MXPA04000066A - Procedimiento para construir un mutante. - Google Patents
Procedimiento para construir un mutante.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a un procedimiento para construir un mutante aleatorio de alta frecuencia de un gen introducido objetivo, el cual comprende transferir un vector de expresion recombinante en donde un promotor eucariotico, una secuencia de ADN introducida, un intensificador de intrones y un intensificador HS3/4 3¦ son ligados entre si en celulas animales, seguido de la expresion de los mismos.
Description
PROCEDIMIENTO PARA CONSTRUIR UN UTAMTE
CAMPO TECNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción novedoso de un muíante, el cual comprende introducir una construcción de ADN mejorada en células animales, la construcción de ADN y un equipo para producir un gen muíante o que exprese un gen mutaníe.
TECNICA ANTECEDENTE
Los seres vivos que exisíen hoy en día han evolucionado durante un largo período a través de la mutagénesis y la selección de mutantes por el medio ambiente. La evolución general tiene una velocidad muy lenta, y pasa a través de muchas generaciones para avanzar. Por otra parte, en el caso de células del sistema inmune que producen aníicuerpos, la muíagénesis y la selección por aníígenos concluyen en una generación, y la siguieníe generación no heredará la función adquirida. Se interpreta que dicha velocidad rápida de evolución en el sistema inmune, se opone a la mutación de un microorganismo patogénico dependiente del medio ambiente. El presente inventor produjo previamente ratones íransgénicos en los cuales se ¡níroducen genes de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa derivada de bacterias, y demostró que la mutación de un gen de anticuerpo es controlada por su promotor e intensificador, y la mutación de cualquier gen puede ser inducida mediante control con un promotor e intensificador de un gen de anticuerpo (Azuma, T., et al., Int. Immunology, 5(2) 121 -130 (1992)). El procedimiento de producción que se usa actualmente para un muíante, es uno de los métodos de producción de mutantes en los cuales se introduce adecuadamente una mutación por deleción, inserción y/o adición en una secuencia de ADN deseada, es decir, mutagénesis específica de sitio para reemplazar específicamente en el sitio una cierta longitud de secuencias de ADN (mutagénesis específica de sitio, Zoller, et al., Nucleic Acid Res., 10, 6487-6500 (1982); Zoiler, et al., Methods in Enzymol., 100, 468-500 (1983)). En la mutación de no apareamiento general que usa un oligonucleótido sintetizado artificialmente como iniciador, se sintetiza un oligonucleótido complementario que consiste de alrededor de 20 bases con una mutación opcional en una secuencia de bases cerca de un sitio en donde la mutación se inducirá, el oligonucleótido es hibridado con un ADN objetivo, y entonces puede producirse un ADN complementario al resto del ADN objetivo usando ADN polimerasa. De esta manera, es posible introducir una mutación deseada en un sitio deseado. Sin embargo, este método no puede inducir muchos mutantes a la vez. En los otros sistemas de mutagénesis, algunos examinan la desaparición o la manifestación de una función específica en presencia de un compuesto que daña a un gen (Myers, et al., Science, 232, 613-618 (1986)), y otros usan bacterias, etc. Sin embargo, estos métodos son fundamentalmente diferentes del anterior para inducir la mutación por el presente inventor. La variación (diversidad) en la región de Ig V de ratones y humanos, es generada por la unión combinatoria de segmentos de genes V, D y J que existen por separado en la línea germinal, la deleción y adición de nucleótidos en la unión de estos segmentos durante la unión, y la hipermutación somática de genes V-(D)-J unidos. La hipermutación somática está relacionada con la maduración de anticuerpos por afinidad, y se ha observado con frecuencia después de estimulación de antígenos dependiente de células T (TD) (Bothwell, A. L. M., et al., Cell, 24, 625 (1981 ): Gearhart, P. J., et al., Nature, 291 , 29 (1981 ): Griffiths, G. M., et al., Nature, 312, 271 (1984): Maizels, N., et al., Cell, 43, 715 (1985): Wysocki, L. T., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 1847 (1986): Cumano, A., et al., EMBO. J., 5, 2459 (1986): Berek, C, et al., Cell, 67, 1121 (1991 ): Taketani, M., et al., Mol. Immunol., 32, 983 (1995): Furukawa, K., et al., Immunity, 11 , 329 (1999): 2-10). Los elementos de acción cis que determinan la inducción de la hipermutación somática, se han identificado usando ratones transgénicos con cadena ? (?' Brien, R. L. et ai., Nature, 326, 405 (1987): Sharpe, M. J., et al., Eur. J. Immunol., 20, 1379 (1990): Sharpe, M. J., et al., EMBO J., 10, 2139 (1991 ): Betz, A. G., et al., Cell, 77, 239 (1994): Yelamos, J., et al., Nature, 376, 225 (1995): Peters, A., et al., Immunity, 4, 57 (1996): 11-16), cadena ? (Klotz, E., et al., J. Immunol., 157, 4458 (1996): 17) y cadena H (Durdik, J., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 2346 (1989): Sohn, J., et al., J. Exp. Med., 177, 493 (1993): Tumas-Brundage, K. M. y Manser, T., J. Exp. Med., 185, 239 (1997): 18-20). Como se indicó anteriormente, el presente inventor preparó ratones transgénicos que poseen el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) que es dirigido por VH17.2.25 (Loh, D. Y., et al., Cell, 33, 85 (1983): Groschedl, R. y Baltimore, D., Cell, 41 , 885 (1985): 22, 23) e intensifícador de intrones J-C (abreviado en lo sucesivo como ?µ) (Gillies, S. D., et al., Cell, 33, 715 (1983): Banerji, J., et al., Cell, 33, 729 (1983): 24, 25)/región de unión de matriz (abreviada en lo sucesivo como MAR) (Forrester, W. C, et al., Science, 265, 1221 (1994): 26). Como resultado, se detectó hipermutación somática en CAT, pero no en el promotor VH O el flanqueo de ?µ/MAR. Sin embargo, la frecuencia de mutación fue de casi un décimo de la observada en VH-D-JH endógeno, sugiriendo que estos elementos de acción cis son críticos o importantes para la inducción de hipermutación, y que otros componentes tales como Gy, C de 3' o el intensificador de flanqueo de C (intensificador 3') (Pettersson, S., et al., Nature, 344, 165 (1990): Dariavach. P., et al., Eur. J. Immunol., 21 , 1499 (1991 ): Lieberson, R., et al., EMBO. J. 14, 6229 (1995): 27-29), podrían determinar la alta hipermutación somática frecuente (Sohn, J., et al., J. Exp. Med., 177, 493 (1993): Tumas-Brundage, K. M. y Manser, T., J. Exp. Med., 185, 239 (1997): Giusti, A. M. y Manser, T., J. Exp. Med., 177, 793 (1997): 19, 20, 30).
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
Para identificar los componentes importantes para elevar la frecuencia de hipermutación en el gen de IgH, el presente inventor usó un sistema deficiente en RAG-2 (gen de activación de recombinación): sistema de complementacion de proteína-2 por reordenamiento de genes de blastocistos, desarrollado por Chen et al. (Chen, J., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 4528 (1993): 31 ). Se microinyectó una serie de construcciones transgénicas que diferían sólo en la región de flanqueo 3' en blastocistos deficientes en RAG-2, para transfectar células madre embrionarias (abreviadas en lo sucesivo como células ES). Se inmunizó a los ratones quiméricos obtenidos en este sistema, con un antígeno dependiente de células T. Como resultado, la frecuencia de hipermutación somática en VR-D-JH del transgen, reveló que la inserción de la región 3b sensible a DNasal (en lo sucesivo HS3b) y/o HS4 (Madisen, L. y Groudine, M., Genes Dev. 8, 2212 (1994): Michaelson, J. S. et al., Nucleic Acids Res., 23, 975 (1995): Arulampalam, V. et al., Immunol. Today, 18, 549 (1997): 32-34), induce hipermutación somática aleatoria. Un objetivo de la presente invención, es proveer un procedimiento de producción de un mutante aleatorio, en donde una construcción de ADN en la cual se enlazan un promotor eucarióíico modificado, una secuencia de ADN externa, un intensificador de intrones y un intensificador HS3/4 3', se introduce en una célula animal. Otro objetivo de la presente invención, es proveer un método para obtener un gen muíante expresando la construcción de ADN en una célula animal. De esta manera, para lograr la presente invención, el inventor encontró una construcción de ADN para producir dicho mutaníe, y un equipo para producir un gen muíante o para expresar el mutante. Además, un producto de expresión mutante obtenido del sistema de expresión usando células animales, significa que se ha sometido a selección para toxicidad contra células animales. La presente invención provee los ítems 1 a 20 siguientes: Item 1. Un procedimiento para la producción de un gen exógeno aleatorio mutante, en donde una construcción de ADN que comprende por lo menos los incisos (a)-(d) siguientes se introduce en una célula animal, y el gen exógeno mutante se produce en la célula animal: (a) un promotor; (b) un gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un intensificador que comprende HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNasal. Item 2. El procedimiento de producción de acuerdo al ítem 1 , en donde (d) el intensificador comprende además HS1 y HS2. Item 3. El procedimiento de producción de acuerdo al ítem 1 ó 2, en donde (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende por lo menos una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 ó 2.
