CN1800401A - 一种酯水解酶及其基因和重组酶 - Google Patents
一种酯水解酶及其基因和重组酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1800401A CN1800401A CNA2005100231721A CN200510023172A CN1800401A CN 1800401 A CN1800401 A CN 1800401A CN A2005100231721 A CNA2005100231721 A CN A2005100231721A CN 200510023172 A CN200510023172 A CN 200510023172A CN 1800401 A CN1800401 A CN 1800401A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ester hydrolase
- ala
- leu
- gly
- pppest
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种来自于恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)编码酯水解酶的基因PPEST，提供了含有PPEST序列及其相应的氨基酸序列；提供了含有PPEST的表达载体pPPEST－PET和表达该酯水解酶的基因工程菌株——含有这种载体的大肠杆菌E.coli细胞BL21(DE3)/pPPEST－PET；本发明还提供了重组该酯水解酶的方法。本发明重组的酯水解酶是可用于立体选择性催化手性化合物(S型)的合成。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种酯水解酶及其基因和重组酶，包括该酯水解酶基因的表达载体及制备其重组酶的方法及其基因工程菌株，以及该酯水解酶在立体选择性催化手性化合物合成中的应用。
背景技术
酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一类在手性合成中有着重要用途的生物催化剂。这些酶能识别很宽的底物，目前＞40％的生物不对物合成反应可由酯水解酶催化完成，这些反应具有条件温和、反应的区域选择性和立体选择高等特点。在酶动力学拆分外消旋酯、胺和转化前手性醇等方面得到广泛的应用。另外，它们还可用于选择性酯化、转酯化和聚合反应中。
由于对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人们的重视和工业化应用。生物法合成手性化合物的关键问题在于寻找具有高度立体选择性催化功能的生物催化剂。由于酯水解酶具有广泛的用途，筛选新的酯水解酶正成为酶工程的研究热点。虽然酯水酶在微生物界分布很广，但它们的立体选择性催化能力不一样。在同一生物体内往往存在多种酯水解酶，由于它们之间立体选择性存在差异性，利用微生物细胞或它们的粗酶制品进行酶法合成手性化合物时往往会降低产物的光学纯度(Geun-Joong Kim，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 17，2002：29-38)。解决这一问题可以通过工程的调控手段来减少副反应的发生(PerBerglund，Biomolecular Engineering，18，2001：13-22)，也可以通过分离纯化得到单一的酶制剂来进行催化反应，但这些过程往往较复杂和高的成本，在生产中不易被采用。如果通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，就能够很方便达到以上的目的。
发明内容
本发明人即为了解决上述课题，通过筛选大量的微生物，发现恶臭假单孢菌能产生一种有高度立体选择性的酯水解酶，可用于催化手性化合物的合成；为了提高这种酯水解酶的产量和消除野生型菌株中同工酶对酶催化反应的负面影响，本发明克隆了该基因并对此基因在大肠杆菌内进行表达。因此，本发明要解决的技术问题，即为提供一种酯水解酶及其基因和重组酶，包括该酯水解酶基因的表达载体及制备其重组酶的方法及其基因工程菌株，以及该酯水解酶在立体选择性催化手性化合物合成中的应用。
本发明的酯水解酶基因可得自恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)，如P.putida ATCC 17522，P.putida NCIB 11772等菌株。本发明采用的技术方案是通过构建恶臭假单孢菌的DNA文库，从文库中筛选得到恶臭假单孢菌酯水解酶基因PPEST，测定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示，其中，其编码序列(CDS)从DNA第5个碱基起至第1150终止，GTG为转录起始密码子，TGA为转录终止密码；并得到相应的氨基酸序列，如序列表中SEQ ID No.2所示。当然，如本领域技术人员所知，本发明酯水解酶基因还可以是编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的酯水解酶不仅限是具有序列表中SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。
本发明的另一目的是提供包括上述酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体。其是用常规方法将本发明的酯水解酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
较佳的是将用PCR扩增到的PPEST基因产物和克隆载体pUC18-T连接，形成克隆载体pPPEST-T。pPPEST-T和表达载体pET22b(+)分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成PPEST基因的表达载体(质粒)pPPEST-PET。
本发明的再一目的是提供一种基因工程菌株，其是将包含本发明酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体转化到感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到的基因工程菌株，如将质粒pPPEST-PET转化其中得到含有pPPEST-PET的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pPPEST-PET。
