JP2003000243A

JP2003000243A - 変異体の製造法

Info

Publication number: JP2003000243A
Application number: JP2001191884A
Authority: JP
Inventors: Takachika Azuma; 隆親東
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-06-25
Filing date: 2001-06-25
Publication date: 2003-01-07
Also published as: CN100497620C; AU2002315884B8; CA2451608A1; KR100933796B1; CA2451608C; DK1411119T3; ES2345653T3; AU2002315884B2; CN1520459A; EP1411119A4; EP1411119A1; KR20040012969A; EP1411119B1; MXPA04000066A; DE60236660D1; WO2003000885A1; US20040209268A1; US7655466B2

Abstract

(57)【要約】【課題】改良された真核生物プロモーター、外来性のＤ
ＮＡ配列、イントロンエンハンサー、および３’ＨＳ３
／４エンハンサーが連結された組換発現ベクターを動物
細胞に発現させて得られる高頻度のランダムな変異体の
産生法を提供できる。低毒性で機能向上した作用を有す
る各種ペプチド産物の迅速な創製が可能となる。【解決手段】真核生物プロモーター、外来性のＤＮＡ
配列、イントロンエンハンサー、および３’ＨＳ３／４
エンハンサーが連結された組換発現ベクターの提供によ
れば、目的外来性遺伝子の高頻度のランダムな変異体の
産生法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、改良されたＤＮＡ
構築物を動物細胞に導入させることによる新規な変異体
の製造法、該ＤＮＡ構築物、および遺伝子の変異体産生
用又は変異体遺伝子の発現用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】現存する生物は、長い時間の間、突然変
異の発現と変異体の環境による選択によって進化してき
た。通常の進化の速度は、極めて緩やかで多くの世代を
経過して進行するが、免疫系の抗体産生細胞は、突然変
異の発現と抗原による選択を一世代で完結し、獲得した
機能は次世代に遺伝することはない。このような、免疫
系の早い進化速度は、環境に依存する病原性微生物の突
然変異に対抗するものと解釈されている。

【０００３】本発明者は先に抗体遺伝子の突然変異はプ
ロモーターとエンハンサーによってコントロールされて
おり、どのような遺伝子でも抗体遺伝子のプロモーター
とエンハンサーで制御することにより、突然変異を誘導
することができることをバクテリア由来の酵素であるク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
を導入したトランスジェニックマウスを作成した証明し
た(Azuma, T., et al., Int. Immunology, 5(2) 121-13
0(1992)) 。

【０００４】これに対して、現在広く用いられている変
異体製造法は、所望のＤＮＡ配列に適宜、欠失、挿入、
および／または付加変異を導入した変異体を作成する方
法として、部位特異的突然変異誘発法(Site-specifice
mutagenesis, Zoller, et al., Nucleic Acid Res., 1
0, 6487-6500(1982); Zoller, et al.., Methods in En
zymol., 100, 468-500(1983)))により、ある長さのＤＮ
Ａ塩基を部位特異的に変換する方法で、人工的に合成し
たオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるミスマ
ッチ変異法が一般的であり、突然変異を起こしたい部位
近傍の塩基配列に任意の変異を有する相補的な２０塩基
程度のオリゴヌクレオチドを合成し、目的のＤＮＡにハ
イブリダイズした後、ＤＮＡポリメラーゼにより残りの
ＤＮＡに相補的なＤＮＡを作成することができ、かくし
て所望の部位に所望の突然変異を導入することが可能で
あるが、該方法は、一度に多くの変異体を誘導すること
ができない。

【０００５】また、その他の突然変異発現系は遺伝子に
損傷を与える化合物の存在下で特定の機能の消失あるい
は発現を調べるもの(Myers, et al., Science, 232, 61
3-618(1986))、あるいはバクテリア等を用いる方法があ
るが、前記本発明者らが実施した突然変異を誘導する方
法とは根本的に異なる。

【０００６】ところで、マウスとヒトの免疫グロブリン
Ｖ領域における変化(多様化)は、生殖細胞系で離れて存
在するＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントのコンビナト
リアルな連結、連結中のこれらのセグメントの接合部位
での核酸の欠失や付加、および連結したＶ−(Ｄ)−Ｊ遺
伝子の体細胞超変異によって産生される。該体細胞超変
異は、抗体の親和性成熟に関連しており、Ｔ細胞依存性
抗原(ＴＤ)の刺激後にしばしば観察されている(Bothwel
l, A.L.M., et al., Cell, 24,625(1981): Gearhart,
P.J., et al., Nature, 291, 29 (1981): Griffiths,
G.M., et al., Nature, 312,271(1984): Maizels, N.,
et al., Cell, 43, 715(1985): Wysocki,L.T., et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1847(1986): C
umano,A., et al., EMBO. J., 5, 2459 (1986): Berek,
C., et al., Cell, 67, 1121(1991):Taketani, M., et
al., Mol. Immunol., 32, 983 (1995): Furukawa,k., e
t al., Immunity, 11, 329 (1999): 2-10 )。体細胞超
変異の誘導に関与するシス作用エレメントは、κ鎖(O'B
rien, R.L. et al., Nature, 326, 405(1987): Sharpe,
M.J.,et al., Eur. J. Immunol., 20, 1379(1990): Sh
arpe, M.J.,et al., EMBO J., 10, 2139 (1991): Betz,
A.G., et al., Cell,77,239(1994): Yelamos,J., et a
l., Nature, 376, 225(1995):Peters,A.,et al., Immun
ity,4,57(1996): 11-16)、λ鎖(Klotz, E., et al., J.
Immunol., 157,4458(1996):17)、およびＨ鎖トランス
・ジェニック・マウスを用いて特定されている(Durdik,
J.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,2346(198
9):Sohn,J.,et al., J.Exp.Med.,177,493(1993): Tumas
-Brundage,K.M. and Manser, T.,J.Exp.Med., 185,239
(1997) :18-20)。

【０００７】前述のように本発明者が、Ｖ_H１７．２．
２５(Loh, D. Y., et al., Cell, 33, 85 (1983): Gros
schedl,R. and Baltimore, D., Cell,41,885 (1985): 2
2,23)およびＪ−Ｃイントロン・エンハンサー(以下、Ｅ
μと略称する)(Gillies, S.D., et al., Cell, 33,715
(1983): Banerji, J.,et al., Cell, 33, 729(1983):2
4,25)/マトリックス結合領域(以下、ＭＡＲと略称する)
(Forrester, W.C.,et al., Science, 265, 1221(1994):
26)によって制御されるクロラムフェニコール・アセチ
ルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子を備えている遺伝
子組換えマウスを作製した。その結果、体細胞超変異が
ＣＡＴにおいて検出されたが、それはＶ_Hプロモーター
あるいはＥμ／ＭＡＲフランキングにおいて検出されな
かった。しかしながら、変異の頻度は、内因性のＶ_H−
Ｄ−Ｊ_Hにおいて観察されたもののおよそ十分の一であ
った。これらのシス作用エレメントが超変異の誘導にお
いて重要であること、および３’のＣγ、Ｃα、あるい
はＣα(3'エンハンサー)(Pettersson, S., et al., Nat
ure, 344,165(1990): Dariavach,P.,et al., Eur. J. I
mmunnol., 21, 1499(1991): Lieberson, R.,et al., EM
BO. J.,14,6229(1995):27-29)のエンハンサー・フラン
キングのような他の構成要素が、高い頻度の体細胞突然
超変異に対して責任があるかもしれないことを提言して
いる(Sohn, J., etal., J.Exp.Med., 177,493(1993):Tu
mas-Brundage,K.M. and Manser, T., J. Exp. Med., 18
5, 239 (1997): Giusti, A. M. and Manser, T., J. Ex
p. Med., 177, 793 (1997):19,20,30）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ＩｇＨ遺伝子における
超変異の頻度に生じている物質の重要性を特定する為
に、本発明者は、チェンらによって開発されたＲＡＧ−
２(Recombination Activating Gene:遺伝子再構成蛋白
−２)不全胚盤胞相補性システムを用い(Chen, J., et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4528(1993):3
1)、３’フランキング領域のみ異なっている導入遺伝子
構築物をＲＡＧ−２不全胚盤胞の中にマイクロインジェ
クトし、胚幹細胞(以下、ＥＳ細胞と略称する)を形質転
換させた。そしてこのシステムで得られたキメラ・マウ
スをＴ細胞依存性抗原で免疫した。

【０００９】その結果、導入遺伝子のＶ_H−Ｄ−Ｊ_Hにお
ける体細胞超変異の頻度は、ＤＮＡ分解酵素Ｉ感受性領
域３ｂ(ＤＮａｓｅＩ sensitive region ３ｂ：以下、
ＨＳ３ｂ）および／またはＨＳ４(Madisen, L.and Grou
dine, M., Genes Dev.8,2212(1994): Michaelson, J.
S., et al., Nucleic Acids Res., 23, 975(1995):Arul
ampalam, V., et al., Immunol.Today, 18, 549(1997):
32-34)の挿入によって、ランダムな体細胞超変異を誘導
することを見出した。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、改良さ
れた真核生物プロモーター、外来性のＤＮＡ配列、イン
トロンエンハンサー、および３’ＨＳ３／４エンハンサ
ーが連結されたＤＮＡ構築物を動物細胞に導入し、ラン
ダムな変異体の産生法を提供することである。更には、
該ＤＮＡ構築物を動物細胞内で発現させ、該変異体遺伝
子を得る方法を提供するものである。そしてそのような
変異体の産生のためのＤＮＡ構築物、および遺伝子の変
異体の産生または該変異体の発現用キットを見出し、発
明を完成させた。また、動物細胞を用いた発現系から得
られた変異体発現物は、動物細胞に対する毒性スクリー
ニングを併せて実施することになる。

