RS59413B2 - Adam6 miševi - Google Patents

Adam6 miševi

Info

Publication number
RS59413B2
RS59413B2 RS20191337A RSP20191337A RS59413B2 RS 59413 B2 RS59413 B2 RS 59413B2 RS 20191337 A RS20191337 A RS 20191337A RS P20191337 A RSP20191337 A RS P20191337A RS 59413 B2 RS59413 B2 RS 59413B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
human
adam6
gene
mice
Prior art date
Application number
RS20191337A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45998616&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59413(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS59413B1 publication Critical patent/RS59413B1/sr
Publication of RS59413B2 publication Critical patent/RS59413B2/sr

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • B60H1/22—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices the heat being derived otherwise than from the propulsion plant
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • B60H1/32—Cooling devices
    • B60H1/3204—Cooling devices using compression
    • B60H1/3228—Cooling devices using compression characterised by refrigerant circuit configurations
    • B60H1/32281—Cooling devices using compression characterised by refrigerant circuit configurations comprising a single secondary circuit, e.g. at evaporator or condenser side
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • B60H1/32—Cooling devices
    • B60H1/3204—Cooling devices using compression
    • B60H1/323—Cooling devices using compression characterised by comprising auxiliary or multiple systems, e.g. plurality of evaporators, or by involving auxiliary cooling devices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • B60H1/00642—Control systems or circuits; Control members or indication devices for heating, cooling or ventilating devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • B60H1/00007—Combined heating, ventilating, or cooling devices
    • B60H1/00021—Air flow details of HVAC devices
    • B60H2001/00185—Distribution of conditionned air
    • B60H2001/00192—Distribution of conditionned air to left and right part of passenger compartment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating [HVAC] devices
    • B60H1/00007—Combined heating, ventilating, or cooling devices
    • B60H1/00021—Air flow details of HVAC devices
    • B60H2001/00185—Distribution of conditionned air
    • B60H2001/002—Distribution of conditionned air to front and rear part of passenger compartment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001 ] Opisani su genetički modifikovani miševi, ćelije embrioni i tkiva koja sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni ADAM6 lokus. Modifikacije obuhvataju humane i/ili humanizovane imunoglobulinske lokuse. Opisani su miševi kojima nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6, ali imaju ADAM6 funkciju, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6. Genetski modifikovani muški miševi koji imaju modifikaciju endogenog imunoglobulinskog VHlokusa koja utiče da miš nije u stanju da proizvodi funkcionalni ADAM6 protein i dovodi do gubitka plodnosti, a opisani su muški miševi koji imaju ADAM6 funkciju, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja vraća plodnost muškim miševima.
Stanje tehnike
[0002 ] U stanju tehnike su poznati miševi koji sadrže gene humanih antitela. Farmaceutska primena antitela u dve zadnje dekade je podstakla veliki broj ispitivanja u vezi sa pripremanjem antitela koja su pogodna za upotrebu kao humani lekovi. Prvi lekovi sa antitelima, koji su bazirani na antitelima miša, nisu bili idealni kao humani lekovi, jer učestalo davanje mišjih antitela ljudima je dovelo do imunogenosti koja može odvratiti od dugoročnih režima lečenja. Razvijena su rešenja koja su zasnovana na humanizaciji mišjih antitela da bi postala humanija i manje nalik mišjim. Postupci ekspresije humanih imunoglobulinskih sekvenci za upotrebu u antitelima koja slede, su uglavnom zasnovana na in vitro ekspresiji humanih imunoglobulinskih biblioteka u fagu, bakteriji ili kvascu. Na kraju, učinjeni su pokušaji da se učine korisnim humana antitela iz humanih limfocita in vitro, u miševima kojima su transplantirane humane hematopoetske ćelije i u transhromozomskim ili transgenim miševima sa onesposobljenim endogenim mišjim genima imunoglobulina. Kod transgenskih miševa, bilo je neophodno da se onesposobe mišji geni imunoglobulina tako da nasumično integrisani potpuno humani transgeni bi funkcionisali kao izvor imunoglobulinskih sekvenci eksprimovanih kod miševa. Takvi miševi mogu napraviti humana antitela pogodna za upotrebu kao humani lekovi, ali ovi miševi pokazuju znatne probleme sa svojim imunim sistemom. Ovi problemi (1) čine miševe nepraktičnim za stvaranje dovoljno raznovrsnog repertora antitela, (2) zahtevaju upotrebu obiminih ponovljenih inženjerskih prepravki, (3) obezbeđuju podoptimalni postupak selekcije klona usled nekompatibilnosti između humanih i mišjih elemenata, i (4) čine ove miševe nepouzadnim izvorom velike i različite populacije humanih varijabilnih sekvenci koje su zaista potrebne za pripremanje humanih lekova.
[0003 ] U stanju tehnike postoji potreba za pripremanje poboljšanih genetski modifikovanih miševa koji su korisni u stvarnju imunoglobulinskih sekvenci, uključujući sekvence humanih antitela. Takođe postoji potreba za miševima koji su u stanju da preurede segmente gena imunoglobulina da obrazuju korisne preuređene imunoglobulinske gene ili koji su u stanju da proizvode proteine iz izmenjenih imunoglobulinskih lokusa, dok u isto vreme se smanjuju ili eliminišu štetne promene koje mogu biti rezultat genetskih modifikacija.
Suština pronalaska
[0004 ] Pronalazak je definisan priloženim zahtevima
[0005 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju koja dovodi do nefunkcionalnog endogenog mišjeg proteina ADAM6 ili gena ADAM6 (npr. izbacivanje ('knokout') ili brisanje u endognenom genu ADAM6), gde miševi sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0006 ] Opisani su konstrukti nukleinskih kiselina, ćelije, embrioni, miševi i postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikacije endognog lokusa mišjeg imunoglobululina, gde miševi sadrže protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu. Endogeni lokus mišjeg imunoglobulina može biti lokus teškog lanca imunoglobulina i modifikacija može smanjiti ili eliminisati ADAM6 aktivnost ćelije ili tkiva muških miševa.
[0007 ] Opisani su miševi koji sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragmet; obezbeđeni su takođe miševi koji sadrže endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragmet, i bar jednu genetsku modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0008 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikacije endogenih lokusa mišjeg imunoglobulina, pri čemu miševi sadrže protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragmet koji je funkcionalan kod muškog miša. Na primer, miševi prema pronalasku mogu se dobiti, ovde opisanim postupcima.
[0009 ] Opisani su postupci za dobijanje miševa koji sadrže genetske modifikacije lokusa teškog lanca imunoglobulina, u kome primena postupaka koji dovode do muških miševa koji imaju modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina (ili je on izbrisan), a muški miševi su u stanju da stvore potomke parenjem. Muški miševi mogu biti u stanju da proizvode spermu koja je u stanju da pređe iz mišje materice kroz mišji jajovod da oplodi mišje jaje.
[0010 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su postupci za dobijanje miševa koji sadrže genetske modifikacije lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu primenjeni postupak dovodi do muških miševa koji sadrže modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina (ili je on izbrisan), pa muški miševi pokazuju smanjenu plodnost, a miševi sadrže genetski modifikaciju koja vraća u celini ili delom smanjenu plodnost. U različitim izvođenjima, smanjena plodnost je karakterisana nemogućnošću sperme muških miševa da prođe kroz matericu miša preko mišjih jajnika da oplodi mišje jaje. U različitim izvođenjima, smanjenje plodnosti je karakterisano spermom koja pokazuje in vivo migracioni nedostatak. U različitim izvođenjima, genetska modifikaciji koja vraća u celini ili delom smanjenje plodnosti je sekvenca nukleinske kiselina koja kodira mišji gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0011 ] U jednom izvođenju, genetska modifikacija obuhvata zamenu endogenih varijabilnih lokusa teškog lanca imunoglobulina sa varijabilnim lokusima teškog lanca humanog imunoglobulina. U jednom izvođenju, genetska modifikacija obuhvata umetanje ortolognih varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina u endogene varijabilne domene teškog lanca. imunoglobulina. U jednom izvođenju, genetska modifikacija obuhvata brisanje celog ili dela endogenog varijabilnog lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu brisanje dovodi do gubitka endogene ADAM6 funkcije. U specifičnom izvođenju, gubitak endogene ADAM6 funkcije je u vezi sa smanjenom plodnošću muških miševa.
[0012 ] Opisani su miševi koji imaju modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 iz endogenog ADAM6 alela tako da muški miševi koji imaju modifikaciju pokazuju smanjenu plodnost (npr. veoma smanjena sposobnost stvaranja potomaka parenjem) ili su u suštini neplodni, usled smanjenje ili eliminisane funkcije endogenog ADAM6, pri čemu miševi dalje imaju ektopičnu ADAM6 sekvencu ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragmet. Modifikacija koja smanjuje ili eliminiše mišju ADAM6 ekspresiju može biti modifikacija (npr. umetanje, brisanje, zamena itd.) u mišjem lokusu imunoglobulina .
[0013 ] Smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije može dovesti do nesposobnosti ili suštinske nesposobnosti miševa da proizvode spermu koja može putovati od mišje materice preko mišjih jajovoda da oplodi jaje miša. Bar oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ćelija sperme koji su proizvedene u ejakulacionoj zapremini miša mogu biti nesposobne da prođu kroz jajnik in vivo i izvrše spajanje i oplođene mišje jajne ćelije.
[0014 ] U jednom izvođenju, redukcija ili gubitak ADAM6 funkcije ima kao posledicu nesposobnost obrazovanja ili suštinsku nesposobnost obrazovanja kompleksa ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelija sperme miša. U jednom izvođenju, gubitak ADAM 6 funkcije može da obuhvata sušinsku nesposobnost oplođenja mišjeg jaja spajanjem sa ženskim mišem.
[0015 ] Opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, i sadrži protein (ili ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein) koja daje mišu ADAM6 funkcionalnost. Miš može biti muški miš i funkcionalnost obuhvata povećanu plodnost u poređenju sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen.
[0016 ] Protein može biti kodiran sa genomskom sekvencom smeštenom u okviru imunoglobulisnkog lokusa u germinativnoj liniji miša. Lokus imunoglobulina može biti lokus teškog lanca. Lokus teškog lanca može sadržati bar jedan humani VHbar jedan humani DHi bar jedan segmet JHgena. Ektopični protein može biti kodiran sa genomskom sekvencom koja je smeštena u neimunoglobulinskom lokusu u germinativnoj liniji miša. Neimunoglobulinski lokus je transkripciono aktivni lokus. Transkripciono aktivni lokus može biti ROSA26 lokus. Transkripciono aktivni lokus može biti u vezi sa ekspresijom specifičnog tkiva. Ekspresija specifična za tkivo može biti prisutna u reproduktivnom tkivu. Protein može biti kodiran sa genomskom sekvencom nasumično umetnutom u germinativnu liniju miša.
[0017 ] Miš može sadržati humani ili himerni humani/mišji ili himerni humani/pacovski laki lanac (npr. humani varijabilni, mišji ili pacovski konstantni) i himerni humani varijabilni/mišji ili pacovski konstantan teški lanac. Miš može sadržati transgen koji sadrži himerni humani varijabilni/pacovski ili mišji konstanti gen lakog lanca operativno vezan za transkripciono aktivni promoter, npr. promote ROSA26. Himerni humani/mišji ili pacovski transgen lakog lanca može sadržati preuređenu sekvencu varijabilnog regiona humanog lakog lanca u germinativnoj liniji miša.
[0018 ] Ektopična nukleotidna sekvenca može biti locirana unutar imunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Imunoglobulinski lokus može biti lokus teškog lanca. Lokus teškog lanca može sadržati bar jedan humani VHbar jedan humani DHi bar jedan humani JHsegment gena. Ektopična nukleotidna sekvenca može biti smeštena u okviru neimunoglobuliskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Neimunoglobulinski lokus može biti transkripcioni aktivni lokus. Transkripciono aktivni lokus može biti ROSA26 lokus. Ektopična nukleotidna sekvenca može biti smeštena tako što je nasumično umetnuta u germinativnu liniju miša.
[0019 ] Opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6, pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa gubitkom mišje ADAM6 funkcije. Ektopična nukleotidna sekvenca može davati mišu sposobnost da daje potomke koji se mogu upoređivati sa odgovarajućim prirodnim tipom ('wild-type') miša koji sadrži funkcionalni endogeni gen ADAM6. Sekvenca može davati mišu sposobnost da obrazuje kompleks ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelija sperme miša. Sekvenca može davati mišu sposobnost da pređe od mišje materice preko mišjih jajvovoda do mišjeg jaja i da oplodi jaje.
[0020 ] Mišu nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja može proizvoditi bar oko 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% od broja legala prirodnog miša iste starosti i vrste proizvedenih u vremenskom periodu od šest meseci.
[0021 ] Miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i ima ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja može proizvoditi bar 1.5-puta, oko 2 puta, oko 2.5 puta, oko 3 puta, oko 4 puta, oko 6 puta, oko 7 puta, oko 8 puta ili oko 10 puta ili više potomstva kada se uzgaja u vremenskom periodu preko šest meseci u odnosu na miša iste starosti i iste ili slične vrste kojoj nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca koja se uzgaja u toku suštinski istog vremenskog perioda i pod suštinski istim uslovima.
[0022 ] Miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja može proizvoditi prosečno bar oko 2 puta, 3 puta ili 4 puta veći broj štenadi po leglu u 4- ili 6-mesečnom periodu razmnožavanja nego mišu kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji nema ektopičnu nukleotidnu sekvencu i koji se razmnožava u istom vremenskom periodu.
[0023 ] Miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu može biti muški miš, i muški miš proizvodi spermu koja kada se regeneriše iz jajovoda posle oko 5-6 sati posle kopulacije odražava pokretljivost u jajnicima koja je bar 10 puta, bar 20 puta, bar 30 puta, bar 40 puta, bar 50 puta, bar 60 puta, bar 70 puta, bar 80 puta, bar 90 puta, bar 100 puta, bar 110 puta ili 120 puta ili viša u odnosu na miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji nema ektopičnu nukleotidnu sekvencu.
[0024 ] Miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu, kada se sparuje sa ženskim mišem može stvarati spermu koja je u stanju da pređe matericu i uđe i pređe jajnik u toku oko 6 sati sa efikasnošču koja je gotovo jednaka spermi prirodnog miša.
[0025 ] Miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu može proizvoditi oko 1.5 puta, oko 2 puta, oko 3-puta, ili oko 4-puta više legala u istom vremenskom periodu u poređenju sa mišem kome nedostaje funkcionali gen ADAM6 i koji nema ektopičnu nukleotidnu sekvencu.
[0026 ] Opisan je miš koji sadrži u svojoj germinativnoj liniji nemišju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski protein, pri čemu nemišja imunoglobulinska sekvenca sadrži umetnuti mišji gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Nemišja imunoglobulinska sekvenca može sadržati humanu sekvencu imunoglobulina. Sekvenca može sadržati humanu sekvencu teškog lanca imunoglobulina. Sekvenca može sadržati humanu sekvencu lakog lanca imunoglobulina. Sekvenca može sadržati jedan ili više V segmenata gena, jedan ili više D segmenata gena, i jedan ili više J segmenata gena; u jednom izvođenju, lista sekvenci sadrži jedan ili više V segmenata gena ili jedan ili više J segmenata gena. Jedan ili više V, D i J segmenata gena, ili jedan ili više V i J segmenata gena možda nisu preuređeni. Jedan ili više V, D i J segmenata gena, ili jedan ili više V i J segmenata gena mogu biti preuređeni. Posle preuređivanja jednog ili više V, D i J segmenata gena, ili jednog ili više V i J segmenata gena, miš može sadržati u svom genomu bar jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Posle preuređivanja miš može sadržati u svom genomu, bar dve sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mišji gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili fragment. Posle preuređivanja miš u svom genomu može sadržati bar jednu sekvencu nukleinske kiseline kodira mišji gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Miš može sadržati gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u B ćeliji. Miš može sadržati gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u ćeliji koja nije B-ćelija.
[0027 ] Opisan je miš koji eksprimuje humani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina ili njegov funkcionalni fragment iz endogenog mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina, gde miš ima i ADAM6 aktivnost koja je funkcionala kod muških miševa.
[0028 ] Muški miš može sadržati pojedinačni nemodifikovani endogeni alel ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment na endogenom lokusu ADAM6.
[0029 ] Muški miš može sadržati ektopičnu mišju sekvencu ADAM6 ili njegovog homologa ili ortologa ili funkcionalnog fragmenta koja kodira protein koji daje ADAM6 funkciju.
[0030 ] Muški miš može sadržati sekvencu ADAM6 ili njegovog homologa ili ortologa ili funkcionalnog fragmenta na mestu u mišjem genomu koji aprokisimira mestu endogenog mišjeg alela ADAM6, npr.
3' krajnjeg V segmenta gena i 5' od inicijalnog D segmenta gena.
[0031 ] Muški miš može sadržati sekvencu ADAM6 ili njegovog homologa ili ortologa ili funkcionalnog fragmenta u blizini ushodno, nizhodno, ili ushodno ili nizhodno (u odnosu na smer transkripcije sekvence ADAM6) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira varijabilan segment gena imunoglobulina. Varijabilni segment gena imunoglobulina može biti humani segment gena. Varijabilni segment gena imunoglobulina može biti humani segment gena i sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment funkcionlan u mišu može biti u položaju između humanog V segmenata gena; miš može imati dva ili više humana V segmenata gena, i sekvenca može biti u položaju između krajnjeg V segmenta gena i pretposlednjeg V segmenta gena; sekvenca može biti u položaju koji je posle krajnjeg V segmenta gena i prvog D segment gena.
[0032 ] Opisan je muški miš koji sadrži nefunkcionalni endogeni gen ADAM6, ili je endogeni gen ADAM6 izbrisan, u njegovoj germinativnoj liniji; pri čemu ćelije sperme miša su u stanju da prođu kroz jajovod ženskog miša i oplode jaje. Miš može sadržati ekstrahromozomalnu kopiju mišjeg gena ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionlani fragment koji je funkcionalan u muškom mišu. Miš može sadržati ektopični mišji gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0033 ] Opisani su miševi koji sadrže genetsku modifikaciju koja smanjuje mišju ADAM6 funkciju, pri čemu miš sadrži bar nešto do ADAM6 funkcionalnosti koja je obezbeđena ili endogenim nemodifikovanim alelom koji je funkcionalan u celini ili delom (npr. heterozigot) ili ekspresijom ektopične sekvence koja kodira ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0034 ] Miš može imati ADAM6 funkciju koja je dovoljna da da muškim miševima sposobnost stvaranja potomaka parenjem, u poređenju sa muškim miševima kojima nedostaje funkcija ADAM6. Funkcija ADAM6 može biti prisutna usled pristustva ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. ADAM6 homolozi ili ortolozi ili njegovi fragmenti koji su funkcionalni u muškom mišu obuhvataju one koje vraćaju, delom ili u potpunosti, izgubljenu sposobnost stvaranja potomaka primećenu kod muških miševa kojima nedostaje dovoljno endogene mišje ADAM6 aktivnosti, npr. gubitak sposobnosti primećene kod ADAM6 'knockout' miševa. U ovom smislu ADAM 'knockout' miševi obuhvataju miševe koji sadrže endogeni lokus ili njegov fragmet, ali koji nije funkcionalan tj. ne eksprimuje uopšte ADAM 6 (ADAM6a i/ili ADAM6b), ili koji eksprimuje ADAM 6 (ADAM6a i/ili ADAM6b) u količini koja nije dovoljna da podrži esencijalnu normalnu sposobnost stvaranja potomaka prirodnih muških miševa. Gubitak funkcije može biti usled, npr. modifikacije u strukturi lokusa gena (tj. u ADAM6a ili ADAM6b kodirajućem regionu) ili u regulatornom reginonu lokusa (npr. u sekvenci 5` do ADAM6a gena ili 3` ADAM6a ili ADAM6b kodirajućem regionu, gde sekvenca kontroliše, u celini ili delom, transkripcju gena ADAM6, ekspresiju ADAM6 RNK ili ekspresiju proteina ADAM6). U različitim izvođenjima, njegovi ortolozi ili homolozi ili fragmenti koji su funkcionalni u muškom mišu su oni koji omogućavaju da sperma muškog miša (ili veći deo ćelija sperme u ejakulatu muškog miša) pređe mišji jajnik i oplodi mišju jajnu ćeliju.
[0035 ] Muški miš koji eksprimuje humani varijabilni region imunoglobulina ili njegov funkcionalni fragment može imati dovoljno ADAM6 aktivnosti da da muškim miševima sposobnost da stvaraju potomke parenjem sa ženskim miševima, muški miš može pokazivati sposobnost stvaranja potomaka kada se pare sa ženskim miševima koja može biti bar 25%, bar 30%, bar 40%, bar 50%, bar 60%, bar 70%, bar 80%, bar 90%, i gotovo ista kao, ona miševa sa jednim ili dva endogena nemodifikovana alela ADAM6.
[0036 ] Muški miševi mogu eksprimovati dovoljno ADAM6 (ili njegovog ortologa ili homologa ili funkcionalnog fragmenta) da bi se osposobila ćelija sperme iz muškog miša da pređe jajnik ženskog miša i oplodi mišje jaje.
[0037 ] ADAM6 funkcionalnost može poticati od sekvence nukleinske kiseline koja se graniči sa mišjom hromozomalnom sekvencom (npr. nukleinska kiselina je nausmično integrisana u mišji hromozom; ili smeštena na specifičnu lokaciju npr. ciljanjem nukleinske kiseline u određenu lokaciju, npr. umetanjem ili homolognom rekombinacijom posredstvom rekombinaza specifičnih za mesto (npr. Creposredovanje)). Sekvenca ADAM6 može biti prisustna u nukleinskoj kiselini koja je različita od hromozoma miša (npr. sekvenca ADAM6 je prisutna na epizomu, tj. ekstrahromozomalno, npr. u ekspresionom konstruktu, vektoru, YAC, transhromozomu, itd.).
[0038 ] Opisani su genetički modifikovani miševi i ćelije koje sadrže modifikaciju endogenih lokusa teškog lanca imunoglobulina gde miševi eksprimuju bar deo sekvence teškog lanca imunoglobulina, npr. bar deo humane sekvence, gde miš ima ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod muškog miša. Modifikacija može smanjiti ili izbrisati ADAM6 aktivnost miša. Miš može biti modifikovan tako da oba alelela koji kodiraju ADAM6 aktivnost su ili odsutna ili eksprimuju ADAM6 koji u suštini ne funkcioniše tako da podržava normalno parenje muških miševa. Miš može dalje sadržati ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišjii ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment.
[0039 ] Opisani su genetički modifikovani miševi i ćelije koje sadrže modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina, gde modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost eksprimovanu od lokusa ADAM6 sekvence i gde miš sadrži ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. Protein ADAM6 ili njegov fragment mogu biti kodirani ektopičnom sekvencom ADAM6. Protein ADAM6 ili njegov fragment mogu biti eksprimovani iz endogenog alela. ADAM6 Miš može sadržati prvi alel teškog lanca imunoglobulina koji sadrži prvu modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 iz prvog alela teškog lanca imunoglobulina i miš sadrži drugi alel teškog lanca imunoglobulina koji sadrži drugu modifikaciju koja u suštini ne smanjuje ili ne eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 iz drugog alela teškog lanca imunoglobulina.
[0040 ] Druga modifikacija može biti smeštena na 3` (u odnosu na transkripconu usmerenost mišjeg V segmenta gena) krajnjeg mišjeg V segmenta gena i smešten na 5` (u odnosu na transkripcionu usmerenost konstantne sekvence) miša (ili himerni humani/mišji) konstantan gen teškog lanca imunoglobulina ili njegovog fragmenta (npr. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani i/ili mišji: CH1 i/ili zglobni (`hinge') i/ili CH2 i/ili CH3).
[0041 ] Modifikacije mogu biti na prvom alelu teškog lanca imunoglobulina, na prvom lokusu koji kodira prvi alel ADAM6 i funkcija ADAM6 potiče od ekspresije endogenog ADAM6 na drugom alelu teškog lanca imunoglobulina na drugom lokusu koji kodira funkcionalni ADAM6, pri čemu drugi alel teškog lanca imunoglobulina sadrži bar jednu modifikaciju V, D i/ili J segmenta gena. Bar jedna modifikacija V, D i / ili J segmenta gena može biti brisanje, zamena sa humanim V, D ili J segmentom gena, zamena sa kamiljim V, D ili J segmentom gena, zamena sa humanizovanim ili kamilizovanim V, D ili J segmentom gena, zamena sekvence teškog lanca sa sekvencom lakog lanca i njihova kombinacija. Bar jedna modifikacija može biti brisanje jednog ili više V, D i/ili J segmenata gena teškog lanca i zamena sa jednim ili više V i/ili J segmenata gena lakog lanca (npr. humani V i/ili J segment gena lakog lanca) na lokusu teškog lanca.
[0042 ] Modifikacija može biti na prvom alelu teškog lanca imunoglobulina na prvom lokusu i drugom alelu teškog lanca imunoglobulina na drugom lokusu, i funkcija ADAM6 može poticati od ekspresije ektopičnog ADAM6 na neimunoglobulinskom lokusu u germinativnoj liniji miša. Neimunoglobulinski lokus može biti lokus ROSA26. Neimunoglobulinski lokus može biti transkripciono aktivan u reproduktivnom tkivu.
[0043 ] Opisan je miš koji sadrži heterozigotni ili homozigotni 'knockout' ADAM6. Miš može dalje sadržati modifikovanu imunoglobulinsku sekvencu koja je humana ili humanizovana imunoglobulinska sekvecna ili kamilja ili kamilizovana humana ili mišja imunoglobulinska sekvenca. Modifikovane imunoglobulinske sekvence mogu biti prisutne na endogenim mišjim lokusima teškog lanca imunoglobulina. Modifikovane imunoglobulinske sekvence mogu sadržati humanu varijabilnu sekvencu gena teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina. Humana varijabilna sekvenca gena teškog lanca može zameniti endogenu mišju varijabilnu sekvencu gena teškog lanca na endogenom lokusu teškog lanca mišjeg imunoglobulina.
[0044 ] Opisan je miš koji nije u stanju da eksprimuje funkcionalni endogeni ADAM6 iz endogenonog mišjeg lokusa ADAM6. Miš može sadržati ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment, koji je funkcionalan u mišu. Ektopična nukleotidna sekvenca može kodirati protein koji spašava gubitak sposobnosti stvaranja potomaka dokazane od strane muškog miša koji je homozigitan za ADAM6 `knockout'. Ektopična nukleotidna sekvenca može kodirati mišji protein ADAM6.
[0045 ] Opisan je miš koji nema funkcionalni endogeni lokus ADAM6, i koji sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja daje miševima ADAM6 funkciju. Sekvenca nukleinske kiseline može sadržati endogenu mišju sekvencu ADAM6 ili njegovog funkcionalnog fragmenta. Endogena mišja sekvenca ADAM6 može sadržati ADAM6a- i ADAM6b-kodirajuće sekvence smeštene u prirodnom mišu između 3` najvišeg mišjeg V segmenta gena teškog lanca imunoglobulina (VH) i 5`-najvišeg mišjeg D segmenta gena teškog lanca imunoglobulina (DH).
[0046 ] U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira mišji ADAM6a ili njegov funkcionalni fragment i/ili sekvencu koja kodira mišji ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu ADAM6a i/ili ADAM6b ili njegov funkcionalni(e) fragment(i) je(su) operativno vezan(i) za promoter. U jednom izvođenju, promoter je humani promoter. U jednom izvođenju, promoter je mišji promoter ADAM6. U specifičnom izvođenju, promoter ADAM6 sadrži sekvencu lociranu između prvog kodona prvog gena ADAM6 najbližeg mišjem 5`-najvišeg DHsegmenta gena i rekombinantne signalne sekvencu 5`-najvišeg DHsegmenta gena, gde 5` je označen u odnosu na smer transkripcije mišjih gena imunoglobulina. U jednom izvođenju, promoter je virusni promoter. U specifičnom izvođenju, virusni promoter je citomegalovirusni (CMV) promoter. U jednom izvođenju, promoter je ubikvitin promoter.
[0047 ] U jednom izvođenju, promoter je inducibilni promoter. U jednom izvođenju inducibilni promoter reguliše ekspresiju nereproduktibilnih tkiva. U jednom izvođenju, inducibilni promoter reguliše ekspresiju u reproduktivnim tkivima. U specifičnom izvođenju, ekspresija mišjih sekvenci ADAM6a i/ili ADAM6b ili njihovih funkcionalnih fragmenata je razvojno regulisana sa inducibilnim promoterom u reproduktivnim tkivima.
[0048 ] U jednom izvođenju, mišji ADAM6a i/ili ADAM6b su izabrani iz ADAM6a SEQ ID NO: 1 i/ili ADAM6b sekvence SEQ ID NO:2. U jednom izvođenju, mišji ADAM6 promoter je promoter SEQ ID NO:3. U specifičnom izvođenju mišji ADAM6 promoter sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO:3 direktno ushodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6) prvog kodona ADAM6a i proteže se do kraja SEQ ID NO:3 nizhodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. U još jednom specifičnom izvođenju, ADAM6 promoter je fragment koji se proteže od između oko 5 do oko 20 nukleotida ushodno od start kodona ADAM6a na oko 0.5 kb, 1 kb, 2 kb ili 3 kb ili više ushodno od start kodona ADAM6a.
[0049 ] U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO:3 ili njen fragment koji je zatim smešten u miša koji je neplodan ili koji ima slabu plodnost usled nedostatka ADAM6, poboljšanju plodnost ili povraćenu plodnost do oko prirodne plodnosti. U jednom izvođenju, SEQ ID NO:3 ili njen fragment daje muškom mišu sposobnost da proizvodi ćeliju spreme koja je u stanju da pređe jajnik ženskog miša u cilju oplođenja mišjeg jaja.
[0050 ] Opisan je miš koji ima izbrisanu endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein ADAM6, zamenu endogenih mišjih VHsegmenata gena sa humanim VHsegmentom gena i ektopiču nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0051 ] Miš može sadržati lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži izbrisanu endogenu nukleotidnu sekvencu lokusa imunoglobulina koja sadrži endogeni ADAM6 gen, koji može saddržatinukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više humanih segmenata gena imunoglobulina i gde ektopična nukleotidna sekvenca kodira mišji protein ADAM6 koji je unutar ili direktno pored nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih segmenata gena imunoglobulina.
[0052 ] U mišu mogu biti zamenjeni svih ili suštinski svih endogenih VHsegmenata gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih se VHsegmenata gena i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 može bitit unutar ili direktno pored nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih VHsegmenata gena. Miš može dalje sadržati zamenu jednog ili više endogenih DHsegmenata gena sa jednim ili više humanih DHsegmenata gena na endogenom DHlokusu gena. Miš može dalje sadržati zamenu jednog ili više JHsegmenata gena sa jednim ili više humanih JHsegmenata gena na endogenom JHlokusu gena. Miš može sadržati zamene svih ili suštinski svih endogenih VH, DH, i JHsegmenata gena i zamene na endogenim VH, DH, i JHlokusima gena sa humanim VH, DH, i JH, segmentima, gde miš sadrži ektopičnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 protein. Ektopična sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 može biti smeštena između pretposlednjeg 3’-najvišeg VHsegmenta gena humanih VHsegmenata gena prisutnih i krajnjeg 3’ VHsegmenta gena prisutnih humanih VHsegmenata gena. Miš može imati izbrisane sve ili suštinski sve mišje VHsegmente gena i zamenjene sve ili suštinski sve sa humanim VHsegmenatima gena i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 koji može biti smešten nizhodno od humanog genskog segmenta VH1-2 i ushodno od humanog genskog segmenta VH6-1.
[0053 ] U mišu mogu biti zamenjeni svi ili u suštini svi endogeni VHsegmenti gena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VHsegmenata gena i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 koji može biti unutar ili direktno pored nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih VHsegmenata gena.
[0054 ] Ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 može biti prisutna na transgenu u genomu miša. Ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein može biti prisutna u ekstrahromozomalno u mišu.
[0055 ] Opis je miš koji sadrži modifikacije endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina, gde miš eksprimuje B ćelije koje sadrže preuređenu sekvencu imunoglobulina operativno vezanu za konstantni region genske sekvence teškog lanca i B ćelije je sadrže u svom genomu (npr., na hromozomu B ćelija) gen koji kodira ADAM6 njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu. Preuređivanje imunoglobulinske sekvence operativno vezane za konstantni region sekvence gena teškog lanca može sadržati humanu V, D, i/ili J sekvencu teškog lanca; mišju V, D, i/ili J sekvencu teškog lanca; humanu ili V i/ili J mišju sekvencu lakog lanca. Konstanti region genske sekvence teškog lanca
1
može sadržati humanu ili mišju sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koju čine, CH1, zglob (`hinge`), CH2, CH3,i njihova kombinacija.
[0056 ] Opisan je genetički modifikovan miš, pri čemu miš ima funkcionalno isključeni gen lakog lanca imunoglobulina i još sadrži zamenjen jedan ili više endogenih varijabilnih regiona segmenata gena teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više humanih varijabilnih regiona segmenata gena teškog lanca imunoglobulina, gde mišu nedostaje funkcionalni endogeni lokus ADAM6, i gde miš ima ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimuje mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0057 ] Opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni mišji lokus ADAM6 ili sekvenca koja sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji lokus ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment mišjeg lokusa ADAM6 ili sekvence, pri čemu je miš u stanju da se pari sa mišem suprotnog pola da bi se dobio potomak koji sadrži ektopični lokus ADAM6 ili sekvencu. Miš može biti muški. Miš može biti ženski.
