Igλ恒定区序列(Cλ1、Cλ2、Cλ3和Cλ6)的cDNA，以及含有小鼠Cλ1序列的cDNA。在逆转录期间，将特异性DNA序列(PIIA：5’-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3’，SEQ ID NO:133)连接至新合成的cDNA的3’末端。通过NucleoSpin凝胶和PCR净化试剂盒(Clontech)纯化cDNA，然后使用与人类Cλ特异性引物(5’-CACYAGTGTG GCCTTGTTGG CTTG-3’，SEQ ID NO:131)和小鼠Cλ1特异性引物(5’-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC-3’，SEQ ID NO:132)配对的PIIA反向互补引物(5’–AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACAT–3’)进一步扩增。
然后使用PIIA特异性引物(5’-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTAAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGT-3’，SEQ ID NO:134)和巢式人类Cλ特异性引物(5’-ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTCAGAGGA GGGCGGGAAC AGAGTG-3’，SEQ ID NO:135)或巢式小鼠Cλ1特异性引物(5’-ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTAAGGTGG AAACAGGGTGACTGATG-3’，SEQ ID NO:136)通过PCR扩增纯化的扩增子。通过Pippin Prep(SAGEScience)分离和收集450-690bp之间的PCR产物。使用以下引物通过PCR进一步扩增这些片段：5’-AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATC-3’，SEQ ID NO:137和5’-CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXG TGACTGGAGTTCAGACGTGT GCTCTTCCGA TCT-3’，SEQ ID NO:138(“XXXXXX”是使样品复用于测序的6bp索引序列)。通过Pippin Prep分离和收集490bp-710bp之间的PCR产物，然后使用KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems)通过qPCR进行定量，其后加载到MiSeq测序仪(Illumina)上进行测序(v3，600个循环)。
对于生物信息学分析，分离所得的Illumina序列并针对质量进行修剪。然后组装重叠双末端读取值并使用本地安装的igblast(NCBI,v2.2.25+)进行标注。将读取值与人类和小鼠生殖系Vλ和Jλ区段数据库比对，并分选出最佳命中值。当检测到具有相同得分的多个最佳命中值时，将序列标记为模糊并从分析中移除。开发一组perl脚本来分析结果并将数据存储在mysql数据库中。代表性结果如图15A(人类Cλ引发)和15B(小鼠Cλ引发)所示。
在另一个实验中，通过新一代测序抗体库分析(上文所述)对从6889靶向载体(6889HO/VI HO/Adam6 HO，参见上文)的插入的纯合子小鼠(n＝3)收集的脾脏B细胞进行人类Igλ基因区段的使用率分析。使用小鼠mCλ(n＝3)和人类hCλ(n＝3)恒定区的引物通过5’RACE对从脾脏B细胞分离的mRNA进行扩增，并使用MiSeq进行测序。代表性结果如图15C(人类Cλ引发)和15D(小鼠Cλ引发)所示。
使用6889靶向载体产生的小鼠(即，两种靶向载体和gRNA的共电穿孔)证明了全部25个功能性人类Vλ基因区段的表达。另外，与在人类脐带血中观察到的人类Vλ基因区段相比，来自这些小鼠的B细胞的人类Vλ基因区段的表达在分离的B细胞中展示出相似的频率。总之，本实施例展示出在生殖系基因组中含有如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座的啮齿动物在B细胞中表达含有人类Igλ序列的Igλ轻链。另外，此类人类Igλ序列可以在含有小鼠或人类Cλ域的轻链中容易地区分。
实施例6.经工程化的啮齿动物中的抗体产生
本实施例展示了使用所关注的抗原(例如，单次跨膜或多次跨膜蛋白等)在包含如上文所述的经工程化的内源性Igλ轻链基因座的啮齿动物中产生抗体。根据需要，本实施例中描述的方法，或本领域熟知的免疫方法，可用于用多肽或其片段(例如，来源于所需的表位的肽)或者多肽或其片段的组合免疫含有如本文所述的经工程化的内源性Igλ轻链基因座的啮齿动物。
使用本领域已知的免疫方法用所关注的抗原挑战具有如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座和人源化IgH基因座(上文所述)或如本文所述的经工程化的Igλ轻链基因座以及人源化IgH和Igκ轻链基因座(上文所述)的小鼠队列。通过ELISA免疫测定(即，血清滴定)监测抗体免疫应答。当实现所需的免疫应答时，收集脾细胞(和/或其他淋巴组织)并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保持其活力并形成永生化杂交瘤细胞系。对杂交瘤细胞系进行筛选(例如，通过ELISA测定)和选择，以鉴定产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞系。还可以根据需要表征杂交瘤的相对结合亲和力和同种型。使用该技术以及上文所述的免疫原，获得了多种抗原特异性嵌合抗体(即，具有人类可变域和啮齿动物恒定域的抗体)。
编码重链和轻链可变域的DNA可被分离并连接至重链和轻链的所需同种型(恒定域)，用于制备完全人类抗体。这种抗体蛋白可以在细胞(诸如CHO细胞)中产生。然后表征完全人类抗体对所关注的抗原的相对结合亲和力和/或中和活性。
编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变域的DNA可以直接从抗原特异性淋巴细胞分离。最初，分离具有人类可变域和啮齿动物恒定域的高亲和力嵌合抗体，并且对所需的特征(包括亲和力、选择性、表位等)进行表征和选择。用所需的人类恒定域替换啮齿动物恒定域，以生成完全人类抗体。虽然选定的恒定域可以根据特定用途而变化，但是高亲和力抗原结合和靶标特异性特征驻留在可变域中。还在不融合至骨髓瘤细胞的情况下，从抗原阳性B细胞(来自免疫的小鼠)直接分离抗原特异性抗体，如例如美国专利No.7,582,298中所述，该专利以引用的方式整体并入本文。使用这种方法，制备了几种完全人类抗原特异性抗体(即，具有人类可变域和人类恒定域的抗体)。
在一个实验中，通过足垫施用受体多肽的胞外域(ECD)来免疫6597het(n＝6)和6680het(n＝6)小鼠，以确定经工程化的小鼠中的免疫应答。
简而言之，用2.35μg抗原(受体多肽ECD)和10μg CpG佐剂(Invivogen ODN1826)初免小鼠。用2.35μg抗原(受体多肽ECD)、10μg CpG佐剂和25μg Adju-Phos(Brenntag)加强小鼠七次。在最终注射后两天，从选定的经工程化的小鼠品系和对照采血。使用Mictrotainer毛细采血管(BD目录#365967)在4℃下以9000rcf离心五分钟来从血液分离血清。进行血清ELISA测定以确定总IgG(图16A)、抗原特异性IgG(图16B)、mIgκ(图17C)mIgλ(图17B)和hIgλ(图17A)滴定度。
