CN1434057A - 可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法，通过基因工程表达可逆光致变色藻胆蛋白的脱辅基蛋白、相应的催化藻蓝胆素从藻蓝蛋白裂解的藻蓝蛋白裂合酶、相应的催化藻胆蛋白脱辅基蛋白与藻胆色素共价偶联的藻红蓝蛋白裂合/异构酶，然后应用此裂合酶、此裂合/异构酶催化藻蓝胆素从藻蓝蛋白及其α亚基转移，并同时与藻胆蛋白脱辅基蛋白体外重组，从而制备可逆光致变色的藻胆蛋白。本发明方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液，是一种环境友好的绿色生产工艺。因此，此可逆光致变色藻胆蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法。
技术背景
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是存在于蓝藻和红藻光合作用捕光复合物中的功能色素蛋白质，大多数藻胆蛋白由α和β亚基组成。根据其吸收光谱特征，藻胆蛋白可分为四类：藻红蛋白、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称PC)和别藻蓝蛋白。藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。天然藻胆色素包括：藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)、藻红胆素、藻尿胆素和藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)。这些藻胆色素以硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸巯基共价结合并形成特定的构象，使得藻胆蛋白主要吸收450～660nm范围内的可见光。PEC是某些蓝藻光合作用捕光复合物的功能组成部分，在体内与其它藻胆蛋白共同起传递光能的作用。分离提纯的藻红蓝蛋白α-亚基(简称α-PEC)具有可逆光致变色性质。在α-PEC中，PVB为辅基色素，它通过硫醚键与脱辅基蛋白84位的半胱氨酸巯基共价连接。在PC的α亚基(简称α-PC)中，PCB为辅基色素，它通过硫醚键与脱辅基蛋白84位的半胱氨酸巯基共价连接。
当蓝藻中存在PEC时，其基因组中必定存在PEC操纵子(简称pec)，pec中含B、A、C、E、F五个基因，分别称为pecB、pecA、pecC、pecE、pecF。其中pecA编码PecA，PecA为α-PEC的脱辅基蛋白，共有162个氨基酸，分子量为18kDa(盛树斌，马晓军，霍海蓉，赵开弘，藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达，武汉大学学报(自然科学版)，1999，45(4)，493～496)。pecE与pecF分别编码PecE与PecF(简称PecE/F)，PecE/PecF催化藻胆蛋白脱辅基蛋白与藻胆色素的共价偶联反应，是α-PEC生物合成的裂合/异构酶(lyase/isomerase)(盛树斌，张富铁，邓明刚，周明，赵开弘，层理鞭枝藻藻红蓝蛋白E基因片段的克隆与表达，水生生物学报，2001，25(4)，427～430。郑敏，答亮，邓明刚，秦艺曼，周明，赵开弘，层理鞭枝藻藻红蓝蛋白操纵子F基因的克隆和表达，水生生物学报，2002，26(2)，168～174)。PecE/PecF催化PCB异构化为PVB，并与PecA的84位半胱氨酸巯基以硫醚键共价连接，从而生成具有天然活性的α-PEC。
当蓝藻中存在PC时，其基因组中必定存在PC操纵子(简称pc)，pc中的E、F基因(即pcE、pcF)，与pecE、pecF类似，编码PcE与PcF(简称PcE/F)，PcE/PcF催化α-PC的脱辅基蛋白(即PcA)与PCB的共价偶联反应，是α-PC生物合成的裂合酶(lyase)。PcE/PcF即可以催化PCB与PcA的84位半胱氨酸巯基以硫醚键共价连接，从而生成具有天然活性的α-PC，也可以催化其中的PCB从PC或α-PC裂解断开。本专利就是利用PcE/F裂合酶的裂解性质，应用PcE/F从PC或α-PC断裂得到PCB，然后同时生成的PCB被PecE/F催化，与α-PEC类脱辅基蛋白共价结合，得到可逆光致变色的藻胆蛋白。
藻胆蛋白可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白仍局限于从藻中提取。α-PEC具有可逆光致变色性质，为了发展可逆光致变色的藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料，可以分子设计和体外重组可逆光致变色藻胆蛋白。应用本专利介绍的方法可以不使用任何有机溶剂和去污剂，通过生物工程生产藻胆蛋白脱辅基蛋白、藻蓝蛋白裂合酶、藻红蓝蛋白裂合/异构酶，然后应用这些酶的催化性质，制备可逆光致变色的藻胆蛋白。因此，本方法为藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不使用有机溶剂和去污剂，而体外重组制备可逆光致变色藻胆蛋白的方法。此方法通过基因工程表达藻胆蛋白的脱辅基蛋白、相应的催化PCB从PC或α-PC裂解开的藻蓝蛋白裂合酶、催化脱辅基蛋白与藻胆色素共价偶联的藻红蓝蛋白裂合/异构酶，然后应用此裂合酶催化PCB从PC或α-PC裂解，同时此裂合/异构酶催化生成的PCB与藻胆蛋白脱辅基蛋白体外重组，从而制备可逆光致变色的藻胆蛋白。在此新方法中，不涉及使用任何有机溶剂和去污剂。本发明还提供了实现该方法的详细技术步骤与条件。
为实现上述发明目的：一种可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法，其步骤为：
一种可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法，其步骤为：
(1)采用基因工程方法，分别将pecE和pecF克隆于表达载体中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF；
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F；
(3)采用基因工程方法，分别将pcE和pcF克隆于表达载体中，将此表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF；
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F；
(5)应用基因工程方法表达PecA类脱辅基蛋白；
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白与PC或α-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度20～45℃，pH值7～8.5；反应所需的辅助因子包括：①二价锰离子、镁离子或钙离子中的一种或几种，其总浓度为1～5mmol/L，和②巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽或其它巯基化合物中的一种或几种，其总浓度为2～10mmol/L。
在现有的可逆光致变色藻胆蛋白制备方法中，由于使用藻蓝胆素这种胆色素小分子，所以需要使用有机溶剂和去污剂(周明，王鲁，郑雷，赵开弘，藻红蓝蛋白连接/异构酶重组体系，华中科技大学学报(自然科学版)，2002，30(8)，114～116)。本发明描述了使用藻蓝蛋白而不是藻蓝胆素作反应物，应用克隆表达的藻蓝蛋白裂合酶、藻红蓝蛋白裂合/异构酶同时催化藻蓝蛋白中的藻蓝胆素转移，并与藻胆蛋白脱辅基蛋白重组，从而生成可逆光致变色的藻胆蛋白。本发明方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液。因此，此种可逆光致变色藻胆蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。可以应用吸收光谱检测如此制备的可逆光致变色藻胆蛋白(见说明书附图)。对于本发明所得到的可逆光致变色藻胆蛋白，当用500nm光辐射时，表现为565nm吸收增强；当用570nm光辐射时，表现为505nm吸收增强，即可逆光致变色范围505565nm。本发明方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液，是一种环境友好的绿色生产工艺。因此，此种可逆光致变色藻胆蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。
附图说明
图1为本发明制备的可逆光致变色藻胆蛋白的吸收光谱检测图。
具体实施方式
下面以实例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。如此生产的PecE与PecF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的PcE与PcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为M34254的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。如此生产的PecA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，或5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例2：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。如此生产的PecE与PecF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的PcE与PcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为M34254的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。