[0058 ] Opisan je genetički modifikovani miš, gde miš sadrži humani varijabilni region segmenta gena teškog lanca imunoglobulina na endogenom mišjem varijabilnom regionu lokusa gena teškog lanca imunoglobulina, mišu nedostaje endogena funkcionalana sekvenca ADAM6 na endogenom mišjem varijabilnom regionu lokusa gena teškog lanca imunoglobulina, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimuje protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0059 ] Ektopična nukleotidna sekvenca koja eksprimuje mišji protein ADAM6 može biti ekstrahromozomalna. Ektopična nukleotidna sekvenca koja eksprimuje mišji protein ADAM6 može biti integrisana u jedan ili više lokusa u genomu miša. Jedan ili više lokusa mogu obuhvatati lokuse imunoglobulina.
[0060 ] Opisan je miš koji eksprimuje sekvencu teškog lanca imunoglobulina iz modifikovanog endogenog mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu teški lanac potiče od humanog V segmenta gena, D segmenta gena i J segmenta gena, pri čemu miš ima ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mišu.
[0061 ] Miš može imati veliki broj humanih V segmenata gena, veliki broj D segmenata gena i veliki groj J segmenata gena. D segmenti gena mogu biti humani D segmenti gena. J segmenti gena mogu biti humani J segmenti gena. Miš još može sadržati humanizovanu sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, gde humanizacija obuhvata zamenu sekvence izabrane od CH1, zglobnog regiona ('hinge'), CH2, CH3, i njihove kombinacije. Teški lanac može poticati iz humanog V segmenta gena, humanog D segmenta gena, humanog J segmenta, humane CH1 sekvence, humane ili mišje sekvence zgloba, mišje CH2 sekvence, i mišje CH3 sekvence. Miš može dalje sadržati konstantnu sekvencu humanog lakog lanca.
[0062 ] D segment gena može biti okružen 5’ (u odnosu na transkripcioni smer D segmenta gena) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu .
[0063 ] U jednom izvođenju, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mišu dovodi do ekspresije nukleotidne sekvence smeštene 5’ od 5’-najvišeg D segmenta gena i 3’ od 3’-najvišeg V segmenta gena (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) modifikovanog endogenog mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0064 ] U jednom izvođenju, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mišu dovodi do ekspresije nukleotidne sekvence smeštene između dva humana V segmenta gena u modifikovanom endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, dva humana V segmenta gena su humani VH1-2 segmenti gena i VH6-1 segmenti gena.
[0065 ] U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca između dva humana V segmenta gena je smeštena u suprotnom smeru od pravca transkripcije u odnosu na humane V segmente gena. U specifičnom izvođenju, nukleotidna sekvenca kodira, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije gena ADAM6, i sekvence ADAM6a iza koje sledi sekvenca ADAM6b.
[0066 ] Miš može sadržati zamenu humane pseudogene sekvence ADAM6 između humanih V segmenata gena VH1-2 i VH6-1 sa mišjom ADAM6 sekvencom ili njegovim funkcionalnim fragmentom.
[0067 ] U jednom izvođenju, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mišu je mišja sekvenca ADAM6 ili njegovog funkcionalnog fragmenta .
[0068 ] Opisan je miš koji sadrži endogeni mišji DFL16.1 segment gena (npr., u mišu heterozigotnom za modifikovani endogeni mišji lokus teškog lanca imunoglobulina), ili humani DH1-1 segment gena. D segment gena teškog lanca imunoglobulina eksprimovan u mišu može poticati od endogenih mišjih DFL16.1 segmenata gena ili humanog DH1-1 segmenta gena.
[0069 ] Opisan je miš koji sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funcionalni fragment) u ćelijama koje nose DNK nepreuređene B ćelijske linije, ali ne sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortholog ili funkcionalni fragment) u B ćeliji koja sadrži preuređene imunoglobulinske lokuse, gde se sekvenca nukleinske kiseline kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) javlja u genomu u položaju koji je različit od položaja u kome se javlja mišji gen ADAM6 u prirodnom mišu. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) može biti prisutna u svim ili suštinski svim ćelijama koje imaju DNK koje nisu B ćelije preuređene linije; sekvenca nukleinske kiseline može biti prisutna u germinativnim ćelijama miša, ali ne u hromozomu preuređene B ćelije.
[0070 ] Opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment ) u svim ili suštinski svim ćelijama koje nose DNK, uključujući B ćelije koje sadrže preuređene imunoglobulinske lokuse, u kojima sekvenca nukleinske kiseline kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) koja se javilja u genomu je u položaju koji je različit od položaja u kome se javlja mišji gen ADAM6 u prirodnom mišu. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) može biti na nukleinskoj kiselini koja je susedna sa preuređenom imunoglobulinskim lokusom. Nukleinska kiselina koja je susedna imunoglobulinskom lokusu može biti hromozom. Hromozom je hromozom koji može biti nađen u prirodnom mišu i hromozom sadrži modifikacije mišjeg imunoglobulinskog lokusa .
[0071 ] Opisan je genetski modifikovani miš, gde miš sadrži B ćeliju koja u svom genomu sadrži sekvencu ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa.
[0072 ]Sekvenca ADAM6 ili njegovog orthologa ili homologa može biti lokus teškog lanca imunoglobulina. Sekvenca ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa može biti na lokusu koji nije imunoglobulinski lokus. Sekvenca ADAM6 može biti na transgenu pokrenutom sa heterolognim promoterom. Heterologni promoter može biti neimunoglobulinski promoter. B ćelije mogu eksprimovati protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog.
[0073 ] 90% ili više B ćelija miša mogu sadržati gen koji kodira protein ADAM6 ili njegov ortolog ili njegov homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u mišu. Miš može biti muški miš.
[0074 ] Genom B ćelije može sadržati prvi alel i drugi alel koji sadrže sekvencu ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa. Genom B ćelija može sadržati prvi alel, ali ne i drugi alel koji sadrži sekvencu ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog.
[0075 ]Opisan je miš koji sadrži modifikaciju jednog ili više endogenih alela.
[0076 ] Modifikacija može činiti miša nesposobnim da eksprimuje funkcionalni protein ADAM6 iz bar jednog od jednog ili više endogenih alela ADAM6. Miš može da nije u stanju da eksprimuje funkcionalni protein ADAM6 sa svakog od endogenih alela ADAM6.
[0077 ] Miševi mgu biti nesposobni da eksprimuju funkcionalni protein ADAM6 sa svakog endogenog alela ADAM6, i miševi sadrže ektopičnu sekvencu ADAM6.
[0078 ] Miševi mogu biti nesposobni da eksprimuju funkcionalni protein ADAM6 sa svakog endogenog alela ADAM6, i miševi mogu sadržati ektopičnu sekvencu ADAM6 smeštenu unutar 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više kb ushodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa teškog lanca) mišjeg konstantnog regiona sekvence teškog lanca imunoglobulina. Ektopična sekvenca ADAM6 može biti na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina (npr., u intergenskom V-D regionu, između dva V segmenta gena, između V i D segmenta gena, između D i J segmenta gena, itd.). Ektopična sekvenca ADAM6 može biti smeštena između 90 do 100 kb intergenske sekvence između krajnjih mišjih V segmenata gena i prvog mišjeg D segmenta gena. Endogena 90 do 100 kb intergenska sekvenca V-D može biti uklonjena, i ektopična sekvenca ADAM6 može biti smeštena između krajnjeg V i prvog D segmenta gena.
[0079 ] Opisan je neplodan muški miš, gde miš ima izbrisana dva ili više endogena alela ADAM6. Obezbeđen je ženski miš koji je nosilac osobine muške neplodnosti, gde ženski miš ima u svojoj germinativnoj liniji nefunkcionalni alel ADAM6 ili izbačen ('knockout') endogeni alel ADAM6.
[0080 ] Opisan je miš kome nedostaje endogeni V, D, i J segment gena teškog lanca imunoglobulina, gde većina B ćelija miša sadrži sekvencu ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa.
[0081 ] Mišu mogu nedostajati endogeni segmenti gena teškog lanca imunoglobulina izabrani od dva ili više V segmenata gena, dva ili više D segmenta gena, dva ili više J segmenata gena i njihove kombinacije. Mišu mogu nedostajati segmenti gena teškog lanca imunoglobulina izabrani od bar jednog do 89 segmenata V gena, bar jednog do 13 D segmenata gena, bar jednog do četiri J segmenata gena, i njihove kombinacije. U jednom izvođenju, mišu nedostaje fragment genomske DNK iz
1
hromozoma 12 koji sadrži oko tri megabaze endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina. Mišu mogu nedostajati svi funkcionalni endogeni V, D, i J segmenti gena teškog lanca. Mišu mogu nedostajati 89 VHsegment gena, 13 DHsegment gena i četiri JHsegmenta gena.
[0082 ] Opisan je miš, gde miš ima genom u germinativnoj liniji koji sadrži modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina, gde modifikacija lokusa teškog lanca imunoglobulina obuhvata zamenu jedne ili više mišjih sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina sa jednom ili više nemišjih sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina, i gde miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji protein ADAM6. Sekvence DHi JHi bar 3, bar 10, bar 20, bar 40, bar 60, ili bar 80 VHsekvenci lokusa teškog lanca imunoglobulina su poželjno zamenjene sa nemišjim sekvencama varijabilnog regiona imunoglobulina. DH, JH, i sve VHsekvence lokusa teškog lanca imunoglobulina su poželjno zamenjene sa nemišjim sekvencama varijabilnog regiona imunoglobulina. Nemišje sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina mogu biti nepreuređene. Nemišje sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina poželjno sadrže kompletne nepreuređene DHi JHregione bar 3, bar 10, bar 20, bar 40, bar 60, ili bar 80 nepreuređenih VHsekvenci nemišjih vrsta. Nemišje sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina poželjno sadrže kompletni varijabilni region, uključujući sve VH, DHi JHregione nemišjih vrsta. Nemišja vrsta može biti Homo sapiens i nemišja sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina može biti humana sekvenca.
[0083 ] Opisan je miš koji eksprimuje antitelo koje sadrži bar jedan humani varijabilan domen/nehumani konstantni domen polipeptida imunoglobulina, gde miš eksprimuje mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog sa lokusa koji je drugačiji od lokusa imunoglobulina.
[0084 ] Protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog može biti eksprimovan u B ćeliji miša, gde B ćelija sadrži preuređenu sekvencu imunoglobulina koja sadrži humanu varijabilnu sekvencu i nehumanu konstantnu sekvencu.
[0085 ] Nehumana konstantna sekvenca može biti sekvenca glodara. Glodar može biti izabran od miša, pacova ili hrčka.
[0086 ] Opisan je postupak za dobijanje neplodnih muških miševa, koji obuhvata činjenje endogenog ADAM6 alela donora ES ćelije nefunkcionalnim (ili izbacivanje pomenutog alela), uvođenje donora ES ćelije u embrion domaćina, gestacija embriona domaćina u surogat majci, i omogućavanje majci da rodi potomka koji potiče ceo ili delom od donora ES ćelije. Postupak može dalje obuhvatati ukrštanje potomaka da bi se dobio neplodni muški miš.
[0087 ] Opisan je postupak za dobijanje miša sa genetskom modifikacijom koja je od interesa, gde je miš neplodan, postupak obuhvata korake (a) pravljena genetske modifikacije od interesa u genomu; (b) modifikovanje genoma da se izbaci endogeni alel ADAM6, ili učini endogeni alel ADAM6 nefukcionalnim; i, (c) korišćenje genoma u dobijanju miša. Genom može biti od ES ćelije ili je korišćen u eksperimentu nuklearnog transfera.
[0088] Opisan je miš napravljen korišćenjem ciljnog vektora, nukleotidnog konstrukta ili ćelije kako je ovde opisano .
[0089] Opisan je potomak parenja miša ovde opisanog sa drugim mišom koji je prirodni miš ili genetički modifikovan.
[0090] Opisan je postupak održavanja mišje vrste, gde mišji soj ima zamenjenu mišju sekvencu teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više heterolognih sekvenci teškog lanca imunoglobulina. Jedna ili više heterolognih sekvenci teškog lanca imunoglobulina mogu biti humane sekvence teškog lanca imunoglobulina.
[0091] Mišji soj može sadržati izbrisane jedan ili više mišjih VH, DH, i/ili JHsegmenata gena. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži jedan ili više humanih VHsegmenata gena, jedan ili više humanih DHsegmenata gena , i/ili jedan ili više humanih JHsegmenata gena. Miš može još sadržati bar 3, bar 10, bar 20, bar 40, bar 60, ili bar 80 human VHsegmenata, bar 27 humanih DHsegmenata gena, bar šest JHsegmenata gena. Miš može sadržati bar 3, bar 10, bar 20, bar 40, bar 60, ili bar 80 humanih VHsegmenata, bar 27 humanih DHsegmenata gena, i bar šest JHsegmenata gena operativno vezanih za konstantni region gena. Konstantni region gena može biti mišji konstantni region gena. Konstantni region gena može sadržatimišju sekvencu konstantnog regiona gena izabranu od CH1, regiona zgloba, CH2, CH3, i/ili CH4 ili njihove kombinacije.
[0092] Opisan je postupak koji obuhvata stvaranje heterozigotnog muškog miša za zamenu sekvence teškog lanca imunoglobulina, i ukrštanje heterozigotnog muškog miša sa prirodnim ženskim mišem ili ženskim mišem koji je homozigotan ili heterozigotan za humanu sekvencu teškog lanca imunoglobulina. Postupak može sadržati održavanje soja ponovljenim ukrštanjem heterozigotnih mužjaka sa ženkama koje su prirodne ili homozigotne ili heterozigotne za humanu sekvencu teškog lanca.
[0093] Postupak može obuhvatati nabavljanje ćelija od muškog ili ženskog miša homozigotnog ili heterozigotnog za humanu sekvencu teškog lanca, i korišćenje ovih ćelija kao ćelija donora ili njihovih nukleusa kao donora nukleusa i korišćenje ćelija ili nukleusa da se naprave genetički modifikovane životinje koristeći ćelije domaćina i/ili gestacije ćelija i/ili nukleusa u surogat majkama.
[0094] Samo muški miševi koji su heterozigotni za zamenu lokusa teškog lanca mogu biti ukrštani sa ženskim miševima. Ženski miševi mogu biti homozigotni, heterozigotni ili prirodni u odnosu na zamenjeni lokus teškog lanca.
[0095] Miš može dalje sadržati zamenjenu varijabilnu sekvencu λ i/ili κ lakog lanca na endogenom lokusu lakog lanca imunoglobulina sa heterolognim sekvencama lakog lanca imunoglobulina. Heterologne sekvence lakog lanca imunoglobulina mogu biti humane varijabilne sekvence λ i/ili κ lakog lanca imunoglobulina.
[0096] Miš može dalje sadržati transgen na lokusu koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina, gde transgen sadrži sekvencu koja kodira preuređenu ili nepreuređenu heterolognu sekvencu λ ili κ lakog lanca (npr., nepreuređen VLi nepreuređen JL, ili preuređen VJ) operativno vezan (za nepreuređenu) ili spojen (za preuređenu) sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina. Heterologna sekvenca λ ili κ lakog lanca može biti humana. Sekvenca konstantnog regiona može biti izabrana od glodara, čoveka, nehumanog primata. Sekvenca konstantnog regiona može biti izabrana od miša, pacova i hrčka. Transgen može sadržati neimunoglobulinski promoter koji pokreće ekspresiju sekvenci lakog lanca. Promoter može biti transkripcioni aktivni promoter. Promoter može biti ROSA26 promoter.
1
[0097] Opisan je konstrukt nukleinske kiseline, koji sadrži homologni krak ushodno i homologni krak nizhodno, gde homologni krak ushodno sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična humanoj ili mišjoj sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina, homologni krak nizhodno je identičan ili suštinski identičan humanoj ili mišjoj sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina, a između homolognih krakova ushodno i nizhodno nalazi se sekvenca koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6. Sekvenca koja kodira mišji gen ADAM6 može biti operativno vezana za mišji promoter pomoću koga je mišji ADAM6 vezan u prirodnom mišu.
[0098] Opisan je ciljni vektor, koji sadrži (a) nukleotidnu sekvencu koja je identična ili suštinski identična sa humanom nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona segmenta gena; i, (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mišu.
[0099] Ciljni vektor može dalje sadržati promoter operativno vezan za sekvencu koja kodira mišji ADAM6. U specifičnom izvođenju, promoter je mišji ADAM6 promoter.
[0100] Opisan je nukleotidni konstrukt za modifikovanje mišjeg varijabilnog lokusa teškog lanca imunoglobulina, gde konstrukt sadrži bar jedno mesto prepoznavanja specifične rekombinaze za prepoznavanje mesta i sekvencu koja kodira protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mišu.
[0101] Opisane su mišje ćelije i mišji embrioni, uključujući ali bez ograničenja ES ćelije, pluripotente ćelije i indukovane pluripotentne ćelije, koje sadrže genetske modifikacije koje su ovde opisane. Obezbeđene su ćelije koje su XX i ćelije koje su XY . Ćelije koje sadrže nukleuse koji sadrže modifikaciju koja je ovde opisana su takođe obezbeđene, npr. modifikaciju unetu u ćeliju pronuklearnom injekcijom. Ćelije, embrioni i miševi koji sadrže virusno unete ADAM6 gene su takođe obezbeđeni, npr., ćelije, embrioni, i miševi koji sadrže transdukcioni konstrukt koji sadrži gen ADAM6 koji je funkcionalan u mišu.
[0102] Opisana je genetički modifikovana mišja ćelija, gde ćeliji nedostaje funkcionalan endogeni mišji lokus ADAM6, i ćelija sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment. Ćelija može dalje sadržati modifikaciju endogene varijabilne sekvence gena imunoglobulina. Modifikacija engogene varijabilne sekvence gena teškog lanca imunoglobulina može sadržatii brisanje izabrano od brisanja mišjeg VHsegmenta gena, brisanja mišjeg DHsegmenta gena, brisanja mišjeg JHsegmenta gena, i njihove kombinacije. Miš može sadržati zamenu jednog ili više mišjih VH, DH, i/ili JHsekvenci sa humanim sekvencama imunoglobulina. Humana sekvenca imunoglbulina može biti izabrana od humane VH, humane VL, humane DH, humane JH, humane JL, i njihove kombinacije.
[0103] Ćelija može biti totipotentna, pluripotentna ćelija, ili indukovana pluripotentna ćelija. Ćelija može biti mišja ES ćelija.
[0104] Opisana je B ćelija, gde mišja B ćelija sadrži preuređeni gen teškog lanca imunoglobulina, gde B ćelija sadrži na hromozomu B ćelije sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu. Mišja B ćelija sadrži dva alela sekvence nukleinske kiseline.
1
[0105] Sekvenca nukleinske kiseline može biti molekul nukleinske kiseline (npr., hromozom B ćelije) koji je susedan preuređenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina.
[0106] Sekvenca nukleinske kiseline može biti molekul nukleinske kiseline (npr., hromozom B ćelije) koji se razlikuje od molekula nukleinske kiseline koji sadrži preuređeni mišji lokus teškog lanca imunoglobulina.
[0107] Mišja B ćelija može sadržati preuređenu nemišju varijabilnu sekvencu gena imunoglobulina operativno vezanu za mišji ili humani konstantni region gena imunoglobulina, gde B ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu.
[0108] Opisana je somatska ćelija, koja sadrži hromozom koji sadrži modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu. Sekvenca nukleinske kiseline može biti na istom hromozomu kao modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina. Nukleinska kiselina može biti na različitom hromozomu u odnosu na modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina. Somatska ćelija može sadržati jednu kopiju sekvence nukleinske kiseline. Somatska ćelija može sadržati bar dve kopije sekvence nukleinske kiseline. Somatska ćelija može biti B ćelija. Ćelija može biti germinativna ćelija. Ćelija može biti stem ćelija.
[0109] Opisana je mišja germinativna ćelija, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) na hromozomu germinativne ćelije, gde sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) je u položaju u hromozomu koji je drugačiji od položaja u hromozomu germinativne ćelije prirodnog miša. Sekvenca nukleinske kiseline može biti na mišjem lokusu imunoglobulina. Sekvenca nukleinske kiseline može biti na istom hromozomu germinativne ćelije mišjeg lokusa imunoglobulina. Sekvenca nukleinske kiseline može biti na različitom hromozomu germinativne ćelije u odnosu na mišji lokus imunoglobulina. Mišji lokus imunoglobulina može sadržati zamenu bar jedne mišje sekvence imunoglobulina sa bar jednom nemišjom sekvencom imunoglobulina. Bar jedna nemišja sekvenca imunoglobulina može biti humana sekvenca imunoglobulina.
[0110] Opisana je pluripotentna, indukovana pluripotentna, ili totipotentna ćelija koja potiče iz miša kako je ovde opisano. Ćelija može biti mišja embrionska stem (ES) ćelija.
[0111] Obezbeđeno je tkivo koje potiče iz miša kako je ovde opisano. Tkivo može poticati iz slezine, limfnog čvora ili koštane srži kao što je ovde opisano.
[0112] Obezbeđen je nukleus koji potiče od miša kako je ovde opisano. Nukleus može biti iz diploidne ćelije koja nije B ćelija.
[0113] Opisana je nukleotidna sekvenca kodira varijabilni region imunoglobulina napravljena u mišu kako je ovde opisano.
[0114] Opisana je amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina ili lakog lanca imunoglobulina antitela napravljenog u mišu kako je ovde opisano.
1
[0115] Opisana je nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina ili lakog lanca imunoglobulina koja kodira varijabilni region antitela napravljenog u mišu kako jeovde opisano.
[0116] Opisano je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen (npr., Fab, F(ab)2, scFv) napravljeno u mišu kako je ovde opisano. Opisan je postupak za dobijanje genetski modifikaovanog miša, koji obuhvata zamenu jednog ili više segmenata gena teškog lanca imunoglobulina ushodno (u odnosu na transkripciju segmenata gena teškog lanca imunoglobulina) endogenog ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više humanih segmenata gena teškog lanca imunoglobulina i zamenu jednog ili više segmenata gena imunoglobulina nizhodno (u odnosu na transkripciju segmenata gena teškog lanca imunoglobulina) lokusa ADAM6 miša sa jednim ili više humanih segmenata gena teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina . Jedan ili više humanih segmenata gena imunoglobulina zamenjuju jedan ili više endogenih segmenata gena imunoglobulina ushodno od endogenog lokusa ADAM6 miša koji može sadržati V segmente gena. Humani segmenti gena imunoglobulina zamenjuju jedan ili više endogenih segmenata gena imunoglobulina ushodno od lokusa ADAM6 miša uključuju V i D segmente gena. Jedan ili više humanih segmenata gena imunoglobulina zamenjuju jedan ili više endogenih segmenata gena imunoglobulina nizhodno od endogenog lokusa ADAM6 miša mogu sadržati J segmente gena. Jedan ili više humanih segmenata gena imunoglobulina zamenjuje jedan ili više endogenih segmenata gena imunoglobulina nizhodno endogenog lokusa ADAM6 miša mogu sadržati D i J segmente gena. Jedan ili više humanih segmenata gena imunoglobulina zamenjuje jedan ili više endogenih segmenata gena imunoglobulina nizhodno od endogenog lokusa ADAM6 miša mogu sadržati V, D i J segmente gena.
[0117] Jedan ili više segmenata gena teškog lanca imunoglobulina ushodno i/ili nizhodno od gena ADAM6 može biti zamenjeno u pluripotentnoj, indukovanoj pluripotentnoj, ili totipotentnoj ćeliji da bi se obrazovala genetički modifikovana progenitorska ćelija; genetički modifikovana progenitorska ćelija je uneta u domaćina; i domaćin koji ima genetički modifikovanu progenitorsku ćeliju može biti u gestaciji da bi se obrazovao miš koji sadrži genom koji potiče od genetički modifikovane progenitorske ćelije. Domaćin može bitiembrion. Domaćin može biti izabran od miša pre-morule (npr., 8-ili 4-stadijum ćelije), tetraploidnog embriona, agregata embrionskih ćelija ili blastocista.
[0118] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za dobijanje genetički modifikovanog miša, koji obuhvata zamenu mišje nukleotidne sekvence koja sadrži mišji segment gena imunoglobulina i mišju neukelotidnu sekvencu ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili fragment funkcionalan u muškom mmišu) sa sekvencom koja sadrži segment gena imunoglobulina da bi se obrazovao prvi himerni lokus, zatim umetanje sekvence koja sadrži mišju kodirajuću sekvencu ADAM6 (ili sekvencu koja kodira njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment ) u sekvencu koja sadrži humani segment gena imunoglobulna da bi se obrazovao drugi himerni lokus.
[0119] Drugi himerni lokus sadrži humani VHsegment gena operativno vezan za humani DHsegment gena i humani JHsegment gena. U drugom specifičnom izvođenju, drugi himerni lokus je operativno vezan za treći himerni lokus koji sadrži humanu sekvencu CH1, ili humanu CH1 i humanu zglobnu sekvencu, spojenu sa mišjom sekvencom CH2 CH3.
[0120] Opisana je upotreba miša koja obuhvata ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji lokus ADAM6 ili sekvencu koja čini muške miševe plodnim, gde upotreba obuhvata parenje miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koji sadrži mišji lokus ADAM6 ili sekvencu, sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni mišji lokus ADAM6 ili sekvenca, i dobijanje potomka koji je ženski u stanju da
1
dobija potomstvo koje sadrži ektopčni lokus ADAM6 ili sekvencu ili koji je muški koji sadrži ektopički lokus ADAM6 ili sekvencu, i muški ispoljava plodnost koja je približno ista kao plodnost koju pokazuju muški prirodni miševi.
[0121] Opisana je upotreba miša kako je ovde opisano da bi se napravila nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina.
[0122] Opisana je upotreba miša kao što je ove opisano da se napravi potpuno humani Fab ili potpuno humani F(ab)2.
[0123] Opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano da se napravi imortalizovana ćelijska linija.
[0124] Opisana je upotreba miša kao što je odve opisano da se dobije hibridoma ili kvadroma.
[0125] Opisana je upotreba miša kako je ovde opisano da se napravi bibloteka faga koja sadrži varijabilne regione humanog teškog lanca i varijabilne regione humanog lakog lanca.
[0126] Opisana je upotreba miša kako je ovde opisano uz stvaranje sekvence varijabilnog regiona za dobijanje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizaciju miša koja je ovde oipsana sa antigenom od interesa, (b) izolovanje limfocita iz imuniziranog miša iz (a), (c) izlaganje limfocita jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikovanje limfocita koji su u stanju da se vežu za antigen od interesa, i (e) pojačavanje jednog ili više varijabilnih regiona sekvence nukleinske kiseline iz limfocita na taj način stvarajući varijabilnu sekvencu regiona.
[0127] Limfocit može da potiče iz slezine miša. Limfocit može da potiče iz limfnog čvora miša. Limfocit može da potiče iz koštane srži miša.
[0128] Obeleženo antitelo može biti antitelo konjugovano sa floroforom. Jedno ili više antitela konjugovano sa fluoroforom može biti izabrano od IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.
[0129] Limfocit je B ćelija.
[0130] Jedan ili više varijabilnih regiona sekence nukleinske kiseline može sadržati varijabilni region sekvence teškog lanca. Jedan ili više varijabilnih regiona sekvence nukleinske kiseline može sadržati varijabilni region sekvence lakog lanca. Varijabilni region sekvence lakog lanca može biti varijabilni region sekvence κ lakog lanca imunoglobulina. Jedan ili više varijabilnih regiona sekvence nukleinske kiseline može sadržati varijabilni region sekvence teškog lanca i κ lakog lanca .
[0131] Opisana je upoteba miša kako je ovde opisano za dobijanje varijabilnog regiona sekvence teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizaciju miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) izolovanje slezine iz imuniziranog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz slezine jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikovanje B limfocita iz (c) koji su u stanju da se vežu za antigen od interesa, i (e) pojačavanje nukleinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita na taj način stvarajući varijabilne regione sekvenci teškog lanca i κ lakog lanca.
[0132] Opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje varijabilnog regiona sekvence teškog lanca i κ lakog lanca za dobijanje humanih antitela, koja obuhvata (a) imunizaciju miša kako je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) izolovanje jednog ili više limfnih čvorova iz imuniziranog
1
miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz jednog ili više limfnih čvorova jenom ili više obeleženih antitela, (d) identifikovanje B limfocita iz (c) koji je u stanju da se veže za antigen od interesa, i (e) pojačavanje varijabilnog regiona sekvence nukleinske kiseline teškog lanca i varijabilnog regiona sekvence nukleinske kiseline κ lakog lanca iz B limfocita na taj način stvarajući varijabilne regione sekvenci teškog lanca i κ lakog lanca.
[0133] Opisana je upoteba miša kao što je ovde opisano za stvaranje varijabilnog regiona sekvence teškog lanca i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizaciju miš kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) izolovanje koštane srži iz imuniziranog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz koštane srži jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikovanja B limfocita iz (c) koji je u stanju da se veže za antigen od interesa, i (e) pojačavanje varijabilnog regiona sekvence nukleinske kiseline teškog lanca i varijabilnog regiona sekvence nukleinske kiseline κ lakog lanca iz B limfocita na taj način stvarajući varijabilne regione sekvenci teškog lanca i κ lakog lanca. Jedno ili više obeleženih antitela može biti izabrano od IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.
[0134] Opisana je upotreba kao što je ovde opisano stvaranja varijabilnog regiona sekvence teškog i κ lakog lanca za dobijenje humanog antitela, koja dalje obuhvata spajanje pojačane sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca sa humanim sekvencama konstantnog regiona lakog i teškog lanca, eksprimujući spojene sekvence lakog i teškog lanca u ćeliji, i regenerisanje eksprimovanih sekvenci teškog i lakog lanca na taj način stvarajući humano antitelo.
[0135] Humani konstantni regioni teškog lanca mogu biti izabrani od IgM, IgD, IgA, IgE i IgG. IgG može biti izabran od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Humani konstanti regioni teškog lanca mogu sadržati CH1, zglob, CH2, CH3, CH4, ili njihovu kombinaciju. Konstantni region lakog lanca može biti konstantni region κ imunoglobulina. Ćelija može biti izabrana od HeLa ćelije, DU145 ćelije, Lncap ćelije, MCF-7 ćelije, MDA-MB-438 ćelije, PC3 ćelije, T47D ćelije, THP-1 ćelije, U87 ćelije, SHSY5Y (humanog neuroblastoma) ćelije, Saos-2 ćelije, Vero ćelije, CHO ćelije, GH3 ćelije, PC12 ćelije, humane ćelije retine (npr., PER.C6TM ćelije), i MC3T3 ćelije. Ćelija može biti CHO ćelija.
[0136] Opisana je postupak za stvaranje reverznih himernih antitela glodara i čoveka specifičnih protiv antigena od interesa, koji sadrži korak imunizacije miša kao što je ovde opisano sa antigenom, izolovanje bar jedne ćelije iz miša koja proizvodi reverzno himerno antitelo miša i čoveka specifično protiv antigena, kultivisanje bar jedne ćelije koja proizvodi reverzno himerno mišje i humano antitelo specifično protiv antigena i dobijanje pomenutog antitela.
[0137] Reverzno himerno antitelo miša i čoveka može sadržati humani varijabilni domen teškog lanca spojena sa mišjim ili glodarskim konstantnim regionom teškog lanca, i humani varijabilni domen lakog lanca spojen sa konstantim genom mišjeg ili pacovskog ili humanog lakog lanca.
[0138] Kultivisanje bar jedne ćelije koja proizvodi reverzno himerno antitelo glodara i čoveka specifično protiv antigena može biti pripremljeno na bar jednoj ćeliji hidbridoma koja potiče iz bar jedne ćelije izolovane iz miša.
[0139] Opisana je postupak za stvaranje potpuno humanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji obuhvata korake imunizacije miša kako je ovde opisano sa antigenom, izolovanje bar jedne ćelije iz miša koja proizvodi reverzno himerno antitelo glodara i čoveka specifično protiv antigena, stvaranjem bar jedne ćelije koja proizvodi potuno humano antitelo koje potiče iz reverzno
2
himernog antitela glodara i čoveka specifičnog protiv antigena, i kultivisanje bar jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo i dobijanje potpuno humanog antitela.
[0140] Bar jedna ćelija izolovana iz miša proizvodi reverzno himerno antitelo čoveka i glodara specifično protiv antigena može biti spelnocit ili B ćelija.
[0141] Antitelo može biti monoklonalno antitelo.
[0142] Imunizacija sa antigenom od interesa može biti izvedena sa proteinom, DNK, kombinacijom DNK i proteina, ćelija koje eksprimuju antigen.
[0143] Opisana je upotreba miša kako je ovde opisano da se napravi sekvenca nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region imunoglobulina ili njegovog fragmenta. Sekvenca nukleinske kiseline može biti korišćena da se napravi humano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. Može biti korišćen miš da se napravi protein koji se vezuje za antigen izabran od antitela, antitela koje je višestruko specifično (npr., bi-specifičnog antitela), scFv, bi-specifični scFv, diatela, triatela, tetratela, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (tj., dualnog varijabilnog domena proteina koji se vezuje za antigen), SVD (tj., pojedinačni varijabilni domen proteina koji se vezuje za antigen), ili bispecifična angažovana T-ćelija (BiTE).
[0144] Opisana je upotreba miša kao što je opisano da se unese ektopična sekvenca ADAM6 u miša kome nedostaje funkcionalna endogena sekvenca ADAM6, gde upotreba obuhvata parenje miša kao što je opisano sa mišem kome nedostaje funkcionalna endogena sekvenca ADAM6.