【００１１】本発明は、以下の項１〜項２０を提供する
ものである。項１．外来性の遺伝子のランダムな変異体を動物細胞
内で製造する方法であって、少なくとも以下の（ａ）〜
（ｄ）を含むＤＮＡ構築物を動物細胞に導入させ、該動
物細胞内において、外来性遺伝子の変異体を製造する方
法：（ａ）プロモーター、（ｂ）外来性の遺伝子、（ｃ）イ
ントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓｅＩ高感
受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含むエンハン
サー。項２．（ｄ）エンハンサーが、さらにＨＳ１及びＨＳ
２を含む項１に記載の製造法。項３．（ｄ）エンハンサーが、少なくとも配列番号：
１または配列番号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を
有する項１または２に記載の製造法。項４．（ａ）、（ｃ）、（ｄ）のＤＮＡ配列が免疫グ
ロブリンのＤＮＡ配列に由来する項１〜３のいずれかに
記載の製造法。項５．（ｄ）エンハンサーが、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ
３ｂ及びＨＳ４を含む請求項２に記載の製造法。項６．（ａ）プロモーターがＶ_Hプロモーターであ
り、（ｄ）エンハンサーが、配列番号：１及び配列番
号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を有する項１〜５
のいずれかに記載の製造法。項７．ＤＮＡ構築物が、ｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／
４である請求項５又は６に記載の製造法。項８．動物細胞が、Ｂ細胞系動物細胞である項１〜７
のいずれかに記載の製造法。項９．Ｂ細胞系動物細胞がプレＢリンパ球系細胞由来
である項８に記載の製造法。項１０．項１〜９に記載の方法によって得られた外来
性遺伝子の変異体を、更に、該動物細胞内で発現させ
て、変異体の遺伝子発現物を得る方法。項１１．外来性の遺伝子の変異体を産生するためのＤ
ＮＡ構築物であって、少なくとも以下の（ａ）〜（ｄ）
を含むＤＮＡ構築物：（ａ）プロモーター、（ｂ）外来性の遺伝子、（ｃ）イ
ントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓｅＩ高感
受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含むエンハン
サー。項１２．（ｄ）エンハンサーが、さらにＨＳ１及びＨ
Ｓ２を含む項１１に記載の製造法。項１３．（ｄ）エンハンサーが、少なくとも配列番
号：１または配列番号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配
列を有する項１１または１２に記載のＤＮＡ構築物。項１４．（ａ）、（ｃ）、（ｄ）のＤＮＡ配列が免疫
グロブリンのＤＮＡ配列に由来する項１１〜１３のいず
れかに記載のＤＮＡ構築物。項１５．（ｄ）エンハンサーが、ＨＳ１、ＨＳ２、Ｈ
Ｓ３ｂ及びＨＳ４を含む項１１〜１４のいずれかに記載
のＤＮＡ構築物。項１６．（ａ）プロモーターがＶ_Hプロモーターであ
り、（ｄ）エンハンサーが、配列番号：１及び配列番
号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を有する項１１〜
１５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。項１７．ＤＮＡ構築物がｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／
４であることを特徴とする項１１または１２に記載のＤ
ＮＡ構築物。項１８．外来性の遺伝子の変異体を産生する変異され
たＤＮＡ配列発現を達成するための（ａ）プロモーター、（ｂ）外来遺伝子挿入可能部位
（ｃ）イントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓ
ｅＩ高感受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含む
エンハンサー、を有するベクターを含む、外来遺伝子変
異体製造法または変異体の遺伝子発現物産生用キット。項１９．（ｄ）エンハンサーが、さらにＨＳ１及びＨ
Ｓ２を含む項１８に記載のキット。項２０．配列番号１４の配列を有するＶ_H１７．２．
２５プロモーター。

【００１２】本発明によれば、抗体遺伝子のプロモータ
ーとエンハンサーで制御される系に外来性遺伝子を導入
することにより、高頻度でランダムな突然変異した遺伝
子群が得られ、広くペプチドや蛋白質に突然変異を導入
する動物細胞系変異体産生法が提供され、かくして天然
に存在する蛋白質の所望の機能改造・転換を試みること
が可能となり、例えば抗生剤耐性菌に対する機能の向上
した新しいタイプの抗生剤の開発、農薬の開発、或いは
インターフェロン、成長ホルモン等の機能向上した改良
ペプチド医薬品の開発が可能となり、しかも動物細胞を
使用することによって動物細胞に対する毒性スクリーニ
ングを併せて実施することが可能となり、一次毒性が検
討され、機能向上した作用を有する各種ペプチド産物の
迅速な創製が可能となる。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本明細書におけるアミノ
酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication
on BiologicalNomenclature, Eur. J. Biochem., 138:
9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書
等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該
分野における慣用記号に従うものとする。

【００１４】また、ＤＮＡの合成、外来性遺伝子を含有
するＤＮＡ構築物(例えば、発現ベクター)の構築、該Ｄ
ＮＡ構築物によって形質転換された宿主細胞及び宿主細
胞が分泌する発現蛋白の製造方法などは、一般的遺伝子
工学的手法〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring H
arbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子
研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）］ある
いは遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431
(1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1
985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (198
3)など参照〕に従って容易に製造・取得することができ
る。

【００１５】本発明において、変異体とは、外来遺伝子
のＤＮＡ配列がランダムに変異したＤＮＡ配列からなる
遺伝子又はランダムに変異した遺伝子によってコードさ
れる変異したアミノ酸配列を有する発現産物をいう。

【００１６】本発明の動物細胞における変異体の産生
は、所望の蛋白をコードする遺伝子を含む宿主細胞中で
発現可能な本発明により提供される変異体誘導用ＤＮＡ
構築物(組換えＤＮＡ)を作成し、細胞に導入することに
よって得られる。

【００１７】本明細書において「ＤＮＡ構築物を動物細
胞に導入」とは、外来性の遺伝子を動物細胞のゲノムに
組み込むことを意味する。

【００１８】また、変異体の発現産物は、上記外来遺伝
子の変異体を含む形質転換体を培養し、次いで得られる
培養物から回収することにより行われる。

【００１９】前記本発明により提供される変異体誘導用
ＤＮＡ構築物は少なくとも（ａ）プロモーター、
（ｂ）外来性の遺伝子、（ｃ）イントロンエンハンサ
ー、および（ｄ）ＤＮａｓｅＩ高感受性領域中、ＨＳ
１、ＨＳ２並びにＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含むエン
ハンサーからなる構造を有し、一般的遺伝子工学的手法
により容易に産生・取得することができる。

【００２０】本発明における各遺伝子（ＤＮＡ）の調製
は、適当な起源由来のものを使用してもよいし、化学的
に合成してもよい。

【００２１】具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルア
ミダイト法またはトリエステル法による化学合成による
こともでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合
成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を
合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせる
か、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラ
ーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した
一本鎖生成物から得ることもできる。

【００２２】また各遺伝子は前記の如くＤＮＡの合成に
よってか、該遺伝子を含有するベクター、あるいは該遺
伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮ
Ａライブラリーを調製し、該ライブラリーから、該遺伝
子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローン
を選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad.
Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (19
83)など〕。

【００２３】上記において、ｃＤＮＡの起源としては、
各遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来す
る培養細胞などが例示される。また、これらからの全Ｒ
ＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得と
そのクローニングなどはいずれも常法に従って実施する
ことができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販され
てもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリ
ー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）な
どより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを
用いることもできる。該遺伝子をｃＤＮＡライブラリ
ーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通
常の方法に従うことができる。

【００２４】具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生
される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した
免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローン
を選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合する
プローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コ
ロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せな
どを例示できる。

【００２５】ここで用いられるプローブとしては、各遺
伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成され
たＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された
本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、外
来性遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プ
ライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング
用プローブとして用いることもできる。

【００２６】前記プローブとして用いられるヌクレオチ
ド配列は、各遺伝子のＤＮＡ配列に対応する部分ヌクレ
オチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩
基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは
３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続し
た塩基を有するものも含まれる、或いは前記配列を有す
る陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも
出来る。

【００２７】遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Scie
nce, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法
が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃ
ＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapi
d amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35
(1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕
などの採用が好適である。

【００２８】かかるＰＣＲ法の採用に際して使用される
プライマーは、遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定で
き、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤ
ＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従う
ことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。

【００２９】また、上記で得られる遺伝子或いは各種Ｄ
ＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl.
Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギ
ルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (198
0)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキ
ットなどを用いて、その塩基配列を決定することができ
る。

【００３０】（ｂ）所望の外来性遺伝子前記ＤＮＡ構築物の構成要素において、（ｂ）外来性の
遺伝子に用いられるＤＮＡは、変異体を誘導するための
基礎となる所望の遺伝子または発現蛋白から得られた外
来性のＤＮＡ配列を用いるか、あるいはそのＤＮＡ配列
を合成するかのいずれでもよい。また、本発明の変異体
の製造法に用いられる外来性の遺伝子の長さは、一般に
４Ｋｂまでの長さを例示できるが、より好ましくは、３
Ｋｂ以下の長さ、更に好ましくは２Ｋｂ前後の長さが好
ましく例示できるが、４Ｋｂを超える長さの外来性の
ＤＮＡ配列を用いてもかまわない。