Item 4. El procedimiento de producción de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 a 3, en donde las secuencias de ADN de (a), (c) y (d) se derivan de una secuencia de ADN de una inmunoglobulina. Item 5. El procedimiento de producción de acuerdo al ítem 2, en donde (d) el intensificador comprende HS1 , HS2, HS3b y HS4. Item 6. El procedimiento de producción de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 a 5, en donde: (a) el promotor es un promotor VH; y (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende secuencias de ADN de SEQ ID Nos: 1 y 2. Item 7. El procedimiento de producción de acuerdo al ítem 5 ó 6, en donde la construcción de ADN es pvehc3'EHS3b/4. Item 8. El procedimiento de producción de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 a 7, en donde la célula animal es una célula animal de la línea de células B. Item 9. El procedimiento de producción de acuerdo al ítem 8, en donde la célula animal de la línea de células B se deriva de una línea de células de pre-linfocitos B. Item 10. Un método para obtener un producto de expresión de un gen mutante expresando el gen exógeno muíante obtenido mediante el método de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 a 9 en la célula animal. Item 1 1 . Una construcción de ADN para producir un gen exógeno mutante, el cual comprende por lo menos: (a) un promotor; (b) un gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un intensificador que comprende HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNasal. Item 12. La construcción de ADN de acuerdo al ítem 11 , en donde (d) el intensificador comprende además HS1 y HS2. Item 3. La construcción de ADN de acuerdo al ítem 11 ó 12, en donde (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende por lo menos una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 ó 2. Item 14. La construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 1 a 13, en donde la secuencia de ADN de (a), (c) y (d) se deriva de una secuencia de ADN de inmunoglobulina. Item 15. La construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 1 a 14, en donde (d) el intensificador comprende HS1 , HS2, HS3b y HS4. Item 16. La construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de los ítems 1 a 15, en donde: (a) el promotor es un promotor VH; y (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende secuencias de ADN de SEQ ID NOs: 1 y 2. Item 17. La construcción de ADN de acuerdo al ítem 11 ó 12, en donde la construcción de ADN es pvehc3'EHS3b/4.
Item 18. Un equipo para el procedimiento de producción de un gen exógeno mutante, o para obtener un producto de expresión de un gen muíante, el cual comprende un vector que tiene: (a) un promotor; (b) un sitio de inserción de gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un intensificador que comprende HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNasal; para lograr la expresión de una secuencia de ADN mutada que produce un gen exógeno mutante. Item 19. El equipo de acuerdo al ítem 18, en donde (d) el intensificador comprende además HS1 y HS2. Item 20. El promotor VH17.2.25 que tiene una secuencia de SEQ
ID NO: 14. De conformidad con la presente invención, se introduce un gen exógeno en el sistema controlado por el promotor e intensificador de un gen de anticuerpo, y por lo tanto puede obtenerse un grupo de genes que tienen mutaciones frecuentes y aleatorias, y se provee un procedimiento de producción de una línea de células animales mutante en la cual se introduce ampliamente una mutación en un péptido o proteína; de esta manera, es posible tratar de mejorar y cambiar una función de una proteína de ocurrencia natural. Por ejemplo, se hace posible desarrollar nuevos tipos de antibióticos que tienen una función mejorada contra bacterias resistentes a antibióticos, agroquímicos, o péptidos farmacéuticos mejorados que tienen una mejor función tales como interferón y hormona de crecimiento. Además, mediante el uso de células animales, es posible llevar a cabo simultáneamente una selección de toxicidad en células animales, y por lo tanto puede examinarse la toxicidad primaria, y se logra la creación rápida de varios productos peptídicos que tienen una acción funcionalmente mejorada. Después en esta especificación, la representación de aminoácidos, péptidos, secuencias de bases, ácidos nucleicos y similares por abreviatura, deberá seguir la provisión de la IUPAC-IUB (IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)), "Guideline for the preparation of specification and others containing a base sequence or an amino acid sequence" (editada por la Oficina de Patentes Japonesa), así como los símbolos convencionales que se usan en la técnica. La síntesis de ADN, la producción de construcciones de ADN que contienen un gen exógeno (por ejemplo, un vector de expresión), el método de preparación de una célula hospedera transformada mediante la construcción de ADN y una proteína expresada secretada por una célula hospedera, etc., puede prepararse u obtenerse fácilmente de conformidad con las técnicas generales de ingeniería genética (Molecular Cloning 2a. ed., Cold Spring Harbor Lab. Press. (1989); Continuation of Biochemical Experiment Course, Genetic Research Method I, II and III, Japanese Biochemical Society (1986) o técnicas de recombinación genética (véase, por ejemplo, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm. 130, 692 (1985); Proc. Nati.
Acad. Sci. USA., 80, 5990 (1983)). En la presente invención, un muíante se refiere a un gen que comprende una secuencia de ADN mutada aleatoria de un gen exógeno o un producto de expresión que tiene una secuencia de aminoácidos mutada codificada por un gen mutado aleatorio. La producción del muíante en una célula animal de conformidad con la invención, puede lograrse preparando una construcción de ADN provista por la invención para inducir el muíante (ADN recombinante) que puede expresarse en una célula hospedera que contiene un gen que codifica para una proteína deseada, e introduciendo la construcción en la célula. En la especificación, "introducir una consírucción de ADN en una célula animal", significa incorporar un gen exógeno en el genoma de la célula animal. El producto de expresión del muíante se obtiene cultivando un transformarte que coníiene el muíante anterior del gen exógeno, y colectando entonces el producto del cultivo resultaníe. La construcción de ADN para inducir el muíante y provista por la preseníe invención, íiene una estrucfura que comprende por lo menos (a) un promotor, (b) un gen exógeno, (c) un iníensificador de intrones, y (d) un iníensificador que coníiene HS1 , HS2 y HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNasal, y puede producirse u obíenerse fácilmeníe medianíe íécnicas generales de ingeniería genéíica. Para la preparación de cada gen (ADN) en la invención, el gen puede derivarse de un origen adecuado, o puede sintetizarse químicamente. Específicamente, la síntesis de ADN puede ser síntesis química basada en el método de fosforamidita o el método del triéster, o puede llevarse a cabo en el sintetizador automático de oligonucleotidos disponible comercialmente. Un fragmento de doble cadena puede prepararse también a partir de un producto de cadena sencilla sintetizado químicamente sintetizando cadenas complementarias, y uniendo estas cadenas bajo condiciones adecuadas; o usando una ADN polimerasa junto con la secuencia de un iniciador adecuado para añadir una cadena complementaria. Además, cada gen puede obtenerse mediante síntesis de ADN como se describió anteriormente, o preparando una biblioteca de ADNc de acuerdo con un método ordinario a partir de un vector que contenga el gen o de un origen adecuado en el cual el gen se expresa, y seleccionando un clon deseado usando una sonda o anticuerpo adecuado específico del gen (véase Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78, 66 3 (1981 ); Science, 222, 778 (1983), etc.). Ilustrados como el origen de ADNc como se mencionó anteriormente, son varios tipos de células y tejidos en donde cada gen se expresa, células cultivadas derivadas de los mismos, y similares. Además, la separación de ARN total de estos orígenes, la separación y purificación del ARN mensajero, la preparación y clonación de ADNc, etc., pueden llevarse a cabo de acuerdo al método ordinario. Pueden usarse en esta invención bibliotecas de ADNc disponibles comercialmente, tales como la biblioteca de ADNc de Clontech Lab. Inc. Un método para seleccionar el gen a partir de la biblioteca de ADNc no es limitado, y puede llevarse a cabo de acuerdo a un método ordinario. Específicamente, puede usarse un método para inmunoseleccionar las proteínas producidas mediante el uso de ADNc usando anticuerpos específicos contra las proteínas, y seleccionando el clon de ADNc correspondiente, hibridación de placas e hibridación de colonias, con el uso de una sonda combinada selectivamente con una secuencia de ADN objetivo, una combinación de estos métodos, etc. Como la sonda usada en la presente, puede usarse en general un ADN sintetizado químicamente basado en la información de la secuencia de bases de cada gen, pero puede usarse también satisfactoriamente un gen ya obtenido de conformidad con la invención, o un fragmento del mismo. Para la selección, puede usarse como sonda un iniciador sentido o iniciador antisentido diseñado basado en la información de la secuencia de bases del gen exógeno. Una secuencia de nucleótidos parcial que corresponda a la secuencia de ADN de cada gen, se usa como la sonda mencionada anteriormente. La secuencia de nucleótidos puede contener por lo menos 15 bases en serie, de preferencia 20 bases en serie, más preferiblemente 30 bases en serie, y muy preferiblemente 50 bases en serie. En forma alternativa, puede usarse como sonda un clon positivo que contenga dicha secuencia misma. La amplificación de ADN/ARN mediante el método de PCR (Science, 230, 1350 (1985)), puede usarse de preferencia para obtener un gen. Específicamente, cuando sea difícil obtener ADNc de longitud completa a partir de la biblioteca, puede adoptarse de preferencia el método de RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc; Journal of Experimental Medicine, 12(6), 35 (1994)), especialmente el método de 5'-RACE (M. A. Frohman et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA., 8, 8998 (1988)), etc. Cuando se adopta el método de PCR, puede diseñarse el iniciador usado basado en la información de secuencias del gen, y puede sintetizarse de acuerdo a un método ordinario. El fragmento de ADN/ARN amplificado puede separarse y purificarse de acuerdo con un método ordinario como se describió anteriormente, por ejemplo, mediante electrofóresis en gel. Las secuencias de los genes o varios tipos de fragmentos de ADN obtenidos anteriormente, pueden determinarse de acuerdo a un método ordinario, por ejemplo, el procedimiento de didesoxi (Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 74, 5463 (1977)) y el método de Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)), o más fácilmente usando un equipo de secuenciación comercial, y similares.
