CN1807618B - 一种at选择性高频率诱变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种AT选择性高频率诱变方法。其步骤包括以dUTP为媒介进行第一轮PCR扩增，得到含dUMP的杂合DNA分子；以该DNA分子为模板，进行第二轮PCR扩增；通过部分U与G配对，获得AT碱基分别被GC替换的突变DNA分子或者在第一轮PCR扩增后，以含有dUMP的杂合DNA分子为模板，在0.5mM Mgcl2存在下进行在第二轮PCR扩增，获得高突变频率的DNA分子。本发明的AT选择性诱变方法突变频率为0.86％.其中AT转换为其它碱基数占总突变碱基数的96.5％；高频率诱变方法的突变率为4.0％。其中AT转换为其它碱基数占总突变碱基的90.4％。本发明的方法可用于DNA分子的体外改良。

Description

一种AT选择性高频率诱变的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人工诱变基因技术，与体外基因定向进化有关。
背景技术
分子生物学和基因工程的快速发展使人们能够使基因在异源寄主中进行表达。然而，当富含AT基因在这些富含GC基因组的寄主中表达时，往往会遇到低表达或不表达的问题，其原因不是由于基因表达元件有问题，而是密码识别系统的差异。为解决这个问题，人们不得不根据寄主使用密码组合偏爱性(bias)人工合成能被寄主所识别的高GC含量基因，从而达到高表达这一目的。这一工作耗资大，劳动强度大。尽管如此，由于这一传统做法是基于密码子的简并性，在合成过程中只改变核苷酸组成而并没有改变氨基酸序列，故只能解决表达量的问题，并不能改变生物活性物质的自然属性，如生物活性、溶解度、特异性以及作用pH、温度等问题。另一方面，生物分子自然属性来自于漫长的自然进化，这些自然属性往往在实际应用中受到限制。人们为改变生物分子的自然属性，相继建立了体外分子进化技术，如体外DNA片段重组(DNA shuffling)，参见：Stemmer，W.P.Ripid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.Nature，1994370：389-391，易错PCR(Leung，D.W，Chen，E.and Goeddel，D.W，Amethod for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction.Techniques，1989，1，11-15)等。这些技术可使DNA分子在体外产生分子间的重排或随机突变。但是，都不能选择性地将AT转变为GC。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用dUTP作为媒介，通过PCR方法使AT碱基转换为GC从而富集基因的GC含量。利用这一技术，使富含AT的基因增加GC含量的同时，还可获得改变自然属性的体外改良分子。
本发明通过以下方案实施：
一种AT选择性高频率诱变的方法，以dUTP为媒介进行第一轮PCR，得到含dUMP的杂合DNA分子；以该DNA分子为模板，进行第二轮PCR；通过部分U与G配对，获得AT碱基分别被GC替换的突变DNA分子。
为了提高突变频率，第二轮PCR是以含有dUMP的杂合DNA分子为模板，在Mn++存在下进行的，其中的Mn++是MnCl2，其用量为0.5mM。
本发明的具体步骤包括：
1)使用dUTP部分取代dTTP进行PCR扩增；
2)在dUTP存在下，降低dTTP浓度，使新合成链中dUMP取代dTMP；
3)在dUTP存在下，降低dATP浓度，增加dGTP浓度，使新合成链中dUTP与dGTP配对，部分A和T通过dUMP介导被G和C取代。
在本发明中，可以向第一轮PCR反应系统增加一种极性溶剂(例如聚乙二醇，最好是聚乙二醇3500降低碱基配对特异性，使新链合成过程中让U与G配对，这样有助于实现AT转换为GC这一目的。
更详细的技术方案如下所述：
1、利用dUTP介导使AT转换为GC
在PCR过程中，通过限制dTTP浓度，让Taq DNA聚合酶催化dUTP取代dTTP掺入到DNA分子形成杂合DNA分子。由于限制了dATP的浓度，使DNA合成过程中，降低了dATP与dUMP配对的机会，相反，增加了dGTP与dUTP配对的机率。同时，加入强极性化合物聚乙二醇增加反应介质的极性，让dGTP更易与模板链中的dUMP配对，使编码链中的A被G取代，T被C所取代，最终达到部分AT被GC取代的目的。
2、dUTP介导AT转换GC的诱变的具体方法
该方法是通过以下两轮PCR程序得以实现：
1)第一轮PCR
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，货号：Cat.No.201203)            5μl
MgCl2(25mM)                                                   7μl
PEG3500(5mM)                                                  5μl
dUTP(10mM)                                                    2.5μl
dGTP(10mM)                                                    2.5μl
dCTP(10mM)                                                    1μl
dTTP(100μM)                                                  2μl
dATP(100μM)                                                  8μl
模板DNA                                                       1μl
正向引物(10μM，根据目标分子设计)                             1μl
反向引物(10μM，根据目标分子设计)                             1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)        1μl
加无离子水至                                                  50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