本发明的又一目的是提供一种制备重组酯水解酶的方法，其包括用上述本发明表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的酯水解酶。
其中，该宿主细胞可以为细菌或昆虫等。较佳的是大肠杆菌，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pPPEST-PET。
此菌株可在常规的IPTG诱导下(在OD600＝0.5-0.6左右时加入，至其浓度为0.1-1mmol/L均可)高效表达酯水解酶蛋白，即为本发明的重组酯水解酶，用于制备光学纯的手性化合物(S型)。
附图说明
图1为本发明PPEST的PCR扩增电泳图谱，其中，1为PPEST的PCR扩增产物；2为DNA Marker(100bp DNA ladder，New England Biolab公司)；3为DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)。
图2为本发明质粒pPPEST-T的HindIII和NdeI双酶切分析图谱，其中，1为DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)；2为pPPEST-T/HindIII+IndeI。
图3为本发明表达质粒pPPEST-PET的HindIII和NdeI双酶切分析图谱，其中，1为DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)；2为pPPEST-PET/HindIII+IndeI。
图4为本发明基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pPPEST-PET表达产物的PAGE电泳图，其中1为低分子量标准蛋白质(上海博亚生物技术有限公司)；2为基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pPPEST-PET诱导前的产物；3为基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pPPEST-PET经IPTG诱导3h的产物。
图5为本发明重组酯水解酶水解氟比洛芬酯的反应产物的C18HPLC分析图谱，其中，1为氟比洛芬；2为氟比洛芬酯。
图6为本发明重组酯水解酶水解氟比洛芬酯的反应产物的手性HPLC分析图谱，其中，1为(S)-氟比洛芬。
图7为本发明表达质粒pPPEST-PET的构建示意图。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明。
下列实施例中的材料与方法为：
所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
所使用的工具酶均购自Takala公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。
所使用的胶回收试剂盒购自上海生工公司，使用方法参考商品说明书。
下面的商品化质粒和大肠杆菌株用于DNA文库构建和基因克隆。
pUC18(Takala，日本)
pUC18-T(Takala，日本)
pET22b(+)(Novagen，美国)
大肠杆菌DH5a(Takala，日本)
大肠杆菌BL21(DE3)(Takala，日本)
实施例1：从恶臭假单孢菌克隆PPEST基因
用Sau3AI消化从恶臭假单孢菌得到的基因组DNA，并在0.7％琼脂糖凝胶上分离。从凝胶中回收2-8kb的DNA片段并和用牛小肠碱性磷酸酯酶(CIAP)处理过、用BamHI酶切的pUC18连接。将连接混合物转化高效感受态大肠杆菌DH5a(用《分子克隆实验指南》中的Hanahan所提供的方法制备高态感受态细胞)，涂布含50ug/ml Amp的LB平板，于37℃培养过夜，共得到约20000克隆。
把LB平板上的菌落转印到含1-10mmol/L(如5mmol/L)甘油三丁酯，0.1-1mmol/L(如1mmol/L)IPTG的新LB平板上，37℃培养48小时、挑取产生透明圈的菌落。接种于含1-10(如5mmol/L)mmol/L氟比洛芬乙酯、0.1-1mmol/L(如1mmol/L)IPTG、50-100ug/ml(如60ug/ml)Amp的LB培养基中，37℃培养24h，分析发酵液中产物氟比洛芬的光学纯度。其中有一个阳性克隆能够产生光学纯度＞99％的氟比洛芬，这克隆含有一个3kb大小的质粒，对该质粒进行DNA测序和酶切分析，表明它有一个编码酯水解酶的基因PPEST，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码成熟肽的DNA的大小为1142bp，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：克隆质粒构建
根据实施例1得到的PPEST基因序列，设计正向引物1和反向引物2。在引物1加上NdeI位点，引物2加上HindIII位点。
引物1序列：GGGAATTC
CATATGCAG GAGGTGAGTC CTCTGG
NdeI
引物2序列：CCC
AAGCTTGATCAAAGGCAACTGGCAAG
HindIII
以恶臭假单孢菌基因组DNA为模板进行PCR扩增(利用Takara试剂盒)，PCR反应混合物由2.5mmol/L dNTP，20pmol引物1和引物2，5单位Taq聚合酶(Takara)和提供的缓冲液组成。反应条件如下所示。步骤1之后向反应混合物加入Taq聚合酶。步骤2到4重复29次。
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 97℃ | 5min |
| 2 | 95℃ | 30sec |
| 3 | 60℃ | 30sec |
| 4 | 72℃ | 1min |
| 5 | 72℃ | 10min |
用0.7％琼脂糖凝胶分离PCR产物，从凝胶中回收1.1kb的DNA片段(如图1所示)，与pUC18-T载体连接，所得质粒称pPPEST-T，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a。质粒pPPEST-T经过HindIII和NdeI双酶切分析，证明含有正确的插入片段(如图2所示)。
实施例3：表达载体和转化体的构建