【００３１】外来性の遺伝子としては、遺伝子の発現に
より生物活性を有する遺伝子であれば特に制限されな
い。例えば、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン、イン
ターフェロン、エリスロポエチンなどが例示される。

【００３２】また、外来性遺伝子が宿主細胞のゲノムに
挿入されたか等を確認しやすくするために、いわゆるマ
ーカー遺伝子となるＤＮＡを上記（ｂ）外来性の遺伝子
に加えておくことも可能である。

【００３３】このようにして得られる外来性遺伝子によ
れば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用
することにより、個体もしくは各種組織における外来性
遺伝子及びその変異体の発現の有無を特異的に検出する
ことができる。

【００３４】かかる検出は常法に従って行うことがで
き、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polyme
rase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 2
1-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティ
ング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor La
b. (1989)〕、in situＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Re
s., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイ
ゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳ
ＢＡ法〔Nucleicacid sequence-based amplification,
Nature, 350, 91-92 (1991)〕及びその他の各種方法を
挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検
出法を挙げることができる。

【００３５】該外来性の遺伝子のＤＮＡ断片は、適当な
制限酵素によって切断された制限断片として前記ＤＮＡ
構築物の（ｂ）外来性の遺伝子として提供される。

【００３６】（ａ）プロモーター次いで、前記ＤＮＡ構築物の構成要素において、（ａ）
プロモーターとして用いられるプロモーターは、免疫グ
ロブリン重鎖可変領域プロモーター(V_Hプロモーター)、
ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモ
ーター、アデノウイルスのプロモーター、サイトメガロ
ウイルスプロモーター、ポリオーマ、Ｂ型肝炎ウイルス
のようなウイルス由来のプロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲα
プロモーターや哺乳動物細胞に効果的な他のプロモータ
ーなどを例示できる。本発明においては、Ｖ_Hプロモー
ター、より詳細にはＶ_H１７．２．２５のプロモーター
(Gillies, S.D., et al.,Cell, 33,715(1983): Banerj
i, J.,et al., Cell, 33, 729(1983))をより好ましく例
示できる。

【００３７】また、前記プロモーターは、例えばネオマ
イシン耐性遺伝子、あるいはテトラマイシン耐性遺伝子
に対して誘導し得るプロモーターを含んでいてもよい。

【００３８】また、前記プロモーターは、２以上が連結
した連結形体であってもよい。

【００３９】これら各種プロモーターのＤＮＡ配列は、
公知であり、それら情報を利用することができる。

【００４０】（ｃ）イントロンエンハンサーイントロンエンハンサーとは、重鎖遺伝子のＪＨ遺伝子
とＣμ遺伝子のエクソン間に介在している非発現領域の
配列を含む転写を調節するＤＮＡ配列である。（ｃ）イントロンエンハンサーとしては、免疫グロブリ
ンの重鎖エンハンサー(Ｃμエンハンサー)とカッパー鎖
エンハンサー(κエンハンサー)が挙げられる。

【００４１】（ｄ）デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮ
アーゼＩ）感受性領域ＤＮアーゼＩ感受性領域とは、単離した細胞の核にＤＮ
アーゼＩを低濃度で処理すると切断を受ける領域であ
り、免疫グロブリン重鎖遺伝子の場合には、ＨＳ１、Ｈ
Ｓ２、ＨＳ３ｂおよびＨＳ４の存在が知られている。こ
こで、ＨＳ３ｂ／４とは、ＨＳ３ｂとＨＳ４の両者或い
はいずれかのことである。本発明においては、ＨＳ３ｂ
領域及び／又はＨＳ４領域を含むことを特徴とし、好ま
しい実施態様としては、ＨＳ３ｂ領域及び／又はＨＳ４
領域に加えてＨＳ１とＨＳ２（これらをあわせて「３’
Ｅ」という。）を含む。ここで、３’ＥＨＳ３ｂ／４
は、リバーソンら(Lieberson, R.,et al., EMBO. J.,1
4,6229(1995))に開示されている３’エンハンサーの
４．０ｋｂからなるＸｂａＩ断片とマディセンら開示の
ＭＰ１１(Madisen, L., et al., Genes Dev., 8,2212(1
994))からの１１８２ｂｐのＨＳ３及び１３８１ｂｐか
らなるＨＳ４のイントロン配列を有することのない配列
を例示できる。

【００４２】各遺伝子の連結（ＤＮＡ構築物の製造）本発明のＤＮＡ構築物は、上記各遺伝子を、例えば、適
当な発現ベクターに挿入することによって得ることがで
き、常法に従い、製造することができるが、例えば、適
当な抗生物質耐性遺伝子を有するベクターに各要素を組
み込むことによって得ることも可能である。具体的に
は、上記ＤＮＡ構築物は、任意の抗生物質耐性遺伝子を
有する動物細胞系に使用されるベクターに、これらプロ
モーター、外来性遺伝子、イントロン・エンハンサー、
ＤＮＡ分解酵素Ｉ感受性領域（ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ
４のＤＮＡ配列を含み、更に必要に応じて３’Ｅからな
るエンハンサーを含む）をベクタークローン、ゲノムＤ
ＮＡ、あるいはプラスミド等から任意の制限酵素によ
り、切り出してか、あるいはこれらＤＮＡを合成するこ
とによって構築することができる。

【００４３】具体的には、制限酵素、リガーゼなどを用
いた通常の手法によりベクター中に組み込むことができ
る。

【００４４】また、所望の組換発現ベクターにおい
て、イントロン・エンハンサー及び３’ＥＨＳ３ｂ／４
エンハンサーは５’端から３’端方向にそれぞれ構築す
るか、あるいは逆の３’端から５’端方向にそれぞれ構
築されるか、５’端から３’端方向と逆の３’端から
５’端方向との互い違い構築されてもよい。

【００４５】また上記ＤＮＡ構築物の構築において、プ
ロモーターと３’ＥＨＳ３ｂ／４エンハンサーとの間に
外来性ＤＮＡを内部側に含んだ両者の距離は、０．１Ｋ
ｂから１００Ｋｂ、好ましくは１Ｋｂから１０Ｋｂ、よ
り好ましくは２ｋｂから５ｋｂの距離であるのが好まし
い。

【００４６】好ましい発現ベクターとしては、レトロウ
イルスベクターが例示できる。より具体的には、ｐＩＮ
Ｄ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invi
trogen社）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ，−Ｃ（Clontech社）等が
挙げられる。

【００４７】前記ＤＮＡ構築物の（ａ）プロモーター及
び（ｃ）イントロンエンハンサーを含む一例としては、
本発明者らのＶＨプロモーターとイントロンエンハンサ
ーを含む発現ベクターが例示できる(Azuma, T., et a
l., Int. Immunology, 5(2) 121-130(1993)) 。これを
用いて、ＤＮＡ構築物を作製するのが好ましい。

【００４８】上記において、プロモーターとイントロン
エンハンサーを含む発現ベクターにおいては、通常導入
される外来性遺伝子に対して、プロモーターは５’上流
に位置し、続いて、外来性遺伝子、イントロンエンハン
サーの順に構築される。

【００４９】本発明の外来性遺伝子を含むＤＮＡ構築物
を製造するためのベクターとして、上記ベクターを、プ
ロモーター、所望の外来性の遺伝子の挿入のためのクロ
ーニング・サイト、変異を誘導するために必要な１以上
のエンハンサー（特に免疫グロブリンエンハンサーであ
ってイントロンエンハンサー）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ感受
性領域を含むように修飾すれば、外来遺伝子変異体製
造法または変異体の遺伝子発現物産生用キットのＤＮＡ
構築物として有用である。

【００５０】本発明のＤＮＡ構築物は、環状ＤＮＡでも
よいし、線状ＤＮＡでもよい。

【００５１】本発明のＤＮＡ構築物であることの確認
は、例えば、制限酵素で切断し電気泳動を行ったり、Ｐ
ＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、シークエンシン
グなどを組み合わせるなどの一般的な手法により行うこ
とができる。

【００５２】変異体の製造法外来性の遺伝子を産生する方法としては、まず、上記方
法によって得ることができるＤＮＡ構築物を適当な宿主
細胞の細胞中に導入し、相同組換え体を得る。

【００５３】上記宿主細胞としては、哺乳動物、酵母、
植物細胞等の細胞からなる真核生物が例示されるが、好
ましくは、哺乳動物の動物細胞がよく、該細胞として
は、変異を効果的にすることが決定できる因子と共に形
質転換される樹立された細胞株やサルの細胞であるＣＯ
Ｓ細胞(Cell, 23,175 (1981))やチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞、Ｈｅｌａ、ＲａｔＩＩ繊維芽細胞、消化
管上皮細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕
などが好適に用いられるが、特に樹立細胞株の場合は、
例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞系動物細胞、特にプレＢ細
胞系動物細胞がこのましく、より具体的にはＪ５５８細
胞、Ｊ５５８Ｌ細胞が例示されるが、これらに限定され
るものではない。また、酵母の細胞を用いる場合にはサ
ッカロミセス属酵母細胞などが用いられる。

【００５４】また、動物生体の細胞が宿主細胞の対象と
なってもよい。

【００５５】宿主細胞のゲノムに外来性遺伝子が組み込
まれる結果、本発明のＤＮＡ構築物によって形質転換さ
れた形質転換体を得ることができる。

【００５６】かかる本発明のＤＮＡ構築物の細胞への導
入は、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシ
ウム共沈法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、
マイクロインジェクション法、ウイルス形質導入などを
始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において
既に知られている各種の方法に従って行うことができ
る。好ましくは、エレクトロポレーション法がよい。