PCR产物的纯化：上述PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离(ManiatisT，Fritsch，E.F，Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1982150-160，cold Spring Harbor Laboratory)。DNA纯化过程采用Qiagen公司试剂盒(QIAEX II Gel extraction kit，Cat.No.20021)进行。纯化过程为：用刀片在紫外灯下取出PCR产物谱带，放入1.5ml离心管，加入3倍体积的3M NaI，置55℃保温10分钟使琼脂糖凝胶完全溶解，上纯化柱(购自Quagen公司，Cat.No.20021)，将柱放入2mL离心管，以8000转/分钟离心30秒，弃去流出液，加750ul缓冲液PE(购自Qiagen公司，Cat.No.20021)洗柱，以14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，加50uL去离子水，以14000转/分钟离心2分钟，收集DNA流出液。
2)第二轮PCR
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，货号：Cat.No.201203)            5μl
dNTP(10mM)                                                    1μl
第一轮PCR产物                                                 1μl
正向引物(10μM，同第一轮PCR)                                  1μl
反向引物(10μM，同第一轮PCR)                                  1μl
Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)                                       1μl
加无离子水至                                                  50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
酶解：PCR产物用限制性内切酶NcoI/BglII(购自New England Bilabs公司)酶解，酶解反应(50μl)含有：5μl 10X酶解缓冲液(购自New England Bilabs公司)，20μl PCR产物，1-2μl限制性内切酶NcoI/BglII，加水至终体积为50l，在37℃下保温2-5小时。
酶解产物纯化：按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification kit，Cat.No.28104)及操作程序进行.具体过程是：取150l PB缓冲液(购自Qiagen公司，与50μl酶解产物混合，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50μl无离子水，用14000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA。
连接：20μl连接反应含有：2μl 10X连接缓冲(购自Qiagen公司)，2-4μl预先用NcoI/BglII酶解的pQE60载体(购自Qiagen公司)，2-4μl酶解PCR产物，1μlT4DNA连接酶(购自Qiagen公司)，加水至终体积20μl，放4℃保温过夜。
转化：将20μl连接混合物与100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自New England Biolabs公司)混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800ul液体LB培养基(其中含1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，37℃保温1小时。铺含100μg/ml氨苄青霉素固体LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)平皿，37℃保温12小时，获得含AT突变文库(见图1)。
2、高频随机突变方法
以含有dUMP的杂合DNA分子为模板，在不同Mn++浓度进行PCR扩增，其过程如下：
1)第一轮PCR
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，货号：Cat.No.201203)        5μl
MgCl2(25mM)                                               7μl
dUTP(10mM)                                                2.5μl
dGTP(10mM)                                                2.5μl
dCTP(10mM)                                                1μl
dTTP(100μM)                                              2μl
dATP(100μM)                                              6，8.10μl
模板DNA                                                   1μl
正向引物(10μM，根据目标分子设计)                         1μl
反向引物(10μM，根据目标分子设计)                         1μl
Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)                                   1μl
加无离子水至                                              50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
PCR产物的纯化：
1)第二轮PCR
以第一轮PCR产物作为模板，用Mn++离子取代Mg++离子作为Taq DNA聚合酶辅基进行PCR扩增。
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)              5μl
MnCl2(5mM)                                                5μl
dNTP(10mM)                                                1μl
第一轮PCR产物                                             1μl
正向引物(10μM，同第一轮PCR)                              1μl  
反向引物(10μM，同第一轮PCR)                              1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)        1μl
