CN1317388C - 2－氨基酚1，6－双加氧酶、其基因及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一个降解对硝基氯代苯开环酶基因及其表达产物，该基因来源于一株睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株。该基因大小为1770bp碱基对，含有两个同方向的ORF开放阅读框架，两个开放阅读框架分别为942bp和813bp，中间相隔15bp，编码两个不同的蛋白产物，为β-亚基和α-亚基。两个β-亚基和两个α-亚基组成一个具有活性的酶分子。该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯直接开环裂解。因此，该基因可以用于构建基因工程菌，生产具有活性的酶，用于含对硝基氯代苯类化合物的污水处理以及用于生物转化加工工程。
Description
技术领域
本发明属于微生物生物技术和基因工程技术领域，具体地说，它涉及一个来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCCNo.1028菌株的基因，该基因大小为1770bp碱基对，其表达一个具有活性的酶，该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯直接开环裂解。因此，该基因可以用于构建基因工程菌，生产具有活性的酶，用于含对硝基氯代苯类化合物的污水处理以及用于生物转化加工工程。
技术背景
氯代硝基苯类化合物(Chloronitrobenzenes，CNBs)作为重要的化工中间体被广泛用于生产和制造橡胶、染料、农药、医用药品等，以对氯硝基苯为例，我国2000年产量为12万吨。氯代硝基苯等芳香族化合物具有多种途径进入环境成为污染物，例如残留在生产过程中排放的废水，或者由环境中含芳香环化合物的不彻底降解和转化而来，例如硝基苯胺和氯代硝基苯胺是农药、染料、颜料等不彻底分解产生的；我国自来水供应多采用氯化消毒，氯代硝基苯是检测到的氯化消毒副产物之一。欧共体早已宣布氯代硝基苯是一种特别有害的化合物且在环境中难以降解，其危害包括引起人和动物的高铁血红蛋白血症(Methemoglobinemia)，并且是一种诱变剂和致癌剂，五氯硝基苯破坏肺、肝、肾的功能，并直接损害神经系统。因此，研究氯代硝基苯类化合物的生物降解和酶促降解对于保护环境及提高人类健康具有重要意义。
目前，国内外就氯代苯类或者硝基苯类有机物的生物降解进行了大量研究，而对芳环上同时存在氯原子和硝基的氯代硝基苯类化合物的研究报道则较少，其主要原因是当氯原子和硝基同时存在时，由于二者的吸电子特性，导致芳环裂解更加困难。许多能够降解氯代苯或硝基苯等芳烃衍生物的菌种并不能降解对氯硝基苯。迄今，除了国外个别报道之外，单一菌种或混合菌种对氯硝基苯的降解能力、降解性质等所知甚少。而对于氯代硝基苯类的酶促降解和转化的研究则更少。
此外，利用酶促反应的生物加工和转化更是近年来新兴的生物工程技术，可以在常温常压条件下以非常经济、高效的方法转化加工获得高纯度的高品质产品，目前已经在生物制药领域、生物化工领域得到应用，如手性药物的生产和丙烯酰胺的生产，但在氯代硝基苯类化合物的生物转化方面尚未见到报道。
因此，研究氯代硝基苯生物降解途径、开发酶制剂资源有着重要的意义。
发明内容
针对上述存在问题，本发明的目的是为氯代硝基苯类及其相关衍生化合物的酶促降解和转化提供一种新的酶的基因及其由该基因编码的两个不同的蛋白产物β-亚基和α-亚基组成的2-氨基酚1，6-双加氧酶，该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯开环裂解。
因此，本发明提供的基因可以用于构建基因工程菌，生产具有活性的酶，用于含对硝基氯代苯类化合物的污水处理以及用于生物转化加工工程。
2-氨基酚1，6-双加氧酶基因大小为1770bp碱基对，含有两个同方向的ORF开放阅读框架，两个开放阅读框架分别为如序列表2NO.1所示的942bp核苷酸序列和如序列表1NO.1所示的813bp核苷酸序列，其编码两个不同的蛋白产物，如序列表2NO.2所示的314个氨基酸序列为β-亚基和如序列表1NO.2所示的271个氨基酸序列为α-亚基。两个β-亚基和两个α-亚基组成一个具有活性的酶分子。该酶可以催化2-氨基酚进行1，6位开环裂解，也可以催化对硝基氯代苯直接开环裂解。
2-氨基酚1，6-双加氧酶基因来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株。将该菌在LB平板上的单菌落挑到LB培养液中，30℃振荡培养，收集菌体，提总DNA，用Mbo I部分酶切至30kb左右的片断。用SuperCos 1作为载体(购自Stratagene Company，USA)，载体先用Xba I酶切后，去磷酸化，再用BamH I酶切成6.8kb和1.1kb的两个片段。将基因组部分酶切的片段和处理后的载体在16℃用T4 DNA连接酶连接。连接好的片段用Gigapack III XL包装蛋白(购自StratageneCompany，USA)包装。最终转染至大肠杆菌XL 1-blue MR(购自StratageneCompany，USA)中，建立Cosmid基因文库。从基因文库中筛选到有2-氨基酚1，6-双加氧酶活性的3个阳性克隆。将其中一个克隆的质粒提取出来测序。从序列中分析出编码2-氨基酚1，6-双加氧酶α、β亚基的基因，这两个亚基的基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列分别如序列表1和序列表2所示。