(b) Gen exóqeno deseado En los constituyentes de la construcción de ADN descrita anteriormente, el ADN usado como (b) gen exógeno, puede ser una secuencia de ADN exógena derivada de un gen deseado, o una proteína expresada que sea una base para inducir un mutante. O bien, el ADN usado como gen exógeno puede sintetizarse. La longitud del gen exógeno usado para el presente procedimiento de producción de un muíante, puede ser en general de 4Kb o menos, de preferencia 3Kb o menos, más preferiblemente alrededor de 2Kb, pero puede usarse también una secuencia de ADN exógena que tenga una longitud mayor de 4Kb. El gen exógeno no es especialmente limitado en cuanto a que exhibe una actividad biológica cuando se expresa. Por ejemplo, pueden ilustrarse hormona de crecimiento (GH), insulina, interferón, eritropoyetina, etc. Para la verificación más fácil de la inserción del gen exógeno en el genoma de la célula hospedera, la secuencia de ADN de un gen que se usará como el denominado marcador, puede enlazarse a la secuencia de ADN del (b) gen exógeno anterior. Mediante el uso de las secuencias de bases completas o una parte de las mismas del gen exógeno obtenido de esta manera, puede detectarse con carácter específico la expresión del gen exógeno y su muíante en un individuo o varios tejidos. Dicha deíección puede llevarse a cabo de acuerdo a un método ordinario, por ejemplo, amplificación de ARN mediante RT-PCR (transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa; E. S. Kawasaki, et al., Amplificaron of RNA, en PCR Protocol, A Guide to meíhods and applicaíions, Academic Press, Inc., San Diego, 21 -27 (1991 )), análisis Northern Bloífing (Molecular Cloning, Coid Spring Harbor Lab. (1989)), deíección a nivel celular usando RT-PCR in situ (Nucí. Acids Res., 21 , 3159-3166 (1993)) e hibridación in situ, método de NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico, Nature, 350, 91-92 (1991 )), y varios otros métodos. Se ilustra de preferencia la detección mediante RT-PCR. El fragmento de ADN del gen exógeno se provee en forma de un fragmento de restricción desdoblado con una enzima de restricción adecuada, es decir, (b) gen exógeno de la construcción de ADN.
(a) Promotor Ejemplos del (a) promotor usado como constituyente de la construcción de ADN mencionada anteriormente, incluyen un promotor de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (promotor VH), un promotor derivado de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de adenovirus, un promotor de citomegalovirus, un promotor derivado de virus tales como virus del polioma o virus de hepatitis B, un promotor de metalotioneína, un promotor de proteína de choque térmico, un promotor de SR , otros promotores eficaces para las células de mamífero, etc. El promotor VH, específicamente el promotor VH17.2.25 (Gillies, S. D., et al., Cell, 33, 715 (1983): Benerji, J. et al., Cell, 33, 729 (1983)), se usa de preferencia en esta invención. Los promotores anteriores pueden incluir, por ejemplo, un promotor que puede inducir un gen de resistencia a neomicina o un gen de resistencia a tetramicina.
Los promotores anteriores pueden estar en forma enlazada de dos o más. Estas varias secuencias de ADN de los promotores anteriores se conocen, y la información de los mismos está disponible.
(c) Intensificador de intrones Un intensificador de intrones es una secuencia de ADN que puede ajusfar la transcripción, y contiene la secuencia o región no expresada interpuesta entre los exones del gen JH y gen ?µ de cadena pesada. El intensificador de cadena pesada (intensificador de ?µ) y el intensificador de cadena kappa (intensificador de ) de inmunoglobulina, pueden ilustrarse como (c) intensificador de intrones.
(d) Región sensible a desoxirribonucleasa l (DNasaO Una región sensible a DNasal, es una región que sufre fragmentación cuando el núcleo de una célula aislada se trata con una baja concentración de DNasal. En el caso del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina, se conocen HS1 , HS2, HS3b y HS4. HS3b/4 es HS3b y HS4, o cualquiera de los mismos. Esta invención se caracteriza porque están contenidas la región HS3b y/o la región HS4. En una modalidad preferida, se incluyen HS1 y HS2 (éstas referidas como 3?) además de HS3b y/o HS4. Ilustrada como 3'EHS3b/4, es una secuencia sin secuencias de intrones, que comprende el fragmento Xbal (4.0 kb) del intensificador 3' descrito por Lieberson, R. et al. (EMBO. J., 14, 6229 (1995)) y HS3 (1 182 pb) y HS4 (1381 pb) de P , descrito por Madisen, L. et al. (Genes Dev., 8, 2212 (1994)).
Conexión de cada gen (preparación de la construcción de ADN) La construcción de ADN de la invención puede prepararse, por ejemplo, insertando cada uno de los genes descritos anteriormente en un vector de expresión adecuado, de acuerdo a un método ordinario, por ejemplo, insertando cada elemento en un vector que tenga un gen adecuado de resistencia a antibióticos. Específicamente, la construcción de ADN puede construirse insertando el promotor, el gen exógeno, el intensificador de intrones, la región sensible a DNasal (incluyendo secuencias de ADN de HS3b y/o HS4 y, si es necesario, incluyendo además un intensificador que comprenda 3?), los cuales se eliminan de un vector de clonación, un ADN genómico o un plásmido, mediante una enzima de restricción opcional, o se sintetizan en un vector usado para líneas de células animales que tengan un gen opcional de resistencia a antibióticos. Específicamente, la inserción puede llevarse a cabo de acuerdo a un método ordinario usando una enzima de restricción, ligasa, etc. En el vector de expresión recombinante deseado, un intensificador de intrones y un intensificador 3'EHS3b/4 pueden construirse en la misma dirección del extremo 5' al extremo 3', en la misma dirección del extremo 3' al extremo 5', o en las direcciones opuestas, del extremo 5' al extremo 3', y del extremo 3' al extremo 5'.
En la construcción de ADN anterior, el intervalo entre el promotor y el intensificador 3'EHS3b/4 que intervienen en un ADN exógeno, puede ser de 0.1 Kb a 100 Kb, de preferencia de 1 Kb a 10 Kb, más preferiblemente de 2 Kb a 5 Kb. Un ejemplo de vector de expresión preferible, es el vector de retrovirus. Más específicamente, puede ilustrarse pIND (Invitrogen), pcDNA3.1/His (Invitrogen), pEGFP-N, pEGFP-C (Clontech), etc. Un ejemplo de la construcción de ADN que contiene (a) un promotor y (c) un intensificador de intrones, es un vector de expresión que contiene al promotor VH e intensificador de intrones de acuerdo al presente inventor y otros (Azuma, T. et al., Int. Immunology, 5 (2) 121-130 (1993)). Se usa de preferencia para preparar la construcción de ADN. En el vector de expresión anterior que contiene un promotor y un intensificador de intrones, el promotor es posicionado hacia el extremo 5' del gen exógeno inducido ordinariamente, y el gen exógeno y un intensificador de intrones, siguen este orden. Cuando el vector anterior para preparar la presente construcción de ADN que contiene un gen exógeno es modificado para contener un promotor, un sitio de clonación para la inserción del gen exógeno deseado, uno o más intensificadores necesarios para inducir la mutación (especialmente el intensificador de inmunoglobulina, así como ei intensificador de intrones) y una región sensible a DNasal, es eficaz como una construcción de ADN en un procedimiento de producción de un gen exógeno muíante, o en un equipo para obtener un producto de. expresión del gen muíante. La presente construcción de ADN puede ser un ADN circular o un ADN lineal. La verificación de si la presente construcción de ADN se logra, puede llevarse a cabo mediante un método ordinario, por ejemplo, desdoblando la construcción con una enzima de restricción, sometiéndola a electrofóresis, o combinando PCR, hibridación Southern y secuenciación, etc.
