CN102286508A - 用于降解硝基苯的重组质粒、基因工程菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于降解硝基苯的重组质粒、基因工程菌及其制备方法。重组质粒在酶切位点BglII和XhoI之间依次含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的基因序列；本发明硝基苯降解工程菌株PET-NB能有效地降解溶液中的硝基苯，形成开环产物，提高水体可生化性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于降解硝基苯的重组质粒和一种高效降解硝基苯的基因工程菌，以及上述重组质粒和基因工程菌的制备方法。
背景技术
目前，水污染问题日益加重，自然水体中的污染物，尤其是硝基苯类等芳香族难降解化合物的污染，已严重威胁到人类及其他生物的安全。采用传统的物理化学工艺不仅成本高，而且容易引起二次污染，在处理后的水体中残留了化学药剂并产生新的污染物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于降解硝基苯的重组质粒、基因工程菌及其制法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于降解硝基苯的重组质粒，在酶切位点EcoRI和XhoI之间依次含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的基因序列。
一种含有上述重组质粒的基因工程菌，该基因工程菌保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.4798。
一种上述用于降解硝基苯的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）通过PCR获得编码硝基苯降解过程中所需酶（硝基苯硝基还原酶、羟基苯胺变位酶和2-氨基酚-1,6-双加氧酶）的编码基因；
（2）将上述基因连接到载体pET-21a(+)中，再通过PCR获得三个带T7启动子的编码基因，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
（3）通过重叠PCR将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2连接，再连接到另一新载体pET-21a(+)，得到重组载体；
（4）通过酶切法将SEQ ID NO.3连接到步骤（3）获得的重组载体中，构建出重组质粒。
一种上述基因工程菌的制备方法，具体为：将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到基因工程菌。
本发明的有益效果是，本发明硝基苯降解工程菌株PET-NB能有效地降解溶液中的硝基苯，形成开环产物，提高水体可生化性。
本发明的用于降解硝基苯的基因工程菌已在中国专利局指定的保藏单位“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏日期为2011年4月28日，保藏编号为：CGMCC No.4798。
附图说明
图1是重组质粒图谱；
图2是核酸电泳图，其中，M：DNA marker；1：SEQ ID No.3；2：SEQ ID No.1；3：SEQ ID No.2；
图3是基因工程菌PET-NB对硝基苯的降解曲线。
具体实施方式
本发明一方面提供了一种重组质粒，该重组质粒携带硝基苯硝基还原酶、羟基苯胺变位酶和2-氨基酚-1,6-双加氧酶的编码序列，硝基苯硝基还原酶、羟基苯胺变位酶和2-氨基酚-1,6-双加氧酶的编码序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。.
本发明另一方面还提供了一种高效降解硝基苯的基因工程菌，该基因工程菌含有上述重组质粒（如图1所示）。
上述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
1、通过PCR获得编码硝基苯降解过程中所需酶（硝基苯硝基还原酶、羟基苯胺变位酶和2-氨基酚-1,6-双加氧酶）的编码基因；
2、将上述基因连接到载体pET-21a(+)中，再通过PCR获得三个带T7启动子的编码基因，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
3、通过重叠PCR将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2连接，再连接到另一新载体pET-21a(+)，得到重组载体；
4、通过酶切法将SEQ ID NO.3连接到步骤（3）获得的重组载体中，构建出重组质粒。
另一方面，本发明提供了一种所述高效降解硝基苯的基因工程菌的构建方法，将上述重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到所述基因工程菌，该基因工程菌已于2011年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为：PET-NB。
下面结合附图和实施例进一步阐述本发明。但这些实例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例例中未注明的具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
一、培养基的配制
LB培养基成分为每升中含有5g酵母粉，10g蛋白胨和10gNaCl。固体培养基为液体培养基中加入2%琼脂粉。必要时，在培养基中加入50μg/ml的氨苄青霉素（Amp）以增加培养基的选择性。
二、重组质粒的构建
根据GenBank中公布的已知硝基苯硝基还原酶、羟基苯胺变位酶和2-氨基酚-1,6-双加氧酶的编码基因，分别设计含有酶切位点（EcoRI、HindIII、XhoI）的引物，引物序列分别如SEQ ID NO.4~9所示，经PCR得到上述酶的编码基因。将所得DNA片段和载体pET-21a（+）在37oC下经相应的限制性内切酶进行酶切，用DNA纯化试剂盒纯化后，分别于16oC在连接酶作用下进行，得到含有相应基因的载体。然后再以构建的载体为模板，设计带有重叠区的引物，经过PCR得到带有T7启动子的编码基因，即SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2。图2为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的电泳图；其中SEQ ID NO.1的下游和SEQ ID NO.2的上游引物含有一段互补区，SEQ ID NO.1的上游和SEQ ID NO.2的下游引物分别带有酶切位点BglII和HindIII，引物序列分别如SEQ ID NO.10~12及SEQ ID NO.7所示，经过重叠PCR将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2连接成一DNA片段，在37oC下经BglII和HindIII两限制性内切酶进行酶切，于16oC在连接酶作用下连接至载体pET-21a（+）。用带有酶切位点HindIII和XhoI的引物经PCR得到DNA片段SEQ ID NO.3，引物序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.9所示，再以上述双酶切和连接的条件将该片段连接至含有PCR将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的pET-21a（+）中，得到所需的重组质粒。
三、基因工程菌的构建
将2μl上述重组质粒与100μlBL21(DE3)感受态细胞混合，在冰上静置30min，42oC水浴90s，再冰浴3~5min，然后加入900μl LB培养基，37oC，200rpm培养2h后涂布于含有Amp的LB平板上，于37oC培养箱中培养过夜后，挑出的单菌落即是所构建的基因工程菌。
四、基因工程菌对硝基苯降解能力的研究
将基因工程菌接种至含400mg/L硝基苯的LB培养基中，在30℃，200rpm条件下培养，每天取样并检测剩余硝基苯含量，经过一星期后，硝基苯含量仅剩原来的20%（如图3所示），结果表明工程菌能高效降解硝基苯。
<110> 浙江大学
<120> 用于降解硝基苯的重组质粒、基因工程菌及其制备方法
<130> 123456
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (4)
1.一种用于降解硝基苯的重组质粒，其特征在于，在酶切位点BglII和XhoI之间依次含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的基因序列。
2.一种含有权利要求1所述重组质粒的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.4798。
3.一种权利要求1所述用于降解硝基苯的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过PCR获得编码硝基苯降解过程中所需的硝基苯硝基还原酶、羟基苯胺变位酶和2-氨基酚-1,6-双加氧酶的编码基因；
（2）将上述基因连接到载体pET-21a(+)中，再通过PCR获得三个带T7启动子的编码基因，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
（3）通过重叠PCR将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2连接，再连接到另一新载体pET-21a(+)，得到重组载体；
（4）通过酶切法将SEQ ID NO.3连接到步骤（3）获得的重组载体中，构建出重组质粒。
4.一种权利要求2所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，该方法具体为：将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到基因工程菌。
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| CN 201110170722 CN102286508A (zh) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | 用于降解硝基苯的重组质粒、基因工程菌及其制备方法 |
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-
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