以这两个亚基的氨基酸序列在NCBI上进行blastx比对，发现α-亚基氨基酸序列与2-aminophenol-1，6-dioxygenase alpha subunit[Pseudomonas pseudoalcaligenes](登录号为AAB71525)的序列相似性为56％；β-亚基的氨基酸序列与2-aminophenol 1，6-dioxygenase betasubunit[Pseudomonas putida](登录号为AAK26519)的序列相似性为79％。同时，从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1(CGMCC No.1028)细胞中纯化出2-氨基酚1，6-双加氧酶蛋白，并将酶蛋白的α、β-亚基送到北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室，对两个亚基的N端各8个氨基酸进行测序，测序结果为：α亚基，TVVSAFLV；β亚基，MQGEIIAG。与得到的基因序列所编码的N端氨基酸序列完全相同。由此可以肯定，得到的序列所编码的蛋白具有2-氨基酚1，6-双加氧酶的活性。
含本发明提供的基因的转化子构建和酶的表达：将本发明提供的基因连接到载体SuperCos 1后，以Gigapack III XL包装蛋白包装，或也可以将该基因连接到其他表达载体，然后将包装好的载体或连接载体转化到感受态大肠杆菌或其他细菌，经LB培养基或其他培养基培养，含有连接基因片段的菌落就为转化子，以SuperCos 1为载体的转化子不需要诱导就可以表达酶活性，而以其他的表达载体为载体的转化子则需要载体相应的诱导物诱导表达酶活性。以这些转化子可以用于酶的生产或这些转化子可以直接用于含对硝基氯代苯或邻氨基酚废水处理或这些底物的生物转化工程。
本发明提供的基因所编码的酶对硝基氯代苯开环酶活性的测定方法为：对硝基氯代苯在280nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定单位时间内280nm处的光吸收值的减少量，可测得对硝基氯代苯开环酶的酶比活。反应体系包括0.3μmol对硝基氯代苯，50mmol/L磷酸盐缓冲液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL。本发明提供的基因所编码的酶2-氨基酚1，6-双加氧酶活性的测定方法为：2-氨基苯酚的反应产物2-氨基粘康酸半醛在380nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定单位时间内380nm处的光吸收值的增加量，可测得双加氧酶的酶比活。反应体系包括0.3μmol 2-氨基苯酚，50mmol/L磷酸盐缓冲液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL。2-氨基粘康酸半醛的摩尔消光系数ε＝15.1Lmmol-1cm-1。1个单位的酶活力定义为1mg蛋白每分钟生成1nmol的2-氨基粘康酸半醛。
本发明提供的基因所编码的2-氨基酚1，6-双加氧酶的纯化方法为：1、硫酸氨沉淀，收集65％～70％饱和浓度之间的蛋白；2、在4℃温度下，用BufferA：20mM Tris-HCl，pH8.0；10％ethanol；1mM dithiothreitol；0.5mML-ascorbic acid作为流动相，过Superdex(Pharmacia Biotech公司)分子筛，收集55～80mL处的流出液，测酶活，选择酶活较高的蛋白溶液进行下一步实验；3、将上一步得到的蛋白溶液过Mono Q HR 5/5(PharmaciaBiotech公司)离子交换柱，用Buffer A+NaCl洗脱，洗脱梯度为50mM～500mM NaCl，收集洗脱液，测酶活，跑SDS-PAGE，即可得到纯的酶蛋白。
具体实施方案
为了更好地理解本发明，通过一下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。
实施例1：2-氨基酚1，6-双加氧酶基因的克隆
将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株在LB平板上的单菌落挑到LB培养液中，30℃振荡培养，收集菌体，提总DNA，用Mbo I部分酶切至30kb左右的片断。用SuperCos 1作为载体(购自Stratagene Company，USA)，载体先用Xba I酶切后，去磷酸化，再用BamH I酶切成6.8kb和1.1kb的两个片段。将基因组部分酶切的片段和处理后的载体在16℃用T4 DNA连接酶连接。连接好的片段用Gigapack IIIXL包装蛋白(购自Stratagene Company，USA)包装。最终转染至大肠杆菌XL 1-blue MR(购自Stratagene Company，USA)中，建立Cosmid基因文库。用2-氨基苯酚作为底物筛选文库，30℃培养两天，溶液为无色的克隆为阳性克隆，从基因文库中筛选到有2-氨基酚1，6-双加氧酶活性的3个阳性克隆。将其中一个克隆的质粒提取出来测序。对测序结果进行ORF分析，在NCBI上进行blastx比对，从序列中分析出编码2-氨基酚1，6-双加氧酶α、β亚基的基因序列。基因编码的α-亚基氨基酸序列与2-aminophenol1，6-dioxygenase alpha subunit[Pseudomonas pseudoalcaligenes](登录号为AAB71525)的序列相似性为56％；基因编码的β-亚基的氨基酸序列与2-aminophenol 1，6-dioxygenase beta subunit[Pseudomonas putida](登录号为AAK26519)的序列相似性为79％。从序列中分析出编码2-氨基酚1，6-双加氧酶α、β亚基的基因，这两个亚基的基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列分别如序列表1和序列表2所示