Procedimiento para la producción de un mutante En un procedimiento para la producción de un gen exógeno, en primer término, la construcción de ADN que resulta del método anterior se introduce en una célula hospedera adecuada para obtener un recombinante homólogo. Ejemplos de la célula hospedera incluyen organismos eucarióticos que comprenden células de mamífero, levadura, planta, y similares, pero se prefieren células animales de mamífero. Usadas de preferencia como dichas células, son líneas de células establecidas que serán transformadas junto con un determinante que puede hacer que la mutación sea más eficaz, células COS de mono (Cell, 23, 175 (1981 )), oocito de hámster chino, células HeLa, fibroblastos Ratll, células epiteliales del canal alimentario, y sus productos defectuosos en dihidrofolato reductasa (Proc. Nati. Acad. Sci., USA. 77: 4216 (1980)). En el caso de una línea de células establecida se prefiere usar, pero no está limitada a, por ejemplo, células animales de la línea de células B o células T, especialmente células animales de la línea de pre-células B, más específicamente células J558 y células J558L. En el caso de células de levadura, se usan células de levadura que pertenezcan al género Saccharomyces, etc. Además, células del cuerpo vivo de un animal pueden usarse también como células hospederas. Como resultado de Introducir un gen exógeno en el genoma de una célula hospedera, puede obtenerse un transformante transformado mediante la construcción de ADN de la presente invención. Dicha introducción de la presente construcción de ADN en una célula, puede llevarse a cabo de acuerdo a varios métodos conocidos en la técnica de introducción de ADN en una célula, por ejemplo, método de electroporación, método de co-precipitación con fosfato de calcio, método de liposomas, método de DEAE dextrán, método de microinyección, transducción por virus, etc. Se usa de preferencia ei método de electroporación. Ejemplos de las células en las cuales la presente construcción de ADN se introduce, son óvulo fecundado, embrión, células germinales, y similares. La introducción en las células puede llevarse a cabo de acuerdo a un método ordinario. Si se obtiene o no un muíante, puede verificarse mediante un método conocido, por ejemplo, mediante el método de secuencias aleatorias, o determinando la actividad del producto expresado por un gen exógeno, y seleccionando el producto cuya actividad sea diferente de la actividad en el gen exógeno. En forma alternativa, puede seleccionarse con base en la actividad normal y su grado, o con base en si la actividad es alta o baja. La forma aislada de la célula misma que contiene un gen mutado aleatorio transformado con el ADN exogeno objetivo, puede consistir en péptidos mejorados que tengan una mejor función relacionada con el gen exogeno humano. Por lo tanto, puede usarse como un agente farmacéutico para mejorar el estado de enfermedad, y como un sistema modelo para el estudio terapéutico. El transformante resultante puede cultivarse de acuerdo a un método ordinario. Como resultado del cultivo, la proteína objetivo de la invención codificada por un muíante de gen exogeno se expresa y produce (se acumula, se secreta) intracelularmente, extracelularmente, o sobre la membrana celular del transformante. Varios cultivos comunes pueden seleccionarse adecuadamente, dependiendo de las células hospederas adoptadas, y pueden usarse para el cultivo, y el cultivo puede realizarse bajo la condición adecuada para el crecimiento de la célula hospedera. La proteína recombinante de la invención obtenida de esta manera puede separarse y purificarse si se desea, mediante varios procedimientos de separación, usando propiedades físicas o químicas de la proteína recombinante (véase, por ejemplo, Biochemistry Data Book II, 1175-1259, primera edición, artículo 1 , publicado por Tokyo agaku Dojin (Jun 23, 1980); Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.).
Ilustrados específicamente como el procedimiento anterior, son procesamiento de reconstitución común, procesamiento mediante precipitante de proteínas (método de salificación), separación centrifuga, método de choque osmótico, ultrasonicación, ultrafiltración, cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, varias cromatografías de líquidos tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR), diálisis, y una combinación de los mismos. Por ejemplo, se prefiere particularmente la cromatografía de afinidad usando una columna unida con anticuerpos específicos de la proteína de la invención. De esta manera, el presente vector de expresión recombinante se expresa en una célula animal para dar un ADN exógeno, dando como resultado mutantes aleatorios codificados por dicho ADN. La frecuencia de los mutantes aleatorios mediante el uso del vector de expresión recombinante de la invención, es de por lo menos de alrededor de 1 x 10"4 a aproximadamente 1 x 10"3/pb/generación. La presente invención provee un procedimiento para la producción de un muíante, el cual comprende un eucarionte, especialmente una célula animal que contiene al vector recombinante anterior, que tiene un sitio insertable de un ADN exógeno o un gen exógeno, para lograr la expresión de una secuencia de ADN introducida o un gen muíante. De conformidad con el presente procedimiento para la producción de un muíante, puede mejorarse un péptido que tenga una actividad antimicrobiana, pero no disponible debido a su toxicidad para células animales, para proveer un péptido antimicrobiano que tenga toxicidad reducida a células animales y mayor actividad antimicrobiana. En forma similar, es posible hacer un Intento por mejorar o cambiar las funciones de proteínas tales como interferon de ocurrencia natural, hormona de crecimiento, y similares. Por lo tanto, puede proveerse un método útil para desarrollar agroquímicos o para mejorar la función de agentes farmacéuticos, o similares. Además, la presente invención provee un equipo para un procedimiento de producción de un gen exógeno muíante, o para producir un producto de expresión del gen muíante, el cual comprende una construcción de ADN que íiene un siíio insertable de un ADN exógeno o un gen exógeno. Específicamenie, la consírucción de ADN comprende: (a) un promotor; (b) un siíio de inserción de gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un iníensificador que comprende HS3b y/o HS4, si es necesario, además HS1 y HS2, en una región sensible a DNasal. De conformidad con el preseníe equipo para producir un muíanle, puede proveerse un pépíido aníimicrobiano mejorado con toxicidad reducida para células animales y mayor actividad antimicrobiana, y proteínas farmacéuticas con funciones mejoradas tales como interferon de ocurrencia natural, hormona de crecimiento, y similares.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1A muestra una vista esquemática de ia construcción transgénica muíante de IgH usada para generar ratones quiméricos. En la figura 1 B, las posiciones y direcciones de los iniciadores que se usan para amplificar el ADNc, se muestran mediante flechas. La figura 2 indica la producción de anticuerpos anti-NP que producen ?µ de humano a partir de células J558L transfectadas con los genes mutantes de IgH mostrados en la figura 1. Los sobrenadantes de células J558L transfectadas (1 X 106 células/ml) cultivadas durante 12 horas, se sometieron a ELISA usando placas revestidas con NP9-BSA para calcular la producción de anticuerpos. La figura 3A muestra una reconstitución de sistemas inmunes de ratones RAG-2_ " por células ES de ratones quiméricos A4-3, 2-1 y 2-3. Se midieron los niveles de IgM de ratón en ratones pre-inmunes mediante ELISA usando placas revestidas con anticuerpo monoclonal de IgM anti-ratón de rata, y anticuerpo de IgM anti-ratón de cabra marcado con POD. La figura 3B muestra una medición de los niveles de IgM de humano en sueros pre-inmunes o inmunes usando placas revestidas con anticuerpo de IgM anti-humano de ratón y anticuerpo de IgM de cabra marcado con POD. Los sueros inmunes se indican como TD. Se usaron antisueros de ratones Balb/c y ratones RAG-2"/_ como controles en A, y se usó un sobrenadante de cultivo de J558L además de estos sueros como controles en B. La figura 3C muestra un análisis de las uniones de anticuerpos anti-NP a placas revestidas con anticuerpo anti NPg-BSA. Los anticuerpos unidos se detectaron usando IgG anti-ratón marcada con POD. La figura 3D muestra las relaciones de unión de antisueros de ratones quiméricos a placas revestidas con NP BSA o NP12-BSA. La figura 4 muestra una amplificación específica de transgenes mediante RT-PCR. Se amplificó mediante PCR, ADNc preparado a partir de ARN mensajero de células lgM-B220+ de bazo de los ratones quiméricos inmunizados con NP3 -CGG. Sólo los ratones quiméricos dieron bandas que correspondían a los transgenes (campos 1-6), y los ratones C57BL/6 no dieron esas bandas (campo 7). Los transfectantes (campo 8) y no transfectantes (campo 9) de células J558L, se muestran también como controles positivos o negativos. La figura 5 muestra una comparación de la distribución y frecuencia de hipermutación somática en construcciones transgénicas a partir de células IgM-B220+ de bazo (A) y células B1 peritoneales (B). La distribución y frecuencia de hipermutación somática en construcciones transgénicas de dos ratones quiméricos, se muestran por separado en A. La escala del fondo indica la posición de aminoácidos enumerados de acuerdo al método de Kabat et al.
MEJOR FORMA DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
Se dan a continuación ejemplos para ilustrar en más detalle la presente invención, pero no se pretende que limiten el alcance de la misma.