[0145] Opisana je upotreba genetskog materijala iz miša kao što je ovde opisano za dobijanje miša koji ima ektopičnu sekvencu ADAM6. Upotreba može obuhvatato nuklearni transfer pomoću nukleusa ćelija miša kao što je ovde opisano. Upotreba može obuhvatati kloniranje ćelije miša kao što je ovde opisano da bi se dobila životinja koja potiče iz te ćelije. Upotreba može obuhvatati korišćenje sperme ili jaja miša kao što je ovde opisano u postupku dobijanje miša koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6.
[0146] Opisan je postupak pripremanja plodnog muškog miša koji sadrži modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata oplođavanje prve mišje germinativne linije koja sadrži modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina sa drugom germinativnom linjom koja sadrži gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u muškom mišu; obrazovanje oplođene ćelije; omogućavanje da se oplođena ćelija razvije u embrion; i gestacija emriona u surogat majci da bi se dobio miš.
[0147] Oplođenje može biti postignuto parenjem muškog miša i ženskog miša. Ženski miš može da sadrži gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment. Muški miš može da sadrži gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment.
[0148] Opisana je upotreba sekvence nukleinske kiseline koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili functionalni fragment odgovarajućeg proteina ADAM6 za vraćanje ili poboljšavanje plodnosti miša koji ima genom koji sadrži modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina, gde modifikacija smanjuje ili eliminše endogenu ADAM6 funkciju.
[0149] Sekvenca nukleinske kiseline može biti integrisana u genom miša u ektopičnom položaju. Sekvenca nukleinske kiseline može biti integrisana u genom miša u endogenom lokusu imunoglobulina. Endogeni lokus imunoglobulina može biti lokus teškog lanca. Sekvenca nukleinske kiseline može biti integrisana u genom miša u položaju koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina.
[0150] Opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za proizvodnju leka (npr., proteina koji se vezuje za antigen), ili za proizvodnju sekvence koja kodira varijabilnu sekvencu leka (npr., proteina koji se vezuje za antigen), za lečenje humane bolesti ili poremećja.
Kratak opis slika nacrta
[0151]
SLIKA 1A je opšti prikaz, ali ne u srazmeri, direkne zamene u genomu oko tri megabaze (Mb) mišjeg varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina (zatvoreni simboli („closed symbols“)) sa oko jednom megabazom humanog varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina (otvoreni simboli („open symbols“)).
SLIKA 1B je opšti prikaz, ali ne u srazmeri, direktne zamene u genomu oko tri megabaze (Mb) mišjeg varijabilnog lokusa gena κ lakog lanca imunoglobulina (zatvoreni simboli) sa oko 0.5 megabaze (Mb) prvog, ili proksimalnog, od dva gotovo identična ponavljanja humanog varijabilnog lokusa gena κ lakog lanca imunoglobulina (otvoreni simboli).
SLIKA 2A je detaljni prikaz, ali ne u srazmeri, tri početna koraka (A-C) direktne zamene u genomu miša varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina koji dovodi do brisanja svih mišjih VH, DHi JHsegmenata gena i zamenu sa tri humana VH, svim humanih DHi JHsegmentima gena. Prikazan je ciljni vektor za prvo umetanje humanog segmenta gena teškog lanca imunoglobulina (3hVHBACvec) sa 67 kb 5’ mišjim homolognim krakom, selekcionom kasetom (otvorenim pravougaonikom), mestom za mesto specifičnu rekombinaciju (otvoreni trougao), 145 kb humanim genomskim fragmentom i 8 kb 3’ mišjim homolognim krakom. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) segmenti gena imunoglobulina, dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonicu) i mesta za mesto specifičnu rekombinaciju (otvoreni trouglovi) umetnuti u sledeće ciljne vektore.
SLIKA 2B je detalji prikaz , ali ne u srazmeri, šest dodatnih koraka (D-I) za direktnu zamenu u genomu mišjeg varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina koja dovodi do umetanja 77 dodatna humanih VHsegmenata gena i uklanjanje krajnje selekcione kasete. Ciljni vektor za umetanje dodatnih humanih VHsegmenata gena (18hVH BACvec) do inicijalnog umetanja humanih segmenata gena teškog lanca (3hVH-CRE hibridni alel) je prikazan sa 20 kb 5’ mišjim homolognim krakom, selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), 196 kb humanog genomskog fragmenta i 62 kb humanog homolognog krakom koji se preklapa sa 5’ krajem inicijalnih umetnutih humanih segmenata gena teškog lanca koji je prikazan sa mestom za mesto specifičnu rekombinaciju (otvoreni trougao) smeštenim na 5’ humane segmenate gena. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) segmenti gena imunoglobulina i dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) umetnuti sa sledećim ciljnim vektorima.
SLIKA 2C prikazuje detaljni prikaz, ali ne u srazmeri, tri početna stupnja (A-C) za usmeravanje genomske zamene mišjeg varijabilnog lokusa gena κ lakog lanca imunoglobulina koji dovodi do brisanja svih mišjih Vκ, i Jκ segemanata gena (Igκ-CRE hibridni alel). Prikazane su selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesta za mesto specifičnu rekombinaciju (otvoreni trouglovi) umetnuta iz ciljnih vektora.
SLIKA 2D je detaljni prikaz, ali ne u srazmeri, pet dodatnih koraka (D-H) za direktnu genomsku zamenu mišjeg varijabilnog lokusa gena κ lakog lanca imunoglobulina koji dovodi do umetanja svih humanih Vκ i Jκ segmenata gena proksimalnog ponavljanja i brisanja krajnje selekcione kasete (40hVκdHyg hidbridnog alela). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) segmenata gena imunoglobulina i dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) umetnuti naknadnim ciljnim vektorima.
SLIKA 3A je opšti prikaz, ali ne u srazmeri, strategije skrininga uključujući mesta kvantitativnih PCR (qPCR) prajmera/setova proba da bi se detektovalo umetanje humanih sekvenci gena teškog lanca i gubitak mišjih sekvenci gena teškog lanca u ciljanim embrionskim stem (ES) ćelijama. Strategija skrininga u ES ćelijama i miševima za prvo humano umetanje gena teškog lanca je pokazana sa qPCR prajmerom/setovima proba za izbrisani region ("izgubljene" probe C i D), umetnuti region ("hlgH" probe G i H) i obližnje regione ("retencione" probe A, B, E i F) na nemodifikovanom mišjem hromozomu (vrh) i pravilno ciljanom hromozomu (dno).
SLIKA 3B prikazuje reprezentativna izračunavanja primećenog broja kopija proba kod roditeljskih i modifikovanih ES ćelija za prvo umentanje humanih segmenata gena teškog lanca. Primećeni broj kopija proba A do F je bio izračunat kao 2/2ΔΔCt. ΔΔCT je izračunat kao ave[ΔCt(uzorak) - medΔCt(kontrola)], gde je ΔCt razlika u Ct između testiranih i referentnih proba (između 4 i 6 referentnih proba u zavisnosti od testa). Izraz medΔCt(kontrola) je srednja vrednost ΔCt višestrukih (>60) neciljanih DNK uzoraka za roditeljske ES ćelije. Svaki modifikovani klon ES ćelije je testiran u šest kopija. Da bi se izračunali brojevi kopija IgH proba G i H u roditeljskim ES ćelijama, za ove probe se smatra da imaju broj kopija 1 u modifikovanim ES ćelijama i maksimalan Ct od 35 je bio korišćen mada nije primećeno pojačanje.
SLIKA 3C prikazuje reprezentativno izračunavanje broja kopija za četiri miša svakog genotipa izračutih korišćenjem samo proba D i H. Prirodni tip miša: WT miševi; Miševi heterozigotni za prvo umetanje humanih segmenata gena imunoglobulina: HET mišvi; Miševi homozigotni za prvo umetanje humanih segmenata gena imunoglobulina: Homo miševi.
SLIKA 4A je detaljni prikaz, ali ne u srazmeri, korišćena tri koraka za konstrukciju 3hVHBACvec sa bakterijskom homolognom rekombinacijom (‚bacterial homologous recombination‘ - BHR). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) segmenati gena imunoglobulina, selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesta za mesto specifičnu rekombinaciju (otvoreni trouglovi) umetnuti iz ciljnog vektora.
SLIKA 4B prikazuje gel elektroforezu u pulsnom polju (‚pulse-field gel electrophoresis‘ -PFGE) tri klona BAC (B1, B2 i B3) posle digestije sa Notl. Markeri M1, M2 i M3 su niskog opsega, srednjeg opsega i lamda stepeničasti PFG markeri, respektivno (New England BioLabs, Ipswich, MA).
SLIKA 5A prikazuje šematski prikaz, ali ne u srazmeri, sekvencijalnih modifikacija mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina sa povećanim količinama humanih segmenata gena teškog lanca
2
imunoglobulina. Napravljeni su homozigotni miševi iz svakog od tri različita stadijuma humanizacije teškog lanca. Otvoreni simboli pokazuju humanu sekvencu; zatvoreni simboli prikazuju mišju sekvencu.
SLIKA 5B je šematski prikaz, ali ne u srazmeri, modifikacija sekvenci mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina sa povećanim količinama humanih segmenata gena κ lakog lanca imunoglobulina. Homozigotni miševi su napravljeni iz svakog od tri različita stupnja humanizacije κ lakog lanca. Otvoreni simboli ukazuju na humanu sekvencu; zatvoreni simboli ukazuju na mišju sekvencu.
SLIKA 6 prikazuje FACS tačkaste dijagrame populacije B ćelija u miševima prirodnog tipa i VELOCIMMUNE®humanizovanim miševima. Ćelije iz slezine (gornji red, treći red od vrha i donji red) ili limfni čvorovi iz prepona (drugi red od vrha) prirodnog miševi tipa (wt), VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) ili VELOCIMMUNE® 3 (V3) miševi su obojeni preko površine IgM koje eksprimuju B ćelije (gornji red, i drugi red od vrha), površine koje sadrže ili κ ili λ laki lanci (treći red od vrha) imunoglobulina ili površina IgM specifičnih haplotipova (donji red), i populacije odvojene sa FACS.
SLIKA 7A prikazuje reprezentativne sekvence CDR3 teških lanaca nasumično izabranih antitela VELOCIMMUNE® oko VH-DH-JH(CDR3) spoja, koje pokazuju različitost spoja i dodavanja nukleotida. Sekvence CDR3 teškog lanca su grupisane prema korišćenju DHsegmenata gena, čija germinativna linija je gore obezbeđena iznad svaka grupe sa masnim slovima. Segmenti VHgena za svaku sekvencu CDR3 teškog lanca su zabeleženi u zagradama na 5’ kraju svake sekvence (npr., 3-72 je humani VH3-72). JHSegmenti gena za svaki CDR3 teškog lanca su zabeleženi u zagradama na 3’ kraju svake sekvence (npr., 3 je nuhmani JH3). SEQ ID NOs za svaki prikazanu sekvencu su dati kao što sledi odozgo na dole: SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ IDNO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39.
SLIKA 7B prikazuje reprezentativne sekvence CDR3 lakog lanca nasumično izabranih VELOCIMMUNE® antitela oko Vκ-Jκ (CDR3) spoja, koji pokazuje raznovrsnost spoja i nukleotidnog dodavanja. Segemanti Vκ gena za svaku sekvencu CDR3 lakog lanca su zabeleženi u zagradama na 5’ kraju svake sekvence (npr., 1-6 je humani Vκ1-6). Segmenti Jκ gena za svaki laki lanac CDR3 su zabeleženi u zagradama na 3’ kraju svake sekence (npr., 1 je humani Jκ1). SEQ ID NOs za svaku prikazanu sekvencu su dati kao što sledi odozgo na dole: SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41 ; SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:58.
SLIKA. 8 prikazuje somatske frekvence hipermutacije teških i lakih lanaca VELOCIMMUNE® antitela ocenjenih (posle poravnavanja sa odgovarajućim sekvencama germinativne linije) kao procenat izmenjenih sekvenci na svakom položaju nukleotida (NT; leva kolona) ili amino kiselina (AA; desna kolona) u setovima sekvenci od 38 (neimunizirani IgM), 28 (neimunizirani IgG), 32 (neimunizirani Igκ iz IgG), 36 (imunizirani IgG) ili 36 (imunizirani Igκ iz IgG). Osenčene trake ukazuju na položaje CDRs.
SLIKA 9A prikazuje nivoe u serumu imunoglobulina IgM i IgG izotipova u prirodnim (otvoreni stubci) ili VELOCIMMUNE® miševima (zatvoreni stubci).
SLIKA 9B prikazuje nivoe u serumu imunoglobulina IgA izotipa u prirodnim (otvoreni stubci) ili VELOCIMMUNE® miševima (zatvoreni stubci).
SLIKA 9C prikazuje nivoe u serumu imunoglobulina IgE izotipa u prirodnim (otvoreni stubci) ili VELOCIMMUNE® miševima (zatvoreni stubci).
SLIKA 10A prikazuje antigen-specifične IgG titre naspram interleukin-6 receptora (IL-6R) seruma iz sedam VELOCIMMUNE® (VI) i pet prirodnih (WT) miševa posle dve (krvarenje 1) ili tri (krvarenje 2) runde imunizacije sa ektodomenom IL-6R.
SLIKA 10B prikazuje anti-IL-6R-specifični IgG izotip specifične titre za sedam VELOCIMMUNE® (VI) i pet prirodnih (WT) miševa.
SLIKA 11A prikazuje afinitetni raspored anti-interleukin-6 receptora monoklonalnih antitela stvorenih u VELOCIMMUNE® miševima.
SLIKA 11B pokazuje antigen specifično blokiranje anti-interleukin 6 receptora monoklonalnih antitela stvorenih u VELOCIMMUNE® (VI) i prirodnom (WT) miševima.
SLIKA 12 je šematski prikaz, ali ne u srazmeri, mišjih gena ADAM6a i ADAM6b na mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina. Korišćeni ciljni vektor (mADAM6 ciljni vektor) za umetanje mišjeg ADAM6a i ADAM6b u humanizovani endogeni lokus teškog lanca je prikazan u selekcionoj kaseti (HYG: higromicin) okruženoj sa mestima za mesto specifične rekombinacje (Frt) uključujući konstruisana restrikciona mesta na 5’ i 3’ krajevima.
SLIKA 13 je šematski prikaz, ali ne u srazmeri, humanog pseudogena ADAM6 (hADAM6Ψ) smeštenog između humanih varijabilnog segmenata gena teškog lanca 1-2 (VH1-2) i 6-1 (VH6-1). Ciljni vektor za bakterijsku homolognu rekombinaciju (hADAM6Ψ ciljni vektor) da se izbriše humani pseudogen ADAM6 i umetnu jedinstvena restrikciona mesta u humani lokus teškog lanca je prikazan sa selekcionom kasetom (NEO: neomicin) okruženomn sa mestima za mesto specifičnu rekombinaciju (loxP) uključujući konstruisana restrikciona mesta na 5’ i 3’ krajevima. Prikazana je ilustacija, ali ne u srazmeri, dobijenog ciljanog humanog lokusa teškog lanca koji sadrže genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6a i ADAM6b uključujući selekcionue kasetu okruženu mestima za mesto specifične rekombinaciju.
SLIKA 14A prikazuje FACS konturni dijagram limfocita vođenih singletima za površinsku ekspresiju IgM i B220 u koštanoj srži miševa homozigotnih za humane varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca imunoglobulina (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat nezrelih (B220<int>IgM+) i zrelih (B220<high>IgM+) B ćelija je zabeležen na svakoj konturi dijagrama.
SLIKA 14B prikazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<high>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanoj iz butne kosti miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog
2
teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).
SLIKA 15A prikazuje FACS konturne dijagrame CD19<+>-vođenih B ćelija za površinsku ekspresiju c-kita i CD43 u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat pro-B (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre-B (CD19+CD43-ckit-) ćelija je zabeležen u gornjem desnom i donjem levom kvadrantu, respektivno, na svakom kontrunom dijagramu.
SLIKA 15B prikazuje ukupan broj pro-B ćelija (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre-B ćelija (CD19<+>CD43-ckit-) u koštanoj srži izolovanih iz butnih kosti miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnog za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).
SLIKA 16A prikazuje FACS kontrurni dijagram limfocita vođenih singletima za površinsku ekspresiju CD19 i CD43 u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat nezrelih B (CD19<+>CD43-), pre-B(CD19<+>CD43<int>) i pro-B (CD19<+>CD43<+>) ćelija je zabeležen u svakoj konturi dijagrama.
SLIKA 16B prikazuje histograme nezrelih B (CD19<+>CD43-) i pre-B (CD19+CD43int) ćelija u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).
SLIKA 17A pokazuje FACS konturne dijagrame limfocita vođenih singletima za površinsku ekspresiju CD19 i CD3 u splenocitama miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat B (CD19<+>CD3-) i T (CD19-CD3<+>) ćelija je zabeležen na svakoj kontruri dijagrama.
SLIKA 17B prikazuje FACs konturne dijagrame za CD19<+>-vođene B ćelije za površinsku ekspresiju Igλ i Igκ lakih lanaca u slezini u miševima homozigotnim za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat Igλ<+>(gornji levi kvadrant) i Igκ<+>(donji desni kvadrant) B ćelija je zabeležen u svakoj kontrui dijagrama.
SLIKA 17C prikazuje ukupni broj CD19<+>B ćelija u slezini miša homozigotnog za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i humanog κ lakog lanca
2
(H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).
SLIKA 18A pokazuje FACs konturni dijagram CD19<+>-vođenih B ćelija za površinsku ekspresiju IgD i IgM u slezini miša za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat zrelih B ćelija (CD19<+>IgD<high>IgM<int>) je zabeležen u svakoj konturi dijagrama. Strelica na desnoj konturi dijagrma prikazuje postupak zrenja B ćelija u vezi sa površinskom ekspresijom IgM i IgD.
SLIKA 18B prikazuje ukupni broj B ćelija slezine miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miša homozigotnog za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji ima ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>) u toku zrenja od CD19<+>IgM<high>IgD<int>do CD19<+>IgM<int>IgD<high>.
SLIKA 19 prikazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje iz miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>; n=5) i miševe homozigotne za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>, n=5) koji su imunizirani sa humanim ćelijskim površinskim receptorom (antigen A).
SLIKA 20 pokazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje iz miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>; n=5) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>, n=10) koji su imunizirani sa humanim antitelom specifičnim za humani receptor tirozin-protein kinaze (antigen B).
SLIKA 21 pokazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje iz miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>; n=12) i miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gene ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>, n=12) koji su imunizirani sa sekrecionim humanim proteinom koji funkcioniše u regulaciji TGF-β signalnog puta (antigen C).
SLIKA 22 pokazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje iz miševa homozigotnih za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira gen ADAM6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>, n=12) koji su imunizirani sa humanim receptorom tirozin kinaze (antigen D).
Detaljni opis pronalaska
[0152] Ovaj pronalazak nije ograničen na određene opisane postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe se podrazumeva da je ovde korišćena terminologija samo u cilju opisivanja određenih izvođenja, i nije namera da bude ograničavajuća, jer je obim prikazanog pronalska definisan patentnim zahtevima.
2
[0153] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze koji su ovde korišćeni obuhvataju značenja koja izrazi i fraze imaju utemeljene u oblasti tehnike, osim ukoliko nije suprotno jasno navedeno ili je očigledno iz konteksta u kom je korišćen izraz ili fraza. Mada bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima ovde opisanim mogu biti korišćeni u praksi ili testiranju prikazanog pronalaska, opisani su određeni postupci i materijali.
[0154] Fraza "suštinski" ili "u suštini" kada je korišćen odnosi se na količinu segmenata gena (npr., "suštinski svi" V segmenti gena) uključuju i funkcionalne i nefunkcionalne segmente gena i uključuju, u različitim izvođenjima, npr., 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, ili 99% ili više svih segmenata gena; u različitim izvođenjima, "suštinski svi" segmenti gena obuhvataju, npr., bar 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% funkcionalnih (tj., nepseudogenih) segmenata gena .
[0155] Izraz "zamena" obuhvata DNK sekvencu smeštenu u genom ćelije na takav način da zamenjuje sekvencu u okviru genoma sa heterolognom sekvencom (npr., humana sekvenca u mišu) na lokusu genomske sekvence. Sekvenca DNK je tako smeštena da može obuhvatati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne DNK korišćene da bi se dobila sekvenca tako smeštena (npr., promoteri, pojačivači, 5’- ili 3’-netranslatorni regioni, odgovarajuće rekombinacione signalne sekvence, itd.). Na primer, u različitim izvođenjima, zamena je supstitucija endogene sekvence sa heterolognom sekvencom koja je dovodi do proizvodnje genskog proizvoda iz tako smeštene DNK sekvence (sadrži heterolognu sekvencu), ali bez ekspresije endogene sekvence; zamena endogene genomske sekvence sa DNK sekvencom koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran sa endogenom genomskom sekvencom (npr., endogena genomska sekvenca kodira gen ili domen imunoglobulina, i DNK fragment kodira jedan ili više humanih gena ili domena imunoglobulina). U različitim izvođenjima, endogeni gen ili njegovi fragment je zamenjen sa odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili njegov fragment koji je ortolog, homolog ili je suštinski identičan ili isti u strukturi i/ili funkciji, kao endogeni gen ili njegov fragment koji je zamenjen.
[0156] Miš kao genetički model je bio veoma unapređen transgenim i 'knockout' tehnologijama, koje su dopustile ispitivanje efekata direktnih prekomernih ekspresija ili brisanja specifičnih gena. Uprkos svim njihovim prednostima, miš i dalje predstavlja genetičku prepreku koja čine jedan nesavršeni model za humane bolesti i nesavršenu platformu za testiranje humanih lekova ili njihovo pravljenje. Prvo, mada oko 99% humanih gena ima mišji homolog (Waterston et al.2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420:520-562), potencijalni terapeutici često ne reaguju unakrsno, ili unakrno reaguju neadekvano sa mišjim ortolozima ili nameravanim humanim metama. Da bi se uklonio ovaj problem, odabrani ciljni geni mogu biti "humanizovani," to jest, mišji gen može biti eliminisan i zamenjen sa odgovarajućim humanim sekvencama gena (npr., US 6,586,251, US 6,596,541 i US 7,105,348). U početku, napori da se humanizuju mišji geni strategijom "’knockout’-plus-transgenska humanizacija" podrazumeva ukrštanje miša koji ima izbrisani (tj, 'knockout') endogeni gen sa mišem koji ima nasumično integrisani humani transgen (videti, npr., Bril et al., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factorVIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al., 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/betathalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al., 2006, Different role for mouse and human
2
CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Ali ovi napori su bili otežani ograničenjima veličine; konvencionalne 'knockout' tehnologije nisu bile dovoljne da direktno zamene veliku količinu mišjih gena sa odgovarajućom velikom količinom humanog genoma. Direktan prilaz direktnoj homolognoj zameni, u kojoj endogeni mišji gen je direktno zamenjen sa humanim odgovarajućim genom na istom preciznom genskom mestu mišjeg gena (tj., na endogenom mišjem lokusu), je retko pokušavano zbog tehničkih teškoća. Do danas, napori na direktnoj zameni znače uključivanje složenih i teških postupaka, na taj način ograničavajući dužinu genetskog materijala sa kojim se rukuje i preciznost sa kojom se radi.
[0157] Egzogeno uneti humani transgeni imunoglobulina preuređeni u prekursorima B ćelija u miševima (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Ovo otkriće je korišečno za konstruisanje 'knockout'-plus-transgenog prilaza da bi eksprimovala humana antitela (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Lokusi mišjeg teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina su inaktivirani u ovim miševima ciljnim brisanjem malih, ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, a zatim uvođenji humani lokusi gena imunoglobulina koji se nasumično integrisani u velike transgene, kao što je gore opisano ili minihromozome (Tomizuka et al., 2000, Double transchromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Takvi miševi predstavljau važnu prednost u genetskom inženjeringu; potpuno humana monoklonalna antitela izolovana iz njih doprinela su obećavajućem terapeutskom potencijalu za lečenje različitih humanih bolesti (Gibson et al., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human antiepidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Ali, kao što je gore diskutovano, ovi miševi pokazuju kompromitovani razvoj B ćelija i nedostatke imuno sistema kada se porede sa prirodnim miševima. Takvi problemi potencijalno ograničavaju sposobnost miševa da podržavaju snažan humoralni odgovor i kao posledicu, stvore potpuno humana antitela naspram nekih antigena. Nedostaci mogu biti usled: (1) neefikasne funkcionalnosti usled nasumičnog unošenja humanih transgena imunoglobulina i dovođenja do netačne ekspresije usled nedostatka kontrolnih elemenata ushodno i nizhodno (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3’ end of the IgH locus involves modular regulationof histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3’ IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760;Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5’ flanking region of the mouse IgHlocus defined by pro-B cell-specific
2
hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851); (2) neefikasni interacije između vrsta između humanog konstantnog domena i mišjih komponenti signalnog kompleksa receptora B ćelija na ćelijskoj površini, mogu narušiti signalni proces zahtevan za normalno zrenje, proliferaciju i preživljavanje B ćelija (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762); i (3) neefikasne interakcije između vrsta rastvornih humanih imunoglobulina i mišjih Fc receptora što može smanjiti afinitet selekcije (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) i koncentracije imunoglobulina u serumu (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Ovi nedostaci mogu biti korigovan in situ humanizacijom samo varijabilnih regiona mišjih lokusa imunoglobulina unutar njihove prirodne lokacije na endogennim lokusima teškog i lakog lanca. Ovo bi efikasno dovelo do miševa koji prave "reverzna himerna" (tj., humani V:mišji C) antitela koja bi bila u stanju za normalne interakcije i selekcije sa mišjim okruženjem zasnovanim na zadržanim mišjim konstantnim regionima. Dalje takva reverzna himerna antitela mogu biti lako reformatirana u potpuno humana antitela za terapeutske svrhe.
[0158] Genetički modifikovane životinje koje sadže zamenu na endogenim lokusima teškog lanca imunoglobulina sa heterolognim (npr., iz drugih vrsta) sekvencama imunoglobulina mogu biti učinjeni u konjukciji sa zamenama na endogenim lokusima lakog lanca imunoglobulina sa transgenima lakog lanca imunoglobulina (npr., himernim transgenima lakog lanca imunoglobulina ili potpuno humanim ili potpuno mišjim, itd.). Vrste iz kojih heterologne sekvence teškog lanca imunoglobulina potiču mogu biti raznovrsne; kao i korišćene sekvence lakog lanca imunoglobulina u zamenama sekvenci lakog lanca imunoglobulina ili transgenima lakog lanca imunoglobulina.
[0159] Sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona lanca imunoglobulina npr., V, D, i/ili J segmenti, su dobijene iz ljudi.
[0160] Opisan je miš koji sadrži zamenjene VH, DH, JHsegmente na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više humanih VH, DH, i JHsegmenata, gde jedan ili više humanih VH, DH, i JHsegmenata je operativno vezano za endogeni gen teškog lanca imunoglobulina gde miš sadrži transgen na lokusu koji je drugačiji od lokusa imunoglobulina, gde transgen sadrži nepreuređen ili preuređen humani VLi humani JLsegment operativno vezan za konstantni region miša ili pacova ili čoveka.
[0161] Opisan je postupak za veliku in situ genetsku zamenu varijabilnog lokusa gena imunoglobulina mišje germinativne linije sa humanim varijabilnim lokusima gena imunoglobulna dok se zadržava sposobnost miša da stvara potomke. Određenije, opisana je precizna zamena šest megabaza oba mišja varijabilna lokusa gena teškog i κ lakog lanca imunoglobulina sa njihovim odgovarajućim humanim delovima pri čemu mišji konstanti regioni ostaju nedirnuti. Kao rezultat, stvoreni su miševi koji imaju precizne zamene njihovih čitavih varijabilnih repertoara imunoglobulina germinativne linije sa ekvivalentnim humanim varijabilnim sekvencama imunoglobulina, dok su zadržani mišji konstantni regioni. Humani varijabilni regioni su vezani za mišje konstantne regione da bi se obrazovali himerni humani-mišji lokusi imunoglobulina koji se preuređuju i eksprimuju na fiziološki odgovarajućem nivou. Eksprimovana antitela su "reverzne himere," tj., ona sadrže humane varijabilne regione sekvenci i mišje sekvence konstantnih regiona. Ovi miševi koji imaju humanizovane varijabilne regione imunoglobulina koji eksprimuju antitela koja imaju humane varijabilne regione i mišje konstante regione se nazivaju VELCOIMMUNE® miševi.
[0162] VELOCIMMUNE® humanizovani miševi pokazuju potpuno funkcionalni humoralni imuni sistem koji se suštinski ne razlikuje od prirodnog miša. Oni pokazuju populacije normalnih ćelija u svim stupnjevima razvoja B ćelija. Oni pokazuju normalnu morfologiju limfnih organa. Sekvence antitela VELOCIMMUNE® miševa pokazuju normalnu frekvencu V(D)J preuređivanja i normalne somatske hipermutacije. Populacije antitela u ovim miševima odražavaju raspored izotipa koji proizilazi iz normalnog prebacivanja klasa (npr., normalo cis-prebacivanje izotipa). Imunizacija VELOCIMMUNE® miševa dovodi do jakog humoralno imunog odgovora koji stvara, velike, različite repertoare antitela koji imaju humane varijabilne domene imunoglobulina pogodne za upotrebu kao kandidata za lekove. Ova platforma obezbeđuje obilan izvor prirodnih afinitetno sazrelih humanih sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina za pravljenje farmaceutski prihvatljivih antitela i drugih proteina koji se vezuju za antigen.
[0163] Precizna zamena mišjih varijabilnih sekvenci imunoglobulina sa humanim varijabilnim sekvencama imunoglobulina omogućava dobijanje VELOCIMMUNE® miševa. Čak precizna zamena mišjih endogeniih sekvenci imunoglobulina na lokusima teškog lanca i lakog lanca sa ekvivalentnim humanim sekvencama imunoglobulina, sekvencionalnim rekombinantnim inženjeringom veoma velikog raspona humanih sekvenci imunoglobulina, može predstavljati izvesan izazov usled različite evolucije lokusa imunoglobulina između miša i čoveka. Na primer, intergenske sekvence koje se smenjuju unutar lokusa imunoglobulina nisu identične između miševa i čoveka i u nekim uslovma, ne moraju biti funkcionalni ekvivalenti. Razlike između miševa i ljudi u njihovim lokusima imunoglobulina mogu još dovesti do abnormalnosti kod humanizovanih miševa, naročito kod humanizacija ili manipulacija izvesnih delova endogenog mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina. Neke modifikacije na mišjim lokusima teškog lanca imunoglobulina su štetne. Štetne modifikacije mogu uključiti, na primer gubitak sposobnosti modifikovanih miševa da se pare i imaju potomke.
[0164] Precizna, izvedena je in situ velika zamena šest megabaza na promenjivim regionima mišjih lokusa teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina (VH-DH-JHi Vκ-Jκ) sa odgovarajućim 1.4 megabaza sekvence humanog genoma, dok su okolne mišje sekvence ostale netaknute i funkcionalne u okviru hibridnih lokusa, uključjući sve mišje gene konstantnog lanca i kontrolne regione transkripcije lokusa (Slika.1A i Slika.1 B). Naročito, humane VH, DH, JH, Vκ i Jκ sekvence gena su unete pomoću umetanja u koracima 13 himerih BAC ciljnih vektora koji nose preklapajuće fragmente lokusa humane germinativne linije u mišje ES ćelije pomoću tehnologije VELOCIGENE® genetskog inženjeringa (videti, npr., US Pat. No. 6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).
[0165] Humanizacija mišjeg gena imunoglobulina predstavlja najveću genetsku modifikaciju mišjeg genoma do danas. Dok su raniji napori za nasumičnu integraciju humanih transgena imunoglobulina bili donekle uspešni (gore diskutovano), direktna zamena mišjih gena imunoglobulina sa njihovim odgovarajućim humanm delovima dramatično povećava efikasnost sa kojom potpuno humana
1
antitela mogu biti efikasno stvorena u inače normalnim miševima. Dalje, takvi miševi pokazuju dramatičan porast raznovrsnosti potpuno humanih antitela koja se mogu dobiti posle imunizacije sa virtuelno bilo kojim antigenom, u poređenju sa miševima koji imaju onesposobljene endogene lokuse i potpuno humane transgene antitela. Višestruke verzije zamenjenih, humanizovanih lokusa pokazuju kompletno normalne nivoe zrelih i nezrelih B ćelija, nasuprot miševima sa nasumično integrisanim humanim transgenima, koji pokazuju značajno smanjenu populaciju B ćelija u različitim stupnjevima diferencijacije. Dok su napori povećavanja broja segmenata humanih gena u humanim transgenim miševima smanjili takve defekte, prošireni repertoari imunoglobulina nisu svi zajedno korigovali smanjenje u populacijama B ćelija u poređenju sa prirodnim miševima.
[0166] Uprkos humoralno imunoj funkciji bliskoj prirodnoj primećenoj kod miševa sa zamenjenim lokusima imunoglobulina (tj. VELOCIMMUNE® miševa), postoje drugi izazovi koji se sreću pri upotrebi direktne zamene imunoglobulina koji se ne sreću u nekim prilazima koji koriste nasumično integirsane transgene. Razlike u genetskoj kompoziciji lokusa imunoglobulina između miševa i ljudi su vodile do otkrića sekvenci koje su od koristi za razmnožavanje miševa sa zamenjenim segmentima gena imunoglobulina. Specifično, mišji ADAM geni smešteni u okviru endogenih lokusa imunoglobulina su optimalno prisutni u miševima sa zamenjeim imunoglobulinskim lokusima, zbog njihove uloge u plodnosti.