【００５７】本発明のＤＮＡ構築物を導入する細胞とし
ては、受精卵、胚、生殖系列の細胞等が挙げられる。ま
た、細胞への導入は、常法に従い行うことができる。

【００５８】変異体が得られたかどうかの確認は、公知
の方法、例えば、ランダムシークエンス法、又は外来性
遺伝子の発現産物の活性を測定し、外来性遺伝子が有す
る活性とは異なる活性を有するものを選択することによ
って確認することができる。または、標準的な活性とそ
の程度において、もしくは活性が高いか、或いは低いか
によっても選択することができる。

【００５９】なお、目的の外来性ＤＮＡで形質転換され
たランダムな変異導入された遺伝子を有する細胞は、そ
れ自体単離状態でヒトの外因性遺伝子に関連する機能向
上した改良ペプチドとなり、病態改善のための医薬や、
治療研究のためのモデル系として利用することも可能で
ある。

【００６０】得られる形質転換体は、常法に従い培養で
き、該培養により外来性遺伝子の変異体によりコードさ
れる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞
外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。

【００６１】該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利
用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で
きる。

【００６２】かくして得られる本発明の組換え蛋白質
は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利
用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、
1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社
東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (198
6); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕に
より分離、精製できる。

【００６３】該方法としては、具体的には、通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本
発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを
利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示す
ることができる。かくして本発明の組換発現ベクターを
用いた動物細胞中に該組換発現ベクターを発現させて得
られる外来性ＤＮＡによってコードされるランダムな変
異体を産生することができる。前記本発明の組換発現ベ
クターによって起こるランダムな変異体の頻度は、少な
くとも約１ｘ１０^-4 〜１０^-3／ｂｐ／生成である。

【００６４】さらに本発明は、誘導されたＤＮＡ配列ま
たは遺伝子変異体の発現を達成するための外来性ＤＮＡ
または外来性遺伝子挿入可能部位を有する上記組換ベク
ターを保有する真核細胞、特に動物細胞とを含む変異体
製造法を提供する。本発明の変異体製造法によれば、例
えば抗菌作用を有したとしても動物細胞に有害なため使
用不可能なペプチドの改良された動物細胞に対して低毒
性で、しかもより高い抗菌活性を有する抗菌ペプチドを
改造する方法が提供できる。同様に、本発明の変異体製
造法により、天然に存在するインターフェロンや成長ホ
ルモン等の蛋白質の機能改造・転換を試みることが可能
となり、また農薬の開発や医薬品等の機能向上のために
有用な方法が提供される。

【００６５】さらに本発明は、外来遺伝子変異体製造法
または変異体の遺伝子発現物産生するための、外来性Ｄ
ＮＡまたは外来性遺伝子挿入可能部位を有するＤＮＡ構
築物を含むキットを提供する。具体的には、該ＤＮＡ
構築物は、（ａ）プロモーター、（ｂ）外来遺伝子挿入可能部位
（ｃ）イントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓ
ｅＩ高感受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４、並び
に必要に応じてさらにＨＳ１、ＨＳ２を含むエンハンサ
ーを含む。

【００６６】本発明の変異体産生用キットにより、例え
ば動物細胞に低毒性で改良されたより高い抗菌活性を有
する抗菌ペプチドや天然に存在するインターフェロンや
成長ホルモン等の蛋白質医薬品の機能向上品を提供する
ことが可能となる。

【００６７】

【発明の効果】本発明によれば、改良された真核生物プ
ロモーター、外来性のＤＮＡ配列、イントロンエンハン
サー、およびＤＮａｓｅＩ高感受性領域中、ＨＳ１、Ｈ
Ｓ２並びにＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含むエンハンサ
ーが連結されたＤＮＡ構築物を動物細胞に導入させて、
ランダムな遺伝子の変異体、更にはそれを発現させて得
られるランダムな変異の発現産物の産生法を提供でき
る。そしてそのようなランダムな変異体の産生のための
ＤＮＡ構築物、および変異体の産生または変異体発現用
キットを提供することができる。

【００６８】本発明の動物細胞を用いた発現系から得ら
れた変異体は、天然に存在する蛋白質の所望の機能改造
・転換を試みることが可能となり、機能向上した改良ペ
プチド産物の開発が可能となり、しかも動物細胞を使用
することによって動物細胞に対する一次の毒性スクリー
ニングを併せて行うことが可能となり、より低毒性の機
能向上した作用を有する各種ペプチド産物の迅速な創製
が可能となる。

【００６９】

【実施例】以下、本発明をより詳しく説明するため実施
例を挙げるが、本発明は之等に限定されない。

【００７０】実施例１１）ＩｇＨ導入遺伝子の構築異なる３’フランキング領域を有するヒトＣμを備えて
いるＩｇのＨ鎖（ＩｇＨを構築した。

【００７１】ＶＨプロモーターを含む断片及びＥμ／Ｍ
ＡＲを含む断片の入手制限酵素ＫｐｎＩおよびＡｐａＩサイトを有するＶ_H１
７．２．２５プロモーター(0.55kb)を含む断片と制限酵
素ＸｈｏＩおよびＳａｌＩサイトを有するＥμ／ＭＡＲ
(1kb)を含む別の断片を、ＣＡＴ遺伝子導入マウスを作
製するために本発明者が先に作成した構築物［Ｖ_H１
７．２．２５由来のＶ_Hプロモーターおよびイントロン
エンハンサー（Ｊ−Ｃイントロン・エンハンサー/マト
リックス付着領域(Ｅμ/ＭＡＲと略称する)）によって
制御されたクロラムフェニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｉ
ＳＫ（＋）の制限酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩサイトの
間に備えているプラスミド］からＰＣＲによりクローン
した(Azuma, T., et al., Int. Immunology, 5(2) 121-
130 (1993))。

【００７２】Ｖ_H−Ｄ−Ｊ_H遺伝子断片の入手制限酵素ＡｐａＩおよびＸｈｏＩサイトを含む再編成し
たＶ_H−Ｄ−Ｊ_H遺伝子断片(2.0kb)も、Ｃ５７ＢＬ／６
マウス(トウキョウ・アニマル・センターから購入)から
得られた抗（４−ヒドロキシ-３−ニトロフェニル）ア
セチル・モノクローナル抗体(以下、抗ＮＰモノクロー
ナル抗体)を産生するハイブリドーマであるＡ６由来の
ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲによってクローンした(T
aketani, M.,et al., Mol. Immunity, 32, 983(1995):F
urukawa,k., et al., Immunity, 11,329 (1999))。

【００７３】これらをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ
(ストラタジーン社製)の中にＶ_Hプロモーター、Ｖ_H−Ｄ
−Ｊ_H遺伝子、Ｅμ／ＭＡＲの順でクローンした。

【００７４】ヒトＣμ遺伝子の入手ヒトＣμ遺伝子の６．９ｋｂのＸｂａＩ断片をＣＨ．
Ｈ．Ｉｇμ−２４ファージクローン(Takahashi, N., et
al., Nucleic Acids Res., 8, 5983 (1980) ; Health
Science Research Resources Bank,)から得た。

【００７５】３’エンハンサーの入手さらに３’エンハンサー(以下、３’Ｅと略称する)のＸ
ｂａＩ断片(4.0kb)を含むプラスミド(Lieberson, R., e
t al., EMBO. J, 14,6229(1995))を、ハーバード医学学
校のマニス氏およびアルト氏より入手した。配列番号１
で示されるＨＳ３ｂ(1.2kb)および配列番号２で示され
るＨＳ４(1.4kb)を含む断片は、配列番号３〜６に示さ
れるプライマーおよびＢ細胞リンパ腫のＭＰＣ１１(Mad
isen, L.and Groudine, M., Genes Dev.8,2212(1994))
由来のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによってクローンし
た。尚、各プライマー配列中のＳｐｅＩおよびＸｂａ
Ｉ制限酵素認識配列部位に下線に引いた。

【００７６】配列番号３：ＨＳ３−Ｓ：5'-TCTAGAACCAC
ATGCGATCTAAGGGATATTGGGG-3' 配列番号４：ＨＳ３−anti SpeI:5'-CAGGACTAGTGATCATT
GAGCTCCGGCTCTAAC-3' 配列番号５：ＨＳ４−Ｓ XbaI：5'-CTAGTCTAGACTGCAGAC
TCACTGTTCACCATG-3' 配列番号６：ＨＳ４−anti SpeI:5'-GTGGACTAGTAAGCTTG
GAGTTAGGTGGGTAGG-3' これら得られた断片を、３’Ｅの３'末端にＨＳ３ｂ及
びＨＳ４の順に結合させた。３’Ｅ、ＨＳ３ｂ、および
ＨＳ４は、如何なる挿入しているＩｇイントロン配列な
しにタンデムに連結していた。

【００７７】上記得られた各フラグメントを用い、遺伝
子組み換え技術を利用して、ｐｖｅｈｃΔ３’Ｅ（１２
ｋｂｐ）、ｐｖｅｈｃ３’Ｅ（１６ｋｂｐ）及びｐｖｅ
ｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／４（１９ｋｂｐ）の３種の構築物
を得た。