pPPEST-T质粒和pET22b(+)分别经NdeI和HindIII双酶切后，用0.7％琼脂糖凝胶分离酶切产物，从凝胶中分别回收1.1kbp和4.8kbp的DNA片段，用T4DNA连接酶连接，所得质粒称pPPEST-PET质粒，连接产物转化感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，经抗性培养基筛选得阳性克隆并进行HindIII和NdeI双酶切分析鉴定，证明含有正确的插入片段(如图3所示)，从而得到转化体——表达本发明酯水解酶的基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pPPEST-PET。
实施例2～3过程如图7所示。
实施例4：酯水解酶的表达
挑取含pPPEST-PET质粒大肠杆菌单菌落，接于5ml、含50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。取50ul培养液接至5ml、含50ug/ml卡那霉素的新鲜LB培养基，培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至其浓度为1mmol/L诱导，继续培养3h。离心收集菌体，表达产物经PAGE电泳和酶活性检测酯水解酶的表达量和酶活力(根据C.Ruiz等人，Letters in AppliedMicrobiology 2003，37，354-359采用的测酶活方法)，从图4可知，与诱导前比较，在4.0kd处有与预测分子大小一致的目标条带，目标蛋白质的表达量约占总蛋白重量20％以上，酶活力为50U/g干菌体。
实施例5：重组酯水解酶的应用
取实施例4中的重组大肠杆菌，经超声破壁，离心去除菌体，上清液经过60％(NH4)2SO4沉淀后，沉淀物复溶后经过phenyl-Sephrose fast flow柱层柱后得到部分纯化的重组酯水解酶。取得到的该重组酯水解酶，水解10-100mmol/L(pH10.0，50mmol/L磷酸钾缓冲液)的外消旋氟比洛芬酯和酮基布洛芬酯，反应温度30℃。反应产物经C18 HPLC(流动相为甲醇∶水＝85∶15(V/V)，检测波长254nm，流速0.8ml/min，检测温度30℃)和手性CHI-TBB HPLC柱(流动相为正己烷∶叔丁基甲醚∶冰醋酸＝70∶30∶0.1(V/V)，检测波长254nm，流速1.0ml/min，检测温度30℃)分析转化率和产物的光学纯度(如图5和图6所示，其中(R)-氟比洛芬的保留时间应为12.153min，该HPLC图谱没有检测到(R)-氟比洛芬)，结果如下表所示。从结果可知，不同的底物经过重组酯水解酶催化水解后，分别得到光学纯度＞99％的氟比洛芬和酮基布洛芬。以野生型的P.putida ATCC 17522分离到的粗酯水解酶催化同样的反应，得到光学纯97-98％的氟比洛芬和酮基布洛芬。说明利用重组酯水解酶进行反应可以消除野生菌产生的其它同工酶的副反应，提高手性化合物的光学纯度。
| 底物 | 产物 | 转化率(％) | 光学纯度ee(％) |
| 氟比洛芬甲酯 | (S)-氟比洛芬 | 42 | ＞99 |
| 氟比洛芬乙酯 | 50 | ＞99 | |
| 酮基布洛芬甲酯 | (S)-酮基布洛芬 | 46 | ＞99 |
| 酮基布洛芬乙酯 | 50 | ＞99 |
序列表
<110>上海医药工业研究院
<120>一种酯水解酶及其基因和重组酶
<130>051016C
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1390
<212>DNA
<213>恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)
<220>
<221>CDS
<222>(5)..(1150)
<223>
<400>1
gcgg gtg cag gag gtg agt cct ctg gtg ctg aag ttc gaa gca gtg cgc 49
Val Gln Glu Val Ser Pro Leu Val Leu Lys Phe Glu Ala Val Arg
1 5 10 15
gaa acc ttc gcc gcg ctg ttc gat gat ccc cag gag cgt ggc gcc gcg 97
Glu Thr Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Ala
20 25 30
ctg tgc atc cag gtt ggt ggc gaa acc gtg gtc gac ctg tgg gcc ggc 145
Leu Cys Ile Gln Val Gly Gly Glu Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly
35 40 45
agt gcc gac aag gac ggc cag cag gcc tgg cac agc gat acc atc gcc 193
Ser Ala Asp Lys Asp Gly Gln Gln Ala Trp His Ser Asp Thr Ile Ala
50 55 60
aac ctg ttc tcc tgc acc aag acc ttc acc gct gtc acc gcc ctg caa 24l
Asn Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Thr Ala Leu Gln
65 70 75
ctg gtc ggc gag ggc aag ctg acg ctc gat gcg ccg gtg gcc aac tac 289
Leu Val Gly Glu Gly Lys Leu Thr Leu Asp Ala Pro Val Ala Asn Tyr
80 85 90 95
tgg ccc gag ttc gcc cag gca ggc aaa cag gct atc acc ctg cgc cag 337
Trp Pro Glu Phe Ala Gln Ala Gly Lys Gln Ala Ile Thr Leu Arg Gln
100 105 110
ttg ctc agc cac cgt gcc ggc ttg ccg gcc atc cgt gag ctg ctg ccg 385
Leu Leu Ser His Arg Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Glu Leu Leu Pro
115 120 125
gcc gaa gcg ctg tat gac tgg cag gcc atg gtc gat gcg ctg gct gcc 433
Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Gln Ala Met Val Asp Ala Leu Ala Ala