Položaj u genomu i funkcija mišjeg ADAM6
[0167] Muški miševi kojima nedostaje sposobnost eksprimovanja funkcionalnog proteina ADAM6 iznenađujuće pokazuju defekt u sposobnosti miša da se pari i stvara potomke. Miševima nedostaje sposobnost eksprimovanja funkcionalnog proteina ADAM6 usled zamene svih ili suštinski svih mišjih varijabilnih regiona segmenta gena imunoglobulina sa humanim varijabilnim regionima segmenata gena. Gubitak funkcije ADAM6 je posledica toga što je lokus ADAM6 smešten unutar regiona endogenog mišjeg varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina, proksimalno 3’ kraju lokusa VHsegmenta gena koji je ushodno od DHsegmenata gena. U cilju parenja miševa koji su homozigotni za zamenu svih ili gotovo svih endogenih mišjih varijabilnih segmenata gena teškog lanca sa humanim varijabilnim segmentima gena teškog lanca, generalno je otežan prilaz smeštanja mužjaka i ženki koji su homozigotni za zamenu i čeka produktivno parenje. Uspešna legla su male učestalosti i veličine. Umesto toga, korišćeni su mužjaci heterozigotni za zamenu za parenje sa ženkama homozigotnim za zamenu da bi se stvorilo potomstvo koje je heterozigotno za zamenu, a zatim su pareni njihovi homozigotni miševi. Pronalazači su odredili da verovatni uzrok gubitka plodnosti u muškim miševima je odsustvo funkcionalnog proteina ADAM6 u homozigotnim muškim miševima.
[0168] U različitim aspektima, muški miševi koji sadrže oštećeni (tj., nefunkcionalni ili marginalno funkcionalni) gen ADAM6 pokazuju smanjenje ili nepostojanje plodnosti. Zbog toga što je u miševima (i ostalim glodarima) gen ADAM6 smešten na lokus teškog lanca imunoglobulina, pronalazači su odredili da u cilju razmnožavanja miševa ili stvaranja i održavanja soja miševa, koji sadrži zamenjeni lokus teškog lanca imunoglobulina, koriste različita modifikovana ukrštanja ili šeme razmnožavanja. Niska plodnost, ili neplodnost, muških miševa homozigotnih za zamenu endogenog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina čini teškim zadržavanje takve modifikacije u mišjem soju. U različitim izvođenjima, održavanje soja obuvata izbegavanje problema neplodnosti, koji se ispoljavaju kod muških miševa homozigotnih za zamenu.
2
[0169] Opisan je postupak za održavanje soja miša kako je ovde opisano. Soj miša ne treba da sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu, i u različitim izvođenjima soj miša je homozigotan ili heterozigotan za izbačeni (‚knockout‘) (npr., funkcionalni ‚knockout‘) ADAM6.
[0170] Soj miševa može sadržati modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina koji dovodi do smanjenja ili gubitka plodnosti u muškim miševima. Modifikacija može sadržati brisanje regulatornog regiona i/ili kodirajućeg gena ADAM6. Modifikacija može sadržati endogeni gen ADAM6 (regulatorni i/ili kodirajući region) koji smanjuje ili eliminiše plodnost muških miševa koji sadrže modifikaciju; modifikacija može smanjiti ili eliminisati plodnost muškog miša koji je homozigotan za modifikaciju.
[0171] Mišji soj može biti homozigotan ili heterozigotan za izbacivanje (‘knockout’) (npr., funkcionalni ‘knockout’) ili brisanje gena ADAM6.
[0172] Mišji soj može biti održavan izolovanjem iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju ćelije i korišćenjem ćelije donora u embrionu domaćina i gestacijom embriona domaćina i ćelije donora u surogat majci i dobijanjem iz surogat majke potomka koji sadrži genetsku modifikaciju. U jednom izvođenju, ćelija donora je ES ćelija. Ćelija donora može biti pluripotentna ćelija, npr. indukovana pluripotentna ćelija.
[0173] Mišji soj može biti održavan izolovanjem iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju, sekvence nukleinske kiseline koja sadrži modifikaciju i unošenje sekvence nukleinske kiseline u nukleus domaćina, i gestacija ćelije koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline i jezgro domaćina u pogodnoj životinji. Sekvenca nukleinske kiseline može biti uneta u oocitni embrion domaćina.
[0174] Mišji soj može biti održavan izolovanjem iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikovani, nukleusa i unošenje nukleusa u ćeliju domaćina i gestacija nukleusa i ćelije domaćina u pogodnoj životinji da bi se dobio potomak koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju.
[0175] Mišji soj može biti održavan korišćenjem in vitro oplodnje (IVF) ženskih miševa (prirodnih, homozigotnih za modifikaciju) koje koriste spermu muških miševa koji sadrže genetsku modifikaciju. Muški miševi mogu biti heterozigotni za genetsku modifikaciju. Muški miševi mogu biti homozigotni za genetsku modifikaciju.
[0176] Mišji soj može biti održavan ukrštanjem muškog miša koji je heterozigotan za genetsku modifikaciju sa ženskim mišem da bi se dobio potomak koji sadrži genetsku modifikaciju, identifikovanjem muškog i ženskog potomka koji sadrži genetsku modifikaciju i korišćene mužjaka koji je heterozigotan za genetsku modifikaciju u ukrštanju sa ženkama koje su prirodne, homozigotne ili heterozigotne za genetsku modifikaciju da bi se dobio potomak koji sadrži genetsku modifikaciju. Korak ukrštanja heterozigotnih mužjaka za genetsku modifikaciju sa prirodnim ženkama, heterozigotnim ženkama za genetsku modifikaciju ili ženkama homozigotnim za genetsku modifikaciju može biti ponovljen u cilju održavanja genetske modifikacije u mišjem soju.
[0177] Opisan je postupak za održavanje mišjeg soja koji obuhvata zamenu endogenog varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više humanih sekvenci teškog lanca imunoglobulina, što obuhvata ukršanje mišjeg soja tako da se stvaraju heterozigotni muški miševi, gde heterozigotni muški miš je ukrštan da bi se održala genetska modifikacija u soju. Soj ne treba održavati bilo kojim ukrštanjem homozigotnih mužjaka sa prirodnim ženkama, ili homozigotnim ili heterozigotnim ženkama za genetsku modifikaciju.
[0178] Protein ADAM6 je član familije ADAM proteina, gde je ADAM akronim za disintegrin i metaloproteazu (A Disintegrin And Metalloprotease). Familija ADAM proteina je velika i raznovrsna, sa različitim funkcijama uključujući ćelijsku adheziju. Neki članovi ADAM familije su uključeni u spermatogenezu i oplođenje. Na primer, ADAM2 kodira podjedinicu proteina fertilina, koji je uključen u interakciju sperma-jaje. ADAM3, ili ciritestin, javlja se kao neophodan za vezivanje sperme za pelucidnu zonu. Nedostatak ili ADAM2 ili ADAM3 dovodi do neplodnosti. Pretpostavlja se da ADAM2, ADAM3, i ADAM6 obrazuju kompleks na površini ćelija sperme miša. Humani gen ADAM6, normalno koji se nalazi između humanih VHsegmenata gena VH1-2 i VH6-1, javlja se kao pseudogen (slika 12). U miševima, postoje dva gena ADAM6-ADAM6a i ADAM6b- koji su nađeni u intergenskom regionu između mišjih VHi DHsegmenata gena, i u mišjim genima ADAM6a i ADAM6b orijentisani su suprotno transkripcionoj orijentaciji u odnosu na onu oklolnih segmenata gena imunoglobulina (slika 12). U mišu, funkcionalni lokus ADAM6 je očigledno potreban za normalno oplođene. Funkcionalni lokus ADAM6 ili sekvenca, koje se odnose na lokus ADAM6 ili sekvencu koja može dopuniti ili spasiti, drastično smanjenu plodnost koja se ispoljava kod muških miševa kojima nedostaje ili je nefunkcionalan endogeni lokus ADAM6.
[0179] Položaj intergenske sekvence u miševima koji kodiraju ADAM6a i ADAM6b čine intergensku sekvencu podložnu modifikaciji kada se modifikuje endogeni mišji teški lanac. Kada su VHsegmenti gena izbrisani ili zamenjeni, ili kada su DHsegmenti gena izbrisani ili zamenjeni, postoji velika verovatnoća da će rezultujući miš pokazivati ozbiljne teškoće u plodnosti. U cilju kompenzovanja deficita, miš je modifikovan tako da ima nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji će upotpuniti gubitak aktivnosti ADAM6 usled modifikacije endogenog mišjeg lokusa ADAM6. U različitim izvođenjima, komplementna nukleotidna sekvenca je ona koja kodira mišji ADAM6a, mišji ADAM6b, ili homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment koji spašava deficit plodnosti.
[0180] Nukleotidna sekvenca koja spašava plodnost može biti smeštena u bilo koji pogodan položaj. Može biti smeštena u intergenski region, ili u bilo koji pogodan ploložaj u genomu (tj., ektopično). U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca može biti uneta u transgen koji je nasumišno integrisan u mišji genom. U jednom izvođenju, sekvenca može biti održavana epizomalno, to jest, na odvojenoj nukleinskoj kiselini pre nego na mišjem hromozomu. Pogodni položaji obuhvataju položaje koji su transkripciono dozvoljeni ili aktivani, npr., lokus ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), lokus BT-5 (Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), ili lokus Oct4 (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Ciljne nukleotidne sekvence za transkripciono aktivne lokuse su opisane npr. u US 7,473,557.
[0181] Alternativno, nukleotidna sekvenca koja spašava plodnost može biti kuplovana sa inducibilnim promoterom tako da olakšava optimalnu ekspresiju u odgovarajućim ćelijama i/ili tkivima, npr. reproduktivnim tkivima. Primeri inducibilnih promotera ukljućuju promotere aktivirane sa fizičkim (npr., promoter toplotnog šoka) i/ili hemijskim sredstvima (npr., IPTG ili tetraciklin).
[0182] Dalje, ekspresija nuklotidne sekvence može biti vezana za druge gene da bi se postigla ekspresija u specifičnim stupnjevima razvoja ili u okviru specifičnih tkiva. Takva ekspresija može se postići smeštanjem nukleotidne sekvence u operativnu vezu sa promoterom eksprimovanog gena u specifičnom stadijumu razvoja. Na primer, sekvence imunoglobulina iz jedne vrste konstruisane u
4
genomu vrsta domaćina su smeštene u operativnu vezi sa sekvencom promotera gena CD19 (specifičnog gena B ćelija) iz vrsta domaćina. Postignuta je specifična ekspresija B ćelija u preciznim stupnjevima razvoja kada se eksprimuju imunoglobulini.
[0183] Još jedan postupak postizanja snažne ekspresije umetnute nukleotidne sekvence je korišćenje konstitutivnih promotera. Primeri konstitutivnih promotera obuhvataju SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK i CAGG. Na sličan način, željena nukleotidna sekvenca je smeštena u operativnu vezu sa izabranim konstitutivnim promoterom, koji obezbeđuje visoki nivo ekspresije proteina kodiranog(ih) sa nukleotidnom sekvencom.
[0184] Izraz "ektopičan" ima nameru da obuhvati zamenu ili smeštanje u položaj koji se normalno ne sreće (npr., smeštanje sekvence nukleinske kiseline u položaj koji nije isti položaj sekvence nukleinske kiseline koji se nalazi u prirodnom mišu). Izraz, u različitim izvođenjima, je korišćen u smislu da je predmet van normale, ili pravog položaja. Na primer, fraza "ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira..." odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se javlja u položaju u kome se normalno ne sreće u mišu. Na primer, u slučaju ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji protein ADAM6 (ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji obezbeđuje istu ili sličnu plodnost muških miševa), sekvenca može biti smeštena u različiti položaj u mišjem genomu u odnosu na onaj koji se normalno nalazi u prirodnom mišu. U takvim slučajevima, novi spojevi sekvenci mišje sekvence će biti kreirani smeštanjem sekvence u različiti položaj mišjeg genoma nego u prirodnom tipu. Funkcionalni homolog ili ortolog mišjeg ADAM6 je sekvenca koja doprinosi spašavanju gubitka plodnosti (npr., gubitak sposobnosti muškog miša da stvara potomke parenjem) što je primećeno kod ADAM6<-/->miša. Funkcionalni homolozi ili ortolozi obuhvataju proteine koji imaju bar oko 89% identičnosti ili više, npr. do 99% identičnosti, sa amino kiselinskom sekvencom ADAM6a i/ili sa amino kiselinskom sekvencom ADAM6b, i zatim može da dopunjava ili spašava sposobnost uspešnog parenja, miša koji ima genotip koji uključuje brisanje ili izbacivanje ('knockout') ADAM6a i/ili ADAM6b.
[0185] Ektopični položaj može biti bilo gde (npr., kao nausmično umetanje transgena koji sadrži mišju sekvencu ADAM6), ili može biti npr. u položaju koji aproksimira (ali nije precizno isti kao) njegov položaj u prirodnom mišu (npr., u modifikovanom endogenom mišjem lokusu imunoglobulina, ali ili ushodno ili nizhodno u odnosu na njegov prirodni položaj, npr. u okviru modifikovanog lokusa imunoglobulna, ali između različitih segmenata gena, ili na različitim položajima u mišjoj V-D intergenskoj sekvenci). Jedan primer ektopičnog smeštanja je smeštanje u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca imunoglobulina. Na primer, miš sadrži zamenu jednog ili više endogenih VHsegmenata gena sa humanim VHsegmentima gena, pri čemu zamena uklanja endogenu sekvencu ADAM6, može biti konstruisan da ima mišju sekvencu ADAM6 smeštenu u okviru sekvence koja sadrži humane VHsegmente gena. Dobijena modifikacija će stvoriti (ektopičnu) mišju sekvencu ADAM6 u okviru humane sekvence gena, i (ektopično) smeštanje mišje sekvence ADAM6 u okviru humane sekvence gena može aproksimitati položaju humanog pseudogena ADAM6 (tj., između dva V segmenta) ili može aproksimirati položaju mišje sekvence ADAM6 (tj., unutat V-D intergenskog regiona). Dobijeni spojevi sekvenci nastali spajanjem (ektopične) mišje sekvence ADAM6 u okviru ili pored humane sekvence gena (npr., sekvence gena imunoglobulina) u okviru germinativne linije miša bi bili novi u poređenju sa istim ili sličnim položajima u genomu prirodnog tipa.
[0186] Opisane su nehumane životinje kojima nedostaje ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, gde nedostatak čini nehumane životinje neplodnim, ili u suštini smanjene plodnosti. Nedostatak ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa može biti usled modifikacije endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina. Suštinsko smanjenje plodnosti je, npr. smanjenje u plodnosti (npr., frekvence ukrštanja, broja štenadi po leglu, broja legla po godini, itd.) od oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95% ili više. U različitim izvođenjima, nehumane životinje su dopunjene sa mišjim genom ADAM6 ili njegovim ortologom ili homologom ili funkcionalnim fragmentom koji je funkcionalan u mužjaku nehumane životinje, gde dodati gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment, spašava smanjenje plodnosti u celini ili u znatnom njegovom delu. Spašavanje polodnosti u znatnom njegovom delu je, npr. vraćanje plodnosti tako da nehumana životinja pokazuje plodnost koja je bar 70%, 80%, ili 90% ili viša u poređenju sa nemodifikovanim (tj., životinjom bez modifikacije gena ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa) lokusom teškog lanca.
[0187] Sekvenca koja doprinosi genetski modifikovanoj životinji (tj., životinja koja nedostaje hunkcionalni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, usled npr. modifikacije lokusa teškog lanca imunoglobulina) je u različitim izvođenjima, izabrana od gena ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa. Na primer, u mišu, gubitak funkcije ADAM6 je spašen dodavanjem, u jednom izvođenju, mišjeg gena ADAM6. U jednom izvođenju, gubitak funkcije ADAM6 u mišu je spašen dodavanjem orologa ili homologa blisko povezane vrste u vezi sa mišom, npr. glodara, npr. miša različitog soja ili vrste, pacova bilo koje vrste, glodara; gde dodavanje ortologa ili homologa u mišu spašava gubitak plodnosti usled gubitka funkcije ADAM6 ili gubitka gena ADAM6. Ortolozi i homolozi iz drugih vrsta, u različitim izvođenjima, su izabrani iz filogenetski povezanih vrsta i u različitim izvođenjima, pokazuju procenat identičnosti sa endogenim ADAM6 (ili ortologom) koji je oko 80% ili viši, 85% ili viši, 90% ili viši, 95% ili viši, 96% ili viši, ili 97% ili viši; i spašavaju gubitak plodnosti koji je u vezi sa ADAM6 (u životinji koja nije miš) ili ortologom ADAM6. Na primer, u genetski modifikovanom muškom pacovu kome nedostaje funkcija ADAM6 (npr., pacov sa endogenim varijabilnim regionom teškog lanca imunoglobulina zamenjenim sa humanm varijabilnim regionom teškog lanca imunoglobulina ili izbačenim iz pacova regiona reškog lanca imunoglobulina), kod pacova je gubitak plodnosti spašen dodavanjem ADAM6 pacova ili, u nekim izvođenjima, ortologa ADAM6 pacova (npr., ortologa ADAM6 iz drugog soja pacova ili vrste, ili, u jednom izvođenju, od miša).
[0188] Prema tome, genetički modifikovne životinje koje ne pokazuju plodnost ili su smanjenje plodnosti usled modifikacija sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog) ili regulatorni region operativno vezan sa sekvencom nukleinske kiseline, mogu da sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja dopunjava ili vraća gubitak plodnosti od drugog soja iste vrste ili iz filogenetski bliskih vrste. Sekvenca nukleinske kiseline koja dopunjuje je ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment. Dopunski ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment može biti iz nehumane životinje koja je blisko povezana sa genetski modifikovan životinjom koja ima defekt plodnosti. Na primer, gde je genetski modifikovana životinja miš određenog soja, ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment mogu biti dobijeni iz miša drugog soja ili miša slične vrste. Ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment može biti izabran iz reda Rodentia, ili podreda Myomorpha.
[0189] U različitim izvođenjima, jedan ili više glodara ortologa ili homologa ADAM6 ili njegovih funkcionalnih fragmenata glodara u familiji vraća plodnost genetički modifikovanom glodaru iste familije kome nedostaje ortolog ili homolog ADAM6 (npr., Cricetidae (npr., hrčci, pacovi i miševi Novoga sveta, voluharice); Muridae (npr., pravi miševi i pacovi, gerbili, bodljikavi miševi, pacovi sa ‘krestom’)).
[0190] U različitim izvođenjima, ortolozi ADAM6, homolozi i njegovi fragmenti su procenjivani na funkcionalnost utvrđivanjem da li ortolog, homolog ili fragmet vraćaju plodnost genetički modifikovanom mužjaku nehumane životinje kojoj nedostaje ADAM6 aktivnost (npr., glodar, npr., miš ili pacov, koji sadrži izbačen ADAM6 ili njegov ortolog). U različitim izvođenjima, funkcionalnost je definsana kao sposobnost sperme genetički modifikovane životinje kojoj nedostaje endogeni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog da prođe kroz jajnik i oplodi jajnu ćeliju iste vrste genetički modifikovane životinje.
[0191] Miševi koji imaju izbrisane ili zamenjene endogene lokuse varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina ili njegovih delova mogu biti napravljeni da sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji daje sličnu plodnost mišu ADAM6 (npr., ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u muškom mišu). Ektopična nukleotidna sekvenca može uključivati nukleinsku sekvencu koja kodira protein koji je homolog ili ortolog ADAM6 (ili njegov fragment) različitog soja miša ili različitih vrsta, npr., različite vrste glodara, i da doprinosi plodnosti, npr., povećava broj legala u odnosu na navedeni vremenski period, i/ili povećava broj mladunaca po leglu, i/ili sposobnost ćelije sperme muškog miša da prođe kroz mišji jajovod da oplodi jaje.
[0192] U jednom izvođenju, ADAM6 je homolog ili ortolog koji je bar 89% do 99% identičan sa mišjim proteinom ADAM6 (npr., bar 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6a ili mišjim ADAM6b). U jednom izvođenju, ektopična nukleotidna sekvenca kodira jedan ili više proteina nezavisno izabranih od proteina bar 89% identičnog sa mišjim ADAM6a, proteina koji je bar 89% identičan mišjem ADAM6b, i njihovoj kombinaciji. U jednom izvođenju, homolog ili ortolog je protein pacova, hrčka, miša ili zamorca koji je ili je modifikovan da je oko 89% ili više idnentičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b. U jednom izvođenju, homolog ili ortolog je ili je bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b.
Ektopični ADAM6 u humanizovanom mišjem teškom lancu
[0193] Razvitak u ciljanju gena, npr., razvoj bakterijskih veštačkih hromozoma (bacterial artificial chromosomes-BACs), sada osposobljava rekombinaciju relativno velikih genomskih fragmenata. BAC inženjerig je omogućio veliko brisanje, u mišjim ES ćelijama.
[0194] Miševi koji prave humana antitela su dostupni već neko vreme. Mada oni predstavljaju važnu prednost u razvoju humanih terapeutskih antitela, ovi miševi pokazuju brojne značajne abnormalnosti koje ograničavaju njihovu korist. Na primer, oni pokazuju kompromitovani razvoj B ćelija. Kompromitovani razvoj može biti usled raznovrsnih razlika između transgenih miševa i prirodnih miševa.
[0195] Humana antitela možda neće optimalno reagovati sa mišjim pre B ćelijama ili receptorima B ćelija na površini mišjih ćelija koji signaliziraju zrenje, proliferaciju ili opstanak u toku selekcije klona. Potpuno humana antitela mogu reagovati neoptimalno sa mišjim sistemom Fc receptora; miš eksprimuje Fc receptore koji ne pokazuju jedan prema jedan korespondenciju sa humanim Fc receptorima. Na kraju, različiti miševi koji koji prave potpuno humana antitela ne obuhvataju sve originalne mišje sekvence, npr., nizhodno od elemenata pojačivača i drugih elemenata kontrole lokusa, koji mogu biti potrebni za prirodni razvoj B ćelija.
[0196] Miševi koji prave potpuno humana antitela generalno sadže endogene lokuse imunoglobulina koji su onesposobljenini neki način, i humani transgeni koji sadrže promenjive segmente gena su uneti na nasumična mesta u mišjem genomu. Dokle god je endogeni lokus dovoljno onesposobljen tako da se ne preuređuju segmenti gena da bi se obrazovao funkcionalni gen imunoglobulina, cilj pravljenja potpuno humanih antitela u takvom mišu može biti ostvaren -ali sa kompromitovanim razvojem B ćelija.
[0197] Mada primoran da pravi potpuno humana antitela iz humanog transgenog lokusa, stvaranje humanih antitela u mišu su očigledno nepogodan proces. U nekim miševima, postupak je toliko nepogodan da dovodi do obrazovanja himernih humanin varijabilnih/mišjih konstantnih teških lanaca (ali ne lakih lanaca) kroz mehanizam trans-prebacivanja. Ovim mehanizmom, transkripti koji kodiraju potpuno humana antitela podleže izotipu prebacivanja u trans od humanog izotipa na mišji izotip. Postupak je u trans, jer je potpuno humani transgen smešten odvojeno od endogenog lokusa koji zadržava neoštećenu kopiju mišjeg konstantnog regiona gena teškog lanca. Mada u takvim miševima trans-prebacivanje je očigledno, pojava je nedovoljna da spasi razvoj B ćelija, koje ostaju potpuno oštećene. U svakom slučaju, trans-prebačena antitela napravljena u takvim miševima zadržavaju potpuno humane lake lance, jer pojava tras-prebacivanja očigledno se ne dešava u odnosu na lake lance; trans-prebacivanje pretpostavlja se da se zasniva na 'switch' (prekidač) sekvencama u endogenim lokusaima koriščenim (mada drugačije) u normalnim prebacivanjima izotipova na cis. Prema tome, čak kada konstruisani miševi prave potpuno humana antitela odaberu mehanizam transprebacivanja da prave antitela sa mišjim konstantnim regionima, strategije je još uvek nedovoljna da spasi normalni razvoj B ćelija.
[0198] Prvenstveni problem pri dobijanju humanog leka koji se zasniva na antitelu je pripremanje dovoljno raznovrsnih humanih sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina da se identifikuju korisni varijabilni domeni koji specifično prepoznaju određene epitope i vezuju se za njih sa željenim afinitetim, uglavnom ali ne uvek sa visokim afinitetom. Pre razvoja VELOCIMMUNE® miševa (ovde opisanih), nisu postojale indikacije da miševi koji eksprimuju humane varijabilne regione sa mišjim konstantnim regionima bi pokazivale bilo koje značajne razlike u odnosu na miševe koji prave humana antitela iz transgena. Ta pretpostavka je međutim bila netačna.
[0199] VELOCIMMUNE® miševi, koji sadrže preciznu zamenu mišjih varijabilnih regiona imunoglobulina sa humanim varijabilnim regionima imunoglobulina na endogenim mišjim lokusima, pokazuju iznenađujuću i značaju sličnost sa prirodnim miševima u odnosu na razvoj B ćelija. U iznenađujućem i zapanjujućem razvoju, VELOCIMMUNE® miševi pokazuju esencijalno normalan, prirodni odgovor na imunizaciju koja se razlikuje samo u jednom značajnom vidu od prirodnih miševa - varijabilni regioni stvoreni kao odgovor na imunizaciju su potpuno humani.
[0200] VELOCIMMUNE® miševi sadrže precizne zamene velike količine varijabilnih regiona germinativne linije mišjeg teškog lanca imunoglobulina (IgH) i lakog lanca imunoglobulina (npr., κ lakog lanca, Igκ) sa odgovarajućim humanim varijabilnim regionima imunoglobulina, na endogenim lokusima. Ukupno, oko šest megabaza mišjih lokusa je zamenjeno sa oko 1.5 megabaza humane sekvence genoma. Ova precizna zamena dovodi do miša sa hibridnim lokusima imunoglobulina koji čine teški i laki lanci koji imaju humane varijabilne regione i mišje konstantne regione. Precizna zamena mišjih VH-DH-JHi Vκ-Jκ segmenata ostavlja okolone mišje sekvence nedirnutim i funkcionalnim na hibridim lokusima imunoglobulina. Humoralni imuni sistem miša funkcioniše kao kod prirodnog miša.
Razvoj B ćelija je neometan u bilo kom značajnom pogledu i stvoreni su raznovrsni humani varijabilni regioni u mišu posle izazivanja antigenom.
[0201] VELOCIMMUNE® miševi su mogući jer segmenti gena imunoglobulina za teške i κ lake lance se preuređuju slično kod ljudi i miševa, ali se ne može reći da su njihovi lokusi isti ili čak blizu, jer je jasno da nisu. Međutim, lokusi su dovoljno slični da humanizacija varijabilnih lokusa gena teškog lanca može biti upotpunjen sa zamenom oko tri miliona parova baza susedne humane sekvence genoma koja pokriva u osnovi ekvivalentnu sekvencu iz humanog lokusa imunoglobulina.
[0202] Dalja zamena izvesnih mišjih sekvenci sa humanim sekvencama (npr., zamena mišjih CH1 sekvenci sa humanom CH1 sekvencom, i zamena mišje CLsekvence sa humanom CLsekvencom) dovodi do miševa sa hibridnim imunoglobulinskim loksuima koji prave antitela koja imaju humane varijabilne regione i delimično humani konstantne regione, pogodne za npr. potpuno humane fragmente antitela, npr. potpuno humane Fab’s. Miševi sa hibridnim lokusima imunoglobulina pokazuju normalna preuređivanja varijabilnih segmenata gena, normalne somatske frekvence hipermutacije i normalnu klasu prebacivanja. Ovi miševi pokazuju humoralni imuni sistem koji se ne razlikuje od prirodnih miševa, i pokazuje normalne populacije ćelija u stupnjevima razvoja B ćelija i normlane strukture limfoidnih organa – čak kada miševima nedostaje pun repertoar humanih segmenata varijabilnog regiona gena. Imunizacija ovih miševa dovodi do jakih humoralnih odgovora koji pokazuju raznovrsnost korišćenja varijabilnih segmenata gena.
[0203] Precizna zamena mišjih segmenata varijabilnih regiona gena germinativne linije omogućava pravljenje miševa koji imaju delimično humane lokuse imunoglobulina. Zbog toga što delimično humani lokusi imunoglobulina se preuređuju, hipermutiraju i prebaciju klase normalno, delimično humani lokusi imunoglobulina stvaraju antitela u mišu koja sadrže humane varijabilne regione. Nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione mogu biti identifikovane i klonirane, zatim spojene (npr., u in vitro sistemu) sa bilo kojim sekvencama prema izboru, npr. bilo kojim izotipom imunoglobulina pogodnim za određenu upotrebu, dovodeći do antitela ili proteina koji se vezuje za antigen koji u potpunosti potiče od humanih sekvenci.
[0204] Humanizacija velikih razmera pomoću postupaka rekombinatnog inženjeringa su korišćene za modifikovanje mišjih embrionskih stem (ES) ćelija da precizno zamene do tri megabaze mišjeg lokusa teškog lanca koji obuhvata suštinski sve mišje VH, DH, i JHsegmente gena sa ekvivalentnim humanim segmentima gena sa do jedne mega baze humane sekvence genoma koja sadrži neke ili suštinski sve humane VH, DH, i JHsegmenate gena. Do jedne polovine megabaza segmenata humnog genom koji sadržee jedan od dva ponavljanja koja kodiraju suštinski sve humane Vκ i Jκ segmente gena su korišćeni da zamene tri segmenta megabaza mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži esencijalno sve mišje Vκ and Jκ segmente gena.
[0205] Miševi sa takvim zamenjenim imunoglobulinskim lokusima mogu sadžati poremećni ili izbrisani endogeni mišji lokus ADAM6, koji se normalno nalazi između 3’-najvišeg VHsegmenta gena i 5’-najvišeg DHsegmenta gena na mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina. Poremećaj u ovom regionu može voditi do smanjenja ili eliminacije funkcionalnosti endogenog mišjeg lokusa ADAM6. Ukoliko repertoari 3’-najviši VHsegmenta gena humanog teškog lanca su korišćeni u zameni, intergenski region koji sadrži pseudogen koji se javlja kao humani pseudogen ADAM6 je prisutan između ovih VH segmenata gena, tj., između humanih VH1-2 i VH1-6. Međutim, muški miševi koji sadrže humane intergenske sekvence pokazuju smanjenju plodnosti.
[0206] Opisani su takođe miševi koji sadrže zamenjene lokuse kao što je gore opisano i takođe sadrže ektopične sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju mišji ADAM6, gde miševi pokazuju u suštini normalnu plodnost. Ektopična sekvenca nukleinske kiseline može sadržati mišji ADAM6a i/ili mišju sekvencu ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment koji je smešten između humanog VH1-2 i humanog VH6-1 na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. U jednom izvođenju, ektopična sekvenca nukleinske kiseline može biti SEQ ID NO:3, smeštena između humanog VH1-2 i humanog VH6-1 na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Smer transkripcije gena ADAM6 iz SEQ ID NO:3 je suprotan u odnosu na smer transkripcije okolonih humanih segmenata VHgena. Mada primeri ovde pokazuju da spašavanje plodnosti smeštanjem ektopične sekvence između navedenih humanih segmenata VHgena, osobe iz struke će znati da smeštanje ektopične sekvence na bilo koji pogodan transkripciono dozvoljen lokus u mišjem genomu (ili čak ekstrahromozomalno) se očekuje da slično spašava plodnost kod muških miševa.
[0207] Pojava dopunjavanja miša kome fali funkcionalni lokus ADAM6 sa ektopičnom sekvencom koja sadrži mišji ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je primenjiv u spašavanju miševa sa nefunkcionalnim ili minimalno funkcionalnim lokusom ADAM6. Prema tome, veoma mnogo miševa koji sadrže modifikaciju koja remeti ADAM6 lokus teškog lanca imunoglobulina mogu biti spašeni sa kompozicijama i postupcima prema pronalasku. Prema tome, pronalazak obuhvata miševe sa raznovrsnim modifikacijama lokusa teškog lanca imunoglobulina koji narušavaju endogenu funkciju ADAM6. Neki (neograničavajući) primeri su obezbeđeni u ovom opisu. Pored toga opisani su VELOCIMMUNE® miševi, kompozicije i postupci koji se odnose na ADAM6 mogu biti korišeni u veoma puno primena, npr. kada se modifikuje lokus teškog lanca na veoma različite načine.
[0208] Opisan je miš koji ima ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragamet), zamenjene sve ili suštinski sve VHsegmente gena sa jednim ili više humanih VHsegmenata gena, zamenjene sve ili suštinski sve mišje DHsegemente gena i JHsegmenate gena sa humanim DHi humanim JHsegmentima gena, gde mišu nedostaje CH1 i/ili region zbloba (‘hinge’). U jednom izvođenju, miševi prave jedan varijabilan domen vezujućeg proteina koji je dimer lanaca imunoglobulina izabranih od: (a) humani VH- mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VH– mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3; i, (c) humani VH- mišji CH2 - mišji CH3.
[0209] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja spašava plodnost je smeštena na humanu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (npr., između humanih VH1-2 i VH1-6 segmenata gena) u mišu koji ima zamenjen jednog ili više mišjih varijabilnih segmenata gena teškog lanca imunoglobulina (mVH’s, mDH’s, i/ili mJH’s) sa jednim ili više humanih varijabilnih segmenata teškog lanca imunoglobulina (hVH’s, hDH’s, i/ili hJH’s), i miš ima zamenjen jedan ili više mišjih varijabilnih segmenata gena κ lakog lanca imunoglobulina (mVκ’s i/ili mJκ’s) sa jednim ili više humanih varijabilnih segmenata gena κ lakog lanca imunoglobulina (hVκ’s i/ili hJκ’s).