实施例2：含本发明提供的基因的转化子构建和酶的表达
将本发明提供的基因连接到载体SuperCos 1后，以Gigapack III XL包装蛋白包装，或也可以将该基因连接到其他表达载体，然后将包装好的载体或连接载体转化到感受态大肠杆菌或其他细菌，经LB培养基或其他培养基培养，含有连接基因片段的菌落就为转化子，以SuperCos 1为载体的转化子不需要诱导就可以表达酶活性，而以其他的表达载体为载体的转化子则需要载体相应的诱导物诱导表达酶活性。以这些转化子可以用于酶的生产或这些转化子可以直接用于含对硝基氯代苯或邻氨基酚废水处理或这些底物的生物转化工程。
实施例3：2-氨基酚1，6-双加氧酶活性的测定
2-氨基苯酚的反应产物2-氨基粘康酸半醛在380nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定380nm处的光吸收值的增加量，可测得双加氧酶的酶比活。反应体系包括0.3μmol 2-氨基苯酚，50mmol/L磷酸盐缓冲液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的细胞提取液，酶促反应总体积为3mL。2-氨基粘康酸半醛的摩尔消光系数ε＝15.1 Lmmol-1cm-1。1个单位的酶活力定义为1mg蛋白每分钟生成1nmol的2-氨基粘康酸半醛。
实施例4：2-氨基酚1，6-双加氧酶的纯化方法
1)硫酸氨沉淀，收集65％～70％饱和浓度之间的蛋白；2)在4℃温度下，用Buffer A(20mM Tris-HCl，pH8.0；10％ethanol；1mM dithiothreitol；0.5mM L-ascorbic acid)作为流动相，过Superdex(Pharmacia Biotech 公司)分子筛，收集55～80ml处的流出液，测酶活，选择酶活较高的蛋白溶液进行下一步实验；3)将上一步得到的蛋白溶液过Mono Q HR 5/5(PharmaciaBiotech公司)离子交换柱，用Buffer A+NaCl洗脱，洗脱梯度为50mM～500mM NaCl，收集洗脱液，测酶活，跑SDS-PAGE，即可得到纯的酶蛋白。
实施例5：酶亚基的N端氨基酸序列测定
从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1(CGMCC No.1028)细胞中纯化出2-氨基酚1，6-双加氧酶蛋白，将10～250pmol的蛋白样品点道聚丙烯酰胺微型凝胶上(7.5～20％梯度)，20W恒功率电泳。电泳完毕，将凝胶浸到转移缓冲液中(10mM CAPS，10％甲醇，pH11.0)，浸泡5min以除去多余的Tris和甘氨酸。将一张PVDF膜用100％甲醇浸润，并储存在转移缓冲液中。将凝胶夹在PVDF膜和几张印迹纸中间，装到印迹装置上，在转移缓冲液中电洗脱20min，80V。PVDF膜在去离子水中漂洗5min，用0.1％考马斯亮蓝R-250的50％甲醇溶液染色5min(室温)。在室温脱色(50％甲醇，10％乙酸)5min。最后将膜用去离子水晶润5～10min，空气干燥，-20℃储存。将处理好的样品送到北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室，对两个亚基的N端各8个氨基酸进行测序，测序结果为：α亚基，TVVSAFLV；β亚基，MQGEIIAG。与得到的基因序列所编码的N端氨基酸序列完全相同。
实施例6：2-氨基酚1，6-双加氧酶的功能鉴定
用按照实施例4得到的纯酶做酶催化反应实验，分别以邻氨基酚和对氯硝基苯为底物，表明纯酶具有将邻氨基酚和对氯硝基苯开环的能力，其结果见表1。反应条件如下：0.3μmol 2-氨基苯酚或对氯硝基苯，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL，于380nm处检验光吸收值的变化速率。
表1本发明提供的基因所编码的酶的底物范围
| 底物 | 酶比活(U/mg蛋白) |
| 邻苯二酚3-甲基邻苯二酚4-甲基邻苯二酚4-氯邻苯二酚2，4-二羟苯甲酸原儿茶酸对氯硝基苯(对硝基氯代苯)邻氨基酚 | +++++++++29.41 |
序列表1(alpha-subunit)
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种降解对硝基氯代苯的开环酶基因及其用途
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>813
<212>DNA
<213>Comamonas testosteroni CNB1
<400>1
atgaccgttg tatctgcttt cctcgtgccc ggcacgcccc tgccacaact caagcccgag 60
gtcccgtcct gggggcaact tgccgccgcc acggagcgcg ccgggaaggc gctcgcggct 120
tcgcgccccg atgtggtctt ggtctactcg acccaatggc ttgccgtgct tgaccagcag 180