【００７８】２）導入遺伝子の構造的特徴本発明において得られた導入遺伝子構築物は、(4-ヒド
ロキシ−3-ニトロフェニル）アセチル・ハプテン(Bothw
ell, A.L.M., et al., Cell, 24,625(1981))への応答に
関連したドミナントＶ_HであるマウスＶ_H１８６．２によ
ってコードされたＶ領域を含む。

【００７９】抗(4-ヒドロキシ−3-ニトロフェニル）ア
セチルに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマであるＡ６(Taketani, M., et al., Mol. Immuni
ty,32, 983 (1995): Furukawa, k., et al., Immunity,
11,329(1999))から再編成されたマウスＶ_H１８６．２
−ＤＦＬ１６．１−Ｊ_H２遺伝子は、ヒトＣμに結合し
ており、それによってコードされた導入遺伝子と内因性
マウスＨ鎖の間の判別を容易にした。

【００８０】加えて、トランスメンブレンのエクソン
が、導入遺伝子がＢ細胞表面に発現することによりＢ細
胞の発生が変化する可能性があるので、導入遺伝子が細
胞表面上の発現を防止する為に、Ｃμから取り除かれ
た。導入遺伝子はＣμのみ含んでいるが、他のＨ鎖イソ
タイプをコードする遺伝子領域は含んでいなかった。

【００８１】導入遺伝子構築物の全ては、３種ともＣＡ
Ｔ導入遺伝子構築(Azuma, T., et al., Int. Immunol.,
5,121 (1993))に用いられたＶ_Hプロモーターとマウス
Ｊ−ＣμイントロンからのＥμ／ＭＡＲをシス作用エレ
メントとして含んでおり、導入遺伝子の構造の違いは、
３’フランキング領域（図１）に限定されている。

【００８２】構築物のひとつであるｐｖｅｈｃΔ３’Ｅ
は、３’エンハンサー領域が欠失しており、そしてＶ_H
プロモーターおよびＥμ／ＭＡＲによって制御されてい
た。また、別の構築物のｐｖｅｈｃ３’Ｅは、Ｖ_Hプロ
モーターおよびＥμ／ＭＡＲに加えて３’エンハンサー
(Lieberson, R.,et al., EMBO. J.,14,6229(1995))を含
んでいた。３’エンハンサー(３’Ｅ)を含んでいる制限
酵素ＢａｍＨＩ断片(4.0kb)が、遺伝子構築の為に使用
された。ｐｖｅｈｃ３’Ｅに対して与えられたＨＳ３ｂ
およびＨＳ４の付加は、ｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／４
と同じく関連した構築物を発生させている。

【００８３】内因性のＩｇＨ遺伝子は、ＨＳ３ｂと同一
の核酸配列を持つが、しかし反対になった形(Arulampal
am, V., et al., Immunol.Today, 18, 549(1997))とし
て存在する、ＨＳ３ａ(Matthias, Ｐ.and Baltimore,
D., Mol. Cell Biol., 13, 1547 (1993))と名付けられ
た付加的なシス作用エレメントを含んでいた。本発明の
導入遺伝子構築物は、このシス作用エレメントを含んで
いなかった。

【００８４】実施例２１）Ｊ５５８Ｌ細胞中へのＩｇＨ変異遺伝子(Lundblad,
A., et al. Immunochemistry 9, 535-544 (1972))のト
ランスフェクションおよび抗体産生これら３種の構築物の転写活性を評価する為に、これら
の構築物をマウス黒色腫細胞株のＪ５５８Ｌ細胞の中に
形質転換させた。制限酵素ＮｏｔＩ認識部位を有する線
状鎖のＩｇＨ遺伝子構築物(10μg)を、プラスミドｐＳ
Ｖ２−ｇｐｔ(1.6μg)(Mulligan, R.C. & Berg P. Scie
nce 209; 1422-1427 (1980))と共にＪ５５８Ｌ細胞中に
電気穿孔(エレクトロポレーション)を行なった(Sahaga
w, B.G. et al. 1986, J.Immunol., 137; 1066-1074)。
電気穿孔の具体的条件を以下に示す。機械：ジーンパルサー（BIO-RAD社）、条件： buffer ：ＰＢＳ、細胞：Ｊ５５８Ｌ 2×10⁷ cells/mlを0.5ml ＰＢＳ中、直線化ＤＮＡＩｇＨ導入遺伝子（１０μｇ）及びｐＳＶ２−ｇｐｔ
(1. 6μg)、反応条件：キャパシタンス（９６０μＦ）、電圧（３５
０Ｖ）。

【００８５】形質転換した細胞を、ヒポキサンチン、キ
サンチンおよびミコフェノール酸の混合液(シグマ社)の
存在下に培養した(３７℃、５％ＣＯ₂下）。薬剤抵抗性
ＩｇＨ遺伝子の形質転換体を、限外希釈し、抗体産生に
基づいてクローンを選択した。具体的には、抗ＮＰキメ
ラ抗体産生をＥＬＩＳＡ(図２)によって測定した。

【００８６】即ち、抗体産生の量的分析のために、各導
入遺伝子構築物から誘導された形質転換体の幾つかのク
ローンを、平底９６穴プレート中で、１０％ウシ胎児血
清（FCS）を含む全容量が２００μlのＲＰＭＩ１６４０
培地(日水製薬社製)中において１２時間、２×１０⁶細
胞／ｍｌの濃度で培養した。１ｍｇ／ｍｌウシ血清アル
ブミン(BSA)を含むリン酸生理緩衝液(PBS)で種々の濃度
に希釈された培養上清を、ＮＰ₉−ＢＳＡでコートされ
たポリビニル・プレートを用いたＥＬＩＳＡによって分
析した。尚、結合した抗体の検出のために、ペルオキ
シダーゼ(POD)−標識抗マウスλ１鎖抗体(サザン・バイ
オテク社製：Southern Biotech)または、抗ヒトμ鎖抗
体(ザイメド社製：ZYMED)を用いた。

【００８７】結果を図２に示す。

【００８８】導入遺伝子構築物は、マウス抗ＮＰモノク
ローナル抗体からのＶ_H領域およびヒトＩｇからのＣ領
域を保有している、キメラＨ鎖をコードするように設計
しているので、これらはマウスλ１鎖とが会合すること
が予期され、抗ＮＰキメラ抗体を発生させた。

【００８９】全ての構築物は、Ｊ５５８Ｌ細胞に促進的
に形質導入され、内因性のλ₁鎖と対になることによっ
て抗ＮＰ抗体を産生した。これらの構築物の間におい
て、ｐｖｅｈｃΔ３’Ｅは、他のものと比較してむしろ
より弱い産生を示した。３’Ｅ(ｐｖｅｈｃ３’Ｅ)の付
加は結果として、抗体の産生の有意な増加を得た。しか
しながら、ＨＳ３ｂとＨＳ４の更なる付加は、抗体産生
量には効果がないと思われた。各形質転換したＤＮＡの
コピー数に関する転写の従属関係に関するわずかな情報
が入手可能であるけれども、本発明者は、抗体の産生の
量は、ｐｖｅｈｃ３’Ｅおよびｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３
ｂ／４との間に有意な差異が無く、構築物の転写の活性
を表わしていると思われた。

【００９０】実施例３１）キメラマウスの産生本発明者は、キメラ・マウスを産生する為にＲＡＧ-２
^-/-マウスからの胚盤胞中へのマイクロインジェクショ
ンのために、少なくとも２つの独立する形質転換された
ＥＳクローンを使用した。また、本発明者は、体細胞超
変異の分析のために少なくとも２つのキメラ・マウス／
導入遺伝子構築物を使用した。この実験に使用された形
質転換したＥＳ細胞株とキメラマウスを表１に示す。

【００９１】即ち、ｐＧＫｎｅｏ(1.5kb,1μg)のＥｃｏ
ＲＩ断片を、前記実施例２と同様に線状鎖の３種のＩｇ
Ｈ導入遺伝子構築物（30μg）を、バイオ−ラド・ジー
ン・パルサー（Bio-Rad Gene Pulser:バイオ・ラド社
製)を用いて１×１０⁷個のＥ１４−１細胞［Kuhn, R.,
et al., Science, 254, 707 (1991)］中にエレクトロポ
レーションを行なった。

【００９２】そして、形質転換された細胞を、Ｇ４１８
(150μg/ml：ギブコ社製)で選択した。得られたコロニ
ーを、Ｖ_H１７．２．２５プロモーターおよびＪ_H２に局
在するＤＮＡ配列にハイブリダイズする配列番号７およ
び配列番号８に示される２つのプライマーを用いるＰＣ
Ｒによって、プローブとしてヒトＣμ遺伝子を用いるサ
ザンブロッティングによってそれぞれスクリーニングし
た。配列番号７：5'-GACTCAGGAGGACTCTAGTT-3' 配列番号８：5'-GGTGTCCCTAGTCCTTCATG-3' ＰＣＲ増幅は９５℃、３０秒、６５℃、３０秒および７
２℃、１分間の３０サイクルの条件で実施した。構成し
たｐｖｅｈｃ３’Ｅのコピー数は、サザンブロッティン
グにより２−３であると計算された。他の導入遺伝子で
あるｐｖｅｈｃΔ３’Ｅ及びｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ
／４のコピー数は、標準としてｐｖｅｈｃ３’Ｅ−形質
転換したＥＳ細胞由来のＤＮＡを使用したＰＣＲの分析
によって、評価した。