[0210] U jednom izvođenju, jedan ili dva mišja varijabilna segmenata gena teškog lanca imunoglobulina sadrže oko tri megabaze mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih segmenata gena teškog lanca imunoglobulina sadrže bar 89 VHsegmenata gena, bar 13 DHsegmenata gena, bar četiri JHsegmenata gena ili njihove kombinacije mišjih lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih segmenata gena teškog lanca imunoglobulina sadrže oko jednu megabazu humanog lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih segmenata gena teškog
4
lanca imunoglobulina sadrže bar 80 VHsegmenata gena, bar 27 DHsegmenata gena, bar šest JHsegmenata gena ili njihove kombinacije humanog lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0211] U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih segmenata gena κ lakog lanca imunoglobulina sadrži oko tri megabaze mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih segmenata gena κ lakog lanca imunoglobulina sadrži bar 137 Vκ segmenata gena, bar pet Jκ segmenata gena ili njihove kombinacije mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih segmenat agena κ lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih segemata gena κ lakog lanca imunoglobulina sadrži proksimalna ponavljanja (u odnosu na κ konstantan region imunoglobulina) humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih segmenata gena κ lakog lanca imunoglobulina sadrže bar 40Vκ segmenata gena, bar pet Jκ segmenata gena ili njihovu kombinaciju humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina.
[0212] U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca je smeštena između dva humana segmenta gena imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, dva humana segmenta gena imunoglobuilina su segmenti gena teškog lanca. U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca je smeštena između humanog VH1-2 segmenta gena i humanog VH1-6 segmenta gena u VELOCIMMUNE® mišu (US 6,596,541 i US 7,105,348). U jednom izvođenju, VELOCIMMUNE® miš je tako modifikovan da sadrži zamenjene mišje varijabilne segmente gena teškog lanca imunoglobulina sa bar 80 humanih VHsegmenata gena, 27 humanih DHsegmenata gena i šest humanih JHsegmenata gena, i zamenjene mišje varijabilne segmenta gena κ lakog lanca imununoglobulina sa bar 40 humanog Vκ segmenata gena i pet humanih Jκ segmenata gena.
[0213] U jednom aspektu, funkcionalni mišji lokus ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) je prisutan u sredini humanih VHsegmenata gena koji zamenjuju endogene mišje VH segmente gena. U jednom izvođenju, bar 89 mišjih VHsegmenata gena je uklonjeno i zamenjeno sa jednim ili više humanih VHsegmenata gena, i mišji lokus ADAM6 je prisutan odmah pored 3’ kraja humanih VH segmenata gena, ili između dva humana VHsegmenta gena. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 je prisutan između dva VHsegmenta gena između oko 20 kilo baza (kb) do oko 40 kilo baza (kb) 3’ terminusa umentnutih humanih VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 je prisutan između dva VHsegmenta gena sa oko 29 kb do oko 31 kb 3’ terminusa umetnutih humanih VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 je prisutan između oko 30 kb od 3’ terminusa umentitih humanih VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 je prikazan između oko 30,184 bp 3’ terminusa umentnutih humanih VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, zamena obuhvata humane VHsegmente gena VH1-2 i VH6-1, i mišji lokus ADAM6 je prikazan nizhodno od VH1-2 segmenta gena i ushodno od VH6-1. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 je prisutan između humanog VH1-2 segmenta gena i humanog VH6-1 segmenta gena, gde 5’ kraj mišjeg lokusa ADAM6 je oko 13,848 bp od 3’ terminusa humanog VH1-2 segmenta gena i 3’ kraja lokusa ADAM6 je oko 29,737 bp 5’ humanog VH6-1 segmenta gena. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 sadrži SEQ ID NO:3 ili njen fragment koji daje ADAM6 funkciju u okviru ćelija miša. U specifičnom izvođenju, raspored humanih VHsegmenata gena je zatim kao što sledi (od uz lanca do niz lanca u odnosu na smer transkripcije humanih VHsegmenata gena): humani VH1-2 – mišji lokus ADAM6 - humani VH6-1. U specifičnom izvođenju, pseudogen ADAM6 između humanog VH1-2 i humanog VH6-1 je zamenjen sa mišjim lokusom ADAM6. U jednom izvođenju, orijenatacija jednog ili više mišjeg ADAM6a i mišjeg ADAM6b mišjeg lokusa ADAM6 je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VHsegmenata gena. Alternativno, mišji lokus ADAM6 je prisutan u intergenskom regonu između 3‘-najvišeg humanog VHsegmenta gena i 5’-najvišeg DHsegmenta gena. Ovo može biti slučaj kada je 5’-najviši DHsegment mišji ili humani.
[0214] Slično, miš modifikovan sa jednim ili više humanih VLsegmenata gena (npr., Vκ ili Vλ segmentima) zamenom svih ili suštinski svih endogenih mišjih VHsegmenta gena može biti modifikovan tako da ili zadrži endogeni mišji lokus ADAM6, kako je gore opisano, npr., korišćenjem ciljnog vektora koji ima homologiju kraka niz lanc koja obuhvata mišji lokus ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment, ili zamenom oštećenog mišjeg lokusa ADAM6 sa ektopičnom sekvencom smeštenom između dva humana VLsegmenta lanca ili između humanog VLsegmenata gena i DHsegmenta gena (bilo humanog ili mišjeg, npr., Vλ m/hDH), ili J segmenta gena (bilo humanog ili mišjeg, npr., Vκ JH). U jednom izvođenju, zamena obuhvata dva ili više humanih VLsegmenata gena, i mišji lokus ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment je prisutan između dva 3’-najviša VLsegmenta gena. U specifičnom izvođenju, raspored humanih VLsegmenata gena je zatim kao što sledi (od ushodno do nizhodno u odnosu na smer transkripcije humanih segmenata gena): humani VL3’-1 – mišji lokus ADAM6 - humani VL3’. U jednom izvođenju, orijantacija jednog ili više mišjeg ADAM6a i mišjeg ADAM6b mišjeg lokusa ADAM6 je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VLsegmenata gena. Alternativno, mišji lokus ADAM6 je prisutan u integenskom region između 3’-najvišeg humanog VLsegmenta gena i 5’-najvišeg DHsegmenta gena. Ovo može biti slučaj bilo da je 5’-najviši DHsegment mišji ili humani.
[0215] Opisan je miš sa zamenjenim jednim ili više endogenih mišjih VHsegmenata gena, i koji sadrži bar jedan endogeni mišji DHsegment gena. Kod takvog miša, modifikacija endogenih mišjih VHsegmenata gena može sadržati modifikaciju jednog ili više 3’-najviših VHsegmenata gena, ali ne 5’-najviši DHsegment gena, pri čemu se vodi računa tako da modifikacija jednog ili više 3’-najviših VHsegmenata gena ne remeti ili utiče na endogeni mišji ADAM6 tako da postane nefukcionalan. Na primer, u jednom izvođenju miš sadrži zamenjene sve ili suštinski sve endogene mišje VHsegmente gena sa jednim ili više humanih VHsegmenata gena, i miš sadrži jedan ili više endogenih DHsegmenata gena i funkcionalni endogeni mišji lokus ADAM6.
[0216] Miš može sadržati modifikaciju endogenih mišjih 3’-najviših VHsegmenata gena, i modifikaciju jednog ili više mišjih DHsegmenata gena, i modifikacija je izvedena da se održi integritet endogenog mišjeg ADAM6 lokusa u stepenu u kome endogeni ADAM6 lokus ostaje funkcionalan. U jednom izvođenju, takva modifikacija je učinjena u dva koraka: (1) zamenom 3’-najviših endogenih mišjih VHsegmenata gena sa jednim ili više humanih VHsegmenata pomoću ciljnog vektora sa ushodno homolognim krakom i nizhodno homologim krakom, gde nizhodno homologni krak uključuje ceo ili deo mišjeg ADAM6; (2) zatim zamenjivanje i endogenog mišjeg DHsegmenta gena sa ciljnim vektorom koji ima homologni krak ushodno koji uključuje ceo ili funkcionalni deo mišjeg lokusa ADAM6.
[0217] Korišćenje miševa koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni homolog može biti korisno kada modifikacije remete funkciju endogenog mišjeg ADAM6. Verovatnoća remećenja endogene mišje ADAM6 funkcije je visoka kada se prave modifikacije mišjih lokusa imunoglobulina, naročito kada se modifikuje mišji varijabilni regioni teškog lanca imunoglobulina i sekvence koje ga okružuju. Prema tome, takvi miševi obezbeđuju određenu korist kada se dobijaju miševi sa lokusima teškog lanca imunoglobulina koji su izbrisani u celini ili delom, humanizovani u celini ili delom, ili su zamenjeni (npr., sa Vκ ili Vλ sekvencama) u celini ili delom. Postupci pripremanja genetskih modifikacija opisanih za miševe koji su dole opisani su poznate ljudima iz struke.
[0218] Miševi koji sadrže ektopične sekvence koje kodiraju mišji protein ADAM6, ili suštinski identičan ili sličan protein koji doprinosi plodnosti mišjeg proteina ADAM6, su naročito korisni zajedno sa modifikacijama mišjeg lokusa varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji remeti ili dovodi do brisanja endogene mišje sekvence ADAM6. Mada primarno opisan u vezi sa miševima koji eksprimuju antitela sa humanim varijabilnim regionima i mišjim konstantnim regionima, takvi miševi su korisni u vezi sa bilo kojim genetskim modifikacijama koje remete endogene mišje gene ADAM6. Osobe iz struke znaju da to obuhvata raznovrsne genetske modifikacije miševa koji sadže mišje varijabilne lokuse gena teškog lanca imunoglobulina. Ovo obuhvata, na primer, miševe sa izbrisanim ili zamenjenim svih ili delom mišjih segmenata gena teškog lanca imunoglobulina, bez obzira na ostale modifikacije. Dole su opisani neograničavajući primeri.
[0219] Opisani su genetički modifikovani miševi koji obuhvataju ektopični gen ADAM6 miša, glodara ili ostalih (ili ortolog ili homolog ili fragment) funkcionalan u mišu, i jedan ili više humanih varijabilnih i/ili konstantih regiona segmenata gena imunoglobulina. Drugi ortolozi, ili homolozi ili fragmenti ADAM6 gena funkcionalni u mišu mogu obuhvatati sekvence iz goveda, kamile, primata, zeca ili drugih nehumanih sekvenci.
[0220] Opisan je miš koji ima ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni protein ADAM6, zamenjene sve ili suštinski sve mišje VHsegmente gena sa jednim ili više humanih VHsegmenata gena; zamenjene sve ili suštinski sve mišje DHsegmente gena sa jednim ili više DHsegmenata gena; i zamenjeme sve ili suštinski sve mišje JHsegmente gena sa jednim ili više humanih JHsegmenata gena.
[0221] Miš može dalje da sadži zamenjenu mišju CH1 nukleotidnu sekvencu sa humanom CH1 nukleotidnom sekvencom. Miš može dalje da sadrži zamenjenu mišju nukleotidnu sekvencu zgloba (‘hinge’) sa humanom nukleotidnom sekvencom zgloba. Miš može dalje da sadrži zamenu varijabilnog lokusa lakog lanca imunoglobulina (VLi JL) sa humanim varijabilnim lokusom lakog lanca imunoglobulina. Miš može dalje da sadrži zamenjenu mišju nukleotidnu sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sa humanom nukleotidnom sekvencom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina. VL, JL, i CLmogu biti sekvence κ lakog lanca imunoglobulina. Miš može da ima mišju CH2 i mišju CH3 sekvencu konstantnog regiona imunoglobulina spojenu sa humanom sekvencom zglobnog regiona i humanom CH1 sekvencom, tako da mišji lokusi imunoglobulina se preuređuju da obrazuju gen koji kodira vezujući protein koji ima (a) težak lanac koji ima humani varijabilni region, humani CH1 region, humani zglobni region, i mišji CH2 i mišji CH3 region; i (b) gen koji kodira laki lanac imunoglobulina koji sadrži humani varijabilni domen i humani konstantni region.
[0222] Opisan je miš koji ima ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6, zamenjene sve ili suštinski sve VHsegmente gena sa jenom ili više humanih VLsegmenata gena i opciono zamenu svih ili suštinski svih DHsegmenata gena ili JHsegmenata gena sa jednim ili više humanih DHsegmenata gena i/ili humanih JHsegmenata gena ili opciono zamenjene sve ili suštinski sve DHsegmenta gena i JHsegmente gena sa jednim ili više humanih JLsegmenata gena.
[0223] Miš može da sadrži zamenu svih ili suštinski svih mišjih VH, DH, i JHsegmenata gena sa jednim ili više VL, jednim ili više DH, i jednim ili više J segmenata gena (npr., Jκ ili Jλ), pri čemu segmenti gena su operativno veznani za endogeni mišji zglobni region, gde miš obrazuje preuređeni gen lanca
4
imunoglobulina koji sadrži, od 5’ do 3’ u smeru transkripcije, humani VL– humani ili mišji DH– humani ili mišji J – mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3. Region J može biti humani Jκ region. Region J može biti humani JHregion. Region J može biti humani Jλ region. Humani VLregion može biti izabran iz humanog Vλ regiona i humanog Vκ regiona.
[0224] Miš može da eksprimuje jedan varijabilni domen antitela koji ima mišji ili humani konstantni regiona i varijabilni region koji potiče od humanog Vκ, humanog DHi humanog Jκ; humanog Vκ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vκ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jκ. U specifičnom izvođenju, rekombinacione prepoznavajuće sekvence su modifikovane tako da omogućavaju javljanje produktivnog premeštanje između navedenih V, D, i J segmenata gena ili između navedenih V i J segmenata gena.
[0225] Opisan je miš koji ima ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenjene sve ili suštinski sve mišje VHsegmente gena sa jednim ili više humanih VLsegmenata gena, zamenjene sve ili suštinski sve mišje DHsegmente gena i JHsegmenate gena sa humanim JLsegmentima gena; gde mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region.
[0226] Mišu može da nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen. Mišu može da nedostaje sekvenca koja kodira region zgloba. Mišu može da nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen i region zgloba.
[0227] Miš može da eksprimuje vezujući protein koji sadrži humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (λ ili κ) spojen sa mišjim CH2 domenom koji je vezan za mišji CH3 domen.
[0228] Opisan je miš koji ima ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenjene sve ili suštinski sve mišje VHsegmenta gena sa jednim ili više humanih VLsegmenata gena, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHi JHsegmenata gena sa humanim JLsegmentima gena.
[0229] Miš smože da adrži izbrisanu sekvencu konstantnog regiona gena teškog lanca imunoglobulina koja kodira CH1 region, region zgloba, CH1 i region zgloba, ili CH1 region i region zgloba i CH2 region.
[0230] Miš može da pravi jedan varijabilni domen vezujućeg proteina koji se sastoji od homodimera izabranog od sledećih: (a) humani VL- mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VL– mišji zglobni – mišji CH2- mišji CH3; (c) humani VL- mišji CH2 - mišji CH3.
[0231] Opisan je miš sa onesposobljenim endogenim lokusom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži onesposobljeni ili izbrisani endogeni mišji lokus ADAM6, gde miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je eksprimovana u humanom ili mišjem ili humanom/mišjem ili drugom himernom antitelu. Sekvenca nukleinske kiseline može biti prisutna u tansgenu koji je interisan tako da je nasumično integrisan u mišji genom. Sekvenca nukleinske kiseline može biti na epizomu (npr., hromozomu) koji nije nađen kod prirodnog miša.
[0232] Miš može dalje da sadrži onesposobljeni endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina. Endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina može biti izabran od lokusa kapa (κ) i lambda (λ) lakih lanaca. Miš može da sadrži onesposobljeni endogeni lokus κ lakog lanca i onesposobljeni lokus λ lakog lanca, gde miš eksprimuje antitelo koje sadrži humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina i humani domen lakog lanca imunoglobulina. Humani domen lakog lanca imunoglobulina može biti izabran od humanog domena κ lakog lanca i humanog domena λ lakog lanca.
[0233] Opisan je genetički modifikovan miš koji eksprimuje himerno antitelo i eksprimuje ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog koji je funkcionalan u genetički modifikovanom mišu.
[0234] Himerno antitelo sadrži humane sekvence varijabilnog domena i konstantnog regiona miša.
[0235] Himerno antitelo može biti eksprimovano iz lokusa imunoglobulina. U jednom izvođenju, varijabilni domen teškog lanca himernog antitela je eksprimovan iz preuređenog endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina. Varijabilni domen lakog lanca himernog antitela može biti eksprimovan iz preuređenog endogenog lokusa lakog lanca imunoglobulina. Varijabilni domen teškog lanca himernog antitela i/ili varijabilnog domena lanca lakog himernog antitela može biti eksprimovan iz preuređenog (npr., preuređene sekvence nukleinske kiseline koja potiče iz nepreuređene sekvence nukleinske kiseline integrisane u životinjski genom na lokusu koji je drugačiji od enogenog lokusa). Varijabilni lanac lakog lanca himernog antitela može biti eksprimovan iz preuređenog transgena (npr., preuređena sekvenca nukleinske kiseline koja potiče od nepreuređene sekvence nukleinske kiseline integrisane u životinjski genom na lokusu koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina).
[0236] Transgen može biti eksprimovan iz transkripciono aktivnog lokusa, npr., lokusa ROSA26, npr., mišjeg (npr., miš) lokusa ROSA26.
[0237] Opisan je miš, koji sadrži humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina, gde humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži nehumanu sekvencu ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa.
[0238] Nehumani ortolog ili homolog ADAM6 može biti sekvenca koja je ortologna i/ili homologna sa mišjom sekvencom ADAM6, gde ortolog ili homolog je funkcionalan u mišu.
[0239] U specifičnom izvođenju, nehumana životinja je miš i ortolog ili homolog ADAM6 je iz životinje koja je izabrana od različitih vrsta miša, pacova i hrčka.
[0240] U specifičnom izvođenju, sekvenca ADAM6 je iz životinje izabrane od glodata superfamilije Dipodoidea i glodara iz superfamilije Muroidea. U specifičnom izvođenju, glodar je miš iz superfamilije Muroidea, i ortolog ili homolog ADAM6 je iz miša ili pacova ili hrčka iz superfamilije Muroidea.
[0241] U jednom izvođenju, nehumana sekvenca ADAM6 je smeštena između dva V segmenta gena. U jednom izvođenju, nehumana sekvenca ADAM6 jedna uz drugu između V i D segmenta gena. U jednom izvođenju, mišja sekvenca ADAM6 je smeštena između V i J segmenta gena. U jednom izvođenju, mišja sekvenca ADAM6 je smeštena jedno do drugog između D i J segmenta gena.
[0242] Opisan je genetički modifikovan miš, koji sadrži B ćelije koje eksprimuju humani VHdomen srodan sa humanim VLdomenom iz lokusa imunoglobulina, gde miš eksprimuje neimunoglobulinski nehumani protein iz loksua imunoglobulina. Neimunoglobulinski nehumani protein je protein ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment.
[0243] Neimunoglobulinski nehumani protein može biti protein glodara. Glodar može biti iz familije Muridae. Glodar može biti iz podfamilije Murinae. Glodar može biti izabran od miša, pacova i hrčka.
4
[0244] Humani domeni VHi VLmogu biti vezani direktno ili preko linkera za sekvencu konstantnog domena imunoglobulina. Sekvenca konstantnog domena može da sadrži sekvencu izabranu od regiona zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. Humani VLdomen može biti izabran od Vκ ili Vλ domena.
[0245] Opisan je miš, koji sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu susednu sa nehumanom sekvencom koja kodira protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment
[0246] Humana sekvenca imunoglobulina sadrži jedan ili VHsegmenata gena, jedan ili više DHsegmenata gena i jedan ili više JHsegmenata gena.
[0247] U jednom izvođenju, sekvenca imunoglobulina sadrži jean ili više VHsegmenata gena koji imaju visoku frekvencu u prirodnim humanim repertoarima. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHsegmenata gena sadrži ne više od dva VHsegmenta gena, ne više od tri VHsegmenta gena, ne više od četiri VHsegmenata gena, ne više od pet VHsegmenata gena, ne više od šest VHsegmenata gena, ne više od sedam VHsegmenata gena, ne više od osam VHsegmenata gena, ne više od devet VHsegmenata gena, ne više od 10 VHsegmenata gena, ne više od 11 VHsegmenata gena, ne više od 12 VHsegmenata gena, ne više od 13 VHsegmenata gena, ne više od 14 VHsegmenata gena, ne više od 15 VHsegemanta gena, ne više od 16, VHsegemanata gena, ne više od 17 VHsegmenata gena, ne više od 18 VHsegmenata gena, ne više od 19 VHsegmenata gena, ne više od 20 VHsegmenata gena, ne više od 21 VHsegmenata gena, ne više od 22 VHsegmenata gena ili ne više od 23 VHsegmenata gena.
[0248] U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHsegmenata gena sadrži pet VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHsegmenata gena sadrži 10 VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHsegmenata gena sadrži 15 VHsegmenata gena. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHsegmenata gena sadrži 20 VHsegmenata gena.
[0249] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 i VH3-74.
[0250] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 i VH6-1.
[0251] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 i VH5-51.
[0252] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 i VH5-51.
[0253] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 i VH4-59.
[0254] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 i VH4-39.
[0255] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH1-18, VH3-23 i VH4-39.
4
[0256] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH3-21, VH3-23 i VH3-30.
[0257] U različitim izvođenjima, VHsegmenti gena su izabrani od VH3-23, VH3-30 i VH4-39.
[0258] Nehumana životinja je miš, i miš sadrži zamenjene endogene mišje VHsegmente gena sa jednim ili više humanih VHsegmenata gena, gde humani VHsegmenti gena su operativno vezani za mišji CHregion gena, tako da miš preuređuje humane VHsegmente gena i eksprimuje reverzni himerni teški lanac imunoglobulina koji sadrži humani VHdomen i mišji CH. U jednom izvođenju, 90-100% nepreuređeni mišjih VHsegmenata gena je zamenjeno sa bar jednim nepreuređenim humanim VHsegmentom gena. U specifičnom izvođenju, svi ili suštinski svi endogeni mišji VHsegmenti gena su zamenjeni sa bar jednim nepreuređenim humanim VHsegmentom gena. U jednom izvođenju, zamena sa bar 19, bar 39, ili bar 80 ili 81 nepreuređenih humanih VHsegmenata gena. U jednom izvođenju, zamenjeno je sa bar 12 funkcionalno nepreuređenih humanih VHsegmenata gena, bar 25 funkcionalno nepreuređenih humanih VHsegmenata gena, ili bar 43 funkcionalnih nepreuređenih humanih VHsegmenata gena. U jednom izvođenju, miš sadrži zamenjene sve mišjie DHi JHsegmenate sa bar jednim nepreuređenim humanim DHsegmentom i bar jednim nepreuređenim humanim JHsegmentom. U jednom izvođenju, bar jedan nepreuređeni humani DHsegment je izabran od 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, i njihove kombinacije. U jednom izvođenju, bar jedan nepreuređeni humani JHsegment je izabran od 1, 2, 3, 4, 5, 6, i njihove kombinacije. U specifičnim izvođenjima, jedan ili više humanih VHsegmenata gena je izabrano od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanog VHsegmenta gena, i njihove kombinacije.
[0259] U različitim izvođenjima, sekvenca humanog imunoglobulina je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji. U jednom izvođenju, konstantni region je humani, himerni humani/mišji ili himerni humani/pacovski ili humani/hrčkov, ili konstantan region miša, pacova ili hrčka. U jednom izvođenju, konstantni region je konstantni region glodara (npr., miša ili pacova ili hrčaka). U specifičnom izvođenju, glodar je miš ili pacov. U različitim izvođenjima, konstantni region sadrži bar CH2 domen i CH3 domen.
[0260] Miš može dalje da sadrži humanu sekvencu lakog lanca imunoglobulina (npr., jednu ili više nepreuređenih sekvenci V i J lakog lanca, ili jednu ili više preuređenih VJ sekvenci) u greminativnoj liniji nehumane životinje. Sekvenca lakog lanca imunoglobulina može biti sekvenca κ lakog lanca imunoglobulina. Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može da sadrži jedan ili više VLsegmenata gena. Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može da sadrži jedan ili više JLsegmenata gena. Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može da sadrži jedan ili više VLsegmenata gena i jedan ili više JLsegmenata gena. Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može da sadrži bar 16 Vκ segmenata gena i pet Jκ segmenata gena. Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može da sadrži bar 30 Vκ segmenata gena i pet Jκ segmenata gena. Sekvenca humanog lakog lanca imunoglobulina može da sadrži bar 40 Vκ segmenata gena i pet Jκ segmenata gena. Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može biti operativno vezana za konstantni region u germinativnoj liniji miša. Konstanti region može biti humani, himerni humani/pacovski, konstantan region miša, pacova ili hrčka. Konstanti region može biti konstantni region miša ili pacova. Konstantni region može biti mišji κ konstantni (mCκ) region ili konstantni (rCκ) region pacova.
[0261] Miš može da sadrži zamenjene sve ili suštinski sve Vκ i Jκ segmente gena sa bar šest humanih Vκ segmenata gena i bar jednim segmentom Jκ gena. Svi ili suštinski svi Vκ i Jκ segmenti gena mogu
4
biti zamenjeni sa bar 16 humanih Vκ segmenata gena (humani Vκ) i bar jednim Jκ segmentom gena. Svi ili suštinski svi Vκ i Jκ segmenti gena mogu biti zamenjeni sa bar 30 humanih Vκ, segmenata gena i bar jednim Jκ segmentom gena. Svi ili suštinski svi Vκ i Jκ segmenti gena mogubiti zamenjeni sa bar 40 humanih Vκ segmenata gena i bar jednim Jκ segmentom gena. Bar jedan Jκ segment gena može da sadrži dva, tri, četiri ili pet humanih Jκ segmenata gena.
[0262] Humani Vκ segmenti gena mogu da sadrže Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, i Vκ1-6. U jednom izvođenju, Vκ segmenti gena sadrže Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15 i Vκ1-16. Humani Vκ segmenti gena mogu da sadrže Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, i Vκ2-30. U jednom izvođenju, humani Vκ segmenti gena sadrže Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i Vκ2-40.
[0263] Vκ segmenti gena mogu da sadrže susedne humane κ segmente gena imunoglobulina koji premošćuju humane lokuse κ lakog lanca imunoglobulina od Vκ4-1 do Vκ2-40, i Jκ segmenti gena sadrže susedne segmente gena koji premošćuju humane lokuse κ lakog lanca imunoglobulina od Jκ1 do Jκ5.
[0264] Humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina može biti smeštena na lokus lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša. Lokus lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša može biti lokus κ lakog lanca imunoglobulina. Humana selvenca lakog lanca imunoglobulina može biti smeštena na lokus lakog lanca neimunoglobulina u germinativnoj liniji miša koji je transkripciono aktivan. Lokus neimoglobulina može biti lokus ROSA26.
[0265] Opisan je postupak pripremanja humanog antitela, gde humano antitelo sadrži varijabilne domene koji potiču od jednog ili više varijabilnih regiona sekvence nukleinske kiseline kodiranih u ćeliji miša kako je ovde opisano.
[0266] Opisana je farmaceutska kompozicija, koja sadrži polipeptid koji sadrži antitelo ili fragment antitela koji potiče od jednog ili više varijabilnih regiona sekvenci nukleinske kiseline izolovanih iz miša kako je ovde opisano. Polipeptid može biti antitelo. Polipeptid može biti samo teški lanac antitela. Polipeptid može biti jedan lanac varijabilnog fragmenta (npr., scFv).
[0267] Opisana je upotreba miša kako je ovde opisano da bi se napravilo antitelo. Antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena koji potiču od jednog ili više varijabilnih regiona sekvenci nukleinske kiseline izolovanih iz miša. Varijabilni region sekvence nuklelotidne kiseline mogu sadržati segmente gena teškog lanca imunoglobulina. Varijabilni regioni sekvence nukleinske kiseline mogu da sadrže segmente gena lakog lanca imunoglobulina.
PRIMERI
[0268] Sledeći primeri su obezbeđeni tako da opisuju kako se dobijaju i koriste postupci i kompozicije prema pronalasku, i nije namera da se ograniči pronalazak, koji je definisan priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije navedno, navedena temperatura je po Celzijusu, a pritisak je blizu atmosferskog.
4
Primer 1
Humanizacija mišjeg gena imunoglobulina
[0269] Humani i mišji bakterijski veštački hromozomi (BACs) su korišćeni za konstruisanje 13 različitih BAC ciljnih vektroa (BACvecs) za humanizaciju mišjih lokusa teškog lanaca i κ lakog lanaca imunoglobulina. Tabele 1 i 2 prikazuju opis koraka izvršenih pri konstruisanju svih BACvecs korišćenih za humanizaciju mišjih lokusa teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina, respektivno.
[0270] Identifikacija humanih i mišjih BACs. Mišji BACs koji premoćuju 5’ i 3’ krajeve lokusa teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina su identifikovani sa hibridizacijom istačkanih filtera sa BAC bibliotekom ili PCR skriningim mišje BAC biblioteke DNK pula. Filteri su hibridizovan pod standarnim uslovim korišćenjem proba koje odgovaraju određenim regionima od interesa. Biblioteke pula su proverevane sa PCR korišćenjem jedinstvene tehnike parova prajmera koji okružuju ciljani region od interesa. Izveden je dodatni PCR u kome se koriste isti prajmeri da bi se dekonvulirao dati bunarčić i izolovao odgovarajući BAC od interesa. Oba BAC filtera i biblioteke pulova su stvorene od 129 SvJ mišjih ES ćelija (Incyte Genomics/Invitrogen). Humani BACs koji pokrivaju sve lokuse teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina su identifikovani ili hibridizacom sa istačkanim filterima sa BAC bibliotekom (Caltech B, C, ili D biblioteke & RPCl-11 biblioteke, Research Genetics/Invitrogen) preko skrininga gumanih BAC biblioteka pula (Caltech library, Invitrogen) pomoću postupka na bazi PCR ili korišćenjem baze podataka krajnje sekvence BAC (Caltech D library, TIGR).
[0271] Konstrukcija BACvecs bakterijskom homolognom rekombinacijom i spajanjem (ligacijom).
Bakterijska homologna rekombinacija (BHR) je izvedena kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003; Zhang et al., 1998, A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nat Genet 20:123-128). U većini slučajeva, linearni fragmenti su stvoreni spajanjem PCR-om stvorenih homolognih boksova za klonirane kasete, a zatim izolovanjem na gelu proizvoda spajanja i elektroporacijom u BHR-kompetentnu bakteriju koja gaji ciljni BAC. Posle selekcije u odgovarajućim petrijevim šoljama sa antibioticima, ispravno rekombinovani BACs su identifikovani sa PCR duž oba nova spoja, a zatim restrikcionom analizom na gelovima sa pulsnim poljem (Schwartz and Cantor, 1984, Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis, Cell 37:67-75) i kontrolom tačaka sa PCR korišćenjem prajmera raspoređenih duž humane sekvence.
[0272] 3hVH BACvec je konstruisan korišćenjem tri sekvencionalna koraka BHR kao početni korak humanizacije lokusa teškog lanca imunoglobulina (slika. 4A i tabela 1). U prvom koraku (korak 1), kaseta je uneta u humani roditeljski BAC ushodno od humanog VH1-3 segment gena koji sadrži region homologije sa mišjim lokusom teškog lanca imunoglobulina (HB1), gen koji doprinosi otpornosti na kanamicin u bakterijskim i otpornosti na G418 u životinjskim ćelijama (kanR) i mesto za mesto specifičnu rekombinaciju (npr., loxP). U drugom koraku (korak 2), druga kaseta je uneta baš nizhodno od poslednjeg JHsegmenta koji sadrži drugi region homologije sa mišjim lokusom teškog lanca imunoglobulina (HB2) i gen koji daje otpornost bakteriji na spektinomicin (specR). Ovaj drugi korak obuhvata brisanje humanih sekvenci lokusa teškog lanca imunoglobulina nizhodno od JH6 i BAC vektora gena otpornosti na hloranfenikol (cmR). U trećem koraku (korak 3), dvostruko modifikovani BAC (B1) je zatim linearizovan korišćenjem I-Ceul mesta koja su bila dodata u toku prva dva koraka i integrisana u mišji BAC (B2) sa BHR preko dva regiona homologije (HB1 i HB2). Odabir lekova za prvi (cm/kan), drugi (spec/kan) i treći (cm/kan) korak je osmišljen tako da bude specifičan za željene
4
proizvode. Modifikovani BAC klonovi su analizirani sa gel elektroforezom sa pulsnim poljem (PFGE) posle digestije sa restrikcionim enzimima da bi se odredila odgovarajuća konstrukcija (slika 4B).
[0273] Na sličan način, 12 dodatnih BACvecs je konstruisano za humanizaciju lokusa teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim slučajevima, BAC spajanje je izvedeno na mestu BHR da bi se spojila dva velika BACs pomoću uvođenja retkih restrikcionih mesta u oba roditeljska BACvecs sa BHR zajedno sa pažljivim smeštanjem selektibilnih markera. Ovo dozvoljava preživljavanje željenog spojenog proizvoda posle selekcije sa specifičnim kombinacijama lekova kao markera. Rekombinantni BACs dobijen spajanjem posle digestije sa retkim restrikcionim enzimima su identifikovani i provereni na sličan način sa onima dobijenim sa BHR (kako je gore opisano).