EJEMPLO 1
1 ) Construcción transqénicas de IqH Se construyó la cadena H de Ig (IgH) que posee a ?µ de humano con diferentes regiones de flanqueo 3'.
Adquisición del fragmento que contiene al promotor VH y el fragmento que contiene a ?µ/MAR Se clonó mediante PCR un fragmento que contenía al promotor VH1 7.2.25 (0.55 kb: SEQ. ID No. 14) con enzimas de restricción Kpnl y sitios Apal y otro fragmento que contenía a ?µ/MAR (1 kb) con enzimas de restricción Xhol y sitios Salí, a partir de la construcción [plásmido que tiene al gen de cloranfenícol acetiltransferasa (CAT) controlado por el promotor VH derivado de VH17.2.25 y por el intensificador de intrones (intensificador de intrones J-C/región de unión a matriz (abreviada como ?µ/MAR)) entre las enzimas de restricción Xbal y los sitios Xhol de pBluescript SK(+)], el cual el presente inventor preparó previamente para generar ratones transgénicos de CAT (Azuma, T., et al. , Int. Immunology, 5(2) 1 21 -1 30 (1993)).
Adquisición del fragmento del gen de VH-D-JH Se clonó también mediante PCR el fragmento del gen de VH-D-JH reordenado (2.0 kb) que contenía enzimas de restricción Apal y sitios Xhol, usando un ADN genómico de A6, un hibridoma que produce anticuerpos monoclonaies de anti-(4-hidroxi-3-nitrofenil)acet¡lo (referidos en lo sucesivo como anticuerpos monoclonaies anti-NP), que se obtiene de ratones C57BL/6 (Tokyo Animal Center) (Taketani, M., et al., Mol. Immunity, 32, 983 (1995): Furukawa, K., et al., Immunity, 1 1 , 329 (1999)). Se clonaron éstos en Bluescript II SK (de Stratagene) siguiendo el orden promotor VH, gen de VH-D-Jh y ?µ?/MAR.
Adquisición del gen ?µ de humano Se obtuvo un fragmento Xbal de 6.9 kb del gen ?µ de humano, a partir de un clon de fagos, CH. H. lgpi-24 (Takahashi, N., et al., Nucleic Acids Res., 8, 5983 (1980); Health Science Research Resources Bank).
Adquisición del intensificador 3' Se obtuvo un plásmido (Lieberson, R., et al., EMBO. J, 14, 6229 (1995)) que contenía al fragmento Xbal (4.0 kb) del intensificador 3' (abreviado en lo sucesivo como 3?) de los Drs. J. Manis y F. Alt (Harvard Medical School). Se clonaron mediante PCR, fragmentos que contenían HS3b (1.2 kb) indicados como SEQ. ID No. 1 y HS4 (1 .4 kb) indicados como SEQ. ID No. 2, usando iniciadores indicados como SEQ ID Nos. 3 a 6 y ADN genómico de un linfoma de células B, MPC1 1 (Madisen, L. y Groudine, M., Genes Dev. 8, 2212 (1994)). En cada secuencia de iniciador, se subraya el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Spel o Xbal. SEQ ID No. 3: HS3-S: 5'-TCTAGAACCACATGCGATCTAAGGGATATTGGGG-3' SEQ ID No. 4: HS3-anti Spel: 5'-CAG G ACTAGTG ATC ATTG AG CTC CG G CTCTAAC-3 ' SEQ ID No 5: HS4-S Xbal: 5'-CTAGTCTAGACTGCAGACTCACTGTTCACCATG-3' SEQ ID No. 6: HS4-anti Spel: 5'- GTGG ACTAGTAAG CTTGG AGTTAG GTG G GTAG G-3' Se enlazaron estos fragmentos ai extremo 3' de 3?, siguiendo el orden de HS3b y HS4. Se enlazaron en tándem 3?, HS3b y HS4 sin secuencia de ¡ntrones de Ig intermedia insertada alguna. Mediante el uso de cada fragmento anterior, se obtuvieron tres tipos de construcciones, pvehcA3'E (12 kpb), pvehc3'E (16 kpb) y pvehc3'EHS3b/4 (19 kpb) mediante técnicas de recombinación genética.
2) Características estructurales de los transqenes Las construcciones transgénicas obtenidas en esta invención, contienen la región V codificada por VH186.2 de ratón, un VH dominante que interviene en la respuesta a haptenos de (4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo (Bothwell, A. L. M., et al., Celí, 24, 625 (1981 )).
El gen de VH186.2-DFL 6.1 -JH2 de ratón reordenado a partir de A6, un hibridoma que produce anticuerpos monocíonales contra (4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo (Taketani, M., et al., Mol. Immunity, 32, 983 (1995): Furukawa, K., et al., Immunity, 1 1 , 329 (1999)), fue enlazado a ?µ de humano, facilitando de esta manera una descriminación entre el transgen codificado y la cadena H endógena de ratón. Además, puesto que la expresión de los transgenes sobre la superficie de células B podría cambiar el desarrollo de la célula B, se removió el exón de transmembrana de ?µ para prevenir la expresión de los transgenes sobre la superficie celular. Los transgenes contenían sólo ?µ, pero no regiones génicas que codificaran para otros ¡sotipos de la cadena H. Los tres tipos de construcciones transgénicas contenían al promotor VH y ?µ/MAR de intrones J-?µ de ratón como elementos de acción cis, los cuales se habían usado para construcciones transgénicas de CAT (Azuma, T., et al., Int. Immunol, 5, 121 (1993)). Por lo tanto, las diferencias en la estructura de los transgenes se restringieron a la región de flanqueo 3' (figura 1 ). Una de las construcciones, pvehcA3'E, careció de ia región de intensificador 3', y fue dirigida por el promotor VH y ?µ/MAR. Otra construcción, pvehc3'E, contenía al intensificador 3' (Lieberson, R., et al., EMBO. J., 14, 6229 (1995)) además del promotor VH y ?µ?/MAR. Se usó el fragmento BamHI (4.0 kb) de la enzima de restricción que contenía al intensificador 3' (3?), para la construcción del gen. La adición de HS3b y HS4 a pvehc3'E, dio lugar a una construcción referida como pvehc3'EHS3b/4. Los genes endógenos de IgH contenían un elemento de acción cis adicional, referido como HS3a (Matthias, P. y Baltimore, D., Mol. Cell. Biol., 13, 1547 (1993)), el cual tiene secuencias de nucleotidos idénticas a las de HS3b, pero estaba en forma invertida (Arulampalam, V. et al., Immunol. Today, 18, 549 (1997)). Las construcciones transgénicas de la presente invención, no contenían este elemento de acción cis.
EJEMPLO 2
1 ) Transfección de genes mutantes de IgH (Lundblad, A. et al. Immunochemistrv 9. 535-544 (1972)) en células J558L. y producción de anticuerpos Para calcular la actividad de transcripción de estas tres construcciones, las construcciones fueron transfectadas en una línea de células de plasmacitoma de ratón, células J558L. Se sometieron a electroporación construcciones linealizadas del gen de IgH (10 µg) que tenían un sitio de reconocimiento Notl de enzima de restricción (Sahagaw, B. G. et al. 1986, J. Immunol., 137; 1066-1074) en células J558L, junto con un plásmido pSV2-gpt (1.6 ^ig) (Mulligan, R. C. y Berg P., Science 209; 1422-1427 (1980)). Las condiciones específicas de la electroporación, son las siguientes. Instrumento: pulsador de genes (BIO-RAD Laboratories). Condiciones:
Regulador de pH: PBS. Células: J558L, 2 X 107 células/ml en 0.5 mi de PBS. ADN linearizado: transgen de IgH (10 ^ig) y pSV2-gpt (1.6
µ9). Condiciones de reacción: capacitancia (960 ^iF), voltaje
(350V). Las células transfectadas se cultivaron a 37°C en presencia de C02 (5%) y una mezcla de hipoxantina, xantina y ácido micofenólico (Sigma). Se llevó a cabo dilución limitativa de transformantes de un gen de IgH resistente a fármacos, y se seleccionaron clones con base en la producción de anticuerpos. Específicamente, la producción de anticuerpos quiméricos anti-NP se midió mediante ELISA (figura 2). Para el análisis cuantitativo de la producción de anticuerpos, algunos clones de transformantes inducidos de cada construcción transgénica se cultivaron durante 12 horas en una placa de fondo plano de 96 cavidades con medio del RPMI 1640 (volumen total: 200 µ?; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) que contenía suero de bovino fetal (FCS) a 10%, a la concentración de 2 X 106 células/ml. El sobrenadante de cultivo diluido a varias concentraciones con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) que contenía 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino (BSA), se analizó mediante ELISA usando una placa de pollvinilo revestida con NPg-BSA. Para detectar los anticuerpos unidos, se usó anticuerpo de cadena ?? anti-ratón marcado con peroxidasa (POD) (Southern Biotech) o anticuerpo de cadena µ anti-humano (ZYMED).