对于总IgG ELISA测定，用每孔1μg/mL溶于DPBS(含Ca和Mg)的山羊抗小鼠IgG+IgM+IgA H&L(Abcam)涂覆Maxisorp平板(Nunc)并在4℃下温育过夜。第二天，在PBS-T(无Ca或Mg的PBS+0.1％Tween-20)中洗涤平板四次，并在室温下含1％BSA的PBS-T中封闭一小时。在含0.1％BSA的PBS-T中稀释血清十倍(从1:100开始并以1:109结束)，并在含0.1％BSA的PBS-T中稀释小鼠IgG标准品(Sigma)三倍(从1μg/mL开始并以0.05ng/mL结束)。将100μl每种标准品和样品稀释物加入平板，并在室温下温育一小时，然后在PBS-T中洗涤四次。将100μl1:2500稀释的山羊抗小鼠IgG人类ads-HRP(Southern Biotech)加入每个孔，并温育平板一小时。在PBS-T中洗涤平板四次，将100μl TMB底物试剂(BD Biosciences)加入每个孔十分钟。每孔用100μl1N硫酸停止反应，并测量450nm下的吸光度。在GraphPad Prism中分析数据并拟合至四参数曲线。
对于抗原特异性ELISA，用每孔1μg/mL溶于DPBS(含Ca和Mg)的抗原涂覆Maxisorp平板(Nunc)并在4℃下温育过夜。第二天，在PBS-T中洗涤平板四次，并在室温下在PBS-T中1:2稀释的Sea Block(ThermoFisher)中封闭一小时。在PBS-T中1:5稀释的Sea Block中稀释血清(如上所述)。将每种样品稀释物加入每个平板，并在室温下温育一小时。然后在PBS-T中洗涤平板四次。将100μl1:2500稀释的山羊抗小鼠IgG人类ads-HRP(SouthernBiotech)、1:4000稀释的山羊抗mIgκ-HRP(Southern Biotech)、1:4000稀释的山羊抗mIgλ-HRP(Southern Biotech)或1:4000稀释的山羊抗hIgλ小鼠ads-HRP(Southern Biotech)加入每个孔，并温育平板一小时。在PBS-T中洗涤平板四次，并如上文所述进行显像。代表性结果如图16和17所示。
总之，本实施例特别展示了，工程化为含有如本文所述的Igλ轻链基因座的啮齿动物对所关注的抗原的免疫产生强烈抗体应答。另外，此类经工程化的啮齿动物展示出相当于野生型对照的总IgG和抗原特异性IgG水平，这证实了在这些经工程化的动物中产生强烈免疫应答的能力。实际上，在免疫时hIgλ滴定度比mIgλ滴定度更强(图17A和17B)。因此，如本文所述的经工程化的啮齿动物提供了产生用于开发基于人类抗体的治疗剂(具体地讲，采用人类Igλ轻链序列的基于人类抗体的治疗剂)的抗体的改进的体内系统。
等同物
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除非明确指出相反，否则说明书和权利要求中的冠词“一个”和“一种”应该理解为包括复数指代物。在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个或全部存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关，除非指出相反或根据上下文明显不同。本发明包括这样的实施方案，其中组中的一个确切成员存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关。本发明还包括这样的实施方案，其中多于一个组成员或全部组成员存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关。此外，应当理解，本发明涵盖所有的变化、组合和置换，其中来自一条或多条所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性用语等被引入从属于同一基础权利要求的另一个权利要求(或者相关的任何其他权利要求)中，除非另外指明或除非对于本领域的普通技术人员来说明显会引起矛盾或不一致。当要素以列表的形式(例如，以马库什组或类似形式)呈现时，应当理解这些要素的每个亚组也被公开，并且任何要素可从该组中去除。应当理解，通常，当本发明或本发明的方面被称为包含特定的要素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由此类要素、特征等组成或基本上由它们组成。为了简洁起见，这些实施方案并不是在每种情况下都用本文的那么多词语来具体描述。还应当理解，本发明的任何实施方案或方面可明确地从权利要求排除，不管在说明书中是否描述了此类具体排除。
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Claims (48)

1.一种制备小鼠的方法，所述方法包括修饰所述小鼠使其生殖系基因组中包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人类Vλ基因区段，
(b)一个或多个人类Jλ基因区段，和
(c)一个或多个人类Cλ基因区段，
其中(a)和(b)可操作地连接至(c)和小鼠Cλ基因区段，并且
其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个小鼠免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，并且其中所述小鼠表达免疫球蛋白λ轻链，所述免疫球蛋白λ轻链包含人类λ可变区，以及人类λ恒定区或小鼠λ恒定区。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个小鼠Eλ。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述两个小鼠Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括修饰所述小鼠以使其生殖系基因组中包含
(i)内源性免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白重链恒定区；或
(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，其包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白Cκ区。
6.根据权利要求5所述的方法，其中一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入替换小鼠VH、DH和JH基因区段。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述插入包括天然出现于人类VH、DH和JH基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