Tabela 1
Tabela 2
1
[0274] Modifikacija embrionskih stem ćelija (ES) i stvaranje miševa. Ciljanje ES ćelija (F1 H4) je izvedeno pomoću postupka VELOCIGENE® genetskog inženjeringa kako je opisano (Valenzuela et al., 2003). Derivatizacja miševa iz modifikovanih ES ćelija sa ili blastocitima (Valenzuela et al., 2003) ili 8-ćelijskom injekcijom (Poueymirou et al., 2007, F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol25:91-99) je obavljena kao što je opisano. Ciljane ES ćelije i miševi su potvrđeni provernom DNK iz ES ćelija ili miševa sa jedinstvenim setom proba i prajmera u testu zasnovanom na PCR (npr., slika 3A, 3B i 3C). Sva ispitivanja miševa su nadgledana i odobrena od stane Regeneron’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
[0275] Analize kariotipa i fluorescentna in situ hibridizacija (FISH). Analiza kariotipa je izvedena od strane Coriell Cell Repositories (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). FISH je izveden na ciljanim ES ćelijama kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003). Probe odgovaraju ili mišjoj BAC DNK ili humanoj BAC DNK su obeležena sa ‘nick’ translacijom (Invitrogen) sa fluorescentno obeleženim narandžastim spektrom ili zelenim spektrom dUTP nukleotida (Vysis).
2
[0276] Varijabilni lokusi gena teškog lanca imunoglobulina. Humanizacija varijabilnih regiona loksua teškog lanca je postignuta sa devet sekvencionalnih koraka direktnom zamenom oko tri miliona bazanih parova (Mb) kontinualne mišje genomske sekvence koja sadrži sve VH, DHi JHsegemnte gena sa oko jedan Mb kontinualne humane genomske sekvence koja sadrži ekvivalentne humane segmente gena (slika 1A i tabela 1) pomoću tehnologije VELOCIGENE® genetskog inženjeringa (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003).
[0277] Intron između JHsegmenata gena i gena konstantnog regiona (J-C intron) sadrži transkripcioni pojačivač (Neuberger, 1983, Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells, EMBO J 2:1373-1378) koji je praćen sa regionom jednostavnog ponavljanja potrebnog za rekombinaciju u toku prebacivanja izotipa (Kataoka et al., 1980, Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch, PNAS USA 77:919-923). Spoj između humanog VH-DH-JHregiona i mišjeg CH regiona (proksimalni spoj) je izabran da održi mišji intronski pojačivač teškog lanca i prebaci domen u cilju održavanja obe efikasne ekspresije i prebacivanja klase humanizovanog lokusa teškog lanca u okviru miša. Tačan položaj tog nukleotida i spoja koji sledi u svi zamenama je bilo moguć upotrebom postupka VELOCIGENE® genetskog inženjeringa (supra), u kome su korišćene bakterijske homologne rekombinacije vođene sintetizovanim oligonukleotidima. Prema tome, proksimalni spoj je smešten oko 200 bp nizhodno od poslednjeg JHsegmenta gena i distalni spoj je smešten nekoloko stotina ushodno od najvišeg 5’ VHsegmenta gena humanog lokusa i oko 9 kb nizhodno od mišjeg VH1-86 segmenta gena, takođe poznatog kao J558.55. Mišji VH1-86 (J558.55) segment gena je najdistalni segment gena teškog lanca, zabeleženo je da je psudogen u C57BL/6 miševima, ali potencijalno aktivan, mada sa siromašnom RSS sekvencom, u ciljanom 129 alelu. Distalni kraj mišjeg lokusa teškog lanca izgleda da može sadržati kontrolne elemente koji regulišu lokus ekspresije i/ili preuređivanja (Pawlitzky et al., 2006).
[0278] Prvo umetanje humane DNK sekvence imunoglobulina u miša je postignuto pomoću 144 kb proksimalnog kraja humanog lokusa teškog lanca koji sadrži 3 VH, svih 27 DHi 9 JHhumanih segmenata gena umetnutih u proksimalni kraj mišjeg IgH lokusa, sa istovremenim brisanjem 16.6 kb mišje genomske sekvence, korišćenjem oko 75 kb mišjeg homolognog kraka (korak A, slika 2A; tabele 1 i 3, 3hVH). Ovo veliko umetanje 144kb i prateće brisanje 16.6 kb je izvedeno u jednom koraku (Korak A) koji se javlja sa frevencom od 0.2% (tabela 3). Ispravno ciljane ES ćelije su bodovane testom gubitka prirodnog alela (loss-of-native-allele (LONA)) (Valenzuela et al., 2003) pomoću proba unutar i okolo izbrisane mišje sekvence i u okviru umetnute humane sekvence i integritet velikog humanog umetnutog dela je verifikovan pomoću višestrukih proba koje premošćuju celi umetnuti deo (slike 3A, 3B i 3C). Zbog toga što je predviđeno mnogo rundi sekvencijalni ciljnih ES ćelija, klonirane ciljne ES ćelije u ovom i svim sledećim koracima su podvrgnute analizi kariotipa (supra) i samo oni klonovi koji pokazuju normalne kariotipove u bar 17 do 20 rasejavanja su korišćeni u sledećim stupnjevima.
[0279] Ciljane ES ćelije iz koraka A su bile ponovo ciljane sa BACvec što dovodi do brisanja 19 kb na distalnom kraju lokusa teškog lanca (korak B, Slika 2A). BACvec iz koraka B sadrži gen za rezistentnost prema higromicinu (hyg) nasuprot gena rezistentnosti prema neominicu (neo) koji se nalazi u BACvec iz koraka A. Geni rezistentnosti iz dva BACvecs su bili konstruisani tako da, posle neuspešnog ciljanja u isti hromozom, približno tri Mb mišjeg varijabilnog lokusa gena teškog lanca imunoglobulina koji sadrži sve mišje VHsegmente gena drugačije od VH1-86 i sve DHsegmenate gena drugačije od DQ52, kao i dva restrikciona gena, su bili okruženi sa loxP mestima; DQ52 i svi mišji JHsegmenti gena lanca su obrisani u koraku A. Klonovi ES ćelija dvostruko ciljani na istom hromozomu su identifikovani vođenjem sa 3hVHproksimalnom kasetom do homozigotnosti u visokom G418 (Mortensen et al., 1992, Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct, Mol Cell Biol 12:2391-2395) prateći sudbinu distalne hyg kasete. Mišji segmenti do veličine od četiri Mb, koji su bili modifikovani na način da su okruženi sa loxP mestima, su bili uspešno obrisani u ES ćelijama trenutnom ekspresijom CRE rekombinaze sa visokom efikasnošću (do ≈11%) čak i odsustvu odabranog leka (Zheng et al., 2000, Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications, Mol Cell Biol 20:648-655). Na sličan način, pronalazači su postigli brisanje tri Mb u 8% klonova ES ćelija posle prolazne CRE ekspresije (korak C, slika 2A; tabela 3). Brisanje je ocenjeno sa LONA testom korišćenjem proba ili na svakom kraju izbrisane mišje sekvence, kao i gubitak neo i hyg i javljanje PCR proizvoda duž tačke brisanja koji sadrži samo preostala loxP mesta. Dalje, brisanje je potvrđeno flurescentnom in situ hibridizacijom (podaci nisu prikazani).
[0280] Ostatak humanog varijabilnog regiona teškog lanca je dodat u 3hVHalel u seriji od 5 koraka pomoću postupka VELOCIGENE® genetskog inženjeringa (koraci E-H, slika 2B), pri čemu svaki korak uključuje precizno umetanje do 210 kb humane sekvence gena. Za svaki korak, proksimalni kraj svakog novog BACvec je napravljen da se preklapa sa najdistalnijom humanom sekvencom iz prethodnog koraka i distalni kraj svakog novog BACvec sadrži isti distalni region mišje homologije koji je korišćen u koraku A. BACvecs iz koraka D, F i H koji sadrže neo selekcione kasete, dok oni iz koraka E i G sadrže hyg selekcione kasete, prema tome selekcije su izmenjene između G418 i higromicina. Ciljanje u koraku D je testirano sa gubitkom jedinstvenog PCR proizvoda duž distalnog loxP mesta hibridnog alela 3hVH. Ciljanje u koracima E do I je procenjeno gubitkom ranije selekcione kasete. U krajnjem koraku (korak I, slika 2B), neo selekciona kaseta, okružena sa Frt mestima (McLeod et al., 1986, Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle, Mol Cell Biol 6:3357-3367), je uklonjena prolaznom FLPe ekspresijom (Buchholz et al., 1998, Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis, Nat Biotechnol 16:657-662). Svaka humana sekvenca BACvecs za korake D, E i G potiče iz dve roditeljske humane BACs, dok one iz koraka F i H su obrazovane od pojedinačnih BACs. Zadržavanje humanih sekvenci je potvrđeno u svakom koraku pomoću višestrukih proba koje premošćuju umetnute humane sekvence (kao što je gore opisano npr., slika 3A, 3B i 3C). Samo oni klonovi sa normalnim kariotipom i germinativnim potencijalom su prenošeni u svakom koraku. ES ćelije iz krajnjeg koraka su bile još uvek u stanju da doprinesu germinativnoj liniji posle devet sekvencionalnih manipulacija (tabela 3). Miševi homozigotni za svaki od alela teškog lanca su bili sposobni za život, zdravi i pokazivali u suštini humoralni imuni sistem koji odgovara prirodnom (videti primer 3).
Tabela 3
4
[0281] Varijabilni lokusi κ lakog lanca imunoglobulina. Varijabilni region κ lakog lanca je humanizovan u osam sekvencijalnih koraka direktnom zamenom od oko tri Mb mišje sekvence koja sadrži sve Vκ i Jκ segmente gena sa oko 0.5 Mb humane sekvence koja sadrži proksimalne humane Vκ i Jκ segmente gena na način sličan kao kod teškog lanca (slika 1 B; tabele 2 i 4).
[0282] Varijabilni region humanog lokusa κ lakog lanca sadrži dva gotovo identična dela od 400 kb koji se ponavljaju i odvojeni su sa spejserom od 800 kb (Weichhold et al., 1993, The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity, Genomics 16:503-511). Zbog toga što su ta dva dela koji se ponavljaju toliko slična, gotovo svi od raznovrsnih lokusa mogu biti reprodukovani u mišu pomoću proksimalnih delova koji se ponavljaju. Dalje, zabeleženo prirodni humani alel lokusa κ lakog lanca kome nedostaje distalni deo koji se ponavlja (Schaible et al., 1993, The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals, Hum Genet 91:261-267). Pronalazači su zamenili oko tri Mb of mišje varijabilne sekvence gena κ lakog lanca sa oko 0.5 Mb humane varijabilne sekvence gena κ lakog lanca da efikasno zamenjuju sve mišje Vκ i Jκ segmente gena sa proksimalnim humanim Vκ i svim humanim Jκ segmentima gena (slika 2C i 2D; tabele 2 i 4). Nasuprot postupku opisanom u primeru 1 za lokus teškog lanca, čitav mišji Vκ region gena, koji sadrži sve Vκ i Jκ segmente gena, je izbrisan u tri koraka postupkom pre dodavanja bilo koje humane sekvence. Prvo, neo kaseta je uneta u proksimalni kraj varijabilnog regiona (korak A, slika 2C). Dalje, hyg kaseta je umetnuta na distalni kraj κ lokusa (korak B, slika 2C). Mesta prepoznavanja rekombinaze (npr., loxP) su ponovo smeštena između svake selekcione kasete tako da CRE tretman uključuje brisanje preostala 3 Mb mišjeg Vκ regiona zajedno sa oba gena rezistencije (korak C, slika 2C).
[0283] Humani genomski fragment veličine od oko 480 kb koji sadrži celokupni varijabilni region κ lakog lanca imunoglobulina je umetnut u četiri sekvencionalna koraka (slika 2D; tabele 2 i 4), sa do 150 kb humane sekvence κ lakog lanca imunoglobulina umetnutim u jednom koraku, pomoću postupaka sličnih onima korišćenim za težak lanac (videti primer 1). Krajni gen rezistencije na hidromicin je uklonjen prolaznom FLPe ekspresijom. Kao kod teškog lanca, kod ciljanih ES ćelijski klonova procenjivan je integritet celokupnog umetnutog humanog dela, normalni kariotip i potencijal germinativne linije posle svakog koraka. Miševi homozigotni za svaki od alela κ lakog lanca je ustanovljeno da su zdravi i normalnog izgleda.
Tabela 4
Primer 2
Stvaranje potpuno humanizovanih miševa kombinacijom višestruko humanizovanih alela imunoglobulina
[0284] U nekoliko tačaka, ES ćelije koje nose deo humanih varijabilnih repertoara teškog lanca ili κ lakog lanca imunoglobulina kako je opisano u primeru 1 su mikro injektovane i dobijeni miševi su ukrštani da bi se dobile višestruke verzije VELOCIMMUNE® miševa sa progresivno višim frakcijama humanih germinativnim linijama repertoara imunoglobulina (tabela 5; slika 5A i 5B). VELOCIMMUNE® 1 (V1) miševi sadrže osamnaest humanih VHsegmenta gena i sve humane DHi JHsegmente gena kombinovane sa šesnaest humanih Vκ segmenata gena i svim humanim Jκ segmentima gena. VELOCIMMUNE® 2 (V2) i VELOCIMMUNE® (V3) miševi imaju povećane varijabilne repertoare koje nose ukupno trideset devet VHi trideset Vκ, i osamdesest VHi četrdeset Vκ, respektivno. S obzorom da genomski regioni kodiraju mišje VH, DHi JHsegmente gena, i Vκ i Jκ segmenti gena su bilo kompeletno zamenjeni, antitela proizvedena od svih verzija VELOCIMMUNE® miševa sadrže varijabilne regione povezane za mišjim konstantnim regionima.
[0285] Mišji lokusi λ lakih lanaca ostaju intaktni u različitim izvođenjima VELOCIMMUNE® miševa i služe kao komparator za efiksnost ekspresije raličitih VELOCIMMUNE® lokusa κ lakog lanca.
[0286] Miševi dvostruko homozigotni za obe humanizacije teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina su stvoreni iz podseta alela opisanih u primeru 1. Svi genotipovi primećeni u toku ukrštanja da bi se stvorili dvostruko homozigotni miševi su se javili u grubim Mendelovim proporcijama. Muški potomci homozigota za svaki humani alel teškog lanca pokazivali su smanjenu plodnost, koja je bila posledica gubitka mišje ADAM6 aktivnosti. Lokusi varijabilnih gena teškog lanca sadrže dva ugrađena funkcionalna gena ADAM6 (ADAM6a i ADAM6b). U toku humanizacije mišjeg varijabilnog lokusa gena teškog lanca, umetnuta humana genomska sekvenca sadži pseudogen ADAM6. Mišji ADAM6 može biti potreban za plodnost, i prema tome nedostatak mišjih gena ADAM6 u humanizovanim varijabilnim lokusima gena teškog lanca vode do redukcije u plodnosti uprkos prisutnosti humanog pseudogena. Primeri 7-11 opisuju restrukturiranje mišjih gena ADAM6 u humanizovane varijabilne lokuse gena teškog lanca, i obnovu prirodnog nivoa plodnosti u miševima sa humnaizovanim lokusima teških lanaca imunoglobulina.
Tabela 5
Primer 3
Populacije limfocita u miševima sa humanizovanim genima imunoglobulina
[0287] Populacije zrelih B ćelija u tri različite verzije VELOCIMMUNE® miševa su procenjivane protočnom citometrijom.
[0288] Ukratko, suspenzije ćelija iz koštane srži, slezine i timusa su napravljene standardnim postupcima. Ćelije su resuspendovane pri 5x10<5>ćelija/mL u BD Pharmingen FACS puferu za bojenje, blokirane sa anti-mišjim CD16/32 (BD Pharmingen), obojene sa odgovrajućim koktelom antitela i fiksirane sa BD CYTOFIX<TM>sve prema uputstvima proizvođača. Krajnje ćelijske kuglice su resuspendovene u 0.5 mL pufera za bojenje i analizirane pomoću BD FACSCALIBUR<TM>i BD CELLQUEST PRO<TM>softvera. Sva antitela (BD Pharmingen) su pripremljena u masenom razblaženju/koktela i dodata do krajnje koncentracije od 0.5 mg/10<5>ćelija.
[0289] Kokteli antitela za bojenje koštane srži (A-D) su bili kao što sledi: A: anti-mišji IgM<b>-FITC, antimišji Ig- M<a>-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; B: anti-mišji-(CD437)-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; C: anti-mišji CD24(HSA)-PE; anti-mišji CD45R(B220)-APC; D: anti-mišji BP-1-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC.
[0290] Kokteli antitela za bojenje slezine i preponskog limfnog čvora (E-H) su bili kao što sledi: E: antimišji IgM<b>-FITC, anti-mišji IgM<a>-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; F: anti-mišji Ig, λ1, λ2, λ3 laki lanac-FITC, anti-mišji Igκ laki lanac-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; G: anti-mišji Ly6G/C-FITC, anti-mišji CD49b(DX5)-PE, anti-mišji CD11b-APC; H: anti-mišji CD4(L3T4)-FITC, anti-mišji (B220)-PE, anti-mišji CD8a-APC. Rezultati su prikazani na slici 6.
[0291] Limfociti izolovani iz slezine ili limfnih čvorova homozigotnih VELOCIMMUNE® miševa su bojeni za površinsku ekspresiju markera B220 i IgM i analizirani pomoću protočene citometrije (slika 6). Veličina B220<+>IgM<+>populacija zrelih B ćelija u svim verzijama VELOCIMMUNE® miševa testiranim su praktično bile identične onim prirodnih miševa, bez obrzira na broj VHsegmenata gena koje one sadrže. Pored toga, miševi koji sadrže homozigotne hibride humanizovanih lokusa teškog lanca imunoglobulina, čak i one sa samo 3 VHsegmenta gena, ali normalnim mišjim lokusima κ lakog lanca imunoglobulina ili miševi koji sadrže homozigotni hibrid humanizovanih lokusa κ lakog lanca sa normalnim mišjim lokusima teškog lanca imunoglobulina, takođe imaju normalne brojeve B220<+>IgM<+>ćelija u njihovim preifernim kompartmentima (nije prikazano). Ovi rezultati ukazuju da himerni lokusi sa humanim varijabilnim segmentima gena i mišjim konstantnim regionima mogu u potpunosti nastanjivati kompartment zrelih B ćelija. Dalje, broj lokusa varijabilnih segmenata gena ili na teškom lancu ili na κ lakom lancu i prema tome teorijski diverzitet repertoara antitela, nije u korelaciji sa sposobnošću stvaranja populacija zrelih mature B ćelija prirodnog tipa. Nasuprot tome, miševi sa nasumično integrisanim potpuno humanim transgenima imunoglobulina i inaktiviranim mišjim lokusima imunoglobulina imaju smanjeni broj B ćelija u ovim kompartmentima, sa opasnošću od deficita u zavisnosti od broja varijabilnih segmenata gena uključenih u transgen (Green and Jakobovits, 1998, Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495). Ovo pokazuje da strategija "in situ genetske humanizacije" dovodi do fundamentalno različitog funkcionalnog ishoda od nasumično integrisanih transgena postignutih u "‘knockout‘-plus-transgenskom" prilazu.
[0292] Ekskluzija (isključenje) alela i izbor lokusa. Sposobnost održavanja eksluzije alela je ispitivan kod miševa heterozigotnih za različite verzije humanizovanih lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0293] Humanizacija lokusa imunoglobulina je izvedena u F1 ES liniji (F1H4, Valenzuela et al., 2003), koja potiče iz 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac heterozigotnih embriona. Varijabilne sekvence gena germinativne linije humanog teškog lanca su ciljane u 129S6 alel, koji nosi IgM<a>haplotip, dok nemodifikovani mišji C576BL/6N alel nosi IgM<b>halotip. Ovi oblici alela IgM mogu se razlikovati protočnom citometrijom pomoću antitela specifičnih za polimorfizam nađen kod IgM<a>ili IgM<b>alela. Kao što je prikazano na slici 6 (donji red), B ćelije indentifikovane u mišu heterozigotnom za svaku verziju humanizovanog lokusa teškog lanca samo eksprimuju jedan alel, ili IgM<a>(humanizovani alel) ili IgM<b>(prirodni tip alela). Ovo pokazuje da mehanizmi uključeni u ekskluziju alela su netaknuti u VELOCIMMUNE® miševima. Dodatno, relativni broj B ćelija pozitivnih za humanizovane alele (IgM<a>) je grubo proporcionalan sa brojem prisutnih VHsegmenata gena. Humanizovani imunoglobulinski lokus je eksprimovan u približno 30% B ćelija u VELOCIMMUNE® 1 heterozigotnim miševima, koji imaju 18 humanih VHsegmenata gena, i u 50% B ćelija u VELOCIMMUNE® 2 i 3 (nije prikazano) heterozigotnih miševa, sa 39 i 80 humanih VHsegmenata gena, respekivno. Značajno, odnos ćelija koje eksprimuju humanizovane naspram prirodnih mišjih alela (0.5 za VELOCIMMUNE® 1 miševe i 0.9 za VELOCIMMUNE® 2 miševe) je veći nego odnos broja varijabilnih segemanata gena koji se nalaze u humanizovanim naspram prirodnih lokusa (0.2 za VELOCIMMUNE® 1 miševe i 0.4 za VELOCIMMUNE® 2 miševe). Ovo može ukazivati da verovatnoća izbora alela je u sredini između nasumičnog izbora jednog ili drugog hromozoma i nasumišnog izbora bilo kog određenog V segmenta RSS. Dalje, mogu postojati frakcije B-ćelija, ali ne sve, u kojima aleli postaju pristupačni za rekombinaciju, završavaju postupak i zaustavljaju rekombinaciju pre nego što drugi aleli postanu pristupačni. Dodatno, ravnomerna raspoređenost ćelija koje imaju površinski IgM (sIgM) koji potiče od ili hibrida humanizovanog lokusa teškog lanca ili prirodnog mišjeg lokusa teškog lanca je dokaz da hibridni lokus radi na normalnom nivou. Nasuprot tome, nasumično integrisani humani transgeni imunoglobulina se jedva takmiče sa prirodnim mišjim lokusima imunoglobulina (Bruggemann et al., 1989, A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice, PNAS 86:6709-6713; Green et al., 1994; Tuaillon et al., 1993, Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts, PNAS USA 90:3720-3724). Ovo dalje pokazuje da imunoglobulini proizvedeni od VELOCIMMUNE® miševa su funkcionalno različiti od onih koji se proizvode nasumično integrisanim transgenima u miševima napravljenim sa "‘knockout‘-plustransgenskim" prilazima.
[0294] Polimorfizam u Cκ regionima nije dostupan u 129S6 ili C57BL/6N da bi se ispitala ekskluzija alela humanizovanih naspram nehumanizovanih lokusa κ lakog lanca. Međutim, svi VELOCIMMUNE® miševi poseduju prirodni mišji lokus λ lakog lanca, pa je prema tome, moguće primetiti da li preuređivanje i ekspresija humanizovanih lokusa κ lakog lanca može sprečiti ekspresiju mišjeg λ lakog lanca. Odnos broja ćelija koja eksprimuju humanizovani κ laki lanac u odnosu na broj ćelija koje eksprimuju mišji λ laki lanac su bile relativno nepromenjene u VELOCIMMUNE® miševima u poređenju sa prirodnim tipom miša, bez obzira na broj humanih Vκ segmenata gena umetnutih na lokus κ lakog lanca (slika 6, treći red odozgo). Dodatno ne postoji porast u broju dvostruko pozitivnih (κ plus λ) ćelija, što ukazuje da produktivna rekombinacija na hibridnom lokusu κ lakog lanca rezultuje u odgovarajućom supresijom rekombinacije mišjih lokusa λ lakog lanca. Nasuprot tome, miševi koji sadrže nasumično integrisane transgene κ lakog lanca sa inaktiviranim mišjim lokusima κ lakog lanca- ali sa mišjih lokusa λ lakog lanca prirodnog tipa -pokazuju dramatično povećane odnose λ/κ (Jakobovits, 1998), ukazujući da uneti transgeni κ lakog lanca ne funkcionišu dobro u takvim miševima. Ovo dalje pokazuje da različiti funkcionalni ishodi primećeni kod imunoglobulina dobijenih sa VELOCIMMUNE® miševima u poređenju sa onim napravljenim sa "‘knockout‘-plus-transgenim" miševima.
[0295] Razvoj B ćelija. Pošto populacija zrelih B ćelija u VELOCIMMUNE® miševima liči na onu prirodnih miševa (gore opisano), moguće je da su defekti u ranoj diferencijaciji B ćelija kompenzovani ekspanzijom populacija zrelih B ćelija. Različiti stupnjevi diferencijacije B ćelija su ispitivani analizom B ćelija pomoću protočne citometrije. Tabela 6 prikazuje odnos frakcija ćelija u svakoj B ćelijskoj linij definisanoj sa FACs, pomoću specifičnih markera na ćelijskoj površini, u VELOCIMMUNE® miševima u poređenju sa prirodnim miševima iz istog legla.
[0296] Rani razvoj B ćelija se javlja u koštanoj srži, i različiti stupnjevi diferencijacije B ćelija su karakterisani promenama u tipovima i količinama ekspresije markera na ćelijskoj površini. Ove razlike u površinskoj ekspresiji su u vezi sa molekularnim promenama koje se javljaju u lokusima imunoglobulina unutar ćelije. Pro-B u pre-B ćelijski prelaz zahteva uspešna preuređivanja i ekspresiju funkcionalnih proteina teškog lanca, dok prelaz iz pre-B u zreli B stupnj je vođen ispravnim preuređivanjem i ekspresijom κ ili λ lakog lanca. Prema tome, neefikasni prelaz između stupnjeva diferencijacije B ćelija može biti detektovan promenama u relativnim populacijama B ćelija u datom stupnju.
Tabela 6
[0297] Veći defektni nisu primećeni u diferencijaciji B ćelija u bilo kojim VELOCIMMUNE® miševima. Unošenje humanih segmenata gena teškog lanca izgleda da ne utiče na prelaz pro-B u pre-B, i unošenje humanih segemnata κ lakog lanca ne utiče na prelaz pre-B u B u VELOCIMMUNE® miševima. Ovo pokazuje da "reverzni himerni" molekuli imunoglobulina koji poseduju humane varijabilne regione i mišje konstantne funkcionišu normalno u kontekstu signalizacije B ćelija i molekula koreceptora koji vode do odgovarajuće diferencijacije u mišjem okruženju. Nasuprot tome, poremećena je ravnoteža između različitih populacija u toku diferencijacije B ćelija u različitoj meri u miševima koji sarže nasumično integrisane transgene i inaktivirane endogene lokuse teškog lanca ili κ lakih lanaca (Green and Jakobovits, 1998).
Primer 4
Varijabilni genski repertoar u humanizovanim mišjim imunoglobulinima
[0298] Upotreba humanih varijabilnih genskih segmenata u repertoarima humanizovanih antitela VELOCIMMUNE® miševa je analizirana lančanom reakcijom reverzne transkriptaze-polimeraze (RT-PCR) humanih varijabilnih regiona iz višestrukih izvora uključujući spenocite i ćelije hibridoma. Određivane su varijabilne sekvence regiona, upotreba segmenata gena, somatska hipermutacija i različitost spojeva preuređenih varijabilnih regiona segmenata gena.
[0299] Ukratko, ukupna RNK je ekstrahovana iz 1x10<7>- 2x10<7>splenocita ili oko 10<4>- 10<5>ćelija hibridoma pomoću TRIZOL™ (Invitrogen) ili Qiagen RNEASY™ Mini Kit (Qiagen) i prajmirana sa mišjim specifičnim prajmerima konstantnog regiona pomoću SUPERSCRIPT™ III jednostepenog RT-PCR sistema (Invitrogen). Reakcije su izvedene sa 2-5 μL RNK iz svakog uzorka pomoću gore pomenutog 3’ konstantnog specifičnog prajmera sparenog sa objedinjenim vodećim prajmerima svake familije humanih varijabilnih regiona za oba, teški lanac i κ laki lanac, odvojeno. Zapremine reagenasa i prajmera, i uslovi RT-PCR/PCR su izvedeni prema uputstvima proizvođača. Sekvence prajmera su zasnovane na višestrukim izvorima (Wang and Stollar, 2000, Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR, J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Kada je prikladna, uklopljene sekundarne PCR reakcije su izvedene sa prajmerima u specifičnom okviru iz pula familije i isti mišji 3’ specifični prajmer sa konstantim imunoglobinom je korišćen u primarnoj reakciji. Alikvoti (5 μL) iz svake rakcije su analaizirani agaroznom elektroforezom i rekacioni proizvodi su prečišćeni od agaroze pomoću MONTAGE™ kita za gel ekstrakciju (Millipore). Prečišćeni proizvodi su klonirani pomoću TOPO™ TA klonirajućeg sistema (Invitrogen) i transformisani u ćelije DH10 β E. coli elektroporacijom. Pojedinačni klonovi su selektovani iz svake transformacione reakcije i gajeni u 2 mL LB bujona za kulture sa selekcijom antibiotika u toku noći na 37°C. Plazmid DNK je prečišćen iz bakterijskih kultura pomoću kita (Qiagen).
[0300] Korišćenje varijabilnih gena imunoglobulina. Plazmid DNK oba klona teškog lanca i κ lakog lanca je sekvencioniran sa ili T7 ili M13 reverznim prajmerima na ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Neobrađeni podaci o sekvenci su uneti u SEQUENCHER™ (v4.5, Gene Codes). Svaka sekvenca je sklopljena u kontinualnu sekvencu i poravnata sa humanim imunoglobulinskim sekvencama pomoću IMGT V-Quest (Brochet et al., 2008, IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis, Nucleic Acids Res 36:W503-508) funkcije za pretragu da bi se identifikovala upotreba humanih VH, DH, JHi Vκ, Jκ segmenata. Sekvence su poređene sa germinativnom linijom sekvenci za somatske hipermutacije i analizom rekombinacionih spojeva.
[0301] Miševi su stvoreni iz ES ćelija koji sadrže inicijalne modifikacije teškog lanca (3hVH-CRE hibridni alele, donji deo slike 2A) sa RAG komplementacijom (Chen et al., 1993, RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development, PNAS USA 90:4528-4532), i cDNA je pripremljen iz splenocita RNK. cDNK je pojačan korišćenjem setova prajmera (gore opisanih) specifičnih za predviđene himerne teške lance mRNK koji će nastati V(D)J rekombinacijom unutar umetnutih humanih segmenata gena i naknadnog splajsovanja sa ili mišjim IgM ili IgG konstantnim domenima. Sekvence koje potiču od ovih cDNK klonova (nije prikazano) su pokazale da se prava V(D)J rekombinacija desila u okviru humanih varijabilnih sekvenci gena, da preuređeni humani V(D)J segmenti gena su pogodno splajsovani u okviru za mišje konstantne domene i da se desilo prebacivanje klase rekombinacije. Izvedena je dalja analiza sekvenci proizvoda mRNK naknadnih hibrida lokusa imunoglobulina.
[0302] U sličnom eksperimentu, B ćelije iz nehumanizovanog prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® miševa su odvojene protočnom citometrijom na osnovu površinske ekspresije B220 i IgM ili IgG. B220<+>IgM<+>ili površinske IgG<+>(sIgG<+>) ćelije su sakupljene i VHi Vκ sekvence su dobijena posle RT-PCR amplifikacije i kloniranja (gore opisanog). Korišćenje reprezentativnih gena u setu RT-PCR amplifikovanog cDNKAs iz neimunizoranih VELOCIMMUNE® 1 miševa (tabela 7) i VELOCIMMUNE® 3 miševi (tabla 8) je zabeleženo (*defektna RSS; †nedostaje ili pseudogen). Zvezdica: segmenti gena sa defektnom RSS. †: segment gena koji nedostaje ili pseudogen.
Tabela 7
VHprimećeno DHprimećeno Vκ primećeno
1
2
[0303] Kao što je prikazano u tabelama 7 i 8, korišćeni su gotovo svi funkcionalni humani VH, DH, JH, Vκ i Jκ segmenti gena. Od opisanih funkcionalnih varijabilnih segmenata gena ali ne i detektovanih u VELOCIMMUNE® miševima ovog eksperimenta, nekoliko je bilo zabeleženo da poseduje defektne rekombinacione signalne sekvence (recombination signal sequences (RSS)) i prema tome, ne bi se očekivalo da budu eksprimovane (Feeney, 2000, Factors that influence formation of B cell repertoire, Immunol Res 21:195-202). Analize nekoliko drugih setova sekvenci imunoglobulina iz različitih VELOCIMMUNE® miševa, izolovane iz oba i prirodnih i imunizovanih repertora, su pokazale koriščenje ovih segmenata gena, i ako sa niskim frekvencama (podaci nisu prikazani). Upotreba podataka agregata gena je pokazala da su svi funkcionalni humani VH, DH, JH, Vκ, i Jκ segmenti gena koji se nalaze u VELOCIMMUNE® miševima primećeni u različitim prirodnim i imuniziranim repertoarima (podaci nisu prikazani). Mada humani VH7-81 segment gena je bio identifikovan u analizi humanih sekvenci lokusa teškog lanca (Matsuda et al., 1998, The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus, J Exp Med 188:2151-2162), nije prisutan u VELOCIMMUNE® miševima što je potvrđeno sa ponovljenim sekvencioniranjem VELOCIMMUNE® 3 mišjeg genoma.