加无离子水至                                                  50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
酶解：PCR产物用限制性内切酶NcoI/BglII(购自New England Bilabs公司)酶解，酶解反应(50μl)含有：5μl 10X酶解缓冲液(购自New England Bilabs公司)，20μl PCR产物，1-2μl限制性内切酶NcoI/BglII，加水至终体积为50μl，在37℃下保温2-5小时。
酶解产物纯化：按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification kit，Cat.No.28104)及操作程序进行.具体过程是：取150l PB缓冲液(购自Qiagen公司，与50μl酶解产物混合，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750l PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50l无离子水，用14000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA。
连接：20μl连接反应含有：2μl 10X连接缓冲(购自Qiagen公司)，2-4μl预先用NcoI/BglII酶解的pQE60载体(购自Qiagen公司)，2-4μl酶解PCR产物，1μl T4DNA连接酶(购自Qiagen公司)，加水至终体积20μl，放4℃保温过夜。
转化：将20μl连接混合物与100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自New England Biolabs公司)混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800ul液体LB培养基(其中含1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，37℃保温1小时。铺含100μg/ml氨苄青霉素固体LB培养基(配方如下：1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)平皿，37℃保温12小时，获得含高频率突变文库(见图1)。
本发明的积极效果是：AT选择性诱变方法突变频率为0.86％.其中AT转换为其它碱基数占总突变碱基数的96.5％；高频率诱变方法的突变率为4.0％。其中AT转换为其它碱基数占总突变碱基的90.4％。是一种经济、实用高频率定向诱发基因突变的方法，该方法可用于体外分子的改良。
附图说明
图1：是本发明方法的技术流程图。
图2：是本发明的AT选择性诱变方法对135031个碱基进行诱变分析的结果图。
图3：是本发明的高频随机诱变方法对绿色荧光蛋白诱变的结果图。
图4：是本发明的AT选择性诱变方法对AlbD酯酶基因进行体外改良的结果图。
具体实施方式
实施例1利用AT选择性诱变方法对绿色荧光蛋白基因的诱变
以含有绿色荧光蛋白基因的pEGFP载体(购自Clontech公司)作为模板，用本发明AT选择性诱变方法进行PCR扩增：具体操作如下：
第一轮PCR反应为：
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司货号：Cat.No.201203)    5μl
MgCl2(25mM)                                         7μl
dUTP(10mM)                                          2.5μl
dGTP(10mM)                                          2.5μl
dCTP(10mM)                                          1μl
dTTP(100μM)                                        2μl
dATP(100μM)                                                8μl
pEGFP质粒DNA                                                1μl
正向引物(10μM，5’-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT)             1μl
反向引物(10μM，5’-TCGAGATCTTATTTGTATAGTTCATCCA)           1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)      1μl
扩增条件为：94℃2分钟；94℃40秒；50℃30秒；72℃50秒；30个循环。
第二轮PCR反应为：
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，货号：Cat.No.201203)          5μl
dNTP(10mM)                                                  1μl
第一轮PCR产物                                               1μl
正向引物(10μM，5’-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT)             1μl
反向引物(10μM，5’-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT)             1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)      1μl
加无离子水至                                                50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。将扩增产物用限制性内
切酶Nco I/BglII双酶解。
酶解反应如下：
10X SuRE/cut缓冲液H(购自Roche公司)                          5μl
第二轮PCR产物                                               30μl
限制性内切酶Nco I(购自Roche公司)                            1μl
限制性内切酶BglII(购自Roche公司)                            1μl
加无离子水至                                                50μl