130 135 140
gaa acg ccc tgg tgg aca ccc ggc acc gag cac ggc tat gcc gcc att 481
Glu Thr Pro Trp Trp Thr Pro Gly Thr Glu His Gly Tyr Ala Ala Ile
145 150 155
acc tac ggc tgg ctg atc ggc gag ctg atc cgg cgt gcc gac ggc cgt 529
Thr Tyr Gly Trp Leu Ile Gly Glu Leu Ile Arg Arg Ala Asp Gly Arg
160 165 170 175
ggc ccc ggc gac tcg atc gtg gcc cgt acc gct cgg ccg ttg ggg ctg 577
Gly Pro Gly Asp Ser Ile Val Ala Arg Thr Ala Arg Pro Leu Gly Leu
180 185 190
gat ttt cat gtc ggc ctg gcg gac gat gag ttt tat cgc gtg gcg cac 625
Asp Phe His Val Gly Leu Ala Asp Asp Glu Phe Tyr Arg Val Ala His
195 200 205
atc gcc cgt ggc aag ggc aac gcc ggg gac gct gcg gcg cag cgc ctg 673
Ile Ala Arg Gly Lys Gly Asn Ala Gly Asp Ala Ala Ala Gln Arg Leu
2l0 215 220
ctg cag gtg acc atg cgc gag ccc gag gcc ctg tcg acc cgt gcc ttc 721
Leu Gln Val Thr Met Arg Glu Pro Glu Ala Leu Ser Thr Arg Ala Phe
225 230 235
acc aac ccg ccg gcg atc ctg acc agt acc aac aag ccg gag tgg cgg 769
Thr Asn Pro Pro Ala Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg
240 245 250 255
cgc atg cag cag cca gcg gcc aat ggc cat ggc aat gca cgc agc ctg 817
Arg Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu
260 265 270
gcg ggc ttc tat gcc ggg ttg ctg gac ggc agc ctg ctc gaa tcc gaa 865
Ala Gly Phe Tyr Ala Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ser Glu
275 280 285
ctg ctc gac gaa ctg acc cgt gag cac agc ctc ggg cag gat cgc acc 913
Leu Leu Asp Glu Leu Thr Arg Glu His Ser Leu Gly Gln Asp Arg Thr
290 295 300
ctg ctc acc cag acc cgt ttt ggc ctg ggc tgc atg ctc gac cag ccc 96l
Leu Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Pro
305 310 315
gac gtg gcc aat gcc acc ttc ggc ctc ggg gcc cgc gcc ttc ggc cac 1009
Asp Val Ala Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Ala Arg Ala Phe Gly His
320 325 330 335
cca ggt gcc ggt ggc tcg gtc ggt ttc gct gac ccg gaa cac gat gtg 1057
Pro Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Phe Ala Asp Pro Glu His Asp Val
340 345 350
gcc ttc ggt ttc gtg gtc aat acc ctc ggc cct tat gtg ctc atg gac 1105
Ala Phe Gly Phe Val Val Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp
355 360 365
ccg cga gcc cag aaa ctg gta cgc gtc ctt gcc agt tgc ctt tga 1150
Pro Arg Ala Gln Lys Leu Val Arg Val Leu Ala Ser Cys Leu
370 375 380
tcgggtaatg cgggtgttgg cccacccctt tgactatcct caatgccaac gcctgaaagg 1210
cgtaggcaaa attcctttct atttcatggt gtatcgctga tgtcttcaca caaaacctta 1270
gcactcgccc tgtgcctgac cgccgttacc ggctgcgcca gccactccca ggacggctcg 1330
aaggacagcg cctcgagctg gtggcccttc ggttcggaca aggttgccga gcaggaagtg 1390
<210>2
<211>381
<212>PRT
<213>恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)
<400>2
Val Gln Glu Val Ser Pro Leu Val Leu Lys Phe Glu Ala Val Arg Glu
1 5 10 15
Thr Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Cys Ile Gln Val Gly Gly Glu Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly Ser