[0304] Sekvence teških i lakih lanaca antitela je poznato da pokazuju izuzetnu varijabilnost, naročito u kratkim polipeptidnim segmentima u okviru preuređenih varijabilnih domena. Ovi regioni, poznati kao hipervarijabilni regioni ili regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), obrazuju vezujuće mesto za antigen u strukturi molekula antitela. Interventne polipeptidne sekvence su nazvane regioni okvira (FRs). Postoje tri CDRs (CDR1, CDR2, CDR3) i 4 FRs (FR1, FR2, FR3, FR4) u oba i teškom i lakom lancu. Jedan CDR, CDR3, je jedinstven u tome da je CDR stvoren rekombinacijom oba i VH, DHi JHi Vκ i Jκ segmenata gena i stvara značajnu količinu raznovrsnog repertoara pre susreta sa antigenom. Ovo spajanje je neprecizno usled oba brisanja nukleotida preko aktivnosti egzonukleaze i kodiranih adicija koje nisu po šablonu, preko terminalne deoksinukleotidil transferaze (TdT) i na taj način, je omogućen nastanak nove sekvence iz rekombinantnog postupka. Mada FRs mogu pokazivati suštinske somatske mutacije usled visoke mutabilnosti varijabilnih regiona u celini, varijabilnost nije, međutim, raspoređena ravnomerno duž varijabilnog regiona. CDRs su koncentrovani i lokalizovani regioni visoke varijabilnosti na površini molekula antitela koji omogućavaju vezivanje za antigen. Sekvence teškog lanca i lakog lanca odabranih antitela iz VELOCIMMUNE® miševa oko CDR3 spoja pokazuju raznovrsnost spoja kako je prikazano na slici 7A i 7B, respektivno.
[0305] Kako je prikazano na slici 7A, nukleotidne adicije koje nisu kodirane po šablonu (N-adicije) su primećene u oba VH-DHi DH-JHspoja u antitelima iz VELOCIMMUNE® miševa, što ukazuje na ispravne funkcije TdT sa humanim segmentima. Krajnje tačke VH, DHi JHsegmenata relativno prema njihovim germinativnim odgovarajućim delovima ukazuju da je došlo do egzonukleazne aktivnosti. Suprotno lokusu teškog lanca, ponovno preuređivanja humanog κ lakog lanca pokazuje malo ili je bez adicija TdT na CDR3, što je obrazovano rekombinacijom Vκ i Jκ segmenata (slika 7B). Ovo se očekuje usled nedostatka ekspresije TdT kod miševa u toku preuređivanja lakog lanca u toku ćelijskom prelazu pre-B u B. Primećena raznovrsnost kod CDR3 preuređenih humanih Vκ regiona je uneta pretežno pomoću egzonukleazne aktivnosti u toku rekombinacije.
[0306] Somatska hipermutacija. Dodatna raznovrsnost je dodata u varijabilne regione preuređenih gena imunoglobulina u toku reakcije u germinalnim centrima sa postupkom nazvanim somatska hipermutacija. B ćelije eksprimuju somatski mutirane varijbilne regione koji se takmiče sa ostalim B ćelijama za pristup antigenu prezentovanom od strane folikularnih dendritičnih ćelija. One B ćelije sa višim afinitetom za antigen će se dalje razvijati i podleći prebacivanju klase pre izlaska na periferiju. Prema tome, B ćelije koje eksprimuju prebačene izotipove tipično su se srele sa antigenom i podlegle reakciji u germinalnim centrima imaće povećane brojeve mutacija u odnosu na prirodne B ćelije. Dalje sekvence varijabilnih regiona iz pretežno prirodnih sIgM<+>B ćelija bi bilo očekivano da imaju relativno manje mutacija nego varijabilne sekvence iz sIgG<+>B ćelija koje su podlegle selekciji antigena.
[0307] Sekvence iz nasumičnih VHili Vκ konova iz sIgM<+>ili sIgG<+>B ćelija iz neimunizovanih VELOCIMMUNE® miševa ili sIgG<+>B ćelija iz imuniziranih miševa su bile poređene sa njihovim varijabilnim segmenatima gena germinativne linije ili promenama u odnosu na zabeležene sekvence germinativne linije . Dobijene nukleotidne sekvence su prevedene in silico i mutacije koje su vodile do promene amino kiselina su takođe zabeležene. Podaci su sakupljeni iz svih varijabilnih regiona i procenat promene je izračunat na datim mestima (slika 8).
[0308] Kao što je prikazano na slici 8, varijabilni regioni humanog teškog lanca koji potiču iz sIgG<+>B ćelija iz neimuniziranih VELOCIMMUNE® miševa prikazuju mnogo više nukleotida u odnosu na sIgM<+>B ćelije iz istog pula splenocita, a varijabilni regioni teškog lanca koji potiču iz imuniziranih miševa
4
pokazuju čak više promena. Broj promena je povećan u regionima za određivanje komplemntarnosti (CDRs) u odnosu na regione okvira, ukazujući na selekciju antigena. Odgovarajuće amino kiselinske sekvence iz varijabilnih regiona humanog teškog lanca takođe pokazuju značajno veći broj mutacije u IgG naspram IgM i čak viši kod imuniziranog IgG. Ove mutacije se ponovo dešavaju sa većom frekvencom u CDRs u poređenju sa sekvencama okvira, sugerišući da su antitela bila selektovana na antigen in vivo. Sličan porast u broju nukleotida i mutacija amino kiselina je viđen kod Vκ sekvencama koje potiču iz IgG<+>B ćelija iz imuniziranih miševa.
[0309] Korišćenje gena i frekvenca somatske hipermutacije primećena kod VELOCIMMUNE® miševa pokazala je da esencijalno svi prisutni segmenti gena su sposobni za ponovno preuređivanje da bi se obrazovala potpuno funkcionalna reverzna himerna antitela u ovim miševima. Dalje VELOCIMMUNE® antitela potpuno učestvuju u okviru mišjeg imunog sistema podležu afinitetnoj selekciji i zrenju da bi se stvorila potpuno zrela humana antitela koja mogu efikasno neutralizovati njihov ciljni antigen. VELOCIMMUNE® miševi su u stanju da podstaknu jak imuni odgovor na višestruke klase antigena što dovodi do upotrebe širokog spektra antitela koja su i visokog afiniteta i pogodna za terapeutsku upotrebu (podaci nisu prikazani).
Primer 5
Analiza limfoidnih struktura i izotipova seruma
[0310] Ukupne strukture uzoraka slezine, preponskih limfnih čvorova, Pajerovih ploča i timusa iz prirodnih ili VELOCIMMUNE® miševa obojene sa H&E su bile ispitivane svetlosnom mikroskopijom. Nivoi izotipova imunoglobulina u serumu sakupljenom iz prirodnih i VELOCIMMUNE® miševa su bili analizirani pomoću LUMINEXTM tehnologije.
[0311] Struktura limfoidnih organa. Struktura i funkcija limfoidnih tkiva je delom zavisna od ispravnog razvoja hematopoietskih ćelija. Defekt u razvoju B ćelija ili funkciji može biti prikazan kao izmena u strukturi limfoidnog tkiva. Posle analize obojenih delova tkiva, nije identifikovana značajna razlika u izgledu sekundarnih limfoidnih organa između prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® miševa (podaci nisu prikazani).
[0312] Nivoi imunoglobulina u serumu. Nivo ekspresije svakog izotipa je sličan u prirodnim i VELOCIMMUNE® miševima (slika 9A, 9B i 9C). Ovo pokazuje da humanizacija varijabilnih segmenata gena nema očiglednih neželjenih efekata na prebacivanje klase ili ekspresiju imunoglobulina i sekreciju i prema tome očigledno zadržava sve endogene mišje sekvence neophodne za ove funkcije.
Primer 6
Imunizacija i proizvodnja antitela u miševima sa humanizovanim imunoglobulinom
[0313] Različite verzije VELOCIMMUNE® miševa su imunizirane sa antigenom da bi se ispitao humoralni odgovor na izazivanje sa stranim antitelima.
[0314] Imunizacija i razvoj hibridoma. VELOCIMMUNE® i prirodni miševi mogu biti imunizirani sa antigenom u obliku proteina, DNK, kombinacijom DNK i proteina ili ćelija koje eksprimuju antigen. Životinje su tipično izazivane svake tri nedelje, ukupno dva ili tri puta. Posle svakog izazivanja sa antigenom, uzorci seruma od svake životinje su sakupljeni i analiziran je odgovor antitela specifičnih za antigen određivanjem titra seruma. Pre spajanja, miševi su dobili poslednji pre-fuzioni rastvor za izazivanje od 5 μg proteina ili DNK, kako je pogodno, pomoću intra-peritonealne i/ili intravenske injekcije. Splenocite su sakupljene i spojene sa Ag8.653 mijeloma ćelijama u elektrofuzionoj komori prema protokolu sugerisanom od proizvođača (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD). Deset dana posle kultivisanja, hibridome su ispitivane na specifičnost na antigen korišćenjem ELISA testova (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York). Alternativno, B ćelije specifične na antigen su izolovane direktno iz imuniziranih VELOCIMMUNE® miševa i ispitivane korišćenjem standardnih tehnika, uključujući one ovde opisane, da bi se dobila humana antitela specifična za antigen od interesa (npr., videti US 2007/0280945A1).
[0315] Određivanje titra u serumu. Da bi se u serumu pratio anti-antigen odgovor životinja, sakupljeni su uzorci seruma oko 10 dana posle svakog izazivanja i titri su određeni korišćenjem ELISA specifičnih za antigen. Ukratko,ploče sa 96 bunarčića Nunc MAXISORPTM su prevučene sa 2 μg/mL antigena u toku noći na 4° C i blokirane sa albuminom iz goveđeg seruma (Sigma, St. Louis, MO). Uzorci seruma u serijskom 3-strukom razblaženu je omogućeno da se vežu za ploče u toku jednog sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane sa PBS koji sadrži 0.05% Tween-20 i vezani IgG je detektovan pomoću HRP-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) za ukupnil IgG titar, ili poliklonalna antitela specifična za izotip obeležena sa biotinom ili specifična za laki lanac (Southern Biotech Inc.) za titre specifičnih izotipova, respektivno. Za biotin obeležena antitela, sledi ispiranje ploča, i dodat je HRP-konjugovani streptavidin (Pierce, Rockford, IL). Sve ploče su razvijene pomoću kolorimetrijskih supstrata kao što su BD OPTEIATM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Pošto je reakcija zaustavljena sa 1 M fosfornom kiselinom, snimljena je optička apsorpcija na 450 nm i podaci su analizirani pomoću PRISMTM softvera odGraph Pad. Potrebna razblaženja da bi se dobio dvostruki signal pozadine je definisan kao tirar.
[0316] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su imunizirani sa humanim receptorom interleukina-6 (hIL-6R). Reprezentativni set titara seruma za VELOCIMMUNE® i prirodni tip miševa imuniziranih sa hIL-6R je prikazan na slici 10A i 10B.
[0317] VELOCIMMUNE® i prirodni miševi koji su podstakli jak odgovor protiv IL-6R sa sličnim opsezima titra (slika 10A). Nekoliko miševa iz VELOCIMMUNE® i prirodnih kohorti su dostigli maksimalan odgovor posle jednog izazivanja antigenom. Ovi rezultati ukazuju da jačina i kinetika imunog odgovora na ovaj antigen je slična u VELOCIMMUNE® i prirodnim miševima. Ovi odgovori antitela za specifični antigen su dalje analizirani da se ispitaju određeni izotipovi antitela specifičnih za antigen nađenih u serumima. Obe grupe VELOCIMMUNE® i prirodnog tipa su pretežno izazvale IgG1 odgovor (slika 10B), sugerišući da klasa prebacivanja u toku humoralnog odgovora je slična u miševima svakog tipa.
[0318] Afinitetno određivanje vezivanja antitela za antigen u rastvoru. Tipično je napravljen ELISA-test kompeticije u rastvoru da odredi afinitet vezivanja antitela za antigen.
[0319] Ukratko, antitela u kondicioniranom medijumu su prethodno pomešana u serijskom razblaženju proteina antigena u opsegu od 0 do 10 mg/mL. Rastvori smeše antitela i antigena su zatim inkubirani u toku dva do četiri sata na sobnim temperaturama da bi se dostigla ravnoteža vezivanja. Količine slobodnih antitela u smešama su zatim merene pomoću kvantitativnog sendvič ELISA. Ploče sa 96 bunarčića MAXISORBTM (VWR, West Chester, PA) su obložene sa 1 μg/mL proteina antigena u PBS rastvoru u toku noći na 4°C a zatim je sledelo BSA nespecifično blokiranje. Smeša rastvora antitelo antigen je zatim premeštena na ove ploče i zatim je sledeo jedan sat inkubacije. Ploče su zatim isprane sa puferom za ispiranje i antitela vezana za ploče su detektovana sa reagensom sa HRP-konjugovanim kozijim anti-mišjim IgG poliklonalnim antitelom (Jackson Immuno Research Lab) i razvijana pomoću kolorimetrijskih supstrata kao što je BD OPTEIATM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Pošto je reakcija zaustavljena sa 1 M fosfornom kiselinom, snimljena je optička apsorpcija na 450 nm i podaci su analizirani pomoću PRISMTM softvera od Graph Pad. Zavisnost signala od koncentracije antigena u rastvoru je analiziranasa 4 parametra koji se uklapaju u analizu i zabeleženi su kao IC50, potrebne koncentracije antigena da se postigne 50% smanjenja signala iz uzoraka antitela bez prisustva antigena u rastvoru.
[0320] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su imunizirani sa hIL-6R (kao što je gore opisano). Slike 11A i 11 B prikazuju reprezentativni set merenja afiniteta za anti-hIL6R antitela iz VELOCIMMUNE® i prirodnih miševa.
[0321] Pošto su imunizirani miševi primili treći rastvor za izazivanje sa antigenom, titri u serumu su određeni pomoću ELISA testa. Splenocite su izolovane iz odabranih prirodnih i VELOCIMMUNE® mišjih kohorti i spojene sa Ag8.653 mijeloma ćelijama da bi se obrazovale hibridome i gajene su pod selekcijom (kao što je gore opisano). Od ukupno dobijenih 671 anti-IL-6R hibridoma, ustanovljeno je da 236 eksprimuje antitela specifična za antigen. Sakupljeni medijum iz bunarčića pozitivnih na antigen je korišćen za određivanje afiniteta antitela za vezivanje za antigen pomoću kompetitivnog ELISA rastvora. Antitela koja potiču iz VELOCIMMUNE® miševa pokazuju široke opsege afiniteta u vezivanju za antigen u rastvoru (slika 11A). Pored toga, 49 od 236 anti-IL-6R hibridoma je nađeno da blokira IL-6 od vezivanja za receptor u in vitro bio-testu (podaci nisu prikazni). Dalje, ovih 49 anti-IL-6R blokirajućih antitela je prikazivalo opseg visoko afinitetnih rastvora sličan onima blokirajućih antitela koji potiču iz paralelne imunizacije prirodnog miša (slika 11 B).
Primer 7
Konstrukcija mišjeg ADAM6 ciljnog vektora
[0322] Usled zamene mišjeg varijabilnog lokusa gena lakog lanca imunoglobulina sa humanim varijabilnim lokusima gena teškog lanca imunoglobulina, ranijim verzijama VELOCIMMUNE® miševa nedostajala je ekspresija mišjih gena ADAM6 . Naročito, muški VELOCIMMUNE® miševi su pokazali smanjenu plodnost. Prema tome, sposobnost da eksprimuju ADAM6 je rekonstruisana u VELOCIMMUNE® miševima da se spasi nedostatak plodnosti.
[0323] Ciljni vektor za umetanje mišjih gena ADAM6a i ADAM6b u humanizovane lokuse teških lanaca je konstruisan korišćenjem tehnologije VELOCIGENE® genetskog inženjeringa (supra) da bi se modifikovao bakterijski veštački hromozom (BAC) 929d24, koji je dobijen od Dr. Frederick Alt (Harvard University). 929d24 BAC DNK je konstruisan da sadrži genomske fragmente koji sadrže mišje gene ADAM6a i ADAM6b i higromicin kasetu za ciljno brisanje humanog pseudogena ADAM6 (hADAM6Ψ) smeštenog između humanih VH1-2 i VH6-1 segmenata gena humanizovanog lokusa teškog lanca (slika 12).
[0324] Prvi, genomski fragment koji sadrži mišji gen ADAM6b , ~800 bp ushodno (5’) sekvence i ~4800 bp nizhodno (3’) sekvence je bio subkloniran iz 929d24 BAC klona. Drugi genomski fragment koji sadrži mišji gen ADAM6a , ~300 bp ushodno (5’) sekvence i ~3400 bp nizhodno (3’) sekvence, je posebno subkloniran iz 929d24 BAC klona. Dva genomska fragmenta koji sadrže mišje gene ADAM6b i ADAM6a su spojena u higromicin kasetu okruženu sa Frt rekombinacionim mestima da bi se stvoro ciljni vektor (mišji ADAM6 ciljni vektor, slika 12; SEQ ID NO:3). Različita mesta restrikcionih enzima su konstruisana na 5’ kraju ciljnog vektora koji prati mišji gen ADAM6b i na 3’ kraju koji prati mišji gen ADAM6a (dno slike 12) za spajanje u humanizovani lokus teškog lanca.
[0325] Učinjene su odvojene modifikacije na BAC klonu koji sadrži zamenjene mišje varijabilne lokuse gena teškog lanca sa humanim varijabilnim lokusima gena teškog lanca, uključujući humani pseudogen ADAM6 (hADAM6Ψ) smešten između humanih VH1-2 i VH6-1 segmenta gena humanizovanih lokusa za naknadno spajanje mišjeg ADAM6 ciljnog vektora (slika 13).
[0326] Ukratko, neomin kaseta okružena sa loxP rekombinacionim mestima je konstruisana da sadrži homologne krakove koji sadrže humanu genomsku sekvencu u položajima 3’ humanog VH1-2 segmenta gena (5’ u odnosu na hADAM6Ψ) i 5’ humanog VH6-1 segmenta gena (3’ u odnosu na hADAM6Ψ; videti sredinu slike.13). Položaj mesta umetanja ciljnog konstrukta je bilo oko 1.3 kb 5’ i ∼350 bp 3’ humanog pseudogena ADAM6. Ciljni konstrukt je takođe obuhvatao ista restrikciona mesta na mišjem ciljnom ADAM6 vektoru da se se omogućilo naknadno BAC spajanje između modifikovanih BAC klonova koji sadrže brisanje humanog pseudogena ADAM6 i mišjeg ADAM6 ciljnog vektora.
[0327] Posle digestije BAC DNK koje potiču iz oba konstrukta, genomski fragmenti su spojeni zajedno za konstrukt konstruisanog BAC klona koji sadrži humanizirani lokus teškog lanca koji sadrži ektopično smeštenu genomsku sekvencu koja sadrži mišje nukleotidne sekvence ADAM6a i ADAM6b. Krajnji ciljni konstrukt za brisanje humanog gena ADAM6 u okviru humaniziranog lokusa teškog lanca i umetnutih mišjih sekvenci ADAM6a i ADAM6b u ES ćelijama sadržao je, od 3’do 5’ genomski fragment koji sadrži ∼13 kb humane genomske sekvence 3’ humanog VH1-2 segmenta gena, ∼800 bp mišje genomske sekvence nizhodno od mišjeg gena ADAM6b, mišji gen ADAM6b, ∼4800 bp gensomske sekvence ushodno od mišjeg gena ADAM6b, 5’ Frt mesto, higromicin kasetu, 3’ Frt mesto, ∼300 bp mišje genomske sekvence nizhodno od mišjeg gena ADAM6a, mišji gen ADAM6a, ∼3400 bp mišje genomske sekvence ushodno od mišjeg gena ADAM6a, i 3’ genomski fragment koji sadrži ∼30 kb humane genomske sekvence 5’ humanog VH6-1 segmenta gena (donji deo slike 13).
[0328] Konstuisani BAC klon (gore opisan) je bio korišćen za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje su sadržale humanizovane lokuse teškog lanca da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže mišju genomsku sekvencu ektopično smeštenu koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca. Pozitivne ES ćelije koje sadrže ektopični mišji genomski fragment u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca identifikovane su sa kvantitativnim PCR testom pomoću TAQMAN™ proba (Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5’nuclease assays, Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). Uzhodni i nizhodni regioni van modifikovanih delova humanizovanih lokusa teškog lanca su potvrđeni upotrebom PCR prajmera i poba smeštenih u okviru modifikovanih regiona da bi se potvrdilo prisustvo ektopične mišje genomske sekvence u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca kao i higromicin kasete. Nukleotidna sekvenca duž uzhodne tačke umetanja uključivala je sledeće, što ukazuje na humanu genomsku sekvencu teškog lanca ushodno od tačke umetanja i I-Ceul restrikcionog mesta (koje se nalazi dole zagradama) kontinualno povezane sa mišjom genomskom sekvencom prisutnom u tački umetanja: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO:4). Nukleotidna sekvenca duž nizhodne tačke umetanja na 3’ kraju ciljanog regiona uključivala je sledeće, što ukazuje na mišju genomsku sekvencu i PI-SceI restrikciono mesto (koje se nalzi dole u zagradama) kontinualno vezane sa humanom genomskom sekvencom teškog lanca nizhodno od mesta umetanja:
(AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEQ ID NO:5).
[0329] Gore opisane ciljane ES ćelije su korišćene kao donorske ES ćelije i unete su u mišji embrion u 8-ćelijskom stadijumu sa postupkom VELOCIMOUSE® mišjeg inženjeringa (videti npr., US Pat. Nos.
7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Miševi koji imaju humanizovani lokuse teškog lanca koji sadrži ektopičnu mišjiu genomsku sekvencu koja obuhvata mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b su identifikovani pomoću genotipovanja sa testom modifikacije alela (Valenzuela et al.,2003) koji je detektovao prisustvo mišjih gena ADAM6a i ADAM6b u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca.
[0330] Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanaca koji sadrži mišje gene ADAM6a i ADAM6b su ukrštani sa mišjim sojem FLPe deleter (videti npr., Rodriguez et al., 2000, High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140) u cilju uklanjanja bilo koje Frt’-ovane higromicin kasete unete sa ciljnim vektorom koji nije uklonjen, npr., u stadijumu ES ćelije ili u embrionu. Opciono, higromicin kaseta je zadržana u mišu.
[0331] Mladuinci su genotipizovani i mladunci koji su heterozigotni na humani lokus teškog lanca koji sadrži ektopični mišji genomski fragment koji sadrži mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b su odabrani za karakterisanje mišje ekspresije gena ADAM6 i plodnosti.
Primer 8
Karakterizacija miševa sa spašenim ADAM6
[0332] Protočna citometrija. Tri miša starosti 25 nedelja homozigotna za varijabilne lokuse gena humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i tri mša starosti 18-20 nedelja homozigotna za humani teški lanac i humani κ laki lanac koji imaju ektopične mišje genomske fragmente koji kodiraju mišje gene ADAM6a i ADAM6b u okviru oba alela humanih lokusa teškog lanca (H<+/+>A6<res>κ<+/+>) su žrtvovani za identifikaciju i analizu populacije ćelija limfocita sa FACs u BD LSR II sistemu (BD Bioscience). Limfociti su vođeni kao specifične ćelijske linije i analizirana je progresija u toku različitih stadijuma razvoja B ćelija. Tkiva sakupljena iz životinja uključivala su krv, slezinu i koštanu srž. Krv je sakupljena u BD Mikrotainer epruvetama sa EDTA (BD Biosciences). Koštana srž je sakupljena iz butnih kosti ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom obogaćenim sa fetalnim telećim serumom, natrijum piruvatom, HEPES, 2-merkaptoetanolom, neesencijalnim amino kiselinama, i gentamicinom. Crvena krvna zrnca iz preparata krvi, slezine i koštane srži su lizirana sa puferom za lizu na bazi amonijum hlorida (npr., ACK pufer za lizu), što je praćeno ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom.
[0333] Za bojenje populacija ćelija, 1 x 10<6>ćelija iz različitih izvora tkiva je inkubirano sa antimišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu u toku 10 minuta, pri čemu je sledelo obeležavanje sa jednim ili kombinacijom sledećih koktela antitela u toku 30 minuta na ledu.
[0334] Koštana srž: anti-mišji FITC-CD43 (1 B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBi-oscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).
[0335] Periferna krv i slezina: anti-mišji FITC-κ (187.1, BD Biosciences), PE-λ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). Posle inkubacije sa obeleženim antitelima, ćelije su isprane i fiksirane sa 2% formaldehidom. Skupljanje podataka je izvedeno na LSRII protočnom citometru i analizom sa FlowJo (Treestar, Inc.). Rezultati iz reprezentativnih H<+/+>κ<+/+>i H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševa su prikazani na slikama.14 - 18.
[0336] Rezultati pokazuju da B ćelije H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševa napreduju kroz stadijume razvoja B ćelija na sličan način sa H<+/+>κ<+/+>miševima u koštanoj srži i perifernim kompartmenitma, i jednom kada uđu na periferiju pokazuju normalne šablone zrenja. H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševi pokazuju porast u CD43<int>CD19<+>ćelijskoj populaciji u poređnju sa H<+/+>κ<+/+>miševima (slika 16B). Ovo može ukazivati na ubrzanu IgM ekspresiju iz humanizovanih lokusa teškog lanca koji sadrže ektopične mišje fragment sekvence koja sadrži mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b u H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševima. Na periferiji, populacije B i T ćelija iz H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševima se javljaju kao normalne i slične H<+/+>κ<+/+>miševima.
[0337] Morfologija testisa i karakterizacija sperme. Da bi odredili da li neplodnost miševa koji imaju humanizovane varijabilne lokuse teških lanaca imunoglobulina potiče usled nedostatka u testisima i/ili proizvodnji sperme, ispitivana je morfologija testisa i sadržaj sperme pasemnika (epididimisa).
[0338] Ukratko, testovi iz dve grupe (n=5 po grupi; grupa 1: miševi homozigotni za humane varijabilne lokuse gena teškog lanca i κ lakog lanca, H<+/+>κ<+/+>; grupa 2: miševi heterozigotni za humane varijabilne lokuse gena teškog lanca i homozigotni za varijabilne lokuse gena κ lakog, H<+/->κ<+/+>) su secirani sa netaktnutim pasemnikom i izmereni.Uzorci su zatim fiksirani, stavljeni u parafin, sekcirani i obojeni sa hematoksilinom i eozinom (HE). Sekcije testisa (2 testa po mišu, za ukupno 20) su ispitivane na nedostatke u morfologiji i dokaz proizvodnje sperme, dok su sekcije pasemnika ispitivane na prisustvo sperme.
[0339] U ovom eksperimentu, nisu primećene razlike u težini testisa ili morfologiji između H<+/+>κ<+/+>miševa i H<+/->κ<+/+>miševa. Sperma je primećena u oba testa i pasemniku svih genotipova. Ovi rezultati su ustanovili da nedostatak mišjih gena ADAM6a i ADAM6b ne vodi do detektabilnih promena u morfologiji testisa i da se sperma proizvodi u miševima u pristustvu i odsustvu ova dva gena. Nedostatak plodnosti muških H<+/+>κ<+/+>miševa prema tome nije usled niske proizvodnje sperme.
[0340] Pokretljivost sperme i migracija. Miševi kojima nedostaju drugi članovi ADAM familije gena su neplodi usled nedostatka pokretljivosti sperme ili migracije. Migracija sperme je definisana kao sposobnost sperme da prođe iz materice u jajnik i normalno što je neophodno za oplođenje kod miša. Da bi se odredilo da li brisanje mišjih ADAM6a i ADAM6b utiče na ovaj postupak, pokretljivost sperme i migracija je procenjivana kod H<+/+>κ<+/+>miševa.
[0341] Ukratko, sperma je dobijena iz testova (1) miševa heterozigotnih za humane varijabilne lokuse gena teškog lanca i homozigotne za humane varijabilne lokuse gena κ lakog lanca (H<+/->κ<+/+>); (2) miševa homozigotnih za humane varijabilne lokuse gena za teški lanac i homozigotne za humane varijabilne lokuse gena κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>); (3) miševa homozigotih za humane varijabilne lokuse gena teškog lanca i homozigotnih za prirodni κ laki lanac (H<+/+>mκ); i, (4) prirodnih C57 BL/6 miševa (WT). Pregledanjem nisu primećene zanačajne abnormalnosti u broju sperme ili celokupnoj pokretljivosti sperme. Za sve miševe, primećeno je rasipanje kumulusa, ukazujući da je svaki uzorak sperme bio u stanju da prodre u ćelije kumulusa i da se veže za pelucidnu zonu in vitro. Ovi razultati utvrđuju da H<+/+>κ<+/+>miševi imaju spermu koja je u stanju da prodre u kumulus i veže se za pelucidnu zonu.
[0342] Oplođenje mišjeg jajeta in vitro (IVF) je učinjeno sa spermom iz miša kako je gore opisano. Neznatno manji broj izdeljenih embriona je primećen kod H<+/+>κ<+/+>miševa dan posle IVF, kao i manji broj sperme vezane za jaja. Ovi rezultati utvrđuju da sperma iz H<+/+>κ<+/+>miševa, jednom kada je izložena jajnoj ćeliji, je u stanju da prodre u kumulus i veže se za pelucidnu zonu.
[0343] U još jednom eksperimentu, sposobnost sperme iz H<+/+>κ<+/+>miševa da migrira iz uterusa i kroz jajnik je određena u testu migracije sperme.
[0344] Ukratko, prva grupa super-ovulacionih ženskih miševa (n=5) je smeštena sa H<+/+>κ<+/+>muškim miševima (n=5) i druga grupa super-ovulacionih ženskih miešva (n=5) je smeštena sa H<+/->κ<+/+>muškim miševima (n=5). Spareni parovi su posmatrani u toku kopulacije, i pet do šest sati posle kopulacije materica zajedno sa jajnicima iz svih ženki su uklonjeni radi analize. Rastvori za ispiranje su proveravani na jaja da bi se potvrdila ovulacija i dobio broj sperme. Migracija sperme je procenjiavana na dva načina. Prvi, oba jajnika su uklonjena od uterusa, isprana sa rastvorom soli i izbrojana je bilo koja identifikovana sperma. Prisustvo jaja je takođe zabeleženo kao podatak ovulacije. Drugo, jajnici su ostavljeni vezani za uterus i oba tkiva su fiksirana, smeštena u parafin, sekcionaisana i obojena (kao što je gore opisano). Sekcije su ispitivane na prisustvo sperme, i u materici i u oba jajnika.
[0345] Za ženke sparene sa pet H<+/+>κ<+/+>mužjaka, veoma malo sperme je nađeno u rastvoru za ispiranje iz jajnika. Rastvori za ispiranje iz jajnika ženskih sparenih sa H<+/->κ<+/+>mužjaka su pokazali nivo sperme od oko 25- do 30-puta viši (avg, n = 10 jajnika) u odnosu na broj prisutan u rastvorima za ispiranje jajnika ženki sparenih sa H<+/+>κ<+/+>mužjacima. Reprezentativna poređenja parenja H<+/+>κ<+/+>i H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševa su prikazana u tabeli 9.
[0346] Pripremljene su histološke sekcije uterusa i jajnika. Sekcije su ispitane na prisustvo sperme u materici i jajniku (colliculus tubarius). Pregledanjem hisoloških sekcija jajnika i materice otkriveno je da je kod ženskih miševa sparenih sa H<+/+>κ<+/+>miševima, sperma nađena u uterusu ali ne i u jajnicima. Dalje, sekcije iz ženki sparenih sa H<+/+>κ<+/+>miševima su otkrile da sperma nije nađena u uterotubalnom spoju (UTJ-uterotubal junction). U sekcijama iz ženki sparenih sa H<+/->κ<+/+>miševima, sperma je identifikovana u UTJ i u jajnicima.
[0347] Ovi rezultati utvrđuju da miševi kojima nedostaju geni ADAM6a i ADAM6b proizvode spermu koja pokazuje in vivo nedostatak migracije. U svim slučajevima, primećena je sperma u uterusu, ukazujući da se kopulacija i oslobađanje sperme desilo normalno, ali malo do nimalo sperme je primećeno u jajnicima posle kopulacije mereno ili brojem sperme ili histološkim posmatranjem. Ovi rezultati utvrđuju da miševi kojima nedostaju geni ADAM6a i ADAM6b proizvode spermu koja pokazuje nesposobnost da migrira od uterusa do jajnika. Ovi nedostaci očigledno vode do neplodnosti jer sperma nije u stanju da pređe uterusno-tubularni spoj do jajnika gde se jaja oplođuju. Uzeti zajedno, svi ovi rezultati konvergiraju podržavanju hipoteze da mišji geni ADAM6 pomažu usmeravanju spreme sa normalnom pokretljivošću da migrira iz materice, preko uterotubularnog spoja i jajnika, i tako priđe jaju da bi došlo do oplođenja. Mehanizam kojim ADAM6 postiže ovo može
1
se odnositi na jedan ili oba ADAM6 proteina, ili preko koordinisane ekspresije sa drugim proteinima, npr. drugim proteinima ADAM, u ćelijama sperme, kao što je dole opisano.
Tabela 9
[0348] Ekspresija familije ADAM gena. Poznato je da je kompleks ADAM proteina prisutan kao kompleks na površini sperme u sazrevanju. Miševi kojima nedostaju ostali članovi familije ADAM gena gube ovaj kompleks kako sperma sazreva i pokazuju smanjenje višestrukih ADAM proteina u zreloj spermi. Da bi se odredilo da li nedostatak gena ADAM6a i ADAM6b utiče na druge ADAM proteine na sličan način, Western blotovi proteinskih ekstrakta iz testisa (nezrela sperma) i epididimus (sperma u sazrevanju) su analizirani da bi se odredili ekspresioni nivoi drugih članova familije ADAM gena.