Los resultados se muestran en la figura 2. Se diseñaron construcciones transgénicas que codificaran para cadenas H quiméricas que poseían la región VH de un anticuerpo monoclonal anti-NP de ratón y la región C de Ig de humano, las cuales se esperó se ensamblaran con las cadenas ?? de ratón y dieran lugar a anticuerpos quiméricos anti-NP. Todas las construcciones fueron transfectadas activamente en células J558L, y produjeron anticuerpos anti-NP mediante apareamiento con cadenas ?? endógenas. Entre estas construcciones, pvehcA3'E mostró una producción más bien más débil, en comparación con las otras. La adición de 3? (pvehc3'E), dio como resultado un incremento significante en la producción de anticuerpos; sin embargo, una mayor adición de HS3b y HS4 no pareció tener efecto alguno sobre la producción de anticuerpos. Aunque había poca información relacionada con la dependencia de la transcripción respecto al número de copias de cada ADN transfectado, el inventor supuso que la cantidad de producción de anticuerpos reflejó la actividad de transcripción de las construcciones, la cual no varió significativamente entre pvehc3'E y pvehc3'EHS3b/4.
EJEMPLO 3
1 ) Generación de ratones quiméricos Para generar ratones quiméricos, el presente inventor usó por lo menos dos clones de células ES transfectadas independientes para la microinyección en blastocistos de ratones RAG-2"A. El inventor usó también por lo menos dos ratones quiméricos/construcciones transgénicas para el análisis de hipermutación somática. Las líneas de células ES transfectadas y los ratones quiméricos usados en este experimento, se muestran en el cuadro 1 más adelante. El fragmento EcoRI de pGKneo (1.5 kb, 1 ^tg), y los tres tipos de construcciones transgénicas de IgH de cadena lineal (30 ?) de la misma forma como en el ejemplo 2, se sometieron a electrofóresís en 1 X 107 de células E14-1 (Kuhn, R. et al., Science, 254, 707 (1991 )) usando un pulsador de genes de Bio-Rad. Las células transfectadas se seleccionaron entonces con G418 (150 Gibco). Las colonias seleccionadas se seleccionaron mediante PCR usando dos iniciadores indicados como SEQ. ID Nos. 7 y 8 que pueden hibridar con secuencias de ADN localizadas en el promotor VH17.2.25 y JH2, y Southern blotting usando el gen C-µ de humano, como sonda, respectivamente. SEQ. ID No. 7: 5'-GACTCAGGAGGACTCTAGTT-3' SEQ. ID No. 8: 5'-GGTGTCCCTAGTCCTTCATG-3'.
Se llevó a cabo amplificación de PCR durante 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto. Se calculó que el número de copias del pvehc3'E integrado, es de 2 a 3 mediante Southern blotting. Se calculó el número de copias de otros transgenes, pvehcA3'E y pvehc3'EHS3b/4, mediante el análisis de PCR, usando ADN de células ES transfectadas con pvehc3'E como patrón.
2) Producción de anticuerpos por ratones quiméricos Se inyectó a clones de células ES que contenían al transgen de IgH en blastocistos de ratones RAG-2"'" (Takahashi, N. et al., Nucleic Acids Res., 8, 5983 (1980)), y se transplantaron en el útero de madres adoptivas de ICR (8 a 12 semanas, CLEA Japan Inc.). La complementaridad del sistema inmune por células T y células B originadas de células ES en ratones quiméricos, se puso a prueba mediante citometría de flujo después de teñir las células con anticuerpo anti-CD3 de PE o anti-B220/SA-FITC de biotina. Se usó anticuerpo de cadena µ anti-ratón de oveja marcado con POD para la detección de los anticuerpos unidos. Para analizar los anticuerpos que tienen ?µ de humano, se revistieron placas con anticuerpo de IgM anti-humano de oveja (Southern Bíotech), y se usó anticuerpo monoclonai de IgM anti-humano marcado con POD (ZYMED) para detectar los anticuerpos unidos. El sobrenadante de cultivo del transformante J558L, IgM de Waldenstrom de humano, y anticuerpo monoclonai de IgM anti-NP B4-3, se usaron como anticuerpos control.
CUADRO 1 Células ES y ratones quiméricos usados
Se realizó una retrocruza con ratones C57BL/6 para examinar la transmisión germinal del transgen, y se extrajo el ADN de la cola del ratón resultante para analizar la generación de ratones quiméricos, con base en si el transgen estaba contenido o no.
3) Sistema inmune y producción de anticuerpos Para examinar si el sistema inmune fue reconstituido con los linfocitos derivados de las células ES, se midieron mediante ELISA las cantidades de IgM en ios sueros pre-inmunes de ratones quiméricos A4-3, 2-1 y 2-3. Los resultados se muestran en la figura 3A. Sin importar el tipo de transgen, las cantidades detectadas de IgM de ratón en todos los sueros de estos ratones fueron similares, pero menores que en un ratón BALB/c normal. Después, se prepararon NP34-globulina ? de pollo (NP34-CGG) y NP-BSA que tenía un diferente valor de NP, de la misma forma como en
Azuma et al., (Azuma, T. et al., Molec. Immunol., 24, 287 (1987)). Se administró CFA (adyuvante completo de Freund: Difco, 100 ng/ratón) que incluía (4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo-globulina ? de pollo (referida en lo sucesivo como NP34-CGG) a los ratones quiméricos, y se administró la misma cantidad de molécula inmune adicional usando IFA (adyuvante incompleto de Freund). Tres días después de la administración final de PBS incluyendo NP34-CGG, se colectaron antisueros de los ratones inmunizados.
Se sacrificó entonces a los ratones, y se obtuvieron muestras de tejido. Se usaron placas revestidas con NP BSA o NP16-BSA para medir la producción de anticuerpos anti-NP y la maduración de estos anticuerpos por afinidad. Se usó IgG anti-ratón de oveja marcada con POD
(ZYMED) para detectar los anticuerpos. Se usó anticuerpo monoclonal anti-NP, F8, como control para un anticuerpo inmaduro, y C6 como control para un anticuerpo monoclonal maduro (Taketani, M. et al., Mol. Immunol. 32, 983 (1995); Furukawa, K., et al., Immunity, 11 , 329 (1999)). Los resultados se muestran en la figura 3B. No se detectó el anticuerpo que expresa a C-µ de humano codificado por los transgenes en los antisueros pre-inmunes o inmunes de los ratones inmunizados con 34- CGG. Se prepararon hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-NP (?1 ?1 ) a partir de ratones con pvehc3'EHS3b/4 inmunizados con NP34-CGG. Ninguno de estos anticuerpos secretados expresó ?µ de humano; sin embargo, algunos de ellos sintetizaron la cadena H intracelular que tiene C^i de humano. Los resultados sugieren que los transgenes fueron transcritos y traducidos en las células B de ratones quiméricos. Sin embargo, el nivel de productos de cadena H secretados, fue menor que el nivel detectable. Después, se examinó mediante ELISA la reacción de anticuerpos de ratones quiméricos contra el antígeno de TD NP34-CGG. Los resultados se muestran en la figura 3C. El valor de anticuerpos cambió, pero todos los ratones produjeron anticuerpos anti-lgG, indicando que los sistemas inmunes responden a la producción de anticuerpos anti-NP. Además, la relación de unión de estos anticuerpos a NP-pBSA, que se relaciona con la unión a NP-ie-BSA, se examinó como la medición de la maduración por afinidad. Los resultados se muestran en la figura 3D. Como se muestra en la figura 3D, un anticuerpo monoclonal control F8 no mostró hipermutación somática, y tuvo una constante, de asociación (Ka) de 2 x 105/M con NP-Cap, y la relación fue de 0.29. Por otra parte, el anticuerpo monoclonal de C6 bien madurado que tenía 2 x 107/M de Ka (Furukawa, K. et al., Immunity, 1 1 , 329 (1999)), tuvo una relación de aproximadamente 1. Todos los sueros de los ratones quiméricos mostraron relaciones similares a las de C6; por lo tanto, la maduración por afinidad de los anticuerpos anti-NP avanzó al grado similar en todos los ratones quiméricos después de ser inmunizados con NP34-CGG.
EJEMPLO 4 Clonación y secuenciación del cien de VH
Aunque se reconstituyó el sistema inmune en los ratones quiméricos, fue más bien difícil obtener una cantidad suficiente de células PNAh1lgG+B, las cuales son populares como células del centro germinal derivadas de un ratón quimérico individual. Por consiguiente, después de la inmunización con NP34-CGG, células lgM"B220+ de bazo, las cuales se espera seleccionan células B de memoria por cambio de isotipos, XX, fueron seleccionadas mediante citometría de flujo usando un FACS Vantage. La suspensión de células individuales de bazo de ratones quiméricos inmunizados con NP34-CGG, se trató con 0.83% de cloruro de amonio para inducir hemolisis. En algunos experimentos, las células T se trataron también con anticuerpo anti-Thyl (T24/40 y H013.4) para inducir hemolisis,- y se trataron entonces con un complemento de conejo. Las células se tiñe.ron con anti-CD45R/B220 marcado con ficoeritrina (PE) (molécula de superficie celular, pherMingen) o IgM anti-ratón marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (ZYMED). Las células peritoneales se tiñeron con anti-CD5 marcado con biotina/estreptavidina marcada con FITC (pherMingen) y anti-CD45R (B220) marcado con PE. Las células CD45R(B220)+igM", CD45R(B220)+lgM+ o CD5+CD45R(B220)+ se fraccionaron mediante citometría de flujo en un seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS) Vantage (Becton, Dickinson and Company). Además, como experimento control, se obtuvieron células CD4+ y/o células CD8+ del timo después de tinción y selección. Se preparó ARN total de células de bazo o peritoneales fraccionadas mediante la citometría anterior, usando TRIzol (reactivo de preparación de ARN, GIBCO BRL) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se preparó el ADNc a partir del ARN total usando oligo(dT) como iniciador, y transcriptasa inversa Superscript II (GIBCO BRL). Cada una de las muestras de ADNc se amplificó mediante PCR usando el iniciador de VH186.2 de SEQ. ID No. 1 1 y el iniciador de C^i de humano de SEQ. ID No. 0 para los transgenes; e iniciador de VH186.2 de SEQ. ID No. 9 e iniciador de Cy1 de ratón de SEQ. ID No. 11 para genes endógenos de Ig de ratón, respectivamente. SEQ. ID No. 9: 5'-CATG CTCTTCTTG G C AG CAAC-3' SEQ. ID No. 10: 5'-GCAGCCAACGGCCACGCTGC-3' SEQ. ID No. 1 1 : 5'-GGCCGAATTCCATGGAGTTAGTTTGGG-3'. La reacción de PCR se llevó a cabo bajo las condiciones de 95°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto durante 30 ciclos. Los productos de PCR de los transgenes y genes endógenos de IgH de ratón, se analizaron mediante electrofóresis en gel de agarosa, o fueron ligados en pCR-2.1 (Invitrogen Corporation), usando equipo de clonación de TA (Invitrogen Corporation), y fueron secuenciados usando el iniciador M13 mostrado como SEQ. ID No. 12 (-20, Takara Bio Inc.), iniciador inverso 13 mostrado como SEQ. ID No. 13 (Takara Bio Inc.) y secuenciador de ADN modelo 5500 de Hitachi (Hitachi, Ltd.). Como se muestra en la figura 4, se identificó la expresión de los fragmentos de anticuerpo incluyendo los transgenes.
2) Hipermutación somática de transgenes en células B de bazo o peritoneales Se calculó la frecuencia de mutación, dividiendo el total de mutaciones entre el total de bases determinadas por secuencia. Los resultados se muestran en el cuadro 2.
CUADRO 2 Mutaciones en las secuencias de la región V de células B IqM* de bazo de ratones quiméricos
a Por ciento de mutaciones en CDR = 100 x (número total de mutaciones puntuales en CDR) / (número total de mutaciones puntuales).
b Frecuencia de mutación = 100 x (número total de mutaciones puntuales) / (número total de pares de bases). 0 Se analizaron dos ratones quiméricos. Para la hipermutación somática en transgenes, se usaron iniciadores para hibridación con VH186.2 o ?µ de humano. Se llevó a cabo clonación y secuenciación del ADNc preparado mediante RT-PCR. Los resultados se muestran en el cuadro 3. La distribución y frecuencia de hipermutación somática entre las construcciones transgénicas en células B de bazo, se muestran en la figura 5. Se observó amplificación específica de los transgenes debida al uso combinado de los iniciadores, sólo en las células de bazo de los ratones quiméricos, pero no en los ratones C57BL/6 inmunizados con NP34-CGG. Además, se observó que todas las secuencias tienen una diversidad de unión idéntica en CDR3 que es característica del ADN de A6 usado para construir los transgenes. Como para la construcción de genes de pvehA3'E, se observaron cambios de nucleótidos que resultan de hipermutación somática en VH186.2-DFL16.1-JH2, pero la frecuencia fue baja. Se calculó que la frecuencia de mutación es de 0.17% (véase cuadro 2). La construcción de genes pvehc3'E mostró una distribución esencialmente similar de hipermutación, aunque la frecuencia aumentó ligeramente en comparación con la de pvehcA3'E (véase cuadro 2). En el caso de pvehc3'EHS3b/4, en donde HS3b/4 se añade además a la construcción de genes pvehc3'E de la invención, se mostró un incremento dramático en la frecuencia de hipermuíación somática como resultado en el gen de VH186.2-DFL16.1-JH2 (figura 5). Todos los clones de PCR secuenciados contenían cambios de nucleótidos, a pesar del hecho de que se seleccionaron aleatoriamente. Estos cambios de nucleótidos se encontraron con alta frecuencia en el área alrededor de CDR2 (región hipervariable 2) y CDR3 (figura 5 y cuadro 2). Los datos se obtuvieron de dos ratones quiméricos que correspondían a cada construcción transgénica mostrada en ia figura 5, y concordaron entre sí. Una alta frecuencia de hipermutacion fue aparente en pvehc3'EHS3b/4. Sin embargo, la mutación faltó claramente en células B1 perifonéales de estos mismos ratones quiméricos (figura 5). El cuadro 3 siguiente muestra las características de las sustituciones identificadas en los transgenes.
CUADRO 3 Mutaciones en el gen de IgH
Fue evidente a partir de la comparación entre los transgenes de IgH, que la transición de bases y la transversión de bases surgen con casi la misma frecuencia. Además, en la secuencia del locus denominada motivo RGYW (A/G, G, C/T, A/T) (Kabat, E. A. et al., US National Institutes of Health, Bethesda, M. D., U.S.A., p1394 (1991 ): Rogozin, I. B. et al, Biochim. Biophys. Acta., 1171 , 1 1 (1992)), se analizó la emergencia de hipermutacion somática en el transgen de VH186.2. El gen de la línea germinal de VH186.2 (294 pb) contenía el motivo RGYW/WRCY (93 pb) que corresponde a 32% del total de las bases, y la frecuencia de hipermutacion somática en este motivo pareció ser de 34%, que no es significativamente mayor que la de otras regiones de VH.
Aplicación industrial En los ejemplos anteriores, el presente inventor usó un sistema de blastocistos RAG-2_/" para preparar ratones quiméricos que poseyeran transgenes de lgH con diferentes elementos de acción cis. El método de producción de la invención tiene algunas ventajas sobre las técnicas de transgenes convencionales, y es superior especialmente cuando se transforman células ES con bajos números de copias del transgen. De hecho, se calculó que el número de copias del transgen en células ES transformantes es de 3 o menos en la mayoría de los casos mediante Southern blotting y PCR (cuadro 1 ). Sólo se encontraron números marginales de hipermutación en pvehcA3'E, y se confirmó el hallazgo de que los elementos de acción cis, promotor VH y ?µ/MAR no fueron suficientes para inducir una alta frecuencia de hipermutación. La adición de un fragmento (4 kb) del intensificador 3' a pvehcA3'E (pvehc3'E), dio como resultado un incremento de casi 30% en la frecuencia de hipermutación. En la presente invención, se encontró que la frecuencia de expresión de la hipermutación inducida mejoró ampliamente al introducir HS3b y HS4 al extremo 3' del intensificador 3' de pvehc3'E, lo cual indica que la construcción pvehc3'EHS3b/4 contiene todos los elementos necesarios para hipermutación somática. Los experimentos realizados por el inventor aclararon que los motivos que determinan la hipermutación de alta frecuencia, están dentro la región HS3b/4 de 2.6 kb. De esta manera, es posible proveer un vector de expresión recombinante para inducir un mutante aleatorio del transgen deseado. Además, es posible proveer un procedimiento para la producción de un mutante aleatorio de alta frecuencia obtenido, expresando el vector de expresión recombinante en células animales. Además, es posible producir un método para expresar un mutante aleatorio, o un equipo para la producción de un mutante aleatorio, el cual comprende el vector de expresión recombinante y células animales.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> OTSUKA PHARMACEUT I CAL C0.,LTD.et al < 120> PROCEDIMIENTO PARA CONSTRUIR UN MUTANTE <130> fOOljp <140> 040 <150> 2001-191884 <151> 25-06-2001 <160> 14 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1182 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 tctagaacca catgcgatct aagggatatt ggggcaatac atgtgtagtg agatacctgc 60 ctttctgatg agccctgtct ggcagggata aactctcctt tctgcatctc cagggcctcg 120 atgagctgac tatctagtcc tctgccagaa tagctgtgtg gccttgggtg atgctggctg 180 acctcaggct ggtctgggtt gtctctggct gacacccctt gactctggat gaccctggga 240 agaccatact taatcttaat tggacttgtt ctcattggga gagaacatgg cctcactaag 300 gcacgagtgt ggatggcctt gggtgatggg ggttggggcc tcctcagccc ctggcaggct 360 tccctggctg ccacccctca tccaggtccc aggcccacct ggcctggtcc agtgtggtgt 420 gattctcaga acagtagctg tggtttgggg cacctgtgct gagaaaggct caggatgact 480 cagctgccct cagctcagag ctgctttgaa tgtttcagca ggtgatagac aacagagact 540 tcagaagaga gaaaaacaag ttgctaatgt gaacatccct gccctacccc cacacctgta 600 ctgcaaatct ccccacactg ttgaccccag atagagatcc caggacagca ggtgatagac 660 aaaggaggct ccagaggaga gaaaaatagt atctacaagc atgactacct ctgccctgcc 720 ccacacctgc cctgcaaagc tccccaggat gctgacccca catctgtaga ccccaggcca 780 gaggctccat ctcccagggc ctgggcttgc tttgtctcca ttctgcgcct ctgagcctgg 840 gcaaggccaa tgagcgaaag gggtcactgt cccagttgca gcccagtgtg tgacagtgtt 900 gtggggattc tggaatcttc tgcaggaatc ccctgtaggg atcctcctaa tgtgaatgag 960 gcttggaata gcaaagggac gtcttgtaaa ataccactga ttccttgggc ctcagacaat 1020 ggatgtgaga tgaggaccaa ggtccagggc cagtgttggt aagcagaatt tggggctaga 1080 gttcaggctt agaagtcaat gatgagggcc agggcccaat gactaggtca gggcccattg 1140 atcagtacag gacccagttg ttagagccgg agctcaatga te 1182