35 40 45
Ala Asp Lys Asp Gly Gln Gln Ala Trp His Ser Asp Thr Ile Ala Asn
50 55 60
Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Thr Ala Leu Gln Leu
65 70 75 80
Val Gly Glu Gly Lys Leu Thr Leu Asp Ala Pro Val Ala Asn Tyr Trp
85 90 95
Pro Glu Phe Ala Gln Ala Gly Lys Gln Ala Ile Thr Leu Arg Gln Leu
100 105 110
Leu Ser His Arg Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Glu Leu Leu Pro Ala
115 120 125
Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Gln Ala Met Val Asp Ala Leu Ala Ala Glu
130 135 140
Thr Pro Trp Trp Thr Pro Gly Thr Glu His Gly Tyr Ala Ala Ile Thr
145 150 155 160
Tyr G1y Trp Leu Ile Gly Glu Leu Ile Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly
165 170 175
Pro Gly Asp Ser Ile Val Ala Arg Thr Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp
180 185 190
Phe His Val Gly Leu Ala Asp Asp Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile
195 200 205
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Ala Gly Asp Ala Ala Ala Gln Arg Leu Leu
210 215 220
Gln Val Thr Met Arg Glu Pro Glu Ala Leu Ser Thr Arg Ala Phe Thr
225 230 235 240
Asn Pro Pro Ala Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg
245 250 255
Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala
260 265 270
Gly Phe Tyr Ala Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ser Glu Leu
275 280 285
Leu Asp Glu Leu Thr Arg Glu His Ser Leu Gly Gln Asp Arg Thr Leu
290 295 300
Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Pro Asp
305 310 315 320
Val Ala Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Ala Arg Ala Phe Gly His Pro
325 330 335
Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Phe Ala Asp Pro Glu His Asp Val Ala
340 345 350
Phe Gly Phe Val Val Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp Pro
355 360 365
Arg Ala Gln Lys Leu Val Arg Val Leu Ala Ser Cys Leu
370 375 380
Claims (10)
1、一种酯水解酶基因，是下列核苷酸序列之一：
1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；
2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2、一种酯水解酶，是a)具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或b)将a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与a)蛋白质相同酶活性的由a)衍生的蛋白质。
3、包括权利要求1所述的酯水解酶基因的核苷酸序列的表达载体。
4、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于其由下列方法制得：将权利要求1所述的酯水解酶基因的核苷酸序列扩增，与质粒pUC18-T连接，得到克隆载体pPPEST-T，再将pPPEST-T和质粒pET22b(+)分别经NdeI和HindIII双酶切后连接得到表达质粒pPPEST-PET。
5、一种用于表达权利要求2所述的酯水解酶的基因工程菌株，其是将权利要求3或4所述的表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到的基因工程菌株。
6、一种制备重组酯水解酶的方法，其包括用权利要求3或4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的酯水解酶。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于该宿主细胞为大肠杆菌。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于该转化体为权利要求5所述的基因工程菌株。
9、根据权利要求6所述的方法制得的重组酯水解酶。