【００９３】２）キメラマウスにおける抗体産生ＩｇＨ導入遺伝子を含むＥＳ細胞クローンを、ＲＡＧ-
２^-/-マウス(Takahashi, N., et al., Nucleic Acids R
es., 8, 5983(1980))由来の胚盤胞中に導入し、ＩＣＲ
仮親（８〜１２週齢、クレア社）の子宮中に移植した。
キメラ・マウスにおけるＥＳ細胞を起源としたＢ細胞お
よびＴ細胞による免疫システムの相補性は、ＰＥ抗ＣＤ
３抗体またはビオチン抗Ｂ２２０／ＳＡ−ＦＩＴＣで細
胞を染色した後にフロー・サイトメトリーによって試験
した。

【００９４】ＰＯＤ標識ヒツジ抗マウスμ鎖抗体を、結
合した抗体の検出のために用いた。ヒトＣμを有する抗
体の分析の為に、プレートを、ヒツジ抗ヒトＩｇＭ抗体
(サザン・バイオテク社製)でコートし、ＰＯＤ標識抗ヒ
トＩｇＭモノクローナル抗体(ザイメド社製)を、結合抗
体を検出するために使用した。尚、Ｊ５５８Ｌ形質転換
体の培養上清、ヒト・ワォルデンストームＩｇＭ(Walde
nstrom IgM)、および抗ＮＰＩｇＭモノクローナル抗体
であるＢ４−３をコントロール抗体として使用した。

【００９５】

【表１】キメラマウスができたかどうかは、導入遺伝子の生殖細
胞系遺伝を試験するためにＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し
交配し、得られたマウスの尾部より、ＤＮＡを抽出し、
ＰＣＲによって導入遺伝子が含まれているかどうか分析
した。

【００９６】３）免疫および抗体産生免疫システムがＥＳ細胞から誘導されたリンパ球と再構
築されているかどうか試験する為に、キメラのマウスの
Ａ４−３、２−１、および２−３のプレ免疫血清中のＩ
ｇＭの量をＥＬＩＳＡによって測定した。

【００９７】結果を図３Ａに示す。マウスＩｇＭの同様
の量が、導入遺伝子に関係なく、これらのマウスの全て
の抗血清において検出されたが、正常のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスにおけるものよりＩｇＭが少なかった。

【００９８】次に、ＮＰ₃₄−ニワトリγグロブリン(Ｎ
Ｐ₃₄−ＣＧＧ)及び異なるＮＰ価を有するＮＰ−ＢＳＡ
を、東らの方法と同様にして調製した(Azuma,T., et a
l., Molec. Immunol., 24, 287(1987 ) )。

【００９９】キメラのマウスに、（４−ヒドロキシ-３
−ニトロフェニル）アセチル・ニワトリ・ガンマグロブ
リン(以下、NP₃₄-CGG: 社製) を含むＣＦＡ(完全フロイ
ントアジュバント:Ｄｉｆｃｏ社製、100μｇ／マウス)
を投与し、追加免疫をＩＦＡ(不完全フロイントアジュ
バント)を用いて同量投与した。ＮＰ₃₄−ＣＧＧを含む
ＰＢＳの最終投与の３日後、抗血清を免疫されたマウス
から集めた。その後マウスを屠殺し、組織のサンプルを
得た。

【０１００】抗ＮＰ抗体産生とこれらの抗体のアフィニ
ティーマチュレーションを測定する為に、ＮＰ₁−ＢＳ
ＡまたはＮＰ₁₆−ＢＳＡでコートされたプレートを使用
した。ＰＯＤ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ(ザイメット社
製)を抗体の検出のために用いた。

【０１０１】抗ＮＰモノクローナル抗体、Ｆ８が未熟抗
体に対するコントロールとして、成熟したモノクローナ
ル抗体コントロールに対してＣ６を使用した(Taketani,
M.,et al., Mol. Immunol., 32，983(1995) ；Furukaw
a, K., et al., Immunty, 11, 329(1999))。

【０１０２】結果を図３Ｂに示す。ＮＰ₃₄−ＣＧＧで免
疫したマウスのプレ免疫または免疫抗血清において導入
遺伝子によってコードされたヒトＣμを表現する抗体を
検出することができなかった。

【０１０３】更に、抗ＮＰモノクローナル抗体(γ１λ
１)を産生するハイブリドーマを、ＮＰ₃₄−ＣＧＧで免
疫したｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／４マウスから調製し
た。ヒトＣμを表現する分泌された抗体は、これらの中
にはひとつもなかった。しかしながら、それらの中で幾
つかは、ヒトＣμを有する細胞内Ｈ鎖を合成した。

【０１０４】この結果から、導入遺伝子は、キメラ・マ
ウスのＢ細胞中に転写、翻訳されたと示唆される。しか
しながら、分泌されたＨ鎖産物は、検出可能なレベル以
下であった。

【０１０５】次に、ＴＤ抗原ＮＰ₃₄−ＣＧＧに対するキ
メラ・マウスの抗体反応を、ＥＬＩＳＡによって試験し
た。結果を図３Ｃに示す。抗体価は、変化していたが、
全てのマウスは、それらの免疫システムが、抗ＮＰ抗体
の産生に応答することを示す抗ＩｇＧ抗体を産生してい
た。

【０１０６】更に、またアフィニティーマチュエーショ
ンの測定として、ＮＰ₁₆−ＢＳＡに対する結合と関係す
るＮＰ₁−ＢＳＡに対するこれらの抗体の結合比を試験
した。結果を図３Ｄに示す。

【０１０７】図３Ｄに示すように、コントロールのモノ
クローナル抗体であるＦ８は、体細胞超変異を示さず、
そして２×１０⁵／ＭのＮＰ−Ｃａｐに対する会合定数
(Ka)を持っており、比率は０．２９であった。一方で
は、２ｘ１０⁷／ＭのＫａを有するよく成熟したモノク
ローナル抗体であるＣ６は(Furukawa, K., et al., Imm
unity,11,329(1999))、約１前後の比率を持っていた。
キメラ・マウスからの全ての抗血清は、Ｃ６と同様の比
率を示したため、抗ＮＰ抗体の親和性成熟は、ＮＰ ₃₄−
ＣＧＧで免疫の後の全てのキメラ・マウスにおいて同程
度まで進んでいた。

【０１０８】実施例４Ｖ_H遺伝子のクローニングおよび
配列決定免疫システムが、キメラ・マウスにおいて再構築された
が、単一のキメラ・マウス由来の胚の中心細胞(Rose,.
M.L., et al., Nature, 284, 364(1980)であるとしてよ
く知られている、ＰＮＡ^hiＩｇＧ⁺Ｂ細胞を十分な量得
ることはかなり困難であった。従って、ＮＰ₃₄−ＣＧＧ
で免疫した後、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅを用いるフロ
ー・サイトメトリーによってイソ型スイッチしたメモリ
ーＢ細胞を選択することが期待される脾臓のＩｇＭ^-Ｂ
２２０⁺細胞間にソートした。

【０１０９】即ち、ＮＰ₃₄−ＣＧＧで免疫したキメラマ
ウスの脾臓からの単一細胞懸濁液を、０．８３％塩化ア
ンモニウムでの処理によって、赤血球を溶血させた。幾
つかの実験において、Ｔ細胞もまた抗Ｔｈｙ１抗体（Ｔ
２４/４０及びＨＯ１３．４）で処理することによって
同様に溶血させ、続いてウサギ補体で処理した。細胞
を、ＰＥ(フィコエリスリン)標識抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２
０(細胞表面分子、フェルミンゲン（pherMingen）社
製）、あるいはフルオレセイントイソチオシアネート(F
ITC)標識抗マウスＩｇＭ（ザイメット社製）で染色し
た。

【０１１０】また、腹膜の細胞は、ビオチン標識抗ＣＤ
５／ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（フェルミンゲン
社製）およびＰＥ標識抗ＣＤ４５Ｒ(B220)で染色した。

【０１１１】ＣＤ４５Ｒ(B220)⁺ＩｇＭ^-、ＣＤ４５Ｒ(B
220)⁺ＩｇＭ⁺、又はＣＤ５⁺ＣＤ４５Ｒ(B220)⁺細胞は、
蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)Ｖａｎｔａｇｅ(ベ
クトンディッキンソン社製 )上にフロー・サイトメトリ
ーによって分画された。

【０１１２】尚、コントロール実験として、ＣＤ４⁺細
胞及び／またはＣＤ８⁺細胞を染色とソーティングの後
に胸腺から得た。

【０１１３】全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ(ＲＮＡ調製試
薬：ギブコＢＲＬ社製）を使用して製品仕様書に従い、
上記のサイトメトリーにより分流した脾臓細胞または腹
膜細胞から調製した。

【０１１４】ｃＤＮＡを、プライマーとしてオリゴ(dT)
およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素(ギブコ
ＢＲＬ社製）を用いて全ＲＮＡから調製した。各ｃＤＮ
Ａサンプルは、導入遺伝子に対して、配列番号９に示さ
れるＶ_H１８６．２プライマーおよび配列番号１０に示
されるヒトＣμプライマーの２つのプライマーを、内因
性のマウスＩｇ遺伝子に対して、配列番号９に示される
Ｖ_H１８６．２プライマーおよび配列番号１１に示され
るマウスＣγ１プライマーをそれぞれ用いてＰＣＲ増幅
した。配列番号９：5'-CATGCTCTTCTTGGCAGCAAC-3' 配列番号１０：5'-GCAGCCAACGGCCACGCTGC-3' 配列番号１１：5'-GGCCGAATTCCATGGAGTTAGTTTGGG-3' ＰＣＲ反応は９５℃、１分間、６２℃、１分間および７
２℃、１分間３０サイクルの条件で実施した。導入遺
伝子と内因性のマウスＩｇＨ遺伝子のＰＣＲ産物は、
アガロースゲル電気泳動によって分析するか、あるいは
ＴＡクローニング・キット(インビトロゲン社製)を用い
てｐＣＲ−２．１（インビトロゲン社製）の中にライゲ
ートし、日立ＤＮＡシーケンサー・モデル５５００(日
立製作所社製)を使用して、Ｍ１３プライマー(-20：寶
酒造社製)およびＭ１３リバース・プライマー（寶酒造
社製）を用いて配列決定した。