[0349] U ovom eksperimentu, ekstrakti proteina su analizirani iz grupa (n=4 po grupi) H<+/+>κ<+/+>i H<+/->κ<+/+>miševa. Rezultati pokazuju da ekspresija ADAM2 i ADAM3 nije bila narušena u ekstraktima testisa. Međutim, oba ADAM2 i ADAM3 su dramatično smanjeni u ekstraktima epididimisa. Ovo pokazuje da nedostatak ADAM6a i ADAM6b u spermi H<+/+>κ<+/+>miševa može imati direktan uticaj na ekspresiju i možda funkciju drugih ADAM proteina kako sperma sazreva (npr., ADAM2 i ADAM3). Ovo sugeriše da su ADAM6a i ADAM6b deo ADAM proteinskog kompleksa na površni sperme, koji može biti kritičan za pogodnu migraciju sperme.
Primer 9
Humani varijabilni geni teškog lanca u miševima sa spašenim ADAM6
[0350] Korišćenje izabranih humanih varijabilnih gena teškog lanca je određeno za miševe homozigotne za humane lokuse varijabilnih gena teškog lanca i κ lakog lanca ili miša kome nedostaju geni ADAM6a i ADAM6b (H<+/+>κ<+/+>) ili sadrže ektopični fragment koji kodira mišje gene ADAM6a i ADAM6b (H<+/+>A6<res>κ<+/+>) pomoću kvantitativnih PCR testova sa TAQMAN™ probama (kako je gore opisano).
[0351] Ukratko, CD19<+>B ćelije su prečišćene iz slezina H<+/+>κ<+/+>i H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševa pomoću mišjih CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec) i ukupna RNK je prečišćena korišćenjem RNEASY™ Mini kit-a (Qiagen). Genomska RNK je uklonena pomoću DNaze bez RNaze tretmanom na koloni (Qiagen). Oko 200 ng mRNK je reverzno transkribovano u cDNA pomoću First Stand cDNA Synthesis kit (Invitrogen) i zatim pojačano sa TAQMAN™ univerzalnim PCR Master Mix (Applied Biosystems) pomoću ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Relativna ekspresija svakog gena je normalizovana do ekspresije mišjeg konstantnog regiona κ lakog lanca (mCκ). Tabela 10 prikazuje kombinacije sense/antisense/TAQMAN™ MGB proba korišćenih u ovom eksperimentu.
2
Tabela 10
[0352] U ovim eksperimentim, ekspresija sva četiri humana VHgena je primećena u analiziranim uzorcima. Dalje, ekspresioni nivoi su upoređivani između H<+/+>κ<+/+>i H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševa. Ovi rezultati su pokazali da humani VHgeni koji su bili i distalni u odnosu na mesto modifikacije (VH3-23 i VH1-69) i proksimalni u odnosu na mesto modifikacije (VH1-2 i V H 6-1) su bili u stanju da se rekombiniju da bi se obrazovao funkcionalno eksprimovani humani teški lanac. Ovi rezultati pokazuju da ektopični genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b umetnute u humanu genomsku sekvencu teškog lacna ne utiče na V(D)J rekombinaciju humanih segmenata gena teškog lanca u okviru lokusa, i ovi miševi su u stanju da rekombinuju humane segmente gena teškog lanca na normalan način da bi se dobili funkcionalni proteini teškog lanca imunoglobulina.
Primer 10
Humoralni imuni odgovor u miševima sa spašenim ADAM6
[0353] Humoralni imuni odgovor je određen za miševe homozigotne za humane lokuse varijabilnih gena teškog lanca i κ lakog lanca ili kojima nedostaju mišji ADAM6a i ADAM6b geni (H<+/+>κ<+/+>) ili koji sadrže ektopične genomske fragmente koji kodiraju mišje gene ADAM6a i ADAM6b (H<+/+>A6<res>κ<+/+>) sa imunizacionom šemom višestrukih antigena praćenom izolovanjem antitela i karakterizacijom.
Rezultati su poređeni za određivanje bilo kod efekta na V(D)J rekombinaciju koja uključuje humane segmente gena imunoglobulina, procenu progresije titra u serumu, proizvodnju antitela od hibridoma i afinite za antigen.
[0354] Protokol imunizacije. Površinski receptor humane ćelije (antigen A), humano antitelo specifično za humani receptor tirozin-protein kinazu (antigen B), sekrecioni humani protein koji funkcioniše u regulaciji TGF-β puta signalizacije (antigen C), i humani receptor tirozin kinaze (antigen D) su korišćeni za komparativne imunizacije u grupama miševa. Serum je sakupljen iz grupa miševa pre imunizacije sa gornjim antigenima. Svaki antigen (2.3 µg svaki) je davan u početnoj inicirajućoj imunizaciji pomešan sa 10 µg CpG oligonukleotida kao adjuvanta (Invivogen). Imunogen je davan preko stopala (f.p.) u zapremini od 25 µl po mišu. Nakon toga, miš je izazivan preko f.p. sa 2.3 µg antigena zajedno sa 10 µg CpG i 25 mg Adju-Phos (Brenntag) kao adjuvanta dana 3, 6, 11, 13, 17, i 20 u toku ukupno šest izazivanja. Miševima je uzeta krv dana 15 i 22 posle četvrtog i šestog izazivanja, respektivno i antiserumi su analizirani za titar antitela za svaki specifični antigen.
[0355] Titri antitela su određena u serumima imuniziranih miševa pomoću ELISA testova. Mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića (Thermo Scientific) su obložene sa odgovarajućim antigenom (2 µg/ml) u rastvoru soli puferovanom sa fosfatima (PBS, Irvine Scientific) u toku noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče su isprane sa rastvorom soli puferovanim fosfatima koji sadrži 0.05% Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich) četiri puta pomoću perača ploča (Molecular Devices). Ploče su zatim blokirane sa 250 µl 0.5% albumina goveđeg seruma (BSA, Sigma-Aldrich) u PBS i inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim ispirane četiri puta sa PBS-T. Serumi iz imuniziranih miševa i preimuniziranih seruma su serijski razblaženi tri puta u 0.5% BSA-PBS polazeći od 1:300 ili 1:1000 i dodati u blokirane ploče u duplikatu i inkubirane u toku jednog sata na sobnoj temperaturi. Dva bunarčića su ostala prazna da se koriste kao sekundarna kontrola antitela. Ploče su zatim ponovo isprane četiri puta sa PBS-T u peraču ploča. Razblaženja 1:5000/1:10,000 kozijeg anti-mišjeg IgG-Fcperoksidaze iz rena (HRP, Jackson Immunoresearch) ili kozijeg antimišjeg IgG-kappa-HRP (Southern Biotech) konjugovanog sekundarnog antitela je dodato u ploče i inkubirano u toku jednog sata na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane osam puta sa PBS-T i razvijene sa TMB/H2O2kao supstratom. Supstrat je inkubiran u toku dvadeset minuta i reakcija je zaustavljena sa 2N H2SO4(VWR) ili 1N H3PO4(JT Baker). Ploče su čitane na spektrofotometru (Victor, Perkin Elmer) na 450 nm. Titri antitela su izračunavani pomoću Graphpad PRISM softvera.
[0356] Titar seruma je izračunat kao razblaženje seruma u okviru eksperimentalnog titracionog opsega pri signalu vezivanja antigena ekvivalentom dva puta iznad pozadine. Rezultati za humoralno imuni odgovor su prikazani na slici 19 (antigen A), slika 20 (antigen B), slika 21 (antigen C), i slika 22 (antigen D). Pozitivni rezultati hibridoma na antigen napravljeni korišćenjem dve slezine izolovane iz miša iz svake grupe odabranih imunizacija su prikazani u tabeli 11 (Rezultat antigena je jednak 2X/pozadina).
[0357] Kao što je pokazano u ovim primerima, titri antitela stvorenih u miševima sa spašenim Adam6 (H<+/+>A6<res>κ<+/+>) su upoređivani sa onima stvorenim u miševima kojima nedostaju ADMA6a i ADAM6b i koji imaju humanizovani teški lanac (H<+/+>κ<+/+>). Dalje, slezine iz H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševa su dale antigen pozitivne hibridome za sve testirane antigene, uključujući visok afinitet anitela, na nivoima uporedivim sa H<+/+>κ<+/+>miševima. Prema tome, nepostojnje pogoršavanja rekombinacije V(D)J humanih segmenata imunoglobulina u miševima sa spašenim Adam6 se smatra da postoji s obzirom na proizvodnju antitela visokog afiniteta koja sadrže humane gene imunoglobulina.
4
Tabela 11
Primer 11
Određivanje afiniteta vezivanja antigena
[0358] Afiniteti vezivanja antitela koja pokazuju specifično vezivanje za antigen B su ispitivana pomoću biosenzora rezonance površinskih plazmona u realnom vremenu (BIAcore 2000). Korišćeni su kondicionirani medijumi za izolovane hibridoma iz dva soja miševa imuniziranih sa antigenom B (H<+/+>κ<+/+>i H<+/+>A6r<es>κ<+/+>) u toku BIAcore ispitivanja. Površina senzora BIAcore je prvo derivatizovana sa polikolnalnim zečijim antimišjim anititelom (GE) da bi se uhvatila anti-antigen B antitela iz kondicioniranog medijuma. U toku čitavkog postupka ispitivanja, korišćen je HBST (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20) kao pufer za rad. Fab fragmenti antigena B su injektovani preko površine antitela protiv anti-antigena B uhvaćenih pri protoku od 50 ml/minuti u koncentraciji od 100nM. Spoj antitelo-antigen je praćen u toku tri minute dok je disocijacija antigena sa uhvaćenim antitelom praćena u toku pet minuta u HBST puferu za rad. Ekspirement je izveden na 25°C. Konstante brzine kinetičkog vezivanja (ka) i disocijacije (kd) su određivane postupkom uklapanja podataka u model vezivanja 1:1 pomoću softvera Scrubber 2.0 za uklapanje u krivu. Ravnotežne konstante vezivanja i disocijacije(KD) i poluživota disocijacije (T1/2) su izračunavane iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd / ka; i T1/2(min) = (In2/(60*kd). Rezultati za odabrana anti-antigen B antitela su prikazani u tabeli 12.
Tabela 12
[0359] U sličnom eksperimantu, kinetike različitih monoklonalnih antitela prisutnih u kondicioniranom medijumu sa hibridomom koji vezuje antigen A su određene pomoću biosenzora rezonance površinskih plazmona u realnom vremenu (BIAcore 4000). Svi korišćeni klonovi hibridoma u ovom testu su proizvedeni u H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševima.
[0360] Ukratko, uhvaćena specifična antitela protiv antigena, poliklonalna zečija anti-mišja antitela (GE Catalog# BR-1008-38) su prvo imobilizirana na čipu senzora. BIAcore ispitivanje je izvedeno u dva različita pufera - PBSP, pH7.2 i PBSP, pH6.0. Oba pufera su obogaćena sa 0.1 mg/ml BSA. Posle hvatanja anti-antigen A antitela iz kondicioniranig medijuma, 1 μM monomera antigena A (pripremljenog u odgovarajućem puferu) je injektovano preko površine uhvaćenog antitela u toku 1.5 minuta na 30 μl/minutu i disocijacija veze monomera antigena A je praćena u toku 1.5 minuta u odgovarajućem puferu za rad na 25°C. Konstante brzine kinetičkog vezivanja (ka) i disocijacije (kd) su određivane obradom i uklapanjem podataka na modelu vezivanja 1:1 pomoću softvera Scrubber 2.0 za uklapanje u krivu. Ravnotežne konstante vezivanja i disocijacije (KD) i poluživot disocijacije (T1/2) su izračuvanavi od konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd / ka; i T1/2(min) = (In2/(60*kd). Tabela 13 prikazuje parametre kinetičkog vezivanja za odabrana vezivanja anti-antigen A antitelo za monomer antigena A na pH7.2 i pH6.0. NR: nije registrovano vezivanje pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
Tabela 13
[0361] Kao što je gore prikazano, antitela sa visokim afinitetom su dobijena i iz H<+/+>A6<res>κ<+/+>i H<+/+>κ<+/+>miševa na uporediv način. Među dvadeset pet antitela prikazanih u tabeli 12, dvadeset dobijenih u H<+/+>A6<res>κ<+/+>miševima pokazuje opseg afiniteta od 0.5 nM do 1 μM, dok pet dobijenih u H<+/+>κ<+/+>miševima pokazuje opseg afiniteta od 10 nM do 150 nM. Dalje, pedeset pet antitela prikazanih u tabeli 13 pokazuje opseg afiniteta od 20 pM do 350 nM za vezivanje za monomera antigena A.
[0362] Kao što je prikazano u ovom primeru, ponovno umetanje mišjih gena Adam6 u humanizovane lokuse teškog lanca imunoglobulina ne ugrožava sposobnost miša da proizvede jak imuni odgovor na višestruke antigene karakterisane repertoarima humanih antitela koji imaju različite afinitete u podnanomolarnom opsegu, koji potiču iz humanih segmenata gena preuređenih iz konstruisane germinativne linije.
LISTA SEKVENCI [0363]
�
�
�
<211> 13894
1
2
4
1
11
12
1
14

Claims (4)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak za modifikovanje lokusa teškog lanca imunoglobulina miša, koji obuhvata:
(a) izvođenje prve modifikacije lokusa teškog lanca imunoglobulina miša, a prva modifikacija se sastoji iz smeštanja jednog ili više humanih imunoglobulinskih VH, DH, i JH genskih segmenta ili zamene jedne ili više sekvenci u lokusu teškog lanca imunoglobulina miša sa jednim ili više humanih immunoglobulinskih VH, DH, i JH genskih segmenata, gde prva modifikacija eliminiše mišju ekspresiju ADAM6 iz endogenog Adam6 alela tako da muški miš koji ima prvu modifikaciju ispoljava smanjenu plodnost; i
(b) izvođenje druge modifikacije na mišu da bi se dodala sekvenca nukleinskih kiselina koja doprinosi funkcionalnosti mišje ADAM6 aktivnosti kod muškog miša, gde nukleinska kiselinska sekvenca kodira mišji ADAM6a protein ili ortolog, homolog, ili njegov funkcionalni fragment, i mišji ADAM6b protein ili ortolog, homolog, ili njegov funkcionalni fragment, gde pomenuta druga modifikacija je napravljena tako da je nukleinska sekvenca okružena ushodno, nizhodno, ili ushodno ili nizhodno sa nukleinskom kiselinskom sekvencom koja kodira humani imunoglobulinski varijabilni genski segment pomenutog modifikovanog endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca,
poželjno gde prva i druga modifikacija su izvedene simultano.
2. Postupak prema zahtevu 1, gde je miš mužjak ili gde je miš ženka.
3. . Postupak prema bilo kom od zahteva 1-2, gde prva modifikacija obuhvata brisanje svih ili dela varijabilnih genskih segmenta teškog lanca imunoglobulina miša.
4. Izolovana pluripotentna, indukovana pluripotentna ili totipotentna ćelija ili izolovano tkivo iz miša dobijeno postupkom prema bilo kom od zahteva 1-3.
RS20191337A 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi RS59413B2 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161446895P 2011-02-25 2011-02-25
US201161497650P 2011-06-16 2011-06-16
US201261595200P 2012-02-06 2012-02-06
EP12192727.1A EP2578688B2 (en) 2011-02-25 2012-02-24 ADAM6 mice

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS59413B1 RS59413B1 (sr) 2019-11-29
RS59413B2 true RS59413B2 (sr) 2023-06-30

Family

ID=45998616

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191599A RS59661B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20230475A RS64280B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20200177A RS59929B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20191337A RS59413B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20150163A RS53880B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191599A RS59661B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20230475A RS64280B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20200177A RS59929B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150163A RS53880B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi

Country Status (31)

Country Link
US (12) US8642835B2 (sr)
EP (7) EP2550363B1 (sr)
JP (8) JP2014507137A (sr)
KR (1) KR101387377B1 (sr)
CN (2) CN105861548B (sr)
AU (5) AU2012243291B2 (sr)
BR (1) BR112013021771B1 (sr)
CA (1) CA2820824A1 (sr)
CY (5) CY1116301T1 (sr)
DE (5) DE14176593T1 (sr)
DK (6) DK2738258T4 (sr)
ES (6) ES2748832T5 (sr)
FI (3) FI2578688T4 (sr)
HR (5) HRP20150262T1 (sr)
HU (5) HUE047687T2 (sr)
IL (4) IL226727A (sr)
IN (1) IN2013CN07629A (sr)
LT (4) LT2738259T (sr)
ME (3) ME03537B (sr)
MX (3) MX343009B (sr)
MY (1) MY172713A (sr)
NZ (2) NZ731926A (sr)
PL (5) PL2578688T5 (sr)
PT (5) PT2550363E (sr)
RS (5) RS59661B2 (sr)
RU (2) RU2582261C2 (sr)
SG (4) SG10201405135RA (sr)
SI (5) SI2550363T1 (sr)
SM (5) SMT201900581T1 (sr)
WO (1) WO2012141798A1 (sr)
ZA (1) ZA201305998B (sr)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
LT2311874T (lt) 2004-07-22 2017-11-27 Erasmus University Medical Center Rotterdam Rišančiosios molekulės
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
CA2807282A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
HUE047687T2 (hu) 2011-02-25 2020-05-28 Regeneron Pharma ADAM6 egér
EP2739300B1 (en) 2011-07-05 2019-06-19 Duke University N-terminal deleted gp120 immunogens
FI3865581T3 (fi) * 2011-08-05 2024-11-02 Regeneron Pharma Humanisoituja universaaleja kevytketjun hiiriä
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
EP2763699A4 (en) 2011-10-03 2015-05-20 Univ Duke VACCINE
KR102762747B1 (ko) 2011-10-17 2025-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20180295821A1 (en) * 2011-12-02 2018-10-18 Kymab Limited Transgenic Animals
US9706759B2 (en) 2011-12-20 2017-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
EP3912465A1 (en) * 2012-02-01 2021-11-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
NZ730271A (en) 2012-03-16 2022-09-30 Regeneron Pharma Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
RS57118B1 (sr) 2012-03-16 2018-06-29 Regeneron Pharma Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih
CN104302170B (zh) 2012-03-16 2016-09-28 瑞泽恩制药公司 生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
PT2838917T (pt) 2012-04-20 2019-09-12 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas similares a ig heterodiméricas
KR102266274B1 (ko) * 2012-06-12 2021-06-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
SG11201505713YA (en) 2013-02-06 2015-08-28 Regeneron Pharma B cell lineage based immunogen design with humanized animals
TR201810255T4 (tr) * 2013-02-20 2018-08-27 Regeneron Pharma Modifiye edilmiş immunoglobulin ağır zincir sekanslarına sahip olan insan olmayan hayvanlar.
EP2967012B1 (en) * 2013-03-14 2020-09-16 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgenic non-human mammal for antibody production
US10993420B2 (en) 2013-03-15 2021-05-04 Erasmus University Medical Center Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP6267986B2 (ja) * 2014-02-13 2018-01-24 株式会社特殊免疫研究所 ヒトの特定分子と結合する分子標的物質のｉｎｖｉｖｏ評価法
CA3124228C (en) * 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
SG11201607015VA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS
AU2015317370A1 (en) 2014-09-19 2017-03-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
WO2016149678A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
TWI752920B (zh) 2015-10-12 2022-01-21 美商再生元醫藥公司 活化瘦素受體的抗原結合蛋白
CN108777951B (zh) * 2016-01-13 2021-11-05 瑞泽恩制药公司 具有包括改造的多样性簇的免疫球蛋白重链可变区的非人动物及其用途
EP3416479A1 (en) 2016-02-16 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a mutant kynureninase gene
EP4368637A3 (en) * 2016-05-20 2024-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
KR102784608B1 (ko) 2016-06-03 2025-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물
WO2017214089A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
CN109996441B (zh) 2016-11-04 2022-02-08 瑞泽恩制药公司 具有经工程化的免疫球蛋白λ轻链基因座的非人类动物
US11122042B1 (en) 2017-05-12 2021-09-14 F5 Networks, Inc. Methods for dynamically managing user access control and devices thereof
EP3635009A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
EP3720279B1 (en) 2017-12-05 2022-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice having an engineered immunoglobulin lambda light chain and uses thereof
IL322464A (en) 2018-02-07 2025-09-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for administering therapeutic protein
KR20200133339A (ko) 2018-03-21 2020-11-27 크리스탈 바이오사이언스 주식회사 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 닭
SMT202500038T1 (it) 2018-03-24 2025-03-12 Regeneron Pharma Topi o ratti geneticamente modificati per la generazione di anticorpi terapeutici contro complessi peptide-mhc, metodi di produzione e loro utilizzo
IL314733A (en) 2018-03-26 2024-10-01 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
SI3773713T1 (sl) 2018-04-06 2025-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Protitelo, agonist leptinskega receptorja, za uporabo pri povečanju kostne mase pri osebi, ki trpi zaradi presnovne disfunkcije ali hipoleptinemije
EP3793591A1 (en) 2018-05-17 2021-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
US12102070B2 (en) 2018-06-13 2024-10-01 Crystal Bioscience Inc. Camelization of a human variable domain by gene conversion
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
BR112021016173A2 (pt) 2019-02-22 2021-11-03 Regeneron Pharma Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma
TW202110323A (zh) 2019-06-05 2021-03-16 美商再生元醫藥公司 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途
DK3785536T4 (da) * 2019-08-28 2025-10-27 Trianni Inc Adam6-knockin-mus
CA3163549A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof
CA3182925A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
KR20230066386A (ko) 2020-09-11 2023-05-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항원 특이적 항체의 확인 및 제조
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
US12371487B2 (en) 2020-12-23 2025-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce the same
CA3165366A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
WO2022225985A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to artemin and methods of use thereof
EP4554977A1 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to ciliary neurotrophic factor receptor (cntfr) and methods of use thereof
IL322397A (en) 2023-02-13 2025-09-01 Regeneron Pharma Treating muscle-related disorders with anti-human CACNG1 antibodies
WO2024229105A1 (en) 2023-05-02 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
WO2025014533A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human cacng1 antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2025055311A1 (zh) 2023-09-15 2025-03-20 赛业（苏州）生物科技有限公司 用于制备抗体的基因修饰小鼠及其制备方法
CN120035380A (zh) * 2023-09-15 2025-05-23 赛业（苏州）生物科技有限公司 用于制备抗体的基因修饰小鼠及其制备方法
WO2025064738A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dntt 250-258 off-target peptides and uses thereof
WO2025064761A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kras10-18 g12d off-target peptides and uses thereof
AU2024329875A1 (en) * 2024-01-02 2025-07-17 Gempharmatech Co., Ltd Animal model generating humanized antibody and construction method thereof

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
PL309249A1 (en) * 1992-12-01 1995-10-02 Protein Design Labs Humanised antibodies against l-selectin
ES2301183T3 (es) 1996-12-03 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpo completamente humano que se une al receptor del egfr.
CN1203922A (zh) * 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
RU10506U1 (ru) 1999-04-08 1999-08-16 Кривулин Виталий Николаевич Ручной культиватор
CA2373638A1 (en) * 1999-05-27 2000-12-07 Human Genome Sciences, Inc. Adam polynucleotides and polypeptides
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
WO2002092812A1 (fr) 2001-05-11 2002-11-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha CHROMOSOME HUMAIN ARTIFICIEL CONTENANT LE GENE A CHAINE LEGERE DE L'ANTICORPS HUMAIN $g(l)
US7473557B2 (en) 2001-06-06 2009-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
JP4099646B2 (ja) 2002-06-04 2008-06-11 株式会社安川電機 ボイスコイルモータ
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
DK1802193T3 (da) 2004-10-19 2014-06-10 Regeneron Pharma Fremgangsmåde til frembringelse af en homozygot mus til genetisk modifikation
ATE416465T1 (de) 2005-06-30 2008-12-15 Borealis Tech Oy Überzug-schicht für energie- oder kommunikationskabel
AU2007235496B2 (en) * 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
PL2374818T3 (pl) 2006-06-02 2013-05-31 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
US9693539B2 (en) 2007-08-10 2017-07-04 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. HCO32 and HCO27 and related examples
US7659842B2 (en) 2007-10-24 2010-02-09 Infineon Technologies Ag Quantization error reduction in PWM full-MASH converters
LT2346994T (lt) 2008-09-30 2022-03-10 Ablexis, Llc Knock-in pelė, skirta chimerinių antikūnų gamybai
AU2009329365B2 (en) * 2008-12-18 2016-01-14 Roger Kingdon Craig Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use thereof
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
JP5399140B2 (ja) * 2009-06-18 2014-01-29 株式会社タイトー モールス信号通信システム
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SMT201900251T1 (it) * 2009-12-10 2019-07-11 Regeneron Pharma Topi che producono anticorpi della catena pesante
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
CA2802591A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
HUE047687T2 (hu) 2011-02-25 2020-05-28 Regeneron Pharma ADAM6 egér
FI3865581T3 (fi) 2011-08-05 2024-11-02 Regeneron Pharma Humanisoituja universaaleja kevytketjun hiiriä
KR102762747B1 (ko) 2011-10-17 2025-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
GB201118579D0 (en) 2011-10-27 2011-12-07 Micromass Ltd Control of ion populations
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9706759B2 (en) 2011-12-20 2017-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
KR102266274B1 (ko) 2012-06-12 2021-06-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물

Also Published As

Publication number Publication date
FI4067496T3 (fi) 2023-05-24
DE14176593T1 (de) 2015-03-05
RS59413B1 (sr) 2019-11-29
DK2738258T3 (da) 2019-12-16
US20130254911A1 (en) 2013-09-26
DK2578688T4 (da) 2023-05-08
DK2738258T4 (da) 2023-05-08
DE12716101T1 (de) 2013-05-08
SG10201913155QA (en) 2020-02-27
PL2738258T5 (pl) 2023-05-15
SI2550363T1 (sl) 2015-04-30
RS53880B1 (sr) 2015-08-31
EP4067496A1 (en) 2022-10-05
AU2012243291A1 (en) 2013-05-09
EP2738258A3 (en) 2014-09-24
PT2578688T (pt) 2019-10-24
US11950578B2 (en) 2024-04-09
CY1122205T1 (el) 2020-11-25
RS59661B2 (sr) 2023-06-30
RU2013125717A (ru) 2014-12-10
AU2012243291B2 (en) 2015-07-09
ES2748832T3 (es) 2020-03-18
US10072095B2 (en) 2018-09-11
DK2550363T3 (en) 2015-03-23
RU2016109443A3 (sr) 2019-07-24
SI2738258T1 (sl) 2020-01-31
CY1122820T1 (el) 2021-05-05
EP2738259A3 (en) 2014-07-30
HK1174490A1 (en) 2013-06-14
IL268671A (en) 2019-10-31
SMT202300173T1 (it) 2023-07-20
EP2738258B2 (en) 2023-02-01
LT2738258T (lt) 2020-01-10
PL2550363T3 (pl) 2015-05-29
FI2578688T4 (fi) 2023-05-05
CN103429746B (zh) 2016-05-11
IL261243A (en) 2018-10-31
HK1201292A1 (en) 2015-08-28
US20120322108A1 (en) 2012-12-20
JP2014507137A (ja) 2014-03-27
ZA201305998B (en) 2016-07-27
US20180346598A1 (en) 2018-12-06
US8642835B2 (en) 2014-02-04
NZ797720A (en) 2024-09-27
IN2013CN07629A (sr) 2015-08-07
HUE024534T2 (hu) 2016-01-28
ES2748832T5 (es) 2023-06-08
DK2813573T1 (da) 2015-01-12
RS59661B1 (sr) 2020-01-31
US10577430B2 (en) 2020-03-03
JP2014110814A (ja) 2014-06-19
DK2578688T3 (da) 2019-10-28
EP4067496B1 (en) 2023-03-29
DK2738259T1 (da) 2014-11-24
US10905108B2 (en) 2021-02-02
DK2738258T1 (da) 2014-11-24
EP2578688B2 (en) 2023-02-08
SMT201900744T1 (it) 2020-01-14
MX2020009714A (es) 2020-10-07
NZ612643A (en) 2015-06-26
DK2738259T3 (da) 2020-02-17
CA2820824A1 (en) 2012-10-18
HRP20230526T1 (hr) 2023-09-01
IL273986B (en) 2021-04-29
CY1116301T1 (el) 2017-02-08
ES2532487T3 (es) 2015-03-27
CN105861548B (zh) 2020-01-10
JP2025032218A (ja) 2025-03-11
ES2805364T3 (es) 2021-02-11
EP2578688A1 (en) 2013-04-10
EP2738258A2 (en) 2014-06-04
LT2738259T (lt) 2020-03-10
AU2015238806A1 (en) 2015-10-29
MX2013009649A (es) 2013-09-26
DE14154967T1 (de) 2014-08-28
IL226727A (en) 2016-08-31
AU2020201279A1 (en) 2020-03-12
NZ703609A (en) 2016-04-29
DK4067496T5 (da) 2024-07-22
JP2019187446A (ja) 2019-10-31
DE14154918T1 (de) 2014-08-21
MY172713A (en) 2019-12-11
KR101387377B1 (ko) 2014-04-21
DK2578688T1 (da) 2014-11-24
US10905109B2 (en) 2021-02-02
JP2015107131A (ja) 2015-06-11
HUE046746T2 (hu) 2020-03-30
PL2578688T5 (pl) 2023-05-29
LT2578688T (lt) 2019-11-11
JP2016135143A (ja) 2016-07-28
ME03537B (sr) 2020-04-20
HRP20192311T4 (hr) 2023-05-12
EP2738259B1 (en) 2019-11-27
SMT202000112T1 (it) 2020-05-08
ES2770424T3 (es) 2020-07-01
JP5866127B2 (ja) 2016-02-17
HRP20150262T1 (hr) 2015-04-10
EP2738259A2 (en) 2014-06-04
PL2738259T3 (pl) 2020-08-24
WO2012141798A1 (en) 2012-10-18
US9932408B2 (en) 2018-04-03
AU2017251802A1 (en) 2017-11-16
JP2018143250A (ja) 2018-09-20
NZ731926A (en) 2021-07-30
MX375115B (es) 2025-03-06
SI2578688T2 (sl) 2023-05-31
SI2738259T1 (sl) 2020-06-30
BR112013021771A2 (pt) 2017-07-04
CN105861548A (zh) 2016-08-17
US20150201589A1 (en) 2015-07-23
PL2738258T3 (pl) 2020-08-24
SMT201900581T1 (it) 2019-11-13
DK4067496T3 (da) 2023-06-26
PL2578688T3 (pl) 2020-05-18
SG10201913160QA (en) 2020-03-30
US20180345760A1 (en) 2018-12-06
IL268671B (en) 2020-05-31
EP2813573B1 (en) 2020-04-22
HUE047687T2 (hu) 2020-05-28
JP2022071051A (ja) 2022-05-13
PT2738258T (pt) 2019-12-10
EP2578688B1 (en) 2019-07-24
DE12192727T1 (de) 2013-07-11
BR112013021771B1 (pt) 2022-11-16
RU2016109443A (ru) 2018-11-26
HRP20200294T1 (hr) 2020-05-29
US20240306617A1 (en) 2024-09-19
US20140213773A1 (en) 2014-07-31
FI2738258T4 (fi) 2023-05-05
RS64280B1 (sr) 2023-07-31
EP2550363A1 (en) 2013-01-30
SG10201405135RA (en) 2014-10-30
CY1126091T1 (el) 2023-11-15
US8697940B2 (en) 2014-04-15
EP2738258B1 (en) 2019-09-25
ES2758974T3 (es) 2020-05-07
HUE046081T2 (hu) 2020-01-28
NZ718688A (en) 2017-07-28
AU2022206806B2 (en) 2025-10-02
ES2946169T3 (es) 2023-07-13
EP3744850A1 (en) 2020-12-02
US10694725B2 (en) 2020-06-30
US9944716B2 (en) 2018-04-17
SI2738258T2 (sl) 2023-05-31
PT2550363E (pt) 2015-03-16
SMT201500061B (it) 2015-05-05
EP2813573A1 (en) 2014-12-17
KR20130116375A (ko) 2013-10-23
US20180362663A1 (en) 2018-12-20
HRP20191895T4 (hr) 2023-05-12
ME03732B (me) 2021-01-20
PT2738259T (pt) 2020-02-18
HRP20192311T1 (hr) 2020-03-20
MX343009B (es) 2016-10-21
HRP20191895T1 (hr) 2020-01-10
RU2722373C2 (ru) 2020-05-29
AU2022206806A1 (en) 2022-08-18
PT4067496T (pt) 2023-06-07
US20150210776A1 (en) 2015-07-30
CY1122459T1 (el) 2021-01-27
HUE062552T2 (hu) 2023-11-28
RU2582261C2 (ru) 2016-04-20
IL273986A (en) 2020-05-31
IL261243B (en) 2019-08-29
NZ776770A (en) 2023-03-31
US20180346599A1 (en) 2018-12-06
ME02106B (me) 2015-10-20
SI4067496T1 (sl) 2023-07-31
SG192933A1 (en) 2013-09-30
PL4067496T3 (pl) 2023-07-31
SI2578688T1 (sl) 2019-11-29
EP2550363B1 (en) 2014-12-10
LT4067496T (lt) 2023-06-12
ES2758974T5 (es) 2023-06-08
US12207628B2 (en) 2025-01-28
US20210105984A1 (en) 2021-04-15
CN103429746A (zh) 2013-12-04
US20210105985A1 (en) 2021-04-15
RS59929B1 (sr) 2020-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2025032218A (ja) Ａｄａｍ６マウス
RS58761B1 (sr) Miševi sa humanizovanim lakim lancem
HK40073129B (en) Adam6 mice
HK40073129A (en) Adam6 mice
HK40041879A (en) Adam6 mice
HK1177226A (en) Adam6 mice
HK1193631A (en) Adam6 mice
HK1177226B (en) Adam6 mice
NZ718688B2 (en) ADAM6 mice
HK1193632A (en) Adam6 mice
HK1193631B (en) ADAM6 Mice
HK1193632B (en) ADAM6 Mice
HK1174490B (en) Adam6 mice
HK1201292B (en) Adam6 mice