8.根据权利要求5所述的方法，其中一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入替换小鼠Vκ和Jκ基因区段。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包括天然出现于人类Vκ和Jκ基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白重链恒定区是内源性小鼠免疫球蛋白重链恒定区。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述小鼠Cκ区是内源性小鼠Cκ区。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含全部或部分的内源性Vλ和Jλ基因区段的缺失。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述小鼠Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的全部或部分的近端Vκ重复的插入。
15.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性小鼠Adam6基因。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种小鼠Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
17.根据权利要求5所述的方法，其中所述小鼠对于所述内源性免疫球蛋白重链基因座是纯合的。
18.根据权利要求5所述的方法，其中所述小鼠对于所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座是纯合的。
19.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述小鼠对于所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座是纯合的。
20.一种产生生殖系基因组包含经工程化的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的小鼠的方法，所述方法包括
(a)将DNA片段引入小鼠胚胎干细胞，所述DNA片段包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含
(i)一个或多个人类Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人类Jλ基因区段，和
(iii)一个或多个人类Cλ基因区段，
其中(i)-(iii)可操作地连接至小鼠Cλ基因区段，并且
其中所述核苷酸序列还包含一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)；
(b)获得(a)中生成的小鼠胚胎干细胞；以及
(c)使用(b)的小鼠胚胎干细胞产生小鼠，并且其中所述小鼠表达免疫球蛋白λ轻链，所述免疫球蛋白λ轻链包含人类λ可变区，以及人类λ恒定域或小鼠λ恒定区。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一个或多个人类Vλ基因区段包括Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个人类Vλ基因区段包括天然出现于人类Vλ5-52至Vλ1-40和/或Vλ3-27至Vλ3-1之间的人类非编码DNA。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人类Jλ基因区段和所述一个或多个人类Cλ基因区段包括人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和所述人类Jλ基因区段。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于所述人类Jλ和Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且所述人类Jλ基因区段包括天然出现于人类Jλ上游(或5’)的人类非编码DNA。
25.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述小鼠Cλ基因区段是小鼠Cλ基因区段。
26.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
27.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个小鼠Eλ。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述两个小鼠Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
29.一种在小鼠中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤
(a)用所关注的抗原免疫小鼠，所述小鼠具有包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的生殖系基因组，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含
(i)一个或多个人类Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人类Jλ基因区段，和
(iii)一个或多个人类Cλ基因区段，
其中(i)和(ii)可操作地连接至(iii)和小鼠Cλ基因区段，并且
其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座还包含：一个或多个小鼠免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)和一个或多个人类免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，并且其中所述小鼠表达免疫球蛋白λ轻链，所述免疫球蛋白λ轻链包含人类λ可变区，以及人类λ恒定域或小鼠λ恒定区；
(b)在足以使所述小鼠对所述所关注的抗原产生免疫应答的条件下维持所述小鼠；以及
(c)从所述小鼠或小鼠细胞回收结合所述所关注的抗原的抗体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含两个小鼠Eλ。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述两个小鼠Eλ是小鼠Eλ和小鼠Eλ3-1。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含三个人类Eλ。
33.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述小鼠在其生殖系基因组中还包括：
(i)内源性免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白重链恒定区；或
(ii)内源性免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入，所述人类VH、DH和JH基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白重链恒定区，以及内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，其包含一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入，所述人类Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白Cκ区。