如此生产的PecA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与α-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值8.0；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，和②5mmol/L的巯基乙醇，或3mmol/L二硫苏糖醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例3：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为M34254的pecA克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例4：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为M34254的pecA克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与α-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值8.0；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例5：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。如此生产的PecE与PecF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的PcE与PcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。如此生产的PecA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，或5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例6：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)用PCR扩增Gene bank中编号为M34254的pecA之N端缺失19个氨基酸的pecA片段(简称pecA-N19)，将pecA-N19克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA-N19。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA-N19与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，或5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PVB-PecA-N19。
实施例7：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。如此生产的PecE与PecF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的PcE与PcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)用PCR扩增Gene bank中编号为M34254的pecA之N端缺失32个氨基酸的pecA片段(简称pecA-N32)，将pecA-N32克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA-N32。如此生产的PecA-N32具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecA-N32。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA-N32与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，或5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PVB-PecA-N32。
实施例8：
(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)用PCR扩增Gene bank中编号为M34254的pecA之N端缺失45个氨基酸的pecA片段(简称pecA-N45)，将pecA-N45克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA-N45。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA-N45与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，或5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PVB-PecA-N45。
实施例9：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度20度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例10：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度45度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，和②5mmol/L的巯基乙醇，或3mmol/L二硫苏糖醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例11：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.0；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，和②1mmol/L与2mmol/L二硫苏糖醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例12：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值8.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L镁离子与2mmol/L钙离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例13：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，和②1mmol/L与2mmol/L二硫苏糖醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例14：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的二价钙离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例15：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①1mmol/L的二价锰离子，②2mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例16：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的二价锰离子，②10mmol/L的巯基乙醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例17：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的二硫苏糖醇。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
实施例18：
(1)分别将Gene bank中编号为AF178757的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。
(3)分别将Gene bank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。
(5)将Gene bank中编号为AF178757的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的还原型谷胱甘肽。
反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。
上述制备方法适用于采用各种pecE、pecF、pcE、pcF和pecA来制备可逆光致变色藻胆蛋白，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了基因库中已公开的微生物为例对本发明方法加以说明，本领域的一般技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
Claims (3)
1.一种可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法，其步骤为：
(1)采用基因工程方法，分别将pecE和pecF克隆于表达载体中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF；
(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F；
(3)采用基因工程方法，分别将pcE和pcF克隆于表达载体中，将此表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF；
(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F；
(5)应用基因工程方法表达PecA类脱辅基蛋白；
(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白与PC或α-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度20～45℃，pH值7～8.5；反应所需的辅助因子包括：①二价锰离子、镁离子或钙离子中的一种或几种，其总浓度为1～5mmol/L，和②巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽或其它巯基化合物中的一种或几种，其总浓度为2～10mmol/L。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中可以在PecA的N端1～45个氨基酸处进行分子设计。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(6)中的反应条件为：温度为35～40℃，pH值为7.5～8.0。
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