37℃反应4小时，反应混合物进行纯化，纯化过程如下：按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification kit，Cat.No.28104)及操作程序进行.具体过程是：取150μl PB缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.28104)与50μl酶解产物混合，上纯化柱(购自Qiagen公司，Cat.No.28104)，以14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.28104)，用14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50l无离子水，用14000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA 。
纯化后连接到预先用NcoI/BglII处理的大肠杆菌表达载体pQE60(购自Qiagen公司)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自New England Biolabs公司)获得随机突变文库。
转化子质粒制备：从随机突变文库中挑取270个转化子接种到3ml含有氨苄青霉素(100g/ml)液体LB培养基(配方：1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，在37℃培养过夜，用Qiagen公司质粒制备试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit，货号：Cat.No.27106)并按照说明书操作程序抽提质粒。具体方法如下：以6000转/分钟离心培养物，收集菌体。加250ml缓冲液A(购自Qiagen公司，Cat.No.27106)悬浮菌体；加250ml缓冲液B(购自Qiagen公司，货号：Cat.No.27106)混匀；再加300ul缓冲液C(购自Qiagen公司，货号：Cat.No.27106)，混匀。以14000转/分钟离心5分钟。收集上清液上柱，加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司，货号Cat.No.27106)，同上离心，弃去流出液，最后，用80μl无离子水洗脱质粒DNA。
绿色荧光蛋白基因的序列分析：以来自随机突变文库的质粒为模扳进行测序，测序PCR引物为5’-CGGATAACAATTTCACACAG。
测序反应体系为：8μl序列反应混合液(购自Qiagen公司)，2μl质粒DNA(200μg)，1μl引物(10pM)，9μl去离子水.PCR条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性15秒，50℃退火15秒，60℃延伸4分钟，30个循环.PCR产物用于序列测定。
测定结果表明，被测定的135031个碱基中，有1169个碱基发生了突变，突变频率为0.86％.其中AT转换为其它碱基数为1127个，占总突变碱基数的96.5％.GC转换其它碱基数为42个.占总突变碱基数的3.5％(见图2)。
实施例2用高频随机诱变方法对绿色荧光蛋白基因进行诱变
按照上述方法，制备含有dUMP的DNA杂合分子(同实施例1中的第一轮PCR反应)作为模板进行PCR诱变。PCR具体程序如下：
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)                  5μl
MnCl2(5mM)                                                    5μl
dNTP(10mM)                                                    1μl
含dUMP的GFP基因的第一轮PCR产物                                1μl
    正向引物(10μM，5’-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT)           1μl
反向引物(10μM，5’-TCGAGATCTTATTTGTATAGTTCATCCA)             1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)        1μl
加无离子水至                                                  50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃1分钟，30个循环。
突变文库的构建：20l连接体系含有：
10X连接缓冲液(购自New England Boilabs公司)                    2μl
NcoI/BglII酶解pQE60                                           2μl
NcoI/BglII酶解PCR产物                                         6μl
T4 DNA连接酶(购自New England Boilabs公司)                     1μl
加无离子水至                                                  20μl
4℃保温过夜。
转化：将连接混合物与100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α混合，冰浴放置30分钟，42℃处90秒，加800μl LB培养基(配方：1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉，pH7.5)，37℃保温1小时.铺含100μg/ml氨苄青霉素固体LB平皿，37℃保温12小时，挑取转化子抽提质粒。
质粒制备和序列测定方法同实施例1中“转化子质粒制备”和“绿色荧光蛋白基因的序列分析”。结果表明：在测定的6750个碱基中，有271个碱基发生突变，突变率为4.0％。其中245个AT转换为其它碱基，占总突变碱基的90.4％；26个GC转换为其它碱基，占总突变碱基的9.6％。(见图3)。
实施例3利用AT选择性诱变方法对AlbD酯酶基因进行体外改良(应用实施例)