34.根据权利要求33所述的方法，其中一个或多个人类VH基因区段、一个或多个人类DH基因区段和一个或多个人类JH基因区段的插入替换小鼠VH、DH和JH基因区段。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述插入包括天然出现于人类VH、DH和JH基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
36.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中一个或多个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的插入替换小鼠Vκ和Jκ基因区段。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包括天然出现于人类Vκ和Jκ基因区段以及它们的组合之间的人类非编码DNA。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白重链恒定区是内源性小鼠免疫球蛋白重链恒定区。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述小鼠Cκ区是内源性小鼠Cκ区。
40.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含全部或部分的内源性Vλ和Jλ基因区段的缺失。
41.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述小鼠Cλ基因区段是小鼠Cλ1基因区段。
42.根据权利要求33所述的方法，其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的全部或部分的近端Vκ重复的插入。
43.根据权利要求33所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座缺乏内源性小鼠Adam6基因。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座还包含编码一种或多种小鼠Adam6多肽的一个或多个核苷酸序列的插入。
45.根据权利要求33所述的方法，其中所述小鼠对于所述内源性免疫球蛋白重链基因座是纯合的。
46.根据权利要求33所述的方法，其中所述小鼠对于所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座是纯合的。
47.根据权利要求29所述的方法，其中所述小鼠对于所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座是纯合的。
48.一种制备小鼠的方法，包括修饰所述小鼠使其生殖系基因组中包含纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座，所述纯合的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座包含：
(i)人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1，
(ii)人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6，
(iii)人类Jλ基因区段Jλ7，和
(iv)三个人类免疫球蛋白λ轻链增强子；
其中(i)-(iv)彼此可操作地连接，并且(i)-(iii)在小鼠Cλ基因区段上游，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座缺乏内源性小鼠免疫球蛋白Eλ2-4，
所述人类Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40和Vλ3-27至Vλ3-1包括天然出现于所述人类Vλ基因区段之间的人类非编码DNA，
所述人类Jλ-Cλ基因区段对Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3和Jλ6-Cλ6包括天然出现于所述人类Jλ-Cλ基因区段对之间的人类非编码DNA，并且
所述人类Jλ基因区段Jλ7包括天然出现于人类Jλ7上游(或5’)的人类非编码DNA，并且其中所述小鼠表达免疫球蛋白λ轻链，所述免疫球蛋白λ轻链包含人类λ可变区，以及人类λ恒定域或小鼠λ恒定区。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2809150T3 (da) * 2012-02-01 2019-12-09 Regeneron Pharma Humaniserede mus, der udtrykker tungkæder indeholdende VL-domæner
WO2017095939A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
LT3407709T (lt) 2016-11-04 2020-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gyvūnai, išskyrus žmogų, turintys sukonstruotą imunoglobulino lambda lengvosios grandinės lokusą
RU2020131383A (ru) 2018-03-24 2022-04-26 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Генетически модифицированные животные, отличные от человека, для выработки терапевтических антител против комплексов пептид-mhc, способы их получения и варианты применения
MA52177A (fr) 2018-03-26 2021-02-17 Regeneron Pharma Rongeurs humanisés pour tester des agents thérapeutiques
SG11202012084WA (en) 2018-06-14 2021-01-28 Regeneron Pharma Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
BR112021016173A2 (pt) 2019-02-22 2021-11-03 Regeneron Pharma Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma
US20220369609A1 (en) * 2019-07-01 2022-11-24 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US20220090060A1 (en) 2020-09-11 2022-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