tggctgacgc gccctcgcag tgaaggcgtt catgtcgacg agaactggta cgagttcggc 240
gacctggcat atgacatccg agcggacact gcattggccg aggcctgtgt gacgagttct 300
ccgctccatg gcgtccatgc ccggggcgtt aactacgatg gatttccgat cgacaccgga 360
acgatcactg catgcactct gatgggaatc ggcaccgatg cattcccatt ggtggttggt 420
tccaacaatc tttaccacag cggcgagatc accgagaagt tggccgcact ggcggtcgac 480
tgcgccaagg atcaaaacaa acgtgtggcg gtcgtcggtg ttggtggcct gtcgggctcg 540
ctcttccgtg aggagattga tccgcgcgaa gatcgaattg ccaatgaaga agacgacaag 600
tggaatcggc gtgttctgaa gctcattgaa gcgggtgacg tgagcgccct gcgcgaggcg 660
atgccagtct atgcaaaaga ggctcgtgtc gatatggggt tcaagcacct ccactggatc 720
cttggtgcgc tcaagggcaa gttctcgggc gccaacgtgc ttggttacgg gccttcctat 780
ggctccggtg ccgccgtgat cgagttccga ctc 813
<210>2
<211>271
<212>PRT
<213>Comamonas testosteroni CNB1
<400>2
Met Thr Val Val Ser Ala Phe Leu Val Pro Gly Thr Pro Leu Pro Gln
1 5 10 15
Leu Lys Pro Glu Val Pro Ser Trp Gly Gln Leu Ala Ala Ala Thr Glu
20 25 30
Arg Ala Gly Lys Ala Leu Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Val Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Thr Gln Trp Leu Ala Val Leu Asp Gln Gln Trp Leu Thr Arg
50 55 60
Pro Arg Ser Glu Gly Val His Val Asp Glu Asn Trp Tyr Glu Phe Gly
65 70 75 80
Asp Leu Ala Tyr Asp Ile Arg Ala Asp Thr Ala Leu Ala Glu Ala Cys
85 90 95
Val Thr Ser Ser Pro Leu His Gly Val His Ala Arg Gly Val Asn Tyr
100 105 110
Asp Gly Phe Pro Ile Asp Thr Gly Thr Ile Thr Ala Cys Thr Leu Met
115 120 125
Gly Ile Gly Thr Asp Ala Phe Pro Leu Val Val Gly Ser Asn Asn Leu
130 135 140
Tyr His Ser Gly Glu Ile Thr Glu Lys Leu Ala Ala Leu Ala Val Asp
145 150 155 160
Cys Ala Lys Asp Gln Asn Lys Arg Val Ala Val Val Gly Val Gly Gly
165 170 175
Leu Ser Gly Ser Leu Phe Arg Glu Glu Ile Asp Pro Arg Glu Asp Arg
180 185 190
Ile Ala Asn Glu Glu Asp Asp Lys Trp Asn Arg Arg Val Leu Lys Leu
195 200 205
Ile Glu Ala Gly Asp Val Ser Ala Leu Arg Glu Ala Met Pro Val Tyr
210 215 220
Ala Lys Glu Ala Arg Val Asp Met Gly Phe Lys His Leu His Trp Ile
225 230 235 240
Leu Gly Ala Leu Lys Gly Lys Phe Ser Gly Ala Asn Val Leu Gly Tyr
245 250 255
Gly Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Ala Val Ile Glu Phe Arg Leu
260 265 270
序列表2(beta-subunit)
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种降解对硝基氯代苯的开环酶基因及其用途
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>942
<212>DNA
<213>Comamonas testosteroni CNB1
<400>1