【０１１５】図４に示されるように、導入遺伝子を含む
抗体断片の発現が確認された。

【０１１６】２）脾臓或いは腹部のＢ細胞における導入
遺伝子の体細胞超変異変異の頻度は、配列決定した塩基の全数による変異の全
数を割ることによって算出した。結果を表２に示す。

【０１１７】

【表２】 ^aＣＤＲ領域での変異のパーセント＝１００×（ＣＤＲ
領域での点突然変異の総数）／（点突然変異の総数） ^b 変異頻度＝１００×（点突然変異の総数）／（塩基対
の総数）^c ２匹のキメラマウスが分析された導入遺伝子における体細胞超変異は、Ｖ_H１８６．２ま
たはヒトＣμのいずれかに対してハイブリダイズするプ
ライマーを使用した。ＲＴ−ＰＣＲで調製したｃＤＮＡ
のクローニングと配列決定を行なった。結果を表３並び
に図５及び図６に示す。

【０１１８】このプライマーの組み合わせの使用による
導入遺伝子の特異的な増幅は、キメラ・マウスからの脾
臓細胞においてのみ観察され、そしてＮＰ₃₄−ＣＧＧで
免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスからのそれには確認され
なかった。さらに全ての配列は、導入遺伝子構築するた
めに使用されるＡ６ＤＮＡの特性であるＣＤＲ３におい
て同一の接合的多様性を持っているということが確認さ
れた。

【０１１９】遺伝子構築物ｐｖｅｈΔ３’Ｅの場合、Ｖ
_H１８６．２−ＤＦＬ１６．１−Ｊ_H２において体細胞超
変異からの結果としての複数の核酸変化を見出された
が、頻度は低かった。変異の頻度は、０．１７％である
と見積もられた(表２)、遺伝子構築物ｐｖｅｈｃ３’Ｅ
の場合、実質的に同様の超変異の配分を示したが(図５
Ｂ)、しかしながら頻度はｐｖｅｈｃΔ３’Ｅと比較し
て少し上昇していた(表２)。

【０１２０】本発明の遺伝子構築物であるｐｖｅｈｃ
３’Ｅに更にＨＳ３ｂ／４を付加したｐｖｅｈｃ３’Ｅ
ＨＳ３ｂ／４の場合、Ｖ_H１８６．２−ＤＦＬ１６．１
−Ｊ_H２遺伝子における体細胞超変異の頻度においてド
ラマチックな上昇を結果として示した（図６）。配列決
定した全てのＰＣＲクローンは、それらが無作為に選択
された事実にもかかわらず核酸の変化を含んでいた。こ
れらの核酸変化は、ＣＤＲ２(超可変領域２)およびＣＤ
Ｒ３の周辺域において高い頻度で認められた(図６およ
び表２)。

【０１２１】脾臓のＢ細胞中の導入遺伝子構築間の体細
胞超変異の分布と頻度を、図７に示す。データは、図７
に示される各導入遺伝子構築物に対応する２匹のキメラ
・マウスから得たが、お互いに良好な一致を示した。ｐ
ｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／４における超変異の高い頻度
は明らかであった。しかしながら、変異は同じキメラの
マウスからの腹部のＢ１細胞においては明らかに存在し
なかった(図７)。

【０１２２】以下の表３に、導入遺伝子において、特定
された置換の特徴を示す。

【０１２３】

【表３】ＩｇＨ導入遺伝子での比較によって、塩基転位と塩基転
換がおよそ同じ頻度で生じていることを明らかになっ
た。

【０１２４】また、ＲＧＹＷモチーフ(A/G、G、C/T、A/
T）(Kabat, E. A., et al.,US National Institutes of
Health, Bethesda, M.D., U.S.A. , p1394, (1991): R
ogozin, I.B., et al., Biochim. Biophys. Acta., 117
1,11(1992))と名付けられる配列の局在において、Ｖ_H１
８６．２導入遺伝子中の体細胞超変異の発生を分析し
た。生殖細胞系Ｖ_H１８６．２遺伝子(294bp)は全塩基の
３２％に相同するＲＧＹＷ／ＷＲＣＹモチーフ(93ｂｐ)
を含んでおり、このモチーフにおける体細胞超変異の頻
度は、他のＶ_H領域のそれよりは有意に高くないであろ
う３４％であることが判明した。

【０１２５】

【発明の効果】上記実施例において、本発明者は、ＲＡ
Ｇ−２^-/-不全胚盤胞システムを用い、異なるシス作用
エレメントでＩｇＨ導入遺伝子を保有するキメラマウス
を調製した。

【０１２６】本発明の製造法は、慣習的な導入遺伝子技
術よりも、幾つかの利点、特にＥＳ細胞の中に形質転換
された低いコピー数の導入遺伝子の条件においてその優
秀性を有するものである。事実、ＥＳ細胞形質転換体に
おける導入遺伝子のコピー数は、サザンブロッティング
及びＰＣＲによって殆ど３コピー以下であると算出され
た(表１)。

【０１２７】ｐｖｅｈｃΔ３’Ｅにおいて、あまり重要
でない数の超変異をのみを見出し、シス作用エレメン
ト、Ｖ_HプロモーターとＥμ／ＭＡＲは、高い頻度の超
変異の誘導に対しては十分ではないという知見を確認し
た。ｐｖｅｈｃΔ３’Ｅに３’エンハンサー断片(4kb)
を付加することによって（ｐｖｅｈｃ３’Ｅ）、超変異
の発現頻度に関して約３０％上昇した。

【０１２８】しかしながら、本発明のごとく、ｐｖｅｈ
ｃ３’Ｅの３’エンハンサーの３’末端に対してＨＳ３
ｂおよびＨＳ４を導入することによって、超変異の誘導
発現頻度を格段に高めることを見出した。これは、構築
物ｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ３ｂ／４が体細胞超変異のため
に必要な全てのエレメントを含んでいることを指摘して
いる。高頻度の超変異導入発現に対して責任あるモチー
フが２．６ｋｂのＨＳ３ｂ／４領域内にあることが本発
明者の実験により明らかとなった。

【０１２９】かくして、所望の導入遺伝子のランダムな
変異体を誘導する組換発現ベクターを提供することがで
きる。さらに前記組換発現ベクターを動物細胞に発現さ
せて得られる高頻度のランダムな変異体の産生法を提供
できる。そして該組換発現ベクターと動物細胞からなる
ランダム変異体の発現方法またはランダム変異体産生用
キットを提供することが可能となった。

【０１３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. et al. <120> A METHOD OF INDUING SOMATIC HYPERMUTATION <130> PR-297 <140> <141> <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tctagaacca catgcgatct aagggatatt ggggcaatac atgtgtagtg agatacctgc 60 ctttctgatg agccctgtct ggcagggata aactctcctt tctgcatctc cagggcctcg 120 atgagctgac tatctagtcc tctgccagaa tagctgtgtg gccttgggtg atgctggctg 180 acctcaggct ggtctgggtt gtctctggct gacacccctt gactctggat gaccctggga 240 agaccatact taatcttaat tggacttgtt ctcattggga gagaacatgg cctcactaag 300 gcacgagtgt ggatggcctt gggtgatggg ggttggggcc tcctcagccc ctggcaggct 360 tccctggctg ccacccctca tccaggtccc aggcccacct ggcctggtcc agtgtggtgt 420 gattctcaga acagtagctg tggtttgggg cacctgtgct gagaaaggct caggatgact 480 cagctgccct cagctcagag ctgctttgaa tgtttcagca ggtgatagac aacagagact 540 tcagaagaga gaaaaacaag ttgctaatgt gaacatccct gccctacccc cacacctgta 600 ctgcaaatct ccccacactg ttgaccccag atagagatcc caggacagca ggtgatagac 660 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gtagtgtgtg tgtgtgtgtg 300 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cacgttgaaa gtcttcagta gactggtatc actagccctg 360 atatgggcaa cacagcaagc ctgggtcaca ctcaagctga gtatcagggt agccagggcc 420 ttctaaccaa gggtagatgc agcctgtgtt ccgtttactg accagtgaga agccatgagc 480 tgaaccagac cagaagaccc ttactgttcc caccccaccc ccacccagtt tagtctcagc 540 aagaccctgt actgtgggcc acagctctcc tctacactcc acctgtagca caaacactat 600 ttgcaaacat ttctaaaaag tagtagaaca ggaaccacag agcagagggg gggactggcg 660 tggaaagccc cattcaccca tgggactgaa actcagggaa ccagaaccgt aaggagattt 720 gcatggtgct gggggaggtt ggccctggat cagtgagccc agagagttac tggtttctca 780 cttccatcat gtcaacctcc tcaaccccca aaaatggcca ggcctaggct atggatgagt 840 ttcaatgacc aggccctaag gacgagtcac agaggacttc ctggtgggct caggcagcag 900 acctgctcag atggattgca gagccagagg gagccatggc caggaaggcc agacgcctta 960 ggggtgtgct gtctctgcat cctttgccct ctctgctcct cacagtccat ctgccatctc 1020 acaatccctg ctgtcgctct ggggcccaga cctggccagt ctgggtacct gtggaataca 1080 cccaaagaag caatccccag cctcaggatc cacaactact tcccctacag 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【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）本発明のキメラマウスを生産する為に
使用されたＩｇＨ変異体導入遺伝子構築物のシェーマ図
を示す。（Ｂ）ｃＤＮＡを増幅する為に使用されたプラ
イマーの場所と方向が（Ｂ）において矢印によって示さ
れている。