EP4262373A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
CN116635413A (zh) 2020-12-23 2023-08-22 再生元制药公司 用于获得结合跨膜蛋白的抗体的方法和生产所述抗体的细胞
KR20230125236A (ko) 2020-12-23 2023-08-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 앵커 변형된 항체를 암호화하는 핵산 및 이의 사용

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2124967C (en) * 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DK2319301T3 (en) 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
MXPA06000562A (es) * 2003-07-15 2006-03-30 Therapeutic Human Polyclonals Loci de inmunoglobulina humanizada.
RS52643B (en) 2006-06-02 2013-06-28 Regeneron Pharmaceuticals Inc. HIGH AFINITY ANTIBODIES TO THE HUMAN IL-6 RECEPTOR
KR101987351B1 (ko) 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
SG172176A1 (en) * 2008-12-18 2011-07-28 Univ Erasmus Medical Ct Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use therof
ES2965212T3 (es) * 2009-07-08 2024-04-11 Kymab Ltd Modelos de animales y moléculas terapéuticas
US20120204278A1 (en) * 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
WO2011115476A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 N.V. Nutricia Infant nutrition for improving fatty acid composition of brain membranes later in life
RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2019-06-28 Regeneron Pharma Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
DK2550363T3 (en) 2011-02-25 2015-03-23 Regeneron Pharma ADAM6 mice
RU2603090C2 (ru) 2011-10-17 2016-11-20 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина
US9253965B2 (en) * 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
MX356429B (es) * 2011-12-20 2018-05-29 Regeneron Pharma Ratones con cadena ligera humanizada.
RS57582B1 (sr) * 2013-02-20 2018-11-30 Regeneron Pharma Nehumane životinje sa modifikovanim sekvencama imunoglobulinskog teškog lanca
EP3561050B1 (en) 2013-02-20 2021-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
US9788534B2 (en) * 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP7133902B2 (ja) * 2013-10-01 2022-09-09 カイマブ・リミテッド 動物モデル及び治療用分子
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
ES2784754T3 (es) 2014-06-06 2020-09-30 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificar un locus objetivo
PL3155099T3 (pl) 2014-06-23 2018-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Łączenie dna mediowane nukleazą
LT3221457T (lt) 2014-11-21 2019-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nukreipiančios genetinės modifikacijos būdai ir kompozicijos, naudojant suporuotas kreipiančiąsias rnr sekas
NZ732895A (en) 2014-12-19 2022-05-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
LT3407709T (lt) 2016-11-04 2020-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gyvūnai, išskyrus žmogų, turintys sukonstruotą imunoglobulino lambda lengvosios grandinės lokusą

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Publication number Publication date
EP3407709A1 (en) 2018-12-05
RU2019112589A (ru) 2020-12-04
SI3407709T1 (sl) 2020-10-30
PL3407709T3 (pl) 2021-01-11
AU2017391167B2 (en) 2024-02-15
NZ753456A (en) 2021-08-27
LT3407709T (lt) 2020-10-12
MX2019005256A (es) 2019-08-05
EP4082334A1 (en) 2022-11-02
KR20210134059A (ko) 2021-11-08
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