gtgaaaatgc aaggtgaaat catcgcggga tttttggctc cccatccccc tcacttggtg 60
tacggtgaaa atccaccgca gaacgagccc cgctcccaag ggggctggga ggtgcttcgt 120
tgggcttacg agcgcgcacg cgaacgcttg gatgccatga agcccgacgt cctgctcgtg 180
cactcgcccc attggatcac ctcggttggt catcacttct tgggcgtgcc cgagctgagt 240
ggcaagtcgg tggatcccat tttcccgaac gtgttccgct acgacttctc gttgaacgtg 300
gacgtggaac tggctgaggc ctgcgccgag gaaggcagaa aagcgggtct tgtgaccaag 360
atgatgcgta acccgaagtt ccgcgtcgac tacggcacga tcaccactct gcacctgatt 420
cgtccgcagt gggacattcc tgtggtgggt atctctgcca acaactcgcc gtactacctc 480
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tggatgcacg ccgcgatgca gtacccggaa ctggccgcag aactgtttgg ctatggcacg 840
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cttggcgctg ccgatcaaaa acaacgcagc gcagctgttg cc 942
<210>2
<211>314
<212>PRT
<213>Comamonas testosteroni CNB1
<400>2
Val Lys Met Gln Gly Glu Ile Ile Ala Gly Phe Leu Ala Pro His Pro
1 5 10 15
Pro His Leu Val Tyr Gly Glu Asn Pro Pro Gln Asn Glu Pro Arg Ser
20 25 30
Gln Gly Gly Trp Glu Val Leu Arg Trp Ala Tyr Glu Arg Ala Arg Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Lys Ser Val Asp Pro Ile Phe Pro Asn Val Phe Arg Tyr Asp Phe
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asn Thr Leu Ser His Trp His Phe His Glu Glu Pro Thr Ile Pro Glu
195 200 205
Asp Met Ser Lys Glu Tyr Pro Ala Thr Met Ala Gly Tyr Gln Trp Asp
210 215 220
Ile Arg Met Ile Glu Leu Met Arg Gln Gly Lys Thr Ser Glu Val Phe
225 230 235 240
Lys Leu Leu Pro Gln Phe Ile Asp Glu Ala Phe Ala Glu Val Lys Ser
245 250 255
Gly Ala Phe Thr Trp Met His Ala Ala Met Gln Tyr Pro Glu Leu Ala
260 265 270
Ala Glu Leu Phe Gly Tyr Gly Thr Val Ile Gly Thr Gly Asn Ala Val
275 280 285
Met Glu Trp Asp Leu Arg Lys Ala Gly Leu Ser Met Leu Gly Ala Ala
290 295 300
Asp Gln Lys Gln Arg Ser Ala Ala Val Ala
305 310
Claims (6)
1.一种2-氨基酚1，6-双加氧酶，其氨基酸组成具有序列表2 NO.2所示的314个氨基酸序列为β-亚基和序列表1 NO.2所示的271个氨基酸序列为α-亚基，酶是由两个β-亚基和两个α-亚基组成。
2.编码权利要求1所述酶的基因，其核苷酸长度为1770碱基对，含有两个同方向的ORF开放阅读框架，分别为序列表2 NO.1所示的942bp核苷酸序列和序列表1 NO.1所示的813bp核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述基因的转化子。
4.权利要求3所述的转化子在2-氨基酚、对硝基氯代苯类化合物的生物降解和生物转化工程中的应用。
5.权利要求1所述的酶在2-氨基酚、对硝基氯代苯类化合物的酶促降解和生物转化工程中的应用。
6.权利要求2所述的基因在2-氨基酚、对硝基氯代苯类化合物的生物降解和生物转化工程中的应用。
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| CNB2003101188128A CN1317388C (zh) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | 2－氨基酚1，6－双加氧酶、其基因及用途 |
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