【図２】図１に示されるＩｇＨ変異体遺伝子で形質転換
されたＪ５５８Ｌ細胞からヒトＣμを生じている抗ＮＰ
抗体の生産。１２時間培養された形質転換されたＪ５５
８Ｌ細胞(1x10⁶細胞/ｍｌ)上清は、抗体産生を評価する
為にＮＰ₉−ＢＳＡでコートされたプレートを使用する
ＥＬＩＳＡの対象とされた。

【図３】キメラ・マウス４−３、２−１、および２−３
におけるＥＳ細胞によるＲＡＧ−２^-/-マウス免疫シス
テムの再構築プレ免疫マウスにおけるマウスＩｇＭのレ
ベルは、ラット抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体及び
ＰＯＤ標識羊抗マウスＩｇＭ抗体でコートしたプレート
を用いるＥＬＩＳＡによって測定した(Ａ)。プレ免疫
抗血清あるいは免疫抗血清におけるヒトＩｇＭのレベル
は、マウス抗ヒトＩｇＭ抗体及びＰＯＤ標識羊抗ヒトＩ
ｇＭ抗体でコートしたプレートを用いて測定した(Ｂ)。
ＡにおけるＢＡＬＢ／Ｃマウス及びＲＡＧ−２^-/-マウ
スからの抗血清とＢにおけるＪ５５８Ｌの培養上清を加
えたこれらの抗血清がコントロールとして使用された。
抗ＮＰ₉−ＢＳＡ抗体でコートしたプレートに対する抗
ＮＰ抗体の結合分析。結合抗体は、ＰＯＤ標識羊抗マウ
スＩｇＧを用いて測定した(Ｃ)。ＮＰ₁−ＢＳＡまたは
ＮＰ₁₂−ＢＳＡでコートしたプレートに対するキメラ・
マウスからの抗血清の結合比率（Ｄ）未熟あるいは成熟
抗体コントロールとして、抗ＮＰモノクローナル抗体Ｆ
８及びＣ６体の抗体価が、それぞれＤに示される。

【図４】ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の特異的増幅。
ＮＰ₃₄−ＣＧＧで免疫されたキメラマウスからのＩｇＭ
−Ｂ２２０⁺脾臓細胞のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮ
ＡはＰＣＲによって増幅された。ただ唯一キメラ・マウ
スは導入遺伝子に相同するバンドが与えられ(レーン１
−６)、そしてＣ５７ＢＬ／６マウスは、バンドがなか
った(レーン７)。Ｊ５５８Ｌ細胞形質転換体(レーン８)
及び非形質転換体(レーン９)もまた陽性または陰性コン
トロールとして示されている。

【図５】ＮＰ₃₄−ＣＧＧで免疫されたキメラ・マウ
ス、３−２(ｐｖｅｈｃΔ３’Ｅ)(Ａ)及び(ｐｖｅｈｃ
３’Ｅ)(Ｂ)からのＩｇＭ^-脾臓Ｂ細胞における導入遺伝
子の変異２つの個々のキメラ・マウスからのｃＤＮＡクローンの
ＤＮＡ配列が示される。上線は、Kabatらの方法に従い
数字付けされている、導入遺伝子のＶ_H１８６．２−Ｄ
ＦＬ１６．１−Ｊ_H２の非変異核酸配列を示す。導入遺
伝子構築物のそれに対して同一である核酸配列は、ダッ
シュによって指摘されている。ＣＤＲｓの部位は、網掛
けで示される。キメラ・マウスからのデータのみがこの
図において示されているが、本質的に類似の結果が他の
マウスを使用して得られた。

【図６】ＮＰ₃₄−ＣＧＧで免疫されたマウス２−１か
らのＩｇＭ^-脾臓Ｂ細胞におけるｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ
３ｂ／４の導入遺伝子の変異２つの個々のキメラ・マウスからのｃＤＮＡクローンの
ＤＮＡ配列が示される。上線は、Kabatらの方法に従い
数字付けされている、導入遺伝子のＶ_H１８６．２−Ｄ
ＦＬ１６．１−Ｊ_H２の非変異核酸配列を示す。導入遺
伝子構築物のそれに対して同一である核酸配列は、ダッ
シュによって指摘されている。ＣＤＲｓの部位は、網掛
けで示される。キメラ・マウスからのデータのみがこの
図において示されているが、本質的に類似の結果が他の
マウスを使用して得られた。

【図７】脾臓ＩｇＭ−Ｂ２２０⁺細胞(Ａ)及び腹部Ｂ１
細胞(Ｂ)からの導入遺伝子構築物における体細胞超変異
の位置と頻度の比較。２つのキメラ・マウスからの導入遺伝子構築物における
体細胞超変異の位置と頻度がＡにおいて分けて示されて
いる。下部でのスケールは、Kabatらの方法に従い数字
付けされているアミノ酸位置を指摘している。

【図８】Ｖ_H１７．２．２５プロモーターの配列を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA20 BA61 CA02 DA02 FA02 FA06 HA01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】外来性の遺伝子のランダムな変異体を動
物細胞内で製造する方法であって、少なくとも以下の
（ａ）〜（ｄ）を含むＤＮＡ構築物を動物細胞に導入さ
せ、該動物細胞内において、外来性遺伝子の変異体を製
造する方法：（ａ）プロモーター、（ｂ）外来性の遺伝子、（ｃ）イ
ントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓｅＩ高感
受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含むエンハン
サー。
【請求項２】（ｄ）エンハンサーが、さらにＨＳ１及
びＨＳ２を含む請求項１に記載の製造法。
【請求項３】（ｄ）エンハンサーが、少なくとも配列
番号：１または配列番号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ
配列を有する請求項１または２に記載の製造法。
【請求項４】（ａ）、（ｃ）、（ｄ）のＤＮＡ配列が
免疫グロブリンのＤＮＡ配列に由来する請求項１〜３の
いずれかに記載の製造法。
【請求項５】（ｄ）エンハンサーが、ＨＳ１、ＨＳ
２、ＨＳ３ｂ及びＨＳ４を含む請求項２に記載の製造
法。
【請求項６】（ａ）プロモーターがＶ_Hプロモーター
であり、（ｄ）エンハンサーが、配列番号：１及び配列
番号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を有する請求項
１〜５のいずれかに記載の製造法。
【請求項７】ＤＮＡ構築物が、ｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ
３ｂ／４である請求項５又は６に記載の製造法。
【請求項８】動物細胞が、Ｂ細胞系動物細胞である請
求項１〜７のいずれかに記載の製造法。
【請求項９】Ｂ細胞系動物細胞がプレＢリンパ球系細
胞由来である請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】請求項１〜９に記載の方法によって得
られた外来性遺伝子の変異体を、更に、該動物細胞内で
発現させて、変異体の遺伝子発現物を得る方法。
【請求項１１】外来性の遺伝子の変異体を産生するた
めのＤＮＡ構築物であって、少なくとも以下の（ａ）〜
（ｄ）を含むＤＮＡ構築物：（ａ）プロモーター、（ｂ）外来性の遺伝子、（ｃ）イ
ントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓｅＩ高感
受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含むエンハン
サー。
【請求項１２】（ｄ）エンハンサーが、さらにＨＳ１
及びＨＳ２を含む請求項１１に記載の製造法。
【請求項１３】（ｄ）エンハンサーが、少なくとも配
列番号：１または配列番号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮ
Ａ配列を有する請求項１１または１２に記載のＤＮＡ構
築物。
【請求項１４】（ａ）、（ｃ）、（ｄ）のＤＮＡ配列
が免疫グロブリンのＤＮＡ配列に由来する請求項１１〜
１３のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】（ｄ）エンハンサーが、ＨＳ１、ＨＳ
２、ＨＳ３ｂ及びＨＳ４を含む請求項１１〜１４のいず
れかに記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】（ａ）プロモーターがＶ_Hプロモータ
ーであり、（ｄ）エンハンサーが、配列番号：１及び配
列番号：２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を有する請求
項１１〜１５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１７】ＤＮＡ構築物がｐｖｅｈｃ３’ＥＨＳ
３ｂ／４であることを特徴とする請求項１１または１２
に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１８】外来性の遺伝子の変異体を産生する変
異されたＤＮＡ配列発現を達成するための（ａ）プロモーター、（ｂ）外来遺伝子挿入可能部位
（ｃ）イントロンエンハンサー、および（ｄ）ＤＮａｓ
ｅＩ高感受性領域中、ＨＳ３ｂ及び／又はＨＳ４を含む
エンハンサー、を有するベクターを含む、外来遺伝子変
異体製造法または変異体の遺伝子発現物産生用キット。
【請求項１９】（ｄ）エンハンサーが、さらにＨＳ１
及びＨＳ２を含む請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】配列番号１４の配列を有するＶ_H１
７．２．２５プロモーター。