10、根据权利要求9所述的重组酯水解酶在立体选择性催化手性化合物合成中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100231721A CN100354422C (zh) | 2005-01-07 | 2005-01-07 | 一种酯水解酶及其基因和重组酶 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100231721A CN100354422C (zh) | 2005-01-07 | 2005-01-07 | 一种酯水解酶及其基因和重组酶 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1800401A true CN1800401A (zh) | 2006-07-12 |
| CN100354422C CN100354422C (zh) | 2007-12-12 |
Family
ID=36810611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100231721A Expired - Fee Related CN100354422C (zh) | 2005-01-07 | 2005-01-07 | 一种酯水解酶及其基因和重组酶 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100354422C (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560912A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-04-29 | 浙江大学 | 酯酶及其编码基因和应用 |
| CN114196653A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-18 | 安徽医科大学 | 重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003512015A (ja) * | 1998-11-10 | 2003-04-02 | ノボザイムス バイオテック，インコーポレイティド | ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸 |
-
2005
- 2005-01-07 CN CNB2005100231721A patent/CN100354422C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560912A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-04-29 | 浙江大学 | 酯酶及其编码基因和应用 |
| CN114196653A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-18 | 安徽医科大学 | 重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用 |
| CN114196653B (zh) * | 2021-12-10 | 2023-06-20 | 安徽医科大学 | 重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100354422C (zh) | 2007-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1250716C (zh) | 新的突变谷氨酰胺合成酶和产生氨基酸的方法 | |
| CN1180082C (zh) | 新的突变型n-乙酰谷氨酸合酶和l-精氨酸生产方法 | |
| CN1871351A (zh) | 一种新的真菌蛋白及其编码核酸 | |
| CN1372597A (zh) | 通过提高细胞nadph生产l－氨基酸的方法 | |
| CN1854303A (zh) | 发酵制造s－腺苷甲硫氨酸的方法 | |
| CN1948470A (zh) | 脂肪酶、其基因、产生该酶的亚罗解脂酵母及其应用 | |
| CN101063157A (zh) | 利用沙雷氏菌脂肪酶催化拆分2－芳基丙酸对映体的方法 | |
| CN1077599C (zh) | 4－甲硫基丁腈的酶水解 | |
| CN1082090C (zh) | 生产D－N－氨基甲酰基－α－氨基酸的方法 | |
| CN1834236A (zh) | 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用 | |
| CN1800401A (zh) | 一种酯水解酶及其基因和重组酶 | |
| CN1617931A (zh) | 具有脂肪酶活性的酯酶 | |
| CN1254532C (zh) | 一种漆酶及其编码基因与工程菌 | |
| CN1958797A (zh) | 南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列 | |
| CN1449447A (zh) | 丁炔醇ⅰ酯酶 | |
| CN100347294C (zh) | 一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用 | |
| CN1141387C (zh) | ppGpp合成酶及用于改善目的蛋白产生的表达系统 | |
| CN1239142A (zh) | 乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因 | |
| CN101058817A (zh) | 具有r－异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和重组酶 | |
| CN1761742A (zh) | 内酯酶的制造方法及其应用 | |
| CN1639347A (zh) | 生产左旋二酮的方法 | |
| CN1300310C (zh) | 一种低温脂肪酶及其编码基因与生产方法 | |
| CN1766097A (zh) | 菊酸乙酯酯酶及其编码基因与其表达专用工程菌和该酶的应用 | |
| CN1215336A (zh) | 稳定的酯水解生物催化剂 | |
| CN101058818A (zh) | 一种海因酶基因及其编码的氨基酸和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20071212 Termination date: 20150107 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |