ES2859373T3 - Modelos animales y moléculas terapéuticas - Google Patents
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Abstract
Una célula de vertebrado no humano cuyo genoma comprende los segmentos génicos VH, D y JH de la Tabla 3 corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada y los segmentos génicos Vκ y Jκ de la Tabla 10 o 11 corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera, en la que los segmentos génicos de cada locus se conectan operativamente a su región constante de manera tal que la célula sea capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o en la cual la célula pueda desarrollarse en un vertebrado que exprese una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, y en la que la célula de vertebrado no humano es una célula de ratón o rata.
Description
DESCRIPCIÓN
Modelos animales y moléculas terapéuticas
Antecedentes
La presente invención se refiere a ratones y ratas y sus células manipuladas genéticamente para contener ADN del gen de inmunoglobulina humana, su uso en medicina y el estudio de enfermedades. En la presente memoria se describen procedimientos para la producción de animales y células no humanos, y anticuerpos y cadenas de anticuerpos producidos por dichos animales y sus derivados.
Sumario de la invención
Todas las coordenadas de nucleótidos para el ratón son las correspondientes a NCBI m37 para la cepa C57BL/6J de ratón, p. ej., Abril 2007 ENSEMBL Release 55.37h, p. ej. NCBI37 Julio 2007 (NCBI build 37) (p. ej. Uc Sc version mm9 véase World Wide Web (www) genome.ucsc.edu y World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html) a menos que se especifique lo contrario. Las coordenadas de nucleótidos humanos son las correspondientes a GRCh37 (p. ej., UCSC version hg 19, World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html), Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37, o son las correspondientes a NCBI36, Ensemble Release 54 a menos que se especifique lo contrario. Los nucleótidos de rata son los correspondientes a RGSC 3.4 Dic 2004 ENSEMBL Release 55.34w, o Baylor College of Medicine HGSC v3.4 Nov 2004 (p. ej., UCSC rn4, véase World Wide Web (www) genome.ucsc.edu y World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html) a menos que se especifique lo contrario. La referencia al trabajo en ratones en la presente memoria es solo a modo de ejemplo, y se considera que la referencia a ratones incluye la referencia a todos los mamíferos no humanos a menos que sea evidente de otra manera a partir de la divulgación, se prefieren los ratones como roedores.
Todas las definiciones descritas en los documentos US2012/0204278 y PCT/GB2013/050682 se describen de forma específica y explícita en la presente memoria.
La referencia a segmentos génicos humanos en el documento abarca tanto la secuencia del segmento génico humano de línea germinal como la forma recombinada del segmento de genes que puede incluir una o más mutaciones relativas a la secuencia del segmento génico humano de línea germinal, por ejemplo, los alelos descritos en la base de datos IMGT y la base de datos de 1000 genomas, así como en el documento WO2013041844.
Todos los segmentos génicos a los que se hace referencia en el documento se pueden identificar usando análisis de secuencia estándar por comparación con secuencias de segmentos génicos de la línea germinal humana opcionalmente por referencia a las bases de datos de secuencias públicas, tales como la base de datos IMGT o 1000 Genomes.
La invención es como se define en las reivindicaciones.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula cuyo genoma comprende segmentos génicos humanos VH, D y JH corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y/o segmentos génicos VL y JL humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos génicos se conectan operativamente a su región constante de manera tal que el vertebrado o la célula es capaz de expresar las cadenas pesadas y/o ligeras de la inmunoglobulina que comprenden dominios VH y VL humanos respectivamente, en el que el locus de cadena pesada comprende un segmento génico VH del alelo 01 humano capaz de recombinarse con un segmento génico D y JH humano para producir un dominio VH, en el que el locus de cadena ligera comprende un segmento génico VL del alelo 01 humano capaz de recombinarse con un segmento génico JL humano para producir un dominio VL, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dichas cadenas pesadas y/o ligeras.
Como se explica con más detalle en los ejemplos siguientes, los inventores han demostrado inesperadamente que los alelos 01 humanos se pueden usar para producir sitios de unión al antígeno específicos, en los que estos se recombinan adecuadamente en un vertebrado no humano, muestran mutaciones somáticas y de unión y se pueden expresar y aislar apropiadamente.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vertebrado o célula no humana (por ejemplo, una célula de ratón o célula de rata) cuyo genoma comprende (a) JH2*01 humano y/o JH6*01 humano o j H6*02 y/o JH3*02, uno o más segmentos génicos VH humanos y uno o más segmentos génicos D humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y/o (b) Jk2*01 humano y/o Jk4*01 humano y uno o más segmentos génicos Vk humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos génicos en cada locus se conectan operativamente a la región constante de la misma de modo que el vertebrado o la célula es capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o en el que la célula puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, en el que la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH2*01 humano y/o JH6*01 o JH6*02 y/o JH3*02 con un segmento D un segmento VH y la cadena ligera se produce por recombinación del segmento Jk2*01 y/o Jk4*01 humano con un segmento Vk. En un ejemplo, el genoma comprende JH2*01 humano. En un ejemplo, el
genoma comprende JH2*01 humano and JH6*01. En un ejemplo, el genoma comprende JH2*01 humano, JH6*01 and JH3*02. En un ejemplo, el genoma comprende JH6*01 humano. En un ejemplo, el genoma comprende JH6*01 humano y JH3*02. En un ejemplo, el genoma comprende JH3*02 humano. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH2*01 humano con un segmento D y un segmento VH. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH6*01 con un segmento D y un segmento Vh . En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH6*02 humano con un segmento D y un segmento VH. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH3*02 humano con un segmento D y un segmento VH.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano cuyo genoma comprende (i) JH1*01, JH2*01, JH3*02, j H4*02, JH5*02 y/o JH6*01 o JH6*02 humanos, uno o más segmentos génicos VH humanos y uno o más segmentos génicos D humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y/o (ii) Jk1*01, Jk2*01, Jk3*01, Jk4*01 y/o Jk5*01 humanos y uno o más segmentos génicos Vk humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos génicos de cada locus se conectan operativamente a su región constante de manera tal que el vertebrado o la célula es capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena pesada del anticuerpo y/o una cadena ligera del anticuerpo, en el que la cadena pesada se produce por recombinación de los segmentos Jh 1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 y/o JH6*01 o JH6*02 humanos con un segmento D y un segmento VH y la cadena ligera se produce por recombinación del segmentos Jk1*01, Jk2*01, Jk3*01, Jk4*01 y/o Jk5*01 humanos con un segmento Vk. En un ejemplo, el genoma comprende JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 y JH6*01 humanos. En un ejemplo, el genoma comprende JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 y JH6*02 humanos. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH2*01 humano con un segmento D y un segmento VH. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH6*01 con un segmento D y un segmento VH. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH6*02 humano con un segmento D y un segmento VH. En un ejemplo, la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH3*02 humano con un segmento D y un segmento VH. En forma adicional o alternativa a estos ejemplos de cadena pesada, en un ejemplo la cadena ligera se produce por recombinación del segmento Jk2*01 humano con un segmento Vk.
En una realización, el vertebrado no humano además comprende uno o más de los segmentos génicos VH y/o uno o más de los segmentos génicos D de la Tabla 7 y/o uno o más segmentos génicos Vk de la Tabla 12. En una realización adicional, el vertebrado no humano además comprende los segmentos génicos VH y segmentos génicos D de la Tabla 3 y/o los segmentos génicos Vk de la Tabla 10 o 11.
Los segmentos descritos en la presente memoria se han identificado por los inventores como ampliamente y muy usados en diversas poblaciones étnicas humanas y, por tanto, ampliamente tolerados para la generación de anticuerpos y la eficacia en humanos en general.
En una realización adicional, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano o célula de vertebrado (por ejemplo, una célula de ratón o célula de rata) cuyo genoma comprende uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos JH humanos y uno o más segmentos génicos D humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y uno o más segmentos génicos JL humanos y uno o más segmentos génicos VL humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera, en el que los segmentos génicos en cada locus se conectan operativamente a su región constante de manera tal que el vertebrado o célula es capaz de producción de una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o donde la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, en el que dicho uno o más segmentos génicos VH humanos del locus de cadena pesada comprenden o consisten en uno, más o todos los segmentos génicos VH humanos seleccionados del grupo que consiste en VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 y VH3-9*01.
En una realización adicional, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano o célula de vertebrado (por ejemplo, una célula de ratón o célula de rata) cuyo genoma comprende uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos JH humanos y uno o más segmentos génicos D humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y uno o más segmento génico Jk humanos y uno o más segmentos génicos Vk humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera, en el que los segmentos génicos en cada locus se conectan operativamente a su región constante de manera tal que el vertebrado o la célula es capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o donde la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, en el que dichos uno o más segmentos génicos Vk humanos comprenden o consisten en uno, más o todos los segmentos génico Vk humanos seleccionados del grupo que consiste en Vk4-1*01, Vk2-28*01, VKlD-13*d01, Vk1-12*01, Vk1D-12*02, Vk3-20*01 , Vk1-17*01, Vk1D-39*01, Vk3-11*01, Vk1D-16*01 y VKl-9*d01.
En otra realización, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano o célula de vertebrado (por ejemplo, una célula de ratón o célula de rata) cuyo genoma comprende JH2*01 humano y/o JH6*02 humano, uno o más segmentos génicos VH humanos y uno o más segmentos génicos D humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y/o Jk2*01 humano y/o Jk4*01 humano y uno o más segmentos génicos Vk humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos
génicos en cada locus están operativamente unidas a su región constante de manera tal que la célula o vertebrado es capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o donde la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, en el que la cadena pesada se produce por recombinación del segmento JH2*01 y/o JH6*02 humanos con un segmento D y un segmento VH y/o la cadena ligera se produce por recombinación del segmento Jk2*01 y/o Jk4*01 humano con un segmento Vk; en el que dichos uno o más segmentos génicos VH humanos del locus de cadena pesada comprenden o consisten en uno, más o todos los segmentos génicos VH humanos seleccionados del grupo que consiste en VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 y VH3-20*d01 y/o en el que dichos uno o más segmentos génicos Vk humanos comprenden o consisten en uno, más o todos los segmentos génicos VH humanos seleccionados del grupo que consiste en Vk4-1*01, Vk2-28*01, VKlD-13*d01, Vk1-12*01, Vk1D-12*02, Vk3-20*01, Vk1-17*01, Vk1D-39*01, Vk3-11*01, Vk1D-16*01 y VKl-9*d01.
Opcionalmente la referencia a un segmento génico humano es la forma recombinada del segmento génico.
Como se explica con más detalle en los ejemplos a continuación, los inventores han demostrado inesperadamente que las cadenas pesadas y/o ligeras producidas de acuerdo con la invención se pueden usar para producir sitios de unión al antígeno específicos, en los que estos se recombinan apropiadamente en un vertebrado no humano, muestran mutaciones de unión y somáticas y se pueden expresar y aislar adecuadamente.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más locus de Ig endógena, el genoma que comprende segmentos génicos VA y JA humanos corriente arriba de una región constante, en el que los segmentos génicos VA y JA humanos se seleccionan de uno, más o todos los segmentos de la Tabla 18 y se han proporcionado mediante la inserción en un locus de cadena ligera endógeno del vertebrado o célula, en el que el vertebrado comprende cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda) o la célula puede desarrollar en un vertebrado que expresa dichas cadenas ligeras de inmunoglobulina, en el que las cadenas ligeras lambda comprenden cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda recombinantes de uno, más o todos los segmentos génicos VA y JA humanos de la Tabla 18.
Inactivación de la cadena ligera endógena y alta expresión de regiones variables lambda humanas en vertebrados y células no humanos transgénicos
Como se explica adicionalmente en los ejemplos siguientes, los inventores han observado inesperadamente niveles de expresión muy altos de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas (al menos 70 u 80% de V lambda humana) a partir de locus de cadenas ligeras transgénicas producidas por inserción dirigida de segmentos génicos lambda humanos en locus de cadenas ligeras endógenas de vertebrados no humanos. Esto es posible incluso en presencia de segmentos génicos V y J endógenos de vertebrados no humanos en el genoma de vertebrados. Asimismo, los niveles de expresión inesperadamente altos se logran cuando la inserción de segmentos génicos lambda humanos está en el locus de kappa o lambda endógena. Hasta ahora, no se han publicado en la técnica niveles tan altos por inserción dirigida.
Los inventores también observaron inesperadamente que la expresión de la cadena kappa endógena se puede inactivar por completo mediante la inserción dirigida de la secuencia del gen lambda humano en el locus kappa endógena, como se explica con más detalle en los ejemplos.
La inserción dirigida de segmentos génicos humanos en locus de Ig endógena es ventajosa porque permite la ubicación operativa de secuencias de Ig humana insertadas con respecto a regiones constantes de Ig endógenas y regiones de control endógenas, tales como, por ejemplo potenciadores y otras regiones de control de locus. Por tanto, la inserción dirigida permite aprovechar el control endógeno importante en uno o más de la recombinación del segmento génico de Ig, exclusión alélica, maduración por afinidad, cambio de clase, niveles de expresión de Ig y el desarrollo deseable del compartimiento de células B. Como tal, la inserción dirigida es superior a los primeros intentos en la técnica para producir locus y expresión de Ig transgénica, dichos intentos se basaron en la introducción en células de vertebrados no humanos de vectores tal como YAC que portan segmentos génicos de Ig humana. Los YAC se integran aleatoriamente en el genoma de las células de vertebrados, por lo que es difícil lograr el control proporcionado por la inserción dirigida y los beneficios concomitantes que se obtienen en términos de aprovechar los mecanismos de control endógenos. Además, la inserción aleatoria a menudo produce los segmentos génicos de Ig humana insertados estén bajo el control de elementos de control heterólogos y/o modificaciones cromosómicas epigenéticas, tales como confirmaciones de metilación y cromatina, cualquiera de las cuales puede ser perjudicial para la recombinación apropiada del segmento génico de Ig, exclusión alélica, maduración por afinidad, cambio de clase, niveles de expresión de Ig y desarrollo deseable del compartimiento de células B. La inserción aleatoria generalmente produce 2 o más copias del transgén introducido que puede causar inestabilidad cromosómica y, por lo tanto, producir un rendimiento reproductivo deficiente de los animales, además de efectos perjudiciales sobre la recombinación adecuada del segmento génico Ig, exclusión alélica, maduración por afinidad, cambio de clase, los niveles de expresión de Ig y desarrollo deseable del compartimiento de células B. Por tanto, los intentos de la técnica anterior que usan inserción aleatoria han llevado a un desarrollo deficiente de células B, compartimientos de células B
relativamente pequeños y una expresión de Ig inferior y una dificultad concomitante para aislar un anticuerpo con una característica deseada.
Por consiguiente la divulgación proporciona los siguientes aspectos:-
Expresión de regiones variables lambda humanas
Cada realización de la divulgación descrita en la presente memoria se puede poner en práctica con un alelo lambda específico descrito en la Tabla 18, o cualquier combinación de los mismos. Cuando se hace referencia a segmentos génicos en la presente memoria sin referencia a un alelo específico, estos pueden ser opcionalmente los alelos específicos descritos en una cualquiera de las Tablas 1 a 18.
1. Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más locus de Ig endógena, el genoma comprende los segmentos génicos VA y JA humanos corriente arriba de un región constante, en la que los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado mediante la inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado, en el que el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en el que las cadenas ligeras lambda comprenden cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más locus de Ig endógena, el genoma comprende segmentos génicos VA y JA humanos corriente arriba de un región constante, en el que los segmentos génicos VA y JA humano se han proporcionado mediante inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado, en el que el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), y donde al menos 70 u 80 de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por los vertebrados se derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. Esto se demuestra en los ejemplos siguientes.
Por ejemplo, al menos el 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%, o el 100% de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por los vertebrados se derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. Esto se demuestra en los ejemplos siguientes.
La expresión (por ejemplo, porcentaje de expresión o proporción o nivel de expresión) de Ig se puede determinar al nivel de transcripciones de ARNm de cadena de anticuerpos en células B (por ejemplo, linfocitos de sangre periférica). En forma adicional o alternativa, el porcentaje de expresión se determina al nivel de anticuerpo en suero o sangre de los vertebrados. En forma adicional o alternativa, la expresión se puede determinar mediante análisis FACS de células B.
En estos aspectos, "cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas" significa regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos VH, D y JH humanos.
"En forma esencialmente exclusiva", las cadenas pesadas expresadas comprenden regiones variables humanas, es decir, hay solo una expresión de región variable de cadena pesada de ratón relativamente muy baja o incluso nula. Por ejemplo, al menos el 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% o 100% de las cadenas pesadas son cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas. En una realización, al menos el 90% de las cadenas pesadas son cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas. El porcentaje de expresión se puede determinar al nivel de transcripciones de ARNm de cadena pesada en células B (por ejemplo, linfocitos de sangre periférica). En forma adicional o alternativa, el porcentaje de expresión se determina al nivel de cadenas pesadas o anticuerpos en el suero o la sangre de los ratones. En forma adicional o alternativa, la expresión se puede determinar mediante análisis FACS de células B.
El ratón puede comprender cualquier locus de cadena pesada endógena en que los segmentos génicos V, D y J humanos están presentes, como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, el genoma de ratón comprende un locus de cadena pesada de ratón en que al menos segmentos génicos VH humanos Vh 2-5, 7-4-1,4-4, 1-3, 1-2, 6 1, y todos los segmentos génicos humanos D y Jh D1-1,2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4 17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6 están corriente arriba de la región constante de ratón.
El vertebrado en estos aspectos es, por ejemplo, naíve (es decir, no inmunizado con un antígeno predeterminado, como se entiende el término en la técnica; por ejemplo, tal vertebrado se ha mantenido en un ambiente relativamente estéril proporcionado por un establecimiento para animales usado para R&D). En otro ejemplo, el vertebrado se ha inmunizado con un antígeno predeterminado, por ejemplo, un antígeno que porta un epítopo humano.
En una realización, las cadenas pesadas, junto con las cadenas ligeras expresadas en los ratones de la invención, forman anticuerpos (Ig). Las cadenas ligeras se pueden expresar a partir de cualquier locus de cadena ligera transgénica como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, el genoma del ratón comprende un locus de
cadena pesada en el que hay un locus de cadena pesada de inmunoglobulina quimérica que comprende uno o más segmentos génicos V humanos, uno o más segmentos génicos D humanos y uno o más segmentos génicos J humanos corriente arriba de una región constante mu de dicha especie no humana; la expresión de cadena pesada endógena ha sido sustancialmente inactivada; y el locus de cadena pesada comprende un potenciador Ep de dicha especie de vertebrado no humano.
En una realización de cualquier aspecto, la expresión de la cadena ligera endógena (por ejemplo, kappa y/o lambda) es sustancialmente inactiva o inactivada, por ejemplo usando un procedimiento como se describe en la presente memoria. En este caso, menos del 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de dichas cadenas ligeras lambda endógenas se expresan o se pueden expresar. En forma adicional o alternativa, menos del 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de dichas cadenas ligeras kappa endógenas se expresan o se pueden expresar. En un ejemplo, hay una inactivación completa de la expresión kappa y/o lambda endógena, por lo que no se expresan o pueden expresar tales cadenas ligeras.
En una realización, el genoma de ratón comprende segmentos génicos kappa humanos (opcionalmente los alelos de la Tabla 12)
(i) Vk1-5, Vk1-6, Vk1-8 y Vk1-9 (y opcionalmente Vk5-2 y Vk4-1); o
(ii) Vk1-5, Vk1-6, Vk1-8, Vk1-9, Vk3-11, Vk1-12, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk3-20 (y opcionalmente Vk2-24 y/o Vk1-13); o
(iii) Vk1-5, Vk1-6, Vk1-8, Vk1-9, Vk3-11, Vk1-12, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk3-20, Vk2-24,, Vk1 -27, Vk2-28, Vk2-30 y Vk1-33 (y opcionalmente Vk2-29 y/o Vk2-40 y/o Vk1-39);
y opcionalmente
(iv) Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5.
En una realización, el genoma también comprende (i) al menos segmentos génicos VH humanos Vh 2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1, y todos los segmentos génicos D y Jh humanos D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2 15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6 (opcionalmente los alelos de la Tabla 7) y (ii) al menos segmentos génicos humanos Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2, Vk4-1, Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5 (opcionalmente los alelos de la Tabla 12). Como se demuestra en el Ejemplo 16, tales ratones son completamente funcionales en el aspecto de reordenamiento, señalización de BCR y maduración de células B. Más del 90% de los anticuerpos expresados por los ratones comprendían regiones variables de cadena pesada humana y regiones variables de cadena ligera kappa humana. Estos ratones son, por tanto, muy útiles para la selección de anticuerpos que tienen regiones variables humanas que se unen específicamente al antígeno humano después de la inmunización de los ratones con dicho antígeno. Después del aislamiento de dicho anticuerpo, el experto en la técnica puede reemplazar las regiones constantes de ratón con regiones constantes humanas usando técnicas convencionales para llegar a anticuerpos totalmente humanos que son útiles como candidatos a fármacos para la administración a seres humanos (opcionalmente después de una mutación o adaptación para producir un derivado adicional, por ejemplo, con potenciación o inactivación de Fc o después de la conjugación con una carga útil tóxica o indicador o marcador u otro resto activo).
En una realización, el genoma también comprende un ÍEk humano y/o 3'Ek humano corriente abajo de los segmentos génicos J humano en el locus.
Vertebrados no humanos que expresan regiones variables kappa y lambda
(i) Cadenas K y L producidas en relaciones tipo humanas
Este aspecto de la divulgación es útil para producir cadenas ligeras que no están sesgadas a relaciones tipo no humanas. Por ejemplo, en ratones, las cadenas ligeras de tipo kappa predominan por mucho sobre las cadenas ligeras de tipo lambda (típicamente del orden del 95% de cadenas ligeras kappa: 5% de cadenas ligeras lambda en un ratón de tipo salvaje). Los seres humanos, por otro lado, normalmente muestran aproximadamente 60% de kappa: aproximadamente 40% de lambda. Por lo tanto, la expresión lambda es mucho más alta que la hallada en un ratón. Sería deseable proporcionar un vertebrado no humano, tal como un ratón o una rata, en el que se pueda expresar una mayor proporción de cadenas ligeras de tipo lambda. Esto es útil cuando el vertebrado expresa cadenas ligeras que portan regiones variables lambda humanas y otras cadenas ligeras que portan regiones variables kappa humanas. Con este fin, los inventores han demostrado por primera vez tal vertebrado que expresa cadenas ligeras lambda elevada y, por lo tanto, la divulgación proporciona:
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más locus de Ig endógena, el genoma que comprende segmentos génicos VA y JA humanos proporcionados por inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado corriente arriba de una región constante, el genoma que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos proporcionados por inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado corriente arriba de una región constante, en el que el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden
regiones variables de cadena ligera kappa y cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera lambda, en las que más del 20% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda (por ejemplo, según lo determinado por FACS de células B esplénicas).
Las cadenas ligeras restantes expresan regiones variables kappa.
El documento WO03047336 enseña la conveniencia de producir relaciones kappa: lambda tipo humana, pero esto no proporciona una divulgación posible o plausible de cómo lograr esto.
(ii) Cadenas K y L producidas con compartimientos de células B normales
Los inventores han generado con éxito vertebrados no humanos que contienen la inserción dirigida de segmentos génicos lambda V y J humanos para permitir la expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas mediante compartimientos de células B normales (es decir, comparables a vertebrados de tipo salvaje). Por lo tanto, los inventores han proporcionado dichos vertebrados que pueden producir de manera útil tales cadenas ligeras con buenos repertorios y de manera más confiable que los vertebrados no humanos transgénicos de la técnica anterior que muestran compartimientos de células B compuestos de tamaño y madurez reducidos, y que en efecto ni siquiera pueden producir cadenas ligeras que tienen regiones variables lambda humanas. Por lo tanto, la divulgación proporciona:
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más locus de Ig endógena, el genoma que comprende segmentos génicos VA y JA humanos proporcionados por inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado corriente arriba de una región constante, el genoma que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos proporcionados por inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado corriente arriba de una región constante, en el que el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera kappa y cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera lambda, y en las que el vertebrado produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras (por ejemplo, según lo determinado por FACS de células B esplénicas).
Con respecto a los vertebrados no humanos (i) y (ii), se contemplan las siguientes realizaciones (a menos que se especifique, cada realización se aplica a (i) o (ii)):
En una realización, la inserción de VA y JA humanas comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales compuestos por un locus de Ig de cadena lambda humana de VA3-27 a CA7.
En una realización, la inserción de VA y JA humanas comprende al menos segmentos génicos V humanos VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1, opcionalmente los alelos de la Tabla 18.
En una realización, la inserción de VA y JA humanas comprende uno, más o todos los segmentos génicos J humanos JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7.
En una realización, la inserción de VA y JA humanas comprende una inserción de un grupo de JA-CA humano, en el que el grupo comprende los segmentos génicos J y C de JA1 a CA7. En una realización, la inserción de VA y JA humanas comprende una inserción de un potenciador EA humano. Por ejemplo, el potenciador EA se proporciona en configuración de línea germinal con respecto a un JA7 humano que también está comprendido por la inserción. Por ejemplo, el potenciador EA se proporciona en configuración de línea germinal con respecto a un grupo JA-CA humano que también está comprendido por la inserción, en el que el grupo comprende JA1 a CA7 en configuración de línea germinal humana. En una configuración de línea germinal humana, el potenciador EA es 3'del grupo JA-CA.
En una realización o vertebrado (i) o (ii), la inserción de VA y JA humanas se proporciona por una inserción de una secuencia correspondiente a las coordenadas 22886217 a 23327884 del cromosoma humano 22.
En una realización o vertebrado (ii), la inserción de VA y JA humanas se proporciona por una inserción de una secuencia correspondiente a las coordenadas 23064876 a 23327884 del cromosoma humano 22.
En una realización, la inserción Vk y Jk humana comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales compuestos por el locus de Ig de cadena kappa humana de Vk1-33 a Jk5.
En una realización, la inserción Vk y Jk humana comprende al menos segmentos génicos V humanos Vk1-33, Vk2-30, Vk2-29, Vk2-28, Vk1-27, Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2 y Vk4-1, opcionalmente los alelos de la Tabla 12.
En una realización, la inserción Vk y Jk humana comprende uno, más o todos los de segmentos génicos J humanos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5, opcionalmente los alelos de la Tabla 12.
En una realización, más de 30, 35, 40, 45 o 50% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda.
En una realización, de 20 a 40, 45 o 50% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda. En una realización, de 30 a 40, 45 o 50% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda.
En una realización, dichas regiones variables de cadena ligera kappa son regiones variables de cadena ligera kappa humanas.
En una realización, los segmentos génicos Vk y Jk humanos están en un locus kappa de la cadena ligera endógena del vertebrado corriente arriba de una región constante kappa.
En una realización, los segmentos génicos VA y JA humanos están en un locus de cadena ligera kappa endógena del vertebrado.
En una realización, los segmentos génicos VA y JA humanos están en un locus de cadena ligera lambda endógena de la cadena ligera del vertebrado.
En una realización, el vertebrado expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables kappa humanas, y expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas. En un ejemplo, la expresión de la cadena kappa endógena (vertebrado no humano) es sustancialmente inactiva o es inactiva y/o la expresión de la cadena lambda endógena (vertebrado no humano) es sustancialmente inactiva o es inactiva. Cuando el vertebrado es un ratón, la expresión de la cadena lambda del ratón es típicamente muy baja (aproximadamente 5% o menos) y en este caso puede no ser necesario manipula genéticamente el genoma del ratón para inactivar adicionalmente la expresión de la cadena lambda endógena. Por tanto, cuando el vertebrado es un ratón, la expresión de la cadena kappa endógena es sustancialmente inactiva o está inactiva y la expresión de la cadena lambda del ratón es el 5% o menos de toda la expresión de la cadena ligera.
En una realización, el vertebrado produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras. Por ejemplo, esto puede determinarse mediante FACS de células B esplénicas aisladas de vertebrados.
En una realización, el vertebrado produce una relación normal de células B esplénicas T1, T2 y maduras. Por ejemplo, esto se puede determinar mediante FACS de células B esplénicas aisladas de vertebrados.
En una realización, al menos el 40, 50, 60 o 70% de las células B esplénicas totales producidas por el vertebrado son células B maduras. Por ejemplo, esto se puede determinar mediante FACS de células B esplénicas aisladas de vertebrados.
Declaraciones adicionales de la divulgación
En una realización la divulgación se refiere a lo siguiente:
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula de vertebrado cuyo genoma comprende segmentos génicos humanos VH, D y JH corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena y/o segmentos génicos VL y JL humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos génicos se conectan operativamente a su región constante de manera tal que el vertebrado o célula es capaz de expresar cadenas pesada y/o ligera de inmunoglobulina que comprende dominios VH y VL humanos respectivamente, en el que el locus de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano capaz de recombinarse con un segmento génico D y JH humano para producir un dominio VH, en el que el locus de cadena ligera comprende un segmento génico VL humano capaz de recombinarse con un segmento génico JL humano para producir un dominio VL, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dichos dominios variables de cadena pesada y ligera.
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula de vertebrado cuyo genoma comprende segmentos génicos humanos VH, D y JH corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena, en el que los segmentos génicos se conectan operativamente con la región constante del mismo de modo que el vertebrado o célula es capaz de expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden dominios VH humanos, en el que el locus de cadena pesada comprende un segmento génico VH del alelo 01 humano capaz de recombinarse con un segmento génico D y JH humano para producir un dominio VH, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dicho dominio variable de cadena pesada.
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula de vertebrado cuyo genoma comprende segmentos génicos VL y JL corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos génicos se conectan operativamente con la región constante del mismo de modo que el vertebrado o célula es capaz de expresar las cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden dominios VL humanos, en el que el locus de cadena ligera comprende un segmento génico VL del alelo 01 humano capaz de recombinarse con un segmento génico JL humano para producir un dominio VL, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dicho dominio variable de cadena ligera.
Opcionalmente el vertebrado o la célula tiene un genoma que comprende el locus de cadena pesada y el locus de cadena ligera definidos anteriormente y por lo tanto comprende un locus de cadena pesada que comprende un segmento génico VH del alelo 01 humano capaz de recombinarse con un segmento génico D y JH humano para producir un dominio VH y un locus de cadena ligera que comprende un segmento génico VL del alelo 01 humano capaz de recombinarse con un segmento génico JL humano para producir un dominio VL.
En una realización alternativa, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano o célula de vertebrado (por ejemplo una célula de ratón o célula de rata) cuyo genoma comprende uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos JH humanos y uno o más segmentos génicos D humanos corriente arriba de una región constante en una cadena pesada endógena, en el que los segmentos génicos se conectan operativamente con la región constante del mismo de modo que la célula o vertebrado es capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo, o donde la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena pesada del anticuerpo, en el que dichos uno o más segmentos génicos VH humanos del locus de cadena pesada comprenden o consisten en uno, más o todos los segmentos génicos VH humanos seleccionados del grupo que consiste en VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 y VH3-9*01.
En una realización alternativa adicional, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano o célula de vertebrado (por ejemplo, una célula de ratón o célula de rata) cuyo genoma comprende uno o más segmento génico Jk humanos y uno o más segmentos génicos Vk humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera, en el que los segmentos génicos se conectan operativamente con la región constante del mismo de modo que la célula o vertebrado es capaz de producir una cadena ligera del anticuerpo, o donde la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa una cadena ligera del anticuerpo, en el que dicho uno o más segmentos génicos Vk humanos comprenden o consisten en uno, más o todos los segmentos génico Vk humanos seleccionados del grupo que consiste en Vk4-1*01 , Vk2-28*01, VKlD-13*d01, Vk1-12*01, Vk1D-12*02, Vk3-20*01, Vk1-17*01, Vk1D-39*01, Vk3-11*01, Vk1D-16*01 y VK1-9*d01.
En una realización alternativa, la divulgación se refiere a un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula de vertebrado cuyo genoma comprende segmentos génicos humanos VH, D y JH corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena, en el que los segmentos génicos JH comprenden JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 y/o Jh 6*01 o JH6*02 y los segmentos génicos se conectan operativamente con la región constante del mismo de modo que el vertebrado o célula es capaz de expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden dominios VH humanos, en el que el locus de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano capaz de recombinarse con un D humano y uno de dichos segmentos génicos JH para producir un dominio VH, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dicho dominio variable de cadena pesada.
En una relación preferida, los segmentos génicos JH son JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 y JH6*02. En otra realización, los segmentos génicos JH son JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 y JH6*01.
En una realización, el vertebrado no humano además comprende uno o más de los segmentos génicos VH y/o uno o más de los segmentos génicos D de la Tabla 7. En una realización adicional, el vertebrado no humano además comprende los segmentos génicos VH y segmentos génicos D de la Tabla 3.
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula de vertebrado cuyo genoma comprende segmentos génicos VL y JL corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que los segmentos génicos JL comprenden Jk1*01, Jk2*01, Jk3*01, Jk4*01 y/o Jk5*01 y los segmentos génicos se conectan operativamente con la región constante del mismo de modo que el vertebrado o célula es capaz de expresar cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden los dominios VL humanos, en el que el locus de cadena ligera comprende un segmento génico VL humano capaz de recombinarse con uno de dichos segmentos génicos JL humanos para producir un dominio VL, o en el que la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dicho dominio variable de cadena ligera.
En una realización, el vertebrado no humano además comprende uno o más o todos los segmentos génicos Vk de la Tabla 12. En una realización adicional, el vertebrado no humano además comprende los segmentos génicos Vk de la Tabla 10 o 11.
Opcionalmente el vertebrado o célula tiene un genoma que comprende el locus de cadena pesada y el locus de cadena ligera definidos anteriormente y por lo tanto comprende un locus de cadena pesada que comprende un segmento génico VH humano capaz de recombinarse con un segmento D humano y uno de dichos segmentos génicos JH para producir un dominio Vh y un locus de cadena ligera que comprende un segmento génico VL humano capaz de recombinarse con uno de dichos segmentos génicos JL humanos para producir un dominio VL.
Se prevé que en todas las realizaciones de la divulgación, el genoma de la célula o vertebrado de acuerdo con la divulgación puede no comprender un segundo alelo humano de uno, más o todos los segmentos génicos humano.
En una realización, el locus de cadena ligera endógena es el locus kappa endógena, y en otra realización es el locus lambda endógena.
Combinaciones de alelo
En una realización, el alelo del segmento génico es un alelo d01, opcionalmente un alelo d01 descrito en la Tabla 7, Tabla 12 o Tabla 18.
En una realización, el vertebrado o célula tiene un genoma adicional que comprende un alelo 02, 03, 04, 05, 10, 12, 18 o d03 descrito en la Tabla 7, Tabla 12 o Tabla 18.
Los alelos preferidos de la divulgación se exponen en las Tablas 1 a 18 siguientes:
Tabla 1: IgH Alelos #1 - alelos S1
En una Tabla 1 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 2: IgH Alelos #2 - Alelos S2
En una Tabla 2 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 3: IgH Alelos #3 - Alelos S3
En una Tabla 3 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 4: IgH Alelos #4 - Alelos S4
En una Tabla 4 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 5: IgH Alelos #5 - Alelos S5
En una Tabla 5 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 6: IgH Alelos #6 - S6 alelos
En una Tabla 6 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 7: IgH Alelos #7 - Alelos S7 (un repertorio completo de segmentos génicos funcionales de IgH)
En una Tabla 7 alternativa, el alelo JH6 puede ser JH6*01.
Tabla 8: IgK Alelos #1 - Alelos K1
Tabla 9: IgK Alelos #2 - Alelos K2
Tabla 10: IgK Alelos #3 - Alelos K3
Tabla 11: IgK Alelos #4 - Alelos K4
Tabla 12: IgK Alelos #5 - Alelos K5 (un repertorio completo de segmentos génicos kappa humano funcionales)
En un aspecto de la Tabla 12 no hay un segmento génico Vk1D-39 presente en el genoma.
Para evitar dudas, cualquier referencia a la Tabla 12 en la presente memoria, incluidas las reivindicaciones, puede leerse con o sin la limitación de que en un aspecto de la Tabla 12, no hay un segmento génico VkID -39 presente en el genoma.
En una Tabla 12, el alelo Vk2D-26 es VK2D-26*d02.
Tabla 13: IgA Alelos #1 - Alelos L1 o P1
Tabla 14: IgA Alelos #2 - Alelos L2 o P2
Tabla 15: IgA Alelos #3 - Alelos L3 o P3
Tabla 16: IgA Alelos #4 - Alelos L4 o P4
Tabla 17: IgA Alelos #5 - Alelos L5 o P5
Tabla 18: IgA Alelos #6 - Alelos L6 o P6 (un repertorio completo de alelos lambda humanos funcionales)
Con respecto a la Tabla 18, en un aspecto no hay segmento génico CA6 o JA6 presente en el genoma. En otro aspecto, en forma adicional o alternativa, no hay segmento del gen VA3-22 y/o VA5-39 y/o VA10-54.
Para evitar dudas, cualquier referencia a la Tabla 18 en la presente, incluidas las reivindicaciones, se puede leer con o sin la limitación de que, en un aspecto de la Tabla 18, no hay CA6 o JA6 presente, y sin o sin la limitación que existe no hay segmento génico VA3-22 y/o VA5-39 y/o VA10-54.
Los ejemplos de segmentos génicos en el documento WO2013/041844 se describen de forma específica y explícita en la presente memoria como posibles segmentos génicos con respecto a la presente invención y para su posible inclusión en una o más reivindicaciones del presente documento.
Cada aspecto, realización, cláusula o disposición descrita en la presente memoria se puede combinar en un vertebrado no humano capaz de expresar uno o más segmentos génicos humanos descritos en el documento WO2013/041844 y/o descritos en la presente memoria o un sitio de unión o anticuerpo que es un producto de recombinación de una o más secuencias génicas humanas descritas en el documento WO2013/041844 y/o descritos en la presente memoria, según corresponda,
Los segmentos génicos descritos en las Tablas 1-7 del documento WO2013/041844 se describen de forma específica y explícita en la presente como posibles secuencias de segmentos génicos con respecto a la presente invención y
para su posible inclusión en una o más reivindicaciones de la presente. Las secuencias se exponen en el listado de secuencias presentada con esa solicitud.
En las secuencias incluidas al final de la divulgación se exponen más ejemplos de secuencias de segmentos génicos para su uso en el contexto de la invención.
En una relación preferida, el genoma del vertebrado o células de la divulgación comprende uno o más segmentos génicos de cualquiera de las Tablas 1 a 18. En una realización preferida adicional, el genoma del vertebrado o célula que comprende una combinación de cualquiera de dos segmentos génicos de cualquiera de las Tablas 1 a 18. En otra realización preferida más, el genoma del vertebrado o célula que comprende una combinación de cualquiera de tres segmentos génicos de cualquiera de las Tablas 1 a 18.
En la realización más preferida, el genoma del vertebrado o célula que comprende una combinación de cualquiera de cuatro segmentos génicos de cualquiera de las Tablas 1 a 18. Con preferencia un segmento de cadena pesada VH y JH se selecciona de la Tabla 7 y un segmento de cadena ligera VL y JL se selecciona de la Tabla 12 o Tabla 18. Opcionalmente un segmento de cadena pesada D se selecciona de la Tabla 7.
Además se refiere a un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula cuyo genoma comprende segmentos génicos VL y JL humanos corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera endógena, en el que el vertebrado o célula expresa las cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprende regiones variables humanas, o donde la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dichas cadenas ligeras, en el que dichas cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden cadenas ligeras que comprenden regiones variables humanas derivadas de la recombinación de (i) segmentos génicos Vk y Jk humanos seleccionados del grupo que consiste en segmentos génicos Vk y Jk de cualquiera de las Tablas 8 a 12 o (ii) segmentos génicos VA y JA humanos seleccionados del grupo que consiste en segmentos génicos VA y JA de cualquiera de las Tablas 12 a 18.
En una realización el vertebrado o células de la divulgación expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas y en las que al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de las regiones variables de tales cadenas ligeras se derivan de la recombinación de los segmentos génicos VA y JA humanos.
Opcionalmente las cadenas ligeras se expresan como anticuerpos IgG, por ejemplo, IgG1 o IgG2b, opcionalmente IgG2a.
La región constante puede ser una región constante kappa o lambda; opcionalmente región constante humana, de ratón o rata. Dichos locus de cadena ligera endógena pueden ser un locus kappa o lambda; opcionalmente en el que el genoma comprende al menos los segmentos génicos V y J de la Tabla 8 en un locus de cadena ligera endógena, por ejemplo, el locus kappa y/o al menos los segmentos génicos V y J de la Tabla 13 en un locus de cadena ligera endógena, por ejemplo el locus lambda o kappa.
Dichas cadenas ligeras pueden comprender cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprende regiones variables humanas que se derivan de la recombinación de (ii), cada una de tal región variable que se expresa con una región constante codificada por un segmento génico CA seleccionado del grupo que consiste en los segmentos génicos CA de la Tabla 18.
En esta realización de la divulgación, el vertebrado o célula pueden expresar cadenas ligeras que comprende regiones variables lambda humanas y al menos 60%, 70% o 80% de las regiones variables de tales cadenas ligeras se pueden derivar de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos, por ejemplo los segmentos V y J listados en la Tabla 18.
Una divulgación también se refiere a un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula cuyo genoma comprende segmentos génicos humanos VH, D y JH corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada endógena, en el que el vertebrado o célula expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprende regiones variables humanas o la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dichas cadenas pesadas, o donde la célula puede expresar las cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en el que dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina comprenden cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas derivadas de la recombinación de (iii) segmentos génicos humanos VH, D y JH seleccionados del grupo que consiste en los segmentos génicos VH, D y JH de la Tabla 7.
En una realización dichas cadenas ligeras se coexpresan con dichas cadenas pesadas para formar anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos IgG.
Un vertebrado no humano (por ejemplo, un ratón o rata) o célula cuyo genoma comprende un repertorio del segmento génico de Ig producido mediante inserción dirigida de segmentos génico de Ig humana en uno o más locus de Ig endógena, el genoma que comprende segmentos génicos VA y JA humanos corriente arriba de una región constante, en el que los segmentos génicos VA y JA humanos se ha proporcionado por inserción en un locus de cadena ligera endógena del vertebrado o célula, en el que el vertebrado comprende cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprende regiones variables lambda (lambda cadenas ligeras) o la célula se puede desarrollar en un vertebrado que expresa dichas cadenas ligeras de inmunoglobulina, en el que las cadenas ligeras lambda comprenden cadenas
ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos; en el que al menos 60%, 70%, 80% o 90% de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado se derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos; opcionalmente en el que el vertebrado o célula es cualquier vertebrado o célula descrito en la presente memoria.
Un dominio variable o región derivada de, o producida como resultado de, la recombinación de segmentos génicos humanos también se denomina en la presente memoria recombinante de dichos segmentos génicos.
Los segmentos génicos en el locus de cadena pesada y/o ligera se conectan operativamente con la región constante, de manera tal que el vertebrado sea capaz de producir una cadena pesada o ligera del anticuerpo producida por recombinación de los segmentos génicos.
En una realización la célula o vertebrado no humano tiene un genoma que comprende los segmentos kappa de la Tabla 8, o Tabla 9 o Tabla 10, Tabla 11 o Tabla 12, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización la célula o vertebrado no humano tiene un genoma que comprende los segmentos lambda de la Tabla 13 o Tabla 14 o Tabla 15 o Tabla 16 o Tabla 17 o Tabla 18, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización la célula o vertebrado no humano tiene un genoma que comprende los segmentos de cadena pesada de la Tabla 1 o Tabla 2 o Tabla 3 o Tabla 4 o Tabla 5 o Tabla 6 o Tabla 7, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización la célula o vertebrado no humano de la divulgación puede expresar cadenas ligeras que comprenden regiones variables humanas derivadas de la recombinación (es decir, recombinantes) de (i) segmentos génicos Vk y Jk humanos seleccionados del grupo que consiste en segmentos génicos Vk y Jk de la Tabla 8, o Tabla 9, o Tabla 10, o Tabla 11 o Tabla 12, o cualquiera de sus combinaciones
En una realización la célula o vertebrado no humano de la divulgación puede expresar cadenas ligeras que comprende regiones variables humanas derivadas de la recombinación (es decir, recombinantes) de (ii) segmentos génicos VA y JA humanos seleccionados del grupo que consiste en segmentos génicos VA y JA de la Tabla 13 o Tabla 14 o Tabla 15 o Tabla 16 o Tabla 17 o Tabla 18, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización la célula o vertebrado de la divulgación puede expresar cadenas pesadas que comprende regiones variables humanas derivadas de la recombinación (es decir, recombinantes) de segmentos génicos humanos VH, D y JH seleccionado del grupo que consiste en segmentos génicos VH, D y JH de la Tabla 1 o Tabla 2, o Tabla 3, o Tabla 4 o Tabla 5 o Tabla 6 o Tabla 7, o cualquiera de sus combinaciones.
En un ejemplo, el vertebrado o células de la divulgación comprende uno o más o todos los alelos JH de la Tabla 7, por ejemplo, j H2*02 y/o al menos JH6*02 (que es útil para producir dominios V HCDR3 largos para uso terapéutico humano como se muestra en los ejemplos).
En consecuencia, cada alelo combinado con cualquier otro alelo en la Tabla 7 se describe explícitamente en la presente memoria. La misma estructura de combinaciones se describe con relación a los alelos de la Tabla 12 y Tabla 18. En consecuencia, se describe cada alelo en la Tabla 7 combinado con cualquier otro alelo en la Tabla 12 o Tabla 18, y cada alelo en la Tabla 12 se describe en combinación con cualquier otro alelo de la Tabla 12, y cada alelo de la Tabla 18 se describe en combinación con cualquier otro alelo de la Tabla 18.
En un ejemplo, el vertebrado o células de la divulgación comprende uno o más o todos los alelos Jk de la Tabla 12, por ejemplo, al menos Jk2*01 y/o Jk4*01 (que es útil para producir los dominios Vk para uso terapéutico humano como se muestra en los ejemplos).
En una realización, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-23*04, JH2*01, VK4-1*01 y/o JK2*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-7*01, JH6*02, VK2-28*01 y/o JK4*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH7-4-1*01, JH6*02, VK2-28*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-16*02.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH4-4-1*02, JH6*02, VK1D-13*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH1-3*01, JH6*02, VK1-12*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-13*01, JH6*02, VK1D-12*02 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-9*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH4-4*02, JH6*02, VK1D-13*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-13*01, JH6*02, VK3-20*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-23*04, JH6*02, VK1 -17*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-22*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-7*01, JH6*02, VK1 D-39*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-9*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-13*01, JH6*02, VK1D-39*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-13*01, JH6*02, VK3-11*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH4-4*02, JH6*02, VK1D-16*01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-9*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende los segmentos génicos VH3-20*d01, JH6*02, VK1-9*d01 y/o JK4*01. Opcionalmente el genoma también comprende D3-10*01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende el segmento génico humano VH3-23*04. En forma adicional o alternativa, los dominios variables de cadena pesada del anticuerpo de la invención están codificadas por (i) segmentos VH3-23*04, D y JH humanos.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende el segmento génico humano VH3-9*01. En forma adicional o alternativa, dominio variable de cadena pesadas del anticuerpo de la divulgación se codifican por (i) segmentos VH3-9*01, D y JH.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende el segmento génico humano Vk1-12*02 o Vk1D-12*02. En forma adicional o alternativa, dominio variable de cadena ligeras del anticuerpo de la divulgación se codifican por (i) segmentos Vk1-12*02 o Vk1D-12*02 y Jk humanos.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende el segmento génico humano Vk2-28*01. En forma adicional o alternativa, dominio variable de cadena ligeras del anticuerpo de la divulgación se codifican por (i) segmentos Vk2-28*01 y Jk humanos.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende el segmento génico humano Vk4-1*01. En forma adicional o alternativa, dominio variable de cadena ligeras del anticuerpo de la divulgación se codifican por (i) segmentos Vk4-1*01 y Jk humanos. En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación tiene un genoma que comprende la combinación de segmentos génicos descritos anteriormente con JH6*01 en lugar de JH6*02.
En todas las realizaciones descritas en la presente memoria, la región de la cadena pesada V y J opcionalmente se pueden recombinar entre sí y con una región D definida en la presente memoria para formar un dominio variable de cadena pesada. Además, las regiones de la cadena ligera V y J opcionalmente se pueden recombinar para formar un dominio variable de cadena ligera.
La divulgación se extiende a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que comprende dominios variables humanos producidos o derivados de la recombinación de cualquiera de las anteriores combinaciones de segmentos génicos.
En los ejemplos se muestra que los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la divulgación son útiles para producir recombinación de segmentos génicos productivos in vivo, que muestran mutación de unión y mutación somática, y producen dominios que se pueden unir específicamente al antígeno con una buena cinética de unión.
La divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de estos que se obtienen o pueden obtener por recombinación, in vivo en un ratón, mamífero o vertebrado de la invención después de la inmunización, de uno o más segmentos génicos D, uno o más segmentos génicos VH y uno o más de los segmentos génicos JH humanos Jh2*01 y JH6*02.
En una realización, la célula o vertebrado de la divulgación puede expresar cadenas pesadas que comprende regiones variables humanas derivadas de la recombinación de uno o más segmentos génicos D, uno o más JH segmentos génicos y uno o más de los siguientes segmentos génicos VH VH3-20*d01, VH1-24*d01 y VH2-26*d01.
Por lo tanto, la divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a sus antígenos que se obtienen o se pueden obtener por recombinación, in vivo en un ratón, mamífero o vertebrado de la invención después de la inmunización, de uno o más segmentos génicos D, uno o más JH segmentos génicos y uno o más de los segmentos génicos VH humanos VH3-20*d01, VH1-24*d01 y VH2-26*d01.
En una realización adicional, la célula o vertebrado de la divulgación en forma adicional o alternativa pueden expresar cadenas ligeras que comprenden regiones variables humanas derivadas de la recombinación de uno o más Jk segmentos génicos y uno o más de los segmentos génicos Vk humanos VK5-2*d01, VKl-9*d01, VKlD-8*d01, Vk3D-11*d01, VKlD-13*d01, VK3D-15*d01, VK2D-26*d01 y VK2D-28*d01 o recombinación de uno o más segmentos génicos JA y uno o más de los segmentos génicos VA humanos VA2-22*d01, VA2-23*d02, VA3-25*d03 y VA4-60*d03.
Por lo tanto, la divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de estos que se obtienen o se pueden obtener por recombinación, in vivo en un ratón, mamífero o vertebrado de la invención después de la inmunización, de uno o más Jk segmentos génicos y uno o más de los segmentos génicos Vk humanos VK5-2*d01, VKl-9*d01, VKlD-8*d01, VK3D-11*d01, VK2D-26*d01 y VK2D-28*d01 o de uno o más segmentos génicos JA y uno o más de los segmentos génicos VA humanos VA2-22*d0l, VA2-23*d02, VA3-25*d03 y VA4-60*d03.
En todos los aspectos de la invención, la célula puede ser una célula de hibridoma, una célula B, opcionalmente una célula B inmortalizada, o una célula madre embrionaria.
En una realización el vertebrado o célula comprende una región constante que es una región constante kappa o lambda; opcionalmente un ratón o rata región constante. En una realización la región constante puede ser una región constante humana.
En una realización el vertebrado o célula descrito en la presente memoria comprende un locus de cadena ligera endógena que es un locus de kappa o lambda; opcionalmente en el que el genoma comprende al menos los segmentos génicos V y J de la tabla 8, 9 o 10 en un locus de cadena ligera endógena, por ejemplo el locus kappa y/o al menos los segmentos génicos V y J de la tabla 13 o 14 en un locus de cadena ligera endógena, por ejemplo en el locus lambda o kappa.
En una realización el vertebrado o célula descrito en la presente memoria comprende cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas que se derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos seleccionados del grupo que consiste en segmentos génicos VA y JA de la tabla 18, cada una de dicha región variable que se expresa con una región constante codificada por un segmento génico CA seleccionado del grupo que consiste en los segmentos génicos CA de la tabla 18.
En una realización las cadenas ligeras comprenden regiones variables humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos seleccionados del grupo que consiste en segmentos génicos VA y JA de la tabla 18.
En todas las realizaciones de la invención, los dominios VH y VL opcionalmente pueden formar un sitio de unión al antígeno.
La célula de cualquier aspecto de la invención puede ser una célula de hibridoma o una célula B, opcionalmente una célula B inmortalizada. La célula también puede ser una célula ES. La célula ES puede formar parte de una población de al menos 90, 150 o más de 200 células. En un ejemplo, la población de células está contenida en una o más placas de pocillos múltiples (por ejemplo, placas de 96 pocillos) y, por ejemplo, puede ser una población clasificada en la que las células individuales están compuestas por pocillos respectivos diferentes de una placa. El vertebrado de cualquier aspecto puede estar comprendido dentro de un recipiente que comprende aire filtrado, que opcionalmente comprende un filtro de aire.
En una realización, el ambiente interior del recipiente es estéril, por ejemplo, como sea posible usando un recipiente estándar para animales, por ejemplo, un loft para ratones Techniplast™ (http://www.tecniplast.it/us/product/mouseloft.html). En un ejemplo, el recipiente tiene un cuerpo de plástico, por ejemplo, un cuerpo translúcido o transparente.
El recipiente que comprende los vertebrados puede tener un volumen no mayor a cuatro, 3, 2 o 1 metros3. El recipiente puede comprender una pluralidad de vertebrados, por ejemplo, un macho y una hembra (por ejemplo, una pareja fértil).
En una realización, los vertebrados de la invención tienen al menos 3,5 semanas de edad, por ejemplo, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas de edad.
El uso de los segmentos génicos reivindicados, específicamente como se indica en las Tablas 1-18, proporciona las ventajas observadas en los Ejemplos.
La invención además se refiere a un procedimiento de producción de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprendiendo el procedimiento inmunizar un vertebrado de la invención con un antígeno y recuperar el anticuerpo o fragmento o recuperar una célula productora del anticuerpo o fragmento; opcionalmente modificar el anticuerpo o fragmento aislado de manera tal que comprenda regiones constantes humanas.
La invención también incluye un procedimiento de producción de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprendiendo el procedimiento aislar un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una célula de la invención; y opcionalmente modificar el anticuerpo o fragmento aislado de manera tal que comprenda regiones constantes humanas.
Se puede usar tecnología de ADN recombinante para producir una secuencia de nucleótidos modificada que codifica el anticuerpo o fragmento modificado.
El procedimiento puede comprender
(a) aislar del vertebrado una célula B que codifica un anticuerpo que se une al antígeno,
(b) identificar o copiar una secuencia de nucleótidos de la célula B que codifica un dominio VH del anticuerpo y/o identifica o copia la secuencia de nucleótidos de la célula B que codifica un dominio VL del anticuerpo; y
(c) usar las secuencias para producir un anticuerpo aislado que comprende el dominio VH y/o VL; opcionalmente en el que el anticuerpo aislado comprende regiones constantes humanas. La invención incluye un procedimiento para producir un anticuerpo humanizado totalmente que comprende inmunizar un vertebrado descrito en la presente memoria y después reemplazar la región constante del vertebrado no humano de un anticuerpo específicamente reactivo con el antígeno con una región constante humana, adecuadamente por manipulación genética del ácido nucleico que codifica el anticuerpo.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo humanizado producido de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria y al uso de un anticuerpo humanizado así producido en medicina.
En una realización adicional, la invención incluye aislar un anticuerpo IgG1, IgG2b y/o IgM que se une específicamente al antígeno diana.
Un anticuerpo aislado de la divulgación se puede producir mediante expresión a partir de una célula huésped seleccionada de una célula CHO, HEK293, Cos o de levadura (por ejemplo, Picchia). En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo producido por expresión de una célula CHO.
En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento aislado se puede formular con un diluyente, portador, excipiente o fármaco para producir una composición farmacéutica para uso médico humano. Opcionalmente, el anticuerpo formulado se puede empacar en un recipiente estéril, por ejemplo, un vial, tubo, bolsa IV o jeringa, también se produce opcionalmente un kit que comprende combinar el empaque con una etiqueta o instrucciones que indiquen el uso de la composición de anticuerpo para uso médico humano; opcionalmente en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de lote de medicamento y/o un número de autorización de comercialización, además opcionalmente un número de autorización de comercialización de EMA o FDA. En un ejemplo, el anticuerpo aislado (por ejemplo, producido por una célula CHO) (i) se formula con un diluyente, portador, excipiente o un fármaco para producir una composición farmacéutica para uso médico humano, (ii) el anticuerpo formulado se envasa en un recipiente estéril combinado con una etiqueta o instrucciones que indican el uso de la composición de anticuerpos para uso médico en humanos; en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de lote de medicamento y/o un número de autorización de comercialización (por ejemplo, un número de autorización de comercialización de EMA o FDA). En una realización de tal ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a PCSK9 humana y el uso es para tratar o prevenir la hiperlipidemia o para reducir el colesterol en un ser humano. En una realización de tal ejemplo, el anticuerpo se une específicamente al IL6Ra humano y el uso es para tratar o prevenir una afección inflamatoria o artritis reumatoide en un ser humano. En una realización de tal ejemplo, el anticuerpo se une específicamente al IL4Ra humana y el uso es para tratar o prevenir una enfermedad atópica, dermatitis atópica o asma en un ser humano.
La divulgación se refiere al anticuerpo o fragmento producido por el procedimiento de la invención para uso médico humano y al uso del anticuerpo o fragmento aislado producido por el procedimiento de la invención en la fabricación de un medicamento para uso médico humano.
El medicamento puede ser una composición o kit descrito en la presente memoria.
La divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno del mismo que comprende dominios variables humanos producidos por o derivados de la recombinación de cualquier combinación de segmentos génicos descritos en la presente memoria, opcionalmente en el que el anticuerpo y fragmentos se obtienen o se pueden obtener por recombinación, in vivo en un ratón, mamífero u otro vertebrado de la invención después de la inmunización.
En una realización las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por la célula o vertebrado son esencialmente en forma exclusiva dichas cadenas pesadas que comprende regiones variables humanas; y dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas se expresan como parte de los anticuerpos IgG séricos, opcionalmente anticuerpos IgG1, IgG2a o IgG2b, o IgM.
En una realización, la célula o vertebrado de la invención expresa un anticuerpo IgG, opcionalmente un anticuerpo IgG1, IgG2a o IgG2b, o a IgM anticuerpo que comprende cadenas pesadas definidas en la presente memoria, en el que el anticuerpo se une específicamente a un antígeno diana.
La invención además se refiere a:
La divulgación, opcionalmente, producida por un procedimiento de la invención que comprende
(a) un dominio variable de cadena pesada humana derivado de recombinación de segmentos génicos humanos VH, D y JH seleccionado del grupo que consiste en segmentos génicos VH, D y JH de cualquiera de las Tablas 1-7; y
(b) un dominio variable de cadena ligera humana derivado de recombinación de segmentos génicos V y J humanos seleccionados de los segmentos génicos V y J de cualquiera de las Tablas 8-18.
Un anticuerpo o fragmento aislado de unión al antígeno del mismo, opcionalmente obtenido u obtenible por el procedimiento de la invención, en el que una región variable del anticuerpo o fragmento comprende uno o más mouse o mutaciones somáticas del patrón de desaminasa (AID) inducido por activación y/o mutaciones de unión del patrón de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de ratón o rata.
El dominio o la región variable pesada o ligera de acuerdo con la invención pueden comprender hasta 10, que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 mutaciones de unión.
En una realización adicional, el dominio o la región variable pesada o ligera de acuerdo con la invención en forma adicional o alternativa puede comprender hasta 9, que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 8, que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, mutaciones somáticas.
En una realización adicional, la invención incluye un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo aislado, opcionalmente obtenido u obtenible por el procedimiento de la invención, que se une a un receptor gamma, y además opcionalmente una cadena ligera constante humana. En una realización, el Fc comprende dominios constantes gamma humanos, por ejemplo dominios constantes IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanos.
Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo aislado, opcionalmente obtenido u obtenible por el procedimiento de la invención, en el que el anticuerpo comprende la glicosilación de las células CHO, HEK293, Cos o levaduras ejemplo, Picchia).
Un anticuerpo o fragmento de la divulgación se puede unir específicamente una enzima humana.
Un anticuerpo o fragmento de la divulgación se puede unir específicamente a las dianas humanas: proproteína convertasa PC9, proproteína convertasa subtilisina kexina-9 (PCSK9), CD126, IL-4, receptor de IL-4, IL-6, receptor de IL-6, IL- 13, receptor de IL-18, Erbb3, células ASIC1, ANG2, GDF-8, ligando de angiopoyetina 2, ligando de proteína tipo delta 4, inmunoglobulina G1, ligando de PDGF, receptor de PDGF o receptor de NGF, toxina A o toxina B de Clostridium difficile, relaxina, CD48, Cd20, receptor de glucagón, receptor 2 activado por proteasa, ligando tipo TNF 1A (TL1A), relacionado con la angiopoyetina 2 (AR-2), proteína tipo angiopoyetina 4, RANKL, proteína tipoa angiopoyetina 3 (ANGPTL3), ligando 4 tipo delta (DLL4), endotelina-1 grande (ET-1), activina A, receptor de tirosina quinasa, por ejemplo AR-1 humana y tirosina quinasa con dominios de homología de Ig y EGF (TIE) o receptor TIE-2 . En un ejemplo, la diana es PCSK9. En un ejemplo, la diana es el receptor de IL-6 (por ejemplo, IL6Ra). En un ejemplo, la diana es el receptor de IL-4 (por ejemplo, IL4Ra).
Los aspectos preferidos de la divulgación incluyen:
El uso del anticuerpo o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por IL-4Ra en un ser humano. Los trastornos mediados o relacionados por IL-4Ra que se tratan mediante el ligando, anticuerpo o fragmento de la invención incluyen, por ejemplo, artritis (que incluye artritis séptica), herpetiforme, urticaria idiopática crónica, esclerodermia, cicatrización hipertrófica, enfermedad de Whipple, hiperplasia benigna de próstata, trastornos pulmonares, tal como asma leve, moderada o grave, trastornos inflamatorios tales como enfermedad inflamatoria intestinal, reacciones alérgicas, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de células falciformes, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preeclampsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis y nefrosis.
Las afecciones particulares para las que se puede usar un anticuerpo o fragmento de la divulgación en el tratamiento o diagnóstico incluyen: asma, COPD (por ejemplo, bronquitis crónica, enfermedad de las vías respiratorias pequeñas o enfisema), enfermedad inflamatoria intestinal, una afección fibrótica (por ejemplo, esclerosis sistémica, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática inducida por parásitos o fibrosis quística), alergia (por ejemplo, dermatitis atópica, alergia a los ácaros del polvo, alergia a las mascotas o alergia a los alimentos), terapia de trasplante para prevenir el rechazo del trasplante, supresión de una hipersensibilidad de tipo retardado o una reacción de hipersensibilidad por contacto, como adyuvante de la inmunoterapia de alergia o como adyuvante de vacuna.
Además, la divulgación abarca el uso del anticuerpo o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, en el que dicha enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria; una enfermedad o afección atópica; una enfermedad o afección respiratoria; una enfermedad o afección asociada con IgE elevada; o una enfermedad o afección asociada con una actividad elevada de IL-4 y/o IL-13.
Además, la divulgación abarca el uso del anticuerpo o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, en el que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad o afección inflamatoria de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por hipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolismo pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de dificultad respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, cáncer de pulmón, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, gripe, micobacterias no tuberculosas, derrame pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis pulmonar X, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis y granulomatosis de Wegener.
Además la divulgación abarca un anticuerpo o fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria, para la prevención o tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno descrito en la presente memoria,
Además la divulgación abarca el uso del anticuerpo, o fragmento del mismo, en un procedimiento de tratamiento médico de una enfermedad o trastorno descrito en la presente memoria,
Además la divulgación abarca el uso del ligando, anticuerpo o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para el uso para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por PCSK9 en un ser humano.
Los ejemplos no limitantes de tales enfermedades o afecciones pueden incluir, por ejemplo, un trastorno de lípidos, hiperlipoproteinemia, hiperlipidemia; dislipidemia; hipercolesterolemia, un ataque cardíaco, un accidente cerebrovascular, enfermedad cardíaca coronaria, aterosclerosis, enfermedad vascular periférica, claudicación, diabetes tipo II, presión arterial alta y una enfermedad o afección cardiovascular.
Además, la divulgación abarca el uso del ligando, anticuerpo o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para usar para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por IL-6Ra en un ser humano.
Dicha enfermedad o afección puede ser una enfermedad o afección inflamatoria. Dicha enfermedad o afección se puede seleccionar del grupo que consiste en una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, psoriasis, bronquiolitis, gingivitis, rechazo de trasplante, rechazo de trasplante alogénico, enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), asma, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), choque séptico, colitis ulcerosa, síndrome de Sjorgen, inflamación de las vías respiratorias, enfermedad de Castleman, periodontitis, dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico y enfermedad arterial coronaria.
Las siguientes definiciones se aplican a cualquier configuración, aspecto, cláusula, disposición, ejemplo o realización de la invención.
"Derivado de" se usa en el sentido ordinario del término. Los ejemplos de sinónimos incluyen "producido como", "resultante de", "recibido de", "obtenido de", "un producto de", "consecuencia de" y "modificado de". Por ejemplo, una región variable de una cadena pesada humana se puede derivar de la recombinación de segmentos génicos VH, D y JH humanos y esto refleja la recombinación in vivo de estos segmentos génicos en, por ejemplo, un locus transgénico de cadena pesada de acuerdo con la invención con cualquier mutación acompañante (por ejemplo, mutación de unión).
Las muestras de las que se pueden obtener células B incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, bazo, tejido esplénico, médula ósea, linfa, ganglio linfático, timo y apéndice. Se pueden obtener anticuerpos y cadenas de inmunoglobulinas de cada una de las muestras mencionadas anteriormente y también de la siguiente lista no limitante de células B, líquido ascítico, hibridomas y cultivos celulares.
"Pluralidad" se usa en el sentido ordinario del término y significa "al menos uno" o "más de uno".
El término "configuración de la línea germinal" se refiere a una configuración genómica de la línea germinal. Por ejemplo, los segmentos génicos de inmunoglobulina humana de un locus de inmunoglobulina transgénica están en una configuración de línea germinal cuando el orden relativo de los segmentos génicos es el mismo que el orden de los segmentos génicos correspondientes en un genoma de la línea germinal humana. Por ejemplo, cuando el locus transgénico es un locus de cadena pesada de la invención que comprende segmentos génicos de inmunoglobulina humana hipotéticos A, B y C, estos se pueden proporcionar en este orden (5' a 3' en el locus) cuando los segmentos génicos correspondientes de un genoma de la línea germinal humana comprende la disposición 5-A-B-C-3'. En un
ejemplo, cuando se proporcionan elementos de un locus de inmunoglobulina humana (por ejemplo, segmentos génicos, potenciadores u otros elementos reguladores) en un locus de inmunoglobulina transgénica de acuerdo con la invención, los elementos del locus de Ig humana están en configuración de línea germinal cuando el orden relativo de los segmentos génicos es el mismo que el orden de los segmentos génicos correspondientes en un genoma de la línea germinal humana y se incluyen las secuencias humanas entre los elementos, que corresponden a dichas secuencias entre los elementos correspondientes en el genoma de la línea germinal humana. En consecuencia, en un ejemplo hipotético, el locus transgénico comprende elementos humanos en la disposición 5-A-S1-B-S2-C-S3-3', en el que A, B y C son segmentos génicos de inmunoglobulina humana y S1-S3 son secuencias de segmentos intergénicos humanos en que la disposición correspondiente 5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'está presente en un genoma de la línea germinal humana. Por ejemplo, esto se puede lograr al proporcionar en un locus de inmunoglobulina transgénica de la invención un inserto de ADN correspondiente a la secuencia de ADN de A a C en un genoma de línea germinal humana (o el inserto que comprende la secuencia de ADN de A a C). Las disposiciones en los genomas de la línea germinal humana y los locus de inmunoglobulina son conocidos en la técnica (por ejemplo, ver IMGT en la World Wide Web (véase más arriba), Kabat y otros recursos de anticuerpos a los que se hace referencia en la presente memoria).
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas de cadena simple, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, dAb, Fab, F (ab') 2 y Fv). El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos H2 que comprenden un dímero de una cadena pesada (5'-VH-(bisagra opcional) -CH2-CH3-3') y están desprovistos de una cadena ligera (similar a los anticuerpos H2 natural; véase, por ejemplo, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R). Por lo tanto, en una realización de la presente invención, el ARN producido a partir del locus de cadena pesada transgénica codifica cadenas pesadas que están desprovistas de un segmento génico CH1 y no comprenden una cadena ligera de anticuerpo funcional. En un ejemplo, el ARN producido a partir del locus de cadena pesada transgénica codifica dominios de variable única VH (dAbs; anticuerpos de dominio). Estos pueden comprender opcionalmente una región constante.
El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con "anticuerpo" en la presente memoria.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su ambiente de producción (por ejemplo, de forma natural o recombinante). Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su ambiente de producción, por ejemplo, de modo que el anticuerpo se ha aislado en un estándar aprobable o aprobado por la FDA. Los componentes contaminantes de su ambiente de producción, tal como el que resulta de células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente pueden interferir en los usos de investigación, diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purifica: (1) hasta más de 95% en peso de anticuerpo según lo determinado, por ejemplo, mediante el procedimiento de Lowry, y en algunas realizaciones, hasta más del 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo. Sin embargo, normalmente se preparará un polipéptido o anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la unión del antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos dAb, Fab, Fab', F (ab') 2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Un anticuerpo que "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido, antígeno o epítopo particular es uno que se une a ese polipéptido, antígeno o epítopo particular sin unirse sustancialmente a otros polipéptidos, antígenos o epítopos. Por ejemplo, la unión al antígeno o epítopo es específica cuando el anticuerpo se une con una Kd de 100 pM o menos, 10 pM o menos, 1 pM o menos, 100 nM o menos, por ejemplo, 10 nM o menos, 1 nM o menos., 500 pM o menos, 100 pM o menos, o 10 pM o menos. La afinidad de unión (Kd) se puede determinar usando procedimientos estándares que serán conocidos por el experto, por ejemplo, unión en ELISA y/o determinación de afinidad usando resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, medición de afinidad en fase de solución Biacore™ o KinExA™ que puede detectar hasta afinidades fM (Sapidyne Instruments, Idaho)).
"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a aprobado o aprobable por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal de los EE. UU., o listado en la Farmacopea de los EE.UU., u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, incluidos los seres humanos. Un "portador, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, excipiente o adyuvante que se puede administrar a un sujeto, junto con un agente, por ejemplo, cualquier anticuerpo o cadena de anticuerpos descritos en la presente memoria, y que no destruye su actividad farmacológica y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para liberar una cantidad terapéutica del agente.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1, parte 1 ilustra el primer y segundo BAC usados para la inserción en los loci de cadenas ligeras endógenas de ratón. Se muestra el ADN humano en cada bAc . La parte 2 de la Figura 1 muestra el punto de inserción del ADN del locus de Ig lambda humana en el locus de la cadena kappa endógena de ratón. La parte 3 de la figura 1 muestra el punto de inserción del ADN del locus de Ig lambda humana en el locus de la cadena lambda endógeno de ratón.
La Fig. 2 muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de CA humana y de ratón (y por tanto la expresión de la región variable humana y de ratón correspondiente) en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos P1 (P1/P1) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT).
La Fig. 3A muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de Ck y CA de ratón en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos P2 (P2/P2) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT). No se observó expresión de Ck de ratón detectable.
La Fig. 3B muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de CA humana (y en consecuencia la correspondiente expresión de la región variable humana) en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos p2 (P2/P2) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT).
La Fig. 4 muestra el uso de VA humana en ratones homocigotos P2 (P2/P2) y el uso típico de VA en seres humanos, (recuadro)
La Fig. 5 muestra el uso de JA humana en ratones homocigotos P2 (P2/P2) y el uso típico de JA en seres humanos (recuadro)
La Fig. 6 muestra el uso de VA es muy alto en ratones homocigotos P2 (P2/P2).
La Fig. 7 muestra la distribución del uso del segmento génico Vk de ratón y VA humano del locus de kappa quimérico en ratones homocigotos P2 (P2/P2).
La Fig. 8 ilustra la disposición de RSS en los locus de lambda y kappa.
La Fig. 9A muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de CA humana y de ratón (y, por tanto, la expresión de la región variable humana y de ratón correspondiente) en células B esplénicas B220 de ratones homocigotos L2 en los que se ha inactivado la expresión de la cadena kappa endógena (L2/L2; KA/KA) en comparación con ratones que no tienen ADN lambda humano insertado y en los que se ha inactivado la expresión de la cadena kappa endógena (KA/KA). Se observó un uso muy alto de VA humana (L2/L2; KA/KA) en ratones, casi con exclusión del uso de VA de ratón.
Fig. 9B: Análisis del compartimiento de células B esplénicas. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B esplénicas de L2/L2 transgénicas; ratones KA/KA (homocigotos L2; homocigotos para la inserción del segmento génico lambda humano en locus de lambda endógena; la expresión de la cadena kappa endógena se ha inactivado) en comparación con células B esplénicas de ratones que expresan solo anticuerpos de ratón (ratones KA/KA). Los resultados muestran que los compartimientos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimientos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
Fig. 10: Desarrollo de células B y marcadores en los compartimientos de médula ósea y esplénicos.
Fig. 11A: Análisis del compartimiento de células B esplénicas. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B esplénicas de ratones transgénicos S1F/HA, KA/+ de la invención que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde se ha inactivado la expresión de cadena pesada endógena por inversión), en comparación con células B esplénicas de ratones que expresan solo anticuerpos de ratón. Los resultados muestran que los compartimientos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimientos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
S1F/HA, /KA = (i) S1F - el primer alelo de cadena pesada endógena tiene una inserción de ADN del locus de cadena pesada humana, la región VDJ de ratón endógena se ha inactivado por inversión y movimiento corriente arriba en el cromosoma; (ii) HA - el segundo alelo de la cadena pesada endógena ha sido inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); (iii) - el primer alelo de kappa endógena es un alelo de kappa de tipo salvaje; y (iv) KA: el segundo alelo de kappa endógena ha sido inactivado (mediante la inserción de una secuencia de interrupción endógena). Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas del primer alelo de cadena pesada endógena.
Fig. 11B: Análisis del compartimiento de células B esplénicas. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B esplénicas de ratones transgénicos S1 F/HA, K2/KA de la divulgación que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde la expresión de cadena pesada endógena ha sido
inactivada por inversión) y regiones variables de la cadena kappa humana, en comparación con las células B esplénicas de ratones / Ha , K2/KA. Los resultados muestran que los compartimientos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales.
S1F/HA, K2/KA = (i) K2 - el primer alelo de kappa endógena tiene dos inserciones de ADN del locus de la cadena kappa entre Jk endógena más 3' y Ck de ratón, lo que proporciona una inserción de 14 Vk y Jk1-Jk5 humanas; y (ii) KA - el segundo alelo de kappa endógena ha sido inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena). Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y sustancialmente cadenas ligeras kappa del primer alelo de kappa endógena.
/HA, K2/KA: esta disposición codifica las cadenas pesadas de ratón y cadenas kappa humanas.
Fig. 12A: Análisis del compartimiento progenitor B de la médula ósea. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B de médula ósea (BM) de ratones transgénicos S1F/HA, KA/+ de la invención que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde se ha inactivado la expresión de cadena pesada endógena por inversión), en comparación con células B de BM de ratones que expresan solo anticuerpos de ratón. Los resultados muestran que los compartimientos de células B BM en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimientos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
Fig. 12B: Análisis del compartimiento progenitor B de la médula ósea. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B de médula ósea (BM) de ratones transgénicos S1F/HA, K2/KA de la invención que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde se ha inactivado la expresión de la cadena pesada endógena por inversión) y regiones variables de la cadena kappa humana, en comparación con células B BM de ratones /HA, K2/KA. Los resultados muestran que los compartimientos de células B de BM en los ratones de la divulgación son normales.
Fig. 13: muestra la cuantificación de Ig para subtipo e Ig total en varios ratones: S1F/HA, KA/+ = (i) S1F - el primer alelo de cadena pesada endógena tiene una inserción de ADN del locus de cadena pesada humana, la región VDJ de ratón endógena ha sido inactivada por inversión y movida corriente arriba en el cromosoma; (ii) HA - el segundo alelo de la cadena pesada endógena ha sido inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); (iii) KA: el primer alelo de kappa endógena ha sido inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); y (iv) - el segundo alelo de kappa endógena es un alelo kappa de tipo salvaje. Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas del primer alelo de cadena pesada endógena.
S1F/HA, K2/KA = (i) K2 - el primer alelo de kappa endógena tiene dos inserciones de ADN del locus de la cadena kappa entre Jk endógena más 3'y Ck de ratón, lo que proporciona una inserción de 14 Vk y Jk1-Jk5 humanas; y (ii) KA - el segundo alelo de kappa endógena ha sido inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena). Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y sustancialmente cadenas ligeras kappa del primer alelo de kappa endógena.
/HA, K2/+: esta disposición codifica las cadenas pesadas de ratón y cadenas kappa tanto de ratón como humanas.
/HA, /KA: esta disposición codifica las cadenas kappa y pesadas de ratón.
En esta figura, "Sum Ig" es la suma de los isotipos IgG e IgM.
Fig. 14: muestra la cuantificación de Ig por subtipo e Ig total en varios ratones: S1F/HA, K2/KA (n = 15) y 12 ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón (+/HA, /KA (n = 6) y ratones tipo salvaje (WT; n = 6)).
Descripción detallada de la invención
Se comprende que las realizaciones particulares descritas en la presente memoria se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención se pueden emplear en diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que un estudio de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en la presente memoria. Se considera que tales equivalentes están dentro del alcance de esta invención y están cubiertos por las reivindicaciones.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas e "y/o." En toda esta solicitud, el término
"aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error del dispositivo, el procedimiento que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprender" y "comprende"), "tener" (y cualquier forma de tener, tal como "tener" y "tiene"), "incluyendo" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluir") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, como "contiene" y "contener") son inclusivos o abiertos y no excluye elementos o etapas de procedimiento adicionales no citados
El término "o sus combinaciones" como se usa en la presente memoria se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C o sus combinaciones pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, Ac , BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente las combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB y similares. El experto en la técnica comprenderá que normalmente no hay límite en el número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que sea evidente por el contexto.
Como fuente de secuencias de segmentos génicos de anticuerpos, el experto en la técnica también conocerá las siguientes bases de datos y recursos disponibles (que incluyen las actualizaciones de los mismos):
La base de datos Kabat (G. Johnson and T. T.Wu, 2002; World Wide Web (www) kabatdatabase.com). Creada por E. A. Kabat y T. T. Wu en 1966, la base de datos Kabat publica secuencias alineadas de anticuerpos, receptores de células T, moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, y otras proteínas de interés inmunológico. La herramienta Seqhuntll proporciona una interfaz de búsqueda, y hay una variedad de utilidades disponibles para el alineamiento de secuencias, clasificación de subgrupos de secuencias y la generación de gráficos de variabilidad. Véase también Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD, en particular con referencia a segmentos génicos humanos para su uso en la presente invención.
KabatMan (A. C. R. Martin, 2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html). Esta es una interfaz web para realizar consultas simples a la base de datos de secuencias de Kabat.
IMGT ((International ImMunoGeneTics Information System®; M.-P. Lefranc, 2002; World Wide Web (www) imgt.cines.fr). IMGT es un sistema de información integrado que se especializa en anticuerpos, receptores de células T y moléculas MHC de todas las especies de vertebrados. Proporciona un portal común a datos estandarizados que incluyen secuencias de nucleótidos y proteínas, cebadores de oligonucleótidos, mapas de genes, polimorfismos genéticos, especificidades y estructuras bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D). IMGT incluye tres bases de datos de secuencia (IMGT/LIGM-DB, IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMERDB), una base de datos de genoma (IMGT/GENE-DB), una base de datos de estructura 3D (IMGT/3Dstructure-DB) y una variedad de recursos web ("página IMGT Marie-Paule") y herramientas interactivas.
V-BASE (I. M. Tomlinson, 2002; World Wide Web (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase). V-BASE es un directorio completo de todas las secuencias de la región variable de la línea germinal de anticuerpos humanos compiladas a partir de más de mil secuencias publicadas. Incluye una versión del software de alineación DNAPLOT (desarrollado por Hans-Helmar Althaus y Werner Müller) que permite la asignación de genes V de anticuerpos reordenados a sus segmentos génicos de línea germinal más cercanos.
Anticuerpos-Estructura y secuencia (A. C. R. Martin, 2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs). Esta página resume información útil sobre la estructura y secuencia de anticuerpos. Proporciona una interfaz de consulta para los datos de la secuencia de anticuerpos de Kabat, información general sobre anticuerpos, estructuras cristalinas y enlaces a otra información relacionada con los anticuerpos. También distribuye un resumen automatizado de todas las estructuras de anticuerpos depositadas en el Banco de datos de proteína (PDB). De particular interés es una divulgación y una comparación exhaustivas de los diversos esquemas de numeración para las regiones variables de anticuerpos.
AAAAA (A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; World Wide Web (www) unizh.ch/~antibody). Este recurso incluye herramientas para análisis estructural, modelado e ingeniería. Adopta un esquema unificador para el alineamiento estructural integral de secuencias de anticuerpos y receptores de células T e incluye macros de Excel para el análisis de anticuerpos y la representación gráfica.
WAM (Web Antibody Modeling; N. Whitelegg and A. R. Rees, 2001; World Wide Web (www) antibody.bath.ac.uk). Alojado por el Centre for Protein Analysis and Design at the University of Bath, Reino Unido. Sobre la base del paquete AbM (anteriormente comercializado por Oxford Molecular) para construir modelos 3D de secuencias de anticuerpos Fv usando una combinación de procedimientos teóricos establecidos, este sitio también incluye la última información estructural de anticuerpos.
Página de estructura/función de inmunoglobulina de Mike (M. R. Clark, 2001; World Wide Web (www) path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html) Estas páginas proporcionan materiales educativos sobre la estructura y
función de las inmunoglobulinas, y están ilustradas con muchas imágenes en color, modelos y animaciones. Hay información adicional disponible sobre la humanización de anticuerpos y el Proyecto de homología humana de anticuerpos terapéuticos de Mike Clark, que tiene como objetivo correlacionar la eficacia clínica y las respuestas antiinmunoglobulinas con secuencias de la región variable de anticuerpos terapéuticos.
La página de recursos de anticuerpos (The Antibody Resource Page, 2000; World Wide Web (www) antibodyresource.com). Este sitio se describe a sí mismo como la "guía completa para la investigación y los proveedores de anticuerpos". Se proporcionan enlaces a herramientas de secuenciación de aminoácidos, herramientas de secuenciación de anticuerpos de nucleótidos y bases de datos de cultivo celular/hibridomas.
Hum anización p o r diseño (J. Saldanha, 2000; World Wide Web (www) people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s). Este recurso proporciona una divulgación general de la tecnología de humanización de anticuerpos. La característica más útil es una base de datos en la que se pueden realizar búsquedas (por secuencia y texto) de más de 40 anticuerpos humanizados publicados que incluyen información sobre problemas de diseño, elección de la estructura, retromutaciones estructurales y afinidad de unión de los constructos humanizados.
Véase también Antibody Engineering Methods and Protocols, Ed. Benny K C Lo, Methods in Molecular Biology™, Human Press. Asimismo en World Wide Web (www) blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-andprotocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdf
Cualquier parte de esta divulgación se puede leer en combinación con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que sea evidente por el contexto.
Todas las composiciones y/o procedimientos descritos y reivindicados en la presente memoria se pueden elaborar y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Si bien las composiciones y procedimientos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o procedimientos y en las etapas o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en la presente memoria sin apartarse del alcance de la invención. Todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica se consideran dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y divulgación completas de cómo realizar y usar la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención.
Ejemplos
Ejemplo 1:
Alta expresión de la región variable lambda humana en ratones transgénicos que comprenden segmentos génicos de lambda humana insertados en el locus de kappa endógena
Se realizó la inserción de segmentos génicos de lambda humana de un primer BAC IGL en el locus IGK de células ES AB2.1 de ratón (Baylor College of Medicine) para crear un alelo de cadena ligera quimérico denominado alelo P1 (Fig. 1). La secuencia humana insertada corresponde a la secuencia del cromosoma humano 22 desde la posición 23217291 a la posición 23327884 y comprende los segmentos génicos funcionales de lambda VA3-1, JA1-CA1, JA2-CA2, JA3-CA3, JA6-CA6 y JA7-CAA7 (los alelos de la Tabla 13). La inserción se realizó entre las posiciones 70674755 y 706747756 en el cromosoma 6 del ratón, que está corriente arriba de la región Ck del ratón y 3'Ek (es decir, dentro de 100 kb del potenciador de la cadena ligera endógena) como se muestra en la Figura 1. Los segmentos génicos Vk y Jk de ratón se retuvieron en el locus quimérico, inmediatamente corriente arriba del ADN de lambda humana insertado. Los locus de lambda de ratón se dejaron intactos. Se generaron ratones homocigotos para el locus P1 quimérico a partir de las células ES usando procedimientos estándares.
Se produjo un segundo tipo de ratones (ratones P2) en los que se insertaron más segmentos génicos VA funcionales humanos corriente arriba (5') de VA3-1 humano mediante la inserción secuencial del ADN humano BAC1 y después el ADN BAC2 para crear el alelo P2 (los alelos de la Tabla 14). La secuencia humana insertada de BAC2 corresponde a la secuencia del cromosoma humano 22 desde la posición 23064876 a la posición 23217287 y comprende los segmentos génicos de lambda funcionales VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8 y VA4-3. Se generaron ratones homocigotos para el locus P2 quimérico a partir de las células ES usando procedimientos estándares.
Se realizó un análisis FACS de células B esplénicas de los homocigotos P1 y P2 para evaluar la expresión de lambda frente a kappa y la expresión de lambda humana frente a lambda de ratón en los ratones transgénicos.
Se llevó a cabo 5'-RACE estándar para analizar los transcriptos de ARN de los locus de cadena ligera en homocigotos P2.
Expresión de cadena ligera y análisis de FACS
Para obtener una suspensión de célula única del bazo, el bazo se pasó suavemente a través de un filtro de células de 30 pm. Se resuspendieron células únicas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con suero de carnero fetal (FCS) inactivado por calor 3%.
Se usaron los siguientes anticuerpos para la tinción:
Anticuerpo anti-lambda de ratón de rata (mCA) ficoeritrina (PE) (Southern Biotech), anti-kappa de ratón de rata (mCK) (BD Pharmingen, clon 187.1) isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-lambda humana (hCA) (eBioscience, clon 1 155-2) ficoeritrina (PE), anti-B220/CD45R (eBioscience, clon RA3-6B2) aloficocianina (Ap C). NB: se esperaba que las cadenas ligeras que portan CA humana tuvieran regiones variables derivadas del reordenamiento de VA humana y JA humana insertadas. Se esperaba que las cadenas ligeras que portan CA de ratón tuvieran regiones variables derivadas del reordenamiento de VA y JA de ratón a partir de los locus de lambda endógena.
Se añadieron 5 x 106 células a tubos individuales, se centrifugaron para eliminar el exceso de líquido y se resuspendieron en 100 pl de PBS fresco FCS 3%. A cada tubo individual se le añadieron los siguientes anticuerpos:
Para la tinción de mA frente a mK, se añadió 1 pl de cada anticuerpo además de 1 pl de anticuerpo B220/CD45R. Para la detección de células B que expresan la cadena ligera lambda humana, el anticuerpo mA se sustituyó con el anticuerpo hA. Las células se incubaron en la oscuridad a 6 ° C durante 15 minutos seguido de varios lavados con PBS+ FCS 3% fresco para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se analizaron usando un analizador de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) de Miltenyi Biotech.
Se activaron esplenocitos vivos usando dispersión lateral (SSC) y dispersión frontal (FSC). Dentro de la población activada por SSC y FSC, se detectó una subpoblación de B220/CD45R (células B de ratón) usando el fluorocromo APC. La población de B220/CD45R positiva única se subdividió adicionalmente en una célula que lleva fluorocromo de PE mA o hA junto con fluorocromo FITC mK. El porcentaje de cada población se calculó mediante un sistema de activación.
Inesperadamente, el análisis FACS de las células B esplénicas de los homocigotos P1 no mostró expresión detectable de Ck de ratón (Fig. 2), lo que indica que la inserción del ADN del locus de lambda humana de BAC1 interrumpe la expresión de la cadena de IGK endógena.
La fuerte expresión de CA endógena y la expresión débil de CA humana en las células B esplénicas agrupadas por análisis FACs (CA de ratón: CA humana = 65: 32) en estos ratones sugieren que la secuencia de IGL humana insertada, aunque interrumpe la actividad de IGK, no puede competir totalmente con los genes de IGL endógena.
El análisis FACS nuevamente mostró inesperadamente que no se detectó expresión de Ck de ratón en los homocigotos P2 (Figuras 3A y B). Sin embargo, la CA humana predomina en gran medida en las células B expresadas agrupadas como CA de ratón o humana después del análisis FACS (CA de ratón: CA humana = 15: 80 correspondiente a una relación de 15 regiones variables lambda de ratón: 80 regiones variables de lambda humana, es decir, 84 % de regiones variables lambda humanas con referencia a las células B agrupadas (que corresponde al 80% de células B totales) de los homocigotos P2. Si bien no desea estar ligado a teoría alguna, se sugiere que la secuencia del locus de lambda humana insertada del 2do BAC proporciona algunas ventajas para competir con la reordenación o expresión del segmento génicos de lambda endógena.
Se analizó el uso de VA y JA humanos en los homocigotos P2. Véase la Figura 4 que muestra el uso de VA humana en homocigotos P2. El uso observado fue similar al observado en seres humanos (según J Mol Biol. 1997 Apr 25;268(1):69-77; "The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoire"; Ignatovich O et al). Además, el uso de JA humana fue similar a la observada en seres humanos (Figura 5). El análisis de uso de VA versus Vk de los transcriptos de CA humana mediante la secuenciación de clones de PCR de 5'-RACE sin sesgo (amplificación rápida de extremos de ADNc) mostró que entre 278 secuencias de clones, solo uno usó Vk para el reordenamiento a JA (JA humana), y todos los demás (277 clones) usaron VA humana (Figs. 6 y 7; VA2-5 se detectó a nivel de transcripto de ARN, pero este es un pseudogén que normalmente no se detecta mediante el uso a nivel de proteína). Si desear estar ligado a teoría alguna, se sugiere que los segmentos génicos Vk de ratón retenidos esencialmente no pueden reordenarse de manera eficiente con los segmentos génicos JA humanos insertados porque tienen el mismo tipo de RSS (secuencias de señales de recombinación; véase explicación a continuación) y son incompatibles para el reordenamiento (Fig. 8). Este resultado también indica que la inactivación de la actividad IGK endógena y la expresión predominante de la secuencia de lambda humana insertada se puede lograr sin modificación adicional del locus de IGK, por ejemplo, no es necesaria la supresión o inversión de segmentos génicos de los locus de kappa endógena, lo que simplifica en gran medida simplifica la generación de ratones transgénicos útiles que expresan cadenas ligeras que portan regiones variables lambda humanas (es decir, regiones variables producidas por recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos).
La disposición de las secuencias señal de recombinación (RSS) que median la recombinación de V (D) J in vivo se analiza, por ejemplo, en Cell. 2002 Apr;109 Suppl:S45-55; "The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination"; Bassing CH, Swat W, Alt FW. Se han identificado dos tipos de elementos RSS: una RSS de una vuelta (12-RSS) y un RSS de dos vueltas (23-RSS). En la recombinación natural de VJ en el locus de cadena ligera lambda, la recombinación se efectúa entre una RSS de dos vueltas que se encuentra en 3' de una V lambda y una RSS de
una vuelta que se encuentra en 5' de una J lambda, las RSS están en orientación opuesta. En la recombinación natural de VJ en el locus de cadena ligera kappa, la recombinación se efectúa entre una RSS de una vuelta que se encuentra en 3' de una V kappa y una RSS de dos vueltas que se encuentra en 5' de una J kappa, las RSS están en orientación opuesta. Por lo tanto, generalmente una RSS de dos vueltas es compatible con una RSS de una vuelta en la orientación opuesta.
Por tanto, los inventores han demostrado cómo (i) inactivar la expresión de la cadena kappa endógena mediante la inserción de segmentos génicos de lambda humana en el locus de kappa; y (ii) cómo lograr una expresión muy alta de la región variable lambda humana (de este modo se proporcionan repertorios de cadenas ligeras útiles para la selección contra el antígeno diana), incluso en presencia de segmentos génicos V de lambda y kappa endógenas. Por tanto, los inventores han demostrado cómo eliminar la competición del segmento génico significativamente (lambda) o eliminar totalmente (kappa) y, por lo tanto, la expresión de la cadena ligera endógena mediante la inserción de al menos los segmentos génicos funcionales de lambda humana comprendidos por los BAC 1 y 2. En este ejemplo, se logró inesperadamente un nivel muy alto de expresión de la región variable lambda humana (84% de las cadenas lambda totales y cadenas ligeras totales como se explicó anteriormente).
Ejemplo 2 :
Alta expresión de la región variable lambda humana en ratones transgénicos que comprenden segmentos génicos de lambda humana insertados en el locus de lambda endógena
Se realizó la inserción de segmentos génicos de lambda humana de un primer y segundo BAC IGL en el locus lambda de células ES AB2.1 de ratón (Baylor College of Medicine) para crear un alelo de cadena ligera lambda denominado alelo L2 (Fig. 1). La secuencia humana insertada corresponde a la secuencia del cromosoma humano 22 desde la posición 23064876 a la posición 23327884 y comprende los segmentos génicos funcionales de lambda VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, JA1-CA1, JA2-CA2, JA3-CA3, JA6-CA6 y JA7-CA7. La inserción se realizó entre las posiciones 19047551 y 19047556 en el cromosoma 16 del ratón, que está corriente arriba de la región CA de ratón y entre EA4-10 y EA3-1 (es decir, dentro de 100 kb del potenciador de la cadena ligera endógena) como se muestra en la Figura 1. Los segmentos génicos VA y JA de ratón se retuvieron en el locus, inmediatamente corriente arriba del ADN de lambda humana insertado. Los locus de kappa de ratón se inactivaron para evitar la expresión de la cadena kappa. Se generaron ratones homocigotos para el locus L2 a partir de las células ES usando procedimientos estándares.
Usando un procedimiento similar al del Ejemplo 1, se realizó el análisis FACS de células B esplénicas de los homocigotos L2 para evaluar la expresión de lambda frente a kappa y la expresión de lambda humana frente a lambda de ratón en los ratones transgénicos.
Expresión de cadena ligera y análisis de FACS
El análisis FACS de células B esplénicas en homocigotos L2 en el contexto de inactivación de IGK (en el que se han retenido los segmentos génicos Vk y Jk) mostró inesperadamente que la expresión de CA humana predomina en gran medida en las células B agrupadas como CA de ratón o humana después del análisis FACS (CA de ratón: CA humana = 5: 93 correspondiente a una relación de 5 regiones variables lambda de ratón: 93 regiones variables de lambda humana, es decir, 95% de regiones variables de lambda humana con referencia a las células B agrupadas, que corresponde al 93% de células B totales) (Fig. 9A), lo que demuestra que los segmentos génicos IGA humanos insertados dentro del locus de IGA endógena pueden superar el reordenamiento o expresión del segmento del gen de IGA endógena.
Por tanto, los inventores han demostrado cómo lograr una expresión muy alta de la región variable lambda humana (de este modo se proporcionan repertorios de cadenas ligeras útiles para la selección contra el antígeno diana), incluso en presencia de segmentos génicos de V lambda y kappa endógenas, Por tanto, los inventores han demostrado cómo eliminar significativamente la competición de del segmento del gen de V lambda endógena y, por tanto, la expresión de la cadena ligera lambda endógena mediante la inserción de al menos los segmentos génicos funcionales de lambda humana comprendidos por los BAC 1 y 2. En este ejemplo, se logró inesperadamente un nivel muy alto de expresión de la región variable lambda humana (95% de las cadenas lambda totales y cadenas ligeras totales como se explicó anteriormente).
Estos datos indican que los ratones que portan alelos P (Ejemplo 1) o L (Ejemplo 2) producidos por inserción dirigida de los segmentos génicos funcionalse proporcionas por BAC1 y BAC2 pueden funcionar en el reordenamiento y la expresión en células B maduras. Estos dos tipos de alelos son muy útiles para proporcionar ratones transgénicos que producen cadenas lambda de Ig humana para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos y como herramientas de investigación.
Los ratones transgénicos de la divulgación que expresan regiones variables lambda humanas desarrollan compartimientos esplénicos normales
En el bazo, las células B se caracterizan como inmaduras (T1 y T2) y maduras (M) según los niveles de marcadores de superficie celular, IgM e IgD. Las células T1 tienen IgM alta y IgD baja. Las células T2 tienen niveles medios de
ambas. Las células M tienen IgM baja pero IgD alta (Figura 10). Véase también J Exp Med. 1999 Jul 5;190(1):75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptorderived signals"; Loder F et al.
Usando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 3 a continuación, se calificaron las células B esplénicas de los animales para la expresión de IgD e IgM usando fAc S. Se compararon los ratones de control KA/KA (en los que se ha inactivado la expresión de la cadena kappa endógena, pero no la expresión de la cadena lambda endógena) con ratones L2/L2; KA/KA (homocigotos L2). Los homocigotos L2 mostraron inesperadamente compartimientos de células B esplénicas comparables a los de los ratones de control (Fig. 9B).
Ejemplo 3 :
Evaluación de células B y desarrollo de Ig en ratones transgénicos de la divulgación
Se observó la expresión normal del subtipo de Ig y el desarrollo de células B en ratones transgénicos de la divulgación que expresan anticuerpos con regiones variables de cadena pesada humana sustancialmente en ausencia de expresión de cadena pesada y kappa endógena.
Usando células madre embrionarias y los procedimientos de manipulación genómica de RMCE descritos anteriormente, se construyeron ratones con combinaciones de los siguientes alelos del locus de Ig:
S1F/HA, /KA = (i) S1F - el primer alelo de cadena pesada endógena tiene una inserción de ADN del locus de cadena pesada humana, la región VDJ de ratón endógena se ha inactivado por inversión y movimiento corriente arriba en el cromosoma (véase la divulgación anterior, donde este alelo se denomina S1inv1); (ii) HA - el segundo alelo de la cadena pesada endógena se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); (iii) - el primer alelo de kappa endógena es un alelo de kappa de tipo salvaje y (iv) KA - el segundo alelo de kappa endógena se ha inactivado (mediante la inserción de una secuencia de interrupción endógena). Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas del primer alelo de cadena pesada endógena.
S1F/HA, K2/KA = (i) K2 - el primer alelo de kappa endógena tiene dos inserciones de ADN del locus de la cadena kappa entre la Jk endógena más 3' y la Ck de ratón, lo que proporciona una inserción de 14 Vk y Jk1-Jk5 humanas; y (ii) KA - el segundo alelo de kappa endógena se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena). Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y sustancialmente cadenas ligeras kappa del primer alelo de kappa endógena.
+/HA, K2/KA: esta disposición codifica para cadenas pesadas de ratón y cadenas kappa humanas.
+/HA, /KA: esta disposición codifica para cadenas pesadas y kappa de ratón; los ratones solo producen cadenas ligeras y pesadas de ratón.
En la médula ósea, las poblaciones de progenitores B se caracterizan en función de sus marcadores de superficie, B220 y CD43. Las células PreProB llevan una configuración de IGH e IGK/L de la línea germinal y tienen B220 bajo y CD43 alto en su superficie celular. Las células ProB comienzan a iniciar la recombinación de v Dj en el locus IGH y portan niveles medios de B220 y CD43. Las células PreB portan el locus VDJ IGH reordenado y comienzan a iniciar el reordenamiento VJ de la cadena ligera, y tienen B220 alto pero CD43 bajo. En el bazo, las células B se caracterizan como inmaduras (T1 y T2) y maduras (M) según los niveles de marcadores de superficie celular, IgM e IgD. Las células T1 tienen IgM alta y IgD baja. Las células T2 tienen niveles medios de ambos. Las células M tienen IgM baja pero IgD alta (figura 10). Véase J Exp Med. 1991 May 1;173(5):1213-25; "Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow"; Hardy RR et al. and J Exp Med. 1999 Jul 5;190(1):75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals"; Loder F et al.
Los ratones transgénicos de la divulgación desarrollan compartimientos esplénicos y de BM normales.
(a) Análisis del compartim iento esplénico
Para cada ratón, para obtener una suspensión celular única del bazo, el bazo se pasó suavemente a través de un filtro de células de 30 pm. Se resuspendieron células individuales en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con suero de ternero fetal (FCS) inactivado por calor 3%. Se añadieron 5 x 106 células a tubos individuales, se centrifugaron para eliminar el exceso de líquido y se resuspendieron en 100 pl de PBS FCS 3% fresco. A cada tubo individual se le añadieron los siguientes anticuerpos: anti-B220/CD45R (eBioscience, clon RA3-6B2) aloficocianina (APC), anticuerpo contra el receptor de IgD conjugado con ficoeritrina (PE) (eBioscience, clon 11 26) y anticuerpo contra IgM receptor conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (eBioscience, clon 11/41).
Para la tinción de IgM versus IgD, se usaron 5 x 106 células para cada tinción. A cada vial que contiene esplenocitos se añadió un cóctel de anticuerpos que consiste en: anti-IgD (PE), anti-IgM (FITC) y anti-B220/CD45R (APC). Las células se incubaron a 6 °C durante 15 minutos, se lavaron para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos y se analizaron usando un analizador de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) de Miltenyi Biotech.
Las células B se activaron como B220ALTO IgMALTO IgDBAJO (es decir, B220+ IgM+ IgD-) para la población T1, B220ALTO IgMALTO IgDALTO (B220+ IgM+ IgD+) para la población T2 y B220ALTO IgMBAJO IgDALTO (B220+ IgM- IgD+) para la población M. El porcentaje de células se calculó usando un sistema de activación. Se usaron portales para identificar y definir subconjuntos de poblaciones de células en gráficos con escala logarítmica. Antes de que se apliquen los portales, se usa un anticuerpo de tinción único para cada fluorocromo para discriminar entre una población positiva (fluorocromo de alta intensidad) y negativa (fluorocromo de intensidad no detectable). Los portales se aplican sobre la base de las intensidades de los fluorocromos de la misma manera a todas las muestras. Las tinciones únicas fueron:
IgD-PE
IgM-FITC
B220-APC
Se seleccionaron esplenocitos vivos usando dispersión lateral (SSC) y dispersión frontal (FSC). Dentro de la población activada por SSC y FSC, se detectó una subpoblación de células positivas para B220/CD45R (células B de ratón) usando el fluorocromo APC. La población de B220/CD45R positiva única se subdividió adicionalmente en una célula que porta isotiocianato de fluoresceína IgM (FITC) o fluorocromo IgD junto con fluorocromo mK FITC. El porcentaje de cada población se calculó mediante el sistema de activación. Los compartimientos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimientos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
(b) Análisis de progenitores B de médula ósea
Para obtener una suspensión de células individuales de la médula ósea para cada ratón, el fémur y la tibia se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con suero de carnero fetal (FCS) inactivado por calor 3%. Las células se pasaron adicionalmente a través de un filtro de células de 30 pm para eliminar fragmentos óseos o grupos de células. Las células se resuspendieron en PBS frío suplementado con suero 3%. Se añadieron 2 x 106 células a tubos individuales, se centrifugaron para eliminar el exceso de tampón y se resuspendieron en 100 pl de PBS FCS 3% fresco. A cada tubo individual se le añadieron los siguientes anticuerpos: anti-leucosialina (CD43) isotiocianato de fluoresceína (FITC) (eBioscience, clon eBioR2/60) y anti-B220/CD45R (eBioscience, clon RA3-6B2) aloficocianina (APC). Las células se incubaron en la oscuridad a 6 ° C durante 15 minutos seguido de varios lavados con PBS FCS 3% fresco para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se analizaron usando un analizador de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) de Miltenyi Biotech. Las células vivas de la médula ósea se activaron usando dispersión lateral (SSC) y dispersión frontal (FSC). Se usaron portales para identificar y definir subconjuntos de poblaciones de células en gráficos con escala logarítmica. Antes de que se apliquen los portales, se usa un anticuerpo de tinción único para cada fluorocromo para discriminar entre una población positiva (fluorocromo de alta intensidad) y negativa (fluorocromo de intensidad no detectable). Los portales se aplican sobre la base de las intensidades de los fluorocromos de la misma manera a todas las muestras. Las tinciones únicas fueron:
B220-APC
CD43-FITC
Dentro de la población viva, se identificó una población doble de células positivas para B220/CD45R y CD43 como células pre-B, pro-B y pre-pro B. Los compartimientos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimientos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
Los ratones transgénicos de la divulgación desarrollan una expresión normal de Ig.
Cuantificación de IgM e IgG séricas
Se revistieron inicialmente placas NUNC de 96 pocillos con un anticuerpo de captura (anticuerpo anti-Fab de ratón de cabra a 1 pg/ml) durante la noche a 4 °C). Las placas de IgG usaron anti-Fab, (M4155 Sigma) y las placas de IgM usaron anti-Fab (OBT1527 AbD Serotec). Después de tres lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Tween20 0,1% v/v, las placas se bloquearon con 200 pl de PBS que contiene albúmina sérica bovina (BSA) 1% p/v durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las placas se lavaron tres veces como anteriormente y después se añadieron 50 pl de estándares (anticuerpos de isotipo de ratón de control, IgG1 (M9269 Sigma), IgG2a (M9144 Sigma), IgG2b (M8894 sigma), IgM (M3795 Sigma) o muestras de suero diluidas en PBS con BSA 0,1% a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a RT. Después de lavar tres veces como se indicó anteriormente, se añadieron 100 pl de anticuerpo de detección (anticuerpo específico de isotipo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante, 1/10000 en PBS con Tween 0,1% ) (anti-IgG1 de ratón (STAR132P AbD Serotec), anti-IgG2 de ratón (STAR133P AdD Serotec), anti-IgG2b de ratón (STAR134P AbD Serotec) y anti- IgM de ratón (ab97230 Abcam) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a RT. Las placas se lavaron tres veces como anteriormente y se revelaron usando sustrato de tetrametilbencidina (TMB, Sigma) durante 4-5 minutos en la oscuridad a RT. El desarrollo se detuvo mediante la adición de 50 pl/pocillo de ácido sulfúrico 1 M. Las placas se leyeron con un lector de placas Biotek Synergy HT a 450 nm.
Conclusión:
La inversión de Vh-D-Jh endógena después de la inserción de BAC de IGH humana da como resultado la inactivación del reordenamiento de la Vh endógena a D-Jh humana insertada. Los inventores observaron, sin embargo, que inesperadamente la inactivación de la expresión de la cadena pesada endógena no cambia la relación de células B en el compartimiento esplénico (Fig. 11) o en el compartimiento progenitor B de la médula ósea (Fig. 12) y los niveles de inmunoglobulina en suero son normales y se expresan los subtipos de Ig correctos (Fig. 13). Esto se demostró en ratones que expresan regiones variables de cadena pesada humana con cadenas ligeras de ratón (Figuras 11A y 12A), así como en ratones que expresan regiones variables de cadena pesada humana y regiones variables de cadena ligera humana (Figuras 11B y 12B). Estos datos demuestran que los segmentos génicos de IGH humana insertados (una inserción de al menos los segmentos génicos de VH humana Vh2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1, y todos los segmentos génicos D y JH humanos D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1 20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6) son completamente funcionales en el aspecto de reordenamiento, señalización BCR y maduración de células B. La funcionalidad también se retiene cuando se insertan segmentos génicos de VJ de cadena ligera humana para proporcionar cadenas ligeras transgénicas, según la inserción usada para crear el alelo K2. Esta inserción es una inserción que comprende los segmentos génicos humanos Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1 -6, Vk1-5, Vk5-2, Vk4-1, Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. Más del 90% de los anticuerpos expresados por los ratones S1F/HA; K2/KA comprendían regiones variables de cadena pesada humana y regiones variables de cadena ligera kappa humana. Estos ratones son, por tanto, muy útiles para la selección de anticuerpos que tienen regiones variables humanas que se unen específicamente al antígeno humano tras la inmunización de los ratones con dicho antígeno. Después del aislamiento de dicho anticuerpo, la persona experta puede reemplazar las regiones constantes de ratón con regiones constantes humanas usando técnicas convencionales para llegar a anticuerpos totalmente humanos que son útiles como candidatos de fármacos para la administración a seres humanos (opcionalmente después de una mutación o adaptación para producir un derivado adicional, por ejemplo, con potenciación o inactivación de Fc o después de la conjugación con una carga útil tóxica o indicador o marcador u otro resto activo).
Se llevó a cabo un experimento adicional para evaluar los niveles de IgG e IgM y las proporciones relativas en ratones transgénicos de la divulgación que expresan anticuerpos que tienen regiones variables humanas pesadas y ligeras (kappa) (ratones S1F/HA, K2/KA; n = 15). Estos se compararon con 12 ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón (+/HA, /KA (n = 6) y ratones de tipo salvaje (WT; n = 6)). Los resultados se tabulan a continuación (Tabla 19) y se muestran en la Figura 14.
Se puede observar que los ratones de la divulgación, en los que esencialmente todas las regiones variables de la cadena pesada son regiones variables de la cadena pesada humana, expresaron proporciones normales de subtipos de IgM e IgG, y también la IgG total con relación a la IgM era normal.
Tabla 19:
Ejemplo 4 :
Evaluación de la relación Kappa: Lambda y compartimientos de células B esplénicas en ratones transgénicos de la divulgación
Se obtuvieron ratones que comprendían los siguientes genomas.
WT/WT = tipo salvaje;
KA/KA = cada alelo kappa endógeno ha sido inactivado; y los locus de lambda endógena se dejan intactos;
K3F/K3F = cada alelo de kappa endógena tiene tres inserciones de ADN del locus de la cadena kappa entre la Jk endógeno más 3' y la Ck del ratón, lo que proporciona la inserción de los segmentos génicos V humanos V k2-40, Vk1-39, Vk1-33, Vk2-30, Vk2-29, Vk2-28, Vk1-27, Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2 y Vk4-1 y segmentos génicos J humanos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5 (los segmentos génicos V humanos son 5' de los segmentos génicos J humanos); cada VJ kappa endógena ha sido inactivado por inversión y movimiento corriente arriba en el cromosoma; y los locus de lambda endógena se dejan intactos;
L2/L2 = como se describe en el Ejemplo 2 (homocigotos L2 en los que se ha insertado ADN de la región variable lambda humana en los locus de lambda endógena; los locus de kappa endógena se dejan intactos);
L2/L2; KA/KA = como L2/L2 pero los alelos de kappa endógena se han inactivado (mediante la inserción de una secuencia de interrupción endógena = KA);
L3/L3; KA/KA = como L2/L2; KA/KA pero suplementado por una tercera inserción de ADN de la región variable lambda humana 5' de la segunda inserción de ADN lambda en los locus de lambda endógena de tal manera que se insertan los siguientes segmentos génicos de lambda humana entre JA endógena más 3' y los segmentos génicos de CA de ratón: V humana VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1, segmentos génicos J y C humanos JA1-CA1, JA2-CA2, JA3-CA3, JA6-CA6 y JA7-CAA7 (también se incluyeron los segmentos no funcionales JA4-CA4, JA5-CA5), de este modo se proporciona una inserción correspondiente a las coordenadas 22886217 a 23327884 del cromosoma humano 22 insertado inmediatamente después de la posición 19047551 en el cromosoma 16 de ratón;
S3F/HA;KA/KA;L3/L3 = El primer alelo de la cadena pesada endógena tiene tres inserciones de ADN de la región variable de la cadena pesada humana entre Jh endógena más 3' y EM, lo que proporciona la inserción de los segmentos génicos humanos Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D4-11, D5-12, D6-13, D1-14, D2-15, D3-16, D4-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D3-22, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, D7-27, Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 y Jh6 (en el orden: segmentos génicos V humanos, segmentos génicos D humanos y segmentos génicos J humanos); la secuencia de
VDJ de cadena pesada endógena ha sido inactivada por inversión y movimiento corriente arriba en el cromosoma; y los locus de lambda endógena se dejan intactos; el segundo alelo de cadena pesada endógena ha sido inactivado mediante la inserción de una secuencia de interrupción endógena = HA); los alelos de kappa endógena se han inactivado (= KA/KA); y los alelos de lambda endógena se han modificado mediante la inserción de ADN de la región variable lambda humana (= L3/L3);
P2/WT = alelo P2 (ADN de la región variable lambda humana como se describe en el Ejemplo 1) en un locus de kappa endógena; el otro locus de kappa endógena se dejó intacto; ambos loci de lambda endógena se dejaron intactos;
P2/P2 = véase el Ejemplo 14; ambos loci de lambda endógena se dejaron intactos;
P2/K2 = = alelo P2 en un locus de kappa endógena; el otro locus de kappa endógena tiene dos inserciones de ADN entre Jk endógena más 3' y la Ck del ratón, lo que proporciona la inserción de los segmentos génicos V humanos Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2 y Vk4-1 y segmentos génicos J humanos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5 (los segmentos génicos V humanos están 5' de los segmentos génicos J humanos); ambos loci de lambda endógena se dejaron intactos;
P3/K3F = como un locus de kappa endógena que tiene una inserción entre los siguientes segmentos génicos de lambda humana que se insertan entre JA endógena más 3' y la Ck del ratón, lo que proporciona la inserción de segmentos génicos V humanos VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1, human J y C segmentos génicos JA1-CA1, JA2-CA2, JA3-CA3, JA6-CA6 y JA7-CAA7 (también se incluyeron los segmentos no funcionales JA4-CA4, JA5-CA5), en consecuencia se proporciona una inserción correspondiente a las coordenadas 22886217 a 23327884 del cromosoma humano 22 insertados inmediatamente después de la posición 70674755 en el cromosoma 6 de ratón; el otro locus de kappa endógena que tiene el alelo K3F descrito anteriormente (segmentos génicos de kappa V y J insertados); ambos loci de lambda endógena se dejaron intactos;
P2/P2; L2/WT = como P2/P2 pero en el que un locus de lambda endógena tiene el alelo L2 (segmentos génicos lambda V y J humanos insertados) y el otro locus de lambda endógena es de tipo salvaje; y
P2/P2; L2/L2 = homocigoto para los alelos P2 y L2 en los locus de kappa y lambda endógenas respectivamente.
Se llevó a cabo el análisis FACS de células B esplénicas (como se describió anteriormente) y se determinaron las proporciones de expresión de la cadena ligera. También se determinaron las proporciones de células B esplénicas T1, T2 y maduras (M) y se compararon con las de los ratones de tipo salvaje, con el fin de evaluar si obtuvieron o no compartimientos de células B esplénicas normales en los ratones transgénicos. Los resultados se muestran en las Tablas 20 y 21. También se evaluó la proporción de células B220 positivas como una indicación de la proporción de células B en las muestras de células esplénicas.
Tabla 20: Comparaciones con ratones con insertos de región variable lambda humana en el locus de lambda endógena
Tabla 21: Ratones con insertos de región variable lambda humana en el locus de kappa endógena
Conclusiones
Como lo demuestran L2/L2; KA/KA y L3/L3; KA/KA, las inserciones de ADN de la región variable lambda humana en el locus de lambda endógena (con un knockout de kappa endógena) mostraron una expresión predominante de cadenas ligeras que portan regiones variables lambda humanas (indicado por la expresión de cadenas CA positivas en aproximadamente 93%). Esto ocurre inesperadamente incluso aunque el ADN de la región variable lambda
endógena de ratón todavía esté presente, lo que indica que el ADN de la región variable lambda humana insertado puede superar el reordenamiento de IGA endógena.
Además, los ratones que tienen los segmentos génicos V y J humanos presentes en la inserción L3 homocigota producen células B (células B220 positivas) en una proporción que es similar a la de tipo salvaje y además producen una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras (es decir, similar al tipo salvaje). Esto es confirmado no solo por los ratones L3/L3; KA/KA, sino que también se observó para S3F/HA; KA/KA; L3/L3, que también comprende un locus de IgH quimérica (humana-ratón).
Además, se observó que los ratones que tienen los segmentos génicos V y J humanos presentes en la inserción de K3F homocigota producen células B (células B220 positivas) en una proporción similar a las de tipo salvaje y, además, producen una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras (es decir, similares a las de tipo salvaje).
Los ratones que tienen los segmentos génicos V y J humanos presentes en la inserción P2 homocigota en el locus de kappa endógena mostraron una alta expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas (como se indica mediante una proporción observada de 76%). Se puede sesgar a un porcentaje aún mayor en general al combinar la inserción de segmentos génicos V y J lambda humanos en los locus de kappa y lambda endógenas (ver P2/P2; L2/WT en aproximadamente 94% y P2/P2; L2/L2 en aproximadamente 95%). Además, los ratones que comprenden el reordenamiento de segmentos génicos V y J humanos de P2/P2; L2/L2 producen una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras (es decir, similares a las de tipo salvaje).
Cuando los segmentos génicos V y J lambda humanos se insertaron en un locus de kappa endógena y el otro locus de kappa endógena comprendía una inserción de segmentos génicos V y J kappa humanos, se obtuvieron ratones que podían expresar cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda y también cadenas ligeras que comprenden regiones variables kappa. Inesperadamente, se observó que se puede aumentar la proporción de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda por encima de la observada en un ratón de tipo salvaje donde solo 5% o menos de las cadenas ligeras comprenden típicamente regiones variables lambda. Se observó una proporción de aproximadamente 22% para el genotipo P2/K2 y aproximadamente 31% para el genotipo P3/K3F. La proporción observada con el último genotipo se aproxima a la observada en un ser humano donde típicamente aproximadamente 60% de las cadenas ligeras comprenden regiones variables kappa y aproximadamente 40% de las cadenas ligeras comprenden regiones variables lambda. También en los casos P2/K2 y P3/K3F, los ratones produjeron una proporción normal de células B en comparación con los ratones de tipo salvaje. Además, los ratones que comprenden el reordenamiento de segmentos génicos V y J humanos de P3/K3F producen una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras (es decir, similares a las de tipo salvaje).
Ejemplo 5 :
Se generaron ratones que comprendían los alelos de IgH específicos enumerados en la Tabla 3; y los alelos de IgL específicos enumerados en las Tablas 10 u 11. Se inmunizaron ratones con antígenos diana y se aislaron anticuerpos específicos de antígeno. Se evaluaron la especificidad de unión de los anticuerpos, la maduración (es decir, el grado de mutación somática y de unión versus las secuencias de segmentos génicos de línea germinal) y la cinética de unión. También se obtuvieron las células B correspondientes y, en algunos casos, se produjeron hibridomas que expresan los anticuerpos seleccionados.
Los anticuerpos seleccionados se resumen en la Tabla 22. La cinética de unión de algunos de estos se determinó de la siguiente manera.
Determinación de la cinética de unión
Se creó una superficie de captura de anti-IgG de ratón en un chip GLM Biosensor™ mediante acoplamiento de amina primaria usando anti-IgG de ratón de GE Healthcare (BR-1008-38). En esta superficie se capturaron los anticuerpos de prueba como se indica en la Tabla 22 y se pasó el antígeno respectivo sobre el Ab capturado a las concentraciones indicadas. Se usó una inyección de tampón (es decir, 0 nM de antígeno) para hacer doble referencia a las curvas de unión, y los datos se ajustaron al modelo 1: 1 inherente al software de análisis ProteOn XPR36™. La regeneración de la superficie de captura se llevó a cabo usando glicina 10 mM, pH 1,7. El ensayo se realizó a 25 ° C y usando HBS-EP como tampón de corrida.
Diana 1: una proteína humana multi-subunidad
Diana 2: una citotoxina bacteriana
Diana 3: una proteína humana multi-subunidad diferente
Diana 4: una proteína expresada como proteína transmembrana en células humanas
Diana 1 mAb1.1
Concentración de DIANA 1 única (256 nM), captura anti-ratón
(Afinidad aparente debido a diana multi-subunidad)
Diana 2 mAb2.1
DIANA 2 aa 256, 64, 16, 4 y 1 nM; resultados de 3 experimentos:
Experimento 1:
Experimento 2:
Experimento 3:
No se pudo resolver la tasa de disociación, lo que indica una unión extremadamente estrecha más allá de los límites detectables.
Diana 3 mAb3.1
DIANA 3 aa 256, 64, 16, 4 y 1 nM
(Afinidad aparente debido a diana multi-subunidad)
Diana 3 mAb3.2
DIANA 3 a 256, 64, 16, 4 y 1 nM
(Afinidad aparente debido a diana multi-subunidad)
Diana 3 mAb3.3
No se puede resolver la tasa de disociación, unión extremadamente estrecha.
(Afinidad aparente debido a diana multi-subunidad)
En conclusión, la presente invención proporciona anticuerpos madurados por afinidad in vivo con dominios variables humanos que se pueden expresar en sistemas in vivo y unirse específicamente a antígenos diana con muy buenas
afinidades y tasas de asociación y disociación. Por tanto, la invención proporciona anticuerpos que son útiles para la medicina humana, así como vertebrados no humanos, células (por ejemplo, células B e hibridomas) para producir dichos anticuerpos.
Ejemplo 6 :
Las líneas S (pesado), K (kappa en locus de kappa), L (lambda en locus de lambda) y P (lambda en locus de kappa) usadas para generar los datos en los ejemplos usaron los alelos de las Tablas 1 a 18 y demostraron que tales las colecciones de alelos pueden producir los resultados inesperados mostrados (por ejemplo, buenos compartimientos de células B, alta expresión de la región V de lambda humana, relación lambda: kappa deseable en un ratón y repertorio normal de isotipos de IgH). Los anticuerpos aislados se basaron todos en los alelos enumerados en la Tabla 1 a 18 anterior. Todos tenían dominios V con mutación del patrón AID y TdT de ratón.
Otras realizaciones
A partir de la divulgación anterior, será evidente que se pueden realizar variaciones y modificaciones a la invención descrita en la presente memoria para adaptarla a diversos usos y condiciones. Tales realizaciones también están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
La mención de un listado de elementos en cualquier definición de una variable de la presente memoria incluye definiciones de esa variable como cualquier elemento individual o combinación (o subcombinación) de elementos enumerados. La mención de una realización de la presente memoria incluye esa realización como una realización única o en combinación con cualquier otra realización o partes de la misma.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.
Claims (8)
1. Una célula de vertebrado no humano cuyo genoma comprende los segmentos génicos VH, D y JH de la Tabla 3 corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada y los segmentos génicos Vk y Jk de la Tabla 10 o 11 corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera, en la que los segmentos génicos de cada locus se conectan operativamente a su región constante de manera tal que la célula sea capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, o en la cual la célula pueda desarrollarse en un vertebrado que exprese una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, y en la que la célula de vertebrado no humano es una célula de ratón o rata.
2. Un vertebrado no humano cuyo genoma comprende los segmentos génicos VH, D y JH de la Tabla 3 corriente arriba de una región constante en un locus de cadena pesada y los segmentos génicos Vk y Jk de la Tabla 10 o 11 corriente arriba de una región constante en un locus de cadena ligera, en el que los segmentos génicos de cada locus se conectan operativamente a su región constante de manera tal que el vertebrado sea capaz de producir una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, y en el que el vertebrado no humano es un ratón o rata.
3. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprendiendo el procedimiento inmunizar un vertebrado de la reivindicación 2 con un antígeno y recuperar el anticuerpo o fragmento o recuperar una célula productora del anticuerpo o fragmento; opcionalmente modificar el anticuerpo o fragmento producido de manera tal que comprenda regiones constantes humanas, en el que los dominios variables de dicho anticuerpo se codifican por un segmento génico JH humano, un segmento génico D humano y un segmento génico VH humano seleccionado del grupo que consiste en VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 y VH3-9*01 y un segmento génico Jk humano y un segmento génico Vk humano seleccionado del grupo que consiste en Vk4-1*01, Vk2-28*01, VKlD-13*d01, Vk1-12*01, Vk1D-12*02, Vk3-20*01, Vk1-17*01, Vk1D-39*01, Vk3-11*01, Vk1D-16*01 y VKl-9*d01.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el antígeno es un antígeno de proteína humano multi-subunidad.
5. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprendiendo el procedimiento (i) aislar un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una célula de acuerdo con la reivindicación 1 o (ii) inmunizar un vertebrado de acuerdo con la reivindicación 2 con un antígeno y recuperar el anticuerpo o fragmento, y opcionalmente modificar el anticuerpo o fragmento aislado de manera tal que comprenda regiones constantes humanas.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 que además comprende
(a) aislar del vertebrado de la reivindicación 2 una célula B que codifica un anticuerpo que se une al antígeno,
(b) identificar o copiar una secuencia de nucleótidos de la célula B que codifica un dominio VH del anticuerpo y/o identificar o copiar la secuencia de nucleótidos de la célula B que codifica un dominio VL del anticuerpo; y
(c) usar la secuencia para producir un anticuerpo o fragmento aislado que comprende el dominio VH y/o VL; opcionalmente en el que el anticuerpo o fragmento aislado comprende regiones constantes humanas.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 que además comprende la formulación del anticuerpo o fragmento con un diluyente, portador, excipiente o un fármaco para producir una composición farmacéutica para uso médico humano, opcionalmente que además comprende empacar la composición en un recipiente estéril, por ejemplo, un vial, tubo, bolsa o jeringa IV, además opcionalmente producir un kit que comprende combinar el empaque con una etiqueta o instrucciones que indiquen el uso de la composición de anticuerpo para uso médico humano; opcionalmente en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de lote de medicamento y/o un número de autorización de comercialización, además opcionalmente un número de autorización de comercialización de EMA o FDA.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el vertebrado está de acuerdo con la reivindicación 2 y el anticuerpo o fragmento producido por el procedimiento comprende (a) un dominio variable de cadena pesada humana que es recombinante de VH3-23*04, VH7-4-1 *01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 o VH3-9*01, un segmento génico JH humano y un segmento génico D humano y (b) un dominio variable de cadena ligera humana que es un recombinante de Vk4-1*01, Vk2-28*01, Vk1D- 13*d01, Vk1-12*01, Vk1D-12*02, Vk3-20*01, Vk1-17*01, Vk1D-39*01, Vk3-11*01, Vk1D-16*01 o VKl-9*d01 y un segmento génico Jk humano; en el que 1) el segmento génico JH es JH2*01, JH6*02, JH6*01 o JH3*02, 2) el segmento génico Jk es Jk4*01 o Jk2*01, 3) el segmento génico JH es JH2*01, JH6*02, JH6*01 o JH3*02 y el segmento génico Jk es Jk4*01 o Jk2*01,4) el anticuerpo o fragmento producido por el procedimiento comprende un recombinante del dominio variable de cadena pesada humana de VH3-23v04 y JH2*01 y un recombinante del dominio variable de cadena ligera humana de Vk4-1*01 y Jk2*01 o 5) el anticuerpo o fragmento producido por el procedimiento comprende un recombinante del dominio variable de cadena pesada humana de VH3-7*01 y JH6*02 y un recombinante del dominio variable de cadena ligera humana de Vk2-28*01 y Jk4*01.
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