<210> 2 <211> 1381 <212> DN <213> Homo sapiens <400> 2 ctgcagactc actgttcacc atgaacccag ctagtcagat tcatatgtga aactcatatc 60 agcctctgca cacacataca cacacataca cacatat tac acccatgcac acacatgtac 120 acatacatac acatgtacac atacatgtgt acacacacat atagagaagg cattggtggg 180 gaaaacatta ggccatggct acagtacagg gcacaaggat ggtggtacag aatgaggtca 240 ggctgggtca gcataacaag aacacttgga caaagtgagg gtagtgtgtg tgtgtgtgtg 300 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cacgttgaaa gtcttcagta gactggtatc actagccctg 360 atatgggcaa cacagcaagc ctgggtcaca ctcaagctga gtatcagggt agccagggcc 420 ttctaaccaa gggtagatgc agcctgtgtt ccgtttactg accagtgaga agccatgagc 480 tgaaccagac cagaagaccc ttactgttcc caccccaccc ccacccagtt tagtctcagc 540 aagaccctgt actgtgggcc acagctctcc tctacactcc acctgtagca caaacactat 600 ttgcaaacat ttctaaaaag tagtagaaca ggaaccacag agcagagggg gggactggcg 660 tggaaagccc cattcaccca tgggactgaa actcagggaa ccagaaccgt aaggagattt 720 gcatggtgct gggggaggtt ggccctggat cagtgagccc agagagttac tggtttctca 780 ct tccatcat gtcaacctcc tcaaccccca aaaatggcca ggcctaggct atggatgagt 840 ttcaatgacc aggccctaag gacgagtcac agaggacttc ctggtgggct caggcagcag 900 acctgctcag atggattgca gagccagagg gagccatggc caggaaggcc agacgcctta 960 ggggtgtgct gtctctgcat cctttgccct ctctgctcct cacagtccat ctgccatctc 1020 acaatccctg ctgtcgctct ggggcccaga cctggccagt ctgggtacct gtggaataca 1080 cccaaagaag caatccccag cctcaggatc cacaactact tcccctacag acatgagtga 1140 tctcagccca catgtctggg ggccacagaa gcccctaaga ccctactctg ctaataggcc 1200 ctcctcccac cacgcaagac aatacacagg caaggtgatg tggatgagag gaccaaccca 1260 ggtacctgtg tgtgagatac accctgtggg tatcctggcc agaatctggt gaccaaccca 1320 acctgtgtcc ctagaggagt actccgtgcc tgcactcacc tacccaccta actccaagct 1380 t 1381
<210> 3 <211> 34 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL: INICIADOR <400> 3 tctagaacca catgcgatct aagggatatt gggg 34
<210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INICIADOR <400> 4 caggactagt gatcattgag ctccggctct aac <210> 5 <21 1> 33 <21 2>ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INICIADOR <400> 5 ctagtctaga ctgcagactc actgttcacc atg
<210> 6 <21 1> 33 <212> ADN <21 3> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INICIADOR <400> 6 gtggactagt aagctíggag ttaggígggt agg
<210> 7 <21 1> 20 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INICIADOR <400> 7 gactcaggag gactctagtt
<210> 8 <21 1> 20 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL: INICIADOR <400> 8 ggtgtcccta gtccttcatg
<210> 9 <21 1 > 21 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL: INICIADOR <400> 9 catgctcttc ttggcagcaa c 21
<210> 10 <211> 20 <212>ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL: INICIADOR <400> 10 gcagccaacg gccacgctgc
<210> 11 <211> 27 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INDICADOR
<400> 11 ggccgaattc catggagtta gtttggg 27
<210> 12 <211> 17 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INICIADOR DELANTERO MI3 <400> 12 ctctacagac acgggcc 17
<210> 13 <211> 29 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : INICIADOR INVERSO M13 <400> 13 aaaaagcttg gtgtccctag tccttcatg 29
<210> 14 <211> 546 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ARTIFICIAL : PROMOTOR <400> 14 ttcttaaata aaatgctgaa tgaacatttg aatacacata ttgctgagac atgttctctt 60 gctgtcattt gtgtaatatt ttagtatgca accttttgga aaggccatta ttatttaaat 120 atatatgaga gaagattgct aactctcata aatgtattgg tttttttttt aaatttccag 180 taagcgttat cctcattgct actaccacca atcaattttt tcactaagac aagtgagtgt 240 ctcaggttag gattctattt taagattgag atattaggct ttgatactac atctaaatgg 300 tctgtacatg tctcgaagaa agttcttcag acagagttag gacttggatc caggagttag 360 gacttggact gactcaggag gactctagtt tcttcttctc cagctggaat gtccttatgt 420 aagaaaagcc ttgcctcatg agtatgcaaa tcatgtgcga ctgtgatgat taatataggg 480 atatccacac caaacatcat atgagcccta tcttctctac agacactgaa tctcaaggtc 540 cttaca 546
Claims (19)
1.- Un procedimiento para la producción de un gen exógeno mutante aleatorio, caracterizado porque una construcción de ADN que comprende por lo menos los incisos (a)-(d) siguientes se introduce en una célula animal, y el gen exógeno mutante se produce en la célula animal: (a) un promotor; (b) un gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un intensificador que comprende HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNasal.
2. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque (d) el intensificador comprende además HS1 y HS2.
3. - El procedimiento de producción de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende por lo menos una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 62.
4. - El procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque las secuencias de ADN de (a), (c) y (d) se derivan de una secuencia de ADN de una inmunoglobulina.
5. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque (d) el intensificador comprende HS1 , HS2, HS3b y HS4.
6. - El procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque (a) el promotor es un promotor VH; y (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende secuencias de ADN de SEQ ID Nos: 1 y 2.
7. - El procedimiento de producción de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado además porque la construcción de ADN es pvehc3'EHS3b/4.
8. - El procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque la célula animal es una célula animal de la línea de células B.
9. - El procedimiento de producción de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la célula animal de la línea de células B se deriva de una célula de la línea de prelinfocitos B.
10.- Un método para obtener un producto de expresión de un gen muíante mediante la expresión del gen exógeno mutante obtenido mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la célula animal. . - Una construcción de ADN para producir un gen mutante exógeno, caracterizada porque comprende por lo menos: (a) un promotor; (b) un gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un intensificador que comprende HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNasal. 12. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque (d) el intensiñcador comprende además HS1 y HS2. 13. - La construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada además porque (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende por lo menos una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 ó 2. 14. - La construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada además porque las secuencias de ADN de (a), (c) y (d) se derivan de una secuencia de ADN de una inmunoglobulina. 15. - La construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada además porque (d) el intensificador comprende HS1 , HS2, HS3b y HS4. 16. - La construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizada además porque (a) el promotor es un promotor VH; y (d) el intensificador tiene una secuencia de ADN que comprende secuencias de ADN de SEQ ID Nos: 1 y 2. 17. - La construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada además porque la construcción de ADN es pvehc3'EHS3b/4. 18. - Un equipo para el procedimiento de producción de un gen exógeno muíante o para producir un producto de expresión de un gen muíante, caracíerizado porque comprende un vecíor que tiene: (a) un promotor; (b) un sitio de inserción de gen exógeno; (c) un intensificador de intrones; y (d) un intensificador que comprende HS3b y/o HS4 en una región sensible a DNAsal; para lograr la expresión de una secuencia de ADN mutada que produce un gen exógeno mutante. '19.- El equipo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque (d) el intensificador comprende además HS1 y HS2. 20.- El promotor VH17.2.25 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 14.
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