黄假单胞菌(L.Zhang and R.G.Birch，Mechanisms of biocontrol by pantoea dispersa of sugar cane leaf scald disease caused by Xanthomonas albilineans Journal of Appl ied Microbiology1997，82，448-454)是一种病原菌。该菌产生一种分子量为842kDa的有机化合物，称为Albicidin。Albicidin可引起甘蔗的白叶枯病(white leaf scald)，在许多国家导致大面积的甘蔗减产，造成巨大的经济损失。Zhang等人从防止甘蔗白叶枯病出发，从Erwinia herbicola中分离到一种可失活albicidin的酶，称之为AlbD，并发现该酶对脂肪酸链长C2-8的酯有水解活性(Zhang，L.H.&R.G.Birch.1997.The gene for albicidin detoxification from Pantoea dispersa encodes an esterase and attenuates pathogenicity of Xanthomonas albilineans to sugarcane.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：9984-9989.)。继后，Zhang等人将albD基因导入甘蔗，发现具有一定的抗病作用(Zhang，L.&Birch，R.G.Engineered detoxification confers resistance against a pathogenic bacterium.Nat.Biotechnol 1999，17，1021-1024)。鉴于这个酶的albicidin脱毒活性在抗甘蔗白叶枯病和酯酶活性的工业应用价值，本申请人用本发明的AT选择性方法对野生型albD基因(基因序列参见：GenBank Accession No.U96453，Zhang，L和Birch，R.G，Mechanisms of biocontrol by Pantoea dispersa of sugar cane leaf scald disease caused by Xanthomonas albilineans，1997)进行了体外诱变，具体诱变步骤如下：
1)第一轮PCR
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)                       5μl
MgCl2(25mM)                                                        7μl
PEG3500(5mM)                                                       5μl
dUTP(10mM)                                                         2.5μl
dGTP(10mM)                                                         2.5μl
dCTP(10mM)                                                         1μl
dTTP(100μM)                                                       2μl
dATP(100μM)                                                       8μl
AlbD DNA                                                           1μl
正向引物(10μM，5’-cgcgtggatccgtttgatggaca-3’)                   1μl
反向引物(10μM，5’-gatgaattcccctggaaaagcttatccc-3’)              1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)             1μl
加无离子水至                                                       50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。然后，将PCR产物用双蒸水稀释1000倍，用稀释的PCR产物作为模板，同上进行PCR，重复6个循环。
2)第二轮PCR
10×PCR缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.201203)                        5μl
dNTP(10mM)                                                          1μl
第6个循环PCR产物                                                1μl
正向引物(10μM，5’-cgcgtggatccgtttgatggaca-3)                  1μl
反向引物(10μM，5’-gatgaattcccctggaaaagcttatccc-3’)           1μl
Taq DNA聚合酶(购自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)          1μl
加无离子水至                                                    50μl
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
酶解：PCR产物用限制性内切酶Bam HI/EcoRI(购自New England Bilabs公司)酶解，酶解反应(50μl)含有：5μl 10X酶解缓冲液(购自New England Bilabs公司)，20μl PCR产物，1-2μl限制性内切酶BamHI/EcoRI，加水至终体积为50μ1，在37℃下保温2-5小时。
酶解产物纯化：按Qiagen公司PCR纯化试剂盒及操作程序进行。具体过程是：取150μl PB缓冲液(购自Qiagen公司)与50μl酶解产物混合，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司)以14000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50μl无离子水，以14000转/分钟离心2分钟，收集纯化酶解DNA。
连接：20μl连接体系含有：2μl 10X连接缓冲(购自Qiagen公司)，2-4μl预先用Bam HI/EcoRI酶解的大肠杆菌载体pGXE-2T(购自Strategen公司)，2-4μl酶解PCR产物，1μl T4DNA连接酶(购自Qiagen公司)，加水至终体积20μl.放4℃保温过夜。
转化：将连接混合物与100μl大肠杆菌感受态细胞DH5d(购自New England Biolabs公司)混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800ul LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，37℃保温1小时。铺含100μg/ml氨苄青霉素和Albicidin固体LB(配方：1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉和1.5％琼脂，pH7.5)平皿，37℃保温12小时，获得AlbD分子多样性突变文库
高酯酶活性突变株筛选：
通过对不同AlbD突变株的酯酶活性测定筛选高酯酶活性突变体，具体操作如下：
1.测定原理：用对-硝基苯戊酯作为底物在AlbD酯酶作用下，生成对-硝基苯酚和羧酸化合物。对一硝基苯酚呈黄色，在405nM波长下有最大光吸收，因此，通过分光光度计测定光吸收便可推算出酶活性。
2.测定方法：从AlbD分子多样性突变文库中挑取转化子接种到含有150μl液体LB培养基的96孔扳，以155转/分钟，37℃培养过夜；取20μl培养物加到含有145μl 3mM的对-硝基苯戊酯(用pH7.4磷酸缓冲液制备。磷酸缓冲液具体配方：137mM Nacl-2.7mMKcl-10mM NaHPO4-2mMKH2PO4，pH7.4)，混合后，28℃保温20分钟；然后，在90℃保温3分钟使AlbD酯酶失活，在405nM波长下测定光吸收。用该方法筛选获得了1株高活性突变株，命名为m-AlbD，其活性比野生型AlbD酯酶提高了4倍(见图4)。
高活性突变株重组质粒制备：将高活性突变株m-AlbD接种到3ml含有100μg/ml氨苄青霉素液体LB培养基(配方：1％胰蛋白胨，0.5％Nacl，1％酵母粉，pH7.5)，在37℃培养过夜，用Qiagen公司质粒制备试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit，货号：Cat.No.27106)并按照说明书操作程序抽提质粒。具体方法如下：以6000转/分钟离心5分钟，收集菌体。加250ml缓冲液A(购自Qiagen公司，Cat.No.27106)悬浮菌体；加250ml缓冲液B(购自Qiagen公司，Cat.No.27106)混匀；再加300ul缓冲液C(购自Qiagen公司，Cat.No.27106)，混匀。以14000转/分钟离心5分钟。收集上清液上柱，加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司，Cat.No.27106)，同上离心，弃去流出液，最后，用80μl无离子水洗脱质粒DNA。序列分析表明：GC含量提高了8.9％(如表1所示)。
表1第6轮PCR诱变AlbD酶GC富集结果
Figure B2006100182560D00091

Claims (2)

1.使碱基AT定向突变为GC的方法，其特征在于，以dUTP为媒介进行第一轮PCR，得到含dUMP的杂合DNA分子，以含有dUMP的杂合DNA分子为模板，进行第二轮PCR，在所述的第二轮PCR反应试剂中含有dNTP，使部分U与G配对，获得AT碱基分别被GC替换的突变DNA分子，或者在第二轮PCR反应中加入终浓度为0.5mM的MnCl2，使随机碱基的突变频率提高，
所述的第一轮PCR和第二轮PCR反应步骤如下：
第一轮PCR：
10×PCR缓冲液                                    5μl，
25mM MgCl2                                       7μl，
5mM聚乙二醇3500                                  5μl，
10mM dUTP                                        2.5μl，
10mM dGTP                                        2.5μl，
10mM dCTP                                        1μl，
100μM dTTP                                      2μl，
100μM dATP                                      8μl，
模板DNA                                          1μl，
根据目标分子设计的正向引物，使其浓度为10μM      1μl，
根据目标分子设计的反向引物，使其浓度为10μM      1μl，
酶浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶                   1μl，
加无离子水至                                     50μl，
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环；
第二轮PCR：
10×PCR缓冲液                                     5μl，
10mM dNTP                                         1μl，
第一轮PCR的产物                                   1μl，
同第一轮PCR的正向引物，使其浓度为10μM            1μl，
同第一轮PCR的反向引物，使其浓度为10μM            1μl，
酶浓度为2.5U/l Taq DNA聚合酶                      1μl，
加无离子水至                            50μl，
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的第二轮PCR反应步骤如下：
10×PCR缓冲液                            5μl，
5mM MnCl2                                5μl
10mM dNTP                                1μl，
第一轮PCR产物                            1μl，
同第一轮PCR的正向引物，使其浓度为10μM   1μl，
同第一轮PCR的反向引物，使其浓度为10μM   1μl，
酶浓度为2.5U/l Taq DNA聚合酶             1μl，
加无离子水至                             50μl，
PCR条件：94℃预热3分钟，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分钟，25个循环。
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马向东 等.基因体外诱变的一种新方法.微生物学报44 3.2004,44(3),第379页1.8-380页右栏末段. *
马向东等.基因体外诱变.微生物学通报29 1.2002,29(1),73页第1段. *
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